CN101023103A - 包含ap205外壳蛋白和抗原性多肽的融合蛋白的病毒样颗粒 - Google Patents

包含ap205外壳蛋白和抗原性多肽的融合蛋白的病毒样颗粒 Download PDF

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CN101023103A CN 200580031352 CN200580031352A CN101023103A CN 101023103 A CN101023103 A CN 101023103A CN 200580031352 CN200580031352 CN 200580031352 CN 200580031352 A CN200580031352 A CN 200580031352A CN 101023103 A CN101023103 A CN 101023103A
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M·巴克曼
A·蒂索特
G·詹宁斯
R·伦霍法
P·庞姆彭斯
I·西伦斯
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Abstract

本发明属于医学、免疫学、病毒学和分子生物学领域。本发明提供一种包含来源于RNA噬菌体AP205的修饰的病毒样(VLP)颗粒的组合物。本发明也提供一种生产上述VLP的方法。本发明公开的修饰的VLP可用于生产诱导免疫应答的组合物，以用于预防或治疗疾病、病症，包括传染病、变态反应、癌症和药物成瘾。而且，本发明公开的修饰的VLP特别可用于有效地诱导自身特异性免疫应答，特别是抗体应答。

Description

包含AP205外壳蛋白和抗原性多肽的融合蛋白的病毒样颗粒
发明背景
发明领域
本发明属于医学、免疫学、病毒学和分子生物学领域。
本发明提供一种包含来源于RNA噬菌体AP205的修饰的病毒样(VLP)颗粒的组合物。本发明也提供一种生产上述VLP的方法。本发明公开的修饰的VLP可用于生产诱导免疫应答的组合物，以用于预防或治疗疾病、病症，包括传染病、变态反应、癌症和药物成瘾。而且，本发明公开的修饰的VLP特别可用于有效地诱导自身特异性免疫应答，特别是抗体应答。
相关技术
为了诱导针对与病毒外壳蛋白融合的外源表位的免疫应答必须满足至少两个条件。首先，外源序列的融合应当不干扰外壳蛋白装配为病毒样颗粒；其次，外源表位应当展示在病毒样颗粒表面。RNA噬菌体外壳蛋白的氨基酸序列的融合在过去已经描述。例如，已经描述了向MS2噬菌体外壳蛋白的AB环内插入表位(WO92/13081；Mastico等人，J.Gen.Virol.(1993)74：541-548)。尚未对于MS2噬菌体描述表位的N末端和C末端融合。该技术的一个明显的限制是通过插入到MS2的AB环内，多肽可能被迫形成不同于其天然多肽的构象。
已经报道了在RNA噬菌体fr的外壳蛋白的位点2和3之间、位点50和52之间(暴露于fr衣壳的内表面)或氨基酸128和129之间插入氨基酸序列(Pushko P.等人，Protein Eng(1993)8：883-891)。Pushko等人也报道了Fr CP的N末端的改变可能影响以准3次轴装配，因为几种N末端插入突变体证明只装配为二聚体(Pushko，p.890，最后一段，ProteinEng，(1993)8：883-891)。在fr外壳蛋白的最后一个C末端残基之前插入三氨基酸的序列可使衣壳装配，而另一个较长的表位则阻止衣壳装配。没有评价这个三氨基酸表位的插入的可及性。迄今为止只描述了氨基酸向外壳蛋白fr内的内部插入。
然而在大量例子中，该表位的游离N末端或游离C末端的存在是表位识别的一个重要因素。例如，Seubert P.等人(Neurobiol.(2004)，Aging 25：S588)描述了当对可被各自疫苗产生的抗体所识别的Aβ表位作图时，他们发现在41个作图的样品中，主要的抗体表位位于Aβ的游离氨基末端。同样，也已经描述了对血管紧张肽II的C末端具有特异性的抗体(Budisavljevic M.等人(1988)J.Immunol.140：3059-3065)。
仅仅在RNA噬菌体Qβ的A1延伸的截短形式中报道了表位与C末端的融合，随后仅装配为嵌合VLP。这是由展示该表位的A1亚单位和不含该表位的野生型外壳蛋白的混合物装配的颗粒。当仅有展示该表位的A1延伸在大肠杆菌中表达时没有获得颗粒(Vasiljeva等人(1998)FEBS Letters 431：7-11)。但是这些嵌合颗粒以较低的密度展示表位，这对于它作为疫苗的应用来说可能是个问题。一个问题是低密度的抗原展示可能不能诱导充分的免疫应答，特别是如果该抗原是自身抗原的话，不能打破自身耐受(Bachmann和Zinkernagel，Immunol.Today17：553-558(1996))。
因此在本领域中需要鉴定这样的病毒外壳蛋白，多种抗原可以融合到该外壳蛋白上，并且其中得到的融合蛋白保留形成VLP和在VLP外表面上展示抗原的能力。而且，需要发现这样的病毒外壳蛋白，其允许外源表位融合，以使如果该表位的游离末端具有强免疫原性，则该游离末端可以接近。
发明概述
我们惊奇地发现多种多肽能够与AP205的外壳蛋白的N-或C-末端融合，而得到的融合蛋白当在宿主中、典型且优选地在大肠杆菌中表达时形成病毒样颗粒。此外，我们惊奇地发现如果多肽包含至少一种抗原，该抗原或该抗原的至少一个抗原性位点展示在装配的VLP的外表面上。
因此，在第一方面，本发明提供一种包含至少一种融合蛋白的修饰的病毒样颗粒(VLP)，其中所述至少一种融合蛋白包含：(a)第一多肽；和(b)第二多肽，其中所述第一多肽是AP205噬菌体的外壳蛋白或其突变蛋白，并且其中所述第二多肽与所述第一多肽在所述第一多肽的N-或C-末端处融合。
在一个优选实施方案中，第二多肽包含至少一种抗原。本发明相对于现有技术有利的是，具有不同长度、疏水性和结构的多种多肽，优选抗原，能够在AP205的外壳蛋白的任一末端融合，而且得到的融合蛋白仍然保留形成病毒样颗粒的能力。例如，我们发现包含AP205的外壳蛋白和高度疏水性T细胞表位p33表位的融合蛋白形成病毒样颗粒；相反，含有相同T细胞表位和fr的外壳蛋白的融合蛋白不能形成VLP。而且，与该外壳蛋白融合的抗原获得正确的折叠，并且展示在病毒样颗粒的外表面上，并且修饰的VLP诱导针对该抗原的强抗体应答。
本发明进一步有利地允许自由接近所述至少一种抗原的至少一个末端，如果该自由末端负责诱导强免疫应答的话，则这是重要的。而且，使用相同VLP在外壳蛋白的任一末端展示至少一种抗原的可能性允许评价与至少一种抗原融合的N-或C-末端的免疫原性，而不依赖于载体效应。
在一个优选实施方案中，修饰的VLP还包括至少一种免疫刺激物，免疫刺激性核酸，甚至更优选含有至少一个非甲基化CpG基序的免疫刺激性核酸。含有与修饰的VLP结合、优选包装在修饰的VLP内的免疫刺激物增强了修饰的VLP诱导的免疫应答。如果所述至少一种抗原是来源于微生物病原体的抗原如病毒抗原、细菌抗原，或诱导针对癌细胞或针对变应原的免疫应答的抗原，则这是特别有利的。
在另一方面，本发明提供一种含有修饰的VLP的疫苗组合物。另外，本发明提供一种向动物或人施用该疫苗的方法。
在一个方面，本发明提供一种生产本发明的修饰的VLP的方法，包括以下步骤：(a)(任选地)符合读框地连接编码间隔区的核苷酸序列和编码第一多肽的第一核苷酸序列或编码第二多肽的第二核苷酸序列；(b)符合读框地连接所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列，得到编码所述融合蛋白的第三核苷酸序列；(c)(任选地)引入终止密码子，该终止密码子在第一核苷酸序列的3′处引起抑制；(d)在宿主中表达所述第三核苷酸序列，优选在得到的表达的蛋白质能够形成所述修饰的VLP的条件下进行；和(e)纯化由步骤(d)获得的所述修饰的VLP。
在另一方面，本发明提供一种包含多肽的融合蛋白，其中所述多肽与AP205的外壳蛋白或其突变蛋白的N-或C-末端或这两个末端融合。在另一方面，本发明提供一种编码所述融合蛋白的核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供一种含有修饰的VLP和药学可接受的载体的药物组合物。
在另一方面，本发明提供一种治疗或预防个体中的疾病、病症或生理状况的方法，其中所述方法包括向动物或人施用本发明的修饰的VLP或本发明的药物组合物或本发明的疫苗组合物。
附图说明
图1显示包含AP205外壳蛋白和D2肽的融合蛋白的修饰VLP的电子显微照片。D2通过间隔区GSG(构建体418)或通过间隔区GTAGGGSG(构建体420)与外壳蛋白的C末端融合。D2通过间隔区GSGG(构建体421)或通过间隔区GSGTAGGGSGS(构建体422)与外壳蛋白的N末端融合。
图2显示包含AP205外壳蛋白和D2肽的融合蛋白的修饰VLP的抑制ELISA。◆构建体418；□构建体420；▲构建体421；○构建体422。这些构建体已经在图1中说明。
图3显示包含AP205外壳蛋白和Nef55的融合蛋白的修饰VLP的电子显微照片。Nef55通过间隔区GTAGGGSG与外壳蛋白的C末端融合。
发明详述
定义：
术语“AP205噬菌体”和术语“RNA噬菌体AP205”在此可以互换使用。
抗原：如此处所用的术语“抗原”是指如果被MHC分子呈递时能够被抗体或T细胞受体(TCR)特异性结合的分子。如此处所用的术语“抗原”也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，以及/或者能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有或连接于Th细胞表位，并且在佐剂中给予，或者需要抗原根据本发明呈递。一个抗原可能包含一个或多个表位或抗原性位点(B和T表位)。这里使用的术语“特异性结合”意思是抗原优选地通常以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的许多其它抗体或TCR反应。如此处所用的抗原也可以是几种不同抗原的混合物。但是，在本申请上下文中使用的术语“抗原”是指不是AP205的外壳蛋白或其突变蛋白并且不是AP205噬菌体的VLP，而是除了AP205的外壳蛋白或其突变蛋白并且除了AP205噬菌体的VLP以外的抗原。
抗原性位点：术语“抗原性位点”和术语“抗原性表位”在本文中可以互换使用，是指一种多肽的连续或不连续的部分，它在MHC分子环境内可以被抗体或T细胞受体免疫特异性地结合。至少在某些情况下，抗原性位点与抗体的结合需要根据本发明呈递该抗原性位点。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定排除交叉反应性。抗原性位点在对于该抗原性位点而言独特的空间构象中一般包含5-10个氨基酸。
结合：如此处所用的术语“结合”是指这样的结合：它可以是共价的，例如通过化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可以是，例如：酯、醚、磷酯、酰胺、肽、亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。该术语也包括物质的包封或部分包封。术语“结合”比诸如“偶联”、“融合”、“包封”、“包装”和“附着”的术语范围更广，并且包括后面这些。
包装的：此处所用的术语“包装的”是指与修饰的VLP有关的免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸的状态。此处所用的术语“包装的”是指免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸的包封或部分包封。此处所用的术语“包装的”包括结合，可以是共价结合如通过化学偶联，或者是非共价结合如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。然而，免疫刺激物如含非甲基化CpG的寡核苷酸可以被VLP包裹，而不需要存在实际上的共价结合。在优选实施方案中，免疫刺激性核酸被包装于VLP内，因此典型且优选地不会被DNase或RNase水解。
AP205噬菌体的外壳蛋白：在此使用的术语“AP205噬菌体的外壳蛋白”是指由AP205噬菌体的基因组或由AP205噬菌体的变体的基因组编码的外壳蛋白。典型且优选地，在此使用的术语“AP205的外壳蛋白”是指由AP205噬菌体的基因组编码的外壳蛋白。更优选地，术语“AP205的外壳蛋白”是指SEQ ID NO：1或从SEQ ID NO：1上切下第一个甲硫氨酸的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)。典型且优选地，AP205的外壳蛋白能够装配为病毒衣壳的一个亚单位或RNA噬菌体AP205的VLP。
CpG：如此处所用的术语“CpG”是指含有非甲基化胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸序列的寡核苷酸(例如“CpG DNA”或含有胞嘧啶及随后的鸟嘌呤、并通过磷酸酯键连接的DNA)，它能刺激/激活脊椎动物细胞，例如对该细胞具有促有丝分裂作用，或诱导或提高该细胞的细胞因子表达。例如，CpG可用于激活B细胞、NK细胞和抗原呈递细胞，如单核细胞、树突细胞和巨噬细胞，以及T细胞。CpG可包括核苷酸类似物，如含有磷酸硫酯键的类似物，并且可以是双链或单链的。通常双链分子在体内更稳定，而单链分子免疫活性更高。
表位：如此处所用的术语“表位”是指在动物、优选哺乳动物、最优选在人中具有抗原性或免疫原活性的多肽的连续或不连续部分。表位在MHC分子环境下被抗体或被T细胞通过其T细胞受体来识别。如此处所用的“免疫原性表位”被定义为通过本领域公知的任何方法测定，能够在动物中引发抗体应答或诱导T细胞应答的多肽的一部分(参见，例如：Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002(1983))。如此处所用的术语“抗原性表位”被定义为蛋白质的一部分，如通过本领域公知的任何方法测定的，抗体能够免疫特异性地结合它的抗原。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定排除与其它抗原的交叉反应性。抗原性表位不需要必须是免疫原性的。抗原性表位也可以是T细胞表位，在这种情况下它们能在MHC分子环境内被T细胞受体免疫特异性地结合。
AP205外壳蛋白的片段：在此使用的术语“AP205外壳蛋白的片段”是指一种多肽，其能够形成AP205的病毒样颗粒，并且具有AP205外壳蛋白的至少一个截短、至少一个内部缺失或其组合，而且具有AP205外壳蛋白长度的至少70％，优选80％。在此使用的术语“AP205外壳蛋白的片段”进一步包括一种多肽，其能够形成AP205的病毒样颗粒，并且与如上定义的“AP205外壳蛋白的片段”具有80％以上，更优选90％以上，甚至更优选95％以上的氨基酸序列同一性。
融合(或其动词形式)：如此处所用的术语“融合”(或其动词形式)是指不同来源的氨基酸序列通过其编码核苷酸序列的框内组合而组合在一条多肽链中。由于遗传密码的简并性，一个以上的核苷酸序列可以编码一种特定的氨基酸序列。
免疫刺激性核酸：如此处所用的术语“免疫刺激性核酸”是指能够诱导和/或增强免疫应答的核酸。优选地，免疫刺激性核酸包含至少一个CpG基序，如其中C未甲基化的CG二核苷酸。CG二核苷酸可以是回文序列的一部分，或者可以包含于一种非回文序列内。如上所述的不含CpG基序的免疫刺激性核酸包括，例如，缺乏CpG二核苷酸的核酸，以及含有具有甲基化CG二核苷酸的CG基序的核酸。如此处所用的术语“免疫刺激性核酸”应当也涉及含有修饰的碱基如4-溴-胞嘧啶的核酸。
免疫刺激物：如此处所用的术语“免疫刺激物”是指能够诱导和/或增强免疫应答的物质。优选地，免疫刺激物是指toll样受体激活物。在本申请的上下文中使用的术语“免疫刺激物”是指不是本发明的修饰VLP而是除了所述修饰VLP以外的免疫刺激物。
AP205噬菌体外壳蛋白的突变蛋白：在此使用的术语“AP205噬菌体外壳蛋白的突变蛋白”是指一种多肽，其氨基酸序列与AP205噬菌体的特定外壳蛋白的氨基酸序列有至少一个氨基酸不同，并且其氨基酸序列与AP205噬菌体的特定外壳蛋白的氨基酸序列具有至少90％，更优选92％，甚至更优选95％，更优选97％的同一性。典型且优选地，AP205噬菌体外壳蛋白的突变蛋白保留形成RNA噬菌体AP205的VLP的能力。在此使用的术语“SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：67的突变蛋白”是指一种多肽，其氨基酸与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：67的氨基酸序列有至少一个氨基酸不同，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQID NO：67的氨基酸序列具有至少90％，更优选92％，甚至更优选95％，更优选97％的同一性。典型且优选地，通过至少一个遗传工程引入AP205外壳蛋白与所述外壳蛋白的突变蛋白之间的序列差异，其中所述遗传工程选自内部添加、插入、缺失、截短(涉及从蛋白质末端的缺失)、置换及其组合。外部添加的氨基酸，即在AP205噬菌体外壳蛋白或AP205噬菌体外壳蛋白的突变蛋白的一端或两端添加的一个或多个氨基酸，不被视为AP205噬菌体外壳蛋白的突变蛋白序列的部分。进一步优选地，至少50％，优选至少70％，更优选至少90％的氨基酸置换是保守的氨基酸置换。如本领域技术人员所理解的，保守的氨基酸置换包括，典型且优选地由等构置换(isosteric substitution)组成，该置换中氨基酸的电荷、极性、芳族、脂族或疏水性性质得到保持。典型的保守置换是下组之一内的氨基酸之间的置换：Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr，Cys；Lys，Arg；Phe和Tyr。
有序且重复的抗原阵列：如此处所用的术语“有序且重复的抗原阵列”通常是指抗原的重复模式，其特征在于典型且优选地，抗原的空间排列相对于病毒样颗粒具有高度的均一性。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可以是一种几何模式。RNA噬菌体AP205的修饰的VLP具有严格重复的类结晶抗原排列，优选间隔1-30纳米，优选2-15纳米，更优选2-10纳米，更优选2-8纳米，进一步更优选1.6-7纳米，最优选0.5-7纳米。
多肽：如此处所用的术语“多肽”是指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接组成的分子。它是指氨基酸分子链，而不是指特定长度的产物。因此，多肽的定义内包括肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质。该术语也包括多肽的翻译后修饰，例如：糖基化、乙酰化、磷酸化等。
自身抗原：如此处所用的术语“自身抗原”是指由宿主DNA编码的多肽，和由被定义为自身的宿主DNA编码的多肽或RNA衍生的产物。而且，如此处所用的术语“自身抗原”优选地也涉及包含或者由自身抗原的片段组成的多肽，其优选地具有至少4个、优选至少5个、更优选至少6个、至少7个或至少8个氨基酸的长度。另外，如此处所用的术语“自身抗原”优选地也涉及与如上定义的自身抗原具有高同源性，优选具有至少80％的同源性的多肽。而且，如此处所用的术语“自身抗原”优选地也应当包括如上定义的自身抗原的直向同源物(ortholog)和能够产生对该自身抗原具有特异性的免疫应答的直向同源物。术语“直向同源物”是指从一个物种中获得的多肽，它是来自不同物种的多肽的功能对应物。直向同源物之间的序列差异是物种形成的结果。而且，如此处所用的术语“自身抗原”优选地也涉及由两种或几种自身抗原的组合产生的多肽。
在此使用的病毒样颗粒(VLP)是指类似于病毒颗粒的结构。本发明的病毒样颗粒是非复制性和非感染性的，因为它缺少全部或部分的病毒基因组，典型且优选地缺少病毒基因组的全部或部分复制和感染成分。
RNA噬菌体AP205的病毒样颗粒：在此使用的术语“RNA噬菌体AP205的病毒样颗粒”是指包含或者优选基本由或者由RNA噬菌体AP205的外壳蛋白、其突变蛋白或片段组成的病毒样颗粒。另外，RNA噬菌体AP205的病毒样颗粒类似于RNA噬菌体AP205的结构，并且是非复制性和非传染性的，并且至少缺少编码RNA噬菌体AP205的复制机制的基因，一般也缺少编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义也包括上述基因仍然存在但是无活性的RNA噬菌体AP205的病毒样颗粒，于是也产生非复制性和非传染性的RNA噬菌体AP205的病毒样颗粒。优选的来源于RNA噬菌体AP205的VLP表现为二十面体对称，并且由180个亚单位组成。在本申请的公开内容中，术语“亚单位”和“单体”可互换使用，并且在上下文中等同地使用。
在本申请中，如果抗体与抗原结合的结合亲和力(Ka)为106 M-1或更高，优选107M-1或更高，更优选108M-1或更高，最优选109M-1或更高，则其被定义为特异性结合。本领域技术人员可以容易地测定抗体的亲和力(例如通过Scatchard分析)。
多肽的氨基酸序列同一性可以使用诸如Bestfit程序的已知计算机程序常规测定。当使用Bestfit或其它任何序列比对程序，优选使用Bestfit确定一种特定序列与参照氨基酸序列是否例如95％相同时，将参数设置为使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分数，并且允许最多占参照序列中氨基酸残基总数的5％的同源性缺口。上述测定多肽之间同一性百分数的方法适用于本发明公开的所有蛋白质、多肽或其片段。
一种：术语“一种”在本申请公开内容中使用时，除非另外说明，是指“至少一种”或“一种或一种以上”。
在此使用时，当涉及任何数值时，术语“大约”或“近似”是指所述数值±10％的值。例如，“约50℃”(或者“近似50℃”)包括45℃至55℃的温度范围；同样，“约100mM”(或者“近似100mM”)包括90mM至110mM的浓度范围。
本发明提供一种包含至少一种融合蛋白的修饰的病毒样颗粒(VLP)，其中所述至少一种融合蛋白包含、基本由、或者由以下组分组成：(a)第一多肽；和(b)第二多肽；并且其中所述第一多肽是AP205噬菌体的外壳蛋白或其突变蛋白，并且其中所述第二多肽与所述第一多肽在第一多肽的N末端或C末端融合。
RNA噬菌体AP205最近已经被鉴定(Klovins，J.，等人，J.Gen.Virol.83：1523-33(2002))。AP205 RNA噬菌体(分类号：154784)是一种单链、正链的RNA病毒。AP205的基因组长度为4267个核苷酸(nt)(登记号AF334111，NC_002700)。AP205噬菌体的天然宿主是不动杆菌属(Acinetobacter)的种(Klovins，J，等人，J.Gen.Virol.83：1523-33(2002))。AP205噬菌体的基因组包括3个大开放阅读框(ORF)，它们分别编码成熟、外壳和复制酶蛋白。另外，另外两个小ORF存在于5′末端，成熟基因之前。这些ORF编码的蛋白质的功能未知。据推断这些ORF之一可能编码一种裂解蛋白(Klovins，J，等人，J.Gen.Virol.83：1523-33(2002))。在大肠杆菌中表达的AP205外壳蛋白装配为VLP最近也在WO2004/007538中公开，其公开内容在此引入作为参考。AP205外壳蛋白的克隆和表达已经在WO04/007538的第24页第二段至第25页第二段以及同一申请的实施例1和2中公开，其具体公开内容也在此引入作为参考。
在一个优选实施方案中，第一多肽由118-144个氨基酸，优选121-141个，更优选124-138个，甚至更优选127-135个，进一步优选128-134个氨基酸组成。在另一个优选实施方案中，第一多肽由131-142个氨基酸，优选131-139个，更优选131-135个，再更优选131-134个氨基酸组成。
在本发明的一个优选实施方案中，AP205噬菌体的外壳蛋白或其突变蛋白选自：(a)SEQ ID NO：1；(b)SEQ ID NO：2；(c)SEQ ID NO：42；(d)SEQ ID NO：67；(e)SEQ ID NO：68；(f)SEQ ID NO：69；和(g)SEQID NO：1或67的突变蛋白。在一个优选实施方案中，该突变蛋白具有如SEQ ID NO：1，2，42，67，68或69所示的氨基酸序列，其中SEQ IDNO：1，2，42，67，68或69的最多6个氨基酸残基，优选最多5、4或3个氨基酸残基，更优选最多2个氨基酸残基，甚至更优选1个氨基酸残基被删除、在内部添加或者置换，其中优选至少1个，更优选至少2、3或4个，甚至更优选全部所述置换是保守置换。
在一个优选实施方案中，突变蛋白具有如SEQ ID NO：1，2，42，67，68或69所示的氨基酸序列，其中至少一个半胱氨酸残基，优选最多两个半胱氨酸残基被删除或被置换，其中优选地所述至少一个，更优选至少两个，甚至更优选所有的所述置换是保守置换。
在一个优选实施方案中，突变蛋白具有如SEQ ID NO：1，2，42，67，68或69所示的氨基酸序列，其中至少一个赖氨酸残基，优选最多三个赖氨酸残基，更优选最多两个赖氨酸残基，甚至更优选一个赖氨酸残基被删除或被置换，其中优选地所述至少一个，更优选至少两个或三个，甚至更优选所有的所述置换是保守置换。
本发明基于以下惊人的发现：具有各种序列和各种长度的多种多肽能够与AP205噬菌体的外壳蛋白或其突变蛋白融合，并且得到的融合蛋白保留形成VLP的能力。
在一个优选实施方案中，第二多肽具有不到100个，更优选不到80个，不到60个，更优选不到40个，再更优选不到30个氨基酸。优选地，第二多肽折叠为独立的结构域或者折叠单位，其不干扰AP205噬菌体的外壳蛋白或其突变蛋白装配为VLP。
在另一个优选实施方案中，第二多肽由1-60个氨基酸，优选3-40个，更优选5-30个，再更优选10-25个氨基酸组成。优选地第二多肽的存在不干扰第一多肽装配为VLP。
在一个优选实施方案中，第二多肽包含或者由具有至少一个反应性官能团的至少一个氨基酸组成。在一个进一步优选的实施方案中，第二多肽包含或者由至少一个半胱氨酸，优选一个半胱氨酸残基组成。具有至少一个反应性官能团的至少一个氨基酸可以作为连接位点与相同或其他分子部分所含的其他官能团连接。
在另一方面，本发明提供修饰的VLP作为基于蛋白质的药物递送系统的用途，其中所述药物被包装在修饰的VLP的内部。药物典型且优选地是指化学化合物、毒素、生物活性物质、用于基因治疗目的的核酸。在一个进一步优选的实施方案中，第二多肽包含是多肽的靶分子。基于蛋白质的药物递送系统在现有技术中已经公开，如Brown WL.等人(2002)Intervirology 45：371-380，Wu M.等人(1995)BioconjugateChem.6：587-595，和欧洲专利EP0648272。这些公开内容在此完整引入作为参考。
在本发明的一个优选实施方案中，第二多肽包含或者基本由或者由至少一种抗原组成，其中所述至少一种抗原是多肽。抗原的大小、疏水性、结构应当适合融合蛋白向本发明的VLP的装配。本发明进一步基于以下惊人发现：具有各种序列和各种长度的多种抗原能够与AP205噬菌体的外壳蛋白或其突变蛋白融合，并且得到的融合蛋白保留形成VLP的能力。此外，惊奇地发现抗原或抗原的至少一个抗原性位点在形成的VLP的外表面上展示。
本领域技术人员应当知道，通过在大肠杆菌中表达融合的外壳蛋白，任选地通过凝胶过滤从细胞裂解物中纯化衣壳，并且用免疫扩散试验(Ouchterlony试验)或电子显微镜检查(EM)(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-37(1993))分析衣壳的形成，可以检测融合蛋白向VLP的装配。免疫扩散试验和EM可以直接用细胞裂解物进行。
通过用修饰的VLP免疫动物，如小鼠，并且利用对于抗原或抗原的至少一个抗原性位点具有特异性的ELISA来检测抗体应答，可以评估抗原或抗原的至少一个抗原性位点在修饰的VLP表面上的展示。或者可以进行抑制ELISA。将抗原直接或间接包被于ELISA板上。通过添加一系列稀释的修饰的VLP可以测定抗原特异性血清例如小鼠血清与包被抗原的结合的抑制。
在一个实施方案中，所述至少一种抗原是蛋白质。在另一个实施方案中，所述至少一种抗原是蛋白质片段。本文使用的术语“蛋白质片段”或其可互换使用的术语“多肽片段”或“抗原片段”应当包括任何包含或者优选由此处定义的蛋白质、多肽或抗原的至少6，7，8，9，10，11，12，17，18，19，20，25，30个连续或非连续氨基酸组成的多肽，以及与之具有65％以上，优选80％以上，更优选90％以上，甚至更优选95％以上氨基酸序列同一性的任何多肽。蛋白质片段应当具有至少一个抗原性位点。蛋白质片段当根据本发明呈递时，应当能够在体内诱导抗体的产生或T细胞的刺激，该抗体或T细胞特异性结合在MHC分子环境内呈递的蛋白质或蛋白质片段。蛋白质片段的优选的实施方案是蛋白质的截短或内部缺失形式。
测定蛋白质的抗原性位点的方法是本领域技术人员公知的。PCT/EP2005/004980在第26页第1段至第27页第4段已经详述了一些这样的方法，这些具体公开内容在此引入作为参考。应当指出，这些方法通常适用于其他多肽抗原，因此不限于如PCT/EP2005/004980中公开的IL-23 p19。
在本发明的另一个实施方案中，所述至少一种抗原是蛋白质的变体。在这里使用的术语“蛋白质的变体”或其可互换使用的术语“多肽的变体”或“抗原的变体”应当包括任何包含或者优选由任何天然或基因工程多肽组成的多肽，它与所述蛋白质、抗原或多肽的序列具有70％以上，优选80％以上，甚至更优选90％以上，再更优选95％以上，最优选97％以上的氨基酸序列同一性。产生蛋白质变体的优选方法是通过基因工程，优选通过插入、置换、缺失或其组合。蛋白质的变体当根据本发明呈递时，应当能够在体内诱导抗体的产生或T细胞的刺激，该抗体或T细胞特异性结合在MHC分子环境内呈递的蛋白质或蛋白质片段。
在一个优选实施方案中，第二多肽包含或者由至少一种天然存在的抗原或其部分组成，其中所述天然存在的抗原的部分包含或者由至少一个抗原性位点组成。天然存在的抗原是指一种抗原，其氨基酸序列天然存在，优选存在于诸如植物、动物、微生物、细菌或病毒的生物中。
在本发明的优选实施方案中，所述至少一种抗原选自：(a)适合于诱导针对癌细胞的免疫应答的抗原；(b)适合于诱导针对至少一种微生物病原体的免疫应答的抗原；(c)适合于诱导针对至少一种变应原的免疫应答的抗原；(d)适合于诱导针对至少一种自身抗原的免疫应答的抗原；(e)适合于在家畜或宠物中诱导免疫应答的抗原；和(f)适合于诱导针对多肽毒素或多肽激素的应答的抗原。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原适合于诱导针对癌细胞的免疫应答；优选所述至少一种抗原是肿瘤抗原、其变体或片段。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，所述肿瘤抗原是乳腺癌细胞的多肽、肾癌细胞的多肽、前列腺癌细胞的多肽、皮肤癌细胞的多肽、脑癌细胞的多肽、或白血病细胞的多肽。在另一个进一步优选的实施方案中，所述肿瘤抗原选自：(a)Her2；(b)GD2；(c)EGF-R；(d)CEA；(e)CD52；(f)人黑色素瘤蛋白gp100；(g)人黑色素瘤蛋白melan-A/MART-1；(h)酪氨酸酶；(i)NA17-A nt蛋白；(j)MAGE-3蛋白；(k)p53蛋白；(1)CD21；(m)HPV16 E7蛋白；(n)(a)至(m)中任意肿瘤抗原的片段；和(o)(a)至(m)中任意肿瘤抗原的变体。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述至少一种抗原适合于诱导针对传染病或针对至少一种微生物病原体的免疫应答；优选所述至少一种抗原是来源于微生物病原体的抗原或其变体或片段。传染病、微生物病原体和来源于微生物病原体的抗原已经在美国专利申请US-2003-0091593-A1中公开，特别是第75页第2段到第83页第4段。这些公开内容在此引入作为参考。在一个进一步优选的实施方案中，所述来源于微生物病原体的至少一种抗原是HIV的多肽、流感病毒的多肽、乙型肝炎病毒的多肽、丙型肝炎病毒的多肽、弓形体(Toxoplasma)的多肽、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的多肽、间日疟原虫(Plasmodium vivax)的多肽、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)的多肽、衣原体的多肽、三日疟原虫(Plasmodium malariae)的多肽、或流感M2蛋白、上述多肽的变体和上述多肽的片段。因此在一个方面，本发明提供本发明的修饰的VLP作为疫苗预防和/或治疗传染病的用途。可以向动物或人施用所述疫苗。优选的动物是家畜或宠物，例如但不限于猪、马、牛、绵羊、狗、猫、兔和鸡。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者基本由或者由流感M2蛋白的胞外域组成。在一个优选实施方案中，M2蛋白的胞外域与AP205噬菌体的外壳蛋白、其突变蛋白或片段的N末端融合。在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者基本由或者由流感M2蛋白的胞外域的片段组成，其中所述片段具有流感M2蛋白的胞外域的序列的至少5个，优选至少7个，更优选至少10个连续氨基酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述流感M2蛋白的胞外域的片段包含所述胞外域的N末端一半。在一个优选实施方案中，流感M2蛋白的胞外域由SEQ ID NO：43的序列组成。在一个进一步优选的实施方案中，流感M2蛋白的胞外域由SEQ ID NO：43的序列组成，其中SEQ IDNO：43的最多3个氨基酸残基被删除、内部添加或置换。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者基本由或者由串联的M2蛋白，优选串联的M2二聚体，或者串联的M2三聚体组成。该实施方案可以增强针对M2肽引起的免疫应答。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原还包括至少一个间隔区，其中所述间隔区位于M2肽之间。优选地，所述间隔区具有最多15个氨基酸，优选最多10个，更优选最多8个，最多6个，更优选最多4个氨基酸。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由PreS1(aa21-47)组成，PreS1是来源于乙型肝炎病毒(HBV)大表面蛋白的PreS1区(PLGFFPDHQLDPAFRANTANPDWDFNP，SEQ IDNO：62)。人HBV的被膜含有三个共端的蛋白质，称为小(S)、中(M)、大(L)表面蛋白。S蛋白是三种蛋白中含量最多的，由226个氨基酸组成。M蛋白含有S蛋白序列和在N末端的另外55个氨基酸。这55个氨基酸的序列被称为PreS2序列。L蛋白含有S和PreS2序列和在N末端的另外119个(或108个，取决于HBV亚型)氨基酸，它被称为PreS1序列。已经表明尚未鉴定的肝细胞受体的HBV-结合位点位于PreS1区内，氨基酸21和47之间(Shouval，D.，2003，Journal of Hepatology 39.S70-S76)。
乙型肝炎是一个重要的健康问题，全世界有超过3.5亿人慢性感染。乙型肝炎病毒慢性感染导致大量疾病，包括肝硬化和癌症。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是HIV蛋白，其片段或变体。有用的HIV抗原包括p17-GAG、p24-GAG、p15-GAG、蛋白酶、逆转录酶(RT)、整合酶、Vif、Vpr、Vpu、Tat、Rev、gp-41-Env、gp-120-Env和Nef(Addo，M.M.等人，J.Virol.77：2081-2092(2003))。已经发现HIV抗原p24-GAG和Nef具有最高的表位密度(Addo，M.M.等人，J.Virol.77：2081-2092(2003))。因此在本发明的优选实施方案中，抗原包含p24-GAG-CTL和/或NEF-CTL和/或Th细胞表位。Th细胞表位被认为对CTL应答的诱导和维持具有贡献。HIV CTL表位和HIV共有序列可以从数据库(例如网站：http://hiv- web.lanl.gov/seq-db.html)以及从参考文献″The Identification of Optimal HIV-Derived CTLEpitopes in Diverse Populations Using HIV Clade-Specific Consensus″(pp.I-1-20 in HIV Molecular Immunology 2001.Edited by：Korber BTK，Brander C，Haynes BF，Koup R，Kuiken C，Moore JP，Walker BD，和Watkins D.)中选择。接种诱导的T细胞应答利用增殖试验(对于Th细胞应答，Belshe R.B.等人，J.Inf.Dis.183：1343-1352(2001))、ELISPOT试验(Oxenius，A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：13747-13752(2002))、或细胞毒性试验(Belshe R.B.等人，J.Inf.Dis.183：1343-1352(2001))来评估。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由HIV的多肽组成。在此使用的术语“HIV的多肽”是指来源于相同或不同HIV多肽的至少两个HIV表位的组合，其中所述至少两个HIV表位融合到一个多肽中。在一个进一步优选的实施方案中，所述多肽与AP205外壳蛋白或其突变蛋白的C末端融合。在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是来源于HIV Nef的多肽。在另一个优选实施方案中，来源于Nef的多肽是Nef55(SEQ ID NO：23)。在又一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原Nef55融合到AP205外壳蛋白的C末端上。在另一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是来源于HIV Gag的多肽。在另一个优选实施方案中，来源于HIV Gag的多肽是gag G50(SEQID NO：119)。在一个进一步优选的实施方案中，来源于HIV Gag的多肽是为了提高肽的溶解度而在C末端添加了赖氨酸残基的gag G50(SEQ ID NO：120)。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含、基本由或者由来源于HIV包膜糖蛋白gp160的肽组成，其中优选地所述肽在所有HIV株中是高度保守的(70％以上保守)，或者其中优选地所述肽诱导中和抗体，或者其中优选地所述肽是一种阻断肽。在一个进一步优选的实施方案中，来源于HIV包膜糖蛋白gp120或gp41的肽选自：
(a)  HIV env1：SLEQIWNNMTWMQWDK(SEQ ID NO：98)；
(b)  HIV env2：SLEQIWNNMTWMQWDR(SEQ ID NO：99)；
(c)  HIV env3：IWNNMTWMQWDR(SEQ ID NO：100)；
(d)  HIV env4：WASLWNW(SEQ ID NO：101)；
(e)  HIV env5：NWFDISNWLW(SEQ ID NO：102)；
(f)  HIV env6：LLELDKWASLWNWFNL(SEQ ID NO：103)；
(g)  HIV env7：ELDKWA，(SEQ ID NO：104)；
(h)  HIV env8：
WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL(SEQID NO：105)；
(i)  HIV env9：CSKLIC(SEQ ID NO：106)；
(j)  HIV env10：GFLGAAGSTMGAASITLVQ(SEQ ID NO：107)；
(k)  HIV env11：QQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQL(SEQID NO：108)；
(1)  HIV env12：GIVQQQ(SEQ ID NO：109)；
(m)  HIV env13：QLLGIWGCSGKLICTTAVPWNSSWS(SEQ ID NO：110)；
(n)  HIV env14：NAKTIIVQLNQSVE(SEQ ID NO：111)；
(o)  HIV env15：GGNSNNESEIFRPGGGD(SEQ ID NO：112)；
和
(p)  HIV env16：
VAPTKAKRRVVQREKRAVGIGALFLGFLGAAGSGC(SEQ ID NO：113)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原适合于诱导针对至少一种自身抗原的免疫应答，优选所述至少一种抗原是自身抗原、其变体或片段。自身抗原过量产生或功能障碍引起的疾病，特别是自身免疫病、慢性炎症疾病的例子，已经在专利申请WO02/056905的第53页最后一段中公开。
在本发明的另一个优选实施方案中，自身抗原选自：(a)淋巴毒素(优选淋巴毒素α(LTα)，淋巴毒素β(LTβ))；(b)淋巴毒素受体；(c)核因子kB配体的受体激活物(RANKL)；(d)血管内皮生长因子(VEGF)；(e)血管内皮生长因子受体(VEGF-R)；(f)白介素-5；(g)白介素-17；(h)白介素-13；(i)IL-23 p19；(j)生长素释放肽(Ghrelin)；(k)CCL21；(1)CXCL12；(m)SDF-1；(n)M-CSF；(o)MCP-1；(p)内皮糖蛋白；(q)GnRH；(r)TRH；(s)嗜酸细胞活化趋化因子；(t)缓激肽；(u)BLC；(v)肿瘤坏死因子α；(w)淀粉样β肽(Aβ1-42)；(x)Aβ1-6；(y)血管紧张肽；(z)CCR5胞外域；(aa)CXCR4胞外域；(bb)胃泌素；(cc)CETP；(dd)C5a；(ee)缓激肽；(ff)Des-Arg缓激肽；(gg)(a)-(ff)的片段；(hh)(a)-(ff)的变体。上述自身抗原、其片段或变体的详细描述已经在WO02/056905的第56页最后一段到第86页第一段公开。这些公开内容在此引用作为参考。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是IL-23 p19蛋白，或更优选IL-23 p19片段，如PCT/EP2005/004980所述，其在此完整引入作为参考。可用于本发明的特别优选的片段是PCT/EP2005/004980中公开的SEQ ID NO：4-15、SEQ ID NO：52和53。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是GnRH或其片段。PCT/EP2005/053858中公开了在疫苗生产中有用的VLP-GnRH偶联物，在此完整引入作为参考。在一个优选实施方案中，GnRH(EHWSYGLRPG(SEQ ID NO：20)或QHWSYGLRPG(SEQ ID NO：114))在AP205外壳蛋白的C末端处融合。这种含有GnRH作为至少一种抗原的修饰的VLP可以向诸如猪的哺乳动物施用，以防止肉的膻味。这种含有GnRH的修饰的VLP可以向诸如狗、猫、绵羊、牛的动物施用，以控制它们的繁殖行为和/或减少它们的繁殖力。这种含有GnRH的修饰的VLP可以向患有类固醇性激素依赖的癌症的人施用。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是生长素释放肽或其变体或片段。在生产治疗肥胖症和其他与食物摄入增加或体重增加有关的疾病的疫苗中有用的VLP-生长素释放肽偶联物已经在公开号为WO04/009124的PCT专利申请中公开，其公开内容在此完整引入作为参考。可用于本发明的特别优选的生长素释放肽或片段是WO04/009124的SEQ ID NO：31-32，48-56，59-63和111-119，以及猫生长素释放肽、其变体或片段、狗生长素释放肽、其变体或片段。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原是具有SEQ ID NO：54的人生长素释放肽的氨基酸序列的生长素释放肽，或其相应的来自其他哺乳动物如狗或猫的直向同源物。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原是包含SEQ ID NO：54的氨基酸3-7的生长素释放肽片段。优选地，所述生长素释放肽片段总共具有最多28个，优选最多25个，更优选最多20个氨基酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述生长素释放肽片段包含SEQ ID NO：54的氨基酸3-7，包含或者优选由SEQ ID NO：54的18个连续氨基酸，优选16个，更优选14个连续氨基酸组成。在一个优选实施方案中，所述生长素释放肽片段包含或者由SEQ ID NO：55的氨基酸组成。在一个优选实施方案中，所述生长素释放肽片段包含或者由SEQ ID NO：56的氨基酸序列组成。在一个优选实施方案中，所述生长素释放肽片段包含或者由SEQ ID NO：57的氨基酸序列组成。在一个优选实施方案中，所述生长素释放肽片段包含或者由SEQ ID NO：58(对于狗而言)和SEQ ID NO：59(对于猫而言)的氨基酸序列组成。
在一个特别优选的实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由血管紧张肽、其变体或片段组成。在生产用于治疗高血压的疫苗中有用的VLP-血管紧张肽偶联物已经在申请号为WO03/031466的PCT专利申请中公开，其在此完整引入作为参考。可用于本发明的特别优选的蛋白质或片段是Angio I：DRVYIHPF(SEQ ID NO：15)，Angio XVIII：DRVYIHP(SEQ ID NO：115)和血管紧张肽I：DRVYIHPFHL(SEQ IDNO：116)。在本发明的一个优选实施方案中，Angio I与AP205外壳蛋白的C末端融合。
在一个特别优选的实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由淀粉样β肽片段组成。一种特别优选的这样的片段是Aβ1-6(DAEFRH，SEQ ID NO：117)，它在公开号为WO04/016282的PCT专利申请中公开，其在此完整引入作为参考。
在一个特别优选的实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由TNF-α、其变体或片段组成。可用于本发明的优选的TNF-α片段已经在PCT/EP2005/005935和PCT/EP2005/005936中公开。这两篇申请的完整内容在此引入作为参考。在一个非常优选的实施方案中，所述至少一种抗原是小鼠TNF-α序列的氨基酸4-23(SEQID NO：41)。在一个进一步优选的实施方案中，所述抗原与AP205外壳蛋白的C末端融合。在本发明的一个优选实施方案中，含有至少一种融合蛋白的修饰的VLP，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO：41，用作人用疫苗。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是CXCR4，优选CXCR4胞外域，更优选CXCR4胞外域的片段。趋化因子受体CXCR4，也被称为LESTR或融合素，属于七跨膜域G-蛋白偶联受体家族(Federsppiel等人(1993)，Genomics 16：707)。CXCR4的唯一已知的配体是SDF-1(Pelchen-Mattews，等人(1999)Immunol.Rev.168：33)。CXCR4后来被确定为HIV的共同受体(Feng等人(1996)Science272：872)。因此，对于进入而言需要CXCR4的HIV株被分类为X4株。SDF-1已经显示阻止HIV-1的进入(Oberlin等人(1996)，Nature382：833；Bleul，等人(1996)Nature 382：829)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由CXCR4胞外域的片段组成。CXCR4胞外域的片段具有至少6、7个，优选至少8、9、10个氨基酸，CCR5胞外域的片段具有少于30个，优选20个，更优选15个，甚至更优选12个氨基酸。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由CXCR4的N-末端胞外域组成。在一个进一步优选的实施方案中，CXCR4的N-末端胞外域包含或者由SEQ ID NO：48组成。在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由CXCR4胞外域ECL2的片段组成。优选地，所述片段具有至少6个，优选7个氨基酸。在另一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由具有SEQ ID NO：49所示氨基酸序列的CXCR4胞外域ECL2的片段组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是CCR5，优选CCR5胞外域，更优选CCR5胞外域的片段。HIV R5株利用细胞表面分子CD4和CCR5附着并进入巨噬细胞和CD4+T细胞。CCR5是一种七跨膜受体，具有4个胞外域：一个N末端序列，和三个暴露于胞外间隙的环，它们后来分别被称为PNt、ECL-1、ECL-2和ECL-3。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由CCR5胞外域的片段组成。CCR5胞外域的片段具有至少6或7个，优选至少8、9或10个氨基酸，CCR5胞外域的片段具有不到3 5个，优选不到30个，优选不到20个，更优选不到15个，甚至更优选不到12个氨基酸。
在一个优选实施方案中，所述CCR5胞外域的片段包含或者由ECL2A组成。如本领域中公知的，ECL2A优选地开始于ECL2的第一个氨基酸，优选地终止于在ECL2中恰好位于半胱氨酸之前的苏氨酸。在一个进一步优选的实施方案中，ECL2A包含或者由SEQ ID NO：46组成。在一个优选实施方案中，本发明的抗原包含或者由CCR5胞外域PNt组成。在一个进一步优选的实施方案中，PNt域包含或者优选由SEQ ID NO：45组成。在一个优选实施方案中，本发明的抗原包含或者由CCR5胞外域ECL2组成。在一个进一步优选的实施方案中，ECL2域包含或者优选由SEQ ID NO：91组成。优选或者可替代地，PNt或ECL2序列中天然存在的半胱氨酸已经被置换为丝氨酸。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是胃泌素和/或前胃泌素。胃泌素(G17)是一组经典的肠肽激素，它们在结肠和胰脏中含量非常低(Koh，Regulatory Peptides.93，37-44(2000))。胃泌素是从它的前体前胃泌素(G34)加工而来的。胃泌素和前胃泌素都以C末端甘氨酸延伸的形式和C末端苯丙氨酸酰胺化的形式存在。众所周知胃泌素具有刺激胃酸分泌的能力(Pharmacol Ther.98，109-127(2003))。最近的数据提示胃泌素可能促进胃肠道癌症的发生。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者优选地由G17(SEQ ID NO：47)组成。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由在C末端增加有甘氨酸的G17组成。在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由前胃泌素G34(SEQ IDNO：60)组成。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由在C末端增加有甘氨酸的前胃泌素G34组成。在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由G171-9片段(SEQ ID NO：61)组成，优选地具有与其C末端融合的连接序列，更优选地具有与C末端融合的连接序列SSPPPPC。
应当指出，作为胃泌素序列部分的序列EGPWLEEEE的位点1处的E可以是E、pyro E或Q。当另外的氨基酸融合到EGPWLEEEE的N端时，序列EGPWLEEEE的位点1处的E可以是E，或者优选Q。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是C5a。C5a是74个氨基酸的四螺旋束糖蛋白(Fernandez和Hugli，J.Biol.Chem.253，6955-6964，1978)，负责产生针对细胞系统，特别是嗜中性粒细胞、内皮细胞和巨噬细胞的大量多样化效应，以诱导局部炎症来对抗传染性微生物(Ward P.，Nat.Rev.Immunol.4：133，2004)。但是，通过相同的方式，脓毒症中C5a的过量产生导致嗜中性粒细胞的严重的功能缺陷(Czermak等人，Nat.Med.5：788，1999；Huber-Lang等人，J.Immunol.166：1193，2001)。提高的C5a的活化也与许多原发和/或慢性炎性疾病有关，如类风湿性关节炎(Jose P.Ann Rheum.Dis.49：747，1990)、牛皮癣(Takematsu H.，Arch.Dermatol.129：74，1993)、成人型呼吸窘迫综合征(Langlois P.，Heart Lung 18：71，1989)、再灌注损伤(Homeister，J.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.34：17，1994)、狼疮肾炎和大疱性类天疱疮。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或由C5a组成。在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或由C5a片段组成。在一个进一步优选的实施方案中，所述C5a片段具有如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是CETP。胆固醇酯转移蛋白(CETP)是一种血浆糖蛋白，其介导胆固醇酯(CE)和甘油三酯(TG)在高密度脂蛋白(HDL)颗粒和富含apo B的颗粒如极低密度脂蛋白(VLDL)颗粒或低密度脂蛋白(LDL)颗粒之间的交换。使用小分子抑制剂、反义寡核苷酸或活性免疫抑制兔中的CETP活性已经一致地显示出抗动脉粥样硬化作用(Barter，P.J.等人(2003)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.23：160-167)。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或由具有SEQ IDNO：51的氨基酸序列的CETP片段组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或由缓激肽组成。缓激肽(BK，KRPPGFSPFR，SEQ ID NO：52)是一种重要的血管扩张肽，在血压、血流和血管通透性的局部调节中起重要作用(Margolius H.S，等人，Hypertension，1995)。另外还描述了缓激肽的几种另外的生物活性，包括平滑肌收缩和舒张、伤害感受和痛觉过敏的诱导、和炎症反应的介导。缓激肽通过B2受体发挥其作用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原包含或者由des-Arg9-缓激肽组成。des-Arg9-BK(KRPPGFSPF，SEQ ID NO：53)与缓激肽既有重叠的也有不同的功能。证据表明des-Arg9-BK在组织损伤后快速产生，调节在炎症过程期间观察到的大多数事件，包括血管扩张、血管通透性提高、血浆外渗、细胞迁移、疼痛和痛觉过敏(CalixtoJ.B.等人，Pain 2000)。Des-Arg9-BK通过B1受体发挥其作用。在急性胸膜炎症模型中B1R-/-小鼠表现出强烈降低的炎症应答这一发现进一步强调了des-Arg9-BK在炎症过程中的重要性(Pesquero J.B.等人，PNAS，2000)。
BK和Des-Arg9-BK在原发性和慢性炎症疾病，特别是变应原或颗粒抗原如病毒诱导的关节炎和气管炎症中起作用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原适合于诱导针对变态反应的免疫应答，优选所述至少一种抗原是变应原、其变体或片段。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原选自：(a)参与蜂螯变态反应的多肽；(b)参与坚果变态反应的多肽；(c)参与食物变态反应的多肽；(d)参与哮喘的多肽；(e)参与屋尘螨变态反应的多肽；(f)参与花粉变态反应的多肽；(e)(a)至(d)的变体；和(f)(a)至(d)的片段。在另一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种抗原选自：(a)磷脂酶A2蛋白；(b)Bet vI(桦树花粉抗原)；(c)Dol mV(白面大黄蜂毒液变应原)；(d)蜂毒肽(Mellitin)；(e)a Der pI肽(屋尘螨变应原)，(f)(a)至(e)的变体；和(g)(a)至(e)的片段。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原适合于诱导针对多肽毒素的免疫应答，优选所述至少一种抗原是多肽毒素、其片段或变体。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原适合于诱导针对多肽激素的免疫应答，优选所述至少一种抗原是多肽激素、其片段或变体。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种抗原适合于在家畜或宠物中诱导免疫应答。在一个进一步优选的实施方案中，该抗原选自：(a)适合于诱导针对家畜或宠物的癌细胞的免疫应答的抗原；(b)适合于诱导针对感染家畜或宠物的至少一种微生物病原体的免疫应答的抗原；(c)适合于诱导针对家畜或宠物的至少一种自身抗原的免疫应答的抗原；和(d)适合于诱导针对多肽毒素或多肽激素的免疫应答的抗原。本申请中公开的可用于本发明的抗原的例子可以是来自人或动物来源的，因此当使用本发明的修饰的VLP作为疫苗用于动物时，后者是本发明的优选实施方案。术语“动物”包括，例如，人、绵羊、麋鹿、鹿、骡、貂、猴、马、公牛、牛、猪、山羊、狗、猫、鸡、鸭、大鼠和小鼠。优选的动物是脊椎动物，更优选的动物是真哺乳亚纲动物，更优选的动物是哺乳动物。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的融合蛋白还包含间隔区，并且其中所述间隔区位于所述第一多肽与所述第二多肽之间。间隔区的选择将取决于本发明的抗原的性质、其生物化学性质如pI、电荷分布和糖基化。通常，柔性间隔区是有利的。间隔区优选地不长于30个氨基酸，更优选不长于15个氨基酸。甘氨酸和丝氨酸残基是用于间隔区的特别有利的氨基酸，优选地间隔区包含至少一个甘氨酸或至少一个丝氨酸残基。间隔区可以含有其他氨基酸，优选丙氨酸、苏氨酸和荷电氨基酸。在一些情况下，间隔区也可以包含脯氨酸。添加间隔区通常是为了增加AP205外壳蛋白与至少一种抗原之间的距离。此外，间隔区也可以提供另外的柔性，这可以减少至少一种抗原序列融合到AP205外壳蛋白序列内的可能的去稳定效应，并且减少至少一种抗原的存在对装配的干扰。
在第一多肽和第二多肽之间构建间隔区可以通过重组DNA技术来实现。例如，一种常规的方法是将编码间隔区的核苷酸序列引入至少用来克隆本发明的抗原的引物序列内。或者，可以将编码间隔区的核苷酸序列引入用来将AP205外壳蛋白克隆到表达载体内的引物序列内，这产生一种质粒，该质粒表达具有在N或C末端融合的间隔区的AP205的外壳蛋白。
在一个优选实施方案中，间隔区具有最多15个氨基酸，优选最多13个，甚至更优选最多11个，再更优选最多8个氨基酸，进一步更优选最多4个，再进一步更优选最多3个氨基酸。
在本发明的一个特定实施方案中，间隔区的氨基酸序列选自：(a)GSGG；(b)GSG；(c)GTAGGGSG；(d)SGG；和(e)GSGTAGGGSGS。
在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原在该抗原的每一端的侧翼为至少1个，优选1个半胱氨酸。侧翼半胱氨酸可以天然存在于该抗原内或人工添加到该抗原上。这允许通过在两个侧翼半胱氨酸之间形成二硫键以环形形式呈现抗原，其可模拟该抗原的天然存在的构型。为了避免不期望的二硫键形成，优选地将抗原内天然存在的半胱氨酸置换，优选保守置换，更优选置换为丝氨酸，条件是这种置换不改变抗原的免疫原性。例如，CCR5的ECL2域在自然中作为7-跨膜受体的第二胞外域存在。因此，在一个优选实施方案中，第二多肽包含或者由环状ECL2或环状ECL2a组成。在一个进一步优选的实施方案中，第二多肽包含或者由SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：116或SEQ IDNO：74组成。
通过在10mM DTT存在下纯化修饰的VLP，接着用具有允许二硫键形成的pH(pH6.5至9，优选6.8至8.5，例如50mM Tris，150 mM NaCl，pH8.0)并且含有氧化型和还原型谷胱甘肽混合物(氧化还原混合物(redox shuffle))或催化二硫键形成的其他试剂如胱氨酸和半胱氨酸的氧化还原混合物的氧化缓冲液透析，可以促进抗原侧翼的两个半胱氨酸之间的二硫键的形成。该氧化还原混合物可以含有例如0.1-5mM还原型谷胱甘肽和0.1-5mM氧化型谷胱甘肽。优选地，该混合物是氧化型的。氧化型与还原型谷胱甘肽的有用的比例例如是(单位为mM)5/0.2，5/0.5，5/1，5/2，1/1，2/2，1/0.2，1/0.5，2/0.2，2/0.5，2/1。在一种替代方法中，半胱氨酸与氧化型谷胱甘肽(例如1-50mM)或连四硫酸钠(例如5mM)反应，透析除去过量的试剂，在例如由还原型谷胱甘肽(0.1-5mM)、二硫苏糖醇(0.1-10mM)、β-巯基乙醇(0.1-10mM)或半胱氨酸(0.1-10mM)催化的二硫键交换反应中闭合内环二硫键。随后，氧化的VLP制剂进一步用50mM Tris，150mM NaCl，pH8.0或PBS或20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2透析，并且可以注射到小鼠中，来测试展示的表位的免疫原性和诱导的抗体的特异性。
使用对于环状构象的肽具有特异性的抗体，根据经验测试用于形成二硫键的最适条件。在一种实验设置中，把展示将要被氧化为环状构象的肽的修饰的VLP包被到ELISA板上，然后用如上所述的各种缓冲液条件在该板上处理，最后使用对于环状构象的肽具有特异性的抗体通过ELISA测定。
在一个优选实施方案中，第二多肽包含、基本由或者由选自下组的氨基酸序列组成：(a)流感病毒M2肽(SEQ ID NO：43)；(b)乙型肝炎病毒Pre S1肽(SEQ ID NO：62)；(c)HIV Nef多肽(SEQ ID NO：23)；(d)GnRH(SEQ ID NO：20)；(e)胃泌素G17(SEQ ID NO：47)；(f)猫生长素释放肽(SEQ ID NO：59)；(g)狗生长素释放肽(SEQ ID NO：58)；(h)HIV Env肽1(SEQ ID NO：98)；(i)HIV Env肽2(SEQ ID NO：99)；(j)CCR5 PNt(SEQ ID NO：45)；和(k)CCR5 ECL2(SEQ ID NO：91)。
在一个优选实施方案中，本发明的修饰的VLP是嵌合VLP。在一个进一步优选的实施方案中，除了本发明的融合蛋白以外，嵌合VLP还包含至少一种蛋白质，其中所述蛋白质的氨基酸序列不同于本发明的融合蛋白。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，所述蛋白质是AP205的外壳蛋白。在另一个进一步优选的实施方案中，所述蛋白质选自：(a)SEQ ID NO：1；(b)SEQ ID NO：2；(c)SEQ ID NO：42；和(d)SEQ ID NO：67；(e)SEQ ID NO：68；(f)SEQ ID NO：69和(g)SEQ IDNO：1或67的突变蛋白。提供AP205的外壳蛋白或其突变蛋白有利于本发明的融合蛋白装配为修饰的VLP，并且稳定化形成的修饰的VLP。现有技术中有各种方法可以用来在一种宿主细胞中，优选在细胞中表达具有不同序列的蛋白质。一种优选方法是在编码第一多肽的核苷酸序列的3′端符合读框地构建一个允许抑制的终止密码子，如乳白或琥珀终止密码子。当核苷酸序列在细菌宿主中表达时，将产生具有两种不同长度的蛋白质。当翻译机制识别终止密码子并终止翻译时，将产生AP205的外壳蛋白。当翻译机制抑制终止密码子并进一步翻译mRNA时，将产生本发明的融合。
在一个优选实施方案中，本发明的噬菌体AP205的修饰的VLP还包含至少一种免疫刺激物。优选地，该免疫刺激物是Toll样受体配体，优选选自：(a)免疫刺激性核酸；(b)肽聚糖；(c)脂多糖；(d)脂磷壁酸；(e)咪唑并喹啉化合物；(f)鞭毛蛋白；(g)脂蛋白；(h)免疫刺激性有机分子；(i)含有非甲基化CpG的寡核苷酸；和(j)(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)和(i)的物质的任意混合物。本发明的组合物中含有至少一种免疫刺激物，优选至少一种Toll样受体配体，显著提高了该组合物的免疫原性，增强了B和T细胞应答。因此，还包含至少一种免疫刺激物的本发明的组合物可能是用于预防或治疗性地治疗变态反应、肿瘤和慢性病毒性疾病的理想的疫苗组合物。
在另一个优选实施方案中，免疫刺激性核酸优选选自：(a)细菌来源的核酸；(b)病毒来源的核酸；(c)包含非甲基化CpG基序的核酸；(d)双链RNA；(e)单链RNA；和(g)不含非甲基化CpG基序的核酸。不含非甲基化CpG基序的免疫刺激性核酸已经在本领域中公开，例如WO01/22972，其在此完整引入作为参考。如本文使用的术语“核酸”是指由线性共价连接的单体(核苷酸)组成的分子。它是指核苷酸的分子链，不是指特定长度的产物。因此，寡核苷酸包括在核酸的定义内。核苷酸之间的键典型且优选地是磷酸二酯链。包含键修饰例如硫代磷酸键的核酸也包括在本发明内。
在一个优选实施方案中，免疫刺激性核酸优选选自：(a)含有免疫刺激性序列特别是侧翼碱基内的非甲基化CpG二核苷酸(称为CpG基序)的细菌DNA，和(b)由各种类型的病毒合成的双链RNA。在一个进一步优选的实施方案中，免疫核酸包含或者基本由或者由双链RNApoly I：C组成。
在一个优选实施方案中，含有非甲基化CpG的寡核苷酸包含序列：5′X1X2CGX3X4 3′，其中X1、X2、X3、X4是任意一种核苷酸。优选地，该寡核苷酸可以包含优选约20个到约300个核苷酸。在一个优选实施方案中，含CpG的寡核苷酸含有1个或多个磷酸骨架的硫代磷酸修饰。在一个可替代的优选实施方案中，含CpG的寡核苷酸不含磷酸骨架的硫代磷酸修饰。在一个优选实施方案中，含非甲基化CpG的寡核苷酸包含或者由TCCATGACGTTCCTGAATAAT(SEQ IDNO：94)组成。
在一个进一步优选的实施方案中，含非甲基化CpG的寡核苷酸包含或者基本由或者由回文序列组成。在一个进一步优选的实施方案中，所述回文序列的侧翼为鸟嘌呤核苷酸，优选至少4或6个，更优选至少8或10个鸟嘌呤核苷酸。在一个优选实施方案中，含有非甲基化CpG的寡核苷酸包含或者由GGGGTCAACGTTGAAGGGGGG(SEQID NO：95)组成。
在一个优选实施方案中，所述回文序列包含、或者基本由、或者由GACGATCGTC(SEQ ID NO：70)组成。在一个非常优选的实施方案中，含有非甲基化CpG的寡核苷酸包含、或者基本由、或者由序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：71)组成。
其他有用的免疫刺激性核酸序列已经在公开的WO2004/085635中公开，其公开内容在此引入作为参考。免疫刺激物，特别是免疫刺激性核酸，更特别的是含有非甲基化CpG的寡核苷酸的详述已经在WO03/024480、WO03/024481和PCT/EP/04/003165中公开。
在一个优选实施方案中，免疫刺激物与修饰的VLP混合。在另一个优选实施方案中，免疫刺激物与修饰的VLP结合，优选被包装于修饰的VLP内。混合免疫刺激物和VLP-抗原的方法已经在WO03/024480中公开。将免疫刺激物包装到VLP内的方法已经在WO03/024481中公开。WO03/024480、03/024481和PCT/EP/04/003165的完整申请因此在此引入作为参考。而且，包装的核酸和CpG分别受到保护而免遭降解，即它们更加稳定。而且，来自先天免疫系统的细胞的非特异性激活明显降低。
在一个方面，本发明提供一种包含本发明的修饰的病毒样颗粒(VLP)的疫苗组合物，优选地该疫苗组合物进一步包括缓冲液。在一个实施方案中，该疫苗组合物进一步包括佐剂。至少一种佐剂的施用可以在施用本发明的组合物之前、同时或之后进行。佐剂有利于树突细胞的靶向，含有激活树突细胞的物质，或诱导局部抗原储库(depot)的形成。至少一种佐剂的例子包括并且优选由完全和不完全弗氏佐剂、氢氧化铝、铝盐和修饰的胞壁酰二肽组成。其他佐剂有矿物质凝胶如氢氧化铝、表面活性剂如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油状乳剂、匙孔戚血蓝蛋白、二硝基酚，以及可能有用的人用佐剂，如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂也是本领域公知的。可与本发明的组合物一起施用的其它佐剂包括但不限于：单磷酰脂质免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294，和病毒体佐剂技术。其他佐剂包括免疫刺激性核酸，优选地的该免疫刺激性核酸在骨架中含有一个或多个修饰，优选硫代磷酸酯修饰。这种修饰使核酸对降解稳定。
佐剂也可包括这些物质的混合物。但是，在本申请上下文中使用的术语“佐剂”是指这样一种佐剂，它不是本发明的修饰的VLP，并且如合适时不是包装在修饰的VLP内的免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸，而是除了所述修饰的VLP，和合适时除了包装在修饰的VLP内的免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸。
在一个优选实施方案中，疫苗组合物不含佐剂。因此，优选地向患者施用本发明的疫苗组合物而不需在施用该疫苗之前、同时或之后向同一名患者施用至少一种佐剂。本发明的一个有利的特征是组合物的高免疫原性，甚至在不含佐剂时。而且，不含佐剂使得不希望的炎症T细胞应答的发生减至最少，这是接种中，特别是针对自身抗原的接种中的一个安全性问题。
本发明进一步公开了一种免疫方法，包括向动物或人施用本发明的疫苗。动物优选的是哺乳动物，如猫、绵羊、猪、马、牛、狗、大鼠、小鼠，特别是人。疫苗可以用本领域所知的各种方法向动物或人施用，但是通常通过注射、输注、吸入、口服或其他适当的物理方法来施用。或者，偶联物可以肌肉内、静脉内、经粘膜、经皮、鼻内、腹膜内或皮下施用。用于施用的偶联物的成分包括无菌水溶液(例如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和注射用有机酯如油酸乙酯。可以利用载体或封闭敷料提高皮肤通透性并促进抗原吸收。
抗原的性质、导入体内的途径、剂量和剂量方案、抗原的重复性质、宿主背景或免疫系统的信号因素可能影响免疫应答的性质。免疫应答可以通过应用本领域公知的理论和常规实验这两方面来调整。如果接受个体能够耐受本发明的疫苗的施用，则认为该疫苗是“药学可接受的”。进而，本发明的疫苗将以“治疗有效量”(即产生希望的生理学效果的量)施用。免疫应答的性质或类型不是本申请公开内容的限制因素。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，包含：(a)本发明的修饰的VLP；和(b)药学上可接受的载体。当向个体施用本发明的疫苗时，它可以是含有盐、缓冲液、佐剂或其他改善偶联物有效性所需的物质的形式。适合在制备药物组合物中使用的材料的例子在许多来源中提供，包括REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol，A，ed.，Mack Publishing Co.，(1990))。
在另一方面，本发明提供一种治疗或预防个体中的疾病、病症或生理状况的方法，其中所述方法包括向动物或人施用本发明的修饰的VLP或本发明的疫苗组合物或本发明的药物组合物。在另一方面，本发明提供修饰的VLP在制备用于治疗或预防动物或人中的疾病、病症或生理状况的药物中的用途。
在一个方面，本发明提供一种生产本发明的修饰的VLP的方法，包括以下步骤：(a)(任选地)符合读框地连接编码间隔区的核苷酸序列和编码第一多肽的第一核苷酸序列或编码第二多肽的第二核苷酸序列；(b)符合读框地连接所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列，得到编码所述融合蛋白的第三核苷酸序列；(c)(任选地)引入终止密码子，该终止密码子在第一核苷酸序列的3′处引起抑制；(d)在宿主中表达所述第三核苷酸序列，优选在形成的表达的蛋白质能够形成所述修饰的VLP的条件下进行；和(e)纯化由步骤(d)获得的所述修饰的VLP。
在一个方面，本发明提供一种含有多肽的融合蛋白，其中所述多肽与AP205噬菌体的外壳蛋白或其突变蛋白的N-或C-末端或这两个末端融合，其中优选地所述多肽由1-60个氨基酸组成，优选由3-40个、更优选5-30个、再更优选10-25个氨基酸、再更优选1-15个、再更优选3-15个、更优选1-11个、更优选3-11个、更优选1-8个、更优选3-8个氨基酸组成；其中所述融合蛋白能够形成VLP。
在另一个优选实施方案中，将要与AP205噬菌体的外壳蛋白或其突变蛋白的末端融合的多肽具有不到30个氨基酸，优选不到20个氨基酸，更优选不到15个氨基酸，甚至更优选不到10个氨基酸。
在一个进一步优选的实施方案中，多肽与AP205的外壳蛋白或其突变蛋白的N-或C-末端或这两个末端融合，该外壳蛋白或其突变蛋白选自：(a)SEQ ID NO：1；(b)SEQ ID NO：2；(c)SEQ ID NO：42；(d)SEQID NO：67，(e)SEQ ID NO：68；(f)SEQ ID NO：69；和(g)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：67的突变蛋白。
在另一方面，本发明提供一种编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。由于遗传密码的简并性，突变蛋白的一种氨基酸序列可以被一种以上的核苷酸序列编码。因此本发明包括编码突变蛋白的相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
实施例
实施例1
用于将抗原融合到AP205外壳蛋白的N-和C-末端的质粒的构建
当在下文描述的克隆工作中提到AP205外壳蛋白的N末端时，术语“N末端”是指第一个丙氨酸，而不是起始甲硫氨酸。
构建体378-2：在AP205外壳蛋白的N末端添加短GSGG间隔区和在编码该间隔区的核酸序列内的NcoI和Kpn2I克隆位点。
使用pAP283-58(SEQ ID NO：3)作为模板，使用含有NcoI-限制性位点的上游引物p2.561(SEQ ID NO：4)和含有HindIII-限制性位点的下游引物p1.46(SEQ ID NO：5)，通过PCR进行此构建。用NcoI和HindIII消化PCR片段，并且将其克隆到pQb185的相同限制性位点中，产生质粒pAP378-2。
构建体382-2：通过PCR在AP205外壳蛋白的N末端添加长GSGTAGGGSGS间隔区和在编码所述间隔区的核酸序列内的NcoI和Kpn2I克隆位点。
这种构建通过PCR进行，使用378-2作为模板，使用含有NcoI的上游引物p2.589(SEQ ID NO：6)和含有HindIII限制性位点的下游引物p1.46(SEQ ID NO：5)。用NcoI和HindIII消化PCR片段，将其克隆到pQb185的相同限制性位点内，产生质粒pAP382-2。
构建体：409-44：在AP205外壳蛋白的C末端添加短GSG间隔区和在编码所述间隔区的核酸序列内的Kpn2I和Mph1103I克隆位点。
这种构建通过PCR进行，使用质粒pAP283-58(SEQ ID NO：3)作为模板，使用含有XbaI的上游引物p1.45(SEQ ID NO：7)和含有Mph1103I限制性位点的下游引物p2.587(SEQ ID NO：8)。用XbaI和Mph1103I消化PCR片段，并将其克隆到pQb10内的相同限制性位点内，产生质粒pAP409-44。
构建体405-61：在AP205外壳蛋白的C末端添加长GTAGGGSG间隔区和在编码它的核酸内的Kpn2I和Mph1103I克隆位点。
这种构建通过PCR进行，使用409-44作为模板，使用含有XbaI的上游引物p1.45(SEQ ID NO：7)和含有Mph1103I限制性位点的下游引物p2.588(SEQ ID NO：9)。用XbaI和Mph1103I消化PCR片段，并将其克隆到pQb10内的相同限制性位点内，产生质粒pAP405-61。
为了简单起见，在下文中将构建体378-2，382-2，409-44，405-61及其相应的质粒称为378，(pAP378)，382(pAP382)，409(pAP409)和405(pAP405)。在下面的实施例中，已经将各种抗原克隆到上述载体内。
为了检测连接序列对颗粒装配的影响，如实施例2所述表达了来自构建体378的蛋白质，并通过EM和免疫扩散(Ouchterlony)试验证实VLP的装配。
实施例2
AP205融合蛋白的表达
用相应的AP205融合蛋白质粒转化大肠杆菌JM109细胞。种子培养物如下制备：将在含有100mg/l氨苄青霉素的琼脂上生长的单个菌落接种到含有20mg/l氨苄青霉素的LB培养基上，并将该培养物在不振摇的条件下37℃培养过夜。为了表达，将过夜培养物用添加有酪蛋白氨基酸(Difco)并且含有20mg/l氨苄青霉素的M9培养基1∶50稀释，在37℃和剧烈通气下进行培养物的生长14-20小时。在4-8℃下以6000rpm离心15′-20′收集细胞。
实施例3
含有与D2肽融合的外壳蛋白的融合蛋白的修饰VLP的克隆、表达和纯化
D2肽在AP205外壳蛋白C末端的克隆
编码D2肽(TSNGSNPSTSYGFAN，SEQ ID NO：10)的DNA片段通过使两种寡核苷酸-oligo2.196(SEQ ID NO：11)和oligo 2.197(SEQID NO：12)退火而产生。获得的片段用Kpn2I和Mph1103I消化，并且克隆到pAP409-44和pAP405-61的相同限制性位点内，处于大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制下。获得的构建体是：
418-7(基于409-44)：AP205外壳蛋白-GSG-D2肽
420-21(基于405-61)：AP205外壳蛋白-GTAGGGSG-D2肽。
D2肽在AP205外壳蛋白N末端的克隆
编码D2肽(TSNGSNPSTSYGFAN，SEQ ID NO：10)的片段通过使两种寡核苷酸-oligo2.590(SEQ ID NO：13)和oligo 2.591(SEQ IDNO：14)退火而产生。获得的片段用NcoI和Kpn2I消化，并且将其克隆到载体pAP378-2和pAP382-2的相同限制性位点内。获得的构建体是：
421-8(基于378-2)：MG-D2肽-GSGG-AP205外壳蛋白。该克隆过程的结果是，SEQ ID NO：1的氨基酸14被改变为天冬氨酸。
422-2(基于382-2)：MG-D2肽-GSGTAGGGSGS-AP205外壳蛋白。为了简便起见，构建体418-7，420-21，421-8和422-2在下文中被称为418，420，421和422。
纯化
用于所有纯化步骤的标准缓冲液是NET缓冲液：20mM Tris-HCl，pH7.8，含有5mM EDTA和150mM NaCl。
细胞裂解物过CL-4B柱纯化，合并的洗脱级分通过CsCl梯度超速离心进一步纯化。纯化的蛋白质的浓度通过Bradford试验确定。
抗原的展示用抑制ELISA检测，其中肽D2与RNase通过氨基酸间隔区(CGG)和交联剂SPDP偶联，并且包被在ELISA板上，而展示D2肽的VLP与针对装配为VLP的D2-Fr融合蛋白的抗-D2兔抗血清一起温育。用驴抗兔HRP偶联物进行检测。
如ELISA所示，所有4种修饰的VLP(在N或C末端具有短或长间隔区的D2肽)都抑制抗-D2抗血清与偶联到RNase上并且包被到板上的D2肽的结合，表明在由4种融合蛋白装配的修饰的VLP上展示了D2肽(图2)。
此外，通过凝胶过滤纯化的所有4种修饰VLP的电子显微镜照片都证实了衣壳的装配(图1)。
实施例4
小鼠的免疫和对使用展示D2肽的AP205的修饰VLP引起的免疫应答的分析
小鼠(每组n＝3)在第0天和第14天用来自构建体418-7，420-21，421-8和422-2的25μg蛋白质皮下免疫，这些蛋白质在下文中称为418，420，421和422。这些蛋白质用PBS稀释到终体积为200μl，将100μl注射到每只动物的左和右腹股沟区。动物在第14天和第21天采血，通过ELISA检测抗体应答。简言之，使用交联剂SPDP将在其N末端含有氨基酸序列CGG的D2肽的变体与RNase偶联。得到的偶联物在4℃包被过夜。血清的结合用辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG偶联物检测。
所有4种修饰的VLP都引起高效价的针对D2肽的抗体应答，而使用免疫前血清未检测到血清的结合，表明结合的特异性。测定产生半数最大结合的稀释度作为效价，三只动物的平均效价对于构建体418为10700±8600，对于构建体420为1∶10200±3000，对于构建体421为1∶7900±5500，对于构建体422为1∶2018±2500。
实施例5
展示Angio I肽的AP205的修饰VLP的克隆、表达和纯化
Angio I肽在AP205外壳蛋白C末端的克隆
编码Angio I肽(DRVYIHPF，SEQ ID NO：15)的片段通过使两种寡核苷酸-oligo3.216(SEQ ID NO：16)和oligo3.217(SEQ ID NO：17)退火而产生。获得的片段用Kpn2I和Mph1103I消化，并且克隆到载体pAP409-44和pAP405-61的相同限制性位点内，处于大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制下。新的构建体是：
441-9(基于409-44)：AP205外壳蛋白-GSG-DRVYIHPF
442-7(基于405-61)：AP205外壳蛋白-GTAGGGSG-DRVYIHPF。
Angio I肽在AP205外壳蛋白N末端的克隆
具有氨基酸序列DRVYIHPF(SEQ ID NO：15)的肽在此被称为Angio I肽。编码Angio I肽的片段通过使两种寡核苷酸-oligo3.218(SEQ ID NO：18)和oligo3.219(SEQ ID NO：19)退火而产生。获得的片段用NcoI和Kpn2I消化，并且克隆到载体pAP378-2和pAP382-2的相同限制性位点内。新的构建体是：
446-6(基于378-2)：MG-DRVYIHPF-GSGG-AP205外壳蛋白
447-9(基于382-2)：MG-DRVYIHPF-GSGTAGGGSGS-AP205外壳蛋白
为了简便起见，构建体441-9，442-7，446-6和447-9在下文中被称为441，442，446和447。
纯化
细胞通过在含有1mg/ml溶菌酶和0.1％Tween 20的Tris-缓冲的裂解缓冲液中冻融3个循环接着超声处理而裂解。裂解物通过离心澄清，得到裂解物1，将沉淀物再次用裂解缓冲液提取，得到裂解物2。然后通过凝胶过滤步骤的组合进一步纯化上清液，将得到的纯级分混合。
对于每种构建体的凝胶过滤步骤的组合在下面描述：
构建体441：首先将裂解物1加样到Sepharose CL-2B上，然后加至Sepharose 6B柱上。第二裂解物首先加到CL-4B上，然后加到CL-2B柱上。
构建体442：裂解物1首先加到CL-2B上，然后加到CL-4B上，最后加到sepharose 6B柱上。裂解物2首先加到CL-4B上，然后加到sepharose 6B柱上。
构建体446：裂解物1过CL-2B柱接着过sepharose 6B柱纯化。弃去裂解物2。
构建体447：裂解物1过CL-4B柱接着过sepharose 6B柱纯化。裂解物2过CL-4B柱纯化两次。
通过电子显微镜检查证实所有4种构建体都形成修饰的VLP。通过ELISA进一步证实在VLP上展示Angio I肽，由此以大约10μg/ml的浓度包被VLP，并且分别评估小鼠中产生的抗Angio I或Angio XVIII肽的两种抗血清的结合。所有4种修饰的VLP在ELISA中均为阳性，证实在修饰的VLP上展示Angio I肽。
实施例6
展示GnRH的AP205的修饰VLP的克隆、表达和纯化和小鼠的免疫
GnRH在AP205外壳蛋白C末端的克隆
编码GnRH肽(EHWSYGLRPG，SEQ ID NO：20)的DNA片段通过使两种寡核苷酸-oligo4.56(SEQ ID NO：21)和oligo4.57(SEQ IDNO：22)退火而产生。获得的片段用Kpn2I和Mph1103I消化，并且克隆到载体pAP405-61的相同限制性位点内，处于大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制下。得到的构建体是：
489-7(基于405-61)：AP205外壳蛋白-GTAGGGSG-EHWSYGLRPG，为了简便起见，该构建体被称为构建体489。
纯化
细胞如实施例4所述裂解。将沉淀物用4份含有7M尿素和0.05MTris的缓冲液提取。将合并的上清液加到用NET缓冲液平衡的Sepharose CL-2B柱上，在sepharose 6B柱上再次层析。通过EM分析证实衣壳的装配。
用含有AP205外壳蛋白和GnRH的融合蛋白的修饰VLP免疫小鼠和免疫应答的分析
小鼠(每组n＝5)在第0天用50μg由构建体489表达的蛋白质皮下免疫。使用20mM Hepes pH7.2将该蛋白质稀释到终体积为200μl，将100μl注射到每只动物的左和右腹股沟区。动物在第21天采血，用ELISA测定抗体应答。简言之，使用交联剂SPDP将在其N末端含有氨基酸序列CGG的变异GnRH肽与RNAse偶联。得到的偶联物在4℃包被过夜。血清的结合用辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG偶联物检测。
来自构建体489的蛋白质引起高效价的针对GnRH肽的抗体应答，而使用免疫前血清未检测到血清的结合，表明结合的特异性。测定产生半数最大结合的稀释度作为效价，5只动物的平均效价为1:18329，标准差为9245。
实施例7
展示Nef55表位的AP205 VLP的克隆、表达和纯化
克隆
Nef55(SEQ ID NO：23)是来源于HIV Nef共有序列，并且选择的含有最高可能的T细胞表位数和溶解度的多肽。通过PCR从编码HIV Nef的另一种多肽Nef74多肽的DNA扩增Nef55。由通过PCR产生的编码氨基酸序列GVGFPVRPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLE和GPGIRYPLTFGWCFKLVPVEP的两个片段装配编码Nef55的DNA。该34个氨基酸的片段的扩增使用含有Kpn2I限制性位点的上游引物p3.242(SEQ ID NO：24)和下游引物p3.222(SEQ ID NO：25)。该21个氨基酸的片段的扩增使用上游引物p3.223(SEQ ID NO：26)和含有Mph1103I限制性位点的下游引物p3.225(SEQ ID NO：27)。使用与上述相同的上游和下游引物通过装配PCR实现片段的融合。获得的片段用Kpn2I和Mph1103I消化，并且克隆到载体pAP409-44和pAP405-61的相同的限制性位点中，处于大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制下。
得到的构建体是：
构建体457-17(基于409-44)：AP205外壳蛋白-GSG-Nef55
构建体459-35(基于405-61)：AP205外壳蛋白-GTAGGGSG-Nef55
为了简便起见，构建体457-17和459-35在下文中分别被称为457和459。
纯化
细胞如实施例4所述裂解。对于构建体457，合并的裂解物通过蔗糖梯度超速离心接着通过Sepharose 2B柱纯化。尽管在部分纯化的蛋白质的EM分析中可见衣壳，但是它们质量较差，可见大量半衣壳。
对于构建体459，将裂解物2加到Sepharose 2B柱(大小2.5×45cm)上，以2ml/h洗脱，用Amicon离心浓缩器浓缩，并加到Sephadex 2B柱上。进一步通过CsCl梯度超速离心纯化蛋白质两次。融合蛋白向VLP的装配通过EM分析证实，分析显示形状规则整齐的衣壳(图3)。
HHD小鼠表达一种嵌合单链I类分子，该分子具有共价连接到与Dbα3域融合的A2α1和α域的N末端上的人β2-微球蛋白(Firat，H.等人1999，Eur.J.Immunol.，29：3112)。这些小鼠中的HLA-A2转基因表达允许研究AP205-Nef55 VLP在体内引发CTL的能力。此外，也可以在体内研究佐剂作为ISS的作用。
HHD小鼠或者不予处理，或者通过皮下注射100μg AP205-Nef55进行免疫。8天后分离脾细胞，利用增殖测定中对于干扰素-γ的胞内细胞因子染色测定(对于Th细胞应答，Belshe R.B.等人，J.Inf.Dis.183：1343-1352(2001))、ELISPOT测定(Oxenius，A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：13747-13752(2002))或细胞毒性测定(Belshe R.B.等人，J.Inf.Dis.183：1343-1352(2001))分析T细胞的诱导，其中使用适当的HLA-A2限制性T细胞表位进行刺激，例如可以使用HIV表位和共有序列的在线数据库http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html进行鉴定所述表位。
实施例8
其中乳白密码子将Nef55与AP205外壳蛋白的C末端分开并且产生嵌合VLP的AP205的修饰VLP的克隆、表达和纯化
克隆
构建体459-35用作AP205外壳蛋白和Nef55编码序列的来源。通过两步PCR消化新构建体512，以便将乳白密码子引入编码外壳蛋白的序列和编码氨基酸间隔区GTAGGGSG的序列之间。
乳白密码子的引入使用反向PCR实验实现。使用引物p4.101(SEQID NO：28)和p4.102(SEQ ID NO：29)将反向引物设计为反向尾对尾的方向，并插入TGA。使用含有NcoI限制酶切位点的上游引物p1.44(SEQID NO：30)和下游引物p74-2(SEQ ID NO：31)，p74-2与位于构建体459-35中Nef56肽的C末端下游的非编码区23核苷酸互补。
用Nco I和Hind III消化PCR片段，并且将其克隆到pGEM-衍生的表达载体的相同限制性酶切位点内，处于大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制下，得到质粒pAP512-24。
得到的构建体是：
构建体512-24：AP205外壳蛋白-乳白密码子-GTAGGGSG-Nef55，为了简便起见，它在下文中被称为512。
表达
用质粒pAP512-24转化含有辅助质粒pISM3001的大肠杆菌JM109细胞，并且涂布于含有100mg/l氨苄青霉素和10mg/L氯霉素的LB琼脂上。如上所述进行后续的步骤，区别在于向所有培养基中添加10mg/L氯霉素。
纯化
细胞如实施例4所述裂解。裂解物1过Sepharose 4B柱(1.2×25cm)纯化，使用Tris，NaCl，EDTA缓冲液(NET缓冲液)以1ml/h洗脱。合并洗脱的级分，用Amicon离心浓缩器浓缩，并加到Sepharose 6B柱(1.2×35cm)上，以2ml/h洗脱。AP205外壳蛋白和融合蛋白的表达通过纯化的VLP的western blot分析加以证实，衣壳装配通过EM分析证实。
实施例9
在AP205外壳蛋白的N末端展示延长的p33肽的AP205的修饰VLP的克隆、表达和纯化
克隆
编码延长的p33肽(AKSLKAVYNFATMA，SEQ ID NO：32)的片段通过使两种寡核苷酸-oligo3.309(SEQ ID NO：33)和oligo3.310(SEQ ID NO：34)退火而产生。获得的片段用NcoI和Kpn2I消化，并克隆到载体378-2和382-2的相同限制酶切位点内，在大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制下。
得到的构建体是：
构建体466(基于382-2)：MAKSLKAVYNFATMA-GSGTAGGGSGS-AP205外壳蛋白。延长的p33肽含有CTL表位KAVYNFATM。
纯化
细胞如实施例4所述裂解。从裂解物2中分离的沉淀物另外用缓冲的7M尿素，pH7.5 Tris缓冲液提取。展示p33肽的修饰的VLP通过以NET缓冲液平衡的Sepharose 4B柱(1.2×25cm)纯化，并且以1ml/h洗脱。衣壳的装配通过用VLP校准的来自柱的洗脱体积来证实。
实施例10
与p33肽融合的fr外壳蛋白的克隆、表达和纯化
延长的p33肽的序列(KSLKAVYNFATMA，SEQ ID NO：32)含有p33 CTL表位(KAVYNFATM)。合成下列寡核苷酸：
5’CG AAA TCT CTT AAA GCG GTT TAC AAC TTC GCT ACC ATG GCT T(SEQ IDNO：39.)
5’CGA AGC CAT GGT AGC GAA GTT GTA AAC CGC TTT AAG AGA TTT(SEQ IDNO：40)
寡核苷酸1含有独特的Nco I位点，以利于克隆的筛选。该寡核苷酸用T4多核苷酸激酶于37℃处理30分钟，然后将混合物1，2加热到100℃3分钟，再缓慢冷却到室温。
载体的制备
质粒pFRd8在AsuII位点处于37℃切割3小时。纯化载体片段，并且将其连接到退火的oligo 1和2上。得到的构建体具有插入到fr外壳蛋白的氨基酸2和3之间的序列KSLKAVYNFATMA(被切割的N末端丙氨酸之后的初始丙氨酸为位点1)。
用于蛋白质纯化的细胞提取物的制备
用缓冲液A进行蛋白质纯化的初始步骤，包括细菌细胞裂解物的制备和超声处理。
缓冲液A：250mM NaCl，50mM Tris HCl pH7.2，5％甘油，2mMEDTA和加到20μg/ml的溶菌酶。
将1g细胞重悬浮在三倍体积的缓冲液A中，悬液在4℃温育20分钟，然后以200瓦特-秒将该悬液超声处理三个30秒的脉冲(burst)。经超声处理的悬液在10℃温育20分钟，此时加入等量的相同缓冲液以及1mM PMSF。如前所述超声处理该混合物，然后以10,000×g离心30分钟。沉淀物用3ml 4M尿素提取。
将Polyimin P(10％w/v pH7.2)缓慢加到上清液中至终浓度为0.35％w/v，浑浊的溶液以6,000g离心15分钟。上清液用35％饱和的硫酸铵沉淀，再搅拌溶液3小时，然后以8,000×g离心15分钟。将沉淀物重悬浮于1倍细胞体积(1ml)的缓冲液B中。
缓冲液B：1M NaCl，10mM Tris HCl pH7.2，5％甘油，1mMEDTA。
然后用50％饱和的硫酸铵沉淀上清液。将来自蛋白质制备每一步的等份进行SDS PAGE电泳，并且进行Western Blot分析。样品用于以后在柱层析中的纯化和蔗糖梯度离心。
通过EM分析使用缓冲液B中的35％饱和的硫酸铵沉淀获得的蛋白质制品，但是未检测到衣壳。但是，在Sephacryl S-200或SephacrylS-400凝胶过滤柱上纯化分析量的蛋白质用于比较。用含有Tris-HClpH7.2，0.5M NaCl，1mM EDTA的缓冲液洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE分析收集的12个级分。收集对应于sephacryl 400电泳峰的级分，并进行EM(电子显微镜)分析。电子显微镜分析在纯化的级分中未检测到任何颗粒，表明p33肽与fr外壳蛋白的融合阻止了衣壳的装配。
实施例11
将各种抗原与AP205的外壳蛋白融合
用于将抗原融合到具有长间隔区或短间隔区的AP205外壳蛋白的N-末端(构建体378-2和382-2)或C末端(构建体409-44和405-61)的4种质粒从实施例1获得。这4种载体含有独特的限制酶切位点，将要与AP205融合的序列可以插入该位点内。简言之，合成两个互补寡核苷酸，其含有在各自载体中存在的限制酶切位点并且编码将要与AP205编码序列符合读框地融合的所需氨基酸序列(见下文)。当在AP205的C末端进行融合时，在编码序列的末端也包括终止密码子。然后使这两个寡核苷酸退火，并用适当的限制性酶消化，并且将其克隆到相应的AP205融合表达载体中。
编码CCR5胞外域片段ECL2A(SEQ ID NO：46，RSQKEGLHYT)的核苷酸序列符合读框地连接到所有4种质粒内。
编码CXCR4 176-185(SEQ ID NO：49)的核苷酸序列符合读框地连接到所有4种质粒内。
编码人C5a片段55-74(SEQ ID NO：46)的核苷酸序列符合读框地连接到所有4种质粒内。
编码胃泌素G17(SEQ ID NO：47，EGPWLEEEEEAYGWMDF)的核苷酸序列符合读框地连接到所有4种质粒内。
编码CETP片段461-476(SEQ ID NO：51)的核苷酸序列符合读框地连接到所有4种质粒内。
编码缓激肽(SEQ ID NO：52)的核苷酸序列符合读框地连接到所有4种质粒内。
编码des-Arg-缓激肽(SEQ ID NO：53)的核苷酸序列符合读框地连接到所有4种质粒内。
上述融合蛋白的表达和纯化基本上与实施例2和3所述相同。为了检查AP205融合蛋白形成VLP，通过电子显微镜术分析样品。
实施例12
使用与各种抗原融合的AP205外壳蛋白的VLP免疫小鼠
在第0天和第14天用从实施例11获得的AP205融合蛋白的VLP的25μg蛋白质皮下免疫小鼠(每组n＝3)。用PBS将蛋白质稀释至终体积为200μl，将100μl注射到每只动物的左和右腹股沟区。动物在第14和21天采血，用ELISA测定抗体应答。
简言之，将待测抗原与RNase通过氨基酸间隔区(CGG)和交联剂SPDP偶联，并且在ELISA板上4℃包被过夜。用辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG偶联物检测血清的结合。
实施例13
使用与GnRH融合的AP205外壳蛋白的VLP免疫猪
如实施例6所述，在第0天用从构建体489表达和纯化的400μg蛋白质皮下免疫猪(每组n＝2)。用含有终浓度为15％的DEAE葡聚糖作为佐剂的5mM磷酸盐/100mM NaCl缓冲液，pH6.8将蛋白质稀释到终体积为1mL。在每只动物的耳后皮下注射疫苗。对照动物(每组n＝2)用在20mM Hepes缓冲液pH7.2中制备并且含有15％DEAE葡聚糖的1mL QβVLP(0.4mg/mL)免疫。在第28天用等量的用于初始免疫的疫苗组合物对动物进行加强免疫。动物在第28、49天采血，用ELISA检测抗体应答。简言之，使用交联剂SPDP将在N末端含有氨基酸序列CGG的变异GnRH肽与RNAse偶联。得到的偶联物在4℃包被过夜。血清的结合用辣根过氧化物酶兔抗猪IgG偶联物检测。
如表1所示，用与GnRH融合的AP205外壳蛋白免疫的猪产生高效价的针对GnRH肽的抗体应答，而使用免疫前血清没有检测到血清的结合，使用Qβ免疫的对照猪的血清也没有检测到血清的结合，表明结合的特异性。测定得到半数最大结合的稀释度作为效价。
表1
抗-GnRH IgG效价  d28  d49
AP205-GnRH#1  1∶857  1∶1344
AP205-GnRH#2  1∶140  1∶603
Qb#1  1∶20  1∶25
Qb#2  1∶21  1∶24
实施例14
包含外壳蛋白和preS1(aa21-47)肽的融合蛋白的修饰VLP的克隆、表达和纯化
preS1肽在AP205外壳蛋白的C末端的克隆
编码preS1肽(PLGFFPDHQLDPAFRANTANPDWDFNP，SEQ IDNO：62)的DNA片段通过使两种寡核苷酸-oligo preS1-1(SEQ IDNO：63)和oligo preS1-2(SEQ ID NO：64)退火而产生。获得的片段用Kpn2I和Mph1103I消化，并且克隆到pAP409-44和pAP405-61的相同限制酶切位点内，在大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制下。获得的构建体是：
preS1-A(基于409-44)：AP205外壳蛋白-GSG-preS1肽
preS1-B(基于405-61)：AP205外壳蛋白-GTAGGGSG-preS1肽。
preS1肽在AP205外壳蛋白的N末端的克隆
编码preS1肽的片段通过使两种寡核苷酸-preS1-3(SEQ IDNO：65)和oligo preS1-4(SEQ ID NO：66)退火而产生。获得的片段用NcoI和Kpn2I消化，并且克隆到载体pAP378-2和pAP382-2的相同的限制酶切位点中。得到的构建体是：
preS1-C(基于3 78-2)：MG-preS1肽-GSGG-AP205外壳蛋白
preS1-D(基于3 82-2)：MG-preS1肽-GSGTAGGGSGS-AP205外壳蛋白。
上述融合蛋白的表达和纯化基本与对于AP205-D2融合所述相同地进行。
实施例15
PreS1(aa21-47)-特异性抗体的产生和中和活性的测定
成年雄性C57BL/6小鼠(每组5只)用AP205-preS1(aa21-47)VLP接种，或者作为对照，用AP205 VLP接种。对于每只小鼠，将100μg透析后的疫苗用PBS稀释为200μl体积，并在第0天和第14天皮下注射(100μl，两腹侧)。施用不含佐剂的疫苗。作为对照，一组小鼠注射PBS。在第21天通过心脏穿刺对小鼠采血，纯化血清。合并来自每组5只小鼠的血清，以14,000rpm离心5分钟。将上清液加到3ml预洗的蛋白G sepharose柱(Amersham Biosciences)上。然后用10倍柱体积的PBS洗柱，并用100mM甘氨酸pH2.8洗脱。将1ml级分收集在含有200/μl1M Tris pH8.0的试管中。合并含有蛋白质的级分，使用分子量截断值为5 kDa的Millipore Ultrafree离心滤器(Millipore)浓缩。使用相同的浓缩滤器进行缓冲液向PBS的更换。纯化的IgG级分用Millipore Millex滤器(Millipore)无菌过滤，在液氮中骤冻并在-80℃长期保存，或者在4℃贮存有限的期限。
preS1-特异性多克隆IgG的中和活性基本如前所述进行(Glebe等人，1993，J.Virol.77，9511-9521)。简言之，从慢性携带者中纯化的乙型肝炎病毒基因型D(每孔1×108基因组)与纯化的多克隆IgG(0.1-100μg/ml)在20℃预温育1小时。然后初级树(tupaia belangeri)肝细胞(每孔5×105)与病毒接种物37℃温育10小时，之后充分洗涤细胞，并继续在37℃温育。每3天更换一次培养基，在注射后9-12天通过可以作为商品获得的酶联免疫吸附测定(AxSYM，Abbott Laboratories)测定产生的乙型肝炎e抗原的量。
实施例16
展示CCR5肽的AP205 VLP的克隆、表达、纯化和包装
克隆和表达
对应于人CCR5的第二胞外环(ECL2)和N末端(Nt)的肽(Cys20突变为Ser以避免氧化问题)与AP205融合，以产生可以诱导抗人CCR5的抗体的疫苗。然后将该疫苗注射到小鼠中，检测抗体的HIV中和活性。除了N末端肽以外，我们还检测了两个环肽，一个对应于具有工程化N末端和C末端半胱氨酸并且为了避免干扰环形成而在位点11处含有Cys到Ser突变的全长ECL2，另一个是在N末端具有工程化半胱氨酸的ECL2a。因此这两个环都可以通过环内N末端和C末端半胱氨酸之间的二硫键连接来闭合。
编码在11位的半胱氨酸突变为丝氨酸的CCR5肽ECL2
(CRSQKEGLHYTSSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIC，cECL2c，SEQ IDNO：73)、Cys20突变为Ser的Nt
(MDYQVSSPIYDINYYTSEPSQKINVKQIAAR，SEQ ID NO：90)或ECL2a(CRSQKEGLHYTC，cECL2a，SEQ ID NO：74)的DNA片段通过使两种具有突出端的磷酸化互补寡脱氧核苷酸退火而产生，该寡脱氧核苷酸对于cECL2c而言为oligo2-I(5’-
CCGGATGTCGATCGCAGAAGGAAGGCCTACATTACACATCCTCATCTCACTTCCCATATTCTCAATATCAATTCTGGAAGAATTTCCAAACTCTGAAGATCTGTTAATGCA-3’，SEQ ID NO：86)和oligo2-II(5’-
TTAACAGATCTTCAGAGTTTGGAAATTCTTCCAGAATTGATATTGAGAATATGGGAAGTGAGATGAGGATGTGTAATGTAGGCCTTCCTTCTGCGATCGACAT-3’，SEQ ID NO：87)，对于Nt而言为oligo(CATGGATTATCAAGTCTCGAGCCCTATCTATGACATTAACTATTACACTTCGGAACCTTCGCAGAAGATTAACGTTAAACAAATTGCAGCACGTT，SEQ ID NO：92)和oligo(CCGGAACGTGCTGCAATTTGTTTAACGTTAATCTTCTGCGAAGGTTCCGAAGTGTAATAGTTAATGTCATAGATAGGGCTCGAGACTTGATAATC，SEQ 11)NO：93)，或者对于ECL2a使用两种寡脱氧核苷酸oligo3-I(5’-GTTCCGGATGTCGATCGCAGAAGGAAGGCCTACATTACACATGCTAATGCATGT-3’，SEQ ID NO：88)和oligo3-II(5’-ACATGCATTAGCATGTGTAATGTAGGCCTTCCTTCTGCGATCGACATCCGGAAC-3’，SEQ IDNO：89)。
获得的编码cECL2a的片段另外用Kpn2I和Mph1103I消化。然后将三个DNA片段分别连接到预先消化的载体pAP405(cECL2a和cECL2c)和pAP378(Nt)内，在大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制下。得到的构建体是：
542：(基于405)：AP205外壳蛋白-GTAGGGSG-CRSQKEGLHYTSSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIC
530：(基于405)：AP205外壳蛋白-GTAGGGSG-CRSQKEGLHYTC
541：(基于378)：MDYQVSSPIYDINYYTSEPSQKINVKQIAAR-SGG-AP205外壳蛋白。
得到的质粒pAP542、pAP530和pAP541如实施例2所述转化大肠杆菌JM109并表达。鉴定所有3种构建体的裂解物中的衣壳，证明相应的AP205外壳蛋白融合蛋白在大肠杆菌中表达后自装配为VLP。
构建体542的纯化
细胞通过在补充了5μg/ml PMSF的裂解缓冲液(50mM Tris，5mM EDTA 0.1％Tween 20，pH8.0)中超声处理来裂解。裂解物通过离心澄清，沉淀物用裂解缓冲液洗涤三次。合并的上清液在NET缓冲液中用Sepharose 4B柱纯化。将含有VLP的洗脱级分合并，用Amicon离心过滤单元浓缩，并且在NET缓冲液中用Sepharose 2B柱纯化。通过SDS-PAGE、使用ECL2肽特异性小鼠抗血清的Western Blot和EM分析纯化的VLP，来证明ECL2肽的颗粒装配和展示。
构建体530的纯化
细胞通过在裂解缓冲液(50mM Tris，5mM EDTA 0.1％Tween 20，pH8.0，5μg/ml PMSF)中超声处理来裂解。裂解物通过离心澄清，沉淀物用含有10mM DTT的裂解缓冲液洗涤三次。合并的洗涤上清液在NET缓冲液中用Sepharose 4B柱纯化。将含有VLP的洗脱级分合并，补充10mM DTT，用Amicon离心过滤单元浓缩，并且在NET缓冲液中用Sepharose 4B柱再次层析。通过SDS-PAGE、使用ECL2a肽特异性小鼠抗血清的Western Blot和EM分析纯化的VLP，来证明ECL2a肽的颗粒装配和展示。
为了促进ECL2a肽的两个半胱氨酸的二硫键连接，从而促进ECL2a环的闭合，以上获得的VLP制品用含有0.1至1mM还原型谷胱甘肽和0.2至5mM氧化型谷胱甘肽的50mM Tris，150 mM NaCl，pH8.0透析。然后，透析后的VLP制品进一步用50mM Tris，150mM NaCl，pH8.0或PBS或20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2透析，并且注射到小鼠中来检测所展示的表位的免疫原性。
在温和还原条件下构建体的纯化
细胞如上所述在含有0.1mM DTT的裂解缓冲液中裂解。所有后续步骤都在含有0.1mM DTT的缓冲液中进行。如果怀疑二硫键的形成不足，则可以任选地如上所述进行ECL2a环的内部半胱氨酸的最终氧化。
实施例17
展示CXCR4 N-末端肽的AP205 VLP的克隆、表达、纯化和包装
克隆和表达
对应于人CXCR4的N末端的肽(具有Cys28到Ser的突变以避免氧化问题)与AP205融合，以产生诱导抗人CXCR4的抗体的疫苗。然后将该疫苗注射到小鼠中，检测抗体的HIV中和活性。编码CXCR4 N-末端肽(CXCR4-Nt)(MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPSFREENANFNKI，SEQ ID NO：75)的DNA片段通过使两种5′磷酸化寡核苷酸退火而产生-Oligo4-I(5′-CATGGAAGGAATTTCCATATATACTTCGGACAACTACACCGAGGAAATGGGTAGCGGCGACTACGACAGCATGAAAGAACCATCCTTCCGCGAGGAGAATGCAAATTTTAATAAAATTT-3’，SEQ ID NO：76)和Oligo4-II(5’-CCGGAAATTTTATTAAAATTTGCATTCTCCTCGCGGAAGGATGGTTCTTTCATGCTGTCGTAGTCGCCGCTACCCATTTCCTCGGTGTAGTTGTCCGAAGTATATATGGAAATTCCTTC-3′，SEQ ID NO：77)。将获得的片段连接到预先用NcoI和Kpn2I消化的载体pAP378中。得到的构建体是：
543：(基于378)：MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPSFREENANFNKI-SGG-AP205外壳蛋白
得到的质粒pAP543转化大肠杆菌JM109，并且如实施例2所述表达。在裂解物中存在的衣壳证明相应的AP205外壳蛋白融合蛋白在大肠杆菌中表达后自装配为VLP。
纯化
细胞通过在补充了5μg/ml PMSF的裂解缓冲液(50mM Tris，5mM EDTA 0.1％Tween 20，pH8.0)中超声处理来裂解。裂解物通过离心澄清，沉淀物用含有1M尿素的裂解缓冲液洗涤三次。合并的上清液在NET缓冲液中用Sepharose 4B柱纯化。将含有VLP的洗脱级分合并，用Amicon离心过滤单元浓缩，并且在NET缓冲液中用Sepharose 6B柱纯化。通过SDS-PAGE、使用CXCR4-Nt肽特异性小鼠抗血清的Western Blot和EM分析纯化的VLP，来证明CXCR4-Nt肽的颗粒装配和展示。
实施例18：免疫和HIV-中和测定
C57BL/6小鼠在第0天用实施例17和18获得的50μg Nt-AP205、AP205-cECL2c、AP205-cECL2A、CXCR4-Nt-AP205 VLP免疫(皮下，在0.2ml PBS中)，并且与分别用50μg构建体378和405 VLP免疫的Balb/C小鼠比较。在第14天用相同疫苗加强免疫后，在第14天和第21天通过ELISA检查α-AP205和α-CCR5、α-CXCR4抗体效价。
多克隆小鼠IgG的纯化
将被免疫小鼠的血清以14,000rpm离心5分钟。将上清液加到3.3ml预洗涤的蛋白G sepharose柱(Amersham Biosciences，Otelfingen，Switzerland)上。然后用PBS洗柱，并用100mM甘氨酸pH2.8洗脱。将1ml的级分收集在预先加有120μl 1M Tris pH8的试管中。将在280nm处具有吸收的峰级分合并。
使用多克隆小鼠IgG对细胞CCR5进行FACS染色
CEM.NKR-CCR5是CEM.NKR细胞系的一种表达CCR5的变体，CEM.NKR细胞系是天然表达CD4的人细胞系(Trkola等人，J.Virol.，1999，8966页)。CEM.NKR-CCR5细胞在RPMI 1640培养基(含有10％FCS、谷氨酰胺和抗生素)中生长。将细胞沉淀，并重悬浮在含有1％胎牛血清(FCS)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，以获得2.3×106细胞/ml的密度。加入2mg/l大鼠抗小鼠-CD16/CD32(Fcγ)(Pharmingen，Basel，Switzerland)作为阻断剂，温育20分钟。将细胞在1％FCS/PBS中洗一次，将0.1ml(2.3×105细胞/孔)加至V形底96孔板中，然后沉淀。然后将细胞用0.1mlα-CCR5多克隆抗体(350mg/l，35mg/l，3.5mg/l或0.35mg/l；从蛋白G柱上洗脱；用1％FCS/PBS稀释)重悬浮。在4℃30分钟后，将细胞在1％FCS/PBS中洗一次，于4℃用1％FCS/PBS中的15mg/l FITC-山羊抗小鼠-IgG(Jackson，Milan Analytica，LaRoche)染色20分钟。用1％FCS/PBS洗涤两次后，通过流式细胞术分析5,000-10,000个染色的细胞。使用“cell quest”流式细胞分析软件确定每个染色的几何平均数。
HIV中和测定
刺激的去除CD8的初级PBMC
简言之，使用Rosette Sep混合物(StemCell Technologies Inc.，BIOCOBA AG)将从3名健康献血者获得的血沉棕黄层去除CD8+T细胞，通过Ficoll-Hypaque离心(Amersham-Pharmacia Biotech)分离PBMC。将细胞用培养基(RPMI 1640，10％FCS，100U/ml IL-2，谷氨酰胺和抗生素)调节为4×106/ml，分成三份，并用5μg/ml植物凝集素(PHA)、0.5μg/ml PHA或1mg/l抗-CD3 MAb OKT3刺激。72小时后，将所有三种刺激的细胞混合，作为刺激的CD4+T细胞的来源用于感染和病毒中和实验。
HIV中和测定基本如以前所述进行(Trkola等人，J.Virol.，1999，8966页)。R5病毒(CCR5共受体特异性的株)、JR-FL和SF162在以前已经描述(O′Brien等人，Nature 1990，348，69页；和Shioda等人，Nature1991，349，167页)。另外，X4株NL4-3和2044在以前已经描述(Trkola等人(1998)，J.Virol.72：396；Trkoly等人(1998)，J.Virol 72-1876)。简言之，细胞与系列稀释的纯化的多克隆小鼠IgG或对照抗体2D7(25μg/ml-25ng/ml；Pharmingen)在96孔培养板中37℃温育1小时。
用测定培养基将HTV-1接种物调节为含有大约1,000至4,000TCID50/ml(TCID50：50％组织培养感染剂量，Trkola等人，J.Virol.，1999，8966)。加入病毒接种物(100 TCID50；50％组织培养感染剂量)，将培养板培养4-14天。总感染体积为200μL。优选地，在感染后的第6天，如以前所述(Moore等人，1990.Science 250，139)，利用免疫测定法测定上清液基质中HIV-1 p24抗原的产生。
实施例19
在其外壳蛋白的C末端展示P33表位的AP205 VLP的克隆、表达、纯化和包装
克隆和表达
编码为了改善在抗原呈递细胞中的加工而在N末端添加亮氨酸修饰的P33肽(LKAVYNFATM，SEQ ID NO：78)的DNA片段通过使两种寡核苷酸-oligo2.198(5′-CCTCCGGACTGAAAGCTGTGTATAACTTCGCGACTATGTAATGCATCG-3′，SEQ ID NO：79)和oligo2.199(5′-CGATGCATTACATAGTCGCGAAGTTATACACAGCTTTCAGTCCGGAGG-3′，SEQ ID NO：80)退火而产生。将获得的片段用Kpn2I和Mph1103I消化，并克隆到载体pAP409的相同限制酶切位点内，处于大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制下。得到的构建体是：
425：(基于409)：AP205外壳蛋白-GSG-LKAVYNFATM
得到的质粒被命名为pAP425，如实施例2所述转化大肠杆菌JM109并表达。
纯化
细胞通过在补充了5μg/ml PMSF的裂解缓冲液(50mM Tris，5mM EDTA 0.1％Triton X100，pH8.0)中超声处理来裂解。裂解物通过离心澄清，沉淀物用裂解缓冲液洗涤两次并用含有1M尿素的裂解缓冲液洗涤一次。合并的上清液在NET缓冲液中用Sepharose CL-4B柱纯化。将含有VLP的洗脱级分合并，用Amicon离心过滤单元浓缩，并且在NET缓冲液中用CL-6B柱纯化。通过SDS-PAGE、使用P33肽特异性小鼠抗血清的Western Blot和EM分析纯化的VLP，来证明P33肽的颗粒装配和展示。蛋白质的产率为2.7mg/g细胞。P33肽因此可以成功地融合到AP205外壳蛋白的C末端，导致丰富的颗粒形成。该结果表明修饰的AP205 VLP是用于融合诸如P33的表位的有效系统，当P33与另外一种RNA噬菌体VLP如Fr融合时它阻止颗粒装配。
包装
以上获得的AP205-p33(2.7mg/ml)用20mM Hepes，pH7.4透析，并用RNAse A(300μg/ml VLP)于37℃消化3小时。RNAse处理的VLP然后于4℃透析过夜(分子量截断值＝100000)。如下所述将寡脱氧核苷酸(oligos)1668pt(t*c*c*a*t*g*a*c*g*t*t*c*c*t*g*a*a*t*a*a*t，其中*是指硫代磷酸键，SEQ ID NO：94)和NKpt(g*g*g*g*t*c*a*a*c*g*t*t*g*a*g*g*g*g*g*g，SEQ ID NO：95)包装在AP205-p33中。加入0.12ml 1mM oligo贮存液/ml处理的VLP和MgCl2(终浓度为2mM)，37℃温育3小时。使用20mM Hepes，pH7.4缓冲液通过正切流动过滤除去游离的oligo。通过溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳分析重装配的VLP来证实oligo的包装。包装的VLP制品中残留的游离oligo通过在同一凝胶上与同一oligo的标准的8个稀释度比较来定量。通过用蛋白酶K处理包装的VLP制品并在10％TBE/尿素凝胶上进行PAGE分析来定量oligo的总量。凝胶用SYBR金染色，使用同一oligo的5个稀释度作为标准，通过密度测定法定量每条带的oligo总含量。从oligo总含量中减去残余的oligo含量，得到包装的oligo的含量，NKptoligo为4.36nmol/100μg VLP，1668pt oligo为2.98nmol/100μg VLP。
实施例20
在寡脱氧核苷酸存在下重装配的AP205 p33融合蛋白诱导CD8+T细胞应答
通过皮下注射如实施例19所述包装有oligo 1668pt或oligo NKpt的150μgAP205-p33(构建体425)或在不同含量的聚-L-谷氨酸(它不是Toll-样受体的配体)存在下重装配的AP205-p33 VLP(AP205-p33/polyL-Glu，含有0.1mg/ml，0.2mg/ml或0.4mg/ml聚-L-谷氨酸)，免疫C57BL/6小鼠。8天后分析被免疫动物的血液中gp33-特异性CD8+T细胞的扩增。将血液收集在FACS缓冲液(PBS，2％FCS，5mM EDTA，pH8.2)中，于37℃用PE-标记的装有gp33-肽的H2-Db-四聚体(Proimmune)染色10分钟，接着于4℃用APC标记的大鼠抗小鼠CD8a-抗体(BDPharMingen)染色30分钟。洗涤后，在室温下用BD-裂解溶液(BDBiosciences，San Jose，USA)裂解红细胞。最后，使用CellQuest软件在FACS Calibur上分析细胞。首先，以前向散射和侧向散射获得细胞，并且用门(gate)圈出淋巴细胞。从这个淋巴细胞群体中，分别用FL2和FL4检测器测量gp33-PE标记的和CD8-APC标记的细胞。gp33-特异性T细胞的量计算为总CD8阳性淋巴细胞中CD8阳性且gp33阳性细胞的百分数。
在测定gp33-特异性的T细胞应答后，用1.5×106pfu表达gp33-肽的重组痘苗病毒激发小鼠。5天后，检测这些小鼠卵巢中的病毒滴度。卵巢的单细胞悬液在BSC40细胞的系列稀释液中温育。在5％CO2下37℃温育过夜后，细胞用结晶紫染色(500ml 96％乙醇，5g结晶紫(Sigma C-3886)，8g NaCl，450ml H2O，50ml甲醛)，以显示病毒诱导的细胞裂解产生的细胞层中的噬斑。卵巢中残余病毒的数量计算为噬斑形成单位(pfu)。
实施例21
展示生长素释放肽的AP205 VLP的克隆、表达和纯化
克隆和表达
对应于人生长素释放肽(1-8)的肽与AP205的C末端融合，以产生诱导抗生长素释放肽抗体的疫苗。然后将该疫苗注射到小鼠中，检测抗体与生长素释放肽的结合。编码该生长素释放肽(GSSFLSPE，SEQ IDNO：55)的DNA片段通过使两种寡核苷酸-Oligo4.173(5′-GT TCCGGA GGG AGC TCC TTC CTG TCT CCG GAA TAA TGCATGT-3′，SEQ ID NO：81)和Oligo4.174(5′-ACATGCA TTA TTC CGG AGACAG GAA GGA GCT CCC TCC GGA AC-3’，SEQ ID NO：82)退火而产生。将获得的片段用Kpn2I和Mph1103I消化，并克隆到载体pAP405和pAP409的相同限制酶切位点内，处于大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制下。得到的构建体是：
(基于405)513 AP205外壳蛋白-GTAGGGSG-GSSFLSPE
(基于409)514 AP205外壳蛋白-GSG-GSSFLSPE。
得到的质粒pAP513和pAP514如实施例2所述转化大肠杆菌JM109并表达。裂解物中存在的衣壳证明相应的AP205外壳蛋白融合蛋白在大肠杆菌中表达后自装配为VLP。
来自构建体513的VLP的纯化
细胞通过在补充了5μg/ml PMSF的裂解缓冲液(50mM Tris，5mM EDTA 0.1％Tween 20，pH8.0)中超声处理来裂解。裂解物通过离心澄清，沉淀物用裂解缓冲液洗涤三次。向合并的上清液中补充NaCl至终浓度为0.4M，并用一半体积的40％PEG 6000水溶液沉淀。将沉淀物通过离心分离，洗涤，并重悬浮在水中，并在NET缓冲液中用Sepharose CL-2B柱纯化。将含有VLP的洗脱级分合并，用Amicon离心过滤单元浓缩。来自构建体513的蛋白质在用下列蔗糖溶液制备的蔗糖梯度上进一步纯化：9ml 36％，3ml 30％，6ml 25％，8ml 20％，6ml15％，6ml 10％和3ml 5％。将VLP级分合并，用离心过滤单元浓缩，并用10mM Hepes，pH7.5透析。将来自构建体514的蛋白质经过CL-2B纯化的含VLP的浓缩级分在Sepharose 6B柱上进一步纯化，并将含有VLP的级分用离心过滤单元浓缩。
通过SDS-PAGE、使用生长素释放肽特异性小鼠抗血清的Westernblot、使用AP205-生长素释放肽VLP抑制生长素释放肽特异性小鼠血清与融合到RNAse上并包被到ELISA板上的生长素释放肽结合的抑制ELISA、和EM分析纯化的VLP，来证明AP205颗粒上生长素释放肽的展示。
成年雌性C57BL/6小鼠(每组5只)用纯化的来自构建体513的VLP接种，用纯化的来自构建体405的VLP作为阴性对照。此外，成年雌性C57BL/6小鼠(每组5只)用纯化的来自构建体514的VLP接种，用纯化的来自构建体409的VLP作为阴性对照。将100μg来自每种样品的透析后的疫苗用PBS稀释至体积为200μl，并在第0、14、28、42天皮下注射(两腹侧100μl)。小鼠在第0、14、28、42、56天眼眶后采血，通过ELISA分析它们的血清。
如果在实验过程中生长素释放肽-特异性抗体的效价显著下降，则其后对小鼠进行加强免疫。所有小鼠都给予高脂肪饮食(35％重量的脂肪，60％作为能量)，以利于发展饮食诱导的肥胖症。食物和水随意给予。定期监测体重。
实施例22
在其N末端展示M2肽的AP205 VLP的克隆、表达、纯化和包装
克隆和表达
对应于来自流感病毒的M2肽的肽与AP205的N末端融合，以产生诱导抗流感蛋白M2的抗体的疫苗。然后将该疫苗注射到小鼠中，评估免疫的保护作用。编码在N末端添加有MG的M2肽(MGSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG，SEQ ID NO：83)的DNA片段通过使两种5′磷酸化的寡脱氧核苷酸-oligo M2-I(5′-GGC CATGGG ATC TCT GCT GAC CGA AGT TGA AAC CCC GAT TCG TAATGA ATG GGG TTG CCG TTG CAA TGA TTC TTC TGA TGG TTCCGG AGG-3’，SEQ ID NO：84)和oligo M2-II(5’-CCT CCG GAACCA TCA GAA GAA TCA TTG CAA CGG CAA CCC CAT TCA TTACGA ATC GGG GTT TCA ACT TCG GTC AGC AGA GAT CCC ATGGCC-3’，SEQ ID NO：85)退火而产生。将获得的片段克隆到预先用NcoI和Kpn2I消化的载体中。得到的构建体是：
551：(基于378)：MGSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG-SGG-AP205外壳蛋白
得到的质粒pAP551如实施例2所述转化大肠杆菌JM109并表达。裂解物中存在的衣壳证明AP205外壳蛋白融合蛋白在大肠杆菌中表达后自装配为VLP。
纯化
细胞通过在补充了5μg/ml PMSF的裂解缓冲液(50mM Tris，5mM EDTA 0.1％Tween 20，pH8.0)中超声处理来裂解。裂解物通过离心澄清，沉淀物用含有1M尿素的裂解缓冲液洗涤三次。合并的上清液在NET缓冲液中用Sepharose CL-4B柱纯化。将含有VLP的洗脱级分合并，用离心过滤单元浓缩，并且用10mM Hepes，pH7.5透析。通过用SDS-PAGE和EM分析纯化的VLP来证明M2肽的颗粒装配和展示。
实施例23
在其C末端展示M2肽的AP205 VLP的克隆、表达、纯化
克隆和表达
对应于来自流感病毒的M2肽的肽与AP205外壳蛋白的C末端融合。简言之，合成两种互补的寡核苷酸，其编码将要与AP205外壳蛋白符合读框地融合的M2序列(SEQ ID NO：43)，侧翼为用于克隆的Kpn2I和Mph1103I限制酶切位点。在肽编码序列的末端处也包括一个终止密码子。使互补的寡核苷酸退火，用Kpn2I和Mph1103I消化，并且克隆到pAP409、pAP405中，产生C末端融合。得到的构建体是：
pAP409-M2：AP205-GSG-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG
pAP405-M2：AP205-GTAGGGSG-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG
相应的融合蛋白基本如实施例22所述表达和纯化。
实施例24
展示与C或N末端融合的M2肽多聚体的AP205 VLP的克隆、表达和纯化
表达载体的克隆
用短间隔序列分隔开的串联的M2肽的多聚体符合读框地与AP205外壳蛋白融合。简言之，合成两种互补的寡核苷酸，其编码将要与AP205外壳蛋白符合读框地融合的所需序列(见下)，侧翼为用于克隆的适当的限制酶切位点。在肽编码序列的末端处也包括一个终止密码子，用于与AP205的C末端融合(克隆到pAP409、pAP405内)。使互补的寡核苷酸退火，用适当的限制酶消化，并且克隆到相应的AP205融合载体中。将M2二聚体(SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG-GSSG-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG，SEQ IDNO：96)或M2三聚体(SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG-GSSG-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG-GSSG-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG，SEQ ID NO：97)克隆到pAP378和pAP382内产生N末端融合，克隆到pAP409和pAP405内产生C末端融合。相应的融合蛋白基本如实施例22所述表达和纯化。
实施例25
在表面上展示M2肽或其多聚体的AP205 VLP的功能检测
为了检测不同的AP205-M2融合疫苗，用从实施例22-24中获得的疫苗免疫小鼠，随后基本如前所述进行流感A病毒激发(Jegerlehner等人，J.Immunol.，2004，5598-5605)。简言之，成年C57BL/6小鼠(每组5只)分别用从实施例22-24中获得的VLP接种，用AP205 VLP作为阴性对照。对于每只小鼠，用PBS稀释100μg疫苗至体积为200μl，在第0天和第14天皮下注射每只动物的右和左腹股沟区。动物在第14和21天采血，通过ELISA检测M2特异性抗体应答。简言之，M2肽与RNase通过氨基酸间隔区(CGG)和交联剂SPDP偶联，并且在ELISA板上4℃包被过夜。血清的结合用辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG偶联物检测。
在第33天，用4000个活流感A病毒(株：A/Puerto Rico 8/34，H1N1亚型)/小鼠激发所有小鼠。然后在14天里监测每个接种组的体重和死亡率。
实施例26
包含AP205外壳蛋白与HIV env肽的融合蛋白的修饰VLP的克隆、表达和纯化
克隆和表达
由HIV包膜糖蛋白gp160衍生的肽(SEQ ID NOs：98-113)符合读框地与AP205外壳蛋白融合。简言之，合成两种互补的寡核苷酸，其编码将要与AP205外壳蛋白符合读框地融合的所需序列，侧翼为用于克隆的适当限制酶切位点。在肽编码序列的末端处也包括一个终止密码子，用于与AP205的C末端融合(克隆到pAP409、pAP405内)。在Oligos的开始处增加起始甲硫氨酸密码子用于在AP205的N末端融合。使互补的寡核苷酸退火，用适当的限制酶消化，并且克隆到相应的AP205融合载体中。将HIV env肽克隆到pAP378和pAP382内产生N末端融合，克隆到pAP409和pAP405内产生C末端融合。
相应融合蛋白的表达和纯化基本如实施例2和3所述进行。
成年C57BL/6小鼠(每组5只)分别用AP205-HIV env肽接种，作为对照，用AP205 VLP接种。对于每只小鼠，将100μg疫苗用PBS稀释到体积为200μl，并在第0天和第14天皮下注射到每只动物的右和左腹股沟区。
动物在第14和21天采血，通过ELISA检测抗体应答。简言之，待测抗原与RNase通过氨基酸间隔区(CGG)和交联剂SPDP偶联，并且在ELISA板上4℃包被过夜。血清的结合用辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG偶联物检测。
然后在第21天通过心脏穿刺对小鼠采血，每种疫苗的血清如下纯化：将来自各组的5只小鼠的血清合并，以14,000rpm离心5分钟。将上清液加到3ml预洗涤的蛋白G sepharose柱(Amersham Biosciences)上。该柱然后用10倍柱体积的PBS洗涤，用100mM甘氨酸pH2.8洗脱。将1ml级分收集到含有200μl 1M Tris pH8.0的试管中。将含有蛋白质的级分合并，使用分子量截断值为5kDa的Millipore Ultrafree离心滤器(Millipore)浓缩。使用相同的浓缩滤器进行缓冲液向PBS的更换。纯化的IgG级分用Millipore Millex滤器(Millipore)无菌过滤，并且在液氮中骤冻并在-80℃长期保存，或者在4℃贮存有限的期限。
然后基本如使用R5、X4病毒株的实施例19所述，用HIV中和试验检测获得的血清。而且，如前所述检测纯化的IgG级分中和初级HIV分离物的能力(Hovanessian等人，Immunity 2004，617-627)。
                          序列表
<110>赛托斯生物技术公司
     M.巴克曼
     A.蒂索特
     G.詹宁斯
     R.伦霍法
     P.庞姆彭斯
     I.西伦斯
<120>分子抗原阵列
<130>P1042PC00
<160>120
<170>Patent In version 3.3
<210>1
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>1
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>2
<211>131
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体AP205位点5处的Pro置换为Thr
<400>2
Mer Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>3
<211>3635
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表达AP205外壳蛋白
<400>3
cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga   60
gctcgcccgg ggatcctcta gaattttctg cgcacccatc ccgggtggcg cccaaagtga  120
ggaaaatcac atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt  180
gtggtcggat ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt  240
taaagttggt atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg  300
tcctgcacct aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca  360
atccattcgc acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg  420
ggaaactcac aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt  480
ccttgaccct actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaagctt gtattctata  540
gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc  600
taacgacaat atgtacaagc ctaattgtgt agcatctggc ttactgaagc agaccctatc  660
atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg  720
taacgccgtt ccgcaccccg gaaatggtca ccgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc  780
agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg  840
gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga  900
gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca  960
tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg 1020
gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg atatggtgca ctctcagtac 1080
aatctgctct gatgccgcat agttaagcca actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg 1140
gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg    1200
gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca    1260
ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctt gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat    1320
ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg    1380
gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc    1440
tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta    1500
ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg    1560
ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg    1620
gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac    1680
gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg    1740
acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt    1800
actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg    1860
ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac    1920
cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt    1980
gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag    2040
caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc    2100
aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc    2160
ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta    2220
tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg    2280
ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga    2340
ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac    2400
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa    2460
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat    2520
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc    2580
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg    2640
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc    2700
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg    2760
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg    2820
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa    2880
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gcgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg    2940
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga    3000
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct    3060
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca    3120
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc    3180
ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg    3240
ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc    3300
caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca    3360
tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct    3420
ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa    3480
ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac  3540
ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag  3600
tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt                             3635
<210>4
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在AP205外壳蛋白的N末端克隆GSGG
<400>4
tgccatggga tccggagggg caaataagcc aatgcaacc    39
<210>5
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>向AP205外壳蛋白的N末端克隆GSGG
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>n是a，c，g，或t
<400>5
nnaagcttaa gcagtagtat cagacgatac g    31
<210>6
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>使用p378-2作为模板向AP205外壳蛋白的N末端克隆GSGTAGGGSGS
<400>6
tgccatgggtt ccggaaccg cgggcggggg atccggttcg gcaaataagc caatgcaacc    60
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>使用p283-58作为模板向AP205外壳蛋白的C末端克隆GSGG
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>n是a，c，g，或t
<400>7
nntctagaat tttctgcgca cccatcccgg    30
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>使用p283-58作为模板向AP205外壳蛋白的C末端克隆GSGG
<400>8
tgatgcatcc tccggatcca gcagtagtat cagacgatac    40
<210>9
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>使用p409-44作为模板向AP205外壳蛋白的C末端克隆GTAGGGSG
<400>9
tgatgcataa tccggaaccg cctcctgcgg ttccagcagt agtatc    46
<210>10
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>D2肽
<400>10
Thr Ser Asn Gly Ser Asn Pro Ser Thr Ser Tyr Gly Phe Ala Asn
1               5                   10                  15
<210>11
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与oligo2：197退火产生D2肽
<400>11
cctccggaac ttccaacgga agcaatccga gcacttcgta cggtttcgcg aattaatgca    60
tcg                                                                  63
<210>12
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与oligo2.196退火产生D2肽
<400>12
cgatgcatta attcgcgaaa ccgtacgaag tgctcggatt gcttccgttg gaagttccgg    60
agg                                                                  63
<210>13
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与oligo590退火在AP205外壳蛋白的N末端产生De肽
<400>13
ctccatggga acttccaacg gaagcaatcc gagcacttcg tacggtttcg cgaatggatc    60
cggatc                                                               66
<210>14
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与oligo 590退火在AP205外壳蛋白的N末端产生D2肽
<400>14
gatccggatc cattcgcgaa accgtacgaa gtgctcggat tgcttccgtt ggaagttccc    60
atggag                                                               66
<210>15
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>血管紧张肽I片段
<400>15
Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe
1               5
<210>16
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与oligo3.217退火在AP205外壳蛋白的C末端产生angio I片段
<400>16
gatccggaga tcgtgtatac atccatccat tctaatgcat tg    42
<210>17
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与oligo3.216退火在AP205外壳蛋白的C末端产生angio I片段
<400>17
caatgcatta gaatggatgg atgtatacac gatctccgga tc    42
<210>18
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与oligo3.219退火在AP205外壳蛋白的N末端产生angio I片段
<400>18
tcccatggga gatcgtgtat acatccatcc attcggatcc ggaac    45
<210>19
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与oligo3.218退火在AP205外壳蛋白的N末端产生angio I片段
<400>19
gttccggatc cgaatggatg gatgtataca cgatctccca tggga    45
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>20
Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
1               5                   10
<210>21
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与oligo4.57退火在AP205外壳蛋白的C末端产生GnRH
<400>21
gttccggaga acactggtcc tatggactca ggcctggtta atgcattg    48
<210>22
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与oligo4.56退火在AP205外壳蛋白的C末端产生GnRH
<400>22
caatgcatta accaggcctg agtccatagg accagtgttc tccggaac    48
<210>23
<211>55
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>23
Gly Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly
            20                  25                  30
Leu Glu Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe
        35                  40                  45
Lys Leu Val Pro Val Glu Pro
    50                  55
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与3.222退火在AP205外壳蛋白的C末端产生Nef54的34aa
<400>24
gatccggagg tgtgggtttc ccggttcg    28
<210>25
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与3.242退火在AP205外壳蛋白的C末端产生Nef56的34aa
<400>25
gaaaagggtg gcctggaagg tccaggtatc cgttatcc    38
<210>26
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与oligo3.225退火在AP205外壳蛋白的C末端产生Nef56的21aa
<400>26
ggataacgga tacctggacc ttccaggcca cccttttc    38
<210>27
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与3.223退火在AP205外壳蛋白的C末端产生Nef56的21aa
<400>27
caatgcatta cggttcaacc ggcac    25
<210>28
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>产生TGA用于嵌合VLP
<400>28
gtatcgtctg atactactgc ttgaggaacc gcaggaggcg gttc    44
<210>29
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>产生TGA用于嵌合VLP
<400>29
gaaccgcctc ctgcggttcc tcaagcagta gtatcagacg atac    44
<210>30
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Nco I位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>n是a，c，g，或t
<400>30
nnccatggca aataagccaa tgcaaccg    28
<210>31
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与Nef56的C末端下游的非编码区23核苷酸互补
<400>31
gatttaggtg acactatag    19
<210>32
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>p33肽
<400>32
 Ala Lys Ser Leu Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met Ala
 1               5                   10
<210>33
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与3.310退火在AP205外壳蛋白的N末端产生p33肽
<400>33
ggccatggct aagtccctga aggctgtata taacttcgcg actatggcat ccggagg    57
<210>34
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与3.309退火在AP205外壳蛋白的N末端产生p33肽
<400>34
cctccggatg ccatagtcgc gaagttatat acagccttca gggacttagc catggcc    57
<210>35
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N-短间隔区
<400>35
Gly Ser Gly Gly
1
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N-长间隔区
<400>36
Gly Ser Gly Thr Ala Gly Gly Gly Ser Gly Ser
1               5                   10
<210>37
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-短间隔区
<400>37
Gly Ser Gly
1
<210>38
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-长间隔区
<400>38
Gly Thr Ala Gly Gly Gly Ser Gly
1               5
<210>39
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于将p33克隆到fr内的引物
<400>39
cgaaatctct taaagcggtt tacaacttcg ctaccatggc tt    42
<210>40
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于将p33克隆到fr内的引物
<400>40
cgaagccatg gtagcgaagt tgtaaaccgc tttaagagat tt    42
<210>41
<211>20
<212>PRT
<213>小鼠
<400>41
Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn
1               5                   10                  15
His Gln Val Glu
            20
<210>42
<211>131
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>AP205外壳蛋白的突变蛋白
<400>42
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asp Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>43
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>流感M2序列
<400>43
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Gly
            20
<210>44
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于小鼠的M2 pr8
<400>44
Ser Leu Lcu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp Gly
            20
<210>45
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CCR5 PNt域
<400>45
Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr
1               5                   10                  15
Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg
            20                  25                  30
<210>46
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CCR5 ECL2A
<400>46
Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr
1               5                   10
<210>47
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>47
Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp
1               5                   10                  15
Phe
<210>48
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCR4 1-39
<400>48
Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met
1               5                   10                  15
Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu
            20                  25                  30
Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile
        35
<210>49
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCR4 176 185
<400>49
Ser Glu Gln Ile Asp Glu Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile
1               5                   10                  15
<210>50
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>50
Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met
1               5               10               15
Gln Leu Gly Arg
            20
<210>51
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CETP 461 479
<400>51
Phe Gly Phe Pro Glu His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
<210>52
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>52
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1               5                   10
<210>53
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>53
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1               5
<210>54
<211>28
<212>PRT
<213>人
<400>54
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>55
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生长素释放肽1-8
<400>55
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu
1               5
<210>56
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生长素释放肽1-10
<400>56
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln
1               5                   10
<210>57
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生长素释放肽1-12
<400>57
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val
1               5                   10
<210>58
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>狗生长素释放肽1-13
<400>58
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln
1               5                   10
<210>59
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>猫生长素释放肽1-13
<400>59
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln
1               5                   10
<210>60
<211>34
<212>PRT
<213>人
<400>60
Glu Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys
1               5                   10                  15
Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met
            20                  25                  30
Asp Phe
<210>61
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胃泌素19
<400>61
Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu
1               5
<210>62
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PreS1的片段21-47
<400>62
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala
1               5                   10                  15
Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro
            20                  25
<210>63
<211>99
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于在C末端克隆PreS1的引物
<400>63
cctccggacc gctgggcttc ttcccggatc accagctgga tccggccttc cgcgccaaca    60
ccgcgaaccc ggattgggat ttcaacccgt aatgcatcg                           99
<210>64
<211>99
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于在C末端克隆PreS1的引物
<400>64
cgatgcatta cgggttgaaa tcccaatccg ggttcgcggt gttggcgcgg aaggccggat      60
ccagctggtg atccgggaag aagcccagcg gtccggagg                             99
<210>65
<211>102
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于在N末端克隆PreS1的引物
<400>65
ctccatggga ccgctgggct tcttcccgga tcaccagctg gatccggcct tccgcgccaa        60
caccgcgaac ccggattggg atttcaaccc gggatccgga tc                          102
<210>66
<211>102
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于在N末端克隆PreS1的引物
<400>66
gatccggatc ccgggttgaa atcccaatcc gggttcgcgg tgttggcgcg gaaggccgga      60
tccagctggt gatccgggaa gaagcccagc ggtcccatgg ag    102
<210>67
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>67
Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile Val
1               5                   10                  15
Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu Leu
            20                  25                  30
Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser Gly
        35                  40                  45
Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly Cys
    50                  55                  60
Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg Thr
65                  70                  75                  80
Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu Trp
                85                  90                  95
Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn Ala
            100                 105                 110
Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp Thr
        115                 120                 125
Thr Ala
    130
<210>68
<211>130
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体AP205的SEQ ID NO：2的de Met
<400>68
Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile Val
1               5                   10                  15
Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu Leu
            20                  25                  30
Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser Gly
        35                  40                  45
Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly Cys
    50                  55                  60
Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg Thr
65                  70                  75                  80
Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu Trp
                85                  90                  95
Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn Ala
            100                 105                110
Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp Thr
        115                 120                 125
Thr Ala
    130
<210>69
<211>130
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体AP205的SEQ ID NO：42的de Met
<400>69
Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asp Lys Ile Val
1               5                   10                  15
Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu Leu
            20                  25                  30
Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser Gly
        35                  40                  45
Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly Cys
    50                  55                  60
Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg Thr
65                  70                  75                  80
Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu Trp
                85                  90                  95
Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn Ala
            100                 105                 110
Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp Thr
        115                 120                 125
Thr Ala
    130
<210>70
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>非甲基化的CpG的同文序列
<400>70
gacgatcgtc    10
<210>71
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>G10
<400>71
gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg    30
<210>72
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<400>72
Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Ser Ser Ser His Phe Pro
1               5                   10                  15
Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe Gln Thr Leu Lys Ile
            20                  25                  30
<210>73
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>在位点20处C置换为S的环状CCR5 ECL2A的序列
<400>73
Cys Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Ser Ser Ser His Phe
1               5                   10                  15
Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe Gln Thr Leu Lys Ile
            20                  25                  30
Cys
<210>74
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>环状CCR5 ECL2A
<400>74
Cys Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Cys
1               5                   10
<210>75
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Cys 28置换为Ser的环状CXCR4 Nt
<400>75
Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met
1               5                   10                  15
Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Ser Phe Arg Glu Glu
            20                  25                  30
Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile
        35
<210>76
<211>119
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于环状CXCR4 Nt退火的引物1
<400>76
catggaagga atttccatat atacttcgga caactacacc gaggaaatgg gtagcggcga    60
ctacgacagc atgaaagaac catccttccg cgaggagaat gcaaatttta ataaaattt    119
<210>77
<211>119
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于环状CXCR4 Nt退火的引物2
<400>77
ccggaaattt tattaaaatt tgcattctcc tcgcggaagg atggttcttt catgctgtcg    60
tagtcgccgc tacccatttc ctcggtgtag ttgtccgaag tatatatgga aattccttc    119
<210>78
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>P33片段2
<400>78
Leu Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met
1               5                   10
<210>79
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于P33片段2退火的引物1
<400>79
cctccggact gaaagctgtg tataacttcg cgactatgta atgcatcg    48
<210>80
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于P33片段2退火的引物2
<400>80
cgatgcatta catagtcgcg aagttataca cagctttcag tccggagg    48
<210>81
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于生长素释放肽的引物1
<400>81
gttccggagg gagctccttc ctgtctccgg aataatgcat gt                           42
<210>82
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于生长素释放肽的引物2
<400>82
acatgcatta ttccggagac aggaaggagc tccctccgga ac                           42
<210>83
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>在N末端添加有MG的M2
<400>83
Met Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp
1               5                   10                  15
Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Gly
            20                  25
<210>84
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于在N末端添加有MG的M2的引物1
<400>84
ggccatggga tctctgctga ccgaagttga aaccccgatt cgtaatgaat ggggttgccg     60
ttgcaatgat tcttctgatg gttccggagg                                      90
<210>85
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于在N末端添加有MG的M2的引物2
<400>85
cctccggaac catcagaaga atcattgcaa cggcaacccc attcattacg aatcggggtt      60
tcaacttcgg tcagcagaga tcccatggcc a                                     91
<210>86
<211>111
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于cECL2c的引物1
<400>86
ccggatgtcg atcgcagaag gaaggcctac attacacatc ctcatctcac ttcccatatt      60
ctcaatatca attctggaag aatttccaaa ctctgaagat ctgttaatgc a    111
<210>87
<211>103
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于cECL2c的引物2
<400>87
ttaacagatc ttcagagttt ggaaattctt ccagaattga tattgagaat atgggaagtg    60
agatgaggat gtgtaatgta ggccttcctt ctgcgatcga cat                     103
<210>88
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于cECL2ac的引物1
<400>88
gttccggatg tcgatcgcag aaggaaggcc tacattacac atgctaatgc atgt    54
<210>89
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于cECL2ac的引物2
<400>89
acatgcatta gcatgtgtaa tgtaggcctt ccttctgcga tcgacatccg gaac    54
<210>90
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>半胱氨酸20改变为S的CCR5 Nt
<400>90
Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr
1               5                   10                  15
Ser Glu Pro Ser Glu Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg
            20                  25                  30
<210>91
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CCR5 ECL2
<400>91
Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Cys Ser Ser His Phe Pro
1               5                   10                  15
Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe Gln Thr Leu Lys Ile
            20                  25                  30
<210>92
<211>95
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于CCR5 PNt的引物1
<400>92
catggattat caagtctcga gccctatcta tgacattaac tattacactt cggaaccttc    60
gcagaagatt aacgttaaac aaattgcagc acgtt                               95
<210>93
<211>95
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于CCR5 PNt的引物2
<400>93
ccggaacgtg ctgcaatttg tttaacgtta atcttctgcg aaggttccga agtgtaatag    60
ttaatgtcat agatagggct cgagacttga taatc                               95
<210>94
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>1668Pt
<400>94
tccatgacgt tcctgaataa t             21
<210>95
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>NK pt
<400>95
ggggtcaacg ttgagggggg               20
<210>96
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有GSSG连接体的M2肽二聚体
<400>96
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Gly Gly Ser Ser Gly Ser Leu Leu Thr
            20                  25                  30
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp
        35                  40                  45
Ser Ser Asp Gly
    50
<210>97
<211>85
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有GSSG连接体的M2肽三聚体
<400>97
Ala Pro Gly Ser Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg
1               5                   10                  15
Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Gly Gly Ser Ser
            20                  25                  30
Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
        35                  40                  45
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Gly GlV Ser Ser Gly Ser Leu Leu
    50                  55                  60
Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn
65                  70                  75                  80
Asp Ser Ser Asp Gly
                85
<210>98
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 1
<400>98
Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Gln Trp Asp Lys
1               5                   10                  15
<210>99
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 2
<400>99
Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Gln Trp Asp Arg
1               5                   10                  15
<210>100
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 3
<400>100
Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Gln Trp Asp Arg
1               5                   10
<210>101
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 4
<400>101
Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp
1               5
<210>102
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 5
<400>102
Asn Trp Phe Asp Ile Ser Asn Trp Leu Trp
1               5                   10
<210>103
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 6
<400>103
Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Leu
1               5                   10                  15
<210>104
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 7
<400>104
Glu Leu Asp Lys Trp Ala
1               5
<210>105
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env8
<400>105
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
            20                  25                  30
Leu Leu
<210>106
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 9
<400>106
Cys Ser Lys Leu Ile Cys
1               5
<210>107
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 10
<400>107
Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Ile Thr
1               5                   10                  15
Leu Val Gln
<210>108
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 11
<400>108
Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu
1               5                   10                  15
Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu
            20                  25
<210>109
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 12
<400>109
Gly Ile Val Gln Gln Gln
1               5
<210>110
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 13
<400>110
Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr
1               5                  10                  15
Ala Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser
            20                  25
<210>111
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 14
<400>111
Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu Asn Gln Ser Val Glu
1               5                   10
<210>112
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 15
<400>112
Gly Gly Asn Ser Asn Asn Glu Ser Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Asp
<210>113
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env 16
<400>113
Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg
1               5                   10                  15
Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly
            20                  25                  30
Ser Gly Cys
        35
<210>114
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>114
Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
1               5                   10
<210>115
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>115
Asp Arg Val Tyr Ile His Pro
1               5
<210>116
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>116
Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu
1               5                   10
<210>117
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ab 1-6
<400>117
Asp Ala Glu Phe Arg His
1               5
<210>118
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>环状CCR5 ECL2
<400>118
Cys Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Cys Ser Ser His Phe
1               5                   10                  15
Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe Gln Thr Leu Lys Ile
            20                  25                  30
Cys
<210>119
<211>48
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV gag
<400>119
Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala
1               5                   10                  15
Trp Val Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu
            20                  25                  30
Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val
        35                  40                  45
<210>120
<211>49
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>在C末端具有Iys的HIV gag
<400>120
Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala
1               5                   10                  15
Trp Val Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu
            20                  25                  30
Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val
        35                  40                  45
Lys

Claims (23)

1.一种包含至少一种融合蛋白的修饰的病毒样颗粒(VLP)，其中所述至少一种融合蛋白包含：
(a)第一多肽；和
(b)第二多肽，
其中所述第一多肽是AP205噬菌体的外壳蛋白或其突变蛋白，并且其中所述第二多肽与所述第一多肽在所述第一多肽的N-或C-末端融合。
2.权利要求1的修饰的VLP，其中所述第二多肽包含至少一种抗原。
3.前述权利要求任一项的修饰的VLP，其中所述第一多肽由124-138个氨基酸组成。
4.前述权利要求任一项的修饰的VLP，其中所述AP205噬菌体的外壳蛋白或其突变蛋白选自：
(a)SEQ ID NO：1；
(b)SEQ ID NO：2；
(c)SEQ ID NO：42；
(d)SEQ ID NO：67；
(e)SEQ ID NO：68；
(f)SEQ ID NO：69；和
(g)SEQ ID NO：1或67的突变蛋白。
5.权利要求4的修饰的VLP，其中所述突变蛋白具有如SEQ ID NO：1或67所示的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO：1或67的最多三个氨基酸残基被删除、内部添加或者置换。
6.前述权利要求任一项的修饰的VLP，其中所述融合蛋白还包含间隔区，其中所述间隔区位于所述第一多肽与所述第二多肽之间。
7.权利要求6的修饰的VLP，其中所述间隔区具有最多15个氨基酸。
8.前述权利要求任一项的修饰的VLP，其中所述第二多肽包含至少一种抗原，该抗原选自：
(a)适合于诱导针对癌细胞的免疫应答的抗原；
(b)适合于诱导针对至少一种微生物病原体的免疫应答的抗原；
(c)适合于诱导针对至少一种变应原的免疫应答的抗原；
(d)适合于诱导针对至少一种自身抗原的免疫应答的抗原；
(e)适合于在家畜或宠物中诱导免疫应答的抗原；和
(f)适合于诱导针对多肽毒素或多肽激素的应答的抗原。
9.前述权利要求任一项的修饰的VLP，其中所述至少一种抗原选自：
(a)HIV的多肽；
(b)乙型肝炎病毒的多肽；
(c)流感病毒的多肽；
(d)丙型肝炎病毒的多肽；
(e)弓形体的多肽；
(f)恶性疟原虫的多肽；
(g)间日疟原虫的多肽；
(h)卵形疟原虫的多肽；
(i)三日疟原虫的多肽；
(j)衣原体的多肽；
(k)乳腺癌细胞的多肽；
(l)肾癌细胞的多肽；
(m)前列腺癌细胞的多肽；
(n)皮肤癌细胞的多肽；
(o)脑癌细胞的多肽；
(p)白血病细胞的多肽；
(q)重组抑制蛋白；
(r)参与蜂螯变态反应的多肽；
(s)参与坚果变态反应的多肽；
(t)参与食物变态反应的多肽；
(u)参与哮喘的多肽；
(v)Her2；
(w)GD2；
(x)EGF-R；
(y)CEA；
(z)CD52；
(aa)人黑色素瘤gp100；
(bb)人黑色素瘤melanA；
(cc)酪氨酸酶；
(dd)NA17-A nt；
(ee)MAGE3；
(ff)P53；
(gg)CD21；
(hh)HPV16E7；
(ii)磷脂酶A2蛋白；
(jj)Der p I肽；
(kk)流感M2蛋白；
(ll)(a)至(z)和(aa)至(kk)的所述至少一种抗原的片段；和
(mm)(a)至(z)和(aa)至(kk)的所述至少一种抗原的变体。
10.前述权利要求任一项的修饰的VLP，其中所述至少一种抗原是自身抗原。
11.权利要求10的修饰的VLP，其中所述自身抗原是一种多肽，其选自：
(a)淋巴毒素(优选淋巴毒素α(LTα)，淋巴毒素β(LTβ))；
(b)淋巴毒素受体；
(c)核因子kB配体的受体激活物(RANKL)；
(d)血管内皮生长因子(VEGF)；
(e)血管内皮生长因子受体(VEGF-R)；
(f)白介素-5；
(g)白介素-17；
(h)白介素-13；
(i)IL-23 p19；
(j)生长素释放肽；
(k)CCL21；
(l)CXCL12；
(m)SDF-1；
(n)M-CSF；
(o)MCP-1；
(p)内皮糖蛋白；
(q)GnRH；
(r)TRH；
(s)嗜酸细胞活化趋化因子；
(t)缓激肽；
(u)BLC；
(v)肿瘤坏死因子α；
(w)淀粉样β肽(APi.42)；
(x)Aβ1-6；
(y)血管紧张肽；
(z)CCR5胞外域；
(aa)CXCR4胞外域；
(bb)胃泌素；
(cc)CETP；
(dd)C5a；
(ee)缓激肽；
(ff)Des-Arg缓激肽；
(gg)(a)-(ff)的片段；和
(hh)(a)-(ff)的变体。
12.前述权利要求任一项的修饰的VLP，其中所述第二多肽由5-30个氨基酸组成。
13.前述权利要求任一项的修饰的VLP，其中所述第二多肽包含选自下组的氨基酸序列：
(a)流感病毒M2肽(SEQ ID NO：43)；
(b)乙型肝炎病毒Pre S1肽(SEQ ID NO：62)；
(c)HIV Nef多肽(SEQ ID NO：23)；
(d)GnRH(SEQ ID NO：20)；
(e)胃泌素G17(SEQ ID NO：47)；
(f)猫生长素释放肽(SEQ ID NO：59)；
(g)狗生长素释放肽(SEQ ID NO：58)；
(h)HIV Env肽1(SEQ ID NO：98)；
(i)HIV Env肽2(SEQ ID NO：99)；
(j)CCR5 PNt(SEQ ID NO：45)；和
(k)CCR5 ECL2(SEQ ID NO：91)。
14.前述权利要求任一项的修饰的VLP，其进一步包含至少一种免疫刺激性核酸，其中所述免疫刺激性核酸被包装于所述修饰的VLP内部。
15.权利要求14的修饰的VLP，其中所述核酸包含至少一种未甲基化的CpG基序，所述基序包含序列
GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：71)。
16.一种药物组合物，包含：
(a)前述权利要求任一项的修饰的VLP；和
(b)一种药学上可接受的载体。
17.一种疫苗组合物，包含免疫有效量的权利要求1-15中任一项的修饰的VLP。
18.权利要求17的疫苗组合物，进一步包含佐剂。
19.一种免疫方法，包括向动物或人施用权利要求17-18中任一项的疫苗组合物。
20.一种包含多肽的融合蛋白，其中所述多肽与AP205噬菌体的外壳蛋白或其突变蛋白的N-或C-末端或两个末端融合；并且其中所述多肽由3-10个氨基酸组成；并且其中所述融合蛋白能够形成VLP。
21.一种编码权利要求20的融合蛋白的核苷酸序列。
22.一种生产权利要求1-15中任一项的修饰的VLP的方法，包括以下步骤：
(a)任选地符合读框地连接编码间隔区的核苷酸序列和编码第一多肽的第一核苷酸序列或编码第二多肽的第二核苷酸序列；
(b)符合读框地连接所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列，得到编码所述融合蛋白的第三核苷酸序列；
(c)任选地引入终止密码子，该终止密码子在第一核苷酸序列的3′处引起抑制；
(d)在宿主中表达所述第三核苷酸序列，优选在得到的表达的蛋白质能够形成所述修饰的VLP的条件下进行；
(e)纯化由步骤(d)获得的所述修饰的VLP。
23.一种治疗或预防个体中的疾病、病症或生理状况的方法，其中所述方法包括向动物或人施用权利要求1-15中任一项的修饰的VLP或权利要求16的药物组合物或权利要求17-18的疫苗组合物。
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