CN105158130A - 高通量量化及分析口蹄病病毒及相关产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高通量方法来量化病毒及病毒分子和分析其大小和完整性。在一个实施例中，本发明的方法使用层析系统和同轴动态光散射(DLS)技术以量化和分析口蹄病病毒(FMDV)的大小和完整性。在一个实施例中，本发明还包括一个用于运行多个层析柱的切换系统以同时进行多个分析。本发明还提供了一种方法来开发和评估包含口蹄病病毒的产品以防止口蹄病。在一个实施例中，本发明的方法用于评估口蹄病病毒的稳定性。在另一个实施例中，本发明的方法用于监控制造口蹄病疫苗的过程的质量。

Description

高通量量化及分析口蹄病病毒及相关产物的方法
此专利申请以申请号为62/009,126在2014年6月6日申请的美国专利申请作为优先权。上述提及的专利申请的所有内容和公开都结合在此申请中。
在此专利申请中的所有不同的参考文献和公开都在此合并到此专利申请中从而更全面描述此发明从属的技术领域。
技术领域
本发明涉及口蹄病病毒(FootandMouthDiseaseVirus,FMDV)的量化和分析。本发明有助于开发用于预防口蹄病的产品，以及评估包含口蹄病病毒的产品。
背景技术
口蹄病或手足口病(FootandMouthDisease,FMD)是一种急性的全身性病毒感染，主要影响供人食用的动物，例如牛﹑绵羊﹑山羊﹑猪以及其它偶蹄类动物。口蹄病的高度传染性大大影响了畜牧业的生产力和经济,因此即使其死亡率极低,口蹄病仍是畜牧业中最严重的疾病之一。
口蹄病在全球多个地方流行。世界动物卫生组织(OIE)定期发布口蹄病的分布和爆发图。由于OIE对肉类贸易市场的限制,OIE颁报的卫生状况对依赖于肉类贸易的国家(特别是受口蹄病影响的国家)产生深远的经济影响。
大多数发达国家通过有效的疫苗和严格的监控计划成功根除口蹄病。但即使制定了严格的国际贸易政策，口蹄病最近在欧洲(2000及2001年)和日本(2000及2010年)仍发生了大爆发。
尽管很多国家的所有或部分领土范围获得OIE认可其“因接种疫苗而消除口蹄病,freefromFMDwithvaccination”的状态，但其邻近国家的口蹄病爆发仍造成持续的威胁。
經過不断的努力开发,現時已不需依賴大规模地增殖病原体來獲取重组亚基疫苗,目前的疫苗都是源自經灭活的病毒，并透過浓缩和提纯這些病毒以達至一定的抗原质量,以产生具保护性的免疫反应。制造这些疫苗的厂房需符合OIE的NBS生物安全等级4的要求。估计每年全球生产的口蹄病疫苗数量為25至30亿劑。
此外，很多国家建立了应急方案以确保在口蹄病爆发时可以快速地制备疫苗应急。例如将口蹄病病毒抗原冷冻储存，以建立抗原储存库。
以灭活病毒制备的疫苗通常用于根除口蹄病和在紧急的情况下使用，疫苗效果大大依赖于疫苗制剂的抗原有效载荷和病毒的完整性。
口蹄病病毒(FMDV)包裹在非脂质的包膜内，呈二十面体对称。口蹄病病毒的直径大小为28至40纳米。整个病毒的颗粒在体外极度不稳定，当温度超过56℃及pH值小于6时，病毒即分离成为单份子。现知有7个口蹄病病毒血清分型，分别是O型﹑A型﹑C型﹑SAT1型﹑SAT2型﹑SAT3型和Asia1型。
现时一般推荐使用140S(146S)量化蔗糖密度梯度分析方法以量化病毒抗原。该方法由Barteling和Meloen(BartelingSJ,MeloenRH.Asimplemethodforthequantificationof140Sparticlesoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV).ArchGesamteVirusforsch,1974；45(4):362–4)建立，在过去30年里一直被视为测定病毒浓度的可靠方法。该方法需要将样本放在20-45％浓度梯度的蔗糖中,并对此进行超速离心。蔗糖梯度可通过人手或使用简易的梯度混合器将浓度较低的蔗糖液放在浓度较高的蔗糖液上预备。
146S分析方法的原理是口蹄病病毒颗粒会根据其沉降系数在相应的蔗糖梯度中分布,从而将不同的FMD病毒的颗粒分离。因此，该方法只能间接地检测病毒颗粒的完整性。
尽管国际间致力将口蹄病病毒的检测方法标准化，但至今还仍未有一个普遍认可的方案或国际标准。这可能是由于检测方法涉及复杂的技术和需要特殊的设备所致(BartelingSJ.Needforfurtherstandardizationofthe146-Stestasthebasisforfinal-Foot-and-MouthDisease(FMD)Vaccineformulation.EUFMDResearchGroupMeeting1999-Appendix17)。
缺乏检测口蹄病疫苗中活性成分的标准方法是引致临床试验费用高昂且繁琐的主要原因。每个批次的疫苗一般需要在临床试验中使用17-20只大型动物以进行口蹄病疫苗登记和发放疫苗。
过去数十年间，人类和动物健康相关的行业见证了政府对制备药物和生物制药产品的生产质量管理规范(GoodManufacturingPractice,GMP)的规管愈来愈严格。期间出现了新的规管概念,例如过程分析技术(ProcessAnalyticalTechnology,PAT)。根据食品和药品监督管理局(FDA)的定义,PAT是一个通过测量影响关键质量参数(CriticalQualityAttributes,CQA)的关键工序参数(CriticalProcessParameters,CPP),进而设计﹑分析和控制药品生产过程的体系。
对疫苗工业，特别是由完整抗原制备的疫苗(例如灭活病毒疫苗或经减毒的活性病毒疫苗)来说，需要能在纳米范围内可靠地量化和测定的颗粒大小的方法和设备以监控生产疫苗的过程。监控生产过程能确保生产过程每个步骤中的病毒抗原合符所需质量,因此十分重要。然而，涉及病毒的颗粒的生产流程复杂,因此相比普通重组蛋白(例如单克隆抗体)其分析困难很多。其中一个挑战就是当前许多疫苗的生产方法都是开发于数十年前,当时仍未有开发出无血清的培养基。因此,现时制备疫苗通常需要使用添加了包含高蛋白量血清的培养基。另外，通过感染细胞培养物而获得的病毒颗粒其产量通常每公升只有数毫克，这与重组蛋白例如单克隆抗体的表达相比小若干个数级。另一个要点是，一些病毒例如口蹄病病毒会出现裂解性复制周期。此时,细胞会被摧毁,细胞的细胞质和细胞核中的所有物质(包括遗传物质如核酸以及来自细胞膜的残留脂质)会释放到细胞培养液，这些物质的存在使分析变得更加困难。
分子排阻层析法(size/molecularexclusionchromatography)根据分子的流体力学体积(hydrodynamicvolume)将不同的分子分开。因此,即使分子量不同,具有相近流体力学体积的不同分子一般在分子排阻层析柱内的流动性相近。非常复杂的生产流程一般涉及大分子量的DNA及脂质,由于这些物质的流体动力学体积与病毒相近,因此分子排阻层析法通常不能将病毒与这些物质分开。
以蛋白或病毒为主的疫苗是常用的疫苗模型,用于将抗原运送到目标受体以进行免疫。疫苗的成效大大取决于所运送的抗原是否具有正确或天然的构象,因为只有正确或天然的构象才能呈现适当的抗原表位，从而诱导特异并有效的免疫反应。因此，错误折迭﹑降解或聚集的抗原都可能降低甚至不能引起特异性的免疫反应。动态光散射法(DynamicLightScattering,DLS)有助于评估蛋白性或病毒性疫苗的完整性和稳定性,从而评估其效力。通过分析DLS图谱，可以检查抗原在一段时间后或在特定缓冲器或温度下存储是否已出现降级或聚集,从而确保疫苗的效力。
分离方法例如分子排阻层析法只考虑颗粒的流动性，仅能粗略地估计颗粒的大小,因此不能灵敏地侦测到抗原尺寸上的细微分别。DLS可以灵敏和准确地检测和估计的颗粒的大小，因此可以侦测到颗粒尺寸上的细微差别。然而，DLS只能估计高度纯化的颗粒的完整性和大小。
由于口蹄病与全球的经济相关，因此必需不断地改进预防口蹄病的措施，特别是改进疫苗和/或制备疫苗的方法。本发明提供了一种能大量和准确地对口蹄病病毒及相关产品进行量化和分析的方法。本发明提供一个有效且划算﹑用于监控口蹄病病毒疫苗质量的工具，可以满足口蹄病病毒疫苗数量和质量上不断增长的需求。
例如,中国市场作为世界上最大的口蹄病疫苗市场，每年需要17亿剂量(每剂量为2毫升)。以现时的工业规模为例,每一批次可达500万剂(即每一批次达一万公升),即是每年需要由不同厂商生产将近340批疫苗以应付中国市场的需要。由于庞大的生产量，截至今日，中国兽医管理局已不再监控每一批的口蹄病疫苗的质量，仅信赖各疫苗生产商的表现。口蹄病疫苗的质量监控通常利用体内效能测试来进行。虽然这些体内效能测试可以大量地评估疫苗的质量，但涉及复杂和繁琐的程序。目前仍未有开发出可以大量及快捷地对疫苗进行质量监控的体外技术。
本发明首次开发一种体外系统能够大量地量化每剂量的抗原负载和测定灭活抗原的大小和完整性。本发明提供了一个相比体内效力测试系统更简化的系统以监控口蹄病疫苗的质量，从而提高产品的质量。本发明估计可以在短短几天完成340个批次疫苗的质量监控。
因此,本发明可以提高疫苗的质量，并为动物带来更好的保护以对抗口蹄病。
发明内容
为了改善目前预防口蹄病的方法和产品，本发明开发了一个结合使用分子排阻层析法及同轴动态光散射(in-linedynamiclightscattering)检测的方法以量化及分析口蹄病病毒(FMDV)。本发明所描述的方法可以大量地并精准地量化和分析口蹄病病毒。
在一个实施例中，本发明提供一种方法用来量化口蹄病病毒(FMDV)的颗粒以及检测它们的大小和完整性。在一个实施例中,这些口蹄病病毒颗粒来自复杂的生产流程，单单通过分子排阻层析法不能将流程中的污染物与口蹄病病毒颗粒分开。
在一个实施例中，本发明的方法还包括一个或多个在进行分子排阻层析法和动态光散射分析之前的样本预备步骤。所述样本预备步骤包括使用溶剂如氯彷进行溶剂萃取步骤，和使用内切酶如进行内切核酸步骤。
在一个实施例中，本发明提供一种用于从含有口蹄病病毒颗粒的产品分离和纯化口蹄病病毒的方法。
在一个实施例中，本发明提供一种用于设计和制备防止口蹄病的制剂产品的方法。
在一个实施例中，本发明提供一种用来评估含有口蹄病病毒的产品的方法,用作评估的参数可以是抗原的数量和稳定性。这些产品包括但不限于含有口蹄病病毒的抗原库存和疫苗。
在一个实施例中，本发明提供一种方法用来监控生产过程期间的中间产品的质量，所述方法测量中间产品当中的口蹄病病毒数量以及测试当中的口蹄病病毒的完整性和大小。
本发明的方法可以大量地并精准地量化和分析病毒如口蹄病病毒(FMDV)。
本发明的方法结合使用两个样本预备步骤及分子排阻层析法,随后使用侦测250-280nm的紫外线检测器及动态光散射检测器作色谱分析。本发明提供了一个突破性的改进方法,用于量化及分析口蹄病疫苗的生产流程中每个步骤所得的口蹄病病毒颗粒。两个样本预备步骤有助将分子分开,使本发明可以大量地量化及分析不同来源包括来自非常复杂的生产流程的口蹄病病毒。复杂的生产流程一般涉及如大分子量的DNA或脂质残基的污染物,由于这些污染物的流体动力学体积与病毒相似,因此单单使用分子排阻层析法(SEC)通常不能将病毒与这些物质分开。并且,分子排阻色谱法仅考虑分子从层析柱洗脱出来的洗脱体积,因此只能间接地及粗略地估计分子的大小。本发明使用动态光散射法(DLS)则可以准确地计算分子的大小。
本发明的方法可以快速并准确地评估口蹄病病毒颗粒的浓度及品质如病毒颗粒的结构完整性和大小。与传统146S蔗糖梯度法相比,本发明采用的动态光散射法(DLS)的测量更精细和准确,因此可以更准确地估计及直接监测病毒抗原的完整性和大小。
经校准的分子排阻层析柱装有层析介质，介质的孔径需要有一定大小以允许部分蛋白分子﹑蛋白段和蛋白聚集体进入介质的内部,进而评估生物制药各种制剂和产品当中的纯化蛋白或肽有否出现聚集或分解成段。然而，DLS只能用来分析具有高纯度的颗粒的完整性和大小。DLS一般不适用大量分析复杂的蛋白溶液或在生产流程期间并未经纯化的中间产物，这些中间产物通常包含其他污染物如DNA或脂质分子。由于分子排阻层析(SEC)的运行较短,此方法不能完全分开溶液中不同分子的蛋白峰,因此不能充分地评估不同分子的大小。SEC-DLS和SEC-MALS(Multi-AngleLightScattering,多角度光散射)技术已被用于量化及分析高度纯化的病毒颗粒和病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLP),但不能用于分析未经提炼或复杂的样本。本发明的方法则可以成功地应用于整个生产病毒颗粒或疫苗过程中所有类型的样本,以及来自其他来源或过程的样本,包括但不限于:a)培养在生物反应器内的细胞的病毒感染(见实施例5)，当中的病毒浓度非常低，但污染物(如牛血清中的蛋白﹑来自裂解细胞的蛋白﹑因细胞膜被破坏而释放的细胞DNA及脂质残基)的水平非常高；b)抗原被浓缩至高至150倍更高的浓度(见实施例4)；c)在制备疫苗最终的制剂前，确定每剂疫苗的适当的有效载荷，以及d)最终制剂产物包括配制成水包油乳剂(W/O)或水包油包水双重乳剂(W/O/W)的疫苗。不论是取自非常复杂和初步程序的中间样本,还是高度纯化的口蹄病病毒参考标准,本发明的方法都可以高效地﹑准确地和大量地定量和分析口蹄病病毒及其产物。
在一个实施例中，本发明的方法每天可以量化及分析(例如完整性和大小)约60至约70个口蹄病病毒样本，这数量远比其他技术的处理量高。由于运行快速蛋白液相层析法(FPLC)所需的设备要求较长的运行时间(如3小时),限制了FPLC每个工作天最多1只能处理4个样本。另一方面，传统的146S技术每个工作日最多只能分析12个样本。
本发明的方法与现有的技术非常不同，因为本发明的方法可以成功地应用到取自所有种类的过程步骤的样本，包括未经纯化的中间产物和已纯化的病毒样本。这是由于本发明的方法采用的同轴DLS检测器可以大量并直接地测量病毒颗粒的完整性和大小。
在一个实施例中，本发明提供了一個可與本发明的方法或其他适用的方法来进一步增加样本處理量的多柱切换系統(见实施例6)。在一个实施例中，本发明提供了一個柱切换系统，它能够同时运行多个柱和DLS检测器以大量地分析樣本。如上所述,大部分层析技术如快速蛋白液相层析法(FPLC)的運行時間都較長(如3小时),因此多柱切换系統并不適用於這些技术。
抗原的三维结构的任何改变,特别是抗原的重要表位的结构的改变可能降低抗原的免疫原性。本发明的分析方法具有高灵敏度,可以检测在病毒抗原颗粒其直径的微小变化。现有的传统检测技术如146S蔗糖梯度技术或层析法是不能检测如此细微的变化。因此，本发明能够检测抗原大小的微小变化，并大大改进了抗原质量的分析方法。
在一个实施例中，本发明的方法使用高效液相层析法(HPLC)量化及分析整个口蹄病病毒(FMDV)。在一个实施例中，本发明的方法包含以下步骤:将包含口蹄病病毒的样本注入到层析柱内,洗脱样本，分析预定洗脱时间范围内的色谱图，并确定口蹄病病毒颗粒的数量﹑完整性和大小。
在一个实施例中，本发明的层析柱是分子排阻层析柱。
在一个实施例中，本发明的层析柱可以分開直徑為20-200纳米或更闊的范围内﹑分子量在105-109Da或更闊的范围内的颗粒。
在一个实施例中，预定的洗脱时间范围是由纯化口蹄病病毒的参考或标准样本的层析色谱所决定。
在一个实施例中，本发明的方法可以量化浓度范围为5-70微克/毫升或3-300微克/毫升的口蹄病病毒抗原或颗粒,这远比现有技术覆盖的浓度范围更广泛。在另一个实施例中，本发明方法可以量化浓度范围为1.2-750微克/毫升的口蹄病病毒抗原或颗粒。在另一个实施例中，本发明方法可以量化浓度高于750微克/毫升的口蹄病病毒抗原或颗粒。
在一个实施例中，本发明的方法不受口蹄病病毒抗原或颗粒的浓度影响,在不同浓度都可以非常准确地检测抗原或颗粒的大小和完整性。本发明进行了实验,証明本发明的方法使用同轴DLS可以精确地测量浓度范围为1.2-750微克/毫升的口蹄病病毒样本的大小，而且测量不受其浓度影响(见实施例4和5)。本发明的实验结果首次显示同轴DLS可以涵盖广阔的病毒浓度范围并能准确地分析口蹄病病毒的大小及完整性。
本发明的紫外线量化方法经实验証实其再现性﹑特异性﹑线性﹑准确性﹑精准度和强健性。此方法是首个通过验证的技术,能够量化口蹄病病毒并同时分析经量化的口蹄病病毒的大小及完整性。由于口蹄病病毒与完成纯化或粗略纯化样本中的大多数组分相比的尺寸较大,因此传统的分子排阻层析技术或可将口蹄病病毒及这些低分子量的组分分开,并于层析柱的排阻体积(即空隙体积)或接近的体积洗脱出口蹄病病毒。可是，高分子量的组分如大分子量的DNA及脂质具有与口蹄病病毒相似的流体动力学体积,因此分子排阻层析法通常不能将病毒及这些物质分开。此外，口蹄病病毒大多不能进入分子排阻层析柱的孔隙,只能直接穿过层析柱。不同大小的口蹄病病毒会在接近的洗脱体积被排出层析柱。因此分子排阻层析法或其他类似技术不能分别大小有轻微改变的口蹄病病毒。离线DLS极受分子分散性的影响,假若样本中同时有大及小的颗粒,其结果会有很大的偏差。因此,离线DLS只能应用于某些样本以准确地测量其中病毒的大小。反之，本发明结合使用DLS和SEC-HPLC,可以从样本高度纯化出蛋白峰并随后利用所得的纯化物以直接测量病毒的大小,而不受样本中其他组分的影响。单纯考虑色谱迁移(如分子排阻层析法)是不可以直接及准确地测量病毒的大小。
在一个实施例中，本发明的层析或色谱图分析是通过侦测波长为250-280纳米的紫外线和动态光散射(DLS)检测器进行。在另一个实施例中，层析或色谱图分析是通过同轴动态光散射(DLS)检测器进行。本方法采用的同轴动态光散射检测器可以直接及实时分析地分析整个分子排阻色谱图,以快速和准确地评估口蹄病病毒抗原的浓度及质量。
在一个实施例中，口蹄病病毒样本的层析分析是通过比较完整口蹄病病毒颗粒其预定尺寸分布来进行的。含有纯化口蹄病病毒的参考或标准样本先通过层析法和同轴DLS分析以测量出每个口蹄病病毒菌株的大小,从而确定口蹄病病毒颗粒的预定尺寸分布。
在一个实施例中，分析纯化样本的色谱图可以分辨出完整病毒颗粒及病毒解体后的片段如12S颗粒或病毒壳粒(capsomers).
在另一个实施例中，本发明的层析分析方法通过比较一个或多个口蹄病病毒的参考样本,能够检测样本中相同病毒菌株的尺寸偏差(例如在20-60纳米的范围内)。
在一个实施例中，本发明的方法每天可以量化多达57个口蹄病病毒样本及分析其大小和完整性。在另一个实施例中，本发明的方法每天可以量化多达72个口蹄病病毒样品及分析其大小和完整性。
在一个实施例中，本发明的口蹄病病毒样本包括但不限于:源自受口蹄病病毒感染的细胞培养物的上清液﹑制造疫苗过程的中间产物﹑抗原﹑抗原库存﹑疫苗﹑一价疫苗或多价疫苗。
在一个实施例中，可以在使用层析柱前使用溶剂预先处理口蹄病病毒样本。在一个实施例中，本发明所用的溶剂是一种非极性或脂溶性溶剂，包括但不限于，氯彷﹑苯﹑甲苯﹑己烷﹑戊烷和辛烷。在一个实施例中，本发明所用的溶剂是极性有机溶剂，包括但不限于，甲醇﹑乙醇﹑异丙醇﹑二氯甲烷﹑丙酮和乙腈。在一个实施例中，可以共同使用一种或多种类型的溶剂以预先处理样本。
在一个实施例中，可以在使用层析柱前使用一种或多种酶预先处理口蹄病病毒样本。在一个实施例中，本发明所用的酶是核酸酶，包括但不限于,DNA酶﹑RNA酶﹑核酸内切酶﹑核酸外切酶和限制性内切酶。在一个实施例中，本发明所用的酶是﹑TURBOTM﹑DNaseT7核酸内切酶﹑S1核酸酶﹑P1核酸酶或核酸内切酶I。在一个实施例中，核酸酶将大分子量的DNA(脱氧核糖核酸)切割成较小分子的DNA，然后可通过层析柱将较小分子的DNA分离。
在另一个实施例中，可以预先处理单价疫苗或多价疫苗，以除去核酸酶程序中的佐剂。
在一个实施例中，可以通过以下方法制备纯化的口蹄病病毒参考或标准样本:使哺乳动物的细胞培养物感染口蹄病病毒﹑使用化学试剂灭活病毒，以及一个或多个以下步骤:对蔗糖梯度进行超速离心﹑超滤﹑离子交换层析法或分子排阻层析法。
在另一个实施例中，纯化的口蹄病病毒参考或标准样本可以通過除去疫苗的佐剂制备。
在一个实施例中，本发明的方法可以从包含口蹄病病毒颗粒的产品分离出及纯化口蹄疫病毒颗粒。
在另一个实施例中，本发明的方法用于确定生产口蹄病病毒疫苗过程中每个步骤的病毒抗原的数量及分析其完整性和大小,从而监控生产过程的质量。本发明结合使用DLS和分子排阻层析法,以监测用来生产病毒抗原的感染流程的动力学(见实施例6)。通过检查存活病毒的数量和质量(例如完整性和大小)，本发明大大提高了监控过程的水平，使之符合生产兽用疫苗最高的质量标准,即过程分析技术(PAT)的国际准则。
在一个实施例中，本发明的方法是能够检测口蹄病病毒的产物是否被其它病毒污染。有时,用于生产口蹄病病毒的细胞或会受其他病毒或病原体污染,这些病毒或病原体随后亦会在培养生物反应器中繁殖。由于大多数病毒的分子量大，口蹄病病毒和其他病毒多会在分子排阻层析柱的排阻体积被洗脱,因此单单使用分子排阻层析柱并不能够去除甚至检测样本中的非口蹄病病毒。反之，本发明通过分析DLS数据能够检测与口蹄病病毒大小不同的其他病毒或病原体的存在。例如，如样本存在比口蹄病病毒较大的病毒，蛋白峰的分散光强度(dispersedlightintensity)和/或Z-平均(Z-average)读数会上升。本发明的方法通过比较受污染和不受污染的样本的DLS数据,可以快速地评估污染的程度。
在一个实施例中，本发明的方法通过比较不同批次的口蹄病病毒疫苗或产品的紫外线和DLS图谱,可以用来评估不同批次的疫苗或产品是否存在显着不同。假如紫外线和DLS图谱恆常不变,表示疫苗或产品的生产过程正常以及产品的质量得以保持。假如紫外线和DLS图谱出现任何可检测的差异,则表示生产过程可能有问题或有偏差,或表示当中可能有污染。因此,本发明的方法可以提供更好的质量监控，以确保产品的质量和疗效一致。
在另一个实施例中，本发明用于评估含有口蹄病病毒抗原的产品中抗原的稳定性。本发明的评估方法包括量化两个不同时间点取得的样本中口蹄病病毒颗粒以及分析其完整性和大小,再量化病毒颗粒在两个时间点其数量﹑大小和/或完整性的分别,从而估计病毒抗原的稳定性。本发明的方法还可以用于分析存储在不同温度或在不同的缓冲液,或以不同佐剂配制的病毒颗粒。
在另一个实施例中，本发明用来评估并制备口蹄病病毒的单价疫苗或多价疫苗。本发明的方法可以量化每剂量的疫苗的抗原的有效载荷,并分析疫苗中抗原的完整性和大小。
在一个实施例中，本发明提供一种用于量化和分析口蹄病病毒的方法，方法包括以下步骤:
a)使用一种或多种酶处理包含口蹄病病毒的原始样本,以获得多个口蹄病病毒样本；
b)将第一个口蹄病病毒样本置于一个层析系统内,所述层析系统包括多个泵和多个层析柱，其中
i)第一个泵通过第一个阀门连接到第一个层析柱，所述第一个层析柱进一步通过第二个阀门连接到一个检测系统,所述检测系统包含一个动态光散射检测器和一个紫外线检测器；以及
ii)第二个泵通过第一个阀门连接到第二个层析柱，所述第二个层析柱进一步通过第二个阀门连接到废物收集匣,
其中所述第一个口蹄病病毒样本在第一个层析柱中运行，清洗缓冲液在第二个层析柱中运行；
c)从所述第一个层析柱洗脱所述第一个口蹄病病毒样本，并从所述检测系统获得层析图谱，所述层析图谱用于量化及分析所述第一个口蹄病病毒样本；
d)切换第一个泵和第二个泵的连接,其中
i)所述第一个泵通过所述第一个阀门连接到所述第二个层析柱，所述第二个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到所述检测系统；以及
ii)所述第二个泵通过所述第一个阀门连接到所述第一个层析柱，所述第一个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到所述废物收集匣；
e)将第二个口蹄病病毒样本注入所述第二个层析柱，并将清洗缓冲液注入所述第一个层析柱；
f)从所述第二个层析柱洗脱所述第二个口蹄病病毒样本，并从所述检测系统获得层析图谱，所述层析图谱用于量化及分析所述第二个口蹄病病毒样本；以及
g)重复步骤(b)至(f)，以量化和分析所述多个口蹄病病毒样本。
在一个实施例中，本发明所用的酶是内切酶﹑核酸外切酶﹑限制性内切酶﹑DNA酶或RNA酶。在一个实施例中，本发明方法中的包含口蹄病病毒的原始样本是源自受口蹄病病毒感染的细胞培养物的上清液﹑制造疫苗过程的中间产物﹑抗原﹑抗原库存﹑疫苗﹑一价疫苗或多价疫苗。
在一个实施例中，包含口蹄病病毒的原始样本在进行层析前使用溶剂处理。在另一个实施例中，原始样本在进行酶处理前或后使用溶剂处理。在一个实施例中，溶剂为以下非极性溶剂:氯彷﹑苯﹑甲苯﹑己烷﹑戊烷或辛烷。
在一个实施例中，本发明的层析系统包含两个层析柱。在另一个实施例中，本发明的层析系统包含三个层析柱。
在一个实施例中，本发明用来量化及分析口蹄病病毒的方法包括确定样本中口蹄病病毒的大小及完整性。
在一个实施例中，本发明的层析柱可以分开直径为20-200纳米或更阔的范围内及分子量为105-109Da或更阔的范围内的颗粒。
在一个实施例中，样本的层析图谱与纯化口蹄病病毒参考样本的层析图谱比较,或与完整的口蹄病病毒颗粒的层析图谱比较,从而分辨完整的口蹄病病毒颗粒和分解的口蹄病病毒片段。
在一个实施例中，本发明的方法可以分开与口蹄病病毒具有相似洗脱体积的大分子量DNA或脂质分子。
在一个实施例中，本发明提供一个用于高通量量化及分析包含口蹄病病毒颗粒样本的系统。该系统包含以下部件:用于注入样本的自动进样器﹑两个或多个用于分离口蹄病病毒颗粒的层析柱,层析柱可以是不同或相同类型﹑两个或多个用于驱动层析柱的泵﹑至少一个紫外线检测器,用于制备洗脱口蹄病病毒颗粒的层析或色谱图及量化病毒颗粒﹑至少一个动态光散射(DLS)检测器，用于确定洗脱口蹄病病毒颗粒的尺寸和完整性﹑一个废物收集匣,用于收集从层析柱洗脱出来的液体；以及多个阀门阵列,当中包括两个或更多个阀门以连接多个系统部件。
在一个实施例中，本发明的系统两个或更多的层析柱顺序地洗脱口蹄病病毒颗粒。系统可以顺序地分析这些病毒颗粒的色谱图,因此可以即时并大量地确定口蹄病病毒颗粒的数量﹑大小和完整性。
在另一个实施例中，本发明的系统进一步包括一个或多个控制系统,用于整合和控制多个系统部件的功能。
通过引用以下的实验细节，可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应理解所提供的实施例仅作为说明作用，而非限制本发明的范围。本发明的范围将由随后的权利要求所界定。
在本申请中的，引用了不同的参考文献或出版物。这些参考或出版物的全文和公开都结合到本申请中,从而更全面地描述本发明的情况。应当指出的是，过渡语“包含”与‘包括’﹑‘含有’或‘以…为特征’是同义的，是包括性或开放式的，当中并不排除有另外未列举的元素或方法步骤。
附图说明
图1所示的是纯化口蹄病病毒O1Campos的色谱图的一个实施例。图1A是254nm下的色谱图，图1B是动态光散射(DLS)的色谱图。
图2所示的是纯化口蹄病病毒O1Campos经过1小时56℃的加热及使用核酸酶内切核酸后所得的色谱图的一个实施例。图2A是254nm下的色谱图，图2B是动态光散射(DLS)的色谱图。
图3A-3C所示的是量化浓缩物当中的口蹄病病毒颗粒的一个实施例,浓缩物由PEG沉淀所得并在进行层析前经氯彷萃取及处理。图3A比较经氯彷萃取及处理的样本以及未经任何处理的样本的254nm色谱图。图3b比较两个经氯彷萃取的样本的254nm色谱图,其中一个样本进一步以处理,另一个样本没有被未处理。图3C比较两个经处理的样本的254nm色谱图,其中一个样本进一步以氯彷萃取,另一个样本没有进行氯彷萃取。
图4A-4C所示的是量化口蹄病病毒抗原的一个实施例,其中的样本为经超滤浓缩(ultrafiltrationconcentration,UF)获得的抗原浓缩物的连续稀释。图4A是经超滤浓缩(UF)获得的口蹄病病毒抗原浓缩液在254nm下的色谱图。图4B显示5个口蹄病病毒样本重迭的色谱图。图4C显示两个含有20％或80％病毒浓缩液的动态光散射(DLS)色谱图。
图5是病毒浓度(μg/mL),病毒颗粒大小(nm)与稀释百分比的关係图及回归线。
图6是一个2000公升细胞培养生物反应器中口蹄病病毒感染的时间进程图。其中显示了感染后首8个小时内病毒的浓度(μg/mL)﹑细胞数量(106细胞/mL)和病毒颗粒大小的变化。
图7是本发明的层析柱切换系统的一个实施例,该系统并行操作两个分子排阻层析柱和一个动态光散射(DLS)检测器。图左边和图右面的设置可以互相切换。
具体实施方式
实施例1
口蹄病病毒参考样本的制备
本实施例描述制备口蹄病病毒参考样本的步骤，以获得的口蹄病病毒颗粒预定洗脱体积(或时间)和预定大小分布。
溶液：
透析膜调节缓冲液：
体积：1升
组分：10mMNaHCO3；1mMEDTA.
透析缓冲液：
体积：5升
成分：100mMNaCl；50mMTrisBase；pH＝8
三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液：:
体积：5升
成分：200mMNaCl；20mMTrisBase；pH＝8
病毒悬液：
体积：200亳升
成分：口蹄病病毒株O1Campos
步骤
第一步：透析
本步骤用来降低病毒悬浮液的离子强度以与随后的酶消化相容,因此不需稀释样本及增加样本体积。
1.将透析袋放入装有透析膜调节缓冲液的玻璃烧杯中，沸腾至少30分钟。用水冲洗5次，4℃储存备用。
2.封闭透析袋下端，装入样本。
3.在4℃下以800亳升透析液中对病毒悬浮液样本透析4次,每次2小时。
4.在1800亳升透析液中透析病毒悬浮液样本，在4℃放置过夜。
第二步：酶消化
本步骤用来消除样本中对核酸酶敏感的杂质。
1.酶制剂：使用时，在10亳升37℃预热的透析缓冲液中加入25微升(250U/微升)的核酸酶。酶稀释液的最后浓度为：25微升x250U/微升＝6250U/10亳升＝625U/亳升。
2.酶消化：将透析过的病毒悬浮液装入50亳升离心管中进行分离，每支体积为24亳升。每支管中加入1亳升酶稀释液。盖紧离心管盖，将其水平放入37℃预热的摇床中。
3.充分搅拌样本2小时，避免起沫。
第三步：凝胶渗透层析法进行脱盐程序
本步骤用来更换参考样本的缓冲液，以除去参考样本中的低分子量成分物质。
1.用500亳升Tris缓冲液冲洗葡聚糖凝胶S-300树脂(SephacrylS-300)两次作平衡程序，调整树脂的体积至最终230亳升。树脂压紧后的总体积为150亳升，柱的总体积为250亳升。
2.用平衡后的葡聚糖S-300树脂制备层析柱:
a.向柱子加入230亳升的悬浮液。
b.静置树脂过夜。
c.将金属网筛盘放置在凝胶上。
d.在金属网上加入25亳升的Tris缓冲液。
e.连接Tris缓冲液到贮液器。
f.向贮液器注入200亳升的Tris缓冲液。
g.截断Tris缓冲液及贮液器的连接。
h.打开柱子开关，直到缓冲液刚刚达到金属网面位置，然后关闭开关。
脱盐/消除低分子量組分：
a.在凝胶上加入43亳升的样本。
b.打开开关，使样本进入凝胶。
c.在柱子中加入60亳升Tris缓冲液。打开开关，收集含有病毒的洗脱物。在4℃储存洗脱物。
d.用300亳升Tris缓冲液平衡柱子。
e.重复以上步骤，直到完成所有样本。如果加入到柱子中最终样本体积小于43亳升，在加入柱子前用Tris缓冲液将样本体积調配到43亳升。
f.結合洗脱所得的样本。
g.用300亳升Tris缓冲液清洗柱子。卸载柱子，用20％乙醇冲洗树脂兩次，每次500亳升。
第四步：评估参考样本
对从第三步获得的洗脱物进行蔗糖梯度离心﹑紫外线分光光度滴定和分子排阻层析法等，来评估获得口蹄病病毒颗粒样本是否纯化。
实施例2
口蹄病病毒颗粒的量化和分析
本实施例描述了本发明如何对生产流程的中间样本和最终产品,以及对口蹄病病毒疫苗中的口蹄病病毒病毒颗粒进行量化及分析其完整性和大小。其中,量化及分析与样本的纯度无关。在一个实施例中，紫外线用于确定峰面积以计算病毒浓度，DLS则用于分析病毒颗粒的尺寸和完整性
设备及操作条件:
·InfinityAgilent1260層析系统:配备有泵，在线脱气系统，自动进样器，样本冷却模块，柱調温箱，可調節波长的紫外線检测器，和PC版OpenlabCDSChemstation软件。
·層析柱：TOSOHBioscience的TSKgelG4000PWXL(内径：7.8亳米，长：30.0厘米)或其他类似層析柱。可选配保护柱TSKgelPWXLGuardcol(内径：6.0亳米，长：4.0厘米)或类似保护柱,以及选配PhenomenexSecurityGuard保护柱芯GFCAJO-4489-4000。
·相容于24x1.5亳升组块的Eppendorf恒温混匀器互换组块(ThermomixerInterchangeableblock)
·GPC1流动相液(30mMTris,400mMNaCl,pH＝8).
·SigmaE1014-25KU-≥250units/μL,≥90％(SDS-PAGE).
·稀释缓冲液(50mMTris,20mMNaCl,2mMMgCl2).
·工作液浓度(1.25U/μL).
·稀释缓冲液：30mMTris,pH＝8.
·MalvernZetasizerNanoS动态光散射(DLS)ZEN1600分析仪，配置7.02版Zetasizer软件
·流动相操作试剂盒,配有HellmaAnalytics176.751-QSZEN0116流動池
分析过程:
a)样本的预先处理
i)氯仿萃取
(1)受感染细胞培养物的上清液﹑制备乳剂前及超滤浓缩物的水溶相液
将5毫升的样品分装至15亳升的离心管中，然后向离心管中加入5亳升氯彷，猛烈震荡2分钟将之混匀，再在4℃以4500RPM离心15分钟。将离心样本的上层水溶液分离并转移至另一个15亳升离心管。重复进行氯彷萃取并将离心样本的上层水溶液分离并转移至另一个离心管。对于超滤病毒浓缩物,进行上述步骤后向每2毫升的萃取水溶液加入1毫升的30mMTris，pH＝8的溶液以稀释样本,这样可以在进行酶消化前减低的样本的离子强度。
(2)使用PEG沉淀以制备病毒浓缩物
使用磁力搅拌器不断搅拌样本以防止沉淀物沉降。抽取10毫升浓缩病毒并将之转移到250毫升的烧杯中。使用30mMTris，pH＝8的溶液稀释样本至最终100毫升的体积。在4℃搅拌过夜。抽取5毫升的稀释浓缩物并如前面段落中描述进行氯彷萃取。
(3)水包油乳劑口蹄病病毒樣本
将20亳升市售的油脂性疫苗分装至50亳升的离心管中，然后向离心管中加入20亳升氯彷，猛烈震荡5分钟将之混匀，再在4℃以4500RPM离心15分钟。将分离的水溶相液转移至另一个50亳升的离心管，再次加入20亳升氯彷，猛烈震荡5分钟将之混匀，再次在4℃以4500RPM离心15分钟，再次将的水溶相液分离并转移至另一个50亳升离心管，所得的水溶相液为用来分析水包油乳剂疫苗的样本。
ii.酶消化
上述水溶相液样本可直接使用或在适当时候采用本发明前述的方法进行预先处理。将在步骤i.获得的1亳升样本转移至1.5亳升Eppendorf离心管。加入20微升酶稀释液(1.25U/微升)，即是将25U加入到离心管中，用Eppendorf恒温混匀器以1400RPM转速(高速)在37℃下震动混匀60分钟。将样本管从恒温混匀器中取出，置于4℃，在离心力16000g下离心10分钟。收集上清液，小心勿碰到沉淀物，将收集的上清液转移至HPLC管中，再盖上HPLC盖子。可以直接使用实施例1中准备的参考样本或校准样本，也可在进行层析分析前采用与处理测试样本同样的方法进行预先处理。本发明使用的Eppendorf高速恒温混匀器以微处理器控制,能够同时处理24个样本管。因此,可以同时对24个样本进行消化程序并能减少样本体积与HPLC更相容。
b)層析分析
依据样本类型安排样本的次序。连接好层析系统的洗脱线路：样本首先进入层析柱，流经紫外线检测器，再进入ZEN1600DLS分析器的Hellma流动池。在DLS分析器的Zetasizer软件上作适当的设置。对应病毒的峰的在层析柱的停留时间大约为15-16分钟(或对应的洗脱体积)，但实际的停留时间取决于层析的洗脱条件。整合对应病毒的峰，并根据下列公式计算对照样本中FMDV的浓度。
FMDV[μg/mL]＝(面积×10×1.02)/(Ft×72×b×Volinj)
其中：
面积：曲线下面积，其单位为mAU*s，mAU*min或mAU*mL
10：单位转换系数
1.02：Benzonase溶液的稀释校正系(如适用)
72：FMDV在254E1％的质量吸收系数
Ft:流量-时间系数，0.5mL/min的層析流速下，面积的单位为mAU*s，mAU*min
和mAU*mL时，Ft分别等于120，2和1
b：UV流動池的光程长度，单位为cm
Volinj：样本体积，单位为mL
对于超滤病毒浓缩物,由于样本在酶消化前被稀释2/3倍,因此需要将其结果乘以1.5倍。
DLSZetasizer软件产生流量踪迹(FlowTrace)与体积/时间(Volume/Time)图。通过记录的峰的洗脱时间/体积和Z-平均(Z-average)直径(d.nm)以取得FMDV峰信号。
采用以下参数以确认分析程序的有效性：a)对照样本的校准曲线的斜率为86.4(mAU*s)/(mg/mL)±8.64，b)X-轴上截距的绝对值小于对照样本的平均浓度的10％，c)FMDV峰的Z-平均(Z-average)直径介于28-40nm。
在一个实施例中，本发明的方法参考从相同口蹄病病毒株的参考或标准样本获得的实验参数以验证测试结果。所考虑的参数包括选择性﹑峰纯度﹑准确度﹑反应的线性﹑重复性﹑中间精密度﹑检测限度和量化限度。在一个实施例中，本发明使用分别涵盖高及低量的口蹄病病毒的两个参考或标准样本以验证测试结果。
在一个实施例中，本发明的方法包括一个或多个无病毒的阴性对照以验证测试结果。阴性对照可以是通过冷冻/解冻被裂解的哺乳动物细胞样本,而且被本发明所述的预先处理程序预先处理。
当确定了分析程序有效后，就可以直接计算样本中口蹄病病毒的数量，或通过对照样本的校准曲线计算出的曲线面积，进而计算测试样本中FMDV的数量。
在一个实施例中，本发明使用的层析柱的长度是30厘米。在一般情况下，较短的层析柱需要较短的运行时间，但其解析度较低(特别是对具有相近流体动力学体积的颗粒而言)。本技术领域的普通技术人员可以根据样品类型调整层析柱的长度。
在一个实施例中，可使用TOSOHBioscienceTSKgelG4000PWXL分子排阻层析柱以在很短的运行时间内充分地将口蹄病病毒颗粒及污染物分开。取决于样品的性质，其它的孔尺寸或以其它形式或材料制造的树脂亦可用于制备本发明的分子排阻层析柱。但是，应该注意的是，树脂的孔径不仅影响层析柱的解析度，亦影响层析的运行时间。例如，如果树脂的孔大得足以让病毒进入树脂内，或需更长的时间来洗脱口蹄病病毒，因此延长了整个分离过程。
结果分析
分析未经加热和加热后纯化口蹄病病毒O1Campos的参考样本的样本(FMD病毒分解)
本实施例描述本发明的方法如何量化口蹄病病毒病毒颗粒以及分析其完整性及大小。
本实施例亦証明了本发明的方法可以检测纯化O1CamposFMD病毒参考样本经加热及核酸酶()消化后所产生的病毒颗粒片段(12S或衣壳蛋白)。
图1A是纯化口蹄病病毒O1Campos在U.V.254nm的色谱图，色谱图仅显示一个单峰,其洗脱体积是6.33mL。采用公式FMDV[μg/mL]＝(面积[mAU*mL]X10)/(1X72X0.5[cm]X0.1[mL])计算曲线下的面积。计算出病毒的浓度为421.7μg/mL。表1列出了洗脱样本(峰)其UV色谱分析的参数。
表1-纯化口蹄病病毒O1Campos的色谱分析参数：
峰 洗脱体积(ml) 面积(mAU*ml) 高度(mAU)
1 6.33 147.1057 217.037
图1B是由DLS检测器记录的光散射强度踪迹图(Intensity,实线)，在同样的体积范围内出现了一个轻微向左倾斜的单峰。Z-平均踪迹(Z-average,点)显示此峰对应平均直径为29.28nm的颗粒。该尺寸与已知的口蹄病病毒颗粒的直径一致。表2列出了洗脱样本(峰)其DLS分析的参数结果。
表2-纯化口蹄病病毒O1Campos的DLS分析参数:
图2A是纯化口蹄病病毒O1Campos经过1小时56℃的加热及使用核酸酶内切核酸后所得的色谱图。56℃可使病毒分解成12S颗粒和/或衣壳蛋白，并使病毒RNA露出从而被核酸酶降解。表3列出了洗脱样本(峰)其UV色谱分析的参数。
表3-纯化口蹄病病毒O1Campos经过加热及核酸处理后的色谱分析参数：
峰 洗脱体积(ml) 面积(mAU*ml) 高度(mAU)
1 7.54 2.6846 5.946
2 9.83 172.3857 265.774
经热和酶处理后的纯化口蹄病病毒O1Campos在U.V.254nm的色谱图中出现了两个峰，小峰出现于7.54mL，大峰出现于9.83mL。未经加热处理和酶处理的O1Campos参考样本的色谱图中所观察到单峰在此色谱图中完全消失。
图2B中DLS检测器记录的光散射强度踪迹图(Intensity,实线)出现了双峰，表4列出了洗脱样本(峰)的DLS分析的参数结果。
表4-纯化口蹄病病毒O1Campos经过加热及核酸处理后的DLS分析参数:
第一个峰(于6.27mL至6.6mL之间)，只有散射光强度的6.2％，并且与U.V.检测结果不对应。此峰的Zaverage踪迹显示了该颗粒的大小在20到60nm之间，Z平均值为33.42nm。使用抗口蹄病病毒蛋白抗体进行蛋白质印迹分析得出，该峰对应未有因为加热及酶处理而分解的病毒颗粒(未显示数据)。
第二个峰(于7.21至9.48mL之间)，Z平均值直径为13.03nm，并且与U.V.254nm色谱图中出现于7.54mL处的小峰相对应。该峰在蛋白质印迹分析中有强烈信号(数据未显示)。根据所测定的大小及蛋白质印迹分析结果，该峰代表口蹄病病毒分解后的片段(12S和/或衣壳蛋白)，由于这些分解成分完全由蛋白质组成，所以在UV254nm的吸收低(见图2A中7.54ml处的峰值)。
在UV色谱图(图2A)中9.83mL洗脱体积处，DLS检测器(图2B)未检测到洗脱峰。口蹄病病毒RNA基因组经消化后降解为核苷酸和/或寡核糖核苷酸，DLS检测结果与所得的核苷酸的结果相一致。
实施例3
氯仿萃取及 對量化由PEG沉淀所得口蹄病病毒浓缩物中的病毒颗粒的影響
本实施例描述了合并使用核酸酶及氯彷萃取的效果。在一个实施例中,使用去除细胞DNA污染物以及使用氯彷萃取去除脂质污染物。
设备及操作条件:
本实施例的所用的设备﹑试剂和溶液与实施例2相同,除下列差别之外：
-層析系统:通用电气(GeneralElectric)的净化系统UPC-10，配有254/280nm固定UV波长和电导率检测器与Unicorn控制软件
-PEG浓缩病毒的稀释缓冲液:30mMTris，100mMNaCl，pH＝8
分析步骤:
受口蹄病病毒O1Campos感染的幼仓鼠肾(BHK)细胞培养物的上清液经化学灭活后,对样本加入PEG6000的浓溶液至最终5.5％的PEG浓度以沉淀病毒。沉淀72小时后，弃去上清液及收集口蹄病病毒浓缩物。浓缩物达至50倍(50X)的浓缩水平。
随后以稀释缓冲液(30mMTris，100mMNaCl，pH＝8)将所收集的病毒浓缩物稀释10倍，置于4℃以磁力搅拌过夜降低PEG浓度并使病毒颗粒回复其可溶形态。
a)样本的预先处理
从稀释的口蹄病病毒的浓缩物抽取四个样本，并在进行层析分析之前分别对四个样本进行以下预先处理程序：
i)将5mL氯彷加入到5mL的样本中，猛烈震荡将之混匀。用离心机将混合物消除形成的乳液，并使用吸管收集上层的水溶液。
ii)如实施例2中所述对2mL的样本使用进行酶消化。
iii)如实施例2中所述对2mL从步骤i)收集的水溶液使用进行酶消化。
iv)2mL的样品，既不使用氯彷萃取，也不进行酶消化处理。
在进行层析分析前，先在离心力16000g下对四个样本进行离心以消除任何非溶性物质，在不干扰沉淀物的情况下将样本的上清液转移至新容器中。
b)层析分析
如实施例2中所述,对四个样本进行层析分析。注射体积为100μL，在254nm下进行监测。
结果分析
图3显示本实施例的结果。图3A比较了未经处理的和充分处理的样本。在未经处理的样本中,对应病毒及核酸峰以肩峰的形式出现,显示层析柱不能将两者分开。在此情况下，由于样本存在核酸污染物,病毒峰的积分分析并不准确。相反，在经处理的样本中，病毒峰以对称的高斯钟形曲线(Gaussianbell)形式出现，其信号随后能重回基线水平。图3B显示省略酶处理对氯彷萃取样本的效果，该图显示造成不同病毒峰形状的原因是酶消化这步骤。图3C显示了即使在酶消化后，样本中仍存在高分子的脂质物，这些脂质物在层析柱的排除体积中洗脱。这些脂质污染物可以通过氯彷萃取除去。省略氯彷萃取或会导致过度估计样品中的病毒含量。
实施例4
口蹄病疫苗的稳定性测试
本实施例描述了本发明被应用于测试口蹄病病毒疫苗的稳定性。
如以上实施例所述的方法,对在4℃储存前及后的口蹄病疫苗中的病毒颗粒进行分析。通过分析U.V.色谱图和DLS踪迹图可计算出口蹄病病毒颗粒的数量和大小。口蹄病病毒颗粒储存前后的数量变化可以通过相比储存前的病毒颗粒数量的百分比来计算。也可通过比较图谱分析口蹄病病毒颗粒的完整性。
实施例5
高浓度口蹄病病毒粒子的量化和分析
本实施例描述了本发明通过超滤技术获得高浓度的口蹄病病毒。本发明测量来自高浓度口蹄病病毒的不同稀释样本的病毒浓度,从本实施例的高度线性结果可以看出本发明能在宽阔范围的病毒浓度内精确地测量样本的病毒浓度。
本实施例亦証明本发明能一致并准确地分析口蹄病病毒抗原的大小而不受病毒浓度的影响。
采用超滤技术浓缩抗原是制造口蹄病疫苗过程中常用的步骤。细胞在生物反应器培养时被感染后会产生低浓度的病毒材料，这些病毒材料会即时通过化学方法将其灭活。可是,由此所得的病毒材料并不适用于疫苗制剂，其中一个原因是材料的病毒颗粒浓度低。其中一种可以克服这个问题的的方法是使用超滤技术以增加病毒颗粒的浓度。在浓缩过程期间，需要密切监测病毒的浓度和质量以评估浓缩过程的产率和抗原的完整性。本实施例证明了不论是低浓度取自细胞感染物的上清液,还是高浓度的口蹄病病毒颗粒浓缩物,本发明都可以非常精确地计算出病毒浓度。本实施例测试了高达150X的浓度(对应本实施例的727μg/mL浓度)。另外，同轴DLS可以灵敏和准确地在宽阔的浓度范围内检测到颗粒尺寸和完整性。改变浓缩过程的条件例如温度﹑pH值﹑剪切速率或会显着地影响病毒颗粒的完整性,因此需要使用能涵盖宽阔的浓度范围的方法以监察浓缩过程。本发明可以应用于不同浓度的抗原样本,并可以用于确定生产抗原流程中的浓缩步骤是否成功及质量。因此，本发明可以作为过程分析技术(PAT)的最终工具，并保証所得的抗原浓缩物符合质量。
本实施例通过超滤技术浓缩口蹄病病毒O1Campos,并利用所得的浓缩物评估本发明所测定的结果是否符合线性反应。结合病毒悬浮液的初始体积﹑体积缩小比率以及超滤过程期间进行的HPLC检定的结果,估计出病毒悬浮液的病毒浓度约为700-800微克/毫升。根据表5的稀释方案在三个不同的日子各自制备一组连续稀释物。随后该三组连续稀释物进行如实施例2中描述的方法预先处理,及使用Agilent1200色谱仪分析样本。重复注射每个样本到Agilent1200色谱仪,一共获得两组数据。本实施例亦分析了口蹄病病毒浓缩物及稀释缓冲液两个样本。所述稀释缓冲液具有以下组分：300mMNaCl；20mMTrisbase；pH＝8。
表5–使用口蹄病病毒的浓缩物制备稀样本的方案
分析所得的紫外线峰面积并计算各样本中口蹄病病毒颗粒的浓度。图4A为经超滤过程(UF)后获得的口蹄病病毒抗原浓缩物在254nm下的色谱图。图4B为5个口蹄病病毒样本(涵盖20％至80％的口蹄病病毒浓缩物)重迭的色谱图。计算三组连续稀释物中每个重复注射样本的结果平均值。列图表示计算出的病毒浓度及浓度百分比的关係(图5)。计算三组连续稀释物的病毒浓度的平均值并进行回归分析。如图5中所示,系数R的数值高达0.9984，显示所估计的病毒浓度和样品的实际病毒浓度之间的关联恒定和健壮，这表明本发明能够精确地估计广阔范围内的病毒浓度。使用与HPLC直接连接的MalvernNanoSDLS仪器每10秒一次收集动态光散射数据。使用MalvernZetasizer软件分析对应病毒峰的数据,图4C显示软件分析出来的Z-平均直径。同轴DLS测定出有关病毒峰的大小为29.9至34.2纳米,这与在不同浓度下测定的口蹄病病毒颗粒的大小相符(见图5和表6)。表6总结了所有从紫外线和DLS图谱分析所得的结果。
表6–三组连续稀释物的紫外线和DLS图谱分析结果
在100mAU至1500mAU的范围内,测光误差一般是相当低的。从此可以合理地推算本发明可以准确地量化比本实施例所测量的病毒浓度高于2-3倍的病毒浓度,即可以测量高达约2250μg/mL的浓度。另外，如需要测定高浓度的病毒样本,亦可以注入较小的样本体积(例如50微升而非100微升),或简单地根据所需浓度稀释样本并使用稀释倍数校正所获得的结果。因此，本方法可以应用于远远超出现时任何实际生产过程所需要的浓度范围。
动态光散射检测器一般能应用于2mg/mL或更高浓度的蛋白样本。因此,本发明的同轴DLS检测方法可以准确地测定如本实施例所示﹑具有更高浓度的蛋白样本。
口蹄病疫苗生产流程一般需要将从细胞培养的感染步骤中得到的病毒浓缩10至60倍。然而，如需要制备浓度非常高的口蹄病毒抗原存库时,或需要将样本浓缩至150甚至200倍。本实施例所用的高度浓缩病毒材料浓度为727μg/mL,即对应于150倍的浓度倍数。尽管不同口蹄病病毒的浓度上限值或有不同且需要个别地确定,可以合理地估计口蹄病病毒抗原可以浓缩至高达1250μg/mL(即1.25mg/mL)或更高的浓度，而不会对对口蹄病病毒颗粒的溶解度有负面影响。
本实施例証明本发明的方法非常适合用于浓度十分高的样本以量化及分析口蹄病病毒颗粒，因此可以应用于高度浓缩的抗原存库。
疫苗的常规病毒浓度一般因应不同病毒株﹑国家管理机构的要求以及疫苗的药学技术性质而决定。口蹄病疫苗最常见的是水包油乳液或水包油包水双乳液两种类型。用于制备乳液的水溶相液的病毒浓度为约2μg/mL到60μg/mL。
实施例6
监察工业用细胞培养生物反应器的口蹄病病毒感染情况
本实施例描述本发明用于监察在2000公升细胞培养生物反应器中的感染过程。
以下为感染病毒的步骤:将2000公升的幼仓鼠肾(BabyHamsterKidney,BHK)细胞在补充有12％(以体积计)的成年牛血清的GMEM(GlasgowMinimalEssentialMedium)培养基中培养至2.4×106/mL的细胞浓度。一旦达到所需细胞浓度，使细胞沉降，去掉含血清的培养基并用不含血清的GMEM取代。在培养基中重悬细胞，并在细胞培养物中接种口蹄病病毒O1Campos的培养种(seedculture)。该病毒培养种的感染复数(multiplicityofinfection,MOI),即感染一个细胞所需的细菌数量,为0.001至0.05。感染前后的温度都是恒定地保持在37℃。培养样品1小时到4小时，4小时后以每30分钟的间隔抽取样本。使用改进的Neubauer血细胞计数器在显微镜下计算细胞的数量。将剩余的样本离心并收集上清液。再用本发明的方法直接测量病毒浓度和分析病毒的大小和完整性。
图6及表7综合了实施例6的结果。
表7-感染后首8个小时内病毒浓度﹑病毒大小和细胞数量变化。
时间(小时) 病毒浓度(μg/mL) 病毒大小(nm) 细胞数量(x106/mL)
0 0.03* / 2.38
1.0 0.01* / 2.52
2.0 0.01* / 2.56
3.0 0.01* / 2.78
4.0 0.12* / 2.80
4.5 0.18* / 2.58
5.0 0.19* / 2.54
5.5 0.25* / 2.16
6.0 1.22 31.0 2.06
6.5 2.72 32.3 1.20
7.0 3.85 33.4 0.60
8.0 5.20 34.7 0.06
*病毒浓度低于现有验证技术的检测限制，因此不能视为与背景信号具有显着分别。
细胞在感染后4小时持续生长，但样本没有检测到病毒或只检测到很少的病毒。从4至6.5小时期间，UV检测器可以检测出病毒，但所得的信号太低并不足以获取准确的DLS读数。从6.5小时起，UV和DLS探测器都很容易地探测到病毒。同轴DLS检测器计算出的尺寸为31-35纳米，这读数符合已知口蹄病病毒的直径。
本实施例说明本发明可以在极低的口蹄病病毒颗粒的浓度范围内量化及分析病毒颗粒。紫外线检测器在感染后6小时开始提供可靠的254nm读数(可测量1μg/mL或以上的浓度,对应现时经验证的检测限值(limitofdetection,LOD)。意想不到的是，DLS检测器在1.2μg/mL的起始浓度开始可以可靠地和一致地测量口蹄病病毒颗粒的大小。这是本发明的其中一个重要特征。DLS检测器在正常操作下一般适用于0.5至2mg/mL的蛋白浓度,这相比本实施例所述的病毒浓度高多于千倍。此外，由于进行了使用溶剂和核酸酶的预先处理步骤，本发明可以去除样品中干扰检测的大分子量污染物，从而获得高纯度的口蹄病病毒颗粒以进行量化和分析。其他技术例如子排阻层析柱多会在相近的洗脱体积范围内洗脱病毒和大分子量污染物,因此无法充分地纯化及分析病毒。
此外,本实施例证明，本发明的技术可以应用于存活的口蹄病病毒颗粒。本实施例以及本发明的其他数据进一步证明了本发明的技术可以应用于制造口蹄带疫苗过程中每一个步骤,不管病毒是仍然活着，或者已经被灭活。
最后，可以合理地预期当使用更现代的紫外线探测器时，例如具有更大光径或更低背景信号的检测器，可进一步降低本发明的检测限值(limitofdetection,LOD)及定量限值(limitofquantification,LOQ)，例如0.1μg/mL的检测限值和0.3μg/mL的定量限值。
实施例7
层析柱切换系统
在一個實施例中,本发明提供一個可以高通量量化及分析口蹄病病毒及相关产物的方法。
受限於分子排阻層析法的性质，通常需要从層析柱洗脱先前样本所有的峰才可以开始對另一個樣本進行新一轮的層析。因此，即使高分子量口蹄病病毒抗原可以於層析過程的上半部被洗脫及分析,但由於样本中低分子量的成分未完全从柱上洗脱出來,因此不能對另一個樣本進行分析。否则，下一个样本的病毒峰或會与先前層析尾随的峰叠加，造成病毒样本污染。因此,这段時間所收集的数据對量化病毒及确定抗原完整性是沒有用的。從層析柱洗脱所有的低分子量组分所需的时间浪費了设备和操作者的时间，井最终降低了分析实验室的整体效率。
虽然可以通过设置另一个包括紫外线检测器和DLS检测器的完整HPLC系统以提高效率,但整套设备昂贵而且需要佔用实验室狭小的空间,因此为疫苗的质量监控实验室带来不便。本发明提供了一种层析柱切换系统，能够省却重复设置紫外线检测器和DLS检测器的费用，并使整套设备仅需佔用与运行一个层析柱相若的空间就可以运作。
在一个实施例中，本发明的层析柱切换系统包括两个阀门阵列﹑两个HPLC泵﹑两个分子排阻层析柱﹑一个UV探测器和一个DLS检测器。在另一个实施例中，如图7所示，该系统还包括其他组件，如自动进样器和废物收集匣。这种设置可以削减一半的层析运行时间，因此能有效地加倍生产力。应当指出的是，本发明的层析柱切换系统可以根据量化和分析的需要采取任何适当的形式以及配置其他特征和部件。例如，可以将三个HPLC泵﹑三分子排阻层析柱和一个DLS检测器连接在一起，以同时对三个不同的样本进行层析分析。
如图7所示，两个阀门阵列包括阀1和阀2，用来连接不同的系统部件如泵﹑自动进样器﹑不同类型的柱﹑紫外线检测器和废液收集匣。系统可以独立控制或一起操作两个阀门。
在进行层析前，将需要分析的样品放入自动进样器中。将适当的缓冲液如平衡缓冲液或洗涤缓冲液连接至两个泵。
如图7的左部所示，当样本在泵B控制下的层析柱1内运行时，泵A使用适当的平衡缓冲液洗涤层析柱2。当层析柱1洗脱出病毒峰,紫外线检测器量化病毒及DLS检测器评估所得病毒的大小和完整性后,阀门阵列由图7左部所示的设置切换成图7右部所示的设置。
排列在自动进样器的下一个样本可以立即注入到层析柱2以进行分析。同时,在泵A的带动下,使用平衡缓冲液直接将残留在层析柱1内的低分子量组分冲到废液收集匣。随后,不断来回切换两个阀门阵列以分析轮流从层析柱1及层析柱2洗脱出来的样本,直至对所有在自动进样器内样本的完成分析。
在一个实施例中，可以使用用于控制及调节各个系统部件(例如泵和自动进样器)的软件,又或是用于收集UV和DLS检测器的数据的软件控制阀门。在一个实施例中，可使用用来控制Agilent1200色谱仪的AgilentChemStation软件以控制本发明的整个系统。另外，亦可以预先设定程序将整个过程完全自动化，程序包括但不限于以下步骤：平衡和洗涤层析柱﹑将样品注入到层析柱中﹑在紫外线监察下进行分子排阻层析﹑使用UV检测器和DLS检测器量化及分析洗脱峰,以及和从层析柱去除废物。亦可以使用其他自动化或机械人系统以进行样本预先处理步骤例如溶剂(如氯彷)萃取和酶消化,以进一步提高量化和分析的效率。
本实施例清楚地表明，本发明的多柱切换系统进一步增强本发明分析方法的处理量。整个系统具有许多有利技术特徵,大大提高了分析口蹄病病毒抗原的效率。本发明的有利技术特徵包括通过内切酶消化去除大分子量的DNA，通过溶剂(如氯彷)萃取去除大分子量的脂质，通过分子排阻层析柱去除低分子量的分子,在排除体积(或接近排斥体积)从分子排阻层析柱的洗脱出病毒颗粒,同时使用两个或两个以上的分子排阻层析柱,和实时DLS分析。
本发明能够产生高度纯化的口蹄病病毒峰,并可以在开始层析程序20分钟后使用UV和DLS检测器分析洗脱出来的病毒峰。本发明不仅实现了高处理量，而且提供一个更具成本效益分析口蹄疫病毒抗原的方法。本发明的层析柱切换系统不需要多个DLS检测器，并大大减少所需的工作空间。
在一个实施例中，本发明的方法配合层析柱切换系统使用时,可以在注入第一个样本的20分钟之后洗脱出病毒，整个层析过程大约在50分钟就能将所有低及高份子量的分子洗脱出来。因此,可以每隔50分钟向层析柱注入新样本以进分新一轮的层析。
在一个实施例中，本发明的方法配合层析柱切换系统使用时,可以在注入第一个样本的20分钟之后对下一个样本进行层析及分析,因此可以尽量利用设备和时间。据估计，本发明每天可以完成至少57个样本的纯化﹑量化和分析。
在一个实施例中，本发明的层析柱切换系统包括两个分子排阻层析柱。每隔50分钟向层析柱注入新样本,因此两个层析柱每24小时可以处理大约57个样本。
在一个实施例中，本发明的层析柱切换系统包括三个泵﹑三个分子排阻层析柱﹑一个UV检测器和一个DLS检测器。由于在注射样本后约20分钟内可以洗脱出病毒峰，结合使用三个层析柱﹑一个UV检测器和一个DLS检测器每小时可以处理3个样本。即是,可以每隔60分钟向层析柱注入新样本。UV检测器和DLS检测纪录及分析从首个层析柱洗脱出来的病毒的信号,然后纪录及分析从第二个层析柱洗脱出来的病毒的信号,最后到第三个层析柱洗脱出来的病毒。当第三个层析柱洗脱出病毒峰后,系统会切换以重新连接层析柱1并向层析柱1注入下一个样品。因此，本系统每24小时可以处理和分析72个样品。
加上能够处理各类型样本(如粗略纯化样本﹑高度纯化样本及高度浓缩样本)的能力，本发明的分析方法更广泛﹑更灵敏和高通量。现有技术如FPLC及146S蔗糖梯度技术是不能比拟的。
总言而之，本发明提供的方法和系统，可以高度纯化口蹄病病毒和抗原,并在非常短的时间内灵敏地及精确地量化和分析这些产品。显然，本发明对口蹄病病毒产品提供一个非常高通量的分析，足以满足现时口蹄病疫苗数量及质量上的高要求。

Claims (10)

1.一种用于量化和分析口蹄病病毒的方法，包括以下步骤:
a)使用一种或多种酶处理包含口蹄病病毒的原始样本,以获得多个口蹄病病毒样本；
b)将第一个口蹄病病毒样本置于一个层析系统内,所述层析系统包括多个泵和多个层析柱，其中
i)第一个泵通过第一个阀门连接到第一个层析柱，所述第一个层析柱进一步通过第二个阀门连接到一个检测系统,所述检测系统包含一个动态光散射检测器和一个紫外线检测器；以及
ii)第二个泵通过所述第一个阀门连接到第二个层析柱，所述第二个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到废物收集匣,
其中当所述第一个口蹄病病毒样本在第一个层析柱中运行时，清洗缓冲液在第二个层析柱中运行；
c)从所述第一个层析柱洗脱所述第一个口蹄病病毒样本，并从所述检测系统获得层析图谱，所述层析图谱用于量化及分析所述第一个口蹄病病毒样本；
d)切换所述第一个泵和第二个泵的连接,其中
i)所述第一个泵通过所述第一个阀门连接到所述第二个层析柱，所述第二个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到所述检测系统；以及
ii)所述第二个泵通过所述第一个阀门连接到所述第一个层析柱，所述第一个层析柱进一步通过所述第二个阀门连接到所述废物收集匣；
e)将第二个口蹄病病毒样本注入所述第二个层析柱，并将清洗缓冲液注入所述第一个层析柱；
f)从所述第二个层析柱洗脱所述第二个口蹄病病毒样本，并从所述检测系统获得层析图谱，所述层析图谱用于量化及分析所述第二个口蹄病病毒样本；以及
g)重复步骤(b)至(f)，以量化和分析所述多个口蹄病病毒样本。
2.根据权利要求1的方法，其中所述酶是内切酶﹑核酸外切酶﹑限制性内切酶﹑DNA酶或RNA酶。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)所述的包含口蹄病病毒的原始样本选自:源自受口蹄病病毒感染的细胞培养物的上清液﹑制造疫苗过程的中间产物﹑抗原﹑抗原库存﹑疫苗﹑一价疫苗和多价疫苗。
4.根据权利要求1的方法，其中所述包含口蹄病病毒的原始样本在进行步骤(a)前或后使用溶剂处理。
5.根据权利要求4的方法，其中所述溶剂选自以下非极性溶剂:氯彷﹑苯﹑甲苯﹑己烷﹑戊烷和辛烷。
6.根据权利要求1的方法，其中所述层析系统包含两个层析柱。
7.根据权利要求1的方法，其中所述层析系统包含三个层析柱。
8.根据权利要求1的方法，其中所述层析柱可以分开直径为20-200纳米及分子量为105-109Da的颗粒。
9.根据权利要求1的方法，其中获得的层析图谱与纯化口蹄病病毒参考样本的层析图谱比较或与完整的口蹄病病毒颗粒的层析图谱比较,从而分辨完整的口蹄病病毒颗粒和分解的口蹄病病毒片段。
10.根据权利要求1的方法，可以每天分析约60至约70个口蹄病病毒样本的层析图谱。
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