ES2280231T3 - Polipeptidos quimericos, metodo para la produccion y usos de los mismos. - Google Patents

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Abstract

Engarce lineal peptídico para la unión de compuestos biológicamente activos, caracterizado porque dicho engarce consta de: un primer resto engarce polipéptido, que consta de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos básicos, elegidos entre el grupo formado por la arginina, la lisina y la ornitina y un segundo resto engarce polipéptido, que consta de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos ácidos, elegidos entre el grupo formado por el glutamato y el aspartato, dichos restos primero y segundo están unidos por interacción iónica debida a sus numerosos aminoácidos cargados y por puentes disulfuro covalentes entre sus cisteínas, cada uno de dichos estos está unido por su extremo C o N a un compuesto biológicamente activo.

Description

Polipéptidos quiméricos, método para la producción y usos de los mismos.
La presente invención se refiere a engarces peptídicos lineales y a métodos para la producción de un polipéptido quimérico.
Los compuestos artificiales biológicamente activos, bifuncionales o multifuncionales, tienen un amplio abanico de utilidades potenciales en diagnosis y en terapia. Las proteínas bifuncionales se emplean con preferencia especial para el inmunodiagnóstico y la inmunoterapia. Por ejemplo, se saca partido de la unión específica de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo con su antígeno, con el fin de dirigir una proteína, que tiene funciones biológicas diferentes, contra este antígeno específico. Por ejemplo puede utilizarse un anticuerpo biespecífico, cuyos antígenos están localizados por un lado en células tumorales y, por otro lado, en macrófagos, para dirigir células asesinas (killer cells) contra un tumor (Bohlen, H. y col., Blood 83, 1803-1812, 1993). Estos anticuerpos biespecíficos pueden producirse por fusión de dos células de hibridoma, que producen los anticuerpos monoespecíficos respectivos, para formar células de cuadroma (Milstein, C. y Cuello, A.C., Nature 305, 537-540, 1983). Aparte de los dos anticuerpos originales, estas células producen también anticuerpos biespecíficos. Sin embargo, este método de producir proteínas biespecíficas está limitado exclusivamente a los anticuerpos. Además, solamente el 15% de los anticuerpos expresados poseen la biespecificidad deseada. Estos anticuerpos tienen que aislarse de la mezcla mediante métodos laboriosos de purificación.
Un método mucho más eficaz de producir anticuerpos biespecíficos y otras proteínas biespecíficas se basa en la reticulación química de dos proteínas que tengan las propiedades deseadas (Fanger, M.W. y col., Crit. Rev. Immunol. 12, 101-24, 1992). Esta reticulación se realiza mediante moléculas engarce bifuncionales, que reaccionan con los grupos amino de las proteínas o de los restos cisteína. En el último caso, por ejemplo, los restos cisteína de una proteína pueden activarse con el ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (DTNB) y la adición de la segunda proteína, que contiene los restos cisteína en forma reducida, provoca la formación de disulfuros y, de este modo, el enlace covalente de las dos proteínas. Aplicando este método puede mejorarse considerablemente el rendimiento de proteínas bifuncionales heterodiméricas, si se compara con la reticulación no específica que normalmente da lugar a una porción elevada de homodímeros. Sin embargo, el método de la reticulación química da lugar a un material no homogéneo. Esta heterogeneidad puede tener un impacto negativo en la estabilidad y en la funcionalidad del constructo biespecífico (Debinski, W. y Pastan, I., Bioconjug. Chem. 5, 40-43, 1994).
El método aplicado con mayor frecuencia para producir proteínas bifuncionales es la formación de proteínas de fusión a nivel genético. A tal fin se une el extremo 5' del cDNA de una proteína con el extremo 3' del gen de otro proteína por métodos de ingeniería genética, pero conservando el marco de lectura, y se expresa el constructo por métodos recombinantes en procariotas o en eucariotas. De esta manera se fusiona por ejemplo un fragmento de anticuerpo dirigido contra un tumor con una toxina bacteriana (Brinkmann, U. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8616-8620, 1991). Esta inmunotoxina es capaz de matar específicamente a células tumorales. Aparte de la toxina bacteriana, las fusiones de fragmentos de anticuerpos se realizan también con éxito con la RNasa y otras enzimas y su funcionalidad se examina en cultivos celulares (Newton, D.I. y col., J. Biol. Chem. 267, 19572-19578, 1992); Zewe, M. y col., Immunotechnol. 3, 127-136, 1997).
Los llamados diacuerpos (diabodies) constituyen otra forma de proteínas de fusión (Holliger, P. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993). Los diacuerpos consisten en dos fragmentos Fv que tienen especificidades diferentes. A diferencia de los fragmentos scFv, en los que dos dominios variables de un anticuerpo están unidos entre sí mediante un engarce (linker), en el caso de los diacuerpos el dominio VL de un anticuerpo está fusionado con el dominio VH de un segundo anticuerpo. La estructura del engarce empleado para este propósito es tal que el engarce impide la asociación intramolecular de los dos dominios y en su lugar se produce una asociación intermolecular de dos constructos de este tipo, obteniéndose un diacuerpo bifuncional.
En los últimos años se han realizado múltiples intentos de desarrollar sistemas que puedan aplicarse en general a la producción de proteínas bifuncionales. A tal fin se fusionan las proteínas a nivel genético con péptidos o proteínas como dominios de dimerización para conferir una asociación dirigida. Como unidades de dimerización se emplean los dominios de anticuerpo CL y CHl, calmodulina y el correspondiente péptido de unión o estreptavidina (Müller, K.M. y col., FEBS Lett. 422, 259-264, 1998; Neri, D. y col., BioTechnology 13, 373-377, 1995; Dübel, S. y col., J. Immunol. Methods 178, 201-209, 1995. Además, las secuencias cortas de péptido, por ejemplo las cremalleras de leucina y las hélices anfífilas, pueden utilizarse como unidades funcionales para la heterodimerización dirigida (Kostelny, S.A. y col., J. Immunol. 148, 1547-1553, 1992). Sin embargo, hasta el presente no se ha impuesto ninguno de los métodos de asociación directa como técnica que pueda aplicarse en general.
Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un engarce peptídico lineal que sea estable y fácil de producir.
Resumen de la invención
La invención se refiere a un engarce peptídico lineal para unir compuestos biológicamente activos, dicho engarce consta de un primer resto de engarce polipéptido que contiene de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos básicos elegidos entre el grupo formado por la arginina, la lisina y la ornitina, y un segundo resto de engarce polipéptido que contiene de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos ácidos elegidos entre el grupo formado por el glutamato y el aspartato, dichos restos primero y segundo están unidos por interacción iónica mediante sus numerosos aminoácidos cargados y por puentes disulfuro covalentes entre sus cisteínas, cada uno de dichos restos está unido por su extremo C y/o N con un compuesto biológicamente activo.
En una forma preferida de ejecución de la invención, dichos compuestos biológicamente activos difieren entre sí por su estructura química. Es también preferido que dicho compuesto sea un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o una enzima.
La invención se refiere además a un método para la producción de un polipéptido quimérico que consta de dos polipéptidos biológicamente activos, unidos mediante un engarce peptídico, para ello se expresan en una células hospedante procariota o eucariota de forma simultánea o separada los ácidos nucleicos que codifican a un primer resto de dicho polipéptido quimérico que consta de un primer polipéptido biológicamente activo y de un primer resto engarce polipéptido, que contiene de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos básicos elegidos entre el grupo formado por la arginina, la lisina y la ornitina, y a un segundo resto de dicho polipéptido quimérico que consta de un segundo polipéptido biológicamente activo y de un segundo resto engarce polipéptido, que contiene de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos ácidos elegidos entre el grupo formado por el glutamato y el aspartato; dichos restos primero y segundo de dicho polipéptido quimérico se recuperan de la célula hospedante o del líquido sobrenadante celular y se ponen en contacto para permitir la formación de una interacción poliiónica entre dichos restos engarces polipéptidos primero y segundo, tratados con un agente oxidante para formar dichos puentes disulfuro entre dichos restos engarces polipéptidos y se aísla dicho polipéptido quimérico.
Con el método de la invención para producir polipéptidos quiméricos es posible evitar esencialmente la formación de homodímeros, en el supuesto de que los heterodímeros sean los productos deseados.
La invención se basa en el hecho de que un resto engarce polipéptido, que contiene de 4 a 12 aminoácidos básicos, interacciona específicamente en solución acuosa de baja intensidad iónica con un resto engarce polipéptido que contenga de 4 a 12 aminoácidos ácidos. Si ambos polipéptidos contienen además cisteínas, en una reacción ulterior pueden formarse específicamente puentes disulfuro entre las cisteínas de ambos restos engarces polipéptidos en condiciones oxidantes o incluso ligeramente reductoras. La distancia que separa dos cisteínas dentro de un resto engarce polipéptido es con preferencia de más de un aminoácido, con mayor preferencia de 3 a 6 aminoácidos. Esto implica que la cantidad y la distancia de las cisteínas de ambos polipéptidos serán con preferencia idénticas y que, si las cisteínas de ambos polipéptidos ocupan posiciones recíprocamente enfrentadas, entonces los aminoácidos ácidos de una hebra y los aminoácidos básicos de la otra hebra ocuparán en cada caso posiciones también enfrentadas. Una distancia idéntica de cisteínas significa que en ambas hebras hay la misma cantidad de aminoácidos diferentes de la cisteína que se hallan intercalados entre dichas cisteínas.
Según la invención es posible unir entre sí dos o más compuestos biológicamente activos mediante dichos restos engarces polipéptidos primero y segundo en una forma estable y covalente y en una posición espacialmente definida.
En otra forma preferida de ejecución de los restos engarce de la invención, dichos restos engarces polipéptidos primero y segundo se diseñan de modo que la posición de las cisteínas y de los aminoácidos básicos y ácidos permitan una interacción iónica optimizada entre los aminoácidos ácidos y básicos y la unión mediante uno o más puentes disulfuro, en una forma dirigida preseleccionada. De este modo es posible colocar a los compuestos biológicamente activos en una posición espacial preseleccionada entre sí. Por ejemplo, cuando los restos engarces polipéptidos primero y segundo están en una posición, en la que se tocan sus extremos terminados en N y en la que se tocan sus extremos terminados en C, los compuestos biológicamente activos pueden colocarse en una posición espacial muy próxima entre sí, si ambos están unidos por su extremo C (o si ambos están unidos por su extremo N) de los restos engarces polipéptidos. Si uno de los compuestos biológicamente activos está unido por su extremo C y el otro está unido por su extremo N del resto engarce polipéptido, la distancia espacial entre ambos será mucho mayor. En tal caso, los restos engarces polipéptidos primero y segundo dimerizados actúan esencialmente como un engarce lineal entre dos compuestos biológicamente activos, con preferencia entre dos polipéptidos. Un procedimiento análogo puede adoptarse cuando cuatro compuestos biológicamente activos se colocan en una posición espacial determinada entre sí.
Descripción detallada de la invención
Se entiende por "polipéptido quimérico" según la invención un polipéptido que consta de un primer y de un segundo resto engarce polipéptido, dichos restos engarces difieren químicamente y se componen de manera que se unan entre sí como resultado de la interacción iónica entre los numerosos aminoácidos que llevan cargas diferentes y que además están unidos por enlaces covalentes entre sí gracias a los puentes disulfuro entre cisteínas. Para producir polipéptidos quiméricos, las interacciones poliiónicas entre los aminoácidos básicos y ácidos de los restos engarces polipéptidos sirven para colocar a los polipéptidos en una posición preseleccionada entre sí, dicha posición permite que los puentes disulfuro se formen fácilmente. La finalidad de los polipéptidos quiméricos consiste en unir entre sí a compuestos biológicamente activos de una manera estable y predefinida, evitando la formación de productos secundarios molestos (p. ej. homodímeros o productos quiméricos, en los que los compuestos biológicamente activos se hallan en una posición desfavorable entre sí). Por lo general, el primero y el segundo restos engarces polipéptidos no poseen de por sí actividad biológica significativa. Son agentes meramente auxiliares que facilitan la unión de los compuestos biológicamente activos, que en su forma dímera o multímera son capaces de desarrollar un efecto farmacéutico preseleccionado. Para la interacción iónica fuerte entre los restos engarces polipéptidos es preferible que los valores pK_{a} de los aminoácidos básicos y ácidos, que ocupan posiciones enfrentadas entre sí en los restos engarces, debería diferir tanto como sea posible. Por consiguiente, es preferido que el valor pK_{a} del aminoácido básico se sitúe en 10 o más, mientras que el valor pK_{a} del aminoácido ácido se sitúe en 4,5 o menos.
Los restos engarces polipéptidos constan de 1 a 3 cisteína y de 4 a 12 aminoácidos adicionales, que en el caso del primer resto engarce polipéptido se eligen con preferencia entre el grupo formado por la arginina, la lisina y la ornitina. También el segundo resto engarce polipéptido consta de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos ácidos, elegidos con preferencia entre el grupo formado por el glutamato y el aspartato. En una forma preferida de ejecución, el resto engarce polipéptido consta de 6 a 10 aminoácidos básicos o ácidos. Es también preferido que los restos engarces polipéptidos contengan cada uno un resto cisteína. Sin embargo pueden utilizarse también otros aminoácidos ácidos o básicos o derivados de los mismos según la invención, en el supuesto de que sus valores pK_{a} difieran de modo considerable (la diferencia preferida es de 5 o más unidades) y la interacción iónica permita la unión de los dos restos engarces polipéptidos.
En calidad de compuesto biológicamente activo puede utilizarse cualquier compuesto biológicamente activo que se desee.
El término "compuesto o material biológicamente activo" empleado aquí significa, pues, una molécula orgánica, incluyendo a un fármaco, una macromolécula biológica, por ejemplo un péptido, una proteína, un hidrato de carbono (incluidos los monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos), una nucleoproteína, una mucoproteína, una lipoproteína, un péptido o una proteína sintéticos, o una molécula pequeña unida a un proteína, glucoproteína, esteroide, ácido nucleico (cualquier forma de DNA, incluido el cDNA, o RNA o un fragmento del mismo), nucleótidos, nucleósidos, oligonucleótidos (incluidos los oligonucleótidos antisentido), los genes, los lípidos, las hormonas, las vitaminas, incluidas la vitamina C y la vitamina E, o una combinación de los mismos, que produce un efecto biológico cuando se administra "in vivo" a un animal, incluidos pero sin limitarse a ellos: las aves y los mamíferos, incluidos los humanos.
El término "fármaco" empleado aquí indica cualquier sustancia empleada por vía interna o externa como medicamento para el tratamiento, curación o prevención de una enfermedad o trastorno e incluye pero no se limita a: inmunosupresores, antioxidantes, anestésicos, agentes quimioterapéuticos, esteroides (incluidos los retinoides), hormonas, antibióticos, antivíricos, antifúngicos, antiproliferantes, antihistaminas, anticoagulantes, agentes contra el envejecimiento provocado por la luz, péptidos melanotrópicos, compuestos antiinflamatorios no esteroideos y esteroideos y absorbentes de radiación, incluidos los absorbentes UV.
El término "agente biológicamente activo" incluye también los agentes del tipo insecticidas, pesticidas, fungicidas, rodenticidas, nutrientes vegetales y promotores de crecimiento.
Las macromoléculas biológicas que tienen con preferencia un peso molecular comprendido entre dos o tres mil y muchos millones son importantes reguladores de las funciones fisiológicas. El tamaño y la estructura terciaria de una macromolécula biológicamente activa contienen información química significativa relativa a interacciones muy específicas con receptores, enzimas, ácidos nucleicos y otros mediadores biológicos que interaccionan con ella. Los episodios tan diversos como la trombosis, las respuestas inflamatorias e inmunológicas se controlan, por lo menos en parte, por la topología tridimensional de las moléculas. La superficie de la macromolécula se compone de grupos distribuidos geométricamente, que imparten el carácter iónico, hidrófobo, estérico, electrostático y de enlace de hidrógeno a la molécula y proporcionan un molde molecular para la unión con el receptor.
Los mucopolisacáridos ácidos, también llamados glucosaminoglucanos (GAG), constan de unidades disacárido repetitivas, cada una de las cuales contiene un derivado de una aminohexosa, por lo general la D-glucosamina o la D-galactosamina. Por lo menos uno de los dos azúcares de la unidad disacárido repetitiva de los mucopolisacáridos ácidos contiene un grupo ácido que tiene una carga negativa a pH 7, ya sea un grupo carboxilato, ya sea un grupo sulfato. Un mucopolisacárido ácido importante es la heparina, que se genera en ciertos tipos de células, que son especialmente abundantes en el forro de los vasos sanguíneos arteriales. La heparina es un inhibidor muy potente de la coagulación de la sangre y ayuda a prevenir la formación de coágulos sanguíneos en la sangre circulante (Jackson, R.L. y col., Physiol. Reviews 71, 481-522, 1991).
Se sabe que los GAG son mediadores de procesos celulares (angiogénesis, desarrollo de células nerviosas, proliferación de células de músculo liso), expresión genética y homeostasis. El GAG interacciona con el DNA (Davidson, J.N., en: "The biochemistry of the nucleic acids", Methuem, Londres, 1969).
Tanto el DNA como el GAG (por ejemplo la heparina) son polímeros lineales que tienen cargas polianiónicas, que son esenciales para la actividad biológica. La rigidez de la hélice del DNA asegura que los ácidos nucleicos de secuencias específicas se presentarán de manera que se obtenga una interacción biológica deseada.
Las proteínas son las macromoléculas más abundantes de las células, constituyendo más de la mitad de su peso seco. Se sabe que las proteínas y los péptidos contienen información química en sus estructuras terciarias. Un gran número de proteínas de origen natural se conjugan con otros grupos químicos. Son ejemplos de ello las lipoproteínas, las glucoproteínas, las fosforoproteínas, las hemoproteínas, las flavoproteínas y las metaloproteínas.
Las proteínas tienen funciones biológicas diversas. Los ejemplos no limitantes son: proteínas de transporte (p. ej. hemoglobina y la albúmina del suero), las proteínas nutrientes y de almacenaje (por ejemplo la gliadina, la ovalbúmina, la caseína y la ferritina), las proteínas contráctiles o móviles (p. ej. la actina, la miosina, la tubulina y la dineína); las proteínas estructurales (por ejemplo, la queratina, la fibroína, el colágeno, la elastina y los proteoglucanos); los proteínas de defensa (p. ej. los anticuerpos, las inmunoglobulinas, el fibrinógeno, la trombina, la toxina botulina, la toxina de la difteria, el veneno de la serpiente y el ricino); las enzimas y las proteínas reguladoras (p. ej. la insulina, las hormonas de crecimiento, la corticotropina y los represores).
Las hormonas se cla sifican en hormonas peptídicas, por ejemplo el factor de liberación de la tirotropina, la corticotropina, la vasopresina, la insulina y el glucagón; hormonas amínicas, por ejemplo la adrenalina y la tiroxina; u hormonas esteroideas, por ejemplo el cortisol, el beta-estradiol, la testosterona y la progesterona. Otros ejemplos de hormonas importantes incluyen, pero no se limitan a: hormonas que liberan la adrenocorticotropina, hormonas que liberan la somatotropina, la somatostatina, hormonas que liberan la prolactina, hormonas que inhiben la prolactina, hormonas que liberan el FSH y el LH, la vasopresina y la oxitocina.
Los compuestos terapéuticos biológicamente activos pueden elegirse también entre el grupo general formado por los agentes antineoplásicos, agentes antiinfecciosos, agentes antidepresivos, agentes antivíricos, agentes antinociceptivos, agentes ansiolíticos y hormonas.
Los ejemplos representativos de agentes antineoplásicos útiles para las composiciones y métodos de la presente invención incluyen al metotrexato, taxol, factor de necrosis tumoral, clorambucilo, interleucinas, bleomicina, etopósido, fluoruracilo y vinblastina.
Los ejemplos representativos de agentes antiinfecciosos útiles para las composiciones y métodos de la presente invención incluyen a la pentamidina, metronidazol, penicilina, cefalexina, tetraciclina y cloranfenicol.
Los ejemplos representativos de agentes antivíricos útiles para las composiciones y métodos de la presente invención incluyen a la didesoxicitidina, zidovudina, aciclovir, interferonas, didesoxiinosina y ganciclovir.
Los ejemplos representativos de ansiolíticos y sedantes útiles para las composiciones y métodos de la presente invención incluyen a las benzodiazepinas, por ejemplo el diazepam, los barbituratos, por ejemplo el fenobarbital y otros compuestos, por ejemplo la buspirona y el haloperidol.
Los ejemplos representativos de hormonas útiles para las composiciones y métodos de la presente invención incluyen al estradiol, prednisona, insulina, hormonas de crecimiento, eritropoyetina y prostaglandinas.
Los ejemplos representativos de agentes antidepresivos útiles para las composiciones y métodos de la presente invención incluyen a la fluoxetina, trazodona, imipramina y doxepina.
Los ejemplos representativos de antinociceptivos útiles para las composiciones y métodos de la presente invención incluyen a la hidromorfina, la oxicodona, el fentanilo, la morfina y la meperidina.
La anterior lista de compuestos terapéuticos biológicamente activos es meramente ilustrativa y no pretende limitar el alcance de la presente invención en modo alguno. En las composiciones y métodos de la presente invención podrían utilizarse muchas otras clases de compuestos farmacológicos, incluidos los anestésicos locales, las vitaminas, las vacunas, los estimuladores de curación de heridas, los inmunosupresivos, los anti-eméticos, los agentes anti-malaria, los agentes antifúngicos, los antisicóticos, los antipiréticos, los coagulantes, los diuréticos, los bloqueadores de canales del calcio, los agentes broncodilatadores, etc.
Los compuestos biológicamente activos pueden unirse a restos engarces polipéptidos según métodos ya conocidos de la técnica, por ejemplo mediante enlace químico a través de los grupos reactivos, por ejemplo los grupos amino o carboxilo. Tales métodos se han descrito por ejemplo en Mattson y col., Mol. Biol. Rep. 17, 167-183, 1993.
Si el compuesto biológicamente activo es un polipéptido, entonces es también posible construir un ácido nucleico que contenga de uno de dichos restos engarces polipéptidos primero o segundo y la secuencia de uno o más polipéptidos que sean compuestos biológicamente activos, expresarlos por medios recombinantes en células hospedantes procariotas o eucariotas, recuperar los polipéptidos recombinantes y unirlos entre sí según la invención.
Es especialmente preferido construir polipéptidos quiméricos, en los que los compuestos biológicamente activos son dos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos diferentes (fragmentos Fav, Fc, Fv) o en los que un compuesto biológicamente activo es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo y el otro es un polipéptido que tiene actividad enzimática, por ejemplo quinasas, fosfatasas, RNasas, toxinas o actividades específicas de fijación, por ejemplo los factores de transcripción.
Es también preferido utilizar como primer compuesto biológicamente activo una sustancia que se fija específicamente sobre las superficies de las células, mientras que el otro compuesto biológicamente activo es un compuesto farmacéuticamente activo, que desarrolla su efecto terapéutico en este sitio. En este contexto, por ejemplo, el primer compuesto biológicamente activo puede ser un ligando para una molécula de superficie celular, p. ej. el CD40 o el CD40L (CD154) y el segundo compuesto biológicamente activo puede ser un compuesto farmacéuticamente activo, por ejemplo un ácido nucleico antisentido o un compuesto citostático.
Otros ejemplos de uso terapéutico serían un anticuerpo específico de un tumor como primer compuesto biológicamente activo y un segundo compuesto biológicamente activo sería una exototoxina de pseudomonas, la toxina de la difteria, los factores de transcripción que activan la producción del p53 u otros factores que inducen la apóptosis.
Otra combinación de compuestos biológicamente activos podría ser la asociación del dominio de fijación gp120-HIV del CD4 y cualquier fármaco antivírico o citotóxico capaz de bloquear la maduración vírica o de matar la célula infectada.
Con la invención pueden crearse no sólo oligómeros bifuncionales sino también multifuncionales, utilizando como uno de los compuestos (no necesariamente biológicamente activo) un sistema multivalente que permita la asociación covalente a través de las interacciones poliiónicas y un puente disulfuro entre los diferentes compuestos biológicamente activos. Por ejemplo, una cápsula vírica que contenga diversas secuencias peptídicas poliiónicas podría proporcionar una matriz multivalente de este tipo.
Según la invención se expresan los ácidos nucleicos que codifican a los dos restos engarces polipéptidos mencionados, que están unidos entre sí para formar un polipéptido biológicamente activo, en una célula hospedante procariota o eucariota de modo simultáneo o separado, se recuperan los polipéptidos de la célula hospedante o del líquido sobrenadante, se tratan con un agente oxidante para formar dichos puentes disulfuro y se aísla dicho polipéptido quimérico. Estos métodos de "naturalización" se describen por ejemplo en la patente US-4,933,434, páginas 453, 363 y en la patente US-5,593,865.
Según la invención, en el primer paso, se unen los restos engarces polipéptidos primero y segundo mediante la interacción iónica en un pH neutro o ligeramente básico (con preferencia un pH de 7 a 8,5) y de intensidad iónica baja (con preferencia de 0 a 200 mmoles/l de NaCl). En el segundo paso se unen directamente los restos engarces polipéptidos con enlace covalente mediante el puente disulfuro, para ello se forma un puente disulfuro y los dos restos engarces polipéptidos quedan unidos mediante dicho puente disulfuro en condiciones oxidantes o ligeramente reductoras. En una forma preferida de ejecución de la invención se emplea el GSH en combinación con el GSSG, situándose la proporción entre GSH y GSSG entre 5:1 y 1:5, a un valor de pH entre neutro y débilmente básico.
Descripción de las figuras
Figura 1. Formación del heterodímero ACE8-ACK8 unido por puente disulfuro en función de la concentración de NaCl del tampón. Se representan las cantidades relativas de ACK8 (\Delta), el disulfuro mixto entre ACK8 y GSSG (ACK8-SG, \Box) y el heterodímero ACE8-ACK8 unido con puente disulfuro (\bullet).
Figura 2. Formación del heterodímero ACE8-ACK8 unido con puente disulfuro en función del potencial redox del tampón. Se representan la cantidad del heterodímero ACE8-ACK8 (\bullet) y del péptido ACK8 no convertido (\Box).
Figura 3. Se analiza la formación del heterodímero ACE8-ACK8 unido mediante puente disulfuro en función de un exceso molar décuple de un péptido de laminina que contiene cisteína y de \alpha-glucosidasa, respectivamente.
Figura 4. SDS-PAGE (18%) teñido con Coomassie en condiciones reductoras para poner de manifiesto la asociación directa de las VLP con el dsFv; pistas: (1) dsFv disociado en VH y VL; (2) reacción de asociación entre el tipo salvaje de las VLP y el dsFv en presencia de 200 mM de NaCl; (3) reacción de asociación entre las VLP construido con VPl-Glu y dsFv en presencia de 750 mM de sulfato amónico; (4) reacción de asociación entre las VLP construidas con VPl-Glu y dsFv en presencia de 200 mM de NaCl; (5) marcador de peso molecular.
Figura 5. Perfil de elución de la reacción de asociación de FabD10SCP y \alpha-glucosidasa-R10CGP de baja intensidad iónica (TosoHaas TSK 2000 SWXL; 50 mM Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} de pH 7,0; 300 mM NaCl; caudal: 0,75 ml/min; volumen de columna: 14,335 ml). Se representan los resultados del ensayo de bifuncionalidad (ELISA modificado) que detecta solamente las moléculas que contienen tanto el th-Fab como la \alpha-glucosidasa. Se incuban partes alícuotas de 100 \mul de las fracciones eluidas con 1 ml de una solución de creatina-quinasa biotinilada (5% de reactivos de bloqueo) en tubos recubiertos con estreptavidina a temperatura ambiente durante 1 h; después de lavar dos veces con tampón salino alto (2M NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) y una vez con tampón salino bajo (10 mM Tris-HCl, pH 7,5) se incuban los tubos con 800 \mul de paranitroglucopiranósido 2 mM en 100 mM Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} de pH 6,8, a 30ºC durante 3 h; se mide la absorbancia en una longitud de onda de 405 nm frente a un patrón. La fracción de peso molecular elevado que contiene la proteína quimérica presenta la actividad bifuncional más elevada. La presencia de la \alpha-glucosidasa no asociada se manifiesta en una señal de fondo baja.
Ejemplos Ejemplo 1 Asociación específica y enlace covalente de péptidos poliiónicos a) Asociación y enlace
La asociación específica y el enlace covalente de péptidos mediante interacciones poliiónicas y un puente disulfuro se analiza utilizando péptidos poliiónicos (SEQ ID NO: 1) AlaCysGluGluGluGluGluGluGluGlu (ACE_{8}) y SEQ ID NO: 2) AlaCysLysLysLysLysLysLysLysLys (ACK_{8}). Todos los péptidos se sintetizan en un aparato del tipo ABI Applied Biosystem Peptide Syntetizer 431A con arreglo al método Fmoc. Se disuelve un 1 mM de péptido en una solución 20 mM de borato sódico, de pH 8,5, 2 mM de EDTA (concentración comprobada con arreglo a Ellman, G.L., Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77, 1959).
Se analiza la formación de heterodímeros unidos mediante puente disulfuro por cromatografía de intercambio catiónico. Se introducen las muestras en una columna POROS 20 HS (volumen de columna: 1,7 ml, equilibrada con 50 mM fosfato sódico, de pH 7,0). Se realiza la elución con un gradiente lineal de NaCl entre 0 y 2 M y un caudal de 4 ml/min. Se eluye el péptido ACK8 en 1070 mM NaCl, el disulfuro mixto de ACK8 y glutationa (ACK8-SG) a 800 nM NaCl y el heterodímero ACK8-ACE8 unido mediante puente disulfuro a 350 mM NaCl. El ACE8 no se fija sobre la columna. Se cuantifican las cantidades de los péptidos integrando las áreas de los picos de la absorción a 205 nm (programa informático de Pharmacia Unikorn).
Se mide la especificidad de la asociación de los péptidos ACK8 y ACE8 en función de diferentes parámetros.
b)
influencia de la intensidad iónica
c)
importancia del potencial redox para la formación del puente disulfuro entre los péptidos
d)
competición de asociación entre péptidos no cargados que contienen cisteína y proteínas.
b) Influencia de la intensidad iónica (concentración de NaCl) en la formación del puente disulfuro entre ACE8 y ACK8
Se convierte el ACK8 200 \muM en la forma disulfuro mixto ACK8-SG utilizando GSSG 10 mM en un tampón borato sódico 500 mM, de pH 8,5. Se purifica este disulfuro mixto por cromatografía de intercambio iónico. Se efectúa la asociación específica y la reacción redox de ACE8 20 \muM y del ACK8-SG disulfuro mixto en borato sódico 20 mM, de pH 8,5, EDTA 2 mM, a 25ºC, en presencia de NaCl en una concentración entre 0 y 1 M. Después de incubar durante 30 min se bloquea la reacción redox ulterior añadiendo 20 mM yodoacetamida. Los análisis de formación de heterodímeros se realizan por cromatografía de intercambio catiónico ya descritos anteriormente.
El heterodímero ACK8-ACE8 unido por puente disulfuro se forma cuantitativamente en una concentración de NaCl inferior a 20 mM. En concentraciones salinas más elevadas resulta suprimida la interacción poliiónica entre los péptidos, conduciendo a rendimientos más bajos de formación de heterodímeros.
c) La unión disulfuro entre ACE8 y ACK8 en dependencia del potencial redox
Se incuban 50 \muM ACK8 y 75 \muM ACE8 en 100 mM fosfato sódico, de pH 8,5, 2 mM EDTA, a 25ºC en presencia de 2,5 mM sustancias redox (GSH y GSSG). Se varía el potencial redox cambiando la relación entre el GSH y el GSSG. Después de una incubación de 5 h se interrumpe la reacción añadiendo 100 mM yodoacetamida y se analiza del modo descrito antes.
La asociación específica y el enlace covalente de los péptidos ACE8 y ACK8 tienen lugar incluso en condiciones reductoras. La formación del heterodímero ACE8-ACK8 es cuantitativa en condiciones redox de GSH^{2}/GSSG = 1:1 (mM).
d) Competencia de la formación del puente disulfuro entre ACK8 y ACE8
La especificidad de la formación del puente disulfuro entre ACE8 y ACK8 se analiza utilizando en ensayo de competencia. Se incuban 25 \muM ACK8 y 37,5 \muM ACE7 en 100 mM borato sódico de pH 8,5, 2 mM EDTA, 0,5 mM GSH, 2 mM GSSG en presencia de 250 \muM de nonapéptido laminina (secuencia: CysAspProGlyTyrIleGlySerArg, SEQ ID NO: 3). En otro ensayo se crea el potencial redox del tampón con 1,65 mM GSH y 0,85 mM GSSG. Como control se realizan los mismos ensayos en ausencia del péptido laminina. Después de una incubación de 2 h se bloquea la reacción por acidificación (pH 2) y se analizan los productos por HPLC-RP. La cantidad de ACE8-ACK8 heterodímero de los controles se iguala al 100% y se analiza el rendimiento de la formación de heterodímeros en los ensayos de competencia.
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Como segundo competidor se emplea la \alpha-glucosidasa (68,1 kDa). Esta proteína contiene 5 cisteínas, accesibles para reactivos tiol de bajo peso molecular. Se incuban 25 \muM ACK8 y 36,5 \muM ACE8 en borato sódico, pH 8,5, 2 mM EDTA, en presencia de 60 \muM \alpha-glucosidasa. Las dos condiciones redox diferentes son idénticas a las descritas antes. Los análisis se realizan por HPLC-RP.
La formación del ACE8-ACK8 heterodímero y unido con enlace covalente no resulta influenciado por la adición de un exceso de péptido laminina ni \alpha-glucosidasa, respectivamente. En base a las interacciones poliiónicas entre el ACE8 y el ACK8, la dimerización de estos péptidos para formar el ACE8-ACK8 es muy específica.
Ejemplo 2 Formación de un oligómero quimérico que consta de un fragmento Fab y de \alpha-glucosidasa de Saccharomyces cerevisiae utilizando péptidos poliiónicos de fusión
Se combina la actividad de fijación sobre antígeno del fragmento Fab del MAb 33 (anticuerpo monoclonal 33) con la actividad enzimática de la \alpha-glucosidasa utilizando péptidos poliiónicos de fusión, lo cual conduce a la formación de un derivado anticuerpo bifuncional (polipéptido quimérico).
Se modifica genéticamente el fragmento Fab del mAb 33 de modo que contenga un péptido de fusión cargado negativamente, con un resto cisteína adicional en su extremo C: AspAspAsp-AspAspAspAspAspAspAspSerCysPro (abreviado como D_{10}SCP, SEQ ID NO: 4). La cadena del segundo péptido es un derivado de la \alpha-glucosidasa PI del Saccharomyces cerevisiae que lleva un péptido de fusión con extremo C cargado positivamente (ArgArgArgArg
ArgArgArgArgArgArgCysGlyPro (abreviado como R_{10}CGP, SEQ ID NO: 5).
La formación de la proteína quimérica incluye los pasos siguientes:
I. Producción de un fragmento Fab con un péptido poliiónico de fusión de extremo terminado en C,
a)
Construcción de vectores de expresión,
b)
Expresión en E. coli, aislamiento de los cuerpos de inclusión, solubilización y renaturalización,
c)
Purificación por cromatografía de intercambio aniónico.
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II. Producción de la \alpha-glucosidasa con un péptido poliiónico de fusión de extremo terminado en C,
a)
Construcción del vector de expresión,
b)
Expresión en E. coli en forma soluble,
c)
Purificación por cromatografía de intercambio iónico.
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III. Formación de una proteína quimérica unida con puente disulfuro mediada por péptidos poliiónicos de fusión
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I. Producción de un fragmento Fab con un péptido poliiónico de fusión con extremo terminado en C a) Construcción de los vectores de expresión
Se utiliza el fragmento Fab del mAb (anticuerpo monoclonal) 33 como una parte de la proteína quimérica. El mAb 33 es un anticuerpo murino del subgrupo kIgGl dirigido contra la creatina-quinasa humana dímera, específica del músculo (CK-MM E. C. 2.7.3.2.) (Buckel y col., Gene 51, 13, 1987). El fragmento Fab del mAb 33 contiene un enlace disulfuro entre la cadena ligera k (25 kD) y la cadena pesada fd (25 kD).
a1) Construcción de un plásmido que codifique a la cadena ligera (kappa)
Se codifica la cadena ligera del mAb 33 en el plásmido pBT1111, que es un derivado del plásmido pBR223-3. La secuencia y la estrategia de clonación se describen en el documento EP-0 364 926 B1. Para la expresión se transforma el plásmido en células hospedantes de E. coli que contienen el plásmido pUBS520 (Brinkmann y col., Gene 85, 109-114, 1989).
a2) Construcción de plásmidos que codifiquen a una proteína de fusión de cadena pesada con una secuencia de péptido poliiónico en extremo C
Se inicia la construcción del vector con un plásmido p12016 que codifica a la cadena pesada del mAb 33 (Buckel y col., Gene 51, 13, 1987). Las secuencias de nucleótido que codifican a los dominios Ch2 y Ch3 de la cadena pesada se someten a deleción y se añade una secuencia de nucleótido que codifica a un péptido poliiónico con una cisteína en su extremo C en el dominio ch1, aplicando una mutagénesis con cebador. La secuencia de nucleótidos contiene codones auxiliares en su extremo 5' que codifican a los cinco restos aminoácido del extremo N de la \beta-galactosidasa (ITNSR) con el fin de facilitar la expresión de la proteína en la E. coli. Se amplifica el cDNA que codifica al fragmento fd con los cebadores 1 y 2 mediante PCR. Se inserta en el extremo 5' un sitio de restricción NdeI. En el extremo 3' se insertan un sitio de restricción Hind III y la secuencia de nucleótidos del péptido poliiónico con la cisteína adicional.
Se lleva a cabo la PCR con los cebadores siguientes:
Cebador delantero: NdI Fd de extremo N (SEQ ID NO: 6):
5'-GCG TTA GCC ATA TGA CCA TGA TTA CGA ATT CCC GG-3'
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Cebador inverso de la variante fdD_{10}SCP (SEQ ID NO: 7):
5'-CAT AGT CCC AAG CTT TTA CGG GCA AGA ATC ATC GTC ATC ATC ATC GTC GTC ATC ATC ACC ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3'
El fragmento cDNA modificado se clona en el vector pET-11a (Novagen), que pertenece a los sistemas de expresión T7 (Studier, F.W. y Moffatt, B.A., J. Mol. Biol. 189, 113, 1986). Para la expresión se transforma el vector en células hospedantes que contengan el plásmido pUBS520. El plásmido pUBS520 (Brinkmann y col., Gene 85, 109-114, 1989) codifica al tRNA que es necesario para la traducción de los codones AGA y AGG que raramente aparecen en la E. coli.
b) Expresión en E. coli, aislamiento de cuerpos de inclusión, solubilización y renaturalización
Se realizan los cultivos en medio salino mineral con glucosa como única fuente de carbono, a 37ºC, en una escala de 5 litros, en un fermentador. Cuatro horas después de la inducción con 0,4 mM IPTG se recogen las células por centrifugación (5000 rpm; 20 min; 4ºC). Se almacena la biomasa a -70ºC. La proteína recombinante sobreexpresada se acumula en cuerpos de inclusión en el citosol bacteriano. Se aíslan los cuerpos de inclusión con arreglo a Rudolph y col., Folding Proteines, en: T.E. Creighton (coord.): Protein function: A Practical Approach, 57 (1996); y se almacenan a -20ºC. Se solubilizan los agregados proteicos en clorhidrato de guanidina 6 M (100 mM TRIS-HCl, pH 8,5; 1 mM EDTA; 100 mM DTT) a 4ºC durante una noche. Se reduce el pH a 4,0 utilizando HCl 0,5 M y se separa el material no solubilizado por centrifugación (20.000 rpm; 30 min; 4ºC). Se dializa con profusión la solución frente a clorhidrato de guanidina 4 M, pH 4,0, con el fin de eliminar el ditiotreitol. Se determina la concentración de proteína por espectrofotometría utilizando como patrón un fragmento Fab auténtico, desnaturalizado y reducido.
Se diluye la proteína desnaturalizada 100 veces en tampón de renaturalización (1 M Tris/HCl, pH 8,0; 2 mM EDTA; 2,4 mM GSSG/0,6 mM GSH) hasta una concentración proteica final de 10 \mug/ml. Se realiza la renaturalización a una escala de 10 litros a 15ºC durante 150 h. Se comprueba la funcionalidad de los fragmentos Fab renaturalizados con un ELISA con arreglo a Buchner, J. y Rudolph, R., Bio/Technology 9, 157, 1991. Se centrifuga la solución de proteína renaturalizada (13.000 rpm; 30 min; 4ºC) con el fin de separar los agregados de peso molecular más elevado y se concentra el líquido sobrenadante por filtración de flujo cruzado (ultrafiltración con flujo tangencial; sistema ProVario 3; filtro cassette: Minisette OMEGA FSQ; corte en: 8 kD). Se dializa el material retenido del fragmento Fab con el péptido de fusión poliaspartato (abreviado como FabD_{10}SCP) frente a 20 mM Tris/HCl de pH 8,0.
c) Purificación por cromatografía de intercambio aniónico
Se purifica el fragmento FabD_{10}SCP por cromatografía de intercambio aniónico empleando una columna Resource Q (Pharmacia, volumen de columna: 6 ml). Se realiza la elución en un gradiente lineal de cloruro sódico, de 0 a 1 M en 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, a lo largo de 20 volúmenes de columna, con un caudal de 6 ml/min. Se eluye el FabD_{10}SCP en una concentración de NaCl de 300 mM. Se separa eficazmente el dímero de las cadenas fdD_{10}SCP unidas con puente disulfuro, de peso molecular más elevado, que eluye en una concentración de cloruro sódico de 400 mM.
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II. Producción de \alpha-glucosidasa con una secuencia de polipéptido poliiónico de extremo terminado en C
El tipo salvaje de la \alpha-glucosidasa del Saccharomyces cerevisiae es una proteína monómera que tiene un peso molecular de 68 kDa. Contiene cinco cisteínas, que no intervienen en la formación de puentes disulfuro. Para las investigaciones presentes se construye genéticamente una proteína de fusión que consta de \alpha-glucosidasa PI y un péptido de fusión deca-arginina en extremo C con una cisteína, glicina y prolina adicionales.
a) Construcción del vector de expresión
El vector pKK177-3/GlucPI descrito por Kopetzki y col., Mol. Gen. Genet. 216, 149, 1989, codifica a la \alpha-glucosidasa PI del Saccharomyces cerevisiae. El vector de expresión es un derivado del pKK223-3 (Brosius, J. y Holy, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6929, 1984), que contiene un promotor tac y un gen de \beta-lactamasa. Se modifica el vector de manera que contenga un solo sitio de restricción EcoRI en la posición 1600 del gen de la \alpha-glucosidasa. El péptido de fusión que codifica a diez restos arginina, uno de cisteína, uno de glicina y uno de prolina se inserta en el extremo C por mutagénesis con cebador aplicando técnicas estándar de DNA recombinante. La PCR se realiza utilizando las siguientes secuencias de cebador:
Cebador delantero EcoRI1600 (SEQ ID NO: 8):
5'-CAT AAG AGT ACG GAG ACA AGA CGC TGT TTG C-3'
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Cebador inverso R10CGP (SEQ ID NO: 9):
5'-AAA CAG AAG CTT ATT ATG GTC CAC ATC GAC GTC GAC GAC GCC GGC GAC GTC GGC GTT TGA CCA GGT AGA TTC TAC C-3'
Después de la digestión del vector y de los productos de la PCR con el EcoRI y el Hind III, se someten a ligación.
b) Expresión en E. coli en forma soluble
Para la expresión se transforma el vector en E. coli C600 (Appleyard, R.K., Genetics 39, 440, 1954), pFDX500 - LacI^{q} en pACYC177 (Chang, A.C.Y. y Cohen, S.N., J. Bacteriol. 134, 1141, 1978). El cultivo y la inducción se realizan con arreglo a Kopetzki y col., Mol. Gen. Genet. 216, 149, 1989. Se incuban las células en un medio del tipo Luria Broth (LB) suplementado con un 2% de glucosa a 37ºC. Para la inducción se reduce el pH de 7,0 a 5,0 con ácido fosfórico (3 M) y se reduce la temperatura a 24ºC. En combinación con la inducción limitada en presencia de un 0,5% de lactosa, la \alpha-glucosidasa se acumula predominantemente en forma soluble en el citosol. Seis horas después de la inducción se recogen las células por centrifugación (5000 rpm; 4ºC; 10 min) y se lavan con 10 mM K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, de pH 6,8; 10 mM EDTA. Se almacena la biomasa a -20ºC.
Se suspenden de nuevo 10 g de biomasa en 50 ml de tampón (10 mM K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, de pH 6,8; 10 mM EDTA). Se desintegran las células por homogeneización de alta presión (Gaulin MicronLab 40; 1200 bar; 2 pasadas). Después se incuba el extracto en bruto en presencia de 15 mM MgCl_{2} y 1 U/ml de benzonasa (Merck, Darmstadt) a 4ºC durante dos horas. Se separan por centrifugación (20.000 rpm; 4ºC; 2 h) los cascotes de las células insolubles.
c) Purificación por cromatografía de intercambio catiónico
Se purifica el líquido sobrenadante del extracto en bruto por cromatografía de intercambio catiónico en una columna Resource 5 (Pharmacia; 6 ml). Se eluye la fracción proteica que contiene actividad de \alpha-galactosidasa en una concentración de NaCl de 350 mM en un gradiente lineal de 0 a 500 mM de NaCl (tampón: 10 mM K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, de pH 6,8; 10 mM EDTA) a lo largo de 20 volúmenes de columna, con un caudal de 6 ml/min. Se determina la actividad enzimática por espectrofotometría con arreglo a Kopetzki y col., Yeast 5, 11, 1989, a 405 nm y 30ºC empleando como sustrato artificial 2 mM de para-nitrofenilglucopiranósido (PNGP) (Sigma) en 100 mM K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, de pH 6,8; 10 mM EDTA (ver Kopetzki y col., Yeast 5, 11, 1989).
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III. Formación de una proteína quimérica unida con puente disulfuro, mediada por péptidos poliiónicos de fusión
La asociación se realiza en 20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 2 mM EDTA, en presencia de un sistema redox. Se utilizan la glutationa oxidada y reducida en una proporción molar de 10:1 y con una concentración total de 2 mM (1,8 mM GSSG/0,2 mM GSH). Se incuban los polipéptidos en cantidades equimolares (3 \mumoles/l) a 20ºC durante 48 h. Para el análisis se interrumpe la reacción con yodoacetamida (concentración final: 20 mM en Tris-HCl, de pH 8,0) y se separan las muestras en un SDS-PAGE del 12% en condiciones oxidantes y reductoras. Se detectan las pistas que contienen Fab por revelado inmune (immunobloting) en nitrocelulosa.
Como alternativa se separan los productos de reacción en una columna de filtración a través de gel (TSKgel 2000 SW_{XL}; TosoHaas) en un tampón 50 mM Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4}, que contiene 300 mM NaCl, con un caudal de 0,75 ml/min, utilizando un aparato filtrador del tipo Vision Workstation (BioCad Vision station: Perspective
Biosystems).
Se inyectan en la columna 200 \mul de la mezcla de la reacción de asociación. Se analizan las fracciones para determinar la funcionalidad de fijación de antígeno, la actividad enzimática y la bifuncionalidad. La bifuncionalidad se detecta con un sistema ELISA modificado: incubación en presencia de la creatina-quinasa biotinilada a temperatura ambiente durante una hora en tubos recubiertos con estreptavidina (Roche Diagnostics GmbH) y posterior lavado, dos veces, con tampón de alto contenido en sal (2 M NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) y una vez con tampón de bajo contenido en sal (10 mM Tris-HCl, pH 7,5) y detección a 405 nm después de una incubación de 3 horas con 2 mM pNPG en 100 mM K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, de pH 6,8, a 30ºC. Las reacciones de asociación se efectúan en ausencia y en presencia de 500 mM NaCl. La asociación de la especie individual se investiga también en una intensidad iónica baja y elevada. Como control se incuba el FabD_{10}SCP con el tipo salvaje de la \alpha-glucosidasa.
La especie individual incubada sola no reacciona con el producto de peso molecular más alto en una intensidad iónica baja, tampoco en la alta. Además, el FabD_{10}SCP no reacciona con el tipo salvaje de la \alpha-glucosidasa. La reacción del FabD_{10}SCP con \alpha-glucosidasa-R_{10}CGP en ausencia de NaCl puede la única que permitió obtener un producto dotado de actividad bifuncional.
Ejemplo 3 Asociación específica entre partículas de tipo vírico (VLP) y un fragmento de anticuerpo, mediada por interacciones poliiónicas
La asociación covalente de las VLP de la proteína de cubierta de polioma VP1 y los fragmentos Fv unidos mediante puente disulfuro (ds-Fv) del mAb B33, basada en secuencias de péptidos poliiónicos de ingeniería genética, es otro ejemplo de la presente invención. La invención incluye la producción de las VLP, la producción de los fragmentos ds-Fv y la posterior asociación.
I) Producción de las VLP
a)
Inserción de un péptido poliiónico en el VP1 a nivel de cDNA y expresión en E. coli
b)
Purificación de la proteína (mutante) soluble VP1-Glu
c)
Asociación "in vitro" de VP1-Glu con las VLP
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II) Producción del ds-Fv
a)
Expresión del ds-Fv con una secuencia de péptido poliiónico en E. coli
b)
Aislamiento de los cuerpos de inclusión (los ib) y solubilización
c)
Renaturalización y purificación del ds-Fv-mAb B3
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III) Asociación de las VLP con los ds-Fv, mediada por interacciones poliiónicas y formación de un puente disulfuro intermolecular
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I) Producción de las VLP a) Inserción de un péptido poliiónico en el VP1: construcción del plásmido y expresión en E. coli
La proteína de cubierta de polioma VP1 es capaz de asociarse "in vitro" con las VLP icosaédricas (Salunke, D.M. y col., Cell 46, 895-904, 1986; Salunke, D.M. y col., Biophysical J. 56, 887-904, 1989). El plásmido pALVPITAC (Leavitt, A.D. y col., J. Biol. Chem. 260, 12803-12809, 1985) codifica al tipo salvaje de la proteína y permite la producción recombinante de una proteína pentámera soluble en E. coli. Basándose en este plásmido se inserta una secuencia poliiónica en un bucle HI expuesto a disolvente en la superficie del VP1 (Stehle, T. y col., Structure 4, 165-182, 1996). Esta secuencia consta de 8 glutamatos y una cisteína. Para clonar el VP1 mutante se inserta la secuencia GluGluGluGluGluGluGluGluCys (E_{8}C, SEQ ID NO: 10) entre los aminoácidos Asn^{294} y Tyr^{295} a nivel de cDNA mediante un kit de mutagénesis dirigida a una posición, llamado QuickChange™ (Stratagene).
Para la expresión se transforma el plásmido resultante que codifica al VP1-Glu en Eco B. Se cultiva la cepa de expresión en medio de sal mineral a 30ºC a escala de 5 litros en un aparato Biostat-Fermenter (Braun), utilizando una técnica llamada "fed-batch". Se induce la expresión recombinante del VP1-Glu con 0,4 mM IPTG en una densidad celular de OD_{600} = 20. Seis horas después de la inducción se recogen las células por centrifugación (8000 rpm, 15 min) y se almacenan a -70ºC.
b) Purificación de la proteína mutante soluble
Para la obtención de la VP1-Glu mutante se suspenden de nuevo 50 g de células en 500 ml de tampón A (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 5% de glicerina; 2 mM EDTA; 200 mM NaCl; 4 mM DTT). Se realiza la lisis celular por dispersión de alta presión (Gaulin, 1200 bar) en presencia de 1 unidad/ml de benzonasa, 20 \mug/ml de RNasa y 4 tabletas de cóctel completo de inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics GmbH, Alemania). Se centrifuga el lisado a 47.000 rpm durante 30 min.
El primer paso de purificación y concentración consiste en una precipitación fraccionada en sulfato amónico entre una saturación de sal del 17,5 al 27,5%. Se introduce la proteína resuspendida en una columna de intercambio aniónico (Poros 20 HQ). En un gradiente lineal comprendido entre 200 mM y 1 M de NaCl en el tampón A se eluyen unos 30 volúmenes de columna de VP1-Glu en 500 mM NaCl en forma de proteína casi homogénea. A continuación se incuba el líquido eluido a 20ºC durante 20 min con 2,5 unidades/ml de benzonasa y 20 \mug/ml de RNasa en presencia de 10 mM cloruro magnésico. Después se realiza una cromatografía de exclusión de tamaños (Pharmacia Superdex 200, calidad preparativa, en tampón A) para separar el VP1 pentámero de material oligómero superior y agregado.
c) Asociación "in vitro" de VP1-Glu (partículas de tipo vírico vacías - VLP)
Para la asociación con las VLP se dializa el VP1-Glu pentámero purificado frente al tampón B (20 mM Tris, pH 7,4; 0,75 M sulfato amónico; 5% de glicerina; 1 mM CaCl2) a 15ºC durante 2 días. En estas condiciones se induce la formación de las VLP. Con el fin de separar el sulfato amónico se dializa la solución de las VLP frente al tampón C (20 mM Tris, pH 7,4; 200 mM NaCl; 5% glicerina; 1 mM CaCl2) a 15ºC durante 1 día y después se almacena a 4ºC o a -20ºC.
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II) Producción de ds-Fv a) Expresión del ds-Fv con una secuencia de péptido poliiónico en E. coli
Basándose en el vector pUli39-1, que codifica al cDNA del dominio Vl asociado a exotoxina de pseudomonas, y en el vector pYR 38-2, que codifica al dominio VH (Reiter, Y. y col., Protein Engng. 12, 1323-1331, 1995) se construye un fragmento Fv estabilizado con disulfuro con un péptido poliiónico de fusión. A tal fin se introduce un codón de paro entre la secuencia codificadora del VL y la parte de toxina, creándose de este modo un vector de expresión para el dominio Vl del mAb B3.
El dominio V_{H}, codificado en el plásmido pYR 38-2, se amplía con una secuencia poliiónica ArgArgArgArg
ArgArgArgArgCysPro (R_{8}CP, SEQ ID NO: 11) en el extremo C. Esta extensión se realiza mediante un procedimiento de dos pasos empleando el kit de mutagénesis dirigido a una posición QuickChange™ (Stratagene). En primer lugar se inserta un oligonucleótido que codifica al ArgArgArgArgCysPro en el extremo 3' del gen V (Reiter, Y. y col., Protein Engng. 12, 1323-1331, 1985).
Para completar el marcador que contiene al péptido R8CP se insertan otras cuatro argininas en una segunda mutagénesis.
b) Aislamiento de los cuerpos de inclusión (ib) y solubilización de los ib
Se expresan por separado los dominios V_{H} y V_{L} en E. coli como cuerpos de inclusión. La preparación de los ib se realiza con arreglo al método de Rudolph y col. (Rudolph y col., Folding Proteins, en: T.E. Creighton (coord.): Protein function: A Practical Approach, 57, 1996). Se almacenan los ib a -70ºC. La solubilización de los ib se realiza de modo similar al descrito en el método de Rudolph y col. (Rudolph y col., Folding Proteins, en: T.E. Creighton (coord.): Protein function: A Practical Approach, 57, 1996).
c) Renaturalización y purificación de ds-Fv del mAb B3
Se renaturaliza el ds-Fv del mAb B3 por dilución simultánea de los ib solubilizados de V_{H} y de V_{L} en el tampón de pliegue (100 mM, pH 8,5; 1 mM EDTA; 0,5 M arginina; 1 mM GSH; 1 mM GSSG). La renaturalización se realiza en una concentración total de proteínas de 30 \mug/ml con una proporción molar V_{H} : V_{L} = 5:1. Se incuba la mezcla de renaturalización a 10ºC durante 7 días. Después se separa por centrifugación a 47.000 rpm durante 30 min el material agregado. En el caso de una proteína plegada correctamente se forma un puente disulfuro intermolecular entre V_{H} y V_{L}. Se concentra el material renaturalizado soluble por flujo tangencial (Vario-3-System Filtron; Minisette FSQ; corte: 8 kD) y se cambia el tampón al tampón D (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl).
La secuencia policatiónica del extremo C del dominio V_{H} permite la purificación del ds-Fv plegado por cromatografía de intercambio catiónico. Se introduce la proteína renaturalizada en una columna Poros 20 HS y se eluye con un gradiente lineal de 0,2 a 1 M de NaCl en tampón D. El ds-Fv eluye en forma de proteína homogénea a 400 mM NaCl. La homogeneidad del ds-Fv se pone de manifiesto por filtración a través de gel (Pharmacia Superdex 75), eluyendo con tampón D y SDS-PAGE.
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III) Asociación covalente de las VLP con los ds-Fv
Se realiza la asociación dirigida de los ds-Fv con las VLP en tampón E (20 mM Tris, pH 7,4; 5% de glicerina; 1 mM CaCl_{2}; 37,5 mM GSSG). La concentración empleada del VP1-Glu es de 5 \muM y la concentración de los ds-Fv es de 2,5 \muM. Se efectúa la reacción en presencia de 0,2 M NaCl y 0,75 M sulfato amónico, respectivamente. Como control se mezcla el tipo salvaje de VP1 sin secuencia poliiónica con el ds-Fv en presencia de 0,2 M NaCl. Se incuban las mezclas de reacción a 20ºC durante 8 h y después se introducen en una columna de filtración a través de gel (TosoHAAS TSK-Gel PW 6000 XL), equilibrada con tampón E y 0,2 M NaCl. Se precipitan las fracciones que contienen las VLP con desoxicolato sódico y se analizan con 18% SDS PAGE (figura 4) y Western Blot.
\newpage
Solamente se forma un puente disulfuro entre el ds-Fv y las VLP mutantes en la mezcla en la que está presente 0,2 M NaCl y las dos proteínas poliiónicas, VP1-Glu y ds-Fv, respectivamente, dicha formación está promovida por las interacciones poliiónicas entre los péptidos poliiónicos de fusión. En presencia de 0,75 M sulfato amónico se suprimen las interacciones poliiónicas y no se forma el puente disulfuro. De igual manera, en la mezcla de control tampoco se detectan puentes disulfuro intermoleculares entre el ds-Fv y el tipo salvaje de las VLP. Estos datos indican que los péptidos poliiónicos de fusión inducen la heterodimerización de las proteínas. En el ejemplo indicado, uno de los reactivos, el VP1-Glu, está presente en forma multímera, permitiendo no solo la unión con la otra proteína funcional sino también el amarre de diversas proteínas poliiónicas marcadas diferentes.
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: péptido ACE8
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\sa{Ala Cys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu}
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: péptido ACK8
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\sa{Ala Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys}
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: laminina nona-péptido
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\sa{Cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg}
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<223> Descripción de secuencia artificial: péptido D10SCP
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<223> Descripción de secuencia artificial: péptido D10CGP
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\sa{Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys Gly Pro}
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador NdI Fd
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcgttagcca tatgaccatg attacgaatt cccgg 
\hfill
35 
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador fdD10SCP
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador EcoRI1600
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cataagagta cggagacaag acgctgtttg c 
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31 
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\newpage
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<223> Descripción de secuencia artificial: péptido E8C
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\sa{Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Cys}
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: péptido R8CP
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<400> 11
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\sa{Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys Pro}

Claims (4)

1. Engarce lineal peptídico para la unión de compuestos biológicamente activos, caracterizado porque dicho engarce consta de:
un primer resto engarce polipéptido, que consta de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos básicos, elegidos entre el grupo formado por la arginina, la lisina y la ornitina y
un segundo resto engarce polipéptido, que consta de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos ácidos, elegidos entre el grupo formado por el glutamato y el aspartato,
dichos restos primero y segundo están unidos por interacción iónica debida a sus numerosos aminoácidos cargados y por puentes disulfuro covalentes entre sus cisteínas,
cada uno de dichos estos está unido por su extremo C o N a un compuesto biológicamente activo.
2. Un engarce peptídico reivindicado en la reivindicación 1, en el que dichos compuestos biológicamente activos unidos a dicho engarce peptídico primero y segundo difieren entre sí por su estructura química.
3. Un engarce peptídico reivindicado en la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho compuesto biológicamente activo es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
4. Un método para la producción de un polipéptido quimérico que consta de dos polipéptidos biológicamente activos unidos mediante un engarce peptídico, caracterizado porque
a) se expresan en una célula hospedante procariota o eucariota de modo simultáneo o por separado los ácidos nucleicos que codifican a
aa)
un primer resto de dicho polipéptido quimérico que consta de un primer polipéptido biológicamente activo y un primer resto engarce polipéptido que consta de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos básicos, elegidos entre el grupo formado por la arginina, la lisina y la ornitina y
ab)
un segundo resto de dicho polipéptido quimérico que consta de un segundo polipéptido biológicamente activo y un segundo resto engarce polipéptido que consta de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos ácidos, elegidos entre el grupo formado por el glutamato y el aspartato,
b) dichos restos primero y segundo de dicho polipéptido quimérico se recuperan de la célula hospedante o del líquido sobrenadante celular y se ponen en contacto para permitir la formación de una interacción poliiónica entre dichos restos engarces polipéptidos primero y segundo,
c) el producto de b) se trata con un agente oxidante para formar puentes disulfuro entre dichos restos engarces polipéptidos y
d) se aísla dicho polipéptido quimérico.
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