CN1662253A - 用作佐剂的包装的病毒样颗粒:制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以下发现：病毒样颗粒(VLP)可以分别负载和包装富含非甲基化C和G(CpG)的DNA寡核苷酸。如果这些CpG－VLP与抗原混合，这些抗原的免疫原性就被显著提高。另外，针对这些抗原的T细胞应答主要是Th1型。令人惊讶的是，抗原与VLP不需要共价连接；只要将VLP与佐剂混合就足以共施用。另外也发现，除非VLP分别负载并包装CpG，否则它们不增强免疫应答。因此，与包装CpG的VLP混合的抗原可以是针对变态反应、肿瘤和其它自身分子和慢性病毒性疾病进行预防性或治疗性接种的理想疫苗。

Description

用作佐剂的包装的病毒样颗粒：制备方法与用途
发明背景
发明领域
本发明涉及疫苗学、免疫学和医学领域。本发明提供用于增强针对与包装有免疫刺激物之病毒样颗粒(VLP)混合的抗原的免疫应答的组合物和方法，所述免疫刺激物优选为免疫刺激核酸，更优选含有至少一个非甲基化CpG序列的寡核苷酸。本发明可以用来诱导强烈的抗体和T细胞应答，尤其可用于治疗变态反应、肿瘤和慢性病毒性疾病以及其它慢性疾病。
背景技术
免疫系统的本质建立在两个不同的基础上：一个是特异性或获得性免疫，其特征在于相对较慢的反应动力学和记忆能力；另一个是非特异性或先天免疫，其显示快速的反应动力学，但缺乏记忆。淋巴细胞是获得性免疫系统的主要参与者。每个淋巴细胞都表达具有独特特异性的抗原受体。在通过该受体识别抗原后，淋巴细胞增殖并产生效应功能。只有极少的淋巴细胞显示对指定抗原或病原体的特异性，通常需要大量增殖才能检测到效应物应答——因此，获得性免疫系统具有较慢的动力学。由于相当一部分扩增的淋巴细胞存活，并且在抗原消失后仍可保留一定的效应物功能，当第二次遇到该抗原时，获得性免疫系统反应较快。这就是记忆能力的基础。
淋巴细胞对病原体的特异性仅局限于极少数细胞，必须增殖才能获得功能，与这种情况相反，先天免疫系统的细胞和分子通常大量存在，并且识别与病原体有关的数量有限的恒定特征(Medzhitov，R.和Janeway，C.A.，Jr.，Cell 91：295-298(1997))。这类模式的例子包括脂多糖(LPS)、富含非甲基化CG的DNA(CpG)或双链RNA，它们分别是细菌和病毒感染特异的。
大多数免疫学研究都集中于获得性免疫系统，只是最近先天免疫系统才受到关注。传统上，获得性和先天免疫系统是作为两个不同的体系来处理和分析的，它们的共同点极少。由于这种不同，很少有研究者奇怪为什么抗原与刺激先天免疫的佐剂一起使用时，对特异性免疫系统的免疫原性更强(Sotomayor，E.M.等人，Nat.Med.5：780(1999)；Diehl，L.等人，Nat.Med.5：774(1999)；Weigle，W.O.，Adv.Immunol.30：159(1980))。然而，这一问题的答案对于了解免疫系统以及理解保护性免疫与自身免疫之间的平衡十分关键。
对先天免疫系统的合理操纵，特别是激活参与T细胞引发(priming)的APC以有意诱导自身特异性T细胞应答，提供了基于T细胞的肿瘤治疗方法。因此，当前大多数治疗都集中于使用激活的树突细胞(DC)作为抗原-载体来诱导持续的T细胞应答(Nestle等人，Nat.Med.4：328(1998))。同样，为了提高肿瘤细胞的免疫原性，可与肿瘤细胞一起使用先天免疫系统的体内激活剂，如CpG或抗-CD40抗体(Sotomayor，E.M.等人，Nat.Med.5：780(1999)；Diehl，L.等人，Nat.Med.5：774(1999))。
刺激先天免疫的因子对APC的普遍激活通常可能是引发自身特异性淋巴细胞和自身免疫的原因。这一观点与以下发现一致：与甲状腺提取物一起施以LPS能够克服耐受并引发自身免疫甲状腺炎(Weigle，W.O.，Adv.Immunol.30：159(1980))。而且，在转基因小鼠模型上，最近发现单独施以自身肽不能引起自身免疫，除非APC被另一途径激活(Garza，K.M.等人，J.Exp.Med.191：2021(2000))。以下发现进一步强调了先天免疫与自身免疫病之间的联系：LPS、病毒感染或APC的普遍激活可延迟或防止外周耐受的形成(Vella，A.T.等人，Immunity 2：261(1995)；Ehl，S.等人，J.Exp.Med.187：763(1998)；Maxwell，J.R.等人，J.Immunol.162：2024(1999))。这样，先天免疫不仅可增强自身特异性淋巴细胞的激活，而且可阻止其随后的消失。这些发现可以扩展到肿瘤生物学和慢性病毒性疾病的控制方面。
用次要组织相容性抗原(如HY抗原)免疫后细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的诱导需要存在T辅助细胞(Th细胞)(Husmann，L.A.和M.J.Bevan，Ann.NY.Acad.Sci.532：158(1988)；Guerder，S.和P.Matzinger，J.Exp.Med.176：553(1992))。通过交叉引发，即用可到达I类途径的外源抗原引发而诱导的CTL应答，也需要存在Th细胞(Bennett，S.R.M.等人，J.Exp.Med.186：65(1997))。这些发现对于肿瘤治疗具有重要意义，T辅助细胞对于肿瘤细胞诱导保护性CTL应答可能至关重要(Ossendorp，F.等人，J.Exp.Med.187：693(1998))。
活化Th细胞上的一种重要的效应物分子是CD40-配体(CD40L)，它可与B细胞、巨噬细胞和树突细胞(DC)上的CD40相互作用(Foy，T.M.等人，Annu.Rev.Immunol.14：591(1996))。对B细胞上CD40的触发对于同种型转换和产生B细胞记忆是不可缺少的(Foy，T.M.等人，Ann.Rev.Immunol.14：591(1996))。最近表明，刺激巨噬细胞和DC上的CD40使细胞激活并成熟(Cella，M.等人，Curr.Opin.Immunol.9：10(1997)；Banchereau，J.和R.M.Steinman，Nature 392：245(1998))。具体而言，DC在激活后上调共同刺激分子并产生细胞因子，如IL-12。令人感兴趣的是，这种CD40L介导的DC成熟似乎导致对CTL应答的辅助作用。实际上，最近表明Th细胞对CD40的触发使DC能够启动CTL应答(Ridge，J.P.等人，Nature 393：474(1998)；Bennett，S.R.M.等人，Nature 393：478(1998)；Schoenenberger，S.P.等人，Nature 393：480(1998))。这与较早前的发现相一致：Th细胞必须识别与CTL识别相同的APC上的配体，表明它们需要相同的相互作用(Bennett，S.R.M.等人，J.Exp.Med.186：65(1997))。因此CD40L介导的Th细胞刺激导致DC的激活，随后能够引发CTL应答。
与这些依赖Th的CTL应答不同，病毒通常能够在没有T辅助的情况下诱导保护性CTL应答(综述见Bachmann，M.F.等人，J.Immunol.161：5791(1998))。具体而言，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)(Leist，T.P.等人，J.Immunol.138：2278(1987)；Ahmed，R.等人，J.Virol.62：2102(1988)；Battegay，M.等人，Cell Immunol.167：115(1996)；Borrow，P.等人，J.Exp.Med.183：2129(1996)；Whitmire，J.K.等人，J.Virol.70：8375(1996))、水泡性口炎病毒(VSV)(Kündig，T.M.等人，Immunity 5：41(1996))、流感病毒(Tripp，R.A.等人，J.Immunol.155：2955(1995))、痘苗病毒(Leist，T.P.等人，Scand.J.Immunol.30：679(1989))和小鼠脱脚病病毒(Buller，R.等人，Nature 328：77(1987))在CD4+T细胞缺失或II类分子或CD40表达缺陷的小鼠中能够引发CTL应答。病毒的这种不依赖Th细胞的CTL引发机制现在还不清楚。而且，大多数病毒不能完全刺激不依赖Th细胞的CTL应答，但是在Th细胞缺陷小鼠中病毒特异的CTL活性降低。因此，Th细胞可增强抗病毒CTL应答，但是这种辅助机制还不完全清楚。最近表明，DC通过交叉引发呈递流感来源的抗原(Albert，M.L.等人，J.Exp.Med.188：1359(1998)；Albert，M.L.等人，Nature 392：86(1998))。因此，可能与次要组织相容性抗原和肿瘤抗原相似(Ridge，J.P.等人，Nature393：474(1998)；Bennett，S.R.M.等人，Nature 393：478(1998)；Schoenenberger，S.P.等人，Nature 393：480(1998))，Th细胞可能通过触发DC上的CD40来辅助CTL的诱导。因此，在病毒或肿瘤细胞刺激后，利用CD40L或抗CD40抗体刺激CD40可增强CTL诱导。
然而，尽管CD40L是重要的DC激活剂，但是在免疫应答过程中似乎还有其它分子能够刺激DC的成熟和激活。实际上，CD40与LCMV或VSV特异性CTL的诱导没有明显相关性(Ruedl，C.等人，J.Exp.Med.189：1875(1999))。因此，尽管VSV特异性CTL应答部分地依赖CD4+T细胞的存在(Kündig，T.M.等人，Immunity 5：41(1996))，但是这种辅助作用不由CD40L介导。在免疫应答过程中触发DC成熟的候选效应分子包括Trance和TNF(Bachmann，M.F.等人，J.Exp.Med.189：1025(1999)；Sallusto，F.和A.Lanzavecchia，J.Exp.Med.179：1109(1994))，但是也可能存在更多具有类似特性的蛋白质，例如CpG。
众所周知，单独施用纯化蛋白质通常不足以引起强免疫应答；分离的抗原通常必须与被称为佐剂的辅助物质一起施用。施用的抗原在这些佐剂内受到保护，不会被快速降解，佐剂导致长时间释放低水平的抗原。
与分离的蛋白质不同，在不用任何佐剂、有及没有T细胞辅助的情况下，病毒均诱导快速和有效的免疫应答(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。尽管病毒通常含极少的蛋白质，但是它们比分离的成分能引发更强的免疫应答。对于B细胞应答，众所周知病毒免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和顺序。许多病毒展示一种准晶体表面，其表面显示规则的表位阵列，可有效交联B细胞上的表位特异性免疫球蛋白(Bachmann & Zinkernagel，Immunol.Today 17：553-558(1996))。B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是强激活信号，可直接诱导细胞周期的进展和IgM抗体的产生。进而，这些触发的B细胞能够激活T辅助细胞，该细胞随后诱导B细胞由产生IgM抗体向产生IgG抗体转换，以及长期B细胞记忆的产生——这是所有接种的目标(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。病毒结构甚至与自身免疫疾病中抗抗体的产生有关，是对病原体自然应答的一部分(参见Fehr，T.等人，J.Exp.Med.185：1785-1792(1997))。因此，病毒颗粒上以有序、重复阵列组织起来的抗原具有高度的免疫原性，它们能够直接激活B细胞。而不与重复表面连接的可溶性抗原在没有佐剂的情况下免疫原性较差。由于病原体、变应原提取物以及肿瘤通常含有多种抗原，这些抗原也许不是全都容易表达并与重复结构如VLP偶联，因此希望制成可以只是与抗原制剂混合而不需要复杂的偶联过程的佐剂制剂。
除了强B细胞应答外，病毒颗粒也能诱导细胞毒性T细胞应答的产生，这是免疫系统的另一个重要功能。对于消除非细胞变性病毒(如HIV或乙型肝炎病毒)和根除肿瘤而言，这些细胞毒性T细胞特别重要。细胞毒性T细胞不识别天然抗原，而是识别与MHC I类分子结合的它们的降解产物(Townsend & Bodmer，Ann.Rev.Immunol.7：601-624(1989))。巨噬细胞和树突细胞能够摄取并加工外源病毒颗粒(而不是其分离的可溶性成分)，并且将产生的降解产物呈递给细胞毒性T细胞，使其激活并增殖(Kovacsovics-Bankowski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：4942-4946(1993)；Bachmann等人，Eur.J.Immunol.26：2595-2600(1996))。另外，激活的DC也能够加工并呈递可溶性蛋白质。
病毒颗粒作为抗原与其分离的成分相比具有两个优点：(1)由于具有高度重复的表面结构，它们能够直接激活B细胞，产生高抗体滴度和长期的B细胞记忆；(2)病毒颗粒而不是可溶性蛋白质，具有诱导细胞毒性T细胞应答的能力，即使这些病毒是非感染性的且不使用佐剂。
几种新的疫苗策略是利用病毒固有的免疫原性。一些这样的方法集中在病毒颗粒的颗粒性质上；(参见Harding，C.等人，J.Immunology153：4925(1994))，它公开了一种由乳胶珠和抗原组成的疫苗；Kovacsovics-Bankowski，M.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：4942-4946(1993))公开了一种由氧化铁珠和抗原组成的疫苗；授予Kossovsky，N.等人的美国专利号5,334,394公开了抗原包被的核心颗粒；美国专利号5,871,747公开了表面共价键合一种或多种蛋白质的合成聚合物颗粒；以及具有非共价结合之包被的核心颗粒，包被至少部分覆盖该核心颗粒的表面，并且至少有一种与该包被核心颗粒接触的生物活性剂(参见，如WO94/15585)。
在进一步的发展中，由于病毒样颗粒(VLP)的结构特征及其非感染性，它们在疫苗生产领域得到应用(参见，例如WO98/50071)。VLP是由一种或多种类型的多个蛋白质分子以对称形式构成的超分子结构。它们缺少病毒基因组，因此是非感染性的。VLP通常能够通过异源表达大量生产，并且易于纯化。
另外，在细菌和大多数非脊椎动物中存在的富含非甲基化CG基序(CpG)的DNA，在体外及体内显示对B细胞、树突细胞和其它APC的强刺激活性。尽管细菌DNA在许多脊椎动物种中是免疫刺激性的，但是单独的CpG基序可能不同。实际上，刺激小鼠免疫细胞的CpG基序可能不一定刺激人免疫细胞，反之亦然。
尽管富含CpG基序的DNA寡核苷酸显示免疫刺激能力，但是其功效通常有限，因为它们在体外及体内均不稳定。因此，它们显示不好的药代动力学。于是，为了使CpG-寡核苷酸的功效更强，通常必须通过向磷酸酯骨架内导入硫代磷酸酯修饰来稳定它们。
使用CpG刺激免疫应答的第二个局限性是它们缺乏特异性，因为与CpG接触的所有APC和B细胞都受到刺激。因此，稳定或包装含有CpG的DNA寡核苷酸，以使细胞激活局限于也呈递相关抗原的细胞，可提高它们的功效和特异性。
另外，免疫刺激性CpG-寡脱氧核苷酸也会产生严重的副作用，在小鼠中引起髓外造血伴脾大和淋巴结病(Sparwasser等人，J.Immunol.(1999)，162：2368-74)。
最近的证据表明，含有包装的CpG的VLP能够引发针对VLP偶联抗原的极强T细胞应答(WO03/024481)。另外，包装的CpG也提高了它们的稳定性，并且基本消除了上述副作用，如在小鼠中导致髓外造血伴脾大和淋巴结病。特别是，包装的CpG不会引起脾大。然而，如上所述，大多数病原体、肿瘤和变应原提取物含有大量抗原，在与VLP偶联之前通常难以重组表达所有这些抗原。因此，希望制成可以只是与抗原制剂混合的佐剂制剂，而不需要复杂的偶联过程。
最近疫苗策略已经取得显著进展，但是现有的策略仍然需要改进。具体而言，本领域仍然需要研制新的改进的疫苗，可以诱导强T细胞和B细胞应答而没有严重副作用，而且也不需要将抗原与载体物质偶联。
发明概述
本发明基于以下惊人的发现：免疫刺激物如DNA寡核苷酸能够被包装于VLP内，使其免疫原性更强。出乎意料的是，VLP内的核酸和寡核苷酸分别能够被免疫刺激物和含有CpG基序的DNA-寡核苷酸特异地替换。令人惊讶的是，这些包装的免疫刺激物，特别是免疫刺激性核酸如含非甲基化CpG的寡核苷酸，保留了免疫刺激能力但是不会广泛激活先天免疫系统。含有VLP和免疫刺激物的本发明组合物特别是CpG-VLP，其免疫原性显著强于不含CpG的对应物，并且显著增强针对与包装的VLP一起施用(即混合)的抗原的B细胞和T细胞应答。出乎意料的是，免疫应答的增强不需要抗原与VLP偶联。而且，由于包装，与VLP结合的CpG不会诱导全身副作用，如脾大。
在第一个实施方案中，本发明提供一种增强动物免疫应答的组合物，其包含病毒样颗粒和免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸，更优选含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中该物质、核酸或寡核苷酸与病毒颗粒偶联、融合或以其它方式附着，或者被后者包裹，即与之结合，优选被病毒样颗粒包装。该组合物还包含与病毒样颗粒混合的抗原。
在本发明的一个优选实施方案中，免疫刺激性核酸特别是含非甲基化CpG的寡核苷酸，通过磷酸酯骨架的硫代磷酸酯修饰而稳定。在另一个优选实施方案中，通过消化VLP内的RNA并同时添加含有所选CpG的DNA寡核苷酸，将免疫刺激性核酸特别是含非甲基化CpG的寡核苷酸包装到VLP内。在一个同样优选的实施方案中，VLP可以先被解装配，之后在CpG存在下重装配。
在一个进一步优选的实施方案中，免疫刺激性核酸不含CpG基序，但仍显示免疫刺激活性。这些核酸在WO01/22972中有描述。其中所述的所有序列都在此引用作为参考。
在本发明的一个优选实施方案中，含非甲基化CpG的寡核苷酸不被磷酸二酯骨架的硫代磷酸酯修饰稳定。
在一个优选实施方案中，含非甲基化CpG的寡核苷酸在人细胞中诱导IFN-α。在另一个优选实施方案中，诱导IFN-α的寡核苷酸的侧翼为富含鸟苷的重复序列，并且含有回文序列。
在一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。同样优选病毒样颗粒不含脂蛋白包膜。优选重组病毒样颗粒包含或者由乙型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒或人乳头瘤病毒、RNA噬菌体、Qβ-噬菌体、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205-噬菌体和Ty的重组蛋白组成。在一个具体实施方案中，病毒样颗粒包含或者由一种或多种不同的乙型肝炎病毒核心(衣壳)蛋白(HBcAg)组成。
在一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组蛋白或其片段。优选的RNA噬菌体是Qβ-噬菌体、AP 205-噬菌体、GA-噬菌体、fr-噬菌体。
在另一个实施方案中，抗原或抗原混合物是重组抗原。在另一个实施方案中，抗原或抗原混合物从天然来源中提取，包括但不限于：花粉、粉尘、真菌、昆虫、食物、哺乳动物表皮、毛发、唾液、血清、蜜蜂、肿瘤、病原体和羽毛。
在另一个实施方案中，抗原可以选自：(1)适于诱导对癌细胞的免疫应答的多肽；(2)适于诱导对传染性疾病的免疫应答的多肽；(3)适于诱导对变应原的免疫应答的多肽；(4)适于诱导对自身抗原的增强应答的多肽；(5)适于在家畜或宠物中诱导免疫应答的多肽。
在另一个实施方案中，抗原或抗原混合物可选自：(1)适于诱导对癌细胞的免疫应答的有机分子；(2)适于诱导对感染性疾病的免疫应答的有机分子；(3)适于诱导对变应原的免疫应答的有机分子；(4)适于诱导对自身抗原的增强应答的有机分子；(5)适于在家畜或宠物中诱导免疫应答的有机分子；(6)适于诱导对药物、激素或毒性化合物的应答的有机分子。
在一个具体实施方案中，抗原包含或者由细胞毒性T细胞或Th细胞表位组成。在一个相关实施方案中，抗原包含或者由B细胞表位组成。在一个相关实施方案中，病毒样颗粒包含乙型肝炎病毒核心蛋白。
本发明的另一方面提供了一种增强人或其它动物种免疫应答的方法，包括向动物体内导入一种组合物，该组合物包含病毒样颗粒和免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸，更优选含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中该物质，优选核酸，更优选寡核苷酸，与病毒样颗粒结合(即偶联、附着或包裹)，优选被病毒样颗粒包装，并且病毒样颗粒与一种抗原、几种抗原或抗原混合物混合。
在本发明的另一个实施方案中，该组合物通过皮下、肌肉内、鼻内、皮内、静脉内或直接导入淋巴结内来导入动物体内。在一个同样优选的实施方案中，免疫增强组合物在希望对其接种的肿瘤或局部病毒池附近局部施用。
在本发明的一个优选方面，免疫应答是T细胞应答，针对抗原的T细胞应答增强。在一个具体实施方案中，T细胞应答是细胞毒性T细胞应答，针对抗原的细胞毒性T细胞应答增强。在本发明的另一个实施方案中，免疫应答是B细胞应答，针对抗原的B细胞应答增强。
本发明也涉及一种疫苗，其包含免疫有效量的本发明免疫增强组合物，以及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在一个优选实施方案中，疫苗还包含至少一种佐剂，如明矾或弗氏不完全佐剂。本发明也提供一种免疫和/或治疗动物的方法，包括对动物施以免疫有效量的本发明公开的疫苗。
在本发明的一个优选实施方案中，用含有免疫刺激物的VLP，优选含有免疫刺激性核酸的VLP，更优选含非甲基化CpG的寡核苷酸VLP，针对与修饰的VLP混合的抗原接种动物或人。修饰的VLP能够用来针对例如肿瘤、病毒性疾病或自身分子进行接种。这种接种可以用于预防或治疗目的，或者同时用于这两种目的。修饰的VLP也可以针对变态反应或与变态反应有关的疾病(如哮喘)进行接种，以诱导针对该变应原的免疫偏离和/或抗体应答。这种接种和治疗分别能够例如使以前患过敏的动物和患者脱敏。
在大多数情况下，希望的免疫应答是针对与含免疫刺激物的VLP、优选含免疫刺激性核酸的VLP、更优选含非甲基化CpG的寡核苷酸VLP混合的抗原。抗原可以是肽、蛋白质或结构域及其混合物。
注射途径优选皮下或肌肉内，但是也能通过真皮内、鼻内、静脉内施用，或者直接将含CpG的VLP施于淋巴结内。在一个同样优选的实施方案中，在希望对其接种的肿瘤或局部病毒池附近局部施用与抗原混合的含CpG的VLP。
应当理解，以上的概述和下面的详述只是代表性和说明性的，旨在进一步说明申请保护的本发明。
附图简述
图1A-1B显示在对照孵育后或RNase A消化后，非变性琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖)中的VLP，用溴化乙锭(图1A)或考马斯蓝(图1B)染色，以分析是否存在RNA或蛋白质。重组产生的VLP用PBS缓冲液稀释到终浓度0.5μg/μl蛋白质，在不含(1道)或含有(2道)RNaseA(100μg/ml)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)的条件下37℃孵育2小时。随后向样品中补充6倍浓缩的DNA加样缓冲液(MBS FermentasGmbH，Heidelberg，德国)，在1％非变性琼脂糖凝胶中以100伏电压电泳30分钟。用Gene Ruler分子量标准(MBS Fermentas GmbH，Heidelberg，德国)作为VLP迁移速度的参照(M道)。箭头表明存在包裹于VLP中的RNA(图1A)或VLP本身(图1B)。3次独立实验获得相同的结果。
图2A-2B显示在只有缓冲液或存在含CpG的DNA-寡核苷酸的情况下，在对照孵育后或RNase A消化后，非变性琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖)中的VLP，用溴化乙锭(图2A)或考马斯蓝(图2B)染色，以分析是否存在RNA/DNA或蛋白质。重组VLP用PBS缓冲液稀释到终浓度0.5μg/μl蛋白质，在不含(1道)或含有(2、3道)RNase A(100μg/ml)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)的条件下37℃孵育2小时。在RNase A消化之前向样品3中添加5nmol CpG-寡核苷酸(含有磷酸酯骨架的硫代磷酸酯修饰)。用Gene Ruler分子量标准(MBS FermentasGmbH，Heidelberg，德国)作为p33-VLP迁移速度的参照(M道)。箭头表明存在包裹于p33-VLP中的RNA/CpG-DNA(图2A)或p33-VLP本身(图2B)。当使用具有正常磷键的CpG寡核苷酸共孵育VLP与RNaseA时，获得类似的结果。
图3A-3B显示在存在含CpG的DNA-寡核苷酸以及随后透析(为了除去未与VLP结合的CpG寡核苷酸)的条件下，在RNase A消化之前及之后，非变性琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖)中的p33-VLP，用溴化乙锭(图3A)或考马斯蓝(图3B)染色，以分析是否存在DNA或蛋白质。重组VLP用PBS缓冲液稀释到终浓度0.5μg/μl蛋白质，在不含(1道)或含有(2-5道)RNase A(100μg/ml)(Sigma，Division of FlukaAG，瑞士)的条件下37℃孵育2小时。在RNase A消化之前向VLP中添加50mol CpG-寡核苷酸(磷酸酯骨架含有硫代磷酸酯修饰：2道和3道，含有正常磷修饰：4道和5道)。使用300kDa MWCO透析膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，USA)，用PBS(4500倍稀释)对处理的样品充分透析24小时，除去过量的DNA(3道和5道)。用Gene Ruler分子量标准(MBS Fermentas GmbH，Heidelberg，德国)作为p33-VLP迁移速度的参照(M道)。箭头表明存在包裹于p33-VLP中的RNA/CpG-DNA(图3A)或VLP本身(图3B)。
图4A-4B显示在对照孵育后或RNase A消化后，非变性琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖)中的VLP，其中只在完成RNA消化后添加含CpG的DNA-寡核苷酸，用溴化乙锭(图4A)或考马斯蓝(图4B)染色，以分析是否存在RNA/DNA或蛋白质。重组VLP用PBS缓冲液稀释为终浓度0.5μg/μl蛋白质，在不含(1道)或含有(2道和3道)RNaseA(100μg/ml)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)的条件下37℃孵育2小时。只在RNase A消化后向样品3中添加5nmol CpG-寡核苷酸(磷酸酯骨架含有硫代磷酸酯修饰)。用Gene Ruler分子量标准(MBSFermentas GmbH，Heidelberg，德国)作为p33-VLP迁移速度的参照(M道)。箭头表明存在包裹于p33-VLP中的RNA/CpG-DNA(图4A)或VLP本身(图4B)。当VLP的重装配使用含有正常磷键的CpG寡核苷酸时，获得类似的结果。
图5显示来源于HBcAg、其内携带富含CpG之DNA(含有正常的磷酸二酯部分)、透析除去未结合的CpG-寡核苷酸、RNase A处理的VLP可有效增强针对蜂毒变应原(BV)的IgG应答。小鼠皮下初次接触(prime)单独的或与下列成分之一混合的5μg蜂毒(ALK Abello)：单独的50μg VLP，分别负载并包装CpG-寡核苷酸的50μg VLP，或与20nmol CpG-寡核苷酸混合的50μg VLP。小鼠也可以初次接触与下列成分混合的5μg蜂毒：单独的VLP，或分别负载并包装CpG-寡核苷酸的VLP连同明矾。14天后，小鼠用相同的疫苗制品加强，在第21天采血。血清中的蜂毒特异性IgG应答通过ELISA测定。结果表示为指定血清稀释度的光密度。显示两只小鼠每只的平均值。
图6显示，RNase A处理的、其内携带富含CpG之DNA(含有正常的磷键)、透析除去未结合的CpG-寡核苷酸的VLPs(HBc)可有效诱导针对蜂毒变应原PLA2(磷酯酶A2)的IgG2a应答，而不是IgG1应答。小鼠皮下初次接触单独的或与下列成分之一混合的5μg蜂毒(ALK Abello)：单独的50μg VLP，分别负载并包装CpG-寡核苷酸的50μg VLP，或与20nmol CpG-寡核苷酸混合的50μg VLP。此外，小鼠也可以初次接触与下列成分混合的5μg蜂毒：单独的VLP，或分别负载并包装CpG-寡核苷酸的VLP连同明矾。14天后，小鼠用相同的疫苗制品加强，在第21天采血。通过ELISA测定第21天血清中PLA2特异性IgG亚类。注意即使在包装CpG的VLP或游离CpG的存在下，明矾的存在仍有利于IgG1的诱导。结果表示为20倍稀释的血清样品的光密度。显示两只小鼠每只的平均值。
图7显示游离CpG而不是包装于VLP(HBc)内的CpG在接种后显著提高脾的大小。小鼠用单独的100μg VLP、单独的CpG(20nmol)、与20nmol CpG混合的100μg VLP或含有包装的CpG的100μg VLP免疫。12天后测量总淋巴细胞数量/脾脏。
图8显示接种VLP(CpG)+蜂毒的小鼠的变应性体温降低。检测了两组小鼠。第1组(n＝7)接受与蜂毒混合的VLP(CpG)作为疫苗。第2组(n＝6)只接受VLP(CpG)。在用高剂量蜂毒(30μg)攻击后，根据小鼠的体温改变评价变态反应。在接受蜂毒与VLP(CpG)的第1组中，在所有试验小鼠中均未观察到体温的显著变化。相反，只接受VLP(CpG)作为脱敏疫苗的第2组在6只动物中有4只显示体温明显下降。因此，这些小鼠未受到针对变态反应的保护。注意：该图中的符号代表6只(VLP(CpG))或7只(VLP(CpG)+蜂毒)小鼠的平均值，包括标准差(SD)。
图9A-9C显示在脱敏之前和之后，小鼠特异性IgE和IgG血清抗体的检测。所有小鼠均通过4次注射佐剂(明矾)中的蜂毒致敏。然后，小鼠接种VLP(CpG)+蜂毒以诱导保护性免疫应答，或者只接种VLP(CpG)作为对照。在脱敏之前及之后采集所有小鼠的血样，通过ELISA分别检测蜂毒特异性IgE抗体(图9A)、IgG1抗体(图9B)和IgG2a抗体(图9C)。如图9A所示，接种VLP(CpG)+蜂毒的小鼠在脱敏后观察到IgE滴度升高。结果表示为1∶250血清稀释度的光密度(OD450nm)。该图显示6只(VLP(CpG))或7只(VLP(CpG)+蜂毒)小鼠的平均值，包括标准差(SD)。图9B显示只有接种VLP(CpG)+蜂毒的小鼠在脱敏后抗蜂毒IgG1血清滴度升高。图9C显示IgG2a血清滴度的检测结果，同样如此。如成功脱敏所预期的，IgG2a抗体滴度的升高最明显。结果表示为分别在1∶12500(IgG1)或1∶500(IgG2a)血清稀释度时2只(VLP(CpG))或3只(VLP(CpG)+蜂毒)小鼠的平均值，包括SD。
图10显示用与Qb VLP、分别负载和包装CpG-2006的Qb VLP或明矾混合的青草花粉提取物免疫的Balb/c小鼠的抗体应答。使用每组5只小鼠的合并血清。用包被于平板上的花粉提取物进行ELISA测定。为了检测IgG1、IgG2a和IgG2b抗体，孔与1∶60稀释的第21天的各小鼠血清孵育，为了检测IgE同种型抗体，孔与1∶10稀释的血清孵育，并且使用与辣根过氧化物酶偶联的相应同种型特异性抗小鼠第二抗体进行检测。在显色反应后对450nm的光密度作图。
图11A-11B显示用与明矾混合的青草花粉提取物致敏，随后用与Qb VLP或分别负载和包装CpG-2006的Qb VLP或明矾混合的青草花粉提取物脱敏的Balb/c小鼠的抗体应答。一组小鼠在致敏后不予处理。用包被于平板上的花粉提取物进行ELISA测定。孔与连续稀释的各小鼠血清孵育，使用与辣根过氧化物酶偶联的IgG1和IgG2a同种型特异性抗小鼠第二抗体进行检测。ELISA滴度计算为产生50％饱和光密度时的稀释度的倒数。图11A显示IgG1滴度，图11B显示IgG2b滴度。
图12A-12B显示利用1％琼脂糖凝胶对包装于HBc33 VLP内的g10gacga-PO的分析，以溴化乙锭(图12A)和考马斯蓝(图12B)染色。加样到凝胶上的是15μg下列样品：1.1kb MBI Fermentas DNA分子量标准；2.未处理的HBc33 VLP；3.用RNase A处理的HBc33 VLP；4.用RNase A处理并包装g10gacga-PO的HBc33 VLP；5.用RNase A处理、包装g10gacga-PO、用Benzonase处理并透析的HBc33 VLP。
图13A-13H显示在不同寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的电子显微照片。VLP在指定寡脱氧核苷酸存在下或在tRNA存在下重装配，但是没有通过大小排阻层析纯化为均质的悬液。从大肠杆菌中纯化的“完整”QβVLP制剂作为阳性对照。
图14A-14B显示通过核酸酶处理和琼脂糖电泳对重装配的QβVLP核酸含量的分析：分别如上所述处理5μg重装配并纯化的QβVLP和5μg从大肠杆菌中纯化的QβVLP。处理后，样品与加样染料混合，加样到0.8％琼脂糖凝胶上。电泳后，凝胶首先用溴化乙锭(图14A)染色，在记录后同一块凝胶用考马斯蓝(图14B)染色。
图15A显示解装配的AP205 VLP蛋白的电子显微照片，而图15B显示纯化前重装配的颗粒。图15C显示纯化的重装配AP205 VLP的电子显微照片。图15A-15C的放大倍数为200000倍。
图16A-16B显示重装配的AP205 VLP的琼脂糖凝胶电泳分析。两张图上加样到凝胶上的样品从左到右是：未处理的AP205 VLP，含有不同量的与CyCpG重装配并且纯化的AP205 VLP的三份样品，和未处理的QβVLP。图16A的凝胶用溴化乙锭染色，而在图16B中相同的凝胶用考马斯蓝染色。
图17显示SDS-PAGE分析，证实多条由与Qβ单体偶联的一个、两个或三个肽组成的偶联带(箭头，图17)。为了简化，特别是在实施例部分，肽p33与QβVLP的偶联产物被称为Qbx33。
图18A-18G显示用1％琼脂糖凝胶对包装于Qbx33VLP内的B-CpGpt的分析，用溴化乙锭(图18A)和考马斯蓝(图18B)染色。图18C显示用15％TBE/尿素对从VLP中提取的包装oligo含量的分析，用SYBRGold染色。加样到凝胶上的是下列样品：1.蛋白酶K消化和RNase A处理后，2μg Qbx33 VLP的BCpGpt oligo内容物；2.20pmol B-CpGpt对照；3.10pmol B-CpGpt对照；4.5pmol B-CpGpt对照。图18D和图18E显示用1％琼脂糖凝胶对包装于Qbx33 VLP内的g10gacga-PO的分析，用溴化乙锭(图18D)和考马斯蓝(图18E)染色。加样到凝胶上的是15μg下列样品：1.MBI Fermentas 1kb DNA分子量标准；2.未处理的Qbx33 VLP；3.用RNase A处理的Qbx33 VLP；4.用RNase A处理并包装g10gacga-PO的Qbx33 VLP；5.用RNase A处理、包装g10gacga-PO、用Benzonase处理并透析的Qbx33 VLP。图18E和F显示用1％琼脂糖凝胶对包装于Qbx33 VLP内的dsCyCpG-253的分析，用溴化乙锭(图18E)和考马斯蓝(图18F)染色。加样到凝胶上的是15μg下列样品：1.MBI Fermentas 1kb DNA分子量标准；2.未处理的Qbx33 VLP；3.用RNase A处理的Qbx33 VLP；4.用RNase A处理、包装dsCyCpG-253并用DNaseI处理的Qbx33 VLP；5.用RNase A处理、包装dsCyCpG-253、用DNaseI处理并透析的Qbx33 VLP。
发明详述
除非另外定义，此处所用的所有科技术语与本发明所属领域技术人员通常理解的含义相同。下文描述了优选的材料与方法，但是在本发明的实施与试验中能够使用与此处所述相似或相当的任何材料与方法。
1.定义
动物：此处所用的术语“动物”包括，例如：人、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟类、爬行动物、鱼、昆虫和蜘蛛类动物。
抗体：此处所用的术语“抗体”是指能够结合表位或抗原决定簇的分子。该术语应该包括整个抗体及其抗原结合片段，包括单链抗体。最优选抗体是人抗原结合性抗体片段，包括但不限于：Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)，以及包含VL或VH域的片段。抗体可来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。优选抗体是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的抗体。此处所用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，包括从人免疫球蛋白文库分离的抗体，或者来自转入一种或多种人免疫球蛋白基因但不表达内源性免疫球蛋白的转基因动物，如授予Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598所述。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的组合物可以用于设计治疗变态反应的疫苗。IgE同种型抗体是变态反应的重要成分。肥大细胞在其表面结合IgE抗体，特异性抗原与结合在肥大细胞表面的IgE分子结合后释放组胺和其它变态反应介质。因此，抑制IgE抗体的产生是针对变态反应进行保护的一个有希望的目标。这可以通过获得希望的T辅助细胞应答来实现。T辅助细胞应答可以分为1型(TH1)和2型(TH2)T辅助细胞应答(Romagnani，Immunol.Today 18：263-266(1997))。TH1细胞分泌干扰素-γ和触发B细胞产生IgG抗体的其它细胞因子。与之不同，TH2细胞产生的一种重要细胞因子是IL-4，它使B细胞产生IgE。在许多实验体系中，TH1和TH2应答的发展是相互排斥的，因为TH1细胞抑制TH2细胞的诱导，反之亦然。因此，能够触发强TH1应答的抗原同时又抑制TH2应答的发展，从而抑制IgE抗体的产生。高浓度IgG抗体的存在可以阻止变应原与肥大细胞结合的IgE结合，从而抑制组胺的释放。因此，IgG抗体的存在可以针对IgE介导的变态反应进行保护。引起变态反应的典型物质包括但不限于：花粉(例如草、豚草、桦或山雪松)；室内粉尘和屋尘螨；哺乳动物表皮变应原和动物毛屑；霉菌和真菌；昆虫身体和昆虫毒液；羽毛；食物；和药物(例如青霉素)。参见Shough，H.等人，REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版，(第82章)，Mack PublishingCompany，Mack Publishing Group，Easton，Pennsylvania(1995)，其全部内容在此引用作为参考。因此，不仅在变态反应发生之前，而且在之后，用与包装有富含非甲基化CG基序之DNA的病毒样颗粒混合的变应原来免疫个体都是应当有益的。
抗原：此处所用的术语“抗原”指如果被MHC分子呈递，即能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。此处所用的术语“抗原”也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，以及/或者能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有或与Th细胞表位连接，并且包含于佐剂中。抗原可以具有一种或多种表位(B和T表位)。上述特异性反应指抗原通常以高选择性方式优选地与其相应抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的许多其它抗体或TCR反应。此处所用的抗原也可以是几种抗原的混合物。
此处所用的“微生物抗原”指微生物的抗原，包括但不限于：传染性病毒、传染性细菌、寄生虫和传染性真菌。这些抗原包括完整的微生物以及自然分离物及其片段或衍生物，以及与天然微生物抗原相同或相似、并能诱导对该微生物特异的免疫应答的合成或重组化合物。如果化合物可以诱导针对天然微生物抗原的免疫应答(体液和/或细胞应答)，则该化合物与该天然微生物抗原相似。这些抗原在本领域中常规使用，为本领域技术人员公知。
已经在人体中发现的传染性病毒的例子包括但不限于：逆转录病毒科(例如人类免疫缺陷病毒，如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III)；和其它分离株，如HIV-LP)；小RNA病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾可病毒)；杯状病毒科(例如导致胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；本扬病毒科(例如汉坦病毒、本扬病毒、白蛉病毒和内罗病毒)；砂粒样病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳头多瘤空泡病毒科(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1、2，水痘带状疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，痘苗病毒，痘病毒)；虹彩病毒(例如非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原体，丁型肝炎的病原体(被认为是乙型肝炎病毒的一种缺陷型卫星病毒)，非甲非乙肝炎的病原体(1类＝体内传播的；2类＝肠胃外传播的(即丙型肝炎)；诺瓦克病毒及相关病毒，和星形病毒)。
在脊椎动物中，革兰氏阴性和革兰氏阳性菌都可以作为抗原。这些革兰氏阳性菌包括但不限于：巴斯德氏菌属的种、葡萄球菌属的种和链球菌属的种。革兰氏阴性菌包括但不限于：大肠杆菌、假单胞菌属的种和沙门氏菌属的种。传染性细菌的具体例子包括但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)，布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)，分枝杆菌属的种(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组链球菌)，链球菌(绿色组)，粪链球菌(Streptococcusfaecalis)，牛链球菌(Streptococcus bovis)，链球菌(厌氧种)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，致病性弯曲杆菌属的种，肠球菌属的种，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)，炭疽芽孢杆菌(Bacillusantracis)，白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)，棒杆菌属的种，猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)，破伤风梭菌(Clostridium tetani)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)，拟杆菌属(Bacteroides)的种，具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)，念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)，苍白密螺旋体(Treponema pallidium)，极细密螺旋体(Treponema pertenue)，钩端螺旋体属(Leptospira)，立克次体属(Rickettsia)，衣氏放线菌(Actinomyces israelli)和衣原体(Chlamydia)。
传染性真菌的例子包括：新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)和白色念珠菌(Candida albicans)。其它传染性微生物(即原生生物)包括：疟原虫，如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)和血吸虫属(Shistosoma)。
其它医学相关的微生物在文献中已有大量描述，例如，参见C.G.A.Thomas，《医学微生物学》，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，其完整内容在此引用作为参考。
本发明的组合物和方法也可通过刺激针对癌抗原的抗原特异性免疫应答治疗癌症。此处所用的“肿瘤抗原”指与肿瘤或癌症相关并能够引发免疫应答的化合物，如肽。具体而言，该化合物在MHC分子中呈递时能够引发免疫应答。肿瘤抗原可以由癌细胞制备，制备方法包括：制备癌细胞的粗提物，如Cohen等人，Cancer Research，54：1055(1994)所述；部分纯化抗原；采用重组技术或从头合成已知抗原。肿瘤抗原包括作为整个肿瘤或癌症多肽或其抗原性部分的抗原。这些抗原能够被分离或者通过重组或本领域公知的其它任何方法制备。癌症或肿瘤包括但不限于：胆管癌；脑癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；上皮肿瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞癌)；黑素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；肾癌，以及其它癌和肉瘤。
在脊椎动物中变应原也可作为抗原。此处所用的术语“变应原”也包括“变应原提取物”和“变应原表位”。变应原的例子包括但不限于：花粉(例如草、豚草、桦或山雪松)；室内粉尘和屋尘螨；哺乳动物表皮变应原和动物毛屑；霉菌和真菌；昆虫身体和昆虫毒液；羽毛；食物；和药物(例如青霉素)。
抗原决定簇：此处所用的术语“抗原决定簇”是指可被B或T淋巴细胞特异识别的抗原部分。B淋巴细胞通过产生抗体对外源性抗原决定簇起反应，而T淋巴细胞通过增殖和建立对介导细胞和/或体液免疫至关重要的效应功能来响应抗原决定簇。
抗原呈递细胞：此处所用的术语“抗原呈递细胞”指具有免疫刺激能力的一群不均一白细胞或骨髓衍生细胞。例如，这些细胞能够产生与MHC分子结合的肽，后者能够被T细胞识别。该术语与术语“佐细胞”同义，包括例如：朗罕氏细胞、交错突细胞、树突细胞、B细胞和巨噬细胞。在某些条件下，上皮细胞、内皮细胞和其它非骨髓来源的细胞也可以作为抗原呈递细胞。
结合：此处所用的术语“结合”指如下结合：可能是共价的，例如含非甲基化CpG的寡核苷酸与病毒样颗粒化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可以是，例如：酯、醚、磷酯、酰胺、肽、亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。该术语也包括物质的包裹或部分包裹。术语“结合”比术语如“偶联”、“融合”、“包裹”、“包装”和“附着”更广义，并且包括后者。此外，对于与病毒样颗粒结合的免疫刺激物而言，术语“结合”还包括包裹或部分包裹免疫刺激物质。因此，对于与病毒样颗粒结合的免疫刺激物而言，术语“结合”比术语如“偶联”、“融合”、“包裹”、“包装”和“附着”更广义，并且包括后者。例如，免疫刺激物如含非甲基化CpG的寡核苷酸，可以被VLP包裹，而不需要存在实际上的共价或非共价的结合，使得寡核苷酸仅通过“包装”固定。
偶联的：此处所用的术语“偶联的”指通过共价键或通过强非共价相互作用而附着，一般且优选地指通过共价键附着。本领域技术人员常用来偶联生物活性物的任何方法都能在本发明中使用。
融合：此处所用的术语“融合”指不同来源的氨基酸序列通过其编码核苷酸序列的框内组合被组合于一条多肽链中。除了与末端之一融合外，术语“融合”还包括内部融合，即不同来源的序列插入多肽链内。CpG：此处所用的术语“CpG”指含有至少一个非甲基化胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸序列的寡核苷酸(例如“CpG-寡核苷酸”或含有胞嘧啶及随后的鸟嘌呤、并通过磷酸酯键连接的DNA)，能够刺激/激活(即具有促有丝分裂效果)脊椎动物的骨髓来源细胞，或者诱导或提高其细胞因子表达。例如，CpG可以用于激活B细胞、NK细胞和抗原呈递细胞，如树突细胞、单核细胞和巨噬细胞。CpG也包括核苷酸类似物，如含有硫代磷酸酯键的类似物，可以是双链或单链的。双链分子通常在体内更稳定，而单链分子免疫活性更高。
外壳蛋白：此处所用的术语“外壳蛋白”是指噬菌体或RNA噬菌体的蛋白质，它能够掺入噬菌体或RNA噬菌体的衣壳装配体内。然而，当指RNA噬菌体外壳蛋白基因的具体基因产物时，使用术语“CP”。例如，RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的具体基因产物被称为“QβCP”，而噬菌体Qβ的“外壳蛋白”包含“QβCP”以及A1蛋白。噬菌体Qβ的衣壳主要由QβCP组成，含有少量A1蛋白。同样，VLPQβ外壳蛋白主要含有QβCP，以及少量A1蛋白。
表位：此处所用的术语“表位”指在动物、优选哺乳动物、最优选对人具有抗原性或免疫原性的多肽的连续或不连续部分。表位可被抗体或T细胞通过其与MHC分子关联的T细胞受体识别。此处所用的“免疫原表位”定义为能在动物中引发抗体应答或诱导T细胞应答的多肽部分，这可通过本领域公知的任何方法测定。(参见，例如：Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002(1983))。此处所用的术语“抗原性表位”定义为抗体能够在其上免疫特异性结合相应抗原的蛋白部分，这种结合可通过本领域公知的任何方法测定。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定排除与其它抗原的交叉反应性。抗原性表位不一定必须是免疫原性的。抗原性表位也可以是T细胞表位，此时它们能被MHC分子内的T细胞受体免疫特异性结合。
一个表位可以该表位唯一的空间构象包含3个氨基酸。一个表位通常由至少约5个这样的氨基酸组成，更常见地由至少约8-10个这样的氨基酸组成。如果表位是有机分子，它可以象硝基苯基一样小。
免疫应答(immune response)：此处所用的术语“免疫应答”指导致B和/或T淋巴细胞和/或抗原呈递细胞激活或增殖的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。然而，在某些情况下，免疫应答可能是低强度的，只有在使用至少一种本发明的物质时才能检测到。“免疫原性的”指用来刺激活生物的免疫系统，使得其针对该免疫原性剂的一种或多种功能增强的试剂。“免疫原性多肽”是引发细胞和/或体液免疫应答的多肽，无论它是单独的还是与载体相连接，使用或不使用佐剂。优选抗原呈递细胞可以被激活。
免疫(immunization)：此处所用的术语“免疫”或相关术语指提供产生针对靶抗原或表位的实质免疫应答(包括抗体或细胞免疫，如效应CTL)的能力。这些术语不需要产生完全免疫，而是产生实质性地高于基线的免疫应答。例如，如果在使用本发明的方法后哺乳动物产生针对靶抗原的细胞和/或体液免疫应答，则可认为针对该靶抗原免疫了该哺乳动物。
免疫刺激性核酸：此处所用的术语“免疫刺激性核酸”指能够诱导和/或增强免疫应答的核酸。此处所用的免疫刺激性核酸包括核糖核酸，特别是脱氧核糖核酸。优选地，免疫刺激性核酸包含至少一个CpG基序，例如CG二核苷酸，其中C是未甲基化的。CG二核苷酸可以是回文序列的一部分，或者可能包含于非回文序列内。如上所述的不含CpG基序的免疫刺激性核酸包括，例如，缺乏CpG二核苷酸的核酸，以及含有CG二核苷酸被甲基化的CG基序的核酸。此处所用的术语“免疫刺激性核酸”也指含有修饰的碱基(如4-溴-胞嘧啶)的核酸。
免疫刺激物：此处所用的术语“免疫刺激物”指能够诱导和/或增强免疫应答的物质。此处所用的免疫刺激物包括但不限于toll样受体激活物和诱导细胞因子分泌的物质。Toll样受体激活物包括但不限于：免疫刺激性核酸、肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、咪唑并喹啉化合物、鞭毛蛋白、脂蛋白和免疫刺激性有机物，如紫杉醇。
混合的，此处所用的术语“混合的”指一起添加的两种或多种物质、成分或要素的组合，它们彼此不会化学结合，并且能够被分离。
寡核苷酸：此处所用的术语“寡核苷酸”或“寡聚体”指包含2个或更多核苷酸的核酸序列，通常至少约6-约100,000个核苷酸，优选约6-约2000个核苷酸，更优选约6-约300个核苷酸，更优选约20个-约300个核苷酸，进一步优选约20-约100个核苷酸。术语“寡核苷酸”或“寡聚体”也指包含超过100-约2000个核苷酸的核酸序列，优选超过100-约1000个核苷酸，更优选超过100-约500个核苷酸。“寡核苷酸”通常也指任何一种聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。这种修饰可以包括骨架或核苷酸类似物。“寡核苷酸”包括但不限于：单链和双链DNA，作为单链和双链区混合物的DNA，单链和双链RNA，作为单链和双链区混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂合分子(可能是单链的，或者更一般而言是双链的或者是单链和双链区的混合物)。另外，“寡核苷酸”也指包含RNA或DNA或既含RNA又含DNA的三链区。此外，寡核苷酸也可能是合成的、基因组的或重组的，例如λ-DNA、粘粒DNA、人工细菌染色体、酵母人工染色体和丝状噬菌体，如M13。
术语“寡核苷酸”也包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，和为了稳定或其它原因而含有修饰骨架的DNA或RNA。例如，合适的核苷酸修饰/类似物包括肽核酸、肌苷、三苯甲基碱基、硫代磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、5-硝基吲哚脱氧呋喃核糖基、5-甲基脱氧胞嘧啶和5，6-二氢-5，6-二羟基脱氧胸苷。已经对DNA和RNA进行了多种修饰；因此，“寡核苷酸”包括自然界常见的多核苷酸的化学、酶或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。本领域技术人员了解其它核苷酸类似物/修饰。
包装的：此处所用的术语“包装的”指与VLP有关的免疫刺激物的状态，特别是免疫刺激性核酸的状态。此处所用的术语“包装的”包括结合，可以是共价结合如化学偶联，或者是非共价结合如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可以是，例如：酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。术语“包装的”包括如“偶联的”和“附着的”等术语，具体而言，术语“包装的”优选也包括物质的包裹或部分包裹。例如，免疫刺激物如含非甲基化CpG的寡核苷酸可以被VLP包裹，而不需要存在实际的共价或非共价的结合。因此，术语“包装的”优选含义，特别是如果免疫刺激物是免疫刺激性核酸，术语“包装的”指不能被DNase或RNase水解的包装状态的核酸。在优选实施方案中，免疫刺激性核酸被包装于VLP衣壳内，最优选以非共价方式包装。
PCR产物：此处所用的术语“PCR产物”指作为PCR初始材料的靶DNA序列的扩增拷贝。靶序列可包括，例如双链DNA。用于PCR的DNA来源可以是互补DNA，也被称为“cDNA”，它可以是使用逆转录酶产生的mRNA的转化产物。用于PCR的DNA来源可以是从细胞中提取的总基因组DNA。能够从中提取DNA进行PCR的细胞来源包括但不限于：血样；人、动物或植物组织；真菌；和细菌。用于PCR的DNA初始材料可以是未纯化的、部分纯化的或高度纯化的。用于PCR的DNA来源可以来自载体内克隆的插入片段，载体包括但不限于质粒载体和噬菌体载体。术语“PCR产物”可与术语“聚合酶链反应产物”互换使用。
本发明的组合物可以任选地与药学可接受载体组合。此处所用的术语“药学可接受的载体”指适于对人或其它动物施用的一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物。术语“载体”指一种天然或合成的有机或无机成分，活性成分与之结合，从而利于施用。
多肽：此处所用的术语“多肽”指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接而成的分子。它是指氨基酸分子链，不是指特定长度的产物。因此，多肽的定义内包括肽、寡肽和蛋白质。该术语也指多肽的表达后修饰，例如：糖基化、乙酰化、磷酸化等。重组或衍生的多肽不一定由指定的核酸序列翻译而来。可以用任何一种方法生产，包括化学合成。
“增强”免疫应答的物质指这样一种物质：与未添加该物质时测得的相同免疫应答相比，添加该物质时观察到更高或增强或偏离的免疫应答。例如，可以在使用或不使用该物质的情况下，用例如51Cr释放试验测定细胞毒性T细胞的裂解活性。与不使用该物质时的CTL裂解活性相比，CTL裂解活性提高时的物质含量被认为是足以增强动物对该抗原的免疫应答的量。在一个优选实施方案中，免疫应答至少提高约2倍，更优选地约3倍或更多。分泌的细胞因子的量或类型也可能改变。此外，诱导抗体的量或其亚类也可能改变。
有效量：此处所用的术语“有效量”指足以达到希望的生物效应的量或必需的量。组合物的有效量是能够获得所选结果的量，此含量可由本领域技术人员按常规方式确定。例如，治疗免疫系统缺陷的有效量是引起免疫系统激活、在接触抗原后产生抗原特异性免疫应答所必需的量。该术语也与“足量”同义。
用于任何一种具体用途的有效量根据以下因素而不同：所治疗的疾病、具体施用的组合物、患者体重和/或疾病的严重程度。本领域技术人员能够根据经验确定本发明具体组合物的有效量，而不需要过多的实验。
治疗(treatment)：此处所用的术语“治疗”指预防和/或治疗。例如，当用于传染性疾病时，该术语指提高患者对病原体感染的抗性，或者换句话说，降低患者感染病原体或表现感染所致病症的可能性的预防性治疗，以及患者感染后的抗感染治疗，例如减轻或消除感染或阻止其恶化。
疫苗：此处所用的术语“疫苗”指包含本发明组合物并且能够对动物施用的形式的制剂。一般而言，疫苗包含常用的盐水或缓冲液，本发明的组合物悬浮或溶解于其中。以这种形式，本发明的组合物能够方便地用于预防、改善或治疗疾病。在导入宿主后，疫苗能够引起免疫应答，包括但不限于抗体、细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突细胞的激活和/或其它细胞应答。
任选地，本发明的疫苗还包含佐剂，与本发明的化合物相比，它可能占一小部分或大部分。此处所用的术语“佐剂”指免疫应答的非特异性刺激物，或可以在宿主中产生贮存的物质，当本发明疫苗与该物质组合时能够产生更强的免疫应答。有多种佐剂可以使用。例子包括弗氏不完全佐剂、氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。
病毒样颗粒：此处所用的术语“病毒样颗粒”(VLP)指类似于病毒但是证明其不致病的结构。一般而言，本发明的病毒样颗粒不携带编码病毒样颗粒蛋白质的遗传信息。病毒样颗粒通常缺乏病毒基因组，因此是非感染性的。病毒样颗粒通常也能通过异源表达大量生产，且易于纯化。某些病毒样颗粒可能含有不同于其基因组的核酸。一般而言，根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和非感染性的，因为它缺乏病毒基因组的全部或一部分，特别是病毒基因组的复制性和感染性部分。本发明的病毒样颗粒可能含有不同于其基因组的核酸。本发明病毒样颗粒的一个典型的优选实施方案是病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体或RNA噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”在此可以互换使用，指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。一般且优选地，病毒蛋白质亚单位分别装配为病毒衣壳和衣壳，具有固有的重复组织的结构，其中这种结构一般是球形或管状。例如，RNA噬菌体或HBcAg的衣壳是二十面体对称的球形。此处所用的术语“衣壳样结构”指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体，它类似于上述衣壳形态，但是与典型的对称装配体不同，而保持足够程度的顺序和重复性。
RNA噬菌体外壳蛋白的VLP：由RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚单位自装配而成、任选地含有宿主RNA的衣壳结构，被称为“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”。一个具体例子是Qβ外壳蛋白的VLP。在此具体情况下，Qβ外壳蛋白的VLP可能仅仅由QβCP亚单位(SEQ ID：No 1)装配而成，该亚单位通过表达含有如TAA终止密码子的QβCP基因产生，该终止密码子通过抑制来阻止更长A1蛋白的任何表达，参见Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 39：9-15(1996))，或者在衣壳装配体中还含有A1蛋白亚单位(SEQ ID：No 2)。通读过程的效率低，在VLP中只有极少量的A1蛋白。已经用包装的ISS与偶联的抗原的不同组合进行了大量实施例。当使用仅由QβCP亚单位装配的Qβ外壳蛋白的VLP或在衣壳中还含有A1蛋白亚单位的Qβ外壳蛋白VLP时，偶联效率和包装未见差异。而且，这些QβVLP制品之间的免疫应答也未见差异。因此，为了清楚起见，在整个实施例描述中，术语“QβVLP”指仅由QβCP亚单位装配的Qβ外壳蛋白VLP或在衣壳中还含有A1蛋白亚单位的Qβ外壳蛋白VLP。
此处所用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形状。某些病毒类型含有由蛋白质衣壳围绕的基因组；其它的具有附加结构(例如包膜、尾等)。
无包膜病毒颗粒由围绕并保护病毒基因组的蛋白质衣壳组成。包膜病毒也具有围绕病毒遗传物质的衣壳结构，另外还有围绕该衣壳的脂双层包膜。
在本发明的一个优选实施方案中，VLP没有脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜。在一个进一步优选的实施方案中，VLP完全不含包膜。
一种：术语“一种”在本公开内容中使用时，除非另外说明，是指“至少一种”或“一种或一种以上”。
本领域技术人员应当清楚，本发明的某些实施方案涉及重组核酸技术的应用，如克隆、聚合酶链反应、DNA和RNA的纯化、重组蛋白质在原核和真核细胞中的表达等。这些方法是本领域技术人员公知的，在出版的实验室方法手册中常见(例如，Sambrook，J.等人编著，《分子克隆：实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997))。应用组织培养细胞系进行的基本实验室技术在文献中也有大量描述(Celis，J.编著，《细胞生物学》，Academic Press，第二版，(1988))和基于抗体的技术(Harlow，E.和Lane，D.，《抗体：实验室手册》，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Habor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，“蛋白质纯化指南”，Meth.Enzymol.128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，《蛋白质纯化原理与实践》，第三版，Springer-Verlag，New York(1994))，这些文献均在此引用作为参考。
2.增强免疫应答的组合物和方法
本发明提供增强动物针对一种或多种抗原的免疫应答的组合物和方法。本发明的组合物包含或者由下列成分组成：病毒样颗粒和免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸，更优选含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中寡核苷酸与病毒样颗粒结合，获得的修饰的病毒样颗粒与一种抗原、几种抗原或抗原混合物混合。而且，本发明能够使技术人员方便地构建这种组合物，用于多种治疗和/或预防目的，包括传染病以及慢性传染病的预防和/或治疗，癌症的预防和/或治疗，以及变态反应或变态反应相关疾病如哮喘的预防和/或治疗。
在本申请书中，病毒样颗粒指类似于病毒颗粒但是不致病的结构。病毒样颗粒通常缺乏病毒基因组，因此无感染性。病毒样颗粒也能够通过异源表达大量生产，并且易于纯化。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。熟练技术人员能够利用重组DNA技术和可公开获得的病毒编码序列制备VLP。例如，可以利用遗传工程学方法使病毒包膜或核心蛋白的编码序列在病毒启动子的调控下在可购得的杆状病毒载体中表达，并对序列进行适当修饰，以使编码序列与调节序列功能性连接。例如，也可以利用遗传工程学方法使病毒包膜或核心蛋白的编码序列在细菌表达载体中表达。
VLP的例子包括但不限于：乙型肝炎病毒(Ulrich等人，Virus Res.50：141-182(1998))、麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160：173-178(1995))、辛德毕斯病毒、轮状病毒(美国专利号5,071,651和5,374,426)、口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 13：1603-1610(1995))、诺瓦克病毒(Jiang，X.等人，Science 250：1580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest.87：1456-1461(1991))的衣壳蛋白，逆转录病毒GAG蛋白(PCT专利申请号WO96/30523)，逆转录转座子Ty蛋白p1，乙型肝炎病毒(WO92/11291)、人乳头瘤病毒(WO98/15631)、RNA噬菌体、Ty、fr-噬菌体、GA-噬菌体、AP205-噬菌体、特别是Qβ-噬菌体的表面蛋白。
本领域技术人员应当理解，本发明的VLP不限于任何特定形式。该颗粒能够化学合成或通过生物学方法制备，可以是天然的或非天然的。例如，这种类型的实施方案包括病毒样颗粒或其重组形式。
在一个更具体的实施方案中，VLP可以包含或者基本由或者由选自下列的重组多肽或其片段组成：重组轮状病毒多肽，重组诺瓦克病毒多肽，重组甲病毒多肽，重组口蹄疫病毒多肽，重组麻疹病毒多肽，重组辛德毕斯病毒多肽，重组多瘤病毒多肽，重组逆转录病毒多肽，重组乙型肝炎病毒多肽(例如HBcAg)，重组烟草花叶病毒多肽，重组禽兽棚病毒多肽，重组人乳头瘤病毒多肽，重组噬菌体多肽，重组RNA噬菌体多肽，重组Ty多肽，重组fr-噬菌体多肽，重组GA-噬菌体多肽，重组AP205-噬菌体多肽，和重组Qβ-噬菌体多肽。病毒样颗粒还可以包含或者基本由或者由这些多肽的一个或多个片段以及这些多肽的变体组成。多肽变体与其野生型对应物在氨基酸水平上例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成。优选地，RNA噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；l)噬菌体PP7；和m)噬菌体AP205。
在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由RNA噬菌体Qβ、RNA噬菌体fr或RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，重组蛋白包含、基本由或者由RNA噬菌体的外壳蛋白组成。
因此，形成衣壳或VLP的RNA噬菌体外壳蛋白，或者适于自装配为衣壳或VLP的噬菌体外壳蛋白的片段，是本发明进一步优选的实施方案。例如，噬菌体Qβ外壳蛋白能够在大肠杆菌中重组表达。进而，这些蛋白质在表达后自发形成衣壳。另外，这些衣壳也能形成具有固有重复组织的结构。
能够用来制备本发明组合物的噬菌体外壳蛋白的具体优选实例包括以下RNA噬菌体的外壳蛋白：噬菌体Qβ(SEQ ID NO：1；PIR数据库，登录号VCBPQβ，指QβCP，和SEQ ID NO：2；登录号AAA16663，指QβA1蛋白)，噬菌体R17(SEQ ID NO：3；PIR登录号VCBPR7)，噬菌体fr(SEQ ID NO：4；PIR登录号VCBPFR)，噬菌体GA(SEQ ID NO：5；GenBank登录号NP-040754)，噬菌体SP(SEQ IDNO：6；GenBank登录号CAA30374，指SP CP，和SEQ ID NO：7；登录号NP695026，指SP A1蛋白)，噬菌体MS2(SEQ ID NO：8；PIR登录号VCBPM2)，噬菌体M11(SEQ ID NO：9；GenBank登录号AAC06250)，噬菌体MX1(SEQ ID NO：10；GenBank登录号AAC14699)，噬菌体NL95(SEQ ID NO：11；GenBank登录号AAC14704)，噬菌体f2(SEQ ID NO：12；GenBank登录号P03611)，噬菌体PP7(SEQ ID NO：13)，噬菌体AP205(SEQ ID NO：90)。此外，噬菌体Qβ的A1蛋白(SEQ ID NO：2)或从C端缺失多达100、150或180个氨基酸的C端截短形式可以掺入Qβ外壳蛋白的衣壳装配中。为了确保衣壳形成，衣壳装配中A1蛋白相对于QβCP的百分比通常受到限制。
也发现Qβ外壳蛋白当在大肠杆菌中表达时自装配为衣壳(Kozlovska TM.等人，GENE 137：133-137(1993))。该衣壳含有180个外壳蛋白拷贝，它们通过二硫键连接成共价五聚体和六聚体(Golmohammadi R.等人，Structure 4：543-5554(1996))，使Qβ外壳蛋白的衣壳具有显著的稳定性。然而，由重组Qβ外壳蛋白构成的衣壳或VLP可能含有与衣壳内的其它亚单位不是通过二硫键连接或者不完全连接的亚单位。因此，在重组Qβ衣壳加样到非还原性SDS-PAGE之后，可见对应于单体Qβ外壳蛋白的带以及对应于Qβ外壳蛋白五聚体或六聚体的带。不完全二硫键连接的亚单位在非还原性SDS-PAGE中可能表现为二聚体、三聚体乃至四聚体带。Qβ衣壳蛋白对有机溶剂和变性剂也显示异常的抗性。我们惊奇地发现，高至30％的DMSO和乙腈浓度和高至1M的胍盐浓度不影响衣壳的稳定性。Qβ外壳蛋白衣壳的高稳定性是一个重要的特征，特别是对于用来免疫和接种哺乳动物和人的用途而言。
在大肠杆菌中表达后，Qβ外壳蛋白的N端甲硫氨酸通常被除去，通过如Stoll，E.等人，J.Biol.Chem.252：990-993(1977)所述的N端Edman测序可以检测。本发明的范围内也包括由N端甲硫氨酸尚未去除的Qβ外壳蛋白组成的VLP，或者含有Qβ外壳蛋白混合物(N端甲硫氨酸被切除或仍然存在)的VLP。
本发明进一步优选的RNA噬菌体特别是Qβ的病毒样颗粒在WO02/056905中公开，其公开内容在此全文引用作为参考。
RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达后也进一步显示自装配(Kastelein，RA等人，Gene 23：245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287：452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology170：238-242(1989)，Ni，CZ.等人，Protein Sci.5：2485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249：283-297(1995))。Qβ噬菌体衣壳除了外壳蛋白外还含有所谓的连读蛋白A1和成熟蛋白A2。A1通过在UGA终止密码子处抑制而产生，长度为329个氨基酸。本发明中使用的噬菌体Qβ重组外壳蛋白的衣壳都缺乏A2裂解蛋白，而含有来自宿主的RNA。RNA噬菌体的外壳蛋白是一种RNA结合蛋白，与复制酶基因的核糖体结合位点的茎环相互作用，作为病毒生命周期中的翻译抑制物。这种相互作用的序列和结构组件已知(Witherell，GW. &Uhlenbeck，OC.Biochemistry 28：71-76(1989)；Lim F.等人，J.Biol.Chem.271：31839-31845(1996))。已知茎环和RNA通常参与病毒装配(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-5554(1996))。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由或者由RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成。在另一个优选实施方案中，通过置换除去至少一个赖氨酸残基、或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基来修饰该突变外壳蛋白；此外，也可以通过缺失至少一个赖氨酸残基、或者通过插入添加至少一个赖氨酸残基来修饰该突变外壳蛋白。
在另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由或者由下列成分组成：具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的外壳蛋白，或具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列的外壳蛋白的混合物，或SEQ ID NO：2的突变体，其中N端甲硫氨酸优选地被切除。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由或者由突变Qβ外壳蛋白组成。在另一个优选实施方案中，通过置换去除至少一个赖氨酸残基或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基来修饰这些突变外壳蛋白。此外，也可以通过缺失至少一个赖氨酸残基或通过插入添加至少一个赖氨酸残基来修饰这些突变外壳蛋白。
有4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的衣壳表面。本发明也可以使用以精氨酸替换暴露赖氨酸残基的Qβ突变体。在本发明的实施中可以使用下列Qβ外壳蛋白突变体和突变的QβVLP：“Qβ-240”(Lys13-Arg；SEQ ID NO：14)，“Qβ-243”(Asn10-Lys；SEQ IDNO：15)，“Qβ-250”(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO：16)，“Qβ-251”(SEQ ID NO：17)和“Qβ-259”(Lys2-Arg，Lys16-Arg；SEQ IDNO：18)。因此，在本发明的进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由突变Qβ外壳蛋白的重组蛋白组成，其包含具有选自下列的氨基酸序列的蛋白质：a)SEQ ID NO：14的氨基酸序列；b)SEQ ID NO：15的氨基酸序列c)SEQ ID NO：16的氨基酸序列；d)SEQID NO：17的氨基酸序列；e)SEQ ID NO：18的氨基酸序列。上述Qβ外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化分别在WO02/056905中描述。具体参照上述申请的实施例18。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由或者由上述Qβ突变体之一和相应A1蛋白的混合物组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。
AP205基因组由成熟蛋白质、外壳蛋白、复制酶和相关噬菌体中不存在的两个开放阅读框组成；裂解基因和开放阅读框在成熟基因的翻译中起作用(Klovins，J.等人，J.Gen.Virol.83：1523-33(2002))。AP205外壳蛋白可以由质粒pAP283-58(SEQ ID NO：91)表达，该质粒是pQb10的衍生物(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-37(1993))，其含有一个AP205核糖体结合位点。此外，AP205外壳蛋白也可以克隆到pQb185内，位于载体中核糖体结合位点的下游。这两种方法都导致蛋白质的表达和衣壳的形成。载体pQb10和pQb185是由pGEM载体衍生的载体，这些载体中的克隆基因的表达受trp启动子控制(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-37(1993))。质粒pAP283-58(SEQID NO：91)在下列序列中包含一个推断的AP205核糖体结合位点，位于AP205外壳蛋白的XbaI位点下游和ATG起始密码子的直接上游：tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAA GTGAGG AAAATCACatg(SEQ ID NO：91的碱基77-133)。载体pQb185在XbaI位点下游和起始密码子上游包含一个SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGT AGGAGTCAGGCCatg，(SEQ ID NO：92)，SD序列以下划线标出)。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段组成。
本发明的这一优选实施方案包含可构成衣壳的AP205外壳蛋白。这些蛋白质是重组表达的或从天然来源制备的。电子显微镜检查(EM)和免疫扩散证实，在细菌中产生的AP205外壳蛋白自发形成衣壳。在EM中可见，AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：90)形成的衣壳与AP205RNA噬菌体外壳蛋白形成的衣壳的结构特征几乎没有区别。AP205VLP具有高度免疫原性，能够与抗原和/或抗原决定簇连接，产生以重复方式展示的抗原和/或抗原决定簇的疫苗构建体。能够产生针对这样展示的抗原的高滴度抗体，这表明结合的抗原和/或抗原决定簇能够与抗体分子相互作用，并且具有免疫原性。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段组成。
AP205VLP的可装配突变形式，包括氨基酸5处的脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：93)，也可以在本发明的实施中使用，形成本发明的一个进一步优选的实施方案。这些VLP、来自天然来源的AP205VLP或AP205病毒颗粒可以与抗原结合，产生本发明的有序、重复的抗原阵列。
AP205 P5-T突变外壳蛋白可以由质粒pAP281-32(SEQ ID NO：94)表达，该质粒由pQb185直接衍生，含有突变的AP205外壳蛋白基因而不是Qβ外壳蛋白基因。为了表达AP205外壳蛋白，用表达AP205外壳蛋白的载体转染大肠杆菌。
在实施例16和17中描述分别表达外壳蛋白和突变外壳蛋白、导致自装配为VLP的方法。合适的大肠杆菌株包括但不限于：大肠杆菌K802、JM109、RR1。合适的载体和菌株及其组合可以通过SDS-PAGE分别检测外壳蛋白和突变外壳蛋白的表达而鉴定，衣壳形成和装配如下鉴定：任选地首先通过凝胶过滤纯化衣壳，随后用免疫扩散试验(Ouchterlony试验)或电子显微镜检查(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-137(1993))检测。
由载体pAP283-58和pAP281-32表达的AP205外壳蛋白由于在大肠杆菌细胞质中加工，可能缺乏初始甲硫氨酸。AP205 VLP的切割、未切割形式或其混合物是本发明进一步优选的实施方案。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段和RNA噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段的混合物组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或重组突变外壳蛋白的片段组成。
在本发明的实施中也可使用能够分别装配为VLP和衣壳的重组AP205外壳蛋白片段。可以通过内部缺失或分别在外壳蛋白和突变外壳蛋白的末端缺失产生这些片段。向外壳蛋白和突变外壳蛋白序列中插入抗原序列或抗原序列与外壳蛋白和突变外壳蛋白序列融合(与VLP装配相容)，是本发明的另一实施方案，分别产生嵌合AP205外壳蛋白和颗粒。可以通过电子显微镜检查来确定插入、缺失以及与外壳蛋白序列融合的结果，以及是否与装配为VLP相容。
由上述AP205外壳蛋白、外壳蛋白片段和嵌合外壳蛋白形成的颗粒可以被分离为纯化形式，分离方法是组合使用通过沉淀的分级分离步骤和通过凝胶过滤的纯化步骤，例如使用Sepharose CL-4B、Sepharose CL-2B、Sepharose CL-6B柱及其组合。分离病毒样颗粒的其它方法在本领域公知，可以用来分离噬菌体AP205的病毒样颗粒(VLP)。例如，美国专利号4,918,166描述了利用超速离心分离酵母逆转录转座子Ty的VLP，在此全文引用作为参考。
几种RNA噬菌体的晶体结构已经测定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-554(1996))。利用这些信息，本领域技术人员可以容易地鉴定表面暴露的残基，并修饰RNA噬菌体外壳蛋白使插入一个或多个反应性氨基酸残基。因此，本领域技术人员可以容易地制备并鉴定能够用于本发明的噬菌体外壳蛋白的修饰形式。因此，也可以利用形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体(例如噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP、噬菌体MS2和噬菌体AP205的外壳蛋白)制备本发明的组合物。
尽管上述变异蛋白质的序列与其野生型不同，但是这些变异蛋白质通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此，本发明还包括：分别还包含形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体的组合物和疫苗组合物，以及分别制备这些组合物和疫苗组合物的方法，用来制备这些组合物的各种蛋白质亚单位，和编码这些蛋白质亚单位的核酸分子。因此，本发明的范围内包括可形成衣壳或衣壳样结构，保留结合并形成衣壳或衣壳样结构的能力的野生型蛋白质变体。
因此，本发明还包括包含以下蛋白质的组合物和疫苗组合物，该蛋白质包含或者基本由或者由与野生型蛋白质至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，它们各自可形成有序的阵列，具有固有的重复结构。在许多情况下，这些蛋白质将被加工除去信号肽(例如异源信号肽)。
本发明的范围内还包括编码用来制备本发明组合物的蛋白质的核酸分子。
在具体实施方案中，本发明还包括包含以下蛋白质的组合物，该蛋白质包含或者基本由或者由与SEQ ID NO：1-11所示任何一种氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
适用于本发明的蛋白质也包括可形成衣壳或衣壳样结构蛋白质的C端截短突变体，以及其它有序阵列。这类截短突变体的具体例子包括具有SEQ ID NO：1-11任一所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从C端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些C端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其它蛋白质也包括可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质的N端截短突变体。这类截短突变体的具体例子包括具有SEQID NO：1-11任一所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些N端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其它蛋白质包括可形成衣壳或衣壳样结构的N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括具有SEQ ID NO：1-11任一所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸，从C端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些N端和C端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
本发明还包括包含以下蛋白质的组合物，这些蛋白质包含或者基本由或者由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
本发明包括由可形成有序阵列的蛋白质制备的组合物和疫苗组合物，由各种蛋白质亚单位和VLP或衣壳制备这些组合物的方法，制备这些蛋白质亚单位的方法，编码这些亚单位的核酸分子，以及利用本发明的这些组合物接种和/或在个体中引发免疫应答的方法。
保留诱导免疫应答能力的VLP片段可以包含或者由如下长度的多肽组成，这些多肽的长度约为15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸，显然这取决于组成VLP的亚单位的序列长度。这些片段的例子包括此处所述适于制备免疫应答增强组合物的蛋白质片段。
在本发明的另一个优选实施方案中，VLP缺乏脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜。在一个进一步优选的实施方案中，VLP完全不含包膜。
缺乏脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜，特别是完全缺乏包膜，产生结构和组成更加明确的病毒样颗粒。这些更加明确的病毒样颗粒可以使副作用减至最小。而且，缺少含脂蛋白的包膜，或者特别是完全缺乏包膜，使得病毒样颗粒内掺入潜在毒性分子和热原的可能性消失或减至最小。
如前所述，本发明包括病毒样颗粒或其重组形式。本领域技术人员了解如何制备这些颗粒并将其与抗原混合。通过其它实施例，本发明在此说明作为病毒样颗粒的乙型肝炎病毒样颗粒的制备(实施例1)。
在一个实施方案中，在本发明组合物中使用的颗粒包含乙型肝炎衣壳(核心)蛋白(HBcAg)或HBcAg的片段。在另外一个实施方案中，在本发明组合物中使用的颗粒包含经过修饰的乙型肝炎衣壳(核心)蛋白(HBcAg)或HBcAg的片段，它们除去或减少了游离半胱氨酸残基的数量。Zhou等人(J.Virol.66：5393-5398(1992))证实，修饰后除去自然存在的半胱氨酸残基的HBcAg保留结合并形成多聚体结构的能力。因此，适于在本发明组合物中使用的核心颗粒包括那些包含修饰HBcAg或其片段的颗粒，其中一个或多个自然存在的半胱氨酸残基已经被去除或者被替换为另外一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。
HBcAg是通过加工乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的蛋白质。HBcAg的大量同种型已经被鉴定，本领域技术人员能够容易地获得其氨基酸序列。例如，具有SEQ ID NO：71所示氨基酸序列的HBcAg蛋白，长度为183个氨基酸，是通过加工212个氨基酸的乙型肝炎核心抗原前体蛋白而产生的。该加工导致从乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端除去29个氨基酸。类似地，长度为185个氨基酸的HBcAg蛋白是通过加工214个氨基酸的乙型肝炎核心抗原前体蛋白而产生。
在大多数情况下，本发明的组合物和疫苗组合物分别用HBcAg的加工形式(即已经除去乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列的HBcAg)制备。
另外，当在不发生加工的条件下制备HBcAg时，HBcAg通常表达为“加工的”形式。例如，当利用将蛋白质定向表达于细胞质的大肠杆菌表达系统生产本发明的HBcAg时，通常这些蛋白质的表达不含乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列。
能够用于本发明的乙型肝炎病毒样颗粒的制备在以下专利中公开，例如：WO00/32227，特别是其实施例17-19和21-24，以及WO01/85208，特别是实施例17-19、21-24、31和41，和WO02/056905。最后一个申请中具体参照实施例23、24、31和51。全部这三篇文献在此明确引用作为参考。
本发明还包括经修饰后缺失或置换一个或多个其它半胱氨酸残基的HBcAg变体。因此，本发明的疫苗组合物包括含有如下HBcAg的组合物，其中SEQ ID NO：71所示氨基酸序列中不含的半胱氨酸残基已经被去除。
本领域公知，游离半胱氨酸残基能够参与一些化学副反应。这些副反应包括二硫键交换，与例如在其它物质联合治疗中注射或形成的化学物质或代谢物反应，或暴露于紫外线后的直接氧化以及与核苷酸的反应。因而可能产生毒性加合物，特别是考虑到HBcAg具有结合核酸的强烈倾向。毒性加合物将会以多种形式分布，它们单个可能以低浓度存在，但在一起存在时达到毒性水平。
如上所述，在疫苗组合物中使用经修饰除去天然存在之半胱氨酸残基的HBcAg的一个优点是，当抗原或抗原决定簇附着时，毒性物能够结合的位点在数量上减少或者完全消失。
适用于本发明的一些天然存在的HBcAg变体已经被鉴定。例如，Yuan等人(J.Virol.73：10122-10128(1999))描述了在对应于SEQ IDNO：19位点97的位点处异亮氨酸残基被置换为亮氨酸残基或苯丙氨酸残基的变体。一些HBcAg变体以及几种乙型肝炎核心抗原前体变体的氨基酸序列在下列GenBank报告中公开：AAF121240(SEQ IDNO：20)、AF121239(SEQ ID NO：21)、X85297(SEQ ID NO：22)、X02496(SEQ ID NO：23)、X85305(SEQ ID NO：24)、X85303(SEQ IDNO：25)、AF151735(SEQ ID NO：26)、X85259(SEQ ID NO：27)、X85286(SEQ ID NO：28)、X85260(SEQ ID NO：29)、X85317(SEQ IDNO：30)、X85298(SEQ ID NO：31)、AF043593(SEQ ID NO：32)、M20706(SEQ ID NO：33)、X85295(SEQ ID NO：34)、X80925(SEQ IDNO：35)、X85284(SEQ ID NO：36)、X85275(SEQ ID NO：37)、X72702(SEQ ID NO：38)、X85291(SEQ ID NO：39)、X65258(SEQ IDNO：40)、X85302(SEQ ID NO：41)、M32138(SEQ ID NO：42)、X85293(SEQ ID NO：43)、X85315(SEQ ID NO：44)、U95551(SEQ IDNO：45)、X85256(SEQ ID NO：46)、X85316(SEQ ID NO：47)、X85296(SEQ ID NO：48)、AB033559(SEQ ID NO：49)、X59795(SEQ IDNO：50)、X85299(SEQ ID NO：51)、X85307(SEQ ID NO：52)、X65257(SEQ ID NO：53)、X85311(SEQ ID NO：54)、X85301(SEQ IDNO：55)、X85314(SEQ ID NO：56)、X85287(SEQ ID NO：57)、X85272(SEQ ID NO：58)、X85319(SEQ ID NO：59)、AB010289(SEQ IDNO：60)、X85285(SEQ ID NO：61)、AB010289(SEQ ID NO：62)、AF121242(SEQ ID NO：63)、M90520(SEQ ID NO：64)、P03153(SEQ IDNO：65)、AF110999(SEQ ID NO：66)和M95589(SEQ ID NO：67)，其公开内容均在此引用作为参考。这些HBcAg变体在多个位点处的氨基酸序列不同，包括对应于位于SEQ ID NO：68中位点12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182和183处氨基酸残基的氨基酸残基。在WO01/98333、WO00/177158和WO00/214478中描述了适于在本发明组合物中使用，并且可根据本申请书公开内容进一步修饰的其它HBcAg变体。
适用于本发明的HBcAg可以来源于任何生物，只要它们能够包裹或偶联或以其它方式附着含非甲基化CpG的寡核苷酸，并诱导免疫应答。
如上所述，一般将加工的HBcAg(即缺乏前导序列)用于本发明的组合物和疫苗组合物中。本发明包括使用上述变异HbcAg的疫苗组合物，以及使用这些组合物的方法。
本发明还包括能够连接形成二聚体或多聚体结构的其它HBcAg变体。因此，本发明还包括包含HBcAg多肽的组合物和疫苗组合物，该多肽包含或者由与任何一种野生型氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，以及必要时加工除去N端前导序列的这些蛋白质的形式。
多肽是否具有与上述野生型氨基酸序列之一或其亚部分至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，可以利用公知的计算机程序如Bestfit程序常规确定。当利用Bestfit或其它任何序列比对程序确定具体序列与参照氨基酸序列是否如95％相同时，设置参数使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分数，并且允许同源性缺口达参照序列中氨基酸残基总数的5％。
具有SEQ ID NO：20-63和64-67所示氨基酸序列的HBcAg变体和前体彼此相对地相似。因此，HBcAg变体中位于对应于SEQ IDNO：68中特定位点的位点处的氨基酸残基，是指在SEQ ID NO：68所示氨基酸序列中该位点处的氨基酸残基。在感染哺乳动物的乙型肝炎病毒之间，这些HBcAg变体之间的同源性在很大程度上足够高，因此本领域技术人员不难检查分别如SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列，以及具体HBcAg变体的氨基酸序列，并确定“相应的”氨基酸残基。例如，SEQ ID NO：64所示的HBcAg氨基酸序列，其显示来源于感染土拨鼠的病毒的HBcAg的氨基酸序列，与含有SEQ ID NO：68所示氨基酸序列的HBcAg有足够的同源性，显然在SEQ ID NO：64中在SEQ ID NO：68的氨基酸残基155与156之间插入了3个氨基酸残基。
本发明还包括包含感染鸟类的乙型肝炎病毒之HBcAg变体的疫苗组合物，以及包含这些HBcAg变体的片段的疫苗组合物。对于这些HBcAg变体，在添加到本发明疫苗组合物之前，这些多肽中自然存在的1、2、3个或更多的半胱氨酸残基可被置换为另外一种氨基酸残基或者缺失。
如上所述，去除游离半胱氨酸残基减少了毒性成分能够与HBcAg结合的位点数，也除去了同一HBcAg或相邻HBcAg分子的赖氨酸与半胱氨酸残基能够交联的位点。因此，在本发明的另一个实施方案中，乙型肝炎病毒衣壳蛋白的一个或多个半胱氨酸残基缺失或被替换为另一种氨基酸残基。
在其它实施方案中，本发明的组合物和疫苗组合物分别含有已经除去C端区(例如SEQ ID NO：68的氨基酸残基145-185或150-185)的HBcAg。因此，适于在实施本发明中使用的其它修饰的HBcAg包括C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
适于在实施本发明中使用的HBcAg还包括N端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的修饰HBcAg。
适于在实施本发明中使用的HBcAg还包括N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸并且从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg，只要C端的截短与含CpG寡核苷酸的结合相容。
本发明还包括包含HBcAg多肽的疫苗组合物，该多肽包含或者由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
在本发明的某些实施方案中，向HBcAg多肽内引入赖氨酸残基，以介导抗原或抗原决定簇与HBcAg的VLP的结合。在优选实施方案中，用如下所述的HBcAg制备本发明的组合物，该HBcAg包含或者由SEQ ID NO：68的氨基酸1-144或1-149或1-185组成，对其进行修饰使对应于位点79和80的氨基酸被替换为氨基酸序列Gly-Gly-Lys-Gly-Gly的肽(SEQ ID NO：95)，产生具有氨基酸序列SEQID NO：96的HBcAg变体。在进一步优选的实施方案中，SEQ ID NO：68的位点48和107处的半胱氨酸残基突变为丝氨酸(SEQ ID NO：97)。本发明还包括包含相应多肽的组合物，该多肽具有SEQ ID NO：20-67任一所示的氨基酸序列，也含有上述氨基酸改变。本发明的范围内还包括能够连接形成衣壳或VLP并且具有上述氨基酸改变的其它HBcAg变体。因此，本发明还包括包含下述HBcAg多肽的组合物，该多肽包含或者由与任何一种野生型氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，以及必要时加工除去N端前导序列并通过上述改变修饰的这些蛋白质的形式。
本发明的组合物可以包含不同HBcAg的混合物。因此，这些组合物可以由氨基酸序列不同的HBcAg组成。例如，可以制备包含“野生型”HBcAg和一个或多个氨基酸残基已经改变(例如缺失、插入或置换)的修饰的HbcAg的组合物。此外，本发明优选的疫苗组合物是呈现高度有序、重复的抗原阵列的组合物。
在本发明的一个方面，与含非甲基化CpG的寡核苷酸结合的病毒样颗粒与希望增强针对它的免疫应答的抗原/免疫原混合。在某些情况下，一种抗原与这样修饰的病毒样颗粒混合。在另外一些情况下，这样修饰的VLP与几种抗原乃至复杂的抗原混合物混合。抗原可以重组制备，或者从天然来源中提取，天然来源包括但不限于：花粉、粉尘、真菌、昆虫、食物、哺乳动物表皮、羽毛、蜜蜂、肿瘤、病原体和羽毛。
如上所述，本发明是基于以下令人惊讶的发现：修饰的VLP(即可与免疫刺激物、优选免疫刺激性核酸、更优选DNA寡核苷酸或聚肌胞苷酸(poly(I:C))结合的VLP，优选与免疫刺激物、优选免疫刺激性核酸、更优选DNA寡核苷酸或聚肌胞苷酸结合产生包装的VLP)仅仅通过将这样修饰的VLP与抗原混合就能够增强针对该抗原的B细胞和T细胞应答。令人惊讶的是，抗原与VLP不需要共价连接或偶联。另外，针对VLP和抗原两者的T细胞应答尤其集中在Th1型。而且，包装的核酸和CpG分别受到保护而免于被降解，即它们更加稳定。而且，来自免疫系统的细胞的非特异性激活被显著降低。
先天免疫系统能够识别微生物病原体共有的固定分子模式。最近的研究揭示，这种识别是诱导有效免疫应答的一个关键步骤。微生物产物增强免疫应答的主要机制是刺激APC，特别是树突细胞，产生促炎细胞因子，并且表达高水平的T细胞共同刺激分子。这些激活的树突细胞随后启动初次T细胞应答，决定T细胞介导的效应功能的类型。
两类核酸，即1)在特定侧翼碱基内含有免疫刺激序列、特别是非甲基化CpG二核苷酸的细菌DNA(称为CpG基序)，2)由多种类型病毒合成的双链RNA，是增强免疫应答的微生物成分的重要成员。合成的双链(ds)RNA如聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚肌胞苷酸)能够诱导树突细胞产生促炎细胞因子并表达高水平的共同刺激分子。
Tokunaga和Yamamoto等人的一系列研究表明，细菌DNA或合成的寡脱氧核苷酸诱导人PBMC和小鼠脾细胞产生I型干扰素(IFN)(Yamamoto等人的综述，Springer Semin Immunopathol.22：11-19)。首先合成聚肌胞苷酸作为I型IFN的强诱导剂，它也诱导其它细胞因子，如IL-12。
优选的核糖核酸包括聚肌苷酸-聚胞苷酸双链RNA(聚肌胞苷酸)。核糖核酸及其修饰及其生产方法在Levy，H.B.(Methods Enzymol.1981，78：242-251)、DeClercq，E(Methods Enzymol.1981，78：227-236)和Torrence，P.F.(Methods Enzymol 1981；78：326-331)以及其中的参考文献中有描述。进一步优选的核糖核酸包含肌苷酸和胞苷酸的多核苷酸如聚肌胞苷酸，其两条链形成双链RNA。核糖核酸能够从生物中分离。核糖核酸也包括其它合成的核糖核酸，特别是合成的聚肌胞苷酸寡核苷酸，它们通过磷酸二酯骨架的修饰，特别是通过硫代磷酸酯修饰形成核酸酶抗性。在另一个实施方案中，用脱氧核糖代替聚肌胞苷酸的核糖骨架。本领域技术人员了解合成寡核苷酸的合成方法。
在本发明的另一个优选实施方案中，包括可激活toll样受体(TLR)的分子。迄今为止已知有10种人toll样受体。它们被多种配体激活。TLR2被肽聚糖、脂蛋白、脂多糖、脂磷壁酸和酵母聚糖以及激活巨噬细胞的脂肽MALP-2所激活；TLR3被双链RNA如聚肌胞苷酸激活；TLR4被脂多糖、脂磷壁酸和紫杉醇以及热休克蛋白如热休克蛋白HSP-60和Gp96激活；TLR5被细菌鞭毛、特别是鞭毛蛋白激活；TLR6被肽聚糖激活；TLR7被咪喹莫特和咪唑并喹啉化合物如R-848、洛索立宾和溴匹立明激活；TLR9被细菌DNA、特别是CpG-寡核苷酸激活。TLR1、TLR8和TLR10的配体迄今为止还不知道。然而，最近的报告表明，相同的受体能够与不同的配体相互作用，并且存在其它受体。以上所列配体并非穷举，本领域技术人员还知道其它的配体。
含非甲基化CpG的寡核苷酸通常包含序列：
5’X1X2CGX3X4 3’
其中X1、X2、X3、X4是任一种核苷酸。另外，该寡核苷酸能够包含约6-约100,000个核苷酸，优选约6-约2000个核苷酸，更优选约20-约2000个核苷酸，更优选包含约20-约300个核苷酸。另外，该寡核苷酸也可以包含100个以上到约2000个核苷酸，优选100个以上到约1000个核苷酸，更优选100个以上到约500个核苷酸。
在一个优选实施方案中，含CpG的寡核苷酸在磷酸酯骨架上含有一个或多个硫代磷酸酯修饰。例如，本发明的范围内包括其中含有一个或多个磷酸酯骨架修饰或者全部磷酸酯骨架修饰的含CpG的寡核苷酸，也包括其中一个、多个或全部核苷酸磷酸酯骨架修饰为硫代磷酸酯修饰的含CpG的寡核苷酸。
含CpG的寡核苷酸也可以是重组的、基因组的、合成的、cDNA、质粒衍生的和单链或双链的。为了在本发明中使用，可以利用本领域公知的多种方法之一从头合成核酸。例如，β-氰乙基亚磷酰胺法(Beaucage，S.L.和Caruthers，M.H.，Tet.Let.22：1859(1981))；核苷H-磷酸酯法(Garegg等人，Tet.Let.27：4051-4054(1986)；Froehler等人，Nucl.Acid.Res.14：5399-5407(1986)；Garegg等人，Tet.Let.27：4055-4058(1986)；Gaffney等人，Tet.Let.29：2619-2622(1988))。这些化学法能够用市售的多种自动寡核苷酸合成仪进行。此外，CpG也能够在质粒中大规模产生(参见Sambrook，T.等人，《分子克隆：实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989)，它在对患者施用后降解为寡核苷酸。可以利用已知技术，如使用限制性内切酶、外切核酸酶或内切核酸酶，由现有的核酸序列(例如基因组或cDNA序列)制备寡核苷酸。
免疫刺激物、免疫刺激性核酸以及含非甲基化CpG的寡核苷酸，可以用本领域已知的任何一种方法与VLP结合，只要该组合物能够增强动物的免疫应答。例如，寡核苷酸可以共价或非共价结合。另外，VLP也可以完全或部分地包裹免疫刺激物、免疫刺激性核酸以及含非甲基化CpG的寡核苷酸。优选地，免疫刺激性核酸以及含非甲基化CpG的寡核苷酸能够结合于VLP位点，如寡核苷酸结合位点(天然或非天然存在的)、DNA结合位点或RNA结合位点。在另一个实施方案中，VLP位点包含富含精氨酸的重复片段或富含赖氨酸的重复片段。
本发明的组合物的一个具体用途是为了增强针对抗原的特异性免疫应答而激活树突细胞。可以用离体(ex vivo)或体内技术增强树突细胞。离体技术可以用于自体或异源细胞，但是优选地用于自体细胞。在优选实施方案中，从外周血或骨髓中分离树突细胞，但是也可以从任何树突细胞来源中分离。为癌症免疫治疗的目的对树突细胞的离体操作在本领域的几篇参考文献中已有描述，包括Engleman，E.G.，Cytotechnology 25：1(1997)；Van Schooten，W.等人，MolecularMedicine Today，June，255(1997)；Steinman，R.M.，ExperimentalHematology 24：849(1996)；Gluckman，J.C.，Cytokines，Cellular andMolecular Therapy 3：187(1997)。
也可以利用体内方法使树突细胞接触本发明的组合物。为了实现这一点，将CpG与混合有抗原的VLP组合，直接施用于需要免疫治疗的患者。在一些实施方案中，优选地在肿瘤局部区域施用VLP/CpG，这可以用本领域公知的任何一种方法实现，例如直接向肿瘤内注射。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，含非甲基化CpG的寡核苷酸含有或者基本由或者由序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：122)组成。以前发现后者能够在体外刺激血细胞(Kuramoto E.等人，JapaneseJournal Cancer Research 83，1128-1131(1992)。
在本发明的另一个优选实施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分。优选地，该回文序列是GACGATCGTC(SEQID NO：105)。在另一个优选实施方案中，该回文序列在其3′端和5′端侧是不到10个鸟苷，其中优选该回文序列是GACGATCGTC(SEQ IDNO：105)。在一个进一步优选的实施方案中，该回文序列在其N端侧为至少3个、最多9个鸟苷，而且该回文序列在其C端侧为至少6个、最多9个鸟苷。意外地发现本发明的这些免疫刺激物可以被非常高效地包装于VLP内。与5’和3’端侧具有10个鸟苷的序列GACGATCGTC(SEQ ID NO：105)的相应免疫刺激物相比，其包装能力提高。
在本发明的一个优选实施方案中，该回文序列包含或者基本由或者由GACGATCGTC(SEQ ID NO：105)组成，或者是该序列本身，其中该回文序列在其5′端侧为至少3个、最多9个鸟苷，而且该回文序列在其3′端侧为至少6个、最多9个鸟苷。
在本发明进一步非常优选的实施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有选自下列的核酸序列：(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ IDNO：106)；在此一般缩写为G3-6)，(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO：107)；在此一般缩写为G4-6)，(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO：108)；在此一般缩写为G5-6)，(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO：109)；在此一般缩写为G6-6)，(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO：110)；在此一般缩写为G7-7)，(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQ ID NO：111)；在此一般缩写为G8-8)，(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG((SEQ ID NO：112)在此一般缩写为G9-9)，和(h)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO：113)；在此一般缩写为G6)。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，该回文序列是GACGATCGTC(SEQID NO：105)，该回文序列在其5’端侧为至少4个、最多9个鸟苷，而且该回文序列在其3’端侧为至少6个、最多9个鸟苷。
在本发明的另一个优选实施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有选自下列的核酸序列：(a)GGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ IDNO：107)，在此一般缩写为G4-6)；(b)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO：108)，在此一般缩写为G5-6)；(c)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO：109)，在此一般缩写为G6-6)；(d)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO：110)，在此一般缩写为G7-7)；(e)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQ IDNO：111)，在此一般缩写为G8-8)；(f)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG((SEQ ID NO：112)，在此一般缩写为G9-9)。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，该回文序列是GACGATCGTC(SEQID NO：105)，该回文序列在其5’端侧为至少5个、最多8个鸟苷，而且该回文序列在其3’端侧为至少6个、最多8个鸟苷。
实验数据表明，对于本发明优选的免疫刺激物，即侧翼为鸟苷、含非甲基化CpG的回文寡核苷酸(其中该回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO：105)，而且该回文序列在其3′端和5′端侧为不到10个鸟苷)，如果回文序列侧翼的鸟苷较少，则更容易被包装到VLP内。然而，减少回文序列侧翼的鸟苷数量会降低体外刺激血细胞。因此，可包装性的代价是本发明所述免疫刺激物的生物活性降低。因此优选实施方案是可包装性与生物活性之间的折衷。
在本发明的另一个优选实施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有选自下列的核酸序列：(a)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ IDNO：108)，在此一般缩写为G5-6)；(b)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO：109)，在此一般缩写为G6-6)；(c)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO：110)，在此一般缩写为G7-7)；(d)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQ ID NO：111)，在此一般缩写为G8-8)。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有SEQID NO：111的核酸序列，即该免疫刺激物是G8-8。
如上所述，被包装到VLP内的最佳序列是可包装性与生物活性之间的折衷。考虑到这一点，G8-8免疫刺激物是本发明的一个非常优选的实施方案，因为它具有高度的生物活性，而仍然被很好地包装。
本发明的组合物还含有与修饰的病毒样颗粒混合的抗原或抗原决定簇。本发明根据希望的疗效提供依所选抗原或抗原决定簇而不同的组合物。适用于本发明的抗原或抗原决定簇在WO00/32227、WO01/85208和WO02/056905中公开，其公开内容在此全文引用作为参考。
抗原可以是来源已知或者未知的任何抗原。可以从细菌、病毒或其它病原体、肿瘤、或者已知可在致敏的患者中引发变态反应的树、禾草、野草、植物、真菌、霉菌、屋尘螨、食物或动物中分离。此外，抗原也可以是通过适当的编码核酸表达获得的重组抗原。在一个优选实施方案中，抗原是重组抗原。抗原的选择当然取决于希望的免疫应答和宿主。
本发明适于使用多种抗原。在一个优选实施方案中，抗原是蛋白质、多肽或肽。
本发明的抗原可选自：(a)适于诱导针对癌细胞的免疫应答的多肽；(b)适于诱导针对传染性疾病的免疫应答的多肽；(c)适于诱导针对变应原的免疫应答的多肽；(d)适于在家畜或宠物中诱导免疫应答的多肽；(e)多肽上天然存在的糖类，和(f)(a)-(e)所述任何一种多肽的片段(例如结构域)。
优选的抗原包括来自病原体(例如病毒、细菌、寄生虫、真菌)和肿瘤的抗原(特别是肿瘤相关抗原或“肿瘤标志物”)和变应原。其它优选抗原分别包括自身抗原(autoantigen)和自体抗原(self antigen)。
在实施例所述的具体实施方案中，抗原是蜂毒。高达3％的人群对蜂毒过敏，可以用蜂毒致敏小鼠，使它们对其过敏。因此，蜂毒是理想的变应原混合物，可以用来研究在存在或不存在各种佐剂(如包装CpG的VLP)的情况下，这种混合物诱导的免疫应答。(特别参见实施例4和实施例9)。
在一些实施例中，使用含有肽p33的VLP。应当指出，只是为了方便才使用含有肽p33的VLP，在本发明中同样可以使用野生型VLP。肽p33来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)。p33肽是研究最多的CTL表位之一(Pircher等人，“Tolerance induction in doublespecific T-cell receptor transgenic mice varies with antigen，”，Nature342：559(1989)；Tissot等人，“Characterizing the functionality ofrecombinant T-cell receptors in vitro：a pMHC tetramer basedapproach”，J Immunol Methods 236：147(2000)；Bachmann等人，“Fourtypes of Ca2+ signals after stimulation of
Figure A0381422200711
T cells with T cellagonists，partial agonists and antagonists”，Eur.J.Immunol.27：3414(1997)；Bachmann等人，“Functional maturation of an anti-viral cytotoxicT cell response”，J.Virol.71：5764(1997)；Bachmann等人，“Peptideinduced TCR-down regulation on T cell predicts angonist/partialagonist properties and strictly correlates with T cell activation”，Eur.J.Immunol.27：2195(1997)；Bachmann等人，“Distinct roles for LFA-1 andCD28 during activation of T cells：adhesion versus costimulation”，Immunity 7：549(1997))。已经证实p33特异的T细胞在转基因小鼠中诱导致死性糖尿病(Ohashi等人，“Ablation of‘tolerance’and inductionof diabetes by virus infection in viral antigen transgenic mice”，Cell65：305(1991))，并且能够阻止表达p33的肿瘤细胞的生长(Kündig等人，“Fibroblasts act as efficient antigen-presenting cells in lymphoidorgans”，Science 268：1343(1995)；Speiser等人，“CTL tumor therapyspecific for an endogenous antigen does not cause autoimmune disease”，J.Exp.Med.186：645(1997))。因此，这种特异性表位特别适合研究自身免疫、肿瘤免疫以及病毒性疾病。
在本发明的一个具体实施方案中，抗原或抗原决定簇是可用来预防传染性疾病的抗原或抗原决定簇。这种治疗可以用来治疗可影响广泛宿主(例如人、牛、绵羊、猪、狗、猫、其它哺乳动物种和非哺乳动物种)的多种传染性疾病。可治疗的传染性疾病在本领域公知，例子包括：病毒性病原体的感染，如HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘、乳头瘤病毒等；或细菌性病原体的感染，如肺炎、结核、梅毒等；或寄生虫病原体的感染，如疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病、阿米巴病等。因此，为本发明的组合物选择的抗原或抗原决定簇在医学领域公知；抗原或抗原决定簇的例子包括：HIV抗原gp140和gp160；流感抗原血凝素、M2蛋白和神经酰胺酶、乙型肝炎表面抗原或核心抗原和疟疾环子孢子蛋白或其片段。
如上所述，抗原包括来自天然来源或合成的传染性微生物，如病毒、细菌和真菌及其片段。人和非人脊椎动物的传染性病毒包括逆转录病毒、RNA病毒和DNA病毒。逆转录病毒包括简单逆转录病毒和复杂逆转录病毒。简单逆转录病毒包括B型逆转录病毒、C型逆转录病毒和D型逆转录病毒亚群。B型逆转录病毒的一个例子是小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)。C型逆转录病毒包括C型A群的亚群(包括劳斯肉瘤病毒(RSV)、禽白血病病毒(ALV)和禽成髓细胞性白血病(AMV))和C型B群(包括鼠白血病病毒(MLV)、猫白血病病毒(FeLV)、鼠肉瘤病毒(MSV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、脾坏死病毒(SNV)、网状内皮组织增生病病毒(RV)和猿肉瘤病毒(SSV))。D型逆转录病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和1型猿逆转录病毒(SRV-1)。复杂逆转录病毒包括慢病毒、T细胞白血病病毒和泡沫病毒的亚群。慢病毒包括HIV-1，也包括HIV-2、SIV、维斯那病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)和马传染性白血病病毒(EIAV)。T细胞白血病病毒包括HTLV-1、HTLV-II、猿T细胞白血病病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)、猿泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。
在脊椎动物中作为抗原的RNA病毒的例子包括但不限于：呼肠孤病毒科的成员，包括正呼肠孤病毒属(哺乳动物和禽逆转录病毒的多种血清型)，环状病毒属(蓝舌病毒、Eugenangee病毒、克米罗沃病毒、非洲马疫病毒和科罗拉多蜱热病毒)，轮状病毒属(人轮状病毒、内布拉斯加牛腹泻病毒、鼠轮状病毒、猿轮状病毒、牛或绵羊轮状病毒、禽轮状病毒)；小RNA病毒科，包括肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A和B，肠道致细胞病变性人肠道孤(ECHO)病毒，甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒，猿肠道病毒，鼠脑脊髓炎(ME)病毒，脊髓灰质炎病毒，牛肠道病毒，猪肠道病毒)，心肌病毒属(脑心肌炎病毒(EMC)，门戈病毒)，鼻病毒属(人鼻病毒，包括至少113个亚型；其它鼻病毒)，鹅口疮病毒属(口蹄疫(FMDV))；杯状病毒科，包括猪水泡疹病毒、圣米格尔海狮病毒、猫小RNA病毒和诺瓦克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒属(东方马脑炎病毒，塞姆利基森林病毒，辛德毕斯病毒，屈曲病毒，阿尼昂尼昂病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊传黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，摩莱河谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，库宁病毒，中欧蜱传脑炎，远东蜱传脑炎，科萨努尔森林病毒，跳跃病病毒，波沃森病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，边界病病毒)；布亚病毒科，包括布亚病毒属(布尼亚维拉病毒及相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒)，静脉病毒属(白蛉热西西里岛病毒，裂谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕羊疾病病毒)，乌库病毒属(Uukuniemi病毒及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(A型流感病毒，多种人亚型)，猪流感病毒，禽及马流感病毒，B型流感(多种人亚型)，C型流感(可能分离的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，2-5型副流感病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，瘟热病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)，牛呼吸道合胞体病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒，辛德毕斯病毒，屈曲病毒，阿尼昂尼昂病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)；黄病毒属(蚊传黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，摩莱河谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，库宁病毒，中欧蜱传病毒，远东蜱传病毒，科萨努尔森林病毒，跳跃病病毒，波沃森病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，边界病病毒)；布亚病毒科，包括布亚病毒属(布尼亚维拉病毒及相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒)，静脉病毒属(白蛉热西西里岛病毒，裂谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕羊疾病病毒)，乌库病毒属(Uukuniemi病毒及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(A型流感病毒，多种人亚型)，猪流感病毒，禽及马流感病毒，B型流感(多种人亚型)，C型流感(可能分离的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，2-5型副流感病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，瘟热病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)，牛呼吸道合胞体病毒和小鼠肺炎病毒)；弹状病毒科，包括水泡性病毒属(VSV)，钱迪普拉病毒，佛朗德-哈特公园病毒)，狂犬病病毒属(狂犬病病毒)，鱼弹状病毒，丝状病毒(马堡病毒和埃博拉病毒)；砂粒样病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)，塔卡里伯病毒复合物，拉萨病毒；冠状病毒科，包括传染性支气管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人肠道冠状病毒，猫传染性腹膜炎病毒(猫冠状病毒)。
在脊椎动物中作为抗原的DNA病毒的例子包括但不限于：痘病毒科，包括正痘病毒属(重型天花病毒、轻型天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、水牛痘病毒、兔痘病毒、小鼠脱脚病病毒)，野兔痘病毒属(粘液瘤病毒，纤维瘤病毒)，禽痘病毒属(鸡痘病毒，其它禽痘病毒)，羊痘病毒属(绵羊痘病毒，山羊痘病毒)，猪痘病毒属(猪痘病毒)，副痘病毒属(触染性脓疮性皮炎病毒，假牛痘病毒，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲猪瘟病毒，蛙病毒2和3，鱼淋巴囊肿病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(1型和2型单纯疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，马流产病毒，马疱疹病毒2和3，假狂犬病病毒，传染性牛角膜结膜炎病毒，传染性牛鼻气管炎病毒，猫鼻气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒)和β-疱疹病毒(人巨细胞病毒和猪、猴、啮齿动物巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(EB病毒(EBV)，马雷克病病毒，松鼠猴疱疹病毒(Herpes saimiri)，蛛猴疱疹病毒(Herpesvirus ateles)，兔疱疹病毒，豚鼠疱疹病毒，勒克肿瘤病毒)；腺病毒科，包括乳腺病毒属(人A、B、C、D、E亚群和未分组的；猿腺病毒(至少23种血清型)，传染性犬肝炎，牛、猪、绵羊、蛙和其它许多种的腺病毒，禽腺病毒属(禽腺病毒)；不可培养的腺病毒；乳头多瘤空泡病毒科，包括乳头瘤病毒属(人乳头状瘤病毒，牛乳头瘤病毒，兔乳头瘤病毒，其它种的多种致病性乳头瘤病毒)，多瘤病毒属(多瘤病毒，猿空泡剂(SV-40)，兔空泡剂(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒，以及其它灵长类动物多瘤病毒，如亲淋巴乳头瘤病毒)；细小病毒科，包括腺伴随病毒属，细小病毒属(猫全血细胞减少症病毒，牛细小病毒，犬细小病毒，阿留申水貂病病毒等)。最后，DNA病毒可包括不属于上述科的病毒，如库鲁病病毒、克-雅氏症病毒和慢性传染性神经性病原体(CHINA病毒)。
以上所列均是说明性的，并非限制性的。
在本发明的一个具体实施方案中，抗原包含一个或多个细胞毒性T细胞表位、Th细胞表位或这两种表位的组合。
除了增强人体的抗原特异性免疫应答外，优选实施方案的方法尤其适于治疗其它哺乳动物或其它动物，例如鸟类，如母鸡、小鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉。鸟类是多种感染的最初目标。
鸡中常见感染的一个例子是鸡传染性贫血病毒(CIAV)。CIAV最早在日本于1979年在研究马雷克病接种过程中被分离(Yuasa等人，Avian Dis.23：366-385(1979))。自那时起，在所有主要家禽生产国的商品家禽中都检测到了CIAV(van Bulow等人，pp.690-699，《家禽疾病》，第九版，Iowa State University Press 1991)。
象其它脊椎动物一样，鸟类的接种可以在任何年龄段进行。对于活微生物，通常在12周龄之前进行接种，对于灭活微生物或其它类型的疫苗，通常在14-18周接种。对于卵内接种，可以在胚胎发育的最后四分之一时段内进行接种。疫苗可以通过皮下、喷雾、口服、眼内、气管内、鼻内、卵内或此处所述的其它方法施用。
牛和家畜也易受感染。影响这些动物的疾病会导致严重的经济损失，特别是牛的疾病。本发明的方法可以用于保护家畜如牛、马、猪、绵羊和山羊免遭感染。
牛可被牛病毒感染。牛病毒腹泻病毒(BVDV)是一种小的包膜正链RNA病毒，与猪霍乱病毒(HOCV)和绵羊边界病病毒(BDV)一起被归类为瘟病毒属。尽管瘟病毒以前被归类为披膜病毒科，但是一些研究建议它们应当与黄病毒和丙型肝炎病毒(HCV)群一起重新归类为黄病毒科。
马疱疹病毒(EHV)包括一组抗原性不同的生物剂，它们在马中引起从亚临床到致死性疾病的多种感染。它们包括马疱疹病毒-1(EHV-1)，这是普遍存在于马中的一种病原体。EHV-1与流产、呼吸道疾病、中枢神经系统疾病的流行有关。其它EHV包括EHV-2，或马巨细胞病毒，EHV-3，或马交配疹病毒，和EHV-4(以前归类为EHV-1亚型2)。
绵羊和山羊可以被多种危险微生物感染，包括维斯那-梅迪病毒。
灵长类动物，如猴、猿和猕猴，可以被猿免疫缺陷病毒感染。已经报告灭活的细胞病毒和不含细胞的全猿免疫缺陷疫苗在猕猴中产生保护(Stott等人，Lancet 36：1538-1541(1990)；Desrosiers等人，PNASUSA 86：6353-6357(1989)；Murphey-Corb等人，Science 246：1293-1297(1989)；Carlson等人，AIDS Res.Human Retroviruses 6：1239-1246(1990))。已经报告重组HIV gp120疫苗在黑猩猩中产生保护(Berman等人，Nature 345：622-625(1990))。
猫科动物，无论是驯养的还是野生的，都易感染多种微生物。例如，猫传染性腹膜炎是在驯养和野生猫科(如狮、豹、猎豹和美洲虎)中都存在的疾病。当希望预防猫感染这种和其它类型的病原微生物时，可以用本发明的方法接种猫，以防止它们感染。
家猫可能感染几种逆转录病毒，包括但不限于：猫白血病病毒(FeLV)、猫肉瘤病毒(FeSV)、内源性C型致癌RNA病毒(RD-114)和猫合胞体形成病毒(FeSFV)。Pedersen等人，Science 235：790-793(1987)首先报告了猫亲T淋巴慢病毒(也称为猫免疫缺陷病毒)的发现。猫传染性腹膜炎(FIP)是在驯养和野生猫中不可预期地发生的一种散发病。FIP主要是家猫的一种疾病，但是也曾经在狮、美洲狮、豹、猎豹和美洲虎中诊断出。罹患FIP的较小型野生猫科包括猞猁和狞獾、沙漠野猫(sand cat)和pallas cat。
有鳍鱼类、有壳水生动物或其它水生生物的病毒和细菌疾病给水产养殖业带来严重的问题。由于孵化场或封闭海水养殖区中动物密度高，传染病有可能消灭例如有鳍鱼类、有壳水生动物或其它水生生物设施中的大部分动物。一旦疾病发展，对疾病的预防是比干预更希望的应对鱼类威胁的补救措施。鱼的接种是唯一可导致长期免疫保护的预防方法。例如，美国专利号5,780,448描述了基于核酸的鱼类接种。
鱼类免疫系统具有许多类似于哺乳动物免疫系统的特征，如存在B细胞、T细胞、淋巴因子、补体和免疫球蛋白。鱼类具有淋巴细胞亚类，其作用在许多方面似乎类似于哺乳动物的B细胞和T细胞。可以通过口服或通过浸没或注射施用疫苗。
水生物种包括但不限于有鳍鱼类、有壳水生动物和其它水生动物。有鳍鱼类包括所有有脊椎的鱼类，它们可能是硬骨鱼或软骨鱼，如鲑鱼、鲤鱼、鲶鱼、黄尾师(yellowtail)、鲷和黑鲈。鲑鱼是有鳍鱼类的一个科，包括鳟鱼(包括虹鳟鱼)、鲑鱼和红点鲑。有壳水生动物的例子包括但不限于：蛤、龙虾、小河虾、螃蟹和牡蛎。其它培养的水生动物包括但不限于鳗鱼、鱿鱼和章鱼。
病毒性水产养殖病原体的多肽包括但不限于：病毒性出血性败血病病毒(VHSV)的糖蛋白或核蛋白；传染性造血坏死病毒(IHNV)的G或N蛋白；传染性胰腺坏死病毒(IPNV)的VP1、VP2、VP3或N结构蛋白；鲤鱼春季病毒血症病毒(SVC)的G蛋白；水道鲶鱼病毒(CCV)的膜结合蛋白、tegumin或衣壳蛋白或糖蛋白。
细菌病原体的多肽包括但不限于：导致疖病的杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁调节外膜蛋白(IROMP)、外膜蛋白(OMP)、A-蛋白，导致细菌性肾病(BKD)的沙氏肾杆菌(Renibacteriumsalmoninarium)的p57蛋白，耶尔森氏菌的主要表面结合抗原(msa)、表面表达的细胞毒素(mpr)、表面表达的溶血素(ish)和鞭毛抗原；巴斯德氏菌的胞外蛋白(ECP)、铁调节外膜蛋白(IROMP)和结构蛋白；鳗弧菌(Vibrosis anguillarum)和奥氏弧菌(V.ordalii)的OMP和鞭毛蛋白；鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiellosis ictaluri)和迟钝爱德华氏菌(E.tarda)的鞭毛蛋白、OMP蛋白、aroA和purA；小瓜虫属的表面抗原；柱状噬纤维菌(Cytophaga columnari)的结构性和调节性蛋白；立克次体的结构性和调节性蛋白。
寄生虫病原体的多肽包括但不限于小瓜虫属的表面抗原。
本发明的另一方面提供了这样的疫苗组合物，其适于在预防和/或缓解由“自身”基因产物(例如肿瘤坏死因子)引起或加重的疾病的方法中使用。因此，本发明的疫苗组合物包括导致产生可预防和/或缓解由“自身”基因产物引起或加重之疾病的抗体的组合物。这类疾病的例子包括移植物抗宿主病、IgE介导的变态反应、过敏反应、成人呼吸窘迫综合征、节段性肠炎、过敏性哮喘、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、Graves病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性自身免疫病、重症肌无力、免疫增生性淋巴结病(IPL)、血管免疫增生性淋巴结病(AIL)、免疫母细胞性淋巴结病(IBL)、类风湿关节炎、糖尿病、朊病毒性疾病、多发性硬化症、阿尔茨海默病和骨质疏松。
在相关的具体实施方案中，本发明的组合物是可以用来治疗和/或预防变态反应、癌症或药物成瘾的免疫治疗剂。
治疗这类疾病的医学领域的技术人员应当知道如何选择用于制备组合物以及在治疗变态反应的方法中使用的抗原或抗原决定簇。这类抗原或抗原决定簇的代表性例子包括：蜂毒磷脂酶A2，Amba1(豚草花粉变应原)，BetvI(桦树花粉变应原)，5DolmV(白面黄蜂毒变应原)，Derp1、Derf2和Der2(屋尘螨变应原)；Lepd2(屋尘螨变应原)；Alta1、Aspf1和Aspf16(真菌变应原)；Arah1、Arah2和Arah3(花生变应原)，以及能够用来引发免疫应答的各变应原的片段。而且，本发明尤其适于使用从生物或生物部分中分离的变应原混合物，如花粉提取物或蜂毒。
在一个优选实施方案中，花粉提取物包含或者由树、禾草、野草和园林植物的提取物组成。树花粉提取物的例子包括但不限于：合金欢、桤木(灰桤木)、杏树(almond)、苹果树、杏树(apricot)、金钟柏、岑树、白杨树、月桂树、山毛榉、桦树(春桦)、桦树(白桦)、红千层(brush bottle)、羽叶槭、角豆树、雪松，包括但不限于日本柳杉，樱桃、栗树、三叶杨、柏树、接骨木、榆树(美洲)、桉树、冷杉、朴树、榛子树、铁杉、山核桃树、霍布叶铁木、铁木、刺柏、洋槐、槭树、白千层、牡豆树、山梅花、桑树、橡树(白橡)、橄榄树、桔树、桑橙树、假紫荆(palo verde)、桃树、梨树、美洲山核桃树(pecan)、胡椒树、松树、李树、杨树、女贞、红杉、沙枣、云杉、香枫、小无花果树(sycamore)、美洲落叶松、臭椿、胡桃和柳树。菁草花粉提取物的例子包括但不限于：百喜草(bahai)、大麦、山毛榉(beach)、剪股颖(bent)、狗牙草、早熟禾(草地早熟禾)、雀麦草、丛生草(bunch)、草芦(canarygrass)、雀麦草(chess)、玉米、羊茅(牛尾草)、格兰马草、蒋森草(johnson grass)、june grass、koeler′s、燕麦、鸭茅、偃麦草，小糠草(redtop)、黑麦草(多年生植物)、盐草、高粱、苏丹草、甜欧洲香草(sweet vernal grass)、梯牧草、绒毛剪股颖(velvet grass)、小麦和冰草。野草和园林植物提取物的例子包括但不限于：紫花苜蓿、苋属植物、紫菀、凤仙花根、雾冰藜、beach bur、金雀花(broomwood)、burrow bush、careless weed、蓖麻子、chamise、三叶草、苍耳、金鸡菊、大波斯菊、水仙花、大丽花、雏菊、蒲公英、酸模、臭甘菊、柳兰、唐菖蒲、一枝黄花、肉叶剌茎藜(greasewood)、大麻、忍冬、蛇麻草(hops)、iodone bush、总状花藜(Jerusalem oak)、地肤(kochia)、藜(lamb′s quarters)、百合、金盏花、marshelder、土荆芥、艾属植物(mugwort)、芥菜、荨麻、pickleweed、苋、车前草(plaintain)(英国)、罂粟、povertyweed、大滨藜(quailbush)、豚草(三裂叶豚草)、豚草(短豚草)、豚草(西方豚草)、玫瑰、俄罗斯蓟(Russian thistle)、三齿蒿(sagebrush)、滨藜、鳞苞(scale)、苏格兰金雀花、sea blight、酸模、金鱼草、甜菜、向日葵、western waterhemp、winter fat、美洲土荆芥、蒿。
在一个优选实施方案中，花粉提取物含有或者由黑麦组成。豚草花粉的季节性出现(9-10月)在许多个体中诱导哮喘(Marshall，J.等人，J.Allergy Clin.Immunol.108：191-197(2001))。哮喘的特征在于肺部炎症、可逆性气流堵塞和呼吸道高反应性。对空气变应原的复杂免疫应答级联导致呼吸道中白细胞的反复增加。具体而言，淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、浆细胞和肥大细胞浸润支气管粘膜(Redman，T.等人，Exp.Lung Res.27：433-451(2001))。嗜酸性粒细胞的反复增加与TH2细胞因子IL-4和IL-5的产生增加有关，这两种细胞因子是引起慢性炎症过程的哮喘发病机制的关键因子(Justice，J.等人，Am.J Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.282：L302-L309(2002)，其完整内容在此引用作为参考)。短豚草(Ambrosia artemisiifolia)中的免疫显性豚草变应原是Amba1(Santeliz，J.等人，J.Allergy Clin.Immunol.109：455-462(2002))。在本发明的一个具体实施方案中，组合物含有与病毒样颗粒混合的Amba1。(参见实施例6)。
在另外一个优选实施方案中，粉尘提取物包含或者由室内粉尘和屋尘螨组成。室内粉尘的例子包括但不限于：室内粉尘、褥垫粉尘和装修粉尘。屋尘螨的例子包括但不限于美洲屋尘螨(D.farniae)、欧洲屋尘螨(D.ptreronysiinus)、螨混合物和害嗜鳞螨(L.destructor)。粉尘提取物还包括但不限于：雪松和铅笔柏屑、轧棉机尘、栎木屑、谷物(谷仓)屑、紫檀(paduk)木屑和木屑。
尘螨是湿润气候的发达国家中室内长期变应原的一个重要来源(Arlian，L.，Current Allergy and Asthma Reports 1：581-586(2001))。所有变应性支气管哮喘患者中约有60-85％对屋尘螨欧洲屋尘螨(Dermatophogoldes pteronyssinus)过敏(Arlian，L.，Current Allergyand Asthma Reports 1：581-586(2001))。免疫显性欧洲屋尘螨变应原包括Derp1、Derf2和Der2(Kircher，M.等人，Allergy Clin.Immunol.109：517-523(2002)，Clarke，A.等人，Int.Arch.Allergy ImmunoL120：126-134(1999)，其完整内容在此引用作为参考)。在本发明的一个具体实施方案中，组合物含有Derp1、Derf2、Der2或其片段，或其与病毒样颗粒混合的抗原性混合物。特别是在农村，对粉尘变态反应的一个重要原因是害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)(Ericksson，T.等人，Clinical and Exp.Allergy 31：1181-1890(2001))。一种免疫显性害嗜鳞螨尘螨变应原是Lepd2(Ericksson，T.等人，Clinical and Exp.Allergy 31：1181-1890(2001))。在本发明的一个具体实施方案中，组合物含有与病毒样颗粒混合的Lepd2。(参见实施例8)。
在一个优选实施方案中，真菌提取物含有或者由下列成分组成：链格孢属、曲霉属、葡萄孢属、假丝酵母属、头孢属、复端孢属(cephalothecium)、毛壳属(chaetomium)、支孢属(cladosporium)、隐球酵母属(crytococcus)、弯孢属(curvularia)、附球菌属(epicoccum)、表皮癣菌属、镰孢属、麻孢壳属(gelasinospora)、地霉属、粘帚霉属(gliocladium)、长蠕孢属(helminthosporium)、单孢枝霉属(hormodendrum)、小孢霉属(microsporium)、毛霉属、疣孢霉属(mycogone)、黑孢属(nigraspora)、拟青霉属(paecilomyces)、青霉属、茎点霉属(phoma)、芽霉属(pullularia)、根霉属、红酵母属、锈菌、酵母属、黑粉菌(smuts)、椎枝孢属(spondylocladium)、匍柄霉属(stemphylium)、木霉属、发癣菌属和轮枝孢属。
在美国，链格孢(Altemaria alternate)被认为是引起变应性疾病的最重要的真菌之一。在美国和澳大利亚的沙漠地区，链格孢属(altemaria)是主要的哮喘相关变应原，在美国中西部地区已经报道可引起严重的呼吸停止和死亡(Vailes，L.等人，J Allergy Clin.Immunol.107：641(2001)，Shampain，M.等人，Am.Rev.Respir.Dis.126：493-498(1982)，其完整内容在此引用作为参考)。免疫显性链格孢抗原是Alta1(Vailes，L.等人，J Allergy Clin.Immunol.107：641(2001))。超过80％的链格孢致敏的个体都含有抗Alta1的IgE抗体(Vailes，L.等人，Clinical and Exp.Allergy 31：1891-1895(2001))。在本发明的一个具体实施方案中，该组合物含有与病毒样颗粒混合的Alta1。(参见实施例7)。
另外一种机会性致病真菌是烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，它与多种肺疾病有关，包括变应性哮喘。免疫显性烟曲霉抗原包括Aspf1和Aspf16(Vailes，L.等人，J.Allergy Clin.Immunol.107：641(2001))。在本发明的一个具体实施方案中，组合物含有Aspf1或Aspf16或其与病毒样颗粒混合的抗原性混合物。(参见实施例7)。
在另外一个优选实施方案中，昆虫提取物包含或者由下列成分组成：整体可诱导变态反应的螫刺昆虫，毒液蛋白可诱导变态反应的螫刺昆虫，以及可诱导吸入性变态反应的昆虫。整体可诱导变态反应的螫刺昆虫的例子包括但不限于：蚂蚁(黑蚁)、蚂蚁(红蚁)、蚂蚁(木蚁)、蚂蚁混合物(黑蚁/红蚁)、蚂蚁(火蚁)。毒液蛋白可诱导变态反应的螫刺昆虫的例子包括但不限于：蜜蜂、大黄蜂、黄蜂、小黄蜂、白面黄蜂和混合黄蜂科昆虫。可诱导吸入性变态反应的昆虫的例子包括但不限于：蚜虫、黑蝇、蝴蝶、石蚕蛾、蝉/蝗虫、蟋蟀、蟑螂、水蚤、鹿虻、果蝇、蜜蜂(整体)、虻、家蝇、叶蝉、蜉蝣、墨西哥菜豆象虫(mexicanbean weevil)、螨(尘螨)、蚊子、蛾、蘑菇蝇(mushroom fly)、螺丽蝇、潮虫、蜘蛛和水蚤。(参见实施例4)。
在另外一个优选实施方案中，食物提取物包含或者由畜产品和植物产品组成。畜产品的例子包括但不限于：牛肉、鸡肉、鹿肉、鸭、蛋(鸡蛋)、鱼、山羊、鹅、羔羊、奶(牛奶)、奶(山羊奶)、猪肉、兔、贝类和火鸡。植物产物的例子包括但不限于：苹果、杏、竹芋、朝鲜蓟、芦笋、鳄梨、香蕉、菜豆、甜菜、桨果、卷心菜类、胡萝卜、芹菜、樱桃、巧克力、柑桔类水果、椰子、咖啡、黄瓜、椰枣、茄子、谷物、葡萄、绿叶植物、树胶、蛇麻子、莴苣、麦芽、芒果、甜瓜、蘑菇、坚果、秋葵、橄榄、洋葱、番木瓜、欧洲防风草、豌豆、花生、梨、甘椒、菠萝、李子、马铃薯、梅子、南瓜、萝卜、大黄、香料/调味品、菠菜、倭瓜，木薯、茶、番茄、西瓜和酵母。
对花生和树坚果的变态反应是致死和接近致死的过敏性反应的主要原因(Sampson，H.，N.Engl.J Med.346(17)：1294-1299(2002))。大约1.1％的美国人，或者300万人，对花生、树坚果或者对这两者过敏(Sampson，H.，N.Engl.J Med.346(17)：1294-1299(2002))。约6％的美国人有对花生敏感的血清学证据(即存在花生蛋白质的特异性IgE抗体)，但是这些人中的大多数在进食花生时不发生变态反应(Sampson，H.，N.Engl.J.Med.346(17)：1294-1299(2002)和Helm，R等人，J.Allergy Clin.Immunol.109：136-142(2002))。花生变态反应通常在低年龄时发生，通常在子宫内接触花生蛋白质后、在母乳喂养期间或者在儿童期早期发生，通常是一种终生疾病(Sampson，H.，N.Engl.J.Med.346(17)：1294-1299(2002)；Li，X.等人，J.Allergy Clin.Immunol.108：639-646(2001)；Helm，R.等人，J.Allergy Clin.Immunol.109：136-142(2002))。对花生过敏的婴儿长大后倾向于更严重的变态反应(Sampson，H.，N.Engl.J.Med.346(17)：1294-1299(2002))。在西方国家已经提出，提倡以花生产品作为妊娠和哺乳期妇女的营养来源致使花生变态反应的发病率增加(Sampson，H.，N.Engl.J.Med.346(17)：1294-1299(2002))。
花生变态反应症状可以在摄入食物后数分钟到数小时内发生，在危及生命的病例中，症状包括严重的支气管痉挛。当前，对花生变态反应的治疗包括教给患者及其家人如何避免意外地摄入花生、如何辨别变态反应的早期症状以及如何应对过敏反应的早期阶段(Sampson，H.，N.Engl.J.Med.346(17)：1294-1299(2002))。对于花生变态反应患者，无意的接触平均每3-5年导致一次变态反应(Sampson，H.，N.Engl.J.Med.346(17)：1294-1299(2002))。这种无意接触可能是由于生产各种产品时使用设备的花生污染、食品标注不充分、餐馆烹饪过程中食物的交叉污染和意外接触(例如在飞机上吸入花生粉尘)(Sampson，H.，N.Engl.J.Med.346(17)：1294-1299(2002))。当前对花生急性反应的治疗包括：肌肉内给予肾上腺素的侵入性治疗；口服、肌肉内或静脉内施用组胺H1-和H2-受体拮抗剂；氧气；吸入沙丁胺醇；全身性给予皮质类固醇(Sampson，H.，N.Engl.J.Med.346(17)：1294-1299(2002))。另外，通常也推荐在对花生的急性反应后予以三天疗程的口服泼尼松和抗组胺剂。如果花生变态反应严重、普遍并且通常终生持续，则需要对花生变态反应进行预防或治疗(Sampson，H.，N.Engl.J.Med.346(17)：1294-1299(2002))。
两种主要的变应原性花生蛋白是Arah1和Arah2，它们可被95％以上的花生变态反应患者识别(Bannon，G.等人，Int.Arch.AllergyImmunol.124：70-72(2001)和Li，X.等人，J.Allergy Clin.Immunol.106：150-158(2000)，其完整内容在此引用作为参考)。Arah3可被约45％的花生变态反应患者识别(Li，X.等人，J.Allergy Clin.Immunol.106：150-158(2000))。在本发明的一个具体实施方案中，组合物包含与病毒样颗粒混合的抗原Arah1、Arah2或Arah3或它们的抗原性混合物。(参见实施例5)。
在另外一个优选实施方案中，哺乳动物表皮变应原包括但不限于：骆驼、猫的毛发、猫的毛皮、灰鼠毛皮、牛、鹿、狗、沙鼠、山羊、豚鼠、仓鼠、猪、马、马海毛、猴、小鼠、兔、羊毛(绵羊)。在另外一个优选实施方案中，羽毛包括但不限于：金丝雀、鸡、鸭、鹅、鹦鹉、鸽子、火鸡。在另外一个优选实施方案中，其它吸入物包括但不限于：阿拉伯胶、藻类、蓖麻子、棉绒、棉籽、鱼藤根、蕨类孢子、谷粒尘、大麻纤维、指甲花、亚麻籽、胍尔胶、黄麻、刺梧桐树胶、木棉、皮革、石松、鸢尾根、除虫菊、丝(生丝)、剑麻、烟叶、黄蓍胶和木屑。
在另外一个优选实施方案中，一般包括从天然来源纯化的或重组表达的限定的哺乳动物变应原。包括但不限于来自猫的Feld1、Feld3(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)和来自猫、骆驼、灰鼠毛皮、牛、鹿、狗、沙鼠、山羊、豚鼠、仓鼠、猪、马、马海毛、猴、小鼠、兔、羊毛(绵羊)的白蛋白。
治疗这类疾病的医学领域的技术人员应当知道如何为治疗癌症的组合物和方法选择抗原或抗原决定簇(参见Renkvist等人，CancerImmunol.Immunother.50：3-15(2001)，在此引用作为参考)，这些抗原或抗原决定簇包括于本发明的范围内。这类抗原或抗原决定簇的代表性例子包括：Her2(乳腺癌)；GD2(神经母细胞瘤)；EGF-R(恶性胶质母细胞瘤)；CEA(甲状腺髓样癌)；CD52(白血病)；人黑素瘤蛋白gp100；人黑素瘤蛋白gp100表位，如氨基酸154-162(序列：KTWGQYWQV，SEQ ID NO：72)、209-217(ITDQVPFSV，SEQ ID NO：73)、280-288(YLEPGPVTA，SEQ ID NO：74)、457-466(LLDGTATLRL，SEQID NO：75)和476-485(VLYRYGSFSV，SEQ ID NO：76)；人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1；人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1表位，如氨基酸26-35(EAAGIGILTV)(SEQ ID NO：98)、26-35AL(ELAGIGICTV，SEQID NO：99)、27-35(AAGIGILTV，SEQ ID NO：77)和32-40(ILTVILGVL，SEQ ID NO：78)；酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白(例如TRP-1和TRP-2)；酪氨酸酶表位，如氨基酸1-9(MLLAVLYCL，SEQ ID NO：79)和368-376(YMDGTMSQV，SEQ ID NO：80)；NA17-Ant蛋白；NA17-Ant蛋白表位，如氨基酸38-64(VLPDVFIRC，SEQ ID NO：81)；MAGE-3蛋白；MAGE-3蛋白表位，如氨基酸271-279(FLWGPRALV，SEQ IDNO：82)；其它人肿瘤抗原，例如CEA表位，如氨基酸571-579(YLSGANLNL，SEQ ID NO：83)；p53蛋白；p53蛋白表位，如氨基酸65-73(RMPEAAPPV，SEQ ID NO：84)、149-157(STPPPGTRV，SEQ ID NO：85)和264-272(LLGRNSFEV，SEQID NO：86)；Her2/neu表位，如氨基酸369-377(KIFGSLAFL，SEQ IDNO：87)和654-662(IISAVVGIL，SEQ ID NO：88)；HPV16 E7蛋白；HPV16 E7蛋白表位，如氨基酸86-93(TLGIVCPI，SEQ ID NO：89)；以及能够用来引发免疫应答的各自的片段或突变体。
治疗这类疾病的医学领域的技术人员应当知道如何为治疗其它自身抗原相关疾病的组合物和方法选择抗原或抗原决定簇。这类抗原或抗原决定簇的代表性例子包括，例如：淋巴毒素(例如淋巴毒素α(LTα)、淋巴毒素β(LTβ))，淋巴毒素受体，核因子κB配体的受体激活剂(RANKL)，破骨细胞相关受体(OSCAR)，血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体(VEGF-R)，白介素17和淀粉样β肽(Aβ1-42)，TNFα，MIF，MCP-1，SDF-1，Rank-L，M-CSF，血管紧张肽原，血管紧张肽I，血管紧张肽II，Endoglin，嗜酸细胞活化趋化因子，Grehlin，BLC，CCL21，IL-13，IL-17，IL-5，IL-8，IL-15，缓激肽，抵抗素，LHRH，GHRH，GIH，CRH，TRH和胃泌素，以及能用来引发免疫应答的各自的片段。
在本发明的一个具体实施方案中，抗原或抗原决定簇选自：(a)重组HIV多肽；(b)重组流感病毒多肽(例如流感病毒M2多肽或其片段)；(c)重组丙型肝炎病毒多肽；(d)重组乙型肝炎病毒多肽；(e)重组弓形体多肽；(f)重组恶性疟原虫多肽；(g)重组间日疟原虫多肽；(h)重组卵形疟原虫多肽；(i)重组三日疟原虫多肽；(j)重组乳腺癌细胞多肽；(k)重组肾癌细胞多肽；(l)重组前列腺癌细胞多肽；(m)重组皮肤癌细胞多肽；(n)重组脑癌细胞多肽；(o)重组白血病细胞多肽；(p)重组抑制蛋白；(q)重组蜂螫变应原多肽；(r)重组坚果变应原多肽；(s)重组花粉多肽；(t)重组室尘多肽；(u)重组猫或猫毛变应原多肽；(V)重组食物变应原蛋白；(w)重组哮喘蛋白；(x)重组衣原体蛋白；(y)从(a)-(x)所述任何一种蛋白质来源中提取的抗原；(z)(a)-(x)所述任何一种蛋白质的片段。
在本发明的另外一个实施方案中，与包装了免疫刺激物、免疫刺激性核酸或含非甲基化CpG的寡核苷酸的本发明病毒样颗粒混合的抗原是T细胞表位，它是细胞毒性表位或Th细胞表位。在本发明的另外一个实施方案中，与包装了免疫刺激物、免疫刺激性核酸或含非甲基化CpG的寡核苷酸的本发明病毒样颗粒混合的抗原是B细胞表位。在一个进一步优选的实施方案中，抗原是至少两种、优选地不同表位的组合物，其中至少两种表位直接连接或通过连接序列连接。这些表位优选地选自细胞毒性表位和Th细胞表位。
本发明的抗原，特别是所述表位，可以被合成或重组表达，并且与病毒样颗粒偶联，或利用重组DNA技术与病毒样颗粒融合。抗原与病毒样颗粒附着的典型方法公开在WO00/32227、WO01/85208和WO02/056905中公开，其公开内容在此引用作为参考。
本发明也提供一种生产用于增强动物免疫应答的组合物的方法，该组合物包含VLP和与VLP结合的含非甲基化CpG的寡核苷酸，该方法包括将VLP与该寡核苷酸孵育，添加RNase，并纯化该组合物。在一个同样优选的实施方案中，该方法包括将VLP与RNase孵育，添加寡核苷酸，并纯化该组合物。在一个实施方案中，VLP在细菌表达系统中制备。在另外一个实施方案中，RNase是RNaseA。
本发明还提供一种制备用于增强动物免疫应答的组合物的方法，该组合物包含与含非甲基化CpG的寡核苷酸结合的VLP，该方法包括解装配VLP，添加寡核苷酸，并重装配VLP。该方法还可以包括除去至少部分解装配的VLP的核酸，和/或在重装配后纯化该组合物。
本发明也提供能够用来预防和/或缓解疾病的疫苗组合物。本发明的疫苗组合物包含或者由下列成分组成：免疫有效量的本发明免疫增强组合物，以及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。疫苗任选地也可包含佐剂。
本发明还提供用来预防和/或缓解动物疾病的接种方法。在一个实施方案中，本发明提供用于预防多种动物(特别是哺乳动物种，如人、猴、牛、狗、猫、马、猪等)的传染病的疫苗。该疫苗可以设计为治疗病毒引起的感染，如HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘等；或细菌引起的感染，如肺炎、结核、梅毒等；或寄生虫引起的感染，如疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病、阿米巴病等。
在另外一个实施方案中，本发明提供用于预防多种物种(特别是哺乳动物种，如人、猴、牛、狗、猫、马、猪等)的癌症的疫苗。该疫苗可以设计为治疗所有类型的癌症，包括但不限于淋巴瘤、癌、肉瘤和黑素瘤。
本领域技术人员应当理解，当对动物施用本发明的组合物时，该组合物可以含有盐、缓冲液、佐剂或希望用来提高组合物效力的其它物质。在大量资料中提出了适于制备药用组合物的材料的例子，包括REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol，A编著，MackPublishing Co.，(1990))。
根据不同的宿主种，可以用不同佐剂增强免疫应答，包括但不限于：弗氏(完全及不完全)佐剂，无机凝胶如氢氧化铝，表面活性剂如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油状乳剂、匙孔戚血蓝蛋白、二硝基酚，以及可能用于人的佐剂，如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂在本领域公知。可以与本发明的组合物一起施用的其它佐剂包括但不限于：单磷酸脂免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294和病毒体佐剂技术。佐剂也可包括这些物质的混合物。
来源于南美树木Quillaja Saponaria Molina的树皮具有佐剂活性的免疫活性皂苷级分为本领域公知。例如，QS21，也被称为QA21，是来自Quillaja Saponaria Molina树的HPLC纯化级分，其生产方法在美国专利号5,057,540中公开(作为QA21)。Scott等人，Int.Archs.Allergy Appl.Immun.，1985，77，409也公开了作为佐剂的Quillaja皂苷。本领域公知单磷酸脂A及其衍生物。一种优选的衍生物是3脱氧酰化单磷酸脂A，由英国专利号2220211公开。进一步优选的佐剂在WO00/00462中公开，其内容在此引用作为参考。
如果接受个体能够耐受本发明组合物的施用，则称该组合物是“药理学可接受的”。而且，本发明的组合物以“治疗有效量”施用(即产生希望的生理学效应的量)。
本发明的组合物可以通过本领域所知的多种方法施用。选择的具体方式当然取决于所选择的具体组合物、所治疗疾病的严重程度和有效治疗所需的剂量。一般来说，本发明的方法可以用医学可接受的任何给药方式实施，即，任何产生有效水平的活性化合物而不会引起临床上不可接受之副作用的方式。这些给药方式包括口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(通过粉末、软膏、液滴或皮肤帖剂)、面颊或口或鼻喷雾。如此处所用的术语“肠胃外”指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液在内的给药方式。本发明的组合物也可以直接注射到淋巴结内。
用于给药的组合物成分包括无菌水溶液(例如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水性溶剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和注射用有机酯如油酸乙酯。可以利用载体或封闭性包衣提高皮肤通透性并促进抗原吸收。
联合给药可以同时(例如作为混合物，或分开但同时或共同给药)或相继施用。这包括组合药剂作为治疗混合物一起施用的形式，以及各种组合药剂分开但同时施用的方法，例如通过不同的静脉输入同一个体内。“联合”给药还包括先给予这些化合物或药剂之一，随后再给予第二种。
剂量水平取决于给药方式、患者状况和载体/佐剂制剂的质量。常用量为每名患者约0.001μg-约20mg。优选的量是每名患者至少约1μg-约100μg。优选多次给药以产生免疫，方案是本领域中适于所述对象的标准方案。一般抗原含量范围与不添加VLP的常用给药范围相当、相似或相同。
组合物可以方便地制成单位剂量形式，可以按制药领域公知的任何方法制备。这些方法包括使本发明的组合物与构成一种或多种辅助成分的载体相结合的步骤。通常如下制备这些组合物：使本发明的组合物均匀、密切地与液体载体、细碎的固体载体或这两种载体混合，然后在必要时使产品成形。
适于口服的组合物可以是分散的单位形式，如胶囊、片剂或锭剂，每个单位含有预定量的本发明组合物。其它形式的组合物包括在水性溶液或非水性液体中的悬液，如糖浆、酏剂或乳剂。
其它给药系统包括定时释放、延时释放或缓释给药系统。这些系统可以避免重复施用上述本发明的组合物，方便了患者和医生。有多种类型的释放给药系统可以应用，这是本领域技术人员公知。
本发明的其它实施方案包括生产本发明组合物的方法，和利用该组合物治疗癌症和变态反应的方法。
因此，本发明尤其涉及以下发现：病毒样颗粒(VLP)分别可以负载和包装富含非甲基化C和G(CpG)的DNA寡核苷酸。如果这些CpG-VLP与抗原混合，这些抗原的免疫原性就被显著提高。另外，针对这些抗原的T细胞应答特别是Th1型。令人惊讶的是，抗原与VLP不需要共价连接，只要混合VLP与佐剂即足以供施用。另外，除非VLP负载和包装了CpG，否则它们不增强免疫应答。因此，与包装CpG的VLP混合的抗原可以是针对变态反应、肿瘤和其它自体分子和慢性病毒性疾病进行预防性或治疗性接种的理想疫苗。
另一方面，本发明提供一种生产用于增强动物免疫应答的组合物的方法，该组合物含有病毒样颗粒和包装于该病毒样颗粒内的免疫刺激物，该方法包括：(a)孵育该病毒样颗粒与该免疫刺激物；(b)添加RNase；和(c)纯化该组合物。
另一方面，本发明提供一种生产用于增强动物免疫应答的组合物的方法，该组合物含有病毒样颗粒和包装于该病毒样颗粒内的免疫刺激物，该方法包括：(a)孵育该病毒样颗粒与RNase；(b)添加该免疫刺激物；和(c)纯化该组合物。
另一方面，本发明提供一种生产用于增强动物免疫应答的组合物的方法，该组合物含有病毒样颗粒和包装于该病毒样颗粒内的免疫刺激物，该方法包括：(a)解装配该病毒样颗粒；(b)添加该免疫刺激物；和(c)重装配该病毒样颗粒。在一个备选实施方案中，本发明生产用于增强动物免疫应答的组合物的方法还包括除去解装配的病毒样颗粒的核酸。在另外一个备选实施方案中，本发明生产用于增强动物免疫应答的组合物的方法还包括在重装配(c)后纯化该组合物。
另一方面，本发明提供一种生产用于增强动物免疫应答的组合物的方法，该组合物含有病毒样颗粒和包装于该病毒样颗粒内的免疫刺激物，该方法包括：(a)将该病毒样颗粒与含有能够水解该病毒样颗粒之核酸的金属离子的溶液孵育；(b)添加该免疫刺激物；和(c)纯化该组合物。优选地，能够水解该病毒样颗粒之核酸的金属离子选自：(a)锌(Zn)离子；(b)铜(Cu)离子；(c)铁(Fe)离子；(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种离子的任意混合物。
在上述本发明生产用于增强动物免疫应答组合物的方法的优选实施方案中，免疫刺激物是免疫刺激性核酸，其选自或者基本由下列成分组成：(a)核糖核酸，优选聚肌胞苷酸或其衍生物；(b)脱氧核糖核酸，优选不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸，更优选含非甲基化CpG的寡核苷酸；(c)嵌合核酸；和(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种核酸的任意混合物。
在本发明生产用于增强动物免疫应答组合物的方法的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒在细菌或哺乳动物表达系统中制备，在一个进一步优选的实施方案中，RNase是RNaseA。
下列实施例只是说明性的，并非意在限制如附加权利要求书所限定的本发明的范围。本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的方法进行多种修改和变化。因此，本发明覆盖本发明的修改和变化，只要它们属于所附权利要求书及其等同物的范围之内。
本文提到的所有专利、专利申请和公开文献均在此全文引用作为参考。
实施例1
VLP的制备
含有肽p33(来自LCMV)的HBcAg DNA序列在SEQ ID NO：70中给出。p33-HBcAg VLP(p33-VLP)如下制备：含有乙型肝炎病毒完整病毒基因组的乙型肝炎克隆pEco63购自ATCC。表达质粒的制备以前已有描述(参见WO03/024481)。
为了良好表达而选择大肠杆菌K802的克隆，用该质粒进行转染，培养细胞并重悬浮于5ml裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA，0.25％Tween-20，pH7.0)中。加入200μl溶菌酶溶液(20mg/ml)。超声处理后，加入4μl Benzonase和10mM MgCl2，悬液在室温下孵育30分钟，在4℃下以15000rpm离心15分钟，保留上清液。
然后，向上清液中添加20％(w/v)(0.2g/ml裂解液)硫酸铵。在冰上孵育30分钟后，在4℃下以20000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀重悬浮于2-3ml PBS中。20ml PBS溶液上样到Sephacryl S-400凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotechnology AG)上，将级分加样到SDS-PAGE凝胶上，合并含有纯化的p33-HBcAg VLP衣壳的级分。将合并的级分上样到羟基磷灰石柱上。收集流出液(含有纯化的p33-HBcAg VLP衣壳)。按照标准程序进行电子显微镜检查。Storni T.等人，(2002)J Immunol.；168(6)：2880-6的图1显示一个代表性实例。
应当指出，只是为了方便才使用含有肽p33的VLP，本发明同样能够使用野生型VLP。在整个说明书中，术语p33-HBcAg VLP、HBcAg-p33 VLP、p33-VLP和HBc33可以互换使用。具体而言，实施例1-4、9和10、18使用的VLP是p33-HBcAg VLP。
实施例2
含CpG的寡核苷酸可以被包装于HBcAg VLP内
对如实施例1所述制备的重组VLP进行非变性琼脂糖(1％)凝胶电泳，并用溴化乙锭或考马斯蓝染色，以检测RNA/DNA或蛋白质(图1)。细菌产生的VLP含有高水平的单链RNA，X-射线结晶学显示，该单链RNA可能与靠近HBcAg蛋白C端的精氨酸重复片段结合，在结构上位于VLP内部。通过VLP与RNase A孵育，污染的RNA能够被容易地消化去除。高活性RNase A的分子量约为14kDa，可以小到足以进入VLP，从而去除不希望的核糖核酸。
重组VLP在用RNase A消化之前添加富含CpG的寡核苷酸(见SEQ ID NO：69)。如图2所示，CpG-寡核苷酸的存在保持了衣壳结构，与未处理的p33-VLP类似的迁移证明了这一点。通过透析(PBS中稀释4500倍，24小时，使用300kDa MWCO透析膜)从未结合的寡核苷酸中纯化含CpG-寡核苷酸的VLP(见图3)。
实施例3
通过用RNase除去RNA随后将寡核苷酸包装于VLP内，含CpG的寡核苷酸可以被包装于VLP内
VLP(含有细菌单链RNA，如实施例1所述制备)首先与RNase A孵育，以除去RNA，第二步，向样品中添加免疫刺激性CpG-寡核苷酸(具有正常的磷酸二酯结构，并且具有磷酸酯骨架的硫代磷酸酯修饰)(图4)。该实验清楚地表明，在RNA降解反应过程中不是绝对地同时需要CpG-寡核苷酸，而是可以在稍后添加。
实施例4
含有CpG-寡核苷酸的VLP诱导针对共施用之蜂毒的强IgG应答
该实验使用如实施例1所述制备的VLP。小鼠皮下初次接触单独的或与下列成分之一混合的5μg蜂毒(ALK Abello)：单独的50μgVLP，分别负载和包装CpG-寡核苷酸的50μg VLP，或与20nmol CpG-寡核苷酸混合的50μg VLP。或者，小鼠初次接触使用与下列成分混合的5μg蜂毒：单独的VLP或分别负载和包装CpG-寡核苷酸的VLP连同氢氧化铝。14天后，小鼠用相同的疫苗制剂加强，并于第21天采血。通过ELISA测定第21天血清中的蜂毒特异性IgG应答。来源于HBcAg、其内携带CpG-寡核苷酸(含有正常的磷酸二酯部分)的VLP(经RNase A处理，透析除去未结合的CpG-寡核苷酸)可有效增强针对蜂毒变应原(BV)的IgG应答。如图5所示，游离CpG或分别负载和包装CpG的VLP的存在显著增强针对蜂毒的IgG应答。不含CpG的VLP不增强免疫应答。存在明矾作为佐剂可进一步增强IgG应答。如果测定IgG亚类(图6)，显然包装CpG的VLP使应答由IgG1占优势转变为IgG2a占优势，表明启动了Th1应答。令人感兴趣的是，明矾的存在增强了Th2相关的IgG1同种型。因此，向明矾中的蜂毒添加包装CpG的VLP导致高IgG滴度，但是这种应答仍然以IgG1为主。重要的是，尽管在存在或不存在明矾的情况下，包装到VLP内的CpG在增强针对蜂毒的IgG应答方面与游离CpG的有效性相似，但是它们不显示全身免疫激活的体征(图7)。具体而言，游离CpG的存在诱发接种小鼠脾大，脾脏的总淋巴细胞数可提高4倍，包装到VLP内的CpG不会导致总淋巴细胞数增加。
实施例5
用于抗花生变态反应的VLP
在以下的实施例5-8中，使用的VLP是包装有G10-PO(SEQ IDNO：122)的Qb核心颗粒(SEQ ID NO：1)。在第0天通过胃内管饲5mg新鲜研磨、烘烤的整个花生以及10μg霍乱毒素，使5周龄雌性C3H/HeJ小鼠对花生致敏。小鼠在1周和3周后加强。最后一次致敏剂量一周后，小鼠接受与10mg花生粗提取物混合的VLP、与5μg Arah1混合的VLP、与5μg Arah2混合的VLP、与5μg Arah3混合的VLP或与各5μg Arah1、Arah2和Arah3混合的VLP。未免疫的小鼠、只接受VLP的小鼠、只接受10mg花生粗提取物的小鼠或接受与5μg无关抗原混合的VLP的小鼠作为对照。
利用ELISA测定花生特异性IgE的水平。监测花生致敏小鼠的合并血清中Arah1、Arah2和Arah3的特异性IgE抗体。平板用Arah1、Arah2和Arah3(2μg/ml)包被。也用ELISA测定IgG亚类，具体是IgG1和IgG2a的水平，以确定是否启动TH1或TH2应答。
在第二次攻击30-40分钟后，利用下列评分系统评估过敏症状30-40分钟：0，无症状；1，鼻与头周围抓破及擦破；2，眼及口周围浮肿、腹泻、毛发直立(pilar erecti)、活动减少，和/或活动减少伴呼吸频率增加；3，哮鸣、呼吸吃力、口及尾部发绀；4，针刺后无反应或者震颤及抽搐；5，死亡。
第二次胃内管饲攻击30分钟后采血。使用酶免疫测定试剂盒(ImmunoTECH Inc，Marseille，法国)如厂商所述测定血浆组胺水平。
在第5周再次攻击之后，从花生致敏且未免疫的小鼠中取出脾脏。在体外用花生抗原刺激后测定脾细胞增殖的能力，作为其激活状态的量度。具体而言，分离脾细胞，将其悬浮于完全培养基(RPMI-1640+10％FBS、1％青霉素-链霉素和1％谷氨酰胺)中。在存在或不存在粗花生提取物、Arah1、Arah2或Arah3(10或50μg/ml)的情况下，脾细胞(1×106/孔，0.2mL)在微孔板中一式三份地孵育。用ConA(2μg/ml)刺激的细胞作为阳性对照。6天后，培养物用每孔1μCi的3H-胸苷标记18小时。收集细胞，用β-闪烁计数器计数掺入的放射性。
脾细胞也在存在或不存在粗花生提取物(50μg/ml)或ConA(2μg/ml)的情况下，在24孔板中培养(4×106/孔/ml)。72小时后收集上清液。按照厂商说明书，通过ELISA测定IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ，以确定是否启动TH1或TH2应答。
实施例6
用于抗豚草变态反应的VLP
在第0天和第4天通过腹膜内注射80μg豚草(RW)(内毒素含量＞2.3ng/mg RW；Greer Laboratories，Lenoir，NC)，使6-10周龄的雄性C3H/HeJ小鼠对RW致敏。致敏溶液由在1ml 0.9％NaCl中的1mgRW(Baxter，Deerfield，IL)加333ml Imject明矾(Pierce，Rockford，IL)组成。最后一次致敏剂量一周后，小鼠接受与160μg RW混合的VLP或与80μg Amba1混合的VLP。未免疫的小鼠、只接受VLP的小鼠、只接受160mg RW的小鼠或接受与80μg无关抗原混合的VLP的小鼠作为对照。
在第25天，自尾静脉采集0.5ml外周血，小鼠用氯胺酮(90μg/kg体重)和赛拉嗪(10mg/kg体重)麻醉，然后通过气管内施用RW攻击(10μg RW，在0.1ml 0.9％NaCl中)。RW攻击12小时后，自尾静脉采集0.5ml外周血，肺用1ml PBS一次性灌洗。样品以2,000rpm离心5分钟，收集支气管肺泡灌洗液。
用双位点免疫酶测定试剂盒(Endogen，Cambridge，MA)，按照厂商说明书测定白介素IL-4和IL-5的水平。IL-4和IL-5的检测下限均为1pg/ml。灌洗后，取出肺。对肺灌注4％低聚甲醛(在PBS中)30分钟，用PBS漂洗，浸于0.5M蔗糖(在PBS中)中4℃过夜。肺膨胀并包埋于石蜡中。组织切片用苏木精和伊红染色，炎症嗜酸性粒细胞浸润的程度通过图像分析定量。
通过在不连续Percoll梯度上离心，随后低渗裂解剩余的红细胞，从外周血中分离白细胞。利用MACS磁珠分离法按照厂商推荐的方案(Miltenyi Bioteclmical，Auburn，CA)，使用抗CD90和抗CD45R抗体去除B细胞和T细胞，通过负选择法从白细胞中富集嗜酸性粒细胞。嗜酸性粒细胞级分通常富集至＜98％。
纯化的外周血嗜酸性粒细胞以1×106细胞/ml的细胞密度重悬浮于RPMI-1640(GIBCO-BRL)和5％胎牛血清(GIBCO-BRL)中。细胞在96孔板中37℃下用10-7M佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol12-myristate 13-acetate，PMA)和10-7MA-23187(Sigma)刺激30分钟、1小时和16小时，或者用Amba1(20μg/ml)刺激6天。刺激后，分析VLP逆转Amba1诱导的TH2占优势的细胞因子分泌谱的能力。具体而言，通过夹心ELISA分析嗜酸性粒细胞产生IFN-γ、IL-4和IL-5的能力。
豚草特异的IgE的水平利用ELISA测定。测定豚草致敏小鼠的合并血清中Amba1特异性IgE抗体。平板用Amba1(2μg/ml)包被。也通过ELISA测定IgG亚类，特别是IgG1和IgG2a的水平，以确定是否启动TH1或TH2应答。
实施例7
用于抗真菌变态反应的VLP
7天大的未免疫的新西兰白兔用下列制品免疫：与10μg Alta1(从链格孢提取物中提取并纯化的一种28kd的热稳定二聚体)混合的VLP，或与10μg Aspf1和/或10μg Aspf16(从烟曲霉中提取并纯化的蛋白质)混合的VLP。未免疫的兔、只接受VLP的兔和接受210ng蛋白质/ml在生理盐水中重建的冻干链格孢或烟曲霉提取物的兔作为对照。兔抗链格孢和抗曲霉的IgE通过同源被动皮肤过敏反应(PCA)测定。对3个月大的未免疫新西兰白兔沿背部皮内注射来自3个月大的免疫白兔的0.2ml血清稀释液。检测来自未免疫兔和牛血清白蛋白免疫兔的血清作为对照。
在3天的潜伏期之后，对受体兔静脉内注射在5ml 2.5％伊文思蓝染料(Fisher Scientific Company，Fair Lawn，NJ)中稀释的2.1ng链格孢或曲霉提取物蛋白质。为了计量皮肤试验反应性，在给予提取物-染料混合物10分钟前皮内注射磷酸组胺(0.275mg/ml，0.2ml)和生理盐水。给予染料1小时后测量各注射部位的变蓝情况。任何稀释度的阳性反应都是蓝斑直径为5mm或更大。
三个月大的免疫兔以及未免疫的对照兔通过静脉内给予1-3ml溶于生理盐水的10mg/ml关索比妥钠(Brevitol，Eli Lilly Co.，Indianapolis，IN)麻醉。给这些兔子插入一个3.5mm的气管导管(PortexInc.，Woburn MA)。将一个与P-240导管(Clay Adams，Parsippany，NJ)连接的3cm长的乳胶气球(Young Rubber Co.，Trenton，NJ)置于食道中。将一段4cm的9mm直径气管导管置于口咽背部，覆盖食管导管和小气管导管，以防止它们被兔子的后牙伤害。口用胶带封住，使动物在2小时后苏醒。向气球内通入少量空气后，将气球的位置调节到终未呼吸压最大负值并且心脏假像最小的位置。食道气囊导管与Hewlett-Packard 270型压差传感器(Minneapolis，MN)相连，记录气球与气管导管间的压力差作为跨肺压。在动物完全苏醒后进行基线测量。测量包括呼吸频率、吸气和呼气流速、潮气量和跨肺压。
在进行基线测量后，动物用生理盐水、在生理盐水中以1∶20重量/体积稀释的链格孢提取物或烟曲霉提取物的气雾剂攻击。1ml生理盐水、链格孢提取物或曲霉提取物在5分钟内直接喷雾到气管导管内，通气量为4L/min(使用压缩空气)。5分钟的攻击结束时，在6小时内每30分钟测量一次肺功能。
Alta1、Aspf1或Aspf16特异性IgE的水平通过ELISA测定。测定链格孢或曲霉致敏小鼠的合并血清中Alta1、Aspf1或Aspf16特异性IgE抗体。平板用Alta1、Aspf1或Aspf16(2μg/ml)包被。也通过ELISA测定IgG亚类，特别是IgG1和IgG2a的水平，以确定是否启动TH1或TH2应答。
实施例8
用于抗屋尘螨变态反应的VLP
在第0天通过皮下注射10μg欧洲屋尘螨或害嗜鳞螨总提取物，使6周龄雄性C57BL/6小鼠对欧洲屋尘螨或害嗜鳞螨致敏。
第14天，对欧洲屋尘螨致敏的小鼠用下列制剂免疫：与10μg欧洲屋尘螨混合的VLP，与5μg从欧洲屋尘螨总提取物中提取并纯化的Derp1、Derf2和/或Der2混合的VLP。未免疫的小鼠、只接受VLP的小鼠、只接受10μg欧洲屋尘螨的小鼠或接受与5μg无关抗原混合的VLP的小鼠作为对照。
第14天，对害嗜鳞螨致敏的小鼠用下列制剂免疫：与10μg害嗜鳞螨混合的VLP，与5μg从害嗜鳞螨总提取物中提取并纯化的Lepd2混合的VLP。未免疫的小鼠、只接受VLP的小鼠、只接受10μg害嗜鳞螨的小鼠或接受与5μg无关抗原混合的VLP的小鼠作为对照。
在第28天，自尾静脉采集0.5ml外周血，小鼠用氯胺酮(90μg/kg体重)和赛拉嗪(10mg/kg体重)麻醉，然后用10μg欧洲屋尘螨或害嗜鳞螨鼻内攻击。欧洲屋尘螨或害嗜鳞螨攻击72小时后，自尾静脉采集0.5ml外周血，取出肺。对肺用4％低聚甲醛(在PBS中)灌注30分钟，用PBS漂洗，浸于0.5M蔗糖(在PBS中)中，4℃过夜。肺膨胀并包埋于石蜡中。组织切片用苏木精和伊红染色，炎症嗜酸性粒细胞浸润的程度通过图像分析定量。
通过在不连续Percoll梯度上离心，随后低渗裂解剩余的红细胞，从外周血中分离白细胞。在不连续的Percoll梯度上从外周血中分离白细胞。利用MACS磁珠分离法按照厂商推荐的方案(MiltenyiBioteclmical，Auburn，CA)，使用抗CD90和抗CD45R抗体去除B细胞和T细胞，通过负选择法从白细胞中富集嗜酸性粒细胞。嗜酸性粒细胞级分通常富集至＜98％。
纯化的外周血嗜酸性粒细胞以1×106细胞/ml的细胞密度重悬浮于RPMI-1640(GIBCO-BRL)和5％胎牛血清(GIBCO-BRL)中。细胞在96孔板中37℃下用10-7M佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和10-7M A-23187(Sigma)刺激30分钟、1小时和16小时，或者用5μgDerp1、Derf2、Der2或Lepd2(20μg/ml)刺激6天。刺激后，分析VLP逆转Derp1、Derf2、Der2或Lepd2诱导的TH2占优势的细胞因子分泌谱的能力。具体而言，通过夹心ELISA分析嗜酸性粒细胞产生IFN-γ、IL-4和IL-5的能力。
欧洲屋尘螨或害嗜鳞螨特异的IgE的水平利用ELISA测定。测定欧洲屋尘螨或害嗜鳞螨致敏小鼠的合并血清中诱导的Derp1、Derf2、Der2和Lepd2特异性IgE抗体。平板用Derp1、Derf2、Der2和Lepd2(2μg/ml)包被。也通过ELISA测定IgG亚类，特别是IgG1和IgG2a的水平，以确定是否启动了TH1或TH2应答。
实施例9
针对蜂毒攻击的小鼠脱敏
VLP包装CpG以及用与蜂毒混合的VLP(CpG)免疫小鼠
具有SEQ ID NO：70所示序列的VLP在大肠杆菌中制备，其含有一定量的RNA，通过将VLP与RNase A一起孵育可以消化从而除去RNA。所用高活性RNase A酶的分子量约为14kDa。重组产生的HBcVLP在pH7.2的PBS缓冲液中浓缩为0.8mg/ml，在不存在或存在RNase A(300μg/ml，Qiagen AG，瑞士)的情况下在37℃孵育3小时。RNase A消化后，向VLP中加入130nmol/ml具有硫代磷酸酯骨架的CpG寡核苷酸(其序列如SEQ ID NO：69所示)，在37℃下孵育3小时。使用300kDa MWCO透析膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，TX，USA)，用PBS pH7.2对用于小鼠免疫的VLP制品充分透析(10,000倍稀释)24小时，除去RNase A和过量的CpG-寡核苷酸。
一组13只CBA/J小鼠在第0、9、23、38天重复注射与PBS混合的0.2μg蜂毒(Phannalgen)和1mg明矾(Pierce)致敏。每天注射，小鼠皮下接受总体积66μl(每侧33μl)。4次致敏后，小鼠在第65、73、80天用VLP(CpG)+蜂毒或单独的VLP(CpG)脱敏。第一组7只小鼠接受3次注射，每次注射溶于PBS的50μg VLP(CpG)+5μg蜂毒。分两次皮下给予总体积200μl，每侧100μl。第二组6只小鼠按照与第一组相同的免疫方案(第65、73和80天)接受等量不含蜂毒的VLP(CpG)。最后，在第87天，所有小鼠都用总体积300μl PBS中的30μg蜂毒皮下攻击。
在说明书全文和附图中，术语VLP(CpG)和VLP-CpG可以互换使用，指包装了CpG的VLP。
实施例10
用蜂毒攻击的接种小鼠的温度变化评价和血清分析
为了评价用VLP(CpG)偶联物脱敏的保护效果，在蜂毒攻击后以10分钟间隔测量小鼠的体温，共1小时(图8)。图8显示接种VLP(CpG)+蜂毒的小鼠变应性体温降低。检测了两组小鼠。第1组(n＝7)接受与蜂毒混合的VLP(CpG)作为疫苗。第2组(n＝6)只接受VLP(CpG)。在用高剂量蜂毒(30μg)攻击后，根据小鼠的体温变化评价变态反应。在接受蜂毒与VLP(CpG)的第1组中，检测的所有小鼠均未见显著体温变化。相反，对于只接受VLP(CpG)作为脱敏疫苗的第2组，6只动物中有4只显示体温明显降低。因此，这些小鼠未受到针对变态反应的保护。注意：图中的符号代表6只(VLP(CpG))或7只(VLP(CpG)+蜂毒)小鼠的平均值，包括标准差(SD)。
对于血清学分析，小鼠在第0天(免疫前)、第58天(致敏后)和第86天(脱敏后)眼眶后采血。ELISA试验如下进行。ELISA板在4℃下用每1ml包被缓冲液(0.1M NaHCO，pH9.6)5μg蜂毒包被过夜。平板用封闭缓冲液(2％牛血清白蛋白(BSA)，溶于PBS(pH7.4)/0.05％Tween20)37℃下封闭2小时，用PBS(pH7.4)/0.05％Tween20洗涤，然后在室温下与封闭缓冲液连续稀释的小鼠血清孵育2小时。为了检测IgE，免疫血清被预吸附于蛋白G柱上。平板用PBS(pH7.4)/0.05％Tween20洗涤，然后在室温下与1μg/ml辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgE、IgG1或IgG2a抗体(JacksonImmunoResearach)孵育1小时。平板用PBS(pH7.4)/0.05％Tween20洗涤，加入底物溶液(0.066M Na2HPO4，0.035M柠檬酸(pH5.0)+0.4mgOPD(1，2-二盐酸苯二胺)+0.01％H2O2)。10分钟后，用5％H2SO4终止显色反应，在450nm下读取吸光度。也检测同一小鼠的免疫前血清作为对照。ELISA滴度表示为1∶250(IgE)、1∶12500(IgG1)或1∶500(IgG2a)稀释血清的光密度(OD450nm)(图9)。图9显示脱敏之前和之后小鼠体内特异性IgE和IgG血清抗体的检测。在脱敏之前和之后采集所有小鼠的血样，用ELISA分别检测蜂毒特异性IgE抗体(图A)、IgG1抗体(图B)和IgG2a抗体(图C)。如图9A所示，脱敏后接种VLP(CpG)+蜂毒的小鼠可见IgE滴度升高。结果表示为1∶250血清稀释度的光密度(OD450nm)。图中显示6只(VLP(CpG))或7只(VLP(CpG)+蜂毒)小鼠的平均值，包括标准差(SD)。图9B显示只有接种VLP(CpG)+蜂毒的小鼠在脱敏后抗蜂毒IgG1血清滴度升高。图9C测定IgG2a血清滴度同样如此。如成功脱敏所预期的，IgG2a抗体滴度的升高最显著。结果分别表示为1∶12500(IgG1)或1∶500(IgG2a)血清稀释度时2只(VLP(CpG))或3只(VLP(CpG)+蜂毒)小鼠的平均值，包括SD。
实施例11
含CpG-寡核苷酸的VLP诱导针对共施用的青草花粉提取物的IgG应答
该实验使用RNA噬菌体Qb的外壳蛋白形成的VLP。它们或者不经处理即使用，或者在包装具有硫代磷酸修饰的磷酯骨架的CpG-2006寡核苷酸(SEQ-ID NO：114)后使用。CpG-2006的包装如下实现：在0.2ml 100mM ZnSO4溶液存在下，8ml Qb VLP溶液(2.2mg/ml)在60℃下孵育过夜。这种处理导致Qb VLP中所含的RNA水解。使用透析管(截止值MWCO 300000)用20mM Hepes，pH7.5透析后，以130nmol/1ml VLP溶液的浓度加入CpG-2006，在650rpm振摇下37℃孵育3小时。在1mM MgCl2存在下，在37℃下用50U/mlBenzonase(Merck)处理3小时，随后如上所述用20mM Hepes，pH7.5透析，除去未包装的CpG-2006。CpG-2006的包装通过琼脂糖凝胶电泳证实，用溴化乙锭染色显示核酸，随后用考马斯蓝染色显示蛋白质。另外，也用TBE-尿素凝胶分析包装的VLP，估计包装的CpG-寡核苷酸的含量。约6.7nmol CpG-2006被包装于100ug Qb VLP中。
雌性Balb/c小鼠用与下列成分之一混合的1.9B.U.青草花粉提取物(5-gras-mix Pangramin，Abello，由多年生黑麦、果树、梯牧草、草地早熟禾和草原羊茅花粉制成)皮下免疫：单独的50μg Qb VLP，分别负载和包装CpG-2006的50μg Qb VLP，或3mg氢氧化铝(Imject，Pierce)。14天后，小鼠用相同的疫苗制剂加强，在第21天采血。通过ELISA测定第21天血清的IgG应答。如图10所示，存在分别负载和包装CpG-2006的VLP可增强对花粉提取物的IgG2b应答。在分别负载和包装CpG-2006的Qb VLP的存在下，不诱导针对花粉提取物的IgE，而在明矾存在下，可观察到强IgE应答。与明矾不同，分别负载和包装CpG-2006的Qb-VLP不诱导IgG1抗体。这表明不存在偏向Th2的应答。
实施例12
含CpG-寡核苷酸的VLP在过敏小鼠中诱导针对共施用的青草花粉提取物的IgG应答
该实验使用RNA噬菌体Qb的外壳蛋白形成的VLP。如实施例11所述，它们在包装CpG-2006寡核苷酸(SEQ-ID NO：114)后使用。
雌性Balb/c小鼠用与3mg氢氧化铝(Imject，Pierce)混合的1.9B.U.青草花粉提取物(参见实施例11)皮下免疫。14天后，小鼠用相同的疫苗制剂加强。一组小鼠不予处理。其它组在第21、28、35天进行脱敏处理，方法是注射单独的或与下列成分之一混合的1.9B.U.青草花粉提取物：单独的50μg Qb VLP，分别负载和包装CpG-2006的50μgQb VLP，或3mg氢氧化铝(Imject，Pierce)。另一组小鼠用分别负载和包装CpG-2006的50μg Qb VLP脱敏。通过ELISA测定第14、21、28、35、42天血清的IgG应答。如图11所示，在花粉和分别负载和包装CpG-2006的VLP的存在下，诱导针对花粉提取物的强IgG2b应答，这在未处理的小鼠或花粉提取物处理的小鼠中不存在。对于用分别负载和包装CpG-2006的Qb VLP脱敏的小鼠，其IgG1应答高于只用花粉提取物处理的小鼠。未处理的小鼠和用分别负载和包装CpG-2006的Qb VLP处理的小鼠，在没有花粉的情况下不诱导IgG1抗体。
实施例13
含CpG-寡核苷酸的VLP在过敏小鼠中诱导针对共施用的树木花粉提取物的IgG应答
该实验使用RNA噬菌体Qb的外壳蛋白形成的VLP。如实施例11所述，它们在包装CpG-2006寡核苷酸(SEQ-ID NO：114)后使用。
雌性Balb/c小鼠用树木花粉提取物皮下致敏。一组小鼠接受2B.U.树木花粉提取物混合物(3棵树的混合物，Abello)，其中含有赤杨属(Alnus glutinosa)、白桦(Betula verrucosa)和欧洲榛(Corylusavellana)的花粉提取物。第二组只接受赤杨花粉提取物，第三组只接受白桦花粉提取物，第四组只接受欧洲榛花粉提取物，第五组只接受日本柳杉(Cryptomeria japonica)花粉提取物。14天后，小鼠用相同的疫苗制剂加强。一组小鼠不予处理。其它组在第21、28、35天通过注射2B.U.与用于致敏的相同树木花粉提取物进行脱敏处理。这种相应的提取物或者单独使用或者与下列成分之一混合使用：单独的50μg Qb VLP，分别负载和包装CpG-2006的50μg Qb VLP，或3mg氢氧化铝(Imject，Pierce)。第14、21、28、35、42天血清的IgG应答通过ELISA测定。
实施例14
含CpG-寡核苷酸的VLP在过敏小鼠中诱导针对共施用的猫变应原提取物的IgG应答
该实验使用RNA噬菌体Qb的外壳蛋白形成的VLP。如实施例11所述，它们在包装CpG-2006寡核苷酸(SEQ-ID NO：114)后使用。
两组雌性Balb/c小鼠用对应于0.5μg和5μg Feld1蛋白的猫变应原提取物皮下致敏。14天后，小鼠用相同的疫苗制剂加强。一组小鼠不予处理。其它组在第21、28、35天通过注射与用于致敏相同的猫变应原提取物进行脱敏处理。这种相应的提取物或者单独使用或者与下列成分之一混合使用：单独的50μg Qb VLP，分别负载和包装CpG-2006的50μg Qb VLP，或3mg氢氧化铝(Imject，Pierce)。第14、21、28、35、42天血清的IgG应答通过ELISA测定。
实施例15
含G10-PO的VLP诱导针对共施用的变应原提取物的IgG应答
该实验使用RNA噬菌体Qb的外壳蛋白形成的VLP。它们不经处理即使用，或者在包装G10-PO(SEQ-ID NO：122)后使用。G10的包装通过下列方法实现：
解装配：在搅拌条件和室温下，45mg QβVLP(通过Bradford分析测定)在PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH7.8)中用5mM DTT还原15分钟。加入氯化镁至终浓度为700mM后，在搅拌条件和室温下进行第二次30分钟的孵育，使RNA沉淀。溶液在4℃下以10000g离心10分钟，分离沉淀的RNA。上清液中解装配的Qβ外壳蛋白二聚体直接用于层析纯化步骤。
解装配的Qβ外壳蛋白通过阳离子交换层析的两步纯化法：解装配反应的上清液含有解装配的外壳蛋白和剩余的RNA，加至SP-Sepharose FF上。在室温以5ml/min的流速进行的层析过程中，监测260nm和280nm的吸光度。层析柱用20mM磷酸钠缓冲液pH7,150mM NaCl平衡；1∶10稀释样品，使电导率低于10mS/cm。用至20mM磷酸钠和500mM氯化钠的梯度进行洗脱步骤(5ml级分)，将纯Qβ外壳蛋白二聚体与污染物分离。
任选地，在随后的一个步骤中，将分离的Qβ外壳蛋白二聚体(从阳离子交换柱上洗脱下来的级分)加到用缓冲液(20mM磷酸钠250mM氯化钠；pH7.2)平衡的Sepharose CL4B(Amersham pharmaciabiotech)上。监测260nm和280nm的吸光度，合并对应于Qβ二聚体的级分。
重装配：在寡脱氧核苷酸G10-PO的存在下，用浓度为1mg/ml的纯化的Qβ外壳蛋白二聚体重装配QβVLP。重装配反应中寡脱氧核苷酸的浓度为35μM。重装配溶液中外壳蛋白二聚体的浓度为70μM。向溶液中加入尿素至终浓度1M。除了尿素之外还可以加入2.5mMDTT。加入氯化钠至总浓度250mM。最后加入在重装配反应中将要包装的寡脱氧核苷酸，使重装配反应的终体积为25ml。首先该溶液在室温下用含有20mM磷酸钠、250mM NaCl的pH7.2缓冲液，MWCO为5kDa的Pellikon XL Biomax 5膜渗滤100分钟。随后在不孵育或与7mM过氧化氢孵育1小时后进行第二次渗滤。第二次渗滤使用20mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.2，MWCO为100kDa或MWCO为300kDa的Pellikon XL Biomax 100膜。
在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的分析：
A)重装配的衣壳的流体动力学大小：通过动态光散射(DLS)对在寡脱氧核苷酸G10-PO存在下重装配的Qβ衣壳进行分析，并与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP进行比较。重装配的衣壳显示与完整QβVLP类似的流体动力学大小(取决于质量和构象)。
B)重装配衣壳中二硫键的形成：重装配的QβVLP通过非变性SDS-PAGE分析，并与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP进行比较。重装配的衣壳显示与完整QβVLP类似的二硫键模式，存在五聚体和六聚体。
C)通过琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶电泳分析在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的核酸内容物：将重装配的QβVLP加样到1％琼脂糖凝胶上，用溴化乙锭和考马斯亮蓝染色。重装配的QβVLP如实施例18所述用蛋白酶K处理。反应体系然后与TBE-尿素样品缓冲液混合，加样到15％聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶上。在同一块凝胶上加样10pmol、20pmol和40pmol用于重装配反应的寡脱氧核苷酸作为定性及定量标准。该凝胶用SYBR_-Gold(Molecular Probes，货号S-11494)染色。SYBR_-Gold染色显示，重装配的Qβ衣壳含有与重装配反应中使用的寡脱氧核苷酸共迁移的核酸。琼脂糖凝胶显示寡核苷酸染色和蛋白质染色同样迁移。总之，QβVLP的核酸内容物与蛋白质的共迁移，以及通过蛋白酶K消化从纯化颗粒中分离寡脱氧核苷酸，证明了寡脱氧核苷酸的包装。
雌性Balb/c小鼠如实施例11和14所述用青草花粉提取物或猫毛提取物皮下致敏。
致敏的小鼠组中有一组不予处理。其它组在第21、28、35天通过注射与用于致敏的变应原相同的提取物进行脱敏处理。相应的提取物或单独使用或与下列成分之一混合使用：单独的50μg QbVLP，分别负载和包装G10-PO的50μg QbVLP，或3mg氢氧化铝(Imject，Pierce)。第14、21、28、35、42天血清的IgG应答通过ELISA测定。
实施例16
AP205外壳蛋白基因的克隆
AP205外壳蛋白(CP)的cDNA(SEQ ID NO：90)由两条cDNA片段装配而成，这两条片段利用反转录PCR技术由噬菌体AP205 RNA产生，并且被克隆到商品化质粒pCR4-TOPO内进行测序。反转录技术为相关领域技术人员周知。质粒p205-246中所含的第一条片段含有位于CP序列上游的269个核苷酸和编码CP前24个N端氨基酸的74个核苷酸。质粒p205-262中所含的第二条片段含有编码CP的氨基酸12-131的364个核苷酸和位于CP序列下游的另外162个核苷酸。p205-246和p205-262均由J.Klovins惠赠。
质粒283-58由两步PCR设计，是为了将来自质粒p205-246和p205-262的两条CP片段融合于一个全长CP序列内。
使用上游引物p1.44(含有NcoI位点，向质粒pQb185内克隆)，或者p1.45(含有XbaI位点，向质粒pQb10内克隆)，和含有HindIII限制位点的下游引物p1.46(限制性内切酶识别序列用下划线标出)：
p1.44 5′-NN CC ATG GCA AAT AAG CCA ATG CAA CCG-3′(SEQ ID NO：100)
p1.45 5′-NN TCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3′(SEQID NO：101)
p1.46 5′-NN AAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TACG-3′(SEQ ID NO：102)
在第一步PCR中用另外两条引物p1.47(在p205-262所含片段的5′端退火)和p1.48(在质粒p205-246所含片段的3′端退火)扩增这些片段。引物p1.47和p1.48彼此互补。
p1.47：
5′-GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTT-TCAGC
AAGTCTG-3′(SEQ ID NO：103)
p1.48：
5′-CAGACTTGCTGAAAATGTAGTTGATAAACGA-GTTGG
ATCACTC-3′(SEQ ID NO：104)
前两个PCR反应产生两条片段。第一条片段由引物p1.45、p1.48和模板p205-246产生。第二条片段由引物p1.47、p1.46和模板p205-262产生。这两条片段都作为第二步PCR反应的模板，使用引物组合p1.45和p1.46或p1.44和p1.46进行剪接重叠延伸(spliceoverlap extension)。两个第二步PCR反应的产物分别用XbaI或NcoI和HindIII消化，利用相同的限制酶切位点分别克隆到pQb10或pQb185内，这是在大肠杆菌色氨酸操纵子启动子控制下的两种pGEM衍生的表达载体。
获得两种质粒，pAP283-58(SEQ ID NO：91)，其在pQb10中含有编码野生型AP205CP的基因(SEQ ID NO：90)，和pAP281-32(SEQ IDNO：94)，其在pQb185中含有Pro5→Thr突变(SEQ ID NO：93)。外壳蛋白序列通过DNA测序证实。pAP283-58含有位于CP的ATG起始密码子上游和XbaI位点下游的49个核苷酸，并且含有推断的外壳蛋白mRNA的原始核糖体结合位点。
实施例17
重组AP205VLP的表达与纯化
A.重组AP205VLP的表达
大肠杆菌JM109用质粒pAP283-58转化。在5ml含有20μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中接种单菌落，在37℃下不加振摇孵育16-24小时。
制备的接种物用100-300ml含有20μg/ml氨苄青霉素的LB培养基1∶100稀释，在37℃下不加振摇孵育过夜。获得的第二种接种物用含有0.2％葡萄糖和磷酸盐进行缓冲的2TY培养基1∶50稀释，并且在摇床上37℃孵育过夜。离心收集细胞，冻存于-80℃。
B.重组AP205VLP的纯化
溶液与缓冲液：
裂解缓冲液
50mM Tris-HCl pH8.0，含5mM EDTA，0.1％triton100和5mg/mlPMSF。
S AS
饱和硫酸铵水溶液。
缓冲液 NET
20mM Tris-HCl，pH7.8，含5mM EDTA和150mM NaCl。
PEG
40％(w/v)聚乙二醇6000，溶于NET
裂解：
冷冻细胞以2ml/g重悬浮于裂解缓冲液中。混合物以22KH超声处理5次各15秒，间隔1分钟，在冰上冷却该溶液。然后用F34-6-38转子(Ependorf)以12000rpm离心裂解液20分钟。除非另外说明，以下所述的离心步骤全都用同一转子进行。上清液贮存于4℃，而细胞碎片用裂解缓冲液洗涤2次。离心后合并裂解液和洗涤级分的上清液。
可以进一步用硫酸铵沉淀来纯化AP205VLP。第一步，选择AP205VLP不会沉淀的硫酸铵浓度。弃去获得的沉淀。第二步，选择AP205VLP定量沉淀的硫酸铵浓度，通过离心(14000rpm，20分钟)从该沉淀步骤获得的沉淀中分离AP205VLP。将获得的沉淀溶解于NET缓冲液中。
层析：
将来自合并上清液的衣壳蛋白上样到Sepharose CL-4B柱(2.8×70cm)上，用NET缓冲液以4ml/小时/级分的速度洗脱。合并级分28-40，用60％饱和的硫酸铵沉淀。这些级分在沉淀之前用AP205特异性抗血清通过SDS-PAGE和Western Blot分析。将离心分离的沉淀重新溶解于NET缓冲液中，上样到Sepharose 2B柱(2.3×65cm)，以3ml/小时/级分的流速洗脱。这些级分通过SDS-PAGE分析，收集合并级分44-50，用60％饱和的硫酸铵沉淀。将离心分离的沉淀重新溶解于NET缓冲液中，用Sepharose 6B柱(2.5×47cm)纯化，以3ml/小时/级分的流速洗脱。这些级分通过SDS-PAGE分析。合并级分23-27，将盐浓度调节为0.5M，用PEG6000(加入40％贮存水溶液至终浓度为13.3％)沉淀。将离心分离的沉淀重新溶解于NET缓冲液中，上样到与上述相同的Sepharose 2B柱上，以相同的方式洗脱。合并级分43-53，用60％饱和的硫酸铵沉淀。将离心分离的沉淀重新溶解于水中，获得的蛋白质溶液用水充分透析。每克细胞能够分离出约10mg纯化的蛋白质。用电子显微镜检查病毒样颗粒，它们与噬菌体颗粒相同。
实施例18
免疫刺激性核酸可以被包装于HBcAg VLP内
在大肠杆菌中通过表达乙型肝炎核心抗原融合蛋白p33-HBcAg(HBc33)制备的HBcAg VLP(见实施例1)含有RNA，通过将VLP与RNase A一起孵育可以消化去除该RNA。应当指出，只是因为方便才使用含有肽p33的VLP，本发明同样可以使用野生型VLP。
酶促RNA水解：1×PBS缓冲液(KCl 0.2g/l，KH2PO4 0.2g/l，NaCl8g/l，Na2HPO4 1.15g/l)pH7.4中浓度为1.0mg/ml的重组制备的HBcAg-p33(HBc33)VLP，在300μg/ml RNase A(Qiagen AG，瑞士)存在下，在恒温混匀器中以650rpm 37℃孵育3小时。
免疫刺激性核酸的包装：用RNase A消化RNA后，向HBcAg-p33VLP中添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpG、NKCpG、G10-PO(表1)。类似地，分别以130nmol/ml或1.2nmol/ml的浓度添加150mer单链Cy150-1和253mer双链dsCyCpG-253，它们均含有多个拷贝的CpG基序，在恒温混匀器中37℃孵育3小时。通过将CyCpG的双链多聚体克隆到pBluescript KS-的EcoRV位点内制备双链CyCpG-253DNA。在大肠杆菌XL1-blue中制备并用Qiagen Endofree质粒Giga试剂盒分离获得的质粒，用限制性内切核酸酶XhoI和XbaI消化，产生的限制酶切产物通过琼脂糖电泳分离。253bp插入片段通过电洗脱和乙醇沉淀分离。通过测序证实两条链的序列。
表1：实施例中使用的免疫刺激性核酸的术语和序列
小写字母表示通过硫代磷酸酯键连接的脱氧核苷酸，而大写字母表示通过磷酸二酯键连接的脱氧核苷酸
 术语  序列  SEQ ID NO
 CyCpGpt  tccatgacgttcctgaataat  69
 CpG-2006  tcgtcgttttgtcgttttgtcgt  114
 CyCpG  TCCATGACGTTCCTGAATAAT  116
 B-CpGpt  tccatgacgttcctgacgtt  117
 B-CpG  TCCATGACGTTCCTGACGTT  118
 NKCpGpt  ggggtcaacgttgaggggg  119
 NKCpG  GGGGTCAACGTTGAGGGGG  120
 CyCpG-rev-pt  attattcaggaacgtcatgga  121
 g10gacga-PO(G10-PO)  GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG  122
 g10gacga-PS(G10-PS)  gggggggggggacgatcgtcgggggggggg  123
 (CpG)20OpA  CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAAATGCATGTCAAAGACAGCAT  124
 Cy(CpG)20  TCCATGACGTTCCTGAATAATCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCG  125
 Cy(CpG)20-OpA  TCCATGACGTTCCTGAATAATCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAAATGCATGTCAAAGACCAT  126
 CyOpA  TCCATGACGTTCCTGAATAATAAATGCATGTAAGACAGCAT  127
 CyCyCy  TCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAAT  128
 Cy150-1  TCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTGGATGACGTTGGTGTAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAACCATGACGTTCCTGAATAATTCC  129
 dsCyCpG-253(互补链未显示)  CTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGATCGATTCATGACTTCCTGAATAATTCCATGACGTTGGTGAATAATCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATCGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATTCCAATCAAGCTTATCGATACCGTCGACC  130
DNase I处理：包装的HBcAg-p33 VLP随后在37℃下用DNase I消化(5U/ml)3小时(DNase I，不含RNase，Fluka AG，瑞士)，用300kDaMWCO透析膜(Spectrum Medical industries Inc.，Houston，USA)用PBSpH7.4充分透析(2次，200倍体积)24小时，除去RNase A和过量的CpG-寡核苷酸。
Benzonase处理：由于某些单链寡脱氧核苷酸对DNase I处理有部分抗性，因此利用Benzonase处理从制品中除去游离的寡核苷酸。添加100-120U/ml Benzonase(Merck KGaA，Darmstadt，德国)和5mMMgCl2，37℃孵育3小时，然后透析。
透析：使用300kDa MWCO透析膜(Spectrum Medical industriesInc.，Houston，US)，用PBS pH7.4对小鼠免疫实验中使用的包装有免疫刺激性核酸的VLP制剂充分透析(2次，透析液为200倍体积)24小时，除去添加的酶和游离的核酸。
包装的分析：包装的免疫刺激性核酸的释放：向50μl衣壳溶液中添加1μl蛋白酶K(600U/ml，Roche，Mannheim，德国)、3μl 10％SDS溶液和6μl 10倍蛋白酶缓冲液(0.5M NaCl，50mM EDTA，0.1MTris pH7.4)，随后在37℃下孵育过夜。VLP在这些条件下完全水解。在65℃下加热20分钟灭活蛋白酶K。向25μl衣壳中添加1μl RNaseA(Qiagen，100μg/ml，稀释250倍)。2-30μg衣壳与1倍体积的2×加样缓冲液(1×TBE，42％w/v尿素，12％w/v Ficoll，0.01％溴酚蓝)混合，95℃加热3分钟，加样到10％(对于约20nt长的寡核苷酸)或15％(对于＞40mer的核酸)TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上。此外，样品也可以与6×加样染料(10mM Tris pH7.5，50mM EDTA，10％v/v甘油，0.4％橙黄G)一起加样到1％琼脂糖凝胶上。TBE/尿素凝胶用CYBRGold染色，琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色。
图12显示G10-PO寡核苷酸被包装于HBc33内。在RNase A处理后，VLP中的RNA内容物大大减少(图12A)，而大多数衣壳作为一条缓慢迁移的弥散条带迁移，这可能是由于除去了带负电荷的RNA(图12B)。与过量寡核苷酸孵育后的衣壳比RNase A处理的衣壳含有更高含量的核酸，因此以类似于未处理衣壳的速度迁移。另外用DNase I或Benzonase处理降解游离的寡核苷酸，而包装于衣壳内的寡核苷酸不被降解，这清楚地证实了寡核苷酸的包装。寡核苷酸恢复衣壳迁移的事实清楚地证实了寡核苷酸的包装。
对于该实施例中使用并描述的其它寡核苷酸，已经获得了类似的结果和图。
实施例19
Qβ的解装配、重装配与包装
QβVLP的解装配和重装配
解装配：在20mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl中的10mg QβVLP(也可以称为Qβ衣壳)(通过Bradford分析测定)用固体硫酸铵沉淀，至硫酸铵终饱和度为60％。在4℃下沉淀过夜，沉淀的VLP在4℃下离心60分钟(SS-34转子)沉淀。将沉淀物重悬浮于含100mMDTT(终浓度)的1ml 6M盐酸胍(GuHCl)中，4℃孵育8小时。
通过大小排阻层析纯化Qβ外壳蛋白：溶液通过14000rpm离心10分钟澄清(Eppendorf 5417R，固定角转子F45-30-11，在下列所有步骤中使用)，用含有7M尿素，100mM TrisHCl，pH8.0，10mM DTT的缓冲液(2000ml)透析过夜。更换一次透析缓冲液，继续透析2小时。获得的悬液在4℃下以14000rpm离心10分钟。弃去微量的沉淀，保留上清液作为“上样级分”，其中含有解装配的外壳蛋白和RNA。蛋白质浓度通过Bradford分析测定，5mg总蛋白上样到HiLoadTMSuperdexTM75制备级柱(26/60，Amersham Biosciences)上，该柱事先用7M尿素，100mM TrisHCl和10mM DTT平衡。在12℃下用平衡缓冲液(7M尿素，100mM TrisHCl pH8.0，10mM DTT)以0.5ml/min的流速进行大小排阻层析。在洗脱过程中监测254nm和280nm的吸光度。分离到两个峰。高分子量峰在较低表观分子量峰之前。以1.5ml级分收集该峰，通过SDS-PAGE、随后通过考马斯蓝染色以及SYBR_Gold染色分析这些等份。显示能够从第二峰洗脱的外壳蛋白中分离RNA。
通过离子交换层析纯化Qβ外壳蛋白：此外，澄清的上清液也可以用含有7M尿素，20mM MES，10mM DTT，pH6.0的缓冲液(2000ml)透析过夜。更换一次透析缓冲液，继续透析2小时。获得的悬液在4℃下以14000rpm离心10分钟。弃去微量的沉淀，保留上清液作为“上样级分”，其中含有解装配的外壳蛋白和RNA。蛋白质浓度通过Bradford分析测定，10mg总蛋白用缓冲液A(见下)稀释至终体积10ml，以1ml/min的流速上样到1ml HiTrapTM SP HP柱(AmershamBiosciences，货号17-1151-01)上，该柱事先用缓冲液A(7M尿素，20mM MES，10mM DTT，pH6.0)平衡。收集含有RNA的流出液作为一种级分。用缓冲液A(30CV)充分洗涤该柱后，以0％-100％线性梯度的缓冲液B洗脱结合的Qβ外壳蛋白(梯度长度为5CV；缓冲液A：见上，缓冲液B：7M尿素，20mM MES，，10mM DTT，2M NaCl，pH6.0)。在上样、洗涤和洗脱过程中监测254nm和280nm的吸光度。按每份1ml收集峰级分，通过SDS-PAGE、随后的考马斯蓝染色以及SYBR_Gold染色分析。鉴定含有Qβ外壳蛋白而不含RNA的级分，通过添加100μl 1M TrisHCl，pH8.0调节pH。
合并含有Qβ外壳蛋白但不含RNA的样品，用0.87M尿素，100mM TrisHCl，10mM DTT(2000ml)透析过夜，更换一次缓冲液，继续透析2小时。获得的悬液在4℃下以14000rpm离心10分钟。弃去微量的沉淀，保留上清液作为“解装配的外壳蛋白”。蛋白质浓度通过Bradford分析测定。
重装配：浓度为0.5mg/ml的纯化Qβ外壳蛋白用于在寡脱氧核苷酸的存在下VLP的重装配。对于重装配反应，使用的寡脱氧核苷酸比计算的Qβ-VLP衣壳的理论量过量10倍(单体浓度除以180)。在Qβ外壳蛋白与重装配反应过程中将要被包装的脱氧核苷酸混合后，该溶液(体积可达5ml)首先在4℃下用含有10％β-巯基乙醇的500mlNET缓冲液透析2小时，然后在4℃下以8ml NET缓冲液/小时的流速，以连续模式透析72小时，最后以相同的连续模式用含有20mMTrisHCl，pH8.0，150mM NaCl的缓冲液再透析72小时。获得的悬液在4℃下以14000rpm离心10分钟。弃去微量的沉淀，上清液含有重装配且包装的VLP。蛋白质浓度通过Bradford分析测定，必要时用离心过滤装置(Millipore，UFV4BCC25，5K NMWL)浓缩重装配且包装的VLP，至终蛋白质浓度为3mg/ml。
重装配且包装的VLP的纯化：将可达10mg总蛋白质上样到SepharoseTM CL-4B柱(16/70，Amersham Biosciences)上，该柱预先用20mM HEPES pH7.4，150mM NaCl平衡。在室温下用平衡缓冲液(20mM HEPES pH7.4，150mM NaCl)以0.4ml/min的流速进行大小排阻层析。在洗脱过程中监测254nm和280nm的吸光度。分离到两个峰。高分子量峰在较低表观分子量峰之前。以每份0.5ml收集级分，通过SDS-PAGE、随后的考马斯蓝染色分析。用高度纯化的来自大肠杆菌的完整Qβ衣壳校准该柱，显示主要第一峰的表观分子量与Qβ衣壳相符。
在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的分析：
A)衣壳的总体结构：在下列寡脱氧核苷酸之一(CyOpA(SEQ IDNO：127)、Cy(CpG)20OpA(SEQ ID NO：126)、Cy(CpG)20(SEQ IDNO：125)、CyCyCy(SEQ ID NO：128)、(CpG)20OpA(SEQ ID NO：124))存在下，或者在来自大肠杆菌的tRNA(Roche Molecular Biochemicals，货号109541)存在下重装配QβVLP，通过电子显微镜检查分析(用pH4.5的乙酸双氧铀负染)，并与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP进行比较。不含核酸的重装配反应作为阴性对照。重装配的衣壳显示与完整QβVLP相同的结构特征和特性(图13)。
B)重装配衣壳的流体动力学大小：通过动态光散射(DLS)对在寡脱氧核苷酸存在下重装配的Qβ衣壳进行分析，并与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP进行比较。重装配的衣壳显示与完整QβVLP相同的流体动力学大小(取决于质量和构象)。
C)重装配的衣壳中二硫键的形成：重装配的QβVLP通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，并与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP进行比较。重装配的衣壳显示与完整QβVLP相同的二硫键模式。
D)通过琼脂糖凝胶电泳分析在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的核酸内容物：5μg重装配的QβVLP在25μl总反应体积中与0.35单位RNase A(Qiagen，货号19101)、15单位DNAse I(Fluka，货号31136)或在不添加任何酶的情况下37℃孵育3小时。从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP作为对照，并且在与上述在寡脱氧核苷酸存在下重装配的衣壳相同的孵育条件下孵育。随后将反应液加样到0.8％琼脂糖凝胶上，首先用溴化乙锭染色(图14A)，随后用考马斯蓝染色(图14B)。溴化乙锭染色显示，添加的酶都不能消化重装配的Qβ衣壳中的核酸内容物，表明核酸内容物(即寡脱氧核苷酸)受到保护。该结果表明，添加的寡脱氧核苷酸在重装配反应过程中被包装到新形成的衣壳内。相反，从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP中的核酸内容物在加入RNase A后降解，表明该VLP中的核酸内容物由RNA组成。另外，琼脂糖凝胶的溴化乙锭染色和考马斯蓝染色都显示，含核酸的QβVLP(分别为重装配的以及从大肠杆菌中纯化的)以大约相同的大小迁移，这表明重装配反应产生的QβVLP与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP大小相当。
凝胶显示，重装配的QβVLP中存在不被DNAse I降解的寡脱氧核苷酸。而且，在用酚/氯仿抽提包装的寡脱氧核苷酸后，它们可被DNAse I消化，但不被RNase A消化。因此，在最初解装配VLP、从核酸中纯化解装配的外壳蛋白并随后在寡脱氧核苷酸存在下重装配VLP后，寡脱氧核苷酸能够被成功地包装于QβVLP内。
E)通过变性聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶电泳分析在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的核酸内容物：按照使用说明书，40μg重装配的QβVLP(0.8mg/ml)在60μl总反应体积中与0.5mg/ml蛋白酶K(PCR级，Roche Molecular Biochemicals，货号1964364)和反应缓冲液37℃孵育3小时。从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP作为对照，与蛋白酶K一起孵育，条件与上述在寡脱氧核苷酸存在下重装配衣壳的孵育条件相同。反应液然后与TBE-尿素样品缓冲液混合，加样到15％聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶(Novex_，Invitrogen，货号EC6885)上。1pmol、5pmol和10pmol用于重装配反应的寡脱氧核苷酸加样到同一凝胶上，作为定性及定量标准。该凝胶用10％乙酸、20％甲醇固定，平衡至中性pH，并用SYBR_-Gold(Molecular Probes货号S-11494)染色。SYBR_-Gold染色显示，重装配的Qβ衣壳含有与重装配反应中使用的寡脱氧核苷酸共迁移的核酸。注意完整QβVLP(从大肠杆菌中纯化的)不含类似大小的核酸。总之，对在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的核酸内容物分析显示，寡脱氧核苷酸受到保护，不被DNase I消化，意味着它们被包装，而且添加的寡脱氧核苷酸能够通过适当方法(例如蛋白酶K消化QβVLP)重新分离。
图13显示在不同寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的电子显微照片。VLP在指定寡脱氧核苷酸存在下或在tRNA存在下重装配，但是没有通过大小排阻层析纯化为均匀的悬液。从大肠杆菌中纯化的“完整”QβVLP制品作为阳性对照。重要的是，与“阳性”对照相比，在重装配反应中通过添加任何指定核酸，都能够形成正确大小和构象的VLP。这表明，重装配过程通常不依赖于核苷酸序列和所用寡脱氧核苷酸的长度。注意在重装配反应过程中添加核酸是形成QβVLP所必需的，因为如果重装配反应中不含核酸，则不形成颗粒。
图14显示通过核酸酶处理和琼脂糖凝胶电泳分析重装配的QβVLP的核酸内容物。5μg重装配并纯化的QβVLP和5μg从大肠杆菌中纯化的QβVLP分别如上所述处理。处理后，样品与加样染料混合，加样到0.8％琼脂糖凝胶上。电泳后，凝胶首先用溴化乙锭染色(A)，记录后该凝胶用考马斯蓝染色(B)。注意，重装配并纯化的QβVLP的核酸内容物对RNase A消化有抗性，而从大肠杆菌中纯化的QβVLP的核酸内容物在与RNase A孵育后被消化。这表明，重装配的Qβ衣壳的核酸内容物由寡脱氧核苷酸组成，它们当然受到保护，不会被RNase A消化。因此，寡脱氧核苷酸在重装配反应过程中被包装于QβVLP内。
实施例20
AP205的解装配-纯化-重装配和免疫刺激性核酸的包装
A.使用不添加寡核苷酸即能够重装配的材料，AP205VLP的解装配和重装配
解装配：将40mg冻干纯化的AP205VLP(SEQ ID NO：90或93)溶解于4ml 6M GuHCl中，在4℃下孵育过夜。解装配的混合物以8000rpm离心(Eppendorf 5810R，固定角转子F34-6-38，在下列所有步骤中使用)。将沉淀溶解于7M尿素中，上清液对NET缓冲液(20mMTris-HCl，pH7.8，5mM EDTA，150mM NaCl)透析3天，这期间更换3次缓冲液。另外，也可以连续方式透析4天。透析的溶液以8000rpm离心20分钟，将沉淀溶解于7M尿素中，上清液用硫酸铵(60％饱和)沉淀，溶解于含有10mM DTT的7M尿素缓冲液中。合并溶解于7M尿素中的上述所有沉淀，用硫酸铵(60％饱和)沉淀，溶解于含有10mMDTT的7M尿素缓冲液中。合并溶解于含有10mM DTT的7M尿素缓冲液中的材料，上样到Sephadex G75柱上，该柱用含有10mM DTT的7M尿素缓冲液平衡并以2ml/h洗脱。从柱上洗脱下一个峰。以每份3ml收集级分。合并含有AP205外壳蛋白的峰级分，用硫酸铵(60％饱和)沉淀。以8000rpm离心20分钟分离沉淀。将沉淀溶解于7M尿素、10mM DTT中，上样到短Sepharose 4B柱(1.5×27cm Sepharose4B，2ml/h，7M尿素、10mM DTT作为洗脱缓冲液)上。从该柱上主要洗脱下一个峰，其含有一个小肩。含有AP205外壳蛋白的级分通过SDS-PAGE鉴定，合并，除去肩部。获得10.3ml样品。用分光光度法测定稀释25倍的蛋白质等份，估计蛋白质浓度，使用下列公式：(1.55×OD280-0.76×OD260)×体积。平均浓度为1nmol/ml VLP(2.6mg/ml)。280nm与260nm的吸光度之比为0.12/0.105。
重装配：向样品中添加1.1ml β-巯基乙醇，配制下列重装配反应物：
1ml AP205外壳蛋白，不含核酸
1ml AP205外壳蛋白，rRNA(约200OD260单位，10nmol)
9ml AP205外壳蛋白，CyCpG(370μl 225pmol/μl溶液，即83nmol)。
这些混合物用30ml含10％β-巯基乙醇的NET缓冲液透析1小时。不含核酸的混合物分开透析。然后以连续方式继续透析3天，更换1升NET缓冲液。反应混合物随后用水充分透析(更换5次缓冲液)，冻干。将它们再溶解于水中，进行EM分析。所有混合物均含有衣壳，表明AP205VLP重装配不依赖于可检测核酸的存在，如同利用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳测定并通过EM分析证实的。EM程序如下：蛋白质悬液吸附到覆盖碳-聚醋酸甲基乙烯脂的网格上，用2％磷钨酸(pH6.8)染色。用JEM100C(JEOL，日本)电子显微镜以80kV的加速电压检查该网格。用Kodak电子成像胶片进行照相记录(负片)，在Kodak Polymax相纸上洗印负片获得电子显微照片。在CyCpG存在下重装配的VLP通过Sepharose 4B柱(1×50cm)纯化，用NET缓冲液洗脱(1ml/h)。这些级分通过Ouchterlony试验分析，合并含有VLP的级分。获得8ml样品，用水透析脱盐，干燥。衣壳产量为10mg。以溴化乙锭染色的0.6％琼脂糖凝胶分析溶解的物质，表明衣壳不含核酸。在重装配步骤之后和充分透析之前采集的含CyCpG的重装配反应样品用0.6％琼脂糖凝胶分析。能够获得与完整AP205VLP迁移高度相同并且能够用溴化乙锭和考马斯蓝染色的一条带，表明含有寡脱氧核苷酸的AP205VLP已经被重装配。重装配程序后的充分透析步骤可能导致寡脱氧核苷酸扩散到VLP之外。值得注意的是，如利用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳所测定的，在不含可检测的寡脱氧核苷酸的条件下，AP205VLP也能被重装配。由此，在最初解装配VLP、从核酸中纯化解装配的外壳蛋白并随后在寡脱氧核苷酸存在下重装配VLP后，寡脱氧核苷酸能够与AP205VLP成功结合。
B.使用在不添加寡核苷酸的条件下不能重装配的解装配材料，AP205VLP的重装配
解装配：将100mg纯化并干燥的重组AP205VLP进行如上所述的解装配。所有步骤都基本如部分A的解装配所述进行，只是使用8M尿素溶解硫酸铵沉淀步骤的沉淀物，并且省略了在重装配之前使用CL-4B柱的凝胶过滤步骤。通过光谱测定，使用A部分所述公式，合并的Sephadex G-75柱级分含有21mg蛋白质。样品的280nm吸光度与260nm吸光度之比为0.16∶0.125。样品稀释50倍进行测量。
重装配：Sephadex G-75凝胶过滤纯化步骤获得的蛋白质制品用60％饱和的硫酸铵沉淀，将获得的沉淀物溶解于2ml 7M尿素、10mMDTT中。样品用含10％β-巯基乙醇的8ml NET缓冲液稀释，用40ml含10％β-巯基乙醇的NET缓冲液透析1小时。通过向透析袋中的蛋白质样品添加0.4ml CyCpG溶液(109nmol/ml)启动重装配。建立连续模式的透析，用NET缓冲液作为洗脱缓冲液。继续透析2天，在完成该透析步骤后采样进行EM分析(图44B)。透析的重装配溶液随后用含50％v/v甘油的NET缓冲液透析，实现浓缩。透析一天后更换一次缓冲液。继续透析共3天。
在Sepharose 4-B柱(1×60cm)上，用NET缓冲液以1ml/h的流速进行凝胶过滤，纯化透析并浓缩的重装配溶液。这些级分用Ouchterlony试验检测，干燥含衣壳的级分，重悬浮于水中，并在用20mM Hepes pH7.6平衡的4-B柱上重新层析。使用下列三个公式：
1.(183×OD230nm-75.8×OD260nm)×体积(ml)-2.((OD235nm-OD280 nm)/2.51)×体积-3.((OD228.5nm-OD234.5nm)×0.37)×体积
检测到6-26mg重装配VLP的蛋白质含量。
0重装配的AP205VLP通过如上所述的EM、琼脂糖凝胶电泳和非还原性条件下的SDS-PAGE进行分析。
解装配材料的EM分析显示，用盐酸胍处理AP205VLP基本上破坏了VLP的衣壳装配。解装配的材料与寡核苷酸的重装配产生衣壳(图15B)，通过凝胶过滤纯化并进一步富集衣壳(图15C)。获得两种大小的颗粒；在图44C的电子显微照片上可见直径约25nm的颗粒和较小的颗粒。没有寡核苷酸时无法获得重装配。在琼脂糖电泳上加样重装配的颗粒显示，重装配的颗粒含有核酸。通过酚抽提提取核酸内容物，随后加样到琼脂糖凝胶上，用溴化乙锭染色，显示这些颗粒含有用于重装配的寡核苷酸(图45A)。通过将该寡核苷酸的样品与从这些颗粒中提取的核酸材料并排加样，控制包装的寡核苷酸的同一性。已经加样了重装配的AP205VLP并且已用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶再用考马斯蓝染色，显示颗粒的寡核苷酸内容物与蛋白质内容物的共迁移(图16B)，表明寡核苷酸已经被包装到颗粒中。
向SDS-PAGE凝胶上加样重装配的AP205VLP，在不含还原剂的条件下电泳，证实重装配的颗粒已经形成二硫桥接，如同未处理的AP205VLP一样。而且，此二硫键模式也与未处理的颗粒相同。
图15A所示是解装配的AP205VLP蛋白的电子显微照片，而图15B显示纯化前的重装配的颗粒。图15C显示纯化的重装配AP205VLP的电子显微照片。图15A-C的放大倍数是200000倍。
图16A和B显示通过琼脂糖凝胶电泳分析重装配的AP205VLP。两张图上加样到凝胶上的样品从左至右是：未处理的AP205VLP，含有与CyCpG重装配并且纯化的不同含量AP205VLP的3份样品，和未处理的QβVLP。图16A的凝胶用溴化乙锭染色，而在图16B中，同一凝胶用考马斯蓝染色。
实施例21
免疫刺激性核酸能够被包装于QβVLP内
p33肽与QβVLP的偶联：
重组产生的RNA噬菌体Qb的病毒样颗粒(QβVLP)不经处理使用，或者在与含有N端CGG或/和C端GGC延伸(CGG-KAVYNFATM(SEQ ID NO：115)和KAVYNFATM-GGC(SEQ IDNO：131))的p33肽偶联后使用。重组产生的QβVLP在25℃下用10倍摩尔过量的SMPH(Pierce)衍化0.5小时，随后在4℃下用20mMHEPES，150mM NaCl，pH7.2透析，除去未反应的SMPH。加入5倍摩尔过量的肽，在30％乙腈存在下在恒温混匀器中25℃反应2小时。图17显示SDS-PAGE分析，证明了由一个、两个或三个与Qβ单体偶联的肽组成的多条偶联带(箭头，图17)。为了简化起见，在实施例部分，肽p33与QβVLP的偶联产物被具体地称为Qbx33。应当指出，只是因为方便才使用含有肽p33的VLP，本发明同样能够使用野生型VLP。
当在大肠杆菌中通过表达噬菌体Qβ衣壳蛋白产生QβVLP时，它含有能够被消化的RNA，因此通过VLP与RNase A一起孵育去除RNA。
低离子强度和低Qβ浓度使RNase A可以水解QβVLP中的RNA：
20mM Hepes/150mM NaCl缓冲液(HBS)pH7.4中浓度为1.0mg/ml的QβVLP，通过加入RNase A(300μg/ml，Qiagen AG，瑞士)直接消化，或者用4倍体积的H2O稀释至终浓度为0.2×HBS，然后与RNase A(60μg/ml，Qiagen AG，瑞士)一起孵育。在恒温混匀器中以650rpm 37℃孵育3小时。琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实，在1×HBS中只观察到极弱的RNA内容物减少，而在0.2×HBS中大多数RNA均被水解。与之一致的是，向1×HBS中添加RNase A后衣壳的迁移不改变，而向0.2×HBS中添加RNase后迁移较慢。
低离子强度增加核酸在QβVLP中的包装：
在0.2×HBS中RNase A消化后，用Millipore Microcon或Centriplus浓缩器将QβVLP浓缩至1mg/ml，其等份用1×HBS或0.2×HBS透析。向QβVLP中添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpG，在恒温混匀器中37℃孵育3小时。随后，在37℃下用Benzonase消化(100U/ml)QβVLP3小时。利用1％琼脂糖凝胶在溴化乙锭或考马斯蓝染色后分析样品。显示在1×HBS中只有极少量的寡核苷酸能被包装，而在0.2×HBS中可检测到强溴化乙锭染色带，它们与衣壳的考马斯蓝染色位置相同。
不同免疫刺激性核酸能够被包装于Qβ和Qbx33VLP中：
在0.2×HBS中用RNase A消化后，用Millipore Microcon或Centriplus浓缩器将QβVLP或Qbx33VLP浓缩为1mg/ml，并添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpGpt、g10gacga和253merdsCyCpG-253(表1)，在恒温混匀器中37℃孵育3小时。随后，在37℃下用DNase I消化(5U/ml)或Benzonase消化(100U/ml)QβVLP或Qbx33VLP3小时。用1％琼脂糖凝胶在溴化乙锭或考马斯蓝染色后分析样品。图18显示，不同的核酸B-CpGpt、g10gacga和253merdsDNA能够被包装于Qbx33内。包装的核酸对DNase I消化有抗性，在透析过程中保持包装状态(图18)。通过蛋白酶K消化释放核酸，随后进行琼脂糖电泳和溴化乙锭染色，证实B-CpGpt的包装(图18C)。
图18显示用1％琼脂糖凝胶分析B-CpGpt在Qbx33VLP内的包装，用溴化乙锭(A)和考马斯蓝(B)染色。加样到凝胶上的是50μg下列样品：1.未处理的Qbx33VLP；2.RNase A处理的Qbx33VLP；3.RNase A处理并包装B-CpGpt的Qbx33VLP；4.RNase A处理、包装B-CpGpt、DNase I处理并透析的Qbx33VLP；5.1kb MBI FermentasDNA分子量标准。(C)显示用15％TBE/尿素CYBR Gold染色分析从VLP中提取的包装oligo的量。加样到凝胶上的是下列样品：1.蛋白酶K消化和RNase A处理后2μg Qbx33VLP中的BCpGpt oligo内容物；2.20pmol BCpGpt对照；3.10pmol BCpGpt对照；4.5pmolBCpGpt对照。
图18D和E显示用1％琼脂糖凝胶分析g10gacga-PO在Qbx33VLP内的包装，用溴化乙锭(D)和考马斯蓝(E)染色。加样到凝胶上的是15μg下列样品：1.MBI Fermentas 1kb DNA分子量标准；2.未处理的Qbx33VLP；3.RNase A处理的Qbx33VLP；4.RNase A处理并包装g10gacga-PO的Qbx33VLP；5.RNase A处理、包装g10gacga-PO、Benzonase处理并透析的Qbx33VLP。
图18E和F显示用1％琼脂糖凝胶分析dsCyCpG-253在Qbx33VLP内的包装，用溴化乙锭(E)和考马斯蓝(F)染色。加样到凝胶上的是15μg下列样品：1.MBI Fermentas 1kb DNA分子量标准；2.未处理的Qbx33VLP；3.RNase A处理的Qbx33VLP；4.RNase A处理、包装dsCyCpG-253并用DNase I处理的Qbx33VLP；5.RNase A处理、包装dsCyCpG-253、用DNase I处理并透析的Qbx33VLP。
实施例22
向VLP内包装免疫刺激性核酸
RNaseA和ZnSO4介导的VLP核酸内容物的降解
QβVLP如实施例21所述在低离子强度条件下(20mM Hepes pH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl，pH7.4)用RNase A处理。此外，QβVLP和AP205VLP也在与实施例11所述类似的低离子强度条件(20mM Hepes pH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl pH7.4)下用ZnSO4处理。在Eppendorf恒温混匀器中，20mM Hepes pH7.4或20mM Hepes，1mM Tris，pH7.4中的AP205VLP(1mg/ml)在50℃下550rpm用2.5mM ZnSO4处理48小时。Qβ和AP205VLP样品以14000rpm离心，上清液在10,000MWCO Spectra/Por_透析管(Spectrum，货号128 118)中在4℃下首先用2L 20mM Hepes，pH7.4透析2小时，然后在更换缓冲液后透析过夜。与实施例11所述类似，在透析后澄清样品，上清液中的蛋白质浓度通过Bradford分析测定。
向RnaseA和ZnSO4处理的VLP内包装ISS：
在RNA水解和透析后，Qβ和AP205VLP(1-1.5mg/ml)与CpG寡核苷酸(NKCpG-参见表1；G3-6，G8-8-参见表2；10mM Tris pH8中的1mM寡核苷酸贮存液)混合(每ml VLP 130μl寡核苷酸)。样品在恒温摇床上650rpm 37℃下孵育3小时。随后在透析前，在2mMMgCl2存在下，样品用125U Benzonase/ml VLP(Merck KGaA，Darmstadt，德国)处理，37℃孵育3小时。样品在4℃下在300,000MWCO Spectra/Por_透析管(Spectrum，货号131 447)中用20mMHepes，pH7.4透析2小时，更换缓冲液后用相同缓冲液透析过夜。透析后，样品以14000rpm离心，上清液中的蛋白质浓度通过Bradford分析测定。
琼脂糖凝胶电泳以及随后的溴化乙锭和考马斯蓝染色显示，寡核苷酸被包装在VLP内。
实施例23
向VLP内包装侧翼为鸟苷的免疫刺激性寡核苷酸
Qbx33VLP(与肽p33偶联的QβVLP，见实施例21)如实施例21所述在低离子强度条件(20mM Hepes pH7.4)下用RNaseA处理，以水解Qbx33VLP的RNA内容物。用20mM Hepes pH7.4透析后，Qbx33VLP与侧翼为鸟苷的寡核苷酸(表2：G3-6、G7-7、G8-8、G9-9或G6，来自10mM Tris pH8中的1mM寡核苷酸贮存液)混合，如实施例22所述孵育。随后，Qbx33VLP用Benzonase处理，在300,000MWCO管中透析。对含有oligos G7-7、G8-8和G9-9的样品充分透析3天，更换4次缓冲液，以除去游离的oligo。利用1％琼脂糖凝胶、以及在蛋白酶K消化后用TBE/尿素凝胶证实包装。
表2：实施例中使用的免疫刺激性核酸的序列
小写字母表示通过硫代磷酸酯键连接的脱氧核苷酸，而大写字母表示通过磷酸二酯键连接的脱氧核苷酸
 ISS名称  5′-3′序列  SEQ ID NO
 GACGATCGTC  105
 G3-6  GGGGACGATCGTCGGGGGG  106
 G4-6  GGGGGACGATCGTCGGGGGG  107
 G5-6  GGGGGGACGATCGTCGGGGGG  108
 G6-6  GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG  109
 G7-7  GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG  110
 G8-8  GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG  111
 G9-9  GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG  112
 G6  GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG  113
实施例24
向VLP内包装核糖核酸
VLP核酸内容物的ZnSO4依赖性降解：
QβVLP在类似于实施例11所述的低离子强度条件(20mM HepespH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl，pH7.4)下用ZnSO4处理。在Eppendorf恒温混匀器中，20mM Hepes pH7.4或20mM Hepes，1mMTris，pH7.4中的AP205VLP(1mg/ml)用2.5mM ZnSO4在50℃下550rpm处理48小时。如实施例22所述，Qβ和AP205VLP样品以14000rpm离心，并用20mM Hepes，pH7.4透析。
聚肌胞苷酸向ZnSO4处理的VLP内的包装：
将免疫刺激性核酸聚肌胞苷酸(货号27-4732-01，poly(I):poly(C)，Pharmacia Biotech)溶解于PBS(Invitrogen，货号14040)或水中，使浓度为4mg/ml(9μM)。聚肌胞苷酸在60℃下孵育10分钟，然后冷却至37℃。将孵育的聚肌胞苷酸以10倍摩尔过量加到ZnSO4处理的Qβ或AP205VLPs(1-1.5mg/ml)中，混合物在恒温混匀器中37℃下650rpm孵育3小时。随后，在2mM MgCl2存在下，在恒温混匀器中，在37℃下300rpm与Benzonase(每ml VLP混合物125U)孵育3小时，酶水解过量的游离聚肌胞苷酸。Benzonase水解后，样品以14000rpm离心，上清液在4℃下在300,000MWCO Spectra/Por_透析管(Spectrum，货号131 447)中用2L 20mM Hepes，pH7.4透析2小时，更换缓冲液后用相同缓冲液透析过夜。透析后，样品以14000rpm离心，上清液中的蛋白质浓度通过Bradford分析测定。
利用1％琼脂糖凝胶、以及在蛋白酶K消化后用TBE/尿素凝胶证实包装。
实施例25
向HBcAg VLP内包装侧翼为鸟苷的免疫刺激性寡核苷酸
HBcAg VLP在如实施例21所述的低离子强度条件(20mM HepespH7.4)下用RNase A处理，水解VLP的RNA内容物。用20mM Hepes，pH7.4透析后，VLP与侧翼为鸟苷的寡核苷酸(表2；G3-6，G7-7，G8-8，G9-9，G10-PO或G6，在10mM Tris pH8中的1mM贮存液)混合，如实施例22所述孵育。随后，VLP用Benzonase处理，在300,000MWCO管中透析。利用1％琼脂糖凝胶、以及在蛋白酶K消化后利用TBE/尿素凝胶分析包装。
实施例26
向HBcAg VLP内包装核糖核酸
HBcAg VLP在如实施例11所述相似的低离子强度条件(20mMHepes pH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl，pH7.4)下用ZnSO4处理，并且如实施例22所述用20mM Hepes，pH7.4透析。向HBcAg VLP(1-1.5mg/ml)中加入10倍摩尔过量的聚肌胞苷酸，如实施例24所述在恒温混匀器中650rpm 37℃下孵育3小时。随后，在2mM MgCl2存在下，在恒温混匀器中，在300rpm 37℃下与Benzonase(每ml VLP混合物125U)孵育3小时，酶水解过量的游离聚肌胞苷酸。在如实施例11所述类似的Benzonase水解后澄清样品，并且如实施例24所述透析。透析后，样品以14000rpm离心，上清液中的蛋白质浓度通过Bradford分析测定。
实施例27
Qβ的解装配、重装配与包装
QβVLP的解装配和重装配
解装配：在室温搅拌条件下，45mg QβVLP(通过Bradford分析测定)在PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH7.5)中用10mM DTT还原15分钟。加入氯化镁至终浓度为700mM后在室温和搅拌条件下进行15分钟的第二次孵育，使RNA沉淀。溶液在4℃下以4000rpm离心10分钟(Eppendorf 5810R，下列所有步骤中均使用固定角转子A-4-62)，分离沉淀的RNA。上清液中解装配的Qβ外壳蛋白二聚体直接进行层析纯化步骤。
解装配的Qβ外壳蛋白通过阳离子交换层析和大小排阻层析的两步纯化法：解装配反应的上清液含有解装配的外壳蛋白和剩余的RNA，加至SP-Sepharose FF(16/20；6ml；Amersham pharmacia biotech)上。在以5ml/min的流速在室温下进行的层析过程中，监测260nm和280nm的吸光度。层析柱用20mM磷酸钠缓冲液pH7平衡；1∶10稀释样品，使电导率低于10mS/cm(稀释到这一电导率是必要的，使用0.5×平衡缓冲液进行)。用至20mM磷酸钠和500mM氯化钠的梯度进行洗脱步骤(5ml级分中)，将纯Qβ外壳蛋白二聚体与污染物分离。该柱用0.5M NaOH再生。
第二步，将分离的Qβ外壳蛋白二聚体(从阳离子交换柱上洗脱下来的级分)加到(分两次)用缓冲液(20mM磷酸钠，150mM氯化钠；pH6.5)平衡的Sephacryl S-100HR柱(26/60；320ml；Amersham pharmaciabiotech)上。在室温下以2.5ml/min的流速进行层析。监测260nm和280nm的吸光度。以每份5ml收集级分。该柱用0.5M NaOH再生。
重装配：在寡脱氧核苷酸G8-8的存在下，使用浓度为2mg/ml的纯化的Qβ外壳蛋白二聚体进行QβVLP的重装配。重装配反应中寡脱氧核苷酸的浓度为10μM。重装配溶液中外壳蛋白二聚体的浓度为40μM。向溶液中加入尿素和DTT，使终浓度分别为1M尿素和5mM DTT。最后加入在重装配反应中将要包装的寡脱氧核苷酸以及H2O，使重装配反应的终体积为3ml。该溶液首先在4℃下用1500ml含有20mM TrisHCl、150mM NaCl pH8.0的缓冲液透析72小时。透析的重装配混合物在4℃下以14000rpm离心10分钟。弃去微量的沉淀，上清液中含有重装配且包装的VLP。蛋白质浓度通过Bradford分析测定。重装配且包装的VLP用离心过滤装置(Millipore，UFV4BCC25，5K NMWL)浓缩，至蛋白质终浓度为3mg/ml。
重装配且包装的VLP的纯化：将可达10mg的总蛋白质上样到SepharoseTM CL-4B柱(16/70，Amersham Biosciences)上，该柱预先用20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4平衡。在室温下用平衡缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4)以0.4ml/min的流速进行大小排阻层析。监测254nm和280nm的吸光度。分离到两个峰。高分子量峰在较低表观分子量峰之前。以每份0.5ml收集级分，通过SDS-PAGE、随后通过考马斯蓝染色鉴定含有QβVLP的级分。用从大肠杆菌中高度纯化的完整Qβ衣壳校准该柱，显示第一主峰的表观分子量与Qβ衣壳相符。
在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的分析：
A)重装配衣壳的流体动力学大小：在寡脱氧核苷酸G8-8存在下重装配的Qβ衣壳通过动态光散射(DLS)分析，并与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP进行比较。重装配的衣壳显示与完整QβVLP相同的流体动力学大小(取决于质量和构象)。
B)重装配的衣壳中二硫键的形成：重装配的QβVLP通过非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，并与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP进行比较。重装配的衣壳显示与完整QβVLP相同的二硫键模式，存在五聚体和六聚体。
C)通过变性聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶电泳分析在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的核酸内容物：在2mM MgCl2存在下，含有G8-8寡核苷酸的重装配QβVLP(0.4mg/ml)与benzonase(每ml QβVLP 125U)37℃下孵育2小时。随后如实施例11所述，用蛋白酶K(PCR级，Roche Molecular Biochemicals，货号1964364)处理经benzonase处理的QβVLP。然后反应液与TBE-尿素样品缓冲液混合，加样到15％聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶(Novex_，Invitrogen，货号EC6885)上。将1pmol、5pmol和10pmol用于重装配反应的寡脱氧核苷酸加样到同一凝胶上，作为定性及定量标准。该凝胶用SYBR_-Gold(Molecular Probes货号S-11494)染色。SYBR_-Gold染色显示，重装配的Qβ衣壳含有与重装配反应中使用的寡脱氧核苷酸共迁移的核酸。总之，在寡脱氧核苷酸存在下重装配的QβVLP的核酸内容物对benzonase消化具有抗性，以及通过蛋白酶K消化从纯化的颗粒中分离寡脱氧核苷酸，证明了寡脱氧核苷酸的包装。
实施例28
含有G10-PO的VLP在明矾存在下诱导针对共施用的青草花粉提取物的Th1型应答
该实验使用RNA噬菌体Qb外壳蛋白形成的VLP。如实施例15所述，它们或者不经处理使用或者在包装G10-PO(SEQ ID NO：122)后使用。雌性Balb/c小鼠用与明矾(Imject，Pierce)混合的1.9B.U.青草花粉提取物(5-gras-mix Pangramin，Abello，由多年生黑麦、果树、梯牧草、草地早熟禾和草原羊茅花粉制成)在单独的50μg QbVLP或分别负载和包装G10-PO的50μg QbVLP存在下进行皮下免疫。对照组小鼠接受只与明矾混合的花粉提取物。50天后，小鼠用相同的疫苗制剂加强，在第57天采血。通过ELISA测定第57天的血清IgG应答。对照组显示IgG1同种型的抗花粉抗体，而没有IgG2a同种型。负载G10-PO的VLP的存在可诱导针对花粉提取物的IgG2a应答。在分别负载并包装G10-PO的Qb-VLP存在下，不诱导针对花粉提取物的IgE，而在仅明矾存在下观察到IgE应答。这表明VLP内装载的G10-PO能够诱导Th1应答，并且抑制明矾诱导的IgE产生。
                           序列表
<110>赛托斯生物技术公司
     马丁·F·马克曼
     沃尔夫冈·A·伦纳
<120>向病毒样颗粒内包装DNA作为佐剂使用：方法及应用
<130>PA030WO
<150>US60/389,898
<151>2002-06-20
<160>131
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qβ
<400>1
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>2
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体Qβ
<400>2
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
1               5                   10                  15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu
                165                 170                 175
Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala
            180                 185                 190
Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr
    210                 215                 220
Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr
225                 230                 235                 240
Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu
                245                 250                 255
Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu
            260                 265                 270
Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His
        275                 280                 285
Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly
    290                 295                 300
Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile
305                 310                 315                 320
Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala
                325
<210>3
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体R17
<400>3
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Prg Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>4
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体f2
<400>4
Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>5
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体GA
<400>5
Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr
        35                  40                  45
Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser
65                  70                  75                  80
Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe
            100                 105                 110
Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe
        115                 120                 125
Tyr Ala
    130
<210>6
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>6
Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>7
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>7
Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val
    50                  55                  60
Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala
            100                 105                 110
Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn
        115                 120                 125
Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp
    130                 135                 140
Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly
                165                 170                 175
Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg
            180                 185                 190
Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu
            260                 265                 270
Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser
                325
<210>8
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体MS2
<400>8
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu
            100                 105                 110
Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>9
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体M11
<400>9
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>10
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体MX1
<400>10
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>11
<211>330
<212>PRT
<213>噬菌体NL95
<400>11
Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly
1               5                   10                  15
Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly
                165                 170                 175
Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys
            180                 185                 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp
                245                 250                 255
Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr
            260                 265                 270
Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu
                325                 330
<210>12
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体F2
<400>12
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>13
<211>128
<212>PRT
<213>噬菌体PP7
<400>13
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1               5                   10                  15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
            20                  25                  30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
        35                  40                  45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
    50                  55                  60
Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr
                85                  90                  95
Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala
            100                 105                 110
Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
        115                 120                 125
<210>14
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qβ240突变体
<400>14
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>15
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qβ243突变体
<400>15
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>16
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qβ250突变体
<400>16
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>17
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qβ251突变体
<400>17
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>18
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qβ259突变体
<400>18
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>19
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>19
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
SerPhe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
           20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>20
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>20
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Gly Ser Gln Cys
            180
<210>21
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>21
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Thr
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Thr Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Cys Val Ile Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Gly Ser Gln Cys
            180
<210>22
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>22
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 14O
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>23
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>23
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40              45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Asn Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 14O
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>24
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>24
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Thr Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>25
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>25
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr
                85                  9O                  95
Leu Ala Thr Trp yal Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 16O
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    2l0
<210>26
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>26
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>27
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>27
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro Gln
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>28
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>28
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Gly Ser Gln Cys
    210
<210>29
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>29
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Phe Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Asp Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Ser Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>30
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>30
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 l10
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>31
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>31
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                    10                 15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg His Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Arg Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>32
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>32
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Phe Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Ala Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Cys
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 19O
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>33
<211>183
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的人乙型肝炎病毒构件
<400>33
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 15O                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Aro Glu Ser Gln Cys
            180
<210>34
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>34
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Ser
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
            10O                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
130                     135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr rhr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg ser Gln Ser Pro Arg Arg Aro Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>35
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>35
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
            165                     170                 175
Gln ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>36
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>36
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asg Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                  105                110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>37
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>37
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Ala Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Thr Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>38
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>38
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                   80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln  Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                  200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>39
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>39
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                   25                 30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>40
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>40
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Thr Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                   45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ala Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>41
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>41
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Phe Glu Cys Ser Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                   95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
           180                  185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>42
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>可以是任意氨基酸
<400>42
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                      15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Xaa Asp Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Ile Thr
                85                   90                 95
Leu Ser Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Thr Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                135                  140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Thr Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>43
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>43
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Asn Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                      95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                     110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                     125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                     140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                     155             160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                     170             175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                     185             190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
       195                      200             205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>44
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>44
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                    10                 15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Cys Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>45
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>45
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
         35                 40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                150                  155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Pro Gln Cys
    210
<210>46
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>46
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Ser Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
130                     135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>47
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>47
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Leu Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>48
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>48
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                   75                 80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Lys Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>49
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>49
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ala
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>50
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>50
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Thr Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Gln Asp Pro Thr
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
            85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Val Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Val Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>51
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>51
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                    10                 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Val Phe Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Thr
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                 85                 90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trg Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>52
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>52
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
         35                 40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                   55                 60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Thr Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>53
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>53
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Ile Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>54
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>54
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Val
65                  70                  75                   80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Ala Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>55
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>55
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Asn
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Gly Tyr Val Asn Thr Thr Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>56
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>56
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Thr Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                 165                 170                 175
 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
             180
<210>57
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>57
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Ala Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Ile Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>58
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>58
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Thr Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>59
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>59
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Arg Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Thr Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>60
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>60
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Val Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ala
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>61
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>61
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Ala Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>62
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>62
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>63
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>63
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Gly Ser Gln Cys
            180
<210>64
<211>188
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>64
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu
1               5                   10                  15
Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu
    50                  55                  60
Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln
65                  70                  75                  80
Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln
            100                 105                 110
His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ser Thr Asn Cys
            180                 185
<210>65
<211>217
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>65
Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro
1               5                   10                  15
Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp
            20                  25                  30
Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Phe
        35                  40                  45
Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp Thr Ala
    50                  55                  60
Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys Ser Pro
65                  70                  75                  80
His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Glu Glu Leu Thr
                85                  90                  95
Arg Leu Ile Thr Trp Met Ser Glu Asn Thr Thr Glu Glu Val Arg Arg
            100                 105                 110
Ile Ile Val Asp His Val Asn Asn Thr Trp Gly Leu Lys Val Arg Gln
        115                 120                 125
Thr Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln His Thr Val
    130                 135                 140
Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Ala Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr
                165                 170                 175
Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ala Arg Ser Pro Arg Arg
            180                 185                 190
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
        195                 200                 205
Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Asn Cys
    210                 215
<210>66
<211>262
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>66
Met Asp Val Asn Ala Ser Arg Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro
1               5                   10                  15
Asp Asp Phe Phe Pro Lys Ile Glu Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp
            20                  25                  30
Ala Leu Glu Pro Tyr Trp Lys Ser Asp Ser Ile Lys Lys His Val Leu
        35                  40                  45
Ile Ala Thr His Phe Val Asp Leu Ile Glu Asp Phe Trp Gln Thr Thr
    50                  55                  60
Gln Gly Met His Glu Ile Ala Glu Ala Ile Arg Ala Val Ile Pro Pro
65                  70                  75                  80
Thr Thr Ala Pro Val Pro Ser Gly Tyr Leu Ile Gln His Asp Glu Ala
                85                  90                  95
Glu Glu Ile Pro Leu Gly Asp Leu Phe Lys Glu Gln Glu Glu Arg Ile
            100                 105                 110
Val Ser Phe Gln Pro Asp Tyr Pro Ile Thr Ala Arg Ile His Ala His
        115                 120                 125
Leu Lys Ala Tyr Ala Lys Ile Asn Glu Glu Ser Leu Asp Arg Ala Arg
    130                 135                 140
Arg Leu Leu Trp Trp His Tyr Asn Cys Leu Leu Trp Gly Glu Ala Thr
145                 150                 155                 160
Val Thr Asn Tyr Ile Ser Arg Leu Arg Thr Trp Leu Ser Thr Pro Glu
                165                 170                 175
Lys Tyr Arg Gly Arg Asp Ala Pro Thr Ile Glu Ala Ile Thr Arg Pro
            180                 185                 190
Ile Gln Val Ala Gln Gly Gly Arg Lys Thr Ser Thr Ala Thr Arg Lys
        195                 200                 205
Pro Arg Gly Leu Glu Pro Arg Arg Arg Lys Val Lys Thr Thr Val Val
    210                 215                 220
Tyr Gly Arg Arg Arg Ser Lys Ser Arg Glu Arg Arg Ala Ser Ser Pro
225                 230                 235                 240
Gln Arg Ala Gly Ser Pro Leu Pro Arg Ser Ser Ser Ser His His Arg
                245                 250                 255
Ser Pro Ser Pro Arg Lys
            260
<210>67
<211>305
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>67
Met Trp Asp Leu Arg Leu His Pro Ser Pro Phe Gly Ala Ala Cys Gln
1               5                   10                  15
Gly Ile Phe Thr Ser Ser Leu Leu Leu Phe Leu Val Thr Val Pro Leu
            20                  25                  30
Val Cys Thr Ile Val Tyr Asp Ser Cys Leu Cys Met Asp Ile Asn Ala
        35                  40                  45
Ser Arg Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro
    50                  55                  60
Lys Ile Asp Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp Ala Leu Glu Pro Tyr
65                  70                  75                  80
Trp Arg Asn Asp Ser Ile Lys Lys His Val Leu Ile Ala Thr His Phe
                85                  90                  95
Val Asp Leu Ile Glu Asp Phe Trp Gln Thr Thr Gln Gly Met His Glu
            100                 105                 110
Ile Ala Glu Ala Leu Arg Ala Ile Ile Pro Ala Thr Thr Ala Pro Val
        115                 120                 125
Pro Gln Gly Phe Leu Val Gln His Glu Glu Ala Glu Glu Ile Pro Leu
    130                 135                 140
Gly Glu Leu Phe Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Leu Thr Asn Phe Gln Pro
145                 150                 155                 160
Asp Tyr Pro Val Thr Ala Arg Ile His Ala His Leu Lys Ala Tyr Ala
                165                 170                 175
Lys Ile Asn Glu Glu Ser Leu Asp Arg Ala Arg Arg Leu Leu Trp Trp
            180                 185                 190
His Tyr Asn Cys Leu Leu Trp Gly Glu Pro Asn Val Thr Asn Tyr Ile
        195                 200                 205
Ser Arg Leu Arg Thr Trp Leu Ser Thr Pro Glu Lys Tyr Arg Gly Lys
    210                 215                 220
Asp Ala Pro Thr Ile Glu Ala Ile Thr Arg Pro Ile Gln Val Ala Gln
225                 230                 235                 240
Gly Gly Arg Asn Lys Thr Gln Gly Val Arg Lys Ser Arg Gly Leu Glu
                245                 250                 255
Pro Arg Arg Arg Arg Val Lys Thr Thr Ile Val Tyr Gly Arg Arg Arg
            260                 265                 270
Ser Lys Ser Arg Glu Arg Arg Ala Pro Thr Pro Gln Arg Ala Gly Ser
        275                 280                 285
Pro Leu Pro Arg Thr Ser Arg Asp His His Arg Ser Pro Ser Pro Arg
    290                 295                 300
Glu
305
<210>68
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>68
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>69
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CyCpG
<400>69
tccatgacgt tcctgaataa t        21
<210>70
<211>594
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(594)
<400>70
atg gac att gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc    48
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
tcg ttt ttg cct tct gac ttc ttt cct tcc gtc aga gat ctc cta gac    96
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
acc gcc tca gct ctg tat cga gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgc    144
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
tca cct cac cat act gca ctc agg caa gcc att ctc tgc tgg ggg gaa    192
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
ttg atg act cta gct acc tgg gtg ggt aat aat ttg gaa gat cca gca    240
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
tcc agg gat cta gta gtc aat tat gtt aat act aac atg ggt tta aag    288
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
atc agg caa cta ttg tgg ttt cat ata tct tgc ctt act ttt gga aga    336
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
gag act gta ctt gaa tat ttg gtc tct ttc gga gtg tgg att cgc act    384
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
cct cca gcc tat aga cca cca aat gcc cct atc tta tca aca ctt ccg    432
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
gaa act act gtt gtt aga cga cgg gac cga ggc agg tcc cct aga aga    480
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
aga act ccc tcg cct cgc aga cgc aga tct caa tcg ccg cgt cgc aga    528
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
aga tct caa tct cgg gaa tct caa tgt ctt ctc ctt aaa gct gtt tac    576
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys Leu Leu Leu Lys Ala Val Tyr
            180                 185                 190
aac ttc gct acc atg taa
Asn Phe Ala Thr Met
        195
<210>71
<211>197
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>71
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys Leu Leu Leu Lys Ala Val Tyr
            180                 185                 190
Asn Phe Ala Thr Met
        195
<210>72
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>72
Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val
1               5
<210>73
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>73
Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val
1               5
<210>74
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>74
Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala
1               5
<210>75
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>75
Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu
1               5                   10
<210>76
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>76
Val Leu Tyr Arg Tyr Gly Ser Phe Ser Val
1               5                   10
<210>77
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>77
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1               5
<210>78
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>78
Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu
1               5
<210>79
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>79
Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu
1               5
<210>80
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>80
Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val
1               5
<210>81
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>81
Val Leu Pro Asp Val Phe Ile Arg Cys
1               5
<210>82
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>82
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val
1               5
<210>83
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>83
Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu
1               5
<210>84
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>84
Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val
1               5
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>85
Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val
1               5
<210>86
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>86
Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val
1               5
<210>87
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>87
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu
1               5
<210>88
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>88
Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu
1               5
<210>89
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>89
Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile
1               5
<210>90
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>90
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>91
<211>3635
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒PA283-58，编码RNA噬菌体AP205外壳蛋白
<400>91
cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga     60
gctcgcccgg ggatcctcta gaattttctg cgcacccatc ccgggtggcg cccaaagtga    120
ggaaaatcac atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt    180
gtggtcggat ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt    240
taaagttggt atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg    300
tcctgcacct aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca    360
atccattcgc acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg    420
ggaaactcac aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt    480
ccttgaccct actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaagctt gtattctata    540
gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc    600
taacgacaat atgtacaagc ctaattgtgt agcatctggc ttactgaagc agaccctatc    660
atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg    720
taacgccgtt ccgcaccccg gaaatggtca ccgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc    780
agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg    840
gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga    900
gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca    960
tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg  1020
gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg atatggtgca ctctcagtac  1080
aatctgctct gatgccgcat agttaagcca actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg  1140
gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg  1200
gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca  1260
ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctt gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat  1320
ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg  1380
gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc  1440
tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta  1500
ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg  1560
ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg  1620
gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac  1680
gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg  1740
acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt  1800
actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg  1860
ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac  1920
cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt  1980
gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag  2040
caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc  2100
aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc  2160
ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta  2220
tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg  2280
ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga  2340
ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac  2400
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa  2460
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat  2520
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc  2580
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg  2640
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc  2700
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg  2760
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg  2820
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa  2880
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gcgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg  2940
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga  3000
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct    3060
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca    3120
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc    3180
ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg    3240
ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc    3300
caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca    3360
tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct    3420
ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa    3480
ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac    3540
ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag    3600
tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt                               3635
<210>92
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>载体PQβ185
<400>92
tctagattaa cccaacgcgt aggagtcagg ccatg                                 35
<210>93
<211>131
<212>PRT
<213>
<220>人工序列
<223>噬菌体AP205突变体
<400>93
Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>94
<211>3613
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pAP281-32，编码RNA噬菌体AP205外壳蛋白
<400>94
cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga     60
gctcgcccgg ggatcctcta gattaaccca acgcgtagga gtcaggccat ggcaaataag    120
acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta    180
tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg    240
aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accggaaggt    300
tgtgcagatg cctgtgtcat tatgccgaat gaaaaccaat ccattcgcac agtgatttca    360
gggtcagccg aaaacttggc taccttaaaa gcagaatggg aaactcacaa acgtaacgtt    420
gacacactct tcgcgagcgg caacgccggt ttgggtttcc ttgaccctac tgcggctatc    480
gtatcgtctg atactactgc ttaagcttgt attctatagt gtcacctaaa tcgtatgtgt    540
atgatacata aggttatgta ttaattgtag ccgcgttcta acgacaatat gtacaagcct    600
aattgtgtag catctggctt actgaagcag accctatcat ctctctcgta aactgccgtc    660
agagtcggtt tggttggacg aaccttctga gtttctggta acgccgttcc gcaccccgga    720
aatggtcacc gaaccaatca gcagggtcat cgctagccag atcctctacg ccggacgcat    780
cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac    840
cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat    900
ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg caccattcct    960
tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa tgcaggagtc   1020
gcataaggga gagcgtcgat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag   1080
ttaagccaac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa   1140
cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg   1200
tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga   1260
ggcagcttga agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat   1320
aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat   1380
ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata   1440
aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct    1500
tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa    1560
agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa    1620
cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt    1680
taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg    1740
tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca    1800
tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa    1860
cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt    1920
gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc    1980
cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa    2040
actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga    2100
ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc    2160
tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga    2220
tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga    2280
acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga    2340
ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat    2400
ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt    2460
ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct    2520
gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc    2580
ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc    2640
aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc    2700
gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc    2760
gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg    2820
aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata    2880
cctacagcgc gagcattgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta    2940
tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc    3000
ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg    3060
atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt    3120
cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt    3180
ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga    3240
gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc    3300
cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg tggtgtcatg gtcggtgatc gccagggtgc    3360
cgacgcgcat ctcgactgca tggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag    3420
ctgtggtatg gccgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact    3480
cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa    3540
tgagctgttg acaattaatc atcgaactag ttaactagta cgcaagttca cgtaaaaagg    3600
gtatcgcgga att                                                       3613
<210>95
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBcAg肽
<400>95
Gly Gly Lys Gly Gly
1               5
<210>96
<211>152
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBcAg变体
<400>96
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val  Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val
                85                   90                  95
Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr
            100                 105                 110
Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
        115                 120                 125
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
    130                 135                 140
Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
145                 150
<210>97
<211>185
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBCAg变体
<400>97
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Ser
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Ser Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
           180                  185
<210>98
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>98
Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1               5                   10
<210>99
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>99
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile cys Thr Val
1               5                   10
<210>100
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.44
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>n可以是任意核苷酸，优选a
<400>100
nnccatggca aataagccaa tgcaaccg                                        28
<210>101
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.45
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>n可以是任意核苷酸，优选a
<400>101
nntctagaat tttctgcgca cccatcccgg                                      30
<210>102
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.46
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>n可以是任意核苷酸，优选a
<400>102
nnaagcttaa gcagtagtat cagacgatacg                                     31
<210>103
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.47
<400>103
gagtgatcca actcgtttat caactacatt ttcagcaagt ctg                       43
<210>104
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>p1.48
<400>104
cagacttgct gaaaatgtag ttgataaacg agttggatca ctc                       43
<210>105
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸ISS
<400>105
gacgatcgtc                                                            10
<210>106
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸G3-6
<400>106
ggggacgatc gtcgggggg                                                  19
<210>107
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸G4-6
<400>107
gggggacgat cgtcgggggg                                                 20
<210>108
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸G5-6
<400>108
ggggggacga tcgtcggggg g                                               21
<210>109
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸G6-6
<400>109
gggggggacg atcgtcgggg gg                                              22
<210>110
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸G7-7
<400>110
ggggggggac gatcgtcggg gggg                                            24
<210>111
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸G8-8
<400>111
ggggggggga cgatcgtcgg gggggg                                          26
<210>112
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸G9-9
<400>112
gggggggggg acgatcgtcg gggggggg                                        28
<210>113
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸G6
<400>113
ggggggcgac gacgatcgtc gtcggggggg                                      30
<210>114
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CpG-2006，通过硫代磷酸酯链连接的脱氧核苷酸
<400>114
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgt                                             23
<210>115
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有GGG N端的p33肽
<400>115
Cys Gly Gly Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met
1               5                   10
<210>116
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CyCpGpt，通过硫代磷酸酯链连接的脱氧核苷酸
<400>116
tccatgacgt tcctgaataa t                                               21
<210>117
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B-CpGpt，通过硫代磷酸酯链连接的脱氧核苷酸
<400>117
tccatgacgt tcctgacgtt                                                 20
<210>118
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B-CpG
<400>118
tccatgacgt tcctgacgtt                                                 20
<210>119
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>NKCpGpt，通过硫代磷酸酯链连接的脱氧核苷酸
<400>119
ggggtcaacg ttgaggggg                                                  19
<210>120
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>NKCpG
<400>120
ggggtcaacg ttgaggggg                                                  19
<210>121
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CyCpG-rev-pt，通过硫代磷酸酯链连接的脱氧核苷酸
<400>121
attattcagg aacgtcatgg a                                               21
<210>122
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>g10gacga-PO(G10-PO)
<400>122
gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg                                      30
<210>123
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>g10gacga-PS(G10-PS)，通过硫代磷酸酯链连接的脱氧核苷酸
<400>123
gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg                                      30
<210>124
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>(CpG)200pA
<400>124
cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg aaatgcatgt caaagacagc     60
at                                                                    62
<210>125
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Cy(CpG)20
<400>125
tccatgacgt tcctgaataa tcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc     60
g                                                                     61
<210>126
<211>83
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Cy(CpG)20-opA
<400>126
tccatgacgt tcctgaataa tcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc     60
gaaatgcatg tcaaagacag cat                                             83
<210>127
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CyopA
<400>127
tccatgacgt tcctgaataa taaatgcatg tcaaagacag cat                       43
<210>128
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CyCyCy
<400>128
tccatgacgt tcctgaataa ttccatgacg ttcctgaata attccatgac gttcctgaat     60
aat                                                                   63
<210>129
<211>150
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Cy150-1
<400>129
tccatgacgt tcctgaataa ttccatgacg ttcctgaata attccatgac gttcctgaat      60
aattggatga cgttggtgaa taattccatg acgttcctga ataattccat gacgttcctg     120
aataattcca tgacgttcct gaataattcc                                      150
<210>130
<211>253
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>dsCycpG-253
<400>130
ctagaactag tggatccccc gggctgcagg aattcgattc atgacttcct gaataattcc      60
atgacgttgg tgaataattc catgacgttc ctgaataatt ccatgacgtt cctgaataat     120
tccatgacgt tcctgaataa ttccatgacg ttcctgaata attccatgac gttcctgaat     180
aattccatga cgttcctgaa taattccatg acgttcctga aaattccaat caagcttatc     240
gataccgtcg acc                                                        253
<210>131
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>p33含有C端GGC的p33肽
<400>131
Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met Gly Gly Cys
1               5                   10

Claims (121)

1.一种增强动物免疫应答的组合物，其包含：
(a)病毒样颗粒；
(b)免疫刺激物；
其中所述免疫刺激物(b)与该病毒样颗粒(a)结合；和
(c)抗原，其中所述抗原与所述病毒样颗粒(a)混合。
2.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是toll样受体激活物。
3.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是细胞因子分泌诱导物。
4.权利要求2的组合物，其中所述toll样受体激活物选自：
(a)免疫刺激性核酸；
(b)肽聚糖；
(c)脂多糖；
(d)脂磷壁酸；
(e)咪唑并喹啉化合物；
(f)鞭毛蛋白；
(g)脂蛋白；
(h)免疫刺激性有机分子；
(i)含非甲基化CpG的寡核苷酸；
(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和/或(i)中至少一种物质的任意混合物。
5.权利要求4的组合物，其中所述免疫刺激性核酸选自：
(a)核糖核酸；
(b)脱氧核糖核酸；
(c)嵌合核酸；和
(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种核酸的任意混合物。
6.权利要求5的组合物，其中所述核糖核酸是聚肌胞苷酸或其衍生物。
7.权利要求5的组合物，其中所述脱氧核糖核酸选自：
(a)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和
(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。
8.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸。
9.权利要求8的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有序列：
5’X1X2CGX3X43’
其中X1、X2、X3和X4是任意核苷酸。
10.权利要求9的组合物，其中所述核苷酸X1、X2、X3和X4中至少一个具有磷酸酯骨架修饰。
11.权利要求8的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含或者基本由或者由选自下列的序列组成：
(a)TCCATGACGTTCCTGAATAAT(SEQ ID NO：116)；
(b)TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO：118)；
(c)GGGGTCAACGTTGAGGGGG(SEQ ID NO：120)；
(d)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO：122)；和
(e)“dsCyCpG-253”(SEQ ID NO：130)。
12.权利要求11的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有磷酸酯骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者其中所述寡核苷酸磷酸酯骨架的每个磷酸酯部分都是硫代磷酸酯修饰。
13.权利要求8的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分。
14.权利要求13的组合物，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO：105)。
15.权利要求8的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含或者基本由或者由序列
GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：122)组成。
16.权利要求13的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有磷酸酯骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者其中所述寡核苷酸磷酸酯骨架的每个磷酸酯部分都是硫代磷酸酯修饰。
17.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，与所述病毒样颗粒非共价结合。
18.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，被包装于所述病毒样颗粒内。
19.权利要求13的组合物，其中所述回文序列在其3′端和5′端侧有少于10个鸟苷。
20.权利要求19的组合物，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO：105)。
21.权利要求19的组合物，其中所述回文序列在其N端侧为至少3个、至多9个鸟苷，所述回文序列在其C端侧为至少6个、至多9个鸟苷。
22.权利要求19的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有选自下列的核酸序列：
(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO：106)；
(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO：107)；
(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO：108)；
(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO：109)；
(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO：110)；
(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO：111)；
(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ IDNO：112)；和
(h)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG(SEQ IDNO：113)。
23.权利要求19的组合物，其中所述回文序列在其5’端侧为至少4个、至多9个鸟苷，所述回文序列在其3’端侧为至少6个、至多9个鸟苷，优选所述回文序列在其5’端侧为至少5个、至多8个鸟苷，并且所述回文序列在其3’端侧为至少6个、至多8个鸟苷。
24.权利要求19的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有SEQ ID NO：111的核酸序列。
25.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有约6-约300个核苷酸，优选约6-约100个核苷酸，更优选地6-约40个核苷酸。
26.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有约20-约300个核苷酸，优选约20-约100个核苷酸，更优选约20-约40个核苷酸。
27.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有约10-约30个核苷酸。
28.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，选自：
(a)重组的寡核苷酸；
(b)基因组寡核苷酸；
(c)合成的寡核苷酸；
(d)质粒来源的寡核苷酸；
(e)PCR产物；
(f)单链寡核苷酸；和
(g)双链寡核苷酸。
29.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸(b)被所述病毒样颗粒(a)包裹。
30.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸(b)与选自寡核苷酸结合位点、DNA结合位点和RNA结合位点的病毒样颗粒位点结合。
31.权利要求30的组合物，其中所述寡核苷酸结合位点是非天然存在的寡核苷酸结合位点。
32.权利要求30的组合物，其中所述病毒样颗粒位点含有富含精氨酸的重复片段。
33.权利要求1的组合物，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸(b)，含有磷酸酯骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者所述寡核苷酸(b)磷酸酯骨架的每个磷酸酯部分都是硫代磷酸酯修饰。
34.权利要求1的组合物，其中所述病毒样颗粒(a)缺乏含脂蛋白的包膜。
35.权利要求1的组合物，其中所述病毒样颗粒(a)是重组病毒样颗粒。
36.权利要求35的组合物，其中所述病毒样颗粒(a)选自：
(a)重组乙型肝炎病毒蛋白；
(b)重组麻疹病毒蛋白；
(c)重组辛德毕斯病毒蛋白；
(d)重组轮状病毒蛋白；
(e)重组口蹄疫病毒蛋白；
(f)重组逆转录病毒蛋白；
(g)重组诺瓦克病毒蛋白；
(h)重组甲病毒蛋白；
(h)重组人乳头瘤病毒蛋白；
(i)重组多瘤病毒蛋白；
(j)重组噬菌体蛋白；
(k)重组RNA噬菌体蛋白；
(l)重组Qβ-噬菌体蛋白；
(m)重组GA-噬菌体蛋白；
(n)重组fr-噬菌体蛋白；
(o)重组AP 205-噬菌体蛋白；
(p)重组Ty蛋白；和
(q)(a)-(p)中任何一种重组蛋白的片段。
37.权利要求35的组合物，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心蛋白或BK病毒VP1蛋白。
38.权利要求1的组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组蛋白或其片段，其中所述RNA噬菌体选自：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(k)噬菌体f2；
(l)噬菌体PP7；和
(m)噬菌体AP205。
39.权利要求1的组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组蛋白或其片段，其中所述RNA噬菌体是Qβ。
40.权利要求1的组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组蛋白或其片段，其中所述RNA噬菌体是fr或AP 205。
41.权利要求1的组合物，其中所述抗原或抗原决定簇还包含至少一个第二附着位点，该位点选自：
(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和
(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点。
42.权利要求41的组合物，它还包含一个氨基酸接头，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第二附着位点组成。
43.权利要求1的组合物，其中所述抗原(c)选自：
(a)多肽；
(b)脂蛋白；和
(c)糖蛋白。
44.权利要求1的组合物，其中所述抗原(c)是重组抗原。
45.权利要求1的组合物，其中所述抗原(c)分离自天然来源。
46.权利要求45的组合物，其中所述天然来源选自：
(a)花粉提取物；
(b)粉尘提取物；
(c)尘螨提取物；
(d)真菌提取物；
(e)哺乳动物表皮提取物；
(f)羽毛提取物；
(g)昆虫提取物；
(h)食物提取物；
(i)毛发提取物；
(j)唾液提取物；和
(k)血清提取物。
47.权利要求1的组合物，其中所述抗原(c)来源于：
(a)病毒；
(b)细菌；
(c)寄生虫；
(d)朊病毒；
(e)肿瘤；
(f)自身分子；
(g)非肽半抗原分子；
(h)变应原；和
(i)激素。
48.权利要求1的组合物，其中所述抗原是肿瘤抗原。
49.权利要求48的组合物，其中所述肿瘤抗原选自：
(a)Her2；
(b)GD2；
(c)EGF-R；
(d)CEA；
(e)CD52；
(f)人黑素瘤蛋白gp 100；
(g)人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1；
(h)酪氨酸酶；
(i)NA17-A nt蛋白；
(j)MAGE-3蛋白；
(k)p53蛋白；
(l)HPV16 E7蛋白；
(m)(a)-(l)中任何一种抗原的类似物；
(n)(a)-(m)中任何一种肿瘤抗原的抗原性片段。
50.权利要求1的组合物，其中所述抗原是变应原。
51.权利要求50的组合物，其中所述变应原来源于：
(a)花粉提取物；
(b)粉尘提取物；
(c)尘螨提取物；
(d)真菌提取物；
(e)哺乳动物表皮提取物；
(f)羽毛提取物；
(g)昆虫提取物；和
(h)食物提取物；
(i)毛发提取物；
(j)唾液提取物；和
(k)血清提取物。
52.权利要求50的组合物，其中所述变应原选自：
(a)树；
(b)草；
(c)室内粉尘；
(d)屋尘螨；
(e)曲霉菌；
(f)动物毛发；
(g)动物羽毛；
(h)蜂毒；
(i)畜产品；和
(j)植物产品。
53.权利要求1的组合物，其中所述抗原选自：
(a)蜂毒磷脂酶A2；
(b)豚草花粉Amb a1；
(c)桦花粉Bet vI；
(d)白面大黄蜂毒液5Dol mV；
(e)屋尘螨Der p1；
(f)屋尘螨Der f2；
(g)屋尘螨Der 2；
(h)尘螨Lep d；
(i)真菌变应原Alt a1；
(j)真菌变应原Aspf1；
(k)真菌变应原Aspf16；和
(l)花生变应原。
54.权利要求1的组合物，其中所述抗原(c)是细胞毒性T细胞表位、Th细胞表位或至少两种所述表位的组合，其中所述至少两个表位直接结合或者通过连接序列结合。
55.权利要求42的组合物，其中所述细胞毒性T细胞表位选自：
(a)病毒表位；
(b)肿瘤表位；和
(c)变应原表位。
56.一种增强动物的免疫应答的方法，包括向所述动物体内导入一种组合物，该组合物含有：
(a)病毒样颗粒；和
(b)免疫刺激物；其中所述免疫刺激物(b)与所述病毒样颗粒(a)结合；
(c)抗原，其中所述抗原与所述病毒样颗粒(a)混合。
57.权利要求56的方法，其中所述免疫刺激物是toll样受体激活物。
58.权利要求56的方法，其中所述免疫刺激物是细胞因子分泌诱导物。
59.权利要求57的方法，其中所述toll样受体激活物选自：
(a)免疫刺激性核酸；
(b)肽聚糖；
(c)脂多糖；
(d)脂磷壁酸；
(e)咪唑并喹啉化合物；
(f)鞭毛蛋白；
(g)脂蛋白；
(h)免疫刺激性有机分子；
(i)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和
(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和/或(i)中至少一种物质的任意混合物。
60.权利要求59的方法，其中所述免疫刺激物选自：
(a)核糖核酸；和
(b)脱氧核糖核酸；和
(c)嵌合核酸；和
(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种核酸的任意混合物。
61.权利要求60的方法，其中所述核糖核酸是聚肌胞苷酸或其衍生物。
62.权利要求60的方法，其中所述脱氧核糖核酸选自：
(a)含非甲基化CpG的寡核苷酸；
(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。
63.权利要求1的方法，其中所述免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸。
64.权利要求63的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有序列：
5’X1X2CGX3X43’
其中X1、X2、X3和X4是任意核苷酸。
65.权利要求64的方法，其中所述核苷酸X1、X2、X3和X4至少有一个含有磷酸酯骨架修饰。
66.权利要求63的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含或者基本由或者由选自下列的序列组成：
(f)TCCATGACGTTCCTGAATAAT(SEQ ID NO：116)；
(g)TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO：118)；
(h)GGGGTCAACGTTGAGGGGG(SEQ ID NO：120)；
(i)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO：122)；和
(j)“dsCyCpG-253”(SEQ ID NO：130)。
67.权利要求66的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有磷酸酯骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者所述寡核苷酸磷酸酯骨架的每个磷酸酯部分都是硫代磷酸酯修饰。
68.权利要求63的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分。
69.权利要求68的方法，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO：105)。
70.权利要求63的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含或者基本由或者由序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：122)组成。
71.权利要求68的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有磷酸酯骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者所述寡核苷酸磷酸酯骨架的每个磷酸酯部分都是硫代磷酸酯修饰。
72.权利要求1的方法，其中所述免疫刺激物，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，与所述病毒样颗粒非共价结合。
73.权利要求1的方法，其中所述免疫刺激物，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，被包装于所述病毒样颗粒内。
74.权利要求68的方法，其中所述回文序列在其3′端和5′端侧有少于10个的鸟苷。
75.权利要求74的方法，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO：105)。
76.权利要求74的方法，其中所述回文序列在其N端侧为至少3个、至多9个鸟苷，所述回文序列在其C端侧为至少6个、至多9个鸟苷。
77.权利要求74的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有选自下列的核酸序列：
(i)GGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO：106)；
(j)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO：107)；
(k)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO：108)；
(l)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO：109)；
(m)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO：110)；
(n)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO：111)；
(o)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ IDNO：112)；和
(p)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG(SEQ IDNO：113)。
78.权利要求74的方法，其中所述回文序列在其5’端侧为至少4个、至多9个鸟苷，所述回文序列在其3’端侧为至少6个、至多9个鸟苷，优选所述回文序列在其5’端侧为至少5个、至多8个鸟苷，所述回文序列在其3’端侧为至少6个、至多8个鸟苷。
79.权利要求74的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有SEQ ID NO：111的核酸序列。
80.权利要求1的方法，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有约6-约300个核苷酸，优选约6-约100个核苷酸，更优选约6-约40个核苷酸。
81.权利要求1的方法，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有约20-约300个核苷酸，优选约20-约100个核苷酸，更优选约20-约40个核苷酸。
82.权利要求1的方法，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有约10-约30个核苷酸。
83.权利要求1的方法，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，选自：
(h)重组寡核苷酸；
(i)基因组寡核苷酸；
(j)合成寡核苷酸；
(k)质粒来源的寡核苷酸；
(l)PCR产物；
(m)单链寡核苷酸；和
(n)双链寡核苷酸。
84.权利要求1的方法，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸(b)，被所述病毒样颗粒(a)包裹。
85.权利要求1的方法，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸(b)与选自寡核苷酸结合位点、DNA结合位点和RNA结合位点的病毒样颗粒位点结合。
86.权利要求85的方法，其中所述寡核苷酸结合位点是非天然存在的寡核苷酸结合位点。
87.权利要求85的方法，其中所述病毒样颗粒位点含有富含精氨酸的重复片段。
88.权利要求1的方法，其中所述免疫刺激物是免疫刺激性核酸，所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸(b)，含有磷酸酯骨架的一个或多个硫代磷酸酯修饰，或者所述寡核苷酸(b)磷酸酯骨架的每个磷酸酯部分都是硫代磷酸酯修饰。
89.权利要求56的方法，其中所述病毒样颗粒(a)缺乏含脂蛋白的包膜。
90.权利要求56的方法，其中所述病毒样颗粒(a)是重组病毒样颗粒。
91.权利要求90的方法，其中所述病毒样颗粒(a)选自：
(a)重组乙型肝炎病毒蛋白；
(b)重组麻疹病毒蛋白；
(c)重组辛德毕斯病毒蛋白；
(d)重组轮状病毒蛋白；
(e)重组口蹄疫病毒蛋白；
(f)重组逆转录病毒蛋白；
(g)重组诺瓦克病毒蛋白；
(h)重组甲病毒蛋白；
(i)重组人乳头瘤病毒蛋白；
(j)重组多瘤病毒蛋白；
(k)重组噬菌体蛋白；
(l)重组RNA噬菌体蛋白；
(m)重组Qβ-噬菌体蛋白；
(n)重组GA-噬菌体蛋白；
(o)重组fr-噬菌体蛋白；
(p)重组AP 205-噬菌体蛋白；
(q)重组Ty蛋白；和
(r)(a)-(q)中任何一种重组蛋白的片段。
92.权利要求91的方法，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心蛋白或BK病毒VP1蛋白。
93.权利要求56的方法，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组蛋白或其片段，其中所述RNA噬菌体选自：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(k)噬菌体f2；
(l)噬菌体PP7；和
(m)噬菌体AP205。
94.权利要求45的方法，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组蛋白或其片段，其中所述RNA噬菌体是Qβ。
95.权利要求45的方法，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组蛋白或其片段，其中所述RNA噬菌体是fr或AP 205。
96.权利要求56的方法，其中所述抗原或抗原决定簇进一步包含至少一个选自以下的第二附着位点：
(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和
(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点。
97.权利要求96的方法，它还包含氨基酸接头，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第二附着位点组成。
98.权利要求56的方法，其中所述病毒样颗粒(a)在细菌表达系统、酵母表达系统或哺乳动物表达系统中制备。
99.权利要求56的方法，其中所述抗原(c)选自：
(a)多肽；
(b)脂蛋白；和
(c)糖蛋白。
100.权利要求56的方法，其中所述抗原(c)是重组抗原。
101.权利要求56的方法，其中所述抗原(c)分离自天然来源。
102.权利要求101的方法，其中所述天然来源选自：
(a)花粉提取物；
(b)粉尘提取物；
(c)尘螨提取物；
(d)哺乳动物表皮提取物；
(e)羽毛提取物；
(f)昆虫提取物；
(g)食物提取物；
(h)毛发提取物；
(i)唾液提取物；和
(j)血清提取物；和
(k)真菌提取物。
103.权利要求56的方法，其中所述抗原(c)来源于：
(a)病毒；
(b)细菌；
(c)寄生虫；
(d)朊病毒；
(e)肿瘤；
(f)自身分子；
(g)非肽半抗原分子；
(h)变应原；和
(i)激素。
104.权利要求56的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
105.权利要求82的方法，其中所述肿瘤抗原选自：
(a)Her2；
(b)GD2；
(c)EGF-R；
(d)CEA；
(e)CD52；
(f)人黑素瘤蛋白gp100；
(g)人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1；
(h)酪氨酸酶；
(i)NA17-A nt蛋白；
(j)MAGE-3蛋白；
(k)p53蛋白；
(l)HPV16 E7蛋白；
(m)(a)-(l)中任何抗原的类似物；
(m)(a)-(m)中任何肿瘤抗原的抗原性片段。
106.权利要求56的方法，其中所述抗原是变应原。
107.权利要求106的方法，其中所述变应原来源于：
(a)花粉提取物；
(b)粉尘提取物；
(c)尘螨提取物；
(d)真菌提取物；
(e)哺乳动物表皮提取物；
(f)羽毛提取物；
(g)昆虫提取物；
(h)食物提取物；
(i)毛发提取物；
(j)唾液提取物；和
(k)血清提取物。
108.权利要求106的方法，其中所述变应原选自：
(a)树；
(b)草；
(c)室内粉尘；
(d)屋尘螨；
(e)曲霉菌；
(f)动物毛发；
(g)动物羽毛；
(h)蜂毒；
(i)畜产品；和
(j)植物产品。
109.权利要求56的方法，其中所述抗原选自：
(a)蜂毒磷脂酶A2；
(b)豚草花粉Amb a1；
(c)桦花粉Bet vI；
(d)白面大黄蜂毒液5Dol mV；
(e)屋尘螨Der p1；
(f)屋尘螨Der f2；
(g)屋尘螨Der 2；
(h)尘螨Lep d；
(i)真菌变应原Alt a1；
(j)真菌变应原Asp f1；
(k)真菌变应原Asp f16；和
(l)花生变应原。
110.权利要求56的方法，其中所述抗原(c)是细胞毒性T细胞表位、Th细胞表位或至少两种所述表位的组合，其中所述至少两个表位直接连接或通过连接序列连接。
111.权利要求110的方法，其中所述细胞毒性T细胞表位选自：
(a)病毒表位；
(b)肿瘤表位；和
(c)变应原表位。
112.权利要求56的方法，其中所述免疫应答是增强的B细胞应答、增强的T细胞应答或CTL应答。
113.权利要求112的方法，其中所述T细胞应答是Th细胞应答。
114.权利要求113的方法，其中所述Th细胞应答是Th1细胞应答。
115.权利要求56的方法，其中所述动物是哺乳动物，优选人。
116.权利要求56的方法，其中所述组合物通过皮下、肌肉内、静脉内、鼻内或者直接导入淋巴结内来导入动物体内。
117.一种疫苗，其包含免疫有效量的权利要求1的组合物，以及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
118.权利要求117的疫苗，进一步含有佐剂。
119.一种免疫或治疗动物的方法，包括对所述动物施以免疫有效量的权利要求117的疫苗。
120.权利要求119的方法，其中所述动物是哺乳动物，优选人。
121.权利要求1的组合物或者权利要求117的疫苗在生产用于治疗包括并且优选变态反应、肿瘤、慢性疾病和慢性病毒性疾病的病征或疾病的药物中的应用。
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