KR100484084B1 - 키메라성 폴리펩타이드, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents
키메라성 폴리펩타이드, 이의 제조 방법 및 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은,
1 내지 3개의 시스테인계 디설파이드 브릿지를 통해 화학적으로 연결된, 1 내지 3개의 시스테인 및 4 내지 12개의 염기성 아미노산, 바람직하게는 아르기닌, 라이신 및 오르니틴으로 구성된 군으로부터 선택된 산성 아미노산으로 이루어진 제 1 폴리펩타이드 쇄; 및 1 내지 3개의 시스테인 및 4 내지 12개의 산성 아미노산, 바람직하게는 글루타메이트 및 아스파테이트로 구성된 군으로부터 선택된 산성 아미노산으로 이루어진 제 2 폴리펩타이드 쇄로 이루어지고,
각각의 상기 폴리펩타이드 쇄가 그의 C- 및/또는 N-말단에서 생물활성 화합물에 연결됨을 특징으로 하는,
다량체성 약제로서 유용한 키메라성 폴리펩타이드에 관한 것이다.
Description
본 발명은 시스테인계 디설파이드 브릿지를 통해 화학적으로 연결된 키메라성 폴리펩타이드, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
인공적 이작용성 또는 다작용성 생물활성 화합물은 진단법 및 치료법에 있어서 광범위한 잠재적인 용도를 갖는다. 이작용성 단백질은 특히 면역진단법 및 면역치료법에 바람직하게 사용된다. 예를 들면, 상이한 생물학적 기능을 갖는 단백질을 특정 항원에 지향시키기 위해 항체 또는 항체 단편을 그의 항원으로 특이적으로 결합시키는 것을 이용한다. 예를 들면, 항원이 한편으로는 종양 세포에 위치하고 다른 한편으로는 마크로파지상에 위치한 이특이적 항체는 킬러 세포를 종양으로 지향시키기 위해 사용될 수 있다(볼렌(Bohlen, H.) 등의 문헌[Blood 82 (1993) 1803-1812] 참조). 이러한 이특이적 항체는 각각의 일특이적 항체를 생성하는 두 개의 하이브리도마 세포를 융합하여 쿠아드로마(quadroma) 세포를 형성함으로써 제조될 수 있다(밀스타인(Milstein, C.) 및 쿠엘로(Cuello, A.C.)의 문헌[Nature 305 (1983) 537-540] 참조). 이들 세포는, 두 개의 본래의(original) 항체 이외에도, 또한 이특이적 항체를 생성할 수 있다. 그러나, 이특이적 단백질을 수득하는 이러한 방법은 항체에만 유일하게 제한된다. 또한, 발현된 항체들중 단지 15%만이 원하는 이특이성을 나타낸다. 이들 항체는 노동 집약적 정제 방법에 의해서만 혼합물로부터 단리된다.
이특이적 항체 및 그 외의 이특이적 단백질을 제조하는 보다 매우 유용한 방법은 원하는 특성을 갖는 두 개의 단백질의 화학적 가교결합에 기초한다(팬저(Fanger, M.W.) 등의 문헌[Crit. Rev. Immunol. 12 (1992) 101-24] 참조). 이러한 가교결합은 단백질의 아미노 그룹 또는 시스테인 잔기와 반응하는 이작용성 링커 분자에 의해 달성된다. 후자의 경우, 예를 들면 한 단백질의 시스테인 잔기를 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)(DTNB)으로 활성화시킬 수 있고, 환원된 형태의 시스테인 잔기를 함유하는 제 2 단백질을 첨가하여 디설파이드를 형성함으로써, 2개의 단백질을 공유 커플링시킨다. 이러한 방법을 통해, 이종이량체성 이작용성 단백질의 수율은 보통 높은 비율의 동종이량체를 초래하는 비특이적 가교결합보다 상당히 개선될 수 있다.
여전히, 화학적 가교결합 방법은 비균질성 물질을 초래한다. 이러한 이형발생성은 이특이적 구조물의 안정성 및 작용성에 부정적인 영향을 줄 수 있다(데빈스키(Debinski, W.) 및 파스탄(Pastan, I.)의 문헌[Bioconjug. Chem. 5 (1994) 40-43] 참조).
가장 빈번히 적용되는 이작용성 단백질의 제조 방법은 유전자적 수준에서 융합 단백질을 형성하는 것이다. 이를 위해, 유전자 조작 방법에 의해 단백질의 cDNA의 5' 말단은 또다른 단백질의 유전자의 3' 말단에 연결되면서 리딩 프레임(reading frame)이 보유되고, 구조물은 원핵 세포 또는 진핵 세포내에서 재조합적으로 발현된다. 상기 방식으로, 예를 들면 종양에 대해 지향되는 항체 단편은 박테리아 독소와 융합되었다(브링크만(Brinkmann, U.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 8616-8620] 참조). 이러한 면역독소는 종양 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있다. 박테리아 독소 외에도, 항체 단편의 융합체는 또한 RNase 및 다른 효소와 함께 성공적으로 제조되었고, 이들의 작용성은 세포 배양물에서 검사되었다(뉴톤(Newton, D.L.) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 267 (1992) 19572-19578]; 제위(Zewe, M.) 등의 문헌[Immunotechnol. 3 (1997) 127-136] 참조).
소위 다이어바디(diabody)는 융합 단백질의 또다른 형태를 나타낸다(홀리거(Holliger, P.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448] 참조). 다이어바디는 상이한 특이성을 갖는 두 개의 Fv 단편으로 구성된다. 항체내의 두 개의 가변성 도메인이 링커를 통해 서로 연결되어 있는 scFv 단편과는 달리, 다이어바디의 경우, 한 항체의 VL 도메인이 제 2 항체의 VH 도메인과 융합된다. 상기 목적에 사용되는 링커는 두 개의 도메인의 분자내 결합을 방지하고, 대신 두 개의 이들 구조물의 분자간 결합을 발생시켜 이작용성 다이어바디를 형성하게 하는 구조를 가져야 한다.
최근에 이작용성 단백질의 제조에 일반적으로 적용될 수 있는 시스템을 개발하기 위한 다양한 시도들이 있었다. 이 때문에, 단백질은 지향된 결합을 부여하기 위해 이량체화 도메인으로서 펩타이드 또는 단백질과 유전자 수준에서 융합되었다. 이량체화 단위로서 항체 도메인 CL 및 CHl, 칼모듈린 및 상응하는 결합 펩타이드 또는 스트렙타비딘이 사용되었다(뮐러(Muller, K.M.) 등의 문헌[FEBS Lett. 422 (1998) 259-264]; 네리(Neri, D.) 등의 문헌[BioTechnology 13 (1995) 373-377]; 뒤벨(Dubel, S) 등의 문헌[J. Immunol. Methods 178 (1995) 201-209] 참조). 또한, 로이신 지퍼(zipper) 및 양성친화성 나선과 같은 짧은 펩타이드 서열이 지향된 이종이량체화를 위한 작용성 단위로서 사용될 수도 있다(코스텔니(Kostelny, S.A.) 등의 문헌[J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553] 참조). 그러나 이제까지, 지향된 결합을 위한 방법중 어느 것도 일반적으로 적용될 수 있는 기법으로서 수립되지는 않았다.
본 발명의 목적은 제조하기에 용이하고 안정한 키메라성 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 1 내지 3개의 시스테인계 디설파이드 브릿지를 통해 화학적으로 연결된, 1 내지 3개의 시스테인 및 4 내지 12개의 염기성 아미노산, 바람직하게는 아르기닌, 라이신 및 오르니틴으로 구성된 군으로부터 선택된 염기성 아미노산으로 이루어진 제 1 폴리펩타이드 쇄, 및 1 내지 3개의 시스테인 및 4 내지 12개의 산성 아미노산, 바람직하게는 글루타메이트 및 아스파테이트로 구성된 군으로부터 선택된 산성 아미노산으로 이루어진 제 2 폴리펩타이드 쇄로 이루어지고, 각각의 상기 폴리펩타이드 쇄가 그의 C- 및/또는 N-말단에서 생물활성 화합물에 연결됨을 특징으로 하는, 키메라성 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 한 바람직한 양태에서, 상기 생물활성 화합물들은 그들의 화학 구조에 의해 서로 상이하다. 상기 화합물은 항체, 항체 단편 또는 효소인 것이 보다 바람직하다.
본 발명은 1 내지 3개의 시스테인계 디설파이드 브릿지를 통해 화학적으로 연결된, 1 내지 3개의 시스테인 및 4 내지 12개의 염기성 아미노산, 바람직하게는 아르기닌, 라이신 및 오르니틴으로 구성된 군으로부터 선택된 염기성 아미노산으로 이루어진 제 1 폴리펩타이드 쇄, 및 1 내지 3개의 시스테인 및 4 내지 12개의 산성 아미노산, 바람직하게는 글루타메이트 및 아스파테이트로 구성된 군으로부터 선택된 산성 아미노산으로 이루어진 제 2 폴리펩타이드 쇄로 이루어지고, 각각의 상기 폴리펩타이드 쇄가 그의 C- 및/또는 N-말단에서 생물활성 화합물에 연결되는,키메라성 폴리펩타이드의 제조 방법을 추가로 포함하는데, 이 방법은 생물활성 폴리펩타이드에 각각 연결되는 상기 두 개의 폴리펩타이드 쇄를 코딩하는 두 개의 핵산을 원핵 또는 진핵 숙주 세포내에서 동시에 또는 별도로 발현시키고, 폴리펩타이드를 숙주 세포 또는 상청액으로부터 회수하며, 산화제로 처리하여 상기 디설파이드 브릿지를 형성하고, 상기 키메라성 폴리펩타이드를 단리함을 특징으로 한다.
키메라성 폴리펩타이드를 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법에 의해, 이종이량체가 원하는 생성물인 경우 동종이량체의 형성을 본질적으로 방지할 수 있다.
본 발명은 4 내지 12개의 염기성 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 쇄가 낮은 이온 강도의 수용액중에서 4 내지 12개의 산성 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 쇄와 특이적으로 상호작용한다는 사실에 기초한다. 이들 폴리펩타이드가 둘다 추가로 시스테인을 함유할 경우, 후속적인 반응에서, 산화 조건 또는 심지어 약간 환원인 조건하에서 양쪽 폴리펩타이드 쇄의 시스테인 사이에 디설파이드 브릿지가 특이적으로 형성될 수 있다. 바람직하게는 폴리펩타이드 쇄중의 두 시스테인 사이의 거리는 1개 이상, 바람직하게는 3 내지 6개의 아미노산이다. 양쪽 폴리펩타이드의 시스테인의 양 및 거리가 동일한 것이 바람직하며, 양쪽 폴리펩타이드의 시스테인이 서로 대향하여 위치할 경우 하나의 스트랜드의 산성 아미노산 및 다른 스트랜드의 염기성 아미노산이 각각의 경우에 또한 대향하여 위치함을 내포한다. 시스테인들의 동일한 거리는 양쪽 스트랜드에서 시스테인 이외의 아미노산의 동일한 양이 상기 시스테인들 사이에 위치함을 의미한다.
본 발명에 따라서, 상기 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 쇄를 통해 둘 이상의 생물활성 화합물을 안정한 공유결합 형태 및 공간적으로 한정된 위치로 연결시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 쇄는, 시스테인의 위치 및 염기성 아미노산과 산성 아미노산의 위치가 산성 및 염기성 아미노산 사이의 이온성 상호작용 및 하나 이상의 디설파이드 브릿지를 통한 커플링을 미리 선택된 지향된 형태로 최적화할 수 있는 방식으로 고안된다. 이러한 방식에서, 생물활성 화합물을 서로에 대해 미리선택된 공간적 위치로 가교결합시킬 수 있다. 예를 들면, 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 쇄가 그들의 N-말단이 만나고 그들의 C-말단이 만나는 위치로 있을 때, 생물활성 화합물들은 이들이 둘다 폴리펩타이드 쇄의 C-말단에서 연결(또는 둘다 N-말단에서 연결)될 경우 서로에 대해 매우 인접한 공간적 위치로 옮겨질 수 있다. 생물활성 화합물중 하나가 C-말단에서 연결되고 다른 하나가 폴리펩타이드 쇄의 N-말단에서 연결된 경우, 서로에 대한 이들의 공간적 거리는 보다 매우 넓다. 이러한 경우, 이량체화된 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 쇄는 본질적으로 두 개의 생물활성 화합물들 사이에서, 바람직하게는 두 개의 폴리펩타이드 사이에서 선형 링커로서 작용한다. 4개의 생물활성 화합물들이 서로에 대한 공간적 위치로 옮겨져야 할 경우 유사한 절차가 적용될 수 있다.
도 1은 완충액중의 NaCl 농도에 따른 디설파이드 결합된 이종이량체 ACE8-ACK8의 형성을 나타낸 그래프이다. ACK8(▲), ACK8 및 GSSG 사이의 혼합된 디설파이드(ACK8-SG, ■) 및 디설파이드 결합된 이종이량체 ACE8-ACK8(●)의 상대량이 제시되어 있다.
도 2는 완충액의 산화환원 전위에 따른 디설파이드 결합된 이종이량체 ACE8-ACK8의 형성을 나타낸 그래프이다. 이종이량체 ACE8-ACK8(●) 및 비전환된 펩타이드 ACK8(■)의 양이 제시되어 있다.
도 3은 시스테인 함유 라미닌 펩타이드 및 α-글루코시데이즈의 10배 몰초과량에 따른 디설파이드 결합된 이종이량체 ACE8-ACK8의 형성을 분석한 그래프이다. 두가지 상이한 산화환원 시스템을 갖는 완충액에서 경쟁이 수행된다.
도 4는 VLP's와 ds Fv's의 지향된 결합을 입증하기 위한 환원 조건하의 쿠마시-염색된 SDS-PAGE(18%)를 나타낸 것이다(래인: (1) VH 및 VL에서 해리된 ds Fv; (2) 200mM NaCl 존재하의 야생형 VLP's 및 ds Fv 사이의 결합 반응; (3) 750mM 암모늄 설페이트의 존재하의, VP1-Glu에 의해 조립된 VLP's 및 ds Fv 사이의 결합 반응; (4) 200mM NaCl의 존재하의, VP1-Glu에 의해 조립된 VLP's 및 ds Fv 사이의 결합 반응; (5) 분자량 마커).
도 5는 낮은 이온 강도에서의 FabD10SCP 및 α-글루코시데이즈 R10CGP의 결합 반응의 용출 프로파일(TosoHaas TSK 2000 SWXL; 50mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7.0; 300mM NaCl; 유속 0.75ml/분; 칼럼 부피: 14.335ml)을 나타낸 것이다. Fab 및 α-글루코시데이즈 둘다를 포함하는 분자만을 검출하는 이작용성 검정(변형된 ELISA) 결과가 제시되어 있다. 용출된 분획의 100㎕ 분취량을 스트렙타비딘 코팅된 튜브내에서 비오틴화된 크레아틴 카이네이즈 용액(5% 차단 시약) 1ml와 함께 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다; 고농도의 염 완충액(2M NaCl; 10mM 트리스-HCl pH 7.5)으로 2회, 저농도의 염 완충액(10mM 트리스-HCl pH 7.5)으로 1회 세척한 후, 튜브를 100mM K2HPO4/KH2PO4(pH 6.8)내에서 2mM 파라-니트로글루코피라노사이드 800㎕와 함께 30℃에서 3시간 동안 항온처리하였다; 405nm 파장에서 기준치에 대한 흡광도를 측정하였다. 키메라성 단백질을 함유하는 고분자량의 분획이 가장 높은 이작용성 활성을 나타낸다. 결합되지 않은 α-글루코시데이즈의 존재에 의해 낮은 배경 시그널이 나타난다.
본 발명에 따른 "키메라성 폴리펩타이드"는, 화학적으로 상이하고, 상이한 전하를 갖는 다수의 아미노산을 통한 이온성 상호작용의 결과로서 서로 결합하고, 추가로 시스테인의 디설파이드 브릿지를 통해 서로 공유결합하는 방식으로 구성되는, 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 폴리펩타이드를 의미한다. 키메라성 폴리펩타이드를 제조하는데 있어서, 폴리펩타이드 쇄중의 산성 및 염기성 아미노산 사이의 다가이온성 상호작용은 폴리펩타이드를 서로에 대해 디설파이드 브릿지를 용이하게 형성하도록 미리선택된 위치로 가교결합시키는 작용을 한다. 키메라성 폴리펩타이드의 목적은 원치않는 부산물(예: 동종이량체 또는 키메라성 생성물; 여기서 생물활성 화합물들은 서로에 대해 바람직하지 않은 위치에 있다)의 형성을 방지하면서 생물활성 화합물들을 안정하고 미리한정된 방식으로 서로 커플링시키는 것이다. 일반적으로, 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 쇄는 그 자체로는 실질적인 생물학적 활성을 나타내지 않는다. 이들은 이량체 또는 다량체 형태로 미리선택된 약학 효과를 진행시킬 수 있는 생물활성 화합물들의 커플링을 보조하는 보조제일 뿐이다. 폴리펩타이드 쇄 사이의 강한 이온성 상호작용을 위해, 서로에 대해 대향된 위치로 쇄상에 위치한 염기 및 산성 아미노산의 pKa값은 가능한 크게 상이한 것이 바람직하다. 따라서, 염기성 아미노산의 pKa값은 약 10 이상인 반면, 산성 아미노산의 pKa값은 약 4.5 미만인 것이 바람직하다.
폴리펩타이드 쇄는, 제 1 폴리펩타이드 쇄의 경우 1 내지 3개의 시스테인 및 바람직하게는 아르기닌, 라이신 및 오르니틴으로 구성된 군으로부터 선택된 4 내지 12개의 추가의 아미노산으로 이루어진다. 제 2 폴리펩타이드 쇄는 또한 1 내지 3개의 시스테인 및 바람직하게는 글루타메이트 및 아스파테이트로 구성된 군으로부터 선택된 4 내지 12개의 산성 아미노산으로 이루어진다. 한 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드 쇄는 6 내지 10개의 염기 또는 산성 아미노산으로 이루어진다. 추가로, 폴리펩타이드 쇄는 각각 시스테인 잔기를 함유하는 것이 바람직하다. 그러나, 다른 산성 또는 염기성 아미노산 또는 이들의 유도체 또한 이들의 pKa값이 매우 상이하고(약 5 단위 이상 차이나는 것이 바람직하다) 이온성 상호작용이 두 폴리펩타이드 쇄의 결합을 유도하는 한, 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
임의의 원하는 생물활성 화합물이 생물활성 화합물로서 사용될 수 있다.
따라서, 본원에서 "생물활성 화합물 또는 물질"이란 용어는, 인간을 비롯한 포유동물 및 조류를 포함하나 이에 제한되지 않는 동물에게 생체내로 투여될 경우 생물학적 효과를 일으키는 약물, 생물학적 거대분자, 예를 들면 펩타이드, 단백질, 탄수화물(단당류, 올리고당류 및 다당류를 포함함), 핵단백질, 뮤코단백질, 지단백질, 합성 폴리펩타이드 또는 합성 단백질, 또는 단백질에 결합된 작은 분자, 당단백질, 스테로이드, 핵산(cDNA를 비롯한 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 단편의 임의의 형태), 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함함), 유전자, 지질, 호르몬, 비타민(비타민 C 및 비타민 E를 포함함), 또는 이들의 조합물을 비롯한 유기 분자를 의미한다.
본원에서 "약물"이란 용어는 질환 또는 질병을 치료, 치유 또는 예방하기 위한 약제로서 내부적으로 또는 외부적으로 사용되는 임의의 물질을 의미하고, 제한되지는 않지만 면역억제제, 산화방지제, 마취제, 화학치료제, 스테로이드(레티노이드를 포함함), 호르몬, 항체, 항바이러스제, 항진균제, 항증식제, 항히스타민제, 응고방지제, 광시효변화 방지제, 멜라닌친화성 펩타이드, 비스테로이드계 및 스테로이드계 소염 화합물 및 방사선 흡수제(UV-흡수제를 포함함)를 포함한다.
"생물활성제"란 용어는 또한 살충제, 구충제, 살진균제, 살설치류제, 및 식물 영양제 및 성장 촉진제를 포함한다.
바람직하게는 2000 또는 3000 내지 수백만의 범위의 분자량을 갖는 생물학적 거대분자는 생리 작용의 중요한 조절제이다. 생물학적으로 활성인 거대분자의 크기 및 3차원 구조는 수용체, 효소, 핵산 또는 이와 상호작용하는 기타 생물학적 매개체와 매우 특이적인 상호작용을 통해 중요한 화학 정보를 수송한다. 혈전증, 염증 및 면역 반응과 같은 다양한 증상이 거대분자의 3차원 형태에 의해 적어도 부분적으로 조절된다. 거대분자의 표면은 이온성, 소수성, 입체성, 정전기성 및 수소 결합 특징을 분자에 부여하고 수용체 결합을 위한 분자 주형을 제공하는 기하학적으로 분포된 그룹으로 구성된다.
글리코스아미노글리칸(GAG)으로도 언급되는 산 뮤코다당류는 반복되는 이당류 단위로 이루어지는데, 이들 단위는 각각 아미노헥소스의 유도체, 일반적으로 D-글루코스아민 또는 D-갈락토스아민을 함유한다. 산 뮤코다당류의 반복되는 이당류 단위에서 두가지 당중 하나 이상은 pH 7에서 음전하를 갖는 산성 그룹을 함유하거나, 카복실레이트 또는 설페이트 그룹을 함유한다. 중요한 산 뮤코다당류는 헤파린으로서, 이는 대동맥 혈관에 특히 풍부한 특정 유형의 세포에 의해 생성된다. 헤파린은 매우 강력한 혈액 응고 억제제이고, 순환되는 혈액에서의 응혈 형성을 방지하는 것을 돕는다(잭슨(Jackson, R.L.) 등의 문헌[Physiol. Reviews 71 (1991) 481-522] 참조).
GAG이 세포 과정(혈관형성, 신경세포 진행, 평활근 세포 증식), 유전자 발현 및 항상성유지의 매개체인 것으로 알려져 있다. GAG는 DNA와 상호작용한다(데이비슨(Davidson, J.N.)의 문헌[The biochemistry of the nucleic acids; Methuem, London, 1969] 참조).
DNA 및 GAG(예를 들면, 헤파린)는 둘다 생물활성을 위해 필수적인 다가음이온 전하를 갖는 선형 중합체이다. DNA 나선의 견고성은, 특이적으로 서열화된 핵산이 원하는 생물학적 상호작용을 수득하기 위해 제공되도록 보증한다.
단백질은 세포중에 가장 풍부한 거대분자로서 세포 건조 중량의 반 이상을 차지한다. 단백질 및 펩타이드는 이들의 3차원 구조로 화학적 정보를 수송하는 것으로 알려져 있다. 천연 발생되는 다수의 단백질은 다른 화학 그룹에 공액된다. 예로서 지단백질, 당단백질, 인단백질, 헤모단백질, 플라보단백질 및 메탈로단백질이 있다.
단백질은 다양한 생물학적 기능을 갖는다. 비제한적인 예로는 수송 단백질(예: 헤모글로빈 및 혈청 알부민), 영양 및 저장 단백질(예: 글리아딘, 오브알부민, 카제인 및 페리틴); 수축 또는 운동 단백질(예: 액틴, 미오신, 튜불린 및 다이나인); 구조 단백질(예: 케라틴, 피브로인, 콜라겐, 엘라스틴 및 프로테오글리칸); 방어 단백질(예: 항체, 면역글로불린, 피브리노겐, 트롬빈, 보튤리너스 독소, 디프테리아 독소, 뱀독 및 리신); 효소 및 조절 단백질(예: 인슐린, 성장 호르몬, 코르티코트로핀 및 억제제)이 포함된다.
호르몬은 티로트로핀-방출 인자, 코르티코트로핀, 바소프레신, 인슐린 및 글루카곤과 같은 펩타이드계 호르몬; 아드레날린 및 티록신과 같은 아민계 호르몬; 또는 코르티솔, 베타-에스트라디올, 테스토스테론 및 프로게스테론과 같은 스테로이드계 호르몬으로 분류된다. 중요한 호르몬의 다른 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 아드레노코르티코트로핀-방출 호르몬, 소마토트로핀 방출 호르몬, 소마토스타틴, 프로락틴-방출 호르몬, 프로락틴-억제 호르몬, FSH- 및 LH-방출 호르몬, 바소프레신 및 옥시토신이 포함된다.
치료학적 생물활성 화합물은 또한 항종양제, 항감염제, 항우울증제, 항바이러스제, 항침해수용제, 불안완화제 및 호르몬으로 이루어진 일반 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 항종양제의 대표적인 예로는 메토트렉세이트, 탁솔, 종양 괴사 인자, 클로람부실, 인터류킨, 블레오마이신, 에토포사이드, 플루오로우라실 및 빈블라스틴이 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 항감염제의 대표적인 예로는 펜타미딘, 메트로니다졸, 페니실린, 세팔렉신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜이 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 항바이러스제의 대표적인 예로는 디데옥시오이티딘, 지도부딘, 아시클로버, 인터페론, 디데옥시이노신 및 간시클로버가 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 불안완화제 및 진정제의 대표적인 예로는 벤조디아제핀, 예컨대 디아제팜, 바르비투레이트, 예컨대 페노바르비탈 및 기타 화합물, 예컨대 부스피론 및 할로페리돌이 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 호르몬의 대표적인 예로는 에스트라디올, 프레드니손, 인슐린, 성장 호르몬, 에리트로포이에틴 및 프로스타글란딘이 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 항우울증제의 대표적인 예로는 플루옥세틴, 트라조돈, 이미프라민 및 독세핀이 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 항침해수용제의 대표적인 예로는 하이드로모르핀, 옥시코돈, 펜타닐, 모르핀 및 메페리딘이 포함된다.
앞서 기술된 치료학적 생물활성 화합물의 목록은 단지 예시적인 것으로서 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 한정하려는 것은 아니다. 국부 마취제, 비타민, 백신, 상처 치유 자극제, 면역억제제, 항구토제, 항말라리아제, 항진균제, 정신병치료제, 해열제, 응집제, 이뇨제, 칼슘 채널 차단제, 기관지확장제 등을 비롯한 많은 다른 부류의 약리학적 화합물이 본 발명의 조성물 및 방법에 유용할 것이다.
생물활성 화합물은 당분야에 공지된 방법에 따라서, 예를 들면 아미노 또는 카복실 그룹과 같은 반응기를 통해 화학적으로 커플링함으로써 폴리펩타이드 쇄에 연결될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면 맷슨(Mattson) 등의 문헌[Mol. Biol. Rep. 17 (1993) 167-183]에 기재되어 있다.
생물활성 화합물이 폴리펩타이드인 경우, 상기 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 쇄중 하나의 서열 및 생물활성 화합물인 하나 이상의 폴리펩타이드의 서열 둘다를 함유하는 핵산을 작성하고, 이들을 재조합 수단에 의해 원핵 또는 진핵 숙주 세포내에서 발현시키며, 재조합 폴리펩타이드를 회수하고 이들을 본 발명에 따라 함께 연결시킬 수도 있다.
생물활성 화합물이 두가지 상이한 항체 또는 항체 단편(Fab, Fc, Fv 단편)이거나, 하나의 생물활성 화합물이 항체이거나 항체 단편이고 다른 화합물이 카이네이즈, 포스파테이즈, RNase, 독소와 같은 효소 활성을 갖거나 전자 인자와 같은 특이적 결합 활성을 갖는 폴리펩타이드인 키메라성 폴리펩타이드를 작성하는 것이 특히 바람직하다.
제 1 생물활성 화합물로서 세포 표면에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하는 것이 바람직한 반면, 다른 생물활성 화합물은 이 부위에서 그의 치료 효과를 진행시킬 약학 활성 화합물이다. 이와 관련하여, 예를 들면 제 1 생물활성 화합물은 세포 표면 분자에 대한 리간드(예: CD40 또는 CD40L(CD154))이고, 제 2 생물활성 화합물은 안티센스 핵산 또는 세포증식억제 화합물과 같은 약학 활성 화합물이다.
치료 용도의 다른 예는, 제 1 생물활성 화합물 및 제 2 생물활성 화합물이 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소, 전사 인자 활성화 p53 생성 또는 기타 아폽토시스(apoptosis) 유도 인자를 포함할 경우 종양 특이적 항체일 수 있다.
생물활성 화합물들의 또다른 조합은 CD4의 gp120-HIV 결합 도메인 및 바이러스 분열을 차단하거나 감염된 세포를 사멸시킬 수 있는 항바이러스성 또는 세포독성 약물의 결합일 수 있다.
본 발명에 의해 하나의 화합물(반드시 생물활성일 필요는 없다)로서 다가 시스템을 사용하여 상이한 생물활성 화합물들의 디설파이드 브릿지 및 다가이온성 상호작용을 통한 공유결합을 가능하게 함으로써 이작용성 올리고머 뿐만 아니라 다작용성 올리고머를 생성할 수 있다. 예를 들면, 표면상에 몇몇 다가이온성 펩타이드 서열을 나타내는 바이러스 외피는 이러한 다가 매트릭스를 제공한다.
본 발명에 따라서, 생물활성 폴리펩타이드에 각각 연결된 상기 두 폴리펩타이드 쇄를 코딩하는 핵산은 원핵 또는 진핵 숙주 세포내에서 동시에 또는 별도로 발현되고, 폴리펩타이드는 숙주 세포 또는 상청액으로부터 회수되며, 산화제로 처리되어 상기 디설파이드 브릿지를 형성하고, 상기 키메라성 폴리펩타이드는 단리된다. 이러한 "재생 방법"은 예를 들면 미국 특허 제 4,933,434호의 453, 363 면 및 미국 특허 제 5,593,865호에 기재되어 있다.
본 발명에 따라서, 제 1 단계에서는, 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 쇄는 중성 또는 약염기성 pH(바람직하게는 pH 7 내지 8.5) 및 낮은 이온 강도(바람직하게는 0 내지 200밀리몰/1 NaCl)에서 이온성 상호작용을 통해 커플링된다. 제 2 단계에서, 폴리펩타이드 쇄는 디설파이드 브릿지를 통해 직접 공유결합되어 혼합된 디설파이드가 형성되고 두 개의 폴리펩타이드 쇄는 산화 또는 약한 환원 조건하에 디설파이드 가교결합을 통해 함께 연결된다. 본 발명의 한 바람직한 양태에서, GSH는 GSSG와 함께 사용되는데, 이때 GSH:GSSG의 비는 중성 또는 약염기성 pH값에서 5:1 내지 1:5이다.
하기 실시예, 참조문헌, 서열목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기위해 제공된 것으로 이의 진정한 범주는 첨부된 청구의 범위에 제시되어 있다. 제시된 절차는 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 변형될 수 있음을 알아야 한다.
실시예 1
다가이온성 펩타이드의 특이적 결합 및 공유결합
a) 결합 및 연결
다가이온성 상호작용 및 디설파이드 결합을 통한 펩타이드의 특이적 결합 및 공유결합을 다가이온성 펩타이드(서열번호:1) AlaCysGluGluGluGluGluGluGluGlu(ACE8) 및 (서열번호:2) AlaCysLysLysLysLysLysLysLysLys(ACK8)을 사용하여 분석하였다. 모든 펩타이드를 Fmoc 방법에 따라 ABI 어플라이드 바이오시스템 펩타이드 합성장치 431A(ABI Applied Biosystem peptide synthesizer 431A) 상에서 합성하였다. 1mM 펩타이드를 20mM 소듐 보레이트(pH 8.5), 2mM EDTA(엘만(Ellman, G.L.)의 문헌[Arch. Biochem. Biophys. 82 (1959) 70-77]에 따라 점검된 농도)에 용해시켰다.
디설파이드 결합된 이종이량체의 형성을 양이온 교환 크로마토그래피로 분석하였다. 샘플을 포로스(Poros) 20 HS 칼럼[칼럼 부피 1.7ml, 50mM 소듐 포스페이트(pH 7.0)에서 평형화됨]상에 적재하였다. 4ml/분의 유동 속도에서 0 내지 2M 사이의 NaCl 선형 구배로 용출을 수행하였다. 펩타이드 ACK8은 1070mM NaCl에서 용출되었고, ACK8 및 글루타티온의 혼합된 디설파이드(ACK8-SG)는 800mM NaCl에서 용출되었고, 디설파이드 결합된 이종이량체 ACK8-ACE8은 350mM NaCl에서 용출되었다. ACE8은 칼럼에 결합되지 않았다. 펩타이드의 양은 205nm에서의 흡광 피크 영역을 적분하여 정량화하였다[파마시아 유니콘 소프트웨어(Pharmacia Unikorn software)].
펩타이드 ACK8 및 ACE8의 결합 특이성을 상이한 파라미터에 따라 측정하였다:
b) 이온 강도의 영향
c) 펩타이드 사이의 디설파이드 결합을 형성하기 위한 산화환원 전위의 중요성
d) 하전되지 않은, 시스테인 함유 펩타이드 및 단백질을 사용하는 결합의 경쟁
b) ACE8 및 ACK8 사이의 디설파이드 결합 형성에 미치는 이온 강도(NaCl 농도)의 영향
500mM 소듐 보레이트(pH 8.5) 완충액중의 10mM GSSG를 사용하여 200μM ACK8을 혼합된 디설파이드 형태 ACK8-SG로 전환시켰다. 이 혼합된 디설파이드를 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 20μM ACE8 및 혼합된 디설파이드 ACK8-SG의 특이적 결합 및 산화환원 반응을 0 내지 1M 농도의 NaCl의 존재하에 20mM 소듐 보레이트(pH 8.5), 2mM EDTA 내에서 수행하였다. 30분간의 항온처리 이후에, 20mM 요오드아세트아미드를 첨가하여 추가로 산화환원 반응을 차단하였다. 이종이량체의 형성을 앞서 기재된 바와 같이 양이온 교환 크로마토그래피로 분석하였다.
디설파이드 결합된 이종이량체 ACK8-ACE8이 200mM 미만의 NaCl 농도에서 다량으로 형성되었다. 보다 높은 염 농도에서, 펩타이드 사이의 다가이온성 상호작용은 억제되어, 보다 낮은 수율로 이종이량체가 형성되었다.
c) ACE8 및 ACK8 사이의 디설파이드 결합의 산화환원 전위에 대한 의존성
50μM ACK8 및 75μM ACE8을 2.5mM 산화환원 물질(GSH 및 GSSG)의 존재하에 25℃에서 100mM 소듐 포스페이트(pH 8.5), 2mM EDTA 내에서 항온처리하였다. GSH 및 GSSG의 비를 변경시킴으로써 완충액의 산화환원 전위를 변화시켰다. 5시간 항온처리후, 100mM 요오도아세트아미드를 첨가하여 반응을 종결시키고 앞서 기재된 바와 같이 분석하였다.
펩타이드 ACE8 및 ACK8의 특이적 결합 및 공유결합이 심지어 환원 조건하에서도 초래되었다. 이종이량체 ACE8-ACK8는 GSH2/GSSG=1:1(mM)인 산화환원 조건에서 다량 형성되었다.
d) ACK8 및 ACE8 사이의 디설파이드 결합 형성의 경쟁
ACE8 및 ACK8 사이의 디설파이드 결합 형성의 특이성을 경쟁 접근법을 사용하여 분석하였다. 25μM ACK8 및 37.5μM ACE8을 250μM의 라미닌 노나-펩타이드(서열: CysAspProGlyTyrIleGlySerArg, 서열번호:3)의 존재하에 100mM 소듐 보레이트(pH 8.5), 2mM EDTA, 0.5mM GSH, 2mM GSSG 내에서 항온처리하였다. 또다른 실험에서, 완충액의 산화환원 전위를 1.65mM GSH 및 0.85mM GSSG에 의해 생성하였다. 대조군으로서, 라미닌 펩타이드의 부재하에 동일한 실험을 수행하였다. 2시간 항온처리 이후에, 반응을 산성처리하여(pH 2) 차단시키고, 생성물을 RP-HPLC로 분석하였다. 대조군에서 이종이량체 ACE8-ACK8의 양을 100%로 설정하고, 경쟁 실험에서 이종이량체 형성의 수율을 분석하였다.
제 2 경쟁체로서 α-글루코시데이즈(68.1kDa)를 사용하였다. 이 단백질은 저분자량의 티올 시약에 접근가능한 5개의 시스테인을 함유한다. 25μM ACK8 및 37.5μM ACE8을 60μM의 α-글루코시데이즈의 존재하에 소듐 보레이트(pH 8.5), 2mM EDTA 내에서 항온처리하였다. 두가지 상이한 산화환원 조건은 앞서 기재한 것과 동일하였다. RP-HPLC로 분석하였다.
이종이량체성의 공유결합된 ACE8-ACK8의 형성은 각각의 과량의 라미닌 펩타이드 및 α-글루코시데이즈의 첨가에 의해 영향받지 않았다. ACE8 및 ACK8 사이의 다가이온성 상호작용에 기초하여, 이들 펩타이드의 ACE8-ACK8로의 이량체화는 매우 특이적이다.
실시예 2
다가이온성 융합 펩타이드를 사용하여 사카로마이세스 세레비지아(
Saccharomyces cerevisiae
)로부터의 Fab-단편 및 α-글루코시데이즈로 이루어진 키메라성 올리고머의 형성
다가이온성 융합 펩타이드를 사용하여 MAb33의 Fab-단편의 항원 결합 활성을 α-글루코시데이즈의 효소 활성과 조합하여 이작용성 항체 유도체(키메라성 폴리펩타이드)를 형성하였다.
MAb 33의 Fab 단편을 유전적으로 변형시켜 C-말단에 추가의 시스테인 잔기를 갖는 음전하로 하전된 융합 펩타이드[AspAspAspAspAspAspAspAspAspAspSerCysPro(D10SCP로 약칭됨, 서열번호:4)]를 함유하도록 하였다. 제 2 폴리펩타이드 쇄는 양전하로 하전된 C-말단 융합 펩타이드[ArgArgArgArgArgArgArgArgArgArgCysGlyPro(R10CGP로 약칭됨, 서열번호:5)]를 갖는 사카로마이세스 세레비지아로부터의 α-글루코시데이즈 PI의 유도체이다.
키메라성 단백질의 형성은 하기 단계를 포함한다:
I. C-말단 다가이온성 융합 펩타이드를 갖는 Fab-단편의 제조
a) 발현 벡터의 작성
b) 이. 콜라이(E. coli)에서의 발현, 봉입체(inclusion body)의 단리, 가용화 및 재생
c) 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제
II. C-말단 다가이온성 융합 펩타이드를 갖는 α-글루코시데이즈의 제조
a) 발현 벡터의 작성
b) 가용성 형태로 이. 콜라이내에서의 발현
c) 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제
III. 다가이온성 융합 펩타이드에 의해 매개되는 디설파이드 연결된 키메라성 단백질의 형성
I. C-말단 다가이온성 융합 펩타이드를 갖는 Fab-단편의 제조
a) 발현 벡터의 작성
mAb(단일클론 항체) 33의 Fab 단편은 키메라성 단백질의 한 부분으로서 사용되었다. mAb 33은 이량체성 근육-특이적 인간 크레아틴 카이네이즈(CK-MM E.C.2.7.3.2.)에 대해 지향된 하위군 kIgG1의 뮤린 항체이다(부켈(Buckel) 등의 문헌[Gene 51 (1987) 13] 참조). mAb 33의 Fab 단편은 경쇄 κ(25kD) 및 중쇄 fd(25kD) 사이의 디설파이드 결합을 함유한다.
a1) 경쇄(카파)를 코딩하는 플라스미드의 작성
mAb 33의 경쇄를 플라스미드 pBR223-3의 유도체인 플라스미드 pBT111 상에 코딩하였다. 서열 및 클로닝 방법이 EP 0 364 926 B1호에 기재되어 있다. 발현을 위해, 플라스미드를 플라스미드 pUBS520이 함유된 이. 콜라이 숙주 세포내로 형질전환시켰다(브링크만 등의 문헌[Gene 85 (1989) 109-114] 참조).
a2) C-말단 다가이온성 펩타이드 서열을 갖는 중쇄의 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드의 작성
벡터의 작성은 mAb 33의 중쇄를 코딩하는 플라스미드 p12016으로 출발하였다(부켈 등의 문헌[Gene 51 (1987) 13] 참조). 중쇄의 Ch2 및 Ch3 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제거하고, C-말단에 시스테인을 갖는 다가이온성 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 프라이머 돌연변이생성에 의해 ch1 도메인에서 첨가하였다. 이. 콜라이내에서의 단백질 발현을 용이하게 하기 위해 뉴클레오티드 서열은 β-갈락토시데이즈(ITNSR)의 5개의 N-말단 아미노산 잔기를 코딩하는 보조 코돈을 그의 5'-말단에 함유한다. fd-단편을 코딩하는 cDNA를 PCR에 의해 프라이머 1 및 2로 증식시켰다. 5'-말단에 NdeI 제한 부위를 삽입하였다. 3'-말단에 Hind III 제한 부위 및 추가의 시스테인을 갖는 다가이온성 펩타이드의 뉴클레오티드 서열을 삽입하였다.
PCR을 하기 프라이머로 수행하였다:
전진 프라이머: N-말단 NdeI Fd(서열번호:6)
5'-GCG TTA GCC ATA TGA CCA TGA TTA CGA ATT CCC GG-3'
fdD10SCP의 후진 프라이머-변종(서열번호:7):
5'-CAT AGT CCC AAG CTT TTA CGG GCA AGA ATC ATC GTC ATC
ATC ATC GTC GTC ATC ATC ACC ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3'
개질된 cDNA 단편을 T7-발현 시스템에 속하는 벡터 pET-11a[노바겐(Novagen) 제품]내로 클로닝하였다(스튜디어(Studier, F.W.) 및 모팻(Moffatt, B.A.)의 문헌 [J. Mol. Biol. 189 (1986) 113] 참조). 발현을 위해, 벡터를 플라스미드 pUBS520이 함유된 숙주 세포내로 형질전환시켰다. 플라스미드 pUBS520(브링크만 등의 문헌[Gene 85 (1989) 109-114] 참조)는 코돈 AGA의 번역에 필수적인 tRNA를 코딩하고, AGG는 이. 콜라이내에서 거의 발생하지 않는다.
b) 이. 콜라이내에서의 발현, 봉입체의 단리, 가용화 및 재생
유일한 탄소원으로서 글루코스를 갖는 미네랄 염 배지내에서 37℃하에 5리터 스케일로 발효기내에서 배양을 수행하였다. 0.4mM IPTG로 유도한 후 4시간째 원심분리(5000rpm, 20분; 4℃)하여 세포를 수거하였다. 바이오매스(biomass)를 -70℃에서 저장하였다. 과발현된 재조합 단백질이 박테리아 사이토졸에서의 봉입체에 축적되었다. 봉입체를 루돌프(Rudolph) 등의 문헌[Folding Proteins, In: T.E. Creighton (편집): Protein function: A practical Approach, 57 (1996)]에 따라 단리하고, -20℃에서 저정하였다. 단백질 응집체를 4℃하에 하룻밤 6M 구아니딘 하이드로클로라이드(100mM 트리스-HCL(pH 8.5); 1mM EDTA; 100mM DTT)에 가용화시켰다. 0.5M HCl을 사용하여 pH를 4.0으로 감소시키고, 가용화되지 않은 물질을 원심분리(20,000rpm; 30분; 4℃)하여 분리하였다. 디티오트레이톨을 제거하기 위해 용액을 4M 구아니딘 하이드로클로라이드(pH 4.0)에 대해 대규모로 투석하였다. 표준물로서 인증된 변성되고 환원된 Fab 단편을 사용하여 단백질 농도를 분광학적으로 측정하였다.
변성된 단백질을 재생 완충액(1M 트리스/HCl(pH 8.0); 2mM EDTA; 2.4mM GSSG/0.6mM GSH)내에서 10㎍/ml의 최종 단백질 농도로 100배 희석시켰다. 재생을 15℃에서 150 시간에 걸쳐 10리터의 스케일로 수행하였다. 재생된 Fab 단편의 작용성을 부흐너(Buchner, J.) 및 루돌프(Rudolph, R.)의 문헌[Bio/Technology 9 (1991) 157]에 따라 ELISA로 분석하였다. 보다 고분자의 응집체를 제거하기 위해 재생된 단백질 용액을 원심분리(13,000rpm; 30분; 4℃)하고 상청액을 교차 유동 여과에 의해 농축시켰다[접선 유동 한외 여과; 프로바리오-3-시스템(ProVario-3-System); 필터 카세트(filter cassette): Minisette OMEGA FSQ; 8kD 차단]. 폴리아스파테이트 융합 펩타이드를 갖는 Fab 단편(FabD10SCP로 약칭됨)의 보유물을 20mM 트리스/HCl(pH 8.0)에 대해 투석하였다.
c) 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제
Fab 단편 FabD10SCP를 리소스 Q(Resource Q) 칼럼[파마시아(Pharmacia); 칼럼 부피; 6ml]을 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20mM 트리스-HCl(pH 8.0)중 0 내지 1M의 선형 염화나트륨 구배로 20 칼럼 부피상에서 6ml/분의 유속으로 용출시켰다. FabD10SCP는 300mM의 NaCl 농도에서 용출되었다. 이량체는 400mM의 염화나트륨 농도에서 용출된 보다 고분자, 즉 디설파이드 가교된 fdD10SCP 쇄로부터 효과적으로 분리되었다.
II. C-말단 다가이온성 펩타이드 서열을 갖는 α-글루코시데이즈의 제조
사카로마이세스 세레비지아로부터의 야생형 α-글루코시데이즈는 68kDa의 분자량을 갖는 단량체성 단백질이다. 이는 디설파이드 결합에 연루되지 않는 5개의 시스테인을 함유한다. 본 연구에서, 융합 단백질은 α-글루코시데이즈 PI 및 추가의 시스테인, 글리신 및 프롤린을 갖는 C-말단 데카-아르기닌 융합 펩타이드로 이루어져 유전적으로 작성되었다.
a) 발현 벡터의 작성
코페츠키(Kopetzki) 등의 문헌[Mol. Gen. Genet. 216 (1989) 149]에 기술된 벡터 pKK177-3/GlucPI는 사카로마이세스 세레비지아의 α-글루코시데이즈를 코딩한다. 발현 벡터는 tac-프로모터 및 β-락타메이즈 유전자를 함유하는 pKK223-3의 유도체이다(브로시우스(Brosius, J.) 및 홀리(Holy, A.)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6929] 참조). 벡터가 α-글루코시데이즈 유전자의 1600 위치에서 단일 EcoRI 제한 부위를 함유하도록 이를 변형시켰다. 표준 재조합 DNA 기법을 사용하는 프라이머 돌연변이생성에 의해 10개의 아르기닌 잔기, 시스테인, 글리신 및 프롤린 잔기를 코딩하는 융합 펩타이드를 C-말단에 삽입하였다. 하기 프라이머 서열을 사용하여 PCR을 수행하였다:
전진 프라이머 EcoRI1600: (서열번호:8)
5'-CAT AAG AGT ACG GAG ACA AGA CGC TGT TTG C-3'
후진 프라이머 R10CGP: (서열번호:9)
5'-AAA CAG AAG CTT ATT ATG GTC CAC ATC GAC GTC GAC GAC GCC GGC GAC GTC GGC GTT TGA CCA GGT AGA TTC TAC C-3'
EcoRI 및 Hind III에 의해 벡터 및 PCR 생성물을 분해한 후, 이들을 라이게이션시켰다.
b) 가용성 형태로 이. 콜라이내에서의 발현
발현을 위해, 벡터를 이. 콜라이 C600[어플레야드(Appleyard, R.K.)의 문헌[Genetics 39 (1954) 440], pFDX500(pACYC177중 LacIq)[창(Chang, A.C.Y.) 및 코헨(Cohen, S.N.)의 문헌[J. Bacteriol. 134 (1978) 1141]내로 형질전환시켰다. 배양 및 유도를 코페츠키 등의 문헌[Mol. Gen. Genet. 216 (1989) 149]에 따라 수행하였다. 세포를 2% 글루코스 보충된 루리아 브로쓰(Luria Broth; LB)-배지상에서 37℃하에 항온처리하였다. 유도를 위해, pH를 7.0에서 5.0으로 인산(3M)으로 감소시키고, 온도를 24℃로 감소시켰다. 0.5% 락토즈의 존재하에서의 제한된 유도에 따라, 주로 α-글루코시데이즈가 사이토졸에서 가용성 형태로 축적되었다. 유도후 6시간째 원심분리(5000rpm; 4℃; 10분)하여 세포를 수거하고, 10mM K2HPO4/KH2PO4(pH 6.8); 10mM EDTA 내에서 세척하였다. 바이오매스를 -20℃에서 저장하였다.
10g의 바이오매스를 50ml의 완충액(10mM K2HPO4/KH2PO4 pH 6.8; 10mM EDTA)에 재현탁시켰다. 세포를 고압 균질화[가울린 마이크론랩(Gaulin MicronLab) 40; 1200bar; 2회 통과]하여 붕해시켰다. 이후에, 조질의 추출물을 15mM MgCl2 및 1U/ml 벤조네이즈[다름스타트 소재의 메르크(Merck) 제품]의 존재하에 4℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 불용성 세포 잔해를 원심분리(20,000rpm; 4℃; 2시간)하여 제거하였다.
c) 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제
조질의 추출물의 상청액을 리소스 S 칼럼[파마시아(Pharmacia) 제품; 6ml]상에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. α-글루코시데이즈 활성을 갖는 단백질 분획은, 6ml/분의 유속하에 20 칼럼 부피에 대하여 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배(완충액; 10mM K2HPO4/KH2PO4(pH 6.8); 10mM EDTA)에서 350mM의 NaCl 농도에서 용출되었다. 효소 활성을 코페츠키 등의 문헌[Yeast 5 (1989) 11]에 따라 405nm 및 30℃에서 인공기질로서의 100mM K2HPO4/KH2PO4(pH 6.8)중의 2mM 파라-니트로페닐글루코피라노사이드(PNPG)[시그마(Sigma) 제품]에 의해 분광학적으로 측정하였다.
III. 다가이온성 융합 펩타이드에 의해 매개된 디설파이드 결합된 키메라성 단백질의 형성
결합을 산화환원 시스템의 존재하에 20mM 트리스-HCl(pH 7.5); 2mM EDTA 내에서 수행하였다. 산화되고 환원된 글루타티온을 2mM(1.8mM GSSG/0.2mM GSH)의 전체 농도로 10:1의 몰비로 사용하였다. 폴리펩타이드를 48시간 동안 20℃에서 동몰량(3μM/ℓ)으로 항온처리하였다. 분석을 위해 반응을 요오도아세트아미드(최종 농도: 트리스-HCl중 20mM(pH 8.0))로 종결시키고, 샘플을 산화 및 환원 조건하에서 12% SDS-PAGE 상에서 분리하였다. Fab를 함유한 래인을 니트로셀룰로즈상에서 면역블로팅에 의해 검출하였다.
다르게는, 반응 생성물을 300mM NaCl이 함유된 50mM Na2HPO4/NaH2PO4
완충액 내에서 겔여과 칼럼[TSKgel 2000 SWXL; 도소하스(TosoHaas) 제품] 상에서 0.75ml/분의 유동 속도로 비젼 웍스테이션(Vision Workstation)[바이오캐드 비젼 스테이션(BioCad Vision station); 퍼스펙티브 바이오시스템즈(Perspective Biosystems)]을 사용하여 분리하였다.
200㎕의 결합 반응물을 칼럼내로 주입하였다. 분획물을 항체 결합 작용성, 효소 활성 및 이작용성에 대해 시험하였다. 이작용성을 개질된 ELISA 시스템으로 검출하고: 실온에서 1시간 동안 스트렙타비딘 코팅된 튜브[로슈 디아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH) 제품] 내에서 바이오틴화된 크레아틴카이네이즈의 존재하에 배양한 후, 고염 완충액(2M NaCl; 10mM 트리스-HCl; pH 7.5)으로 2회, 저염 완충액(10mM 트리스-HCl; pH 7.5)으로 1회 세척하고, 30℃에서 100mM K2HPO4/KH2PO4(pH 6.8)중에서 2mM pNPG와 함께 3시간 배양한 후 405nm에서 검출하였다. 결합 반응을 500mM NaCl의 존재 및 부재하에 수행하였다. 단일 종의 결합을 또한 낮은 이온 강도 및 높은 이온 강도에서 조사하였다. 대조군으로서, FabD10SCP를 α-글루코시데이즈 야생형 단백질과 함께 항온처리하였다.
단독 항온처리된 단일 종은 낮은 이온 강도 및 높은 이온 강도 둘다에서 보다 고분자 생성물로 반응하지 않았다. 또한, FabD10SCP는 야생형 α-글루코시데이즈와 반응하지 않았다. NaCl의 부재하에서의 FabD10SCP의 α-글루코시데이즈 R10CGP와의 반응은 이작용성 활성을 갖는 생성물만을 유도하였다.
실시예 3
다가이온성 상호작용에 의해 매개된 바이러스형 입자(VLP's) 및 항체 단편 사이의 특이적 결합
조작된 다가이온성 펩타이드 서열에 기초한 폴리오마 코팅-단백질 VP1의 VLP's와 mAb B3의 디설파이드 가교된 Fv-단편(ds Fv)의 공유결합은 본 발명을 위한 또다른 예이다. 본 발명은 VLP's의 제조, ds Fv-단편의 제조 및 하기 결합을 포함한다.
I) VLP's의 제조
a) cDNA-수준에서의 VP1 내로의 다가이온성 펩타이드의 삽입 및 이. 콜라이내에서의 발현
b) 가용성 (돌연변이) 단백질 VP1-Glu의 정제
c) VP1-Glu의 VLP's로의 시험관내 조립
II) ds Fv의 제조
a) 이. 콜라이내에서의 다가이온성 펩타이드 서열을 갖는 ds Fv의 발현
b) 봉입체(ib's)의 단리 및 가용화
c) ds Fv mAb B3의 재생 및 정제
III) 다가이온성 상호작용 및 분자간 디설파이드 브릿지의 형성에 의해 매개된 VLP's와 ds Fv's의 결합
I) VLP's의 제조
a) 다가이온성 펩타이드의 VP1 내로의 삽입: 플라스미드 작성 및 이. 콜라이내에서의 발현
폴리오마(polyoma) 외피 단백질 VP1은 시험관내에서 이코아사에드릭(icoasaedric) VLP's내로 조립될 수 있다(살룬케(Salunke, D.M.) 등의 문헌[Cell 46 (1986) 895-904]; 살룬케 등의 문헌[Biophysical J. 56 (1989) 887-904] 참조). 플라스미드 pALVP1TAC(리아비트(Leavitt, A.D.) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 260 (1985) 12803-12809] 참조)는 야생형 단백질을 코딩하고, 이. 콜라이내에서의 가용성 오량체성 단백질의 재조합체 생성을 가능하게 한다. 이러한 플라스미드에 기초하여, 다가이온성 서열을 VP1의 표면상에 용매-노출된 HI-루프내에 삽입하였다(스테흘(Stehle, T.) 등의 문헌[Structure 4 (1996) 165-182] 참조). 이 서열은 8개의 글루타메이트 및 1개의 시스테인으로 이루어진다. 돌연변이체 VP1의 클로닝을 위하여, 서열 GluGluGluGluGluGluGluGluCys(E8C, 서열번호:10)를 퀵체인지(QuickChange; 등록상표) 부위 지향된 돌연변이생성 키트[스트라타젠(Stratagene) 제품]에 의해 cDNA-수준으로 아미노산 Asn294 및 Tyr295 사이에 삽입하였다.
발현을 위해, VP1-Glu를 코딩하는 생성된 플라스미드를 EcoB내로 형질전환시켰다. 발현 균주를 페드-배치(fed-batch) 기법을 사용하여 미네랄 염 배지에서 30℃에서 바이오스타트(Biostat)-발효기[브라운(Braun) 제품] 내에서 5리터 스케일로 배양하였다. VP1-Glu의 재조합체 발현을 OD600=20의 세포 밀도로 0.4mM IPTG에 의해 유도하였다. 유도후 6시간째 세포를 원심분리(8000g, 15분)하여 수거하고 -70℃에서 저장하였다.
b) 돌연변이 가용성 단백질의 정제
돌연변이 VP1-Glu의 제조를 위해, 50g의 세포를 500ml의 완충액 A[50mM 트리스-HCl; pH 7.4; 5% 글리세롤; 2mM EDTA; 200mM NaCl; 4mM DTT]에 재현탁시켰다. 세포 용해(cell lysis)를 1유닛/ml의 벤조네이즈, 20㎍/ml의 RNase 및 4 타블렛(tablet)의 완전 프로테이즈 억제제 콕테일(coctail)(독일 소재의 로슈 디아그노스틱스 게엠베하 제품)의 존재하에 고압 분산[가울린(Gaulin), 1200 bar]에 의해 수행하였다. 용해물(lysate)을 30분 동안 47,000g에서 원심분리하였다.
제 1 정제 및 농축 단계는 17.5% 및 27.5% 포화염 사이에서의 분별화된 암모늄 설페이트 침전으로 구성된다. 재현탁된 단백질을 음이온 교환 칼럼(포로스 20 HQ) 상에 적재하였다. 완충액 A중의 200mM 내지 1M NaCl의 선형 구배 및 약 30 칼럼 부피에서, VP1-Glu가 거의 균질한 단백질로서 500mM NaCl에서 용출되었다. 이후, 용출물을 20℃에서 20분 동안 2.5유닛/ml의 벤조네이즈 및 20㎍/ml의 RNase와 함께 10mM 마그네슘 클로라이드의 존재하에 항온처리하였다. 후속적으로, 크기 배재 크로마토그래피[파마시아 수퍼덱스 200(Pharmacia Superdex 200), 제조용 등급, 완충액 A]를 수행하여 오량체성 VP1을 보다 큰 올리고머성의 응집된 물질로부터 분리하였다.
c) VP1-Glu(속이 빈 바이러스 유형 입자-VLP's)의 시험관내 조립
VLP's로의 조립을 위해, 정제된 오량체성 VP1-Glu를 완충액 B(20mM 트리스, pH 7.4; 0.75M 암모늄 설페이트; 5% 글리세롤; 1mM CaCl2)에 대해 2일 동안 15℃에서 투석하였다. 이러한 조건하에서, VLP's의 형성이 유도된다. 암모늄 설페이트를 제거하기 위해, VLP's의 용액을 완충액 C(20mM 트리스, pH 7.4; 200mM NaCl; 5% 글리세린; 1mM CaCl2)에 대해 15℃에서 1일 동안 투석하고, 이후 4℃ 또는 -20℃에서 저장하였다.
II) ds Fv의 제조
a) 다가이온성 펩타이드 서열을 갖는 ds Fv의 이. 콜라이내에서의 발현
슈도모나스 외독소에 커플링된 VL 도메인의 cDNA를 코딩하는 벡터 pUli 39-1 및 VH 도메인을 코딩하는 벡터 pYR 38-2에 기초하여(라이터(Reiter, Y.) 등의 문헌 [Protein Engng. 12 (1995) 1323-1331]), 다가이온성 융합 펩타이드를 갖는 디설파이드 안정화된 Fv-단편을 작성하였다. 이러한 목적을 위해, 종결 코돈을 VL의 코딩 서열 및 독소 부분 사이에 도입하여, mAb B3의 VL 도메인을 위한 발현 벡터를 생성하였다.
플라스미드 pYR 38-2상에 코딩된 VH 도메인을 C-말단에서 다가이온성 서열 ArgArgArgArgArgArgArgArgCysPro(R8CP, 서열번호:11)로 연장시켰다. 퀵체인지 부위 지향된 돌연변이생성 키트(스트라타젠 제품)를 사용하여 2단계 절차에 의해 이러한 연장을 달성하였다. 우선, ArgArgArgArgCysPro를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 VH 유전자의 3' 말단에 삽입하였다(라이터 등의 문헌[Protein Engng. 12 (1995) 1323-1331] 참조).
R8CP 펩타이드를 함유하는 택(tag)을 완성하기 위해, 4개의 추가의 아르기닌을 제 2 돌연변이생성에 의해 삽입하였다.
b) ib's의 단리 및 ib's의 가용화
VH 및 VL-도메인을 봉입체로서의 이. 콜라이내에서 별도로 발현시켰다. ib's의 제조를 루돌프 등에 의한 방법(문헌[Folding Proteins, In: T.E. Creighton (편집): Protein function: A Practical Approach, 57 (1996)] 참조)에 따라 수행하였다. ib's를 -70℃에서 저장하였다. ib's의 가용화를 루돌프 등의 방법(문헌[Folding Proteins, In: T.E. Creighton (편집): Protein function: A Practical Approach, 57 (1996)] 참조)에 따라 유사하게 수행하였다.
c) ds Fv mAb B3의 재생 및 정제
접힘(folding) 완충액(100mM 트리스, pH 8.5; 1mM EDTA; 0.5M 아르기닌; 1mM GSH; 1mM GSSG) 내에서 가용화된 VH- 및 VL-ib's을 동시에 희석시켜 ds Fv mAb B3을 재생시켰다. 30㎍/ml의 총 단백질 농도에서 5:1의 VH:VL의 몰비로 재생을 수행하였다. 재생 혼합물을 10℃에서 7일 동안 항온처리하였다. 이후, 응집된 물질을 47,000g에서 30분 동안 원심분리하여 제거하였다. 적절히 접힌 단백질의 경우, VH 및 VL 사이에 분자간 디설파이드 브릿지가 형성되었다. 가용성 재생물을 접선 유동[바리오-3-시스템 필트론(Vario-3-System Filtron); Minisette FSQ; 8kDa 차단]에 의해 농축시키고, 완충액을 완충액 D(50mM 트리스, pH 7.5; 200mM NaCl)로 바꾸었다.
VH-도메인의 C-말단에 있는 다가양이온성 서열은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 접힌 ds Fv의 정제를 가능하게 하였다. 재생된 단백질을 포로스 20HS 칼럼상에 적재하고, 완충액 D에서의 0.2 내지 1M NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. ds Fv는 400mM NaCl에서 균질 단백질로서 용출한다. ds Fv의 균질성은 완충액 D로 수행하는 겔 여과(파마시아 수퍼덱스 75) 및 SDS PAGE에 의해 나타났다.
III) VLP's와 ds Fv's의 공유결합
ds Fv 및 VLP's의 지향된 결합을 완충액 E(20mM 트리스; pH 7.4; 5% 글리세롤; 1mM CaCl2; 37.5μM GSSG)에서 수행하였다. 사용된 VP1-Glu의 농도는 5μM이었고, ds Fv의 농도는 2.5μM이었다. 반응을 0.2M NaCl 및 0.75M 암모늄 설페이트의 존재하에 각각 수행하였다. 대조군으로서, 다가이온성 서열이 없는 야생형 VP1을 0.2M NaCl의 존재하에 ds Fv와 혼합하였다. 반응 혼합물을 8시간 동안 20℃에서 항온처리하고, 이어서 완충액 E 및 0.2M NaCl에서 평형화된 겔 여과 칼럼(도소하스 TSK-Gel PW 6000 XL)상에 적용시켰다. VLP's 함유 분획물을 소듐 데스옥시콜레이트로 침전시키고, 18% SDS PAGE(도 4) 및 웨스턴 블롯(Western Blot)으로 분석하였다.
0.2M NaCl의 존재하에 각 다가이온성 단백질 VP1-Glu 및 ds Fv B3 둘다의 혼합물에서만, ds Fv 및 돌연변이 VLP's 사이의 디설파이드 브릿지가 형성되었고, 이는 다가이온성 융합 펩타이드 사이의 다가이온성 상호작용에 의해 촉진되었다. 0.75M 암모늄 설페이트의 존재하에, 다가이온성 상호작용이 억제되고 디설파이드는 형성되지 않았다. 유사하게, 대조 혼합물에서, ds Fv 및 야생형 VLP's 사이의 분자간 디설파이드 브릿지는 전혀 검출되지 않는다. 이들 데이터는 다가이온성 융합 펩타이드가 단백질의 이종이량체화를 유도함을 나타낸다. 제시된 실시예에서, 반응 파트너중 하나인 VP1-Glu는 다량체 형태로 남아 있어 다른 작용성 단백질의 커플링을 허용할 뿐만 아니라 몇몇 상이한 다가이온성의 태깅된(tagged) 단백질의 도킹(docking)을 가능하게 한다.
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Claims (4)
1 내지 3개의 시스테인, 및 아르기닌, 라이신 및 오르니틴으로 구성된 군으로부터 선택된 2 내지 12개의 염기성 아미노산으로 이루어진 제 1 폴리펩타이드 링커 잔기; 및 1 내지 3개의 시스테인, 및 글루타메이트 및 아스파테이트로 구성된 군으로부터 선택된 4 내지 12개의 산성 아미노산으로 이루어진 제 2 폴리펩타이드 링커 잔기로 이루어지고,
상기 제 1 잔기 및 제 2 잔기가 다수의 하전된 아미노산을 통한 이온성 상호작용 및 시스테인 사이의 공유 디설파이드 브릿지에 의해서 결합되고,
상기 각각의 잔기가 그의 C- 또는 N-말단에서 생물활성 화합물에 연결됨을 특징으로 하는,
생물활성 화합물의 연결을 위한 펩타이드성 선형 링커.
제 1 항에 있어서,
제 1 폴리펩타이드 쇄 및 제 2 폴리펩타이드 쇄에 화학 구조가 서로 상이한 생물활성 화합물이 연결되는 펩타이드성 선형 링커.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
생물활성 화합물이 항체 또는 항체 단편인 펩타이드성 선형 링커.
a) aa) 제 1 생물활성 폴리펩타이드, 및 1 내지 3개의 시스테인 및 아르기닌, 라이신 및 오르니틴으로 구성된 군으로부터 선택된 2 내지 12개의 염기성 아미노산으로 이루어진 제 1 폴리펩타이드 링커 잔기로 이루어진, 키메라성 폴리펩타이드의 제 1 잔기; 및 ab) 제 2 생물활성 폴리펩타이드, 및 1 내지 3개의 시스테인 및 글루타메이트 및 아스파테이트로 구성된 군으로부터 선택된 4 내지 12개의 산성 아미노산으로 이루어진 제 2 폴리펩타이드 링커 잔기로 이루어진, 키메라성 폴리펩타이드의 제 2 잔기를 코딩하는 핵산을 동시에 또는 별도로 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포내에서 발현시키고,
b) 상기 키메라성 폴리펩타이드의 제 1 잔기 및 제 2 잔기를 숙주 세포 또는 세포 상청액으로부터 회수하여 함께 모아 상기 제 1 폴리펩타이드 링커 잔기와 제 2 폴리펩타이드 링커 잔기 사이에 다가이온성 상호작용이 형성되도록 하고,
c) 상기 b)의 생성물을 산화제로 처리하여 상기 폴리펩타이드 링커 잔기들 사이에 디설파이드 브릿지를 형성하고,
d) 상기 키메라성 폴리펩타이드를 단리함을 특징으로 하는,
상기 펩타이드성 링커로 연결된 두 개의 생물활성 폴리펩타이드로 이루어진 키메라성 폴리펩타이드의 제조 방법.
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