CN113366016B - 抗人白细胞介素5(il-5)单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗人白细胞介素5(il-5)单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向IL‑5的抗体、其制备方法和用途。具体地，本发明公开了一种新的靶向IL‑5的鼠源或嵌合单克隆抗体。本发明还公开了制备所述的单克隆抗体的方法。本发明的单克隆抗体能够高特异性地结合IL‑5抗原，其具有很高的亲和力并且可以很好地缓解IL‑5导致的一系列哮喘症状，从而起到治疗哮喘的作用。

Description

抗人白细胞介素5(IL-5)单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种IL-5抗体及其制备方法和应用
背景技术
支气管哮喘(简称哮喘)是一种常见的慢性气道性炎症疾病，通常伴随气道反应性增高，出现反复发作的喘息、气促、胸闷和(或)咳嗽等症状。20世纪70年代以后，哮喘病广泛流行。到2011年，全球约有2.35亿至3亿人受到影响，大约有25万人因此失去生命。临床上，哮喘通常是以吸入类固醇等糖皮质激素的方式控制病情。对于病情控制不理想者，可以通过加用吸入长效β2激动剂，或缓释茶碱，或白三烯调节剂等辅助治疗。但是，约有10％的病人通过常规的治疗方式仍然无法很好地控制病情，这些病人往往需要通过口服或者静脉的方式给于病人大剂量的糖皮质激素来控制病情，而且仍然伴随着较高的死亡率，患者不仅生活质量受到巨大影响，产生的直接医疗费用和间接成本都会造成个人和社会经济的巨大负担。
近年来，有文献报道，可逆的气道梗阻导致非特异性支气管高反应性的哮喘，主要依赖于在支气管粘膜水平一种慢性炎症反应的产生，其典型特征是巨噬细胞，淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的浸润。而嗜酸性粒细胞在启动粘膜损伤的典型疾病中发挥重要的作用。嗜酸性粒细胞是人体正常白细胞中的一种，具有杀伤细菌、寄生虫的功能，也是免疫反应和过敏反应过程中极为重要的细胞。嗜酸性粒细胞可以释放颗粒中的内容物，引起组织损伤，促进炎症进展。另外，有报告称慢性哮喘患者的循环系统中支气管分泌物和肺实质中嗜酸性粒细胞均有增加。并且将血液中嗜酸性粒细胞数目的多少作为判断肺功能疾病严重程度的的重要指标。
随着对哮喘的深入研究，现认为嗜酸性粒细胞是各种炎症性疾病包括与肺组织过敏反应有关的过敏性疾病的主要发病机制。很大部分哮喘患者是由于Th2细胞过度释放可溶性细胞因子，诱导IgE的产生，导致肥大细胞，嗜酸性粒细胞脱颗粒，从而引起多种炎症细胞参与的气道过敏反应和慢性气道炎症。其中白细胞介素5(以下简称IL-5)在这个过程中起着非常重要的作用。IL-5是一种由Th2细胞及肥大细胞分泌的多效应细胞因子，是一种二硫键连接的同型二聚体糖蛋白。分子量约为24KDa，其基因位于第5号染色体上，与其他细胞因子白细胞介素3(IL-3)，白细胞介素4(IL-4)和粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)基因紧密连接。现已证实IL-5特异地作用于嗜酸粒细胞，主要调节其生长、分化、成熟、存活、激活以及从骨髓、血液、组织中释放等。
近年来，多项动物实验已经证实IL-5可导致外周血和组织中嗜酸性粒细胞数目的增加，在使用抗小鼠IL-5抗体后，嗜酸粒细胞明显减少。同时在哮喘患者的支气管肺泡灌洗洗液也发现有高浓度的IL-5。
因此，本领域亟待开发高效的IL-5抗体以惠及更多患者。
发明内容
为了克服目前缺少全人IL-5抗体及现有IL-5抗体在活性方面的缺点，本发明提供一种亲和力高、特异性强的IL-5抗体及其制备方法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO：10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO：10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO：10n+5所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、或4；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留IL-5结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO：10n+1所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、或4。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明的第一方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源或鼠源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG4恒定区。
在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO：10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO：10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO：10n+10所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、或4；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留IL-5结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：10n+6所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、或4。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明的第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源或鼠源的。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如本发明的第二方面所述的重链；和/或如本发明的第四方面所述的轻链，
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留IL-5结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列，并且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所构成的衍生抗体能够保留与IL-5结合的亲和力。
在另一优选例中，所述的衍生抗体与IL-5结合的亲和力F1与相应非衍生的抗体与IL-5结合的亲和力F0之比(FI/F0)为0.5-2，较佳地为0.7-1.5，和更佳地0.8-1.2。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。
在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留IL-5结合亲和力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少96％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG4恒定区，且所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的嵌合抗体在人中的免疫原性Z1与非嵌合的抗体(如鼠源抗体)在人中的免疫原性Z0之比(Z1/Z0)为0-0.5，较佳地0-0.2，更佳地0-0.05(如0.001-0.05)。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在另一优选例中，所述抗体具有选自下组的一个或多个特性：
(a)抑制哮喘的发生和/或发展；
(b)缓解哮喘症状。
在另一优选例中，所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区；
其中，所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR：
Figure GPA0000306333090000061
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留IL-5结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区；其中，
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO：3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO：4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO：5所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO：8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO：9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO：10所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO：13所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO：14所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO：15所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO：18所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO：19所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO：20所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO：23所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO：24所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO：25所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO：28所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO：29所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO：30所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO：33所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO：34所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO：35所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO：38所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO：39所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO：40所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO：43所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO：44所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO：45所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO：48所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO：49所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO：50所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO：1、11、21、31、或41所示的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO：6、16、26、36、或46所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体选自下组：
抗体编号 克隆 VH序列编号 VL序列编号
1 147D7H2 1 6
2 102A2E11B6 11 16
3 69F2F3 21 26
4 154F10G8 31 36
5 151G3B11 41 46。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO：1、11、21、31、或41所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO：6、16、26、36、或46所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：
(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述重组蛋白包括：
(i)选自下组的抗体，
抗体编号 克隆 VH序列编号 VL序列编号
1 147D7H2 1 6
2 102A2E11B6 11 16
3 69F2F3 21 26
4 154F10G8 31 36
5 151G3B11 41 46
以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及
(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO：2、12、22、32、或42所示；和/或，编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO：7、17、27、37、或47所示。
在另一优选例中，编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组：
Figure GPA0000306333090000091
在本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在本发明的第十方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在本发明的第十一方面，提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明的第五方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第十二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在本发明的第十三方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗与IL-5表达或功能异常相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述IL-5表达或功能异常相关的疾病选自下组：哮喘、特异性皮炎、炎症疾病。
在另一优选例中，所述炎症疾病为慢性阻塞性肺病。
在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于：
(1)检测样品中IL-5蛋白；和/或
(2)检测细胞中内源性的IL-5蛋白；和/或
(3)检测表达IL-5蛋白的细胞；
而所述药物用于预防和/或治疗与IL-5表达或功能异常相关的疾病，所述与IL-5表达或功能异常相关的疾病为哮喘、特异性皮炎、炎症疾病。
在另一优选例中，所述炎症疾病为慢性阻塞性肺病。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断IL-5相关疾病。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于检测样品中IL-5蛋白。
在本发明的第十四方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中IL-5蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明的第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在IL-5蛋白。
在本发明的第十五方面，提供了一种体外检测样品中IL-5蛋白的组合物，其包括如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合作为活性成分。
在本发明的第十六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合。
在本发明的第十七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明抗体的二抗；
或者，
所述试剂盒含有如本发明的第十六方面所述的检测板。
在本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明的第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明的第五方面所述的抗体或如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十九方面，提供了一种药物组合，包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分包括如本发明的第五方面所述的抗体1、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括第二抗体、或化疗剂。
在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：IL-13抗体、IL-4抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体为IL-13抗体。
在另一优选例中，所述化疗剂选自下组：多西他赛、卡铂、或其组合。
在本发明的第二十方面，提供了本发明的第五方面所述的抗体，或本发明的第六方面所述的重组蛋白、或本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或本发明的第十一方面所述的免疫细胞、和/或本发明的第十二方面所述的药物组合物与第二抗体或化疗剂的组合在制备用于治疗IL-5表达或功能异常相关的疾病的药物中的用途。
在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：IL-13抗体、IL-4抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体为IL-13抗体。
在本发明的第二十一方面，提供了一种治疗与IL-5表达或功能异常相关的疾病的方法，向有需要的对象施用有效量的如本发明的第五方面所述的抗体、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合。
在另一优选例中，所述与IL-5表达或功能异常相关的疾病为哮喘、特异性皮炎、炎症疾病。
在另一优选例中，所述炎症疾病为慢性阻塞性肺病。
在另一优选例中，所述的方法还包括：在施用第一活性成分之前、之中和/或之后，向所述对象施用安全有效量的第二抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体选自下组：IL-13抗体、IL-4抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体为IL-13抗体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了重组IL-5蛋白的生物学活性。
图2显示了ELISA检测重组IL-5蛋白免疫后小鼠血清抗体效价。
图3显示了ELISA(酶联免疫吸附实验)中IL-5抗体与人IL-5反应活性。
图4显示了ELISA(酶联免疫吸附实验)中IL-5抗体与猴IL-5反应活性。
图5显示了ELISA(酶联免疫吸附实验)中IL-5抗体与鼠IL-5反应活性。
图6显示了流式细胞分析方法检测CHOK1重组细胞系IL5Ra/CSF2RB蛋白的表达水平。
图7显示了流式细胞分析方法检测IL-5抗体阻滞IL-5与细胞表面受体IL-5Ra的结合。
图8显示了IL-5抗体中和IL-5刺激CTLL-2的增殖实验。
图9显示了IL-5抗体中和IL-5刺激TF-1的增殖实验。
图10显示了IL-5抗体与人IL-5亲和力检测试验。
图11显示了ELISA(酶联免疫吸附实验)中IL-5嵌合抗体与人IL-5反应活性。
图12显示了ELISA(酶联免疫吸附实验)中IL-5嵌合抗体与猴IL-5反应活性。
图13显示了ELISA(酶联免疫吸附实验)中IL-5嵌合抗体与鼠IL-5反应活性。
图14显示了流式细胞分析方法检测IL-5嵌合抗体阻滞IL-5与细胞表面受体IL-5Ra的结合。
图15显示了IL-5嵌合抗体中和IL-5刺激CTLL-2的增殖实验。
图16显示了IL-5嵌合抗体中和IL-5刺激TF-1的增殖实验。
图17显示了IL-5嵌合抗体与人IL-5亲和力检测试验。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，以人源IL-5作为免疫原，采用优化的杂交瘤技术制备了一组与IL-5结合的特异性单克隆鼠源抗体。通过分子生物学方法，测定可变区部分的DNA和氨基酸序列。并将该类鼠源抗体可变区与人源抗体恒定区组合为鼠-人嵌合抗体分子，或者通过人源化技术转变为人源化抗体分子，或者根据特定用途构建成其它分子形式如双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体、单片段抗体等。这些抗体能够结合人IL-5蛋白并能够抑制IL-5与其受体IL-5Ra亚基结合。在抗体中和IL-5刺激CTLL-2和TF-1增殖实验中，这些抗体表现出良好的生物学活性。本发明通过抗IL-5抗体发挥抑制IL-5对嗜酸粒细胞增值和分化的作用，可以很好地缓解IL-5导致的一系列哮喘症状，从而起到治疗哮喘的作用。尤其是针对严重哮喘起到辅助常规治疗方式甚至替代常规疗法的治疗作用。此外，本发明还提供了这些抗体的用途，包括但不仅限于中和IL-5，以减少嗜酸性粒细胞的分化和增殖，即减少嗜酸性粒细胞的积累和浸润等哮喘症状，单独或与其他抗哮喘抗体联合应用用于哮喘的治疗，以及相关的哮喘患者的诊断等用途。在此基础上完成了本发明。
术语
本发明中，“VH-CDR1”与“CDR-H1”可互换使用，均指重链可变区的CDR1；“VH-CDR2”与“CDR-H2”可互换使用，均指重链可变区的CDR2；“VH-CDR3”与“CDR-H3”可互换使用，均指重链可变区的CDR3。“VL-CDR1”与“CDR-L1”可互换使用，均指轻链可变区的CDR1；“VL-CDR2”与“CDR-L2”可互换使用，均指轻链可变区的CDR2；“VL-CDR3”与“CDR-L3”可互换使用，均指轻链可变区的CDR3。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397，在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表23进行氨基酸替换而产生。
表23
Figure GPA0000306333090000151
Figure GPA0000306333090000161
抗IL-5的抗体
本发明中，所述抗体(本发明抗体)为抗IL-5的抗体。本发明提供一种针对IL-5的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
优选地，
所述的重链可变区(VH)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO：10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO：10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO：10n+5所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、或4；
所述的轻链可变区(VL)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO：10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO：10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO：10n+10所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、或4；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留IL-5结合亲和力的衍生序列。
优选地，重链可变区(VH)包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO：10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO：10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO：10n+5所示的VH-CDR3；
轻链可变区(VL)包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO：10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO：10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO：10n+10所示的VL-CDR3；
各n独立地为0、1、2、3、或4；较佳地n为0或1；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留IL-5结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing：Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
本发明中的抗体可以是全长蛋白(如IgG1，IgG2(例如IgG2a，IgG2b或者IgG2c)，IgG3或者IgG4)，也可以是包含抗原抗体结合域的蛋白片段(例如Fab，F(ab’)，sdAb，ScFv片段)。本发明中的抗体可以是野生型蛋白，也可以是经过特定突变已达到某种特定效果的突变型蛋白，例如利用突变消除抗体的效应子功能等。
较佳地，本文所述抗体为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(singledomain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向IL-5(例如人IL-5)的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO：1、11、21、31、或41所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO：6、16、26、36、或46所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述靶向IL-5的抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列，和/或，轻链可变区氨基酸序列如下表24所示：
表24
抗体编号 VH序列编号 VL序列编号
1 1 6
2 11 16
3 21 26
4 31 36
5 41 46。
在另一优选例中，所述靶向IL-5的抗体为147D7H2、102A2E11B6、69F2F3、154F10G8、151G3B11、100F4E11B3、144D3C4A5、90F9G10H2、136E11F2、128G11B3。
在另一优选例中，所述靶向IL-5的抗体为147D7H2。
在另一优选例中，所述靶向IL-5的抗体为102A2E11B6。
重组蛋白
本发明还提供一种重组蛋白，其包括IL-5抗体的重链CDR1(VH-CDR1)、重链CDR2(VH-CDR2)和重链CDR3(VH-CDR3)中的一种或多种，和/或，IL-5抗体的轻链CDR1(VL-CDR1)、轻链CDR2(VL-CDR2)和轻链CDR3(VL-CDR3)中的一种或多种，
所述重链CDR1-3的序列如下：
SEQ ID NO：10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO：10n+4所示的VH-CDR2，
SEQ ID NO：10n+5所示的VH-CDR3；
所述轻链CDR1-3的序列如下：
SEQ ID NO：10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO：10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO：10n+10所示的VL-CDR3；
各n独立地为0、1、2、3、或4；较佳地n为0或1；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留IL-5结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括IL-5抗体的重链可变区和/或IL-5抗体的轻链可变区，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO：1、11、21、31、或41所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO：6、16、26、36、或46所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括IL-5抗体的重链可变区和IL-5抗体的轻链可变区，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO：1、11、21、31、或41所示的氨基酸序列，且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO：6、16、26、36、或46所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重组蛋白及其包括的重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号如表25所示：
表25重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号
Figure GPA0000306333090000191
Figure GPA0000306333090000201
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留IL-5结合亲和力的衍生序列。
较佳地，所述的重组蛋白还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区，更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区，更佳地为人源抗体轻链恒定区。
所述的重组蛋白为本领域常规的蛋白质，较佳地，其为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)、单域抗体(single domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domainantibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)。
所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。
所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。
其中，所述重组蛋白的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述重组蛋白。
核酸
本发明还提供一种核酸，其编码上述的抗体(例如抗IL-5的抗体)或重组蛋白或抗IL-5的抗体的重链可变区或轻链可变区。
较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2、12、22、32、或42所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：7、17、27、37、或47所示。
更佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2、12、22、32、或42所示；且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：7、17、27、37、或47所示。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
载体
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3，6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1，4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1，3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：
Ab-(LU-D)p
其中：
Ab是抗体，
LU是接头；
D是药物；
而且下标p是选自1到8的值。
应用
本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。
较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗与IL-5表达或功能异常相关的疾病的药物。
本发明中，所述与IL-5表达或功能异常相关的疾病是本领域常规的与IL-5表达或功能异常相关的疾病。较佳地，所述与IL-5表达或功能异常相关的疾病为哮喘、特异性皮炎、慢性阻塞性肺病等炎症疾病。
本发明中，所述哮喘为本领域常规的哮喘，较佳地为嗜酸粒细胞性哮喘。本发明中，所述特异性皮炎疾病为本领域常规的特异性皮炎疾病，较佳地为外源性特异性皮炎或内源性特异性皮炎。本发明中，所述慢性阻塞性肺病为本领域常规的慢性阻塞性肺病，较佳地为慢性支气管炎。
本发明抗体、ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，包括(但并不限于)：
(i)诊断、预防和/或治疗哮喘发生、和/或发展，尤其是IL-5高表达的哮喘。所述哮喘包括(但并不限于)：嗜酸粒细胞性哮喘。
(ii)诊断、预防和/或治疗特异性皮炎，所述特异性皮炎包括(但并不限于)：外源性特异性皮炎或内源性特异性皮炎。
(iii)诊断、预防和/或治疗慢性阻塞性肺病，所述慢性阻塞性肺病包括(但并不限于)：慢性支气管炎。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如哮喘患者的体液样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与IL-5表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。
本发明的药物组合物可直接用于结合IL-5蛋白分子，因而可用于预防和治疗哮喘等疾病。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗与IL-5表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用。较佳地，所述与IL-5表达或功能异常相关的疾病为哮喘、特异性皮炎、慢性阻塞性肺病等炎症疾病。
检测样品中IL-5蛋白的方法、组合物
本发明还提供一种检测样品中IL-5蛋白(例如检测过表达IL-5细胞)的方法，包括如下的步骤：上述的抗体与待检样品在体外接触，检测上述的抗体与所述待检样品是否结合形成抗原-抗体复合物即可。
所述的过表达的含义为本领域常规，指IL-5蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。
本发明中，上述是否结合形成抗原-抗体复合物的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为流式细胞实验(FACS)检测。
本发明提供一种检测样品中IL-5蛋白的组合物，其包括上述的抗体、重组蛋白、抗体偶联物、免疫细胞、或其组合作为活性成分。较佳地，其还包括上述的抗体的功能片段组成的化合物作为活性成分。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的主要优点在于：
本发明利用杂交瘤技术，筛选出了一组与IL-5结合的鼠源全长抗体。以上这些抗体可变区可用常规分子生物学方法进行氨基酸和DNA测序。所有可变区均含有CDR1，CDR2，CDR3三个互补决定区或高变区。杂交瘤得到的鼠源抗体可与人源抗体恒定区组合为鼠-人嵌合抗体。该组抗体或抗原结合片段具有一系列优异的特性，包括结合人IL-5蛋白的高亲和力和高特异性，有效阻滞IL-5与其受体结合，中和IL-5刺激CTLL-2和TF-1的增殖等。具体特性包括：
(1)与人IL-5蛋白具有高度亲和力，其解离常数通常小于5x10-10；
(2)与人和猴(食蟹猴)IL-5有较强的结合能力；部分抗体对小鼠IL-5同样有较强的结合能力；
(3)经受体配体结合阻滞实验证实，能明显阻滞IL-5与其受体结合；
(4)在抗体中和IL-5刺激CTLL-2增殖实验中，能明显中和IL-5的活性，抑制细胞增殖；其中抗体在10-11M浓度下即有明显的抑制效果。
(5)在抗体中和IL-5刺激TF-1增殖实验中，能明显中和IL-5的活性，抑制细胞增殖。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件(例如商品说明书)。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10～30℃。
实施例1：重组人IL-5的表达与纯化
用PCR法，将编码人IL-5蛋白氨基酸序列(NP_000870.1)Met1-Ser134的DNA片段的3’端加入编码六个组氨酸的DNA，将得到的编码his标签重组人IL-5蛋白的DNA片段通过分子生物学方法克隆到表达载体中。利用大肠杆菌进行扩增，碱裂解法抽提纯化质粒，将表达质粒通过瞬时转染的方法，利用昆虫细胞SF21进行重组蛋白的表达。经过5-7天的培养之后，离心过滤，收集细胞培养上清。通过Ni-NTA亲和层析法纯化上清中带有His标签的重组人IL-5蛋白，再使用分子筛柱进一步纯化，除去大分子聚合体等杂质。纯化后的蛋白保存在PBS缓冲液中，经0.22微米无菌过滤后分装-80℃保存。蛋白样品使用前须经一系列质控检测，包括蛋白浓度、纯度、分子量、生物活性等。重组人IL-5蛋白的生物学活性通过实验来检测。部分实验结果见表1，图1。
表1 TF-1细胞增殖实验检验重组人IL-5蛋白的生物学活性
Figure GPA0000306333090000281
Figure GPA0000306333090000291
表1说明，重组人IL-5蛋白可以刺激TF-1细胞增殖，且重组人IL-5蛋白所具有的生物学活性与商业化蛋白的生物学活性基本一致。其中，IL-5(Peprotech)指商业化的IL-5蛋白，购自Peprotech，作为阳性对照；IL-5(CP-20161104)即为上述重组人IL-5蛋白。
实施例2：利用杂交瘤技术制备抗人IL-5抗体
2.1小鼠免疫采用的是用重组人IL-5蛋白免疫
蛋白免疫采用的是6-8周龄的Balb/c，SJL/J小鼠(上海斯莱克提供)。小鼠接收后在SPF条件下饲养。初次免疫剂量为每只小鼠50微克重组人IL-5蛋白。将蛋白用弗氏完全佐剂乳化后尾部皮下注射0.25毫升。初次免疫2周后，加强免疫。重组人IL-5蛋白(每只小鼠25微克蛋白)用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升。以后每次加强免疫间隔3周。每次加强免疫一周后采集血清样品，用ELISA检测血清中抗体效价并用受体配体结合阻滞实验检测血清中抗体的活性。血清效价较高且可以更好阻滞IL-5与受体结合的小鼠将优先选择用于细胞融合和杂交瘤细胞制备，剩余小鼠继续加强免疫备用。部分实验结果见图2和表2所示。
表2 ELISA检测免疫原重组人IL-5蛋白免疫后小鼠血清抗体效价
Figure GPA0000306333090000292
表2说明，经重组人IL-5蛋白免疫的小鼠的血清对重组人IL-5蛋白均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应。其中，血清的最高稀释度(即稀释倍数)在十万左右。表2中空白对照指1％(w/w)BSA，批次TB2指第二次加强免疫后第七天的小鼠血清，表中的数据为OD450nm值。
2.2杂交瘤细胞的制备和抗体筛选
通常大部分小鼠经2-3次免疫后效价可达到1∶1000以上，即可用于收集淋巴细胞进行细胞融合和杂交瘤制备。细胞融合前，小鼠最后一次免疫用每只50-100微克重组人IL-5蛋白腹腔注射。3-5天后处死小鼠，收集脾细胞。加入NH4OH至终浓度1％以裂解脾细胞悬液中的红细胞，用DMEM基础培养基离心清洗细胞2-3次，然后按5∶1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，采用传统的PEG细胞融合方法或高效电融合方法进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清、1×HAT的DMEM选择性培养基中，按1×105/20微升每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％CO2、37℃培养箱中。10-14天后用ELISA筛选细胞融合板上清，阳性克隆扩增到24孔板扩大培养，2-3天后对24孔板上清复检，包括利用ELISA检测上清中的抗体对人IL-5蛋白的结合活性、检测上清中的抗体阻滞人IL-5与受体结合活性以及利用上清中的抗体中和IL-5刺激CTLL-2增殖实验检验其与人IL-5的生物学活性。
根据24孔板样品的二次筛选结果，选择阳性克隆用有限稀释法在96孔板进行亚克隆。亚克隆后7-10天用ELISA进行初步筛选，挑选3-4个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。2-3天后对上清按照亚克隆之间的检验方法进行复检，包括ELISA，受体配体结合阻滞实验，上清中的抗体中和IL-5刺激CTLL-2增殖实验。根据24孔板样品检测结果，挑选最优亚克隆进行扩大培养、液氮冻存、抗体生产和纯化。
2.3杂交瘤抗体的初步生产和纯化
本发明将杂交瘤细胞扩增并用生产培养基(Hybridoma serum free medium，Invitrogen)驯化后，接种细胞培养转瓶。每个2升的培养转瓶加入200-500毫升生产培养基，接种细胞密度为0.5-1.0×105/毫升。接种细胞密度有时需要根据细胞生长状态进行适当调整。按无菌操作接种细胞后，将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上，连续旋转培养10-14天后，收集细胞培养液，去除细胞并过滤澄清。处理后的细胞培养上清可马上进行纯化或-30℃冻存。
杂交瘤细胞培养上清中的单克隆抗体可用蛋白G(Protein G)亲和层析柱进行纯化。根据样品量的大小，准备相应体积的层析柱。对于200-300毫升的小体积纯化，需要1-2毫升蛋白G柱。蛋白G柱先用平衡缓冲液(PBS，pH7.2)平衡，然后将培养上清加到层析柱。上样完毕，用平衡缓冲液清洗层析柱以去除未结合的其它蛋白。结合在柱上的抗体用0.1M，pH2.5甘氨盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱的抗体(紫外吸收峰)。加入10％体积的1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH，然后立即用PBS透析。透析后的抗体，用0.22微米的滤器过滤除菌，无菌分装保存。取小样进行蛋白浓度、纯度、内毒等检测分析。内毒素(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，是抗体纯化过程中常见的杂质，对很多体外体内生物学实验均有潜在影响。因而抗体纯化过程需严格控制内毒素的污染，且最终产品内毒素浓度要尽可能控制在1.0EU/mg以内。部分结果见表3。
表3抗体检测分析
Figure GPA0000306333090000301
Figure GPA0000306333090000311
实施例3：先导抗体的检定
3.1抗原结合实验：
抗体与人IL-5蛋白反应的效价，与鼠、猴IL-5蛋白的交叉反应等将通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测分析。将链霉亲和素用PBS稀释到终浓度1.0μg/ml，然后按照100微升每孔加到96孔酶标板。4℃孵育过夜；第二天用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2次，加入封闭液(PBS+0.05％Tween20+2％BSA)37℃封闭1-2小时；弃去封闭液，将生物素标记的人IL-5用样品稀释液(PBS+0.05％Tween20+0.2％BSA)稀释至0.5μg/ml，按照每孔50-100微升加入酶标板，37℃孵育1小时；用洗板液(PBS+0.05％Tween20)洗板2-3次；加入待测抗体样品每孔50-100微升，37℃孵育1小时后，用洗板液(PBS+0.05％Tween20)洗板2-3次；加入辣根过氧化物酶标记的抗人或小鼠IgG二抗，37℃反应1小时后，用洗板液(PBS+0.05％Tween20)洗板2-3次；加入TMB底物100微升每孔，室温孵育15分钟后，加入终止液(1.0NHCl)50微升每孔。用ELISA读板机(SpectraMax M5e，Molecular Device)读取O.D.450nm值。部分实验结果见图3～5和表4～6所示。
表4 ELISA检测先导抗体与人IL-5的结合活性
Figure GPA0000306333090000312
Figure GPA0000306333090000321
表5 ELISA检测先导抗体与猴IL-5的结合活性
Figure GPA0000306333090000322
表6 ELISA检测先导抗体与鼠IL-5的结合活性
Figure GPA0000306333090000323
表4～6说明，先导抗体与重组人IL-5蛋白，重组猴IL-5在ELISA水平结合。部分先导抗体与小鼠IL-5在ELISA水平结合。其中mIgG对照为鼠IgG，表中的数据为OD450nm值。
3.2生物学功能分析
3.2.1稳定表达细胞株的构建：
人IL-5Ra和CSF2RB链全长基因序列被克隆到pIRES表达载体上，并包装成慢病毒(上海吉玛)。同时使用包含表达人IL-5Ra和CSF2RB链基因的慢病毒感染CHOK1细胞，之后将细胞在含筛选抗生素的培养基中培养，2周后，用有限稀释法将感染后的细胞亚克隆到96孔培养板中。待克隆长大后，将单克隆孔细胞扩增到6孔板中或培养瓶中。对扩增后的克隆用抗每种受体对应的特异性抗体经流式细胞分析法检测受体表达水平，及与配体IL-5蛋白的结合能力。选择长势较好、表达水平较高、结合强的单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存。用表达人IL-5Ra和CSF2RB链的病毒颗粒感染CTLL-2细胞，按照同样的方法筛选选择长势较好、表达水平较高、结合强的单克隆的细胞系扩大培养并于液氮中保存。部分结果见图6、表7。
表7流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-5Ra的CHOK1细胞株中IL-5Ra蛋白的表达水平
Figure GPA0000306333090000331
表7的结果说明，CHOK1细胞表达IL-5Ra受体，且细胞表面受体表达量均较高，可以用作后续试验使用
3.2.2利用流式细胞技术的受体配体结合阻滞实验：
将过表达全长人IL-5Ra/CSF2RB的CHOK1细胞株在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度，弃去培养基，用PBS洗涤1-2次，然后用重组酶细胞解离液(TrypLE：Lifetechnology)消化并收集细胞；用PBS缓冲液洗涤细胞1-2次，进行细胞计数后将细胞用封闭液(PBS，2％胎牛血清)稀释至1-2×106细胞每毫升，冰上孵育20-30分钟，然后用封闭液(PBS，2％胎牛血清)洗涤2次。将收集的细胞用封闭液(PBS，2％胎牛血清)悬浮至1×106细胞/ml，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中(每孔1×105细胞)，将梯度稀释的待测抗体样品或者培养上清与生物素标记的IL-5(终浓度为hIL-5Ra1/hIL-4Ra：30ng/ml；hIL-5Ra2：20ng/ml)混合后，按照每孔100微升加入细胞中，冰上孵育1-2小时。用封闭液(PBS，2％胎牛血清)离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa 488)标记的链霉亲和素，冰上孵育0.5-1.0小时。用封闭液(PBS，2％胎牛血清)离心洗涤2-3次，加入每孔100微升PBS悬浮细胞，用FACS(FACS Verse，BD)检测和分析结果。部分结果见图7、表8。
表8 FACS检测检测先导抗体阻滞IL-5与细胞表面受体IL-5Ra的结合
Figure GPA0000306333090000332
Figure GPA0000306333090000341
表8说明，IL-5抗体与人IL-5结合后，能阻滞人IL-5与细胞表面的受体IL-5Ra的结合，其中mIgG对照为鼠IgG，表格中数据为平均荧光强度。
3.2.3抗体中和IL-5刺激CTLL-2增殖实验：
将过表达全长人IL-5Ra/CSF2RB的CTLL-2细胞(ATCC)培养在含有10％胎牛血清1640培养基(Gibco)中(RPMI1640+10％FBS+2mM L-Glutamine+1mM Sodium Pyruvate+10ng/ml IL2+1.5ug/mL puromycin+200ug/mL Hygromycin)，待其在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度时，离心弃去培养基并收集细胞。将收集到的细胞重悬与2％胎牛血清1640培养基(Gibco)中(RPMI1640+2％FBS+2mM L-Glutamine+1mM Sodium Pyruvate)，计数后将细胞稀释至2×105细胞每毫升，按照每孔细胞50微升加到96孔细胞培养板中(每孔1×104细胞)，将培养板置于37℃，5％CO2培养箱。将梯度稀释的待测抗体或者培养上清与IL-5(终浓度为5ng/ml)混合后加入细胞培养板放在37℃，5％CO2培养箱培养。48小时后，细胞培养板每孔加入50微升Cell Titer-Glo试剂(Promega)，用酶标仪检测相对发光强度。部分结果见图8、表9。
表9先导抗体中和IL-5刺激CTLL-2细胞增殖
Figure GPA0000306333090000342
表9说明，先导抗体通过与人IL-5的结合，能够中和由IL-5刺激条件下诱导CTLL-2细胞的增殖。表9的数据为细胞培养板中测得的ATP的相对光单位值，其中mIgG对照为鼠IgG。
3.2.4抗体中和IL-5刺激TF-1增殖实验：
将内源性表达人IL-5Ra/CSF2RB的TF-1细胞(ATCC)培养在含有10％胎牛血清1640培养基(Gibco)中(RPMI1640+10％FBS)，待其在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度时，离心弃去培养基并收集细胞。用PBS洗涤3次。将收集到的细胞重悬于2％胎牛血清1640培养基(Gibco)中(RPMI1640+2％FBS)，计数后将细胞稀释至2×105细胞每毫升，按照每孔细胞50微升加到96孔细胞培养板中(每孔1×104细胞)，将培养板置于37℃，5％CO2培养箱。将梯度稀释的待测抗体或者培养上清与IL-5(终浓度为5ng/ml)混合后加入细胞培养板放在37℃，5％CO2培养箱培养。48小时后，细胞培养板每孔加入50微升Cell Titer-Glo试剂(Promega)，用酶标仪检测相对发光强度。部分结果见图9、表10。
表10先导抗体中和IL-5刺激TF-1细胞增殖
Figure GPA0000306333090000351
表10说明，先导抗体通过与人IL-5的结合，能够中和由IL-5刺激条件下诱导TF-1细胞的增殖。表10的数据为细胞培养板中测得的ATP的相对光单位值，其中mIgG对照为鼠IgG。
实施例4：轻重链可变区氨基酸序列测定
总RNA抽提：将经过筛选选定的先导抗体所对应的杂交瘤细胞株复苏，培养，通过离心搜集1-5×107细胞。在细胞沉淀加入1毫升Trizol，反复吹打以裂解细胞，将细胞裂解液转移到1.5毫升离心管中，室温静置5分钟；加0.2毫升氯仿，振荡15秒，静置2分钟后于4℃，12,000g离心10分钟，将上层水层液体转移到新的1.5毫升离心管中；加入0.5毫升异丙醇，混匀，室温静置10分钟后于4℃，12,000g离心15分钟，收集沉淀，用1毫升75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，离心后，小心吸去上清并晾干，用适量的DEPC处理过的H2O溶解(55℃水浴促溶10分钟)RNA沉淀，用光吸收法测定RNA浓度。
逆转录与PCR：取1微克总RNA，加入dNTP、缓冲液、逆转录酶等配置成20μl反应体系，于42℃反应60分钟，再于70℃反应10分钟以灭活逆转录酶。取1微升逆转录产物(cDNA)加入引物25pmol、1微升DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs配置等成50微升PCR体系；设置PCR程序，预变性95℃ 3分钟，变性95℃，30秒，退火55℃，30秒，延伸72℃，35秒，35个循环后再额外于72℃延伸5分钟。
克隆与测序：取5微升PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化；进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μl，缓冲液1μl，反应体系10μl，于16℃反应半小时；取5微升连接产物加入100微升的感受态细胞中，冰浴5分钟，而后于42℃水浴热激1分钟，放回冰上1分钟后加入650微升无抗生素SOC培养基，于37℃摇床上以200RPM的速度复苏30分钟，取出200微升涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养；次日，使用T载体上引物M13F和M13R配置30微升PCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μl点于另一块含抗生素的LB固体培养皿上以保存菌株；PCR反应结束后，取出5微升进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序。
测序结果见附录中本发明序列信息。
实施例5：抗体亲和力检测试验
将人抗原IL-5固定在CM5芯片表面至150-200RU的过程如下：用新鲜配置的1∶1的50mM NHS和200mM EDC的混合物活化200sec，用10mM NaOAc(pH5.0)将抗原IL-5稀释至1ug/ml，以10ul/min的流速捕获到芯片上约1min。剩余的活化位点用1M乙醇胺封闭。然后将待测抗体稀释至不同浓度(0，12.5，25nM)，分别以30ul/min的流速流经芯片表面。结合时间180s，解离时间1200s。在每个循环结束后，芯片表面用10mM，PH1.5的Glycine进行再生。动力学速率常数需减去空白对照，用global fit分析方法1∶1结合模型进行数据拟合。解离平衡速率常数(KD)用以下公式计算：KD＝kd/ka。部分结果见表11，图10。
表11抗体与人IL-5亲和力检测结果
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
69F2F3 3.678E+05 8.143E-06 2.214E-11
102A2E11B6 3.691E+05 2.324E-05 6.297E-11
100F4E11B3 1.259E+05 1.237E-04 9.824E-10
144D3C4A5 4.262E+05 1.429E-05 3.35E-11
90F9G10H2 1.601E+05 ＜1E-05 ＜1/1.601E-10
136E11F2 3.655E+05 ＜1E-05 ＜1/3.655E-10
147D7H2 1.985E+05 ＜1E-05 ＜1/1.985E-10
151G3B11 4.864E+05 9.037E-06 1.858E-11
128G11B3 2.869E+05 ＜1E-05 ＜1/2.869E-10
154F 10G8 4.221E+05 6.650E-05 1.576E-10
表11表明先导抗体与人IL-5有较强的亲和力。
实施例6：鼠-人嵌合抗体的构建、抗体的生产和纯化
质粒构建与准备：将杂交瘤抗体重链可变区序列克隆到包含信号肽和人源重链抗体IgG4恒定区的pCP表达载体当中，将轻链可变区重组到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达pCP载体当中，并经测序验证。使用碱裂解法试剂盒中量抽提高纯度质粒，经0.22μm滤膜过滤，供转染使用。
细胞转染：使用Freestyle 293F细胞，培养基为Freestyle 293 expressionmedium，使用时添加10％F68指终浓度0.1％。转染时将细胞密度培养至每毫升1-1.5×106细胞；摇床设置为37℃，130RPM，8％CO2浓度。取5毫升培养基和PEI混匀(200μg/ml)，取5毫升培养基和一定量质粒混匀(质粒用量为100μg/ml)，5min后合并混匀，静置15分钟；缓缓加到细胞中，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入摇床培养；第二天加入蛋白胨(sigma)至终浓度为0.5％；第5～7天，测培养液抗体效价，第6～7天，离心(3500RPM，30min)、过滤收集上清以供纯化。
抗体纯化：对于连续生产的无内毒素的层析柱和Protein A填料，使用0.1M NaOH处理30min或者5个柱体积0.5M NaOH冲洗；对于长期未使用的柱料和层析柱至少使用1MNaOH浸泡1h，用无内毒的水冲洗至中性，用10倍柱体积的1％Triton X100对柱料清洗。使用5个柱体积的PBS进行平衡，将过滤好的细胞上清上柱，必要时收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱体积PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并用1/10体积的pH8.5的1M Tris-HCl(1.5M NaCl)中和。收获抗体后，在1×PBS中透析过夜，避免内毒素污染。透析结束后，使用分光光度或试剂盒测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒检测抗体内毒素含量。部分结果见表12。
表12嵌合抗体检测分析
Figure GPA0000306333090000371
实施例7：鼠-人嵌合抗体的检定
7.1与抗原结合实验
嵌合抗体与人IL-5蛋白反应的效价，与鼠、猴IL-5蛋白的交叉反应等将通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测分析实验过程与实施例4.1相同，详细过程见3.1。部分实验结果见图11～13和表13～15所示。
表13 ELISA检测嵌合抗体与人IL-5的结合活性
Figure GPA0000306333090000381
表14 ELISA检测先导抗体与猴IL-5的结合活性
Figure GPA0000306333090000382
表15 ELISA检测先导抗体与鼠IL-5的结合活性
Figure GPA0000306333090000383
表13～15说明，嵌合抗体与重组人IL-5蛋白，重组猴IL-5在ELISA水平结合。部分嵌合抗体与小鼠IL-5在ELISA水平结合。其中hIgG对照为人IgG，表中的数据为OD450nm值。
7.2生物学功能分析
7.2.1受体配体结合阻滞实验
该实验利用流式细胞技术，检测IL-5嵌合抗体阻滞生物素化标记的IL-5与过表达全长人IL-5Ra/CSF2RB的CHOK1细胞株表面的受体IL-5Ra异原二聚体的结合。详细步骤同3.2.2。部分结果见图14、表16。
表16 FACS检测检测先导抗体阻滞IL-5与细胞表面受体IL-5Ra的结合
Figure GPA0000306333090000384
Figure GPA0000306333090000391
表16说明，人-鼠嵌合抗体与人IL-5结合后，能阻滞人IL-5与细胞表面的受体IL-5Ra的结合，其中hIgG对照为人IgG，表格中数据为平均荧光强度。
7.2.2嵌合抗体中和IL-5刺激CTLL-2增殖实验
嵌合抗体中和IL-5刺激CTLL-2增殖实验是IL-5嵌合抗体阻滞IL-5与其受体的结合，中和IL-5刺激过表达全长人IL-5Ra/CSF2RB的CTLL-2细胞株。详细过程见4.2.3。部分结果见图15、表17。
表17嵌合抗体中和IL-5刺激CTLL-2细胞增殖
Figure GPA0000306333090000392
表17说明，嵌合抗体通过与人IL-5的结合，能够中和由IL-5刺激条件下诱导CTLL-2细胞的增殖。表17的数据为细胞培养板中测得的ATP的相对光单位值，其中hIgG对照为人IgG。
7.2.3嵌合抗体中和IL-5刺激TF1增殖实验
嵌合抗体中和IL-5刺激TF-1增殖实验是IL-5嵌合抗体与IL-5结合，阻滞IL-5与其在TF-1细胞表面的受体的结合，进而中和IL-5诱导的TF-1细胞增殖。详细过程见3.2.4.部分结果见图16、表18。
表18嵌合抗体中和IL-5刺激TF-1细胞增殖
Figure GPA0000306333090000393
表18说明，嵌合抗体通过与人IL-5的结合，能够中和由IL-5刺激条件下诱导TF-1细胞的增殖。表18的数据为细胞培养板中测得的ATP的相对光单位值，其中hIgG对照为人IgG。
实施例8：嵌合抗体亲和力检测实验
将人抗原IL-5固定在CM5芯片表面至150-200RU的过程如下：用新鲜配置的1∶1的50mM NHS和200mM EDC的混合物活化200sec，用10mM NaOAc(pH5.0)将抗原IL-5稀释至1ug/ml，以10ul/min的流速捕获到芯片上约1min。剩余的活化位点用1M乙醇胺封闭。然后将待测抗体稀释至不同浓度(0，3.125，6.25，12.5，25，50nM)，分别以30ul/min的流速流经芯片表面。结合时间180s，解离时间1200s。在每个循环结束后，芯片表面用10mM，PH1.5的Glycine进行再生。动力学速率常数需减去空白对照，用global fit分析方法1∶1结合模型进行数据拟合。解离平衡速率常数(KD)用以下公式计算：KD＝kd/ka。部分结果如图17、表19所示。
表19嵌合抗体与人IL-5亲和力检测结果
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
69F2F3 8.19E+04 ＜1E-05 ＜1.2E-10
102A2E11B6 1.24E+05 2.73E-05 2.21E-10
100F4E11B3 3.11E+05 1.16E-04 3.71E-10
144D3C4A5 2.69E+05 ＜1E-05 ＜3.7E-11
90F9G10H2 9.44E+04 ＜1E-05 ＜1.06E-10
136E11F2 1.05E+05 ＜1E-05 ＜9.5E-11
147D7H2 1.57E+05 ＜1E-05 ＜6.37E-11
151G3B11 1.57E+05 ＜1E-05 ＜6.37E-11
128G11B3 1.93E+05 3.76E-05 1.94E-10
154F10G8 2.79E+05 5.24E-05 1.88E-10
表19说明，嵌合抗体与人IL-5具有高亲和力，表19的数据为嵌合抗体与IL-5结合时的ka、kd、KD值，其中hIgG对照为人IgG。
实施例9：本发明抗体能够更有效中和IL-5诱导TF1增殖实验中作用。
本发明中的抗体较之于对比例抗体，能够更有效中和IL-5诱导TF1增殖实验中作用。结果见表20
Figure GPA0000306333090000401
表20结果表明：本发明抗体(102A2E11B6，147D7H2，151G3B11)在该实验中的IC50为10E-12M级，而对比例抗体(Mepolizumab，Amgen IL-5 antibody)为10E-11M级。
讨论
本发明的技术方案：本发明采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。
治疗用单克隆抗体可由多种技术和途径进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等。但是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单抗，仍然是目前治疗用单抗制备方法的主流。根据目前最新的单抗技术进展，本发明采用优化的杂交瘤技术来制备所需的抗IL-5抗体。
传统的杂交瘤制备技术由Kohler and Milstein在40年前建立(Kohler andMilstein 1975，Nature 256：495)，现在已广泛应用于科研、诊断、治疗等许多相关的单克隆抗体的制备和生产之中。其基本方法虽然延用至今，但在许多方面都有所变化、改进和创新，包括不同品系动物如转基因动物的使用、电融合技术的引入、高效筛选技术设备的应用如ClonePix设备等，使杂交瘤技术的应用更多样化和高效化。常规动物如小鼠等制备的单抗，可以通过常规分子生物学方法克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因，可变区基因可以嫁接到人源抗体恒定区基因从而形成人鼠嵌合抗体，以大大降低人体使用时的免疫原性。此外，鼠源抗体可变区的CDR结构域可以嫁接到人源抗体架构上，从而使鼠源抗体成分降低到5％以下，大大增加了抗体在人体内使用的安全性。这一途径得到抗体称为人源化抗体，并且是目前抗体药物市场的主要产品。
附录
本发明的序列信息(本发明抗体产品的蛋白和基因(DNA)序列)：
表21 IL-5抗体的蛋白(氨基酸)和基因(核苷酸)序列编号
Figure GPA0000306333090000421
表22 IL-5抗体的CDR区序列及其氨基酸序列编号(SEQ ID No：)如下：
Figure GPA0000306333090000422
Figure GPA0000306333090000431
注：其中VH-CDR1为重链可变区-CDR1，VH-CDR2为重链可变区-CDR2，VH-CDR3为重链可变区-CDR3；其中VL-CDR1为轻链可变区-CDR1，VL-CDR2为轻链可变区-CDR2，VL-CDR3为轻链可变区-CDR3。
本发明5个单克隆抗体的蛋白(氨基酸)和基因(核苷酸)序列
IL-5抗体147D7H2重链可变区蛋白和基因序列
SEQ ID NO.1氨基酸序列118aa
Figure GPA0000306333090000432
SEQ ID NO.2基因序列
Figure GPA0000306333090000433
IL-5抗体147D7H2轻链可变区蛋白和基因序列
SEQ ID NO.6氨基酸序列106aa
Figure GPA0000306333090000434
SEQ ID NO.7基因序列
Figure GPA0000306333090000435
IL-5抗体102A2E11B6重链可变区蛋白和基因序列
SEQ ID NO.11氨基酸序列115aa
Figure GPA0000306333090000436
SEQ ID NO.12基因序列
Figure GPA0000306333090000437
IL-5抗体102A2E11B6轻链可变区蛋白和基因序列
SEQ ID NO.16氨基酸序列113aa
Figure GPA0000306333090000441
SEQ ID NO.17基因序列
Figure GPA0000306333090000442
IL-5抗体69F2F3重链可变区蛋白和基因序列
SEQ ID NO.21氨基酸序列115aa
Figure GPA0000306333090000443
SEQ ID NO.22基因序列
Figure GPA0000306333090000444
IL-5抗体69F2F3轻链可变区蛋白和基因序列
SEQ ID NO.26氨基酸序列113aa
Figure GPA0000306333090000445
SEQ ID NO.27基因序列
Figure GPA0000306333090000446
IL-5抗体154F10G8重链可变区蛋白和基因序列
SEQ ID NO.31氨基酸序列115aa
Figure GPA0000306333090000447
SEQ ID NO.32基因序列
Figure GPA0000306333090000448
IL-5抗体154F10G8轻链可变区蛋白和基因序列
SEQ ID NO.36氨基酸序列112aa
Figure GPA0000306333090000449
SEQ ID NO.37基因序列
Figure GPA00003063330900004410
IL-5抗体151G3B11重链可变区蛋白和基因序列
SEQ ID NO.41氨基酸序列116aa
Figure GPA0000306333090000451
SEQ ID NO.42基因序列
Figure GPA0000306333090000452
IL-5抗体151G3B11轻链可变区蛋白和基因序列
SEQ ID NO.46氨基酸序列106aa
Figure GPA0000306333090000453
SEQ ID NO.47基因序列
Figure GPA0000306333090000454
序列表
<110> 上海开拓者生物医药有限公司
<120> 抗人白细胞介素5（IL-5）单克隆抗体及其应用
<130> P2021-1268
<150> CN201811519048.8
<151> 2018-12-12
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Thr Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ile Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Tyr Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Asn Tyr Val Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 2
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaaac caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactacttta tacactgggt gaagcagagg 120
actgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatactg aggatggtga aactaaatat 180
gccccgaaat tccagggcaa ggccactata acaatagaca catcctccaa tacagcctac 240
ctgtatttca gcagcctgac atctgaggac actgccatgt attactgtgc tagatatggt 300
aattacgtcg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 3
Asp Tyr Phe Ile His
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 4
Arg Ile Asp Thr Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 5
Tyr Gly Asn Tyr Val Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 6
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 6
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ser Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 7
caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgttct ggtaccagca gaagccaagt 120
tcctccccca aaccctggat ttatctcaca tccaagctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcgt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg tcagcagtgg aacagtaacc cgtacacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaataaaa 318
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 8
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Phe
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 9
Leu Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 10
Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 11
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 11
Gln Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Val Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Arg Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 12
caggtgcagc tgaggcagtc aggacctggc ctggtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60
acctgcacag tctctggttt ctcattaact agctatggtg tacactgggt tcgccagtct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaagcac agactataat 180
gcagttttca tgtccagact gagcatcagc aaggacagtt ccaagagcca agttttcttt 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatatt actgtgccag aaaccgttac 300
gttttggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctca 345
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 13
Ser Tyr Gly Val His
1 5
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 14
Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Val Phe Met Ser
1 5 10 15
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 15
Asn Arg Tyr Val Leu Asp Tyr
1 5
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Ser
20 25 30
Gly Asp Gln Lys Asn His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Thr Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp His Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 17
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 17
gacattgtga tgacacagtc gccatcctcc ctgagtgtgt cagcaggaga gagggtcact 60
atgaggtgca agtccagtca gagtctgtta accagtggag atcaaaagaa ccacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctacggggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaaccgattt cactcttacc 240
atcaccagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga tcatagtttt 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 18
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Ser Gly Asp Gln Lys Asn His Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 19
Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 20
Gln Asn Asp His Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 21
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 21
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Val Phe
65 70 75 80
Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Lys Asp Phe Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Lys Phe Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 22
caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60
acctgcacag tctctggttt ctcattaagt aactatggtg tacactgggt tcgccagtct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaagcac agactataat 180
gcagctttca aatccagact gagcatcacc aaggacaatt ccaagagcca agttgtcttt 240
agaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccacttatt actgtgccag aaataaggac 300
ttcttggact actggggcca aggcaccaag ttcacagtct cctca 345
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 23
Asn Tyr Gly Val His
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 24
Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Lys Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 25
Asn Lys Asp Phe Leu Asp Tyr
1 5
<210> 26
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Gly Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 27
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 27
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgacctgca agtccagtca gggtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccaccagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatcatttt 300
ccgctcacgt tcggagctgg gaccaagctg gaactgaaa 339
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 28
Lys Ser Ser Gln Gly Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 29
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 30
Gln Asn Asp Tyr His Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 31
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Phe Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Glu Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Ser Thr Glu Thr Thr Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 32
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga taacctgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagat atttatcctg gtagtggtag tactttctac 180
aatgagaagt tcaagagcga ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct tttactgttc aaccgagact 300
accctgggct actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 33
Ser Tyr Trp Ile Thr
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 34
Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Phe Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 35
Glu Thr Thr Leu Gly Tyr
1 5
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 36
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 37
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagcattgta cataataatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca 300
ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 38
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 39
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 40
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr
1 5
<210> 41
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 41
Glu Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Asn
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Asn Phe Pro Asp Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 42
gaggttcacc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactactata tgcactgggt gaagcagagg 120
actgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg aggatggtga aactaaatat 180
gccccgaaat tccagggcca ggccactata acagcggaca catcctccaa cactgccaac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc gagatatggt 300
aacttccctg actactgggg cccaggcacc actctcacag tctcctca 348
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 43
Asp Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 44
Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 45
Tyr Gly Asn Phe Pro Asp Tyr
1 5
<210> 46
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 46
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 47
caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccaaga 120
tcctcaccca aaccctggat ttatctcaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg aatagtaacc cgtacacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaataaaa 318
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 48
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 49
Leu Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 50
Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Tyr Thr
1 5

Claims (10)

1.一种抗IL-5的抗体，其特征在于，所述抗体具有重链可变区和轻链可变区，其中，所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括下列CDR：
氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的VH-CDR1；
氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的VH-CDR2；
氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的VH-CDR3；
氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的VL-CDR1；
氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的VL-CDR2；和
氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的VL-CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区氨基酸序列如SE QID NO:11所示；和/或所述抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
3.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：
(i)如权利要求1所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1抗体；或
(2)如权利要求3所述的重组蛋白。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQID NO:12所示；和/或，编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:17所示。
6.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4或5所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的载体或基因组中整合有权利要求4或5所述的多核苷酸。
8.一种抗体偶联物，其特征在于，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
9.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达权利要求1或2所述的抗体。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求3所述的重组蛋白、如权利要求8所述的抗体偶联物、权利要求9所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
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