ES2832733T3 - Métodos de preparación y uso de complejos de hemaglutinina del virus de la gripe - Google Patents

Métodos de preparación y uso de complejos de hemaglutinina del virus de la gripe Download PDF

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Abstract

Un método para preparar un complejo de proteína HA del virus de la gripe sin cabeza, comprendiendo el método: (a) obtener o expresar una proteína HA del virus de la gripe que comprende: (i) un dominio de tallo, en el que el dominio de tallo comprende una mutación puntual a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 y 435, o un residuo de aminoácido correspondiente al mismo por alineamiento con SEQ ID NO: 1, y (ii) un dominio de cabeza, en el que el dominio de cabeza comprende uno o más motivos de reconocimiento de proteasa introducidos artificialmente, (b) permitir que la proteína HA del virus de la gripe obtenida o expresada en la etapa (a) se pliegue en su conformación natural que tiene un dominio de cabeza y un dominio de tallo trimérico compuesto por tres protómeros, (c) introducir una o más entrecruzamientos ditirosina, en el dominio de tallo trimérico con el fin de estabilizar el dominio de tallo en su conformación natural de trímero, y (d) posteriormente escindir proteolíticamente el dominio de cabeza en el uno o más motivos de reconocimiento de proteasa introducidos artificialmente, produciendo de ese modo un complejo de proteína HA del virus de la gripe sin cabeza.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de preparación y uso de complejos de hemaglutinina del virus de la gripe
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/861.989, presentada el 3 de agosto de 2013.
Lista de secuencias
La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 1 de agosto de 2014, se denomina Avatar_006_WO1_Sequence_Listing.txt y tiene un tamaño de 414.314 bytes.
Antecedentes de la invención
Las poblaciones de EE.UU. y del mundo continúan estando en riesgo de un brote de pandemia de gripe, análogo al brote de gripe española de 1918 (H1N1) que mató a más de 50 millones de personas. De forma similar, el virus de la gripe usado como arma sigue siendo una amenaza importante de guerra biológica. Además, la deriva antigénica requiere que los individuos que buscan protección contra la gripe se vacunen anualmente, y estudios recientes han mostrado que los productos de vacunas estacionales son solo débilmente eficaces si se produce un desajuste entre las cepas de la vacuna y las cepas que circulan.
El desarrollo de una vacuna para la gripe universal eficaz que proporcione protección frente a todas las cepas del virus de la gripe, tendría un enorme valor. La evidencia de que anticuerpos específicos para el dominio de tallo conservado de la proteína HA del virus de la gripe puede proteger contra la infección ha impulsado un esfuerzo común para identificar anticuerpos monoclonales adicionales y mejores, y para desarrollar una vacuna protectora para abordar esta necesidad de salud médica y pública insatisfecha. El documento WO2013079473 describe (véase, por ejemplo, las reivindicaciones 10 y 17) la mutación de aminoácidos seleccionados en restos de cisteína, con el fin de permitir la formación de puentes disulfuro.
Sumario de la invención
La invención es como se define en las reivindicaciones.
Algunos aspectos de la presente invención se resumen a continuación. Se describen aspectos adicionales en las secciones Descripción detallada de la invención, Ejemplos y Figuras de la presente solicitud de patente.
Se sabe que la proteína HA del virus de la gripe induce potentes anticuerpos neutralizantes que se correlacionan con la protección contra la infección por el virus de la gripe. La mayoría de las vacunas contra el virus de la gripe existentes proporcionan protección basada en la generación de anticuerpos contra el dominio de cabeza inmunodominante, altamente variable, de la proteína HA del virus de la gripe. Sin embargo, el domino de cabeza a menudo es específico de la cepa, de modo que dichas vacunas en general son solo eficaces contra cepas del virus de la gripe homólogas, y no proporcionan protección contra otras formas del virus de la gripe, tales como variantes de deriva homólogas y cepas heterólogas. Recientemente se ha mostrado que el dominio de tallo de la HA del virus de la gripe puede producir anticuerpos que reaccionan a lo largo de los subtipos de virus de la gripe, debido a la estructura más conservada del dominio de tallo y a la presencia de epítopos presentados en el tallo conservado. También se han aislado anticuerpos neutralizantes (nAb) potentes que se unen específicamente a la conformación natural de trímero del dominio de tallo. Sin embargo, el dominio de tallo se vuelve muy inestable y se transforma fácilmente a una conformación no natural o se disocia tras la eliminación del dominio de cabeza de la HA, limitando la utilidad del dominio de tallo por sí mismo (por ejemplo, sin el dominio de cabeza) como un inmunógeno de vacuna. Una proteína HA del virus de la gripe que tiene un dominio de tallo estabilizado en su conformación natural de trímero podría ser muy valiosa - proporcionando un inmunógeno candidato para vacuna de la gripe capaz de proporcionar protección para todas las cepas de virus de la gripe. De forma similar, dicha proteína HA del virus de la gripe estabilizada también podría ser útil para la generación de anticuerpos, tales como anticuerpos de diagnóstico y terapéuticos.
Basado en un análisis extenso de la estructura de la proteína HA del virus de la gripe, la presente invención proporciona una variedad de nuevas estrategias de diseño y nuevas construcciones para estabilizar o “bloquear” el dominio de tallo de la proteína HA del virus de la gripe en su conformación natural de trímero como se cita en las reivindicaciones. La presente divulgación también proporciona una variedad de polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe genéticamente modificados, tales como los que comprenden uno o más entrecruzamientos ditirosina dirigidos, o una o más mutaciones de tirosina, y opcionalmente uno o más sitios/motivos de escisión de proteasa introducidos artificialmente. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe genéticamente modificados de la divulgación se pueden hacer usando cualquier polipéptido o proteína HA del virus de la gripe adecuado como punto de partida. Por ejemplo, se puede usar una secuencia de HA del virus de la gripe de cualquier tipo, subtipo o cepa de virus de la gripe como un punto de partida para la generación de los productos genéticamente modificados descritos en el presente documento. En muchas de las realizaciones descritas en el presente documento, se usa la cepa del virus de la gripe Puerto Rico/8/1934 o “PR8” (que es una cepa del subtipo de virus de la gripe H1N1 de la gripe A) como punto de partida. Se proporciona la secuencia de aminoácidos de una cepa PR8 silvestre en la figura 9 (SEQ ID NO: 1). Sin embargo, se podría usar igualmente cualquier otra secuencia de HA del virus de la gripe de cualquier otro tipo, subtipo o cepa del virus de la gripe. Los ejemplos no limitativos de otras secuencias de HA del virus de la gripe que se pueden usar como el punto de partida para la generación de los productos de HA genéticamente modificados descritos en el presente documento incluyen, las ilustradas en las figuras 55, 56, 57, 58, 59 y 60, y las que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 111, 112, 113, 114 y 115. Igualmente, se pueden usar versiones optimizadas de codones de las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de HA del virus de la gripe como puntos de partida para la generación de los productos de HA genéticamente modificados descritos en el presente documento. Los ejemplos no limitativos de secuencias de HA de codón optimizado de la cepa de la gripe PR8 incluyen los que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 63, 64, 65, 66, 67 y 68.
La presente divulgación proporciona polipétidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden uno o más entrecruzamientos ditirosina dirigidos, en su dominio de tallo que sirven para estabilizar o “bloquear” el dominio de tallo en su conformación natural de trímero. En algunas realizaciones, tales entrecruzamientos dirigidos son entrecruzamientos ditirosina. La presente divulgación proporciona un complejo de proteínas de HA del virus de la gripe que comprende un dominio de tallo trimérico formado por la asociación de tres promotores, en donde el dominio de tallo comprende uno o más entrecruzamientos dirigidos, tales como entrecruzamientos ditirosina, que estabilizan el dominio de tallo en su conformación natural de trímero. En algunas de dichas realizaciones, el complejo de proteínas de HA del virus de la gripe comprende además uno o más entrecruzamientos en el dominio de cabeza de la HA del virus de la gripe. En algunas de dichas realizaciones, el complejo de proteína de HA del virus de la gripe no comprende un dominio de cabeza intacto. En realizaciones en las que se usan entrecruzamientos ditirosina, dichos entrecruzamientos se pueden hacer entre dos restos de tirosina que están presentes de manera natural en el polipéptido, proteína y/o complejo de proteína de HA, o entre dos restos tirosina que se han introducido por mutación, o entre un primer resto tirosina que está presente de manera natural en un polipéptido, proteína y/o complejo de proteína de HA y un segundo resto de tirosina que se ha introducido por mutación. La presente divulgación también proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden una o más mutaciones “a tirosina” en el dominio de tallo de la HA en localizaciones que se ha determinado que son localizaciones convenientes para la formación de entrecruzamientos ditirosina para estabilizar el dominio de tallo en su conformación natural de trímero. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación (ya contengan entrecruzamientos dirigidos (tales como entrecruzamientos ditirosina), o mutaciones a tirosina, o ambos) son proteínas de HA de longitud entera que comprenden tanto el dominio de tallo de la HA (con o sin el péptido señal) como el dominio de cabeza de la HA, y opcionalmente también el dominio transmembrana de la hA. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación carecen de uno o más del dominio de cabeza de la HA, el dominio transmembrana y/o el péptido señal. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención comprenden el dominio de tallo de la HA, o al menos una parte del dominio de tallo de la HA que es suficiente para ensamblarlo en, o que forme parte de, la conformación de tallo de trímero normal. Por lo tanto, en algunas realizaciones, puede ser posible eliminar, añadir o sustituir determinados aminoácidos del dominio de tallo de la HA sin comprometer la capacidad del polipéptido o proteína HA para ensamblarse en su conformación de trímero.
La presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden mutaciones a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 403, 406, 429, 432, 433 y 435, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 9 (SEQ ID NO: 1), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos cuando se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la SEQ ID NO: 1. Los ejemplos no limitativos de secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe que comprenden una o más mutaciones a tirosina incluyen las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 y 110. La presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden entrecruzamientos ditirosina entre una o más pares de aminoácidos seleccionados de las siguientes posiciones de aminoácidos: 308, 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433, 435 y 437, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 9 (SEQ ID NO: 1), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos cuando se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la SEQ ID NO: 1.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden uno o más sitios de escisión de proteasas introducidos artificialmente, que se pueden usar para la eliminación proteolítica del dominio de cabeza de un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA. La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden uno o más sitios de escisión de proteasas introducidos artificialmente, insertados después (por ejemplo, inmediatamente después) de las posiciones de aminoácidos 48, 63, 228, 278, 282, 283, 286 y 291, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos por ejemplo cuando se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 1. Los ejemplos no limitativos de secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe que comprenden uno o más sitios de escisión de proteasas introducidos artificialmente incluyen las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden al menos un par de sitios de escisión de proteasas introducidos artificialmente, de modo que la escisión en ambos sitios de escisión del par dará como resultado la eliminación del dominio de cabeza de la HA. Los ejemplos no limitativos de secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe que comprenden un par de dichos sitios de escisión de proteasa introducidos artificialmente incluyen las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 26, 27, 28, 29, y 30. Donde hay un par de sitios de escisión de proteasa introducidos artificialmente, el primero de dichos sitios de escisión de proteasa se inserta después (por ejemplo, inmediatamente después) de la posición de aminoácido 48 o 63, y el segundo de dichos sitios de escisión de proteasa se inserta después (por ejemplo, inmediatamente después) de la posición de aminoácido 228, 278, 282, 283, 286 o 291, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo cuando se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 1.
La presente solicitud también da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas del dominio de tallo de HA del virus de la gripe que no comprenden un dominio de cabeza de la HA intacto, tal como los generados por eliminación proteolítica del dominio de cabeza de la HA del virus de la gripe, por ejemplo por escisión de uno o más sitios de escisión de proteasas introducidos artificialmente descritos en el presente documento. Las secuencias del dominio de tallo de la HA del virus de la gripe son discontinuas porque la proteína HA comprende una región N-terminal que comprende secuencias del dominio de tallo, seguido de una región media que comprende secuencias del dominio de cabeza, seguido de una región C-terminal que comprende secuencias del dominio de tallo adicionales. Por consiguiente, la escisión/eliminación proteolítica del dominio de cabeza de la HA da como resultado la generación de dos fragmentos de polipéptido del dominio de tallo, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal. La presente solicitud da a conocer dichos polipéptidos y/o polipéptidos, proteínas o complejos de proteína del dominio de tallo N y C-terminales que comprenden dichos polipéptidos del dominio de tallo N y C-terminales. Dichos polipéptidos del dominio de tallo N y C-terminales están presentes en un complejo de proteína del dominio de tallo de la hA que tiene una conformación del dominio de tallo de trímero natural. Los ejemplos no limitativos de polipéptidos del dominio de tallo N-terminal de la HA del virus de la gripe incluyen las SEQ ID NO: 94 y 95. Los ejemplos no limitativos de polipéptidos del dominio de tallo C-terminal de la HA del virus de la gripe incluyen las SEQ ID NO: 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 y 117. Un ejemplo no limitativo adicional de un polipéptido del dominio de tallo N-terminal de HA del virus de la gripe es uno que consiste en, consiste esencialmente en, o comprende los aminoácidos 1-228 de la SEQ ID NO: 117, o los aminoácidos de 229 a 519 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones el polipéptido del dominio de tallo N-terminal de la HA del virus de la gripe comprende una o más mutaciones a tirosina, por ejemplo, en una o más de las posiciones 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 o 435 de la SEQ ID NO: 1, o posiciones que corresponden a las mismas (por ejemplo determinadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1) o en una o más las posiciones 112, 115, 120, 131, 137, 141, 142 o 144 de la SEQ ID NO: 117, o posiciones que corresponden a las mismas (por ejemplo determinadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 117).
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden tanto (a) uno o más entrecruzamientos dirigidos, tales como entrecruzamientos ditirosina en su dominio de tallo que sirven para estabilizar o “bloquear” el dominio de tallo en su conformación natural de trímero y/o una o más mutaciones “a tirosina” en el dominio de tallo de la HA en localizaciones que se ha determinado que son localizaciones convenientes para la formación de entrecruzamientos ditirosina para estabilizar el dominio de tallo en su conformación natural de trímero, por ejemplo, como se ha descrito antes y en otro sitio a lo largo de la presente memoria descriptiva de patente, como (b) uno o más sitios de escisión de proteasa introducidos artificialmente que se pueden usar para eliminar proteolíticamente el dominio de cabeza del polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA, por ejemplo como se ha descrito antes y en otra parte a lo largo de la presente memoria descriptiva de patente. La presente solicitud da a conocer un polipéptido, proteína o complejo de proteína de HA del virus de la gripe que comprende: (a) un dominio de tallo trimérico que comprende una o más mutaciones a tirosina, y (b) un dominio de cabeza que comprende uno o más motivos de reconocimiento de proteasa introducidos artificialmente. Los ejemplos no limitativos de secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe que comprenden tanto una mutación a tirosina como un sitio de escisión de proteasa introducido artificialmente incluyen las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 y 17. Además, cualquiera de las mutaciones a tirosina e inserciones de sitios de escisión de proteasa descritas o ilustradas en el presente documento se pueden combinar en el mismo polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA.
La presente solicitud da a conocer un complejo de proteínas de HA del virus de la gripe que comprende: (a) un dominio de tallo trimérico formado por la asociación de tres promotores, en donde el dominio de tallo comprende uno o más entrecruzamientos dirigidos introducidos artificialmente, tales como entrecruzamientos ditirosina (por ejemplo, para estabilizar el dominio de tallo en su conformación natural de trímero), y (b) un dominio de cabeza que comprende uno o más motivos de reconocimiento de proteasa introducidos artificialmente.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para hacer un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe sin cabeza, comprendiendo el método: (a) obtener o expresar una proteína HA del virus de la gripe que comprende (i) un dominio de tallo, en el que el dominio de tallo comprende una mutación puntual a tirosina en una o más posiciones de aminoácidos 403, 406, 411, 422, 429, 433 y 435, o un residuo de aminoácido correspondiente a lo mismo por alineamiento con SEQ ID NO: 1, y (ii) un dominio de cabeza que contiene no o más motivos de reconocimiento de proteasa introducidos artificialmente, (b) dejar que la proteína Ha del virus de la gripe obtenida o expresada en la etapa (a) se pliegue en su conformación natural que tiene un dominio de cabeza y un dominio de tallo trimérico compuesto por tres promotores, (c) introducir uno o más entrecruzamientos ditirosina, en el dominio de tallo trimérico con el fin de estabilizar el dominio de tallo en su conformación trimérica natural, y (d) posteriormente escindir proteolíticamente el dominio de cabeza en el uno o más motivos de reconocimiento de proteasa introducidos artificialmente, produciendo así un complejo de proteínas de HA del virus de la gripe sin cabeza. En algunos de dichos métodos, las localizaciones de los entrecruzamientos ditirosina, mutaciones a tirosina y/o sitios/motivos de escisión de proteasa introducidos artificialmente, pueden ser las especificadas antes y/o en otra parte a lo largo de la presente memoria descriptiva de patente. En algunos de dichos métodos, la proteína HA del virus de la gripe puede ser expresada en cualquier tipo de célula adecuada, que incluye células de mamífero o células de insecto.
La presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe presentadas en el presente documento, o cualquiera de sus variantes o fragmentos, que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos presentadas en el presente documento, en donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden una mutación a tirosina en uno o más de los restos 403, 406, 411, 429, 432, 433 y 435, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 9 (SEQ ID NO: 1), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determina por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 1.
La presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe presentadas en el presente documento, o cualquiera de sus variantes o fragmentos, que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos presentadas en el presente documento, en donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden un sitio de escisión de proteasa introducido artificialmente después de, por ejemplo, inmediatamente después de, uno o más de los siguientes restos: 48, 63, 228, 278, 283, 286 y 291, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 9 (SEQ ID NO: 1), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 1.
La presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe presentadas en el presente documento, o cualquiera de sus variantes o fragmentos, que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos presentadas en el presente documento, en donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden dos sitios de escisión de proteasa introducidos artificialmente, el primero de dichos sitios introducido inmediatamente después del resto 48 o 63, y el segundo de dichos sitios introducido inmediatamente después del resto 228, 278, 282, 283, 286 o 291, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 9 (SEQ ID NO: 1), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 1.
La presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe presentadas en el presente documento, o cualquiera de sus variantes o fragmentos, que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos presentadas en el presente documento, en donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden tanto (a) un resto de tirosina (bien se encuentre de forma natural o proceda de una mutación a tirosina), en uno o más de los restos 308, 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433, 435 o 437, como (b) un sitio de escisión de proteasa introducido artificialmente insertado inmediatamente después de uno o más de los siguientes restos: 48, 63, 228, 278, 282, 283, 286 y 291, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 9 (SEQ ID NO: 1), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 1.
La presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe presentadas en el presente documento, o cualquiera de sus variantes o fragmentos, que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos presentadas en el presente documento, en donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden tanto (a) un resto de tirosina (bien se encuentre de forma natural o proceda de una mutación a tirosina), en uno o más de los restos 308, 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433, 435 o 437, como (b) dos sitios de escisión de proteasa introducidos artificialmente, el primero de dichos sitios introducido inmediatamente después del resto 48 o 63, y el segundo de dichos sitios introducido inmediatamente después del resto 228, 278, 282, 283, 286 o 291, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 9 (SEQ ID NO: 1), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de Ha con la secuencia ID NO: 1.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los restos de aminoácidos 229 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 279 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 283 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 284 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 287 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 292 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 o 117, o los restos de aminoácidos 1-228 de la SEQ ID NO: 117, o secuencias que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos, en donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden un resto de tirosina o mutación a tirosina en uno o más de los restos 308, 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433, 435 o 437, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 9 (SEQ ID NO: 1), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 1, o uno o más de los restos 112, 115, 120, 131, 137, 141, 142 o 144, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 89 (SEQ ID NO: 117), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 117.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los restos de aminoácidos 1 a 47 de la SEQ ID NO: 1, o de 1 a 62 de la SEQ ID NO: 1, o secuencias que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos, uno o más de los restos 308, 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433, 435 y 437, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 9 (SEQ ID NO: 1), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de Ha con la secuencia ID NO: 1.
La presente solicitud da a conocer composiciones y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en un primer y un segundo polipéptido, en donde (a) el primer polipéptido (C-terminal) comprende, consiste esencialmente en o consiste en los restos de aminoácidos 229 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 279 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 283 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 284 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 287 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 292 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 o 117, o los restos de aminoácidos 1-228 de la SEQ ID NO: 117, o secuencias que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos, y en donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden un resto de tirosina o mutación a tirosina en uno o más de los restos 308, 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433, 435 o 437, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 9 (SEQ ID NO: 1), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 1, o uno o más de los restos 112, 115, 120, 131, 137, 141, 142 o 144, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 89 (SEQ ID NO: 117), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 117, y en donde (b) el segundo polipéptido (N-terminal) comprende, consiste esencialmente en o consiste en los restos de aminoácidos 1 a 47 de la SEQ ID NO: 1, o de 1 a 62 de la SEQ ID NO: 1, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 9 (SEQ ID NO: 1), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 1, o secuencias que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos.
La presente divulgación proporciona un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 50, el 55, el 60, el 65 o el 70 % de identidad de secuencia con los restos de aminoácidos 229 a 519 de la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una mutación puntual a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 403, 406, 429, 432, 433 y 435, o un resto de aminoácido que corresponde a las mismas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1. La presente divulgación proporciona un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 50, el 55, el 60, el 65 o el 70 % de identidad de secuencia con los restos de aminoácidos 1 a 228 de la SEQ ID NO: 117, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una mutación puntual a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 112, 115, 120, 131, 137, 141, 142 o 144, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 89 (SEQ ID NO: 117), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 117. En algunas realizaciones, el polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe forma parte de, y/o se pliega en un complejo de proteína que tiene, o es capaz de formar una conformación de tallo trimérica, y que comprende al menos un entrecruzamiento ditirosina, en donde una o ambas tirosinas del al menos un entrecruzamiento ditirosina se originan de una de las mutaciones a tirosina. En algunas de dichas realizaciones, el polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe comprende entrecruzamientos localizados entre uno o más restos de tirosina emparejados, en donde los restos de tirosina emparejados se seleccionan del grupo que consiste en los restos 403 y 433; 411 y 422, 403 y 429, 403 y 432, 433 y 435, y 406 y 433, donde dicha numeración de aminoácidos se basa en la secuencia mostrada en la figura 9 (SEQ ID NO: 1), o en las posiciones de aminoácidos que corresponden a dichas posiciones de aminoácidos, por ejemplo como se determinan por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de HA con la secuencia ID NO: 1.
En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA descritos en el presente documento son capaces de plegarse en una conformación de tallo trimérica. En algunas de dichas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento comprenden además una o más mutaciones puntuales a cisteína. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento, comprenden además un dominio de trimerización, tal como un dominio foldon.
Los ejemplos no limitativos de polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención, incluyen los de SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 86, 87, 88, 89, 90. 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 y 117.
Los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento pueden ser capaces de provocar la producción de anticuerpos específicos de HA del virus de la gripe en un sujeto. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento, son capaces de unirse a un anticuerpo que reconoce el domino de tallo trimérico de la HA del virus de la gripe.
La presente divulgación proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de hA del virus de la gripe descritos en el presente documento.
La presente divulgación proporciona composiciones que comprenden los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento, incluyendo composiciones de vacunas. En algunas de dichas realizaciones, dichas composiciones pueden comprender además un adyuvante, un vehículo, un agente inmunoestimulador, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para preparar un complejo de proteína HA del virus de la gripe "con cabeza", comprendiendo el método: (a) expresar una proteína HA del virus de la gripe que tiene una o más mutaciones "a tirosina" en posiciones dirigidas dentro de su dominio de tallo, y opcionalmente también en el dominio de cabeza, en el que el dominio de tallo comprende una mutación puntual a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 y 435, o un residuo de aminoácido correspondiente por alineamiento con SEQ ID NO: 1, (b) permitir que la proteína HA del virus de la gripe se pliegue en su conformación natural que tiene un dominio de tallo trimérico y un dominio de cabeza, y (c) realizar una reacción de entrecruzamiento DT para entrecruzar residuos de tirosina en el dominio de tallo, y opcionalmente también en el dominio de cabeza, produciendo de ese modo un complejo de proteína HA del virus de la gripe "con cabeza" genéticamente modificado que tiene un dominio de tallo entrecruzado con DT. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para generar un anticuerpo contra un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, comprendiendo el método; (i) inmunizar un animal no humano con un complejo de proteína hemaglutinina (HA) del virus de la gripe entrecruzado con ditirosina que comprende una mutación a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 y 435, o en una posición de aminoácido que corresponda a la misma según se determina mediante la secuencia de alineamiento con SEQ ID NO: 1; y (ii) obtener el anticuerpo del animal. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para someter a ensayo y/o medir la unión y/o el título de un anticuerpo anti-HA, en el que el método usa como analito un complejo de proteína hemaglutinina (HA) de virus de la gripe entrecruzado con ditirosina que comprende un mutación puntual a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 403, 406, 411,422, 429, 432, 433 y 435, o un residuo de aminoácido correspondiente al mismo por alineamiento con SEQ ID NO: 1. La presente divulgación proporciona además un método para vacunar a un sujeto contra el virus de la gripe, comprendiendo el método administrar a un sujeto una composición que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe como se describe en el presente documento. Estas y otras realizaciones o casos de la presente invención se describen a lo largo de la presente memoria descriptiva de patente.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Representación esquemática de un inmunógeno de vacuna universal sin cabeza (PR8) que presenta un complejo de QNE-bnAb (izquierda), y el mismo bnAb que neutraliza HA del virus (a) PR8 homólogo, (b) de deriva (NL09), (c) grupo 1 heterólogo (VN04), y (d) grupo 2 heterólogo (x31) a la derecha.
Figuras 2A-2B. Representación esquemática de entrecruzamientos DT en la HA sin cabeza que estabilizan el trímero del tallo. A. Enlaces DT (arriba en negro) que bloquean conformacionalmente el trímero del tallo. B. El trímero del tallo se ha deshecho sin bloqueo conformacional. Se pierde el QNE.
Figura 3. Diagrama esquemático de la vista desde arriba hacia abajo del tallo, que muestra el diseño variante de HA: dos sustituciones de aminoácidos por promotor (círculos negros y blancos).
Figuras 4A-4B. (A) Medición de fluorescencia específica de DT a 405 nm o WT (control negativo, izquierda), cuatro variantes de HA con dos sustituciones de aminoácidos cada una, e insulina, ya que forma enlaces Dt con eficacia alta (control positivo, derecha). (B) Fluorescencia relativa de mutantes de ditirosina. Los datos representan la media de cuatro repeticiones con la desviación estándar indicada por las barras de error.
Figura 5. Estructura cristalina indicada de HA unida a CRC261. El círculo inferior indica la zona dirigida para la formación de enlace DT, el círculo del medio indica la zona dirigida para la escisión proteolítica proximal del tallo, y el círculo superior indica la zona dirigida para la proteolisis del bucle variable diseñada para desenredar la cabeza para permitir el acceso al sitio de escisión proximal del tallo.
Figura 6. La tinción inmunofluorescente de células que expresan la proteína HA WT y una sin cabeza sin entrecruzamiento para estabilizar el dominio de tallo, demostraba que la proteína HA sin cabeza no estabilizada no se unía a uno de los mAb más ampliamente reactivo, C179. Las células A549 se transfectaron con plásmidos para la expresión o bien de HA WT o bien de una construcción sin cabeza de corte y empalme recombinante sin ningún entrecruzamiento en el dominio de tallo. 24 h después de la transfección, las células se fijaron, se permeabilizaron y se detectó la proteína HA con Ab primarios tanto policlonal de conejo, pAB (expresión general) (paneles superiores), como mAb anti-tallo C 179 (conformacional) (paneles inferiores) seguido de Ab secundarios anti-IgG de conejo conjugado con Alexa 555 y anti-IgG de ratón conjugado con Alexa 488.
Figuras 7A-7B. Los entrecruzamientoss DT se forman eficazmente en el tallo de PR8, y la antigenicidad de C179 se conserva antes y después del entrecruzamiento. A. Medición de fluorescencia específica de DT a ex320/em405 nm de WT (control neg., A), cuatro variantes de HA con dos sustituciones de aminoácidos cada una (sustituciones a Tyr), en los restos 403 y 429 (B), 406 y 433 (C), 403 y 433 (D), y 403 y 432 (E) insulina, la cual forma enlaces de DT con alta eficacia (control positivo, F). B. Unión de C179 a las variantes (B-E) antes y después de entrecruzamiento DT, medido por ELISA de tipo sándwich usando anticuerpo policlonal de cabra anti-HA para la captura (BEI n° de catálogo NR-3148) y el Ab conformacional C179 para la detección.
Figuras 8A-8C. Células 293T no se transfectaron (-) o se transfectaron con NA WT y los plásmidos de HA indicados.
72 horas después de transfección, se analizaron las VLP en los líquidos sobrenadantes y los WCE por ELISA de tipo sándwich (A, BEI n° de catálogo NR-3148 anticuerpo policlonal de cabra anti-HA para captura, C179 para detección), transferencia western (B, panel izquierdo; WCE tratado con PNGasa), y ensayo de HA (C). Panel B, derecha. Las células se transfectaron como antes como se ha indicado con HA y NA. 72 horas después de la transfección, las VLP se purificaron sobre almohadilla de sacarosa al 30 %-NTE, se ensayó la proteína total, y se incubaron de forma simulada (WT, 48G) o digirieron con proteasa de TEV (WT+TEV, 48G+TEV) y se trataron con PNGasa. El porcentaje de escisión se determinó por transferencia western.
Figura 9. Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO. 1) de la proteína HA de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1. Los aminoácidos 59 a 291 comprenden el dominio de cabeza, que puede ser eliminado o alterado proteolíticamente en algunas realizaciones. Los aminoácidos de 1 a 58 (o de 18 a 58 sin el péptido señal - que está localizado en los restos 1-17) y de 292 a 566 (o de 292 a 529 sin el dominio transmembrana y cola citoplasmática) comprenden el dominio de tallo. El dominio de tallo es discontinuo y comprende una parte tanto N-terminal como una C-terminal de la proteína HA. Los aminoácidos 529 a 565 comprenden la región transmembranal y cola citoplasmática. El ectodominio de HA (es decir, la parte expuesta exterior / no unida a membrana) comprende los restos 1-528 (o 18 a 528 sin el péptido señal).
Figura 10. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 2) del ADN que codifica la proteína HA de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1.
Figura 11. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 63 y 278 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y) y 433 (D433Y) (subrayadas) (SEQ ID No : 3). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31 mostrada en la figura 28.
Figura 12. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 63 y 278 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 411 (K411Y) y 422 (N422Y) (subrayadas) (SEQ ID NO: 4). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32 mostrada en la figura 29.
Figura 13. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 63 y 278 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y), 411 (K411Y), 422 (N422Y) y 433 (D433Y) (subrayadas) (SEQ ID NO: 5). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33 mostrada en la figura 30.
Figura 14. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 63 y 282 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y) y 433 (D433Y) (subrayadas) (SEQ ID No : 6). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34 mostrada en la figura 31.
Figura 15. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 63 y 282 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 411 (K411Y) y 422 (N422Y) (subrayadas) (SEQ ID NO: 7). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 35 mostrada en la figura 32.
Figura 16. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 63 y 228 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y), 411 (K411Y), 422 (N422Y) y 433 (D433Y) (subrayadas) (SEQ ID NO: 8). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 36 mostrada en la figura 33.
Figura 17. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 63 y 283 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y) y 433 (D433Y) (subrayadas) (SEQ ID No : 9). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 37 mostrada en la figura 34.
Figura 18. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 63 y 283 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 411 (K411Y) y 422 (N422Y) (subrayadas) (SEQ ID NO: 10). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 38 mostrada en la figura 35.
Figura 19. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 63 y 283 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y), 411 (K411Y), 422 (N422Y) y 433 (D433Y) (subrayadas) (SEQ ID NO: 11). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 mostrada en la figura 36.
Figura 20. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 48 y 291 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y) y 433 (D433Y) (subrayadas) (SEQ ID NO: 12). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 43 mostrada en la figura 40.
Figura 21. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 48 y 291 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 411 (K411Y) y 422 (N422Y) (subrayadas) (SEQ ID NO: 13). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 44 mostrada en la figura 41.
Figura 22. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 48 y 291 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y), 411 (K411Y), 422 (N422Y) y 433 (D433Y) (subrayadas) (SEQ ID NO: 14). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 45 mostrada en la figura 42.
Figura 23. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 48 y 291 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y) y 433 (D433Y) (subrayadas) (SEQ ID NO: 15). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 46 mostrada en la figura 43.
Figura 24. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 48 y 291 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 411 (K411Y) y 422 (N422Y) (subrayadas) (SEQ ID NO: 16). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 47 mostrada en la figura 44.
Figura 25. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende los sitios de escisión de proteasa de TEV insertados en las posiciones 48 y 291 (subrayadas), y mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y), 411 (K411Y), 422 (N422Y) y 433 (D433Y) (subrayadas) (SEQ ID NO: 17). La secuencia C-terminal recuadrada comprende la región transmembrana. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 48 mostrada en la figura 45.
Figuras 26A-26B. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de proteínas HA del virus de la gripe PR8 modificadas que comprenden un sitio de escisión de proteasa insertado, y la secuencia de HA PR8 silvestre de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 (SEQ ID NO: 1 - identificada como “PR8HA-WT” en la figura). Los restos de aminoácidos subrayados indican los sitios de escisión de proteasas insertados en la secuencia silvestre por sustitución y/o reemplazo de aminoácidos en la SEQ ID NO: 1. Los sitios de escisión de proteasas se insertan inmediatamente después de los siguientes restos de aminoácidos: 291 (SEQ ID NO. 18 y Se Q ID NO. 19), 48 (SEQ ID NO. 20), 286 (SEQ ID NO. 21), 278 (SEQ ID NO. 22), 282, (SEQ ID NO. 23), 63 (SEQ ID NO. 24), o 283 (SEQ ID NO. 25). Los sitios de escisión de proteasas insertados son secuencias de reconocimiento de proteasa de TEV. Las secuencias C-terminales mostradas dentro de la parte recuadrada del alineamiento comprenden las regiones transmembrana de las proteínas HA del virus de la gripe. Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 y 25 son codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO. 49, 50, 52, 56, 53, 54, 51 y 55, respectivamente como se muestran en la figura 46.
Figuras 27A-27B. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de proteínas HA del virus de la gripe PR8 modificadas que comprenden dos sitios de escisión de proteasas insertados, y la secuencia de HA PR8 silvestre de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 (SEQ ID NO: 1 - identificada como “PR8HA-WT” en la figura). Los sitios de escisión de proteasas se insertan inmediatamente después de los siguientes restos de aminoácidos: 63 y 278 (SEQ ID NO. 26), 63 y 282 (SEQ ID NO. 27), 63 y 283 (SEQ ID NO. 28), 48 y 291 (SEQ ID NO. 29 y 30). Los sitios de escisión de proteasas insertados son secuencias de reconocimiento de proteasa de TEV. Los restos de aminoácidos subrayados indican la secuencia localizada entre los sitios de escisión de proteasas que se eliminaría de la secuencia de HA tras la escisión por una proteasa (aquí, proteasa de TEV), por ejemplo para facilitar la producción de una proteína HA “sin cabeza”, donde el dominio de cabeza se altera o elimina. Las secuencias C-terminales mostradas dentro de la parte recuadrada del alineamiento comprenden las regiones transmembrana de las proteínas HA del virus de la gripe. Los restos de aminoácidos mostrados en negrita (N403, F406, K411, N422, D429, L432, D433 y W435) ilustran las posiciones donde se pueden hacer las mutaciones a tirosina, para así facilitar la formación de enlaces ditirosina en el dominio de tallo de la HA del virus de la gripe, como se describe en el presente documento. Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 y 30 son codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO. 57, 58, 62, 60 y 61, respectivamente como se muestra en la figura 47.
Figura 28. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 31) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 63 y 278 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 403 (N403Y) y 433 (D433Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 29. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 32) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 63 y 278 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 411 (K411Y) y 422 (N422Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 30. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 33) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 63 y 278 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 403 (N403Y), 411 (K411Y), 422 (N422Y), y 433 (D433Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 31. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 34) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 63 y 282 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 403 (N403Y) y 433 (D433Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 32. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 34) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 63 y 282 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 411 (K411Y) y 422 (N422Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 33. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 36) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 63 y 282 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 403 (N403Y), 411 (K411Y), 422 (N422Y), y 433 (D433Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 34. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 37) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 63 y 283 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 403 (N403Y) y 433 (D433Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 35. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 38) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 63 y 283 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 411 (K411Y) y 422 (N422Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 36. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 39) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 63 y 283 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 403 (N403Y), 411 (K411Y), 422 (N422Y), y 433 (D433Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 37. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 40) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 63 y 286 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 403 (N403Y) y 433 (D433Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 38. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 41) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 63 y 286 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 411 (K411Y) y 422 (N422Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 39. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 42) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 63 y 286 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 403 (N403Y), 411 (K411Y), 422 (N422Y), y 433 (D433Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 40. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 43) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 48 y 291 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 403 (N403Y) y 433 (D433Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 41. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 44) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 48 y 291 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 411 (K411Y) y 422 (N422Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 42. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 45) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 48 y 291 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 403 (N403Y), 411 (K411Y), 422 (N422Y), y 433 (D433Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 43. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 46) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 48 y 291 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 403 (N403Y) y 433 (D433Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 44. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 47) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 48 y 291 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 411 (K411Y) y 422 (N422Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figura 45. Secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 48) que codifica una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada, que comprende restos de ácidos nucleicos insertados (mostrados en letras minúsculas) que codifican los sitios de escisión de la proteasa de TEV en las posiciones 48 y 291 en la proteína, y mutaciones a tirosina (mostradas en letras minúsculas) codificadas en las posiciones 403 (N403Y), 411 (K411Y), 422 (N422Y), y 433 (D433Y) en la proteína. La secuencia C-terminal recuadrada comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figuras 46A-46F. Alineamiento de secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas HA del virus de la gripe PR8 modificadas que comprenden un sitio de escisión de proteasa insertado, y la secuencia de la proteína Ha silvestre de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 (SEQ ID NO: 2 - identificada como “RR8HA-WT” en la figura). Los restos de ácidos nucleicos subrayados codifican los sitios de escisión de proteasa de TEV por sustitución y/o reemplazo de los restos de ácido nucleico de SEQ ID NO. 2. Los restos de ácidos nucleicos son insertados en la secuencia de ácido nucleico de modo que la proteína codificada tendrá un sitio de escisión de proteasa inmediatamente después de los siguientes restos de aminoácidos: 291 (SEQ ID NO. 49 y SEQ ID NO. 50), 48 (SEQ ID NO. 52), 286 (SEQ ID NO. 56), 278 (SEQ ID NO. 53), 282 (SEQ ID NO. 54), 63 (SEQ ID NO. 51), o 283 (SEQ ID NO. 55). Las secuencias C-terminales recuadradas comprenden la secuencia que codifica la región transmembrana de la proteína.
Figuras 47A-47E. Alineamiento de secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas HA del virus de la gripe PR8 modificadas que comprenden dos sitios de escisión de proteasas insertados, y la secuencia de HA silvestre de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 (SEQ ID NO: 2 - identificada como “PR8HA-WT” en la figura). Los restos de ácidos nucleicos subrayados codifican los sitios de escisión de proteasa de TEV por sustitución y/o reemplazo de los restos de ácido nucleico de SEQ ID NO. 2. Los restos de ácidos nucleicos son insertados en la secuencia de ácido nucleico de modo que la proteína HA codificada tendrá sitios de escisión de proteasas inmediatamente después de los siguientes restos de aminoácidos: 63 y 278 (SEQ ID NO. 57), 63 y 282 (SEQ ID NO. 58), 63 y 286 (SEQ ID NO.
59), 48 y 291 (SEQ ID NO. 60 y 61), y 63 y 283 (SEQ ID NO. 62). Las secuencias C-terminales recuadradas comprenden la secuencia que codifica la región transmembrana de la proteína. Los restos de ácidos nucleicos recuadrados (que corresponden a las posiciones de los aminoácidos N403, F406, K411, N422, D429, L432, D433 y W435 en la proteína hA codificada) ilustran posiciones donde se pueden hacer mutaciones a tirosina para así facilitar la formación de enlaces ditirosina en el dominio de tallo de la proteína HA del virus de la gripe codificada, como se describe en el presente documento.
Figura 48. Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína HA de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 con optimización de codones para la expresión de la proteína HA codificada en Homo sapiens (SEQ ID NO: 63).
Figura 49. Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína HA de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 con optimización de codones para la expresión de la proteína HA codificada en Cricetulus griseus (SEQ ID NO: 64). Figura 50. Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína HA de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 con optimización de codones para la expresión de la proteína HA codificada en Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO: 65). Figura 51. Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína HA de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 con optimización de codones para la expresión de la proteína HA codificada en Pichia pastoris (SEQ ID NO: 66).
Figura 52. Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína HA de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 con optimización de codones para la expresión de la proteína HA codificada en Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 67).
Figura 53. Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína HA de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 con optimización de codones para la expresión de la proteína HA codificada en Spodoptera frugiperda (SEQ ID NO: 68). Figuras 54A-54C. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de versiones de longitud entera de proteínas HA de diferentes cepas del virus de la gripe (Udorn 72 (SEQ ID NO: 73), Hong Kong 68 (SEQ ID NO: 74), Panamá 99 (SEQ ID NO: 75), Wisconsin 05 (SEQ ID NO: 76), Shanghai 13 (SEQ ID NO: 77), Singapur 57 (SEQ ID NO: 78), Vietnam 04 (SEQ ID NO: 79) y PR834 (SEQ ID NO: 1), URSS 77 (SEQ ID NO: 111), Texas 91 (SEQ ID NO: 112), WSN 33 (SEQ ID NO: 113), Carolina del Sur 1918 (SEQ ID NO: 114), y California 09 (SEQ ID NO: 115)). Los restos de aminoácidos recuadrados (que corresponden a las posiciones de aminoácidos 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 y 435 en la secuencia de HA silvestre de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 (SEQ ID NO: 1 - identificada como “WT-PR8-34” en la figura) representan posiciones donde está contemplado que una mutación a un resto de tirosina facilite la formación de enlaces itirosina en la región de tallo de la proteína HA. Las secuencias C-terminales en cursiva comprenden la secuencia que codifica la región transmembrana endógena de la proteína, y que se puede eliminar o alterar para así generar una versión soluble de la proteína HA del virus de la gripe (véase, por ejemplo, las figuras 55 - 60).
Figura 55. Secuencia de aminoácidos de una versión soluble de la proteína HA de la cepa PR8 del virus de la gripe (SEQ ID NO: 80). Los aminoácidos 520 - 565 de la región transmembrana endógena (secuencia C-terminal en cursiva de la SEQ ID NO: 1 en la figura 54) se han sustituido por un marcador opcional (subrayado) que comprende un dominio de escisión de trombina, un motivo de trimerización foldon de T4, y un marcador 6xHis (SEQ Id NO: 118).
Figura 56. Secuencia de aminoácidos de una versión soluble de la proteína HA de la cepa Hong Kong 68 del virus de la gripe (SEQ ID NO: 81). Los aminoácidos 521 - 566 de la región transmembrana endógena (secuencia C-terminal en cursiva de la SEQ ID NO: 74 en la figura 54) se han sustituido por un marcador opcional (subrayado) que comprende un dominio de escisión de trombina, un motivo de trimerización foldon de T4, y un marcador 6xHis (SEQ ID NO: 118).
Figura 57. Secuencia de aminoácidos de una versión soluble de la proteína HA de la cepa Wisconsin 05 del virus de la gripe (SEQ ID NO: 82). Los aminoácidos 521 - 566 de la región transmembrana endógena (secuencia C-terminal en cursiva de la SEQ ID NO: 76 en la figura 54) se han sustituido por un marcador opcional (subrayado) que comprende un dominio de escisión de trombina, un motivo de trimerización foldon de T4, y un marcador 6xHis (s Eq ID NO: 118).
Figura 58. Secuencia de aminoácidos de una versión soluble de la proteína HA de la cepa Vietnam 04 del virus de la gripe (SEQ ID NO: 83). Los aminoácidos 522 - 568 de la región transmembrana endógena (secuencia C-terminal en cursiva de la SEQ ID NO: 79 en la figura 54) se han sustituido por un marcador opcional (subrayado) que comprende un dominio de escisión de trombina, un motivo de trimerización foldon de T4, y un marcador 6xHis (SEQ ID NO: 118).
Figura 59. Secuencia de aminoácidos de una versión soluble de la proteína HA de la cepa Shanghai 13 del virus de la gripe (SEQ ID NO: 84). Los aminoácidos 515 - 560 de la región transmembrana endógena (secuencia C-terminal en cursiva de la SEQ ID NO: 77 en la figura 54) se han sustituido por un marcador opcional (subrayado) que comprende un dominio de escisión de trombina, un motivo de trimerización foldon de T4, y un marcador 6xHis (s Eq ID NO: 118).
Figura 60. Secuencia de aminoácidos de una versión soluble de la proteína HA de la cepa Singapur 57 del virus de la gripe (SEQ ID NO: 85). Los aminoácidos 516 - 562 de la región transmembrana endógena (secuencia C-terminal en cursiva de la SEQ ID NO: 78 en la figura 54) se han sustituido por un marcador opcional (subrayado) que comprende un dominio de escisión de trombina, un motivo de trimerización foldon de T4, y un marcador 6xHis (SEQ ID NO: 118).
Figura 61. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y) y 429 (D429Y) (subrayado) (SEQ ID NO: 86).
Figura 62. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y) y 432 (L432Y) (subrayado) (SEQ ID NO: 87).
Figura 63. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende una mutación a tirosina en la posición 403 (N403Y) (subrayado) (SEQ ID NO: 88).
Figura 64. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 403 (N403Y) y 433 (D433Y) (subrayado) (SEQ ID NO: 89).
Figura 65. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 433 (D433Y) y 435 (W435Y) (subrayado) (SEQ ID NO: 90).
Figura 66. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende una mutación a tirosina en la posición 435 (W435Y) (subrayado) (SEQ ID NO: 91).
Figura 67. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 406 (F406Y) y 433 (D433Y) (subrayado) (SEQ ID NO: 92).
Figura 68. Secuencia de aminoácidos de una proteína HA del virus de la gripe PR8 modificada que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 411 (K411Y) y 422 (N422Y) (subrayado) (SEQ ID NO: 93).
Figuras 69A-69B. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de proteínas HA del virus de la gripe PR8 modificadas que comprenden una o más mutaciones a tirosina, y la secuencia de HA PR8 silvestre de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 (SEQ ID NO: 1 - identificada como “PR8HA-WT” en la figura). Se pueden introducir enlaces ditirosina entre diferentes combinaciones de restos de tirosina endógenos (por ejemplo, Y308 y Y437 de la SEQ ID NO: 1, mostrado en negrita) y restos que comprenden mutaciones a tirosina (por ejemplo, N403, F406, K411, N422, D429, L432, D433 y W435 de la SEQ ID NO: 1, mostrado subrayado), como se describe en el presente documento.
Figura 70. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (63G/278S) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 94) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 96) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende dos mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 120 y 150 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 403 y 433, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 71. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (63G/278S) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 94) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 97) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende dos mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 128 y 139 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 411 y 422, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 72. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (63G/278S) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 94) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 98) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende cuatro mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 120, 128, 139 y 150 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 403, 411, 422 y 433, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 73. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (63G/282S) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 94) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 99) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende dos mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 122 y 152 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 403 y 433, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 74. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (63G/282S) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 94) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 100) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende dos mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 130 y 141 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 411 y 422, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 75. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (63G/282S) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 94) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 101) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende cuatro mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 122, 130, 141 y 152 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 403, 411, 422 y 433, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 76. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (63G/283G) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 94) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 102) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende dos mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 121 y 151 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 403 y 433, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 77. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (63G/283G) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 94) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 103) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende dos mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 129 y 140 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 411 y 422, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 78. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (63G/283G) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 94) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 104) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende cuatro mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 121, 129, 140 y 151 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 403, 411,422 y 433, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 79. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (48G/291G) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 95) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 105) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende dos mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 113 y 143 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 403 y 433, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 80. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (48G/291G) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 95) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 106) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende dos mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 121 y 132 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 411 y 422, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 81. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (48G/291G) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 95) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 107) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende cuatro mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 113, 121, 132 y 143 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 403, 411, 422 y 433, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 82. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (48G/291S) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 95) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 108) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende dos mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 113 y 143 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 403 y 433, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 83. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (48G/291S) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 95) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 109) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende dos mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 121 y 132 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 411 y 422, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figura 84. Fragmentos de proteínas que comprenden una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza” generada después de proteolisis en dos sitios de escisión de proteasas (48G/291S) insertados en la secuencia de partida de longitud completa (PR8 HA, SEQ ID NO: 1). El primer fragmento (SEQ ID NO: 95) es la parte N-terminal del dominio de tallo y el segundo fragmento (SEQ ID NO: 110) es la parte C-terminal del dominio de tallo que comprende cuatro mutaciones a tirosina en las posiciones de aminoácidos 113, 121, 132 y 143 (subrayadas; que corresponden a las posiciones de aminoácidos 403, 411, 422 y 433, respectivamente, en la SEQ ID NO: 1).
Figuras 85A-85C. (A) Se transfectaron células 293T con construcciones para la expresión de los mutantes de ditirosina de HA indicados (403Y, 411Y-422Y, 403Y-433Y y 433Y-435Y) y la proteína HA soluble (con un dominio foldon C-terminal) se purificó de los líquidos sobrenadantes 72 horas después de la transfección por cromatografía de afinidad con Ni2+. La proteína HA pura después se sometió a condiciones de entrecruzamiento ditirosina en presencia (+) o ausencia (-) de la enzima peroxidasa de ARP requerida y se analizó por SDS-PAGE reductora seguido de tinción con azul de Coomassie. La flecha marca la migración del monómero y trímero entrecruzado, como se indica. (B) Para confirmar la formación de entrecruzamientos ditirosina, las muestras entrecruzadas y no entrecruzadas purificadas, obtenidas como se describe en A, se analizaron por fluorescencia específica de DT: longitud de onda de excitación: 320 nm, longitud de onda de emisión: 405 nm. (C) Unión del mutante HA 403Y-433Y soluble, antes y después de entrecruzamiento, a mAb específico del tallo Vh1-69 ampliamente neutralizante 8D4 por ELISA de captura directa con 20 |ig/ml de 8D4.
Figuras 86A-86B. (A) Se transfectaron células 293T con plásmidos para la expresión de HA (WT y los mutantes de inserción indicados) y NA. Las partículas similares a virus se analizaron por ELISA de captura directa de los líquidos sobrenadantes de las células transfectadas, con un anticuerpo de cabeza globular, PY-102. (B) Las VLP obtenidas como se describe en A se purificaron sobre una almohadilla de sacarosa al 30 %-NTE. Después se incubaron 10 ug de proteína total en tampón de escisión en presencia (+) o ausencia (-) de proteasa de TEV (Promega), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La eficacia de la escisión se vigiló por transferencia Western usando un anticuerpo anti-HA2. Las flechas indican el producto de escisión de cada una de las inserciones indicadas (48G, 63G y 278S).
Figuras 87A-87B. (A) Se transfectaron células 293T con plásmidos para la expresión de HA (WT y los mutantes de doble inserción indicados) y NA. Las partículas similares a virus se analizaron por ELISA de captura directa de los líquidos sobrenadantes de las células, con un anticuerpo de cabeza globular, pY-102. (B) Unión de los mutantes de hA de doble inserción (inserciones en las posiciones 63+278, y 63+286) a dos mAB específicos de tallo Vh1-69 ampliamente neutralizantes por ELISA de captura directa con 50 |ig/ml (normalizado para la presencia de HA en líquidos sobrenadantes).
Figura 88. Secuencias de aminoácidos de fragmentos C-terminales de HA del virus de la gripe, generados después de proteolisis en un sitio de escisión de proteasa insertado en la posición 291 de la secuencia de aminoácidos de HA PR8 silvestre (SEQ ID NO: 1). La secuencia de SEQ ID NO: 108 comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 113 y 143 (subrayadas; que corresponden a las posiciones 403 y 433, respectivamente, de la SEQ ID NO: 1). La secuencia de SEQ ID NO: 109 comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 121 y 132 (subrayadas; que corresponden a las posiciones 411 y 422, respectivamente, de la SEQ ID NO: 1). La secuencia de SEQ ID NO: 110 comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 113, 121, 132 y 143 (subrayadas; que corresponden a las posiciones 403, 411, 422 y 433, respectivamente, de la SEQ ID NO: 1). La región transmembrana C-terminal está subrayada en cada secuencia.
Figura 89. Secuencia de aminoácidos de un fragmento C-terminal de la proteína HA del virus de la gripe (SEQ ID NO: 117). Este fragmento se genera después de proteolisis en un sitio de escisión de proteasa en la posición 291 de la secuencia de aminoácidos HA PR8 Ha PR8 silvestre (SEQ ID NO: 1). Los restos de aminoácidos subrayados N112, F115, K120, N131, D137, L141, D142 y W144 ilustran posiciones en la SEQ ID NO: 117, donde se pueden hacer mutaciones a tirosina para facilitar la formación de enlaces ditirosina. Los restos subrayados corresponden a las posiciones N403, F406, K411, N422, D429, L432, D433 y W435 respectivamente de la SEQ ID NO: 1. La región transmembrana C-terminal está subrayada. En algunas realizaciones, la región transmembrana está ausente (es decir, el fragmento no contiene los últimos 46 restos de aminoácidos (229-274 de la SEQ ID NO: 117, pero contiene los restos 1-228 de la SEQ ID NO: 117). Los restos de tirosina en las posiciones 17 y 146 (mostradas en cursiva negrita) son restos de tirosina endógenos que se pueden usar en la formación de enlaces ditirosina. Estos restos endógenos corresponden a restos de tirosina en las posiciones 308 y 437, respectivamente, de la SEQ ID NO: 1. Descripción detallada de la invención
La invención es como se define en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona, en parte, métodos para elaborar complejos de proteínas de HA del virus de la gripe (tales como los que comprenden un dominio de tallo que tiene su conformación natural y que pueden comprender o no comprender un dominio de cabeza intacto).
Definiciones y abreviaturas
Como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos “alrededor” y “aproximadamente”, cuando se usan en relación con valores numéricos, significan dentro de o - 20 % del valor expuesto.
La abreviatura “HA” como se usa en el presente documento se refiere a una proteína de hemaglutinina. La abreviatura “Ab” como se usa en el presente documento se refiere a anticuerpo. La abreviatura “bnAb” como se usa en el presente documento se refiere a anticuerpos ampliamente neutralizantes. La abreviatura “QNE” como se usa en el presente documento se refiere a epítopos neutralizantes cuaternarios. La abreviatura “DT” como se usa en el presente documento se refiere a ditirosina. Como se usa en el presente documento, la frase “longitud completa” cuando se usa en relación con una proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe no requiere una proteína o polipéptido de HA que sea tan larga como una proteína HA del virus de la gripe silvestre. Más bien la frase se usa para referirse a una proteína o polipéptido de hA del virus de la gripe que comprende, al menos, tanto un dominio de tallo como un dominio de cabeza. Dichos dominios de tallo y cabeza pueden ser o no tan largos como los encontrados en la proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe silvestre. Por ejemplo, una proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe que le falta el dominio transmembrana encontrado en una proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe silvestre, puede denominarse todavía una proteína o polipéptido de HA de “longitud completa” en el presente documento, si tiene un dominio de tallo y un dominio de cabeza. En algunas realizaciones, la frase “longitud completa” cuando se usa en relación con una proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe, se puede referir a una proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe que, además del dominio de tallo y cabeza, también comprende un dominio transmembrana. Como se usa en el presente documento, la frase “soluble” cuando se usa en relación con una proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe se refiere a una proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe que no comprende un dominio transmembrana. Dichas proteínas o polipéptidos de HA solubles pueden comprender bien un dominio de tallo y un dominio de cabeza, o dominio de tallo en ausencia de un dominio de cabeza.
Como se usa en el presente documento, los términos “proteína” y “polipéptido” se usan de forma intercambiable, salvo que se exponga otra cosa. Como se usa en el presente documento, la frase “complejo de proteínas” se refiere a un ensamblaje de dos o más proteínas o subunidades de proteínas, tales como dos o más monómeros. Salvo que se exponga otra cosa, toda descripción del presente documento que se refiere a proteínas y/o polipéptidos se aplica por igual a complejos de proteínas, y viceversa.
Como se usa en el presente documento, los términos “estabilizado” y “bloqueado” se usan de forma intercambiable, por ejemplo, en relación con el efecto del entrecruzamiento en la estabilización o bloqueo del dominio de tallo de una proteína, polipéptido o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe, en su conformación natural de trímero. Estos términos no requieren el 100 % de estabilidad. Más bien estos términos indican un grado de estabilidad mejorada o aumentada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, cuando el término “estabilizado” se usa en relación con un dominio entrecruzado en su conformación natural de trímero, el término indica que la conformación natural de trímero del dominio de tallo tiene mayor estabilidad que la que habría tenido antes de o sin el entrecruzamiento. La estabilidad y estabilidad relativa se pueden medir de diferentes formas como se describe en otras secciones de esta solicitud, por ejemplo, basándose en la semivida de la conformación natural de trímero del dominio de tallo. La mejora o aumento de la estabilidad puede ser de cualquier grado que sea útil o significativo para la aplicación prevista. Por ejemplo, en algunas realizaciones la estabilidad puede aumentar en aproximadamente el 10 %, el 25 %, el 50 %, el 100 %, el 200 % (es decir, 2 veces), el 300 % (es decir, 3 veces), el 400 % (es decir, 4 veces), el 500 % (es decir, 5 veces), el 1000 % (es decir, 10 veces), o más.
Como se usa en el presente documento, los términos “tronco” y “tallo se usan de forma intercambiable para referirse a un dominio de tallo, o parte del mismo, de una proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe.
Como se usa en el presente documento, la frase “genéticamente modificado” cuando se usa en relación con polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación, en general se refiere a polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que se han alterado de alguna forma comparado con las versiones silvestres de estos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas, por ejemplo, por la eliminación o alteración de una parte o dominio particular del polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas silvestres (tal como un dominio transmembrana o un dominio de cabeza) o por introducción de una o más mutaciones puntuales (tales como las introducidas para facilitar la formación de enlaces ditirosina) o mediante la introducción de uno o más motivos de reconocimiento de proteasas que no están habitualmente presentes en el polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas silvestre, o por cualquier otra modificación del polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas comparado con su forma silvestre.
Otras definiciones y abreviaturas se encuentran a lo largo de la memoria descriptiva.
Gripe y virus de la gripe
La gripe, también conocida como “influenza”, es una enfermedad infecciosa de aves y mamíferos causada por virus ARN de la familia Orthomyxoviridae, los virus de la gripe. La gripe se propaga por el mundo en epidemias estacionales, dando lugar a aproximadamente de tres a cinco millones de casos de enfermedad grave y aproximadamente de 250.000 a 500.000 muertes anualmente, subiendo a millones los años de pandemia. En el siglo 20 se han producido tres pandemias de la gripe, cada una causada por la aparición de una nueva cepa de virus en seres humanos, y ha matado a decenas de millones de personas. A menudo, las nuevas cepas de virus de la gripe aparecen cuando un virus de la gripe existente se propaga a seres humanos desde otra especie animal, o cuando una cepa en humana existente adquiere nuevos genes de un virus que normalmente infecta aves o cerdos.
Hay tres tipos diferentes de virus de la gripe, tipo A, tipo B y tipo C, con diferentes subtipos y cepas dentro de estos tipos.
Los virus de la gripe de tipo A son los patógenos más virulentos en seres humanos entre los tres tipos de virus de la gripe y causan la enfermedad más grave. El virus de la gripe A se puede subdividir en diferentes subtipos o serotipos que incluyen H1N1 (que causó la gripe española en 1918, y la gripe porcina en 2009), H2N2 (que causó la gripe asiática en 1957), H3N2 (que causó la gripe de Hong Kong en 1968), H5N1 (que causó la gripe aviar en 2004), H7N7, H1N2 (que es endémico en seres humanos, cerdos y aves), H9N2, H7N2, H7N3, H10N7 y H7N9. Las aves acuáticas salvajes son los hospedantes naturales para una amplia variedad de virus de la gripe A. Sin embargo, las aves de corral domésticas, tales como pavos y pollos, también pueden ponerse muy enfermos y morir por la gripe aviar, y algunos virus de la gripe A aviares también pueden producir enfermedad grave y muerte en aves silvestres. El virus de la gripe de tipo B infecta exclusivamente a seres humanos y es menos común que la gripe A. Los únicos otros animales que se sabe que son susceptibles a la infección por el virus de la gripe B son las ballenas y los hurones. El virus de la gripe de tipo B muta a una velocidad 2-3 veces más lenta que el de tipo A y por consiguiente es genéticamente menos diverso, con solo un serotipo de virus de la gripe B conocido. Como resultado de esta falta de diversidad antigénica, normalmente se adquiere un grado de inmunidad al virus de la gripe B en una edad temprana. Sin embargo, el virus de la gripe B muta con suficiente frecuencia para que la inmunidad duradera no sea posible.
El virus de la gripe de tipo C infecta a seres humanos, perros y cerdos, a veces causando tanto enfermedad grave como epidemias locales. Sin embargo, el virus de la gripe C es menos común que los otros tipos y normalmente solo causa enfermedad leve.
Los virus de la gripe A, B y C son muy similares en su estructura general. Comprenden una envuelta vírica que contiene dos tipos principales de glucoproteínas, y un núcleo central que contiene el genoma ARN vírico y otras proteínas víricas. La hemaglutinina (“HA”) y la neuraminidasa (“NA”) son las dos glucoproteínas grandes de la envuelta. La HA es una lecitina que media la unión del virus a células diana y la entrada del genoma vírico en la célula diana. Los diferentes subtipos de virus de la gripe A se clasifican basados en sus respuestas de anticuerpos a las proteínas HA y NA. Por ejemplo, un “virus H7N2” designa un subtipo A el virus de la gripe que tiene una proteína HA 7 y una proteína NA 2. Igualmente, un virus “H5N1” tiene una proteína HA 5 y una proteína NA 1. Actualmente hay alrededor de 17 subtipos de HA conocido y alrededor de 10 subtipos de NA conocidos. Son posibles muchas combinaciones diferentes de proteínas HA y NA. Los subtipos del virus de la gripe A H1N1, H1N2, y H3N2 actualmente son los tipos principales en la circulación general en la población humana. Hay también varios subtipos dominantes de virus de la gripe A aviar que se sabe que infectan tanto a aves como a seres humanos, tales como los subtipos H5N1, H7N2, H7N7, H7N3 y H7N7.
Dentro del virus de la gripe de tipo A, se pueden agrupar los diferentes subtipos de virus de la gripe en una variedad de formas diferentes, si se desea. Por ejemplo, los subtipos de virus de la gripe A se clasifican o agrupan con frecuencia en diferentes grupos antigénicos o subgrupos antigénicos basándose en su proteína HA. Dichas agrupaciones se relacionan con la antigenicidad y el grado de identidad de secuencia de la HA entre los diferentes subgrupos. Los subtipos de virus de la gripe en el mismo grupo antigénico o subgrupo antigénico son más similares entre sí en términos de antigenicidad y secuencia de HA que los de otros grupos antigénicos. El grupo antigénico 1 consiste en los subtipos de virus de la gripe A H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 y H16. El grupo antigénico 2 consiste en los subtipos de virus de la gripe A H3, H4, H14, H7, H10, y H15. Dentro del grupo antigénico 1, hay tres subgrupos antigénicos, que se denominarán en el presente documento subgrupo 1A, 1B y 1C. El subgrupo antigénico 1A consiste en los subtipos de virus de la gripe A H1, H2, H5 y H6. El subgrupo antigénico 1B consiste en los subtipos de virus de la gripe A H11, H13 y H16. El subgrupo antigénico 1C consiste en los subtipos de virus de la gripe A H8, H9 y H12.
En algunas realizaciones en el presente documento, los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA de la invención se generan a partir de secuencias de HA de cualquier tipo de virus de la gripe, incluyendo el tipo A, B o C. En algunas realizaciones en el presente documento los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA de la invención se generan a partir de secuencias de HA del virus de la gripe de tipo A. En algunas realizaciones en el presente documento los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA de la invención se generan a partir de secuencias de HA del virus de la gripe de tipo A, grupo antigénico 1. En algunas realizaciones en el presente documento los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA de la invención se generan a partir de secuencias de HA del virus de la gripe de tipo A, grupo antigénico 1A.
En algunas realizaciones en el presente documento los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA de la invención se pueden usar para vacunar a un sujeto, y proporcionar protección contra cualquier tipo de virus de la gripe, incluyendo el tipo A, B o C. En algunas realizaciones en el presente documento los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA de la invención se pueden usar para vacunar a un sujeto y proporcionar protección contra el virus de la gripe de tipo A. En algunas realizaciones en el presente documento los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de hA de la invención se pueden usar para vacunar a un sujeto y proporcionar protección contra el virus de la gripe de tipo A, grupo antigénico 1. En algunas realizaciones en el presente documento los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA de la invención se pueden usar para vacunar a un sujeto y proporcionar protección contra el virus de la gripe de tipo A, grupo antigénico 1A. En algunas realizaciones en el presente documento los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA de la invención se pueden usar para vacunar a un sujeto y proporcionar protección contra el virus de la gripe de subtipo H1. En algunas realizaciones en el presente documento los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA de la invención se pueden usar para vacunar a un sujeto y proporcionar protección contra el virus de la gripe de subtipos H1 y H2. En algunas realizaciones en el presente documento los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA de la invención se pueden usar para vacunar a un sujeto y proporcionar protección contra el virus de la gripe de subtipos H1, H2 y H5. En algunas realizaciones en el presente documento los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de hA de la invención se pueden usar para vacunar a un sujeto y proporcionar protección contra el virus de la gripe de subtipos H1, H2, H5 y H6.
Las tablas A y B a continuación proporcionan algunos ejemplos de la identidad de secuencia entre la proteína HA de H1N1 de la cepa PR8, o determinados fragmentos de proteína HA, y proteínas o fragmentos correspondientes de otros subtipos y cepas de virus de la gripe, que incluyen algunos de los grupos antigénicos 1 y 2.
Tabla A. Porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe de longitud completa frente a la secuencia de aminoácidos de PR8 de SEQ ID NO: 1 (como se ilustra en la figura 54).
Figure imgf000019_0001
Tabla B. Porcentaje de identidad del fragmento que permanece después de escisión de la proteína HA del virus de la gripe en los sitios de escisión 48 y 291.
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000020_0001
Además de las identidades de secuencia mostradas en la tabla anterior, se encontró que el porcentaje de identidad entre PR8 (SEQ ID NO: 1) y las secuencias de los subtipos H6, H9, H11 y H13 a lo largo de un fragmento C-terminal que quedaba después de escisión proteolítica de la proteína HA del virus de la gripe, era del 68,2 %, el 54,7 %, el 56,2 % y el 50,5 %, respectivamente.
Polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe genéticamente modificados, composiciones que comprenden dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas, y métodos de uso de dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas. Dichas proteínas se pueden hacer usando cualquier proteína HA del virus de la gripe adecuada como un punto de partida. Por ejemplo, las proteínas de la invención se pueden hacer usando una proteína A del virus de la gripe de cualquier tipo de virus de la gripe adecuado (tal como A, B o C), subtipo (incluyendo los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2) o cepa (por ejemplo, la cepa H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 (“PR8”) (SEQ iD NO. 1)) del virus de la gripe como punto de partida. Una de las características importantes de los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento, es que comprenden el dominio de tallo trimérico de la proteína HA que, a diferencia del dominio de cabeza altamente variable, está más conservado entre los tipos, subtipos y cepas de virus de la gripe. Por consiguiente, además de ser útiles como inmunógenos de vacunas contra tipos, subtipos y cepas homólogos del virus de la gripe (es decir, contra virus de la gripe del mismo tipo, subtipo y/o cepa que la usada como punto de partida para hacer los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento), los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA de la invención también pueden ser útiles como inmunógenos de vacunas contra tipos, subtipos y cepas heterólogos de virus de la gripe (es decir, contra virus de la gripe de un tipo, subtipo y/o cepa diferente del usado como punto de partida para hacer los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA genéticamente modificados).
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para estabilizar el domino de tallo de una proteína HA del virus de la gripe en su conformación natural de trímero, que incluye proporcionar localizaciones específicas dentro de la proteína HA del virus de la gripe, que se pueden o se deben entrecruzar, y proporcionar formas mutantes de la proteína HA que pueden facilitar la formación de dichos entrecruzamientos. Dichos entrecruzamientos y mutaciones se pueden usar solos (por ejemplo, en el contexto de una proteína HA silvestre o en el contexto de una proteína HA que no comprende ninguna mutación artificial u otras modificaciones artificiales), o se puede usar en combinación con una o más de otras mutaciones, modificaciones, entrecruzamientos o estrategias de estabilización artificiales. Por lo tanto, por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar en conjunto con el uso de dominios de trimerización foldon añadidos, anticuerpos estabilizantes (tales como 6F12, C179, CR6261, F10, A66 y D8), y/u otras modificaciones o mutaciones parcialmente o potencialmente estabilizantes.
Los presentes inventores han llevado a cabo análisis extensos de la estructura de la proteína HA del virus de la gripe y han desarrollado una variedad de nuevas estrategias de diseño y nuevos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe genéticamente modificados. La presente invención también proporciona métodos para hacer dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona localizaciones específicas dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína HA del virus de la gripe en las que, o entre las que, se pueden hacer entrecruzamientos dirigidos con el fin de “bloquear” el dominio de tallo de la proteína HA en su conformación natural de trímero. En algunas realizaciones, los entrecruzamientos dirigidos son entrecruzamientos ditirosina. Donde se usan entrecruzamientos ditirosina, la presente invención proporciona restos de aminoácidos específicos (o pares de restos de aminoácidos) que bien comprenden un resto de tirosina previamente existente o se pueden mutar o se mutan a un resto de tirosina de modo que se puedan hacer entrecruzamientos ditirosina.
Los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe genéticamente modificados descritos en el presente documento se pueden hacer basándose en la secuencia de cualquier polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe adecuado, tal como una proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe silvestre (WT), o mutante, homólogo, derivado, análogo, ortólogo o cualquier otro derivado de un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe, con la condición de que el polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA tenga un dominio de tallo, o una parte de un dominio de tallo, que sea capaz de plegarse en, o formar parte de un dominio de tallo que tiene una conformación natural de trímero, y/o es capaz de unirse a uno o más anticuerpos anti-tallo. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe adecuados, y las secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe, son conocidas en la técnica y se puede usar cualquiera de dichas secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Además, las secuencias de aminoácidos de varios polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe adecuados, y secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe, se proporcionan en el presente documento. Aunque cualquier proteína HA del virus de la gripe adecuada se puede usar como punto de partida para hacer los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe solubles descritos en el presente documento, dicha proteína A debe comprender al menos un dominio de tallo, o una parte de un dominio de tallo, que sea capaz de plegarse en una conformación natural de trímero y/o sea capaz de unirse a uno o más anticuerpos anti-tallo, tal como anticuerpos anti-tallo neutralizantes. En algunas realizaciones la proteína HA usada como punto de partida es una proteína HA silvestre de longitud completa que comprende un dominio de cabeza y un dominio de tallo, y opcionalmente también un dominio transmembrana. En algunas realizaciones la proteína HA usada carece de un dominio transmembrana o carece de un dominio transmembrana funcional o intacto. En algunas realizaciones la proteína HA comprende un motivo de trimerización foldon de T4. En algunas realizaciones, las proteínas HA que se usan como punto de partida para hacer los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento: (a) comprenden un dominio de tallo, o una parte de un dominio de tallo, que es capaz de plegarse en una conformación natural de trímero y/o es capaz de unirse a uno o más anticuerpos anti-tallo neutralizantes, (b) comprende un motivo de trimerización foldon de T4, y (c) carece de un dominio transmembrana funcional o intacto.
A lo largo de la presente memoria descriptiva de patente, cuando se hace referencia a restos de aminoácidos específicos o regiones de aminoácidos específicas en la proteína HA del virus de la gripe refiriéndose a su número o números de resto amino (tal como restos de aminoácidos 403 y 422, por ejemplo), y salvo que se exponga otra cosa, la numeración se basa en la secuencia de aminoácidos de HA proporcionada en el presente documento en la figura 9 y SEQ ID NO: 1 - que es una secuencia de aminoácidos de un proteína HA silvestre de la cepa del virus de la gripe PR8 (virus de la gripe de tipo A - subtipo H1N1). Sin embargo, debe indicarse, y un experto en la técnica entenderá, que las diferentes secuencias de hA pueden tener diferentes sistemas de numeración, por ejemplo, si hay restos de aminoácidos adicionales añadidos o eliminados comparado con la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, como se ilustra en las figuras 26 y 27 y muchas de las otras figuras y secuencias en el presente documento). Así pues, debe entenderse que cuando se hace referencia a restos de aminoácidos específicos por su número, la descripción no está limitada a solo los aminoácidos situados de forma precisa en la posición numerada cuando se cuenta desde el principio de una secuencia de aminoácidos dada, sino que se entiende que el resto de aminoácido equivalente/correspondiente en todas y cada una de las secuencias de HA, incluso aunque este resto no esté en la misma posición numerada precisa, por ejemplo, si la secuencia de HA es más corta o más larga que la SEQ ID NO.
1, o tiene inserciones o eliminaciones comparada con la SEQ ID NO. 1. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente cuál es la posición de aminoácido correspondiente/equivalente respecto a cualquiera de los restos numerados específicos citados en el presente documento, por ejemplo, por alineamiento de una secuencia de HA dada con la SEQ ID NO. 1. Por lo tanto, en realizaciones donde se hace referencia a restos de aminoácidos específicos de la proteína HA del virus de la gripe, debe entenderse que la invención no está limitada a secuencias que tienen las propiedades de aminoácidos especificadas (por ejemplo, presencia de un resto de tirosina, una mutación o una inserción de un sitio de reconocimiento de proteasa, etc.) solo en esas posiciones de aminoácidos numeradas precisas. Más bien las propiedades de aminoácidos especificadas pueden localizarse en cualquier posición en cualquier proteína HA del virus de la gripe que sea equivalente/correspondiente a las posiciones numeradas citadas para la proteína HA del virus de la gripe PR8 de la SEQ ID NO: 1. Esta descripción se aplica igualmente donde se hace referencia a restos de ácidos nucleicos específicos o regiones de ácidos nucleicos específicas en una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HA del virus de la gripe, por referencia a su número o números de resto de ácido nucleico. Por lo tanto, salvo que se exponga otra cosa, la numeración se basa en la secuencia de nucleótidos proporcionada en el presente documento en la figura 10 y SEQ ID NO. 2.
En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la presente divulgación pueden derivar de (o pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en) las secuencias de aminoácidos de cualquier secuencia de polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe adecuada conocida en la técnica, incluyendo, sin limitación: la secuencia de aminoácidos de la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 1) o una forma soluble (SEQ ID NO: 80; o sus restos de aminoácidos 1-519), la secuencia de aminoácidos de la cepa Udorn 72 del virus de la gripe H3N2 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 73) o una forma soluble que comprende sus restos de aminoácidos 1-520), la secuencia de aminoácidos de la cepa Hong Kong 68 del virus de la gripe H3N2 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 74) o una forma soluble (SEQ ID NO: 81; o sus restos de aminoácidos 1-520)), la secuencia de aminoácidos de la cepa Panamá 99 del virus de la gripe H3N2 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 75) o una forma soluble que comprende sus restos de aminoácidos 1-520), la secuencia de aminoácidos de la cepa Wisconsin 05 del virus de la gripe H3N2 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 76) o una forma soluble (SEQ ID NO: 82; o sus restos de aminoácidos 1-520)), la secuencia de aminoácidos de la cepa Shanghai 13 del virus de la gripe H7N9 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 77) o una forma soluble (SEQ ID NO: 84; o sus restos de aminoácidos 1-514)), la secuencia de aminoácidos de la cepa Singapur 57 del virus de la gripe H2N2 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 78) o una forma soluble (SEQ ID NO: 85; o sus restos de aminoácidos 1-515)), la secuencia de aminoácidos de la cepa Vietnam 04 del virus de la gripe H5N1 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 79) o una forma soluble (SEQ ID NO: 83; o sus restos de aminoácidos 1-521)), la secuencia de aminoácidos de la cepa URSS 77 del virus de la gripe H1N1 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 111) o una forma soluble que comprende sus restos de aminoácidos 1­ 519), la secuencia de aminoácidos de la cepa Texas 91 del virus de la gripe H1N1 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 112) o una forma soluble que comprende sus restos de aminoácidos 1-519), la secuencia de aminoácidos de la cepa WSN 33 del virus de la gripe H1N1 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 113) o una forma soluble que comprende sus restos 1-518), la secuencia de aminoácidos de la cepa Carolina del Sur 1918 del virus de la gripe H1N1 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 114) o una forma soluble que comprende los aminoácidos 1-519), la secuencia de aminoácidos de la cepa California 09 del virus de la gripe H1N1 (por ejemplo, en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 115) o una forma soluble que comprende los aminoácidos 1-519), o cualquier fragmento de las mismas. En algunas realizaciones, las proteínas y polipéptidos de HA del virus de la gripe de la presente invención se pueden obtener de (o pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en) secuencias de aminoácidos que tienen al menos aproximadamente el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con cualquier secuencia de HA del virus de la gripe conocida o con secuencias de HA de cualesquiera grupos, subgrupos, familias, subfamilias, tipos, subtipos, géneros, especies, cepas y/o clados de virus de la gripe conocidos, o cualquier fragmento de los mismos. Asimismo, además del gran número de moléculas de aminoácidos y nucleótidos específicas y secuencias proporcionadas en el presente documento (que incluyen las SEQ ID NO: 1-110); la presente divulgación también proporciona y abarca moléculas de aminoácidos y nucleótidos y secuencias que tienen al menos aproximadamente el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de dichas moléculas y secuencias. Por lo tanto, para cada realización en el presente documento que se refiere a una secuencia específica o una SEQ ID NO específica (tal como SEQ ID NO: 1-110), la presente invención también incluye variaciones de dichas realizaciones que incluyen moléculas de aminoácidos y nucleótidos y secuencias que tienen al menos aproximadamente el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con dichas secuencias o SEQ ID NO específicas.
La presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe genéticamente modificadas, que comprenden un dominio de tallo (por ejemplo, que tiene o es capaz de formar su conformación natural de trímero) y que no comprenden un dominio de cabeza. Dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas se pueden llamar polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe “sin cabeza”.
La presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden un dominio de tallo que tiene su conformación natural de trímero y un dominio de cabeza. Dichas proteínas se pueden llamar polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe “con cabeza”. En algunas realizaciones, dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas también pueden comprender uno o más motivos de reconocimiento de proteasa genéticamente modificados que se pueden usar para la alteración y/o eliminación proteolítica del dominio de cabeza. En algunas realizaciones dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe con cabeza, pueden ser útiles como, por ejemplo, productos intermedios en la producción de polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe “sin cabeza” - como se describe en el presente documento.
Las variantes de HA “sin cabeza” se pueden obtener o generar por una variedad de métodos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las variantes de HA sin cabeza se pueden obtener eliminando todo o parte del dominio de cabeza de la HA, por ejemplo, por eliminación proteolítica del dominio de cabeza o por otro medio adecuado. En otras realizaciones, las variantes de HA sin cabeza se pueden obtener por expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica solo el dominio de tallo. En algunas realizaciones, las variantes de HA “sin cabeza” se pueden generar por escisión proteolítica de la proteína HA del virus de la gripe de longitud completa en motivos de reconocimiento de proteasas insertados en la proteína, de modo que después de la escisión, la secuencia del dominio de cabeza se corta y quedan al menos dos fragmentos de proteína que comprenden el dominio de tallo. La figura 27 ilustra ejemplos de motivos de escisión de proteasas y muestra secuencias intermedias del dominio de cabeza que son cortadas tras el tratamiento con proteasa. Por lo tanto, en algunas realizaciones, por ejemplo como se muestra en la figura 27, una variante de Ha del virus de la gripe “sin cabeza” comprende al menos dos fragmentos de proteínas, por ejemplo, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal, que comprenden el dominio de tallo. En algunas realizaciones uno o más fragmentos de la proteína del virus de la gripe “sin cabeza” comprende una o más mutaciones a tirosina y/o uno o más entrecruzamientos ditirosina. Dichas mutaciones y/o entrecruzamientos típicamente estarán presentes en el fragmento C-terminal de la proteína HA “sin cabeza”. (Véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 96-110 y 117). Las figuras 70-84 y 89 ilustran ejemplos de algunos de dichos péptidos de HA. En algunas realizaciones dichos péptidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 96-110 y 117) pueden estar comprendidos dentro de una molécula de HA mayor que comprende un dominio de cabeza, o pueden estar presentes en una proteína HA “sin cabeza”. En algunas realizaciones, varios de dichos péptidos pueden asociarse para formar un complejo de proteínas HA que está en, o es capaz de formar, un dominio de tallo trimérico. En algunas realizaciones, un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, 109, 110. En algunas realizaciones un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 96, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 97, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 98, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 99, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 100, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 101, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 102, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 103, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 104, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 106, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 107, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 108, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 109, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 110. En algunas realizaciones un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe comprende un péptido de HA N-terminal, que comprende, consiste esencialmente en o consiste en la SEQ ID NO: 94 o SEQ ID NO: 95, y un péptido de HA C-terminal que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en las SEQ ID NO: 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o 110, o un péptido de HA C-terminal que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en los restos de aminoácidos de 229 a 519 de la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una mutación puntual a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433, o 435, o un péptido de HA C-terminal que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en los restos de aminoácidos 1 a 228 de la SEQ ID NO: 117, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una mutación puntual a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 112, 115, 120, 131, 137, 141, 142 o 144.
Debe indicarse que los restos de aminoácidos 1 a 58 (o 18 a 58 sin el péptido señal, que está situado en los restos 1-17) y 292 a 566 (o 292 a 529 sin el dominio transmembrana y cola citoplastámica) de la secuencia de aminoácidos de HA PR8 (SEQ ID NO. 1) representa la secuencia del dominio de tallo de HA del virus de la gripe. El dominio de tallo es discontinuo y comprende una parte tanto N-terminal como una C-terminal de la proteína hA. Las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento pueden comprender dominios adicionales que pueden estar presentes o parcialmente presentes o ausentes en algunas realizaciones pero no en otras, por ejemplo, el dominio de cabeza (por ejemplo, los restos de aminoácidos 59-291 de la secuencia de aminoácidos de hA PR8 (SEQ ID NO. 1)), y/o la región transmembrana y citoplasmática (por ejemplo, los restos de aminoácidos 529 o 530 a 565 de la secuencia de aminoácidos de HA PR8 (SEQ ID NO. 1)), y/o el péptido señal (por ejemplo, restos de aminoácidos 1-17 de la secuencia de aminoácidos de HA PR8 (SEQ ID NO: 1), y/o una o más secuencias exógenas opcionales (no HA) tales como marcadores epítopos, dominios foldon, y similares. Por ejemplo, en algunas realizaciones, puede estar presente un dominio de trimerización foldon opcional, sitio de escisión de trombina, marcador 6xHis (SEQ ID NO: 118), y/o un Strep-tag. En algunas realizaciones, estas secuencias adicionales pueden estar ausentes, modificadas, reordenadas o reemplazadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones se pueden usar diferentes dominios de trimerización, o diferentes marcadores epítopos. En algunas realizaciones, estas secuencias adicionales pueden estar ausentes, modificadas, reordenadas o reemplazadas, por ejemplo con diferentes dominios transmembrana o citoplasmáticos.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe presentadas en el presente documento, o cualquiera de sus variantes o fragmentos que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos presentadas en el presente documento, en donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden un resto de tirosina (bien se encuentre de forma natural o proceda de una mutación a tirosina), en uno o más de los restos 308, 403, 406, 437, 411, 422, 429, 432, 433 y 435.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteína de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe presentadas en el presente documento, o cualquiera de sus variantes o fragmentos, que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos presentadas en el presente documento, en donde polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden un sitio de escisión de proteasa introducido artificialmente insertado inmediatamente después de uno o más de los siguientes restos: 48, 63, 228, 278, 282, 283, 286 y 291.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe presentadas en el presente documento, o cualquiera de sus variantes o fragmentos, que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos presentadas en el presente documento, en donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden dos sitios de escisión de proteasa introducidos artificialmente, el primero de dichos sitios introducido inmediatamente después del resto 48 o 63, y el segundo de dichos sitios introducido inmediatamente después del resto 228, 278, 282, 283, 286 o 291.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de Ha del virus de la gripe presentadas en el presente documento, o cualquiera de sus variantes o fragmentos, que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el
80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos presentadas en el presente documento, en donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden tanto (a) un resto de tirosina (bien se encuentre de forma natural o proceda de una mutación a tirosina), en uno o más de los restos 308, 403, 406, 437, 411, 422, 429, 432, 433 y 435, como (b) un sitio de escisión de proteasa introducido artificialmente insertado inmediatamente después de uno o más de los siguientes restos: 48, 63, 228, 278, 282, 283, 286 y 291.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HA del virus de la gripe presentadas en el presente documento, o cualquiera de sus variantes o fragmentos, que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el
80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos presentadas en el presente documento, en donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden tanto (a) un resto de tirosina (bien se encuentre de forma natural o proceda de una mutación a tirosina), en uno o más de los restos 308, 403, 406, 437, 411, 422, 429, 432, 433 y 435, como (b) dos sitios de escisión de proteasa introducidos artificialmente, el primero de dichos sitios introducido inmediatamente después del resto 48 o 63, y el segundo de dichos sitios introducido inmediatamente después del resto 228, 278, 282, 283, 286 o 291.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los restos de aminoácidos 229 a 519 de SEQ
ID NO: 1, o 279 a 519 de SEQ ID NO: 1, o 283 a 519 de SEQ ID NO: 1, o 284 a 519 de SEQ ID NO: 1, o 287 a 519 de SEQ ID NO: 1, o 292 a 519 de SEQ ID NO: 1, o secuencias que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el
50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos, en donde los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de
HA del virus de la gripe comprenden un resto de tirosina (bien se encuentre de forma natural o proceda de una mutación a tirosina), en uno o más de los residuos 308, 403, 406, 437, 411, 422, 429, 432, 433 y 435.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los restos de aminoácidos 1 a 47 de la SEQ ID
NO: 1, o de 1 a 62 de la SEQ ID NO: 1, o secuencias que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el
60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos.
La presente solicitud da a conocer composiciones y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden, consisten esencialmente en, o consiste en un primer y un segundo péptido, en donde (a) el primer péptido comprende, consiste esencialmente en o consiste en los restos de aminoácidos 229 a 519 de la SEQ ID NO:
1, o de 279 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 283 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 284 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de
287 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o de 292 a 519 de la SEQ ID NO: 1, o secuencias que tiene al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos, y en donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden un resto de tirosina (bien se encuentre de forma natural o proceda de una mutación a tirosina), en uno o más de los restos 308, 403, 406, 437, 411, 422, 429, 432,
433 y 435, y en donde (b) el segundo péptido comprende, consiste esencialmente en o consiste en los restos de aminoácidos 1 a 47 de la SEQ ID NO: 1, o de 1 a 62 de la SEQ ID NO: 1, o secuencias que tienen al menos aproximadamente el 40 % o el 50 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 o el 98 % o el 99 % de identidad con dichas secuencias de aminoácidos.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden uno o más entrecruzamientos introducidos artificialmente, en donde al menos uno de los siguientes restos de aminoácidos dentro de los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe se entrecruza artificialmente con otro resto de tirosina en la proteína Ha del virus de la gripe: Y308, N403, F406, Y437, K411, N422, D429, L432, D433, y W435. En algunas de dichas realizaciones, donde la posición indicada no es una tirosina, este resto se muta a tirosina. En algunas de dichas realizaciones, el entrecruzamiento es un entrecruzamiento ditirosina.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden uno o más entrecruzamientos introducidos artificialmente, en donde dichos entrecruzamientos introducidos artificialmente conectan dos de los siguientes restos de aminoácidos: Y308, N403, F406, K411, Y437, N422, D429, L432, D433 y W435. En algunas de dichas realizaciones, donde la posición indicada no es una tirosina, este resto se muta a tirosina. En algunas de dichas realizaciones, el entrecruzamiento es un entrecruzamiento ditirosina.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe en los que los restos de aminoácidos en uno o más de los siguientes pares de restos de aminoácidos se entrecruzan entre sí mediante un entrecruzamiento introducido artificialmente: 308/403, 308/435, 403/437, 403/429, 403/432, 403/433, 406/429, 406/433, 411/422, 422/433, 433/435 y 437/435. En algunas de dichas realizaciones, donde la posición indicada no es una tirosina, este resto se muta a tirosina. En algunas de dichas realizaciones, el entrecruzamiento es un entrecruzamiento ditirosina.
La presente divulgación contempla la introducción dirigida de uno o más entrecruzamientos en cualquier posición(es) adecuada(s) en un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe, por ejemplo, en el dominio de tallo donde el entrecruzamiento estabilizará o puede estabilizar el dominio de tallo en una conformación natural de trímero u otra conformación capaz de unir anticuerpos anti-tallo, tal como anticuerpos anti-tallo neutralizantes o ampliamente neutralizantes. Dicha estabilización se puede lograr, por ejemplo, introduciendo entrecruzamientos que estabilizan las interacciones o plegados dentro de un monómero del tallo o promotor del tallo (entrecruzamientos intramoleculares), y/o las interacciones entre uno o más monómeros del tallo o promotores del tallo (entrecruzamiento intermolecular), o cualquier combinación de dichos entrecruzamientos. El entrecruzamiento es un entrecruzamiento ditirosina. Por ejemplo, en algunas realizaciones se pueden formar entrecruzamientos ditirosina intermoleculares entre restos de tirosina en las posiciones 403 y 433, 411 y 422, o 433 y 435. Igualmente, en algunas realizaciones se pueden formar entrecruzamientos ditirosina intermoleculares entre una tirosina en el resto 403 y otro resto de tirosina, y/o entre una tirosina en el resto 433 y otro resto, tal como, en particular, cualquiera de los restos descritos en el presente documento como potenciales sitios para entrecruzamientos ditirosina, tales como tirosinas (sean naturales o mutadas) localizadas en los restos 308, 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433, 435 o 437.
La presente solicitud da a conocer polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden un entrecruzamiento introducido artificialmente entre dos de las siguientes regiones: restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 298 a aproximadamente 318, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 393 a aproximadamente la posición 413, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 396 a aproximadamente la posición 416, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 401 a aproximadamente la posición 421, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 412 a aproximadamente la posición 432, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 419 a aproximadamente la posición 439, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 422 a aproximadamente la posición 442, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 423 a aproximadamente la posición 443, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 425 a aproximadamente la posición 445 y restos de aminoácidos desde aproximadamente 427 a aproximadamente 447. En algunas de dichas realizaciones, el entrecruzamiento es un entrecruzamiento ditirosina.
En realizaciones donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación comprenden uno o más entrecruzamientos ditirosina, los entrecruzamientos ditirosina se pueden introducir entre dos restos de tirosina endógenos, entre dos restos de tirosina procedentes de mutaciones “a tirosina” o entre un resto de tirosina procedente de una mutación “a tirosina” y un resto de tirosina endógeno. En algunas realizaciones, se introduce más de un entrecruzamiento ditirosina en una proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe.
En realizaciones donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación comprenden uno o más entrecruzamientos ditirosina, los ejemplos no limitativos de posiciones de aminoácidos donde se puede introducir una mutación “a tirosina” incluyen N403, F406, K411, N422, D429, L432, D433, W435, o cualquiera de sus combinaciones.
En realizaciones donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación comprenden uno o más entrecruzamientos ditirosina, los ejemplos no limitativos de restos de tirosina previamente existentes o endógenos que se pueden usar para formar un entrecruzamiento ditirosina incluyen Y308 y Y437, o cualquiera de sus combinaciones.
En realizaciones donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación comprenden uno o más entrecruzamientos ditirosina, los ejemplos no limitativos de pares de restos entre los que se puede introducir un entrecruzamiento ditirosina incluyen 403/429, 403/432, 403/433, 406/429, 406/433, 411/422 y 433/435, o cualquiera de sus combinaciones.
En realizaciones donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación comprenden uno o más entrecruzamientos ditirosina, los ejemplos no limitativos de regiones o estructuras secundarias de la proteína HA del virus de la gripe de las cuales se pueden seleccionar aminoácidos para la sustitución por tirosina y/o el entrecruzamiento ditirosina incluyen el dominio de tallo (por ejemplo, restos de aminoácidos 1 (con el péptido señal) o 18 (sin el péptido señal) a 58, y 292 a 529 (sin los domino(s) transmembrana y citoplasmático) o 566 (con el dominio transmembrana). En algunas realizaciones la región inferior del dominio de tallo (que comprende los restos de aminoácidos 18-46, 334-343, 344-390 y 449-503 de la SEQ ID NO: 1), y/o el dominio de cabeza (por ejemplo, restos de aminoácidos 59 a 291 de la SEQ ID NO: 1), de los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención también pueden comprender uno o más entrecruzamientos ditirosina y/o una o más mutaciones a tirosina.
Los ejemplos no limitativos de otras regiones de proteínas HA del virus de la gripe de las cuales se pueden seleccionar uno o más aminoácidos para la sustitución por tirosina y/o entrecruzamiento, incluyen los restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 298 a aproximadamente la posición 313, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 393 a aproximadamente la posición 413, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 396 a aproximadamente la posición 416, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 401 a aproximadamente la posición 421, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 412 a aproximadamente la posición 432, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 419 a aproximadamente la posición 439, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 422 a aproximadamente la posición 442, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 423 a aproximadamente la posición 443, restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 425 a aproximadamente la posición 445, y restos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 427 a aproximadamente la posición 447.
La presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o 110 (cada una de las cuales son mutantes de la secuencia de aminoácidos de HA del virus de la gripe, que comprenden una o más secuencias de reconocimiento de proteasas para facilitar la escisión proteolítica del dominio de cabeza de la proteína HA, y/o una o más mutaciones “a tirosina” para facilitar el entrecruzamiento ditirosina y para facilitar el “bloqueo” del dominio de tallo de la proteína HA del virus de la gripe en una conformación particular, por ejemplo, en su conformación natural de trímero), o cualquier fragmento de los mismos, tales como los fragmentos que comprenden el aminoácido el dominio de tallo de la proteína HA de la influenza, o cualquier otro fragmento de la influenza Proteína HA que se puede generar proteolíticamente y/o que se puede ensamblar o formar parte de una proteína HA del virus de la gripe funcional. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o 110, o cualquier fragmento de los mismos.
Los ejemplos no limitativos de posiciones de aminoácidos en la proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe a las cuales se pueden dirigir los entrecruzamientos ditirosina incluyen las posiciones Y308 (resto de Tyr previamente existente/endógeno) y N403Y (sustitución a Tyr), las posiciones Y308 (resto de Tyr previamente existente/endógeno) y W435Y (sustitución a Tyr), las posiciones N403Y (sustitución a Tyr) y y 437 (resto de Tyr previamente existente/endógeno), las posiciones N403Y (sustitución a Tyr) y D429Y (sustitución a Tyr), las posiciones N403Y (sustitución a Tyr) y L432Y (sustitución a Tyr), las posiciones N403Y (sustitución a Tyr) y D433Y (sustitución a Tyr), las posiciones N406Y (sustitución a Tyr) y D429Y (sustitución a Tyr), las posiciones N406Y (sustitución a Tyr) y D433Y (sustitución a Tyr), las posiciones D433Y (sustitución a Tyr) y W435Y (sustitución a Tyr), las posiciones K4111Y (sustitución a Tyr) y W422Y (sustitución a Tyr), y las posiciones Y437 (resto de Tyr previamente existente/endógeno) y W435Y (sustitución a Tyr). En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación comprenden uno o más de los entrecruzamientos ditirosina citados antes. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación comprenden dos de los entrecruzamientos ditirosina citados antes (por ejemplo, SEQ ID NO: 5, 8, 11, 14, y 17). En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación comprenden tres de los entrecruzamientos ditirosina citados antes. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación comprenden cuatro de los entrecruzamientos ditirosina citados antes. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación comprenden cinco o más de los entrecruzamientos ditirosina citados antes. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación comprenden cualquier combinación o uno o más de los entrecruzamientos ditirosina citados antes.
Los ejemplos no limitativos de polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe diseñados para tener más de un entrecruzamiento ditirosina incluyen proteínas HA del virus de la gripe con dos mutaciones “a tirosina”, donde cada uno de dichos restos de tirosina forma un entrecruzamiento con diferentes restos de tirosina endógenos/previamente existentes, o proteínas HA del virus de la gripe con cuatro mutaciones “a tirosina”, por ejemplo, N403Y/K411Y/N422Y/D433Y, como se ilustra con las SEQ ID NO: 5, 8, 11, 14 y 17 donde la tirosina en la posición 403 está destinada a emparejarse con la tirosina en la posición 411, y la tirosina en la posición 422 está destinada a emparejarse con la tirosina en la posición 433, estabilizando así el dominio de tallo de la proteína HA por la formación de dos entrecruzamientos ditirosina.
Un enlace entre un primer polipéptido de HA y un segundo polipéptido de HA dentro del mismo complejo de proteínas (por ejemplo, monómeros que se disponen para formar un trímero) es un ejemplo de un enlace intermolecular. La invención proporciona proteínas y polipéptidos de HA del virus de la gripe de ejemplo que comprenden entrecruzamientos destinados a estabilizar interacciones intermoleculares, así como polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe derivados de dichas secuencias y que incluyen las mutaciones “a tirosina” específicas presentes en dichas secuencias. Por ejemplo, una tirosina introducida en un monómero está destinada a emparejarse con la otra tirosina introducida en el monómero adyacente.
En algunas realizaciones, un polipéptido de HA se entrecruza intramolecularmente (por ejemplo, ambas tirosinas del entrecruzamiento están localizadas en el mismo polipéptido de HA). La divulgación proporciona proteínas y polipéptidos de HA del virus de la gripe de ejemplo que comprenden entrecruzamientos destinados a estabilizar interacciones intramoleculares, incluyendo sin limitación la SEQ ID NO:_, así como polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe derivados de dichas secuencias y que incluyen las mutaciones “a tirosina” específicas presentes en dichas secuencias.
En algunas realizaciones (que incluyen todas las descritas anteriormente y las que implican polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que tienen cualquiera de las secuencias de aminoácidos específicas citadas en el presente documento, y las que implican variantes o fragmentos de dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que tienen menos del 100 % de identidad con las secuencias de aminoácidos específicas proporcionadas en el presente documento), los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación deben tener una o más propiedades deseadas, tales como ser capaces de (1) formar una conformación natural de trímero del dominio de tallo, (2) tener el dominio de tallo “bloqueado” en una conformación natural de trímero mediante entrecruzamiento, (3) unirse a un anticuerpo específico del tallo de la HA del virus de la gripe, (4) unirse a un anticuerpo neutralizante, (5) unirse a un anticuerpo ampliamente neutralizante, (6) unirse a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en 6F12, C179, CR6261, F10, A66, y D8, (7) unirse a y/o activar un receptor de linfocitos B, (8) producir una respuesta de anticuerpos en un animal, (9) producir una respuesta de anticuerpos protectora en un animal, (10) producir la producción de anticuerpos neutralizantes en un animal, (11) producir la producción de anticuerpos ampliamente neutralizantes en un animal, (12) producir la producción de anticuerpos que reconocen epítopos neutralizantes cuaternarios (QNE) en un animal, y/o (13) producir una respuesta inmunitaria protectora en un animal. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento son capaces de producir una respuesta inmunitaria protectora contra una o más cepas del virus de la gripe en un animal y/o capaces de producir una respuesta inmunitaria protectora contra cepas del virus de la gripe tanto homólogas como heterólogas en un animal.
Salvo que se exponga otra cosa, toda la descripción del presente documento que se refiere a polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe específicos, se refiere igualmente a todos los homólogos, ortólogos, análogos, derivados, formas mutantes, fragmentos, quimeras, proteínas de fusión, etc. de los mismos, tales como los que tienen determinadas propiedades o características deseadas (por ejemplo, los que tienen un dominio de tallo, o una parte de un dominio de tallo, que es capaz de plegarse en una conformación natural de trímero, o que tiene las propiedades funcionales deseadas, que incluyen, ser capaz de unirse a, o producir la producción de, uno o más anticuerpos anti-HA, tal como anticuerpos que son específicos contra el dominio de tallo de HA del virus de la gripe).
Igualmente, toda la descripción en el presente documento que se refiere a polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas específicos, polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas (por ejemplo, los que tienen secuencias de aminoácidos específicas o los de un tipo, subtipo o cepa de virus de la gripe específico) se refiere igualmente a otras formas relacionadas de dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas que pueden existir en la naturaleza (por ejemplo, en diferentes tipos, subtipos o cepas de virus de la gripe) o que están relacionados con las secuencias específicas del presente documento pero se han alterado artificialmente de alguna forma, tal como por medios recombinantes, medios químicos o cualquier otro medio. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento pueden tener, o se pueden obtener de las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos de cualesquiera polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe adecuados conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención pueden ser, o pueden derivar de, derivados y/o análogos de polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de Ha del virus de la gripe específicos descritos en el presente documento o conocidos en la técnica, que incluyen proteínas que son sustancialmente homólogas a cualquiera de dichas proteínas, o sus fragmentos (por ejemplo, en diferentes realizaciones, las que tienen al menos aproximadamente el 50 % o el 55 % o el 60 % o el 65 % o el 70 % o el 75 % o el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleico de cualesquiera polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe específicos descritos en el presente documento o conocidos en la técnica, cuando se alinean usando cualquier método adecuado conocido para el experto en la técnica, tal como, por ejemplo, usando un programa de ordenador de homologías conocido en la técnica) o cuyo ácido nucleico codificante es capaz de hibridar con una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína de la invención, en condiciones de restricción alta, restricción moderada o restricción baja.
La presente solicitud proporciona fragmentos de los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento, tal como los que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en al menos aproximadamente 10 aminoácidos, 20 aminoácidos, 50 aminoácidos, 100 aminoácidos, 200 aminoácidos, o 500 aminoácidos.
En algunas realizaciones uno o más restos de aminoácidos dentro de un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe específico como se describe en el presente documento, o como se conoce en la técnica, se puede eliminar, añadir o sustituir por otro aminoácido. En realizaciones donde se introducen dichas mutaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe se pueden microsecuenciar para determinar una secuencia de aminoácidos parcial. En otras realizaciones, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe se pueden secuenciar para identificar y/o confirmar la introducción de mutaciones.
En algunas realizaciones, uno o más de los restos de aminoácidos se pueden sustituir por otro aminoácido que tenga una polaridad similar y que actúe como un equivalente funcional, dando una alteración silenciosa. En algunas realizaciones, las sustituciones de un aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido, por ejemplo, para crear una sustitución conservadora. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalinina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Dichas sustituciones, en general, se entiende que son sustituciones conservadoras.
En algunas realizaciones se pueden usar aminoácidos artificiales, sintéticos o no clásicos o análogos químicos de aminoácidos para hacer los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a isómeros D de los aminoácidos comunes, fluoro-aminoácidos, y aminoácidos “diseñados” tales como p-metil-aminoácidos, Cy-metil-aminoácidos, Ny-metilaminoácidos, y análogos de aminoácidos en general. Los ejemplos adicionales no limitativos de aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a: ácido a-aminocaprílico, Acpa; (S)-2-aminoetil-L-cisteína/HCl, Aecys; aminofenilacetato, Afa; ácido 6-amino-hexanoico, Ahx; ácido y-amino-isobutírico y ácido a-aminoisobutírico, Aiba; aloisoleucina, Aile; L-alilglicina, Alg; ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico y ácido a-aminobutírico, Aba; paminofenilalanina, Aphe; b-alanina, Bal; p-bromofenilalanina, Brphe; ciclohexilalanina, Cha; citrulina, Cit; pcloroalanina, Clala; cicloleucina, Cle; p-colorfenilalanina, Clphe; ácido cisteico, Cya; ácido 2,4-diaminobutírico, Dab; ácido 3-aminopropiónico y ácido 2,3-diaminopropiónico, Dap; 3,4-deshidroprolina, Dhp; 3,4-dihidroxilfenilalanina, Dhphe; p-flurofenilalanina, Fphe; ácido D-glucosaamínico, Gaa; homoarginina, Hag; 8-hidroxilisina/HCl, Hlys; DL-phidroxinorvalina, Hnvl; homoglutamina, Hog; homofenilalanina, Hoph; homoserina, Hos; hidroxiprolina, Hpr; pyodofenilalanina, Iphe; isoserina, Ise; a-metileucina, Mle; cloruro de DL-metionina-S-metilsulfonio, Msmet; 3-(1-naftil)alanina, 1Nala; 3-(2-naftil)alanina, 2Nala; norleucina, Nle; N-metilalanina, Nmala; Norvalina, Nva; O-bencilserina, Obser; O-benciltirosina, Obtyr; O-etiltirosina, Oetyr; O-metilserina, Omser; O-metiltreonina, Omthr; O-metiltirosina, Omtyr; Ornitina, Orn; fenilglicina; penicilamina, Pen; ácido piroglutámico, Pga; ácido pipecólico, Pip; sarcosina, Sar; t-butilglicina; t-butilalanina; 3,3,3-trifluroalanina, Tfa; 6-hidroxidopa, Thphe; L-vinilglicina, Vig; dihidroxocloruro del ácido (-)-(2R)-2-amino-3-(2-aminoetilsulfonil)propanoico, Aaspa; ácido (2S)-2-amino-9-hidroxi-4,7-dioxanonanoico, Ahdna; ácido (2S)-2-amino-6-hidroxi-4-oxahexanoico, Ahoha; ácido (-)-(2R)-2-amino-3-(2-hidroxietilsulfonil)propanoico, Ahsopa; ácido (-)-(2R)-2-amino-3-(2-hidroxietilsulfanil)propanoico, Ahspa; ácido (2S)-2-amino-12-hidroxi-4,7,10-trioxadodecanoico, Ahtda; ácido (2S)-2,9-diamino-4,7-dioxanonanoico, Dadna; ácido (2S)-2,12-diamino-4,7,10-trioxadodecanoico, Datda; (S)-5,5-difluoronorleucina, Dfnl; (S)-4,4-difluoronorvalina, Dfnv; ácido (3R)-1-1-dioxo-[1,4]tiaziana-3-carboxílico, Dtca; (S)-4,4,5,5,6,6,6-heptafluoronorleucina, Hfnl; (S)-5,5,6,6,6-pentafluoronorleucina, Pfnl; (S)-4,4,5,5,5-pentafluoronorvalina, Pfnv; y ácido (3R)-1,4-tiazinano-3-carboxílico, Tca. Además, el aminoácido puede ser D (dextrorrotatorio) o L (levorrotatorio). Para una revisión de aminoácidos clásicos y no clásicos, véase Sandberg et al., 1998 (Sandberg et al., 1998. “New chemical descriptors relevant for the design of biologically active peptides. A multivariate characterization of 87 amino acids”. J Med Chem 41(14): pág. 2481-91).
Ácidos nucleicos
Además de proporcionar determinados polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe, como se describe en el presente documento, la presente solicitud también da a conocer ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe, y composiciones y vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos. Dichos ácidos nucleicos se pueden obtener o hacer usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden obtener moléculas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe a partir de ADN clonado o hecho por síntesis química. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se pueden obtener por transcripción inversa de ARN preparado por cualquiera de los métodos conocidos para el experto en la técnica, tal como transcripción inversa con cebado aleatorio o poli-A. Cualquiera que sea la fuente, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe de la presente divulgación, se puede clonar en cualquier vector adecuado, tales como los usados para la propagación de la molécula de ácido nucleico o los usados para la expresión de la molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico se puede escindir en sitios específicos usando diferentes enzimas de restricción, si es necesario. En realizaciones que requieren expresión, el ácido nucleico se puede unir operativamente a un promotor adecuado para dirigir la expresión en el tipo de célula deseado, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto, y se puede incorporar en cualquier vector de expresión adecuado, tal como un vector de expresión de mamífero o insecto. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe de la presente invención optimizada por métodos conocidos en la técnica para mejorar los niveles de expresión de la proteína expresada a partir de la misma. Por ejemplo, se puede usar la optimización de codones para minimizar o eliminar variaciones en el uso de codones entre especies. Un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe de la presente invención se obtiene de una molécula de ácido nucleico en la que se ha hecho optimización de codones para la expresión en seres humanos (véase, por ejemplo, SEQ ID NO. 63 y figura 48), Cricetulus griseus (véase, por ejemplo, SEQ ID NO. 64 y figura 49), Nicotiana benthamiana (véase, por ejemplo, SEQ ID NO. 65 y figura 50), Pichia pastoris (véase, por ejemplo, SEQ ID NO. 66 y figura 51), Saccharomyces cerevisiae (véase, por ejemplo, SEQ ID NO. 67 y figura 52) o Spodoptera frugiperda (véase, por ejemplo, SEQ ID NO. 68 y figura 53).
La presente solicitud da a conocer ácidos nucleicos que derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, o 62 (cada uno de los cuales codifica un mutante de la secuencia de aminoácidos de HA del virus de la gripe que comprende una o más secuencias de reconocimiento de proteasas para facilitar la escisión proteolítica del dominio de cabeza de la proteína HA, y/o una o más mutaciones “a tirosina” para facilitar el entrecruzamiento ditirosina y facilitar el “bloqueo” del dominio de tallo de la proteína HA del virus de la gripe en una conformación particular, por ejemplo, en su conformación natural de trímero), o cualquiera de sus fragmentos, tales como fragmentos que codifican el dominio de tallo de la proteína HA del virus de la gripe.
Además, un experto en la técnica puede visualizar fácilmente, o hacer, moléculas de ácido nucleico que comprenden una cualquiera o más de las mutaciones “a tirosina” específicas descritas en el presente documento, por ejemplo, por localización del codón de nucleótidos que codifica el resto de aminoácido específico que se va a mutar, y mutación de los nucleótidos que codifican ese codón según sea necesario para producir un codón que codifica tirosina.
Entrecruzamiento
En algunas realizaciones, los polipéptidos y/o proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación se ensamblan en complejos de proteínas que tienen una estructura conformacional deseada, tal como la conformación natural de trímero del dominio de tallo, y se entrecruzan con el fin de estabilizar la conformación. Los detalles de regiones particulares de la proteína HA del virus de la gripe que se pueden entrecruzar, así como mutantes de HA del virus de la gripe particulares destinados a facilitar dicho entrecruzamiento, se describen en otras secciones de esta solicitud. En algunas realizaciones, los entrecruzamientos se pueden usar para estabilizar las estructuras terciaria y/o cuaternaria de la proteína HA del virus de la gripe. En algunas realizaciones, el entrecruzamiento puede ser entrecruzamiento intra- y/o intermolecular. En algunas realizaciones, los entrecruzamientos que se usan son entrecruzamientos dirigidos. En algunas realizaciones, los entrecruzamientos que se usan son estables en condiciones fisiológicas. En algunas realizaciones, los entrecruzamientos que se usan no conducen a la formación de agregados de la proteína HA del virus de la gripe, por ejemplo durante la expresión y/o durante el almacenamiento (tal como el almacenamiento de composiciones que comprenden concentraciones altas de la proteína HA del virus de la gripe). En algunas realizaciones, la introducción de dichos entrecruzamientos puede potenciar la eficacia de los polipéptidos, proteínas y proteínas HA del virus de la gripe de la invención como inmunógenos, tal como inmunógenos de vacunas. En algunas realizaciones, la introducción de dichos entrecruzamientos puede estabilizar epítopos dentro de la proteína HA del virus de la gripe, por ejemplo, epítopos en el dominio de tallo, de modo que los epítopos pueden ser reconocidos por anticuerpos particulares, producir la producción de anticuerpos, y/o activar receptores de linfocitos B tras la unión del anticuerpo.
En algunas realizaciones se pueden usar entrecruzamientos dirigidos. Un entrecruzamiento dirigido es uno que se puede hacer para formarse en una posición o posiciones particulares dentro de la proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe. Se pueden usar varias estrategias para realizar los entrecruzamientos dirigidos en localizaciones específicas en la proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe, tales como las localizaciones específicas descritas en el presente documento. La presente divulgación proporciona pares de restos dentro de la proteína HA del virus de la gripe que, cuando se entrecruzan, pueden o podrían estabilizar el polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe en una conformación que es capaz de unirse a, o producir la producción de anticuerpos neutralizantes, y/o que es capaz de generar una respuesta de anticuerpos neutralizantes en un animal. Un entrecruzamiento dirigido se puede introducir en una o más localizaciones o posiciones especificadas en el presente documento, aprovechando las propiedades físicas y/o químicas de determinadas cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo, usando reacciones enzimáticas que reconocen secuencias de aminoácidos específicas o estructuras tridimensionales, o incorporando aminoácidos no naturales que tienen la capacidad de formar entrecruzamientos en una proteína o complejo de proteínas plegados.
Los entrecruzamientos o modificaciones se pueden dirigir a sitios específicos en la estructura de la proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe, por ejemplo el dominio de tallo, con el fin de lograr el resultado deseado, por ejemplo, estabilización del dominio en su conformación natural de trímero. La presente invención contempla la introducción dirigida de uno o más entrecruzamientos y/u otras modificaciones estabilizantes en cualquier posición o posiciones adecuadas en una proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe, preferiblemente donde el entrecruzamiento o modificación estabiliza el dominio de tallo en su conformación natural de trímero, o proporciona estabilización potenciada de la conformación natural de trímero del dominio de tallo. La invención contempla que cualquier resto de aminoácido de proteína HA del virus de la gripe, par de restos, estructura secundaria u otra región descrita en el presente documento para el entrecruzamiento ditirosina también se pueda usar en la formación de otros entrecruzamientos o enlaces dirigidos u otras modificaciones, incluyendo las posiciones de aminoácidos Y308, N403, N406, K411, W422, D429, L432, D433, W435, y Y437 o cualquiera de sus combinaciones; pares de restos 308/403, 308/435, 403/437, 403/429, 403/432, 403/433, 406/429, 406/433, 411/422, 433/435 y 437/435, o cualquiera de sus combinaciones; regiones o estructuras secundarias que incluyen, por ejemplo, el dominio de tallo o dominio de cabeza de la proteína HA; y otras regiones de la proteína HA del virus de la gripe incluyendo el dominio transmembrana o la región inferior del dominio de tallo.
En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención comprenden entrecruzamientos en el dominio de tallo, no es necesario que dichos entrecruzamientos estén situados solo en el dominio de tallo. En algunas realizaciones los entrecruzamientos se pueden localizar en cualquier sitio a lo largo del polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe, incluyendo el dominio de cabeza en los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas “con cabeza”, según se desee. Preferiblemente, un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe que comprende entrecruzamientos en otras regiones (por ejemplo, fuera del dominio de tallo) retendrá una o más propiedades deseadas tales como ser capaz de (1) formar una conformación natural de trímero del dominio de tallo, (2) tener el dominio de tallo “bloqueado” en una conformación natural de trímero por entrecruzamiento, (3) unirse a un anticuerpo específico de tallo de HA del virus de la gripe, (4) unirse a un anticuerpo neutralizante, (5) unirse a un anticuerpo ampliamente neutralizante, (6) unirse a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en 6F 12, C179, CR6261, F10, A66, y D8, (7) unirse a y/o activar un receptor de linfocitos B, (8) producir una respuesta de anticuerpos en un animal, (9) producir una respuesta de anticuerpos protectora en un animal, (10) producir la producción de anticuerpos neutralizantes en un animal, (11) producir la producción de anticuerpos ampliamente neutralizantes en un animal, (12) producir la producción de anticuerpos que reconocen epítopos neutralizantes cuaternarios (QNE) en un animal, y/o (13) producir una respuesta inmunitaria protectora en un animal.
Se conocen en la técnica una amplia variedad de métodos de entrecruzamiento de proteínas de forma intra e intermolecular, que incluyen los que tienen entrecruzamientos con diferentes longitudes de brazos espaciadores, y aquellos con o sin grupos fluorescentes o funcionales para la purificación. Dichos métodos incluyen el uso de agentes de entrecruzamientos heterobifuncionales (por ejemplo, acetiltioacetato de succinimidilo (SATA), trans-4-(maleimidilmetil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), y 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo (SPDP)), agentes de entrecruzamiento homobifuncionales (por ejemplo, 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo), agentes de entrecruzamientos fotorreactivos (por ejemplo, ácido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoico, éster de STP, sal sódica (ATFB, éster de STP), ácido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoico, éster de succinimidilo (ATFB, SE), 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobencil-amina, hidrocloruro, benzofenona-4-isotiocianato, benzofenona-4-maleimida, ácido 4-benzoilbenzoico, éster de succinimidilo, N-((2-piridilditio)etil)-4-azidosalicilamida (PEAS; AET), agentes de entrecruzamiento reactivos con tiol (por ejemplo, maleimidas y yodoacetamidas), agentes de entrecruzamiento reactivos con amina (por ejemplo, glutaraldehído, bis(imido-ésteres), bis(ésteres de succinimidilo), diisocianatos y cloruros de diácido). Debido a que los grupos tiol son muy reactivos y relativamente raros en la mayoría de las proteínas en comparación con grupos amina, en algunas realizaciones se pueden usar entrecruzamientos reactivos con tiol. En casos donde están ausentes o no están presentes grupos tiol en sitios adecuados en las estructuras de la proteína HA del virus de la gripe, se pueden introducir usando uno o varios métodos de tiolación. Por ejemplo, se puede usar el trans-4-(maleimidilmetil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo para introducir grupos reactivos con tiol en sitios de amina.
Se conocen varios agentes de entrecruzamiento oxidantes, tales como enlaces disulfuro (que se forman espontáneamente y son sensibles al pH y a la oxidorreducción) y enlaces ditirosina (que son muy estables, e irreversibles en condiciones fisiológicas).
En algunas realizaciones los entrecruzamientos estabilizan la estructura terciaria de una proteína de HA del virus de la gripe. En algunas realizaciones los entrecruzamientos estabilizan la estructura cuaternaria de una proteína de HA del virus de la gripe. En algunas realizaciones, los entrecruzamientos estabilizan la estructura tanto terciaria como cuaternaria de una proteína HA del virus de la gripe.
En algunas realizaciones, un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación tiene entrecruzamientos que son termoestables. En algunas realizaciones, un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación tiene entrecruzamientos que son no tóxicos. En algunas realizaciones un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención tiene entrecruzamientos que son entrecruzamientos dirigidos, o entrecruzamientos no dirigidos, o entrecruzamientos reversibles, o entrecruzamientos irreversibles, o entrecruzamientos formados por el uso de agentes de entrecruzamiento homo-bifuncionales, o entrecruzamientos formados por el uso de agentes de entrecruzamiento hetero-bifuncionales, o entrecruzamientos formados usando reactivos que reaccionan con grupos amina, o entrecruzamientos formados usando reactivos que reaccionan con grupos tiol, o entrecruzamientos formados usando reactivos que son fotorreactivos, o entrecruzamientos formados entre restos de aminoácidos, o entrecruzamientos formados entre restos de aminoácidos mutados incorporados en la estructura de las proteínas o complejos de proteínas, o entrecruzamientos oxidantes, o enlaces ditirosina, o entrecruzamientos de glutaraldehído, o cualquiera de sus combinaciones. En algunas realizaciones, un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención no tiene entrecruzamientos de glutaraldehído.
En algunas realizaciones un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación no tiene ningún enlace disulfuro introducido artificialmente, o si tiene dichos enlaces disulfuro, también tiene entrecruzamientos introducidos artificialmente adicionales. En algunas realizaciones un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación no tiene enlaces disulfuro introducidos artificialmente, pero puede tener enlaces disulfuro que se encuentran de forma natural. Los enlaces disulfuro se pueden introducir artificialmente cuando se modifican genéticamente cadenas laterales de cisteína por mutación puntual. Sin embargo, se sabe que los enlaces disulfuro son sensibles al pH y se disuelven en determinadas condiciones de oxidorreducción, y por lo tanto puede estar comprometida la utilidad preventiva y/o terapéutica de proteínas y/o complejos de proteínas genéticamente modificados con entrecruzamientos disulfuro, por ejemplo, para usar como inmunógeno in vivo. Además, a menudo se forman enlaces disulfuro no deseados entre proteínas con grupos sulfhidrilo libres que median la formación de agregados (véase, por ejemplo, Harris RJ et al. 2004, “Commercial manufacturing scale formulation and analytical characterization of therapeutic recombinant antibodies”. Drug Dev Res 61 (3): 137 - 154; Costantino & Pikal (Eds.), 2004. Lyophilization of Biopharmaceuticals, editors Costantino & Pekal. Lyophilization of Biopharmaceuticals. Series: Biotechnology: Pharmaceutical Aspects II, véanse las páginas 453-454; Tracy et al., 2002, patente de EE.UU. 6.465.425), lo cual también se ha descrito como un problema con gp120 y gp41 del VIH (Jeffs et al. 2004. “Expression and characterization of recombinant oligomeric envelope glycoproteins derived from primary isolates of HIV-1”. Vaccine 22:1032-1046; Schulke et al., 2002. “Oligomeric and conformational properties of a proteolytically mature, disulfide-stabilized human immunodeficiency virus type 1 gp140 envelope glycoprotein”. J Virol 76:7760-7776). Por lo tanto, en muchas realizaciones se prefiere que no se usen los enlaces disulfuro, o que no se usen como el único método de entrecruzamiento.
Si la estructura y/o inmunogenicidad de un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe se compromete o altera por un entrecruzamiento, el mantenimiento de su estructura y función globales se puede lograr controlando la disponibilidad de las cadenas laterales de los aminoácidos para la reacción de entrecruzamiento o introduciendo entrecruzamientos adicionales u otras modificaciones estabilizantes. Por ejemplo, en el caso del entrecruzamiento DT, las cadenas laterales de tirosilo que están disponibles para la reacción, pero que conducen a la distorsión de la estructura del complejo, y que comprometen la inmunogenicidad/antigenicidad de la proteína HA del virus de la gripe, se pueden eliminar por mutación de dichos restos a otro aminoácido tal como, por ejemplo, fenilalanina. Además, se pueden introducir mutaciones puntuales en las posiciones donde las cadenas laterales de aminoácidos reaccionarán con agentes de entrecruzamiento o entre sí, de modo que la formación del o de los enlaces produce el resultado más beneficioso. Estas posiciones también se pueden identificar como se describe en el presente documento.
Cuando en un resto seleccionado una cadena lateral reactivo no está ya presente, se puede introducir una mutación puntual, por ejemplo, usando métodos de biología molecular para introducir dicha mutación puntual en el ADNc de un ácido nucleico que dirige su expresión, de modo que la cadena lateral reactiva esté presente y disponible para la reacción.
Los entrecruzamientos que se pueden usar incluyen entrecruzamientos reversibles que resultan del uso de agentes de entrecruzamiento homo- y hetero-bifuncionales que reaccionan con grupos amina y/o tiol, reactivos de entrecruzamiento fotorreactivos, cualesquiera entrecruzamientos que se puedan formar entre aminoácidos no clásicos incorporados en la estructura de un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe, cualesquiera entrecruzamientos oxidantes, tales como entrecruzamientos/enlaces ditirosina, agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales (por ejemplo, acetiltioacetato de succinimidilo (SATA), trans-4-(maleimidilmetil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), y 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo (SPDP)), agentes de entrecruzamiento homobifuncionales (por ejemplo, 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo), agentes de entrecruzamiento fotorreactivos (por ejemplo, ácido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoico, éster de STP, sal de sodio (ATFB, éster de STP), ácido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoico, éster de succinimidilo (ATFB, SE), 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobencil-amina, hidrocloruro, benzopfenona-4-isotiocianato, benzofenona-4-maleimida, ácido 4-benzoilbenzoico, éster de succinimidilo, N-((2-piridilditio)etil)-4-azidosalicilamida (PEAS; AET), agentes de entrecruzamiento reactivos con tiol (por ejemplo, maleimidas y yodoacetamidas), agentes de entrecruzamiento reactivos con amina (por ejemplo, glutaraldehído, bis(imido-ésteres), bis(ésteres de succinimidilo), diisocianatos y cloruros de diácido).
La presente invención también contempla la introducción de interacciones de apilamiento de tirosinas no covalentes dirigidas como “entrecruzamientos” para estabilizar las interacciones de proteína-proteína y/o las conformaciones de proteína o péptido deseadas, tal como la conformación natural de trímero de un dominio de tallo de un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe. El entrecruzamiento comprende una interacción de apilamiento pi dirigido que incluye una interacción de apilamiento pi en forma de T, sándwich o desplazado paralelo entre las cadenas laterales aromáticas de una tirosina introducida/genéticamente modificada y una tirosina, fenilalanina, histidina o triptófano endógenos, en el polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe, o entre la cadena lateral aromática de una tirosina introducida/genéticamente modificada y una segunda tirosina introducida/genéticamente modificada en el polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe.
Los entrecruzamientos irreversibles, como se usa en el contexto de esta solicitud, incluyen los que no se disuelven significativamente en condiciones fisiológicas relevantes. Se prefiere que el tipo de entrecruzamientos usados no conduzca a la formación de agregados durante la expresión o cuando los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación se almacenan en concentraciones altas. Los enlaces disulfuro no son entrecruzamientos irreversibles. Son más bien entrecruzamientos reversibles y se pueden disolver en condiciones fisiológicamente relevantes y/o conducir a la formación de agregados durante la expresión y/o producción de proteínas o cuando se almacenan en concentraciones altas.
En algunas realizaciones, los entrecruzamientos se pueden dirigir a las regiones específicas de polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento con el fin de lograr la estabilización conformacional deseada y/o las propiedades inmunógenas deseadas (por ejemplo, la capacidad de mantener el dominio de tallo en su conformación natural de trímero y/o de unirse a anticuerpos ampliamente neutralizantes). Alternativamente, se pueden aislar proteínas con los entrecruzamientos en las localizaciones especificadas en el presente documento, de una mezcla de proteínas entrecruzadas y no entrecruzadas, con o sin modificaciones deseadas, por ejemplo, basado en sus características químicas, físicas y/o funcionales. Dichas características pueden incluir, por ejemplo, la trimerización, la presencia de un dominio de tallo que tiene una conformación natural de trímero y/o cualesquiera características antígenas, inmunógenas o bioquímicas deseadas.
Alternativamente, en algunas realizaciones, los entrecruzamientos pueden no ser dirigidos, y las proteínas con los entrecruzamientos o propiedades deseadas se pueden aislar de una mezcla de proteínas modificadas y no modificadas hechas usando un sistema de entrecruzamiento no dirigido.
En realizaciones donde se van a aislar polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe con los entrecruzamiento deseados de una mezcla de proteínas entrecruzadas y no entrecruzadas, dicho aislamiento o separación se puede llevar a cabo basándose en una o más características que incluyen peso molecular, volumen molecular, propiedades cromatográficas, movilidad en electroforesis, características antígenas y bioquímicas, características de fluorescencia, solubilidad, unión a anticuerpos, características estructurales, características inmunológicas, o cualesquiera otras características deseadas.
Además de las posiciones de entrecruzamiento específicas descritas en el presente documento, se pueden identificar posiciones adicionales en los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe en las que se pueden hacer entrecruzamientos adicionales, por ejemplo, donde una cadena lateral reactiva podría formar un enlace con una cadena lateral reactiva en otra parte del polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe. En algunas realizaciones, dichas posiciones adicionales se pueden seleccionar, por ejemplo, para mantener o mejorar la inmunogenicidad/antigenicidad de la proteína, polipéptido o complejo de proteínas. En algunas realizaciones, dichas posiciones adicionales para entrecruzar se pueden seleccionar en pares. Entrecruzamiento ditirosina (DT)
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que comprenden entrecruzamientos ditirosina (DT), y métodos para hacer dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe con entrecruzamientos DT.
El entrecruzamiento ditirosina introduce uno o más enlaces covalentes carbono-carbono en las proteínas o complejos de proteínas. Esto proporciona un método para estabilizar proteínas, complejos de proteínas y conformaciones, por la introducción de enlaces ditirosina intra y/o inter-polipéptidos, mientras que se mantiene su integridad estructura y funcional (véase, Marshall et al., patentes de EE.UU. número 7.037.894 y 7.445.912). El entrecruzamiento DT que altera mínimamente y de longitud cero no es hidrolizado en condiciones fisiológicas y se ha demostrado que mantiene la integridad estructura de las proteínas, por cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS). Se sabe que los entrecruzamientos ditirosina son seguros, puesto que se forman naturalmente in vivo, tanto en el contexto de proteínas desarrolladas para usar sus características específicas (por ejemplo, Elvin CM et al. 2005, Nature 437:999-1002; Tenovuo J y Paunio K 1979, Arch Oral Biol.;24(8):591-4), como también como consecuencia de la oxidación de proteínas no específica (Giulivi et al. 2003, Amino Acids 25(3-4):227-32), y en cuanto que están presentes en grandes cantidades en algunos de nuestros alimentos más comunes: los enlaces DT forman la estructura del gluten del trigo, la estructura cuaternaria de la proteína que comprende subunidades de gluteinina, por ejemplo, en la masa de pan durante el amasado y horneado (Tilley et al. 2001, Agrie. Food Chem 49, 2627). Los enlaces ditirosina no se forman espontáneamente in vitro. Más bien la reacción de entrecruzamiento enzimática se lleva a cabo en condiciones optimizadas para conservar la estructura y función de la proteína. Por lo tanto, no se producen enlaces no específicos/agregación (a diferencia de los enlaces disulfuro), y por lo tanto la fabricación a gran escala de un inmunógeno estabilizado por DT puede ser económicamente más factible.
Las cadenas laterales de tirosilo están presentes en muchas enzimas rédox, y la catálisis de las reacciones específicas de enzimas a menudo implica radicales tirosilo que son de vida larga y tienen comparativamente baja reactividad. En condiciones optimizadas la formación de radicales es específica para las cadenas laterales de tirosilo. En la proximidad, las cadenas laterales de tirosilo dan acoplamiento por radicales y forman un enlace covalente carbono-carbono. Los radicales tirosilo que no reaccionan vuelven a cadenas laterales de tirosilo no radicálicas (Malencik y Anderson, 2003. “Di-tyrosine as a product of oxidative stress and fluorescent probe”. Amino Acids 25: 233-247). Por lo tanto, las cadenas laterales de tirosilo deben estar situadas muy próximas para formar los enlaces DT, sea en una sola cadena de polipéptido plegada, o en dominios de proteínas que interaccionan próximos dentro de un complejo. Puesto que una separación Ca-Ca de aproximadamente 5-8 A es un prerrequisito para la formación de enlace (Brown et al., 1998. “Determining protein-protein interactions by oxidative cross-linking of a glycine-glycine-histidine fusion protein”. Biochemistry 37, 4397-4406; Marshall et al. 2006, patente de EE.UU. n° 7.037.894), y debido a que no se añade ningún átomo en la formación de estos enlaces, el “grapado” resultante es de “longitud cero” y no altera la estructura de la proteína.
Los restos de tirosina que se van a entrecruzar pueden estar presentes naturalmente en la estructura primaria de la proteína que se va a entrecruzar o se pueden añadir por una mutación puntual controlada. Para formar enlaces DT, las proteínas con cadenas laterales de tirosilo se pueden someter a condiciones de reacción que conducen a la formación de enlaces DT. Dichas condiciones son, o se convierten en, condiciones de reacción oxidantes, puesto que la reacción de formación de enlace DT es una reacción de entrecruzamiento oxidante. En algunas realizaciones las condiciones de reacción del entrecruzamiento DT da proteínas que de otra forma no se modificarían, o no de forma detectable. Dichas condiciones se pueden obtener mediante el uso de enzimas que catalizan la formación de H2O2, tales como peroxidasas. La formación de enlace DT se puede vigilar por espectrofotometría con una longitud de onda de excitación de aproximadamente 320 nm, y la fluorescencia medida a una longitud de onda de aproximadamente 400 nm (véase, por ejemplo, la figura 4A), mientras que la pérdida de fluorescencia del tirosilo se vigila también por procedimientos convencionales. Cuando la pérdida de fluorescencia del tirosilo ya no es estequiométrica con la formación de enlace DT, la reacción se puede detener por cualquier método conocido para el experto en la técnica, tal como, por ejemplo, la adición de un agente reductor y posterior enfriamiento (en hielo) o refrigeración de la muestra. Se conocen en la técnica detalles adicionales de cómo llevar a cabo el entrecruzamiento DT y se describen, por ejemplo, en Marshall et al. 2006, patente de EE.UU. n° 7.037.894.
Las ventajas principales del entrecruzamiento ditirosina en la modificación genética de proteínas incluyen (i) la capacidad de dirigir restos específicos para el entrecruzamiento (basado en las estructuras primaria, secundaria, terciaria y/o cuaternaria de las proteínas y complejos), (ii) modificación estructural mínima, (iii) especificidad de la reacción (la tirosina es el único aminoácido que se sabe que forma entrecruzamientos en condiciones de entrecruzamiento específicas); (iv) estabilidad de la unión, (v) longitud cero del entrecruzamiento (no se añade átomo),y (vi) la escalabilidad de la química de entrecruzamientos.
En algunas realizaciones, se pueden introducir entrecruzamientos DT en una o más localizaciones específicas en la proteína de HA del virus de la gripe, que se citan en el presente documento. En otras realizaciones, se pueden identificar posiciones adicionales en los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe en las que se pueden hacer entrecruzamientos DT. En algunas realizaciones, los enlaces o entrecruzamientos ditirosina se dirigen a pares de restos específicos dentro de la estructura de un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe donde los enlaces DT se formarán, o se espera que se formen debido, por ejemplo, a su proximidad. En algunas realizaciones las cadenas laterales de tirosilo ya están presentes en los restos de aminoácidos que se van a entrecruzar. En algunos casos, los restos de tirosina que se encuentran de forma natural pueden constituir uno o los dos restos de tirosina emparejados necesarios para la formación del enlace ditirosina. Sin embargo, en otros casos, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación se mutan o modifican genéticamente para añadir uno o más restos de tirosina, o para sustituir uno o más restos no tirosina por restos de tirosina. Dichas mutaciones se denominan en el presente documento mutaciones “a tirosina”, y se pueden introducir en localizaciones donde es deseable formar entrecruzamientos/enlaces ditirosina. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe mutantes en los que se introducen cadenas laterales de tirosilo en posiciones de entrecruzamiento deseadas, introduciendo mutaciones puntuales a tirosina en una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe. Alternativamente, en algunas realizaciones se pueden sintetizar proteínas, polipéptidos o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe, o partes de los mismos, para incluir restos de tirosina o aminoácidos que tengan cadena lateral de tirosilo en posiciones de entrecruzamiento deseadas. A la inversa, en algunas realizaciones la presente divulgación proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe mutantes en los que se eliminan cadenas laterales de tirosilo en posiciones de entrecruzamiento no deseadas, introduciendo mutaciones puntuales de tirosina en una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe, o se pueden sintetizar polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe para excluir restos de tirosina o aminoácidos que tienen cadenas laterales de tirosilo en posiciones donde no se desea el entrecruzamiento. Por ejemplo, al menos una de las cadenas laterales de tirosilo se puede sustituir por otra cadena lateral, tal como una cadena lateral de fenilalanina (véase, por ejemplo, Marshall CP et al., patente de EE.UU. n° 7.037.894). Por consiguiente, los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención pueden comprender mutaciones puntuales “a tirosina” o “de tirosina”. Dichas mutaciones se pueden hacer alterando las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención usando cualesquiera métodos de mutagénesis adecuados conocidos en la técnica. Alternativamente, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe mutantes se pueden sintetizar, purificar y/o producir por cualquier otro método adecuado conocido en la técnica.
En algunas realizaciones, la presente invención contempla la introducción dirigida de uno o más entrecruzamientos ditirosina en cualquier posición(es) adecuada(s) en un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe, por ejemplo, en el dominio de tallo donde el entrecruzamiento estabilizará o puede estabilizar el dominio de tallo en una conformación natural de trímero u otra conformación capaz de unir anticuerpos anti-tallo, tal como anticuerpos anti-tallo neutralizantes o ampliamente neutralizantes. Dicha estabilización se puede lograr, por ejemplo, introduciendo entrecruzamientos que estabilizan las interacciones o plegados en un monómero del tallo (entrecruzamiento intramolecular) y/o las interacciones entre uno o más monómeros del tallo que comprenden ese trímero del tallo (entrecruzamiento intermolecular), o cualquier combinación de entrecruzamientos intra y/o intermoleculares.
Escisión proteolítica
En algunas realizaciones de la divulgación los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación (y/o productos intermedios en su síntesis), comprenden uno o más motivos de reconocimiento de proteasas que se pueden usar, por ejemplo, para facilitar la eliminación proteolítica del dominio de cabeza. Se puede usar cualquier motivo de reconocimiento de proteasa adecuado conocido en la técnica. Dichos sitios de reconocimiento de proteasas genéticamente modificados se pueden localizar en cualquier localización adecuada en el polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe, en la que serán útiles para la alteración y/o eliminación del dominio de cabeza, pero preferiblemente no alterarán la conformación natural de trímero de (y/o conformación de los epítopos neutralizantes en) el dominio de tallo. Dichas localizaciones se pueden determinar usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo el ensayo del efecto de la introducción de sitios de reconocimiento de proteasas genéticamente modificados en ensayos funcionales, ensayos de unión a anticuerpos, ensayos antigénicos, ensayos estructurales, y similares. En algunas realizaciones dichos sitios de reconocimiento de proteasas genéticamente modificados se pueden localizar dentro de una región de bucle variable, puesto que se sabe que dichas regiones toleran variaciones en la secuencia de aminoácidos sin alterar significativamente la estructura y/o función de la proteína HA del virus de la gripe. Las proteínas HA del virus de la gripe de la invención se pueden modificar genéricamente para introducir una o más secuencias de reconocimiento de proteasas, por ejemplo, insertando uno o más aminoácidos que comprenden, o comprenden parte de un sitio de reconocimiento de proteasa (véase por ejemplo SEQ ID NO. 18, 19, 21, 23 y 25), o sustituyendo uno o más aminoácidos de la proteína HA del virus de la gripe por diferentes aminoácidos que comprenden, o comprenden parte de un sitio de reconocimiento de proteasa (véase por ejemplo SEQ ID NO. 24), o iba llevando a cabo una combinación de inserción y sustitución de aminoácidos (véase por ejemplo SEQ ID NO. 20 y 22) con el fin de generar una secuencia de reconocimiento de proteasa dentro de la secuencia de proteína HA del virus de la gripe. El sitio de reconocimiento de proteasa genéticamente modificado típicamente consistirá en hasta aproximadamente 20 restos de aminoácidos. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento comprenden un motivo de reconocimiento de proteasa genéticamente modificado en uno o más de los siguientes sitios principales de eliminación de la cabeza: restos de aminoácidos 53-67, restos de aminoácidos 60-76, restos de aminoácidos 269-277, y restos de aminoácidos 277-290, y también pueden comprender opcionalmente un motivo de reconocimiento de proteasa genéticamente modificado en uno o más de los siguientes sitios secundarios de eliminación de la cabeza: restos de aminoácidos 142-146, y restos de aminoácidos 155-164. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la presente invención comprenden una secuencia de reconocimiento de proteasa que empieza en una posición de resto de aminoácido dentro de las siguientes regiones de la proteína HA del virus de la gripe: restos de aminoácidos 40-68, restos de aminoácidos 60-76, restos de aminoácidos 77-114, restos de aminoácidos 120-141, restos de aminoácidos 142-146, restos de aminoácidos 148-178, restos de aminoácidos 182­ 188, restos de aminoácidos 195-201, restos de aminoácidos 209-242, restos de aminoácidos 250-255, restos de aminoácidos 260-285, restos de aminoácidos 277-290, y restos de aminoácidos 286-320. En algunas realizaciones dichos motivos de reconocimiento de proteasa pueden permitir la escisión proteolítica en uno o más de los sitios antigénicos Sa, Ca, Sb y Cb en el dominio de cabeza de la HA del virus de la gripe. En algunas realizaciones el motivo de reconocimiento de proteasa se inserta en la proteína HA del virus de la gripe inmediatamente después del aminoácido en la posición 48, 63, 278, 282, 286 o 291. En algunas realizaciones el motivo de reconocimiento de proteasa se inserta en la proteína HA del virus de la gripe dentro de una o más de las siguientes regiones de la proteína HA del virus de la gripe: restos de aminoácidos 38-58, restos de aminoácidos 53-73, restos de aminoácidos 268-288, restos de aminoácidos 272-292, restos de aminoácidos 276-296 y restos de aminoácidos 281-301. En algunas realizaciones los motivos de reconocimiento de proteasa pueden comprender una secuencia de reconocimiento PreScission Protease (por ejemplo, LEVLFQGP (SEQ ID No .69)) o sitio de reconocimiento de TEV, (por ejemplo, ENLYFQG (SEQ ID NO. 70) o e NlYFQS (SEQ ID NO. 71)), o cualquiera de sus combinaciones. Las secuencias de nucleótidos que codifican dichos sitios de reconocimiento de proteasa se pueden modificar genéticamente en ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención usando técnicas de biología molecular convencionales conocidas en la técnica. Formación y análisis de polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe
En algunas realizaciones la presente invención proporciona métodos para hacer los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de hA del virus de la gripe de la divulgación. Los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación se pueden hacer por cualquier medio adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación se pueden hacer por medios recombinantes. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación, o cualquiera de sus partes, se pueden hacer por medios de síntesis química. Por ejemplo, un péptido que corresponde a una parte de una proteína o complejo de proteínas como se describe en el presente documento, se puede sintetizar usando un sintetizador de péptidos.
Métodos de producción recombinantes
En realizaciones donde los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación se hacen por medios recombinantes, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación se pueden expresar en cualquier tipo de célula adecuada, incluyendo células de mamífero, células de aves (tales como células de ánade EB66) y células de insecto (tales como células SF9 o Hi5, usando un sistema de expresión de baculovirus). Los métodos para la expresión de polipéptidos y proteínas a partir de moléculas de ácido nucleico son rutinarios y bien conocidos en la técnica, y se pueden usar cualesquiera métodos, vectores, sistemas y tipos de células adecuados conocidos en la técnica. Por ejemplo, típicamente las secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se pondrán en una construcción de expresión adecuada que contiene un promotor adecuado, que después se suministrará a las células para la expresión.
Proteínas quiméricas/de fusión y dominios de oligomerización
En algunas realizaciones puede ser conveniente añadir dominios quiméricos a los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento, para producir proteínas/proteínas de fusión quiméricas, por ejemplo, para facilitar el análisis y/o aislamiento y/o purificación de los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de Ha del virus de la gripe descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación pueden comprender secuencias líder, secuencias de polipéptidos precursores, señales de secreción, señales de localización, marcadores epítopos, sitios de escisión de proteasas, y similares. Los marcadores epítopos que se pueden usar incluyen marcadores FLAG, marcadores de glutatión S-transferasa (GST), marcadores de proteína verde fluorescente (GFP), marcadores de hemaglutinina A (HA), marcadores de histidina (His), marcadores de luciferasa, marcadores de proteína de unión a maltosa (MBP), marcadores c-Myc, marcadores de proteína A, marcadores de proteína G, marcadores de estreptavidina (strep), y similares.
En algunas realizaciones puede ser conveniente añadir dominios de oligomerización para facilitar el ensamblado de los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe como se describe en el presente documento, y/o facilitar la estabilización del dominio de tallo en una conformación natural de trímero, y/o estabilizar otras características estructurales de los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe. En algunas realizaciones los dominios de oligomerización son motivos de trimerización, incluyendo el motivo foldon de T4. Hay una amplia variedad de dominios de trimerización en proteínas naturales que se pueden usar para estos fines, incluyendo, los descritos en Habazettl et al., 2009 (Habazettl et al., 2009. “NMR Structure of a Monomeric Intermediate on the Evolutionarily Optimized Assembly Pathway of a Small Trimerization Domain”. J. Mol. Biol.), Kammerer et al., 2005 (Kammerer et al., 2005. “A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils”. Proc Natl Acad Sci USA 102 (39): 13891-13896), Innamorati et al., 2006 (Innamorati et al., 2006. “An intracellular role for the C1q-globular domain”. Cell signal 18(6): 761-770), y Schelling et al., 2007 (Schelling et al., 2007. “The reovirus a-1 aspartic acid sandwich: A trimerization motif poised for conformational change”. Biol Chem 282(15): 11582-11589). La estabilización de complejos de proteínas triméricos se puede llevar a cabo también usando los motivos de fibritina de GCN4 y T4 (Pancera et al., 2005. “Soluble Mimetics of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Viral Spikes Produced by Replacement of the Native Trimerization Domain with a Heterologous Trimerization Motif: Characterization and Ligand Binding Analysis”. J Virol 79(15): 9954-9969; Guthe et al., 2004. “Very fast folding and association of a trimerization domain from bacteriophage T4 fibritin”. J. Mol. Biol. v337 pp. 905­ 15; Papanikolopoulou et al., 2008. “Creation of hybrid nanorods from sequences of natural trimeric fibrous proteins using the fibritin trimerization motif. Methods Mol Biol 474:15-33). Se pueden introducir motivos de oligomerización heterólogos por cualquier método recombinante conocido por el experto en la técnica con el fin de estabilizar las interacciones de proteína-proteína de las proteínas de la presente divulgación.
En algunas realizaciones puede ser conveniente añadir más de un dominio y/o marcador adicional a los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas del virus de la gripe descritos en el presente documento, y se puede añadir cualquier combinación de dominios quiméricos y/o de oligomerización adecuados para hacer los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe deseados. En algunas realizaciones, los dominios adicionales se modifican genéticamente a o en la región transmembrana de una proteína HA del virus de la gripe, por ejemplo por inserción y/o sustitución de uno o más aminoácidos en la región transmembrana de modo que toda o una parte de la región transmembrana se sustituye por los dominios adicionales. En algunas realizaciones los motivos adicionales comprenden un sitio de escisión de trombina, un motivo foldon de T4 y un marcador de histidina (por ejemplo, un marcador 6xHis (SEQ ID NO: 118)). En algunas realizaciones los dominios adicionales están codificados por una secuencia de ácido nucleico que comprende CGTTCTCTGGTTCCGCGT GC TTCTCCG GGTTCTGGTTAC ATCCCGG A AGCTCCGC
GTGACGGTt AGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTtTACCTT
CCTGCACCACCACCACCACCACTGA (S tQ ID NO. 72) En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe comprenden un marcador que comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos RSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRJCDGEWVLLSTFLHHHHHH (SbQ ID NO: 116).
Los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas quiméricos de HA del virus de la gripe se pueden hacer por cualquier método conocido para el experto en la técnica, y pueden comprender, por ejemplo, uno o varios polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación, y/o cualquier fragmento, derivado o su análogo (por ejemplo, que consiste en al menos un dominio de un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de la divulgación, o al menos 6, y preferiblemente al menos 10 de sus aminoácidos) unidos en sus extremos amino o carboxi por un enlace peptídico a una secuencia de aminoácidos de otra proteína u otro dominio o motivo de proteína. En algunas realizaciones dichas proteínas quiméricas se pueden producir por cualquier método conocido por el experto en la técnica, incluyendo la expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica una proteína quimérica (por ejemplo, que comprende una primera secuencia codificante unida en el marco de lectura a una segunda secuencia codificante); ligado de las secuencias de ácido nucleico adecuadas que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas entre sí en el marco codificante adecuado, y expresión del producto quimérico.
Modificaciones postraduccionales
En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento se pueden alterar añadiendo o eliminando modificaciones postraduccionales, añadiendo o eliminando modificaciones químicas o apéndices, y/o introduciendo cualesquiera otras modificaciones conocidas para los expertos en la técnica. Están incluidos en el alcance de la invención los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe que son modificados durante o después de la traducción o síntesis, por ejemplo, por glucosilación (o desglucosilación), acetilación (o desacetilación), fosforilación (o desforforilación), amidación (o desamidación), pegilación, derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, o por cualquier otro medio conocido en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe se pueden someter a escisión química por bromuro de cianógeno, tripsina, quimiotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc. En algunas realizaciones dichas modificaciones postraduccionales se pueden usar para hacer a los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la presente invención más inmunógenos, más estables y/o más capaces de unirse a, o de producir la producción de anticuerpos neutralizantes o ampliamente neutralizantes.
Obtención de la proteína HA del virus de la gripe en las conformaciones deseadas
En algunas realizaciones, los polipéptidos y/o proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se ensamblan en complejos de proteínas que tienen una estructura conformacional deseada, tal como la estructura natural de trímero del dominio de tallo, y se entrecruzan con el fin de estabilizar la conformación. Como se describe en otra parte en la presente solicitud, la proteína HA del virus de la gripe comprende un trímero formado a partir de tres monómeros. En algunas realizaciones, antes y/o durante la reacción enzimática de entrecruzamiento, la proteína HA del virus de la gripe se puede obtener (y/o mantener) en la conformación deseada, por ejemplo mientras se lleva a cabo el entrecruzamiento. En algunas realizaciones la proteína HA del virus de la gripe se puede producir y/o aislar de modo que la mayoría, o sustancialmente todas las moléculas de HA del virus de la gripe tengan un dominio de tallo presente en una conformación natural de trímero. Por ejemplo, cuando la proteína hA es expresada o se obtiene de una forma que comprende todavía el dominio de cabeza, el dominio de tallo típicamente adoptará su confirmación de tallo natural de trímero. En algunas realizaciones las moléculas de HA del virus de la gripe en una conformación deseada se pueden separar de una población mixta de moléculas de proteína HA del virus de la gripe que comprenden algunas que están en la conformación deseada (por ejemplo, conformación natural de trímero del dominio de tallo) y algunas que están en otras conformaciones (por ejemplo, dominio de tallo en una conformación monomérica y/o dimérica). En algunas realizaciones, la proteína de hA del virus de la gripe es expresada en células (por ejemplo, como su forma unida a membrana o soluble) y se ensambla espontáneamente en su conformación normal (por ejemplo, que tiene un dominio de tallo en su conformación natural de trímero). En algunas realizaciones, puede no ser necesaria ninguna estabilización adicional para retener el dominio de tallo de la proteína HA del virus de la gripe en su conformación natural de trímero. En algunas realizaciones, la proteína HA del virus de la gripe expresada y ensamblada/plegada se puede mantener en condiciones particulares, o en composiciones particulares, que favorecen la formación y/o mantenimiento de la conformación natural de trímero del dominio de tallo. La proteína Ha del virus de la gripe se puede obtener y/o aislar y/o mantener en la conformación deseada usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo los métodos de purificación de proteínas convencionales, tales como métodos de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por exclusión de tamaños, y cromatografía de afinidad. En algunas realizaciones, la proteína HA del virus de la gripe se puede expresar en presencia de, coexpresar con, o poner en contacto con moléculas que se unen a la proteína hA del virus de la gripe y estabilizarla en su conformación deseada, incluyendo anticuerpos, moléculas pequeñas, péptidos y/o peptidomiméticos. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos que se unen al dominio de tallo en su conformación natural de trímero incluyen 6F12, C 179, CR6261, F10, A66, y D8. Otros anticuerpos que se pueden usar para caracterizar o estabilizar los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA de la invención incluyen, pero no se limitan a 18A3, 18C11, 18E7, 18E12, 18H9, 16B5, 10A14, 5K24, FI6v3, 6K14, 6J24, 8D4, anticuerpos anti-virus de la gripe humana del linaje de cadena pesada Vh1-69, y anticuerpos anti-virus de la gripe humana del linaje de cadena pesada Vh3-30. En algunas realizaciones, la proteína HA del virus de la gripe se puede obtener, aislar o mantener en su conformación deseada controlando la fuerza iónica del medio/tampón en el que está presente la proteína (tal como usando medio de fuerza iónica alta o baja). En algunas realizaciones la proteína HA del virus de la gripe se puede obtener, aislar o mantener a una o más temperaturas que favorezcan la conservación de la conformación deseada. En algunas realizaciones la proteína HA del virus de la gripe se puede obtener, aislar o mantener a lo largo de un periodo de tiempo que disminuye el grado al que se pierde la conformación deseada.
En algunas realizaciones se puede llevar a cabo un análisis para confirmar que la conformación deseada, tal como la conformación natural de trímero del dominio de tallo, se ha formado y/o mantenido en la proteína HA del virus de la gripe. Dicho análisis se puede llevar a cabo antes del entrecruzamiento, durante el procedimiento de entrecruzamiento, después del procedimiento de entrecruzamiento o en cualquier combinación de dichas etapas. Dicho análisis puede comprender cualquier método conocido en la técnica para evaluar la estructura tridimensional de una proteína o complejo de proteínas, incluyendo el análisis funcional, análisis cristalográfico, y similares. En algunas realizaciones dicho análisis puede incluir evaluar la unión de la proteína HA del virus de la gripe a determinados anticuerpos, tal como los que son específicos para la conformación natural de trímero del dominio de tallo y/o los que se sabe que se unen a sitios antigénicos en el dominio de tallo o en otra parte en la proteína HA del virus de la gripe, como se describe en otra parte en el presente documento, incluyendo los anticuerpos 6F12, C179, CR6261, F10, A66, y D8.
Purificación de proteína
Los métodos para hacer polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención pueden comprender purificar los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe antes, durante o después de una o más etapas del procedimiento de fabricación. Por ejemplo, en algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se pueden purificar después de completarse todas las etapas de fabricación. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se pueden purificar antes de empezar el procedimiento de entrecruzamiento, o después de una o más etapas intermedias del método en el procedimiento, por ejemplo, después de la expresión de un polipéptido o proteína de HA del virus de la gripe, después de ensamblar un complejo de proteínas, después de obtener la proteína HA del virus de la gripe en una conformación deseada, durante o después de llevar a cabo una reacción de entrecruzamiento o después de eliminación del dominio de cabeza. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se pueden aislar o purificar usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Dichos métodos incluyen la cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, afinidad y/o de exclusión por tamaño molecular), precipitación con sulfato amónico, centrifugación, solubilidad diferencial o cualquier otra técnica para la purificación de proteínas conocida para un experto en la técnica. En realizaciones específicas puede ser necesario separar los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas deseados de HA del virus de la gripe de la invención de los que no estuvieran suficientemente entrecruzados, o aquellos en los que el dominio de cabeza no estuviera suficientemente eliminado. Esto se puede hacer usando cualquier sistema adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, las proteínas HA del virus de la gripe que tienen un dominio de tallo en su conformación natural de trímero se pueden separar de aquellas que tienen un dominio de tallo que no está en la conformación natural de trímero, usando métodos de separación basados en anticuerpo. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se pueden purificar de cualquier fuente usada para producirlos. Por ejemplo, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se pueden purificar de fuentes que incluyen insectos, procariotas, eucariotas, monocelular, multicelular, animal, planta, hongo, vertebrado, mamífero, humana, porcina, bovina, felina, equina, canina, aviar, o células de cultivo celular, o cualquier otra fuente. El grado de pureza puede variar, pero en diferentes realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención purificados, se proporcionan en una forma que comprende más de aproximadamente el 10 %, el 20 %, el 50 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 %, el 99 % o el 99,9 % de la proteína total en la composición final. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se pueden aislar y purificar de otras proteínas, o cualesquiera otros productos no deseados (tal como productos entrecruzados donde la eliminación del dominio de cabeza es insuficiente o incompleta), por métodos convencionales que incluyen la cromatografía, gradientes de glicerol, cromatografía de afinidad, centrifugación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño molecular, y cromatografía de afinidad, o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas conocida en la técnica. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de Ha del virus de la gripe que se van a aislar pueden ser expresados en medios iónicos altos o bajos, o se pueden aislar en tampones o soluciones iónicas altas o bajas. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se pueden aislar a una o más temperaturas que favorecen la conservación de la conformación deseada. También se pueden aislar a lo largo de un periodo de tiempo que disminuya el grado en el que una preparación habría perdido la conformación deseada. El grado con el que una preparación de proteínas retiene una o más conformaciones deseadas (tal como la conformación natural de trímero del dominio de tallo y/o conformaciones que favorecen la unión a anticuerpos neutralizantes u otras propiedades deseadas) se puede ensayar por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, análisis bioquímicos, biofísicos, inmunológicos y virológicos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), o ensayos de inmunoadsorción ligado a enzimas de puntos (ELISPOT), análisis cristalográficos (incluyendo cocristalización con anticuerpos), sedimentación, ultrcentrifugación analítica, dispersión de luz dinámica (DLS), microscopía electrónica (EM), criomicroscopía electrónica tomografía, calorimetría, resonancia del plasmón de superficie (SPR), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), análisis de dicroísmo circular, y dispersión de rayos X de ángulo pequeño, ensayos de neutralización, ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, y/o estudios de exposición virológica in vivo.
El rendimiento de los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se puede determinar por cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, comparando la cantidad de las proteínas finales genéticamente modificadas (tales como proteínas HA del virus de la gripe entrecruzadas) comparado con la cantidad del material de partida, o comparado con la cantidad de los materiales presentes en cualquier etapa precedente de los métodos de producción. Las concentraciones de proteínas se pueden determinar por procedimientos convencionales tales como, por ejemplo, ensayos de proteínas de Bradford o Lowry. El ensayo de Bradford es compatible con agentes de reducción y agentes desnaturalizantes (Bradford, M, 1976. Anal. Biochem. 72: 248). El ensayo de Lowry tiene mejor compatibilidad con detergentes y la reacción es más lineal con respecto a las concentraciones de proteínas y lectura (Lowry, O J, 1951. Biol. Chem. 193: 265).
Métodos de producción de ejemplo
En algunas realizaciones la presente invención proporciona métodos para hacer complejos de proteínas de HA del virus de la gripe “sin cabeza” como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones los métodos para hacer los complejos de proteínas de HA del virus de la gripe “sin cabeza” comprenden: (a) expresar una proteína HA del virus de la gripe que tiene (i) tanto un dominio de tallo como un dominio de cabeza, y (ii) uno o más motivos de reconocimiento de proteasas genéticamente modificados en o cerca de su dominio de cabeza, (b) dejar que la proteína HA del virus de la gripe soluble expresada en la etapa (a) se pliegue en su conformación natural que tiene un dominio de tallo trimérico y un dominio de cabeza, (c) introducir uno o más entrecruzamientos en el dominio de tallo trimérico, en donde los entrecruzamientos estabilizan el dominio de tallo en su conformación natural de trímero, y (d) posteriormente alterar o eliminar proteolíticamente el dominio de cabeza, produciendo así una proteína HA del virus de la gripe sin cabeza. Según la invención, los entrecruzamientos son entrecruzamientos ditirosina dirigidos. En algunos aspectos de la divulgación, los métodos también implican primero (al menos antes de la etapa (c)) identificar una o más regiones en la proteína HA en las que la introducción de uno o más entrecruzamientos en la etapa (c) podría estabilizar la conformación del tallo en su conformación natural de trímero y/o estabilizar el tallo en una conformación que permite la unión de uno o más anticuerpos anti-tallo ampliamente neutralizantes. En algunas realizaciones, los métodos para hacer los complejos de proteínas de HA del virus de la gripe “sin cabeza” comprenden: (a) expresar una proteína HA del virus de la gripe que tiene: (i) tanto un dominio de tallo como un dominio de cabeza, (ii) una o más mutaciones “a tirosina” dentro de su dominio de tallo, y (iii) uno o más motivos de reconocimiento de proteasas genéticamente modificados dentro o cerca de su dominio de cabeza, (b) dejar que la proteína HA del virus de la gripe se pliegue en su conformación natural que tiene un dominio de tallo trimérico y un dominio de cabeza, (c) introducir uno o más entrecruzamientos ditirosina en el dominio de tallo trimérico, en donde los entrecruzamientos ditirosina son estables en condiciones fisiológicas y estabilizan el dominio de tallo en su conformación natural de trímero, y (d) posteriormente eliminar proteolíticamente el dominio de cabeza, produciendo así una proteína HA del virus de la gripe sin cabeza soluble. En algunos aspectos, el método también implica primero identificar (al menos antes de la etapa (c)) una o más regiones en la proteína HA en las que la introducción de uno o más entrecruzamientos DT en la etapa (c) podría estabilizar la conformación del tallo en su conformación natural de trímero y/o estabilizar el tallo en una conformación que permite la unión de uno o más anticuerpos anti­ tallo ampliamente neutralizantes. En dichos métodos, la proteína HA del virus de la gripe soluble típicamente comprenderá uno o más motivos de reconocimiento de proteasas que se pueden usar para facilitar la eliminación proteolítica del dominio de cabeza, como se ha descrito antes y en otras secciones en esta solicitud.
En algunas realizaciones, los métodos para hacer complejos de proteínas de HA del virus de la gripe “sin cabeza” descritos en el presente documento, pueden comprender además llevar a cabo un análisis después de empezar o tras completarse la o las etapas de escisión proteolítica, para confirmar que el dominio de cabeza de la proteína HA del virus de la gripe se ha alterado o eliminado suficientemente. En algunas de dichas realizaciones, este análisis puede comprender, por ejemplo, llevar a cabo un ensayo de desplazamiento de movilidad en gel de SDS-PAGE o usar un anticuerpo específico de la cabeza.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos para hacer complejos de proteínas de HA del virus de la gripe “con cabeza” como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones los métodos para hacer complejos de proteínas de HA del virus de la gripe “con cabeza” comprenden: (a) expresar una proteína HA del virus de la gripe que comprende un dominio de tallo y un dominio de cabeza, (b) dejar que la proteína HA del virus de la gripe expresada se pliegue en su conformación natural que tiene un dominio de tallo trimérico, y (c) introducir uno o más entrecruzamientos fisiológicamente estables en la proteína HA en el tallo trimérico y opcionalmente también en el dominio de cabeza, produciendo así una proteína HA del virus de la gripe “con cabeza” genéticamente modificada, que tiene un dominio de tallo entrecruzado. Según la invención, los entrecruzamientos son entrecruzamientos ditirosina dirigidos. En algunas realizaciones los métodos para hacer complejos de proteínas de HA del virus de la gripe “sin cabeza” comprenden: (a) expresar una proteína HA del virus de la gripe que tiene una o más mutaciones “a tirosina” en posiciones dirigidas dentro de su dominio de tallo y opcionalmente en el dominio de cabeza, (b) dejar que la proteína HA del virus de la gripe se pliegue en su conformación natural que tiene un dominio de tallo trimérico y un dominio de cabeza, y (c) llevar a cabo una reacción de entrecruzamiento DT para entrecruzar restos de tirosina en el dominio de tallo y opcionalmente también en el dominio de cabeza, produciendo así una proteína HA del virus de la gripe “con cabeza” genéticamente modificada, que tiene un dominio de tallo con entrecruzamientos DT. En dichos métodos la proteína HA del virus de la gripe puede comprender uno o más motivos de reconocimiento de proteasas que se podrían usar, si se desea, para facilitar la posterior eliminación proteolítica del dominio de cabeza de la proteína “con cabeza” para generar una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza”.
Propiedades de polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe
En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación, incluyendo en particular aquellos que están entrecruzados como se describe en el presente documento, tienen determinadas propiedades estructurales, físicas, funcionales y/o biológicas. Dichas propiedades pueden incluir una o más de las siguientes, o cualquier combinación de las siguientes: presencia o ausencia de un dominio de cabeza, existencia del dominio de tallo e su conformación natural de trímero; estabilidad mejorada de la conformación natural de trímero del dominio de tallo (comparado con las proteínas HA del virus de la gripe no entrecruzadas); semivida mejorada de la proteína HA del virus de la gripe (comparado con las proteínas HA del virus de la gripe no entrecruzadas); termoestabilidad mejorada (comparado con las proteínas HA del virus de la gripe no entrecruzadas); vida en anaquel prolongada (comparado con las proteínas HA del virus de la gripe no entrecruzadas); semivida prolongada dentro del cuerpo de un sujeto (comparado con las proteínas HA del virus de la gripe no entrecruzadas); capacidad para ser almacenada en solución sin formación de agregados (incluyendo cuando está presente en una concentración alta en solución); agregación reducida en solución (comparado con las proteínas HA del virus de la gripe no entrecruzadas); unión a un anticuerpo; unión a un anticuerpo neutralizante; unión a un anticuerpo ampliamente neutralizante; unión a un anticuerpo específico de tallo; unión a un anticuerpo conformacionalmente específico; unión a un anticuerpo que reconoce el epítopo de dominio de tallo; unión a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en 6F12, C179, CR6261, F10, A66, y D8; unión a un receptor de linfocitos T; activación de un receptor de linfocitos B; producción de una respuesta de anticuerpos in vivo; producción de una respuesta de anticuerpos protectora in vivo; producción de la producción de anticuerpos neutralizantes in vivo; producción de la producción de anticuerpos ampliamente neutralizantes in vivo; producción de la producción de anticuerpos que reconocen epítopos neutralizantes cuaternarios (QNE) in vivo; producción de una respuesta de inmunitaria protectora in vivo; y/o producción de una respuesta inmunitaria humoral in vivo. En el caso de la unión a moléculas de anticuerpo, en algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se unen a los anticuerpos (tales como anticuerpos específicos del tallo y/o 6F12, C179, CR6261, F10, A66 y D8) con alta especificidad y/o con alta afinidad.
Ensayos de las propiedades
En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación, o cualquier producto intermedio en su fabricación, se pueden analizar para confirmar que tienen las propiedades deseadas, tales como las propiedades estructurales, físicas, funcionales y/o biológicas deseadas, tales como aquellas propiedades citadas antes o identificadas en otra parte en esta memoria descriptiva de patente. Por ejemplo, en algunas realizaciones se pueden llevar a cabo ensayos in vitro o in vivo para evaluar en una proteína HA del virus de la gripe la estructura conformacional, estabilidad (por ejemplo, termoestabilidad), semivida (por ejemplo, dentro del cuerpo de un sujeto), agregación en solución, unión a un anticuerpo (tal como un anticuerpo neutralizante, anticuerpo ampliamente neutralizante; anticuerpo específico del tallo; anticuerpo que reconoce epítopos del dominio de tallo, anticuerpos conformacionalmente específico, 6F12, C179, CR6261, F10, A66 y Da), unión a receptor de linfocitos B, activación de un receptor de linfocitos B, antigenicidad, inmunogenicidad, capacidad para producir una respuesta de anticuerpos, capacidad para producir una respuesta de anticuerpos/inmunitaria protectora, capacidad para producir la producción de anticuerpos neutralizantes, o capacidad para producir la producción de anticuerpos ampliamente neutralizantes. En realizaciones donde los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación se ensayan en un animal in vivo, el animal puede ser cualquier especie de animal adecuada, incluyendo un mamífero (tal como una especie de roedor (por ejemplo, un ratón o rata), un conejo, un hurón, una especie porcina, una especie bovina, una especie equina, una especie ovina o una especie de primate (por ejemplo, un ser humano o un primate no humano), o una especie de ave (tal como un pollo)).
Los ensayos para evaluar una estructura conformacional de una proteína son bien conocidos en la técnica y se puede usar cualquier ensayo adecuado, incluyendo, ensayos de análisis cristalográfico (por ejemplo, cristalografía de rayos X o cristalografía electrónica), análisis de sedimentación, ultracentrifugación analítica, microscopía electrónica (EM), criomicroscopía electrónica (crio-EM), tomografía crio-EM, resonancia magnética nuclear (RMN), dispersión de rayos X de ángulo pequeño, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y similares.
Los ensayos para evaluar la estabilidad de una proteína son bien conocidos en la técnica y se puede usar cualquier ensayo adecuado, incluyendo la electroforesis desnaturalizante y no desnaturalizante, calorimetría de titulación isotérmica, y experimentos de evolución temporal en los que las proteínas se incuban y se analiza a lo largo del tiempo en diferentes concentraciones de proteínas, temperaturas, pH o condiciones de oxidorreducción. Las proteínas también se pueden analizar en cuanto a la susceptibilidad a la degradación proteolítica.
Los ensayos para evaluar la unión de proteínas a anticuerpos son bien conocidos en la técnica, y se puede usar cualquier ensayo adecuado, incluyendo ensayos de inmunoprecipitación, ensayos de inmunoadsorción ligados a enzima (ELISA), ensayos de inmunoadsorción ligado a enzimas de puntos (ELISPOT), ensayos cristalográficos (incluyendo cocristalización con anticuerpos), ensayos de resonancia del plasmón de superficie (SPR), ensayos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), y similares.
Los ensayos para evaluar la actividad de neutralización son bien conocidos en la técnica, y se puede usar cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos para determinar la actividad neutralizante de anticuerpos o antisuero generado por vacunación/inmunización de animales con los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención. Los ensayos de neutralización conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a los descritos por Dey et al. 2007 (Dey et al., 2007, “Characterization of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Monomeric and Trimeric gp120 Glycoproteins Stabilized in the CD4-Bound State: Antigenicity, Biophysics, and Immunogenicity”. J Virol 81(11): 5579-5593) y Beddows et al., 2006 (Beddows et al., 2007, “A comparative immunogenicity study in rabbits of disulfide-stabilized proteolytically cleaved, soluble trimeric human immunodeficiency virus type 1 gp140, trimeric cleavage-defective gp140 and momomeric gp120”. Virol 360: 329-340).
Los ensayos para evaluar si un inmunógeno de vacuna es capaz de producir una respuesta inmunitaria y/o proporcionar inmunidad protectora, son bien conocidos en la técnica, y se puede usar cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos para determinar si la vacunación/inmunización de los animales con los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención proporciona una respuesta inmunitaria y/o inmunidad protectora frente a la infección por el virus de la gripe. En algunas realizaciones, se pueden hacer comparaciones entre los grupos de placebo y los de ensayo vacunados, con respecto a sus tasas de infección o seroconversión o cargas víricas.
Los ensayos para evaluar la farmacocinética y biodistribución de una proteína también son bien conocidos en la técnica, y se puede usar cualquier ensayo adecuado para evaluar las propiedades de los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención.
Composiciones
La presente divulgación proporciona composiciones que comprenden cualquiera de los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de Ha del virus de la gripe descritos en el presente documento. En algunas realizaciones dichas composiciones pueden ser composiciones inmunógenas, composiciones de vacunas y/o composiciones terapéuticas. En algunas realizaciones, dichas composiciones se pueden administrar a sujetos. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe descritos en el presente documento se pueden presentar en partículas similares a virus “VLP.”
En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación se pueden proporcionar en una composición que comprende uno o más componentes activos adicionales, tales como uno o más inmunógenos de vacuna o agentes terapéuticos adicionales. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación se pueden proporcionar en una composición que comprende uno o más de otros componentes, que incluyen vehículos farmacéuticamente aceptables, adyuvantes, agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH, conservantes y/o cualquier otro componente adecuado para el uso previsto de las composiciones. Dichas composiciones pueden tener la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones y similares. La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye diversos diluyentes, excipientes y/o soportes en los que, o con los que se pueden proporcionar los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención. La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye vehículos que se sabe que son seguros para el suministro a sujetos humanos y/u otros animales, y/o aprobados por la agencia reguladora del gobierno federal o estatal, y/o citado en la farmacopea de EE.UU., y/u otras farmacopeas generalmente reconocidas, y/o que recibe aprobación específica o individual de una o más de las agencias reguladoras generalmente reconocidas para usar en seres humanos y/u otros animales. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen agua, soluciones acuosas (tales como soluciones salinas, tampones y similares), disolventes orgánicos (tales como determinados alcoholes y aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo) y similares. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención también comprenden uno o más adyuvantes. Los adyuvantes de ejemplo incluyen adyuvantes inorgánicos u orgánicos, adyuvantes basados en aceite, virosomas, liposomas, lipopolisacáridos (LPS), jaulas moleculares para antígenos (tales como complejos inmunoestimuladores (“ ISCo MS”)), micelas de saponina/colesterol modificadas con Ag que forman estructuras de tipo jaula estables que son transportadas a los ganglios linfáticos de drenaje), componentes de la pared celular bacteriana, ácidos nucleicos endocitosados (tales como ARN bicatenario (ARNbc), ADN monocatenario (ADNmc), y ADN que contiene el dinucleótido CpG no metilado), AUM, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio y escualeno. En algunas realizaciones se usan virosomas como adyuvante. Los adyuvantes disponibles en el mercado adicionales que se pueden usar de acuerdo con la presente divulgación incluyen, el sistema adyuvante Ribi (RAS, una emulsión de aceite en agua que contiene endotoxina detoxificada (MPL) y componentes de la pared celular micobacteriana en escualeno al 2 % (Sigma M6536)), TiterMax (un adyuvante de agua en aceite metabolizable, estable (CytRx Corporation 150 Technology Parkway Technology Park/Atlanta Norcross, Georgia 30092)), formulación adyuvante Syntex (SAF, una emulsión de aceite en agua estabilizada por Tween 80 y copolímero de bloques de polioxietileno/polioxipropileno plurónico L121 (Chiron Corporation, Emeryville, CA)), adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, ALUM -hidróxido de aluminio, Al(OH)3 (disponible como Alhydrogel, Accurate Chemical & Scientific Co, Westbury, NY), SuperCarrier (Syntex Research 3401 Hillview Ave. P.O. Box 10850 Palo Alto, CA 94303), Elvax 40W1,2 (un copolímero de etileno-acetato de vinilo (DuPont Chemical Co. Wilmington, DE)), coprecipitado de L-tirosina con un antígeno (disponible en numerosas empresas químicas); Montanide (un oleato de manida, ISA Seppic Fairfield, NJ)), AdjuPrime (un polímero hidrato de carbono), proteína absorbida en nitrocelulosa, adyuvante Gerbu (C-C Biotech, Poway, CA), y similares.
En algunas realizaciones, las composiciones de la divulgación comprenden una “cantidad eficaz” de un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención. Una “cantidad eficaz” es una cantidad necesaria para lograr un resultado final deseado. Los ejemplos de resultados finales deseados incluyen, pero no se limitan a la generación de una respuesta inmunitaria humoral, la generación de una respuesta de anticuerpos neutralizantes, la generación de una respuesta de anticuerpos ampliamente neutralizantes, y la generación de inmunidad protectora. La cantidad de un polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención que es eficaz para lograr el resultado final deseado dependerá de una variedad de factores que incluyen el tipo, subtipo y cepa del virus de la gripe contra el cual se busca protección o algún otro efecto terapéutico, la especie del sujeto previsto (por ejemplo, si es una especie humana o alguna otra especie animal), la edad y/o el sexo del sujeto previsto, la vía de administración planificada, la pauta posológica planificada, la gravedad de cualquier infección de gripe en curso (por ejemplo, en el caso de usos terapéuticos) y similares. La cantidad eficaz, que puede ser un intervalo de cantidades eficaces, puede determinarse mediante técnicas convencionales sin ninguna experimentación indebida, por ejemplo usando ensayos in vitro y/o ensayos in vivo en las especies objeto pretendidas o cualquier especie modelo animal adecuada. Los ensayos adecuados incluyen los que implican extrapolación de curvas de dosis-respuesta y/u otros datos de los sistemas modelo in vitro y/o in vivo. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz se puede determinar de acuerdo con el criterio de un profesional médico o veterinario basado en las circunstancias específicas.
Usos de los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación
En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación pueden ser útiles como herramientas de investigación, como herramientas de diagnóstico, como agentes terapéuticos, como dianas para la producción de reactivos de anticuerpos o anticuerpos terapéuticos, y/o como vacunas o componentes de composiciones de vacunas. Por ejemplo, en algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación son útiles como inmunógenos de vacunas en sujetos animales, tales como sujetos mamíferos, incluyendo seres humanos. Estos y otros usos de los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se describen de forma más completa más adelante. Los expertos en la técnica apreciarán que los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación pueden ser útiles para una variedad de otras aplicaciones también, y todas dichas aplicaciones y usos está previsto que estén dentro del alcance de esta divulgación.
Herramientas para estudiar los anticuerpos contra HA del virus de la gripe
En una realización los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas del virus de la gripe de la invención pueden ser útiles como analitos para ensayar y/o medir la unión de, y/o títulos de anticuerpos anti-HA, por ejemplo en ensayos ELISA, ensayos de unión Biacore/SPR y/u otros ensayos para la unión de anticuerpos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se podrían usar para analizar y/o comparar la eficacia de anticuerpos anti-HA.
Herramientas para la generación de anticuerpos
Los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación (incluyendo cualquier producto intermedio y/o variante producido durante la fabricación de los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe) también pueden ser útiles para la generación de anticuerpos terapéuticos y/o anticuerpos que se pueden usar como herramientas de investigación o para cualquier otro uso deseado. Por ejemplo, los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se pueden usar para inmunizaciones para obtener anticuerpos contra la proteína HA del virus de la gripe para usar como herramientas de investigación y/o productos terapéuticos. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se pueden usar para inmunizar un animal no humano, tal como un vertebrado, incluyendo un ratón, rata, cobaya, conejo, cabra, primate no humano, etc. con el fin de generar anticuerpos. Dichos anticuerpos, que pueden ser monoclonales o policlonales y/o células que producen dichos anticuerpos, se pueden obtener entonces del animal. Por ejemplo, en algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se pueden usar para inmunizar un ratón y producir y obtener anticuerpos monoclonales y/o hibridomas que producen dichos anticuerpos monoclonales. Dichos métodos se pueden llevar a cabo usando métodos convencionales conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales de ratón, incluyendo métodos convencionales para la producción de hibridomas. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se pueden usar para la producción de un anticuerpo quimérico (por ejemplo, parte humano), humanizado o completamente humano, por ejemplo usando cualquiera de los métodos actualmente conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos quiméricos, humanizados y completamente humanos, incluyendo métodos de injerto de CDR, métodos de presentación en fago, métodos de ratones transgénicos (por ejemplo, usando un ratón que se ha alterado genéticamente para permitir la producción de anticuerpos totalmente humanos, tales como el Xenomouse) y/o cualquier otro método adecuado conocido en la técnica. Los anticuerpos contra los polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención hechos usando dichos sistemas se pueden caracterizar de forma antigénica usando uno o un conjunto de varios antígenos, preferiblemente que incluyen los propios polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención. La caracterización adicional de dichos anticuerpos se puede llevar a cabo mediante cualquier método convencional conocido por un experto en la técnica, que incluye métodos basados en ELISA, métodos basados en SPR, métodos bioquímicos (tales como, determinación del punto isoeléctrico) y métodos conocidos en la técnica para estudiar la biodistribución, seguridad y eficacia de los anticuerpos, por ejemplo, en estudios preclínicos y clínicos.
Administración a sujetos
La presente solicitud da a conocer métodos que comprenden administrar los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación (o composiciones que comprenden dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe) a sujetos. Dichos métodos pueden comprender métodos para tratar individuos que tienen el virus de la gripe (es decir, métodos terapéuticos) y/o métodos para proteger a los individuos contra futuras infecciones por el virus de la gripe (es decir, métodos profilácticos).
Los sujetos a los que se pueden administrar los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación, o composiciones que comprenden dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe (por ejemplo en el curso de un método de tratamiento o un método de vacunación) incluyen todas y cada una de las especies animales, incluyendo, en particular, aquellas que son susceptibles a la infección por el virus de la gripe o que pueden proporcionar sistemas animales modelo para el estudio de la infección por el virus de la gripe. En algunas realizaciones, los sujetos son especies de mamíferos. En algunas realizaciones, los sujetos son especies de aves. Los sujetos mamíferos incluyen, pero no se limitan a seres humanos, primates no humanos, roedores, conejos y hurones. Las aves incluyen, pero no se limitan a pollos, tales como los de granjas de aves de corral. En algunas realizaciones, los sujetos a los que se administran los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación, o composiciones que comprenden dichos polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe, bien tienen gripe, o están en riesgo de tener una infección de gripe, por ejemplo debido a la edad del sujeto y/o a afecciones médicas subyacentes. En algunas realizaciones, el sujeto está inmunocomprometido. En algunas realizaciones, el sujeto tiene enfermedad cardíaca, enfermedad pulmonar, diabetes, enfermedad renal, demencia, apoplejía y/o enfermedad reumatológica. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano de más de aproximadamente 50 años de edad, más de aproximadamente 55 años de edad, más de aproximadamente 60 años de edad, más de aproximadamente 65 años de edad, más de aproximadamente 70 años de edad, más de aproximadamente 75 años de edad, más de aproximadamente 80 años de edad, más de aproximadamente 85 años de edad, o más de aproximadamente 90 años de edad. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano de menos de aproximadamente 1 mes de edad, menos de aproximadamente 2 meses de edad, menos de aproximadamente 3 meses de edad, menos de aproximadamente 4 meses de edad, menos de aproximadamente 5 meses de edad, menos de aproximadamente 6 meses de edad, menos de aproximadamente 7 meses de edad, menos de aproximadamente 8 meses de edad, menos de aproximadamente 9 meses de edad, menos de aproximadamente 10 meses de edad, menos de aproximadamente 11 meses de edad, menos de aproximadamente 12 meses de edad, menos de aproximadamente 13 meses de edad, menos de aproximadamente 14 meses de edad, menos de aproximadamente 15 meses de edad, menos de aproximadamente 16 meses de edad, menos de aproximadamente 17 meses de edad, menos de aproximadamente 18 meses de edad, menos de aproximadamente 19 meses de edad, menos de aproximadamente 20 meses de edad, menos de aproximadamente 21 meses de edad, menos de aproximadamente 22 meses de edad, menos de aproximadamente 23 meses de edad, o menos de aproximadamente 24 meses de edad.
Se conocen diversos sistemas de suministro en la técnica y se puede usar cualquier sistema de suministro adecuado para administrar las composiciones de la presente invención a los sujetos. Dichos sistemas de suministro incluyen sistemas de suministro intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutáneo, intranasal, epidural y oral. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. También se puede usar la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante.
En algunas realizaciones, puede ser conveniente administrar las composiciones farmacéuticas de la divulgación localmente a un tejido en el que el polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe puede ser más eficaz para generar un resultado deseado. Esto puede lograrse mediante, por ejemplo, infusión local, inyección, suministro usando un catéter, o mediante un implante, tal como un implante poroso, no poroso o gelatinoso o un implante que comprende una o más membranas (tales como membranas de silastic) o fibras desde o a través de las cuales se pueden liberar localmente la proteína o complejos de proteínas. En algunas realizaciones se puede usar un sistema de liberación controlada. En algunas realizaciones se puede usar una bomba (véase, Langer, véase antes; Sefton, 1987. CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980. Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989. N. Engl. J. Med. 321: 574). En algunas realizaciones, se pueden usar materiales poliméricos para facilitar y/o controlar la liberación del polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974. CRC Pres., Boca Raton, Florida; Controlled Drug Bioavailability, 1984. Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York; Ranger y Peppas, 1983 Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; véase también Levy et al., 1985. Science 228:190; During et al, 1989. Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989. J. Neurosurg 71:105). En algunas realizaciones, un sistema de liberación controlada se puede poner cerca del tejido/órgano al que se va a suministrar el polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe (véase, por ejemplo, Goodson, 1984. Medical Applications of Controlled Release, véase antes, vol. 2: 115-138). Se describen algunos sistemas de liberación controlada adecuados que se pueden usar junto con la presente invención en Langer, 1990, Science; vol.
249: pág. 527-1533
En algunas realizaciones, la administración del polipéptido, proteína y/o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe de la invención se puede llevar a cabo conjuntamente con la administración de uno o más agentes inmunoestimuladores. Los ejemplos no limitativos de dichos agentes inmunoestimuladoras incluyen diversas citoquinas, linfoquinas y quimioquinas con actividades inmunoestimuladora, inmunopotenciadora y proinflamatoria, tales como interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); factores de crecimiento (por ejemplo, factor estimulador de colonias (CSF) de granulocitos y macrófagos (GM)); y otros agentes inmunoestimuladores, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando de Flt3, B7.1; B7.2. Los agentes inmunoestimuladores se pueden administrar en la misma formulación que la proteína o polipéptido de HA del virus de la gripe o se pueden administrar por separado.
En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación, o composiciones que los comprenden, se pueden administrar a sujetos en una variedad de métodos o regímenes de vacunación contra el virus de la gripe. En algunas de dichas realizaciones, se prefiere la administración de una sola dosis. Sin embargo, en otras realizaciones, se pueden administrar dosis adicionales, por la misma o diferente vía, para lograr el efecto profiláctico deseado. En recién nacidos y bebés, por ejemplo, pueden requerirse múltiples administraciones para producir suficientes niveles de inmunidad. La administración puede continuar a intervalos a lo largo de la infancia, según sea necesario para mantener niveles suficientes de protección contra la infección por el virus de la gripe. De forma similar, los adultos que son particularmente susceptibles a la infección por el virus de la gripe, tales como, los ancianos y los individuos inmunocomprometidos, pueden requerir múltiples inmunizaciones para establecer y/o mantener respuestas inmunitarias protectoras. Los niveles de inmunidad inducida se pueden controlar, por ejemplo, midiendo las cantidades de anticuerpos secretores y séricos neutralizantes, y las dosis se pueden ajustar o repetir las vacunaciones según sea necesario para producir y mantener los niveles deseados de protección.
En algunas realizaciones, los regímenes de dosificación pueden comprender una única administración/inmunización. En otras realizaciones, los regímenes de dosificación pueden comprender múltiples administraciones/inmunizaciones. Por ejemplo, las vacunas se pueden dar como una inmunización primaria seguido de uno o más refuerzos. En algunas realizaciones de la presente divulgación se puede usar dicho régimen de vacunación de sensibilización-refuerzo. Por ejemplo, en algunos de dichos regímenes de sensibilización-refuerzo se puede administrar una composición que comprende un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe como se describe en el presente documento, a un individuo en múltiples ocasiones (tal como dos, tres o incluso más ocasiones) separadas en el tiempo, siendo la primera administración la administración de “sensibilización” y siendo las administraciones posteriores administraciones de “refuerzo”. En otro de dichos regímenes de sensibilización-refuerzo se puede administrar una composición que comprende un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe como se describe en el presente documento a un individuo después de administrar primero al individuo una composición que comprende un vector vírico o de ADN que codifica un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe como una administración de “sensibilización”, con una o más administraciones posteriores de “refuerzo” de una composición que comprende un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de HA del virus de la gripe como se describe en el presente documento. Los refuerzos se pueden suministrar por la misma y/o diferente vía que la inmunización primaria. Los refuerzos en general se administran después de un periodo de tiempo después de la inmunización primaria o el refuerzo administrado previamente. Por ejemplo, se puede dar un refuerzo aproximadamente dos semanas o más después de una inmunización primaria, y/o se puede dar un segundo refuerzo aproximadamente dos semanas o más después de los primeros refuerzos. Se pueden administrar refuerzos repetidamente en periodos de tiempo, por ejemplo, de aproximadamente dos semanas o más a lo largo de toda la vida de un sujeto. Los refuerzos se pueden separar, por ejemplo, aproximadamente dos semanas, aproximadamente tres semanas, aproximadamente cuatro semanas, aproximadamente un mes, aproximadamente dos meses, aproximadamente tres meses, aproximadamente cuatro meses, aproximadamente cinco meses, aproximadamente seis meses, aproximadamente siete meses, aproximadamente ocho meses, aproximadamente nueve meses, aproximadamente diez meses, aproximadamente once meses, aproximadamente un año, aproximadamente un año y medio, aproximadamente dos años, aproximadamente dos años y medio, aproximadamente tres años, aproximadamente tres años y medio, aproximadamente cuatro años, aproximadamente cuatro años y medio, aproximadamente cinco años o más después de una inmunización primaria o después de un refuerzo previo.
Las formulaciones farmacéuticas unitarias preferidas son las que contienen una dosis o unidad (por ejemplo, una cantidad eficaz), o una fracción adecuada de la misma, de los polipéptidos, proteínas y/o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación. Además de dichos ingredientes, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes comúnmente usados por un experto en la técnica. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas por la divulgación se pueden presentar convenientemente en formas farmacéuticas unitarias preferidas preparadas usando técnicas farmacéuticas convencionales. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar el principio activo y el o los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables u otros ingredientes. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el principio activo con vehículos líquidos. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y se pueden almacenar en un estado liofilizado (congelación-secado) que solo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de usar. Se pueden preparar soluciones y suspensiones extemporáneas para inyección a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles usados habitualmente por los expertos en la técnica.
Kits
La presente solicitud da a conocer además kits que comprenden los polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas de HA del virus de la gripe de la divulgación, o composiciones que comprenden dichos polipéptidos, proteínas o complejos de proteínas. Para facilitar el uso de las composiciones de la invención, cualquiera de los componentes y/o composiciones descritas en el presente documento, y componentes adicionales útiles para fines experimentales o terapéuticos o de vacunas, se pueden envasar en forma de un kit. Típicamente, el kit contiene, además de los componentes anteriores, materiales adicionales que pueden incluir, por ejemplo, instrucciones para usar los componentes, material de envasado, un recipiente y/o un dispositivo de suministro.
Diferentes realizaciones de la presente invención también se pueden describir con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Los números entre corchetes/paréntesis en la sección de ejemplos de la presente solicitud son citas a las referencias numeradas proporcionadas como una lista de referencias en el presente documento.
Ejemplo 1
Las poblaciones de los Estados Unidos y del mundo continúan en riesgo de un brote de gripe pandémica, y el uso del virus de la gripe como arma sigue siendo una importante amenaza de guerra biológica/terrorismo. [23,24]. Un inmunógeno de vacuna basado en HA del virus de la gripe capaz de producir respuestas de anticuerpos contra los QNE del tallo conservados, en lugar de la cabeza inmunodominante de la HA, se espera que dé lugar a anticuerpos ampliamente neutralizantes que podrían proteger frente a la exposición de virus homólogos (H1N1), así como la variante de deriva de homólogos, heterólogos del grupo 1 (H5N1), y heterólogos del grupo 2 (H3N2). Por lo tanto, un solo inmunógeno universal podría producir respuestas inmunitarias protectoras contra el virus de la gripe estacional, pandémico y usado como arma. Destacar el impacto comercial y en salud pública que el virus de la gripe tiene en la población es el hecho por el que hoy en día las compañías de seguros de vida en Estados Unidos tienen la obligación de mantener un capital contra una potencial recurrencia de la pandemia de la gripe española de 1918 (Oliver, Wyman, & Co, 2012 & [25]). El procedimiento descrito en el presente documento tiene el potencial de proporcionar una vacuna para la gripe ampliamente protectora que podría permitir el almacenamiento de grandes cantidades de productos de vacunas y eliminar las amenazas reales que derivan de los tiempos de aumento en la fabricación necesarios para enfrentar cada nueva amenaza.
Las vacunas actuales contra el virus de la gripe protegen mayoritariamente contra cepas de virus homólogos, requiriendo que se ajusten los nuevos cócteles de vacuna trivalente estacionalmente con las cepas circulantes. La protección se debe principalmente a los anticuerpos de alta afinidad contra la hemaglutinina (HA), y a menudo es específica de la cepa debido a que la respuesta inmunitaria se centra predominantemente contra el dominio de cabeza inmunodominante, altamente variable de la proteína HA. Sin embargo, el tallo de la HA está altamente conservado a lo largo de las cepas de virus de la gripe, y ahora pruebas considerables sugieren que mejores respuestas contra las regiones conservadas del tallo proporcionarían una protección más amplia [1 - 4]. La inmunización con ADN que codifica la HA produce respuestas de Ab específicos del tallo predominantemente, y recientemente se han descrito datos que muestran protección heterosubtípica limitada por vacunación con ADN de HA por electroporación [5]. Además, la vacunación con un inmunógeno basado en proteína HA “sin cabeza” (“HA sin cabeza”, una construcción de la cual se elimina el dominio de cabeza variable) produce la inducción de respuestas de Ab con actividad de unión heterosubtípica significativamente potenciada [1,6]. Una combinación de sensibilización-refuerzo de un vector vírico o de ADN que codifica la HA, seguido de un refuerzo de proteínas sin cabeza mantiene la promesa de generar respuestas ampliamente heteroespecíficas que dan protección de larga duración. Sin embargo, actualmente todavía sigue siendo difícil de encontrar una buena protección contra exposiciones heterólogas [7 -10].
Se ha centrado una atención significativa en la identificación y caracterización de anticuerpos ampliamente neutralizantes (“bnAb”) con el fin de producir por ingeniería inversa un inmunógeno capaz de producir respuestas de anticuerpos similares [9,11]. Se han descrito una serie de estos bnAb, y los más potentes se unen a epítopos específicos de complejo/conformación, conservados, que son presentados en el tallo conservado de los trímeros de hA del virus de la gripe, pero no en promotores del mismo complejo [7,12,13]. El aislamiento de estos Ab humanos demuestra que una vacuna ampliamente protectora es, de hecho, un objetivo que se puede lograr (un “promotor” es una subunidad del trímero, que es el mismo un heterodímero HA1/HA2). Estos epítopos específicos de trímero/complejo se llaman por lo tanto epítopos neutralizantes cuaternarios (QNE), y se cree que representan sitios clave de vulnerabilidad de los virus de la gripe, puesto que tienen el potencial de producir bnAb cuaternarios potentes. [14,15]. Solo el tallo trimérico intacto presenta el QNE ampliamente protector (véase figura 2). Una construcción sin cabeza que está bloqueada en su conformación natural, trimérica, y que se une a los bnAb cuaternarios potentes y ampliamente protectores podría proporcionar un inmunógeno del virus de la gripe universal y podría producir bnAb potentes en los sujetos vacunados.
Recientemente, se ha mostrado que un inmunógeno de hemaglutinina del virus de la gripe sin cabeza (“HA sin cabeza”) produce respuestas de anticuerpos (“Ab”) centradas en la región de tallo altamente conservada de la hemaglutinina del virus de la gripe (HA) que tienen una amplia reactividad cruzada. Ha quedado claro también que los Ab más potentes y ampliamente neutralizantes/protectores (bnAb) contra la región de tallo son específicos de trímero (es decir, reconocen la estructura cuaternaria del tallo), y que sus epítopos cuaternarios correspondientes no son presentados cuando se elimina la cabeza de la HA del virus de la gripe. En ausencia del dominio de cabeza, el trímero del tallo aparentemente se deshace. La presente invención proporciona un inmunógeno de HA sin cabeza en el que la conformación trimérica de la región de tallo es estabilizada o “bloqueada conformacionalmente”, por ejemplo, introduciendo entrecruzamientos dirigidos, antes de eliminar proteolíticamente la cabeza. Este inmunógeno de HA sin cabeza debe retener la unión a los bnAb cuaternarios y presentar epítopos neutralizantes cuaternarios (“QNE”) como en el inmunógeno del virus de la gripe. Dicho trímero de HA sin cabeza conformacionalmente bloqueado puede posibilitar el objetivo largamente buscado de una protección amplia contra los virus de la gripe a partir de un solo régimen de vacunación.
La tecnología de estabilización de ditirosina (“DT”) mínimamente modificadora, introduce enzimáticamente enlaces DT seguros, dirigidos, de longitud cero e irreversibles, que bloquean las proteínas y complejos en las conformaciones naturales. La aplicación de esta tecnología conserva totalmente la estructura de la proteína y evita la agregación porque los enlaces DT no se forman espontáneamente. Los enlaces solo se forman entre cadenas laterales de Tyr en una estrecha proximidad estructural, y se introducen después de que la proteína se ha plegado totalmente y esté en su estado natural. Los entrecruzamientos DT dirigidos permiten diseñar un inmunógeno de vacuna del virus de la gripe mejorado, bloqueando conformacionalmente los QNE para maximizar la protección amplia.
Los métodos descritos en el presente ejemplo implican 3 etapas. La primera etapa implica expresar la HA del virus de la gripe de longitud completa, soluble, con sustituciones “a Tyr” en posiciones dirigidas dentro de la región de tallo. La segunda etapa implica la introducción de entrecruzamientos DT estabilizantes. Y la tercera etapa implica eliminar proteolíticamente el dominio de cabeza de la HA del virus de la gripe con el fin de centrar las respuestas inmunitarias en los QNE de la HA sin cabeza-DT.
Estudios preliminares usando un trímero de Env del VIH soluble, recombinante, han demostrado que el entrecruzamiento DT se puede usar para bloquear conformacionalmente el inmunógeno Env en su conformación natural, de trímero, de modo que mejora la unión a los bnAb cuaternarios del VIH más potentes, análogos a los bnAb anti-tallo cuaternarios de la gripe, demostrando que este procedimiento es factible. Env del VIH y HA sin cabeza del virus de la gripe son muy análogos en cuanto que ambos son trímeros inestables cuando se expresan de forma recombinante; y en que en ambos los QNE clave solo son presentados en el complejo trimérico natural. En otros estudios preliminares, se han introducido satisfactoriamente enlaces DT dirigidos en el tallo la HA del virus de la gripe.
El entrecruzamiento DT de una construcción de HA PR8 recombinante en su conformación natural de trímero, se puede llevar a cabo para confirmar la unión a los bnAb clave, y posteriormente el dominio de “cabeza” se puede eliminar mediante modificación genética de sitios de escisión proteolítica, mientras que se mantiene la conformación antigénica natural, bloqueada por DT del trímero del tallo. El inmunógeno de HA sin cabeza resultante se puede ensayar para confirmar que produce una protección amplia en un modelo de ratón C57BL/6. El ensayo preclínico de la eficacia se puede realizar en un modelo de exposición letal de hurones altamente predictivo. El ensayo preclínico de seguridad se puede realizar en conejos.
Entrecruzamiento DT dirigido
Mediante la generación de trímeros de HA naturales, solubles y recombinantes y la aplicación de “grapas” de ditirosina (DT) dirigidas para entrecruzar covalentemente interacciones de trimerización en el tallo del trímero, se obtendrán por modificación genética trímeros de HA estabilizados por DT con perfiles antigénicos completamente conservados. La estabilización covalente del trímero en la región de tallo de la HA se obtendrá por modificación genética para hacer estable la estructura cuaternaria del tallo, y esto permitirá la posterior eliminación proteolítica de la cabeza mientras que se conservan los QNE del tallo. Se introducen enlaces DT para estabilizar el complejo después de que la proteína/complejo se ha plegado completamente, y por lo tanto bloquean la conformación natural, a la vez que se mantiene la integridad funcional estructural de la proteína [16 - 18]. Estos entrecruzamientos seguros, irreversibles y de longitud cero se forman solo entre restos de Tyr en una estrecha proximidad estructural, y no distorsionan la estructura de la proteína. Tampoco causan la formación de agregados no específicos, como se observa con los enlaces disulfuro [17,19 - 22]. La tecnología de entrecruzamientos DT dirigidos se puede aplicar para estabilizar covalentemente un trímero de HA soluble en su conformación correctamente plegada, y después se puede determinar si, de hecho, presenta QNE claves. Posteriormente se puede eliminar la cabeza inmunodominante introduciendo sitios de escisión de proteasas específicos de secuencia, usando la tolerancia del bucle variable para la variación de aminoácidos y la información reunida del análisis de mutagénesis basado en transposones de hA. La presentación de QNE en la HA sin cabeza se espera que mejore tras la amplitud de la protección en estudios de exposición letal con virus heterólogos y variantes de deriva. El trabajo previo de los autores de la invención en el VIH muestra que multímeros altamente glucosilados (por ejemplo, Env de VIH) pueden ser bloqueados eficazmente juntos por los entrecruzamientos DT en diferentes localizaciones dentro del trímero de Emv escindido, mientras que se mantiene la estructura cuaternaria relevante y la antigenicidad.
Bloqueo conformacional del complejo trimérico de HA del virus de la gripe
La espícula de la envuelta del VIH trimeriza a través de interacciones bien caracterizadas en su base, así como interacciones en la punta de la espícula [33, 34]. Con el fin de estabilizar las interacciones de trimerización en la punta de la espícula, se introdujeron sustituciones de tirosina y la proteína se expresó, purificó y se realizaron entrecruzamientos DT. Por fluorescencia, se identificaron 7 variantes que forman entrecruzamientos intermoleculares de trimerización con un promedio de 80 % de eficacia antes de cualquier optimización, cuando se cuantificaba usando longitudes de onda de excitación (320 nm) y emisión (405 nm) específicas de DT. Se ensayó la capacidad de estas construcciones para unir bnAb específicos de trímero y conformación. El entrecruzamiento DT conserva completamente la unión del bnAb anti-sitio de unión de CD4 b12, que se une tanto a promotores como a trímeros, y el bnAb anti-V2 PG9, que se une preferiblemente a trímeros, pero también se une a monómeros. Además, el bloqueo conformacional también reduce significativamente la unión a mAb no neutralizantes, tales como b6 y b13, en ensayos ELISA. La posición de los enlaces DT se confirmó por MS/MS de fragmentos trípticos del trímero DT-Env. Lo que es más importante, se encontró que un trímero de Env de VIH conformacionalmente bloqueado se une significativamente mejor a uno de los bnAb anti-Env VIH más extremadamente potente y ampliamente neutralizante, PG16, en comparación con el promotor WT; el epítopo PG16 solo se presenta en el trímero de la envuelta del VIH natural/funcional [28]. La unión mejorada de PG16 se correlaciona con una reducción significativa en la unión a un mAb anti-V2 poco neutralizante, CH58, que se une a un confórmero en hélice a de un epítopo que se superpone al que se une PG16 como una lámina p. La siguiente etapa con el trímero de Env del VIH soluble bloqueado por DT, será ensayarlo en experimentos de inmunogenicidad en animales.
Se analizó la HA del virus de la gripe, la estructura trimérica de la proteína HA en el complejo con el bnAb CR6261. Se identificaron inicialmente cinco ejemplos de posibles variantes de HA (N403Y_D429Y; N403Y_L432Y; N403Y_D433Y; N406Y_D429Y; y N406Y_D433Y), cada una con dos mutaciones puntuales que se predijo que formaban enlaces intermoleculares y estabilizaban el trímero del tallo en el extremo distal de la membrana/proximal de la cabeza (véase el esquema para el diseño en la figura 3) sin alterar el epítopo cuaternario de CR6261. Se generaron vectores de expresión que codifican cuatro de estas variantes, y las variantes se expresaron y sometieron a condiciones de entrecruzamiento. Se usó espectrofluorometría para determinar si estas variantes estaban formando enlaces DT, usando las longitudes de onda de excitación y emisión específicas de DT a las que los enlaces DT fluorescen con fuerza en proporción directa a su concentración molar. Las cuatro variantes, pero no lo HA silvestre, formaban enlaces DT de forma eficaz (figura 4). Basándose en la comparación con el control positivo (insulina) y una referencia de DT, se calcula una eficacia de entrecruzamiento >70 % para las cuatro de estas construcciones antes de cualquier optimización [35].
Eliminación de la cabeza de HA de la HA conformacionalmente bloqueada
La eliminación proteolítica del dominio de cabeza de la HA del trímero de HA bloqueado por DT requiere la modificación genética de motivos de reconocimientos en el dominio de cabeza de HA1 para una proteasa específica de sustrato (por ejemplo, TEV). Usando un cribado de mutagénesis basada en transposones, se han identificado cuatro regiones dentro de la cabeza globular de HA1 PR8 que toleran la inserción de secuencias extrañas aproximadamente del mismo tamaño que un sitio de la proteasa TEV genéticamente modificado. Sin más optimización, dos de estas regiones (localizadas en los restos de aminoácidos 128 y 223) permitirían la escisión proteolítica de 3 de los 4 sitios antigénicos principales en la cabeza globular de PR8, los sitios Sa, Ca, y Sb [36]. El sitio Cb restante también se eliminará. Los virus con inserciones en estos sitios en HA1 siguen siendo capaces de fusión y por lo tanto el complejo de HA permanece funcionalmente intacto. Después se llevará a cabo la reacción proteolítica.
Estos datos demuestran que el procedimiento de bloquear junto el trímero de HA en el tallo, y posteriormente eliminar el dominio de cabeza inmunodominante, conservará los QNE relevantes para la vacuna de la HA sin cabeza, y bloqueará el inmunógeno en una conformación antigénicamente favorable. Esto, a su vez, sugiere que el o los trímeros sin cabeza bloqueados por DT descritos en el presente documento se espera que induzcan respuestas de anticuerpos ampliamente protectoras in vivo.
Bloqueo conformacional del complejo trimérico de HA del virus de la gripe
Diseño experimental. Se expresarán formas solubles (por ejemplo, que carecen del dominio transmembrana y tienen el motivo de trimerización foldon de T4) de la HA WT y variantes descritas antes, en células SF9 o Hi5 como proteínas secretadas y se purificarán por métodos bien establecidos [37 - 38]. El efecto antigénico de las sustituciones a Tyr y el entrecruzamiento DT se determinarán en ensayos ELISA usando un panel de mAb ampliamente neutralizantes anti-tallo de HA (por ejemplo, 6F12, C179, CR6261, F10, A66 y d8), puesto que cambios estructurales causados por las sustituciones a Tyr pueden reducir o potenciar la unión a algunos de estos anticuerpos. Métodos: Ensayos de unión de curva completos compararán la HA WT con las variantes de HA no entrecruzadas y entrecruzadas. Los cambios en la unión se determinarán usando análisis de regresión no lineal (software Graphpad) de las curvas de unión para calcular y comparar los valores de CE50 para cada construcción con cada mAb. La formación de enlaces intermoleculares se confirmará por desplazamiento en gel en SDS-PAGE reductora (transferencia Western/Coomassie; los enlaces DT no se reducen); el entrecruzamiento DT se cuantificará por espectrofluorometría, como se ha descrito antes. Dichos métodos se pueden usar para producir variantes de HA que forman enlaces DT intermoleculares, y que retienen la unión a bnAb cuaternarios anti-tallo claves igual que la HA PR8 silvestre, después de entrecruzamiento del inmunógeno del virus de la gripe genéticamente modificado. Eliminación proteolítica de la cabeza de HA de la HA conformacionalmente bloqueada
Se pueden insertar secuencias de reconocimiento de PreScission Protease (LEVLFQGP (SEQ ID NO: 69) (escisión entre los restos Q y G) y/o secuencias de reconocimiento de TEV (ENLYFQG (SEQ ID NO: 70) (escisión entre los restos Q y G) y ENLYFQs (SEQ ID NO: 71) (escisión entre los restos G y S)) en posiciones definidas (por ejemplo, restos de aminoácidos 128 y 223) o adicionales para eliminar la mayor parte de la cabeza globular del precursor de HA expresado en baculovirus, purificado, completamente plegado, estabilizado por DT, soluble. Después de confirmación antigénica, se pueden llevar a cabo el análisis de aminoácidos y espectrometría de masas para caracterizar bioquímicamente la molécula entrecruzada.
La proteolisis del dominio de cabeza se puede llevar a cabo por procedimientos bioquímicos convencionales y se puede ensayar por desplazamiento por electromovilidad en SDS-PAGE desde un peso molecular que corresponde a un trímero de HA-DT completo (225 kD) al de un trímero sin cabeza (135 kDa) (tinción con Coomassie, transferencia Western). La eliminación de la cabeza del tallo de HA entrecruzado por DT se puede confirmar con Ab específicos de cabeza, por ejemplo, en transferencias Western y ELISA. Los mismos bnAb y ensayos descritos antes se pueden usar para confirmar la conservación de los QNE más relevantes en la HA sin cabeza-DT.
Se puede llevar a cabo el análisis de aminoácidos para evaluar cualquier cambio no específico de cadenas laterales de aminoácidos, y para confirmar la presencia de enlaces dT (el propio motivo DT se puede detectar específicamente). Con el fin de identificar la posición de los enlaces DT en DT-sin cabeza, se puede llevar a cabo el análisis por LC-MS/MS de digestiones trípticas desglucosiladas, por ejemplo, en un espectrómetro de masas Thermo Scientific LTQ con un HPLC Michrom Paradigm HPLC y fuente de ionización por pulverización al vacío. Se puede llevar a cabo la caracterización bioquímica para identificar variantes de las HA sin cabeza, estabilizadas por DT, que retienen la unión a los bnAb cuaternarios anti-tallo claves igual que el trímero de HA PR8 soluble silvestre. Si es necesario se pueden modificar genéticamente sitios de escisión adicionales con el fin de primero desenredar la cabeza, y mejorar así la eficacia de la escisión proteolítica. Igualmente, se pueden usar las proteasas PreScission y/o TEV y sus sitios de escisión como se ha descrito antes.
Ensayo de protección frente a la exposición con virus heterólogos y de deriva
Una variante de HA PR8 se puede expresar en cantidades de mg, entrecruzar por DT, proteolizar, purificar y caracterizar antigénicamente. Se pueden hacer preparaciones de virus mutantes de PR8, NL09 y VN04 HALO/PR8_6+2. Para establecer la DL50 para cada uno de los virus de exposición, para cada virus se pueden inocular 4 grupos de 4 ratones C57BL/6 (hembras, 6 a 8 semanas de edad (Charles River Laboratories), usando diluciones de 10 veces de los virus indicados para cada grupo aproximadamente a la DE50 publicada para cada virus. Para establecer la dosis óptima del inmunógeno de trímero de HA sin cabeza bloqueado por DT purificado que protege 80 % de los animales de 5 X la dosis DL50 de exposición homóloga (PR8), se pueden inmunizar 4 grupos de 5 ratones C57BL/6 (hembra, 6 a 8 semanas de edad (Charles River Laboratories) con una estrategia de sensibilización-refuerzo que consistía en inyecciones consecutivas de diferentes cantidades del inmunógeno HA sin cabeza-DT purificado con una cantidad fijada de adyuvante Poli I/C (10 pg). Brevemente, cada grupo se puede inmunizar con 0 pg, 2,5 pg, 5 pg y 10 pg del trímero sin cabeza bloqueado por DT formulado con Poli I/C como adyuvante. Tres semanas más tarde, se puede administrar un refuerzo a los ratones, cada uno con una cantidad equivalente del inmunógeno con adyuvante. Tres semanas después del refuerzo, se pueden exponer por vía intranasal con una dosis de 5XLD50 del virus de la gripe homólogo (PR8). Los ratones se pueden controlar y evaluar la morbosidad y mortalidad durante un tiempo adecuado, tal como 14 días. Los ratones que pierden más de 25 % de su peso inicial se pueden sacrificar y puntuar como muertos. La supervivencia se puede definir como <25 % de pérdida de peso. Para ensayar los ratones inmunizados en cuanto a la protección contra exposiciones a una variante de deriva y grupo 1 heterólogo, se inmunizaron tres grupos de ratones C57BL/6 con 10 pg de adyuvante Poli I/C solo (grupos de control “Adyuvante solo”) y los tres grupos restantes se pueden inmunizar de acuerdo con el programa descrito antes con la dosis óptima de inmunógeno HA sin cabeza-DT con adyuvante identificado antes (grupos “trímero sin cabeza bloqueado-DT”).
Dos semanas después de la inmunización final, se puede exponer por vía intranasal un grupo de adyuvante solo y un grupo inmunizado con la dosis optimizada del trímero sin cabeza bloqueado-DT con una dosis letal de virus homólogo (H1N1 PR8), la variante de deriva pandémica porcina nueva adaptada de ratón (NL/09, H1N1), y con el virus de la gripe del grupo 1, heterosubtípico (VN04 hAlO/PR8_6+2 mutante H5N1) (Tabla 1). Los ratones se pueden vigilar y evaluar la morbosidad y mortalidad durante 10 días y puntuarlos como se ha descrito antes.
Tabla 1: Grupos de inmunización para evaluar la amplitud de la
protección
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Consideraciones estadísticas: En vista del hecho de que tanto el predictor (solo adyuvante frente a adyuvante inmunógeno sin cabeza DT) como el resultado (muerte frente a supervivencia) son dicotómicos, la hipótesis nula de que la vacuna no tiene efecto se puede ensayar con la prueba exacta de Fisher. Para calcular el número mínimo de animales por grupo (igual número en todos los grupos) necesario para detectar un efecto con un nivel de confianza al 95 % (p<0,05), la potencia se puede fijar en 80 % y se puede usar un tamaño de efecto supuesto de 50 % (80 % de letalidad en el grupo de control, 30 % de letalidad en los grupos vacunados). Por consiguiente, cada analito y grupo de control debería usar un mínimo de 15 animales.
Todos los métodos se pueden llevar a cabo de acuerdo con procedimientos convencionales, por ejemplo como se describe en Steel et al. 2010 [1]. Por ejemplo, en ensayos ELISA el antígeno (HA PR8) se puede inmovilizar con un mAb a-foldon (por ejemplo, 74550, Fibrogen Inc.) o un mAb a-tallo contra un epítopo no cuaternario con el fin de optimizar la presentación de su estructura nativa. La Ig específica de antígeno en el suero se puede detectar usando Ab de a-ratón marcados.
Se espera que sin cabeza-DT induzca satisfactoriamente la protección contra el virus de deriva (grupo D: NL09, H1N1), y/o una cepa heteróloga (grupo F: H5N1). Si fuera necesario el inmunógeno se puede reformular con un adyuvante diferente/adicional y/o las dosis ensayadas se pueden aumentar, y se puede repetir el ensayo de calibración de la dosis de inmunógeno. Además, si fuera necesario el régimen de sensibilización-refuerzo se puede alterar para incluir un tercer refuerzo con antígeno HA sin cabeza-DT. El número de animales usados en el estudio de exposición final se puede alterar/aumentar para lograr un nivel de confianza aceptable a partir de las exposiciones a virus homólogos frente a deriva y heterólogos.
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38. Crowe, J. E. Personal Communication. Director, Vanderbilt Vaccine Center, Vanderbilt ilniversity Medical Center Ejemplo 2
Los inmunógenos de proteínas solubles recombinantes representan una oportunidad significativa en la lucha contra los patógenos naturales y usados como armas. En años recientes se han descrito anticuerpos ampliamente neutralizantes (bnAb) contra muchos patógenos, muchos de los cuales se unen a estructuras cuaternarias presentadas solo por complejos de proteínas, los cuales son ellos mismos muchas veces inestables. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de “bloquear” inmunógenos de vacunas basados en proteína en la misma conformación cuaternaria natural, como son presentados por el propio patógeno.
El presente ejemplo se refiere a una vacuna para la gripe universal basada en hemaglutinina sin cabeza, hecha usando un sistema que incluyen (i) llevar a cabo mutagénesis dirigida al sitio, en posiciones donde se predice que los restos de Tyr resultantes estarán estrechamente próximos estructuralmente, (ii) expresar y purificar la proteína mutante, y (iii) posteriormente entrecruzar/bloquear enzimáticamente el complejo de proteínas completamente plegado. El entrecruzamiento DT es dirigido y de longitud cero, los enlaces DT son irreversibles y no se forman espontáneamente, y lo que es más importante, la introducción de enlaces DT conserva la estructura y función de la proteína, puesto que se producen una vez que la proteína está completamente plegada.
En este momento no hay disponible un inmunógeno de vacuna para la gripe universal. Sin embargo, recientemente, se describieron construcciones de HA sin cabeza trimerizadas en el dominio transmembrana que centraban las respuestas de Ab solo en el tallo altamente conservado, y que, de hecho, producían respuestas ampliamente protectoras. Sin embargo, la HA sin cabeza soluble trimerizada por un motivo foldon, se pliega de forma incorrecta, no presenta epítopos neutralizantes cuaternarios (QNE) claves, y produce respuestas insuficientemente protectoras. La presente invención proporciona un sistema alternativo que implica (i) entrecruzamiento DT de una construcción de HA soluble en su conformación natural de trímero, y (ii) eliminar el dominio de “cabeza” por modificación genética y cortar sitios de escisión proteolítica en los bucles variables y en la base de la cabeza. Las interacciones entre las subunidades del tallo de HA soluble (que carece del dominio transmembrana) se pueden bloquear por entrecruzamiento ditirosina mientras que se mantiene la integridad estructural de los trímeros de HA. Basándose en las estructuras cristalinas, se pueden hacer construcciones con cadenas laterales de Tyr en el tallo y en estrecha proximidad estructural, a la vez que se evitan sitios de unión de bnAb. Estas construcciones pueden ser expresadas y las proteínas resultantes se pueden purificar por cromatografía de afinidad con marcador His. Se pueden llevar a cabo ensayos para determinar si las construcciones forman entrecruzamientos DT intermoleculares mediante cribado según la fluorescencia específica de DT y por análisis de desplazamiento en gel (por ejemplo, transferencias Western).
Usando un panel de bnAb anti-tallo, se puede medir la conservación funcional del trímero de HA entrecruzado con DT por ELISA usando bnAb anti-tallo. La estabilización termodinámica se puede ensayar para confirmar las posiciones de enlaces DT y la integridad estructural de las construcciones después de entrecruzamiento biofísicamente. Las construcciones se pueden seleccionar basándose en los perfiles antigénicos y/o bioquímicos favorables. Se espera que la unión a bnAb anti-tallo cuaternarios tales como 6F12, C179, CR6261, F10, A66 y D8 se mantenga completamente.
Los sitios de escisión proteolítica se pueden modificar genéticamente para desenredar y eliminar la cabeza de los trímeros de HA estabilizados por DT naturales. Se pueden diseñar construcciones de HA completamente plegadas con 4 o más sitios de escisión para 1 o 2 proteasas, generar, expresar y entercruzar por DT, y después purificar por cromatografía de afinidad con marcador His antes de digerir con proteasa(s) para eliminar la cabeza. Se pueden llevar a cabo análisis antigénicos y bioquímicos y biofísicos para confirmar la conservación/integridad de los QNE en la HA sin cabeza-DT después de digestión proteolítica y se puede llevar a cabo el análisis inmunogénico en ratones.
Los virus de la gripe estacionales y pandémicos siguen siendo una amenaza grave para la salud humana, debido a su capacidad para escapar de la vigilancia inmunitaria por rápida deriva y reagrupación genética Solo en los EE.UU. el virus de la gripe causa epidemias estacionales que contribuyen a miles de hospitalizaciones y una media de 30.000 muertes anuales, a la vez que crea graves cargas económicas para los individuos y la economía global [1-3]. Los brotes pandémicos se producen cuando surge una cepa de virus virulenta que infecta a personas con poca o sin inmunidad, y se propaga rápidamente por todo el mundo, representando una de las amenazas más graves para la salud humana. La pandemia de gripe española de 1918 (H1N1) se calcula que causó 50 millones de muertes; la pandemia de gripe asiática de 1957 (H2N2) y la pandemia de 1968 de Hong Kong (H3N2) causó cada una varios millones de muertes [6]. Debido a que los virus de la gripe son fácilmente accesibles y se transmiten fácilmente por aerosol, la posibilidad de modificación genética representa una enorme amenaza para el armamentismo, guerra biológica y bioterrorismo [7,8]. Las vacunas son la mayor promesa de proporcionar protección con el fin de controlar la infección.
Aunque muy eficaces cuando se corresponden con las cepas circulantes, las vacunas actuales para el virus de la gripe protegen principalmente contra cepas de virus homólogos. La protección se debe principalmente a anticuerpos de alta avidez contra el dominio de cabeza inmunodominante altamente variable de la proteína de hemaglutinina (HA), que es específica para cada cepa de virus de la gripe. Por lo tanto, cada año se deben diseñar nuevos cócteles de vacunas trivalentes para las cepas de virus de la gripe prevalentes en la circulación. La fabricación de vacunas para la gripe basada en huevos, convencional, requiere que las cepas sean seleccionadas 9 meses antes de empezar la temporada. Desgraciadamente, las predicciones de las cepas en la circulación a menudo no son precisas, dando como resultado vacunas que se corresponden poco, y por lo tanto son poco protectoras [9-11]. Están en marcha una multitud de programas de desarrollo para abordar este problema, muchos de ellos en etapas avanzadas, pero el procedimiento propuesto en la presente invención tiene el potencial de moverse uno o más programas más allá de los obstáculos de seguridad y eficacia, y permite un producto de vacuna ampliamente protectora verdaderamente a largo plazo tanto para la gripe estacional como pandémica.
El tallo de la HA está altamente conservado a través de una multitud de cepas de virus de la gripe, y considerables pruebas sugieren ahora que la vacunación con una HA “sin cabeza” que consiste principalmente en el tallo de la HA, produce la inducción de respuestas de anticuerpos con actividad de unión heterosubtípica significativamente potenciada, y amplia protección contra la exposición letal [12-15, 16, 17]. Así pues, la Ha sin cabeza es una promesa importante como un inmunógeno de vacuna universal capaz de proteger contra todas las cepas del virus de la gripe [16] [17]. Es interesante que se ha observado que la inmunización con ADN que codifica la HA genera predominantemente respuestas de Ab específicos del tallo, y recientemente se han descrito datos que describen protección heterosubtípica por vacunación con ADN de HA por electroporación [50]. Una combinación de sensibilización-refuerzo de un vector de expresión que codifica la HA, seguido de un refuerzo de proteínas sin cabeza soluble es prometedor para generar respuestas ampliamente heteroespecíficas que dan protección de larga duración.
La presente solicitud da a conocer un trímero de HA “sin cabeza” soluble covalentemente estabilizado en su conformación plegada correcta, que presenta epítopos neutralizantes cuaternarios (QNE) claves. La tecnología de entrecruzamiento ditirosina dirigido se usa para estabilizar un trímero de HA de longitud completa, y posteriormente se elimina la cabeza usando proteasas específicas de secuencia/sustrato, usando la tolerancia del bucle variable para la variación de aminoácidos.
El entrecruzamiento ditirosina (DT) proporciona un método para estabilizar pliegues de proteínas, complejos y conformaciones introduciendo enzimáticamente entrecruzamientos de longitud cero, a la vez que se mantiene la integridad estructural y funcional de la proteína [20,21]. Los enlaces ditirosina proporcionan estabilizad conformacional y rigidez a las estructuras de proteínas y se han descrito en muchos marcos naturales diversos. Los entrecruzamientos DT se forman naturalmente in vivo, tanto en el contexto de proteínas evolucionadas para usar sus características específicas [22-24], como también como consecuencia de la oxidación de proteínas [25]. Los enlaces DT forman la estructura del gluten del trigo, la estructura de proteína cuaternaria que comprende las subunidades de glutenina, y están presentes en grandes cantidades en algunos de nuestros alimentos más comunes [26]. Ningún otro aminoácido forma entrecruzamientos o son modificados cuando se lleva a cabo la reacción en condiciones suaves, aunque las propias cadenas laterales de tirosilo se pueden oxidar si se encuentran en posiciones muy separadas, limitando así la eficacia de la reacción, en particular en condiciones subóptimas. Los entrecruzamientos DT no se hidrolizan en condiciones fisiológicas normales y no se forman espontáneamente in vitro. Estas características del entrecruzamiento DT proporcionan ventajas importantes frente a la química de S-S convencional; en concreto no se forman productos de proteínas espontáneos y/o no deseados y no se produce la unión no específica/agregación en la maduración y procesamiento. Debido a que la reacción se puede controlar estrechamente, el desarrollo de un procedimiento de alto rendimiento a gran escala puede ser relativamente sencillo, haciendo que la fabricación a gran escala de un inmunógeno estabilizado por DT sea económicamente más factible. Una de las características clave del entrecruzamiento DT es que es muy dependiente de la proximidad estructural de las cadenas laterales de tirosilo, las cuales por lo tanto deben modificarse genéticamente dentro de la estructura de una proteína o complejo de proteínas. Debido a que no se añaden carbonos en la formación del enlace, las “grapas” resultantes no alteran el plegado de la proteína global y se pueden dirigir a sitios críticamente específicos dentro de la estructura de la proteína con alta especificidad. Las tirosinas necesarias pueden estar presentes en la estructura primaria de la proteína, o se pueden añadir por mutaciones puntuales “a tirosina”, mientras que los restos de Tyr que forman enlaces DT no deseables se pueden mutar (a Phe, por ejemplo) para reducir el fondo.
Los inmunógenos de proteínas son cadenas plegadas de polipéptidos de aminoácidos, que a veces consisten en varias subunidades de polipéptidos. La velocidad de desplegado espontáneo, transición conformacional y disociación, determinan una semivida funcional de la proteína. Los enlaces covalentes no peptídicos entre cadenas laterales de aminoácidos no adyacentes pueden afectar notablemente a la velocidad de desplegado, y por lo tanto a la semivida de una proteína o complejo de proteínas. Se han desarrollado al menos dos procesos químicos diferentes para abordar los entrecruzamientos covalentes en proteínas in vivo para estabilizar sus conformaciones y/o retrasar el desplegado: estos son los enlaces disulfuro y los enlaces ditirosina (DT).
Una ventaja principal de un procedimiento de entrecruzamiento DT dirigido es que los enlaces covalentes dirigidos a localizaciones específicas pueden reforzar disposiciones 3-D particulares de estructuras secundarias, terciarias y/o cuaternarias de epítopos, previniendo así transiciones conformacionales no deseadas, y tienen el potencial de proporcionar un grado alto de estabilización termodinámica y bloqueo conformacional sin afectar de forma adversa a las propiedades antigénicas de los inmunógenos de proteína.
Se han encontrado enlaces disulfuro en muchas proteínas eucariotas de función diversa. Los entrecruzamientos S-S intramoleculares a menudo son esenciales para estabilizar dominios de proteínas, y los enlaces S-S intermoleculares proporcionan estabilidad para la estructura cuaternaria de los complejos de proteínas. Estos enlaces se pueden formar espontáneamente, y por lo tanto no requieren un procedimiento de fabricación y purificación adicional, pero también reducen los rendimientos de fabricación debido a la formación de agregados mediada por los sulfhidrilos libres. Además, debido a que se forman cuando la proteína se está plegando en el ER/aparato de Golgi, pueden conducir a distorsiones estructurales que afectarían a la presentación de QNE y la amplitud de la protección inmunógena.
El enlace C-C creado por el entrecruzamiento DT es estable en prácticamente cualesquiera condiciones fisiológicas y/o operacionales que es probable que se usen de acuerdo con la presente invención, incluyendo las usadas en el procedimiento de inmunización y vacunación. Los enlaces DT son de “longitud cero”, es decir no se añade átomo. El catalizador del entrecruzamiento simplemente inicia la formación de enlace entre dos tirosinas y no se incorpora al producto. Por lo tanto, no se produce modificación química no deseable de la proteína. El entrecruzamiento DT también es muy específico, ningún aminoácido distinto de las tirosinas muestra la formación de entrecruzamientos o son modificados cuando se lleva a cabo la reacción en condiciones suaves. Además, hay un requisito de distancia estricto entre las cadenas laterales de tirosina, formándose el enlace solo cuando las dos están muy próximas. Además, los entrecruzamientos DT no se forman espontáneamente, y como se ha descrito antes, se forman solo entre restos de Tyr muy próximos. Por lo tanto, el entrecruzamiento DT de una proteína puede bloquearla en su conformación natural/funcional previamente existente. En el contexto del diseño de HA sin cabeza, esto permite i) la modificación genética sin cabeza en una conformación antigénica/inmunogénicamente favorable, por ejemplo, introduciendo mutaciones puntuales, y después ii) bloquearla en su conformación preferida por entrecruzamiento DT.
Se han identificado enlaces ditirosina (DT) que tienen importantes funciones biológicas en proteínas de varias especies, supuestamente en entornos donde los enlaces disulfuro no serían adecuados. Se han descrito enlaces DT específicos, por ejemplo, en la proteína cuticlina de Caenorhabditis elegans [27], las proteínas de la pared celular de brotes de bambú [28], y colágeno de pergamino [29]. En todos los casos, las proteínas han evolucionado de modo que entrecruzamientos DT específicamente situados contribuyen a la rigidez estructural que subyace en la funcionalidad de las proteínas. La importancia de dichos enlaces también se pone de manifiesto por el hecho de que en levaduras, por ejemplo, se ha descrito una ruta metabólica que conduce a la formación de enlaces DT en proteínas especializadas [30].
Además, debido a las diferentes propiedades fluorescentes de enlaces DT, en ausencia de estructuras a nivel atómico, su formación se puede ensayar fácilmente usando lectores de placas de fluorescencia de 96 y 384 pocillos convencionales. Esto también hace que la optimización de las condiciones de entrecruzamiento sea sencilla y eficaz.
Los presentes métodos implican (a) generar una molécula de HA de longitud completa estabilizada por DT que retiene un perfil antigénico específico de tallo equivalente al de la HA WT, (b) eliminar el dominio de cabeza de la HA-DT complemente plegada por escisión proteolítica a la vez que retiene al mismo perfil antigénico “específico del tallo” que la HA WT. La inmunogenicidad se puede confirmar en estudios con animales.
El presente ejemplo usa HA de H1N1 de la cepa A/Puerto Rico/8/1934 (“PR8”) del virus de la gripe como punto de partida. La mayor parte de la investigación en el virus de la gripe en ratones usa virus de la gripe PR8 adaptados a laboratorio o los A/WSN/1933 (H1N1) [WSN]. Los estudios de inmunogenicidad y exposición se pueden llevar a cabo en ratones BALB/c con exposiciones a H1N1 PR8 y H3N2 X31 homólogos y heterólogos. X31 es un virus genéticamente reordenado que lleva los genes de HA y NA de A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) en el contexto genético de PR8 [35].
Para identificar construcciones de HA que permitan formar enlaces ditirosina y estabilizar el trímero de HA, se analiza la estructura cristalina de la HA trimérica (archivo pdb 3GBN) y se seleccionan restos próximos para la sustitución por tyr alejados de los sitios de unión de anticuerpos neutralizantes cuaternarios (véase la figura 5). Una vez que se ha completado el diseño in silico de las mutaciones puntuales “a tyr” (2T-HA), se puede generar cADN que codifica el ectodominio de HA silvestre (PR8) y mutantes de sustitución a tyr y clonarlos en un vector de transferencia baculovirus (pAcGP67A) usando técnicas de biología molecular convencionales. Las proteínas WT y 2T-HA se pueden expresar en células SF9 o Hi5 y la HA secretada se puede purificar sobre columnas de glucoafinidad basadas en lecitina y columnas de intercambio aniónico MonoQ. Después de purificación, los trímeros de HA secretados se pueden aislar de los monómeros y agregados de alto peso molecular por cromatografía de exclusión por tamaño molecular (SEC) en una columna Superdex200.
Para evaluar si las construcciones de 2T-HA diseñadas forman o no entrecruzamientos DT intermoleculares, las proteínas purificadas se pueden analizar antes y después de la exposición a las condiciones de entrecruzamiento DT por desplazamiento en gel en SDS-PAGE reductora (transferencia Western y tinción con Coomassie) y por la fluorescencia específica de DT. Las construcciones capaces de formar entrecruzamientos DT con una eficacia >50 % se pueden llevar más adelante para la caracterización adicional. Basándose en los estudios preliminares con trímeros de env de VIH, se cree que las eficacias de entrecruzamiento mayores de 80 % se pueden lograr sin proceso de optimización significativo. Los análisis bioquímicos y biofísicos de trímeros de HA entrecruzados por DT (DT-HA) se pueden llevar a cabo para comparar su termoestabilidad con la de la HA no entrecruzada en el suero humano normal a 37 °C a lo largo de una evolución temporal de 1-30 días. Se puede analizar en la DT-HA trimérica y la HA trimérica de control (no entrecruzada) cada día la presencia de trímero retenido por transferencia Western. Igualmente, se puede analizar una evolución temporal de 60 días, 25 °C en PBS (pH 7,4) de la DT-HA trimérica purificada y HA trimérica de control (no entrecruzada) semanalmente por SEC. La proporción del material total en las fracciones triméricas y monoméricas se puede cuantificar usando software de integración de picos convencional y se puede determinar la relación de trímero a monómero en las muestras de DT-HA y de control. Dado que las construcciones de DT-HA se pueden identificar basándose en su estabilidad en SDS-PAGE reductora, se espera que 100 % del trímero entrecruzado por DT permanezca en forma de trímero en las condiciones experimentales descritas antes, mientras que los trímeros de HA no entrecruzados lábiles se disociarán en las subunidades monoméricas a lo largo de la duración de la evolución temporal.
Una ventaja central de la tecnología de entrecruzamiento DT frente a otras metodologías de entrecruzamiento, es la capacidad para formar entrecruzamientos intermoleculares covalentes sin alterar el perfil antigénico de los candidatos a inmunógenos de vacunas. El efecto tanto de las mutaciones “a tyr” como de los entrecruzamientos DT se puede determinar por ELISA usando un panel de mAb ampliamente neutralizantes anti-tallo de HA (por ejemplo, 6F12, C179, CR6261, F10, A66 y D8). Los ensayos de unión de curva completos se pueden usar para comparar trímeros de HA WT con los trímeros de 2T-HA mutantes (no entrecruzados) y con los trímeros DT-HA (entrecruzados). Los cambios en la unión después de la introducción de mutaciones a tyr así como después del entrecruzamiento DT, se pueden determinar usando análisis de regresión no lineal de curvas de unión para calcular y comparar los valores de CE50 para cada construcción con cada mAb. La posición de las mutaciones a tyr puede ser distal y que no se solape con los aminoácidos implicados en la unión de los bnAb anti-tallo citados antes. Es posible que cambios estructurales causados por sustituciones de tirosina puedan reducir o potenciar la unión a algunos de estos anticuerpos. Sin embargo, estudios preliminares que usaban el VIH sugieren que el entrecruzamiento DT conserva completamente el perfil antigénico de una proteína candidata y se espera un grado similar de conservación antigénica después del entrecruzamiento DT de la HA del virus de la gripe.
Con el fin de evaluar los cambios no específicos de cadenas laterales de aminoácidos a lo largo de toda la proteína entrecruzada, se puede llevar a cabo un análisis de aminoácidos (AAA) comparativo en construcciones no entrecruzadas (control) y entrecruzadas. Los análisis de aminoácidos también se pueden usar para confirmar la presencia de enlaces DT puesto que los entrecruzamientos DT aguantan incluso la hidrólisis ácida usada para preparar las muestras para el AAA y la propia ditirosina se puede detectar específicamente en el análisis. Con el fin de identificar directamente la posición de los enlaces ditirosina en DT-HA, se puede usar el análisis espectrométrico de digestiones trípticas desglucosiladas, por ejemplo llevando a cabo LC-MS/MS en un espectrómetro de masas Thermo Scientific LTQ con un HPLC Michrom Paradigm HPLC y fuente de ionización por pulverización al vacío. Colectivamente estos estudios se pueden usar para identificar y caracterizar construcciones de HA capaces de formar enlaces DT de trimerización. Dichas construcciones pueden, incluso antes de eliminar el dominio de cabeza de HA inmunodominante, proporcionar inmunógenos de HA mejorados que presentan establemente QNE específicos de tallo.
Las construcciones de HA sin cabeza recombinantes previamente descritas no retienen la estructura cuaternaria natural completamente del tallo de la HA, y por lo tanto, esas estructuras no se unen a bnAb específicos cuaternarios conocidos. Después de expresión en baculovirus y purificación de construcción(es) DT-HA como se ha descrito antes, se puede eliminar el dominio de cabeza de forma proteolítica, después de plegado y después de entrecruzamiento Dt , con el fin de generar una HA sin cabeza estable que retiene la unión a anticuerpos cuaternarios dependientes de conformación, ampliamente protectores. Con el fin de permitir la eliminación proteolítica del dominio de cabeza globular de HA, se pueden introducir sitios de escisión de proteasa en HA1. Los sitios de eliminación de cabeza se pueden introducir, por ejemplo, en las posiciones 60-76 (sitio N-terminal) y 277­ 290 (sitio C-terminal) por técnicas de biología molecular convencionales [19]. Las estructuras cristalinas de la HA indican que estas posiciones están expuestas al disolvente y podrían hacer más accesibles a las proteasas eliminando las restricciones estructurales que pueden obstaculizar la proteolisis eficaz mediante la introducción de sitios de escisión adicionales en los dominios de bucle variable de HA1 (posiciones de AA 142-146 y 155-164) [37]. El desenredado de la cabeza se puede usar para mejorar más el acceso al sustrato de la proteasa, si es necesario. La introducción de sitios de escisión en los bucles variables de HA no se espera que altere la conformación global del trímero de HA, puesto que estos sitios son muy tolerantes a sustituciones de aminoácidos. Realmente, todas estas posiciones de aminoácidos (por ejemplo, 142-146 y 155-164) han cambiado en aislados de virus infecciosos recogidos desde 1968 a 1999 [38]. La escisión de hA1 en los bucles variables se puede llevar a cabo para desestabilizar la estructura globular de la cabeza, permitiendo la exposición completa y escisión eficaz en los sitios de eliminación de cabeza primarios (53-67 y 269-277). Se pueden usar/introducir las secuencias de reconocimiento de proteasas PreScission (GE Healthcare Life Sciences) (LEVLFQGP (SEQ ID NO: 69)) y secuencias de reconocimiento de TEV (proteasa del virus del grabado del tabaco) ENLYFQG (SEQ ID NO: 70) y ENLYFQS (SEQ ID NO: 71)). La escisión con TEV se puede llevar a cabo con una relación de sustrato a enzima de 1:50-200 p/p en un tampón de Tris-HCl 25 mM con NaCl 150-500 mM y p-mercaptoetanol 14 mM a pH 7,0. La escisión con la proteasa PreScission se puede llevar a cabo en un tampón de Tris-HCl 50 mM, con NaCl 150 mM, EDTA 1 mM y ditiotreitol 1 mM (DTT) a pH 7,0. La eliminación de la cabeza se puede ensayar por desplazamiento de electromovilidad a partir de un peso molecular que corresponde a un trímero DT-HA de longitud completa (~225 kDa) al de un trímero sin cabeza (~135 kDa) por SDS-PAGE, seguido de tinción con coomassie y transferencia Western. Se pueden usar Ab de detección específicos de la cabeza para confirmar la eliminación de la cabeza del tallo de HA entrecruzado por DT por transferencia Western y ELISA. Si la eliminación de la cabeza de HA es incompleta, los sitios de proteasa Prescission y TEV se pueden alternar, o se puede introducir solo un solo tipo de sitio en todas las posiciones de escisión deseadas.
Con el fin de ensayar la inmunogenicidad de las construcciones DT-sin cabeza, se pueden llevar a cabo estudios de inmunogenicidad en ratones. Ratones BALB/c (6-8 semanas de edad) se pueden anestesiar con isoflurano al 3-5 % y posteriormente inmunizar con un régimen/esquema de sensibilización-refuerzo con dos inyecciones intramusculares separadas 3 semanas, primero con ADN que comprende 37,5 |ig de pGag-EGFP y 75 |ig de pDZ_PR8_HA seguido de pulsos por electroporación (sensibilización), y posteriormente con 25 |ig de HA WT, trímeros de HA estabilizados foldon/GCN4, o proteína DT-sin cabeza (refuerzo). Los inmunógenos de proteína (refuerzo) se pueden formular con Alum (fosfato de aluminio, 300 |ig/dosis). Dos semanas después de la segunda inyección (refuerzo), se puede recoger suero y ensayar las respuestas anti-HA con respecto al suero antes de inmunización y controles solo con adyuvante. Los títulos de IgG e IgM anti-HA globales para cada grupo se pueden determinar por ELISA. La reactividad heterosubtípica de anti-suero contra 10 HA diferentes del grupo 1 y grupo 2 purificadas se puede determinar por transferencia Western y ELISA. Se espera que los inmunógenos de cada grupo produzcan respuestas de anticuerpos anti-HA. Con el fin de investigar la capacidad de neutralización heterosubtípica del antisuero de cada grupo, se puede ensayar la capacidad de estos sueros para neutralizar un panel de los virus de la gripe heterólogos (HK/68 H3, Bris/07 H3, Neth/03 H7, Cal/09 H1, Sing/57 H2, Viet/04 H5, HK/97 H6, HK/99 H9). El antisuero se puede diluir 2 veces de forma seriada, mezclar con un volumen igual de virus e incubar durante 2 h a 37 °C. Las mezclas de virus-suero se pueden añadir a células diana (MDCK) en medio exento de suero que contiene tripsina e incubar durante 3 h antes de sustitución del medio. Se pueden vigilar los efectos citopáticos en las células 3-5 días después de la exposición a las mezclas de virus-suero.
Un objetivo principal de este diseño de inmunógeno y proceso de desarrollo es generar un inmunógeno DT-sin cabeza capaz de producir bn-Ab y proteger frente a la exposición a virus de la gripe heterólogos. Para investigar directamente la capacidad de DT-sin cabeza para producir respuestas protectoras contra la infección de la gripe, se pueden inmunizar 3 grupos de 20 ratones BALB/c con HA WT, foldon/GCN4 sin cabeza, o DT-sin cabeza, comparar con no/pre-inmunizados y controles solo con adyuvante (grupos 4 y 5, 20 ratones en cada uno), y exponer por vía intranasal con una dosis letal de virus homólogo (PR8) o heterólogo (X31) - 10 ratones cada uno - 2 semanas después de la segunda inmunización (refuerzo). Los ratones se pueden anestesiar con una inyección intraperitoneal de ketamina (75 mg/kg) y xilazina (15 mg/kg) antes de la exposición, y se puede determinar el peso corporal diariamente. Una pérdida de peso <20 % se puede usar como equivalente de supervivencia. Se espera que cada inmunógeno (HA WT, foldon/GCN4 sin cabeza, DT-sin cabeza) proporcione algún grado de protección frente a la exposición a PR8. Sin embargo, se espera que la inmunización con un inmunógeno DT-sin cabeza proporcione una protección significativamente mejorada contra la exposición a virus de la gripe heterólogo y que esta protección se correlacione con los títulos de bnAb que reconocen QNE que son presentados en el tallo de HA natural en su forma de trímero.
Se puede usar el sistema de vector de expresión de baculovirus (BEVS) para la fabricación de antígeno HA recombinante puesto que este sistema está bien establecido y los protocolos de producción/purificación adecuados se han descrito bien y validado [10]. En general, dichos protocolos implican recoger células infectadas por centrifugación, la solubilización de proteínas mediada por detergente, seguido de la purificación que implica dos etapas cromatográficas (columnas de IE y HIC) [10]. Debido a la gran diferencia de PM en el tallo trimérico comparado con la cabeza monomérica, y las enzimas usadas en el procesamiento, también se puede usar la filtración en gel. También se puede usar la cromatografía IE.
Se usan dos enzimas en los procedimientos descritos en el presente documento, peroxidasas para catalizar la formación de enlaces DT y proteasas para escindir la cabeza de HA después de entrecruzamiento. Ambas están disponibles en el mercado.
La pureza de los inmunógenos terminados se puede evaluar por electroforesis en gel y HPLC convencionales. Los entrecruzamientos se pueden evaluar por una combinación de electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes, mediciones de fluorescencia y análisis de aminoácidos. La inmunogenicidad se puede evaluar por caracterización de perfil contra un panel de anticuerpos seleccionados como se ha descrito antes. Se pueden usar ensayos basados en HPLC para identificar y medir composiciones de proteínas y azúcares.
La HA DT-sin cabeza se puede formular con un adyuvante seleccionado basándose en las especificaciones técnicas y otras consideraciones. La HA con adyuvante formulada con una variedad de excipientes y agentes de estabilización/conservantes se puede liofilizar, y después de rehidratación se pueden realizar ensayos biofísicos (dispersión de luz dinámica) y antigénicos. El efecto del almacenamiento a temperatura ambiente, 4 °C y -20 °C se puede ensayar para determinar las condiciones de almacenamiento a largo plazo, estabilidad y potencia.
Se pueden llevar a cabo estudios de eficacia en animales (por ejemplo, realizados en hurones) y se pueden llevar a cabo estudios de seguridad en animales agudos y a largo plazo. Los hurones son susceptibles a los virus de la gripe humana y desarrollan algunos de los síntomas de la gripe que se ven en seres humanos; además, son suficientemente grandes para vigilar parámetros clínicos (por ejemplo, temperatura, pulso y velocidad respiratoria), y se pueden obtener cantidades relativamente grandes de suero para usar en la caracterización serológica y antígena. Referencias para el ejemplo 2
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Ejemplo 3
Los intentos previos de modificación genética de HA sin cabeza han incluido expresar proteínas HA en las que la región de cabeza globular se ha cortado y empalmado de forma recombinante. Dichas construcciones de HA sin cabeza previas generaron una expectación considerable en el campo, porque producían respuestas de Ab con reactividad cruzada, mejorada. Sin embargo, estos Ab no daban protección cruzada y solo protegían contra la exposición a virus homólogos. Estas construcciones sin cabeza recombinantes previas no se unen el repertorio actual de Ab para tallo conformacionales y de protección cruzada, lo que sugiere al menos algún grado de plegado incorrecto del tallo en ausencia de la cabeza globular intacta. Estas observaciones previas se confirmaron usando uno de los Ab anti-tallo de reactividad cruzada más amplia, C 179, por análisis de inmunofluorescencia (véase la figura 6). La aplicación del bloqueo conformacional basado en DT evitará este inconveniente, manteniendo junto el trímero del tallo en su conformación natural, antes de la eliminación proteolítica de la cabeza, y por lo tanto da como resultado un inmunógeno de HA sin cabeza bloqueado-DT que se centrará en respuestas de Ab en los QNE del tallo críticos.
Ejemplo 4
Se introdujeron entrecruzamientos DT en el dominio de tallo de HA PR8, y el trímero de HA entrecruzado por DT mantuvo su antigenicidad natural. Basándose en las estructuras cristalinas del trímero de HA H1N1 1918 en complejo con el bnAb cr6261 (archivo pdb: 3GBN) y de HA PR8 (archivo pdb: 1RU7), se hicieron por modificación genética sustituciones a tirosina satisfactoriamente en el dominio de tallo de HA con el fin de permitir la formación de entrecruzamientos DT, que mantendrían la antigenicidad cuaternaria tras la eliminación proteolítica de la cabeza globular. Posteriormente se transfectaron células 293T con variantes secretadas de mutantes a tirosina y se midió la fluorescencia a 405 nm en los líquidos sobrenadantes de las células transfectadas, para determinar la formación de enlaces DT. Un gran aumento de la fluorescencia a 405 nm (muy específica de los enlaces DT) demuestra el fuerte entrecruzamiento en varios mutantes a tirosina (figura 7A). Basándose en la comparación con el control positivo (insulina) y una referencia de DT, se confirmó una eficacia de entrecruzamiento >70 % para las cuatro de estas construcciones antes de cualquier optimización. Como se muestra en la figura 7B, la unión de Ab C179 no cambia antes y después de la reacción de entrecruzamiento. Estos datos muestran que el tallo de HA PR8 se puede entrecruzar y que se mantiene el epítopo de tallo cuaternario clave unido por uno o más de los mAb conformacionales de reactividad cruzada más amplia, C 179 (2).
También se introdujeron satisfactoriamente sitios de escisión de proteasa dirigidos y se usaron para escindir el dominio de cabeza de HA PR8. El análisis extenso de la estructura de HA PR8 y los estudios de mutagénesis basados en transposones pusieron de manifiesto múltiples localizaciones dentro de la región de cabeza globular que podrían tolerar la inserción de sitios de escisión proteolíticos. De los 20 posibles sitios identificados, se generaron dos construcciones que permiten la inserción. Un sitio está situado en la base del dominio de cabeza globular (“48G”), mientras que el otro reside más cerca de los bucles variables de la proteína (“128S”). Ambas inserciones expresan bien, como se indica por transferencia Western de extractos de células enteras (figura 6B, izquierda) y forman partículas similares a virus (VLP) en cantidad suficiente para la detección en líquidos sobrenadantes de células transfectadas por C179 por ELISA (figura 8A). De las dos construcciones generadas, se predice que la inserción en 48G es menos accesible para la proteasa, aunque eliminaría completamente el dominio de cabeza, debido a su localización cerca de la base de la cabeza. Con el fin de demostrar que el sitio 48G es suficientemente accesible, se llevó a cabo la escisión con proteasa TEV en la proteína HA 48G, usando HA WT como control negativo. Como se muestra en la figura 8B, derecha, la escisión con proteasa TEV de la proteína HA 48G produce la eliminación los primeros 48 AA (6,5 kDa) de HA, pero no se produce escisión en la proteína HA WT. Además, HA 48G también mantiene la actividad de hemaglutinación cuando se ensayaba directamente de los líquidos sobrenadantes de células transfectadas, sugiriendo que permanece plegada en su conformación funcional (figura 8C).
Ejemplo 5
Introducción: En el diseño de una HA sin cabeza conformacionalmente bloqueada, se analizaron las estructuras atómicas del complejo 1918 HA:cr6261 (PDB:3GBN) y PR8 HA (PDB:1RU7) para identificar las posiciones que 1) permiten el entrecruzamiento ditirosina (DT) en el tallo a una distancia suficiente del epítopo cr6261 para mantener la unión a bnAb de tallo; y 2) permiten la inserción de sitios de escisión de proteasas, que se pueden usar para eliminar la cabeza.
Los trímeros de HA PR8 se bloquearon satisfactoriamente en su conformación natural de trímero usando entrecruzamientos DT en varias localizaciones en el tallo de HA; y estas HA bloqueadas-DT mantienen la antigenicidad del tallo natural
Se obtuvieron por modificación genética varias mutaciones de tirosina en el tallo de HA PR8 que permitían bloquear los trímeros en su estado de perfusión natural, con una eficacia alta. La figura 85A demuestra un claro desplazamiento al estado de trímero (SDS-PAGE reductora) después de entrecruzamiento DT; y la figura 85B confirma que los enlaces ditirosina se han formado por la fluorescencia específica a 405 nm. La densitometría de las especies entrecruzadas demuestra una conversión mayor de 80 % al estado de trímero. Lo que es más importante, la unión de 8D4, un bnAb específico de tallo, se mantiene completamente (figura 85C). Los análisis cristalográficos han mostrado que 8D4 se une al mismo epítopo que cr6261. Estos datos confirman que HA PR8 se puede entrecruzar en su tallo, a la vez que se mantiene la conformación nativa del epítopo de tallo cuaternario Vh1-69 clave.
Se han modificado genéticamente satisfactoriamente múltiples sitios de reconocimiento de proteasa TEV C y N-terminales en la cabeza de HA PR8, individualmente y en combinación
Se identificaron regiones en la cabeza de HA PR8 en las que se pueden insertar sitios de escisión de proteasa TEV sin alterar la función de la HA. Para el diseño basado en la estructura, se combinaron los datos estructurales de HA PR8 y el sitio de reconocimiento de proteasa TEV, y las inserciones de sitios de escisión se dirigieron específicamente en las regiones de la cabeza de HA basándose en los siguientes criterios: i) proximidad a la punta del tallo, con el fin de maximizar la eliminación de la cabeza inmunodominante; ii) similitud entre las estructuras secundarias de HA y el sitio de escisión TEV, para minimizar la perturbación estructural; iii) regiones identificadas como tolerantes de inserción basadas en el cribado de mutagénesis de transposones con datos de un cribado de mutagénesis basado en transposones (Heaton y Palese PNAS vol. 110, No. 50; pág. 20248-53).
En total, se cribaron aproximadamente 50 sitios de inserción y se ensayó su capacidad para incorporarlos en VLP expresando solo HA (WT o con inserción) y NA. Este ensayo abarca varios de los atributos funcionales de HA, incluyendo la expresión, acumulación en la superficie celular, localización de microdominio en membrana, y formación de partículas, y por lo tanto se llevó a cabo con proteínas HA de longitud completa. Este procedimiento

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar un complejo de proteína HA del virus de la gripe sin cabeza, comprendiendo el método:
(a) obtener o expresar una proteína HA del virus de la gripe que comprende:
(i) un dominio de tallo, en el que el dominio de tallo comprende una mutación puntual a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 y 435, o un residuo de aminoácido correspondiente al mismo por alineamiento con SEQ ID NO: 1, y
(ii) un dominio de cabeza, en el que el dominio de cabeza comprende uno o más motivos de reconocimiento de proteasa introducidos artificialmente,
(b) permitir que la proteína HA del virus de la gripe obtenida o expresada en la etapa (a) se pliegue en su conformación natural que tiene un dominio de cabeza y un dominio de tallo trimérico compuesto por tres protómeros,
(c) introducir una o más entrecruzamientos ditirosina, en el dominio de tallo trimérico con el fin de estabilizar el dominio de tallo en su conformación natural de trímero, y
(d) posteriormente escindir proteolíticamente el dominio de cabeza en el uno o más motivos de reconocimiento de proteasa introducidos artificialmente,
produciendo de ese modo un complejo de proteína HA del virus de la gripe sin cabeza.
2. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína HA del virus de la gripe se expresa en una célula de mamífero o de insecto.
3. El método según la reivindicación 1, que comprende además realizar un análisis después del comienzo o la finalización de la etapa de escisión proteolítica (etapa d) para confirmar que el dominio de cabeza de la proteína HA del virus de la gripe se ha interrumpido o eliminado suficientemente.
4. El método según la reivindicación 3, en el que el análisis comprende realizar un ensayo de cambio de movilidad en gel SDS PAGE o realizar un ensayo usando un anticuerpo específico de cabeza.
5. El método según la reivindicación 1, que comprende además usar un anticuerpo anti-tallo ampliamente neutralizante (bnAb) para evaluar la conservación funcional del trímero HA.
6. El método según la reivindicación 5, que comprende realizar un ELISA con el anticuerpo anti-tallo ampliamente neutralizante (bnAb).
7. Un método para preparar un complejo de proteína HA del virus de la gripe “con cabeza”, comprendiendo el método:
(a) expresar una proteína HA del virus de la gripe que tiene una o más mutaciones “a tirosina” en posiciones dirigidas dentro de su dominio de tallo, y opcionalmente también en el dominio de cabeza, en el que el dominio de tallo comprende una mutación puntual a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 y 435, o un residuo de aminoácido correspondiente por alineamiento con SEQ ID NO: 1,
(b) permitir que la proteína HA del virus de la gripe se pliegue en su conformación natural que tiene un dominio de tallo trimérico y un dominio de cabeza, y
(c) realizar una reacción de entrecruzamiento de DT para entrecruzar residuos de tirosina en el dominio de tallo y, opcionalmente, también en el dominio de cabeza,
produciendo de ese modo un complejo de proteína HA del virus de la gripe “con cabeza” genéticamente modificado que tiene un dominio de tallo entrecruzado con DT.
8. Un método para preparar un complejo de proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza”, comprendiendo el método realizar el método según la reivindicación 7 y, posteriormente eliminar proteolíticamente el dominio de cabeza para generar una proteína HA del virus de la gripe “sin cabeza”.
9. Un método para generar un anticuerpo contra un polipéptido, proteína o complejo de proteínas de hemaglutinina (HA) de la gripe, comprendiendo el método;
(i) inmunizar un animal no humano con un complejo de proteína hemaglutinina (HA) de la gripe entrecruzado con ditirosina que comprende una mutación a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 y 435, o en una posición de aminoácido que corresponda a la misma tal como se determina mediante la secuencia de alineamiento con SEQ ID NO: 1; y
(ii) obtener el anticuerpo del animal.
10. El método según la reivindicación 9, en el que el animal es un ratón, una rata, un conejillo de indias, un conejo, una cabra o un primate no humano.
11. Un método para someter a ensayo y/o medir la unión y/o el título de un anticuerpo anti-HA, en el que el método usa como analito un complejo de proteínas de hemaglutinina (HA) de la gripe entrecruzado por ditirosina que comprende una mutación puntual a tirosina en una o más de las posiciones de aminoácidos 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 y 435, o un residuo de aminoácido correspondiente a las mismas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
12. El método según la reivindicación 11, en el que el método comprende un ensayo ELISA o un ensayo de unión Biacore/SPR.
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