KR101963983B1 - 바이러스 및 이의 생성물의 고속 처리 정량 및 특징분석 - Google Patents

바이러스 및 이의 생성물의 고속 처리 정량 및 특징분석 Download PDF

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Abstract

본 발명은 크로마토그래피 시스템 및 인-라인 역학적 광 산란(DLS) 기술을 사용하여 바이러스 및 바이러스 분자의 크기 및 통합성을 정량하고 특징분석하기 위한 고속 처리 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 외피 또는 비-외피 바이러스, 생 또는 생-약독화된 또는 불활성화된 바이러스, 재조합 바이러스 벡터 또는 바이러스형 입자(VLP)의 크기 및 통합성을 정량하고 특징분석한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 다중 분석을 동시에 전개하기 위한 칼럼-스위칭 시스템을 포함한다. 본 발명은 또한 바이러스 질환의 예방을 위한 바이러스 함유 제품을 개발하고 평가하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 바이러스 백신의 제조 공정을 위한 제조 과정의 품질 관리로서 사용한다.

Description

바이러스 및 이의 생성물의 고속 처리 정량 및 특징분석{HIGH THROUGHPUT QUANTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF VIRUSES AND PRODUCTS THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 6월 6일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/009,126호의 우선권을 주장한다. 이전 출원의 전체 내용 및 기재 내용은 본원에 참조로서 인용된다.
본원 전반에 걸쳐, 다양한 문헌이 언급되어 있고 이들 공보의 기재 내용은 전문이 본 발명이 속하는 기술 분야의 상황을 보다 완전하게 기재하기 위해 본원에 참조로 인용된다.
발명의 분야
본 발명은 바이러스, 바이러스 입자, 바이러스형 입자 (VLP) 및 재조합 바이러스 벡터의 정량 및 특징분석에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 외피 또는 비-외피 바이러스에 의해 유발되는 감염성 질환을 예방하기 위한 생성물의 개발, 및 외피 또는 비-외피 바이러스 또는 바이러스형 입자를 함유하는 생성물의 평가에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 유전자 치료요법 응용을 위한 생성물의 개발, 및 유전자-치료요법에 사용되는 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 생성물의 평가에 관한 것이다.
바이러스는 복제하고 번식하기 위해 원핵 또는 진핵 세포를 요구하는 자가-복제 실체이다. 바이러스가 처음에 민감성 세포와 접촉하게 되는 경우, 이것 자체가 세포에 부착하고 진입한다. 세포 내부에 있게 되면, 상기 바이러스는 세포의 단백질 합성 기구를 장악하여 이것이 자신의 보다 많은 복제물을 어셈블리하기 위해 요구되는 성분을 제조하도록 하게 한다. 특정 시간이 흐른 후, 상기 바이러스 복제물은 세포를 터트리거나 세포막을 통해 출아(budding)함에 의해 세포를 이탈한다. 바이러스는 여러 분류학적 기준에 따라 분류되고 가장 적절한 것 중 하나는 이들이 인지질 이중층 외피를 갖는지 갖지 않는지의 여부이다.
외피 및 비-외피 바이러스 둘다는 인간 및 수의과 병원체 중에서 발견된다. 비-외피 바이러스에 의해 유발되는 가장 중요한 수의과 질환 중 하나는 구제역 바이러스(FMDV)에 의해 유발되는 구제역 질환(FMD)이다. 가축 생산성에 큰 영향을 유발하는 비-외피 바이러스의 또 다른 예는 소 로타바이러스이고, 이는 송아지에서 신생아 설사의 유발제이다. 수의과 질환을 유발하는 외피 바이러스의 일부 예는 각각이 감염성 소 비강기관염 및 소 포진성 뇌염의 병인제인 소 헤르페스바이러스 1 및 5 (BoHV-1 또는 BHV-1 및 BoHV-5 또는 BHV-5); 소 호흡기 질환(BRD) 합병증과 관련된 소 파라인플루엔자 바이러스 3 (PI3 또는 BPIV-3); 및 동물 및 인간 둘다에서 치명적 뇌염의 원인 병원체인 광견병(Rabies) 바이러스를 포함한다.
FMD는 발굽이 갈라진 동물에 영향을 주는 중증의 고도의 전염성 질환이고 상기 동물은 소, 돼지, 양, 염소 및 사슴을 포함한다. 구제역 질환 증상은 구강내 및 발 및 젖꼭지에서의 열, 수포, 우유 생산의 저하, 식욕 및 체중 감소 및 절뚝거림을 포함한다.
상기 질환은 세계 많은 지역에서 풍토병이지만 동물원성 감염증으로서 인지되지 않는다. 동물 보건을 위한 세계 기구 (OIE)는 질환 분포 및 발병 맵을 주기적으로 공표한다. OIE에 의해 승인되는 위생 상태는 육류 무역 경제에 의존하는 국가에서는 OIE가 부과하는 시장 규제 때문에 심각한 경제적 영향을 주고 특히 FMD 영향하에 있는 국가에 심각한 경제적 영향을 미친다.
상기 FMD 바이러스 (FMDV)는 20면체 대칭 및 28 내지 40nm 범위의 기재된 크기(직경)를 특징으로 하는 비-지질-외피 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 상기 바이러스는 피코나비리대 과내에 아프토바이러스 속에 속한다. 상기 전체 바이러스 입자는 시험관내에서 극히 연약하고 이것은 56℃ 초과의 온도 및 6 미만의 pH에서 단량체로 해리된다. 7개의 FMDV 혈청형이 보고되었고, O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 및 Asial로 지정되었다.
효과적인 백신 및 엄격한 관리 프로그램은 대부분의 선진국에서 FMD를 박멸시켰지만, 엄격한 국제 무역 정책과 상관 없이, 주요 발병은 비교적 최근에 유럽(2000, 2001) 및 일본(2000, 2010)에서 발생하였다. FMD 백신은 NBS 생물학적 안전 수준 4(OIE)를 갖는 식물에서 제조한다. 25억명 내지 30억 분량이 연간 전세계에서 제조되고 있는 것으로 추산된다.
로타바이러스는 송아지에서 신생아 설사의 가장 흔한 원인이다. 로타바이러스 설사는 일반적으로 4일령 내지 3주령의 송아지에 영향을 준다. 송아지는 일반적으로 둔해지고 마시기를 꺼려한다. 4 내지 8일간 지속할 수 있는 질환 과정 동안에, 송아지 우울증, 탈수 및 2차 감염에 대해 상당한 위험이 있다. 송아지는 감소된 식욕을 갖고 침을 흘릴 수 있다. 사망율은 중재 없이는 50% 정도로 높을 수 있다.
가축 산업에 대한 송아지 설사의 경제적 영향은 매우 상당하고 큰 영향력을 발휘한다: 추가적 노동, 약물 소비 및 송아지 사망과 관련된 비용 뿐만 아니라, 영향받은 송아지의 불량한 장기 수행능과 관련된 잠재적인 경제적 영향력이 있다. 출산으로부터 21일까지의 송아지 이환율 80%는 설사 때문인 것으로 밝혀졌다.
소 로타바이러스는 레오비리대(Reoviridae) 과에 속하는 비-외피 이중-가닥 RNA 바이러스이다. 상기 비리온은 20면체 형태를 갖고 3중 단백질 캡시드 구조를 특징으로 한다. 상기 비리온의 직경은 약 80 나노미터인 것으로 기재되었다.
로타바이러스에 대한 어미(dams)의 백신 접종은 신생아 송아지에서 질환을 방지하고 설사를 예방하기 위한 효과적인 방법을 나타낸다. 송아지는 분만 1 내지 3개월 전 로타바이러스 감염에 대해 백신 접종된 어미로부터 초유를 공급받아야 한다.
소 헤르페스바이러스에 의한 소의 감염은 중증의 질환을 유도할 수 있다. 감염성 소 비기관염 (IBR)은 소 헤르페스바이러스-1(BHV-1 또는 BoHV-1)에 의해 유발되는 고도로 전염성의 감염성 호흡 질환이다. 소 헤르페스바이러스 5 (BHV-5 또는 BoHV-5)는 굴성에서 BoHV-1과는 상이하다: BoHV-5는 젊은 소에서 수막뇌염의 병인제이다. BoHV-1 및 BoHV-5는 바리셀로바이러스(Varicellovirus) 속 및 헤르페스비리대 과에 속하는 외피 이중-가닥 DNA 바이러스이다. 이들은 구형 내지 다형성 형태 및 150-200nm의 기재된 직경을 갖는다. 내부 단백질 캡시드는 162개 캡소머로 이루어지고 무정형 피막(tegument)에 의해 둘려싸여 있다.
IBR은 젊고 노령의 소에 영향을 미칠 수 있다. 호흡기 질환을 유발하는 것 뿐만 아니라 상기 바이러스는 결막염, 유산, 뇌염 및 일반화된 전신성 감염을 유발할 수 있다. IBR은 상부 호흡기의 급성 염증을 특징으로 한다. 제1 감염 후, 상기 바이러스는 결코 완전히 제거되지 않는다. 평생 잠복(숨겨진) 감염으로서 뇌의 신경 세포 뒤에 잔류하고 있다. 그러나, 스트레스 시에, 상기 바이러스는 다시 증식할 수 있고, 일반적으로 코 및 눈으로부터 다시 배설될 수 있다. 따라서, 감염된 동물은 결코 안전한 것으로 고려될 수 없다. 감염된 동물의 구매는 새로운 감염의 주요 원인이다. 바이러스에 의해 유발된 질환은 심각할 수 있고, 따라서, 국제 무역에 대한 장벽이다.
BHV-1은 산재해 있는 고도의 전염성 바이러스이기 때문에, 백신 접종은 통상적으로 약 4개월 내지 6개월령에서 수동 면역력이 송아지에서 상실되는 즉시 요구된다. IBR에 대한 현재 가용한 백신은 변형된-생-바이러스(MLV) 백신 및 불활성화되거나 사멸된-바이러스(KV) 백신을 포함한다.
소 파라인플루엔자-3(PI3)은 소 집단에서 고도의 전염성 호흡 질환이다. 상기 질환은 소 호흡 질환 합병증(BRD)과 관련된다.
단독의 PI3 바이러스(PIV-3)에 의한 감염은 단지 경미한 질환을 유발한다. 상기 임상적 징후는 열, 기침, 콧물 및 눈물 방출 및 증가된 호흡율 및 증가된 숨 소리를 포함한다. 감염은 소 바이러스 설사 및 감염성 소 비기관지염과 같은 다른 바이러스 질환의 이환율을 증가시킬 수 있다. PI3 감염의 영향은 2차 세균 폐렴과 커플링되는 경우 보다 상당하다.
파라인플루엔자-3 바이러스(PIV-3)는 파라믹소비리대 과내에 레스피로바이러스 속에 속하는 음성-가닥의 RNA 외피 바이러스이다. 상기 바이러스는 구형 형태 및 약 150nm의 기재된 직경을 갖는다.
백신 접종을 통한 예방은 파라인플루엔자-3의 임의의 큰 영향을 예방하기 위한 최상의 방법이다. 대부분의 PI3 백신은 예를 들어, 소 헤르페스바이러스-1(BHV-1)과 같은 다른 호흡기 바이러스와 조합된다. 상기 백신은 변형된 생 또는 불활성화된 형태로 가용하다.
광견병은 동물로부터 사람에게 전염되는 동물원성 질환이고 라브도비리대(Rhabdoviridae) 과내 리사바이러스(Lyssavirus) 속의 광견병 바이러스에 의해 유발된다. 상기 광견병 바이러스는 음성-가닥의 RNA 외피 바이러스이고 길이가 약 180nm이고 단면 직경이 약 75nm인 총알형 형태를 갖는다.
모든 포유 동물은 광견병 바이러스에 민감성인 것으로 사료된다. 애완용 개는 바이러스의 가장 흔한 병원소이고 95% 초과의 인간 사망은 개-매개된 광견병에 의해 유발된다.
광견병의 마비된 임상적 증상은 소, 돼지 및 말에서 가장 흔한 형태이다. 여우 또는 과쿤과 같은 감염된 야생 동물로부터의 물림은 소에서 통상적인 감염 방법이지만 상기 질환은 또한 열대 및 아열대 지역에서 흡혈성 박쥐, a.k.a. "뱀파이어"에 의해 전염된다. 이것은 해마다 수천마리의 소를 잃게 되는 동물 사육 및 정상적인 사육 작업 동안에 인간과 광견병에 걸린 소의 접촉 때문에 인간 보건에 심각한 위협이다.
남극 대륙을 제외하고는, 광견병은 모든 대륙에서 고질병이다. 연간 광견병으로 인해 발생하는 수만건의 사망 중에서 사례의 95%는 아시아 및 아프리카에서 보고되었다.
광견경은 100% 백신-예방될 수 있는 질환이다: 안전하고 효과적인 불활성화된 바이러스 백신은 개, 소 및 인간에 대해 가용하다. 노출 후 예방학적 백신 접종은 이전의 면역화를 갖지 않았던 개체를 치료하기 위해 요구된다.
지난 수십년에 걸쳐, 인간 및 수의사 보건 산업은 약제학적 및 생물약제학적 제품의 제조를 위한 우수한 제조 관행(GMP)과 관련하여 날로 엄중해지는 정부 규제를 목격하였다. 공정 분석학적 기술(PAT)과 같은 새로운 품질 개념이 생겨났고, 이에 대해 식약청은 중요 품질 속성(CQA)에 영향을 미치는 중요 공정 파라미터(CPP)의 측정을 통한 약제학적 제조 공정을 디자인하고 분석하고 관리하기 위한 메카니즘으로서 정의하고 있다. PAT는 최종 제품에 대한 최고 품질 표준을 성취하기 위한 수단으로서 제조 공정을 관리하는 중요성을 강조한다. PAT는 백신 산업에서 중간체 및 최종 제품의 품질 관리를 위해 특히 유용한 도구를 대표한다. 실제로, 박멸 프로그램의 일부로서 및 긴급 상황에서 통상적으로 사용되는 불활성화된 바이러스 백신의 효능은 각각의 투여형으로 제형화된 항원성 페이로드 및 바이러스 통합성에 크게 의존한다.
현재 기준으로, 중간체 공정 스트림에서 전체 바이러스 항원의 공정 품질 관리는 주로, 바이러스가 여전히 생존하는 경우 (불활성화 단계 전) 적정 검정의 수행능 또는 ELISA (효소-결합된 면역흡착 검정)와 같은 면역화학 방법 또는 단일 방사 면역확산(SRID) 시험 및 일부 경우에, 바이러스가 이미 불활성화된 경우 실시간 정량적 PCR에 의존한다.
ELISA 검출 키트는 통상적으로 인간 및 동물에 대한 둘다의 체액에서 질환 유발제의 검출을 위해 사용된다. ELISA 키트는 일반적으로 감염성 제제 자체가 아니라 감염성 제제에 대한 항체 반응을 검출하기 위해 디자인된다. ELISA 검출 검정이 일부 경우에 제조 공정 동안에 바이러스 항원의 모니터링 및 품질 관리를 위해사용되지만, 이들 검정은 사례 별로 개발되어야 하고 검정 조건이 모노클로날 또는 폴리클로날 항체와 같이, 키트에 사용되는 검출 시약에 의존하기 때문에 상이한 종류의 바이러스에 대해 표준화될 수 없다. 이는 SRID 검정에서도 동일하다.
더욱이, ELISA 방법은 단지 항체-항원 반응의 비색 적정법을 기준으로 바이러스 입자의 대략적 정량을 산출할 수 있다. 상기 결과는 샘플 및 샘플 매트릭스의 희석 인자에 의해 크게 영향을 받는다. 결과적으로, 상기 ELISA 검정은 상이한 제조 단계의 상이한 종류의 샘플에 순응되어야만 하고 공정 분석학적 기술(PAT)에 대한 유용한 도구로서 고려될 수 없다.
추가로, ELISA 검정 또는 정량적 PCR 방법은 방법 둘다가 전체 또는 붕괴된 바이러스 항원을 구분할 수 없기 때문에 바이러스 입자의 크기 및 구조적 통합성에 대한 임의의 정보를 산출하지 않는다. 바이러스 입자의 크기 및 구조적 통합성을 아는 것은 백신의 면역화 효능을 보장하는데 중요하다.
FMD 바이러스에 대해, 140S (146S) 정량적 슈크로스 밀도 구배 분석은 바텔링 및 멜론[문헌참조: Barteling and Meloen (Barteling SJ, Meloen RH. A simple method for the quantification of 140S particles of foot-and-mouth disease virus (FMDV). Arch Gesamte Virusforsch, 1974;45(4):362-4)]에 의해 개발되었고 바이러스 항원을 정량하고 이를 기준으로 백신을 제형화하기 위해 추천된 방법이다. 146S 방법의 원리는 슈크로스 구배에서 이들의 침강 계수를 기준으로 FMD 바이러스 입자를 분리시키는 것이다. 따라서, 상기 기술은 바이러스 입자의 통합성에 대한 간접적인 측정만을 제공한다.
다수의 국제적 노력은 방법을 표준화시키기 위해 시도되었지만, 아직 균일화된 프로토콜 또는 국제적 FMDV 표준이 아니다. 상기 방법의 기술적 복잡성 및 장비의 특수화된 항목의 필요성은 상기 상황에 기여할 수 있다(문헌참조: Barteling SJ. Need for further standardization of the 146- S test as the basis for final- Foot -and- Mouth Disease (FMD) Vaccine formulation. EUFMD Research Group Meeting 1999 - Appendix 17).
바이러스 백신에 존재하는 활성 성분을 측정하기 위한 표준화된 방법의 부재는 전형적으로 대형 동물(표적 종) 또는 연구 동물을 포함하는 고가이고 복잡한 임상 시험이 아직까지 바이러스 백신 및 배치 방출의 등록을 위해 요구되는지에 대한 이유를 설명하는 중요한 인자이다.
예를 들어, 광견경 백신의 경우에, NIH 효능 시험은 백신 배치의 효능 시험에 대한 참조 검정으로서 수십년에 걸쳐 사용되어 왔다. 상기 힘들고 고도로 복잡한 생체내 검정은 배치 당 150마리 마우스의 사용을 요구하고 마우스에 병원성 광견병 종을 두개내 챌린지시킴을 포함한다.
백신 및 생물약제학적 분자의 효능 관리 방법을 균일화시키고자 하는 현재 국제적 노력은 3R 원칙에 집중하고 있다: 사용된 동물 수의 감소; 대안적 기술을 사용한 동물의 대체 및 실험적 방식을 개선하여 확실하게 동물이 가능한 한 적게 앓게 한다.
백신 산업 및 특히 전체-크기 항원을 기준으로 하는 백신(불활성화된 바이러스 백신 또는 생 약독화된 바이러스 백신과 같은)을 위해, 나노미터(nm) 범위의 입자 크기를 확실히 정량하고 결정할 수 있는 방법 및 장비는 공정의 모든 단계에서 생성되는 바이러스 항원의 품질을 보장하기 위한 제조 과정내 관리 수단(in-process controls meant)의 수행을 위해 중요한 도구를 대표한다. 그럼에도 불구하고, 바이러스 입자를 함유하는 복잡한 공정 스트림의 분석은 모노클로날 항체(mAb)와 같은 통상의 재조합 단백질의 분석 보다 훨씬 어려운 작업이다. 하나의 챌린지는 많은 현재 백신에 대한 입자 제조 방법이 무혈청 배지 배양 기술이 생기기 수십년 전에 개발되었다는 것이다. 많은 제조 공정에서 사용되는 혈청 함유 배지는 매우 고함량의 단백질을 함유한다. 또한, 세포 배양물의 감염으로부터 수득된 바이러스 입자의 수율은 일반적으로 mAb와 같은 재조합 단백질의 발현과 비교하여 낮은 규모의 수개 정도인 리터당 mg의 정도이다. 또한 일부 바이러스가 세포의 파괴를 유발하는 용해 복제 사이클을 갖는다는 것은 매우 중요하다. 모든 게놈 물질, 및 세포막 기원의 지질 잔기를 포함하는 세포의 세포질 및 핵내에 함유된 모든 물질의 세포 배양 배지에서의 방출은 상기 분석을 보다 어렵게 한다.
크기 배제 크로마토그래피는 이들의 수력학적 용적을 기준으로 상이한 분자를 분리하기 때문에, 상이한 분자량이지만 유사한 수력학적 용적의 분자들은 크로마토그래피 전개 동안에 매우 유사한 이동성 거동을 보여주는 경향이 있다. 매우 복잡한 공정 스트림의 조건에서, 크기 배제 크로마토그래피는 통상적으로 DNA 및 대형 지질 잔기의 대형 분자와 같은 유사 수력학적 용적의 다른 공정 오염물로부터 목적하는 바이러스 입자의 피크를 분리하기에 충분히 양호한 분리능을 제공할 수 없다.
단백질 또는 바이러스-기반의 백신은 항원을 면역화를 위해 대상체에게 전달하기 위해 통상적으로 사용되는 백신 모델이다. 적당한 에피토프가 특이적이고 효과적인 면역 반응을 유도하기 위해 제공될 수 있도록, 전달되는 항원이 이의 올바르거나 천연 형태를 갖는 것이 매우 중요하다. 따라서, 잘못폴딩되거나, 분해되거나, 응집된 항원이 감소된 효능을 가질 수 있거나, 심지어 특이적 면역 반응을 유발할 수 없다. 역학적 광 산란(DLS)은 이들의 통합성 및 안정성 측면으로 단백질 또는 바이러스-기반 백신의 효능 평가를 돕는다. 통상의 기술자는 DLS 프로필을 분석함에 의해, 항원이 시간 경과에 따라 또는 특정 완충액 또는 온도에 저장시 분해되거나 응집되는지를 조사함으로써 백신의 효능을 보장할 수 있다.
단독으로 사용되는 경우, 크기-배제 크로마토그래피와 같은 분리 방법은 통상적으로 이동성 거동의 세밀한 조사에 의해 입자 크기의 대략적인 평가를 제공하지만 이들 평가는 항원 차원의 민감한 변형을 검출하기에 충분한 민감성이 아니다. 대조적으로, DLS는 민감하고 정확하게 입자의 크기를 검출하여 추산하고, 따라서 입자 크기에 대한 민감한 차이의 모니터링을 가능하게 한다. 그러나, DLS는 고순도 입자의 통합성만을 분석하고 이의 크기를 추산할 수 있다.
전세계적인 상기 가축 질환의 경제적 관련성으로 인해, 특히 개선된 백신 및/또는 이의 제조 방법에 관한 예방 도구는 계속 개선될 필요가 있다. 본 발명은 고속 처리 및 정확한 방식으로 외피 및 비-외피 바이러스, 및 RNA 및 DNA-기반 바이러스를 포함하는 바이러스, 및 관련 생성물의 정량 및 특징분석을 위한 방법을 제공한다. 가축 백신의 양 및 품질 둘다에 대한 요구가 커지면서, 본 발명은 매우 유용하고 바이러스 백신의 품질 관리를 위한 저렴한 도구를 제공한다.
일례로서 그리고 구제역 질환의 경우에, 세계에서 가장 큰 백신 시장인 중국 시장은 연간 17억 분량(각각 2밀리리터)을 요구한다. 백신의 하나의 평균 산업적 배치가 500만 분량(즉, 10000리터 배치)임을 고려하여, 이것은 FMD 백신의 대략 340개 배치가 상이한 제조업자에 의해 중국에서 매년 제조됨을 의미한다. 현재 시점에서 및 상기 거대한 수의 배치가 제조되기 때문에, 중국 가축 규제 기관은 FMD 백신의 품질을 관리하는 책임을 박탈당하여 각각의 백신 제조업자에 의한 품질 관리 시험의 수행능에 의존해야만 한다. FMD 백신의 품질 관리는 통상적으로 벌크 양의 백신 배치 품질의 평가를 가능하게 하지만 복잡하고 번잡한 과정을 요구하는 생체내 효능 시험을 사용하여 모니터링된다. 현재, 시기적으로 적절한 방식으로 상기 다량의 백신 배치의 품질 관리를 가능하게 할, 어떠한 다른 가용한 시험관내 기술이 없다.
본 발명은 처음으로 항원이 생약독화되거나 불활성화된 바이러스인지에 상관없이 고속 처리 방식으로 각각의 백신 배치에서 용량 당 항원 페이로드를 정량할 수 있고 바이러스 항원의 크기 및 통합성을 특징분석할 수 있는 시험관내 시스템을 도입한다. 본 발명은 바이러스 백신의 품질 관리를 위한 생체내 효능 시험 시스템에서 보다 훨씬 더 단순화된 시스템을 수행함으로써 생성물의 품질을 개선시킨다. 단지 몇일 이내에 340배치의 백신의 품질을 모니터링할 수 있는 것으로 추산된다.
따라서, 본 발명은 궁극적으로 백신의 우수한 품질을 보장하고 동물 및 인간 집단에 대한 가축 질환에 대해 우수한 보호를 부여한다.
발명의 간략한 요약
바이러스 질환(구제역 질환, 로타바이러스성 설사, 감염성 소 비강기관염, 소 포진성 뇌염, 소 호흡 질환(BRD) 합병증 및 광견병을 포함하지만 이에 제한되지 않는)을 예방하기 위한 현재 방법 및 제품을 개선하기 위해, 본 발명은 크로마토그래피 프로필의 분석을 위해 분자 배제 크로마토그래피 및 인-라인 역학적 광 산란 검출(DLS)을 조합적으로 사용함에 의한 바이러스의 정량 및 특징분석을 위한 방법을 도입한다. 본원에 기재된 방법은 고속 처리 및 정확도로 모든 바이러스를 정량하고 특징분석할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 지질 외피 및 비-외피 바이러스의 크기 및 통합성을 정량하고 특징분석하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 물질로서 리보핵산을 갖는 바이러스(RNA 바이러스) 또는 유전자 물질로서 데옥시리보핵산을 갖는 바이러스(DNA 바이러스)의 크기 및 통합성을 정량하고 특징분석하기 위한 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 일부 공정 오염물이 분자 배제 크로마토그래피만으로는 바이러스 입자로부터 분리될 수 없는 복합 공정 스트림에서 바이러스 입자를 정량하고 이들의 크기 및 통합성을 특징분석하기 위한 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 분자 배제 크로마토그래피 방법 및 역학적 광 산란 분석 전에 클로로포름과 같은 용매를 사용하는 가능한 용매 추출 단계 및 Benzonase® 또는 Turbo™ DNase와 같은 엔도뉴클레아제를 사용하는 엔도뉴클레아제 분해 단계를 포함하는 하나 이상의 샘플 제조 단계를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 입자를 함유하는 생성물로부터 바이러스 입자를 단리하고 정제하기 위한 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 구제역 질환, 로타바이러스 설사, 감염성 소 비강기관염, 소 포진성 뇌염, 소 호흡 질환(BRD) 합병증 및 광견병과 같은 바이러스 또는 가축 질환을 예방하기 위한 제품의 제형을 디자인하고 제조하기 위한 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 항원의 양 및 안정성과 같은, 바이러스 입자를 함유하는 제품의 평가 방법을 제공한다. 이들 제품은 상기 바이러스를 함유하는 항원 뱅크 및 백신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, 본 발명은 전체 백신 생산 공정 동안에 합성된 중간체 생성물에서 바이러스 항원의 양을 측정하고 이의 통합성 및 크기를 특징분석하기 위한 제조 과정 품질 관리 도구로서 작용하는 방법을 제공한다.
도 1a-1b는 정제된 01 Campos FMDV의 크로마토그래피 프로필의 하나의 양태를 보여준다. 도 1a는 254nm 하의 트랙킹된 크로마토그래피 프로필이고 도 1b는 역학적 광 산란(DLS)을 사용하여 트랙킹된 크로마토그래피 프로필이다.
도 2a-2b는 56℃에서 1시간동안 항온처리 및 Benzonase®를 사용한 후속적 분해 후 정제된 01 Campos FMDV의 크로마토그래피 프로필의 하나의 양태를 보여준다. 도 2a는 254nm 하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필이고 도 2b는 역학적 광 산란(DLS)을 사용하여 트랙킹된 크로마토그래피 프로필이다.
도 3a-3c는 PEG 침전에 의해 제조된 바이러스 농축물에서 FMDV 01 Campos 입자의 정량에 대한 클로로포름 추출 및 Benzonase® 분해 효과의 하나의 양태를 보여준다. 도 3a는 2개 샘플의 254nm 하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다: 1개의 샘플은 클로로포름 추출 및 Benzonase® 분해로 처리되었고 다른 1개의 샘플은 어떠한 처리도 하지 않았다. 도 3b는 클로로포름 추출로 이미 둘다 처리된 2개의 샘플의 254 nm하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다: 1개의 샘플은 Benzonase® 분해로 추가로 처리되고 다른 샘플은 Benzonase® 분해를 처리하지 않았다. 도 3c는 Benzonase® 분해로 이미 둘다 처리된 2개의 샘플의 254nm 하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다: 1개의 샘플은 클로로포름 추출로 추가로 처리하였고 다른 샘플은 클로로포름 추출로 처리하지 않았다.
도 4a-4d는 한외여과 농축(UF)에 의해 수득된 항원 농축물로부터 제조된 FMDV 종 01 Campos 항원의 일련의 희석물의 정량에 대한 하나의 양태를 보여준다. 도 4a는 한외여과(UF)에 의해 수득된 FMDV 항원 01 Campos 농축물의 254nm하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 4b는 5개의 시험된 FMDV 01 Campos 샘플로부터 수득된 U.V. 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다. 도 4c는 하나의 FMDV 01 Campos 샘플의 2개의 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다: 하나의 프로필은 U.V. 254 nm하에 트랙킹된 것이고 다른 프로필은 역학적 광 산란(DLS)를 사용한 것이다. 도 4d는 회귀선과 함께 희석 %에 대한 FMDV 01 Campos 바이러스 농도(㎍/mL) 및 바이러스 입자 크기(nm)의 플롯을 보여준다.
도 5a-5d는 한외여과 농축(UF)에 의해 수득된 항원 농축물로부터 제조된 소 로타바이러스 혈청형 G6 항원의 연속 희석물의 정량에 대한 하나의 양태를 보여준다. 도 5a는 한외여과(UF)에 의해 수득된 소 로타바이러스 G6 항원 농축물의 254nm 하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 5b는 5개의 시험된 소 로타바이러스 G6 샘플로부터 수득된 U.V. 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다. 도 5c는 하나의 소 로타바이러스 G6 샘플의 2개 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다: 하나의 프로필은 U.V. 254 nm하에 트랙킹하고 다른 프로필은 역학적 광 산란(DLS)을 사용한다. 도 5d는 회귀선과 함께 희석 %에 대한 로타바이러스 G6 바이러스 피크 면적 (mAU.mL) 및 바이러스 입자 크기(nm)의 플롯을 보여준다.
도 6a-6d는 한외여과 농축(UF)에 의해 수득된 항원 농축물로부터 제조된 BoHV-5 항원의 연속 희석물의 정량에 대한 하나의 양태를 보여준다. 도 6a는 한외여과(UF)에 의해 수득된 BoHV-5 항원 농축물의 254 nm 하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 6b는 5개의 시험된 BoHV-5 샘플로부터 수득된 U.V. 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다. 도 6c는 하나의 BoHV-5 샘플의 2개의 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다: 하나의 프로필은 U.V. 254 nm하에 트랙킹되고 다른 프로필은 역학적 광 산란(DLS)을 사용한다. 도 6d는 회귀선과 함께 희석물의 %에 대한 BoHV-5 바이러스 피크 면적(mAU.mL) 및 바이러스 입자 크기 (nm)의 플롯을 보여준다.
도 7a-7d는 한외여과 농축(UF)에 의해 수득된 항원 농축물로부터 제조된 PIV-3 항원의 연속 희석물의 정량에 대한 하나의 양태를 보여준다. 도 7a는 한외여과(UF)에 의해 수득된 PIV-3 항원 농축물의 254nm하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 7b는 5개의 시험된 PIV-3 샘플로부터 수득된 U.V. 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다. 도 7c는 하나의 PIV-3 샘플의 2개의 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다: 하나의 프로필은 U.V. 254 nm하에 트랙킹되고 다른 프로필은 역학적 광 산란(DLS)을 사용한다. 도 7d는 회귀선과 함께 희석물의 %에 대한 PIV-3 바이러스 피크 면적(mAU.mL) 및 바이러스 입자 크기(nm)의 플롯을 보여준다.
도 8a-8d는 한외여과 농축(UF)에 의해 수득된 항원 농축물로부터 제조된 광견병 바이러스 항원의 연속 희석물의 정량에 대한 하나의 양태를 보여준다. 도 8a는 한외여과(UF)에 의해 수득된 광견병 바이러스 항원 농축물의 254nm 하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 8b는 5개의 시험된 광견병 바이러스 샘플로부터 수득된 U.V. 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다. 도 8c는 하나의 광견병 바이러스 샘플의 2개의 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다: 하나의 프로필은 U.V. 254nm하에 트랙킹되고 다른 프로필은 역학적 광 산란(DLS)을 사용한다. 도 8d는 회귀선과 함께 희석물의 %에 대한 광견병 바이러스 피크 면적(mAU.mL) 및 바이러스 입자 크기(nm)의 플롯을 보여준다.
도 9는 2000 리터 세포 배양 생물반응기에서 FMD 01 Campos 바이러스 감염의 시간 과정 플롯을 보여준다. 이것은 감염 후 처음 8시간 동안에 바이러스 농도(㎍/mL), 세포 계수(106 세포/mL) 및 바이러스 입자의 크기(nm)에서의 변화를 보여준다.
도 10은 역학적 광 산란(DLS) 검출기 및 2개의 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 칼럼을 병행하여 작동시키는 칼럼-스위칭 시스템의 도식에 대한 하나의 양태를 보여준다. 좌측 및 우측 패널에 대한 셋업은 후방 및 전방으로 스위칭될 수 있다.
본 발명은 높은 고속 처리 및 높은 정확도로 바이러스의 정량 및 특징분석을 위한 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 지질 외피 및 비-외피 바이러스의 크기 및 통합성을 정량하고 특징분석한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 유전자 물질로서 리보핵산을 갖는 바이러스(RNA 바이러스) 또는 유전자 물질로서 데옥시리보핵산을 갖는 바이러스(DNA 바이러스)의 크기 및 통합성을 정량하고 특징분석한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 구제역 질환 바이러스(FMDV) (모든 혈청형: O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 및 Asial), 소 헤르페스바이러스 5 (BoHV-5), 소 헤르페스바이러스 1 (BoHV-1), 파라인플루엔자 3 바이러스 (PIV-3), 소 로타바이러스, 예를 들어, 혈청형 G6 및 G10, 광견병 바이러스, 소 바이러스 설사 바이러스 1 및 2 (BVDV-1 및 BVDV-2), 소 호흡 신시티알 바이러스(BRSV), 돼지 시르코바이러스 2 (PCV-2), 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스(PRRSV), 돼지 파르보바이러스 (PPV) 및 블루텅 바이러스 (BTV)를 포함하지만 이에 제한되지 않은 바이러스를 정량하고 특징분석한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 문헌, 공개 도메인 또는 웹사이트[예를 들어, the report or "Virus Taxonomy" released by the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV)]에 열거된 임의의 바이러스에 적용할 수 있다. 이들 공개 내용은 본원에 참조로 인용한다.
250 내지 280nm에서 UV 흡수 및 역학적 광 산란(DLS) 검출기를 수단으로 수행되는 분자 배제 크로마토그래피 및 크로마토그래피 프로필 분석과 함께 임의의 용매 추출 및 엔도뉴클레아제 분해의 2개 샘플 제조 단계의 조합된 용도를 사용하여, 본 발명의 방법은 백신의 제조 방법의 모든 단계에서 외피 및 비-외피 바이러스 둘다에 대한 바이러스 입자의 통합성 및 크기의 정량 및 특징분석을 위한 예상치 않게 개선된 방법을 제공한다.
샘플 제조 단계의 선택은 바이러스 유형에 의존한다. FMDV 및 소 로타바이러스와 같은 비-외피 바이러스에 대한 하나의 양태에서, 용매 추출 단계는 오염 대형 지질 잔기를 제거하기 위해 매우 유용하다. BoHV-5, PIV-3 및 광견병 바이러스와 같은 지질-외피 바이러스에 대한 또 다른 양태에서, 용매 추출 단계는 이것이 이들 바이러스의 지질 외피를 파괴하고 결과적으로 바이러스 입자를 파괴하기 때문에 수행될 수 없다.
2개의 샘플 제조 단계는 분자의 분리를 촉진시키고 매우 복잡한 공정 스트림을 포함하는 세포 공급원으로부터의 바이러스 입자의 고속 처리 정량 및 특징분석을 가능하게 한다. 단독의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 이들 복잡한 공정에서 나타나는 대형 DNA 분자 또는 대형 지질 잔기와 같은 오염물로부터 바이러스 입자를 분리할 수 없는데, 그 이유는 이들 오염물이 상기 바이러스 입자의 용적과 유사한 수력학적 용적을 갖기 때문이다. 또한, 본 발명의 방법은 바이러스 항원의 특징분석을 위해 단독의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하는 것 보다 유리한데, 그 이유는 후자가 크로마토그래피 칼럼 기원의 용출 용적을 기준으로 크기의 간접적이고 대략적인 추산만을 제공할 수 있기 때문이다.
본 발명의 방법은 바이러스 항원의 농도 및 품질 둘다의 신속하고 정확한 평가를 가능하게 하고, 여기서, 상기 품질은 바이러스 입자의 구조적 통합성 및 크기를 기준으로 정의된다. 역학적 광 산란(DLS)에 의한 정밀하고 정확한 측정을 사용하여, 본원에 기재된 방법은 바이러스 항원의 통합성 및 크기의 보다 정확한 추산 및 직접적인 조절을 가능하게 한다.
단백질 분자, 단백질 단편 및 응집체의 매질의 내부 용적으로의 부분적 접근을 가능하게 하는 공극 크기의 크로마토그래피 매질로 팩킹된 보정된 SEC 칼럼은 생물약제학적 제제 및 제품에서 고도로 정제된 단백질 또는 펩타이드의 중합 및 분자 단편화를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, DLS는 고순도를 갖는 입자의 통합성 및 크기를 분석하기 위해서만 사용될 수 있다. 이들 기술은 보다 복잡한 단백질 용액에서 또는 DNA 또는 지질 분자와 같은 다른 종류의 오염물을 함유하는 조악한 공정 중간체에 고속 처리 포맷으로 용이하게 적용될 수 없다. 짧은 크로마토그래피 전개에서 SEC의 제한된 분리능은 용액에서 상이한 종의 피크의 충분한 분리를 가능하게 하지 않고 따라서 상이한 분자 크기의 우수한 특징분석을 가능하게 하지 않는다. 본 발명은 바이러스 입자 또는 백신의 전체 제조 공정 동안에 모든 종류의 샘플, 및 다른 공급원 또는 공정으로부터의 샘플에 성공적으로 적용될 수 있다. 실시예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: a) 바이러스 농도가 매우 낮고 공정 오염물(예를 들어, 소 혈청 기원의 단백질, 용해된 세포 기원의 단백질, 세포막 파괴로 인해 방출된 세포 DNA 및 지질 잔기) 수준이 매우 높은 생물반응기에서 배양된 세포의 감염 동안에 (실시예 7 참조); b) 농도 인자가 150X 이상 정도로 높을 수 있는 항원의 농축 후(실시예 5-6 참조); c) 각각의 백신 용량의 적당한 페이로드를 결정하기 위한 최종 백신의 제형화 전 및 d) 유중수 에멀젼 (W/O) 또는 수중유중수의 이중 에멀젼 (W/O/W)으로서 제형화된 백신의 경우에서도 최종 제형화된 생성물에 대해. 본 발명에 기재된 정량 및 특징분석 기술은 매우 복잡하고 조악한 공정으로부터 취해진 중간체 샘플, 및 동일한 효능, 정확도 및 고속 처리를 사용한 고도로 정제된 바이러스 참조물에 적용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 하루 당 바이러스 입자의 약 60 내지 약 70개 샘플의 정량 및 품질(예를 들어, 통합성 및 크기) 둘다의 분석을 가능하게 하고, 상당히 보다 높은 고속 처리는 FPLC 장비에 대한 하나의 샘플 전개 지속 시간(예를 들어, 3시간)으로 인한 시간 제한 때문에 신속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)와 같은 다른 기술을 사용하는 경우에는 수득할 수 없다. 따라서, FLPC 장비의 사용은 하루 작업 당 최대 4개 샘플의 프로세싱을 가능하게 한다. 한편, 예를 들어, FMD 바이러스에 대한 통상의 146S 기술은 단지 하루 작업 당 최대 12개 샘플의 분석을 가능하게 한다.
본 발명의 방법은 선행 기술과는 매우 상당히 상이한데, 그 이유는 이것이 조악한 중간체 및 정제된 바이러스 샘플을 포함하는 모든 종류의 공정으로부터 제조된 샘플에 성공적으로 적용될 수 있기 때문이고, 미지의 바이러스 입자의 통합성 및 크기의 직접적인 평가를 제공하고 고속 처리 포맷으로 전개될 수 있는 인-라인 DLS 검출기를 포함하기 때문이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 고속 샘플 처리를 추가로 성취하기 위해 본 발명의 방법 또는 다른 적용가능한 방법을 조합하여 사용될 수 있는 멀티-칼럼 스위칭 메카니즘을 제공한다(실시예 8 참조). 하나의 양태에서, 본 발명은 고속 처리 분석을 위해 동시에 멀티 칼럼 및 DLS 검출기를 전개할 수 있는 칼럼-스위칭 시스템을 제공한다. 반대로, FPLC의 경우에 상기 동일한 기술을 실행할 수 없는데 그 이유는 FPLC가 통상적으로 전개의 지속 시간, 예를 들어, 전개 당 3시간을 포함하기 때문이다.
특히, 항원의 중요한 에피토프와 관련하여 3-차원 구조에서의 임의의 변화는 항원의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 고민감성으로 항원의 특징분석을 가능하게 하는데, 그 이유는 이것이 정량되는 바이러스 항원 입자의 직경에서의 작은 변화를 검출 가능하게 하기 때문인 반면, 상기 작은 변화는 단독의 ELISA 또는 SRID, 슈크로스 농도 구배 146S 기술, 정량적 PCR 또는 크로마토그래피와 같은 다른 기술로 전체적으로 검출될 수 없다. 따라서, 본 발명은 항원 크기에서의 작은 변형을 검출할 수 있고 항원 품질의 특징분석을 위한 상당한 개선을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 구제역 질환 바이러스 (FMDV), 소 헤르페스바이러스 5 (BoHV-5), 파라인플루엔자 3 바이러스 (PIV-3), 소 로타바이러스 및 광견병 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 전체 바이러스를 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 정량하고 특징분석하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 구제역 질환 바이러스 (FMDV), 소 헤르페스바이러스 5 (BoHV-5), 파라인플루엔자 3 바이러스 (PIV-3), 소 로타바이러스 또는 광견병 바이러스와 같은 바이러스를 함유하는 샘플을 크로마토그래피 칼럼으로 주사하고, 상기 샘플을 용출시키고, 미리 결정된 용출 시간 범위에서 크로마토그래피 프로필을 분석하고, 바이러스 입자의 양, 통합성 및 크기를 결정함을 포함한다.
하나의 양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 분자 배제 크로마토그래피 칼럼이다.
하나의 양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 크기가 10 내지 200nm 이상 범위이고 분자량이 105 내지 109 돌턴 이상의 범위인 입자를 분리하기 위해 디자인한다.
하나의 양태에서, 표적 바이러스에 대한 미리 결정된 용출 시간 범위는 정제된 바이러스 입자의 참조 또는 표준 샘플의 크로마토그래피 전개에 의해 결정된다.
하나의 양태에서, 본원에 기재된 방법은 현재 기술에 의해 달성되는 것 보다 광범위한 농도 범위 즉, 5 내지 70 μg/mL 또는 3 내지 300 μg/mL의 바이러스 항원 또는 입자를 정량할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 1.2 내지 750 μg/mL 농도 내 바이러스 항원 또는 입자를 정량할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 750 μg/mL 초과의 바이러스 항원 또는 입자를 정량할 수 있다.
하나의 양태에서, 본원에 기재된 방법은 바이러스 입자의 농도와는 별개로 바이러스 항원 또는 입자의 크기 및 통합성을 큰 정확도로 특징분석할 수 있다. 인-라인 DLS를 사용한 하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 농도 범위가 1.2 내지 750 μg/mL 범위의 농도를 갖는 FMDV 샘플 크기를 정확하게 측정할 수 있고, 상기 측정은 FMDV 항원의 농도와는 무관하다(실시예 5 및 7 참조). 이들 결과는 상기 넓은 농도 범위에 대한 인-라인 DLS에 의한 FMD 바이러스의 정확한 크기 및 통합성 특징분석을 처음 보고한 것이다.
하기와 같은 실시예에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 방법은 재생성, 특이성, 선형성, 정확도, 정밀도 및 강도와 관련하여 비-외피 바이러스 FMD 바이러스에 대해 완전히 확인되었다(실시예 5 및 7 참조). 이것은 또한 정량된 입자의 통합성 및 크기를 인-라인으로 특징분석하는 바이러스 입자의 정량을 위해 가용한 제1 입증된 시험관내 기술을 나타낸다. 바이러스는 정제되거나 조악하게 정제된 샘플에서 대부분의 성분과 비교하여 큰 크기를 갖기 때문에, 바이러스는 통상의 SEC 기술을 사용하는 샘플에서 저분자량의 성분으로부터 분리될 수 있고 사용되는 크기 배제 칼럼의 유형에 따라 칼럼의 배제 용적(또는 보이드(void) 용적) 또는 이와 매우 유사한 용적으로 용출된다. 그러나, 대형 DNA 분자 또는 지질 잔기와 같은, 일부 고분자량의 성분들은 이들 분자들이 바이러스 입자와 비교하여 매우 유사한 수력학적 용적을 갖기 때문에 단독의 SEC에 의해 분리될 수 없다. 추가로, SEC 또는 유사 기술은 크기가 약간 상이한 바이러스를 구분할 수 없다. 이것은 대부분의 바이러스가 SEC의 공극으로부터 거의 배제되고 칼럼을 바로 통과하기 때문이다. 상이한 크기를 갖는 바이러스의 용출 용적은 매우 유사할 수 있다. 오프라인 DLS는 이의 결과가 다분산성에 의해 강하게 영향받기 때문에 바이러스 입자 크기를 확인시켜 주기 위해 제한된 값을 갖는다. 샘플에서 보다 크고 작은 입자의 존재는 상기 결과에 큰 영향을 줄 수 있다. 한편, DLS와 SEC-HPLC의 조합된 용도는 다른 샘플 성분에 의해 방해 받지 않는 직접적인 입자 크기 측정을 하기 위해 크로마토그래피 피크의 고순도에 의존하고; 상기 크기 측정은 크로마토그래피 이동성으로부터 추론될 수 없다.
하나의 양태에서, 크로마토그래피 프로필 분석은 250 내지 280 nm에서 UV 흡광도 및 역학적 광 산란(DLS) 검출기를 사용하여 수행된다. 또 다른 양태에서, 크로마토그래피 프로필 분석은 인-라인 역학적 광 산란(DLS) 검출기에 의해 수행된다. 본 발명의 방법은 전체 크기 배제 크로마토그래피 프로필의 실시간 분석을 가능하게 함으로써 바이러스 항원의 농도 및 품질 둘다의 신속하고 정확한 평가를 가능하게 하는 인-라인 역학적 광 산란 검출기를 특징으로 한다.
하나의 양태에서, 바이러스 샘플의 크로마토그래피 프로필 분석은 통합 바이러스 입자의 미리 결정된 크기 분포와 비교함에 의해 수행된다. 정제된 바이러스를 함유하는 참조 또는 표준 샘플은 크로마토그래피 및 인-라인 DLS 분석에 의해 분석함으로써 각각의 바이러스 종의 크기를 분리하고 바이러스 입자의 미리 결정된 크기 분포를 생성한다.
하나의 양태에서, 정제된 샘플의 크로마토그래피 프로필 분석은 붕해된 바이러스 단편으로부터 전체 통합 바이러스 입자의 구분을 가능하게 한다. 예를 들어, FMDV의 경우에, 본 발명의 방법은 12S 입자 또는 캅소머와 같은 붕해된 단편으로부터 전체 FMDV 입자의 구분을 가능하게 한다.
또 다른 양태에서, 크로마토그래피 프로필 분석은 동일한 바이러스 및 종의 참조 샘플(들)과 비교하여 샘플내에서 구제역 질환 바이러스 (FMDV), 소 헤르페스바이러스 5 (BoHV-5), 파라인플루엔자 3 바이러스 (PIV-3), 소 로타바이러스 또는 광견병 바이러스와 같은 바이러스 입자의 크기 편차의 검출을 가능하게 한다.
하나의 양태에서, 크로마토그래피 프로필 분석은 하루 작업 당 57개 이하의 샘플의 구제역 질환 바이러스 (FMDV), 소 헤르페스 바이러스 5 (BoHV-5), 파라인플루엔자 3 바이러스 (PIV-3), 소 로타바이러스 및 광견병 바이러스 입자와 같은 바이러스의 크기 및 통합성의 정량 및 특징분석을 가능하게 한다. 하나의 양태에서, 크로마토그래피 프로필 분석은 하루 작업 당 72개 이하의 샘플의 구제역 질환 바이러스 (FMDV), 소 헤르페스바이러스 5 (BoHV-5), 파라인플루엔자 3 바이러스 (PIV-3), 소 로타바이러스 및 광견병 바이러스 입자의 정량 및 특징분석을 가능하게 한다.
하나의 양태에서, FMDV 샘플은 FMDV 감염된 세포 배양물의 상등액, 백신 제조 공정으로부터의 중간 생성물, 항원 배치 또는 뱅크, 백신, 1가 백신 배치 또는 다가 백신 배치를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, 소 로타바이러스 샘플은 로타바이러스 감염된 세포 배양물의 상등액, 백신 제조 공정으로부터의 중간 생성물, 항원 배치 또는 뱅크, 백신, 1가 백신 배치 또는 다가 백신 배치를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, BoHV-5 샘플은 BoHV-5 감염된 세포 배양물의 상등액, 백신 제조 공정으로부터의 중간체 생성물, 항원 배치 또는 뱅크, 백신, 1가 백신 배치 또는 다가 백신 배치를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, PIV-3 샘플은 PIV-3 감염된 세포 배양물의 상등액, 백신 제조 공정으로부터 중간체 생성물, 항원 배치 또는 뱅크, 백신, 1가 백신 배치 또는 다가 백신 배치를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, 광견병 바이러스 샘플은 광견병 감염된 세포 배양물의 상등액, 백신 제조 공정으로부터 중간체 생성물, 항원 배치 또는 뱅크, 백신, 1가 백신 배치 또는 다가 백신 배치를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, FMDV 또는 소 로타바이러스와 같은 비-외피 바이러스 샘플 은 임의로 크로마토그래피 칼럼으로의 주사 전에 용매로 전처리한다. 하나의 양태에서, 본원에 사용된 용매는 비-극성 또는 지용성 용매이고, 이는 클로로포름, 벤젠, 톨루엔, 헥산, 펜탄 및 옥탄을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 양태에서, 본원에 사용된 용매는 극성 유기 용매이고, 이는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 디클로로메탄, 아세톤 및 아세토니트릴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 양태에서, 용매의 하나 이상의 유형은 상기 샘플을 전처리하기 위해 함께 사용된다.
하나의 양태에서, 외피 또는 비-외피 바이러스 샘플은 크로마토그래피 칼럼으로의 주사 전에 하나 이상의 효소로 전처리한다. 하나의 양태에서, 상기 효소는 뉴클레아제이고 이는 DNase, RNase, 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 및 제한 엔도뉴클레아제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 양태에서, 상기 효소는 Benzonase®, TURBO™ DNase, T7 엔도뉴클레아제, S1-뉴클레아제, P1-뉴클레아제, 및 엔도뉴클레아제 I이다. 뉴클레아제는 대형 DNA 분자를, 후속적으로 크로마토그래피 칼럼에 의해 분리될 수 있는 보다 작은 DNA 분자로 절단한다.
또 다른 양태에서, 1가 백신 또는 다가 백신은 뉴클레아제를 사용한 임의의 처리 전에 보조제를 제거하기 위해 전처리한다.
하나의 양태에서, 각각의 유형 또는 종에 대한 참조 또는 표준 샘플(들)은 포유동물 세포 배양물을 바이러스로 감염시키고, 상기 생성된 바이러스를 화학제로 불활성화시키고, 슈크로스 농도 구배에 대한 한외원심분리, 한외여과, 이온 교환 크로마토그래피 또는 분자 배제 크로마토그래피 중 하나 이상에 의해 제조된다.
또 다른 양태에서, 정제된 바이러스의 참조 또는 표준 샘플은 동일한 바이러스를 함유하는 참조 백신으로부터 보조제를 제거함에 의해 제조된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 바이러스 입자를 함유하는 생성물로부터 바이러스 입자를 단리하고 정제하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 바이러스 백신의 제조 공정의 모든 단계에서 생성되는, 구제역 질환 바이러스 (FMDV), 소 헤르페스바이러스 5 (BoHV-5), 파라인플루엔자 3 바이러스 (PIV-3), 소 로타바이러스 및 광견병 바이러스 항원들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 바이러스 항원들의 정량 및 이들의 통합성 및 크기를 특징분석함을 결정하기 위한 제조 과정의 품질 관리 방법을 제공한다. 크기 배제 크로마토그래피 및 인-라인 DLS 검출의 조합된 용도와 함께, 본 발명은 또한 바이러스 항원의 제조 공정 동안에 감염 역학을 모니터링하기 위한 도구를 제공한다(실시예 7 참조). 생 바이러스의 양 및 품질관리(예를 들어, 통합성 및 크기) 둘다를 조사함에 의해 본 발명은 수의과용 백신의 제조에서 최고 품질 표준인 국제 지침서 PAT(Process Analytical Technologies)에 따라 고수준의 제조 과정 제어를 가능하게 한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 특이적 바이러스 생성물이 다른 바이러스에 의해 오염되어 있는지의 여부를 검출할 수 있다. 때로는, 외피 또는 비-외피 바이러스의 생산을 위해 사용되는 세포는 세포 배양물 기질에서도 번식할 수 있는 다른 상이한 바이러스 또는 병원체에 의해 오염될 수 있다. 단독의 SEC는 대부분의 바이러스가 크기가 크고 따라서 목적하는 특이적 바이러스 및 오염 바이러스 둘다가 칼럼의 배출 용적으로 용출되기 때문에 오염 바이러스를 제거하거나 심지어 검출할 수도 없다. 대조적으로, 본 발명은 DLS 프로필을 분석함에 의해 특이적 목적하는 바이러스와는 상이한 크기를 갖는 오염 바이러스 또는 다른 병원체의 존재를 검출할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 특이적 바이러스 보다 큰 바이러스는 피크에서 분산 광 강도 및/또는 Z-평균에서 증가를 유도할 것이다. 또한, 오염되고 비-오염된 샘플의 DLS 프로필을 비교함에 의해 오염 정도를 신속하게 평가할 수 있다. 도 4 내지 8에서 설명된 바와 같이, 본원에서 각각 시험된 5개의 바이러스는 자신의 특징적인 U.V. 및 DLS 프로필을 갖고, 이는 본 발명이 상이한 유형의 바이러스 또는 병원체를 민감하게 구분할 수 있음을 지적한다. 따라서, 본 발명은 샘플이 크로마토그래피 프로필을 수득케하거나 정상적인 프로필로부터 이탈된 판독값을 유도하는 다른 바이러스, 병원체 또는 다른 오염물과 같은 다른 분자에 의해 오염되었는지를 결정할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 U.V. 및 DLS 프로필을 비교함에 의해 상당한 변화가 바이러스 백신 또는 생성물의 다양한 배치 간에 존재하는지를 평가하기 위해 사용된다. 일정 세트의 U.V. 및 DLS 프로필은 상기 공정 스트림이 정상이고 생성물의 품질이 유지되는지를 지적한다. U.V. 또는 DLS 프로필에서의 임의의 검출가능한 차이는 정상의 공정 스트림 또는 가능한 오염으로부터의 오차 또는 편차를 지적할 수 있다. 이것은 궁극적으로 제품의 일정한 품질 및 효능을 확신하기 위해 보다 우수한 품질 관리를 제공한다.
또 다른 양태에서, 바이러스 항원의 안정성을 결정함에 의해 바이러스 항원-함유 제품을 평가하기 위한 방법이 제공된다. 상기 평가 방법은 바이러스 항원의 안정성을 측정하기 위해 2개의 시점 동안에 본 발명의 벙법 및 샘플에서 나타난 변화의 정량 및 바이러스 입자의 크기 및/또는 통합성에서의 편차에 의해 2개의 상이한 시점에서 샘플 중에 바이러스 입자의 통합성 및 크기의 정량 및 특징분석을 포함한다. 본 발명의 방법은 또한 상이한 온도에서 저장되거나 상이한 완충액 중에 또는 상이한 보조제와 함께 제형화된 바이러스 입자를 특징분석하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 FMDV에 의해 유발된 구제역 질환, 소 로타바이러스 G6 또는 G10에 의해 유발된 신생아 송아지 설사, BoHV-1에 의해 유발되는 감염성 소 비강기관염, BoHV-5에 의해 유발된 소 포진성 뇌염, PIV-3에 의해 유발된 호흡 질환 및 광견병 바이러스에 의해 유발된 광견병과 같은 질환에 대한 1가 또는 다가 백신을 평가하고 제조하기 위한 방법을 제공한다. 본원에 기재된 방법을 사용함에 의해, 용량 당 항원성 페이로드의 정량, 및 백신 중에 제형화된 항원의 통합성 및 크기의 특징분석이 수행될 수 있다.
본원에 기재된 모든 방법 및 시스템은 바이러스가 공지되거나 공지되어 있지 않거나 바이러스가 정제되거나 다른 분자로 오염되어 있는지에 상관없이 바이러스의 모든 유형, 아유형 또는 종에 적용될 수 있는 것으로 주지되어야 한다. 본원에 제공된 5개의 바이러스에 대한 기재 및 예는 본 발명의 기술적 효과 및 이점을 보여주기 위한 설명적 목적을 위한 것이고 청구된 바와 같은 발명을 제한하는 것으로 의미하지 않는다. 통상의 기술자는 정량 및 특징분석의 특정 필요성에 충족하기 위해 본원에 따른 본 발명의 방법 및 시스템을 조정할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 바이러스 또는 바이러스 입자의 하나 이상의 유형의 정량 및 특징분석을 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 상기 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함하는 표본을 하나 이상의 효소로 처리하여 다수의 바이러스 샘플을 수득하는 단계; (b) 제1 바이러스 샘플을 다수의 펌프 및 다수의 크로마토그래피 칼럼을 포함하는 크로마토그래피 시스템에 적용하는 단계로서, 여기서, (i) 제1 펌프는 제1 밸브를 통해 제1 크로마토그래피 칼럼에 연결되어 있고, 상기 제1 칼럼은 제2 밸브를 통해 역학적 광 산란(DLS) 검출기 및 UV 검출기를 포함하는 검출 시스템에 추가로 연결되어 있고; (ii) 제2 펌프는 상기 제1 밸브를 통해 제2 크로마토그래피 칼럼에 연결되어 있고, 상기 제2 칼럼은 상기 제2 밸브를 통해 폐기물 수집기에 추가로 연결되어 있고, 여기서, 상기 제1 바이러스 샘플은 제1 칼럼을 통해 전개하고, 세척 완충액은 상기 제2 칼럼을 통해 전개하는, 단계; (c) 상기 제1 바이러스 샘플을 상기 제1 칼럼으로부터 용출시키고 상기 검출 시스템에 의해 상기 제1 바이러스 샘플의 정량 및 특징분석을 위한 크로마토그래피 프로필을 수득하는 단계; (d) 상기 제1 및 제2 펌프에 대한 연결체를 스위칭하여 (i) 상기 제1 펌프가 현재 상기 제1 밸브를 통해 상기 제2 칼럼에 연결되고, 상기 제2 칼럼은 상기 제2 밸브를 통해 상기 검출 시스템에 추가로 연결되고; (ii) 상기 제2 펌프가 현재 상기 제1 밸브를 통해 상기 제1 칼럼에 연결되고, 상기 제1 칼럼은 상기 제2 밸브를 통해 폐기물 수집기에 추가로 연결되어 있도록 하는, 단계; (e) 세척 완충액을 제1 칼럼에 적용하면서 제2 바이러스 샘플을 상기 제2 칼럼에 적용하는 단계; (f) 상기 제2 바이러스 샘플을 상기 제2 칼럼으로부터 용출시키고 상기 검출 시스템에 의해 상기 제2 바이러스 샘플의 정량 및 특징분석을 위한 크로마토그래피 프로필을 수득하는 단계; 및 (g) (b) 내지 (f) 단계를 반복하여 상기 다수의 바이러스 샘플의 정량 및 특징분석을 수득하는 단계를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 바이러스 또는 바이러스 입자는 외피 바이러스, 비-외피 바이러스, DNA 바이러스, RNA 바이러스, 생 바이러스, 생-약독화된 바이러스, 불활성화된 바이러스, 재조합 바이러스, 바이러스 벡터 또는 바이러스형 입자이다. 하나의 양태에서, 상기 바이러스는 구제역 질환 바이러스(FMDV), 소 헤르페스바이러스 5 (BoHV-5), 소 헤르페스바이러스 1 (BoHV-1), 파라인플루엔자 3 바이러스 (PIV-3), 소 로타바이러스, 광견병 바이러스, 소 바이러스 설사 바이러스, 소 호흡 신시티알 바이러스 (BRSV), 돼지 시르코바이러스 2 (PCV-2), 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV), 돼지 파르보바이러스 (PPV) 또는 블루텅 바이러스(BTV)이다.
하나의 양태에서, 제1 및 제2 바이러스 샘플은 동일한 유형의 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함한다. 또 다른 양태에서, 제1 바이러스 샘플은 제2 바이러스 샘플의 것들과는 상이한 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 표본은 바이러스-감염된 세포 배양물의 상등액, 백신 제조 공정으로부터의 중간체 생성물, 항원 배치 또는 뱅크, 백신, 1가 백신 배치 또는 다가 백신 배치이다.
하나의 양태에서, 상기 방법에 사용되는 효소는 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 제한 효소, DNase 또는 RNase이다.
하나의 양태에서, 단계 (a)에서 하나 이상의 효소를 사용한 처리는 상기 바이러스의 정량 및 특징분석을 방해하는 분자를 제거한다. 또 다른 양태에서, 상기 표본은 단계 (a)에서 상기 하나 이상의 효소를 사용한 처리 전후 용매 중에서 처리한다. 예를 들어, 상기 용매는 클로로포름, 벤젠, 톨루엔, 헥산, 펜탄 또는 옥탄과 같은 비극성 용매이다.
하나의 양태에서, 상기 크로마토그래피 시스템은 2개의 크로마토그래피 칼럼을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 크로마토그래피 시스템은 3개의 크로마토그래피 칼럼을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 크로마토그래피 시스템은 상기 바이러스 샘플을 크로마토그래피 칼럼으로 주입하기 위한 자동 샘플 채취기를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 크로마토그래피 시스템은 크로마토그래피 시스템의 다수의 성분들의 기능을 통합하고 제어하기 위한 하나 이상의 시스템을 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 바이러스의 상기 정량 및 특징분석은 상기 바이러스 또는 바이러스 입자의 크기 및 통합성을 결정함을 포함한다. 하나의 양태에서, 크로마토그래피 프로필은 정제된 바이러스의 참조 샘플로부터 유래된 크로마토그래피 프로필과 비교하거나 전체 통합성 바이러스 입자로부터 유래된 크로마토그래피 프로필과 비교하여 붕괴된 바이러스 단편으로부터 전체 통합성 바이러스 입자의 구분을 가능하게 한다.
하나의 양태에서, 크기가 10 내지 200nm 범위이고 분자량이 105 내지 109 돌턴 범위인 입자를 분리하도록 디자인한다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 하루 약 60 내지 70개 샘플까지의 크로마토그래피 프로필을 분석할 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 크로마토그래피 칼럼으로부터 용출됨에 따라 대형 DNA 분자, 지질 분자 및 유사 용출 용적을 갖는 바이러스 입자를 분리한다. 하나의 양태에서, 바이러스의 정량은 상기 바이러스 샘플에서 바이러스의 농도와는 무관하다.
하나의 양태에서, 샘플에 존재하는 FMDV 입자의 농도는 약 1.2 내자 약 750 μg/mL이다.
본 발명은 또한 바이러스 입자를 함유하는 샘플의 고속 처리 정량 및 특징분석을 위한 시스템을 제공하고, 이는 샘플 주사를 위한 자동 샘플 채취기; 바이러스 입자를 분리하기 위한 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼(여기서, 상기 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 동일한 유형이거나 상이한 유형이다); 상기 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼을 구동시키기 위한 2개 이상의 펌프; 용출된 바이러스 입자의 크로마토그래피 프로필을 생성하고 상기 용출된 바이러스 입자의 양을 결정하기 위한 적어도 하나의 자외선 검출기; 상기 용출된 바이러스 입자의 크기 및 통합성을 결정하기 위한 적어도 하나의 동력학적 광 산란(DLS) 검출기; 크로마토그래피 칼럼으로부터 용출된 액체를 수거하기 위한 폐기물 수집기; 및 상기 시스템의 다수의 성분들을 연결하기 위해 2개 이상의 밸브를 포함하는 다중-밸브 어레이를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 시스템은 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼 각각으로부터 후속적으로 용출된 외피 및 비-외피 바이러스 입자를 포함하는 바이러스 입자의 크로마토그래피 프로필을 분석하여 고속 처리 및 실시간 방식으로 바이러스 입자의 양, 크기 및 통합성을 결정한다. 또 다른 양태에서, 상기 시스템은 상기 시스템의 다수의 성분들의 기능을 통합하고 제어하기 위한 하나 이상의 제어 시스템을 추가로 포함한다.
본 발명은 하기의 실험 세부 사항을 참조로 보다 잘 이해될 것이지만, 당업자는 세부적인 특정 실험이 단지 설명을 목적으로 하고 이후 이어지는 특허청구범위에 의해 한정되는 본원에 기재된 바와 같은 발명을 제한하는 것으로 의미되지 않는다.
본원 전반에 걸쳐, 다양한 참조문헌 또는 공보가 인용된다. 이들의 전문이 참조문헌 또는 공보의 기재는 본 발명이 속하는 기술 분야를 보다 완전하게 설명하기 위해 본원에 참조로 인용된다. 변형 용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)", "함유하는" 또는 "을 특징으로 하는"과 동의어이고 포괄적이거나 말단 개방형이고 추가의, 언급되지 않은 요소들 또는 방법 단계를 배제하지 않는 것으로 주지되어야 한다.
실시예 1
FMDV의 참조 샘플의 제조
본 실시예는 미리 결정된 용출 용적(또는 시간) 및 FMDV 입자의 미리 결정된 크기 분포를 생성하는 FMDV의 참조 샘플을 제조하기 위한 과정을 설명한다.
사용된 용액:
투석막 조건화 완충액:
용적: 1L
조성: 10 mM NaHCO3; 1 mM EDTA.
투석 완충액:
용적: 5 L
조성: 100 mM NaCl; 50 mM Tris 염기; pH = 8
Tris 완충액:
용적: 5 L
조성: 200 mM NaCl; 20 mM Tris 염기; pH = 8
바이러스 현탁액:
용적: 200 mL
조성: FMDV 종 01 Campos
과정:
단계 1: 투석
본 단계는 바이러스 현탁액의 이온 강도를 감소시켜 샘플의 용적을 증가시키지 않으면서 후속적 효소 분해가 가능하도록 수행하였다.
1. 유리 비이커에서 적어도 30분 동안 투석막 조건화 완충액 중에서 투석 백(bag)을 비등시켰다. 물로 5회 세정하고 사용때까지 4℃에서 저장하였다.
2. 투석 백의 아래 말단부를 봉쇄하고 샘플에 충전시켰다.
3. 매번 2시간동안 4℃에서 800mL의 투석 완충액에 대하여 바이러스 현탁액샘플을 4회 투석시켰다.
4. 밤새 동안 4℃에서 1800mL의 투석 완충액에 대하여 바이러스 현탁액 샘플을 투석시켰다.
단계 2: 효소 분해
본 단계는 샘플로부터 뉴클레아제-민감성 불순물을 제거하기 위해 수행하였다.
1. 효소 제제: 사용 시점에, 37℃로 예비가열된 10mL의 투석 완충액 중에 25μL의 Benzonase® (250U/μL)를 희석시켰다. 효소 희석액의 최종 농도: 25μL x 250 U/μL = 6250 U/10 mL = 625 U/mL의 Benzonase®.
2. 분해: 희석된 바이러스 현탁액을 튜브당 24mL로 50mL의 원심분리 튜브에 분획화하였다. 1mL의 효소 희석액을 각각의 튜브에 첨가하였다. 튜브를 밀봉하고 37℃에서 예비가열된 회전 플랫폼 진탕기에 수평으로 튜브를 놓았다.
3. 현탁액의 우수한 교반을 위해 2시간 동안 충분히 샘플을 교반하고 발포가 일어나지 않도록 한다.
단계 3: 겔 침투 크로마토그래피에 의한 탈염
본 단계는 참조 샘플의 완충액을 교환하고 상기 참조 샘플로부터 저분자량의 성분들을 제거하기 위해 수행하였다.
1. Sephacryl S-300 매질을 500 mL의 Tris 완충액 2개 세척물로 평형화시키고 상기 매질을 230mL의 최종 용적에 재현탁시켰다. 팩킹된 수지의 총 용적은 150 mL이고 예비 칼럼의 총 용적은 250 mL이었다.
2. 예비 칼럼 크로마토그래피를 평형화된 Sephacryl S-300 수지로 팩킹하였다:
a. 230mL의 현탁액을 상기 칼럼에 부었다.
b. 상기 수지가 밤새 중력에 의해 첨가되도록 하였다.
c. 금속성 메쉬 디스크를 겔 상에 위치시켰다.
d. 금속 메쉬상에 25mL의 Tris-염 완충액을 첨가하였다.
e. 저장소를 Tris 완충액과 연결시켰다.
f. 200 mL의 완충액을 상기 저장소에 통과시켰다.
g. Tris 완충액으로부터 저장소의 연결을 중단시켰다.
h. 완충액이 메쉬 수준에 도달하기 직전까지 칼럼의 적가를 개방하고 이어서 적가를 폐쇄시켰다.
저분자량의 성분의 탈염/제거:
a. 43ml의 샘플을 겔상으로 로딩하였다.
b. 적가를 개방하고 샘플이 겔에 진입하도록 하였다.
c. 60mL의 Tris 완충액을 칼럼에 로딩하였다. 적가를 개방하고 바이러스를 함유하는 용출물을 수거하였다. 4℃에서 용출물을 저장하였다.
d. 칼럼을 300 mL의 Tris 완충액으로 평형화시켰다.
e. 모든 샘플의 통과가 종료될때까지 상기를 반복하였다. 칼럼에 로딩될 최종 샘플 용적이 43mL 미만인 경우, 샘플을 칼럼에 로딩하기 전에 샘플 용적을 Tris 완충액으로 43mL까지 구성한다.
f. 수거된 용출물 풀(pool)을 제조하였다.
g. 300mL의 Tris 완충액으로 최종 칼럼 세척을 수행하였다. 칼럼의 팩킹을 해제하고 수지를 매번 500mL의 20% 에탄올로 2회 세척하였다.
단계 4: 참조 샘플의 평가
단계 3으로부터 수득된 용출물은 슈크로스 농도구배 원심분리, UV 분광측정기 적정 및 크기 배제 크로마토그래피에 적용하여 FMDV 입자의 정제된 샘플이 제조되었는지를 평가하였다.
실시예 2
FMDV 입자의 정량 및 특징분석
본 실시예는 이들의 순도와는 무관하게 중간체 공정 샘플에서 및 최종 제품인 FMD 백신에서 역학적 광 산란(DLS)을 사용하여 FMDV 입자를 정량하고 이의 통합성 및 크기를 특징분석하기 위한 본 발명의 한 양태를 설명한다. 하나의 양태에서, U.V. 추적을 사용하여 바이러스 농도를 계산하기 위해 피크 면적을 결정하고 DLS를 사용하여 바이러스 입자의 크기 및 통합성을 특징분석한다.
장비 및 작동 조건:
ㆍ펌프, 온라인 탈기기, 자동 샘플 채취기, 샘플 냉각 모듈, 칼럼 서모스탯, 가변 파장의 UV 검출기 및 PC 에디션 오픈랩 CDS 켐스테이션 소프트웨어가 장착된 인피니티 아길런트(Infinity Agilent) 1260 크로마토그래피.
ㆍ 크로마토그래피 칼럼: 가드 칼럼 TSKgel PWXL 가드콜(Guardcol) (6.0 mm ID x 4.0 cm L) 또는 이의 등가물 및 카트리지 페노메넥스 SecurityGuard GFC AJO- 4489 -4000이 임의로 장착된 TOSOH Bioscience TSKgel G4000PWXL (7.8 mm ID x 30.0 cm L) 또는 이의 등가물.
ㆍ 24 x 1.5 mL 블록에 대한 에펜도르프 서모믹서 상호교환가능한 블록.
ㆍ GPC1 이동상(30 mM Tris, 400 mM NaCl, pH = 8).
ㆍ Benzonase®, Sigma E1014 - 25KU - ≥ 250 유니트/μL, ≥ 90 % (SDS- PAGE).
ㆍ Benzonase® 희석 완충액(50 mM Tris, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2).
ㆍ Benzonase® (1.25 U/μL)의 작동 희석물.
ㆍ 희석 완충액 30 mM Tris, pH = 8.
ㆍ 제타사이저(Zetasizer) v. 7.02 소프트웨어를 갖는 말베른 제타사이저 나노(Malvern Zetasizer Nano) S 역학적 광 산란 (DLS) ZEN 1600 분석기.
ㆍ유동 셀 헬마 분석기(Hellma Analytics) 176.751-QS ZEN0116을 갖는 유동 방식 작동 키트.
분석 과정:
a) 샘플의 전처리
i. 클로로포름 추출
(1) 에멀젼 및 한외여과 농축물의 제형화 전 수성상인 세포 배양 감염물의 상등액
5 mL의 샘플은 15mL 원심분리 튜브에 분획화하고 5mL의 클로로포름을 첨가하였다. 샘플 및 클로로포름은 2분동안 왕성하게 진탕시키고 이어서 4℃에서 15분 동안 4500 RPM에서 원심분리하였다. 수성 상부 층을 새로운 15mL 튜브로 옮겼다. 클로로포름 추출은 다시 반복하고 상부 층을 또 다른 새로운 튜브에 회수하였다. 한외여과 바이러스 농축을 위해, 1mL의 Tris 30 mM, pH = 8 용액을 2mL의 클로로포름 추출된 샘플에 첨가하는 추가의 희석을 수행하여 효소 분해 전에 샘플 이온 강도를 감소시켰다.
(2) PEG 침전에 의해 제조된 바이러스 농축물
10 mL의 바이러스 농축물은 일정한 왕성한 자기 교반하에 샘플 채취하여 침전물이 침강되지 않도록 하였다. 상기 샘플은 250 mL의 비이커로 옮기고 30 mM Tris, 100 mM NaCl, pH = 8을 사용하여 100 mL의 최종 용적으로 희석시키고 4℃에서 밤새 자기적으로 교반하였다. 5 mL의 희석된 농축물을 이전의 문단에 기재된 바와 같이 클로로포름 추출에 적용하였다.
(3) 유중수 에멀젼 FMD 백신
20 mL의 상업적 오일-기반 백신은 50mL의 원심분리 튜브에 분획화하였다. 20 mL의 클로로포름을 상기 튜브에 첨가하고; 5분 동안 왕성하게 진탕시키고 이어서 4℃에서 15분 동안 4500 RPM에서 원심분리하였다. 수성상을 분리하고 또 다른 50mL 튜브로 옮겼다. 20mL의 클로로포름의 제2 부분을 상기 튜브에 첨가하고 5분 동안 왕성하게 진탕시키고 4℃에서 15분 동안 4500 RPM에서 원심분리하였다. 상기 수성상을 분리하고 또 다른 50mL 튜브로 옮겼다. 상기 회수된 수성상은 유중수 에멀젼 FMD 백신에 대해 분석될 샘플이다.
ii. 효소 분해
상기 회수된 샘플은 직접 사용하거나 적절한 경우 이전의 섹션에 기재된 바와 같이 전처리에 적용할 수 있다. 회수 과정(i)에서 수득된 1 mL의 샘플은 1.5 mL 의 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 20μL의 Benzonase® (1.25 U/μL) 즉, 25 U의 Benzonase ®의 작동 희석물을 상기 튜브에 첨가하고 60분동안 에펜도르프 서모믹서에서 1400 RPM(고속)으로 37℃에서 진탕시켰다. 상기 샘플 튜브를 서모믹서로부터 제거하고 10분 동안 4℃에서 16000g에서 원심분리하였다. 상기 상등액은 펠렛을 교란시키지 않는데 주의하면서 상기 튜브로부터 수거하고 최종 캡핑된 HPLC 바이알에 로딩하였다. 상기된 바와 같이 제조된 참조 또는 보정 샘플(들)은 직접 사용하거나 크로마토그래피 분석을 수행하기 전에 시험된 샘플과 동일한 방식으로 전처리하였다. 에펜도르프로부터 미세원심 튜브를 위한 온도 조절되고, 마이크로프로세서-제어되고 고속 회전 믹서로 HPLC의 감소된 샘플 용적 요구와 동시에 24회 이하의 분해 동안 효소 분해를 수행하도록 한다.
b) 크로마토그래피 분석
주사될 샘플의 순서는 각각의 샘플 유형을 위해 적당한 방법과 함께 스케줄하였다. 크로마토그래피 용출 라인을 연결하였다: 샘플은 ZEN1600 DLS 분석기에서 크로마토그래피 칼럼, U.V. 검출기 및 이어서 헬마 유동 셀을 통해 전개시켰다. 적당한 플레이리스트는 DLS 분석기의 제타사이저 소프트웨어에서 설정하였다. 대략 15 내지 16분의 체류 시간을 갖는 바이러스 피크(또는 상응하는 용출 용적)를 통합하였다(정확한 시간은 사용되는 크로마토그래피 용출 조건에 의존한다). 대조군 샘플에서 FMDV의 농도는 하기의 수학식에 따라 결정하였다:
FMDV [μg/mL] = (면적 x 10 x 1.02)/(Ft x 72 x b x Volinj)
여기서:
면적: 곡선 이하 면적이다. mAU*s, mAU*min 또는 mAU*mL의 단위를 가질 수 있다.
10: 단위 전환 인자이다.
1.02: 적용할 수 있는 경우, 벤조나제 용액 첨가를 위한 희석 보정 인자이다.
72: FMDV의 공개된 매쓰 흡광도 계수 254E1%이다.
Ft: mAU*s에서 면적에 대해 120과 동등하고, mAU*min에서 면적에 대해 2와 동등하고 0.5 mL/min 크로마토그래피 유동에 대한 mAU*mL에서 면적에 대해 1과 동등한 유동-시간 인자이다.
b: cm의 U.V. 유동 셀의 광학 경로 길이이다.
Volinj: mL의 주사된 용적이다.
한외여과 바이러스 농축물에 대해, 상기 결과에 1.5 인자를 곱하여 효소 분해 전에 요구되는 2/3 희석을 고려하였다.
상기 플롯 유동 추적 대 용적/시간 플롯은 DLS 제타사이저 소프트웨어에서 생성시켰다. FMDV 피크 시그날은 이의 용출 시간/용적에 의해 동정하고 피크의 Z-평균 직경(d.nm)을 기록하였다.
전체 분석 과정의 타당성은 하기의 파라미터로 확인하였다: a) 대조군 샘플로 수득된 보정 곡선의 기울기는 86.4 (mAU*s)/(mg/mL) +/- 8.64이었고; b) x-절편의 절대 값은 대조군 샘플의 평균 농도의 10% 미만이었고; c) FMDV 피크 Z-평균 직경은 28 내지 40 nm이다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 동일한 바이러스 종의 FMDV 참조 또는 표준 샘플로부터 결정된 선택성, 피크 순도, 정확성, 반응의 선형성, 반복성, 중간체 정밀도 및 검출 한계치 및 정량과 같은 파라미터를 기준으로 확증된다. 하나의 양태에서, 각각 높거나 낮은 양의 FMDV를 나타내는 2개의 참조 또는 표준 샘플은 확증 목적을 위한 모든 시험에 포함된다. 하나의 양태에서, 동결/해동 사이클에 의해 용해되고 FMDV 샘플과 유사하게 전처리된 포유동물 세포 샘플과 같은 하나 이상의 바이러스 부재 음성 대조군은 상기 결과를 확증하기 위해 시험에 포함되었다.
상기 시험이 유효한 것으로 확인되면, 시험된 샘플의 값은 직접적인 계산 또는 대조군 샘플로 확립된 보정 곡선에서 수득된 면적 값의 외삽에 의해 결정하였다.
하나의 양태에서, 본 발명에 사용되는 칼럼의 길이는 30 cm이다. 일반적으로, 보다 짧은 칼럼은 보다 짧은 전개를 제공하지만 특히 유사한 수력학적 용적을 갖는 입자에 대해 보다 낮은 분리능을 제공한다. 당업자는 목적하는 샘플 유형에 따라 칼럼의 길이를 조정할 수 있다.
하나의 양태에서, TOSOH Bioscience TSKgel G4000PWXL 크기-배제 칼럼은 짧은 크로마토그래피 전개에서 오염물로부터 FMDV 입자를 충분히 단리시키기 위해 사용한다. 샘플의 특성에 의존하여, 다른 공극 크기 또는 다른 형태 또는 물질의 수지를 사용하여 기존의 크기-배제 칼럼을 제조할 수 있다. 그러나, 수지의 공극 크기가 분리 분리능에 영향을 미칠뿐만 아니라 총 전개 시간에 영향을 미칠 수 있음을 주지해야 한다. 예를 들어, 공극 크기가 바이러스가 진입하는데 충분히 큰 경우 FMDV를 용출시키기 위해 오랜 시간이 걸릴 것이고 따라서 전체 분리 공정이 길어질 수 있다.
결과 해석
정제된 Ol Campos FMD 바이러스 참조 샘플의 분석 및 열 처리 후 이의 붕괴 증거
본 실시예는 본 발명의 방법이 어떻게 FMD 바이러스 입자의 정량 및 통합성 및 크기에 대한 특징분석을 어떻게 가능하게 하는지의 직접적인 증거를 보여준다.
본 실시예는 본 발명의 방법이 정제된 Ol Campos FMDV 참조 샘플의 열처리 및 뉴클레아제(Benzonase®) 분해 후 붕괴된 입자의 단편들(12S 또는 캡소머)을 어떻게 검출할 수 있는지를 보여준다.
도 1a는 정제된 Ol Campos FMDV의 U.V. 254nm에서의 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 상기 크로마토그래피 프로필은 6.33 mL의 용출 용적을 갖는 단일 피크를 보여준다. 곡선 이하 면적을 기준으로 하는 바이러스 농도의 계산은 하기 수학식을 사용하여 421.7 μg/mL의 농도를 산출하였다: FMDV [㎍/mL] = (면적[mAU*mL] x 10)/(1 x 72 x 0.5 [cm] x 0.1 [mL]). 표 1은 용출 피크의 UV 크로마토그래피 분석으로부터 파라미터 산출량을 열거한다.
[표 1]
정제된 Ol Campos FMDV의 크로마토그래피 파라미터
Figure 112017001412617-pct00001
DLS 검출기에서 기록된, 도 1b에서 제공된 바와 같은 광 산란 강도 추적 (실선)은 또한 동일한 용적 범위에서 좌측으로의 약간의 왜곡과 함께 단일 피크를 보여준다. Z-평균 추적(점선)은 상기 피크가 평균 직경이 29.28 nm인 입자에 의해 생성됨을 지적한다. 상기 측정은 FMDV 바이러스 입자 크기의 공지된 직경과 일치한다. 표 2는 용출 피크의 DLS 분석으로부터 파라미터 산출량을 열거한다.
[표 2]
정제된 Ol Campos FMDV의 DLS 분석
Figure 112017001412617-pct00002
도 2a는 1시간 동안 56℃에서 항온처리 및 Benzonase®를 사용한 후속적 분해 후 정제된 Ol Campos FMDV의 U.V. 254nm에서의 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 상기 온도에서 열 처리는 바이러스 입자를 12S 입자 및/또는 캡소머로 분해시키고 바이러스 RNA를 뉴클레아제 분해에 노출시키는 것으로 공지되어 있다. 표 3은 용출 피크의 UV 크로마토그래피 분석으로부터 파라미터 산출량을 열거한다.
[표 3]
열/효소 처리 후 정제된 Ol Campos FMDV의 크로마토그래피 파라미터
Figure 112017001412617-pct00003
열/효소 처리 후 정제된 Ol Campos FMDV의 U.V. 254nm에서 크로마토그래피 프로필은 7.54 mL에서 작은 것과 9.83 mL에서 큰 것의 2개의 피크를 보여주었다. 처리 전에 참조 01 Campos 샘플의 크로마토그래피 프로필상에서 관찰된 피크(도 1a에 대한 용출 용적 6.33 mL)는 상기 크로마토그래피 프로필상에서 완전히 사라졌다.
DLS 검출기에서 도 2b에서 제공된 바와 같은 광 산란 강도 추적(실선)은 2개의 시그날을 보여준다. 표 4는 용출 피크의 DLS 분석으로부터 파라미터 산출량을 열거한다.
[표 4]
열/효소 처리 후 정제된 Ol Campos FMDV의 DLS 분석
Figure 112017001412617-pct00004
용출 용적의 6.27 mL 내지 6.6 mL의 첫번째 하나는 산란 광의 6.2%만을 나타내고 상당한 U.V. 검출과 서로 관련이 없었다. Z-평균 추적은 상기 피크에 대해 33.42 nm의 Z-평균을 갖는 20 내지 60 nm 범위의 가변 크기를 보여주었다. FMDV 바이러스 단백질에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인된 바와 같이, 상기 피크는 처리시 붕해되지 않은 FMD 바이러스 입자에 의해 생성되었다(데이터는 나타내지 않음).
7.21 내지 9.48 mL의 용출 용적 범위에서 Z-평균 직경이 13.03 nm인 제2 강도 피크는 U.V. 254 nm 프로필에서 7.54 mL에서 보다 작은 피크와 서로 관련이 있었다. 상기 피크는 웨스턴 블롯 분석에서 강한 시그날을 생성하였다(데이타는 나타내지 않음). 크기 및 반응성을 기준으로, 상기 피크는 100% 단백질로 구성되고 따라서 254 nm에서 낮은 흡광성을 나타내는 (도 2a에서 7.54 nm에서의 피크에 의해 주지되는) FMDV 분해된 단편 (12S 입자 및/또는 캡소머) 때문이었다.
U.V. 크로마토그래피 프로필에서 관찰된 9.83 nm에서 용출된 높은 피크(도 2a)는 DLS 검출기에 의해 검출되지 않았다(도 2b). 상기 결과는 FMDV 바이러스 RNA 게놈의 Benzonase® 분해 후 생성된 리보뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드와 일치하였다.
실시예 3
PEG 침전에 의해 제조된 바이러스 농축물에서 비-외피 바이러스 입자의 정량에 대한 클로로포름 추출 및 벤조나제 분해의 효과
본 실시예는 뉴클레아제 분해 및 용매 추출의 조합 처리의 유용성을 설명한다. 하나의 양태에서, Benzonase® 분해를 사용하여 오염물 세포 핵산을 제거하였고 클로로포름 추출을 사용하여 지질 오염물을 세정하였다.
장비 및 작동 조건:
사용되는 장비, 시약 및 용액은 하기의 차이점을 제외하고는 실시예 2에 기재된 바와 같았다:
- 크로마토그래피: 254/280 nm 고정 파장 UV를 사용하는 Akta 정제기(Purifier) UPC- 10 형태 제네랄 일렉트릭(General Electric) 및 유니콘 제어 소프트웨어를 갖는 전도성 검출기.
- PEG 농축된 바이러스에 대한 희석 완충액: 30 mM Tris, 100 mM NaCl, pH = 8.
분석 과정:
01 Campos FMDV 종으로 감염된 BHK 세포 현탁 배양물의 세포 배양 상등액을 화학적으로 불활성화시키고 최종 PEG 6000의 농도가 5.5%에 도달하도록, 농축된 용액의 PEG 6000 첨가에 의한 침전으로 50배(50x) 농축시켰다. 72시간 침전 후, 상기 상등액을 버리고 50X FMDV 농축물을 수거하였다.
상기 수거된 바이러스 농축물을 이어서 희석 완충액 30 mM Tris, 100 mM NaCl, pH = 8로 10배 희석시키고 4℃에서 밤새 자기 교반시켜 PEG 농도를 감소시키고 바이러스 입자가 가용성 형태로 복귀하도록 한다.
a) 샘플의 전처리
희석된 FMDV 농축물 샘플의 4개의 상이한 적정액을 다음과 같은 크로마토그래피 전개 전에 처리하였다:
i) 5 mL의 클로로포름을 5 mL의 샘플에 첨가하고 왕성하게 진탕시켜 완전하게 혼합하였다. 상기 혼합물을 원심분리하여 형성된 에멀젼을 깨부수고 상부 수성 층을 피펫팅함에 의해 회수하였다.
ii) 2 mL의 샘플은 실시예 2에 기재된 바와 같이 Benzonase®로 효소적으로 분해시켰다.
iii) 적정액 i)로부터 회수된 2 mL의 수성 적정액을 실시예 2에 기재된 바와 같이 Benzonase®로 효소적으로 분해하였다.
iv) 2 mL의 샘플은 클로로포름 추출 또는 효소적 분해에 의해 처리하지 않았다.
모든 4개의 적정액을 크로마토그래피 분석 전에 16000g에서 원심분리하여 임의의 불용성 물질을 제거하고 수득된 상등액을 펠렛이 파괴되지 않도록 하면서 새로운 튜브로 옮겼다.
b) 크로마토그래피 분석
모든 4개의 적정액의 크로마토그래피 분석은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 주사 용적은 100 μL이었고 흡광도는 254 nm에서 모니터링하였다.
결과의 해석
결과는 도 3에 나타낸다. 도 3a에서, 처리되지 않은 것과 완전히 처리된 샘플을 비교하였다. 비처리된 샘플에서, 상기 바이러스 피크는 핵산 피크로부터 분리되지 않고 "쇼율더(shoulder)"로서 용출하였다. 본 경우에, 정확한 바이러스 피크 통합은 핵산 오염물로 인해 성취할 수 없었다. 반대로, 처리된 샘플에서, 바이러스 피크는 기준선으로 분리된 대칭 "고시안 벨(Gaussian bell)" 형태의 피크와 일치하였다. 도 3b는 클로로포름 추출된 샘플에 대한 효소적 처리를 제거한 효과를 설명하고, 이는 바이러스 피크 형태에서의 주요 차이가 상기 분해 단계로 인한 것임을 보여주었다. 도 3c는 효소 분해 후에도 일부 고분자량의 지질 잔기들이 제외된 용적에 잔류한다는 점을 강조한다. 이들 지질 오염물은 클로로포름 추출에 의해 제거될 수 있다. 따라서 상기 단계를 수행하지 않으면 샘플 중 바이러스 함량의 과대 평가를 유도할 수 있다.
실시예 4
외피 및 비-외피 바이러스를 함유하는 백신의 안정성 결정
본 실시예는 바이러스 백신의 안정성을 결정하기 위한 본 발명의 하나의 양태를 설명한다. 4℃에서 저장 후 초기 시점 및 후기 시점에서 바이러스 입자를 함유하는 백신은 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 수득된 U.V. 및 DLS 프로필은 바이러스 입자의 양 및 크기를 계산하기 위해 분석한다. 저장시 바이러스 입자 수의 변화는 초기 입자의 백분율 측면에서 해석될 수 있다. 바이러스 입자의 통합성은 또한 수득된 프로필을 비교함에 의해 평가될 수 있다.
실시예 5
높은 농도에서 비-외피 바이러스 입자의 정량 및 특징분석
본 실시예는 한외여과에 의해 수득된 고도로 농축된 비-외피 바이러스 샘플에 대한 본 발명의 적용을 설명한다. 하나의 양태에서, 본 실시예는 고도로 농축된 FMDV 샘플에 대한 본 발명의 적용을 설명한다. 또 다른 양태에서, 본 실시예는 농축된 로타바이러스 샘플에 대한 본 발명의 적용을 설명한다.
하나의 양태에서, 본 실시예는 또한 한외여과 공정에 의해 수득된 항원 농축물로부터 제조된 FMDV 항원의 연속 희석물의 정량 및 특징분석을 설명한다. 또 다른 양태에서, 본 실시예는 또한 한외여과 공정에 의해 수득된 항원 농축물로부터 제조된 로타바이러스 항원의 연속 희석물의 정량 및 특징분석을 설명한다.
I - 고도로 농축된 FMDV 샘플의 분석
장비 및 작동 조건:
사용된 장비 및 수행된 과정은 실시예 2에 기재된 바와 동일하였다.
분석 과정:
생물반응기에서 배양 중 01 Campos 종에 의한 BHK 세포의 감염은 에틸렌이민 용액을 사용한 화학적 불활성화에 의해 즉각적으로 불활성화된 저농도 물질을 생성시켰다. 이어서 상기 01 Campos 바이러스 현탁액은 한외여과 공정에 의해 농축시켜 150X의 고농도 인자에 도달하게 하였다. 상기 농축 공정 동안에, 샘플 중 바이러스의 농도 및 양은 농축된 항원의 공정 수율 및 통합성을 평가하기 위해 세밀하게 모니터링하였다. 상기 바이러스 현탁액의 바이러스 농도는 한외여과 공정과 함께 바이러스 현탁액의 초기 용적, 용적 감소 비율 및 HPLC 결정을 기준으로 700 내지 800 μg/mL의 범위인 것으로 추산되었다. 3개 세트의 연속 희석물은 표 5에 나타낸 희석 계획에 따라 3개의 상이한 날에 제조하였다. 3개의 연속 바이러스 희석 샘플은 Agilent 1260 인피니티 크로마토그래피(Infinity chromatograph)를 사용하는 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 각각의 샘플에 대해 중복 주사로 전처리하고 분석하였다. 순수한 FMDV 농축물 및 희석 완충액 둘다의 샘플을 또한 분석하였다. 샘플의 희석을 위해 사용된 완충액은 하기의 조성을 갖는다: 300 mM NaCl; 20 mM Tris Base; pH = 8.
[표 5]
상이한 FMDV 샘플의 제조를 위한 FMDV 농축물의 희석 계획
Figure 112017001412617-pct00005
상기 수득한 U.V. 피크 면적을 분석하고 FMD 바이러스 입자 농도는 각각의 샘플에 대해 추론하였다. 중복 주사 결과는 각각의 세트의 연속 희석물에 대해 평균하였다. 결정된 바이러스 농도는 백분율 농도에 대해 플롯팅하였다. 3개 시리즈의 최종 평균을 사용하여 회귀 분석을 수행하였다. 역학적 광 산란 데이터는 10초마다 1개 판독의 샘플링 빈도로 HPLC와 인-라인 연결된 말베른 나노 S DLS 장비를 사용하여 연속 포획하였다. 바이러스 피크에 상응하는 판독은 말베른 제타사이저 소프트웨어 v. 7.02에서 Z-평균 직경 분석을 위해 선택하였다.
결과:
도 4a는 한외여과에 의해 수득된 FMDV 항원 농축물의 254 nm하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 4b는 FMDV 농축물의 20% 내지 100% 범위의 5개 시험된 FMDV 샘플로부터 수득된 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다. 도 4c는 샘플의 하나에 대한 UV 254 nm 크로마토그래피 프로필 및 DLS 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다. U.V 및 DLS 프로필의 오버레이는 U.V.에 의해 트랙킹된 동정된 FMD 바이러스 피크가 DLS에 의해 트랙킹되는 경우 분산된 광의 상당한 강도를 생성시키는 유일한 피크임을 명백히 보여준다. 이러한 결과는 상기 샘플에서 FMD 바이러스 입자가 DLS 검출기에 의해 검출되기에 충분히 높은 강도에서 실제로 광을 분산시키기 위해 충분히 높은 유일한 분자 종임을 지적한다.
도 4d에 지적된 바와 같이, 샘플의 평가된 바이러스 농도와 실제 바이러스 농도 간의 일정하고 막강한 연합을 보여주는 결정 R2의 매우 높은 계수(0.9984)가 수득되었고, 이는 본 발명이 광범위한 바이러스 농도상에서의 바이러스 농도를 정확하게 평가할 수 있음을 시사한다. 인-라인 DLS 입자 크기 결정은 29.9 내지 34.2 nm 범위의 일정 판독값을 보여주었고 평가된 모든 농도 범위에 걸친 FMDV 입자와 일치하였다(도 4d 및 표 6을 참조한다). 자외선 및 DLS 추적으로부터 수득된 모든 결과는 표 6에 요약한다.
[표 6]
3개 세트의 FMDV 농축물 연속 희석 샘플의 자외선 및 DLS 분석
Figure 112017001412617-pct00006
II - 농축된 소 로타바이러스 혈청형 G6 샘플의 분석
사용된 장비 및 수행된 과정은 하기의 차이점을 제외하고는 실시예 2에 기재된 바와 동일하였다:
장비 및 작동 조건:
- 크로마토그래피 장비: 이분 펌프, 254/280 nm 고정된 파장 UV 검출기, 전도도 검출기 및 유니콘 컨트롤 및 데이터 획득 소프트웨어가 장착된 제네랄 일렉트릭 헬스케어 Akta 정제기 UPC-10 크로마토그래피를 사용하였다.
- 크로마토그래피 칼럼: TOSOH Bioscience TSKgel G4000PWXL (7.8 mm ID x 30.0 cm L) 또는 등가물은 가드 칼럼 또는 카트릿지 없이 사용하였다.
- 상이한 원심분리 튜브를 위해 적합한 에펜도르프 서모믹서 상호교환가능한 블록.
- TURBO™ DNase (2 U/μL), 카탈로그 # AM2238; Life Technologies.
- 제조업체(Life Technologies)에 의해 공급된 바와 같은 TURBO™ DNase 10X 완충액.
- 말베른 제타사이저 나노 S 역학적 광 산란(DLS) ZEN1600 분석기를 조절하고 데이타는 제타사이저 v. 7.11 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
분석 과정:
녹색 아프리카 몽키 (Cercophitecus aethiops)의 신장으로부터 기원하는 MA104 세포의 배양물은 소 로타바이러스 혈청형 G6로 감염시켰다. 세포 배양 상등액은 포름알데하이드 용액으로 불활성화시키고 한외여과에 의해 농축시켜 13.4X 농도 인자에 도달하도록 하였다. 위약 용액 (음성 대조군)은 세포 배양물의 동결 및 해동을 반복함에 의해 제조하였다.
샘플 희석:
샘플의 연속 희석물은 희석제로서 위약을 사용하여 제조하였다.
[표 7]
상이한 로타바이러스 샘플의 제조를 위한 소 로타바이러스 G6 농축물의 희석 계획.
Figure 112017001412617-pct00007
샘플 전처리:
클로로포름 추출:
i) 이전 단계로부터의 샘플 희석물을 실시예 3 a) (i)에 기재된 바와 같은 클로로포름으로 추출하고 수성 상부 층을 회수하였다.
b) 효소 분해:
i) 이전 단계에서 수득된 4.5mL의 각각의 샘플에, 500μL의 TURBO™ DNase 10X 완충액 및 5μL의 TURBO™ DNase (2 U/μL)을 첨가하였다.
ii) 37℃ 및 750 rpm에서의 60분 항온처리는 15 mL 튜브용으로 적합한 서모블록을 갖는 에펜도르프 서모믹서를 사용하여 수행하였다.
iii) 1 mL의 각각의 샘플은 1.5 mL의 에펜도르프 미세원심분리 튜브로 옮기고 4℃에서 10분 동안 16000g에서 원심분리하였다. 상등액은 크로마토그래피 칼럼의 막힘현상을 회피하기 위해 펠렛을 파괴하지 않도록 주의하면서 피펫팅함에 의해 새로운 튜브로 옮겼다.
크로마토그래피 전개:
i) 100μL의 각각의 원심분리된, 분해된 샘플은 자동 주사 밸브에서 측정 루프를 사용하여 주사하였다.
ii) GPC1 이동상에서 등장성 전개는 U.V. 프로필을 수득하기 위한 U.V 검출기에서의 254 nm에서 일정한 유동의 0.5mL/분 모니터링 및 DLS 산란 광 강도 및 Z-평균을 획득하기 위한 연속 배위의 말베른 제타사이저 검출기를 사용하여 수행하였다.
iii) U.V. 프로필은 유니콘 소프트웨어 및 산란 광 강도를 사용하여 포획하여 분석하고 입자 직경의 Z-평균은 말베른 제타사이저 v. 7.11 소프트웨어를 사용하여 수거하고 분석하였다.
결과:
도 5a는 한외여과에 의해 수득된 소 로타바이러스 항원 농축물의 254 nm하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 5b는 로타 바이러스 농축물의 20% 내지 100% 범위의 5개의 시험된 로타바이러스 샘플로부터 수득된 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다.
도 5c는 샘플의 하나에 대해 UV 254 nm 크로마토그래피 프로필 및 DLS 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다. U.V. 및 DLS 프로필의 오버레이는 U.V.에 의해 트랙킹된 동정된 로타바이러스 피크가 DLS에 의해 트랙킹되는 경우 분산된 광의 상당한 강도를 생성하는 유일한 피크임을 명백하게 보여준다. 상기 결과는 상기 샘플에서 로타바이러스 바이러스 입자가 DLS 검출기에 의해 검출되기에 충분한 큰 강도로 광을 실제로 분산시키기 위해 충분히 큰 유일한 분자 종임을 지적한다.
도 5d에 지적된 바와 같이, 샘플의 평가된 바이러스 농도와 실제 바이러스 농도 간의 일정하고 강한 연합을 보여주는 결정 R2의 매우 큰 계수(0.9997)를 수득하였고, 이는 본 발명이 광범위한 바이러스 농도 상에서 로타바이러스 입자 농도를 정확하게 평가할 수 있음을 시사한다.
인-라인 DLS 입자 크기 결정은 63.2 내지 72.8 nm 범위의 일정 판독값을 보여주었고 평가된 모든 농도 범위에 걸친 로타바이러스 입자와 일치하였다(도 5d 및 표 8을 참조한다). 자외선 및 DLS 추적으로부터 수득된 모든 결과는 표 8에 요약한다.
[표 8]
로타바이러스 농축물 및 이의 연속 희석 샘플의 자외선 및 DLS 분석
Figure 112017001412617-pct00008
III - 결과의 해석
본 실시예는 본원이 비-외피 바이러스에 대한 광범위한 바이러스 농도상에서 정확한 측정을 생성시킬 수 있음을 설명한다.
하나의 양태에서, 본 실시예는 본원이 높은 바이러스 농축물로부터 희석된 다양한 바이러스 샘플로부터 결정된 바이러스 농도의 높은 선형성에 의해 지적된 바와 같이 광범위한 바이러스 농도상에서 FMDV 및 소 로타바이러스와 같은 바이러스 입자에 대해 정확한 측정을 생성시킬 수 있음을 보여준다.
본 실시예는 바이러스 농도와는 무관하게 FMDV 또는 소 로타바이러스 항원의 크기 및 통합성을 일관되게 및 정확하게 특징분석하는 본 발명의 능력을 보여준다.
본 실시예는 본 발명이 저농도의 감염 상등액에서부터 본 실시예에서 시험된 바와 같은 150X 및 727 μg/mL 이하의 FMDV 입자의 고농축물까지 바이러스 농축물을 정량하기 위해 큰 정확도로 사용될 수 있다. 추가로, 인-라인 DLS 검출은 바이러스 입자의 완전한 농도 범위에 걸친 큰 정확도 및 일관성을 갖는 바이러스 입자 크기 및 통합성을 특징분석할 수 있는 것으로 나타난다. 상기 특징은 사용되는 온도, pH 및 전단율과 같은 공정의 특정 가변 조건이 바이러스 입자 통합성에 대해 급격한 충격을 가질 수 있음으로 상기 유형의 농축 공정 동안에 특히 중요하다. 따라서, 본 발명은 최종 농도가 얼마나 높은지에 상관 없이 제조 공정의 농축 단계의 성공을 확실히하고 생성된 농축된 항원의 품질을 보장하기 위한 공정 분석학적 기술(PAT)의 궁극적인 도구를 나타낸다.
분광측정 오차 고려사항을 기준으로, 상기 실험에서 측정된 것 보다 2배 또는 3배 높은 농도가 상한 범위가 약 2250 μg/mL인 FMDV 입자에 도달하는, 본 발명의 방법으로 정확하게 정량될 수 있음을 합리적으로 예상될 수 있다. 이것은 광측정 오차가 100 mAU 내지 1500 mAU의 범위에서 매우 낮다는 사실을 기반으로 한다. 또한, 예를 들어, 100 μL 대신 50 μL의 보다 적은 샘플 용적을 주사할 수 있거나 예상된 농도에 따라 샘플을 간단히 희석하고 희석 인자에 의해 수득된 결과를 보정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 임의의 실제 제조 공정의 필요성을 훨씬 능가하는 농도 범위에 대해 작용할 수 있다.
역학적 광 산란 검출기는 통상적으로 2 mg/mL 이상의 정도로 단백질 샘플과 함께 작동한다. 따라서, 본 발명에 기재된 인-라인 DLS 검출 방법이 본 실시예에서 기재한 바와 같이 보다 높은 농도의 샘플에 보다 완벽하게 작용한다는 것은 의심할 여지가 없다.
FMD 백신 제조 공정에서 전형적인 농축 단계는 세포 배양물에서 감염 단계 동안에 수득된 10X 내지 60X의 바이러스 농도 범위인 농도에 도달시킨다. 그럼에도 불구하고, 목적이 매우 고도로 농축된 FMD 바이러스 항원 뱅크를 제조해야만 하는 것인 경우, 상기 농축 단계는 150X의 농도 인자 및 심지어 200X의 농도 인자에 도달할때까지 계속될 수 있다. 본 실시예에서, 727 μg/mL의 측정된 농도를 갖는 고도로 농축된 바이러스 물질은 150X의 농도 인자에 상응한다. 농도 인자에 대한 상한치는 각각의 FMDV 바이러스 종에 대한 개별적으로 결정되어야만 하지만, 1250 μg/mL (또는 1.25 mg/mL) 이상까지의 FMDV 항원 농도는 FMDV 입자의 가용성에 안좋은 영향을 주는 것 없이 도달될 수 있음이 합당하게 평가될 수 있다.
본 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 방법은 매우 고도로 농축된 샘플에서 비-외피 바이러스 입자를 정량하고 특징분석하기 위해 매우 적합하고 따라서 초농축된 FMDV 항원 뱅크 또는 소 로타바이러스 항원 뱅크에 적용될 수 있다.
참조로서, 백신에서 통상적인 바이러스 농도는 바이러스 종, 국가 규제 기관 요구사항 및 백신의 약리기술학적 성질에 따라 다양하다. 대부분의 공통된 유형의 FMD 백신은 유중수 에멀젼 또는 수중유중수 이중 에멀젼이다. 에멀젼을 제조하기 위해 사용되는 수성상은 약 2 μg/mL 내지 60 μg/mL의 바이러스 농도 범위이다.
실시예 6
고농도의 외피 바이러스 입자의 정량 및 특징분석
본 실시예는 한외여과에 의해 수득된 농축된 외피 바이러스 샘플에 대한 본 발명의 적용을 설명한다. 하나의 양태에서, 본 실시예는 농축된 BoHV-5 샘플에 대한 본 발명의 적용을 설명한다. 또 다른 양태에서, 본 실시예는 농축된 PIV-3 샘플에 대한 본 발명의 적용을 설명한다. 또 다른 양태에서, 본 실시예는 농축된 광견병 바이러스 샘플에 대한 본 발명의 적용을 설명한다.
하나의 양태에서, 본 실시예는 또한 한외여과 공정에 의해 수득되는 항원 농축물로부터 제조된 연속 희석물의 BoHV-5 항원, PIV-3 항원 및 광견병 바이러스 항원의 정량 및 특징분석을 설명한다.
I) 농축된 BoHV-5 샘플의 분석
사용되는 장비 및 수행된 과정은 하기의 차이점과 함께 실시예 2에 기재된 바와 동일하였다:
장비 및 작동 조건:
- 크로마토그래피 장비: 이분 펌프, 254/280 nm 고정된 파장 UV 검출기, 전도도 검출기 및 유니콘 컨트롤이 장착된 제네랄 일렉트릭 헬스케어 Akta 정제기 UPC-10 크로마토그래피 및 데이타 획득 소프트웨어를 사용하였다.
- 크로마토그래피 칼럼: GE 헬스케어 라이프 사이언스(Healtcare Life Sciences) 세파크릴 S-400 SEC/GPC 크로마토그래피 배지와 함께 제조업자로부터 지침에 따라 팩킹된 제네랄 일렉트릭 헬스케어 XK 16/40 보로실리케이트 유리 칼럼(16 mm ID x 40.0 cm L).
- 상이한 원심분리 튜브에 대해 적합한 에펜도르프 서모믹서 상호교환가능한 블록.
- TURBO™ DNase (2 U/μL), 카탈로그 # AM2238; Life Technologies.
- 제조업체에 의해 공급된 바와 같은 TURBO™ DNase 10X 완충액; Life Technologies.
- 말베른 제타사이저 나노 S 역학적 광 산란 (DLS) ZEN 1600 분석기는 제어되고 데이터는 제타사이저 v. 7.11 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
분석 과정:
마딘-다비(Madin-Darby) 소 신장 세포(MDBK)의 배양물은 소 헤르페스바이러스 5(BoHV-5) 종 A663으로 감염시키고, 세포 배양 상등액은 에틸렌이민 용액으로 불활성화시키고 한외여과에 의해 농축시켜 6.4X 농도 인자에 도달하도록 하였다. 위약 용액(음성 대조군)은 세포 배양물의 동결 및 해동을 반복적으로 수행하여 제조하였다.
샘플 희석:
샘플의 연속 희석물을 희석제로서 위약을 사용하여 제조하였다.
[표 9]
상이한 BoHV-5 샘플의 제조를 위한 BoHV-5 농축물의 희석 계획
Figure 112017001412617-pct00009
샘플 전처리:
a) 효소 분해:
i) 4.5 mL의 각각 희석된 샘플에 500 μL의 TURBO™ DNase 10X 완충액 및 20 μL의 TURBO™ DNase (2 U/μL)를 첨가하였다.
ii) 37℃ 및 750 rpm에서 60분 항온처리는 15 mL의 튜브에 적합한 서모블록과 함께 에펜도르프 서모믹서를 사용하여 수행하였다.
iii) 1 mL의 각각의 샘플을 1.5 mL의 에펜도르프 미세원심분리 튜브로 옮기고 10분 동안 4℃에서 16000g에서 원심분리하였다. 상등액은 크로마토그래피 칼럼의 막힘 현상을 회피하기 위해 펠렛을 파괴하지 않도록 주의하면서 피펫팅함에 의해 새로운 튜브로 옮겼다.
크로마토그래피 전개:
i) 940 μL의 각각의 원심분리된, 분해된 샘플은 자동 주사 밸브내 측정 루프를 사용하여 주사하였다.
ii) GPC1 이동상에서 등장성 전개는 U.V. 프로필을 수득하기 위한 U.V 검출기에서의 254 nm에서 일정한 유동의 1 mL/분 모니터링 및 DLS 산란 광 강도 및 Z-평균을 획득하기 위한 연속 배위의 말베른 제타사이저 검출기를 사용하여 수행하였다.
iii) U.V. 프로필은 유니콘 소프트웨어 및 산란 광 강도를 사용하여 포획하여 분석하고 입자 직경의 Z-평균은 말베른 제타사이저 v. 7.11 소프트웨어를 사용하여 수집하여 분석하였다.
결과:
도 6a는 한외여과에 의해 수득된 BoHV-5 항원 농축물의 254 nm하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 6b는 BoHV-5 농축물의 20% 내지 100% 범위의 5개의 시험된 BoHV-5 샘플로부터 수득된 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다.
도 6c는 샘플의 하나에 대해 UV 254 nm 크로마토그래피 프로필 및 DLS 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다. U.V. 및 DLS 프로필의 오버레이는 U.V.에 의해 트랙킹된 동정된 BoHV-5 피크가 DLS에 의해 트랙킹되는 경우 분산된 광의 상당한 강도를 생성하는 유일한 피크임을 명백하게 보여준다. 상기 결과는 상기 샘플에서 BoHV-5 바이러스 입자가 DLS 검출기에 의해 검출되기에 충분한 큰 강도로 광을 실제로 분산시키기 위해 충분히 큰 유일한 분자 종임을 지적한다.
도 6d에 지적된 바와 같이, 샘플의 평가된 바이러스 농도와 실제 바이러스 농도 간의 일정하고 강한 연합을 보여주는 결정 R2의 매우 큰 계수(0.9997)를 수득하였고, 이는 본 발명이 광범위한 바이러스 농도 상에서 BoHV-5 입자 농도를 정확하게 추산할 수 있음을 시사한다.
인-라인 DLS 입자 크기 결정은 137.1 내지 151.7 nm 범위의 일정 판독값을 보여주었고 평가된 모든 농도 범위에 걸친 BoHV-5 입자와 일치하였다(도 6d 및 표 10을 참조한다). 자외선 및 DLS 추적으로부터 수득된 모든 결과는 표 10에 요약한다.
[표 10]
BoHV-5 농축물 및 이의 연속 희석물 샘플의 자외선 및 DLS 분석
Figure 112017001412617-pct00010
농축된 PIV-3 샘플의 분석
사용된 장비 및 수행된 과정은 하기의 차이점과 함께 실시예 2에 기재된 바와 동일하였다:
장비 및 작동 조건:
- 크로마토그래피 장비: 이분 펌프, 254/280 nm 고정된 파장 UV 검출기, 전도도 검출기 및 유니콘 컨트롤이 장착된 제네랄 일렉트릭 헬스케어 Akta 정제기 UPC-10 크로마토그래피 및 데이타 획득 소프트웨어를 사용하였다.
- 크로마토그래피 칼럼: TOSOH Bioscience TSK겔 G4000PWXL(7.8mm ID x 30.0 cm L)은 또는 등가물은 가드 칼럼 또는 카트릿지 없이 사용하였다.
- 상이한 원심분리 튜브에 대해 적합한 에펜도르프 서모믹서 상호교환가능한 블록.
- TURBO™ DNase (2 U/μL), 카탈로그 # AM2238; Life Technologies.
- 제조업체에 의해 공급된 바와 같은 TURBO™ DNase 10X 완충액; Life Technologies.
- 말베른 제타사이저 나노 S 역학적 광 산란 (DLS) ZEN 1600 분석기는 제어되고 데이터는 제타사이저 v. 7.11 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
분석 과정:
마딘-다비(Madin-Darby) 소 신장 세포 (MDBK)의 배양물은 파라인플루엔자 바이러스 3(PIV-3)으로 감염시키고, 세포 배양 상등액은 에틸렌이민 용액으로 불활성화시키고 한외여과에 의해 농축시켜 19.4X 농도 인자에 도달하도록 하였다. 위약 용액(음성 대조군)은 세포 배양물의 동결 및 해동을 반복적으로 수행하여 제조하였다.
샘플 희석:
샘플의 연속 희석물을 희석제로서 위약을 사용하여 제조하였다.
[표 11]
상이한 PIV-3 샘플의 제조를 위한 PIV-3 농축물의 희석 계획
Figure 112017001412617-pct00011
샘플 전처리:
a) 효소 분해:
i) 이전의 단계에서 수득된 4.5 mL의 각각의 샘플에 500 μL의 TURBO™ DNase 10X 완충액 및 5 μL의 TURBO™ DNase (2U/μL)를 첨가하였다.
ii) 37 ℃ 및 750 rpm에서 60분 항온처리는 15 mL의 튜브에 적합한 서모블록과 함께 에펜도르프 서모믹서를 사용하여 수행하였다.
iii) 1 mL의 각각의 샘플을 1.5 mL의 에펜도르프 미세원심분리 튜브로 옮기고 4℃에서 10분 동안 16000g에서 원심분리하였다. 상등액은 크로마토그래피 칼럼의 막힘 현상을 회피하기 위해 펠렛을 파괴하지 않도록 주의하면서 피펫팅함에 의해 새로운 튜브로 옮겼다.
크로마토그래피 전개:
i) 100 μL의 각각의 원심분리된, 분해된 샘플은 자동 주사 밸브내 측정 루프를 사용하여 주사하였다.
ii) GPC1 이동상에서 등장성 전개는 U.V. 프로필을 수득하기 위한 U.V 검출기에서의 254 nm에서 일정한 유동의 0.5 mL/분 모니터링 및 DLS 산란 광 강도 및 Z-평균을 획득하기 위한 연속 배위의 말베른 제타사이저 검출기를 사용하여 수행하였다.
iii) U.V. 프로필은 유니콘 소프트웨어 및 산란 광 강도를 사용하여 포획하여 분석하고 입자 직경의 Z-평균은 말베른 제타사이저 v. 7.11 소프트웨어를 사용하여 수집하여 분석하였다.
결과:
도 7a는 한외여과에 의해 수득된 PIV-3 항원 농축물의 254 nm하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 7b는 PIV-3 농축물의 20% 내지 100% 범위의 5개의 시험된 PIV-3 샘플로부터 수득된 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다.
도 7c는 샘플의 하나에 대해 UV 254 nm 크로마토그래피 프로필 및 DLS 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다. U.V. 및 DLS 프로필의 오버레이는 U.V.에 의해 트랙킹된 동정된 PIV-3 피크가 DLS에 의해 트랙킹되는 경우 분산된 광의 상당한 강도를 생성하는 유일한 피크임을 명백하게 보여준다. 상기 결과는 상기 샘플에서 PIV-3 바이러스 입자가 DLS 검출기에 의해 검출되기에 충분한 큰 강도로 광을 실제로 분산시키기 위해 충분히 큰 유일한 분자 종임을 지적한다.
도 7d에 지적된 바와 같이, 샘플의 추산된 바이러스 농도와 실제 바이러스 농도 간의 일정하고 강한 연합을 보여주는 결정 R2의 매우 큰 계수(0.9993)를 수득하였고, 이는 본 발명이 광범위한 바이러스 농도 상에서 PIV-3 입자 농도를 정확하게 추산할 수 있음을 시사한다.
인-라인 DLS 입자 크기 결정은 123 내지 138 nm 범위의 일정 판독값을 보여주었고 평가된 모든 농도 범위에 걸친 PIV-3 입자와 일치하였다(도 7d 및 표 12를 참조한다). 분석된 샘플 중 하나(바이러스 농축물의 80%)에 대해, DLS 시그날은 등록하는데 실패하였고 따라서, z-평균 크기 판독은 수행될 수 없다. 자외선 및 DLS 추적으로부터 수득된 모든 결과는 표 12에 요약한다.
[표 12]
PIV-3 농축물 및 이의 연속 희석 샘플의 자외선 및 DLS 분석
Figure 112017001412617-pct00012
III) 농축된 광견병 바이러스 샘플의 분석
사용되는 장비 및 수행된 과정은 하기의 차이점과 함께 실시예 2에 기재된 바와 동일하였다:
장비 및 작동 조건:
- 크로마토그래피 장비: 이분 펌프, 254/280 nm 고정된 파장 UV 검출기, 전도도 검출기 및 유니콘 컨트롤이 장착된 제네랄 일렉트릭 헬스케어 Akta 정제기 UPC-10 크로마토그래피 및 데이타 획득 소프트웨어를 사용하였다.
- 크로마토그래피 칼럼: TOSOH Bioscience TSK겔 G4000PWXL(7.8mm ID x 30.0cm L)은 또는 등가물은 가드 칼럼 또는 카트릿지 없이 사용하였다.
- 상이한 원심분리 튜브에 대해 적합한 에펜도르프 서모믹서 상호교환가능한 블록.
- TURBO™ DNase (2 U/μL), 카탈로그 # AM2238; Life Technologies.
- 제조업체에 의해 공급된 바와 같은 TURBO™ DNase 10X 완충액; Life Technologies.
- 말베른 제타사이저 나노 S 역학적 광 산란 (DLS) ZEN 1600 분석기는 제어되고 데이터는 제타사이저 v. 7.11 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
분석 과정:
베이비 햄스터 신장 세포(BHK21)의 배양물은 광견병 바이러스(종 파스퇴르 백신/PV)로 감염시키고, 세포 배양 상등액은 에틸렌이민 용액으로 불활성화시키고 한외여과에 의해 농축시켜 10.2X 농도 인자에 도달하도록 하였다. 위약 용액(음성 대조군)은 수거 시점에 감염된 배양물의 동일한 성장 연령의 비-감염된 세포 배양물을 수거함에 의해 제조하였다.
샘플 희석:
샘플의 연속 희석물을 희석제로서 위약을 사용하여 제조하였다.
[표 13]
상이한 광견병 바이러스 샘플의 제조를 위한 광견병 바이러스 농축물의 희석 계획
Figure 112017001412617-pct00013
샘플 전처리:
a) 효소 분해:
i) 이전의 단계에서 수득된 4.5mL의 각각의 샘플에 500μL의 TURBO™ DNase 10X 완충액 및 5μL의 TURBO™ DNase (2 U/μL)를 첨가하였다.
ii) 37℃ 및 750rpm에서 60분 항온처리는 15 mL의 튜브에 적합한 서모블록과 함께 에펜도르프 서모믹서를 사용하여 수행하였다.
iii) 1 mL의 각각의 샘플을 1.5 mL의 에펜도르프 미세원심분리 튜브로 옮기고 4℃에서 10분 동안 16000g에서 원심분리하였다. 상등액은 크로마토그래피 칼럼의 막힘 현상을 회피하기 위해 펠렛을 파괴하지 않도록 주의하면서 피펫팅함에 의해 새로운 튜브로 옮겼다.
크로마토그래피 전개:
i) 100μL의 각각의 원심분리된, 분해된 샘플은 자동 주사 밸브내 측정 루프를 사용하여 주사하였다.
ii) GPC1 이동상에서 등장성 전개는 U.V. 프로필을 수득하기 위한 U.V 검출기에서의 254 nm에서 일정한 유동의 0.5 mL/분 모니터링 및 DLS 산란 광 강도 및 Z-평균을 획득하기 위한 연속 배위의 말베른 제타사이저 검출기를 사용하여 수행하였다.
iii) U.V. 프로필은 유니콘 소프트웨어 및 산란 광 강도를 사용하여 포획하여 분석하고 입자 직경의 Z-평균은 말베른 제타사이저 v. 7.11 소프트웨어를 사용하여 수집하여 분석하였다.
결과:
도 8a는 한외여과에 의해 수득된 광견병 바이러스 항원 농축물의 254 nm하에 트랙킹된 크로마토그래피 프로필을 보여준다. 도 8b는 광견병 바이러스 농축물의 20% 내지 100% 범위의 5개의 시험된 광견병 바이러스 샘플로부터 수득된 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다.
도 8c는 샘플의 하나에 대해 UV 254 nm 크로마토그래피 프로필 및 DLS 크로마토그래피 프로필의 오버레이를 보여준다. U.V. 및 DLS 프로필의 오버레이는 U.V.에 의해 트랙킹된 동정된 광견병 바이러스 피크가 DLS에 의해 트랙킹되는 경우 분산된 광의 상당한 강도를 생성하는 유일한 피크임을 명백하게 보여준다. 상기 결과는 상기 샘플에서 광견병 바이러스 입자가 DLS 검출기에 의해 검출되기에 충분한 큰 강도로 광을 실제로 분산시키기 위해 충분히 큰 유일한 분자 종임을 지적한다.
도 8d에 지적된 바와 같이, 샘플의 추산된 바이러스 농도와 실제 바이러스 농도 간의 일정하고 강한 연합을 보여주는 결정 R2의 매우 큰 계수(0.9972)를 수득하였고, 이는 본 발명이 광범위한 바이러스 농도 상에서 광견병 바이러스 입자 농도를 정확하게 추산할 수 있음을 시사한다.
인-라인 DLS 입자 크기 결정은 106 내지 112 nm 범위의 일정 판독값을 보여주었고 평가된 모든 농도 범위에 걸친 광견병 바이러스 입자와 일치하였다(도 8d 및 표 14를 참조한다). 실제로 광견병 바이러스는 총알형 형태를 갖고 길이가 약 180nm이고 직경이 75 nm인 것으로 기재되어 있다. DLS 검출기는 각각의 입자의 수력학적 반경을 계산하고 상기 목적을 위해 DLS는 모든 입자가 구형임을 고려하기 때문에 상기 실험에서 수득된 크기 측정이 75 내지 180nm 범위인 것이 총체적으로 타당하다. 자외선 및 DLS 추적으로부터 수득된 모든 결과는 표 14에 요약한다.
[표 14]
광견병 바이러스 농축물 및 이의 연속 희석물의 자외선 및 DLS 분석
Figure 112017001412617-pct00014
결과의 해석
본 실시예는 본원이 외피 바이러스에 대한 광범위한 바이러스 농도 범위에서 정확한 측정을 생성시킬 수 있음을 설명한다.
하나의 양태에서, 본 실시예는 본원이 바이러스 농축물로부터 희석된 다양한 바이러스 샘플로부터 결정된 바이러스 농도의 높은 선형성에 지적된 바와 같이 광범위한 바이러스 농도 범위에서 BoHV-5, PIV-3 및 광견병 바이러스와 같은 외피 바이러스의 입자에 대해 정확한 측정을 생성시킬 수 있음을 보여준다.
본 실시예는 바이러스 농도와는 무관하게 BoHV-5 항원, PIV-3 항원 및 광견병 바이러스 항원의 크기 및 통합성을 일관되고 정확하게 특징분석하는 본 발명의 능력을 보여준다.
본 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 방법은 농축된 샘플에서 외피 바이러스 입자를 정량하고 특징분석하기 위해 매우 적합하고 따라서 과농축된 BoHV-5 항원 뱅크 또는 PIV-3 항원 뱅크 또는 광견병 바이러스 항원 뱅크에 적용될 수 있다.
실시예 7
산업적 세포 배양에서 FMDV 감염의 모니터링
본 실시예는 2000 리터의 산업적 세포 배양 생물반응기에서 감염 과정을 모니터링하기 위해 본 발명의 용도를 보여준다.
FMDV 감염 단계를 위해, 12용적%의 성숙한 소 혈청이 보충된 GMEM(Glasgov 최소 필수 배지)에서 2000 L의 BHK (베이비 햄스터 신장) 세포 현탁 배양물을 2.4 x 106 세포/mL의 세포 농도까지 성장시켰다. 일단 상기 세포 농도에 도달한다면, 상기 세포가 침강하도록 방치하고 혈청 함유 배지를 버리고 무혈청 GMEM으로 대체하였다. 일단 재현탁되면, 세포 배양물에 세포 당 0.001 내지 0.05 생존 바이러스 입자 범위의 MOI(감염 다중도)로 01 Campos FMDV 씨드 배양물을 접종하였다. 온도는 감염 전후 37℃에서 일정하게 유지하였다. 배양 샘플은 4시간 이하까지 1시간 간격으로 이후 30분 마다 인출시켰다. 세포 수는 개선된 뉴바우어(Neubauer) 혈구측정기에서 현미경 계수에 의해 결정하였다. 나머지 샘플은 원심분리하고 상등액은 본 발명을 사용하여 바이러스 농도를 정량하고 이의 크기 및 통합성을 측정 분석하기 위해 직접 분석하였다. 실시예 7의 결과는 도 9 및 표 15에 요약한다.
[표 15]
8시간 감염 동안에 바이러스의 농도, 크기 및 세포 수의 변화
Figure 112017001412617-pct00015
* 상기 값은 적합한 기술의 현재 검출 한계치 미만이고 따라서 본 실시예에서 백그라운드 노이즈로부터 상당히 상이한 것으로서 취할 수 없다.
감염 후 4시간 이하까지, 세포를 계속 성장시켰지만 전혀 또는 거의 바이러스가 검출되지 않았다. 4시간 내지 6.5시간까지, 바이러스는 U.V. 검출기에 의해 검출될 수 있지만 상기 시그날은 매우 낮아 정확한 DLS를 판독할 수 없었다. 이후 6.5시간 부터, 바이러스는 U.V. 및 DLS 검출기 둘다로 용이하게 검출할 수 있었다. 인-라인 DLS 검출기는 31 내지 35nm의 판독값을 생성시켰고, 이는 FMDV의 기재된 직경과 완전히 일치하였다.
본 실시예는 본 발명의 정량 및 특징분석 기술이 FMD 바이러스 입자의 매우 낮은 농도 범위에서 어떻게 수행될 수 있는지를 보여준다. U.V 검출기는 세포 배양의 감염 개시 후 6시간째에 254 nm에서 신뢰가능한 판독값을 제공하기 시작했다(현재 입증된 검출 한계치(LOD)인 1 μg/mL 보다 우수한 측정). 놀랍게도, DLS 검출기는 1.2 μg/mL의 출발 농도에서 FMDV 입자 크기의 신뢰할 수 있고 일관된 측정을 제공하기 시작했다. 이것은 DLS 검출기의 정상적 작동을 위해 통상 기재된 처리 단백질 농도가 본 실시예에 기재된 바이러스 농도 보다 높은 여러 등급 정도인 0.5 내지 2 mg/mL 범위에 있으므로 본 발명의 중요한 특징을 나타낸다.
또한, 본 실시예는 본 발명의 기술이 생존 FMD 바이러스 입자에 적용될 수 있음을 입증한다. 본 발명의 나머지 데이터와 함께 이들 데이터는 바이러스가 여전히 생존해 있든 또는 이것이 이미 불활성화되어 있든 상관 없이 상기된 기술이 FMD 백신의 제조 공정의 절대적 모든 단일 단계에서 사용될 수 있음을 추가로 입증한다. 또한, 본 발명의 기술은 소 로타바이러스, BoHV-5, PIV-3 및 광견병 바이러스와 같은 다른 유형의 생존 바이러스 입자의 제조 공정의 모든 단계 단계에 적용될 수 있다.
최종적으로, 보다 큰 광학적 경로 또는 감소된 배경 수준을 갖는 검출기와 같은 보다 최신의 U.V. 검출기의 사용이 본 발명의 검출 한계치(LOD) 및 정량 한계치(LOQ)를 예를 들어 0.1 μg/mL의 LOD 및 0.3 μg/mL의 LOQ로 추가로 감소시킬 수 있음은 합리적으로 예상될 수 있다.
실시예 8
칼럼-스위칭 시스템
하나의 양태에서, 본 발명은 모든 외피 및 비-외피 바이러스의 고속 처리 정량 및 특징분석 방법을 제공한다.
크기 배제 크로마토그래피의 특성으로 인해, 통상적으로 또 다른 샘플에 대한 새로운 라운드의 크로마토그래피를 개시하기 전에 이전의 샘플로부터 모든 피크를 완전히 용출시킬 필요가 있다. 따라서, 큰 분자량을 갖는 바이러스 항원은 크로마토그래피 전개의 처음 절반 동안에 정량될 수 있지만 다음 샘플의 분석은 이전 샘플의 저분자량 성분들이 칼럼으로부터 완전히 용출될때까지 개시될 수 없다. 다르게는, 다음 샘플의 바이러스 피크를 이전의 전개 샘플 기원의 길게 늘어진 피크와 겹쳐서 오염을 유발할 수 있다. 상기 시간 프레임내 포획된 데이터는 바이러스 함량을 정량하거나 항원 통합성을 결정할 목적으로는 쓸모없었다. 모든 저분자량의 성분을 용출하기 위해 요구되는 시간은 장비와 작동 시간의 비생산적 공회전으로서 간주될 수 있고 이는 궁극적으로 분석 연구의 전체 생산성을 감소시킨다.
자신의 UV 및 DLS 검출기 쌍을 갖는 또 다른 완전한 HPLC 시스템을 설정함에 의해 생산성을 증가시킬 수 있지만 이것은 매우 고가이고 FMDV 백신 제조 QC 연구에서 공간적 제약으로 인해 불편할 수 있다. 본 발명은 이중 UV 및 DLS 검출기를 가질 비용을 감소시키고 단일 칼럼 배위와 거의 동일한 장비 풋프린트(footprint)를 유지할 수 있는 칼럼-스위칭 시스템을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 칼럼-스위칭 시스템은 2개-밸브 어레이, 2개의 HPLC 펌프, 2개의 SEC 칼럼, 1개의 U.V. 검출기 및 1개의 DLS 검출기를 포함하도록 구성된다. 도 10에 도시된 바와 같은 또 다른 양태에서, 상기 시스템은 자동 샘플 채취기 및 폐기물 수거기와 같은 부품들을 추가로 포함한다. 상기 구성은 크로마토그래피 전개 시간을 절반으로 줄일 수 있음에 따라서 생산성을 효과적으로 배가시킨다. 본 발명의 칼럼-스위칭 시스템은 정량 및 특징분석의 필요성에 따라 임의의 적합한 형태를 취할 수 있고 다양한 특징부 및 부품으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 3개의 샘플 배치를 동시에 전개하기 위해 3개의 HPLC 펌프, 3개의 SEC 칼럼 및 1개의 DLS 검출기를 연결할 수 있다.
도 10에 도시된 바와 같이, 2개 밸브 어레이는 펌프, 자동 샘플 채취기, 상이한 유형의 칼럼, VU 검출기 및 폐기물 수거기와 같은 상이한 시스템 부품에 연결될 수 있는 밸브 1 및 밸브 2를 포함한다. 2개의 밸브는 본 발명의 칼럼-스위칭 시스템을 수행하기 위해 함께 독립적으로 제어되거나 작동될 수 있다.
전개하기 전에, 분석될 샘플은 자동 샘플 채취기에 위치시킨다. 평형화 완충액 및 세척 완충액과 같은 적당한 완충액은 2개의 펌프 아래에 위치시킨다.
도 10의 좌측 패널에 나타낸 바와 같이, 샘플은 펌프 B를 사용하는 칼럼 1에서 전개하면서, 칼럼 2는 펌프 A 기원의 적당한 완충액으로 세척되고 평형화된다. 바이러스 피크가 UV 검출기에서 용출되고 정량되고 수득된 바이러스 용출의 크기 및 통합성이 DLS 검출기에서 평가된 후, 상기 밸브 어레이는 도 10의 우측 패널에 보여지는 위치로 스위칭된다.
자동 샘플 채취기에서 다음 대기된 샘플의 분석은 이어서 칼럼 2에서 개시될 수 있다. 한편, 목적하지 않은 칼럼 1에 잔류하는 임의의 저분자량의 성분들은 펌프 A에 의한 평형화하에 폐기물로 직접 세정될 수 있다. 하기의 샘플을 위해, 밸브 어레이는 전후방으로 스위칭되고 용출된 샘플 분석은 자동 샘플 채취기에서 모든 샘플이 소모될때까지 칼럼 1 및 칼럼 2로부터 번갈아 수행한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 칼럼-스위칭 시스템에 구성된 칼럼에는 동일한 유형의 바이러스가 로딩될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 칼럼-스위칭 시스템에 구성된 칼럼에는 상이한 유형의 바이러스가 로딩될 수 있다. 이중 어느 하나의 경우에서, UV 및 DLS 검출기는 칼럼으로부터 후속적으로 용출된 피크를 정량하고 분석하여 고속 처리 분석을 성취한다. 튜빙, 칼럼 및 검출 시스템의 적당한 세척과 함께, 교차 오염 위험은 매우 낮고 따라서 분석 정확도는 보장된다.
하나의 양태에서, 상기 밸브는 펌프 및 자동 샘플 채취기와 같은 다른 시스템 부품의 기능을 제어하고 통합하는 동일한 소프트웨어 또는 UV 및 DLS 검출기로부터 데이터를 포획하는 소프트웨어에 의해 제어된다. 하나의 양태에서, Agilent 1260 인피니티 크로마토그래프를 제어하는 Agilent ChemStation 소프트웨어를 사용하여 전체 시스템을 제어한다. 또한, 하기의 단계를 포함하지만 이에 제한되지 않는 완전히 자동화된 공정을 수행하기 위한 프로그램을 예비 설정할 수 있다: 칼럼의 평형화 및 세척, 샘플의 칼럼으로의 주사, 트랙킹된 UV 프로필을 갖는 크기 배제 크로마토그래피 수행, 및 정량, U.V. 검출기 및 DLS 검출기를 사용한 용출된 피크의 특징분석 및 칼럼으로부터 폐기물 제거. 다른 자동화되거나 로보트 시스템을 또한 사용하여 정량 및 특징분석의 효율을 추가로 개선시키기 위한 전처리 단계에서 용매(예를 들어, 클로로포름) 추출 및 효소적 분해와 같은 단계를 수행할 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 시스템의 작동은 적합한 소프트웨어 및 시스템에 의해 엄격하게 제어된다. 예를 들어, UV 및 DLS 크로마토그래피를 생성하고, 통합하고 분석하는 소프트웨어 및 시스템을 사용하여 각각의 용출된 분획물의 크로마토그래피 데이터를 보다 용이한 해석을 위해 실시간 방식으로 분석 데이터로 전환시킬 수 있다. 통상적인 오류 조건(예를 들어, 누출, 과압)에 대한 경고 시스템 및 원격 제어 시스템이 또한 본 발명의 시스템에 포함될 수 있다.
본 실시예는 다중-칼럼 스위칭 시스템이 분석의 고속 처리를 추가로 증진시킴을 명백하게 보여준다. 상기 전체 시스템은 FMDV 항원 분석의 효율, 즉, 엔도뉴클레아제 분해에 의한 대형 DNA 분자 간섭의 제거, 용매(예를 들어, 클로로포름) 추출에 의한 대형 지질 잔기의 간섭 제거, SEC에 의한 저분자량 분자의 분리, SEC 칼럼의 배제 용적(또는 근사 배제 용적)으로 바이러스 입자의 용출, 2개 이상의 SEC 및 실시간 DLS 분석의 동시 전개를 크게 개선시키는 많은 상승 작용적 특징분석을 입증한다. 본 발명은 순수하게 분리된 외피 및 비-외피 바이러스 피크를 생성할 수 있고 크로마토그래피 전개 개시 20분 후 U.V. 검출기 및 DLS 검출기에 의해 용출된 피크를 분석할 수 있다. 본 발명은 스위칭 시스템이 다중의 DLS 검출기들을 필요로 하지 않고 전체 시스템을 세팅하기 위한 작업 공간을 최소화하기 때문에 바이러스 항원의 고속 처리 및 보다 저렴한 분석을 달성한다.
본 발명의 SEC의 하나의 양태에서, 바이러스 피크의 용출은 모든 바이러스에 대한 샘플의 주사 후 20분 마크전에 완료되고 전체 크로마토그래피는 칼럼으로부터 모든 저분자량 및 고분자량의 분자를 용출시키는데 약 50분 걸린다. 따라서, 하나의 샘플은 새로운 라운드의 분리를 위해 50분 마다 하나의 칼럼에 로딩할 수 있다.
칼럼-스위칭 시스템이 수행된 본 발명의 하나의 양태에서, 다음 샘플의 분석은 제1 샘플의 처음 20분 분석 후 수행될 수 있어 기계 및 시간의 사용을 최대화한다. 본 발명이 하루 당 적어도 57개 샘플의 정제, 정량 및 특징분석을 완료할 수 있는 것으로 추산된다.
2개의 SEC 칼럼을 포함하는 본 발명의 칼럼-스위칭 시스템의 하나의 양태에서, 하나의 샘플이 50분 마다 칼럼 각각으로 로딩되는 경우, 2개의 칼럼은 24시간 마다 약 57개의 샘플을 취급할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 칼럼-스위칭 시스템은 3개의 HPLC 펌프, 3개의 SEC 칼럼, 1개의 U.V. 검출기 및 1개의 DLS 검출기를 포함한다. 바이러스 피크가 샘플 주사 후 약 20분에 용출되기 때문에, U.V. 및 DL 검출기를 함께 갖고 있는 3개의 칼럼은 시간당 3개의 샘플을 취급할 수 있다. 상기 경우에, 하나의 샘플은 60분 마다 칼럼 각각에 로딩한다. 2개의 검출기는 제1 칼럼으로부터 용출된 바이러스에 이어서 제2 칼럼으로부터 및 최종적으로 제3 칼럼으로부터 용출된 바이러스의 시그날을 기록하여 분석한다. 바이러스 피크가 칼럼 번호 3으로부터 용출된 후, 상기 시스템은 칼럼 1로 다시 스위칭되어 다음 샘플을 로딩한다. 따라서, 상기 시스템은 24시간 후 약 72개 샘플을 취급하고 분석할 수 있다.
조악한 샘플에서 고도로 정제되고 농축된 샘플까지의 모든 유형의 샘플을 취급하는 능력에 추가로, 본 발명은 ELISA, SRID, 실시간 PCR, FPLC 및 146S 슈크로스 농도구배 기술과 같은 임의의 현재 기술에 의해 달성될 수 없는 매우 다재다능하고, 민감한 고속 처리 분석을 제공한다.
요약하면, 본 발명은 외피, 비-외피, DNA 및 RNA 바이러스를 포함하는 모든유형의 바이러스, 및 고순도의 이들의 항원들을 분리할 수 있고 매우 짧은 시간내에 높은 민감성 및 정확도로 이들 생성물을 정량하고 특징분석할 수 있는 방법 및 시스템을 제공한다. 실시예 4 내지 6, 및 도 4 내지 9의 데이터로부터, 본 발명이 바이러스 농도와는 무관하게 높은 재현성, 선형성, 정확도 및 민감성으로 다양한 바이러스를 정량하기 위해 사용될 수 있음은 의심할 여지가 없다. 본원에 제공된 데이터는 또한 본 발명이 높은 민감성 및 정확도로 다양한 유형의 바이러스의 크기 및 통합성을 결정할 수 있음을 입증하였다. 보다 중요하게, 본 발명은 백신 제조 공정의 임의의 단계로부터 취해진 고도로 정제된 샘플이든 또는 조악한 샘플이든 상관 없이 모든 종류의 샘플에 적용될 수 있다. 본 발명은 입자의 통합성에 영향을 주는 것 없이 고속 처리 방식으로 바이러스 입자의 양, 크기 및 통합성을 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이들이 본래의 샘플에 있는 바이러스 입자의 특징을 실제로 반영하는 분석을 제공한다. 명백하게, 본 발명은 바이러스 백신의 양 및 품질 둘다에서의 높은 요구 조건을 충족하는 바이러스 생성물의 매우 높은 고속 처리 분석을 가능하게 한다.

Claims (18)

  1. 다수의 정제되지 않거나 조악하게 정제된 표본 내의 하나 이상의 유형의 바이러스 또는 바이러스 입자의 양, 크기 및 붕괴 또는 응집을 측정하기 위한 방법으로서,
    a) 상기 다수의 정제되지 않거나 조악하게 정제된 표본을 하나 이상의 효소로 처리하여 다수의 바이러스 샘플을 수득하는 단계;
    b) 두 개의 펌프와 두 개의 칼럼을 포함하는 크로마토그래피 시스템을 설정하는 단계로서, 여기서,
    i. 제1 펌프는 제1 밸브를 통해 제1 크로마토그래피 칼럼에 연결되어 있고, 상기 제1 칼럼은 제2 밸브를 통해 역학적 광 산란(DLS) 검출기 및 UV 검출기를 포함하는 검출 시스템에 추가로 연결되어 있고;
    ii. 제2 펌프는 상기 제1 밸브를 통해 제2 크로마토그래피 칼럼에 연결되어 있고, 상기 제2 칼럼은 상기 제2 밸브를 통해 폐기물 수집기에 추가로 연결되어 있는, 단계;
    c) 완충액을 상기 제2 칼럼을 통해서 통과시키면서, 제1 바이러스 샘플을 상기 제1 컬럼에 적용하고, 상기 제1 바이러스 샘플을 상기 제1 칼럼으로부터 용출시키고, 상기 제1 바이러스 샘플 내의 바이러스 또는 바이러스 입자의 양, 크기 및 붕괴 또는 응집을 측정하기 위한 데이터를 상기 검출 시스템으로부터 수득하는 단계;
    d) 상기 제1 및 제2 펌프에 대한 연결체를 스위칭하여
    i. 상기 제1 펌프가 현재 상기 제1 밸브를 통해 상기 제2 칼럼에 연결되고, 상기 제2 칼럼은 상기 제2 밸브를 통해 상기 검출 시스템에 추가로 연결되고;
    ii. 상기 제2 펌프가 현재 상기 제1 밸브를 통해 상기 제1 칼럼에 연결되고, 상기 제1 칼럼이 상기 제2 밸브를 통해 상기 폐기물 수집기에 추가로 연결되어 있도록 하는, 단계;
    e) 완충액을 상기 제1 칼럼을 통해서 통과시키면서, 제2 바이러스 샘플을 상기 제2 컬럼에 적용하고, 상기 제2 바이러스 샘플을 상기 제2 칼럼으로부터 용출시키고, 상기 제2 바이러스 샘플 내의 바이러스 또는 바이러스 입자의 양, 크기 및 붕괴 또는 응집을 측정하기 위한 데이터를 상기 검출 시스템으로부터 수득하는 단계; 및
    f) 단계 (c) 내지 (e)를 반복하여 상기 다수의 바이러스 샘플의 양, 크기 및 붕괴 또는 응집을 측정하기 위한 데이터를 상기 검출 시스템으로부터 수득하는 단계
    를 포함하는, 하나 이상의 유형의 바이러스 또는 바이러스 입자의 양, 크기 및 붕괴 또는 응집을 측정하기 위한 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 바이러스 또는 바이러스 입자가 외피 바이러스, 비-외피 바이러스, DNA 바이러스, RNA 바이러스, 생 바이러스, 생-약독화된 바이러스, 불활성화된 바이러스, 재조합 바이러스, 바이러스 벡터 또는 바이러스형 입자인, 방법.
  3. 제1 항에 있어서, 상기 바이러스가 구제역 질환 바이러스(FMDV), 소 헤르페스바이러스 5(BoHV-5), 소 헤르페스바이러스 1(BoHV-1), 파라인플루엔자 3 바이러스(PIV-3), 소 로타바이러스, 광견병 바이러스, 소 바이러스 설사 바이러스, 소 호흡 신시티알 바이러스(BRSV), 돼지 시르코바이러스 2(PCV-2), 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스(PRRSV), 돼지 파르보바이러스(PPV) 또는 블루텅 바이러스(BTV)인, 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 샘플이 동일한 유형의 바이러스 또는 바이러스 입자, 또는 상이한 유형의 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함하는, 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 정제되지 않거나 조악하게 정제된 표본이 바이러스-감염된 세포 배양물의 상등액, 또는 백신 제조 공정으로부터의 중간체 생성물인, 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 효소가 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 제한 효소, DNase 또는 RNase인, 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 단계 (a)에서의 하나 이상의 효소에 의한 처리가 상기 바이러스의 정량 및 특징분석을 방해하는 분자를 제거하는, 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 정제되지 않거나 조악하게 정제된 표본이 단계 (a)에서의 상기 하나 이상의 효소에 의한 처리 전에 또는 그 후에 용매로 처리되는, 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 용매가 클로로포름, 벤젠, 톨루엔, 헥산, 펜탄 및 옥탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 비극성 용매인, 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 크로마토그래피 시스템이
    a. 상기 바이러스 샘플을 크로마토그래피 칼럼으로 주입하기 위한 자동 샘플 채취기; 및
    b. 상기 크로마토그래피 시스템의 다수의 성분들의 기능을 통합하고 제어하기 위한 하나 이상의 시스템중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 1항에 있어서, 상기 검출 시스템으로부터의 데이터가 용출된 바이러스 샘플의 제1 크로마토그래피 프로필을 포함하고, 정제된 바이러스 또는 전체 통합성 바이러스 입자의 참조 샘플의 제2 크로마토그래피 프로필과의 상기 제1 크로마토그래피 프로필의 비교가 붕괴된 바이러스 단편으로부터 전체 통합성 바이러스 또는 바이러스 입자의 구분을 가능하게 하는, 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 크로마토그래피 칼럼이 크기가 10 내지 200nm 범위이고 분자량이 105 내지 109 돌턴 범위인 입자를 분리하도록 디자인된, 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
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