CN102573915A

CN102573915A - 流感血凝素组合物及其用途

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Publication number: CN102573915A
Application number: CN2010800190699A
Authority: CN
Inventors: M·巴赫曼; A·杰格勒纳; P·桑丹
Original assignee: Cytos Biotechnology AG
Current assignee: Cytos Biotechnology AG
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2030-04-30
Also published as: CN102573915B; JP2012525134A; EP2424570A1; NZ596058A; US20120263743A1; SG175382A1; WO2010125202A1; CA2759873A1; AU2010243490A1

Abstract

本发明属于医学、公共健康、免疫学、分子生物学和病毒学领域。本发明提供用于治疗、改善和/或预防流感的组合物、疫苗组合物和药物组合物。本发明的组合物、疫苗组合物和药物组合物包含RNA噬菌体的病毒样颗粒和至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段。当施用于动物，优选人时，所述组合物、疫苗组合物和药物组合物有效诱导免疫应答，特别是抗体应答，其中典型地和优选地，所述抗体应答针对流感病毒。因此，本发明还提供治疗、改善和/或预防流感病毒感染的方法。

Description

流感血凝素组合物及其用途

技术领域

本发明属于医学、公共健康、免疫学、分子生物学和病毒学领域。本发明提供用于治疗、改善和/或预防流感的组合物、疫苗组合物和药物组合物。本发明的组合物、疫苗组合物和药物组合物包含RNA噬菌体的病毒样颗粒和至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段。当施用于动物，优选人时，所述组合物、疫苗组合物和药物组合物有效地诱导免疫应答，特别是抗体应答，其中典型地和优选地，所述抗体应答针对流感病毒。因此，本发明还提供治疗、改善和/或预防流感病毒感染的方法。

背景技术

由于禽流感病毒或猪病毒的流行性传播的可能性，高致病性禽流感病毒在家禽中的出现和不同亚型的禽流感病毒或猪病毒传染到人以及这些病毒随后在人群中直接传播的的病例数不断增加对公众健康造成重大威胁(Subbarao等，2007，Nature reviews 7：267-278)。

存在三种类型的流感病毒：A、B和C型流感。B型流感病毒几乎只感染人，且仅含有主要表面糖蛋白(血凝素(HA)和神经氨糖酸苷酶(NA))中的一种。

根据其主要表面糖蛋白(血凝素(HA)和神经氨糖酸苷酶(NA))的遗传性和抗原性的差异，A型流感病毒分为不同的亚型(Wright等，2001，Fields Virology 4th edn.；Eds Knipe D.M.& Howley，P.M.1533-1579)。已知至少有16种不同的HA抗原。这些亚型命名为H1到H16。

HA蛋白介导病毒附着于宿主细胞和病毒侵入细胞的细胞溶质过程中病毒-细胞膜的融合。流感病毒基因组由八个单链的负链RNA片段组成，其中第四大片段编码HA蛋白。

流感HA是同源三聚体的整合膜糖蛋白，其存在于病毒粒子的表面上和受感染细胞上。HA蛋白通过跨膜区锚定在膜上，所述跨膜区是三个单体中各单体的跨越序列(spanning sequence)。流感疫苗的主要保护性效力归因于抑制附着从而抑制细胞感染的抗血凝素抗体(Virelizier J.L.，1975 J.Immunol.115：434-439)。病毒附着的抑制保护个体抵抗感染或严重疾病。保护程度和抗-HA滴度的大小相关。HA糖蛋白合成为HA0前体，其经翻译后切割成HA1和HA2亚基。这种切割在融合肽的N-末端发生，且对融合的发生是必不可少的(Steinhauer D.A.1999 Virology258：1-20)。融合过程要求HA形成同源三聚体(Danieli等，1996 J.CellBiol.133：559-569)。流感病毒按照包括类型、地理来源、株号、分离年份及HA和NA亚型的系统命名法进行描述，例如A/California/04/09(H1N1)来描述。已知至少有16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)(Murphy and Webster，″Orthomyxoviruses″，in Virology，ed.Fields，B.N.，Knipe，D.M.，Chanock，R.M.，1091-1152(Raven Press，NewYork 1990))。已经在感染人的A型流感病毒中鉴别出16种HA亚型中的六种，H1、H2、H3、H5、H7和H9(Cox等，2003 Scandanavian J.of Immun.59：1-15)。

针对HA的抗体可以中和流感病毒感染，并且是抗流感的自然免疫的基础(Clements，″influenza Vaccines″，in Vaccines：New Approaches toImmunological Problems，ed.Ronald W.Ellis，pp.129-150(Butterworth-Heinemann，Stoneham，Mass.1992)。HA分子内的抗原性变异导致流感的频繁爆发和通过接种控制感染的局限性。流感病毒的HA部分是保护性免疫反应的靶标，且可由于抗原性漂移和抗原性转变而变化。

抗原性漂移是指通过包含产生主要表面蛋白(血凝素和神经氨糖酸苷酶)的遗传物质的两种基因中的点突变而发生的小的、逐渐的变化。这些点突变不可预测地发生，并导致这些表面蛋白的微小变化。抗原性漂移产生可能不会被针对先前的流感病毒株的抗体识别的新病毒株。这是为什么人可以不止一次被流感病毒感染以及为什么全球性监测对于监控人流感病毒染色的进化从而选择应该包括在流感疫苗的年度生产中的那些病毒株非常关键的主要理由之一。在大多数年份中，流感疫苗中的三种病毒株的一种或两种进行更新以跟上流行的流感病毒的变化。为此，想要进行抗流感免疫的人们需要每年进行接种(Center for Diseasecontrol and Prevention Subbarao等，2007 Nature reviews 7：267-278)。抗原性转变是A型流感病毒中观察到的现象。它是指产生目前不在人群中流行的新型的人A型流感病毒亚型的突然的、重大的变化。抗原性转变也可以通过直接的动物-人传播或通过混合人A型流感病毒和动物A型流感病毒基因以生成新的人A型流感亚型病毒(通过称为基因重整的过程)而发生。如果遇到以下三种情况，则可发生全球性的流感大流行(世界范围的传播)：(i)A型流感病毒的新亚型被引入人群中；(ii)所述病毒引起人的重病；(iii)所述病毒可以很容易地以持续的方式在人和人之间传播。

大多数市售流感疫苗在含胚的鸡蛋中制备。使用鸡蛋产生每年的流感疫苗有着若干公知的缺点，特别是不能响应于流行病学的或流行性的状况快速地制备出疫苗。已经研究了基于抗原的重组表达的方法作为新的流感疫苗的替代品。在这些疫苗中，蛋白质抗原在原核和真核表达系统例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞中产生。用于流感的重组亚基疫苗的开发是有吸引力的选项，因为避免了培养病毒的需要。

两个主要的问题阻碍了重组流感蛋白质的开发。一方面是低的表达水平，另一方面是在原核细胞中难于表达具有天然构象的蛋白质。例如，HA(流感疫苗的主要成分)被证实难以重组表达。已经报道了毕赤酵母中无锚定膜HA分子的表达(Saelens等，1999 Eur.J.Biochem.260：166-175)。在另一项研究中，Mc Ewen等(1992 Vaccine；10：405-411)证明，克隆到沙门氏菌的鞭毛蛋白基因中的包含H3亚型流感病毒HA分子的18个氨基酸残基表位的合成肽能够在肺中诱导局部IgA，并在小鼠模型中提供抗流感病毒激发的部分保护。类似地，Jeon等(2002 ViralImmunology 15：165-176)报道，基于肺组织匀浆的红血球凝集分析，用蛋白片段HA91-261免疫的小鼠诱导出抗病毒激发的明显保护作用。Song等(2008 PLoS one 3：e2257)制备了其中HA抗原的球形头结构域和有效的TLR5配体鞭毛蛋白融合的疫苗。

发明简述

本发明的主要方面涉及组合物，其包含：(a)病毒样颗粒(VLP)，其具有至少一个第一附着位点，其中优选地所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒；和(b)至少一种抗原，其具有至少一个第二附着位点，其中所述至少一种抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的至少80个连续氨基酸；且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。目前，令人惊异的是我们已经发现本发明的组合物能够诱导免疫应答，特别是抗体应答，从而导致在流感动物模型中对抗流感病毒的致死性激发的高抗体滴度。

发明详述

佐剂：本发明使用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物或允许在宿主中产生储存的物质，当与本发明的疫苗组合物或药物组合物结合时，其提供比单独的所述疫苗组合物或药物组合物所提供的增强的免疫应答。佐剂包括(a)矿物凝胶，优选氢氧化铝；(b)表面活性物质，包括溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油状乳液、钥孔帽贝血蓝蛋白或二硝基酚；和(c)人佐剂，优选BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。佐剂还包括完全和不完全弗氏佐剂、改性的胞壁酰二肽、单磷酰基脂质免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294和病毒体(virosomal)佐剂技术。优选的佐剂是含铝佐剂，优选铝盐，最优选氢氧化铝(Alum)。术语佐剂也包括这些物质的混合物。通常VLP描述为佐剂。然而，本申请上下文内使用的术语“佐剂”是指本发明组合物、疫苗组合物和/或药物组合物包含的非VLP的佐剂。相反，术语佐剂涉及所述组合物、疫苗组合物和/或药物组合物的附加的不同组分。

抗原：如本发明所使用的，术语“抗原”是指如果经MHC分子呈递，能够被抗体或T-细胞受体(TCR)结合的分子。本发明所使用的术语“抗原”也指T-细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别和/或能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，从而导致B-和/或T-淋巴细胞的激活。然而，至少在某些情况下，这可能要求所述抗原包含Th细胞表位或与Th细胞表位连接和/或在佐剂中给出。抗原可以有一个或多个表位(B-和T-表位)。上述的特异性反应意指所述抗原优选与其相应抗体或TCR反应(通常以高选择性的方式)，而不与可能由其他抗原引起的众多其他抗体或TCR反应。除非另有说明，本发明所使用的术语“抗原”不涉及包含于本发明组合物、疫苗组合物和/或药物组合物中的病毒样颗粒。

“相应的”氨基酸位置(H3编号)：流感病毒血凝素蛋白的HA1和HA2亚基的氨基酸序列是高度可变的。因此，这些亚基的氨基酸位置通常不直接编定，而是将它们映射至流感病毒参照株的HA1和HA2亚基氨基酸序列的氨基酸位置上，优选通过结构比对。通常用于本领域中且也用于本发明中的参照株是人A型流感病毒H31968(Wilson等1981，Nature 289：366-373)。因此，优选通过结构比对，血凝素HA1亚基的氨基酸位置映射到人A型流感病毒H3 1968的HA1亚基(SEQ ID NO：75)上，且血凝素HA2亚基的氨基酸位置映射到人A型流感病毒H31 968的HA2亚基(SEQ ID NO：76)上。因此所得到的氨基酸位置的编号系统通常称为“H3编号”。典型地且优选地，所述结构比对基于晶体结构数据进行。可获得亚型H1(Gamblin等，2004 Science303：1838-1842以及本发明引用的参考文献)、H3(Wilson等，1981，Nature289：366-373)、H5(Stevens等，2006，Science 312：404-410)的晶体结构数据。不能获得晶体结构的HA亚型的结构信息可通过基于氨基酸序列的结构模型构建获得。出于本发明的目的，结构模型构建优选通过软件SWISS-MODEL进行。产生基于结构数据的比对的工具和算法是本领域技术人员容易获得的(例如Weis WI等，1990，Refinement of the influenza virus hemagglutinin bysimulated annealing.J Mol Biol.1990Apr 20；212(4)：737-61.)。典型地且优选地，A型流感病毒亚型H1、H2、H3、H5和H9的给定HA1或HA2亚基的氨基酸位置的映射基于Stevens等2004(Science 303：1866-1870，supplementalonline materials，Figure SI)提供的比对。B型流感病毒血凝素的结构从Wang等，2008(J.Virol，p.3011-3020)得知。典型地且优选地，给定的B型流感病毒血凝素HA1亚基的氨基酸位置的H3映射基于Tung等，2004(J Gen Virol.85：3249-59)提供的比对。当给定的氨基酸序列可以映射(即结构上对准)参照氨基酸序列的连续部分(其中所述连续部分由特定氨基酸位置定义)时，则所述给定的氨基酸序列被称为对应于所述参照氨基酸序列上的所述氨基酸位置。典型地且优选地，对应于参照氨基酸序列上的特定氨基酸位置的给定氨基酸序列不包括不能映射到参照氨基酸序列上的任何侧翼序列。因此，术语“对应于SEQ ID NO：75的11位氨基酸到328位氨基酸的氨基酸序列”、“对应于SEQ ID NO：75的11位氨基酸到329位氨基酸的氨基酸序列”、“对应于SEQ ID NO：76的1位到176位的氨基酸序列”或类似的表述例如“对应于由SEQ ID NO：75的115位到261位组成的氨基酸序列的氨基酸序列”是指可以映射(即结构上对准)至由所述位置号定义的参照氨基酸序列的连续片段的氨基酸序列。

流感病毒血凝素蛋白的胞外域(HA胞外域)：如本发明所使用的，术语“流感病毒血凝素蛋白的胞外域”(HA胞外域)是指(i)蛋白质，其中所述蛋白质由以下亚基组成：(a)包含SEQ ID NO：75的11位氨基酸到328位氨基酸或优选由其组成的HA1亚基，和(b)由SEQ ID NO：76的1位到176位组成HA2亚基，和(ii)与其具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、再更优选至少85％、再更优选至少90％、再更优选至少95％、再更优选至少96％、再更优选至少97％、再更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性的任何蛋白质，其中更优选地，所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。术语“流感病毒血凝素蛋白的胞外域”优选是指选自下组的蛋白质：(i)由(a)由SEQ ID NO：75的11位氨基酸到329位氨基酸组成的HA1亚基和(b)由SEQ ID NO：76的1位到176位组成的HA2亚基构成的蛋白质；(ii)由(a)由SEQ ID NO：75的11位氨基酸到328位氨基酸组成的HA1亚基和(b)由SEQID NO：76的1位到176位组成的HA2亚基构成的蛋白质；(iii)由(a)天然存在的流感病毒血凝素蛋白的HA1亚基和(b)天然存在的流感病毒血凝素蛋白的HA2亚基构成的蛋白质，其中所述天然存在的流感病毒血凝素蛋白的所述HA1亚基由对应于SEQ ID NO：75的11位氨基酸到329位氨基酸的氨基酸序列组成，和其中所述天然存在的流感病毒血凝素蛋白的所述HA2亚基由对应于SEQ ID NO：76的1位到176位氨基酸的氨基酸序列组成；(iv)由(a)天然存在的流感病毒血凝素蛋白的HA1亚基和(b)天然存在的流感病毒血凝素蛋白的HA2亚基构成的蛋白质，其中所述天然存在的流感病毒血凝素蛋白的所述HA1亚基由对应于SEQ ID NO：75的11位氨基酸到328位氨基酸的氨基酸序列组成，和其中所述天然存在的流感病毒血凝素蛋白的所述HA2亚基由对应于SEQ ID NO：76的1位到176位氨基酸的氨基酸序列组成；和(v)与(i)、(ii)、(iii)或(iv)所定义的任何一种蛋白质具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、再更优选至少85％、再更优选至少90％、再更优选至少95％、再更优选至少96％、再更优选至少97％、再更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质，其中更优选地，所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。在本发明的HA胞外域中，所述HA1亚基(a)典型地且优选地经由至少一个，优选经由一个或两个，共价键与所述HA2亚基(b)结合，其中优选所述共价键选自肽键和二硫键。非常优选地，所述HA1亚基(a)经由至少一个，优选经由一个或两个，共价键与所述HA2亚基(b)结合，其中至少一个所述共价键是二硫键。非常优选地，所述HA1亚基(a)通过遗传方式与所述HA2亚基(b)的N末端融合，其中所述HA1亚基(a)进一步通过至少一个，优选一个，二硫键与所述HA2亚基(b)结合。应理解，在本发明的某些实施方式中，所述HA1和所述HA2亚基之间的肽键可在融合产物成熟过程中被切割，其中所述二硫键保持完整。因此，所述HA1亚基(a)优选恰好经由一个共价键与所述HA2亚基(b)结合，其中所述共价键是二硫键。然而，本发明也包括HA胞外域是HA1和HA2的融合产物而其中所述HA1和所述HA2亚基之间的肽键保持完整的情况。因此，在本发明的更优选的HA胞外域中，所述HA1亚基(a)通过遗传方式与所述HA2亚基(b)的N末端融合，其中所述HA1亚基(a)通过一个第一共价键和通过至少一个，优选一个，第二共价键与所述HA2亚基(b)结合，其中所述第一共价键是肽键和其中所述至少一个第二共价键是二硫键。

“天然存在”：对于流感病毒或相对于流感病毒株来说，术语“天然存在”是指存在于天然宿主群体，优选人群，中的流感病毒或流感病毒株。典型地且优选地，天然存在的流感病毒或流感病毒株从所述群体的被感染个体分离。对于流感病毒血凝素蛋白或对于HA胞外域而言，术语“天然存在”是指天然存在的流感病毒或天然存在的流感病毒株的流感病毒血凝素蛋白或HA胞外域。

所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段：如本发明所使用的，术语“所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段”是指流感病毒血凝素蛋白的一部分，且包含A或B型流感病毒的流感病毒血凝素蛋白胞外域，优选流感病毒血凝素蛋白胞外域的HA1亚基的至少80个、或至少100个、或至少150个、或至少180个、或至少190个、或至少200个、或至少210个、或至少220个、或至少230个、或至少250个、或至少270个、或至少290个、或至少310个或至少320个连续氨基酸。术语所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段也包括流感病毒血凝素蛋白的部分，其中所述片段通过所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的N和/或C末端的一个或更多个氨基酸的缺失来衍生。所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段优选包含其二级结构的特定元件。基于可从现有技术获得的结构数据，本领域技术人员可很容易地确认这种结构元件。在非常优选的实施方式中，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含流感病毒血凝素蛋白的至少一个八链的胶冻卷桶(Jelly roll barrel)和至少一个α-螺旋。在优选实施方式中，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含受体结合域或优选由受体结合域组成。在进一步的优选实施方式中，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段还包含痕迹酯酶域。典型地且优选地，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含至少一对和至多四对能形成分子内二硫键的半胱氨酸残基。更优选地，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含两对能形成分子内二硫键的半胱氨酸残基。优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段通过在真核或原核表达系统中，优选原核表达系统中，最优选大肠杆菌中的重组表达获得。典型地且优选地，当与本发明的病毒样颗粒结合时，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段能够诱导红血球的红血球凝集，其中所述红血球优选来源于鸡、火鸡、马或人类。因此当在0.50μg或更低的偶联物/1μl的1％红血球的浓度下观察到红血球凝集时，与本发明病毒样颗粒结合的所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段被认为能够诱导红血球的红血球凝集。因此红血球凝集试验优选按照实施例35所描写的进行。

所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的HA1亚基的54a位：A或B型流感病毒的天然存在的氨基酸序列可以具有异源氨基酸残基的插入。例如，位置“54a”是指如Russell等，2004(Virology 325：287-296)的图1所描述的插入。因此，对于A型流感病毒亚型H1，54a位的氨基酸是赖氨酸。

结合：本发明所使用的术语“结合的”或“结合”是指化学和/或物理相互作用，两个分子通过该作用连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价相互作用。优选的非共价相互作用是离子相互作用、疏水相互作用或氢键。优选的共价相互作用是共价键，最优选酯键、醚键、磷酯键、酰胺键、肽键、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。

附着位点，第一：如本发明所使用的，“第一附着位点”是指VLP天然存在的或人工添加到VLP上的，且第二附着位点可以连接至其上的元件。优选第一附着位点包含化学反应性基团或者是化学反应性基团，优选氨基、羧基、巯基、羟基、胍基(guanidinyl)、组氨基或其组合。非常优选地，所述第一附着位点包含氨基或者是氨基。因此，术语第一附着位点也包括蛋白质、多肽、肽以及优选氨基酸残基。术语第一附着位点还包括其他的反应化学残基，包括糖、生物素、荧光素、视黄醇和洋地黄毒甙。在优选实施方式中，所述第一附着位点是化学反应性基团，优选氨基酸残基的氨基，最优选赖氨酸残基的氨基。在进一步的优选实施方式中，所述第一附着位点是氨基或羧基，优选氨基酸残基的氨基或羧基。优选所述第一附着位点位于VLP的表面上，最优选位于VLP的外表面上。另外优选地，多个第一附着位点存在于VLP的表面上，优选存在于VLP的外表面上，典型地且优选地以重复构型存在。在优选的实施方式中，所述第一附着位点通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键与VLP结合。在进一步的优选实施方式中，所述第一附着位点天然存在于VLP。在非常优选的实施方式中，所述第一附着位点是VLP包含的蛋白质的氨基酸残基的氨基，其中更优选所述第一附着位点是VLP蛋白包含的赖氨酸残基的氨基。在还进一步的优选实施方式中，所述第一附着位点是VLP包含的外壳蛋白的氨基酸残基的氨基，其中更优选所述第一附着位点是VLP的外壳蛋白包含的赖氨酸残基的氨基。或者，在优选实施方式中，所述第一附着位点是人工添加到VLP上的。

附着位点，第二：如本发明所使用的，“第二附着位点”是指抗原天然存在的或人工加到抗原上的，且第一附着位点可以连接至其上的元件。所述抗原的第二附着位点优选是蛋白质、多肽、肽、氨基酸、糖或化学反应性基团，例如氨基、羧基或巯基。在优选实施方式中，所述第二附着位点是化学反应性基团，优选氨基酸的化学反应性基团。在非常优选的实施方式中，所述第二附着位点是巯基，优选氨基酸的巯基，最优选半胱氨酸残基的巯基。在进一步的优选实施方式中，所述第二附着位点是氨基或羧基，优选氨基酸残基的氨基或羧基。因此，术语“具有至少一个第二附着位点的抗原”是指含有抗原和至少一个第二附着位点的构造体。在一个实施方式中，所述第二附着位点是抗原内天然存在的。在另一个实施方式中，所述第二附着位点(优选通过接头)人工添加到所述抗原上。因此，具有至少一个第二附着位点的抗原(其中所述第二附着位点不是天然存在于所述抗原内的)典型地且优选地还包含“接头”。在优选实施方式中，所述第二附着位点通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键与所述抗原结合。

接头：本发明所使用的“接头”或者将所述第二附着位点与抗原结合，或者其包含第二附着位点、基本上由第二附着位点组成或由第二附着位点组成。优选地，所述“接头”包含第二附着位点或由第二附着位点组成，其中更优选所述第二附着位点是一个氨基酸残基，优选半胱氨酸残基。含有至少一个氨基酸残基的接头也称为氨基酸接头。在非常优选的实施方式中，所述接头是氨基酸接头，其中优选所述氨基酸接头仅由氨基酸残基组成。本发明接头的进一步优选的实施方式是包含巯基或半胱氨酸残基的分子。接头与抗原的结合优选借助于至少一个共价键，更优选借助于至少一个肽键。在VLP和抗原通过基因融合连接的情况中，接头可以不存在或者优选是氨基酸接头，更优选仅由氨基酸残基组成的氨基酸接头。

有序和重复的抗原阵列：如本发明所使用的，术语“有序和重复的抗原阵列”是指抗原的重复模式。有序和重复的抗原阵列的特征在于相对于病毒样颗粒抗原在空间排列上的一般和优选的高度均匀性。在本发明的一个实施方式中，重复模式是几何模式。优选的有序和重复的抗原阵列由与RNA噬菌体的VLP偶联的抗原形成。有序和重复的抗原阵列由通过与RNA噬菌体的VLP接合的抗原形成的有序和重复的抗原阵列典型地且优选地具有抗原的严格重复的拟晶体秩序，优选具有1到30纳米，优选2到15纳米，更优选2到10纳米，还更优选2到8纳米和再更优选1.6到7纳米的间隔。

多肽：本发明所使用的术语“多肽”是指通过酰胺键(又名肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。它表示氨基酸的分子链，且不涉及产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质也包括在多肽的定义中。多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等也包括在内。

序列同一性(氨基酸序列)：两个给定的氨基酸序列之间的序列同一性百分比通过任何标准算法确定，优选通过Bestfit程序中实施的算法确定。典型地且优选地应用所述算法的缺省参数设置，优选Bestfit算法的缺省参数设置。该方法适用于确定本发明公开的任何蛋白质、多肽或其片段的氨基酸序列之间的序列同一性。

外壳蛋白：术语“外壳蛋白”是指病毒蛋白，优选指病毒(优选RNA噬菌体)的天然衣壳的亚基，其能够结合入病毒衣壳或VLP中。术语外壳蛋白包括天然存在的外壳蛋白以及重组表达的外壳蛋白。还包括外壳蛋白的突变体和片段，其中所述突变体和片段保持形成VLP的能力。

病毒样颗粒(VLP)：如本发明所使用的，其是指非复制性的或非感染性的，优选非复制性和非感染性的病毒颗粒，或是指非复制性的或非感染性的，优选非复制性和非感染性的类似于病毒颗粒的结构，优选病毒衣壳。本发明所使用的术语“非复制性的”是指不能复制VLP所包含的基因组。本发明所使用的术语“非感染性的”是指不能进入宿主细胞。优选地，本发明的病毒样颗粒是非复制性的和/或非感染性的，因为它缺少全部或部分病毒基因组或基因组功能。在一个实施方式中，病毒样颗粒是病毒颗粒，其中病毒基因组已被物理或化学地灭活。通常且更优选地，病毒样颗粒缺少病毒基因组的全部或部分复制性和感染性组分。本发明的病毒样颗粒可以包含明显不同于其基因组的核酸。本发明病毒样颗粒的典型和优选的实施方式是病毒衣壳，例如相应病毒、噬菌体(优选RNA噬菌体)的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指由病毒蛋白亚基组成的高分子装配体，其中优选所述病毒蛋白亚基是所述病毒的外壳蛋白。通常，存在60、120、180、240、300、360和超过360个病毒蛋白亚基，优选外壳蛋白亚基。典型地且优选地，这些亚基的相互作用导致形成具有固有的重复性组织的病毒衣壳，其中所述结构通常是球形或管形的。例如，RNA噬菌体的衣壳具有二十面体对称的球形形状。病毒样颗粒的一个特征是其亚基的高度有序的和重复性的排列。

RNA噬菌体的病毒样颗粒：如本发明所使用的，术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指含有RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段、优选基本上由其组成或由其组成的病毒样颗粒。另外，RNA噬菌体的病毒样颗粒类似于RNA噬菌体的结构，是非复制性的和/或非感染性的，且至少缺少编码RNA噬菌体的复制机制的一个或多个基因，且通常也缺少编码负责使病毒附着于宿主或进入宿主的一种或多种蛋白的一个或多个基因。该定义也包括RNA噬菌体的病毒样颗粒，其中上述一个或多个基因仍然存在但是是失活的，并因此也导致RNA噬菌体的非复制性的和/或非感染性的病毒样颗粒。来源于RNA噬菌体的优选VLP显示二十面体对称性且由180个亚基(单体)组成。使RNA噬菌体的病毒样颗粒具有非复制性和/或非感染性的优选方法是通过物理、化学灭活，例如UV照射、甲醛处理，典型地且优选地通过遗传学操作。

重组VLP：本发明所使用的术语“重组VLP”是指通过包括至少一个重组DNA技术的步骤的方法获得的VLP。典型地且优选地，重组VLP通过在宿主中，优选细菌细胞中的重组病毒外壳蛋白的表达而获得。

免疫刺激核酸：如本发明所使用的，术语免疫刺激核酸是指能够诱导和/或增强免疫反应的核酸。免疫刺激核酸包括核糖核酸和特别是脱氧核糖核酸，当核糖核酸和脱氧核糖核酸两者可以是双链或单链的。优选的ISS-NA是脱氧核糖核酸，其中更优选所述脱氧核糖核酸是单链的。优选地，免疫刺激核酸包含至少一个含有非甲基化C的CpG基序。非常优选的免疫刺激核酸包含至少一个CpG基序，其中所述至少一个CpG基序包含至少一个(优选一个)CG二核苷酸，或优选由至少一个(优选一个)CG二核苷酸组成，其中所述C是非甲基化的。优选的但非必须的，所述CG二核苷酸是回文序列的一部分。术语免疫刺激核酸也指包含修饰碱基，优选4-溴-胞嘧啶的核酸。在本发明的情况中特别优选的是能刺激树状细胞中产生IFN-α的ISS-NA。可用于本发明目的的免疫刺激核酸例如描述在WO2007/068747A1中。

寡核苷酸：如本发明所使用的，术语“寡核苷酸”是指含有2个或更多个核苷酸，优选约6到约200个核苷酸，更优选20到约100个核苷酸，最优选20到40个核苷酸的核酸序列。非常优选地，寡核苷酸包含约30个核苷酸，更优选寡核苷酸包含正好30个核苷酸，最优选寡核苷酸由正好30个核苷酸组成。寡核苷酸是聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，且优选选自下组：(a)未修饰的RNA或DNA，和(b)修饰的RNA或DNA。修饰可以包括骨架或核苷酸类似物。寡核苷酸优选选自下组：(a)单链和双链DNA，(b)作为单链和双链区域的混合物的DNA，(c)单链和双链RNA，(d)作为单链和双链区域的混合物的RNA，和(e)含有为单链的区域或更优选双链的区域或单链和双链区域的混合物的DNA和RNA的杂交分子。优选的核苷酸修饰/类似物选自下组：(a)肽核酸，(b)肌苷(inosin)，(c)三苯甲基化碱基，(d)硫逐磷酸酯，(e)烷基硫逐磷酸酯，(f)5-硝基吲哚脱氧呋喃糖基(5-nitroindoledesoxyribofuranosyl)，(g)5-甲基脱氨氧胞苷和(h)5，6-二氢-5，6-二羟基脱氧胸苷。硫代磷酸酯化r(phosphothioated)核苷酸在细胞或生物体中抵抗降解，并因此是优选的核苷酸修饰。仅由磷酸二酯结合的核苷酸组成的未修饰寡核苷酸通常活性高于修饰的核苷酸，因此通常在本发明的情况中是优选的。最优选的是仅由磷酸二酯结合的脱氧核苷酸组成的寡核苷酸，其中更优选所述寡核苷酸是单链的。进一步优选的是能刺激细胞(优选树状细胞)中产生IFN-α的寡核苷酸。非常优选的能刺激细胞产生IFN-α的寡核苷酸选自A型CpG和C型CpG。

CpG基序：如本发明所使用的，术语“CpG基序”是指包括被在中央CpG(的3′和5′侧)侧翼的至少一个碱基(优选一个或二个核苷酸)围绕的非甲基化中央CpG(即非甲基化CpG二核苷酸，其中所述C是非甲基化的)的核苷酸模式。典型地且优选地，本发明所使用的CpG基序包含非甲基化的CpG二核苷酸和在其5′和3′末端的两个核苷酸或由其组成。不被理论束缚，在CpG侧翼的碱基赋予CpG寡核苷酸活性的重要部分。

含有非甲基化CpG的寡核苷酸：如本发明所使用的，术语“含有非甲基化CpG的寡核苷酸”或“CpG”是指包含至少一个CpG基序的寡核苷酸，优选寡脱氧核苷酸。因此，CpG包含至少一个非甲基化的胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸。例如，优选的CpG刺激/激活来源于脊椎动物骨髓的细胞，例如对其具有促有丝分裂效应或者诱导或增加其细胞因子表达。例如，CpG可用于激活B细胞、NK细胞和抗原呈递细胞，例如树状细胞、单核细胞和巨噬细胞。优选地，CpG涉及包含3′端紧接鸟嘌呤核苷的非甲基化胞嘧啶的寡脱氧核苷酸，优选单链寡脱氧核苷酸，其中所述非甲基化的胞嘧啶和所述鸟嘌呤核苷经由磷酯键连接，其中优选所述磷酯键是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键，其中更优选所述磷酯键是磷酸二酯键。CpG可以包括核苷酸类似物(例如包含硫逐磷酸酯键(phosphorothioester bond)的类似物)，且可以是双链或单链的。通常，双链分子在体内更加稳定，而单链分子具有更高的免疫活性。优选地，如本发明所使用的，CpG是长度至少约十个核苷酸且包含至少一个CpG基序的寡核苷酸，其中更优选所述CpG长度为10到60个、更优选15到50个、还更优选20到40个、还更优选约30个和最优选正好30个核苷酸。CpG可以由甲基化和/或非甲基化的核苷酸组成，其中所述至少一个CpG基序包含至少一个CG二核苷酸，其中所述C是非甲基化的。所述CpG也可以包含甲基化和非甲基化序列延伸，其中所述至少一个CpG基序包含至少一个CG二核苷酸，其中所述C是非甲基化的。非常优选地，CpG涉及包含3′端紧接鸟嘌呤核苷的非甲基化胞嘧啶的单链寡脱氧核苷酸，其中所述非甲基化胞嘧啶和所述鸟嘌呤核苷通过磷酸二酯键连接。CpG可以包括核苷酸类似物，例如包含硫逐磷酸酯键的类似物，且可以是双链或单链的。通常，磷酸二酯CpG是如下所示的A型CpG，而硫代磷酸酯稳定的CpG是B型CpG。本发明情况中优选的CpG寡核苷酸是A型CpG。

A型CpG：如本发明所使用的，“A型CpG”或“D型CpG”是指含有至少一个CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)。A型CpG优先刺激T细胞的活化和树状细胞的成熟，且能够刺激IFN-α产生。在A型CpG中，至少一个CpG基序的核苷酸通过至少一个磷酸二酯键连接。A型CpG包含至少一个磷酸二酯键CpG基序，其可在其5′端和/或(优选和)其3′端被硫逐磷酸酯键结合的核苷酸侧邻。优选地，CpG基序且因此优选的CG二核苷酸及其含有至少一个，优选两个核苷酸的直接侧邻区域由磷酸二酯核苷酸组成。优选的A型CpG仅由磷酸二酯(PO)键核苷酸组成。典型地且优选地，多聚G基序包含至少一个，优选至少三个，至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个G(鸟嘌呤核苷)，最优选至少10个G；或多聚G基序由至少一个，优选至少三个，至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个G(鸟嘌呤核苷)，最优选至少10个G组成。优选地，本发明的A型CpG包含回文序列或由回文序列组成。

回文序列：回文序列是，当以具有规则碱基对(A/T；C/G)的双链核酸形式存在时，其由沿5′-3′方向具有相同序列的两条单链组成的核苷酸序列。

包装的：本发明所使用的术语“包装的”是指免疫刺激核酸相对于VLP的状态。本发明所使用的术语“包装的”包括可以是共价(例如通过化学偶联)或非共价(例如，离子相互作用、疏水性相互作用、氢键等)的结合。该术语也包括免疫刺激核酸的包被或部分包被。因此，免疫刺激核酸可以被VLP包被而不存在实际的结合，特别是共价结合。在优选的实施方式中，所述免疫刺激核酸包装在VLP内，最优选以非共价方式包装在VLP内。在所述免疫刺激核酸是DNA，优选含有非甲基化CpG的寡核苷酸的情况下，术语“包装的”意味着所述免疫刺激核酸，优选所述含有非甲基化CpG的寡核苷酸不能被利用进行核酸酶水解，优选不能被利用进行DNA酶水解(例如DNA酶I或Benzonase)，其中优选所述可利用性通过WO2003/024481A2的实施例11-17所描写的方法检测。

一个、一或一种：当术语“一个”、“一”或“一种”用于本公开中时，除非另有说明，它们是指“至少一个”或“一个或多个”。

一方面，本发明涉及一种组合物，其包含：(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中优选所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域(HA胞外域)或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的至少80个连续氨基酸；且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。

在优选的实施方式中，所述HA胞外域是蛋白质，其中所述蛋白质由以下亚基组成：(a)HA1亚基，其包含SEQ ID NO：75的11位氨基酸到328位氨基酸或优选由其组成，和(b)HA2亚基，其由SEQ ID NO：76的1到176位组成。

在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域是A型流感病毒的HA胞外域，其中优选所述A型流感病毒属于天然存在的A型流感病毒株。在进一步的优选实施方式中，所述天然存在的A型流感病毒株选自下组：(a)A/California/04/2009(H1N1)(Genbank登录号：ACP41105.1)(SEQ ID NO.74)；(b)A/Brisbane/59/2007(H1N1)(Genbank登录号：ACA28844.1)(SEQ IDNO.73)；(c)A/Albany/1/1968(H2N2)(Genbank登录号：ABO52247.1)；(d)A/northern shoveler/California/HKWF 1128/2007(H2N7)(Genbank登录号：ACF47420.1)；(e)A/Uruguay/716/2007 X-175(H3N2)(Genbank登录号：ACD47234.1)(SEQ ID NO.40)；(f)A/ruddy turnstone/NewJersey/Sg-00542/2008(H4N6)(Genbank登录号：ACN86642.1)；(g)A/VietNam/1203/2004(H5N1)(Genbank登录号：ABP51977.1)(SEQ ID NO.41)；(h)A/Indonesia/5/2005(H5N1)(Genbank登录号：ABW06108.1)(SEQ ID NO.42)；(i)A/Egypt/2321-NAMRU3/2007(H5N1)(Genbank登录号：ABP96850.1)(SEQID NO.43)；(j)A/northern shoveler/California/HKWF383/2007(H6N1)(Genbank登录号：ACE76614.1)；(k)A/Canada/rv504/2004(H7N3)(Genbank登录号：ABI85000.1)；(l)A/duck/Mongolia/119/2008(H7N9)(Genbank登录号：BAH22785.1)；(m)A/mallard/Minnesota/Sg-00570/2008(H8N4)(Genbank登录号：ACN86714.1)；(n)A/HK/2108/2003(H9N2)(Genbank登录号：ABB58945.1)；(o)A/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2)(Genbank登录号：ABQ57378.1)；(p)A/chicken/Anhui/AH16/2008(H9N2)(Genbank登录号：ACJ35235.1)；(q)A/ruddy turnstone/New Jersey/Sg-00490/2008(H10N7)(Genbank登录号：ACN86516.1)；(r)A/ruddy turnstone/NewJersey/Sg-00561/2008(H11N9)(Genbank登录号：ACN86684.1)；(s)A/ruddyturnstone/New Jersey/Sg-00484/2008(H12N5)(Genbank登录号：ACN86498.1)；(t)A/herring gull/Norway/10_2336/2006(H13N6)(Genbank登录号：CAQ77191.1)；(u)A/mallard duck/Astrakhan/263/1982(H 14N5)(Genbank登录号：ABI84453.1)；(v)A/Australian shelduck/Western Australia/1756/1983(H15N2)(Genbank登录号：ABB90704.1)；(w)A/herringgull/Norway/10_1623/2006(H16N3)(Genbank登录号：CAQ77189.1)；(x)A/California/07/2009(H1N1)(Genbank登录号：ACP44189.1)和(y)A/Perth/16/2009(H3N2)(Genbank登录号：ACS71642.1)。在非常优选的实施方式中，所述天然存在的A型流感病毒株是A/California/07/2009(H1N1)(Genbank登录号：ACP44189.1)或A/Perth/16/2009(H3N2)(Genbank登录号：ACS71642.1)。

在本发明的优选实施方式中，所述HA胞外域选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16的胞外域。优选地，所述HA胞外域选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型H1、H2、H3、H5、H7和H9的胞外域，其中更优选地，所述HA胞外域选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型H1、H2、H3、H5和H9的胞外域，其中再更优选地所述HA胞外域选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型H1、H3和H5的胞外域。此外更优选所述HA胞外域选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型H1、H2和H3的胞外域。在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域是A型流感病毒血凝素蛋白亚型H1的胞外域。在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域是A型流感病毒血凝素蛋白亚型H3的胞外域。在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域是A型流感病毒血凝素蛋白亚型H3的胞外域。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域是A型流感病毒血凝素蛋白亚型H5的胞外域。

在进一步的优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO：39具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。

在其他优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ IDNO：40具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。

在其他优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ IDNO：41具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。

在其他优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ IDNO：42具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。

在其他优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ IDNO：43具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。

在其他优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ IDNO：73具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。

在其他优选实施方式中，所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ IDNO：74具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中更优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是天然存在的A型流感病毒血凝素蛋白胞外域。

在其他优选实施方式中，所述HA胞外域是B型流感病毒的HA胞外域，其中优选所述B型流感病毒属于天然存在的B型流感病毒株。在优选实施方式中，所述天然存在的B型流感病毒株选自下组：(a)B/Brisbane/33/2008(Genbank登录号：ACN29387.1)；(b)B/Guangzhou/01/2007(Genbank登录号：ABX71684.1)和(c)B/Brisbane/60/2008(Genbank登录号：ACN29383.1)。

在进一步的优选实施方式中，所述抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域，其中优选所述流感病毒血凝素蛋白的胞外域是三聚体形式。在进一步的优选实施方式中，所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述三聚体形式可通过包括以下步骤的方法获得：(i)通过将噬菌体T4蛋白fibritin或其功能片段的三聚化域与所述流感病毒血凝素蛋白胞外域，优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的C末端融合而重组形成构建体；(ii)在基于真核或原核细胞的系统中，优选在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达所述构建体；(iii)纯化所述三聚体形式。在优选实施方式中，所述噬菌体T4蛋白fibritin的三聚化域是SEQ IDNO：95或其功能片段。在非常优选的实施方式中，所述噬菌体T4蛋白fibritin的三聚化域是SEQ ID NO：95。该构建体的表达优选在Hi5或sf21昆虫细胞中，优选在sf21昆虫细胞中进行。所述抗原还可以在所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的C末端引入His-标签，以使得能够纯化。所述His-标签优选包含与包含三聚化序列的所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的C末端融合，优选与所述流感病毒血凝素的胞外域的C末端融合的3到6个组氨酸残基，优选6个组氨酸残基。

在进一步的优选实施方式中，所述抗原是所述HA胞外域的片段，其中优选所述HA胞外域的所述片段是所述HA胞外域的所述HA1亚基或所述HA胞外域的所述HA1亚基的片段。

在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的11位到328位的氨基酸序列，或优先由对应于SEQ ID NO：75的11位到328位的氨基酸序列组成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段由对应于SEQ ID NO：75的11位到329位的氨基酸序列组成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ IDNO：75的115位到261位的氨基酸序列，或优先由对应于SEQ ID NO：75的115位到261位的氨基酸序列组成。在其他优选的实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的50位到261位的氨基酸序列，或由对应于SEQ ID NO：75的50位到261位的氨基酸序列组成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的98和195位的酪氨酸，对应于SEQ ID NO：75的153位的色氨酸和对应于SEQID NO：75的183位的组氨酸的氨基酸残基。

在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含至少一个二硫键，优选至少2个二硫键，更优选至少3个，还更优选至少4个二硫键。因此，在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的97和139位的半胱氨酸残基，优选所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的64、76、97、139位的半胱氨酸残基，更优选所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的52、64、76、97、139、277、281、305位的半胱氨酸残基。

在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段是所述HA胞外域的HA1亚基的片段。在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的57位到270位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的57位到270位的氨基酸序列组成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的57位到276位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的57位到276位的氨基酸序列组成。

在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的46位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的46位到310位的氨基酸序列组成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的46位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的46位到310位的氨基酸序列组成，其中所述HA胞外域与A型流感病毒株A/California/07/2009(H1N1)(Genbank登录号：ACP44189.1)或A/Perth/16/2009(H3N2)(Genbank登录号：ACS71642.1)的HA胞外域具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性，且其中优选所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。

在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的46位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的46位到310位的氨基酸序列组成，其中所述HA胞外域与B型流感病毒株B/Brisbane/33/2008(Genbank登录号：ACN29387.1)、B/Guangzhou/01/2007(Genbank登录号：ABX71684.1)或B/Brisbane/60/2008(Genbank登录号：ACN29383.1)的HA胞外域具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性，且其中优选所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。

在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的42位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的42位到310位的氨基酸序列组成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的42位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的42位到310位的氨基酸序列组成，其中所述HA胞外域与A型流感病毒株A/California/07/2009(H1N1)(Genbank登录号：ACP44189.1)或A/Perth/16/2009(H3N2)(Genbank登录号：ACS71642.1)的HA胞外域具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性，且其中优选所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。

在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的42位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的42位到310位的氨基酸序列组成，其中所述HA胞外域与B型流感病毒株B/Brisbane/33/2008(Genbank登录号：ACN29387.1)、B/Guangzhou/01/2007(Genbank登录号：ABX71684.1)或B/Brisbane/60/2008(Genbank登录号：ACN29383.1)的HA胞外域具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性，且其中优选所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。

在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的54位到276位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的54位到276位的氨基酸序列组成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的54位到270位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的54位到270位的氨基酸序列组成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的54a到276位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的54a到276位的氨基酸序列组成。在其他优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的54a到270位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的54a到270位的氨基酸序列组成。

在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段的氨基酸序列是与选自下组的氨基酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、最优选至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：67的2到277位；(b)SEQ ID NO：68的2到273位；(c)SEQ ID NO：69的2到230位；(d)SEQ ID NO：70的2到230位；(e)SEQ ID NO：71的2到224位；(f)SEQ ID NO：72的2到221位；(g)SEQ ID NO：84；(h)SEQ ID NO：85；(i)SEQID NO：86；(j)SEQ ID NO：88；(k)SEQ ID NO：89；和(l)SEQ ID NO：90。

在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段的氨基酸序列是选自下组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：67的2到277位；(b)SEQ ID NO：68的2到273位；(c)SEQ ID NO：69的2到230位；(d)SEQ ID NO：70的2到230位；(e)SEQ ID NO：71的2到224位；和(f)SEQ ID NO：72的2到221位；(g)SEQ ID NO：84；(h)SEQ ID NO：85；(i)SEQ ID NO：86；(j)SEQ ID NO：88；(k)SEQ ID NO：89；和(l)SEQ ID NO：90。

在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段的氨基酸序列是与SEQ ID NO：87具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、最优选至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在进一步的优选实施方式中，所述HA胞外域的所述片段的氨基酸序列是SEQ ID NO：87。

在进一步的优选实施方式中，具有至少一个第二附着位点的所述至少一种抗原还包含接头，其中所述接头包含所述第二附着位点或由所述第二附着位点组成。在优选实施方式中，所述接头经由一个肽键与所述抗原结合，其中优选所述接头选自下组：(a)半胱氨酸残基；(b)CGG和(c)GGC。具有至少一个第二附着位点的所述至少一种抗原还可以在所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的C末端引入His-标签。

因此，在进一步的优选实施方式中，具有至少一个第二附着位点的所述至少一种抗原包含SEQ ID NO：67到72中的任何一个，或优选由SEQ ID NO：67到72中的任何一个组成。因此，本领域技术人员应理解，重组产生的多肽的N末端甲硫氨酸残基可被切割掉。因此，在进一步的优选实施方式中，所述至少一种抗原包含SEQ ID NO：84到90中的任何一个。

在进一步的优选实施方式中，本发明组合物能以1μl的1％红血球中小于0.50μg的所述组合物的浓度诱导红血球的红血球凝集。因此，红血球凝集试验优选在实施例35所描写的条件下进行。

本发明优选涉及WO2007/068747A1的46-52页公开的病毒的病毒样颗粒，所述文献以引用方式合并于此。在优选实施方式中，所述VLP是重组VLP。重组VLP通过在宿主细胞中，优选在细菌细胞中，最优选在大肠杆菌中表达外壳蛋白而获得。

在其他优选实施方式中，所述VLP是RNA噬菌体的VLP。本发明优选涉及WO2007/068747A1的49-50页公开的RNA噬菌体的病毒样颗粒，所述文献以引用方式合并于此。

RNA噬菌体的外壳蛋白的特别有利之处是它们能够容易地在细菌表达系统，特别是在大肠杆菌中表达。因此，在本发明的一个优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成。优选的RNA噬菌体的外壳蛋白是如WO2007/068747A1的SEQ ID NO：3到23所公开的外壳蛋白。在优选的实施方式中，所述病毒样颗粒包含重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成，其中优选所述重组外壳蛋白是RNA噬菌体的重组外壳蛋白。在其他优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ、RNA噬菌体AP205或RNA噬菌体的重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成。在其他优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成，所述重组外壳蛋白包含或优选由选自下组的氨基酸序列组成：(a)SEQ ID NO：1(Qβ外壳蛋白)；(b)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的混合物(QβA1蛋白)；(c)SEQ ID NO：19(AP205外壳蛋白)；(d)SEQ ID NO：92

(e)SEQ ID NO：93

和(f)SEQID NO：94(

双Cys)。

在一个优选的实施方式中，所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP。因此，在进一步的优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ的重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成。在其他优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含含有SEQ ID NO：1或优选由SEQ ID NO：1组成的重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成。WO 02/056905公开了进一步优选的RNA噬菌体，特别是噬菌体Qβ和噬菌体fr的病毒样颗粒，所述公开以引用方式全部合并于此。特别是，WO 02/056905的实施例18包含制备噬菌体Qβ的VLP颗粒的详细说明。

在其他优选实施方式中，所述VLP是噬菌体AP205的VLP。因此，在进一步的优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成。在其他实施方式中，所述病毒样颗粒包含含有或优选由SEQ ID NO：19组成的重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成。其他优选的噬菌体AP205的VLP是公开于WO2004/007538，特别其实施例1和实施例2中的那些。

在其他优选实施方式中，所述VLP是RNA噬菌体

的VLP。因此，在进一步的优选实施方式中，所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成。在其他实施方式中，所述病毒样颗粒包含含有或优选由SEQ ID NO：92到94中的任何一个，优选SEQ ID NO：92组成的重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成。

在另一方面，本发明涉及制备本发明组合物的方法，包括(a)提供具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒；(b)提供具有至少一种第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的至少80个连续氨基酸；和(c)将所述病毒样颗粒和所述至少一种抗原组合以制备所述组合物，其中所述至少一种抗原和所述病毒样颗粒通过第一和第二附着位点连接。在优选的实施方式中，通过表达，优通过由在细菌系统，优选大肠杆菌中的表达来提供具有至少一种第二附着位点的至少一种抗原。

在一个优选实施方式中，具有至少一个第一附着位点的所述病毒样颗粒和具有所述至少一个第二附着位点的所述至少一种抗原经由至少一个肽共价键连接。编码所述抗原的基因与编码外壳蛋白的基因在内部同框接合或优选地同框接合到编码外壳蛋白的基因的N末端或C末端，其中融合蛋白优选保持形成病毒样颗粒的能力。进一步的实施方式包括如Kozlovska，T.M.等，Intervirology 39：9-15(1996)，Pushko P.等，Prot.Eng.6：883-891(1993)、WO92/13081或US 5,698,424中所描述的抗原与外壳蛋白序列的融合。

在进一步的优选实施方式中，具有至少一个第一附着位点的所述病毒样颗粒和具含有所述至少一个第二附着位点的所述至少一种抗原经由至少一个非肽共价键连接。在进一步的优选实施方式中，所述第一附着位点和所述第二附着位点经由至少一个非肽共价键连接。

衣壳和抗原性蛋白经由二硫键的连接特别地对于含有巯基部分的分子不稳定，而且在血清中比例如在硫醚连接更不稳定(Martin FJ.和Papahadjopoulos D.(1982)，Irreversible Coupling of Immunoglobulin Fragmentsto Preformed Vesicles.J.Biol.Chem.257：286-288)。因此，在进一步的非常优选的实施方式中，具有至少一个第一附着位点的所述病毒样颗粒和具有所述至少一个第二附着位点的所述至少一种抗原之间的结合或连接不包括硫-硫键。在其他非常优选的实施方式中，所述至少一个第一附着位点不是或不包含巯基。在再另外的非常优选的实施方式中，所述至少一个第一附着位点不是或不包含半胱氨酸的巯基。

在优选的实施方式中，所述第一附着位点包含或优选是氨基，优选赖氨酸残基的氨基，其中优选所述赖氨酸残基是由所述病毒样颗粒包含的赖氨酸残基，且其中更优选所述赖氨酸残基是由RNA噬菌体的重组外壳蛋白包含的赖氨酸残基，最优选是由RNA噬菌体Qβ、RNA噬菌体AP205或RNA噬菌体

的重组外壳蛋白包含的赖氨酸残基。在非常优选的实施方式中，所述赖氨酸残基是SEQ ID NO：1、19或SEQ ID NO：92到93中任一的赖氨酸残基。在另一个优选实施方式中，所述第二附着位点包含或优选是巯基，优选半胱氨酸的巯基。

在进一步的优选实施方式中，所述至少一个第一附着位点包含氨基且所述第二附着位点包含巯基。在进一步的优选实施方式中，所述第一附着位点是氨基且所述第二附着位点是巯基。在更进一步的优选实施方式中，所述第一附着位点是赖氨酸残基的氨基，其中优选所述赖氨酸残基是所述病毒样颗粒的外壳蛋白包含的赖氨酸残基，且所述第二附着位点是半胱氨酸残基的巯基。

在进一步的优选实施方式中，具有至少一个第一附着位点的所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成，其中所述重组外壳蛋白包含SEQ ID NO：1、19或SEQ ID NO：92到94中任一的氨基酸序列，或优选由SEQ ID NO：1、19或SEQ ID NO：92到94中任一的氨基酸序列组成，且其中所述第一附着位点包含或优选是所述氨基酸序列的赖氨酸残基的氨基。在进一步的优选实施方式中，所述重组外壳蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成，且所述第一附着位点包含或优选是SEQ ID NO：1的赖氨酸残基的氨基。

在进一步的优选实施方式中，仅一个所述第二附着位点中通过至少一个非肽共价键和所述第一附着位点结合，导致所述抗原与所述病毒样颗粒的单一和一致的结合类型，其中与所述第一附着位点结合的所述仅一个第二附着位点是巯基，且其中所述抗原和所述病毒样颗粒通过所述结合发生相互作用，以形成有序和重复的抗原阵列。

使用异双官能交联剂连接抗原与VLP使得抗原能够以定向方式与VLP偶联。因此，在一个优选实施方式中，具有至少一个第一附着位点的所述病毒样颗粒与具有所述至少一个第二附着位点的所述至少一种抗原经由化学交联连接，典型地和优选地通过使用异双官能交联剂连接。在优选实施方式中，所述异双官能交联剂包含(a)与VLP的优选的第一附着位点，优选与氨基，更优选与赖氨酸残基的氨基反应的官能团，和(b)与优选的第二附着位点，优选与巯基，最优选与半胱氨酸残基的巯基反应的另外的官能团，其是抗原所固有的或人工添加到抗原上的，且任选地可以通过还原使得可用于反应。因此，优选的异双官能交联剂包含与氨基具有反应性的官能团和与巯基具有反应性的官能团。非常优选的异双官能交联剂选自下组：SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、Sulfo-KMUS、SVSB和SIA，其中最优选所述异双官能交联剂是SMPH。上述交联剂全部在与氨基反应后导致酰胺键的形成和在与巯基反应后导致硫醚键的形成。

在优选实施方式中，具有至少一个第二附着位点的所述至少一种抗原还包含接头，其中优选所述接头包含所述第二附着位点或由所述第二附着位点组成。在优选实施方式中，所述接头结合所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点。在本发明进一步的优选实施方式中，接头经由至少一个共价键，优选经由至少一个(优选一个)肽键与抗原结合。在进一步的优选实施方式中，具有所述至少一个第二附着位点的所述至少一种抗原包含接头，其中所述接头包含所述第二附着位点，且其中优选所述接头经由一个肽键与所述抗原结合，且其中更优选所述接头包含半胱氨酸残基或由半胱氨酸残基组成。优选地，所述接头包含所述第二附着位点或由第二附着位点组成。在进一步的优选实施方式中，所述接头包含巯基，优选半胱氨酸残基。在另一个优选实施方式中，所述接头包含或优选是半胱氨酸残基。在进一步的优选实施方式中，所述接头选自下组：(a)CGG；(b)N-末端甘氨酸接头，优选GCGGGG；(c)GGC；和(d)C-末端甘氨酸接头，优选GGGGCG。能用于本发明的其他接头公开于例如WO2007/039552A1(第32页第111和112段)。在优选实施方式中，所述接头添加至抗原的C末端。

在进一步的优选实施方式中，所述组合物还包含至少一种免疫刺激物质。可用于本发明的免疫刺激物质通常是本领域已知的，且尤其是公开在WO2003/024481A2中。

在进一步的优选实施方式中，所述免疫刺激物质与所述病毒样颗粒结合。在进一步的优选实施方式中，所述免疫刺激物质与所述病毒样颗粒混合。在进一步的优选实施方式中，所述免疫刺激物质选自下组：(a)免疫刺激核酸；(b)肽聚糖；(c)脂多糖；(d)脂磷壁酸(lipoteichonic acid)；(e)咪唑并喹啉(imidazoquinoline)化合物；(f)鞭毛蛋白(flagelline)；(g)脂蛋白；和(h)(a)到(g)至少一种物质的任意混合物。

在进一步的优选实施方式中，所述免疫刺激物质是免疫刺激核酸，其中优选所述免疫刺激核酸选自下组：(a)核糖核酸；(b)脱氧核糖核酸；(c)嵌合核酸；和(d)(a)、(b)和/或(c)的任意混合物。

在进一步的优选实施方式中，所述免疫刺激核酸是核糖核酸，且其中所述核糖核酸是宿主细胞源的RNA。在其他优选实施方式中，所述免疫刺激核酸是聚-(I:C)或其衍生物。

在进一步的优选实施方式中，所述免疫刺激核酸是脱氧核糖核酸，其中优选所述脱氧核糖核酸是含非甲基化CpG的寡核苷酸。在进一步的优选实施方式中，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸是A型CpG。

在进一步的优选实施方式中，将所述免疫刺激核酸，且因此优选所述脱氧核糖核酸，且因此更优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包装到所述病毒样颗粒中。

在进一步的优选实施方式中，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含回文序列。在进一步的优选实施方式中，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分。在进一步的优选实施方式中，所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO：96)。

在进一步的优选实施方式中，所述回文序列的5′末端和3′末端侧邻鸟嘌呤核苷实体。在进一步的优选实施方式中，所述回文序列的5′末端侧邻至少3个和至多15个鸟嘌呤核苷实体，且其中所述回文序列的3′末端侧邻至少3个和至多15个鸟嘌呤核苷实体。在进一步的优选实施方式中，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含选自下组的序列或由选自下组的序列组成：(a)″G6-6″GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO：97)；(b)″G7-7″GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO：98)；(c)″G8-8″GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO：99)；(d)″G9-9″GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ ID NO：100)；和(e)″G10″GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：101)。在进一步的优选实施方式中，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：101)或由序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：101)组成。在其他优选实施方式中，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸仅由磷酸二酯键核苷酸组成，其中优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包装到所述VLP中。

在进一步的优选实施方式中，所述免疫刺激核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，不能被用于DNA酶水解。在进一步的优选实施方式中，所述免疫刺激核酸是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸不能被用于Benzonase水解。在进一步的优选实施方式中，所述免疫刺激核酸是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其由序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：101)组成，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸仅由磷酸二酯键核苷酸组成，且其中优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包装到所述VLP中。

本发明的另一方面是包含本发明组合物或优选由本发明组合物组成的疫苗组合物，其中优选所述疫苗组合物包含有效量的本发明组合物，且其中更优选所述疫苗组合物包含治疗有效量的本发明组合物。在此“有效量”是指产生所需生理学效应，优选免疫效应的量。在此“治疗有效量”是指产生所需治疗效果的量。在本发明的情况中，所需的治疗效果是预防或改善动物，优选人中的流感病毒感染。

本发明的有利特征是所述组合物甚至在不含佐剂的情况下的高免疫原性。因此，在优选实施方式中，所述疫苗组合物不含佐剂。此外，不含佐剂使得不良副作用的发生最小化。因此，在施用疫苗组合物之前、同时或之后将不将佐剂施用于同一患者。

在进一步的优选实施方式中，所述疫苗组合物还包含至少一种佐剂。因此当施用佐剂时，所述至少一种佐剂的施用可以在施用本发明组合物或疫苗组合物之前、同时或之后发生。

本发明的另一方面是包含：(1)本发明的组合物或疫苗组合物；和(2)药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。本发明的组合物和/或疫苗组合物以药学可接受的形式施用于个体。如果本发明药物组合物的施用可以被被接受个体，优选被人耐受，则本发明的药物组合物被称为是药学可接受的。药学上可接受的载体或赋形剂可以包含盐、缓冲液、佐剂或用于改善偶联物效力的其他物质。适用于制备疫苗组合物或药物组合物的材料的实例例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Osol，A，ed.，Mack Publishing Co.，(1990))中提供。这包括无菌水溶液(例如，生理盐水)或非水性溶液和悬浮液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。载体或包封敷料可用于增加皮肤渗透并提高抗原吸收。

本发明的另一方面涉及免疫方法，优选涉及抗流感(最优选抗流行性感冒)的免疫方法，所述方法包括将本发明的组合物、疫苗组合物或药物组合物施用于动物，优选施用于人。

另一方面，本发明涉及治疗、改善和/或预防动物，优选人中的流感病毒感染，优选A型流感病毒感染的方法，所述方法包括将本发明的组合物、疫苗组合物或药物组合物施用于所述动物，优选施用于所述人。

另一方面，本发明涉及本发明的组合物、疫苗组合物或药物组合物，其用作药物。

另一方面，本发明涉及本发明的组合物、疫苗组合物或药物组合物，其用于治疗、改善和/或预防流感病毒感染，优选A型流感病毒感染。

另一方面，本发明涉及治疗、改善和/或预防流感，优选A型流感的方法，所述方法包括将本发明的组合物、疫苗组合物或药物组合物施用于动物，优选施用于人，其中优选所述组合物、所述疫苗组合物和/或所述药物组合物以有效量，优选免疫有效量施用于所述动物，更优选施用于所述人。因此免疫有效量是指能够引起所述个体，优选所述人中的可检测免疫应答，优选抗体应答的量。

在一个实施方式中，所述组合物、疫苗组合物和/或药物组合物通过注射、灌注、吸入、口服施用或其他适当的物理方法施用于所述动物，优选施用于所述人。在优选实施方式中，所述组合物、疫苗组合物和/或药物组合物通过肌内、静脉内、跨粘膜、透皮、鼻内、腹膜内、皮下或直接进入淋巴结的方式施用于所述动物，优选施用于所述人。

在另一方面，本发明涉及本发明的组合物、疫苗组合物和/或药物组合物用于治疗、改善和/或预防流感，优选A型流感的用途。

本发明的另一方面是本发明的组合物、疫苗组合物和/或药物组合物在制备治疗、改善和/或预防流感，优选A型流感的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及抗原，其中所述抗原是本文定义的HA胞外域或HA胞外域的片段。在优选的实施方式中，所述抗原是本文定义的HA胞外域的片段。在进一步的优选实施方式中，所述抗原是包含对应于SEQ IDNO：75的42位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的42位到310位的氨基酸序列组成的HA胞外域的片段。在进一步的优选实施方式中，所述抗原是包含对应于SEQ ID NO：75的42位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的42位到310位的氨基酸序列组成的HA胞外域的片段，其中所述HA胞外域与A型流感病毒株A/California/07/2009(H1N1)(Genbank登录号：ACP44189.1)或A/Perth/16/2009(H3N2)(Genbank登录号：ACS71642.1)的HA胞外域具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性，且其中优选所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。

在进一步的优选实施方式中，所述抗原是包含对应于SEQ ID NO：75的42位到310位的氨基酸序列，或优选由对应于SEQ ID NO：75的42位到310位的氨基酸序列组成的HA胞外域的片段，其中所述HA胞外域与B型流感病毒株B/Brisbane/33/2008(Genbank登录号：ACN29387.1)、B/Guangzhou/01/2007(Genbank登录号：ABX71684.1)或B/Brisbane/60/2008(Genbank登录号：ACN29383.1)的HA胞外域具有至少70％、优选至少80％、更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少96％、还更优选至少97％、还更优选至少98％和最优选至少99％的氨基酸序列同一性，且其中优选所述HA胞外域是天然存在的HA胞外域。

应理解，本文描述的所有技术特征和实施方式，特别是用于描述本发明组合物及其组分的技术特征和实施方式，可单独或以任何可能的组合方式应用于本发明的所有方面，特别是应用于疫苗组合物、药物组合物、方法和用途。

具体实施方式

实施例1：ecHA A/PR/8/34(H1N1)的克隆、表达和纯化

A)pFastBacl_GP67的产生

载体pFastBacl_GP67(SEQ ID NO：33)是pFastBacl(Invitrogen)的衍生物，其中将GP67的信号肽引入到多个克隆位点的前面以用于分泌蛋白。载体通过将退火的寡核苷酸对PH155(SEQ ID NO：20)和PH156(SEQ ID NO：21)和退火的寡核苷酸对PH157(SEQ ID NO：22)和PH158(SEQ ID NO：23)和退火的寡核苷酸对PH159(SEQ ID NO：24)和PH160(SEQ ID NO：25)和退火的寡核苷酸对PH161(SEQ ID NO：26)和PH162(SEQ ID NO：27)一起接合到BamHI-EcoRI消化的pFastBacl质粒中以获得pFastBacl_GP67而构建。所得质粒在其多个克隆位点具有BamHI、EcoRI、PstI、XhoI、SphI、Acc65I、KpnI和HindIII限制性位点。

B)小鼠适应的流感病毒A/PR8/34(H1N1)的ecHA的克隆和测序

通过使用引物Uni12(SEQ ID NO：28)反转录从A型流感病毒PR8感染的MDCK细胞的上清液中提取的vRNAs(-)，然后使用引物BM-HA-1(SEQID NO：29)和BM-NS-890R(SEQ ID NO：30)进行PCR从而制备(HA0 PR8)株的HA0的cDNA。来自PR8的ecHA的翻译序列是SEQ ID NO：39。

C)pFastBacl_GP67_HA_PR8的产生

编码氨基酸11-329(HA1)、接着来自小鼠适应的PR8(见B项下)的氨基酸1-176(HA2)[HA氨基酸位置基于H3编号]、接着来自噬菌体T4 fibritin的三聚化序列(foldon)、6xHis-标签和含有半胱氨酸的接头)的DNA被优化以在哺乳动物细胞中表达并通过基因合成制备(Geneart，Regensburg，Germany)。用寡聚核苷酸PH163(SEQ ID NO：31)和PH164(SEQ ID NO：32)扩增优化的核苷酸序列。用BamHI和XhoI消化所得DNA片段并克隆到BamHI-XhoI消化的表达载体pFastBacl_GP67中，从而得到质粒pFastBacl_GP67_HA_PR8(SEQ ID NO：34)。该质粒编码由与SEQ ID NO：44的N末端融合的含有来自小鼠适应的PR8的HA0(由与HA2的aa 1-176的N末端融合的HA1的aa11-329组成，HA1和HA2的aa位置基于H3编号)(SEQ ID NO：39)的N末端组成的融合蛋白。与SEQ ID NO：44的N末端融合的SEQ ID NO：34的融合蛋白称为ecHA-PR8。

D)重组杆状病毒的产生、ecHA的制备和纯化

使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)用质粒pFastBacl_GP67_HA_PR8产生表达ecHA-PR8的重组杆状病毒。为了表达，在27℃下培养Hi5昆虫细胞(Invitrogen)并用重组杆状病毒以5的MOI感染和孵育72小时。感染后(p.i.)72小时收获含有重组表达的蛋白ecHA-PR8的上清液。通过TFF使用GE中空纤维盒UFP-5-C-35；5′000NMWC使得上清液浓缩10倍。浓缩的上清液应用于Ni²⁺-NTA琼胶糖柱(Qiagen，Hilden，Germany)。用清洗缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0)彻底清洗柱子后，用洗脱缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，200mM咪唑，pH 8.0)洗脱蛋白。相对于pH 7.2的PBS透析纯化的蛋白并贮存在-80℃下直到进一步使用。

实施例2：来自A/Uruguay/716/2007 X-175(H3N2)的ecHA的克隆、表达和纯化

3′端侧邻BamHI限制性位点且5′端侧邻AscI限制性位点的编码接有来自A/Uruguay/716/2007 X-175(H3N2)(NCBI登录号ACD47234.1)的氨基酸1-176(HA2)[HA氨基酸位置基于H3编号]的氨基酸11-329(HA1)的DNA被优化以在昆虫细胞中表达并通过基因合成制备(Geneart，Regensburg，Germany)。用BamHI和AscI消化所得DNA片段(SEQ ID NO：35)并克隆入BamHI-AscI消化的表达载体pFastBacl_GP67_HA_PR8(如实施例1所述)中，得到质粒pFastBacl_GP67_HA_A/Uruguay/716/2007 NYMC X-175C，简称为pFastBacl_GP67_HA_A_Uruguay。该质粒编码由与实施例1C所述的aa接头(SEQ ID NO：44)的N末端融合的包含来自流感病毒A/Uruguay/716/2007X-175的HA0(由与HA2的aa 1-176的N末端融合的HA1的aa 11-329组成，HA1和HA2的aa位置基于H3编号)(SEQ ID NO：40)的N末端组成的融合蛋白。与SEQ ID NO：44的N末端融合的SEQ ID NO：40的融合蛋白称为ecHA-Uruguay。ecHA-Uruguay如在实施例1D中所述制备和纯化。

实施例3：来自A型流感病毒H5N1株A/Viet Nam/1203/2004、A/Indonesia/5/2005和A/Egypt/2321-NAMRU3/2007的ecHA的克隆、表达和纯化

3′端侧邻BamHI限制性位点且5′端侧邻AscI限制性位点的编码接有来自A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)(NCBI登录号ABP51977.1)、A/Indonesia/5/2005(H5N1)(NCBI登录号ABW06108.1)和(A/Egypt/2321-NAMRU3/2007(H5N1))株(NCBI登录号ABP96850.1)的氨基酸1-176(HA2)[HA氨基酸位置基于H3编号]、氨基酸11-329(HA1)的DNA被优化以在昆虫细胞中表达并通过基因合成制备(Geneart，Regensburg，Germany)。用BamHI和AscI(SEQ ID NO：36，37，38)消化所得DNA片段并克隆入BamHI-AscI消化的表达载体pFastBacl_GP67_HA_PR8中，得到简称为pFastBacl_GP67_HA_A_VietNam的质粒pFastBacl_GP67_HA_A/Viet Nam/1203/2004，称为pFastBacl_GP67_HA_A_Indonesia的pFastBacl_GP67_HA_A/Indonesia/5/2005以及简称为pFastBacl_GP67_HA_A_Egypt的pFastBacl_GP67_HA_A/Egypt/2321-NAMRU3/2007。该质粒将编码由与实施例1C所述的aa接头(SEQ ID NO：44)的N末端融合的包含来自相应病毒株(ecHAAVietNam.SEQ ID NO：41，ecHAAIndonesia SEQ ID NO：42和ecHAAEgypt SEQ ID NO：43)的HA0(由与HA2的aa 1-176的N末端融合的HA1的aa 11-329组成，HA1和HA2的aa位置基于H3编号)的N末端组成的融合蛋白。具有SEQ ID NO：44的相应融合蛋白将分别称为ecHA-Vietnam、ecHA-Indonesia和ecHA-Egypt。这些蛋白如实施例1D所述进行制备和纯化。

实施例4：来自A型流感病毒H1N1株A/Brisbane/59/2007和A/California/04/09的ecHA的克隆、表达和纯化

3′端侧邻BamHI限制性位点且5′端侧邻AscI限制性位点的编码接有来自A/Brisbane/59/2007(NCBI登录号ACA28844.1)和A/California/04/09(NCBI登录号ACP41105.1)的氨基酸1-176(HA2)[HA氨基酸位置基于H3编号]的氨基酸11-329(HA1)的DNA被优化以在昆虫细胞中表达并通过基因合成制备(Geneart，Regensburg，Germany)。用BamHI和AscI消化所得DNA片段并克隆入BamHI-AscI消化的表达载体pFastBacl_GP67_HA_PR8中，得到简称为pFastBacl_GP67_HA_A_Brisbane的质粒pFastBacl_GP67_A/Brisbane/59/2007和简称为pFastBacl_GP67_HA_A_California的质粒pFastBacl_GP67_A_California_04_09。这些质粒将编码由与实施例1D所述的aa接头(SEQ ID NO：44)的N末端融合的包含来自相应病毒株(ecHAA/Brisbane/59/2007_ACA28844.1，SEQ ID NO：73和ecHAA_California/04/2009_ACP41105.1，SEQ ID NO：74)的HA0(由与HA2的aa1-176的N末端融合的HA1的aa 11-329组成，HA1和HA2的aa位置基于H3编号)的N端组成的融合蛋白。具有SEQ ID NO：44的相应融合蛋白将分别称为cHA-Brisbane和ecHA-California。这些蛋白将如实施例1C所述进行制备和纯化。

实施例5：ecHA-PR8(H1N1)与Qβ和AP205病毒样颗粒的偶联

PBS(pH 7.2)中包含1mg/ml的来自实施例1的纯化ecHA-PR8蛋白(与SEQ ID NO：44的N-末端基因融合的SEQ ID NO：39)的溶液在室温下用3折摩尔过量的TCEP孵育5min以还原C末端半胱氨酸残基。4ml的1mg/ml的QβVLP蛋白在20mM HEPES(pH 7.2)中的溶液在室温下与85.2μl的SMPH溶液(DMSO中的50mM)反应30min。反应溶液在4℃下分别在12和2小时内相对于两个20mM HEPES(pH为7.2)的4l换液进行透析。1ml衍生化和透析的Qβ溶液与3700、1850或925μl的经TCEP处理的ecHA-PR8[1mg/ml]混合并在室温下孵育4h以发生化学交联，从而分别形成疫苗批次Qβ-ecHA(PR8)-1、Qβ-ecHA(PR8)-2或Qβ-ecHA(PR8)-3。未偶联蛋白用Sepharose CL4B柱通过尺寸排阻层析除去。偶联产物在还原条件下在4-12％的二-三-聚丙烯酰胺凝胶上分析。凝胶的考马斯(Coomassie)染色显示分子量相对于Qβ单体和ecHA-PR8单体增加的几个带，从而清楚地显示ecHA-PR8蛋白与QβVLP的成功交联。偶联带的光密度定量显示不同疫苗批次的以下偶联密度：Qβ-ecHA(PR8)-1：40ecHA/VLP，Qβ-ecHA(PR8)-2：29ecHA/VLP以及Qβ-ecHA(PR8)-3：17ecHA/VLP。为了与AP205VLP偶联，5ml的1mg/ml AP205VLP在20mM HEPES(pH 7.2)中的溶液在室温下与106.5μl的SMPH溶液(DMSO中50mM)反应90min。反应溶液在4℃下分别在12、2和2小时内相对于三个20mM HEPES(pH 7.2)的51换液进行透析。2ml衍生化和透析的AP205溶液与5500μl的经TCEP处理的ecHA-PR8(H1N1)混合并在室温下孵育4h以化学交联，从而形成AP205-ecHA(PR8)。未偶联蛋白用Sepharose CL4B柱通过尺寸排阻层析去除。偶联产物在还原条件下在4-12％的二-三-聚丙烯酰胺凝胶上分析。考马斯(Coomassie)染色的凝胶显示分子量相对于VLP单体和ecHA-PR8单体增加的几个带，从而清楚地证明ecHA-PR8蛋白与AP205VLP的成功交联。偶联带的光密度定量显示偶联密度为30ecHA/VLP。

实施例6：ELISA

为测定HA特异性抗体滴度，ELISA板用实施例1获得的ecHA-PR8、实施例2获得的ecHA-Uruguay或从Protein Sciences获得的重组流感HA蛋白(rHA)(rHA_A/Brisbane/59/2007，rHA_A/Vietnam/1203/2004，rHA_A/Indonesia/05/2005，rHA_A/California/04/2009，rHA_B/Florida/04/2006)涂覆，或者所述ELISA板用浓度为1μg/ml的实施例3和实施例4获得的ecHA蛋白涂覆或浓度为10μg/ml的Qβ或AP205VLP涂覆。封闭所述板，然后与系列稀释液的小鼠血清一起孵育。用酶标记的抗-小鼠IgG、抗-小鼠IgG1或抗-小鼠IgG2a抗体检测结合的抗体。总IgG抗体滴度确定为达到饱和时测定的50％的光密度(OD450nm，)所需的稀释度的倒数。对于IgG1和IgG2a，计算终点滴度。显示了平均抗体滴度。

实施例7：流感病毒PR8的红血球凝集抑制滴度的测定

测定小鼠血清抑制流感病毒PR8导致的鸡红血球凝集的能力。为使非特异性抑制剂失活，首先用受体破坏酶(RDE，Seiken，Japan)处理血清。简言之，将三份RDE添加至一份血清中并在37℃下孵育过夜。通过在56℃孵育30min使RDE失活。取决于血清的稀释度，添加0到6份PBS以使血清的最终稀释度为1∶4到1∶10。在v-底微量滴定板中使RDE-处理的血清连续地两倍稀释。将调节至8HAU/50ul的等体积流感PR8病毒添加到各孔。覆盖板并在室温下孵育30min，然后添加PBS中的1％鸡红血球。通过搅拌混合平板、覆盖，并使RBC在室温下放置1h。HAI滴度确定为包含非凝集RBC的最后一排的稀释度的倒数。为测定对抗其他流感病毒株的HAI滴度，使用相应的病毒株(代替流感病毒A/PR/8/34)来进行RBC凝集。对于这些其他的流感病毒株，可能必须使用来自不同物种(例如火鸡或马)的RBC进行凝集。

实施例8：鼠科动物流感模型

以下A型流感病毒用于不同的研究：A/PR/8/34(H1N1)、A/FM/1/47(H1N1)、A/Aichi/2/68(X31)(H3N2)和A/WSM33(H1N1)。为测定各病毒的致死剂量，在用异氟烷浅麻醉下经鼻给予小鼠系列稀释的病毒(2x 50μl)。感染后至少20天监控被感染小鼠的体重和体温。处死损失超过30％的初始体重或体温等于或低于30℃的小鼠。根据Reed and Munch(Reed LJ等.1938.Am.J.Hyg.27，493-497)的方法计算各病毒株的LD50滴度。为测定不同疫苗的效力，用指定化合物免疫小鼠并用相应实施例中所示的致死剂量的同源或异源流感病毒(4LD50或10LD50)激发小鼠，并如上所述进行监控。处死损失超过30％的初始体重或体温等于或低于30℃的小鼠。感染后20天各处理组的存活动物％表示在相应实施例中。

实施例9：Qβ-ecHA(PR8)和AP205-ecHA(PR8)疫苗对抗致死的同源流感病毒激发

在第0天用50、5或0.5μg的Qβ-ecHA(PR8)-1、Qβ-ecHA(PR8)-2或Qβ-ecHA(PR8)-3(实施例5中获得的)或者45或4.5μg的ecHA(PR8)(实施例1中获得的)或配制在200μl PBS中的50μg的QβVLP皮下免疫每组三只雌性balb/c小鼠。在第20天通过眼窝后放血收集血清，并使用实施例6和7中所述的ecHA(PR8)-特异性ELISA或红血球凝集抑制(HAI)试验进行分析。在第21天用4LD50的小鼠适应的流感病毒A/PR/8/34激发所有小鼠并如实施例8中所述监控20天内的存活率。该实验的结果显示于表1中。如表1所示，用三种Qβ-ecHA(PR8)偶联物的任何一种以每种测试浓度免疫的所有动物都在致死性激发中存活下来，而仅用载体(Qβ)免疫的所有动物均死亡。在接受两种测试浓度的仅ecHA(PR8)的动物中观察到部分保护作用。类似地，与仅用ecHA(PR8)免疫的动物相比，接受Qβ-ecHA(PR8)的所有动物中ecHA-PR8特异性滴度和HAI滴度显著提高。诱导的HAI滴度与抗-ecHA(PR8)抗体ELISA滴度成正比，提示诱导的抗体识别病毒上的天然HA。这些结果显示，ecHA-PR8与QβVLP的偶联，即使是低偶联密度下，显著增强ecHA-PR8的免疫原性，而当抗原与使得载体诱导表位抑制的风险最小化的VLP偶联时，QβVLP的免疫应答显著降低。此外，用0.5μg具有低偶联密度(17HA/VLP)的Qβ-ecHA(PR8)的单次免疫能够完全保护小鼠以对抗同源流感病毒A/PR8/34的致死激发。

表1：

实施例10：Qβ-ecHA(PR8)在致死激发研究中的剂量调整

为进一步测定疫苗的保护能力，用5、1、0.2、0.04、0.008μg的Qβ-ecHA(PR8)-1(实施例5获得)或15μg的ecHA(PR8)总蛋白(实施例1获得)或作为阴性对照的50μg的QβVLP免疫每组五只雌性balb/c小鼠。所有化合物配制在200μl PBS中并在第0天皮下注射。第21天小鼠眼窝后放血，并使用ecHA(PR8)-特异性ELISA或HAI试验分析血清。第63天用4LD50的小鼠适应的流感病毒A/PR/8/34激发所有小鼠并监控20天内的存活(如实施例8所述)。该实验的结果显示于表2中。如表2所示，单次注射0.008μg的QβecHA(PR8)-1比15μg的ecHA(PR8)诱导更高的抗-HA(PR8)-IgG和HAI滴度。而且，对于0.008μg的QβecHA(PR8)-1观察到对小鼠适应的流感病毒A/PR/8/34的致死激发的与15μg的ecHA(PR8)类似的保护。这说明ecHA-PR8与QβVLP的偶联使得能够约一千倍剂量的ecHA-PR8抗原，因为0.008μg的QβecHA(PR8)-1诱导与15μg的ecHA(PR8)(这是饮包含商用TIV流感疫苗中的流感HA的标准剂量)类似的应答和保护。

表2：

实施例11：Qβ-ecHA(PR8)和AP205-ecHA(PR8)在致死激发研究中的剂量调整

接着评估基于另一种噬菌体载体的HA疫苗的保护能力。为此目的，用15、3、0.6、0.12、0.024、0.0046μg的实施例5获得的AP205-ecHA(PR8)或15μg的实施例5获得的Qβ-ecHA(PR8)-1或15μg的实施例1获得的ecHA(PR8)或50μg的QβVLP免疫每组四只雌性balb/c小鼠。所有化合物配制在200μl PBS中并在第0天皮下注射。第21天小鼠眼窝后放血，并使用实施例6和7所述的ecHA(PR8)-特异性ELISA或HAI试验分析血清。第27天用4LD50的小鼠适应的流感病毒A/PR/8/34激发所有小鼠并如实施例8所述监控20天内的存活。该实验的结果显示于表3中。如表3所示，ecHA-PR8与AP205VLP的偶联显著提高ecHA-PR8的免疫原性并使得节约了约625倍剂量的ecHA-PR8抗原，因为0.024μg的AP205-ecHA(PR8)诱导与15μg的HA(PR8)(这是商用TIV流感疫苗中包含的流感HA的标准剂量)类似的抗HA(PR8)-IgG滴度和HAI滴度。而且，单剂量的0.024μg的AP205-ecHA(PR8)完全保护小鼠对抗致死流感病毒激发。有趣的是，由与AP205VLP的偶联的ecHA诱导的应答诱导出高于IgG1滴度的IgG2a，而单独的ecHA(PR8)诱导高于IgG2a滴度的IgG1，这表明与VLP的偶联诱导从TH2到TH1免疫应答的转变。

表3：

实施例12：用Qβ-ecHA(PR8)和AP205-ecHA(PR8)在致死流感病毒激发实验中诱导交叉保护

为进一步测定HA疫苗的保护能力，用15μg的实施例5获得的Qβ-ecHA(PR8)-1或15μg的实施例5获得的AP205-ecHA(PR8)或15μg的实施例1获得的ecHA(PR8)或50μg的Qβ或AP205免疫每实验组六只雌性balb/c小鼠。所有蛋白配制在200μl PBS中并进行两次(第0天和第21天)或仅在第21天一次皮下注射(详细说明参见表4)。第35天小鼠眼窝后放血，并使用实施例6和7所述的ELISA或HAI试验分析血清。第39天，用表4所列的10LD50 A/PR/8/34(H1N1)、10LD50 A/WSN/33(H1N1)、10LD50A/FM/1/47(H1N1)或10LD50 A/Aichi/2/68(X31)(H3N2)激发相应的组。然后如实施例8所述监控小鼠。该实验的结果显示于表4中。如表4所示，用与Qβ或AP205偶联的ecHA(PR8)免疫小鼠单次注射后诱导对抗高致死剂量(10LD50)的同源流感病毒A/PR8/34和异源流感病毒A/WSN/33病毒感染的保护。相反，用ecHA(PR8)的单次免疫不能对抗A/WSN/33的异源激发，且仅能部分对抗A/PR/8/34的同源激发。为完全对抗同源或A/WSN/33的异源激发，需要用ecHA(PR8)进行二次免疫。类似地，当用A/FM/1/47-MA(H1N1)株激发小鼠时，与Qβ或AP205偶联的ecHA(PR8)与ecHA(PR8)相比在一次或两次免疫后明显改善交叉保护，因为用单独的ecHA(PR8)注射1次或2次都不能完全保护小鼠对抗致死激发。用单独的ecHA(PR8)或与Qβ或AP205偶联的ecHA(PR8)免疫小鼠诱导小鼠某些程度的对抗H3N1流感病毒株A/Aichi/2/68(X31)病毒的致死感染(10LD50)的交叉保护。交叉保护的水平不与抗-ecHA(PR8)IgG抗体滴度相关，表明在这种情况下ecHA(PR8)-特异性IgG抗体可能不是交叉保护的原因，提示在这些实验组中存在用于交叉保护的不同机制。这些实验合起来考虑还强调，ecHA与噬菌体(AP205或Qβ)VLP表面的偶联明显提高其免疫原性并改善为对抗HA而诱导的保护性应答。以下事实是特别重要的：噬菌体-ecHA疫苗能完全对抗异源病毒的激发而单独的ecHA不能。

表4：

实施例13：对抗流感H3N2病毒株疫苗的制备和测试

实施例2得到的ecHA-A-Uruguay如实施例5所述与QβVLP偶联。在小鼠中测试该疫苗的免疫原性。简言之，用15、3、0.6、0.12、0.024、0.0046μg的Qβ-ecHA(Uruguay)或15μg的实施例2获得的ecHA(Uruguay)或50μg的QβVLP免疫每组四只雌性balb/c小鼠。所有化合物配制在200μl PBS中并在第0天皮下注射。第21天小鼠眼窝后放血，并使用ecHA-Uruguay特异性ELISA分析血清。结果概括于表5中。如表5所示，ecHA-Uruguay与QβVLP的偶联急剧增加其免疫原性，因为0.0046μg疫苗诱导的ecHA特异性ELISA滴度高于15μg单独的ecHA(Uruguay)诱导的ecHA特异性ELISA滴度。

表5：

实施例14：对抗流感H5N1和H1N1病毒株的疫苗的制备和测试

实施例3和4获得的ecHA-Vietnam、ecHA-Indonesia、ecHA-Egypt、ecHA-Brisbane和ecHA-California与实施例5中所述的Qβ和AP205VLP偶联。如实施例8所述在流感感染小鼠模型中测试这些疫苗的效力。如实施例6和7所述，采用用于红血球凝集反应测试的适当涂覆试剂和病毒株来测定来自免疫小鼠的血清中的ELISA抗体滴度和HAI滴度。另外，进行其中用类似于实施例10所述实验的同源病毒激发免疫动物的剂量调整实验。此外，为进一步评估保护能力，类似于实施例12所述的实验，进行其中用同源流感病毒或异源流感病毒株激发动物的交叉保护实验。

实施例15：通过来自接种疫苗的动物的血清体外中和流感病毒

实施例9-14和26-33获得的免疫小鼠的血清用于体外中和试验。简言之，同源和异源流感病毒与相应血清的系列稀释液一起孵育，并测定其抑制具有相应流感病毒的MDCK细胞的能力。病毒中和滴度定义为能够完全抑制200TCID50的相应流感病毒的感染微量滴定板中的MDCK单层的最高血清稀释度的倒数。感染通过测定细胞内产生的病毒NP蛋白的ELISA进行测量。

实施例16：小鼠适应的流感A/PR/8/34(H1N1)病毒HA(gdHA)的球状结构域的不同片段的克隆、表达、纯化和重折叠。

A)pET-42T(+)的产生

pET-42T(+)是pET-42a(+)(Novagen)的衍生物，其中接有终止密码子的6xHis-标签和aa接头(GGC)引入多个克隆位点之后，所述克隆位点用于表达具有编码SEQ ID NO：91的aa序列的C末端的融合蛋白。第一步，通过将退火的寡聚42-1(SEQ ID NO：45)和寡聚42-2(SEQ ID NO：46)的对接合入NdeI-AvrII消化的pET-42a(+)质粒中以获得pET-42S(+)来构造中间载体pET-42S(+)。第二步，将退火的寡聚42T-1(SEQ ID NO：47)和寡聚42T-2(SEQID NO：48)的对接合入XhoI-AvrII消化的pET-42S(+)质粒以获得载体pET-42T(+)(SEQ ID NO：60)。所得质粒在其多个克隆位点中具有NdeI、EcoRV、EcoRI，HindIII、PstI、PvuII、XhoI、XcmI、AvrII限制性位点。

B)构建体gdHA_PR8_42_310、gdHA_PR8_46_310、gdHA_PR8_57_276、gdHA_PR8_54a_276、gdHA_PR8_54a_270、gdHA_PR8_57_270的产生

基于Gamblin SJ等，Science，2004 303：1838-42所描述的原型人(1934-人)H1流感病毒A/Puerto Rico/8/34HA的蛋白结构(PDB 1RVX)设计小鼠适应的流感A/PR/8/34(H1N1)病毒的HA(gdHA)的胞外域片段(原型HI HA片段)。基于小鼠适应的A/PR/8/34(SEQ ID NO：39，由实施例1B获得)和原型人(1934-人)H1流感病毒A/Puerto Rico/8/34HA(Gamblin SJ等，Science，2004303：1838-42)的aa序列比对，N-末端侧邻NdeI限制性位点和C末端侧邻XhoI限制性位点的编码对应于基于H3编号的氨基酸42-310(HA 1)(Stevens J，Science 2004 303，1866-1870)的氨基酸36-311(HA1)的核苷酸序列被优化以在大肠杆菌中表达，并通过基因合成制备(Geneart，Regensburg，Germany)。用NdeI和XhoI消化优化的核苷酸序列并克隆入pET-42T(+)的NdeI-XhoI位点，从而得到质粒pET42T_HA1_PR8_42_310(SEQ ID NO：61)。该载体用于如表6所列通过PCR产生不同的较短片段。简言之，用指定引物在pET42T_HA1_PR8_42_310上进行PCR反应，用NdeI和XhoI消化所得产物并克隆入pET-42T(+)的NdeI-XhoI位点中，得到表6最后一栏所示构建体。这些质粒编码由与SEQ ID NO：91的N-端基因融合的N-末端组成的融合蛋白，所述N-末端由小鼠适应的流感病毒A/PR/8/34(SEQ ID NO：39)的胞外域的aa序列aa42-310(SEQ ID NO：67)、aa 46-310(SEQ ID NO：68)、aa57-276(SEQ ID NO：69)、aa54a-276(SEQ ID NO：70)、aa54a-270(SEQ ID NO：71)和aa57-270(SEQ ID NO：72)组成。氨基酸位置是根据源自Stevens J.等，Science2004 303，1866-1870的H3编号。所得蛋白分别命名为gdHA_PR8_42_310、gdHA_PR8_46_310、gdHA_PR8_57_276、gdHA_PR8_54a_276、gdHA_PR8_54a_270、gdHA_PR8_57_270。

表6：

C)gdHA构建体的表达、纯化和重折叠

为进行表达，携带有任一质粒的大肠杆菌BL21细胞在37℃下生长到OD(600nm)为1.0，然后通过添加1mM浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷进行诱导。细菌在37℃下生长4个以上小时，通过离心收获，并每克湿重再悬浮在5ml的裂解缓冲液(50mM Na₂HPO₄、300mM NaCl、10mM咪唑、pH 8.0)中，通过用1mg/ml溶菌酶孵育30min溶解细胞。然后通过声波处理破坏细胞，并用5μg/ml DNAse I在冰上孵育15min来消化细胞DNA。通过离心(10′000x g，4℃，30min)收获包涵体(IB)，用B-PER I试剂(Pierce)纯化并溶解在IB溶解缓冲液(8M尿素，50mM Tris-Cl pH 8.0，50mM二硫苏糖醇)中至浓度为0.5mg/ml。通过相对于重折叠缓冲液2(2M尿素、50mM Na₂HPO₄、0.5M精氨酸、10％甘油(v/v)、5mM还原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、pH 8.5)透析，然后相对于重折叠缓冲液3(50mMNa₂HPO₄、0.5M精氨酸、10％甘油(v/v)、5mM还原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、pH 8.5)透析，然后相对于重折叠缓冲液4(20mM磷酸钠、10％甘油(v/v)、pH 7.2)透析进行蛋白质的重折叠。重折叠的蛋白质贮存在-80℃直到进一步使用。

实施例17：天然存在的A型流感病毒和B型流感病毒的A型流感病毒亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 HA的胞外域片段的设计和编号

基于人1934-H1N1A型流感病毒株(pdb 1RVX)(Gamblin SJ等，Science，2004 303，1838-1842)的H1 HA的结构，如实施例16B所述设计A型流感病毒H1 HA原型片段。A型流感病毒H1 HA原型片段在结构上对齐H3亚型(人1968-H3N2A型流感病毒株(pdb 1E08)，Wilson IA等，Nature(1981)289，366-373)的流感病毒HA的结构，对齐H5亚型，即人2004-H5N1 A型流感病毒株(pdb 2FK0)(Stevens J等，Science(2006)312，404-410)和人B型流感病毒B/Hong Kong/8/73(pdb 3BT6)(Wang Q等，J.Virol(2008)3011-3020)的流感病毒HA的结构，以设计具有与A型流感病毒H1 HA原型片段类似的结构的A型流感病毒H3原型、A型流感病毒H5原型HA片段和B型流感原型HA片段。片段的编号基于人1968-H3N2A型流感病毒株(pdb 1E08)(Wilson IA等，Nature(1981)289，366-373)。通过与A型流感病毒株的相应亚型的原型HA片段的aa比对来设计天然存在的流感病毒的A型流感病毒H1、H3和H5片段。通过与原型H1HA片段的aa比对或结构建模和结构比对来设计天然存在的A型流感病毒的A型流感病毒H6、H13、H11、H16 HA片段，通过与原型H3 HA片段的aa比对或结构建模和结构比对来设计A型流感病毒H4、H7、H10、H14、H15 HA片段，通过与原型H5 HA片段的aa比对或结构建模和结构比对来设计天然存在的流感病毒的A型流感病毒H2、H8、H9、H12HA片段，并根据H3编号方式(Wilson IA等，Nature(1981)289，366-373)进行编号。使用程序SWISS-MODEL进行模型构建。

实施例18：来自流感病毒A/California/04/2009的gdHA片段的克隆、表达、纯化和重折叠

3′端侧邻NdeI限制性位点且5′端侧邻XhoI限制性位点的编码氨基酸42-310(基于H3编号)的A型流感病毒(A/California/04/09)(H1N1)株(NCBI登录号ACP41105.1)的HA0的cDNA被优化以在大肠杆菌中表达，并由Geneart，Regensburg，Germany通过基因合成而制备。用NdeI和XhoI消化该优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：77)，并克隆入pET-42T(+)的NdeI-XhoI位点中，从而形成质粒pET42T_HA1_AC0409_42_310。该质粒编码与SEQ IDNO：91的N-末端融合的流感病毒A/California/04/09的胞外域的aa42-310(SEQ ID NO：84)，和称为gdHA_AC0409_42_310，并如实施例16C所描述的进行制备、纯化和重折叠。或者，侧邻NdeI和XhoI位点的包含A/California/04/2009的球状结构域的较短片段(基于H3编号的aa 46-310、aa57-276、aa54a-276、aa54a-270和aa57-270)的pET-42T(+)表达构建体用适当的寡核苷酸扩增，并与实施例16B类似地克隆入pET-42T(+)。如实施例16C所描述的纯化并重折叠这些蛋白质。

实施例19：来自流感病毒A/Brisbane/59/2007 IVR148(H1N1)的gdHA片段的克隆、表达、纯化和重折叠

3′端侧邻NdeI限制性位点且5′端侧邻XhoI限制性位点的编码氨基酸42-310(基于H3编号)的流感病毒(A/Brisbane/59/2007(H1N1))株(NCBI登录号ACA28844.1)的HA0的cDNA被优化以在大肠杆菌中表达，并由Geneart，Regensburg，Germany通过基因合成而制备。用NdeI和XhoI消化该优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：78)，并克隆入pET-42T(+)的NdeI-XhoI位点，从而形成质粒pET42T_HA1_AB5907_42_310。该质粒编码与SEQ ID NO：91的N-末端融合的流感病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1)的胞外域的aa42-310(SEQ ID NO：85)，称为gdHA_AB5907_42_310，并如实施例16C所描述的进行制备、纯化和重折叠。或者，侧邻NdeI和XhoI位点的包含A/Brisbane/59/2007 IVR148的球状结构域的较短片段(基于H3编号的aa46-310、aa57-276、aa54a-276、aa54a-270和aa57-270)的pET-42T(+)表达构建体用适当的寡核苷酸扩增，并与实施例16B类似地克隆入pET-42T(+)中。如实施例16C所描述的纯化并重折叠这些蛋白质。

实施例20：来自流感病毒A/Uruguay/716/2007/NYMC/X/175C(H3N2)的gdHA片段的克隆、表达、纯化和重折叠

3′端侧邻NdeI限制性位点且5′端侧邻XhoI限制性位点的编码氨基酸42-310(基于H3编号)的A型流感病毒(A/Uruguay/716/2007 X-175(H3N2))株(NCBI登录号ACD47234.1)的HA0的cDNA被优化以在大肠杆菌中表达，并由Geneart，Regensburg，Germany通过基因合成而制备。用NdeI和XhoI消化该优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：79)，并克隆入pET-42T(+)的NdeI-XhoI位点中，形成质粒pET42T_HA1_AU71607_42_310。该质粒编码与SEQ ID NO：91的N-末端融合的流感病毒A/Uruguay/716/2007(X-175)H3N2的胞外域的aa42-310(SEQ ID NO：86)，称为gdHA_AU71607_42_310，并如实施例16C所描述的进行制备、纯化和重折叠。或者，包含侧邻NdeI和XhoI位点的包含A/Uruguay/716/2007/NYMC/X/175C的球状结构域的较短片段(基于H3编号的aa 46-310、aa57-276、aa54a-276、aa54a-270和aa57-270)的pET-42T(+)表达构建体用适当的寡核苷酸扩增，并与实施例16B类似地克隆入pET-42T(+)中。如实施例16C所描述的纯化并重折叠这些蛋白质。

实施例21：来自流感病毒A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)的gdHA片段的克隆、表达、纯化和重折叠

3′端侧邻NdeI限制性位点且5′端侧邻XhoI限制性位点的编码氨基酸42-310(基于H3编号)的流感病毒A(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))株(NCBI登录号ABP51977.1)的HA0的cDNA被优化以在大肠杆菌中表达，并由Geneart，Regensburg，Germany通过基因合成而制备。用NdeI和XhoI消化该优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：81)，并克隆入pET-42T(+)的NdeI-XhoI位点，以形成质粒pET42T_HA1_AV120304_42_310。该质粒编码与SEQ ID NO：91的N-端融合的流感病毒A/VietNam/1203/2004(H5N1)的胞外域的aa42-310(SEQ ID NO：88)，称为gdHA_AV120304_42_310，并如实施例16C所描述的进行制备、纯化和重折叠。或者，侧邻NdeI和XhoI位点的A/VietNam/1203/2004的球状结构域的包含较短片段(基于H3编号的aa 46-310、aa57-276、aa54a-276、aa54a-270和aa57-270)的pET-42T(+)表达构建体用适当的寡核苷酸扩增，并与实施例16B类似地克隆入pET-42T(+)中。如实施例16C所描述的纯化并重折叠这些蛋白质。

实施例22：来自流感病毒A/Indonesia/5/2005(H5N1)的gdHA片段的克隆、表达、纯化和重折叠

3′端侧邻NdeI限制性位点且5′端侧邻XhoI限制性位点的编码氨基酸42-310(基于H3编号)的A型流感病毒(A/Indonesia/5/2005(H5N1))株(NCBI登录号ABW06108.1)的HA0的cDNA被优化以在大肠杆菌中表达，并由Geneart，Regensburg，Germany通过基因合成而制备。用NdeI和XhoI消化该优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：82)，并克隆入pET-42T(+)的NdeI-XhoI位点中，形成质粒pET42T_HA_AI505_42_310。该质粒编码与SEQ ID NO：91的N-末端融合的流感病毒A/Indonesia/5/2005(H5N1)的胞外域的aa42-310，称为gdHA_AI505_42_310(SEQ ID NO：89)，并如实施例16C所描述的进行制备、纯化和重折叠。或者，侧邻NdeI和XhoI位点的包含A/Indonesia/5/2005的球状结构域的较短片段(基于H3编号的aa 46-310、aa57-276、aa54a-276、aa54a-270和aa57-270)的pET-42T(+)表达构建体用适当的寡核苷酸扩增，并与实施例16B类似地克隆入pET-42T(+)中。如实施例16C所描述的纯化并重折叠这些蛋白质。

实施例23：来自流感病毒B/Brisbane/3/07的gdHA片段的克隆、表达、纯化和重折叠

3′端侧邻NdeI限制性位点且5′端侧邻XhoI限制性位点的编码氨基酸42-310(基于H3编号)的B型流感病毒(B/Brisbane/3/2007)株(登录号ISDN263782)的HA0的cDNA被优化以在大肠杆菌中表达，并由Geneart，Regensburg，Germany通过基因合成而制备。用NdeI和XhoI消化该优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：80)，并克隆入pET-42T(+)的NdeI-XhoI位点，从而形成质粒pET42T_HA1_BB307_42_310。该质粒编码与SEQ ID NO：91的N-末端融合的流感病毒B/Brisbane/3/2007的胞外域的aa42-310(SEQ ID NO：87)，称为gdHA_BB307_42_310，并如实施例16C所描述的进行制备、纯化和重折叠。或者，侧邻NdeI和XhoI位点的包含B/Brisbane/3/07的球状结构域的较短片段(基于H3编号的aa 46-310、aa57-276、aa54a-276、aa54a-270和aa57-270)的pET-42T(+)表达构建体用适当的寡核苷酸扩增，并与实施例16B类似地克隆入pET-42T(+)中。如实施例16C所描述的纯化并重折叠这些蛋白质。

实施例24：来自流感病毒A/California/07/2009(H1N1)的gdHA片段的克隆、表达、纯化和重折叠

3′端侧邻XbaI限制性位点且5′端侧邻HindIII限制性位点的编码氨基酸42-310(基于H3编号)的A型流感病毒(A/Galifornia/07/09)(H1N1))株(NCBI登录号ACR78583)的HA0的cDNA被优化以在大肠杆菌中表达，并由Geneart，Regensburg，Germany通过基因合成而制备。用XbaI-HindIII消化该优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：83)，并克隆入pET-42T(+)的XbaI-HindIII位点中，从而形成质粒pET_HA1_AC0709_42_310。该质粒编码与aa接头GGCG的N-末端融合的流感病毒A/California/07/09(H1N1)的胞外域的aa42-310(SEQ ID NO：90)，称为gdHA_AC0709_42_310，并如实施例16C所描述的进行制备、纯化和重折叠。或者，侧邻XbaI和HindIII位点的包含A/California/07/2009的球状结构域的较短片段(基于H3编号的aa 46-310、aa57-276、aa54a-276、aa54a-270和aa57-270)的pET-42T(+)表达构建体用适当的寡核苷酸扩增，并与实施例16B类似地克隆入pET-42T(+)中。如实施例16C所描述的纯化并重折叠这些蛋白质。

实施例25：A/PR/A/34HA的球状结构域与Qβ和AP205VLP的偶联

20mM HEPES(pH 7.2)中的6ml的1mg/ml QβVLP蛋白在室温下与128μl的SMPH溶液(DMSO中50mM)反应30min。反应溶液在4℃下分别在12和2小时内用20mM HEPES(pH为7.2)的两次61换液透析。1ml衍生化和透析的Qβ溶液与由实施例16获得的4400μl gdHA_PR8_42_310[0.5mg/ml]、5450μl gdHA_PR8_46_310[0.4mg/ml]、2090μl gdHA_PR8_54a_276[0.45mg/ml]、2′000μl gdHA_PR8_57_276[0.45mg/ml]、2950μlgdHA_PR8_54a_270[0.6mg/ml]和3529μl gdHA_PR8_57_270混合，从而形成Qβ_gdHA_PR8_42_310、Qβ_gdHA_PR8_46_310、Qβ_gdHA_PR8_54a_276、Qβ_gdHA_PR8_57_276、Qβ_gdHA_PR8_54a_270。未偶联的蛋白用SepharoseCL4B柱通过尺寸排阻层析去除。偶联产物在还原条件下在4-12％的二-三-聚丙烯酰胺凝胶上分析。可看见分子量相对于Qβ单体和ecHA-PR8单体增加的几个带，这清楚地表明PR8的所有球状结构域片段与QβVLP的成功交联。20mM HEPES(pH 7.2)中的6ml的1mg/ml AP205衣壳蛋白在室温下与128μl的SMPH溶液(DMSO中50mM)反应60min。反应溶液在4℃下分别在12和2小时内用20mM HEPES(pH为7.2)的两次6l换液透析。1ml衍生化和透析的AP205溶液与4400μl gdHA_PR8_42_310[0.5mg/ml]、5450μl gdHA_PR8_46_310[0.4mg/ml]、2090μl gdHA_PR8_54a_276[0.45mg/ml]、2000μl gdHA_PR8_57_276[0.45mg/ml]、2950μl gdHA_PR8_54a_270[0.6mg/ml]和3529μl gdHA_PR8_57_270混合，从而形成AP205_gdHA_PR8_42_310、AP205_gdHA_PR8_46_310、AP205_gdHA_PR8_54a_276、AP205_gdHA_PR8_57_276、AP205_gdHA_PR8_54a_270、AP205_gdHA_PR8_57_270。未偶联蛋白用Sepharose CL4B柱通过尺寸排阻层析去除。偶联产物在还原条件下在4-12％的二-三-聚丙烯酰胺凝胶上分析。可看见分子量相对于AP205衣壳单体和gdHA-PR8单体增加的几个带，这清楚地显示PR8的所有球状结构域片段与AP205VLP的成功交联。

实施例26：来源于ma A/PR/8/34的不同gdHA的效力测试

为了测试由实施例16中的A/PR/8/34产生的不同球状结构域构建体是否能诱导保护性免疫应答，利用实施例25获得的这些球状结构域产生的疫苗在流感小鼠模型中进行测试。使用含有整个胞外域的疫苗(由实施例5获得，Qβ-ecHA(PR8))作为阳性对照。简言之，在第0天用配制在200μl PBS中的15μg的表7第一栏所示抗原皮下免疫每组四只雌性balb/c小鼠。第21天小鼠眼窝后放血，并使用实施例6中所述的ecHA(PR8)-特异性ELISA和实施例7中所述的红血球凝集抑制(HAI)试验分析血清。为测试疫苗的保护能力，在第28天用致死剂量(10LD50)的流感病毒A/PR/8/34激发所有小鼠，并如实施例8所述监控小鼠。激发后的抗体滴度、HAI滴度以及存活率概括在表7中。这些结果合起来表明，当用于制备疫苗的大部分球状结构域如整个胞外域与噬菌体VLP偶联一样与同样的VLP偶联时，显示更高的滴度，这强烈提示所用片段包含正确的表位和构型。而且，由球状结构域制备的所有疫苗完全保护小鼠对抗同源病毒的致死激发，而大部分单独的球状结构域未能保护小鼠对抗致死激发，这进一步说明在噬菌体VLP上呈示明显提高了所附着抗原的免疫原性。而且，一旦抗原与VLP偶联，对抗Qβ的免疫应答明显降低，这使得载体诱导的表位抑制的风险最小化。

表7：

实施例27：对抗异源病毒激发的保护

为进一步观察基于gdHA的疫苗的保护能力，在第0天用配制在200μlPBS中的15μg的Qβ_gdHA_PR8_42_310或Qβ_gdHA_PR8_46_310(实施例16获得)或15μg的Qβ_ecHA(PR8)(实施例5获得)或15μg的ecHA(PR8)总蛋白(实施例1获得)或15μg的Qβ总蛋白皮下免疫每组六只雌性balb/c小鼠。第16天小鼠眼窝后放血，并使用实施例6所述的ecHA(PR8)-特异性ELISA或实施例7所述的红血球凝集抑制(HAI)试验分析血清。为测试疫苗的保护能力，在第23天用致死剂量(10LD50)的异源A型流感病毒株A/WSN/33和A/FM/1/47激发所有小鼠，并如实施例8所述监控小鼠。激发后的抗体滴度、HAI滴度以及存活率概括在表8中。如表8所示，与QβVLP结合的HA的两种球状结构域诱导抗来源于同源病毒的天然HA的高抗体滴度。类似地，诱导出抗同源病毒的良好的HAI滴度。这些抗体滴度和HAI滴度类似于或好于通过由与VLP结合的整个胞外域组成的疫苗诱导的抗体滴度和HAI滴度。重要的是注意到，含有球状结构域的两种疫苗完全保护小鼠对抗两种不同的H1N1病毒株(A/FM/47和A/WSN/33)的异源激发，而用完整天然胞外域进行免疫未能提供完全的保护。该结果进一步强调了选择用于制备流感疫苗的胞外域片段的能力。

表8：

实施例28：与Qβ结合的球状结构域的剂量滴定

为进一步观察疫苗的保护能力，在第0天用配制在200μl PBS中的15、3、0.6、0.12、0.024、0.0046μg的与Qβ结合的gdHA_PR8_42_310或gdHA_PR8_46_310(由实施例16获得)或15μg的ecHA(PR8)(由实施例1获得)或15μg的Qβ(也参见表9的前两列)皮下免疫每组四只雌性balb/c小鼠。第18天小鼠眼窝后放血，并使用分别在实施例6和7中描述的ecHA(PR8)-特异性ELISA或红血球凝集抑制(HAI)试验分析血清。为测试疫苗的保护能力，在第21天用致死量(4LD50)的流感病毒A/PR/8/34激发所有小鼠，并如实施例8所述监控小鼠。激发后的抗体滴度、HAI滴度以及存活率概括在表9中。如表9所示，具有所研究的两种球状结构域的疫苗诱导对抗来自同源病毒的天然HA的高抗体滴度以及由同源病毒株测定的良好的HAI滴度。而且，单次注射120ng疫苗能够完全保护小鼠对抗同源病毒的致死激发。重要的是注意到，15μg的在真核表达系统中生成的HA胞外域不能完全保护小鼠对抗致死激发，这进一步突出了基于HA球状结构域的疫苗的功效。如上述所观察的，抗原与噬菌体VLP的偶联明显降低载体特异性免疫应答。

表9：

实施例29：与AP205结合的球状结构域的剂量调整

为进一步观察疫苗的保护能力，在第0天用配制在200μl PBS中的15、3、0.6、0.12、0.024、0.0046μg的与AP205结合的gdHA_PR8_42_310或gdHA_PR8_46_310(由实施例16获得)或15μg的ecHA(PR8)(由实施例1获得)或15μg的AP205(也参见表10的前两列)皮下免疫每组四只雌性balb/c小鼠。第21天小鼠眼窝后放血，并使用分别在实施例6和7中描述的ecHA(PR8)-特异性ELISA或红血球凝集抑制(HAI)试验分析血清。为测试疫苗的保护能力，在第34天用致死剂量(4LD50)的流感病毒A/PR/8/34激发所有小鼠，并如实施例8所述监控小鼠。激发后的抗体滴度、HAI滴度以及存活率概括在表10中。如表10所示，具有所研究的两个球状结构域的疫苗诱导对抗来自同源病毒的天然HA的高抗体滴度以及由同源病毒株测定的良好的HAI滴度。而且，单次注射24ng或120ng疫苗(取决于所用的球状结构域)能够完全保护小鼠对抗同源病毒的致死激发，这进一步突出了基于HA的球状结构域的疫苗的效能。与上述所观察的类似，抗原与噬菌体VLP的偶联明显降低载体特异性免疫应答。

表10：

实施例30：用与噬菌体VLP结合的gdHA PR8_42_310和gdHAPR8_46_310+/-Alum、+/-增强剂免疫

为了进一步研究疫苗与佐剂结合的免疫原性，在第0天和第24天用配制在200μl PBS中的含或不含Alum(每小鼠每次注射8.3μl Alhydrogel2％(Brenntag，Biosector))的15、3、0.6或0.12μg的Qβ_gdHA_PR8_42_310、Qβ_gdHA_PR8_46_310、AP205_gdHA_PR8_42_310或AP205_gdHA_PR8_46_310(由实施例16获得)皮下免疫每组四只雌性balb/c小鼠。第24天和第48天小鼠眼窝后放血，并使用ecHA(PR8)-特异性ELISA或红血球凝集抑制(HAI)试验分析血清。第24天和第48天的平均抗-ecHA-PR8抗体滴度显示于表11中。表11的结果表明，在各测试浓度下，所有疫苗诱导对抗同源病毒的天然胞外域的良好抗体应答。对HAI滴度而言也是同样。再次注射相同剂量的疫苗可以使初始滴度(ELISA和HAI)得到明显增强。而且数据显示将Alum加到疫苗中甚至进一步增强了诱导的免疫应答。

表11：

实施例31：由与噬菌体VLP偶联的A/California/04/09的球状结构域组成的疫苗的功效

为测试来自流感病毒A/California/04/2009(H1N1)的球状结构域，制备疫苗，并在小鼠功效研究中利用异源病毒激发进行测试。简言之，来自A型流感病毒A/California/04/2009(由实施例18获得)的球状结构域与Qβ和AP205偶联，并基本上如实施例25所述去除未偶联蛋白。所得疫苗称为Qβ_gdHA_AC0409_42_310和AP205_gdHA_AC0409_42_310。在第0天和第28天用配制在200μl PBS中的含或不含Alum(每小鼠每次注射8.3μlAlhydrogel 2％(Brenntag，Biosector))的75、15、3、0.6或0.12μg的Qβ_gdHA_AC0409_42_310或AP205_gdHA_AC0409_42_310皮下免疫每组四只雌性balb/c小鼠。第21天和第49天小鼠眼窝后放血，并使用实施例6所述rHA(A/California/04/09)-特异性ELISA分析血清。第65天用致死剂量4LD50的异源小鼠适应的流感A/PR/8/34病毒激发小鼠，并如实施例8所述监控小鼠存活率。该实验的结果概括在表12中。表12所示结果表明，通过用流感A/California/04/09病毒血凝素的胞外域变体(其在大肠杆菌中表达并重折叠)免疫小鼠而诱导的IgG抗体识别流感病毒A/California/04/09血凝素蛋白的天然三聚体形式。两种疫苗在测试的各浓度下都诱导对抗同源病毒的天然胞外域的良好抗体应答。再次注射相同剂量的疫苗可以明显提高初始滴度。而且数据显示将Alum加到疫苗中甚至进一步增强了对抗偶联抗原的免疫应答。重要的是，除一个实验组外，用与噬菌体VLP偶联的球状结构域免疫的所有小鼠(不管单独施用还是和Alum一起施用)都经受异源病毒的致死激发而存活。完全相反的是，如果与Alum一起施用15μg的单独球状结构域，只观察到部分保护。类似地，接受单独的球状结构域但没有Alum的所有动物均死亡。这些结果合起来还表明，球状结构域和噬菌体VLP的偶联明显改善其保护能力。

表12：

实施例32：来自不同流感病毒株的gdHA在小鼠中的免疫原性

为测试来自不同流感病毒亚型的球状结构域是否可用于产生识别相应亚型的天然HA的疫苗，制备了具有不同亚型的球状结构域的疫苗，并测试其在小鼠中的免疫原性。简言之，来自A型流感病毒H1N1的球状结构域(由实施例19和实施例24获得)、来自A型流感病毒H3N2的球状结构域(由实施例20获得)、来自A型流感病毒H5N1株的球状结构域(由实施例21和22获得)以及B型流感病毒的球状结构域(由实施例23获得)与Qβ和/或AP205偶联，并基本上如实施例25所述去除未偶联蛋白。所得疫苗按照VLP(Qβ或AP205)和所连接的球状结构域命名(例如Qβ_gdHA_AB5907_42_310)。在第0天用配制在200μl PBS中的15μg表13第一栏所列抗原皮下一次性免疫每组三到五只雌性balb/c小鼠。第21天小鼠眼窝后放血，并利用实施例6所述HA特异性ELISA使用表13第二栏所示涂层分析血清。如表13所示，测试的所有不同A型流感病毒亚型(H1、H5和H3)和B型流感病毒株的球状结构域都能诱生识别来自相应流感病毒亚型的天然HA的抗体应答。在各种情况下，与单独用gdHA的免疫相比，gdHA结构域与VLP的偶联明显提高其免疫原性。重要的是：该方法对所研究的所有病毒株和亚型均有效的事实强烈提示作为疫苗发挥作用的球状结构域可预期用于将来出现的流感病毒株和亚型。

表13：

实施例34：CB5

A)gdHA_PR8_42_310(H1N1)与Cb5病毒样颗粒的偶联

PBS/10％甘油(pH 7.2)中的2ml的1mg/ml Cb5 VLP蛋白(SEQ ID NO：92)在室温下与42.6μl的SMPH溶液(DMSO中的50mM)反应60min。反应溶液在4℃下分别在12和4小时内用20mM HEPES/10％甘油(pH为7.2)的两次21换液透析。1.4ml衍生化和透析的Cb5溶液与2ml含有PBS(pH为7.2)中的实施例16获得的1mg/ml纯化gdHA_PR8_42_310蛋白质的溶液混合并在室温下孵育4h以发生化学交联，得到Cb5-gdHA_PR8_42_310。未偶联蛋白用Sepharose CL4B柱通过尺寸排阻层析去除。偶联产物在还原条件下在12％的二-三-聚丙烯酰胺凝胶上分析。可看见分子量相对于Cb5衣壳单体增加的条带，这清楚地表明流感病毒gdHA_PR8_42_310蛋白与Cb5 VLP的成功交联。

B)用与Cb5衣壳偶联的gdHA-PR8(H1N1)蛋白(Cb5-gdHA(PR8))免疫小鼠

在如实施例8所述的流感病毒感染的鼠科动物模型中测试Cb5-gdHA(PR8)免疫的效力。简言之，在第0天用配制在200μl PBS中的15μg的Cb5-gdHA_PR8_42_310疫苗或15μg的Cb5VLP经皮下注射免疫每组四只雌性balb/c小鼠。第34天小鼠眼窝后放血，并使用ecHA(PR8)-特异性的和Cb5-特异性的ELISA分析血清。然后在第41天用致死剂量(4xLD50)的小数适应的流感病毒A/PR/8/34激发小鼠。该结果的结果显示于表14中。表14所示结果表明，gdHA(PR8)与Cb5 VLP的偶联允许诱导高的抗-ecHA(PR8)抗体应答。而且，用Cb5-gdHA(PR8)疫苗单次免疫小鼠诱导对抗小鼠适应的流感病毒A/PR/8/34的致死激发的保护性抗体应答，从而表明Cb5是用于基于HA的球状结构域的流感疫苗的良好载体。

表14：

实施例35：红血球凝集试验

为测试是否如实施例24所述制备并如实施例25所述与Qβ或AP205偶联的gdHA片段在结构上类似于天然HA蛋白，用与Qβ或AP205结合的gdHA_PR8_42_310或gdHA_PR8_46_310进行红血球凝集试验。流感病毒上存在的天然HA蛋白能够凝集红血球，这是它们与其在红血球(RBC)上的受体结合的结果。流感病毒对鸡红血球的这一凝集作用通过中和如实施例7所述的抗体而在红血球凝集抑制试验中被抑制。为测试是否与Qβ或AP205偶联的gdHA片段和流感病毒表面上的天然HA蛋白具有类似结构并因此能够与RBC上的受体结合和由此诱导鸡RBC的凝集，Qβ-gdHA_PR8_42_310、Qβ-gdHA_PR8_46_310、AP205-gdHA_PR8_42_310和AP205-gdHA_PR8_46_310溶液在PBS中系列稀释并在96孔板中与50μl的1％鸡RBC混合。所述板通过搅拌、覆盖进行混合，且使RBC在室温下放置1h。测定仍然能够凝集鸡RBC的Qβ-gdHA_PR8_42_310、Qβ-gdHA_PR8_46_310、AP205-gdHA_PR8_42_310和AP205-gdHA_PR8_46_310的最小量，且对于Qβ-gdHA_PR8_42_310，所述最小量是80ng/孔，对于Qβ-gdHA_PR8_42_310，所述最小量是80ng/孔，对于AP205-gdHA_PR8_42_310，所述最小量是40ng/孔，和对于AP205-gdHA_PR8_46_310，所述最小量是10ng/孔。该实验的结果显示gdHA片段可以与天然HA蛋白的受体结合，因此其结构上必定与天然HA蛋白类似。

Claims

1.组合物，包含：

(a)病毒样颗粒(VLP)，其具有至少一个第一附着位点，其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒；和

(b)至少一种抗原，其具有至少一个第二附着位点，其中所述至少一种抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的至少80个连续氨基酸；

其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。

2.权利要求1的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是蛋白，其中所述蛋白由以下亚基组成：(a)HA1亚基，包含SEQ ID NO：75的11位氨基酸到328位氨基酸或优选由其组成，和(b)HA2亚基，由SEQ ID NO：76的1到176位组成。

3.前述任一权利要求的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是A型流感病毒血凝素蛋白的胞外域。

4.前述任一权利要求的组合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16的A型流感病毒血凝素蛋白亚型的胞外域，且其中优选所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域是选自A型流感病毒血凝素蛋白亚型H1、H2和H3的A型流感病毒血凝素蛋白亚型的胞外域。

5.前述任一权利要求的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是天然存在的流感病毒血凝素蛋白胞外域。

6.前述任一权利要求的组合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO：39具有至少70％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

7.权利要求1至5中任一的组合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO：40具有至少70％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

8.权利要求1至5中任一的组合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO：41具有至少70％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

9.权利要求1至5中任一的组合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO：42具有至少70％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

10.权利要求1至5中任一的组合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO：43具有至少70％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

11.权利要求1至5中任一的组合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO：73具有至少70％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

12.权利要求1至5中任一的组合物，其中所述A型流感病毒血凝素蛋白的所述胞外域的氨基酸序列选自下组：(i)SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列；和(ii)与SEQ ID NO：74具有至少70％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

13.权利要求1的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是B型流感病毒血凝素蛋白的胞外域。

14.前述任一权利要求的组合物，其中所述抗原是流感病毒血凝素蛋白的胞外域，且其中优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是三聚体形式。

15.权利要求1至13中任一的组合物，其中所述抗原是所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的片段，其中优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段是所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的HA1亚基或所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述HA1亚基的片段。

16.权利要求15的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含流感病毒血凝素蛋白的至少一个八链胶冻卷桶和至少一个α-螺旋。

17.权利要求15或16任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含受体结合域或优选由其组成。

18.权利要求15至17任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段还包含痕迹酯酶域。

19.权利要求15至18任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的98和195位的酪氨酸，对应于SEQ ID NO：75的153位的色氨酸和对应于SEQ ID NO：75的位的组氨酸的氨基酸残基。

20.权利要求15至19任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的半胱氨酸残基，优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的64、76、97、139位的半胱氨酸残基，更优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的52、64、76、97、139、277、281、305位的半胱氨酸残基。

21.权利要求15至20任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的57位到276位的氨基酸序列或优选由其组成。

22.权利要求15至21任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的46位到310位的氨基酸序列或优选由其组成。

23.权利要求15至22任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的42位到310位的氨基酸序列或优选由其组成。

24.权利要求15至23任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的54位到276位的氨基酸序列或优选由其组成。

25.权利要求15至24任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的54位到270位的氨基酸序列或优选由其组成。

26.权利要求15至25任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的54a位到276位的氨基酸序列或优选由其组成。

27.权利要求15至26任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域的所述片段包含对应于SEQ ID NO：75的54a位到270位的氨基酸序列或优选由其组成。

28.权利要求15至27任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域与A型流感病毒株A/California/07/2009(H1N1)(Genbank登录号：ACP44189.1)或A/Perth/16/2009(H3N2)(Genbank登录号：ACS71642.1)的HA胞外域具有至少70％的氨基酸序列同一性，且其中优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是天然存在的所述流感病毒血凝素蛋白胞外域。

29.权利要求15至27任一的组合物，其中所述流感病毒血凝素蛋白胞外域与B型流感病毒株B/Brisbane/33/2008(Genbank登录号：ACN29387.1)、B/Guangzhou/01/2007(Genbank登录号：ABX71684.1)或B/Brisbane/60/2008(Genbank登录号：ACN29383.1)的HA胞外域具有至少70％的氨基酸序列同一性，且其中优选所述流感病毒血凝素蛋白胞外域是天然存在的所述流感病毒血凝素蛋白胞外域。

30.前述任一权利要求的组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组外壳蛋白、基本上由其组成或者由其组成。

31.前述任一权利要求的组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ、RNA噬菌体AP205或RNA噬菌体

的重组外壳蛋白、基本上由其组成或者由其组成。

32.前述任一权利要求的组合物，其中所述病毒样颗粒包含重组外壳蛋白、基本上由其组成或者由其组成，所述重组外壳蛋白包含选自下组的氨基酸序列或优选由其组成：(a)SEQ ID NO：1；(b)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的混合；(c)SEQ ID NO：19；(d)SEQ ID NO：92；(e)SEQ ID NO：93和(f)SEQID NO：94。

33.前述任一权利要求的组合物，其中所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP。

34.前述任一权利要求的组合物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ的重组外壳蛋白、基本上由其组成或由其组成。

35.前述任一权利要求的组合物，其中所述病毒样颗粒包含含有SEQ IDNO：1或优选由其组成的重组外壳蛋白、基本上由其组成或者由其组成。

36.前述任一权利要求的组合物，其中所述第一附着位点和所述第二附着位点经由至少一个非肽共价键连接。

37.前述任一权利要求的组合物，其中所述第一附着位点包含或优选是氨基，优选赖氨酸残基的氨基。

38.前述任一权利要求的组合物，其中所述第二附着位点包含或优选是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。

39.包含有效量的前述任一权利要求的组合物的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物还包含佐剂。

40.一种药物组合物，其包含：

(a)权利要求1-38中任一项的组合物或权利要求39的疫苗组合物；和

(b)药学上可接受的载体。

41.一种免疫方法，所述方法包括向动物，优选向人，施用权利要求1-38中任一项的组合物、权利要求39的疫苗组合物或权利要求40的药物组合物。

42.权利要求1-38中任一项的组合物、权利要求39的疫苗组合物或权利要求40的药物组合物，其用作药物。

43.权利要求1-38中任一项的组合物、权利要求39的疫苗组合物或权利要求40的药物组合物，其用于治疗流感的方法中。

44.一种治疗、改善和/或预防流感的方法，所述方法包括向动物，优选向人，施用免疫有效量的权利要求1-38中任一项的组合物、权利要求39的疫苗组合物和/或权利要求40的药物组合物。