CN112839964A - 包含融合蛋白的药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及一种融合蛋白组合物，其包含α1‑抗胰蛋白酶或α1‑抗胰蛋白酶(也称为A1AT、A1A或AAT)多肽(AAT)，经修饰的AAT(mAAT)或其功能性变体和生物活性多肽。本公开内容尤其是涉及一种用于治疗疾病的包含所述融合蛋白的药物组合物，例如癌症或自身免疫性疾病。所述生物活性多肽可以是肽激素、干扰素或细胞因子，例如白细胞介素‑2(IL‑2)、经修饰的IL‑2(mIL‑2)、IL‑15、G‑CSF、GM‑CSF、IFN‑α2、IFN‑β1、GLP‑1、FGF21、sdAb、其片段、其经修饰的多肽或其组合。所述融合蛋白的一个优点是增强所述生物活性多肽的活性、稳定性、生物利用度或其组合。

Description

包含融合蛋白的药物组合物及其用途
技术领域
本发明涉及包含人AAT多肽(包括经修饰的AAT(mAAT))的融合蛋白，该融合蛋白可以用作药物组合物，用于递送靶生物活性剂(例如经修饰的IL-2)以治疗人类疾病。本发明还涉及用于产生融合蛋白组合物和药物组合物的方法。
背景技术
蛋白质和肽是已经用于药物应用中的重要生物分子，例如抗体、抗原、细胞因子和激素，如胰岛素、生长激素、疫苗等。正在深入研究和开发的是调节或增强蛋白质或肽的活性，尤其是在递送和体内活性的调节或提高方面。
细胞因子是一组在细胞信号转导中重要的小蛋白质。细胞因子的分子量通常在5-20KDa范围内。细胞因子的一个特殊特征在于循环中的细胞因子浓度可以在很大范围内变化。例如，血液中的IL-6浓度通常为皮摩尔(10-12M)范围。但是，在创伤或感染期间，它可以提高至最高达1000倍。白细胞介素是由白细胞(白细胞(leukocytes))和许多不同类型的细胞(包括辅助CD4 T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞)产生的一组细胞因子。免疫系统的功能主要依赖于白细胞介素。它们促进T和B淋巴细胞以及造血细胞的发育和分化。
白细胞介素2(IL-2)是白细胞介素家族的成员。IL-2在免疫系统的基本功能中起着至关重要的作用。它在持久的细胞介导的免疫中发挥关键作用。当T细胞受到抗原刺激时，IL-2促进这些T细胞分化为效应T细胞和记忆T细胞克隆，并且促进抗原刺激的T细胞克隆的扩增，从而帮助机体抵抗感染和其他疾病，例如癌症。IL-2在免疫耐受方面也发挥关键作用。IL-2促进某些未成熟的T细胞分化为调节性T细胞，其抑制其他T细胞并预防自身免疫性疾病。
IL-2分子具有四个α-螺旋束的结构。IL-2的信号转导取决于其与T细胞表面受体IL-2R的结合。IL-2R具有三个亚基，α、β和γ。该白细胞介素组的所有家族成员都具有γ链，包括IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受体。IL-2以低亲和力与IL-2R亚基α结合。然而，与IL-2R的β和γ亚基的结合使IL-2的结合亲和力增加约100倍。IL-2和3-亚基IL-2R复合物的形成对于T细胞中IL-2信号转导至关重要。IL-2基因表达是在多个水平上调控，包括通过T细胞受体(TCR)的信号转导。在TCR识别MHC肽复合物后，信号通过磷脂酶C(PLC)依赖性途径转导并且激活3种主要的转录因子及其途径：NFAT、NFkB和AP-1。在从CD28共刺激后，诱导IL-2表达。
已经开发了几种重组IL-2类似物，并批准用于治疗应用。例如，最初由赛特斯公司(Cetus Corporation)开发的阿地白介素(Aldesleukin)(可以注册商标
Figure BDA0002818940740000021
由诺华疫苗和诊断有限公司获得)，其半胱氨酸残基125被丝氨酸替换，并且移除N末端丙氨酸。其在1992年被FDA批准用于转移性肾癌。由罗氏(Roche)公司开发的替西白介素(Teceleukin)，其在蛋白质N末端添加甲硫氨酸。由葛兰素史克(Glaxo)开发的生物白介素(Bioleukin)，其也在蛋白质的N末端添加甲硫氨酸，且半胱氨酸残基125被丙氨酸替换。
α-1-抗胰蛋白酶(Alpha-1-antitrypsin)或α1-抗胰蛋白酶(A1AT、A1A或AAT，以下称为“AAT”)是属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)超家族的蛋白质。它也被称为α1-蛋白酶抑制剂或α1-抗蛋白酶，因为它抑制各种蛋白酶。在人类中，它由SERPINA1基因编码。
人类基因组编码36种丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白，被称为serpinAX至serpinPX(X是数字)。其中，29种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白具有蛋白酶抑制活性，7种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白不具有蛋白酶抑制活性。非抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂发挥多种重要作用。例如，卵清蛋白是蛋清中含量最丰富的蛋白质。尽管其确切功能尚不清楚，但据推测它是发育中胎儿的储存蛋白。热激蛋白47(Hsp 47也称为SERPINH1)是分子伴侣，对于胶原的正确折叠至关重要。
尽管它们的功能各不相同，但所有丝氨酸蛋白酶抑制剂都具有共同的结构。所有丝氨酸蛋白酶抑制蛋白通常具有3个β-折叠(sheet)(分别命名为A、B和C)以及8或9个α-螺旋(命名为hA-hl)。对丝氨酸蛋白酶抑制剂功能来说最重要的区域是A折叠和反应性中心环(RCL)。A折叠包括两个平行取向的β链，它们之间的区域称为“百叶窗(shutter)”，上部区域称为“缺口(breach)”。RCL与抑制分子中的目标蛋白酶形成初始相互作用。所有抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂均使用不常见的构象变化来破坏蛋白酶并阻止其完成催化作用。所述构象变化包括RCL移动至蛋白质的相对端并且插入到β-折叠A中，形成额外的反平行β-链。这种构象变化将丝氨酸蛋白酶抑制剂分子从紧张(S)状态转换为能量较低的松弛(R)状态。这种从S到R的转变是大多数(如果不是全部)丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白(包括非抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂)共有的最显著的特征。
AAT是52KDa丝氨酸蛋白酶抑制剂，其成熟形式中具有由394个氨基酸残基组成的单链多肽。它显示出许多的糖型。在成年人中，AAT蛋白是在肝脏中产生并参与全身循环。它在血液中的参考范围为0.9-2.3g/L，但在急性炎症时其浓度会升高许多倍。它的主要功能是保护组织抵御炎性细胞的酶，尤其是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。如果血液中的功能性AAT蛋白的含量不足，例如在AAT缺乏症患者中，则嗜中性粒细胞弹性蛋白酶会降低肺的弹性，并导致呼吸系统并发症，例如慢性阻塞性肺疾病。对于这些患者，已批准了五种AAT产品用于治疗用途，包括Aralast NP，Glassia，
Figure BDA0002818940740000031
(GRIFOLS THERAPEUTICS LLC的注册商标)，
Figure BDA0002818940740000032
(GRIFOLS THERAPEUTICS LLC的注册商标)和
Figure BDA0002818940740000033
(CSLBEHRING L.L.C.的注册商标)。这些AAT的药物形式都是从人类供体血液中纯化的。重组形式正在研究中，但尚无法获得。
与所有的丝氨酸蛋白酶抑制剂一样，AAT具有β折叠和α螺旋的特征性二级结构。AAT的主要靶标是弹性蛋白酶，但它也可以在一定程度上抑制纤溶酶和凝血酶。在体外，AAT可以抑制胰蛋白酶(这使其得名“抗胰蛋白酶”)、胰凝乳蛋白酶和其他丝氨酸蛋白酶。也与许多其他丝氨酸蛋白酶抑制剂相似，蛋白酶抑制的机制涉及AAT结构的大的构象变化(S到R转变)。反应性中心环(RCL)从AAT蛋白的主体伸出，并且引导与靶蛋白酶的结合。蛋白酶在RCL内的反应位点处切割丝氨酸蛋白酶抑制剂，在丝氨酸蛋白酶抑制剂反应位点的羧基与蛋白酶的丝氨酸羟基之间建立共价键。所得的失活的丝氨酸蛋白酶抑制剂-蛋白酶复合物是高度稳定的。
可能由于AAT结构的独特特征，AAT中的许多突变都可能产生非功能性蛋白质。其中，最值得关注的一种是被称为α1-抗胰蛋白酶Pittsburgh(α1-AT-P)，其最初被指定为抗凝血酶Pittsburgh，其特征在于Met358被Arg置换。Pittsburgh突变是在1983年，在一名14岁时死于严重出血障碍的男孩的血浆中被鉴定的。该突变位于反应性RCL环的中间：344GTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNK368(此处标明的编号是针对成熟AAT蛋白，包含对应于其天然形式中Met382的24个氨基酸信号序列)。该突变导致有效的凝血酶抑制活性。
尽管AAT的许多突变是已知的，并且可以在以下网址https://www.uniprot.org/uniprot/P01009中找到，但是仍然需要新的AAT形式和经修饰的AAT，以改进其效用以及新的应用。
发明内容
本发明涉及一种融合蛋白组合物，其包含AAT多肽或其功能性变体，和生物活性多肽；其中所述生物活性多肽与AAT多肽共价连接，经由接头肽与所述AAT多肽共价连接，或它们的组合。所述融合蛋白组合物包含具有N-末端、C-末端和1-50个氨基酸残基的接头肽，并且其中所述接头肽位于所述AAT多肽与所述生物活性多肽之间。AAT多肽可包括mAAT多肽或其功能性变体，其中mAAT多肽或其功能性变体不含半胱氨酸氨基酸残基，其中所述功能性变体与mAAT多肽具有至少85％的序列同一性并且其中mAAT多肽和功能性变体均不具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。
本发明还涉及药物组合物，其包含融合蛋白和任选地一种或多种药学上可接受的载体，所述融合蛋白包含：AAT多肽或其功能性变体；生物活性多肽；其中，所述生物活性多肽与所述AAT多肽共价连接，经由接头肽与所述AAT多肽共价连接或它们的组合。
本发明还涉及包含编码区的表达载体，所述编码区包含编码AAT多肽或其功能性变体的AAT密码(code)，以及编码生物活性多肽的生物活性多肽密码，其中将AAT密码和生物活性多肽密码设置成直接地连接在一起或经由编码具有N末端、C末端和1-50个氨基酸残基的接头肽的接头密码连接在一起，并且其中所述接头密码位于所述AAT密码和所述生物活性多肽密码之间。
本发明还涉及产生融合蛋白的方法，该方法包括：在宿主中表达本文公开的任何一种包含编码融合蛋白的编码区的表达载体，以产生前融合蛋白(pre-fusion protein)；从宿主的细胞，宿主的细胞裂解物，宿主的包涵体，培养宿主的培养基或其组合中收集前融合蛋白；由前融合蛋白产生融合蛋白。
本发明还涉及使用本文公开的药物组合物治疗疾病的方法。该疾病可以是癌症、自身免疫性疾病、糖尿病、血管炎、心脏病、病毒感染，或其组合。
附图说明
图1.融合蛋白的结构的示意图：(A)在其C末端具有AAT或mAAT的结构，以及(B)在其N末端具有AAT或mAAT的结构。
图2.融合蛋白的突变的实例。
图3.制备融合蛋白的方法的示意性实例。
图4.所表达的融合蛋白IL2-接头1-AAT(X＝Ser，Z＝Ser)的凝胶图像的代表性实例。
图5.纯化并重折叠的融合蛋白IL2-接头1-AAT(X＝Ser，Z＝Ser)的凝胶图像的代表性实例。
图6.Mw为约60kDa的IL2-接头1-AAT(X＝Ser；Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。如此处使用的，在包括所有附图的整个公开内容中：分子量标记物(M)以KDa示出；BI：诱导前；AI：诱导后；RF-PU：重折叠和纯化。融合蛋白用箭头指示。
图7.Mw为约60kDa的IL2-接头2-AAT(X＝Ser；Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图8.Mw为约60kDa的IL2-接头2-AAT(X＝Ser；Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图9.使用CTLL2细胞增殖测定法测量的IL2对照(IL2 CN，实心菱形)，IL2-接头1-AAT(X＝Ser；Z＝Ser)(IL2-AAT(S)，实心正方形)和IL2-接头1-AAT(X＝Ser，Z＝Cys)(IL2-AAT(C)，空心三角形)的活性的代表性实例。
图10.细胞刺激测定的代表性实例。使用CTLL2细胞增殖测定法测量IL2蛋白对照和IL2-接头1-AAT(X＝Ser；Z＝Ser)融合蛋白的活性。
图11.体内肿瘤抑制测定的代表性实例。三颗星表示p<0.05。
图12.IL2-接头2-AAT(X＝Ser；Z＝Cys)融合蛋白的抗胰蛋白酶功能的代表性测定。泳道：M.MW标记物；1.包含重链和轻链的抗体PT038；2.IL2-接头2-AAT(X＝Ser；Z＝Cys)；3.抗体加胰蛋白酶；4.IL2-接头2-AAT(X＝Ser；Z＝Cys)加胰蛋白酶；5.抗体和IL2-接头2-AAT(X＝Ser；Z＝Cys)加胰蛋白酶；6.抗体加弹性蛋白酶；7.抗体和IL2-接头2-AAT(X＝Ser；Z＝Cys)加弹性蛋白酶。
图13.Mw为约58kDa的IL15-接头2-AAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图14.Mw为约58kDa的IL15-接头2-AAT(Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化代表性实例。
图15.融合蛋白的活性的代表性实例。使用CTLL2细胞增殖测定法测量的IL15活性：IL2对照(IL2 CN，实心菱形)，mIL15-接头2-AAT(X＝Asn，Z＝Ser)(IL15-AAT(S)，实心正方形)和mIL15-接头2-AAT(X＝Asn，Z＝Cys)(IL15-AAT(C)，空心三角形)。
图16.Mw为约64kDa的G-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图17.Mw为约64kDa的G-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图18.使用M-NFS-60细胞增殖测定法测量的G-CSF活性的代表性实例。G-CSF对照：实心菱形；G-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)：G-CSF-AAT(S)，实心正方形；和G-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)：G-CSF AAT(C)，空心三角形。
图19.Mw为约60kDa的GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图20.Mw为约60kDa的GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图21.使用TF1细胞增殖测定法测量的GM-CSF活性的代表性实例。GM-CSF对照：MG-CSF cn，实心菱形；GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)：GM-CSF-AAT(S)，空心三角形；GM-CSF-AAT(Z＝Cys)：GM-CSF AAT(C)，实心正方形。
图22.Mw为约65kDa的IFNα2-接头2-AAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图23.Mw为约65kDa的IFNα2-接头2-AAT(Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图24.Mw为约65kDa的IFNβ1-接头2-AAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图25.Mw为约65kDa的IFNβ1-接头2-AAT(Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图26.Mw为约48kDa的GLP1-接头2-AAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图27.Mw为约48kDa的GLP1-接头2-AAT(Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图28.Mw为约65kDa的AAT(Z＝Ser)-接头2-FGF21融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图29.Mw为约65kDa的AAT(Z＝Cys)-接头2-FGF21融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图30.Mw为约59kDa的sdAb-接头2-AAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图31.Mw为约59kDa的sdAb-接头2-AAT(Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
图32.对于融合蛋白GLP1-接头2-AAT(Z＝Cys)、AAT(Z＝Cys)-接头2-FGF21、G-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)和GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)的胰蛋白酶蛋白酶抑制功能测定的代表性实例。泳道：1.GLP1-接头2-AAT(Z＝Cys)；2.GLP1-接头2-AAT(Z＝Cys)加胰蛋白酶；3.AAT(Z＝Cys)-接头2-FGF21；4.AAT(Z＝Cys)-接头2-FGF21加胰蛋白酶；5.G-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)；6.G-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)加胰蛋白酶；7.G-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)；8.G-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)加胰蛋白酶；9.GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)；10.GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)加胰蛋白酶；11.GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)；12.GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)加胰蛋白酶。
具体实施方式
以下是与本公开内容的方法和装置有关的各种概念以及实施方案的更详细的描述。应当认识到，以上介绍的主题和下文更为详细讨论的主题的各个方面均可以多种方式中任意种实现，因为所述主题并不限于任何特定的实现方式。提供具体的实现和应用实例主要是用于说明目的。
如本文所用，
术语“蛋白质”(“protein”,“proteins”)、“肽”(“peptide”,“peptides”)、或“多肽”(“polypeptide”，“polypeptide”)是指各自具有氨基酸残基的链，具有经修饰的氨基酸残基的链或其组合的一种或多种生物分子。除非另外特别定义，否则在本公开内容的通篇中，这些术语可以互换使用。例如，术语“生物活性多肽”还可以包括“生物活性肽”或“生物活性蛋白质”。该术语可以指天然生物分子或合成分子，其包括通过化学合成来合成的或通过生物系统(例如表达载体和宿主细胞或无细胞系统)产生的分子。
术语“生物活性剂”或语法上的变型均是指在体内或体外能够具有生物活性的天然或合成材料、化合物、分子、其一部分或其组合。生物活性剂可以是大分子，例如蛋白质、肽、多肽、抗体、单克隆抗体、抗体的衍生物或片段、核苷酸、多核苷酸(例如寡核苷酸、DNA、RNA)；小分子(例如化合物)；一种或多种分子的聚集体；多种分子或物质的复合物；或它们的组合。生物活性剂可以包括生物活性多肽。
术语“融合蛋白”(“fusion protein”,“fusion proteins”)、“融合肽”，“融合多肽”(“fusion polypeptide”,“fusion polypeptides”)、“嵌合蛋白”或“嵌合多肽”是指与两种或更多种蛋白质或其片段具有相似性的同一性的氨基酸残基链的生物分子。
术语“AAT”、“A1AT”或“A1A”是指α-1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶、α1-蛋白酶抑制剂或α1-抗蛋白酶，统称为“AAT”。AAT由人SERPINA1基因编码。术语“AAT”还包括经修饰的AAT(mAAT)。通篇中术语“mAAT”是指经修饰的AAT。所述修饰可以包括在AAT多肽的至少一个位置处的至少一个氨基酸突变或修饰，在AAT的N-末端处的一个或多个氨基酸的添加或截短，在AAT多肽的C-末端处的一个或多个氨基酸的添加或截短，或其组合。术语“mAAT”也可以指经修饰的AAT编码序列。在实例中，mAAT可在特定位置(例如，如本文公开的Z位置)处具有突变。在其他的实例中，AAT可以具有截短或缺失的信号肽(也称为信号序列)或具有一个或多个附加的氨基酸。在另外的实例中，术语AAT或mAAT也可以指包含针对在某一宿主中的表达而优化的密码子(例如针对在大肠杆菌(E.coli)宿主中的表达而优化的密码子)的cDNA序列。上文或下文公开的修饰可能是适用的。通常，当用另一种蛋白质修饰AAT时，经修饰的AAT蛋白质也可以称为融合蛋白。
本发明涉及融合蛋白组合物，其包含AAT多肽或其功能性变体和生物活性多肽，其中所述生物活性多肽与AAT多肽共价连接，经由接头肽与AAT多肽共价连接或其组合。
融合蛋白组合物可包含具有N末端、C末端和1-50个氨基酸残基的接头肽，其中接头肽位于AAT多肽和生物活性多肽之间。
在实施方案中，生物活性多肽可以连接至接头肽的N-末端，且AAT多肽可以连接至接头肽的C-末端。
在其他实施方案中，生物活性多肽可以连接至接头肽的C-末端，且AAT多肽可以连接至接头肽的N-末端。
本发明的融合蛋白组合物可包含mAAT(经修饰的AAT)多肽或其功能性变体，其中所述mAAT多肽不含半胱氨酸(本文称为Cys或C)氨基酸残基，其中功能性变体与mAAT多肽具有至少85％的序列同一性，并且其中mAAT多肽和功能性变体均不具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。百分比是基于mAAT中氨基酸残基的数量。
与原始的人AAT不同，mAAT可以包含在Z位置(以下定义)处的突变，其中原始的半胱氨酸(C)被不同于半胱氨酸的另一种氨基酸替代。在一个实例中，mAAT可以具有由SEQ IDNO.1中鉴定的氨基酸序列，其中原始的半胱氨酸(C)被丝氨酸(S)替代(SEQ ID.1中的Z位置是氨基酸位置232)。在另一个实例中，Z位置的氨基酸可以选自Z＝A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。在另一个实例中，Z位置的氨基酸可以选自Z＝S或A。不含其信号序列的原始的人AAT示出为SEQ ID.2，在Z位置处具有其原始的半胱氨酸。包含信号序列的原始的人AAT的完整多肽序列示出为SEQ ID NO.3。mAAT可以是具有一个或多个突变的合成多肽，其中至少一个突变是在Z位置处，具有选自Z＝A、R、N、D、B、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V的氨基酸。在实例中，本发明的融合蛋白组合物可包含在mAAT的Z位置处具有丝氨酸或丙氨酸突变的mAAT。
融合蛋白组合物可包含与mAAT多肽或其功能性变体连接的其他氨基酸残基或多肽。在一个实例中，蛋白质组合物可包含这样的mAAT多肽，所述mAAT多肽具有与其N-末端连接的附加的甲硫氨酸(M)，与其N-末端连接的信号肽，或与其N-末端或C-末端连接的其他氨基酸、肽或多肽。
mAAT的功能性变体可以与mAAT多肽具有至少85％的序列同一性，基于mAAT的氨基酸残基的数量计。在一个实例中，其功能性变体可以与mAAT多肽具有85％至100％的同一性，在另一个实例中具有90％至100％的同一性，在另一个实例中具有95％至100％的同一性以及在另一个实例中具有98％至100％的同一性，基于mAAT的氨基酸残基的数量计。mAAT的功能性变体可以不含半胱氨酸(C)，并且可以在Z位置处具有选自Z＝A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V的氨基酸。在具体的实例中，mAAT的功能性变体可以在Z位置处具有选自Z＝S或Z＝A的氨基酸。
mAAT多肽和功能性变体均不具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。
本文公开的融合蛋白组合物可以包含生物活性多肽，其与AAT或mAAT多肽共价连接或经由接头肽与mAAT多肽共价连接。在一个实例中，生物活性多肽可以直接与mAAT多肽共价连接，而没有接头肽；或者在另一个实例中，生物活性多肽可以经由接头肽与mAAT多肽共价连接。在另一个实例中，融合蛋白组合物可包含融合蛋白(所述融合蛋白包含mAAT(经修饰的AAT)多肽或其功能性变体)，以及与mAAT多肽共价连接的或经由接头肽与mAAT多肽共价连接的生物活性多肽。
融合蛋白的示意图示于图1A和图1B中，其中AAT或mAAT多肽(1)经由接头肽(3)连接至生物活性多肽(2)。所示融合蛋白的左侧为N-末端(N)，也称为NH2末端或胺末端，并且其右侧为C末端(C)也称为羧基末端(carboxyl-terminal)、羧基末端(carboxy-terminal)、C末端尾部、C末端终点或COOH末端。
接头肽可以具有N末端、C末端和1-50个氨基酸残基，其中接头肽位于AAT或mAAT多肽与生物活性多肽之间(图1A-图1B)。在一个实例中，生物活性多肽连接至接头肽的N-末端，并且AAT或mAAT多肽连接至接头肽的C末端(图1A)。在另一个实例中，生物活性多肽连接至接头肽的C-末端，并且AAT或mAAT多肽连接至接头肽的N-末端(图1B)。对于融合蛋白，第一个Met(M)残基可以是可选的。在一个实例中，第一个M可以在融合蛋白编码区中编码并在宿主中表达。在另一个实例中，在宿主细胞中第一个M可以随后例如通过氨基肽酶从融合蛋白中移除。
接头肽可以具有1至50个氨基酸残基。当存在时，接头肽可能会影响表达融合蛋白的表达产率(yield)，融合蛋白的结构，有利于融合蛋白的稳定性、活性、生物利用度和体内代谢。通常，尽管对于给定的融合蛋白而言，可能满意地使用许多不同的接头肽序列，但是接头序列在融合蛋白中的适用性必须通过实验确定。
融合蛋白接头根据其结构通常分为三类：柔性接头、刚性接头和体内可裂解的接头。已成功地将这三种类型的接头用于制备功能性融合蛋白。
当两个连接的蛋白质结构域在其移动及与其他蛋白质的相互作用中需要一定自由度时，该接头肽可以是柔性接头。柔性接头可以由小的氨基酸残基(例如甘氨酸、丝氨酸或其组合)组成。也可以添加Thr和Ala来改变其柔性。因为甘氨酸是尺寸最小的氨基酸，所以它可以提供高度的柔性。丝氨酸或苏氨酸(Thr)可通过与水分子形成氢键来帮助维持接头在水溶液中的稳定性，并且减少蛋白质结构域或部分与接头之间的不利的相互作用。合适的柔性接头的实例可包括(Gly)6、(Gly)8、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(n＝1,2或4)(也称为(G4S)n接头)或其变体。许多其他类似的接头序列(例如将Thr或Ala掺入到(G4S)n接头中)也适合于提供与柔性接头类似的功能。
接头肽可以是刚性接头肽，例如，当具有柔性接头的融合蛋白具有某些表达或活性问题，或者需要相连的蛋白结构域的空间间隔时。在融合蛋白中的刚性接头肽可以保持蛋白质结构域之间的距离。刚性接头的两种形式可能适用：例如(EAAAK)n接头，其具有E至K盐桥并且形成螺旋结构；或(XP)n接头，其中X可以是任何氨基酸，优选Ala、Lys或Glu。在接头肽中多个脯氨酸残基的存在可以增加其刚性(stiffness)和增加两个相连蛋白结构域之间的空间间隔。
柔性和刚性接头在体内都是稳定的，并且不允许相连的蛋白质或蛋白质结构域分开。另一方面，可裂解的接头允许相连的蛋白质或蛋白质结构域分开，从而在体内释放出游离的蛋白质结构域。可裂解的接头肽可以包含一个或多个二硫键或一个或多个可蛋白水解的裂解的肽键。二硫键的还原或蛋白水解的裂解可导致相连的蛋白结构域的分开。可裂解的接头可以用于改善生物活性或者改善蛋白质药物对特定组织或细胞的靶向性。可裂解的接头的实例包括环肽接头，其包含在两个Cys残基之间的二硫键；以及蛋白酶敏感性接头，其包含对特定组织或细胞内区室中存在的蛋白酶敏感的裂解位点，所述蛋白酶例如基质金属蛋白酶(MMP)，由FURIN基因编码的弗林蛋白酶(furin)(也称为PACE，成对的碱性氨基酸裂解酶)和组织蛋白酶B(一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶)。
适合于本发明的接头肽可以是柔性接头。刚性接头也可以是合适的，这取决于AAT或mAAT多肽和生物活性多肽的分子结构。接头肽可以包含小的氨基酸残基，例如一个实例中GSTSGS肽(SEQ ID.15)；或可以包含经修饰的(G4S)n接头，例如在另一个实例中为GGGGSGGGGS肽(SEQ ID.16)。
在本文公开的融合蛋白组合物中，生物活性多肽可包含细胞因子、经修饰的细胞因子、肽激素、经修饰的肽激素、干扰素、经修饰的干扰素、生长因子、经修饰的生长因子、抗体、抗体的片段、肽、抗原、新抗原、抑制剂、激活剂、酶、结合蛋白、蛋白质、蛋白质的片段，或其组合。本文使用的术语“抗体”可以包括多克隆抗体(Ab)、单克隆抗体(mAb)、三功能单克隆抗体、双功能单克隆抗体、交叉mAb、IgG、IgM、DV_Ig、IgG-scFV、scFv2-Fc、双纳米抗体、BiTE、tandAB或DART。生物活性多肽可以具有100至500,000道尔顿(或0.1至500KDa)的分子量。在一个实例中，生物活性多肽可以具有100至500,000道尔顿的分子量，在另一个实例中100至250,000道尔顿，在另一个实例中100至150,000道尔顿，在另一个实例中100至100,000道尔顿，在另一个实例中100到75,000道尔顿，在另一个实例中100至50,000道尔顿，在另一个实例中100至25,000道尔顿。在优选的实例中，生物活性多肽可以具有100至25,000道尔顿的分子量。在另一个实例中，生物活性多肽可以具有100至24,000道尔顿的分子量。在另一个实例中，生物活性多肽可以具有0至3个二硫键。对于在大肠杆菌中表达的蛋白质，当蛋白质内或蛋白质分子之间存在三个以上的二硫键时，例如，当一个蛋白质多肽的一个氨基酸与另一个蛋白质多肽的另一个氨基酸之间形成二硫键时，难以发生重折叠。在又一个另外的实例中，生物活性多肽可以具有100至24,000道尔顿的分子量，0至3个二硫键或其组合。
生物活性多肽可以包含一种或多种新抗原或表位。在一个实例中，由Kreiter等人鉴定的突变MHC II类表位(NATURE,692,第520卷，2015年4月30日)可以用作生物活性多肽，以驱动癌症患者中的治疗性免疫应答。
在实例中，生物活性多肽可包含一种或多种干扰素(IFN)，例如I、II或III型INF。在一个实例中，生物活性多肽可包含包括IFN-a、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-μ、IFN-τ或IFN-ζ的哺乳动物I型IFN；在另一个实例中可包含II型IFN-γ；以及在另一个实例中，可包含包括IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)的III型干扰素。在另一些实例中，生物活性多肽可包含白细胞介素-2(IL-2)、经修饰的白细胞介素-2(mIL-2)、白细胞介素-15(IL-15)、经修饰的白细胞介素-15(mIL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、经修饰的粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、经修饰的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)、干扰素α-2(IFN-α2)、经修饰的干扰素α-2(mIFN-a2)、干扰素β-1(IFN-β1)、经修饰的干扰素β-1(mIFN-β1)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、经修饰的胰高血糖素样肽-1(mGLP-1)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、经修饰的成纤维细胞生长因子21(mFGF21)、单域抗体(sdAb)、经修饰的单域抗体(msdAb)、其片段，或其组合。本文所用的术语“其片段”是指本文所公开的多肽的片段。术语“经修饰的多肽”是指包含至少一种突变，缺失，添加或其组合的多肽，例如在至少一个位置上改变至少一个氨基酸残基的突变。在一个实例中，人IL15的Asn72可被突变为Asp72。在另一个实例中，人G-CSF的Cys17可以突变为Ser17。在另一个实例中，人GLP1(7-37)肽的Ala2可以改变为Gly2。在另一个实例中，人IFN-βb1中的Cys 16可以改变为Ser16。本文所用的编号可以基于在N末端不包含信号序列或Met残基的序列。
适合于本发明的融合蛋白组合物的生物活性多肽可以包含白细胞介素-2(IL-2)或经修饰的IL-2(mlL-2)。在实例中，白细胞介素-2(IL-2)可以是人IL-2，例如SEQ ID.4中鉴定的那一个。经修饰的IL-2(mIL-2)可以是经修饰的人IL-2，例如在SEQ ID.10和SEQ IDNO.11中鉴定的那些。经修饰的IL-2可以在mIL-2的X位置处包含丝氨酸或丙氨酸突变，即，突变为在X位置处用Ser或Ala代替Cys。融合蛋白组合物可以包含与接头肽连接在一起的mAAT多肽和mIL-2多肽，其中在mIL-2多肽的X位置处具有丝氨酸或丙氨酸突变并且在mAAT的Z位置处具有丝氨酸或丙氨酸突变。
将X位置定义为氨基酸位置125，其在不包含信号序列的原始的人IL-2多肽中是半胱氨酸(125Cys)(当考虑20个氨基酸的信号序列时为145Cys)，而与融合蛋白中实际氨基酸位置编号无关，该编号可能会因前导序列(例如信号序列)的变化、第一个甲硫氨酸残基的移除或添加，接头的长度或任何其他变化而改变。例如，当X＝C时，在IL-2的位置125处的氨基酸是半胱氨酸，当X＝S时，在mIL-2的位置125处的氨基酸是丝氨酸等等。在本公开内容的通篇中，将本文使用的术语“Z位置”或语法上的变体定义为氨基酸位置256，其在包含信号序列的原始的人AAT多肽中是半胱氨酸(256Cys)(当缺少24个氨基酸的信号序列时为232Cys)，这与融合蛋白中实际氨基酸位置编号无关，该编号可能会因前导序列(例如信号序列)的变化、第一个甲硫氨酸残基的移除或添加、接头的长度或任何其他的变化而改变。例如，当Z＝C时，AAT的位置256处的氨基酸为半胱氨酸(C)，当Z＝S时，mAAT的位置256处的氨基酸为丝氨酸(S)等等。在一个实例中，X＝A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。在另一个实例中，Z＝A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。在另一个实例中，X＝S或A，Z＝S或A，或其组合。X和Z位置以及相应的突变在图2中示意性地说明。融合蛋白及其组合的实例，融合物1至融合物14如表1所示。融合蛋白3-14各自包含了在Z位置处具有特定氨基残基的mAAT多肽，在X位置处具有特定氨基残基的mIL-2多肽和特定的接头肽。融合蛋白1-2各自包含在Z位置处具有原始的Cys残基的AAT多肽，在X位置处具有原始的Cys残基的IL-2多肽和特定的接头肽。
在一个实例中，融合蛋白可包含具有X＝S的mIL-2多肽，短接头和具有Z＝S的mAAT多肽(SEQ ID.5)。在另一个实例中，融合蛋白可包含具有X＝S的mIL-2多肽，长接头和具有Z＝S的mAAT多肽(SEQ ID.6)。
表1.包含AAT(mAAT)和IL-2(mIL-2)组合的融合蛋白的实例(仅显示位于X或Z位置两侧的氨基酸残基)。
Figure BDA0002818940740000151
其他生物活性多肽中的X位置可以根据每个多肽中是否需要在这个位置的突变而变化。例如，在IL15中，X位置定义为原始的IL15多肽的氨基酸73。在大多数情况下，可通过大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶移除生物活性多肽(包括本文公开的许多生物活性多肽)的第一个Met。
适合于本发明的融合蛋白组合物的生物活性多肽可以包含白细胞介素-15(IL-15)或经修饰的IL-15(mIL-15)。在实例中，融合蛋白可以包含连接至长接头(接头2)的生物活性多肽，其包含其中氨基酸73位被Asp(X＝Asp)替代的细胞因子mIL-15多肽(该区域的序列为64-VENLIILANDSLSSNGN-80)，以及具有Z＝Ser的mAAT多肽(此处称为mIL15(X＝Asp，Z＝Ser)，SEQ ID.26)。包含上述mIL15(X＝Asp，Z＝Ser)的融合蛋白可以在大肠杆菌BL21细胞中表达为可溶性蛋白质。在其他的实例中，融合蛋白可以包含与长接头(接头2)连接的生物活性多肽，其包含其中氨基酸73位被Asn替代的mIL-15多肽(该区域的序列为64-VENLIILANNSLSSNGN-80)，以及具有Z＝Ser的mAAT多肽(此处称为mIL15(X＝Asp，Z＝Ser)，SEQ ID.28)。包含上述mIL15(X＝Asn，Z＝Ser)的融合蛋白可以在大肠杆菌BL21细胞中主要表达为包涵体，并且可以通过如本文公开的重折叠过程转化为生物活性融合蛋白。在其他的实例中，融合蛋白可以包含与长接头(接头2)连接的生物活性多肽，其包含其中氨基酸73位被Asn替代的mIL-15多肽(该区域的序列为64-VENLIILANNSLSSNGN-80)，以及具有Z＝Cys的mAAT多肽(此处称为mIL15(X＝Asn，Z＝Cys)，SEQ ID.30)。包含上述mIL15(X＝Asn，Z＝Cys)的融合蛋白可以在大肠杆菌BL21细胞中主要表达为包涵体，并且可以通过如本文公开的重折叠过程转化为生物活性融合蛋白。IL15或mIL15也可以包含cDNA序列，所述cDNA序列含有为在宿主中(例如在大肠杆菌宿主中)表达而优化的经修饰的密码子。
适合于本发明的融合蛋白组合物的生物活性多肽可以包含G-CSF或经修饰的G-CSF(mG-CSF)。在一个实例中，融合蛋白可以包含与接头肽连接的含有细胞生长因子(G-CSF)的生物活性多肽，以及具有Z＝Ser的mAAT多肽(G-CSF-接头-mAAT(Z＝Ser)，SEQID.32)。在另一个实例中，融合蛋白可以包含与接头肽连接的含有细胞生长因子(G-CSF)的生物活性多肽，以及具有Z＝Cys的mAAT多肽(G-CSF-接头-mAAT(Z＝Cys)，SEQ ID.34)。这两种融合蛋白均可以在大肠杆菌BL21细胞中以高表达水平表达为包涵体。这两种融合蛋白都可以高产率重折叠，并且可以具有天然G-CSF的生物学活性。具有一个或多个突变并保留一些或全部天然G-CSF活性的任意G-CSF都可适合作为mG-CSF。在一个实例中，mG-CSF可包含C18S突变，即在G-CSF多肽的氨基酸位置18(对于G-CSF而言的X位置)处的原始的Cys突变为Ser。mG-CSF还可以包含cDNA序列，所述cDNA序列含有为在宿主中(例如在大肠杆菌宿主中)表达而优化的经修饰的密码子。
适合于本发明的融合蛋白组合物的生物活性多肽可以包含GM-CSF或经修饰的GM-CSF(mGM-CSF)。在一个实例中，融合蛋白可以包含与接头肽连接的含有细胞生长因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的生物活性多肽，以及具有Z＝Ser的mAAT多肽(GM-CSF-接头-AAT(Z＝Ser)，SEQ ID.36)。在另一个实例中，融合蛋白可以包含与接头肽连接的含有GM-CSF的生物活性多肽，以及具有Z＝Cys的mAAT多肽(GM-CSF-接头-AAT(Z＝Cys)，SEQID.38)。这两种融合蛋白均可以在大肠杆菌BL21细胞中以高表达水平表达为包涵体。这两种融合蛋白都可以高产率重折叠，并且可以具有天然GM-CSF的生物学活性。mGM-CSF还可以包含cDNA序列，所述cDNA序列含有为在宿主中(例如在大肠杆菌宿主中)表达而优化的经修饰的密码子。
生物活性多肽可包含IFN-α2或经修饰的IFN-α2(m1FN-α2)。在一个实例中，融合蛋白可以包含与接头肽连接的含有IFN-α2的生物活性多肽，以及具有Z＝Ser的mAAT多肽(IFN-α2-接头-AAT(Z＝Ser)，SEQ ID.40)。在另一个实例中，融合蛋白可以包含与接头肽连接的含有IFN-α2的生物活性多肽，以及具有Z＝Cys的mAAT多肽(IFN-α2-接头-AAT(Z＝Cys)，SEQ ID.42)。这两种融合蛋白均可以在大肠杆菌BL21细胞中以高表达水平表达为包涵体。这两种融合蛋白都可以高产率重折叠。具有一个或多个突变并保留一些或全部天然IFN-α2活性的任意IFN-α2都可适合作为mIFN-α2。mIFN-α2还可以包含cDNA序列，所述cDNA序列含有为在宿主中(例如在大肠杆菌宿主中)表达而优化的经修饰的密码子。
生物活性多肽可包含IFN-β1或经修饰的IFN-β1(m1FN-β1)。在一个实例中，融合蛋白可以包含与接头肽连接的含有IFN-β1的生物活性多肽，以及具有Z＝Ser的mAAT多肽(IFN-β1-接头-AAT(Z＝Ser)，SEQ ID.44)。在另一个实例中，融合蛋白可以包含与接头肽连接的含有IFN-β1的生物活性多肽，以及具有Z＝Cys的mAAT多肽(IFN-β1-接头-AAT(Z＝Cys)，SEQ ID.46)。这两种融合蛋白均可以在大肠杆菌BL21细胞中以高表达水平表达为包涵体。这两种融合蛋白都可以高产率重折叠。具有一个或多个突变并保留一些或全部天然IFN-β1活性的任意IFN-β1都可适合作为mIFN-β1。mIFN-β1还可以包含cDNA序列，所述cDNA序列含有为在宿主中(例如在大肠杆菌宿主中)表达而优化的经修饰的密码子。在又一个实例中，生物活性多肽包含具有C17S突变的IFN-β1，即在IFN-β1多肽的氨基酸位置17(IFN-β1的X位置)处的原始的Cys突变为Ser。
生物活性多肽可以包含GLP-1或经修饰的GLP-1(mGLP-1)。在一个实例中，融合蛋白可以包含与接头肽连接的含有肽激素类似物mGLP-1的生物活性多肽，以及具有Z＝Ser的AAT多肽(GLP-1-接头-AAT(Z＝Ser)，SEQ ID.48)。在另一个实例中，融合蛋白可以包含与接头肽连接的含有肽激素类似物mGLP-1的生物活性多肽，以及具有Z＝Cys的AAT多肽(GLP-1-接头-AAT(Z＝Cys)，SEQ ID NO.50)。这两种融合蛋白均可以在大肠杆菌BL21细胞中以高表达水平表达为包涵体。这两种融合蛋白都可以高产率重折叠。具有一个或多个突变并保留一些或全部天然GLP-1活性的任意的GLP-1都可适合作为mGLP-1。mGLP-1还可以包含cDNA序列，所述cDNA序列含有为在宿主(例如在大肠杆菌宿主)中表达而优化的经修饰的密码子。在又一个实例中，生物活性多肽可包含具有A2G突变的GLP-1，即在GLP-1多肽的氨基酸位置2(GLP-1的X位置)处的原始Ala突变为Gly。
生物活性多肽可以包含FGF21或经修饰的FGF21(mFGF21)。在一个实例中，融合蛋白可以包含经由接头肽与mAAT多肽的C末端融合的含有细胞生长因子FGF21的生物活性多肽，并且在mAAT中具有Z＝Ser(AAT(Z＝Ser)-接头-FGF21，SEQ ID.52)。在另一个实例中，融合蛋白可以包含经由接头肽与mAAT多肽的C末端融合的含有FGF21的生物活性多肽，并且在mAAT中具有Z＝Cys(AAT(Z＝Cys)-接头-FGF21，SEQ ID.54)。这两种融合蛋白均可以在大肠杆菌BL21细胞中以高表达水平表达为包涵体。这两种融合蛋白都可以高产率重折叠。具有一个或多个突变并保留一些或全部天然FGF21活性的任意FGF21都可适合作为mFGF21。mFGF21还可以包含cDNA序列，所述cDNA序列含有为在宿主(例如在大肠杆菌宿主)中表达而优化的经修饰的密码子。在又一个实例中，生物活性多肽可包含在其C末端被截短的FGF21。
生物活性多肽可以包含sdAb或经修饰的sdAb(msdAb)。在一个实例中，融合蛋白可以包含与接头肽连接的含有单域抗体(sdAb)的生物活性多肽，及具有Z＝Ser的mAAT多肽(sdAb-接头-AAT(Z＝Ser)，SEQ ID.56)。在另一个实例中，融合蛋白可以包含与接头肽连接的含有单域抗体(sdAb)的生物活性多肽，及具有Z＝Cys的mAAT多肽(sdAb-接头-AAT(Z＝Cys)，SEQ ID.58)。这两种融合蛋白均可以在大肠杆菌BL21细胞中以高表达水平表达为包涵体。这两种融合蛋白都可以高产率重折叠。具有一个或多个突变并保留一些或全部天然sdAb活性的任意sdAb都可适合作为msdAb。msdAb还可以包含cDNA序列，所述cDNA序列含有为在宿主(例如在大肠杆菌宿主)中表达而优化的经修饰的密码子。
本文公开的蛋白质组合物可进一步包含靶向试剂，其共价连接至AAT或mAAT多肽、生物活性多肽或其组合。
靶向试剂可以包含抗体、抗体片段、抗原、新抗原或其组合。靶向试剂可用于将融合蛋白靶向至生物受试者(例如患者)中的特定位置。在一个实例中，靶向试剂可以与融合蛋白的mAAT共价连接；在另一个实例中，可以与融合蛋白的生物活性多肽共价连接；或者在另一个实例中，可以同时与融合蛋白的mAAT和生物活性多肽共价连接。在一个实例中，靶向试剂可以与mAAT-mIL-2融合蛋白的mAAT共价连接；在另一实例中，可以与融合蛋白的mIL-2共价连接；或者在另一个实例中，可以同时与融合蛋白的mAAT和IL-2共价连接。
本发明还涉及包含融合蛋白和任选地一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物，所述融合蛋白包含：
AAT多肽或其功能性变体；
生物活性多肽；
其中，所述生物活性多肽与AAT多肽共价连接，经由接头肽与AAT多肽共价连接，或它们的组合。
任何上述的融合蛋白都可能适用于所述药物组合物。融合蛋白可以包含具有N末端、C末端和1-50个氨基酸残基的接头肽，并且其中接头肽位于AAT多肽和生物活性多肽之间。上述接头肽都可以是合适的。
在一个实例中，生物活性多肽可以共价连接至接头肽的N-末端，并且AAT多肽可以共价连接至接头肽的C-末端。在另一个实例中，生物活性多肽可以连接至接头肽的C-末端，并且AAT多肽可以连接至接头肽的N-末端。
适合于本发明的药物组合物的AAT多肽可以包含mAAT多肽或其功能性变体，其中mAAT多肽或其功能性变体可以不含半胱氨酸氨基酸残基，其中功能性变体可以与mAAT多肽具有至少85％的序列同一性，并且其中mAAT多肽及其功能性变体均不具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。
适合于本发明的药物组合物的融合蛋白可包含在mAAT的Z位置处具有丝氨酸或丙氨酸突变的mAAT。
适合于本文公开的药物组合物的生物活性多肽可以包含细胞因子、经修饰的细胞因子、肽激素、经修饰的肽激素、干扰素、经修饰的干扰素、生长因子、经修饰的生长因子、抗体、抗体的片段、肽、抗原、新抗原、抑制剂、激活剂、酶、结合蛋白、蛋白质、蛋白质片段，或其组合。任意的上述生物活性多肽都可以是合适的。在一个实例中，生物活性多肽可以具有100至500,000道尔顿的分子量，在另一个实例中100至250,000道尔顿，在另一个实例中100至150,000道尔顿，在另一个实例中100至100,000道尔顿，在另一个实例中100到75,000道尔顿，在另一个实例中100至50,000道尔顿，在另一个实例中100至25,000道尔顿。在一个具体的实例中，生物活性多肽可以具有100至25,000道尔顿的分子量。在另外的实例中，生物活性多肽可以具有100至24,000道尔顿的分子量。在另外的实例中，生物活性多肽可以具有0至3个二硫键。在另外的实例中，生物活性多肽可以具有100至24,000道尔顿的分子量，0至3个二硫键，或其组合。
适合于本发明的药物组合物的生物活性多肽可以包含白细胞介素-2(IL-2)、经修饰的白细胞介素-2(mIL-2)、白细胞介素-15(IL-15)、经修饰的白细胞介素-15(mIL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、经修饰的粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、经修饰的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)、干扰素α-2(IFN-α2)、经修饰的干扰素α-2(mIFN-α2)、干扰素β-1(IFN-β1)、经修饰的干扰素β-1(mIFN-β1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、经修饰的胰高血糖素样肽-1(mGLP-1)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、经修饰的成纤维细胞生长因子21(mFGF21)、单域抗体(sdAb)、经修饰的单域抗体(msdAb)、其片段，或其组合。
在一个实例中，生物活性多肽可以包含白细胞介素2(IL-2)，或者在另一个实例中包含经修饰的IL-2(mIL-2)。所述mIL-2可以在mIL-2的X位置处包含丝氨酸或丙氨酸突变。在本文公开的药物组合物中，融合蛋白可以包含mAAT和mIL-2，且在mIL-2的X位置处具有丝氨酸或丙氨酸突变并且在mAAT的Z位置处具有丝氨酸或丙氨酸突变。
适合于本发明的药物组合物的生物活性多肽可以包含白细胞介素-15(IL-15)或经修饰的IL-15(mIL-15)，如上所述。
适合于本发明的药物组合物的生物活性多肽可以包含G-CSF或经修饰的G-CSF(mG-CSF)，如上所述。
适合于本发明的药物组合物的生物活性多肽可以包含IFN-α2或经修饰的IFN-α2(mIFN-α2)，如上所述。
适合于本发明的药物组合物的生物活性多肽可以包含IFN-β1或经修饰的IFN-β1(mIFN-β1)，如上所述。
适合于本发明的药物组合物的生物活性多肽可包含GLP-1或经修饰的GLP-1(mGLP-1)，如上所述。
适合于本发明的药物组合物的生物活性多肽可以包含FGF21或经修饰的FGF21(mFGF21)，如上所述。
适合于本发明的药物组合物的生物活性多肽可以包含GM-CSF或经修饰的GM-CSF(mG-CSF)，如上所述。
适合于本发明的药物组合物的生物活性多肽可以包含sdAb或经修饰的sdAb(msdAb)，如上所述。
如上所述，融合蛋白还可以包含靶向试剂，其共价连接至AAT或mAAT多肽、生物活性多肽或其组合。
本发明还涉及包含mAAT多肽或其功能性变体的蛋白质组合物，其中mAAT多肽或其功能性变体不含半胱氨酸氨基酸残基，所述功能性变体可以与mAAT多肽具有至少85％的序列同一性，并且其中mAAT多肽和功能性变体都不具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。所述蛋白质组合物可以包含在mAAT的Z位置处具有丝氨酸或丙氨酸突变的mAAT。
本发明还涉及包含本文公开的蛋白质组合物的药物组合物。
本发明还涉及表达载体，其包含编码区，所述编码区包含编码AAT多肽或其功能性变体的AAT密码，以及编码生物活性多肽的生物活性多肽密码，其中将AAT密码和生物活性多肽密码设置为直接连接在一起，或者设置为经由编码具有N末端、C末端和1-50个氨基酸残基的接头肽的接头密码而连接在一起，并且其中接头密码位于所述AAT密码和生物活性多肽密码之间。
在实例中，将编码区设置为在表达时，具有与所述接头肽的N-末端连接的生物活性多肽以及与所述接头肽的C末端连接的AAT多肽。
在其他实例中，将编码区设置为在表达时，具有与所述接头肽的C末端连接的生物活性多肽以及与所述接头肽的N末端连接的AAT多肽。
适合于本发明的表达载体的AAT密码可以包含编码mAAT多肽或其功能性变体的mAAT密码，其中mAAT多肽或其功能性变体不含半胱氨酸氨基酸残基，其中所述功能性变体与mAAT多肽具有至少85％的序列同一性，并且其中mAAT多肽和功能性变体均不具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。
在本文公开的表达载体中，编码区还可以包含编码生物活性多肽的生物活性多肽密码，其中将mAAT密码和生物活性多肽密码设置为直接连接在一起，或者设置为经由编码具有1至50个氨基酸残基的接头肽的接头密码而连接在一起。编码区可以包含mAAT密码和生物活性多肽密码，其在一个实例中被设置为直接连接在一起，或在另一个实例中被设置为经由编码连接肽的接头密码而连接在一起。mAAT密码可以编码在mAAT的Z位置处具有丝氨酸或丙氨酸突变的mAAT多肽。
在一个实例中，可将编码区设置为在表达时，具有与接头肽的N-末端连接的生物活性多肽以及与接头肽的C-末端连接的mAAT多肽。在另一个实例中，可将编码区设置为在表达时，具有与接头肽的C-末端连接的生物活性多肽以及与接头肽的N-末端连接的mAAT多肽。
在一个实施方案中，对生物活性多肽密码进行设置，以编码生物活性多肽，所述生物活性多肽包括细胞因子、经修饰的细胞因子、肽激素、经修饰的肽激素、干扰素、经修饰的干扰素、生长因子、经修饰的生长因子、抗体、抗体的片段、肽、抗原、新抗原、抑制剂、激活剂、酶、结合蛋白、蛋白质、蛋白质的片段，或其组合。编码上述生物活性多肽的任何密码都可以是合适的。在一些实例中，生物活性多肽可以包含白细胞介素-2(IL-2)、经修饰的白细胞介素-2(mIL-2)、白细胞介素-15(IL-15)、经修饰的白细胞介素-15(mIL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、经修饰的粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、经修饰的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)、干扰素α-2(IFN-α2)、经修饰的干扰素α-2(mIFN-α2)、干扰素β-1(IFN-β1)、经修饰的干扰素β-1(mIFN-β1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、经修饰的胰高血糖素样肽-1(mGLP-1)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、经修饰的成纤维细胞生长因子21(mFGF21)、单域抗体(sdAb)、经修饰的单域抗体(msdAb)、其片段，或其组合。
在一个实例中，生物活性多肽可以具有为100至500,000道尔顿的分子量，在另一个实例中100至250,000道尔顿，在另一个实例中100至150,000道尔顿，在另一个实例中100至100,000道尔顿，在另一个实例中100到75,000道尔顿，在另一个实例中100至50,000道尔顿，在另一个实例中100至25,000道尔顿。在一个具体的实例中，生物活性多肽可以具有100至25,000道尔顿的分子量。在另外的实例中，生物活性多肽可以具有100至24,000道尔顿的分子量。在另外的实例中，生物活性多肽可以具有0至3个二硫键。在另外的实例中，生物活性多肽可以具有100至24,000道尔顿的分子量，0至3个二硫键或其组合。
在另一个实施方案中，生物活性多肽包含白细胞介素2(IL-2)或经修饰的IL-2(mIL-2)。所述mlL-2可以在mlL-2的X位置处包含丝氨酸或丙氨酸突变。在另外的实例中，mAAT密码可以包括编码在mAAT的Z位置处的丝氨酸或丙氨酸突变的密码，并且生物活性多肽密码可以包括编码在mlL-2的X位置处的丝氨酸或丙氨酸突变的密码。
在另一个实施方案中，编码区可以包含SEQ ID.7中鉴定的密码，SEQ ID.7编码包含mIL-2、短接头肽GSTSGS和mAAT的融合蛋白；或者包含SEQ ID.8中鉴定的密码，SEQ ID.8编码包含mIL-2、长接头肽GGGGSGGGGS和mAAT的融合蛋白。
适合于本发明的表达载体的生物活性多肽可以包含白细胞介素15(IL-15)或经修饰的IL-15(mIL-15)。
适合于本发明的表达载体的生物活性多肽可以包含G-CSF或经修饰的G-CSF(mG-CSF)。
适合于本发明的表达载体的生物活性多肽可以包含IFN-α2或经修饰的IFN-α2(mIFN-α2)。
适合于本发明的表达载体的生物活性多肽可以包含IFN-β1或经修饰的IFN-β1(mIFN-β1)。
适合于本发明的表达载体的生物活性多肽可以包含GLP-1或经修饰的GLP-1(mGLP-1)。
适合于本发明的表达载体的生物活性多肽可以包含FGF21或经修饰的FGF21(mFGF21)。
适合于本发明的表达载体的生物活性多肽可以包含sdAb或经修饰的sdAb(msdAb)。
适合于本发明的表达载体的编码区还可以包含编码靶向试剂多肽的靶向试剂密码，所述靶向试剂多肽连接至AAT多肽、生物活性多肽或其组合。
可以对本文公开的表达载体进行设置，以在原核生物、真核生物、病毒系统、细胞培养系统、无细胞表达系统、细菌、酵母、昆虫细胞、植物、哺乳动物细胞或其组合中表达。可以将表达载体设置为，在一个实例中在无细胞系统中表达编码区，在另一个实例中在细菌大肠杆菌中表达编码区，在另一个实例中在酵母中表达编码区，在另一个实例中在哺乳动物细胞中表达编码区以及在另一个实例中在病毒-宿主系统中表达编码区。还可以将表达载体设置为在系统的组合中表达编码区，例如同时具有大肠杆菌和哺乳动物表达盒的载体，所述表达盒包括启动子、增强子、诱导序列、终止子、poly(A)或本领域技术人员已知的表达所必需的其他元件。
可以基于所选择的宿主来设置表达载体。典型的宿主可以包括：细菌、酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动物细胞。可以基于多种因素来选择一种或多种宿主，例如目的蛋白质的性质、期望的表达产率、发育时间、表达载体的可得性以及其他技术和生产因素。
细菌宿主作为表达系统提供了一些重要优势，包括蛋白质产率高、发育周期快、生产成本低、对蛋白质表达调控的深入了解以及表达载体的广泛可得性。但是，细菌宿主也具有某些缺点。首先，在大肠杆菌中表达的许多哺乳动物蛋白质都是不溶形式(包涵体)，因此需要重折叠过程以获得可溶性蛋白质。目前，没有用于蛋白质重折叠的通用方法，并且需要根据经验开发以建立高产率的重折叠方法。第二，作为原核生物，细菌中表达的蛋白质位于胞质中，这是一种还原性环境，阻止正确的蛋白质折叠所需要的蛋白质二硫键的形成。由于大多数真核生物分泌的蛋白质都含有二硫键，因此细菌中表达的真核蛋白质通常需要额外的步骤来形成其功能所需的二硫键。这可能是一个挑战，特别是当蛋白质包含多个二硫键时。第三，细菌中表达的蛋白质通常不包含正确的翻译后修饰，例如糖基化或磷酸化，这可能会影响其生物学活性。在细菌表达系统中，虽然也可以使用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和其他细菌，但是大肠杆菌是最广泛使用的细菌。
通常使用三种类型的酵母作为产生蛋白质的宿主细胞：毕赤酵母(Pichiapastoris)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和乳克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)。尽管酵母表达系统具有以下优点：高的生物量、容易的遗传操作以及可以表达分泌的蛋白质，但是酵母表达系统的某些缺点却限制了其更广泛的使用。例如，酵母的N-和O-糖基化与哺乳动物细胞中的不同。这可能导致具有酵母糖基化的蛋白质在其他生物体(例如人)中具有免疫原性。另外，与其他宿主中的表达水平相比，许多哺乳动物蛋白质在酵母中的表达水平相对较低。
昆虫细胞也可以用于蛋白质表达。常用的昆虫细胞系包括例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(来自鳞翅目(lepidopteran)(飞蛾和蝴蝶))和杆状病毒(Baculovirus)(一种可以感染昆虫细胞的杆状病毒)。将病毒衍生的穿梭载体称为杆粒(bacmid)。昆虫细胞可以快速生长，而无需通常促进细胞生长所必需的昂贵血清。蛋白质通常以糖基化的可溶形式表达，尽管聚糖的模式可能与哺乳动物细胞中表达的模式不同。
类似地，许多类型的植物都可以用于蛋白质表达，并且许多植物表达载体都是可用的。
将哺乳动物细胞用于大多数治疗性蛋白质产品的生产。尽管已经开发了Hela细胞、HEK293细胞、COS细胞和许多其他哺乳动物细胞用于蛋白质生产，但是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞实际上已经成为生产治疗性蛋白质的生物制药行业的标准宿主。CHO细胞可以被改造为适应无血清培养基，并且在悬液中生长至高的细胞密度(>2x107)。对于抗体而言，蛋白质产率可高达10g/L。蛋白质产物通常以正确折叠的可溶形式表达，其糖基化与源自哺乳动物的蛋白质的天然形式相似。CHO表达系统的缺点可能包括发育周期时间长、细胞培养基成本高以及处理和操作复杂(通常需要高水平的技术技能)。
无细胞系统已用于小规模的蛋白质生产。由于试剂成本高且产率相对较低，因此无细胞系统的使用一般非常有限。
表达载体(例如质粒或基于病毒的表达载体)通常包含大肠杆菌复制起点(PUCOri)和大肠杆菌选择性标记(AMP和KAN是最常使用的)，以促进在大肠杆菌中进行的克隆过程。如果表达宿主不是大肠杆菌，它也可以包含所选宿主的选择性标记。例如，抗生素新霉素抗性标记NeoR可用于许多不同的宿主细胞，DHFR和GS可用于CHO表达载体。如果表达载体未被整合到宿主基因组中，则表达载体中还需要宿主细胞的复制起始序列。
表达载体可以包含表达盒，所述表达盒包含启动子、增强子和翻译起始位点(用于哺乳动物细胞的Kozak序列和用于大肠杆菌的Shine-Dalgarno序列)。这些元件通常可能位于第一个密码子ATG之前，尽管哺乳动物系统中的增强子可以位于编码区的中间或之后。通常有合适的限制性酶切位点，用于插入编码目的蛋白的cDNA序列。cDNA编码序列可以通过化学基因合成或通过来自基因模板的PCR扩增获得。表达盒还可以包含聚腺苷酸化位点，以确保在终止密码子(例如TAA)之后在编码序列末端对mRNA的适当加工。如果目的蛋白旨在从宿主细胞分泌到培养基中，则表达盒还可以包括包含在编码区中的信号序列。
启动子可以包括强启动子，例如用于大肠杆菌的T7启动子，用于毕赤酵母的AOX1启动子；用于杆状病毒的pPolh启动子和用于CHO细胞的CMV启动子。许多其他启动子也可以用于实现不同的表达水平。
根据启动子的选择，可以将表达载体设置为组成型表达或诱导型表达。在强启动子下的组成型表达可导致细胞生长过程中大量蛋白质产物的积累。例如，在CHO细胞中CMV启动子下的重组抗体的表达是组成型的。抗体产物被连续分泌到培养基中。对于在大肠杆菌或酵母中的蛋白质表达，可以使用诱导型启动子。在一个实例中，大肠杆菌中的蛋白质表达可以在lac操纵子和T7启动子的控制下。在将诱导剂例如IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)加入到生长培养基之后，基因表达可以启动。在另一个实例中，酵母毕赤酵母中的蛋白质表达可以在AOX1启动子的控制下，其可以通过在生长培养基中加入甲醇来诱导。
除表达盒中的元件例如启动子和增强子以外，重组蛋白的表达也可能受到编码序列的影响。通过密码子优化而改变cDNA序列有时可以使蛋白质产率提高许多倍。表达产率的提高通常是由于消除了宿主细胞中很少使用的密码子以及消除了可能对翻译产生抑制作用的某些mRNA结构。表达载体可以包含具有优化密码子的编码区，以在大肠杆菌宿主中产生本发明的融合蛋白。在一个实例中，表达载体可以包含具有编码AAT或mAAT多肽的优化密码子的编码区。在另一个实例中，表达载体可以包含具有编码生物活性多肽的优化密码子的编码区。在另一个实例中，表达载体可以包含具有编码mIL-2多肽的优化密码子的编码区。在另一个实例中，表达载体可以包含具有编码AAT或mAAT和mIL-2多肽的优化密码子的编码区。
本发明还涉及产生融合蛋白的方法，该方法包括：
在宿主中表达包含编码融合蛋白的编码区的表达载体以产生前融合蛋白；
从宿主的细胞，所述宿主的细胞裂解物，宿主的包涵体，培养宿主的培养基或其组合中收集前融合蛋白；以及
由前融合蛋白产生融合蛋白。
本文公开的任何表达载体都可适合于该方法。可以对表达载体进行设置，以包含编码融合蛋白的编码区，所述融合蛋白包含AAT或mAAT多肽和生物活性多肽；所述生物活性多肽包括细胞因子、经修饰的细胞因子、肽激素、经修饰的肽激素、干扰素、经修饰的干扰素、生长因子、经修饰的生长因子、抗体、抗体的片段、肽、抗原、新抗原、抑制剂、激活剂、酶、结合蛋白、蛋白质、蛋白质的片段，或其组合。
适合于该方法的表达载体可以包含生物活性多肽，所述生物活性多肽包括白细胞介素-2(IL-2)、经修饰的白细胞介素-2(mIL-2)、白细胞介素-15(IL-15)、经修饰的白细胞介素-15(mIL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、经修饰的粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、经修饰的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)、干扰素α-2(IFN-α2)、经修饰的干扰素α-2(mlFN-α2)、干扰素β-1(IFN-β1)、经修饰的干扰素β-1(mlFN-β1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、经修饰的胰高血糖素样肽1(mGLP-1)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、经修饰的成纤维细胞生长因子21(mFGF21)、单域抗体(sdAb)、经修饰的单域抗体(msdAb)、其片段，或其组合。
适合于该方法的生物活性多肽在一个实例中可以具有100至500,000道尔顿的分子量，在另一个实例中100至250,000道尔顿，在另一个实例中100至150,000道尔顿，在另一个实例中100至100,000道尔顿，在另一个实例中100到75,000道尔顿，在另一个实例中100至50,000道尔顿，在另一个实例中100至25,000道尔顿。在一个具体的实例中，生物活性多肽可以具有100至25,000道尔顿的分子量。生物活性多肽可以具有100至500,000道尔顿的分子量，其包括上述每一个分子量范围。在另外的实例中，生物活性多肽可以具有100至24,000道尔顿的分子量。在另外的实例中，生物活性多肽可以具有0至3个二硫键。在另外的实例中，生物活性多肽可以具有100至24,000道尔顿的分子量，0至3个二硫键或其组合。
适合于本发明方法的生物活性多肽包含白细胞介素2(IL-2)或经修饰的IL-2(mlL-2)。所述mlL-2可以在mlL-2的X位置处包含丝氨酸或丙氨酸突变。在一个实例中，表达载体可以包含含有编码mAAT多肽或其功能性变体的mAAT密码的编码区，其中mAAT多肽或其功能性变体不含半胱氨酸氨基酸残基，其中功能性变体与mAAT多肽具有至少85％的序列同一性，并且其中mAAT多肽和功能变体都不具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。在另一个实例中，上述表达载体的编码区还可以包含编码生物活性多肽的生物活性多肽密码，其中将mAAT密码和生物活性多肽密码设置为直接连接在一起，或者设置为经由编码具有1-50个氨基酸残基的接头肽的接头密码而连接在一起。编码区可包含mAAT密码和生物活性多肽密码，其被设置为直接连接在一起的或者被设置为经由编码接头肽的接头密码而连接在一起的。在另一个实例中，可以将编码区设置为在表达时，具有与接头肽的N-末端连接的生物活性多肽以及与接头肽的C-末端连接的mAAT多肽。在另一个实例中，可以将编码区设置为在表达时，具有与接头肽的C-末端连接的生物活性多肽以及与接头肽的N-末端连接的mAAT多肽。在另一个实例中，表达载体可以包含编码mAAT的Z位置处的丝氨酸或丙氨酸突变的mAAT密码，以及编码mIL-2多肽的X位置处的丝氨酸或丙氨酸突变的生物活性多肽密码。在另一个实例中，表达载体可以包含含有在SEQ ID NO.7中鉴定的密码的编码区，SEQ ID NO.7编码包含mIL-2多肽、短接头肽GSTSGS和mAAT的融合蛋白；或者包含含有在SEQ ID NO.8中鉴定的密码的编码区，SEQ ID NO.8编码包含mIL-2、长接头肽GGGGSGGGGS和mAAT多肽的融合蛋白。
对于本文公开的方法，在一个实例中，编码上述融合蛋白的编码区可以包含mAAT多肽和白细胞介素-2(IL-2)多肽，或者mAAT多肽和经修饰的白细胞介素-2(mlL-2)多肽。编码融合蛋白的编码区可以包含由SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8中鉴定的密码。
适合于本发明方法的生物活性多肽可以包含白细胞介素-15(IL-15)或经修饰的IL-15(mIL-15)。
适合于本发明方法的生物活性多肽可以包含G-CSF或经修饰的G-CSF(mG-CSF)。
适合于本发明方法的生物活性多肽可包含IFN-α2或经修饰的IFN-α2(mIFN-α2)。
适合于本发明方法的生物活性多肽可以包含IFN-β1或经修饰的IFN-β1(mIFN-β1)。
适合于本发明方法的生物活性多肽可以包含GLP-1或经修饰的GLP-1(mGLP-1)。
适合于本发明方法的生物活性多肽可以包含FGF21或经修饰的FGF21(mFGF21)。
适合于本发明方法的生物活性多肽可以包含sdAb或经修饰的sdAb(msdAb)。
适合于本发明方法的融合蛋白还可以包含靶向试剂，其共价连接至AAT或mAAT多肽、生物活性多肽或其组合。
对于本文公开的方法，宿主可以包含大肠杆菌细胞。本文公开的表达载体可以用于表达融合蛋白。基于表达载体，可以进行诱导，例如通过加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)来诱导表达以产生前融合蛋白(101)(图3)。
在本文公开的方法中，可以从包涵体(102)中收集前融合蛋白。如果宿主产生可溶形式的融合蛋白，则也可以从细胞或培养基中收集融合蛋白(103)。如果融合蛋白是不溶的且主要位于包涵体中，则可以破坏细胞并且可以收集包涵体(104)。
融合蛋白可以由前融合蛋白通过重折叠过程产生，该过程包括：
(1)使前融合蛋白与变性剂接触；
(2)通过逐渐移除变性剂使前融合蛋白发生重折叠以形成融合蛋白；以及
(3)纯化融合蛋白。
含有前融合蛋白的包涵体可以在与变性剂接触之前用洗涤缓冲液洗涤。洗涤缓冲液可包含盐、洗涤剂或其组合。在变性步骤(105)中，变性剂可以包含变性剂，例如胍、胍-HCl、尿素或其组合，以及还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇或其组合。变性剂还可以包含一种或多种盐、一种或多种洗涤剂例如Triton X-100、脱氧胆酸钠或其组合。变性剂可以例如通过透析逐渐移除。移除变性剂后，增溶的融合蛋白可以发生重折叠(107)。然后可以纯化重折叠的增溶的蛋白(108)以产生纯化的融合蛋白(109)。如果需要，可任选地使可溶性融合物变性并且重折叠(106)以修饰或改善蛋白质结构。可溶性蛋白质也可以直接纯化(108)，而无需进行重折叠。
可以使用离子交换色谱法，例如强阴离子交换或弱阴离子交换色谱法来，纯化融合蛋白。HiTrap Q HP阴离子交换色谱柱(可以由GE Health Life Sciences,Pittsburgh,PA,USA获得)可适合用作强阴离子交换色谱。HiTrap DEAE Sepharose FF(也可以由GEHealth Life Sciences获得)是适用于弱阴离子交换色谱法的实例。可以将蛋白质上样到Q柱或DEAE柱上，并根据制造商的说明书进行洗脱。
本发明还涉及在有需要的受试者中治疗疾病的方法。该方法可以包括向受试者给予本文公开的药物组合物。
本发明的任意上述药物组合物都可是合适的。药物组合物可以包含含有AAT或mAAT多肽和生物活性多肽的融合蛋白。药物组合物可以包含含有AAT或mAAT多肽、生物活性多肽和位于AAT或mAAT多肽与生物活性多肽之间的接头的融合蛋白，如上所述。药物组合物可以包含含有AAT或mAAT多肽、IL-2多肽和接头肽的融合蛋白，其中AAT或mAAT多肽在Z位置处具有丝氨酸或丙氨酸残基，IL-2多肽在X位置处具有丝氨酸或丙氨酸残基。
在另一个实例中，融合蛋白可以包含具有X＝S或X＝A的mIL-2多肽、短接头和具有Z＝S或Z＝A的mAAT多肽(例如SEQ ID.5)。在另一个实例中，融合蛋白可以包含具有X＝S或X＝A的mIL-2多肽、长接头和具有Z＝S或Z＝A的mAAT多肽(例如，SEQ ID.6)。
适用于本发明方法的融合蛋白可包含AAT或mAAT以及生物活性多肽，所述生物活性多肽包括白细胞介素-2(IL-2)、经修饰的白细胞介素-2(mIL-2)、白细胞介素-15(IL-15)、经修饰的白细胞介素-15(mIL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、经修饰的粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、经修饰的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)、干扰素α-2(IFN-α2)、经修饰的干扰素α-2(mIFN-α2)、干扰素β-1(IFN-β1)、修饰干扰素β-1(mIFN-β1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、经修饰的胰高血糖素样肽-1(mGLP-1)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、经修饰的成纤维细胞生长因子21(mFGF21)、单域抗体(sdAb)、经修饰的单域抗体(msdAb)、其片段，或其组合。
适用于该方法的生物活性多肽在一个实例中可以具有100至500,000道尔顿的分子量，在另一个实例中100至250,000道尔顿，在另一个实例中100至150,000道尔顿，在另一个实例中100至100,000道尔顿，在另一个实例中100至75,000道尔顿，在另一个实例中100至50,000道尔顿，在另一个实例中100至25,000道尔顿。在一个具体的实例中，生物活性多肽可以具有100至25,000道尔顿的分子量。在另外的实例中，生物活性多肽可以具有100至24,000道尔顿的分子量。在另外的实例中，生物活性多肽可以具有0至3个二硫键。在另外的实例中，生物活性多肽可以具有100至24,000道尔顿的分子量，0至3个二硫键或其组合。
在本文公开的方法中，可以通过静脉内(IV)注射、皮下(SC)注射、肌内(IM)注射、皮内(ID)注射或其组合将药物组合物给予受试者。在一个实例中通过静脉内(IV)注射将药物组合物给予受试者，在另一个实例中皮下(SC)注射，在另一个实例中肌内(IM)注射，在另一个实例中皮内(ID)注射，或在另一个实例中它们的组合。
在本文公开的方法中，可以通过局部注射将药物组合物给予受试者，以将药物组合物递送至靶部位或疾病部位(例如组织、病变、感染部位或肿瘤)或其附近。药物组合物也可以被纳米材料(例如聚合物纳米颗粒)、脂质体或其组合包封或与其缀合。药物组合物还可以通过将包含药物组合物的装置植入到疾病部位内或邻近而局部给予。
对于本文公开的方法，该疾病可以是癌症、自身免疫性疾病、糖尿病、血管炎、心脏病、病毒感染或其组合。在一个实例中，药物组合物包含用于癌症免疫疗法的mAAT-抗体融合蛋白。该抗体可以是适合于癌症免疫疗法的mAb或多克隆抗体，例如PD-1抗体、PD-L1抗体、检查点抑制剂抗体，或其每种抗体的片段。
本发明的融合蛋白的一个优点是增强生物活性多肽的活性、稳定性、生物利用度或其组合。
为产生完全人源的融合蛋白，本发明可以用作新的融合蛋白平台。融合蛋白可以在微生物(例如大肠杆菌)中表达和产生，其具有发育时间短、生产成本低和生产产率高的优点。尽管可获得几种公知的人蛋白的融合蛋白平台，例如人血清白蛋白(HSA)、免疫球蛋白Fc片段或转铁蛋白，但是它们通常无法在大肠杆菌中很好地表达。另一方面，大肠杆菌中常用的融合蛋白平台(例如GST、MBP)不是人类蛋白，如果将融合蛋白在人类患者中用于治疗目的，则其可能具有免疫原性。因此，需要一种新的融合蛋白平台，其是人源的并且可以在大肠杆菌或者类似微生物中以良好的产率表达。本发明的融合蛋白平台相对于这些现有平台具有优势。
与丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质的一些其他成员相似，AAT蛋白质具有“柔性”构象这一非常独特的性质。AAT蛋白质可以自发地或者在与其他蛋白质相互作用时将其构象从S(紧张)变为R(松弛)。IL-2蛋白质包含被视为“刚性”结构的四α螺旋束。不希望受特定理论或机理的束缚，申请人认为，包含mAAT和mIL-2多肽的本发明的融合蛋白可以为包含刚性“头部”和柔性“主体”的IL-2受体(IL-2R)提供新的配体。这种新的配体可以在IL-2R结合、T细胞活化以及其他生物学和生理活性方面提供一些特别的性质或功能，其中一些将下文中进行举例说明。
除上述生物活性外，申请人也意外地发现，在变性和重折叠由大肠杆菌宿主系统表达的融合蛋白之后，在X和Z位置替换Cys残基的突变(例如X＝S或A和Z＝S或A的那些突变)将显著提高可溶性蛋白质的产率。
申请人还出乎意料地发现，本发明的mAAT-mIL-2融合蛋白在T细胞刺激方面具有与天然IL-2相当的活性(图10)。这是出乎意料的，因为已知聚乙二醇(PEG)缀合(PEG化)的白细胞介素2分子(PEG-IL2)的活性比天然IL-2的活性低约10至100倍，基于EC50值计(Charych,等人,Clin Cancer Res.2016Feb 1；22(3):680-90)。申请人出乎意料地发现，在小鼠肿瘤模型中，本发明的mAAT-mIL-2融合蛋白进一步显示出显著的肿瘤抑制活性，如下文举例说明的(图11)。白细胞介素2是一种公知的细胞因子，其在调节免疫系统中起关键作用。在体内，IL-2分子的活性是短暂的，这限制了其在治疗疾病(如癌症或自身免疫性疾病)的治疗应用中的用途。此外，将IL-2分子用作治疗剂具有一些严重的副作用，例如毛细血管渗漏综合症。不希望受任何特定理论或机理的束缚，申请人认为本发明的融合蛋白提供了更好的体内稳定性和蛋白质构象，从而得到了优异的T细胞活化活性和延长的作用持续时间。本发明的融合蛋白的这种特征实现了提高的用于治疗疾病(例如癌症和自身免疫疾病)的药物效果。仍然需要进一步的临床研究和开发。
另一个优点是，使用了重组技术的本发明的融合蛋白可具有高度的可重现性，这与其他蛋白质修饰技术不同，例如在批次之间可有很多差异的缀合蛋白质(例如PEG化蛋白质或HSA包封的蛋白质)。一旦选择了优化的融合蛋白肽序列，就可以使用本发明的融合蛋白平台来可再现性地生产正确的蛋白质。
如以下代表性实施例中所举例说明的，产生大量的AAT(或mAAT)融合蛋白表达构建体，在大肠杆菌细胞中表达以产生前融合蛋白，重折叠并且纯化。所产生的融合蛋白具有：(1)不同种类的生物活性多肽，例如细胞因子(IL2、IL15)，干扰素(IFN-α-2、IFN-β-1)，生长因子(G-CSF、GM-CSF、FGF21)，激素(GLP-1)和单域抗体(ALX-81)；(2)N末端和C末端融合；(3)不同的接头；(4)在AAT序列中的Z位置处的各种突变，例如Z＝Ser、Cys、Ala等；(5)生物活性多肽序列中的X位置处的各种突变，例如对于IL2，X＝Ser、Cys、Ala，对于IL15，X＝Asp、Asn等。在宿主细胞中表达和产生融合蛋白、重折叠和纯化。然后将纯化的融合蛋白用于功能测定。这些代表性的实例证明了本发明的另一个优点，即可以将不同类别的多种生物活性多肽中的每一种均与AAT或mAAT多肽融合，以产生分子量增加同时保留生物活性多肽的生物学活性的融合蛋白。本发明的融合蛋白可提供增强的体内稳定性和蛋白质构象以改善功能。
尽管在本公开内容中示例性说明融合蛋白的代表性实例，但应理解，可以在不脱离本发明的精神的情况下，制备具有额外的组合或修饰、或者组合或经修饰的变体的融合蛋白。所述组合或修饰可以包括但不限于，不同类别的生物活性多肽或试剂、不同接头或各种接头尺寸、不同的融合形式(N末端或C末端)、AAT多肽的突变或修饰变体、以及生物活性多肽或生物活性剂的突变和修饰变体。
实施例
在以下实施例中对于本发明进行进一步定义。应当理解，这些实施例虽然指出本发明的优选实施方案，但是仅以举例说明的方式给出。根据以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。
1.甲基化和诱变反应
制备25X SAM：该溶液是通过以下方式制备：在每次诱变步骤之前的几个小时内，将由Invitrogen LifetechnologiesTM(Carlsbad,CA,USA,以各自的商标或注册商标)获得的
Figure BDA0002818940740000341
定点诱变PLUS试剂盒中的200×SAM(S-腺苷甲硫氨酸)溶液于蒸馏无菌水中稀释。
DNA聚合酶：所用的DNA聚合酶是AccuPrimeTM Pfx DNA聚合酶，其可由ThemoFisher(Carlsbad,CA,USA，以各自的商标)获得，用于DNA片段的高保真、高特异性扩增。
质粒的量：每50μL甲基化反应/PCR扩增使用约20-50ng或更少的质粒DNA。
根据试剂盒制造商的说明书进行诱变反应。
重组反应：使用相应的PCR产物对多位点和单位点诱变反应进行体外重组反应。对于单位点诱变，观察到重组反应可提高诱变效率并且使菌落产率增加3到10倍。以下步骤用于重组反应：
1)对于使用多种PCR产物的每10μL重组反应，在试管中加入以下成分：
PCR水34μL(根据以下使用的PCR产物的体积调节PCR水的体积，以使Enzyme Mix之前的总体积达到5μL)
PCR产物2μL
Figure BDA0002818940740000351
2X Enzyme Mix 5μL(终浓度：1X)
2)充分混合并在室温下孵育15分钟；
3)通过加入1μL 0.5M EDTA终止反应。充分混合并将试管放在冰上；和
4)将试管放在冰上，然后立即进行转化。
使用诱变反应产物进行转化：
1)将50μL One
Figure BDA0002818940740000352
MAX
Figure BDA0002818940740000353
感受态细胞(以各自的商标和注册商标，由ThemoFisher Scientific,Carlsbad,CA,USA获得)用于转化。
2)将以上制备的约3μL重组反应物直接转移到感受态细胞中，按照制造商的说明书转化细胞。
3)从冰中取出小瓶并且将250μL预热的S.O.C.培养基加入每个小瓶中，在设置为225rpm的振荡培养箱中于37℃下孵育正好1小时。在含有适当抗生素的LB琼脂平板上铺板30-100μL的细胞悬液。
4)将剩余的转化反应物存储在4℃下，并且将平板在37℃下孵育16-18小时。
5)选择3至5个菌落，并且通过质粒分离、PCR和测序进行分析。
2.mIL2-接头1-mAAT(短接头)(X＝Ser；Z＝Ser)的构建
这是A-短接头-B结构。根据在大肠杆菌中的最佳表达，通过实验选择一种编码具有短接头且X＝Ser(实际位置126)和Z＝Ser(实际位置372)的融合蛋白(SEQ ID.5)的cDNA。对于IL-2和AAT基因，cDNA序列与原始的人cDNA不同。已移除AAT的信号序列。在合成的cDNA中还包括5'和3'末端的两个独特的限制性酶切位点。将合成的cDNA亚克隆到由申请人开发的类似于PET-28a(Novagen，现在是Merck KGaA的一部分，德国)的蛋白质表达载体PT88中。PT88载体包含受lac操纵子控制的T7启动子、卡那霉素抗性(KanR)选择标记、PUC复制起点以及与克隆中的限制性酶切位点匹配的限制性酶切位点(质粒1)。质粒1中融合蛋白编码区的cDNA序列如SEQ ID.7所示，从ATG开始到TAA，其分别对应于起始密码子和终止密码子。
3.mIL2-接头2-mAAT(长接头)(X＝Ser；Z＝Ser)的构建
这是编码具有X＝Ser(实际位置126)和Z＝Ser(实际位置376)突变的A-长接头-B结构融合蛋白(SEQ ID.6)的cDNA。其是通过使用限制性内切酶Sphl和Sspl在位置118-567处进行切割，以从上述质粒1中移除一个449bp(碱基对)片段来构建。插入包含编码长接头(GGGGSGGGGS)的DNA的一个合成的461bp DNA片段来替代已移除的片段，从而产生质粒2。质粒2中的融合蛋白编码区的cDNA序列如SEQ ID.8所示。
4.通过诱变来构建其他IL2-AAT融合蛋白(X＝Cys，Ala；Z＝Cys，Ala)
通过使用质粒1或2作为模板，以及如上所述的GENEART定点诱变Plus试剂盒(LifeTechnologies)和AccuPrime Pfx DNA聚合酶(Life Technologies)进行诱变而产生IL-2和AAT编码区中的其他突变。然后如上所述将突变的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞Dh5α中。使用以下引物构建突变。表2示出融合蛋白的列表。
用于产生所需突变的配对引物
引物1，用于生成X＝Cys(融合物5和6)：
F GTTGGATTACCTTCTgTCAGTCTATCATTTC SEQ ID.17 39％GC,Tm 55℃
R GAAATGATAGACTGAcAGAAGGTAATCCAAC SEQ ID.18 39％GC,Tm 53℃
引物2，用于生成Z＝Cys(融合物7和8)：
F TCAACATCCAACACTgCAAGAAACTGTCGTC SEQ ID.19 45％GC,Tm 61℃
R GACGACAGTTTCTTGcAGTGTTGGATGTTGA SEQ ID.20 45％GC,Tm 59℃
引物3，用于生成X＝Ala(融合物9、10、13和14)：
F CGTTGGATTACCTTCgCTCAGTCTATCATTT SEQ ID.21 42％GC,Tm 58℃
R AAATGATAGACTGAGcGAAGGTAATCCAACG SEQ ID.22 42％GC,Tm 56℃
引物4，用于生成Z＝Ala(融合物11-14)：
F TTCAACATCCAACACgCCAAGAAACTGTCGTC SEQ ID.23 47％GC,Tm 61℃
R GACGACAGTTTCTTGGcGTGTTGGATGTTGAA SEQ ID.24 47％GC,Tm 59℃
对于融合物13和14，进行了两轮诱变：首先使用引物3对产生X＝Ala突变，使用融合物3和4以产生具有X＝A和Z＝Ser的中间质粒融合物。然后，将中间质粒用作模板，使用引物-4产生具有双突变X＝A和Z＝A的融合物。
表2.突变的融合蛋白(仅示出位于X或Z位置两侧的氨基酸残基)。
Figure BDA0002818940740000371
5.mAAT-接头-mIL-2融合蛋白的构建
B-接头-A结构的融合蛋白是通过重新排列AAT和IL-2多肽而构建(表3)。融合物15具有含短接头的多肽mAAT-接头-mIL-2结构。融合物16具有含长接头的多肽mAAT-接头-mIL-2结构。
表3.具有B-接头-A结构的融合蛋白(仅示出位于X或Z位置两侧的氨基酸残基)。
Figure BDA0002818940740000381
6.多肽序列确定
通过基于LC-MS的肽图确定蛋白质的序列。对于每种蛋白质，通过加入胍HCl(GuHCl)至6M，使约20μg的纯化蛋白质变性。通过与1,4-二硫苏糖醇(DTT，在pH 8下的反应中使用20mM)反应，使蛋白质中的二硫键还原。使用碘乙酰胺(IOM，反应中25mM)使游离的半胱氨酸烷基化。优选以高于DTT的浓度加入IOM，因为在发生半胱氨酸烷基化反应之前，反应混合物中剩余的DTT需要使用IOM进行滴定。还原反应在37℃下进行1小时，烷基化反应在黑暗中于室温下进行1小时。烷基化反应后，将样品透析以移除所有盐。然后，用胰蛋白酶(测序级经修饰的胰蛋白酶，目录号V511C，Promega，Madison，WI，USA)消化干净的蛋白质样品。在pH 8下，于50mM NH4HCO3中，消化反应在37℃下进行2小时。然后将消化的样品上样到NanoLC-MS系统(与Thermo LTQ XL线性离子阱质谱仪偶联的Agilent HPLC 1100)上进行肽测序。基于来自包含突变氨基酸的肽的MS/MS数据确定具体的突变。
7.IL2-AAT融合蛋白的表达
融合蛋白在表达载体中受T7启动子的控制。编码融合蛋白的质粒在大肠杆菌BL21(由ThemoFisher获得)和OrigamiTM(分别以各自的商标，由MilliporeSigma，Burlington，MA，USA获得)菌株中表达。使转化的大肠杆菌细胞在LB+卡那霉素培养基中生长，直到培养物的OD为0.8-1.0。将IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(0.02mM)加入培养物中以诱导蛋白质表达。在收集大肠杆菌细胞之前，在20℃下进行诱导12小时。使用诱导前后的细胞等分试样以及细胞裂解后的样品(不溶和可溶级分)进行SDS-PAGE。具有结构mIL-2-短接头-mAAT(也称为IL2-接头1-AAT(X＝Ser，Z＝Ser))的融合蛋白3的代表性SDS-PAGE凝胶图像示于图4。
图4的图例：泳道1，分子量(MW)标记；泳道2，诱导前BL21细胞；泳道3，诱导前OrigamiTM细胞；泳道4，诱导后BL21细胞；泳道5，诱导后Origami细胞；泳道6，细胞裂解后诱导的BL21上清液；泳道7，细胞裂解后诱导的Origami上清液；泳道8，来自诱导的BL21细胞的包涵体；泳道9，来自诱导的Origami细胞的包涵体。融合蛋白具有约50KDa的MW。
结果表明，在BL21细胞中融合蛋白以高产率表达，而在Origami菌株中以低产率表达。在这两种类型的大肠杆菌细胞中，大多数表达的融合蛋白为不溶形式并且位于包涵体中。
与在X和/或Z位置处具有Ser残基的融合蛋白相比，在X和/或Z位置处具有Ala残基的融合蛋白具有相似的蛋白表达水平。
与在X和/或Z位置处具有Ser残基的融合蛋白相比，在X和Z位置均具有Cys残基的融合蛋白在大肠杆菌细胞中具有较低的表达水平。
8.IL2-AAT融合蛋白的重折叠
由于所表达的融合蛋白主要为不溶形式，因此重折叠是产生蛋白活性形式的必要步骤。将来自包涵体的融合蛋白用0.5％CHAPS洗涤剂洗涤3次，然后溶解在6M胍、10mMβ-巯基乙醇中。将增溶的蛋白质稀释20倍，然后在10mM Tris缓冲液(pH 8)中透析过夜，同时更换三次缓冲液以逐渐移除变性剂。沉淀不溶的蛋白质后，用SDS-PAGE检查重折叠后的蛋白质的溶解度。SDS-PAGE结果表明，在该重折叠步骤后，很大一部分不溶蛋白变为可溶的。具有X＝S和Z＝S的融合蛋白(IL2-接头1-AAT(X＝S，Z＝S))的代表性的凝胶图像示于图5。
图5的图例：泳道1，MW标记；泳道2和3，重折叠步骤前的融合蛋白；泳道4和5，重折叠后的融合蛋白。
在X和/或Z位置处具有一个或两个Cys残基的融合蛋白(比较例1-6)显示出沉淀并且没有很好地重折叠。
当在大肠杆菌BL21菌株中表达时，在X或Z位置含有Cys残基的融合蛋白以较低产率产生。对于表2中的融合物1、2、5、6、7、8(比较例1-6)，尽管它们来自大肠杆菌BL21菌株的初始表达水平与其他融合蛋白相似(融合物3、4、9、10、11，12、13、14)，但是在重折叠步骤后的折叠蛋白质的产率基本上无法检测到。在折叠步骤中，那些比较例中约大于99％的蛋白质以不溶形式沉淀。相反，在相同的重折叠条件下，不含Cys残基的融合蛋白(融合物3、4、9、10、1 1、12、13、14)能够很好地重折叠，并且重折叠的蛋白质的产率大于80％，百分比基于用于折叠的总蛋白质的量计。
9.IL2-AAT融合蛋白的纯化
通过强阴离子交换，例如HiTrap Q HP阴离子交换色谱柱(由GE Health LifeSciences，Pittsburgh,PA,USA获得)或弱阴离子交换色谱，例如HiTrap DEAE SepharoseFF(也由GE Health Life Sciences获得)纯化融合蛋白。对于强阴离子交换，将蛋白质上样到pH8.0的Q柱上，并用溶于MES缓冲液(pH 6.5)中的0.5M至1M NaCl进行洗脱。对于弱阴离子交换色谱，将蛋白质上样到在pH 8.0的Tris缓冲液中的DEAE柱上。使用溶于10mM MES缓冲液(pH 6.5)中的0.1M NaCl至最高达1M NaCl进行分级洗脱。采用0.2M和0.3M NaCl洗脱融合蛋白。
图6示出Mw为约60kDa的IL2-接头1-AAT(X＝Ser；Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。图7示出Mw为约60kDa的IL2-接头2-AAT(X＝Ser；Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。图8示出Mw为约60kDa的IL2-接头2-AAT(X＝Ser；Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性实例。
如本文所使用的，包括所有附图的本公开内容的通篇中：分子量标记以KDa为单位示出；BI：诱导前；AI：诱导后；RF-PU：重折叠和纯化。融合蛋白用箭头指示。
上文和下文公开的这些数据和其他数据表明，各种形式的AAT多肽可与各种生物活性多肽一起用于构建融合蛋白，并且可以将所得的融合蛋白以高产率表达、重折叠和纯化。
10.融合蛋白的表征
融合蛋白的序列是通过基于NanoLC-MS的肽测序进行确定。分析步骤如下。
样品制备：融合蛋白溶液样品首先在8M尿素中变性，利用DTT使二硫键还原，利用碘乙酰胺使所有半胱氨酸残基烷基化。然后通过透析清洁样品以移除所有化学物质，并在消化缓冲液(碳酸氢铵100mM，pH8.5)中用测序级经修饰的胰蛋白酶(由Promega，Madison，WI，USA获得)进行消化。将消化后的肽在SpeedVac装置中完全干燥(由ThermoFisher获得)。然后将干燥的样品重新溶解在样品溶液(2％乙腈，97.5％水，0.5％甲酸)中。随后如前所述，将重新溶解的蛋白质样品通过NanoLC-ESI-MS/MS系统分析。
NanoLC-ESI-MS/MS分析：消化的蛋白质样品的NanoLC-ESI-MS/MS分析是通过高效液相色谱(HPLC)系统(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)，使用内径75微米、长8厘米的反相C18柱进行的。C18的粒径为3μM，孔径为
Figure BDA0002818940740000411
注射时间为约20分钟。HPLC溶剂A为97.5％水、2％乙腈、0.5％甲酸。HPLC溶剂B为9.5％水、90％乙腈、0.5％甲酸。从2％溶剂B到90％溶剂B的梯度时间是60分钟，加上20分钟的样品上样时间和20分钟的柱冲洗时间。分离(splitting)后，柱流速为每分钟约800纳升。通常注射体积为约3μl。
HPLC系统与离子阱质谱仪(LTQ，ThermoFisher)在线偶联(on-line coupled)，其方式是将由HPLC柱洗脱的样品通过电喷雾电离(ESI)工艺直接电离并且进入质谱仪。电离电压通常每次都会优化，且通常在1.2kv-1.8kv的范围内。将毛细管温度设定为120℃。将质谱仪设置为数据相关模式，以通过低能碰撞诱导解离(CID)过程获取MS/MS数据。默认的碰撞能量约为33％，默认的充电状态为3。进行了一次全扫描，其中一次微扫描的质量范围为550a.m.u到1800a.m.u，然后进行了一次全质量范围内的最强离子的MS/MS扫描和三次微扫描。动态排除特征设置如下：0.3分钟内重复计数1，排除持续时间0.4min。排除宽度为4Da。
数据库检索和验证：使用ProtTech的ProtQuest软件包，将质谱数据用于针对非冗余蛋白质数据库(NR数据库，NCBI)的检索。在确认靶蛋白的正确性之后，在数据库检索中使用包含特定氨基酸序列的融合蛋白的小型数据库以验证整个融合蛋白序列，其包括X和Z位置处的突变以及接头序列。
结果：确定了所有融合蛋白的序列。观察到一些具有截短的N-末端的融合蛋白。例如，在所产生的融合蛋白中截短一些第一Met残基。这样的截短未表现出对所测试的融合蛋白的功能的影响。不同融合蛋白之间截短蛋白的百分比不同。
11.mIL2-接头-mAAT融合蛋白的基于细胞的测定
使用基于CTLL-2细胞的比色MTS测定来测量mIL2-接头-mAAT融合蛋白对于刺激T细胞的活性，以评估细胞代谢活性。在吩嗪硫酸甲酯的存在下，NAD(P)H依赖性细胞氧化还原酶可以将MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓)转换成甲臜(formazan)产物，其在磷酸盐缓冲盐水中在490nm处具有最大吸光度。
在补充有10％胎牛血清和33ng/ml IL-2的RPMI 1640中培养CTLL-2细胞。在细胞的对数生长期中收集细胞，并且用初始体积的Hanks’平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次，以1000rpm离心5分钟，然后在补充有10％FBS的RPMI 1640(不含IL-2)中，在37℃、5％CO2下孵育4小时。将IL-2对照和融合蛋白3(以上制备的带有短接头的mIL2-mAAT)于测定培养基中稀释至100ng/ml的初始浓度，接着进行系列稀释，并加入孔中的100μL测定培养基中。将所制备的细胞悬液立即接种在96孔板的孔中的100μL测定培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育48小时。在48小时孵育期后，加入MTS测定溶液(20μL/孔)，并在37℃、5％CO2下再孵育4小时。然后通过Bio-Rad 680型微板读数器(由Bio-Rad,Hercules,CA,USA获得)读取该板在490nm处的读数，这测量了96孔微量滴定板的孔中内容物在490nM处的的吸光度。使用CTLL2细胞增殖测定法测量IL2对照(IL2 CN，实心菱形)，IL2-接头1-AAT(X＝Ser；Z＝Ser)(IL2-AAT(S)，实心正方形)和IL2-接头1-AAT(X＝Ser，Z＝Cys)(IL2-AAT(C)，空心三角形)的活性的代表性实例(图9)。图10示出在较低的IL2浓度下，融合蛋白融合物3(SEQ ID.5，其具有短接头肽(接头1)以及在X位置处的IL2突变和在Z位置处的AAT突变(X＝S和Z＝S))的代表性结果。所用的IL-2对照购自R&D Systems(目录号202-IL，R&D Systems Inc.,Minniapolis,MN,USA)。数据表明本发明的融合蛋白具有与天然IL-2对照相当的T细胞活化活性。
使用基于CTLL-2细胞的测定法测量了各种mIL2-AAT融合蛋白的EC50，并且在表4中列出。图9和图10示出使用重组rhIL2(IL2 CN)、mIL2-接头1-AAT(X＝Ser，Z＝Ser)和mIL2-接头1-AAT(X＝Ser，Z＝Cys)进行CTLL-2测定的细胞增殖曲线。
表4.各种IL2-AAT融合蛋白的EC50
融合蛋白 EC50(nM)
IL2(X＝Ser)-接头1-AAT(Z＝Ser) 0.14
IL2(X＝Ser)-接头2-AAT(Z＝Ser) 0.15
IL2(X＝Cys)-接头1-AAT(Z＝Ser) 1.1
IL2(X＝Ser)-接头1-AAT(Z＝Cys) 1.5
IL2(X＝Ala)-接头1-AAT(Z＝Ser) 1.95
IL2(X＝Ser)-接头1-AAT(Z＝Ala) 3.2
IL2(X＝Ala)-接头1-AAT(Z＝Ala) 1.9
将基于细胞的测定中具有最高活性的融合蛋白用于下述动物研究。
12.mIL2-mAAT融合蛋白在小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性
使用肿瘤模型Foxp3YFP_cre小鼠(由Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME,USA获得)检查了IL-2-AAT融合蛋白的抗肿瘤活性。将约1x106MCA205肉瘤肿瘤细胞植入Foxp3YFP _cre小鼠中。当肿瘤大小达到50×50mm2时(14至20天)时，使小鼠接受10μg mIL2-mAAT融合蛋白或相同体积的PBS作为对照。每三天评估肿瘤生长。在接下来的一周中，小鼠接受了另一次融合蛋白或PBS注射。约10只小鼠用于测试融合蛋白(药物组5只，对照组5只)。为了使实验中处死的小鼠数量最少，本发明人仅在动物模型研究中测试了具有高的表达/重折叠产率和良好的T细胞刺激活性的融合蛋白形式(formats)。mIL2-接头1-mAAT(以上制备的融合物3，具有短接头肽、X＝Ser和Z＝Ser)的结果如图11所示。
13.IL2-AAT融合蛋白的蛋白酶抑制活性
天然形式的AAT可通过与蛋白酶共价连接来抑制丝氨酸蛋白酶活性(例如胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)。本发明人通过以下方法测试了IL2-接头-AAT融合蛋白的蛋白酶抑制：孵育过量的融合蛋白与丝氨酸蛋白酶(弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)，以及与蛋白酶和蛋白酶底物、变性的单克隆抗体、抗CD134抗体(购自Biorbyt Ltd，目录号orb303967(Biorbyt Ltd.,Cambridge,United Kingdom))孵育。对于IL2-接头1-AAT(短接头，X＝Ser，Z＝Ser)(融合物3)，未检测到丝氨酸蛋白酶抑制活性。mAAT融合蛋白的存在对于所测试的蛋白酶的蛋白酶活性没有抑制作用。结果证明融合蛋白不具有蛋白酶抑制剂活性。
一些代表性的数据示于图12中：
泳道1，含有抗体样品作为蛋白酶底物的对照；
泳道2，如上文确定的IL2-接头1-AAT融合蛋白；
泳道3，底物加胰蛋白酶，在孵育后胰蛋白酶消化底物表现为底物条带的消失；
泳道4，融合蛋白加胰蛋白酶，示出融合蛋白的条带消失，这表明由于缺乏蛋白酶抑制活性，融合蛋白被胰蛋白酶消化；
泳道5：底物、AAT融合蛋白和胰蛋白酶，示出融合蛋白和底物的条带消失，这表明由于缺乏抑制，胰蛋白酶具有完整的蛋白酶活性；
泳道6和泳道7与泳道4和5相似，其中胰蛋白酶被弹性蛋白酶(另一种丝氨酸蛋白酶)替代。
以上结果表明IL2-接头1-AAT(Z＝Cys)融合蛋白不保留蛋白酶抑制剂活性。还测试了IL2-接头2-AAT(Z＝Ser)，结果相似。
14.mIL15-接头-mAAT融合蛋白的构建、表达、重折叠、纯化和表征
14(a).mIL15-接头2-mAAT(X＝Asp，Z＝Ser)的构建、表达和纯化
通过用包含IL15 cDNA序列(IL15氨基酸位置73X＝Asp)的合成DNA片段IL15 cDNA序列替换质粒2中的Xbal-DralII DNA片段，构建用于该mIL15-AAT融合体的表达载体，其中IL15中的X位置是氨基酸位置73。所得的融合蛋白mIL15-接头2-AAT(X＝Asp，Z＝Ser)的cDNA序列示于SEQ ID ID.25，这由DNA测序确认。所表达的蛋白质的序列在SEQ ID.26中，这通过如上所述的LC-MS/MS确认。所表达的融合蛋白主要位于大肠杆菌细胞的胞质中。使用上述操作，融合蛋白在基于CTLL-2细胞的生物活性测定中具有活性。可溶性蛋白质可以在不进行蛋白质重折叠步骤的情况下纯化。尽管不进行蛋白质重折叠步骤可能是有益的，但是将大肠杆菌胞质中的可溶性蛋白质纯化至适合于药物用途的高纯度是一大挑战。
14(b).mIL15-接头2-mAAT(X＝Asn，Z＝Ser)的构建、表达和纯化
按照上述操作，该融合蛋白的表达载体是通过使用SEQ ID 59和SEQ ID NO 60的引物对，对来自14(a)(对于cDNA序列，SEQ ID.25)的表达载体进行定点诱变而产生的。所得的融合蛋白mIL15-接头2-AAT(X＝Asn，Z＝Ser)的cDNA序列如SEQ ID NO.27所示，这由DNA测序确认。所表达的蛋白质的序列示于SEQ ID.28中，这通过如上所述的LC-MS/MS确认。在如上所述的IPTG诱导后，该构建体在大肠杆菌BL21细胞中的表达产生了高水平的融合蛋白。与14(a)中记载的融合蛋白不同，该融合蛋白主要位于包涵体中。使用上述操作，融合蛋白将以高产率重折叠，并且用离子交换柱Q进一步纯化至高纯度。IPTG诱导之前和之后的全细胞裂解物的代表性数据示于图13，分别为泳道BI和AI。用箭头标记的凝胶条带是目标融合蛋白。图13中的泳道RF-PU示出了重折叠和纯化步骤后得到的IL15-AAT融合蛋白。
14(c).mIL15-接头2-mAAT(X＝Asn，Z＝Cys)的构建、表达和纯化
按照上述操作，该融合蛋白的表达载体是通过使用SEQ ID.19和SEQ ID NO.20的引物对，对来自14(b)(对于cDNA序列，SEQ ID.27)的表达载体进行定点诱变而产生的。所得的cDNA序列包含在AAT氨基酸256(Z位置)处的Cys残基。该融合蛋白mIL15-接头2-AAT(X＝Asn，Z＝Cys)的cDNA序列如SEQ ID NO.29所示，这由DNA测序确认。所表达的蛋白质的序列示于SEQ ID.30中，这由LC-MS/MS确认。在IPTG诱导后，该构建体在大肠杆菌BL21细胞中的表达产生了非常高水平的融合蛋白。所表达的融合蛋白也主要位于包涵体中。使用上述操作，融合蛋白以高产率重折叠，与mIL15-接头2-AAT(X＝Asn，Z＝Ser)相似。利用离子交换柱Q将重折叠的融合蛋白进一步纯化至高纯度。IPTG诱导之前和之后的全细胞裂解物的代表性数据示于图14，分别为泳道BI和AI。用箭头标记的凝胶条带是目标融合蛋白。图14中的泳道RF-PU示出了重折叠和纯化步骤后得到的IL15-接头2-mAAT(X＝Asn，Z＝Cys)。
15.mIL15-接头-mAAT融合蛋白的基于CTLL-2细胞的测定
还可以通过如上所述的基于CTLL-2细胞的增殖测定法分析IL15-AAT融合蛋白的生物学活性。代表性数据示于图15。与重组IL2参考蛋白相比，mIL15-接头2-mAAT(X＝Asn，Z＝Ser)(IL15-AAT(S)，实心正方形)和mIL15-接头2-mAAT(X＝Asn，Z＝Cys)(IL15-AAT(C)，空心三角形)融合蛋白都表现出CTLL-2细胞增殖活性。与图9中所示的IL2-AAT融合蛋白不同，根据基于CTLL-2细胞的测定法，IL15-AAT融合蛋白mIL15-接头2-mAAT(X＝Asn，Z＝Ser)和mIL15-接头2-mAAT(X＝Asn，Z＝Cys)的活性相似。
16.G-CSF-接头-mAAT融合蛋白的构建、表达、重折叠、纯化和表征
16(a).G-CSF-接头2-mAAT(Z＝Ser)的构建、表达、纯化和功能测定
通过用合成的DNA片段G-CSF cDNA序列替换质粒2中的Xbal-DraIII DNA片段，构建用于G-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达载体。所得的融合蛋白G-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)的cDNA序列示于SEQ ID.31，这由DNA测序确认。所表达的融合蛋白的序列示于SEQID.32，这由LC-MS/MS确认。表达载体在大肠杆菌BL21细胞中产生高水平的融合蛋白。所表达的融合蛋白主要位于包涵体中。使用上述操作，Mw约为64kDa的融合蛋白以高产率重折叠，并用离子交换柱Q进一步纯化至高纯度。IPTG诱导之前、之后及重折叠/纯化后大肠杆菌BL21全细胞裂解物中的融合蛋白表达的代表性数据示于图16，分别为泳道BI、AI和RF-PU，其中融合蛋白以箭头表示。
16(b).G-CSF-接头2-mAAT(Z＝Cys)的构建、表达、纯化
融合蛋白G-CSF-接头2-mAAT(Z＝Cys)的表达载体是通过使用16(a)中所记载的表达载体和SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20引物对的定点诱变产生，这导致在AAT氨基酸256位置(Z位置)处的Ser至Cys的突变。所得的融合蛋白G-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)的cDNA序列示于SEQ ID.33，这由DNA测序确认。所表达的融合蛋白的序列示于SEQ ID.34，这由如上所述的LC-MS/MS方法确认。融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中以高水平表达。几乎所有表达的融合蛋白都以不溶形式位于包涵体中。进行上述重折叠过程。G-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)融合蛋白表达、重折叠和纯化的代表性数据示于图17，包括IPTG诱导前的总细胞蛋白质(BI)、IPTG诱导后的总细胞蛋白质(AI)以及在重折叠和纯化后的融合蛋白(RF-PU)。融合蛋白的条带以箭头表示。
17.G-CSF-接头-mAAT融合蛋白的基于M-NFS-60细胞的测定
用基于M-NFS-60细胞的增殖测定法分析以上产生的G-CSF-AAT融合蛋白的生物学活性，以在G-CSF或G-CSF-AAT融合蛋白的存在下测试细胞生长刺激。测定方案简述如下。
使用单个96孔测定板，以十点稀释系列，分别对于G-CSF标准品和G-CSF-AAT融合蛋白进行一式三份地测定。优化起始浓度和稀释方案，以实现完整的剂量响应曲线，其具有适当的上下渐近线以及足够的斜坡上的点。使用完全RPMI1640培养基，将标准重组G-CSF对照品以2:1十点稀释系列稀释。将50微升样品加到每个孔中。G-CSF标准曲线的起始浓度选择为20ng/ml。
使M-NFS-60细胞离心沉淀(spin down)，并用RPMI1640培养基洗涤。然后将细胞以6x105细胞/毫升的细胞密度重悬于完全培养基中。将50微升(μ)的细胞加入96孔板的每个孔中。细胞在37℃下、在5％CO2中孵育2天。
孵育2天后，向每个孔中加入20μl的Cell Titer 96Aqueous试剂(1体积的四唑鎓化合物(MTS)和1体积的电子偶合剂——溶于Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中的吩嗪乙基硫酸盐(PES))。在使混合物在37℃下、在5％CO2中孵育2h后，使用BioRad板读数器读取490nm处的吸光度。该方案是新的。
代表性数据示于图18。G-CSF-接头2-mAAT(Z＝Ser)(表示为G-CSF-AAT(S))和G-CSF-接头2-mAAT(Z＝Cys)(表示为G-CSF-AAT(C))融合蛋白显示出生物活性。如通过M-NFS-60细胞增殖测定所确定的，G-CSF-接头2-mAAT(Z＝Ser)融合蛋白具有比G-CSF-接头2-mAAT(Z＝Cys)更高的活性。
18.GM-CSF-接头-mAAT融合蛋白的构建、表达、重折叠、纯化和表征
18(a).GM-CSF-接头2-mAAT(Z＝Ser)的构建、表达和纯化
通过用合成的DNA片段GM-CSF cDNA序列替换质粒2中的Xbal-DraIII DNA片段，构建GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达载体。融合蛋白GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)的cDNA序列示于SEQ ID.35，这由DNA测序证实。所表达的GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)蛋白的序列在SEQ ID.36中，这使用如上所述的操作通过LC-MS/MS确定。融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中以高水平表达。已发现所表达的融合蛋白主要位于包涵体中。使用上述操作，融合蛋白以高产率重折叠。使用上述操作，用离子交换柱Q将重折叠的蛋白质纯化至均质(homogeneity)。代表性数据示于图19：泳道BI是IPTG诱导前的细胞裂解物蛋白质；泳道AI是IPTG诱导后的细胞裂解物蛋白质；泳道RF-PU是重折叠和纯化的融合蛋白，如箭头所示。
18(b).GM-CSF-接头2-mAAT(Z＝Cys)的构建、表达和纯化
通过定点诱变产生融合蛋白GM-CSF-接头2-mAAT(Z＝Cys)的表达载体。诱变中使用的引物对的序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID.20，这导致在AAT氨基酸256位置(Z位置)处由Ser至Cys的突变。所得的融合蛋白GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)的cDNA序列示于SEQ ID.37，这由DNA测序确认。所表达的融合蛋白的序列示于SEQ ID.38，这通过上述6中所记载的LC-MS/MS方法确认。融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中以高水平表达。几乎所有表达的融合蛋白都以不溶形式位于包涵体中。通过上述操作进行融合蛋白的重折叠。GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)融合蛋白表达、重折叠和纯化的代表性数据示于图20，其中泳道BI是IPTG诱导前的总细胞蛋白质，泳道AI是IPTG诱导后的总细胞蛋白质，泳道RF-PU是重折叠和纯化后的融合蛋白。
19.GM-CSF-接头2-mAAT(Z＝Ser)和GM-CSF-接头2-mAAT(Z＝Cys)的生物活性
使用基于TF-1细胞的增殖测定法分析GM-CSF-AAT融合蛋白的生物学活性，其中TF-1细胞的生长依赖于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。测定过程如下所述。
TF-1细胞来自ATCC(CRL-2003)。在测定中用作对照的GM-CSF参考标准品是重组GM-CSF蛋白(厦门特宝生物工程有限责任公司(Xiamen Tebao Bioengineering LLC))。使用单个96孔测定板，以十点稀释系列，对于每个测试样品和参考GM-CSF样品进行一式三份地测定。将GM-CSF标准品或融合蛋白用完全RPMI1640培养基以2:1十点稀释系列稀释。然后将50μl的每个样品添加到每个孔中。GM-CSF标准曲线(GM-CSF cn)的起始浓度为20ng/ml。
将TF-1细胞用RPMI1640培养基洗涤，然后以6x105细胞/毫升的细胞密度重悬于完全培养基中。将50μl的细胞加入96孔板的每个孔中。细胞在37℃下、在5％CO2中孵育2天。孵育2天后，向每个孔中加入20μl的Cell Titer 96Aqueous试剂(1体积MTS和1体积PES，其由新的四唑鎓化合物(MTS)和电子偶合剂——溶于Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中的吩嗪乙基硫酸盐(PES)组成)，并且在37℃下、在5％CO2中孵育2h。使用BioRad板读数器读取490nm处的吸光度。
来自基于细胞的测定的代表性数据示于图21。GM-CSF-接头2-mAAT(Z＝Ser)(表示为GM-CSF-AAT(S))和GM-CSF-接头2-mAAT(Z＝Cys)(表示为GM-CSF-AAT(C))融合蛋白具有刺激性生物学活性。根据细胞增殖测定，GM-CSF-接头2-mAAT(Z＝Ser)融合蛋白具有比GM-CSF-接头2-mAAT(Z＝Cys)更高的活性。
20.IFNα2-接头-mAAT融合蛋白的构建、表达、重折叠、纯化和表征
20(a).IFNα2-接头2-mAAT(Z＝Ser)的构建、表达和纯化
通过用合成的DNA片段IFNα2cDNA序列替换质粒2中的Xbal-DralII DNA片段，构建该IFNα2-接头2-AAT(Z＝Ser)融合物的表达载体。将合成的cDNA序列进行密码子使用优化以用于大肠杆菌K12表达。融合蛋白IFNα2-接头2-AAT(Z＝Ser)的cDNA序列在SEQ ID.39中列出，这由DNA测序确认。所表达的IFNα2-接头2-AAT(Z＝Ser)蛋白的序列示于SEQ ID.40，这使用如上所述的操作通过LC-MS/MS确认。融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中以高水平表达。已发现所表达的融合蛋白主要位于包涵体中。使用上述操作，从包涵体分离的融合蛋白以高产率重折叠。使用上述操作，用离子交换柱Q将重折叠的蛋白质纯化至均质。IFNα2-接头2-AAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性数据示于图22：泳道BI是IPTG诱导前的细胞裂解物蛋白质；泳道AI是IPTG诱导后的细胞裂解物蛋白质；泳道RF-PU是重折叠和纯化的融合蛋白，如箭头所示。
20(b).IFNα2-接头2-mAAT(Z＝Cys)的构建、表达、纯化
通过对于来自20(a)中所记载的IFNα2-接头2-mAAT(Z＝Ser)的表达载体进行定点诱变，产生融合蛋白IFNα2-接头2-mAAT(Z＝Cys)的表达载体。诱变中使用的引物对的序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID.20。该诱变将AAT氨基酸256位置(Z位置)处的Ser残基变为Cys残基。所得的融合蛋白IFNα2-接头2-AAT(Z＝Cys)的cDNA序列示于SEQ ID.41，这由DNA测序确认。所表达的融合蛋白的序列示于SEQ ID.42，这由LC-MS/MS确认。融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中以高水平表达。几乎所有表达的融合蛋白都以不溶形式位于包涵体中。使用上述操作进行重折叠。IFNα2-接头2-AAT(Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性数据示于图23：泳道BI，IPTG诱导前的总细胞蛋白质；泳道AI，IPTG诱导后的总细胞蛋白质；和泳道RF-PU，重折叠和纯化后的融合蛋白。
21.IFNβ1-接头2-mAAT融合蛋白的构建、表达、重折叠、纯化和的表征
21(a).IFNβ1-接头2-mAAT(Z＝Ser)的构建、表达和纯化
通过用合成的DNA片段IFNβ1cDNA序列替换质粒2中的Xbal-DraIII DNA片段，构建IFNβ1-接头2-AAT(Z＝Ser)融合物的表达载体。将合成的cDNA序列进行密码子使用优化以用于大肠杆菌K12表达。融合蛋白IFNβ1-接头2-AAT(Z＝Ser)的cDNA序列在SEQ ID.43中列出，这由DNA测序确认。所表达的IFNβ1-接头2-AAT(Z＝Ser)蛋白的序列示于SEQ ID.44，这由LC-MS/MS确认。融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中以非常高的水平表达。已发现所表达的融合蛋白主要位于包涵体中。使用上述操作，从包涵体分离的融合蛋白以高产率重折叠。使用上述操作，用离子交换柱Q将重折叠的蛋白质纯化至均质。IFNβ1-接头2-AAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性数据示于图22：泳道BI，IPTG诱导前的细胞裂解物蛋白质；泳道AI，IPTG诱导后的细胞裂解物蛋白质；泳道RF-PU，重折叠和纯化的融合蛋白，如箭头所示。
21(b).IFNβ1-接头2-AAT(Z＝Cys)的构建、表达、纯化
通过对于来自21(a)中所记载的IFNβ1-接头2-mAAT(Z＝Ser)的表达载体进行定点诱变，产生融合蛋白IFNβ1-接头2-mAAT(Z＝Cys)的表达载体。诱变中使用的引物对的序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID.20。诱变将AAT氨基酸256位置(Z位置)处的Ser残基变为Cys残基。所得的融合蛋白IFNβ1-接头2-AAT(Z＝Cys)的cDNA序列示于SEQ ID.45，这由DNA测序确认。所表达的融合蛋白的序列示于SEQ ID.46，这由LC-MS/MS确认。融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中以高水平表达。几乎所有表达的融合蛋白都以不溶形式位于包涵体中。使用上述操作进行重折叠。IFNβ1-接头2-AAT(Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性数据示于图25：泳道BI，IPTG诱导前的细胞裂解物蛋白质；泳道AI，IPTG诱导后的细胞裂解物蛋白质；泳道RF-PU，重折叠和纯化的融合蛋白，如箭头所示。
22.GLP-1-接头-mAAT融合蛋白的构建、表达、重折叠、纯化和表征
22(a).GLP-1-接头2-mAAT(Z＝Ser)的构建、表达、纯化和功能测定
通过用合成的包含GLP-1cDNA序列的DNA片段替换质粒2中的Xbal-DraIII DNA片段，构建这种GLP-1-接头2-mAAT(Z＝Ser)融合物的表达载体。将合成的cDNA序列进行密码子使用优化以用于大肠杆菌K12表达。融合蛋白GLP-1-接头2-mAAT(Z＝Ser)的cDNA序列在SEQ ID.47中列出，这由DNA测序确认。所表达的GLP-1-接头2-mAAT(Z＝Ser)蛋白的序列示于SEQ ID.48，这由LC-MS/MS确认。融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中以非常高的水平表达。已发现所表达的融合蛋白主要位于包涵体中。使用上述操作，从包涵体分离的融合蛋白以高产率重折叠。使用上述操作，用离子交换柱Q将重折叠的蛋白质纯化至均质。GLP-1-接头2-mAAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性数据示于图26：泳道BI，IPTG诱导前的细胞裂解物蛋白质；泳道AI，IPTG诱导后的细胞裂解物蛋白质；泳道RF-PU，重折叠和纯化的融合蛋白，如箭头所示。
22(b).GLP1-接头2-mAAT(Z＝Cys)的构建、表达、纯化
通过对于来自22(a)中所记载的GLP1-接头2-mAAT(Z＝Ser)的表达载体进行定点诱变，产生融合蛋白GLP1-接头2-mAAT(Z＝Cys)的表达载体。诱变中使用的引物对的序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID.20。诱变将AAT氨基酸256位置(Z位置)处的Ser残基变为Cys残基。所得的融合蛋白GLP1-接头2-AAT(Z＝Cys)的cDNA序列示于SEQ ID.49，这由DNA测序确认。所表达的融合蛋白的序列示于SEQ ID.50，这由LC-MS/MS确认。融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中以高水平表达。几乎所有表达的融合蛋白都以不溶形式位于包涵体中。按照上述操作，进行融合蛋白的重折叠。GLP1-接头2-AAT(Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性数据示于图27：泳道BI，IPTG诱导前的细胞裂解物蛋白质；泳道AI，IPTG诱导后的细胞裂解物蛋白质；泳道RF-PU，重折叠和纯化的融合蛋白，如箭头所示。
23.mAAT-接头-FGF21融合蛋白的构建、表达、重折叠、纯化和表征23(a).mAAT-接头2-FGF21(Z＝Ser)的载体构建及表达
以化学方法合成mAAT-接头2-FGF21的cDNA(FGF21位于AAT的C末端，Z＝Ser)。其cDNA序列示于SEQ ID.51。与本公开内容中记载的其他AAT融合蛋白不同，将生物活性多肽FGF21经由接头2(GGGGSGGGGS)融合至AAT的C末端，以保留对于受体结合活性来说重要的FGF21蛋白质的C末端。通常，可以基于生物活性多肽的结构和活性来确定选择与AAT的N末端或C末端融合。
通过DNA测序确认mAAT-接头2-FGF21的合成cDNA的序列。合成的DNA片段还在两端含有Nael-BamHI限制性酶切位点，并被插入到用Sspl-BamHI消化的大肠杆菌表达载体PT88。通过向生长培养基中加入IPTG来诱导靶蛋白的表达。所表达的融合蛋白的序列示于SEQ ID.52。
如图28所示，在IPTG诱导之前融合蛋白的表达非常低(泳道BI)，而在IPTG诱导后表达水平增加(泳道AI)。所表达的融合蛋白仅位于包涵体中，并使用上述操作进行重折叠。按照上述操作纯化融合蛋白。由图28可见，如泳道RF-PU所示，将融合蛋白纯化至同质。融合蛋白产物通过上述LC-MS/MS方法表征，这确认了正确的融合蛋白序列。基于LC-MS/MS分析，确认了N末端Met残基多数保留在融合蛋白中。
23(b)mAAT-接头2-FGF21(Z＝Cys)的载体构建和表达
通过对于来自23(a)中所记载的GLP1-接头2-mAAT(Z＝Ser)的表达载体进行定点诱变，产生融合蛋白mAAT-接头2-FGF21(Z＝Cys)的表达载体。诱变中使用的引物对的序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID.20。诱变将AAT氨基酸256位置(Z位置)处的Ser残基变为Cys残基。所得的融合蛋白mAAT-接头2-FGF21(Z＝Cys)的cDNA序列示于SEQ ID.53，这由DNA测序确认。所表达的融合蛋白的序列示于SEQ ID.54，这由LC-MS/MS确认。融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中以高水平表达。几乎所有表达的融合蛋白都以不溶形式位于包涵体中。按照上述操作进行重折叠。mAAT-接头2-FGF21(Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性数据示于图29：泳道BI，IPTG诱导前的细胞裂解物蛋白质；泳道AI，IPTG诱导后的细胞裂解物蛋白质；泳道RF-PU，重折叠和纯化的融合蛋白，如箭头所示。
24.sdAb-接头-mAAT融合蛋白的构建、表达、重折叠、纯化和表征24(a).sdAb-接头2-mAAT(Z＝Ser)的构建、表达和纯化
通过用合成的包含来自ALX-0081的序列的DNA片段替换质粒2中的Xbal-DraIIIDNA片段，构建这种sdAb-接头2-mAAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达载体，ALX-0081是靶向vonWillebrand因子的单域抗体。将合成的cDNA序列进行密码子使用优化以用于大肠杆菌K12表达。融合蛋白sdAb-接头2-mAAT(Z＝Ser)的cDNA序列在SEQ ID.55中列出，这由DNA测序确认。所表达的sdAb-接头2-mAAT(Z＝Ser)融合蛋白的序列示于SEQ ID.56，这由LC-MS/MS确认。融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中以非常高的水平表达。已发现所表达的融合蛋白主要位于包涵体中。使用上述操作，从包涵体分离的融合蛋白以高产率重折叠。使用上述操作，用离子交换柱Q将重折叠的蛋白质纯化至均质。sdAb-接头2-mAAT(Z＝Ser)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性数据示于图30：泳道BI，IPTG诱导前的细胞裂解物蛋白质；泳道AI，IPTG诱导后的细胞裂解物蛋白质；和泳道RF-PU，重折叠和纯化的融合蛋白，如箭头所示。
24(b).sdAb-接头2-mAAT(Z＝Cys)的构建、表达、纯化
通过对于来自24(a)中所记载的sdAb-接头2-mAAT(Z＝Ser)的表达载体进行定点诱变，产生融合蛋白sdAb-接头2-mAAT(Z＝Cys)的表达载体。诱变中使用的引物对的序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID.20。诱变将AAT氨基酸256位置(Z位置)处的Ser残基变为Cys残基。所得的融合蛋白sdAb-接头2-mAAT(Z＝Cys)的cDNA序列示于SEQ ID.57，这由DNA测序确认。所表达的融合蛋白的序列示于SEQ ID.58，这由LC-MS/MS确认。融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中以高水平表达。几乎所有表达的融合蛋白都以不溶形式位于包涵体中。按照上述操作进行重折叠。sdAb-接头2-mAAT(Z＝Cys)融合蛋白的表达、重折叠和纯化的代表性数据示于图31：泳道BI，IPTG诱导前的细胞裂解物蛋白质；泳道AI，IPTG诱导后的细胞裂解物蛋白质；和泳道RF-PU，重折叠和纯化的融合蛋白，如箭头所示。如图30和图31所示，sdAb-接头2-mAAT(Z＝Ser)和sdAb-接头2-mAAT(Z＝Cys)的蛋白表达水平和重折叠产率非常相似。
25.融合蛋白的蛋白酶抑制活性
使用相同的蛋白酶测定法检查了上述AAT融合蛋白的胰蛋白酶抑制活性。如图32所示，所有测试的AAT融合蛋白都没有胰蛋白酶抑制活性。在图32中，泳道1、3、5、7、9、11分别是纯化的融合蛋白GLP1-接头2-AAT(Z＝Cys)，AAT(Z＝Cys)-接头2-FGF21，G-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)，G-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)，GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Ser)，GM-CSF-接头2-AAT(Z＝Cys)，它们均在胰蛋白酶消化缓冲液(pH＝8)中，但未添加胰蛋白酶；泳道2、4、6、8、10、12分别是纯化的蛋白质样品GLP1-接头-AAT1(Z＝Cys)，AAT1(Z＝Cys)-接头-FGF21，G-CSF-接头-AAT1(Z＝Ser)，G-CSF-接头(Z＝Cys)，GM-CSF-接头-AAT(Z＝Ser)，GM-CSF-接头-AAT(Z＝Cys)，它们均在胰蛋白酶消化缓冲液(pH＝8)中，但添加的胰蛋白酶：胰蛋白酶＝10：1(w/w)比率(测序级修饰的胰蛋白酶，目录号V511C，Promega,Madison,WI,USA)。将融合蛋白用作胰蛋白酶的底物。在37℃下孵育1小时后，融合蛋白被完全消化，如融合蛋白条带的消失所证明的。结果表明，对于N末端或C末端融合或Z位置处的序列变体的融合蛋白，均无胰蛋白酶抑制活性。
Figure BDA0002818940740000551
Figure BDA0002818940740000561
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Figure BDA0002818940740001411
Figure BDA0002818940740001421
序列表
<110> Zhang,Xiaolong
<120> 包含融合蛋白的药物组合物及其用途
<130> C1802_01
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 394
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> mAAT
<222> (1)..(394)
<223> 不含信号序列的经修饰的人AAT，其中原始的256 Cys 突变为Ser (232)
<400> 1
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Ser Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390
<210> 2
<211> 394
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 人AAT
<222> (1)..(394)
<223> 不含信号序列的原始的人AAT
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA
<220>
<221> 人 AAT_不含信号序列
<222> (1)..(394)
<223> 不含信号序列的原始的人AAT
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA
<400> 2
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390
<210> 3
<211> 418
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 人_AAT_SignqlSeq
<222> (1)..(24)
<223> 人AAT 信号序列
<220>
<221> 人_AAT
<222> (1)..(418)
<223> 人AAT全序列sp|P01009|A1AT_HUMAN α-1-抗胰蛋白酶
OS=智人
<400> 3
Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys
1 5 10 15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala
20 25 30
Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn
35 40 45
Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln
50 55 60
Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser
65 70 75 80
Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr
85 90 95
His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro
100 105 110
Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn
115 120 125
Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu
130 135 140
Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys
145 150 155 160
Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu
165 170 175
Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys
180 185 190
Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu
195 200 205
Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val
210 215 220
Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val
225 230 235 240
Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys
245 250 255
Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala
260 265 270
Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu
275 280 285
Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp
290 295 300
Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr
305 310 315 320
Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe
325 330 335
Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys
340 345 350
Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly
355 360 365
Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile
370 375 380
Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu
385 390 395 400
Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr
405 410 415
Gln Lys
<210> 4
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> IL2_信号
<222> (1)..(20)
<223> 包含信号序列的原始的人IL-2
<220>
<221> IL2_人类完全（ IL2_HumanFull）
<222> (1)..(153)
<223> 包含信号序列的原始的人IL-2
<400> 4
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 5
<211> 534
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> IL2
<222> (1)..(134)
<223> 具有添加的第一个M且C126替换为S126的人IL-2
<220>
<221> mIL2_mAAT_短接头
<222> (1)..(534)
<223> 具有添加的第一个M且C126替换为S126的人IL-2_短接头_mAAT
<220>
<221> IL2
<222> (1)..(134)
<223> 具有添加的第一个M且C126替换为S126的人IL-2
<220>
<221> 接头
<222> (135)..(140)
<223> IL-2和mAAT之间的接头，短接头 GSTSGS
<220>
<221> mAAT
<222> (141)..(534)
<223> 包含Cys372突变为Ser372的突变的人mAAT
<400> 5
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser
115 120 125
Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Glu Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His
145 150 155 160
Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser
165 170 175
Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe
180 185 190
Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr
195 200 205
Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu
210 215 220
Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu
225 230 235 240
Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn
245 250 255
Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu
260 265 270
Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly
275 280 285
Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly
290 295 300
Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr
305 310 315 320
Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg
325 330 335
Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln
340 345 350
Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn
355 360 365
Ile Gln His Ser Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr
370 375 380
Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu
385 390 395 400
Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu
405 410 415
Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser
420 425 430
Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile
435 440 445
Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu
450 455 460
Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile
465 470 475 480
Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile
485 490 495
Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe
500 505 510
Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val
515 520 525
Val Asn Pro Thr Gln Lys
530
<210> 6
<211> 538
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> IL2
<222> (1)..(134)
<223> 包含126 Cys突变为Ser的突变的人IL2
<220>
<221> mIL2_mAAT_长接头
<222> (1)..(538)
<223> 包含126 Cys突变为Ser的突变的人IL2
<220>
<221> IL2
<222> (1)..(134)
<223> 包含126 Cys突变为Ser的突变的人IL2
<220>
<221> 接头
<222> (135)..(144)
<223> 长接头 GGGGSGGGGS
<220>
<221> mAAT
<222> (145)..(538)
<223> 不含信号序列且具有Cys256 (376)突变为Ser的突变的人AAT
<400> 6
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser
115 120 125
Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
145 150 155 160
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
165 170 175
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
180 185 190
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
195 200 205
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
210 215 220
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
225 230 235 240
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
245 250 255
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
260 265 270
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
275 280 285
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
290 295 300
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
305 310 315 320
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
325 330 335
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
340 345 350
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
355 360 365
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Ser Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
370 375 380
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
385 390 395 400
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
405 410 415
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
420 425 430
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
435 440 445
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
450 455 460
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
465 470 475 480
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
485 490 495
Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
500 505 510
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
515 520 525
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
530 535
<210> 7
<211> 1605
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> mIL2_mAAT_短
<222> (1)..(1605)
<223> 包含X=Ser,Z=Ser突变的短接头
<400> 7
atggctccca cgtcgagtag tactaaaaaa actcagcttc agttagaaca tctgttgttg 60
gatttgcaga tgatcttgaa cggtattaac aactataaga atccgaagtt gacgcgcatg 120
cttacgttca agttctacat gcccaagaaa gctacggagc tgaaacattt acagtgtttg 180
gaagaagaac tgaagccgtt ggaggaggta ttaaatttgg cacaatctaa gaattttcat 240
ttacgcccac gtgatctgat tagtaatatc aacgtcatcg tattggagct gaagggcagt 300
gagacgacat tcatgtgtga gtatgccgac gaaacagcta cgattgtaga atttcttaat 360
cgttggatta ccttctctca gtctatcatt tcaaccttaa ctggctctac gtccgggtcg 420
gaagatcctc aaggtgatgc tgcgcaaaag accgacacat cacaccacga tcaagatcat 480
ccaacattta acaaaattac gcctaacttg gccgagtttg cattcagttt gtatcgtcag 540
cttgcgcatc aatccaattc aacaaatatt ttctttagtc ccgtctctat cgcgacagcc 600
tttgccatgc tttcattggg aaccaaggcc gatacacatg atgaaatctt ggaaggtttg 660
aattttaatc ttaccgagat cccagaagcc caaatccacg aaggcttcca ggaattgctg 720
cgtacgttaa accaacccga ttcacaactt cagttaacta ccggaaatgg gcttttctta 780
tctgaagggc tgaagttggt tgataaattc ttagaagacg tgaagaaact ttatcattcg 840
gaggcattca cggtgaactt cggtgacacg gaggaagcca aaaagcaaat taacgactat 900
gttgaaaaag ggacgcaggg taagatcgtg gacttagtaa aggagctgga tcgtgatacc 960
gtcttcgcct tggtaaacta catcttcttc aaaggaaagt gggagcgtcc gtttgaggtg 1020
aaggatactg aggaggaaga tttccatgtt gaccaagtga ctactgttaa ggtccccatg 1080
atgaagcgtc ttggcatgtt caacatccaa cactccaaga aactgtcgtc atgggtgttg 1140
ctgatgaaat atcttggtaa cgctaccgcc attttctttt tgcccgatga aggaaagtta 1200
cagcaccttg agaacgagct tacccatgat attattacga aatttttaga aaatgaagac 1260
cgtcgttcgg catctttaca cttaccgaag cttagtatca ctggtaccta tgacttgaag 1320
tcagttttgg gacagcttgg cattacgaag gtgttctcta atggagccga cctgtccggc 1380
gttacggagg aagcaccatt aaagttgagc aaagccgtgc ataaagccgt tttaactatc 1440
gatgaaaaag gaactgaagc tgcgggcgcg atgttccttg aggcaattcc tatgagcatc 1500
ccacctgaag ttaaattcaa taagcctttt gtgtttttga tgatcgagca gaacacaaag 1560
agtccgttgt tcatgggcaa ggttgttaac cccacgcaga aataa 1605
<210> 8
<211> 1617
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> mIL2_mAAT_长接头
<222> (1)..(1617)
<223> 用于具有突变X=Ser Z=Ser的 mIL2 mAAT,长接头的DNA
<400> 8
atggctccca cgtcgagtag tactaaaaaa actcagcttc agttagaaca tctgttgttg 60
gatttgcaga tgatcttgaa cggtattaac aactataaga atccgaagtt gacgcgcatg 120
cttacgttca agttctacat gcccaagaaa gctacggagc tgaaacattt acagtgtttg 180
gaagaagaac tgaagccgtt ggaggaggta ttaaatttgg cacaatctaa gaattttcat 240
ttacgcccac gtgatctgat tagtaatatc aacgtcatcg tattggagct gaagggcagt 300
gagacgacat tcatgtgtga gtatgccgac gaaacagcta cgattgtaga atttcttaat 360
cgttggatta ccttctctca gtctatcatt tcaaccttaa ctggcggtgg tggctctggc 420
ggtggtggct ccgaagatcc tcaaggtgat gctgcgcaaa agaccgacac atcacaccac 480
gatcaagatc atccaacatt taacaaaatt acgcctaact tggccgagtt tgcattcagt 540
ttgtatcgtc agcttgcgca tcaatccaat tcaacaaata ttttctttag tcccgtctct 600
atcgcgacag cctttgccat gctttcattg ggaaccaagg ccgatacaca tgatgaaatc 660
ttggaaggtt tgaattttaa tcttaccgag atcccagaag cccaaatcca cgaaggcttc 720
caggaattgc tgcgtacgtt aaaccaaccc gattcacaac ttcagttaac taccggaaat 780
gggcttttct tatctgaagg gctgaagttg gttgataaat tcttagaaga cgtgaagaaa 840
ctttatcatt cggaggcatt cacggtgaac ttcggtgaca cggaggaagc caaaaagcaa 900
attaacgact atgttgaaaa agggacgcag ggtaagatcg tggacttagt aaaggagctg 960
gatcgtgata ccgtcttcgc cttggtaaac tacatcttct tcaaaggaaa gtgggagcgt 1020
ccgtttgagg tgaaggatac tgaggaggaa gatttccatg ttgaccaagt gactactgtt 1080
aaggtcccca tgatgaagcg tcttggcatg ttcaacatcc aacactccaa gaaactgtcg 1140
tcatgggtgt tgctgatgaa atatcttggt aacgctaccg ccattttctt tttgcccgat 1200
gaaggaaagt tacagcacct tgagaacgag cttacccatg atattattac gaaattttta 1260
gaaaatgaag accgtcgttc ggcatcttta cacttaccga agcttagtat cactggtacc 1320
tatgacttga agtcagtttt gggacagctt ggcattacga aggtgttctc taatggagcc 1380
gacctgtccg gcgttacgga ggaagcacca ttaaagttga gcaaagccgt gcataaagcc 1440
gttttaacta tcgatgaaaa aggaactgaa gctgcgggcg cgatgttcct tgaggcaatt 1500
cctatgagca tcccacctga agttaaattc aataagcctt ttgtgttttt gatgatcgag 1560
cagaacacaa agagtccgtt gttcatgggc aaggttgtta accccacgca gaaataa 1617
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> IL2_Cyc125
<222> (6)..(6)
<223> Cys 原始的. X=C
<400> 9
Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> mIL2_Ser125
<222> (6)..(6)
<223> 包含Cys125突变为Ser125. X=S的mIL2
<400> 10
Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
1 5 10
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> mIL2_Ala125
<222> (6)..(6)
<223> 包含Cys125 突变为Ala125. X=A的人IL-2
<400> 11
Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
1 5 10
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> AAT_C256
<222> (5)..(5)
<223> 包含原始的Cys256. Z=C的人AAT
<400> 12
Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> mAAT_Ser256
<222> (5)..(5)
<223> 包含Cys256突变为Ser256. Z=S的经修饰的人AAT
<400> 13
Asn Ile Gln His Ser Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
1 5 10
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> mAAT_Ala256
<222> (5)..(5)
<223> 包含Cys256突变为Ala256. Z=A的经修饰的人AAT
<400> 14
Asn Ile Gln His Ala Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
1 5 10
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 15
Gly Ser Thr Ser Gly Ser
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
gttggattac cttctgtcag tctatcattt c 31
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
gaaatgatag actgacagaa ggtaatccaa c 31
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
tcaacatcca acactgcaag aaactgtcgt c 31
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
gacgacagtt tcttgcagtg ttggatgttg a 31
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
cgttggatta ccttcgctca gtctatcatt t 31
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
aaatgataga ctgagcgaag gtaatccaac g 31
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
ttcaacatcc aacacgccaa gaaactgtcg tc 32
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
gacgacagtt tcttggcgtg ttggatgttg aa 32
<210> 25
<211> 1560
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> IL15(73D)-接头-AAT(Z=Ser) cDNA
<222> (1)..(1560)
<400> 25
atgaactggg tgaatgtaat atctgattta aagaagatag aagaccttat tcagagtatg 60
cacatagatg ctacgcttta tacggagtcc gatgtgcacc ctagttgcaa ggtgacggcg 120
atgaagtgct ttttacttga attgcaagtt atttcccttg aatcggggga cgccagtata 180
cacgacacag tggaaaattt gattatcctg gctaacgata gcctgtcgag caacggaaat 240
gtgacagaaa gtggatgtaa ggagtgcgag gagttagagg aaaagaacat taaagagttc 300
cttcaatcat tcgtgcatat cgtccagatg ttcattaaca catcaggtgg tggtggctct 360
ggcggtggtg gctccgaaga tccacaaggt gatgctgcgc aaaagaccga cacatcacac 420
cacgatcaag atcatccaac atttaacaaa attacgccta acttggccga gtttgcattc 480
agtttgtatc gtcagcttgc gcatcaatcc aattcaacaa atattttctt tagtcccgtc 540
tctatcgcga cagcctttgc catgctttca ttgggaacca aggccgatac acatgatgaa 600
atcttggaag gtttgaattt taatcttacc gagatcccag aagcccaaat ccacgaaggc 660
ttccaggaat tgctgcgtac gttaaaccaa cccgattcac aacttcagtt aactaccgga 720
aatgggcttt tcttatctga agggctgaag ttggttgata aattcttaga agacgtgaag 780
aaactttatc attcggaggc attcacggtg aacttcggtg acacggagga agccaaaaag 840
caaattaacg actatgttga aaaagggacg cagggtaaga tcgtggactt agtaaaggag 900
ctggatcgtg ataccgtctt cgccttggta aactacatct tcttcaaagg aaagtgggag 960
cgtccgtttg aggtgaagga tactgaggag gaagatttcc atgttgacca agtgactact 1020
gttaaggtcc ccatgatgaa gcgtcttggc atgttcaaca tccaacactc caagaaactg 1080
tcgtcatggg tgttgctgat gaaatatctt ggtaacgcta ccgccatttt ctttttgccc 1140
gatgaaggaa agttacagca ccttgagaac gagcttaccc atgatattat tacgaaattt 1200
ttagaaaatg aagaccgtcg ttcggcatct ttacacttac cgaagcttag tatcactggt 1260
acctatgact tgaagtcagt tttgggacag cttggcatta cgaaggtgtt ctctaatgga 1320
gccgacctgt ccggcgttac ggaggaagca ccattaaagt tgagcaaagc cgtgcataaa 1380
gccgttttaa ctatcgatga aaaaggaact gaagctgcgg gcgcgatgtt ccttgaggca 1440
attcctatga gcatcccacc tgaagttaaa ttcaataagc cttttgtgtt tttgatgatc 1500
gagcagaaca caaagagtcc gttgttcatg ggcaaggttg ttaaccccac gcagaaataa 1560
<210> 26
<211> 519
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> IL15(73D)-接头-AAT(Z=Ser) 蛋白质
<222> (1)..(519)
<400> 26
Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asp Pro
115 120 125
Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp
130 135 140
His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe
145 150 155 160
Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe
165 170 175
Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn
195 200 205
Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu
210 215 220
Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly
225 230 235 240
Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu
245 250 255
Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe
260 265 270
Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys
275 280 285
Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp
290 295 300
Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu
305 310 315 320
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<212> DNA
<213> 智人
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Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn
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Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr
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Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys
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Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro
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Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu
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Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met
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Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met
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<213> 智人
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Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr
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Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn
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Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu
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<222> (1)..(533)
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85 90 95
Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu
100 105 110
Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asp Pro Gln Gly
130 135 140
Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro
145 150 155 160
Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu
165 170 175
Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser
180 185 190
Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys
195 200 205
Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr
210 215 220
Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg
225 230 235 240
Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly
245 250 255
Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp
260 265 270
Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr
290 295 300
Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val
305 310 315 320
Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro
325 330 335
Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val
340 345 350
Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile
355 360 365
Gln His Ser Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu
370 375 380
Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln
385 390 395 400
His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu
405 410 415
Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile
420 425 430
Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr
435 440 445
Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala
450 455 460
Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp
465 470 475 480
Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro
485 490 495
Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu
500 505 510
Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val
515 520 525
Asn Pro Thr Gln Lys
530
<210> 57
<211> 1602
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> sdAb-接头-AAT (Z=Cys) cDNA
<222> (1)..(1602)
<400> 57
atggaagtac agttagtgga atccggagga ggtctggtgc agcctggggg ttccctgcgt 60
ttgtcatgcg cggcttcggg acgtactttc tcgtacaacc caatgggctg gtttcgtcag 120
gcgcccggaa aaggccggga attggttgcc gctatcagtc gcactggggg atctacttat 180
tacccggata gcgtcgaagg acggtttacc atctcgcggg acaacgcaaa gcggatggtt 240
tacttgcaaa tgaactccct gcgtgcagaa gacaccgcgg tctactattg cgcggcggca 300
ggtgtcagag ctgaggacgg gcgggtacgg acgttgccct ctgagtacac cttctggggt 360
cagggaactc aagtgacagt gtcgagcggt ggtggtggct ctggcggtgg tggctccgaa 420
gatccacaag gtgatgctgc gcaaaagacc gacacatcac accacgatca agatcatcca 480
acatttaaca aaattacgcc taacttggcc gagtttgcat tcagtttgta tcgtcagctt 540
gcgcatcaat ccaattcaac aaatattttc tttagtcccg tctctatcgc gacagccttt 600
gccatgcttt cattgggaac caaggccgat acacatgatg aaatcttgga aggtttgaat 660
tttaatctta ccgagatccc agaagcccaa atccacgaag gcttccagga attgctgcgt 720
acgttaaacc aacccgattc acaacttcag ttaactaccg gaaatgggct tttcttatct 780
gaagggctga agttggttga taaattctta gaagacgtga agaaacttta tcattcggag 840
gcattcacgg tgaacttcgg tgacacggag gaagccaaaa agcaaattaa cgactatgtt 900
gaaaaaggga cgcagggtaa gatcgtggac ttagtaaagg agctggatcg tgataccgtc 960
ttcgccttgg taaactacat cttcttcaaa ggaaagtggg agcgtccgtt tgaggtgaag 1020
gatactgagg aggaagattt ccatgttgac caagtgacta ctgttaaggt ccccatgatg 1080
aagcgtcttg gcatgttcaa catccaacac tgcaagaaac tgtcgtcatg ggtgttgctg 1140
atgaaatatc ttggtaacgc taccgccatt ttctttttgc ccgatgaagg aaagttacag 1200
caccttgaga acgagcttac ccatgatatt attacgaaat ttttagaaaa tgaagaccgt 1260
cgttcggcat ctttacactt accgaagctt agtatcactg gtacctatga cttgaagtca 1320
gttttgggac agcttggcat tacgaaggtg ttctctaatg gagccgacct gtccggcgtt 1380
acggaggaag caccattaaa gttgagcaaa gccgtgcata aagccgtttt aactatcgat 1440
gaaaaaggaa ctgaagctgc gggcgcgatg ttccttgagg caattcctat gagcatccca 1500
cctgaagtta aattcaataa gccttttgtg tttttgatga tcgagcagaa cacaaagagt 1560
ccgttgttca tgggcaaggt tgttaacccc acgcagaaat aa 1602
<210> 58
<211> 533
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> sdAb-接头-AAT(Z=Cys) 蛋白质
<222> (1)..(533)
<400> 58
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr
20 25 30
Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser
50 55 60
Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu
100 105 110
Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asp Pro Gln Gly
130 135 140
Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro
145 150 155 160
Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu
165 170 175
Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser
180 185 190
Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys
195 200 205
Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr
210 215 220
Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg
225 230 235 240
Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly
245 250 255
Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp
260 265 270
Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr
290 295 300
Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val
305 310 315 320
Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro
325 330 335
Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val
340 345 350
Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile
355 360 365
Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu
370 375 380
Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln
385 390 395 400
His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu
405 410 415
Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile
420 425 430
Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr
435 440 445
Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala
450 455 460
Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp
465 470 475 480
Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro
485 490 495
Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu
500 505 510
Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val
515 520 525
Asn Pro Thr Gln Lys
530
<210> 59
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<220>
<221> 用于IL15 aa73 位置处的Asp>Asn突变的正向引物
<222> (1)..(32)
<400> 59
gattatcctg gctaacaata gcctgtcgag ca 32
<210> 60
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<220>
<221> 用于IL15 aa73 位置处的Asp>Asn突变的反向引物
<222> (1)..(32)
<400> 60
tgctcgacag gctattgtta gccaggataa tc 32

Claims (88)

1.一种融合蛋白组合物，其包含AAT多肽或其功能性变体，和生物活性多肽；其中所述生物活性多肽与所述AAT多肽共价连接，经由接头肽与所述AAT多肽共价连接，或它们的组合。
2.权利要求1的融合蛋白组合物，其中所述融合蛋白组合物包含具有N末端、C末端和1-50个氨基酸残基的所述接头肽，并且其中所述接头肽位于所述AAT多肽和所述生物活性多肽之间。
3.权利要求2的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽连接至所述接头肽的N末端，并且所述AAT多肽连接至所述接头肽的C末端。
4.权利要求2的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽连接至所述接头肽的C末端，并且所述AAT多肽连接至所述接头肽的N末端。
5.权利要求1-4中任一项的融合蛋白，其中所述AAT多肽包含mAAT多肽或其功能性变体，其中所述mAAT多肽或所述其功能性变体不含半胱氨酸氨基酸残基，其中所述功能性变体与所述mAAT多肽具有至少85％的序列同一性，并且其中所述mAAT多肽和所述功能性变体均不具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。
6.权利要求5的融合蛋白组合物，其中所述融合蛋白组合物包含在所述mAAT的Z位置处具有丝氨酸或丙氨酸突变的所述mAAT。
7.权利要求1-6中任一项的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽具有100至25,000道尔顿的分子量。
8.权利要求1-7中任一项的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽具有100至24,000道尔顿的分子量，0至3个二硫键，或其组合。
9.权利要求1-8中任一项的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽包括细胞因子、经修饰的细胞因子、肽激素、经修饰的肽激素、干扰素、经修饰的干扰素、生长因子、经修饰的生长因子、抗体、抗体的片段、肽、抗原、新抗原、抑制剂、激活剂、酶、结合蛋白、蛋白质、蛋白质的片段，或其组合。
10.权利要求1-9中任一项的融合蛋白，其中所述生物活性多肽包含白细胞介素-2(IL-2)、经修饰的白细胞介素-2(mIL-2)、白细胞介素-15(IL-15)、经修饰的白细胞介素-15(mIL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、经修饰的粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、经修饰的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)、干扰素α-2(IFN-α
2)、经修饰的干扰素α-2(mIFN-α2)、干扰素β-1(IFN-β1)、经修饰的干扰素β-1(mIFN-β1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、经修饰的胰高血糖素样肽-1(mGLP-1)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、经修饰的成纤维细胞生长因子21(mFGF21)、单域抗体(sdAb)、经修饰的单域抗体(msdAb)、其片段，或其组合。
11.权利要求9-10中任一项的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽包括白细胞介素-2(IL-2)或经修饰的IL-2(mIL-2)。
12.权利要求9-11中任一项的融合蛋白，其中所述mIL-2在所述mIL-2的X位置处包含丝氨酸或丙氨酸突变。
13.权利要求9-10中任一项的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽包含白细胞介素-15(IL-15)或经修饰的IL-15(mIL-15)。
14.权利要求9-10中任一项的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽包含G-CSF或经修饰的G-CSF(mG-CSF)。
15.权利要求9-10中任一项的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽包含GM-CSF或经修饰的GM-CSF(mGM-CSF)。
16.权利要求9-10中任一项的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽包含IFN-α2或经修饰的IFN-α2(mIFN-α2)。
17.权利要求9-10中任一项的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽包含IFN-β1或经修饰的IFN-β1(mIFN-β1)。
18.权利要求9-10中任一项的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽包含GLP-1或经修饰的GLP-1(mGLP-1)。
19.权利要求9-10中任一项的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽包含FGF21或经修饰的FGF21(mFGF21)。
20.权利要求9-10中任一项的融合蛋白组合物，其中所述生物活性多肽包含sdAb或经修饰的sdAb(msdAb)。
21.权利要求1-20中任一项的融合蛋白组合物，还包含靶向试剂，其共价连接至所述AAT或mAAT多肽、所述生物活性多肽或其组合。
22.一种药物组合物，其包含融合蛋白和任选地一种或多种药学上可接受的载体，所述融合蛋白包含：
AAT多肽或其功能性变体；
生物活性多肽；
其中，所述生物活性多肽与所述AAT多肽共价连接，经由接头肽与所述AAT多肽共价连接，或它们的组合。
23.权利要求22的药物组合物，其中所述融合蛋白包含具有N末端、C末端和1-50个氨基酸残基的所述接头肽，并且其中所述接头肽位于所述AAT多肽和所述生物活性多肽之间。
24.权利要求23的药物组合物，其中所述生物活性多肽连接至所述接头肽的N末端，并且所述AAT多肽连接至所述接头肽的C末端。
25.权利要求23的药物组合物，其中所述生物活性多肽连接至所述接头肽的C末端，并且所述AAT多肽连接至所述接头肽的N末端。
26.权利要求22-25中任一项的药物组合物，其中所述AAT多肽包含mAAT多肽或其功能性变体，其中所述mAAT多肽或所述其功能性变体不含半胱氨酸氨基酸残基，其中所述功能性变体与所述mAAT多肽具有至少85％的序列同一性，并且其中所述mAAT多肽和所述功能性变体均不具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。
27.权利要求26的药物组合物，其中所述融合蛋白包含在所述mAAT的Z位置处具有丝氨酸或丙氨酸突变的所述mAAT。
28.权利要求22-27中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽具有100至25,000道尔顿的分子量。
29.权利要求22-28中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽具有100至24,000道尔顿的分子量，0至3个二硫键，或其组合。
30.权利要求22-29中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽包括细胞因子、经修饰的细胞因子、肽激素、经修饰的肽激素、干扰素、经修饰的干扰素、生长因子、经修饰的生长因子、抗体、抗体的片段、肽、抗原、新抗原、抑制剂、激活剂、酶、结合蛋白、蛋白质、蛋白质的片段，或其组合。
31.权利要求22-30中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽包含白细胞介素-2(IL-2)、经修饰的白细胞介素-2(mIL-2)、白细胞介素-15(IL-15)、经修饰的白细胞介素-15(mlL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、经修饰的粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、经修饰的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)、干扰素α-2(IFN-α2)、经修饰的干扰素α-2(mIFN-α2)、干扰素β-1(IFN-β1)、经修饰的干扰素β-1(mIFN-β1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、经修饰的胰高血糖素样肽-1(mGLP-1)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、经修饰的成纤维细胞生长因子21(mFGF21)、单域抗体(sdAb)、经修饰的单域抗体(msdAb)、其片段，或其组合。
32.权利要求30-31中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽包括白细胞介素-2(IL-2)或经修饰的IL-2(mIL-2)。
33.权利要求30-32中任一项的药物组合物，其中所述mIL-2在所述mIL-2的X位置处包含丝氨酸或丙氨酸突变。
34.权利要求30-31中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽包含白细胞介素-15(IL-15)或经修饰的IL-15(mIL-15)。
35.权利要求30-31中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽包含G-CSF或经修饰的G-CSF(mG-CSF)。
36.权利要求30-31中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽包含IFN-α2或经修饰的IFN-α2(mIFN-α2)。
37.权利要求30-31中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽包含IFN-β1或经修饰的IFN-β1(mIFN-β1)。
38.权利要求30-31中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽包含GLP-1或经修饰的GLP-1(mGLP-1)。
39.权利要求30-31中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽包含FGF21或经修饰的FGF21(mFGF21)。
40.权利要求30-31中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽包含GM-CSF或经修饰的GM-CSF(mGM-CSF)。
41.权利要求30-31中任一项的药物组合物，其中所述生物活性多肽包含sdAb或经修饰的sdAb(msdAb)。
42.权利要求22-41中任一项的药物组合物，其中所述融合蛋白还包含靶向试剂，其共价连接至所述AAT或mAAT多肽、所述生物活性多肽或其组合。
43.一种蛋白质组合物，其包含mATT多肽或其功能性变体，其中所述mAAT多肽或所述其功能性变体不含半胱氨酸氨基酸残基，所述功能性变体与所述mAAT多肽具有至少85％的序列同一性，并且其中所述mAAT多肽和所述功能性变体均不具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。
44.权利要求43的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物包含在所述mAAT的Z位置处具有丝氨酸或丙氨酸突变的所述mAAT。
45.一种药物组合物，其包含权利要求43-44中任一项的蛋白质组合物。
46.一种表达载体，其包含编码区，所述编码区包含编码AAT多肽或其功能性变体的AAT密码以及编码生物活性多肽的生物活性多肽密码，其中将所述AAT密码和所述生物活性多肽密码设置为直接连接在一起，或者设置为经由编码具有N末端、C末端和1-50个氨基酸残基的接头肽的接头密码而连接在一起，并且其中所述接头密码位于所述AAT密码和所述生物活性多肽密码之间。
47.权利要求46的表达载体，其中将所述编码区设置为在表达时，具有与所述接头肽的N末端连接的所述生物活性多肽以及与所述接头肽的C末端连接的所述AAT多肽。
48.权利要求46的表达载体，其中将所述编码区设置为在表达时，具有与所述接头肽的C末端连接的所述生物活性多肽以及与所述接头肽的N末端连接的所述AAT多肽。
49.权利要求46-48中任一项的表达载体，其中所述AAT密码包含编码mAAT多肽或其功能性变体的mAAT密码，其中所述mAAT多肽或所述其功能性变体不含半胱氨酸氨基酸残基，其中所述功能性变体与所述mAAT多肽具有至少85％的序列同一性，并且其中所述mAAT多肽和所述功能性变体均不具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。
50.权利要求49的表达载体，其中所述mAAT密码编码在所述mAAT的Z位置处具有丝氨酸或丙氨酸突变的mAAT多肽。
51.权利要求46-50中任一项的表达载体，其中所述生物活性多肽具有100至25,000道尔顿的分子量。
52.权利要求46-51中任一项的表达载体，其中所述生物活性多肽具有100至24,000道尔顿的分子量，0至3个二硫键，或其组合。
53.权利要求46-52中任一项的表达载体，其中所述生物活性多肽包括细胞因子、经修饰的细胞因子、肽激素、经修饰的肽激素、干扰素、经修饰的干扰素、生长因子、经修饰的生长因子、抗体、抗体的片段、肽、抗原、新抗原、抑制剂、激活剂、酶、结合蛋白、蛋白质、蛋白质的片段，或其组合。
54.权利要求53的表达载体，其中所述生物活性多肽包含白细胞介素-2(IL-2)、经修饰的白细胞介素-2(mIL-2)、白细胞介素-15(IL-15)、经修饰的白细胞介素-15(mIL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、经修饰的粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、经修饰的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)、干扰素α-2(IFN-α2)、经修饰的干扰素α-2(mIFN-α2)、干扰素β-1(IFN-β1)、经修饰的干扰素β-1(mIFN-β1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、经修饰的胰高血糖素样肽-1(mGLP-1)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、经修饰的成纤维细胞生长因子21(mFGF21)、单域抗体(sdAb)、经修饰的单域抗体(msdAb)、其片段，或其组合。
55.权利要求53-54中任一项的表达载体，其中所述生物活性多肽包括白细胞介素-2(IL-2)或经修饰的IL-2(mIL-2)。
56.权利要求53-55中任一项的表达载体，其中所述mIL-2在所述mIL-2的X位置处包含丝氨酸或丙氨酸突变。
57.权利要求53-54中任一项的表达载体，其中所述生物活性多肽包含白细胞介素-15(IL-15)或经修饰的IL-15(mIL-15)。
58.权利要求53-54中任一项的表达载体，其中所述生物活性多肽包含G-CSF或经修饰的G-CSF(mG-CSF)。
59.权利要求53-54中任一项的表达载体，其中所述生物活性多肽包含IFN-α2或经修饰的IFN-α2(mIFN-α2)。
60.权利要求53-54中任一项的表达载体，其中所述生物活性多肽包含IFN-β1或经修饰的IFN-β1(mIFN-β1)。
61.权利要求53-54中任一项的表达载体，其中所述生物活性多肽包含GLP-1或经修饰的GLP-1(mGLP-1)。
62.权利要求53-54中任一项的表达载体，其中所述生物活性多肽包含FGF21或经修饰的FGF21(mFGF21)。
63.权利要求53-54中任一项的表达载体，其中所述生物活性多肽包含sdAb或经修饰的sdAb(msdAb)。
64.权利要求46-63中任一项的表达载体，其中所述编码区还包含编码靶向试剂多肽的靶向试剂密码，所述靶向试剂多肽与所述AAT多肽、所述生物活性多肽或其组合连接。
65.权利要求46-64中任一项的表达载体，其中所述编码区包含在SEQ ID.7或SEQ ID.8中鉴定的密码。
66.权利要求46-65中任一项的表达载体，其中所述表达载体被设置为在原核生物、真核生物、病毒系统、细胞培养系统、无细胞表达系统或其组合中表达所述编码区。
67.权利要求46-66中任一项的表达载体，其中所述表达载体被设置为在大肠杆菌细胞中表达所述编码区。
68.一种用于产生融合蛋白的方法，该方法包括：
在宿主中表达包含编码所述融合蛋白的编码区的权利要求46-67中任一项的表达载体以产生前融合蛋白；
从所述宿主的细胞，所述宿主的细胞裂解物，所述宿主的包涵体，培养所述宿主的培养基或其组合中收集所述前融合蛋白；以及
由所述前融合蛋白产生所述融合蛋白。
69.权利要求68的方法，其中所述前融合蛋白是从所述包涵体中收集的。
70.权利要求68-69中任一项的方法，其中所述融合蛋白是通过重折叠过程由所述前融合蛋白产生，所述过程包括：
(1)使所述前融合蛋白与变性剂接触；
(2)通过逐渐移除所述变性剂来重折叠所述前融合蛋白，以形成所述融合蛋白；以及
(3)纯化所述融合蛋白。
71.权利要求68-70中任一项的方法，其中所述编码区编码所述融合蛋白，所述融合蛋白包含AAT或mAAT多肽和生物活性多肽，所述生物活性多肽包含细胞因子、经修饰的细胞因子、肽激素、经修饰的肽激素、干扰素、经修饰的干扰素、生长因子、经修饰的生长因子、抗体、抗体的片段、肽、抗原、新抗原、抑制剂、激活剂、酶、结合蛋白、蛋白质、蛋白质的片段，或其组合。
72.权利要求71的方法，其中所述生物活性多肽包括白细胞介素-2(IL-2)、经修饰的白细胞介素-2(mIL-2)、白细胞介素-15(IL-15)、经修饰的白细胞介素-15(mIL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、经修饰的粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、经修饰的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)、干扰素α-2(IFN-α2)、经修饰的干扰素α-2(mIFN-α2)、干扰素β-1(IFN-β1)、经修饰的干扰素β-1(mIFN-β1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、经修饰的胰高血糖素样肽1(mGLP-1)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、经修饰的成纤维细胞生长因子21(mFGF21)、单域抗体(sdAb)、经修饰的单域抗体(msdAb)、其片段，或其组合。
73.权利要求71-72中任一项的方法，其中所述生物活性多肽包括白细胞介素-2(IL-2)或经修饰的IL-2(mIL-2)。
74.权利要求71-73中任一项的方法，其中所述mIL-2在所述mIL-2的X位置处包含丝氨酸或丙氨酸突变。
75.权利要求71-72中任一项的方法，其中所述生物活性多肽包含白细胞介素-15(IL-15)或经修饰的IL-15(mIL-15)。
76.权利要求71-72中任一项的方法，其中所述生物活性多肽包含G-CSF或经修饰的G-CSF(mG-CSF)。
77.权利要求71-72中任一项的方法，其中所述生物活性多肽包含IFN-α2或经修饰的IFN-α2(mIFN-α2)。
78.权利要求71-72中任一项的方法，其中所述生物活性多肽包含IFN-β1或经修饰的IFN-β1(m1FN-β1)。
79.权利要求71-72中任一项的方法，其中所述生物活性多肽包含GLP-1或经修饰的GLP-1(mGLP-1)。
80.权利要求71-72中任一项的方法，其中所述生物活性多肽包含FGF21或经修饰的FGF21(mFGF21)。
81.权利要求71-72中任一项的方法，其中所述生物活性多肽包含sdAb或经修饰的sdAb(msdAb)。
82.权利要求71-72中任一项的方法，所述融合蛋白还包含靶向试剂，其共价连接至所述AAT或mATT多肽、所述生物活性多肽或其组合。
83.权利要求71-72中任一项的方法，其中所述编码区包含在SEQ ID.7或SEQ ID.8中鉴定的密码。
84.权利要求68-83中任一项的方法，其中所述宿主包含大肠杆菌细胞。
85.一种在需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括将权利要求22-42中任一项或权利要求45的药物组合物给予所述受试者。
86.权利要求85的方法，其中所述药物组合物是通过静脉内(IV)注射、皮下(SC)注射、肌内(IM)注射、皮内(ID)注射或其组合给予所述受试者。
87.权利要求85的方法，其中所述药物组合物是通过局部注射给予所述受试者，以将所述药物组合物递送至疾病部位内或附近。
88.权利要求85-87中任一项的方法，其中所述疾病是癌症、自身免疫性疾病、糖尿病、血管炎、心脏病、病毒感染，或其组合。
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