CN113755523B

CN113755523B - 重组前融合状态新冠刺突蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN113755523B
Application number: CN202110970870.1A
Authority: CN
Inventors: 项阳; 李军; 张福城; 余乐; 张云; 谭焱
Original assignee: Wuhan Abclonal Inc
Current assignee: Wuhan Abclonal Inc
Priority date: 2020-06-25
Filing date: 2021-08-23
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2041-08-23
Also published as: US11020474B1; CN113755523A

Abstract

本发明披露了利用弗林基因敲除或着敲低的哺乳动物细胞(如HEK293,CHO或者其他哺乳动物细胞)生产重组前融合状态的新冠刺突蛋白的技术。前融合状态的新冠刺突蛋白可以作为抗原产生抗体/结合分子，用以制备检测分析或诊断的试剂，或者判断检测对象是否为新型冠状病毒既往感染者。该蛋白还可以用作干扰新冠病毒与受体结合的抑制剂；或者用于制备具有治疗效果的新冠病毒抗体/结合分子；同时还可以用作能够对SARS‑CoV‑2病毒产生免疫力的疫苗。除此之外，该蛋白也可以用作能够对SARS‑CoV‑2相关冠状病毒产生预防性或治疗性的药物。

Description

重组前融合状态新冠刺突蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及重组前融合状态新冠刺突蛋白的制备方法。

背景技术

新冠病毒主要通过其刺突蛋白与受体血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，从而进入人体细胞。

SARS-CoV-2有四种主要的结构蛋白，分别为S(刺突蛋白)、E(包膜蛋白)、M(膜蛋白)和 N(核衣壳蛋白)。其中，核衣壳蛋白包裹RNA基因组，刺突蛋白、包膜蛋白和膜蛋白一起构成病毒外膜。刺突蛋白(S)使病毒颗粒与宿主细胞的细胞膜吸附并融合，实现病毒与宿主受体的结合。

刺突蛋白是一种I型融合蛋白，具有融合前三聚体和融合后三聚体两种构象，包含两个不同功能的亚基S1和S2。其中，S1亚基负责与宿主受体细胞结合，S2亚基介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合，从而使得病毒遗传物质能够进入宿主细胞。刺突蛋白有两种形式，分别为前融合形式和被蛋白酶酶切激活后的成熟/活性形式。

重组的SARS-CoV-2结构蛋白对抗体、疫苗和药物研发至关重要。但是，重组野生型S-ECD(胞外域)非常不稳定，导致重组蛋白的生产极为困难。目前市场上大多数的重组S-ECD都是通过突变来解决被蛋白酶酶切的问题，但是这样就导致得到的重组蛋白与野生型不同，即得到了非天然结构的蛋白。而非天然结构的蛋白在科研和治疗中一般不会被接受。

S蛋白的酶切水解是病毒入侵宿主细胞必经的过程，它可能发生在组成型细胞分泌通路上，也可能发生在病毒进入宿主细胞期间。

弗林蛋白酶是一种能够将底物蛋白切割成成熟/活性形式的内切酶，它的底物包括凝血因子、血清蛋白、生长因子受体以及病毒刺突蛋白。弗林蛋白酶属于类枯草杆菌蛋白酶前体蛋白转换酶家族，该家族的成员能够将潜在的前体蛋白转换成其生物活性产物。弗林蛋白酶一般富集在高尔基体中，并在高尔基体中将其他底物蛋白切割或激活成相应的成熟/活性形式。弗林蛋白酶是S蛋白的一种前体蛋白转换酶。

因此，如果借助弗林蛋白酶来抑制或阻止S蛋白的酶解，也许能够制备出前融合状态蛋白 (S-ECD-PFS)。S-ECD-PFS可以作为抗原产生抗体，用以制备检测分析或诊断的试剂；或者用作干扰SARS-CoV-2病毒进行细胞结合的抑制剂；或者作为抗原用于制备SARS-CoV-2的单克隆抗体；或作为疫苗激发受体对SARS-CoV-2的免疫力。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了重组前融合状态新冠刺突蛋白的制备方法，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种制备前融合状态的重组SARS-CoV-2刺突蛋白的方法，包括：使用CRISPR Cas9转染技术制备无法表达弗林蛋白酶但能表达SARS-CoV-2刺突蛋白的宿主细胞，使用的sgRNA支架序列为：GATGCGCACAGCCCACGTGT，如SEQ ID NO:19所示和ACAGTGTGGCACGGAAGCAT，如SEQ ID NO:20所示；

在宿主细胞中表达SARS-CoV-2刺突蛋白。

进一步地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

进一步地，所述宿主细胞是HEK293细胞。

进一步地，所述sgRNA被整合至载体中。

进一步地，构建的正向和反向sgRNA载体包含以下正向和反向sgRNA支架序列：

forward:CACC-GATGCGCACAGCCCACGTGT，如SEQ ID NO:5所示；

reverse:AAAC-ACACGTGGGCTGTGCGCATC，如SEQ ID NO:6所示；

forward:CACC-ACAGTGTGGCACGGAAGCAT，如SEQ ID NO:7所示；和reverse:

AAAC-ATGCTTCCGTGCCACACTGT，如SEQ ID NO:8所示。

进一步地，还包括将载体蛋白与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的步骤。

进一步地，所述载体蛋白包括脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白复合物、破伤风类毒素蛋白、白喉毒素衍生物、牛血清白蛋白、阳离子化牛血清白蛋白、Concholepas concholepas血蓝蛋白、乙型肝炎病毒蛋白、匙孔血蓝蛋白、轮状病毒衣壳蛋白，牛乳头瘤病毒的L1蛋白、人乳头瘤病毒的L1蛋白、卵清蛋白和流感血凝素蛋白。

进一步地，所述乙型肝炎病毒蛋白为表面抗原蛋白或乙肝病毒核心抗原蛋白。

所述血凝素蛋白来自血凝素A亚型H1至H17。

所述转染技术使用SEQ ID NOs:19和20的反向序列作为包含或不包含3'末端AAAC序列的 sgRNA支架序列，3'末端AAAC序列分别如SEQ ID NO:6(3′-5′) AAAC-ACACGTGGGCTGTGCGCATC；和SEQ ID NO:8(3′-5′) AAAC-ATGCTTCCGTGCCACACTGT所示。

总结

本申请涉及利用弗林基因敲除或着敲低的哺乳动物细胞(如HEK293、CHO或者其他哺乳动物细胞)生产重组前融合状态的新冠刺突蛋白的技术。S-ECD-PFS的制备及活性检测方法如下：

1.运用CRISPR Cas9技术敲除哺乳动物细胞中的弗林蛋白酶基因，如HEK293细胞；

2.将S-ECD-PFS基因的表达载体转染至弗林蛋白酶基因缺失的细胞中；

3.纯化重组的S-ECD-PFS蛋白，纯化方法优选为镍柱纯化；

4.检验重组S-ECD-PFS蛋白的生物活性，检测方法优选为使用ELISA结合实验检测样品蛋白与重组表达的ACE2的结合能力。

重组S-ECD-PFS可以作为抗原产生抗体，用于制备检测分析或诊断的试剂(例如，输血、器官移植或者新冠病毒诊断的试剂)；或者判断检测对象是否为新型冠状病毒既往感染者。重组S-ECD-PFS 还可以用作干扰新冠病毒与受体结合的抑制剂；或者用于制备具有治疗效果的新冠病毒抗体/结合分子；同时还可以用作能够对SARS-CoV-2产生免疫力的疫苗。重组S-ECD-PFS还可以用作干扰细胞结合的抑制剂；或者用作能够对与SARS-CoV-2相关的病毒产生免疫力的疫苗，如CoV-ZXC21 (MG772934)、SARS-CoV(NC_004718.3)、SARS-likeBM4821(MG772934)、HCoV-OC43(AY391777)、 HKU9-1(EF065513)、HCoV-NL63(KF530114.1)、HCoV229E(KF514433.1)、MERS-CoV(NC019843.3) 和HKU1(NC_006577.2)。基于本申请中描述的方法，可以将上述这些病毒的蛋白基因导入弗林蛋白酶基因缺失的细胞中，构建表达载体表达重组蛋白，制备能够干扰细胞结合的抑制剂；或作为抗原产生抗体，用以制备检测分析或诊断的试剂；或者用作能够对这些病毒产生免疫力的疫苗。

附图说明

图1是SARS-CoV-2刺突蛋白结构示意图，并标注了弗林蛋白酶的切割位点。

图2是用HEK293野生型细胞表达重组S-ECD-PFS的电泳图。

图3a展示了在HEK293细胞株30-18和30-28中，弗林蛋白酶基因敲除前后的序列差异；SEQ ID NO.1为野生型(WT)，SEQ ID NO.2为敲除型(KO)，SEQ ID NO.3为敲除型中的缺失序列。

图3b为Western blot图，结果显示，向培养基中添加抗弗林蛋白酶抗体后，在HEK293细胞株 30-18和30-28(右栏)的培养基中无弗林蛋白酶，左栏表示野生型细胞中表达弗林蛋白酶；第二排右栏为包含抗肌动蛋白的对照组。

图3c为电泳图，结果显示，以表达野生型弗林蛋白酶的HEK293细胞为对照(泳道1)，S-ECD-PFS 在弗林蛋白酶基因敲除的HEK293细胞中表达时有单一主要条带(泳道2)。

图4是弗林蛋白酶基因敲除细胞中表达的重组蛋白经镍柱纯化后的电泳图(泳道1-5)。

图5是本申请中的重组S-ECD-PFS、市场购买的重组S-ECD与ACE2结合的ELISA检测结果。

详细说明

除上下文另有明确说明外，本申请中涉及的“一个”、“一种”和“所述”包括复数项。

“结合分子”指如下描述的所有抗体、抗体片段或抗体衍生物，以及能够靶向S-ECD-PFS的蛋白质和非蛋白质、抗体和抗体片段或衍生物，以上所有片段或蛋白等都可以采用下文描述的方法进行修饰或检测，从而得到对S-ECD-PFS具有高亲和力的结合分子。

“偶联物”包括根据上下文能够推断出的，与抗体、结合剂或S-ECD-PFS偶联的物体，包括融合蛋白、与至少一种多肽或抗体或结合剂或核酸或化合物或药物载体缀合的蛋白质或抗体。除此之外，“偶联物”还可以包括至少一种药物或药物活性剂。所述的药物或药物活性剂包括能够适用于偶联(或包含于药物载体中的)的抗生素、抗病毒药物、细胞毒性药物、以及其他已知的或潜在的能够抑制或改善Covid 19感染的抗生素和药物等，如羟氯喹、阿奇霉素、瑞德西韦、一氧化氮(封装的)、艾芬地尔、利巴韦林、干扰素β-1a、干扰素-a或其他干扰素、重组牛分枝杆菌、秋水仙碱、法匹拉韦、洛匹那韦、利托那韦、聚乙二醇干扰素λ-1A、芬维A胺以及其他的抗生素、多柔比星、长春新碱、顺铂、道诺霉素、甲氨蝶呤和其他抗癌剂，如毒素(如白喉类毒素或蓖麻毒蛋白)、环磷酰胺等药物、烷化剂(如环磷酰胺、美法仑等)、细胞毒性抗生素(阿霉素、表柔比星、博来霉素、丝裂霉素、甲氨蝶呤、卡培他滨、吉西他滨、氟尿嘧啶、长春花生物碱和依托泊苷(长春碱、长春新碱等)、铂化合物(卡铂化合物)、奥沙利铂)、紫杉烷类(紫杉醇、多西他赛等)、拓扑异构酶I抑制剂(伊立替康、拓扑替康等)以及环磷酰胺等药剂及其组合。在一个实施例中，组合物可以包含本申请中的至少一种多肽(抗体)、融合蛋白、偶联物、核酸、载体或细胞，以及至少一种药物或药物活性剂。

“氨基酸的保守性替换”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换。本领域，具有相似侧链的氨基酸残基家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

“药物载体”包括脂质体、聚合物胶束、微球和纳米颗粒。

“接头”是指作为分子桥连接两个不同分子的化合物或化合物的部分结构(例如，接头的一部分与结合剂或S-ECD-PFS结合，另一部分与偶联物的其他分子结合)。接头包括但不限于化学链、化合物(如试剂)和氨基酸等。接头包括但不限于同源双功能接头、异双功能接头、生物稳定接头和生物可降解接头。接头可以是立体的(例如，使偶联物的结合部分呈非刚性固定)。异双功能接头包含两个官能团，第一官能团的一端与第一分子特异性连接，第二官能团的另一端与第二分子的特异性连接。为了具备更优异的生物稳定性、化学和/或温度耐受性、立体选择性或尺寸等，接头的长度和组成可以根据连接的分子或连接条件等因素的不同进行调整。优选的，接头为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基的“合成肽接头”。这些残基排列成最长为五个氨基酸的重复单元，每个重复单元重复2-5次以形成多聚体单元。在多聚体单元的氨基和/或羧基末端可以额外添加最多六个任意天然氨基酸。

S-ECD-PFS指SEQ ID NO.16所示的序列，以及以此制备的用于治疗、预防或检测的试剂，还包括与此类试剂具备相同使用方式的其他相关蛋白，如，包括使用本申请中的技术从以下任一种制备得到的重组蛋白：CoV-ZXC21(MG772934),SARSCoV(NC_004718.3),SARS-like BM4821(MG772934), HCoV-OC43(AY391777),HKU9-1(EF065513),HCoV-NL63(KF530114.1),HCoV229E(KF514433.1), MERS-CoV(NC019843.3),HKU1(NC_006577.2)。

“序列同源性”是指两个序列中相同氨基酸所占的比例，可以是从0％～100％的任意数字。在某些实施例中，相关蛋白质的同源性可以是75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或与S-ECD-PFS具有99％的同源性。

结合剂

本申请中的结合剂包括抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)和其他靶向S-ECD-PFS的结合剂。这些结合剂可以用于诊断、预防或治疗SARS-CoV-2或相关病原体的感染，或用于血液或组织样本中 SARS-CoV-2或相关病原体的检测，或用于法医研究，包括疾病监测等。

一般情况下，抗体包括重链和轻链。每条重链和轻链都包含一个恒定区和一个可变区(分别为 VH和VL)，这些“区”也可以称为“域”。轻链和重链可变区包含一个被三个高变区中断的“框架”区，也称为“互补决定区”或“CDR”。不同轻链或重链的框架区序列在同一物种内相对保守。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和排列CDR。

CDR主要负责抗原表位的结合。每条链的CDR从N末端开始依次编号CDR1、CDR2和CDR3，并且通常由特定CDR所在的链来识别。因此，VH CDR3位于其所在抗体的重链可变域中，而VL CDR1 来自其所在抗体轻链可变域的CDR1。

优选的，抗-S-ECD-PFS单克隆抗体(通常在小鼠或其他啮齿动物中产生)或其片段是嵌合、人源化或人单克隆抗体。人源化抗体包括至少一个非人源的氨基酸残基，通常为引入残基，一般来自引入的可变区。人源化的方法可以参照Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；或Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988)中的方法进行，使用啮齿动物CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列进行人源化。因此，人源化抗体是部分人类可变域被非人类物种的相应序列取代的嵌合抗体(美国专利，No.4,816,567)。实际上，人源化抗体通常是一些 CDR残基和一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代后的人抗体。

在某些实施例中，“人抗体”是指除人框架和恒定区之外还包含人高变区的免疫球蛋白，可以使用本领域现有的各种技术来获得此类抗体。如体外方法，包括使用噬菌体(McCafferty等，1990， Nature 348：552-554；Hoogenboom&Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；和Marks等，J.Mol.Biol. 222：581(1991))、酵母细胞(Boder and Wittrup,1997,Nat Biotechnol 15:553-557)或核糖体(Hanes and Pluckthun,1997,Procci美国94：4937-4942)制备的人抗体片段的重组文库。同样地，也可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物中来制备人抗体，例如引入至内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠中，能够得到人类抗体。这在基因重排、组装和抗体库等所有方面都与人类非常相似。这种方法在美国专利Nos.6,150,584,5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425； 5,661,016,和文献(如，Jakobavits,Drug Deliv Rev.31:33-42(1998),Marks等,Bio/Technology 10: 779-783(1992)；Lonberg等,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild 等，Nature Biotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)；Lonberg& Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)中都有所描述。

在某些实施例中，本申请中的抗体或其片段为抗S-ECD-PFS抗体的F(ab)’2、Fab、Fv或单链 Fv片段，或至少包含这些片段。

在某些实施例中，“抗体片段”指完整抗体的一部分，通常是指抗原结合区或可变区。如，Fab、 Fab'、F(ab)'2和Fv片段；单域抗体(参见Wesolowski,Med MicrobiolImmunol.(2009)198(3):157-74； Saerens,et al.,Curr Opin Pharmacol.(2008)8(5):600-8；Harmsen and de Haard,Appl Microbiol Biotechnol.(2007)77(1):13-22))；螺旋稳定抗体(参见Arndt et al.,J Mol Biol 312:221-228(2001))； diabodies(见下文)，单链抗体分子(“scFvs”，参见美国专利号5,888,773)；二硫键稳定性抗体(“dsFvs”，参见美国专利号5747654和6558672)，和域抗体(“dAbs”，参见Holt et al.,Trends Biotech 21(11): 484-490(2003),Ghahroudi et al.,FEBS Lett.414:521-526(1997),Lauwereys etal.,EMBO J 17: 3512-3520(1998),Reiter et al.,J.Mol.Biol.290:685-698(1999),Davies and Riechmann,Biotechnology, 13:475-479(2001))。

美国专利5,932,448中披露了一种双特异性抗体的制备方法，其中，Fab'部分由亮氨酸拉链结构连接。美国专利7,538,196中公开了双特异性抗体的制备方法，其中连接部分由连接子连接。美国专利8,148,496中公开了一种多特异性Fv抗体结构体，该结构体具有至少四个可变结构域，这些可变结构域通过肽连接器连接。双特异性抗体的一个结合位点靶向ICB，另一个靶向肿瘤标记物。

美国出版No.20170335281披露了一种表达CAR的转基因T细胞，该CAR包含一个与癌症相关抗原结合的抗原结合域。相似的技术也可以用于修饰T细胞或其他免疫细胞，从而表达抗原结合域的至少一个CDR1、CDR2和CDR3，进而实现癌症的治疗。CAR多肽分子的抗原结合域可以包括任何抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab')2、单域抗体(SDAB，参见WO9404678和Hamers-Casterman, C.et al.(1993)Nature 363:446-448)、VH或VL结构域，或VHH结构域。表达CAR的T细胞可以与本申请中的治疗方法联合使用。抗原结合域可以是抗-S-ECD-PFS域。

高亲和力抗体变体

高亲和力抗S-ECD-PFS抗体的制备

抗体可以是保留对抗原的高亲和力和其他有利生物学特性的人源化抗体。可以借助对亲本和人源化序列的三维模型的分析制备人源化抗体。例如使用计算机程序分析免疫球蛋白的三维结构模型，筛选或检测影响免疫球蛋白结合其抗原能力的残基。这样就可以从受体和外源序列中筛选或组合FR残基，达到调整抗体特征的目的，如增加对抗原的亲和力。

需要修饰的框架区残基包括与靶标非共价结合的残基(参见Amit et al.Science233:747-753 (1986))；与CDR的构象相互作用/影响的残基(参见Chothia etal.J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；和/或参与VL-VH接口的残基(EP 239 400B1)。框架区残基的修饰能够增强抗体与靶标结合的亲和力。

可以采用本领域的各种方法制备核苷酸序列，如寡核苷酸介导的(定点)诱变、PCR诱变和早期制备抗体或非抗体变体使用的盒式诱变。优选寡核苷酸介导的诱变方法。某些实施例中，抗体变体可以仅发生单个高变区残基的取代，如约2-15个高变区替换。

本申请中可以通过寡核苷酸介导的合成方法制备变体文库。包含3条寡核苷酸，每条寡核苷酸含约100个核苷酸，跨越整个轻链或重链可变区。每条寡核苷酸可以包含：(1)由20个三联体(NNK) 组成的含60个氨基酸的片段，其中，N是任何核苷酸，K、G或T；(2)与下一个寡核苷酸或载体发生序列重叠的约15-30个核苷酸。三条寡核苷酸经PCR反应退火后，其互补链被聚合酶填充，得到完整的双链重链或轻链可变区序列。可以根据链的长度调整三联体的数量以及它们在寡核苷酸内的位置，从而达到仅取代特定CDR或框架区中氨基酸的目的。(NNK)的存在导致20个氨基酸可以位于变体序列的任何位置。5-10个氨基酸(15-30个核苷酸)的重叠序列是不变的，但是可以位于框架的重叠区内，被单独替换，或在下一轮合成中被替换。寡核苷酸可以直接购买或采用本领域的现有方法合成。利用这些寡核苷酸产生抗体变体的方法也可以是本领域公知的方法，如PCR。

本申请中重链和轻链变体文库在序列中的随机位置不同，可以构建在任何包含其编码序列的表达载体中，如噬菌体。

本申请中在获得抗体变体后，需要检测其相对于亲本抗体的生物活性，检测变体对ICB靶标的亲和力，现有技术中有多种能够进行高通量检测筛选的方法。

本申请中经过多轮筛选获得亲和力较强的抗体变体。检测亲和力的常用方法是利用BIAcore表面等离子共振系统(BIAcore,Inc.)评估结合和解离速率常数。根据产品说明书(BIAcore)进行操作，激活生物传感器芯片实现目标物的共价偶联，把稀释后的靶标注射到芯片上，获得响应信号。由于信号与样品质量成正比，因此其能够反映样品浓度。使用单点模型获得解离数据的koff+/-s.d(测量的标准差)；计算每条曲线的伪一级反映速率常数(ks)，并绘制成蛋白质浓度的函数，从而获得kon+/-s.e (拟合的标准差)。利用SPR计算平衡解离常数Kd's，为koff/kon。假定关联率(kon)是所有变体的常数，由于Kd与koff成反比，因此能够对亲和力的改变程度进行推测。

为了确定筛选的高亲和力候选抗体变体具有治疗效果，本申请中可以采用前述的方法对其进行生物活性检测。最优的抗体变体与ICB的结合力显著高于亲本抗体，且可以根据其用途进行进一步地修饰。比如氨基酸序列的改变、与异源多肽的融合和/或共价修饰等。如，对抗体变体的结构不会产生影响的半胱氨酸残基可以被丝氨酸替换，从而改善分子的氧化稳定性并减少异常交联。相反地，可以将半胱氨酸添加到抗体中以提高其稳定性(特别是当抗体是抗体片段如Fv片段时)。

结合剂的偶联物

本申请中，结合剂与任何细胞毒性药物、抗生素、已知的抗病毒药物、细胞毒性药物、已知或潜在可抑制或改善Covid 19感染的抗生素和药物、任何包含上述细胞毒性药物或抗生素等的偶联物，都可以用于治疗或预防Covid 19。

S-ECD-PFS蛋白的偶联物

S-ECD-PFS蛋白与载体(如下所述)的偶联物可以用作Covid 19的疫苗，或者制备结合剂。 S-ECD-PFS蛋白与细胞毒素(如上所述)的偶联物可以用于治疗Covid 19。

本申请中的技术方案和肽偶联物中涉及的载体蛋白可以为能够引发抗体产生的任何免疫原性蛋白。载体蛋白、以及载体蛋白与肽偶联的方法可以采用本领域的现有技术进行制备，如美国专利No. 2011/060318，其中给出了载体蛋白及连接方法的案例。载体蛋白包括但不限于脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白复合物(OMPC)、破伤风类毒素蛋白、白喉毒素衍生物(CRM197)、牛血清白蛋白(BSA)、阳离子化BSA、Concholepas concholepas血蓝蛋白(CCH))、乙型肝炎病毒(HBV)蛋白(如表面抗原蛋白 (HBsAg)和HBV核心抗原蛋白)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、轮状病毒衣壳蛋白、牛乳头瘤病毒的L1蛋白(BPV L1)、人乳头瘤病毒的L1蛋白(HPV L1；例如，HPV 6、11或16型)、卵清蛋白和流感血凝素(HA)蛋白，如来自血凝素A亚型H1至H17的HA蛋白。本领域技术人员可以对本发明中涉及的载体蛋白、偶联方法和连接体等进行选择性调整。

载体蛋白与另一载体蛋白通过反应位点结合，与目标肽通过连接基团连接，如氨基酸残基上的伯氨基(如赖氨酸的ε氨基，蛋白质N端的α氨基)。与硫醇反应肽偶联时，一般需要将至少一个伯氨基转化为含硫醇的基团(如，半胱氨酸或同型半胱氨酸残基)、亲电不饱和基团(如马来酰亚胺基团) 或卤代基团(如溴乙酰基)。血凝素FIR肽或肽的接头上的伯氨基转化为含硫醇的基团，从而与载体蛋白上的硫醇(巯基)通过二硫键偶联。

某些实施例中，可以选用琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(sSMCC

马来酰亚胺己酰氧基]-磺基琥珀酰亚胺酯 (sEMCS)、双-重氮联苯胺(BDB)、N-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、戊二醛、1- 乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)或N-乙酰高半胱氨酸硫内酯(NAHT)。

涉及SMCC时，SMCC将半胱氨酸残基的SH基团与载体蛋白上赖氨酸残基的氨基交联。首先， SMCC与伯胺(如，载体蛋白的赖氨酸残基)反应激活载体蛋白。然后，将活化的载体与过量的SMCC 及副产物分离，并加入含半胱氨酸的肽，半胱氨酸的硫醇基团与SMCC衍生载体蛋白上马来酰亚胺部分的双键相加，从而以共价硫键将载体与肽偶联。若血凝素FIR肽不包含半胱氨酸残基，则需将半胱氨酸残基添加到肽中，优选在N端或C端。如果血凝素FIR肽的表位包含半胱氨酸，或者如果肽中至少一个半胱氨酸基团，则可以选用无需对半胱氨酸修饰的偶联方法。添加至肽中的半胱氨酸残基与血凝素FIR肽之间需要间隔至少一个氨基酸，从而将两者分离开，避免载体蛋白与肽之间的连接干扰肽的表位。半胱氨酸、间隔残基和修饰后的SMCC共同构成了血凝素FIR肽偶联物的连接基团。

本申请中还可以通过碳二亚胺交联剂将羧基共价连接到伯胺基团上实现肽与载体蛋白的偶联。如：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-环己基-2-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基- 对甲苯磺酸盐(CMC)等。这种方法简单，特异性差，可以引发多种潜在表位产生抗体。此外，EDC 偶联可能会发生聚合现象，使偶联物的溶解度降低，后期处理困难。

其他偶联剂也可以直接或通过连接基团将FIR肽与载体蛋白偶联。如，使用异氰酸酯偶联剂(如 2-吗啉代乙基异氰化物)实现共轭；使用N-乙酰高半胱氨酸硫内酯(OMPC)在载体蛋白上添加硫醇基团，从而与马来酰亚胺或溴乙酰基功能化肽偶联；使用本领域已知的其他任何试剂将半抗原(潜在免疫原)偶联到多肽和蛋白质上。

本领域已知非特异性交联剂的应用。如，与戊二醛反应；与N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺反应(琥珀酰化载体存在与否均可)；在硼氢化钠或氰基硼氢化钠的存在下，糖基化取代基的高碘酸盐氧化后偶联到蛋白质载体的游离氨基上；非酰化末端丝氨酸和苏氨酸残基的高碘酸盐氧化形成末端醛，然后与胺或酰肼反应生成席夫碱或腙，后者可以用氰基硼氢化物还原成仲胺；芳族氨基重氮化，然后与蛋白质的酪氨酸侧链残基偶联；与异氰酸酯反应；或参与混合酸酐的反应。接头部分可以用间隔基团(如氨基酸残基、己二酸二酰肼等)补充或延伸。

位于FIR肽和载体蛋白之间的间隔太包含单个氨基酸和与FIR肽连接的短肽(即短的非血凝素 FIR肽序列)，如含赖氨酸的肽、含半胱氨酸的肽等。优选地，连接基团含硫键(如，参与至SMCC 和相关偶联方法中)。优选地，连接基团包括通过其巯基侧链与琥珀酰亚胺部分结合的Cys残基，其通过肽键结合FIR肽的N-末端。式I中环己基部分上的1-羰基通过酰胺键与载体蛋白上的伯胺结合。

在某些实施例中，肽偶联物包括与载体蛋白连接的单个血凝素FIR肽。其他实施例中，可以使用至少两个血凝素FIR肽。

内服试剂

配体及其他活性成分用量

1、配方

用于治疗或预防SARS-CoV2的结合剂、偶联物或S-ECD-PFS的剂量可以根据如下确定：偶联物包括聚乙二醇、免疫球蛋白Fc片段或连接至基础分子的胶原蛋白、白蛋白和其他蛋白，以及抗体 (包括单克隆抗体及其片段)。任何能够模拟与ACE-2受体结合反应的化合物或其组合均可用于本申请。关于药物配制或给药方法参见文献(如Remington'sPharmaceutical Sciences,Maack Publishing Co., Easton Pa.等)。

本申请中的活性药物可以制备成任何剂型的药剂，包括静脉注射、皮下给药、肌内给药、舌下给药、局部给药、口服和吸入式给药制剂。具体如下文所述。

制备成静脉注射药物时，可以是无菌注射剂，如水性或油性无菌注射悬浮液。可以利用本领域中的已知技术及上文提及的分散剂、润湿剂和悬浮液来配制。无菌注射剂也可以是肠胃外形式的稀释剂或溶剂，溶剂包括水、林格氏溶液，即等渗氯化钠。此外，非挥发性油也可以做溶剂或悬浮剂使用。如温和性固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪油如油酸也可以用于制备注射剂。

可以使用本领域已知的药学上可接受的载体，制备成合适剂量的口服给药药物。口服给药剂型包括片剂、丸剂、粉剂、胶囊、液体、锭剂、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。为了避免活性成分在胃酸中被破坏，口服药剂通常包括肠溶涂层。口服药剂包括活性配体与固体赋形剂，还可以根据需要加入其他化合物后制备成颗粒混合物，并进一步制备成片剂或丸剂。

固体赋形剂一般是碳水化合物或蛋白质填充剂，如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；来自玉米、小麦、大米、马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶，如阿拉伯树胶和黄蓍胶；明胶和胶原蛋白等蛋白质。还可以根据需要加入崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，如海藻酸钠。口服药剂还包括由明胶制成的推入式胶囊，以及由明胶和涂层如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推入式胶囊中可以含填充剂或粘合剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)以及稳定剂。软胶囊中，配体溶解或悬浮于液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇，稳定剂可以根据情况确定是否添加。

内服式悬浮液包含有与配体混合的赋形剂，包括悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；以及分散剂或润湿剂，如天然存在的磷脂(如卵磷脂)、亚烷基的缩合产物氧化物与脂肪酸(如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇(如十七亚乙基氧十六醇)的缩合产物、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液中还可以包含至少一种防腐剂，如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯；以及其他需要的添加剂，包括着色剂、调味剂和甜味剂，如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。调整配方比例可以调整制剂的渗透压。

内服式油性悬浮液可以通过植物油(如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)将活性配体悬浮于内部。油性悬浮液中还可以包含增稠剂，如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。还可以添加甜味剂来调整口感，添加抗氧化剂延长保存，如抗坏血酸。

水性悬浮液可以通过将活性配体与分散剂、悬浮剂和/或润湿剂以及至少一种防腐剂混合配制，制备成可分散粉剂或颗粒，加入水中得到悬浮液。分散剂或润湿剂、悬浮剂如上文所述，也可以另外添加赋形剂、甜味剂、调味剂和着色剂。

药剂还可以是水包油型的乳剂。油相可以是植物油，如橄榄油或花生油；矿物油，如液体石蜡，或其混合物。乳化剂包括天然存在的树胶，如阿拉伯树胶和黄蓍胶；天然存在的磷脂，如大豆卵磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，如脱水山梨糖醇单油酸酯及其缩合产物；环氧乙烷的偏酯，如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳液中还可以包含甜味剂和调味剂。糖浆和酏剂可以与甜味剂一起配制，例如甘油、山梨糖醇或蔗糖。还可包含缓和剂、防腐剂、调味剂或着色剂。

对于静脉注射药剂，水溶性抗体及赋形剂可以通过滴注法给药。赋形剂可以包含5％葡萄糖、0.9％盐水、林格氏溶液或其他赋形剂。

在其中一个实施例中，可以通过位点特异性或靶向局部递送技术给药。具体方法包括抗体或局部递送导管的各种可植入贮库源，如输液导管、留置导管或针导管、合成移植物、外膜包裹物、分流器和支架或其他可植入的部件，特定位点的载体、直接注射或使用。参见专利：WO 00/53211和US 5,981,568。

本申请的一个实施例中还提供了包含本申请的任何药物组合物或药剂(如，包含结合剂)的产品使用或制备方法的说明。产品中包括容器，如瓶子、小瓶(如双室小瓶)、注射器(如双室注射器) 和试管。容器可以由多种材料形成，如玻璃或塑料。容器上的标签可以印制使用或制备方法，如，标签上可以说明该制剂被制备成特定的蛋白浓度。容器可以是多用途的小瓶，其允许所制备产品的多次给药(如2-6次)。产品还可以包含盛放稀释剂(如BWFI)的第二容器。将稀释剂和冻干剂混合后，蛋白质浓度一般至少为50mg/mL。产品还可以包括商业或使用所需的其他材料，如缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装说明。

2.药剂的给药方式

含有药物活性试剂、S-ECD-PFS和其他活性成分的药剂可以以任何方式给药，如静脉内、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、皮内、关节内、滑膜内、鞘内、皮内、瘤内、结内、髓内、口服、吸入或局部途径；或者口服、吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或通过植入的贮液器给药；推注或在一段时间内连续输注；或通过注射贮库给药，如使用1个月、3个月或6个月贮库注射或生物可降解材料和方法。给药方式将随着药物的药代动力学和其他特性以及患者的状况而变化。

液体制剂的市售雾化器也可以用于给药，包括喷射雾化器和超声雾化器。液体试剂可直接雾化，冻干粉剂可以溶解后雾化。抗体可以使用碳氟化合物制剂和定量吸入器雾化，或作为冻干和研磨的粉末吸入。本申请中涉及CAR时，免疫效应细胞(如，T细胞、NK细胞)的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位或其他地方。

本申请的治疗方法的治疗对象可以是哺乳动物，包括：农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠，优选人。

能够实现治疗的结合剂、S-ECD-PFS或与其他试剂组合的量是有效剂量。给药方式和给药量取决于多种因素，包括患病阶段、疾病的严重性、不良副作用的严重性、病人的健康状况、身体状况、年龄等。确定给药量时，还需要考虑给药方式、药代动力学，即吸收率、生物利用度、代谢、清除率等。根据体外和哺乳动物模型中确定并推理至人类的相关参数值，预测人类的给药方案，然后进行临床试验，并依据本领域公知方法对剂量进行完善。

本申请中的技术方案允许医生根据给药途径、患病阶段、患者规模和SARS-CoV2患者状态等因素调整给药方案。如，医生的开药剂量可以从一定水平逐渐递增，并根据个体反应进行调整。药剂的使用时间、达到有效效果的时间、或仅用于预防等的时间可根据使用对象的不同进行调整。

冻干剂

在获得结合剂、S-ECD-PFS或其偶联物之后，可以将其制备成合适的制剂，优选冻干剂。其第一步是要制备成预冻干试剂，需要通过目标剂量、体积、给药方式等来确定预冻干试剂中结合剂的用量。结合剂一般存在于溶液中，如，存在于pH 4-8，优选5-7的缓冲液中。缓冲液包括组氨酸、磷酸盐、 Tris、柠檬酸盐、琥珀酸盐和其他有机酸。缓冲液浓度一般为1-20mM，优选3-15mM，具体取决于缓冲液和药剂所需渗透性能。缓冲液优选含组氨酸的试剂，因为组氨酸具有冻干保护性能，琥珀酸盐也可以。

预冻干试剂中还可以添加冻干保护剂，优选非还原糖，如蔗糖或海藻糖。优选地，冻干保护剂的用量通常使所得药剂使用时呈等渗状态，有时高渗也是可以的。冻干保护剂的用量不能太低，以免发生结合剂降解或聚集现象。

当冻干保护剂是糖(如蔗糖或海藻糖)，且结合剂是抗体时，冻干保护剂的浓度一般为10-400mM，优选30-300mM，更优选50-100mM。

结合剂与冻干保护剂的比例与所使用物质的种类有关。当使用抗体作为结合剂、糖(如蔗糖或海藻糖)作为冻干保护剂以制备具有高蛋白浓度的等渗制剂时，冻干保护剂与抗体的摩尔比一般为 100-1500，优选200-1000，更优选200-600。

优选地，可以将表面活性剂添加至预冻干试剂中，或者将表面活性剂加入至冻干剂中。表面活性剂包括非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(如泊洛沙姆188)；曲拉通；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基 -磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基-或甲基油酰基-牛磺酸二钠；MONAQUATTM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(如Pluronics、PF68等)。表面活性剂的用量应确保能够减少蛋白质的聚集，并使制备的颗粒粒径最小化。如，预冻干试剂中表面活性剂用量范围为 0.001-0.5％，优选0.005-0.05％。

预冻干试剂可以包含冻干保护剂(如蔗糖或海藻糖)和填充剂(如甘露醇或甘氨酸)的混合物。填充剂的使用需要保证制备的冻干粉均匀、不成团。

预冻干试剂中还可以包含其他药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(如文献Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中所述的)，且这些物质的使用需要确保其不影响药剂的目标特性。载体、赋形剂或稳定剂的使用不会对使用者产生毒性，其可以包括缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，如抗坏血酸和蛋氨酸；螯合剂如EDTA；金属配合物(如锌-蛋白质配合物)；可生物降解的聚合物，如聚酯；和/或盐平衡离子，如钠。

本申请中的药物组合物或制剂最好性能稳定，从而保证储存期间理化性能稳定且完整。本领域现有的各种检测蛋白质稳定性的方法都适用于本申请，如文献Peptide andProtein Drug Delivery,247-301, Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10: 29-90(1993)中所述的方法。蛋白质稳定性需要在特定时间特定温度条件下进行检测。

体内给药制剂必须是无菌的，这可以通过无菌过滤膜来实现，或者，将除蛋白质以外的其他混合物在约120℃高压灭菌30min来实现。

将结合剂与冻干保护剂混合后，可以使用冻干机将其制备成冻干剂，如

(Hull，美国) 或

(Leybold-Heraeus，德国)冻干机。冷冻干燥是指将制剂冷冻后在初级干燥温度下干燥升华，此温度下，产品温度低于制剂的结晶点或熔点。

初级干燥温度一般为-30℃-25℃(假设产品在该条件下保持冷冻)、压力一般在50-250mTorr。干燥所需时间一般取决于容器(如玻璃瓶)、尺寸和类型以及样品的体积等，可以从几小时到几天不等 (如40-60h)。二次干燥可在0-40℃下进行，具体条件取决于容器的类型、大小及蛋白质种类。如，整个冻干脱水阶段温度可以为15-30℃(如20℃)。二次干燥所需的时间和压力取决于温度和其他参数，也将决定是否能够产生合适的冻干物。二次干燥的时间还影响产品中的水分含量，一般二次干燥至少需要5小时(如10-15h)。二次干燥的压力可以与初次干燥的压力相同。冷冻干燥的条件可以根据材料和容器尺寸而变化。

有时可能需要在容器中冻干蛋白制剂，进行蛋白质的构建，以免发生转移。选用的容器可以是3、 5、10、20、50或100cc的小瓶。一般冻干后，水分含量小于5％，优选小于3％。

使用时，可以使用稀释剂稀释冻干剂，稀释程度优选为使结合剂的浓度与预冻干试剂中的浓度相似。

蛋白质的构建一般在约25℃下进行，以确保完全水合，当然也可以根据需要调整为其他温度。构建所需时间取决于稀释剂的类型、赋形剂和蛋白质的量。稀释剂可以为无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、 pH缓冲溶液(如磷酸盐缓冲液)、无菌盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。稀释剂还可以包含防腐剂。上文中已经已经对防腐剂进行举例介绍，优选芳族醇，如苄醇或酚醇。防腐剂的用量需要根据其浓度、对蛋白质的防腐效果来确定。如使用芳香醇(例如苯甲醇)，用量约0.1-2.0％，优选约0.5-1.5％，但最优选约1.0-1.2％。

还可以使用非冻干制剂，包括结合剂、已知载体、赋形剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、佐剂和本文描述的和本领域已知的其他添加剂。

检测分析

本申请中提供了用于检测结合剂与S-ECD-PFS结合的方法，包括本领域任何可用方法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)。在某些实施例中，可以使用对S-ECD-PFS的抗体，或二抗，如抗-S-ECD-PFS 抗体。检测部分可以包含荧光基团，且与至少一种抗体偶联。本申请中，“荧光基团”(也称荧光标记或荧光染料)是指在特定波长下吸收光能并能在不同波长下发射光能的部分。某些实施例中，检测部分可以包含酶，如β-半乳糖苷酶，其能够催化底物产生有色物质。

本申请中，“检测”或“测量”是指评估样品中物质的存在与否、数量或有效量，包括物质定性或定量浓度的计算，或以其他方式评估目标值。

在某些实施例中，检测时可以将捕获剂添加至底物或反应容器中，在捕获剂与底物结合的条件下进行如ELISA检测。样品(如来自受试者的组织样品，如血液、血浆、唾液或眼泪)可以添加到含有捕获剂的底物或反应器中。结合剂能够与捕获剂结合。可以将抗体或抗体-检测剂复合物加入到反应混合体系中。复合物的抗体与之前结合的抗原分子(如C1-INH)结合，形成抗体-抗原-抗体“三明治”结构。除去多余的复合物后，加入底物以进行检测。如，在设定时间停止反应(如，通过添加1N NaOH停止反应)，基于颜色强度与结合抗原的浓度成正比，在分光光度计中检测有色产物浓度。

实施例

如图1所示，本申请已经预测S蛋白在第682位和686位氨基酸(R682和S686)之间含有弗林蛋白酶切割位点(⁶⁸²RRAR↓S⁶⁸⁶)。本申请中首先进行实验用来验证弗林酶能识别并酶切S蛋白。在野生型HEK293细胞中表达的S-ECD被蛋白酶切呈现三条条带

为了制备能够用于抗体、疫苗或药物开发等用途的重组S-ECD蛋白，本申请中首先在HEK293细胞中制备在C末端具有6个His标签(SEQ ID NO.4)的重组S-ECD(“S-ECD-C6XHis”)细胞，然后使用镍柱纯化。SDS-PAGE进行表达、纯化、分离后，观察到野生型S-ECD-C6XHis有三个条带。与预期相符：S蛋白在氨基酸R682和氨基酸S686之间含有弗林蛋白酶裂解位点(⁶⁸²RRAR↓ S⁶⁸⁶)，参见图1。如图2所示，180KD条带对应于S-ECD-PFS，120KD和80KD条带对应于包含S1和S2亚基的S蛋白的成熟/活性形式。

但是，HEK293野生型细胞中S-ECD的产量普遍较低(小于1毫克/升)，且蛋白质不稳定。市场上现有的重组S-ECD(简称S-ECD-MT)一般都敲除了切割位点，如图1(⁶⁸²RAAA↓S⁶⁸⁶)，以避免蛋白酶裂解，得到S-ECD-PFS类似物。但是，人工突变/缺失导致蛋白产生了不相关的表位，这类蛋白在科研或治疗中很难被应用。且突变导致重组蛋白被加工制备具有弗林蛋白酶活性的产物。

运用CRISPR技术在HEK293细胞中敲除弗林蛋白酶基因

本申请中预期，利用CRISPR-Cas9技术敲除HEK293细胞中的FURIN基因，将能够在HEK293 敲除细胞中表达具有完整弗林蛋白酶的S-ECD。本申请中靶向外显子1设计了两个sgRNA，并挑选单克隆进行测序分析。其中有两个单克隆都发生了56bp的缺失，弗林蛋白酶的敲除型和野生型序列比对结果如图3a所示。

通过Western Blot对弗林蛋白酶进行检测，结果如图3b所示，在敲除型HEK293细胞中没有检测到弗林蛋白酶，与预期相符。

敲除HEK293细胞中FURIN基因提高S-ECD的产量

将表达S-ECD-C6XHis蛋白的基因载体分别转染至HEK293野生型细胞和弗林蛋白酶基因敲除细胞中，将培养液进行SDS-PAGE分离，并使用抗6XHis抗体进行Western Blot检测。结果如图3C 所示，HEK293野生型样品中显示出两条带，一条是全长S-ECD，另一个是S2；而敲除型样品中显示出单条带，与预期相符。

扩大敲除型细胞的培养，收集1L培养液进行镍柱纯化。结果如图4所示，敲除型细胞中的表达量显著高于野生型中的表达量(>20毫克/升培养液)。

S-ECD-PFS比S-ECD-MT具有更高的ACE2结合亲和力

本实施例中用ELISA方法检测S-ECD或重组S1和ACE2的结合力。

将重组S-ECD和重组S1(作为对照)以2μg/mL(100μL/孔)包被至96孔板上。用不同稀释度(从2μg/mL(100/孔)开始)的包含Fc结构域的重组ACE2与其反应，空白作阴性对照。利用抗人Fc-HRP抗体检测捕获的重组ACE2-Fc，Origin8软件根据OD值计算EC50。结果如图5所示， S1的EC50为12.14ng/mL；S-ECD-MT的EC50为10.38ng/mL；S-ECD-PFS的EC50为4.33ng/mL，EC50越低表明结合活性越高。

实验结果表明S-ECD-PFS具有较高的亲和力，在作为抗原制备抗体或用于检测分析、诊断时优于S1或S-ECD-MT，能够作为干扰SARS-CoV-2细胞结合的治疗剂，或作为疫苗(产生针对 SARS-CoV-2的抗体)使用。

实验方法

CRISPR Cas9涉及的sgRNA：

sgRNA1：GATGCGCACAGCCCACGTGT(SEQ ID NO:19)；

sgRNA2：ACAGTGTGGCACGGAAGCAT(SEQ ID NO:20)。

用Bbs1酶切位点整合到如下的载体PX459 addgene#62988(来自Addgene，Watertown MA)，引物序列如下：

Vector-sgRNA1(forward):CACC-GATGCGCACAGCCCACGTGT(SEQ ID NO:5)；

Vector-sgRNA1(reverse):AAAC-ACACGTGGGCTGTGCGCATC(SEQ ID NO:6)；

Vector-sgRNA2(forward):CACC-ACAGTGTGGCACGGAAGCAT(SEQ ID NO:7)；

Vector-sgRNA2(reverse):AAAC-ATGCTTCCGTGCCACACTGT(SEQ ID NO:8)。

哺乳动物细胞转染、蛋白纯化及质粒的制备方法如下。

质粒带有β内酰胺酶(amp)抗性基因，转染至大肠杆菌中后，于37℃或30℃下过夜。使用市售Maxiprep试剂盒(Qiagen)提取质粒，之后还可以去除内毒素。

使用Expi293培养基培养HEK293细胞，培养基或转染试剂如下，当然也可以使用其他细胞或试剂材料，如293T、CHO等。

材料和设备

Expi293表达培养基(Gibco#A1435102)；Opti-MEM I减血清培养基(Gibco#31985088)； ExpiFectamine 293转染试剂盒(GIbco#A14524)；PBS(1X)(Gibco#10010-023或同等产品)；Ni-NTA 琼脂糖(Qiagen#30230或同等产品)；NuPAGE 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶(Invitrogen目录号： NP0329BOX)；SDS-PAGE电池和电源；氯化钠NaCl(Sigma-Aldrich#S3014或等效物)；咪唑 (Sigma-Aldrich#I5513或同等产品)；Furin mAb抗体(AbclonalA5043)；肌动蛋白mAb抗体 (Abclonal AC026)；重组S-ECD R683A、R685A突变(AbclonalRP01260MT)；重组ACE2(Abclonal RP01275)。使用镍柱纯化蛋白(当然也可以使用其他纯化方法)。

序列

FURIN野生型基因参见NCBI中的部分序列：NC_000015.10，如SEQ ID NO:9。

FURIN基因引物：seq-F：TCCTCTCAGGGTCGGCACTC(SEQ ID NO:10)；seq-R：GCTGCTTGCCTGAACCACCT(SEQ ID NO:11)。

敲除后的FURIN基因，如SEQ ID NO:12。

FURIN野生型蛋白序列，如SEQ ID NO:13。

Furin蛋白突变序列，如SEQ ID NO:14。

S-ECD编码序列：S-ECD(AAVal16-Gln1208(SEQ ID NO:15))在优化后通过5'XbaI/3'AgeI亚克隆到 pcDNA载体中(登录号#YP_009724390.1)。

S-ECD(AA Val16-Gln1208(SEQ ID NO:16))蛋白质序列。

S-ECD克隆序列：S-ECD(AA Met1-Gln1208(SEQ ID NO:17))，通过5'XbaI/3'AgeI亚克隆到pcDNA 载体中；包括优化的DNA密码子；前45位为信号肽编码部分(登录号#YP_009724390.1)。

蛋白质序列(AA Met1-Gln1208(SEQ ID NO:18))，前15位为信号肽。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明。本领域技术人员可以基于本申请中的记载想到将其用于其他目的、用途或实施案例，所做修改或转用均包括在本申请的保护范围内。对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，如替换和修改，而不会偏离本申请的精神和范围。对于本申请中没有特别说明为必须元素的物质或条件，本领域技术人员可以在缺少这些元素的情况下进行尝试性实验。本申请中，“包含”、“包括”均为非限制性描述。本申请中的方法或工艺过程的步骤顺序可以进行调整，并不限于说明书或权利要求书中的顺序。本申请中的“一个”、“一种”和“所述”包括复数项。包括复数形式，除另有说明外，复数形式也包括单数形式。任何情况下，本申请的技术方案都不限于本申请中具体公开的实施例或方法；不受任何审查员或专利商标局的任何其他官员或雇员所作的任何声明的限制，除非该声明已被申请人书面明确表示全面采用。

本申请中已经对技术进行了较宽泛地、上位概念地描述，上位概念中的每个下位概念，如较详细的物种或种属也属于本发明的一部分。本申请中使用的术语或表达方式仅是为了进行描述，不产生限制作用，且所用术语或表达方式并不将与其同等意义的术语等特征部分排除在外，可以在本申请的精神范围内进行各种修改。应当理解的是，虽然本申请中已经公开了具体的优选方案和可选方案，但是，本领域技术人员依然可以对公开的技术方案进行修改或改变，这种修改或改变被认为是属于本申请权利要求书所限定的范围内的。

参考文献

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序列表

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<151> 2020-08-25

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 91

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gaaggtcttc accaacacgt gggctgtgcg catccctgga ggcccagcgg tggccaacag 60

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<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<211> 56

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

His His His His His His

1 5

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 野生型(Homo sapiens)

<400> 9

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<212> DNA

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<213> 野生型(Homo sapiens)

<400> 13

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Pro Asp Leu Ala Gly Asn Tyr Asp Pro Gly Ala Ser Phe Asp Val Asn

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Asn Lys Asn Leu Thr Trp Arg Asp Met Gln His Leu Val Val Gln Thr

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Ser Lys Pro Ala His Leu Asn Ala Asn Asp Trp Ala Thr Asn Gly Val

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Gly Arg Lys Val Ser His Ser Tyr Gly Tyr Gly Leu Leu Asp Ala Gly

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Ala Met Val Ala Leu Ala Gln Asn Trp Thr Thr Val Ala Pro Gln Arg

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Lys Cys Ile Ile Asp Ile Leu Thr Glu Pro Lys Asp Ile Gly Lys Arg

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<210> 14

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Glu Leu Arg Pro Trp Leu Leu Trp Val Val Ala Ala Thr Gly Thr

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Leu Val Leu Leu Ala Ala Asp Ala Gln Gly Gln Lys Val Phe Thr Asn

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Thr Trp

<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtgaacctga ccaccaggac ccaacttcct cctgcctaca ccaactcctt caccagggga 60

gtctactacc ctgacaaggt gttcaggtcc tctgtgctgc acagcaccca ggacctgttc 120

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tgtccatttg gagaggtgtt caatgccacc aggtttgcct ctgtctatgc ctggaacagg 1020

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tacagcacag gcagcaatgt gttccagacc agggctggct gtctgattgg agcagagcat 1920

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<210> 16

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

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Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His

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Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln

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Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

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Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

355 360 365

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

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Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

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Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

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Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

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Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

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Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn

725 730 735

Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu

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Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln

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Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val

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Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe

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Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser

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Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser

1025 1030 1035 1040

Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln

1045 1050 1055

Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala

1060 1065 1070

His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe

1075 1080 1085

Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn

1090 1095 1100

Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn

1105 1110 1115 1120

Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu

1125 1130 1135

Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly

1140 1145 1150

Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile

1155 1160 1165

Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp

1170 1175 1180

Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln His His His His His His

1185 1190 1195

<210> 17

<211> 3660

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgtttgtgt tcctggtgct gctgccactg gtgtccagcc agtgtgtgaa cctgaccacc 60

aggacccaac ttcctcctgc ctacaccaac tccttcacca ggggagtcta ctaccctgac 120

aaggtgttca ggtcctctgt gctgcacagc acccaggacc tgttcctgcc attcttcagc 180

aatgtgacct ggttccatgc catccatgtg tctggcacca atggcaccaa gaggtttgac 240

aaccctgtgc tgccattcaa tgatggagtc tactttgcca gcacagagaa gagcaacatc 300

atcaggggct ggatttttgg caccaccctg gacagcaaga cccagtccct gctgattgtg 360

aacaatgcca ccaatgtggt gattaaggtg tgtgagttcc agttctgtaa tgacccattc 420

ctgggagtct actaccacaa gaacaacaag tcctggatgg agtctgagtt cagggtctac 480

tcctctgcca acaactgtac ctttgaatat gtgagccaac cattcctgat ggacttggag 540

ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgagg gagtttgtgt tcaagaacat tgatggctac 600

ttcaagattt acagcaaaca cacaccaatc aacctggtga gggacctgcc acagggcttc 660

tctgccttgg aaccactggt ggacctgcca attggcatca acatcaccag gttccagacc 720

ctgctggctc tgcacaggtc ctacctgaca cctggagact cctcctctgg ctggacagca 780

ggagcagcag cctactatgt gggctacctc caaccaagga ccttcctgct gaaatacaat 840

gagaatggca ccatcacaga tgctgtggac tgtgccctgg acccactgtc tgagaccaag 900

tgtaccctga aatccttcac agtggagaag ggcatctacc agaccagcaa cttcagggtc 960

caaccaacag agagcattgt gaggtttcca aacatcacca acctgtgtcc atttggagag 1020

gtgttcaatg ccaccaggtt tgcctctgtc tatgcctgga acaggaagag gattagcaac 1080

tgtgtggctg actactctgt gctctacaac tctgcctcct tcagcacctt caagtgttat 1140

ggagtgagcc caaccaaact gaatgacctg tgtttcacca atgtctatgc tgactccttt 1200

gtgattaggg gagatgaggt gagacagatt gcccctggac aaacaggcaa gattgctgac 1260

tacaactaca aactgcctga tgacttcaca ggctgtgtga ttgcctggaa cagcaacaac 1320

ctggacagca aggtgggagg caactacaac tacctctaca gactgttcag gaagagcaac 1380

ctgaaaccat ttgagaggga catcagcaca gagatttacc aggctggcag cacaccatgt 1440

aatggagtgg agggcttcaa ctgttacttt ccactccaat cctatggctt ccaaccaacc 1500

aatggagtgg gctaccaacc atacagggtg gtggtgctgt cctttgaact gctccatgcc 1560

cctgccacag tgtgtggacc aaagaagagc accaacctgg tgaagaacaa gtgtgtgaac 1620

ttcaacttca atggactgac aggcacagga gtgctgacag agagcaacaa gaagttcctg 1680

ccattccaac agtttggcag ggacattgct gacaccacag atgctgtgag ggacccacag 1740

accttggaga ttctggacat cacaccatgt tcctttggag gagtgtctgt gattacacct 1800

ggcaccaaca ccagcaacca ggtggctgtg ctctaccagg atgtgaactg tactgaggtg 1860

cctgtggcta tccatgctga ccaacttaca ccaacctgga gggtctacag cacaggcagc 1920

aatgtgttcc agaccagggc tggctgtctg attggagcag agcatgtgaa caactcctat 1980

gagtgtgaca tcccaattgg agcaggcatc tgtgcctcct accagaccca gaccaacagc 2040

ccaaggaggg caaggtctgt ggcaagccag agcatcattg cctacacaat gagtctggga 2100

gcagagaact ctgtggctta cagcaacaac agcattgcca tcccaaccaa cttcaccatc 2160

tctgtgacca cagagattct gcctgtgagt atgaccaaga cctctgtgga ctgtacaatg 2220

tatatctgtg gagacagcac agagtgtagc aacctgctgc tccaatatgg ctccttctgt 2280

acccaactta acagggctct gacaggcatt gctgtggaac aggacaagaa cacccaggag 2340

gtgtttgccc aggtgaagca gatttacaag acacctccaa tcaaggactt tggaggcttc 2400

aacttcagcc agattctgcc tgacccaagc aagccaagca agaggtcctt cattgaggac 2460

ctgctgttca acaaggtgac cctggctgat gctggcttca tcaagcaata tggagactgt 2520

ctgggagaca ttgctgccag ggacctgatt tgtgcccaga agttcaatgg actgacagtg 2580

ctgcctccac tgctgacaga tgagatgatt gcccaataca cctctgccct gctggctggc 2640

accatcacct ctggctggac ctttggagca ggagcagccc tccaaatccc atttgctatg 2700

cagatggctt acaggttcaa tggcattgga gtgacccaga atgtgctcta tgagaaccag 2760

aaactgattg ccaaccagtt caactctgcc attggcaaga ttcaggactc cctgtccagc 2820

acagcctctg ccctgggcaa actccaagat gtggtgaacc agaatgccca ggctctgaac 2880

accctggtga agcaactttc cagcaacttt ggagccatct cctctgtgct gaatgacatc 2940

ctgagcagac tggacaaggt ggaggctgag gtccagattg acagactgat tacaggcaga 3000

ctccaatccc tccaaaccta tgtgacccaa caacttatca gggctgctga gattagggca 3060

tctgccaacc tggctgccac caagatgagt gagtgtgtgc tgggacaaag caagagggtg 3120

gacttctgtg gcaagggcta ccacctgatg agttttccac agtctgcccc tcatggagtg 3180

gtgttcctgc atgtgaccta tgtgcctgcc caggagaaga acttcaccac agcccctgcc 3240

atctgccatg atggcaaggc tcactttcca agggagggag tgtttgtgag caatggcacc 3300

cactggtttg tgacccagag gaacttctat gaaccacaga ttatcaccac agacaacacc 3360

tttgtgtctg gcaactgtga tgtggtgatt ggcattgtga acaacacagt ctatgaccca 3420

ctccaacctg aactggactc cttcaaggag gaactggaca aatacttcaa gaaccacacc 3480

agccctgatg tggacctggg agacatctct ggcatcaatg cctctgtggt gaacatccag 3540

aaggagattg acagactgaa tgaggtggct aagaacctga atgagtccct gattgacctc 3600

caagaactgg gcaaatatga acaatacatc aagtggccac atcatcacca ccatcactaa 3660

<210> 18

<211> 1214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu

1010 1015 1020

Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val

1025 1030 1035 1040

Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala

1045 1050 1055

Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu

1060 1065 1070

Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His

1075 1080 1085

Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val

1090 1095 1100

Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr

1105 1110 1115 1120

Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr

1125 1130 1135

Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu

1140 1145 1150

Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp

1155 1160 1165

Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp

1170 1175 1180

Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu

1185 1190 1195 1200

Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln His His His His His His

1205 1210

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gatgcgcaca gcccacgtgt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acagtgtggc acggaagcat 20

Claims

1.一种制备前融合状态的重组SARS-CoV-2刺突蛋白的方法，包括：使用CRISPR Cas9转染技术制备无法表达弗林蛋白酶但能表达 SARS-CoV-2 刺突蛋白的宿主细胞，使用的sgRNA1支架序列为：GATGCGCACAGCCCACGTGT，如SEQ ID NO:19所示和sgRNA2支架序列ACAGTGTGGCACGGAAGCAT，如SEQ ID NO:20所示；

在所述宿主细胞中表达SARS-CoV-2 刺突蛋白；

所述宿主细胞为运用CRISPR Cas9技术敲除细胞中的弗林蛋白酶基因后的HEK293细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，所述sgRNA被整合至载体中。

3.根据权利要求2所述的方法，构建的正向和反向 sgRNA 载体包含以下正向和反向sgRNA支架序列：

Vector-sgRNA1 forward: CACC-GATGCGCACAGCCCACGTGT，如SEQ ID NO:5所示；Vector-sgRNA1 reverse: AAAC-ACACGTGGGCTGTGCGCATC，如SEQ ID NO:6所示； Vector-sgRNA2 forward: CACC-ACAGTGTGGCACGGAAGCAT，如SEQ ID NO:7所示；和Vector-sgRNA2reverse: AAAC-ATGCTTCCGTGCCACACTGT ，如SEQ ID NO:8所示。

4.根据权利要求1所述的方法，还包括将载体蛋白与 SARS-CoV-2 刺突蛋白结合的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，所述载体蛋白包括脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白复合物、破伤风类毒素蛋白、白喉毒素衍生物、牛血清白蛋白、阳离子化牛血清白蛋白、Concholepasconcholepas血蓝蛋白、乙型肝炎病毒蛋白、匙孔血蓝蛋白、轮状病毒衣壳蛋白，牛乳头瘤病毒的 L1 蛋白、人乳头瘤病毒的 L1 蛋白、卵清蛋白和流感血凝素蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，所述乙型肝炎病毒蛋白为表面抗原蛋白或乙肝病毒核心抗原蛋白。

7.根据权利要求5所述的方法，所述血凝素蛋白来自血凝素 A 亚型 H1 至 H17。