CN112437675A - 用于消融造血干细胞的抗体药物缀合物 - Google Patents

用于消融造血干细胞的抗体药物缀合物 Download PDF

Info

Publication number
CN112437675A
CN112437675A CN201980048184.XA CN201980048184A CN112437675A CN 112437675 A CN112437675 A CN 112437675A CN 201980048184 A CN201980048184 A CN 201980048184A CN 112437675 A CN112437675 A CN 112437675A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
fab
antibody
light chain
heavy chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980048184.XA
Other languages
English (en)
Inventor
A·E·博伊塔诺
M·T·伯格
S·E·塞利蒂
M·P·库克
C·芬纳
B·H·盖尔斯坦格尔
S·T·李-赫夫利希
H·T·彭
S·H·施莱尔
K·蒂索
宇野哲郎
万咏勤
B·温
Q·(A)·张
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Publication of CN112437675A publication Critical patent/CN112437675A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了抗体药物缀合物，其中特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段任选地通过接头与药物部分连接。本发明进一步提供了包含抗体药物缀合物的药物组合物；以及制备和使用此类药物组合物用于在有需要的患者中消融造血干细胞的方法。

Description

用于消融造血干细胞的抗体药物缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年6月20日提交的美国临时申请号62/687,382的权益，将其内容通过引用以其整体特此并入。
技术领域
本披露涉及抗cKIT抗体药物缀合物，和它们用于在有需要的患者(例如造血干细胞移植受者)中消融造血干细胞的用途。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且将该序列表通过引用以其整体特此并入。所述ASCII副本创建于2019年5月2日，名称为PAT058157-WO-PCT_SL.txt并且大小为186,540字节。
背景技术
cKIT(CD117)是一种结合配体干细胞因子(SCF)的单次跨膜受体酪氨酸激酶。SCF诱导cKIT的同型二聚化，该同型二聚化激活其酪氨酸激酶活性并通过PI3-AKT途径和MAPK途径发送信号(Kindblom等人,Am J.Path.[病理学杂志]1998 152(5):1259)。最初发现cKIT为由猫科逆转录病毒表达的呈截短形式的致癌基因(Besmer等人,Nature[自然]1986 320:415-421)。克隆相应的人基因证实cKIT是III类类型受体酪氨酸激酶的成员，其中认为FLT3、CSF-1受体和PDGF受体属于本家族成员。cKIT是造血细胞、生殖细胞、肥大细胞和黑素细胞发育所必需的。骨髓中的造血祖细胞，例如造血干细胞(HSC)在细胞表面上表达高水平的cKIT。此外，肥大细胞、皮肤中的黑素细胞和消化道中Cajal间质细胞表达cKIT。
造血干细胞(HSC)能够再生移植受者中的所有血液和免疫细胞，并且因此具有很大的治疗潜力。造血干细胞移植广泛用作白血病、淋巴瘤和其他威胁生命的疾病的疗法。然而，许多风险与这种移植相关，包括移植不良、免疫排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、或感染。同种异体造血干细胞移植通常需要通过细胞减灭治疗来调理受者，以防止移植物的免疫排斥。目前的调理方案通常对宿主是有毒的，以致于它们对于大量移植患者是禁忌的和/或不能以足够预防移植物抗宿主病的量提供。因此，需要改进调理和移植方法并且降低与造血干细胞移植相关的风险并增加其对各种障碍的有效性。
发明内容
本披露提供了抗体药物缀合物，其中特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)任选地通过接头与药物部分(例如细胞毒性剂)连接。那些抗体药物缀合物可以选择性地将细胞毒性剂递送至表达cKIT的细胞，例如造血干细胞，从而选择性地消融患者，例如造血干细胞移植受者中的那些细胞。优选地，这些cKIT抗体药物缀合物具有药代动力学特性，使得它在患者的循环中不会长时间存在和/或有活性，因此它们可用于在造血干细胞移植之前调理造血干细胞移植受者。在一些实施例中，本文提供了缀合物，这些缀合物包含特异性结合cKIT、任选地通过接头与药物部分(例如细胞毒性剂)连接的抗体片段(例如Fab或Fab’)。令人惊讶的是，本发明人发现全长抗cKIT抗体(例如，全长IgG)、F(ab’)2片段及其毒素缀合物引起肥大细胞脱粒，但抗cKIT Fab'或Fab-毒素缀合物甚至当交联和/或多聚化成较大的复合物(如在患者形成或具有预先存在的识别Fab片段的抗药物抗体的情况下可以观察到的)时也不引起肥大细胞脱粒。本披露进一步提供了包含抗体药物缀合物的药物组合物，以及制备和使用此类药物组合物用于在有需要的患者(例如造血干细胞移植受者)中消融造血干细胞的方法。
在一个方面，本披露涉及一种具有式(I)的缀合物：
A-(LB-(D)n)y 式(I)；
其中：
A是特异性结合人cKIT的抗体片段；
LB是接头；
D是细胞毒性剂；
n是从1至10的整数，并且y是从1至10的整数。
在一个方面，本披露涉及一种具有式(E)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000031
其中R2、A、L1、y和R114如本文所定义的。
在一个方面，本披露涉及一种具有式(G)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000032
其中R2、A、L1、y和R114如本文所定义的。
在另一个方面，本文提供了特异性结合人cKIT的抗体和抗体片段(例如Fab或Fab’)。此类抗cKIT抗体和抗体片段(例如Fab或Fab’)可用于本文所述的任一种缀合物中。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)是特异性结合人cKIT的细胞外结构域(SEQ ID NO:112)的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)是特异性结合人cKIT的结构域1-3(SEQ ID NO:113)中的表位的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)是表1中所述的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:1的HCDR1；SEQ ID NO:2的HCDR2；SEQ ID NO:3的HCDR3；SEQ ID NO:16的LCDR1；SEQID NO:17的LCDR2；和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:4的HCDR1；SEQ ID NO:5的HCDR2；SEQ ID NO:3的HCDR3；SEQ ID NO:19的LCDR1；SEQID NO:20的LCDR2；和SEQ ID NO:21的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:6的HCDR1；SEQ ID NO:2的HCDR2；SEQ ID NO:3的HCDR3；SEQ ID NO:16的LCDR1；SEQID NO:17的LCDR2；和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:8的HCDR2；SEQ ID NO:9的HCDR3；SEQ ID NO:22的LCDR1；SEQID NO:20的LCDR2；和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:27的HCDR1；SEQ ID NO:28的HCDR2；SEQ ID NO:29的HCDR3；SEQ ID NO:42的LCDR1；SEQ ID NO:17的LCDR2；和SEQ ID NO:43的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:30的HCDR1；SEQ ID NO:31的HCDR2；SEQ ID NO:29的HCDR3；SEQ ID NO:44的LCDR1；SEQ ID NO:20的LCDR2；和SEQ ID NO:45的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:32的HCDR1；SEQ ID NO:28的HCDR2；SEQ ID NO:29的HCDR3；SEQ ID NO:42的LCDR1；SEQ ID NO:17的LCDR2；和SEQ ID NO:43的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:33的HCDR1；SEQ ID NO:34的HCDR2；SEQ ID NO:35的HCDR3；SEQ ID NO:46的LCDR1；SEQ ID NO:20的LCDR2；和SEQ ID NO:43的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:1的HCDR1；SEQ ID NO:51的HCDR2；SEQ ID NO:3的HCDR3；SEQ ID NO:16的LCDR1；SEQID NO:17的LCDR2；和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:4的HCDR1；SEQ ID NO:52的HCDR2；SEQ ID NO:3的HCDR3；SEQ ID NO:19的LCDR1；SEQID NO:20的LCDR2；和SEQ ID NO:21的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:6的HCDR1；SEQ ID NO:51的HCDR2；SEQ ID NO:3的HCDR3；SEQ ID NO:16的LCDR1；SEQID NO:17的LCDR2；和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:53的HCDR2；SEQ ID NO:9的HCDR3；SEQ ID NO:22的LCDR1；SEQID NO:20的LCDR2；和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:60的HCDR1；SEQ ID NO:61的HCDR2；SEQ ID NO:62的HCDR3；SEQ ID NO:75的LCDR1；SEQ ID NO:76的LCDR2；和SEQ ID NO:77的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:63的HCDR1；SEQ ID NO:64的HCDR2；SEQ ID NO:62的HCDR3；SEQ ID NO:78的LCDR1；SEQ ID NO:79的LCDR2；和SEQ ID NO:80的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:65的HCDR1；SEQ ID NO:61的HCDR2；SEQ ID NO:62的HCDR3；SEQ ID NO:75的LCDR1；SEQ ID NO:76的LCDR2；和SEQ ID NO:77的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:66的HCDR1；SEQ ID NO:67的HCDR2；SEQ ID NO:68的HCDR3；SEQ ID NO:81的LCDR1；SEQ ID NO:79的LCDR2；和SEQ ID NO:77的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:86的HCDR1；SEQ ID NO:87的HCDR2；SEQ ID NO:88的HCDR3；SEQ ID NO:101的LCDR1；SEQ ID NO:102的LCDR2；和SEQ ID NO:103的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:89的HCDR1；SEQ ID NO:90的HCDR2；SEQ ID NO:88的HCDR3；SEQ ID NO:104的LCDR1；SEQ ID NO:105的LCDR2；和SEQ ID NO:106的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:91的HCDR1；SEQ ID NO:87的HCDR2；SEQ ID NO:88的HCDR3；SEQ ID NO:101的LCDR1；SEQ ID NO:102的LCDR2；和SEQ ID NO:103的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:92的HCDR1；SEQ ID NO:93的HCDR2；SEQ ID NO:94的HCDR3；SEQ ID NO:107的LCDR1；SEQ ID NO:105的LCDR2；和SEQ ID NO:103的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区(VH)，和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:145的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有选自SEQ IDNO:119、120或121的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有选自SEQ IDNO:125、126或127的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有选自SEQ IDNO:131、132或133的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有选自SEQ IDNO:137、138或139的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有选自SEQ IDNO:142、143或144的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体包含含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体包含含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体包含含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，本文提供了缀合物，这些缀合物包含特异性结合cKIT、任选地通过接头与药物部分(例如细胞毒性剂)连接的抗体片段(例如Fab或Fab’)(抗cKIT Fab或Fab’)。该抗cKIT Fab或Fab’可以是本文所述的任一种Fab或Fab’，例如表1中的任一种Fab或Fab’。如本文所述，此类抗cKIT Fab或Fab’-毒素缀合物能够消融体外和体内的人HSC细胞，但甚至当交联和/或多聚化成较大的复合物时也不引起肥大细胞脱粒。
附图说明
图1A-1C示出了抗cKIT Fab’-DAR4缀合物样品(对于缀合物细节参见表2)的子集以大致相等的效力体外杀伤人干细胞和祖细胞(cKIT+/CD90+细胞)的线形图。图1A示出了来自J4(菱形)、J5(空心圆圈，短划线)、J8(正方形)和J9(空心三角形，点划线)的数据。图1B示出了来自J10(空心正方形)和J11(圆圈)的数据。图1C示出了相对于同种型对照抗HER2 Fab'-DAR4缀合物和未处理细胞(正方形，点划线)的抗cKit Fab’1-DAR4和抗cKit Fab’2-DAR4缀合物：J10(菱形)、J15(圆圈)、J16(空心正方形)、J19(空心圆圈，短划线)和J20(空心三角形)。
图2A-2O是显示体外人肥大细胞脱粒测定的代表性结果的线形图，这些测定使用人外周血HSC衍生的肥大细胞并且使用β-己糖胺酶释放作为读出(通过基于620nm处的参考吸光度进行基线抠出所得的405nm处的吸光度评估)。此处示出的数据是在不存在SCF的情况下收集的。线形图示出了当使用对抗体测试试剂(在x轴上滴定的)上的Fab部分特异的抗体使测试试剂交联时，由以下各种浓度的抗体或抗体片段触发的肥大细胞脱粒水平：0.006nM(三角形)；0.098nM(菱形)；1.6nM(圆圈)；25nM(正方形)。对于参考，将单独的交联剂抗体绘制在每个图上(空心菱形，短划线)。图2A-2C显示全长抗cKIT抗体4(图2A)和抗cKIT F(ab’4)2片段(图2B)在交联时引起肥大细胞脱粒，而在所有测试浓度下的抗cKIT Fab4(HC-E152C)片段没有触发肥大细胞脱粒(图2C)。图2D-2F显示全长抗cKIT抗体1(图2D)和抗cKITF(ab’1)2片段(图2E)在交联时引起肥大细胞脱粒，而在所有测试浓度下的抗cKIT Fab1(HC-E152C)片段没有触发肥大细胞脱粒(图2F)。图2G-2I显示全长抗cKIT抗体2(图2G)和抗cKIT F(ab’2)2片段(图2H)在交联时引起肥大细胞脱粒，而在所有测试浓度下的抗cKITFab2(HC-E152C)片段没有触发肥大细胞脱粒(图2I)。图2J-2L显示全长抗cKIT抗体3(图2J)和抗cKIT F(ab’3)2片段(图2K)在交联时引起肥大细胞脱粒，而在所有测试浓度下的抗cKIT Fab3(HC-E152C)片段没有触发肥大细胞脱粒(图2L)。图2M-2O是示出抗Her2抗体(图2M)、抗Her2-F(ab’)2片段(图2N)、或抗Her2-Fab(HC-E152C)片段(图2O)在交联时未引起肥大细胞脱粒的线形图。
图3是示出了使用抗cKit缀合物从小鼠宿主体内消融人HSC的点图。
具体实施方式
本披露提供了抗体药物缀合物，其中特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)任选地通过接头与药物部分(例如细胞毒性剂)连接。那些抗体药物缀合物可以选择性地将细胞毒性剂递送至表达cKIT的细胞，例如造血干细胞，从而选择性地消融患者，例如造血干细胞移植受者中的那些细胞。优选地，cKIT抗体药物缀合物具有药代动力学特性，使得它在患者的循环中不会长时间存在和/或有活性(例如，半衰期小于24-48小时)，因此它们可用于在造血干细胞移植之前调理造血干细胞移植受者。在一些实施例中，本文提供了缀合物，这些缀合物包含特异性结合cKIT、任选地通过接头与药物部分(例如细胞毒性剂)连接的抗体片段(例如Fab或Fab’)。令人惊讶的是，本发明人发现全长抗cKIT抗体(例如，全长IgG)、F(ab’)2片段及其毒素缀合物引起肥大细胞脱粒，但抗cKIT Fab'或Fab-毒素缀合物甚至当交联和/或多聚化成较大的复合物(如在患者形成或具有预先存在的识别Fab片段的抗药物抗体的情况下可以观察到的)时也不引起肥大细胞脱粒。本披露进一步提供了包含抗体药物缀合物的药物组合物，以及制备和使用此类药物组合物用于在有需要的患者(例如造血干细胞移植受者)中消融造血干细胞的方法。
定义
除非另外声明，否则如本文所用以下术语和短语意在具有以下意思：
术语“烷基”是指具有指定碳原子数目的单价饱和烃链。例如，C1-6C烷基是指具有从1至6个碳原子的烷基基团。烷基基团可以是直链的或支链的。代表性的支链烷基基团具有一个、两个或三个分支。烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基(正丙基和异丙基)、丁基(正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基)、戊基(正戊基、异戊基和新戊基)以及己基。
如本文所用，术语“抗体”是指衍生自特异性结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质、或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或来自重组来源。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域(即CH1、CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(即CL)组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，它们散布着称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q))的结合。抗体可以是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、或嵌合抗体。这些抗体可以具有任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
“互补性决定结构域”或“互补性决定区”(“CDR”)可互换地指VL和VH的高变区。CDR是抗体链的靶蛋白结合位点，该结合位点携带针对这种靶蛋白的特异性。每种人VL或VH中存在三个CDR(CDR1-3，从N末端顺序编号)，构成约15％-20％的可变结构域。CDR可以按其区域和顺序提到。例如，“VHCDR1”或“HCDR1”均是指重链可变区的第一CDR。CDR在结构上与靶蛋白的表位互补并因此直接负责结合特异性。VL或VH的剩余伸展段(所谓的框架区)表现出较小的氨基酸序列变异性(Kuby,Immunology[免疫学],第4版,第4章.W.H.Freeman&Co.[W.H.弗里曼公司],纽约,2000)。
给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种来确定，包括以下中所述的那些：卡巴特等人(1991),“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[免疫学兴趣的蛋白质序列],”第5版,Public Health Service[公共卫生服务],National Institutes of Health[国立卫生研究院],Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)和免疫遗传学(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,The Immunologist[免疫学家],7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育免疫学与比较免疫学],27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)。例如，对于经典形式，根据Kabat，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并将轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并将VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基编号为大约26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，并且VL中的CDR氨基酸残基编号为大约27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)(根据“Kabat”编号)。在IMGT下，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR区。
可以将轻链和重链两者分成结构和功能同源性区域。术语“恒定”和“可变”是在功能上使用。在这点上，应当理解轻链(VL)和重链(VH)部分两者的可变结构域均决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3，并且在一些情况下CH4)的恒定结构域赋予重要生物特性如分泌、经胎盘移动性(transplacentalmobility)、Fc受体结合、补体结合、FcRn受体结合、半衰期、药代动力学等。按照惯例，恒定区结构域离抗体的抗原结合位点或者氨基末端越远，它的编号越大。N末端是可变区并且在C末端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端结构域。
如本文所用，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个部分，该一个或多个部分保留与抗原(例如cKIT)的表位特异性相互作用的能力(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段，该Fab片段是一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；Fab'片段，该Fab'片段是一种由VL、VH、CL、CH1结构域和铰链区组成的单价片段；F(ab’)2片段，该F(ab’)2片段是一种包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；半抗体，该半抗体包括通过二硫键连接的单条重链和单条轻链；一臂抗体，该一臂抗体包括连接至Fc区的Fab片段；CH2结构域缺失的抗体，该抗体包括与CH3结构域二聚体连接的两个Fab片段(参见Glaser,J Biol Chem.[生物化学杂志]2005；280(50):41494-503)；单链Fv(scFv)；二硫化物连接的Fv(sdFv)；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature[自然]341:544-546,1989)；和分离的互补性决定区(CDR)、或抗体的其他表位结合片段。例如，Fab片段可包含抗体重链的氨基酸残基1-222(EU编号)；而Fab’片段可包含抗体重链的氨基酸残基1-236(EU编号)。抗体的Fab或Fab’片段可以重组产生或通过酶消化亲本抗体产生。可以将重组产生的Fab或Fab’工程化，以引入用于位点特异性缀合的氨基酸如半胱氨酸(Junutula,J.R.等人,Nature biotechnology[自然生物技术]2008,26,925)、吡咯啉-羧基-赖氨酸(Ou,W.等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]2011；108(26):10437-42)或非天然氨基酸(例如Tian,F.等人,Proc Natl Acad SciUSA[美国国家科学院院刊]2014,111,1766；Axup,J.Y.等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊].2012,109,16101)。类似地，可以添加突变或肽标签以有利于通过磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(Grunewald,J.等人,Bioconjugate chemistry[生物缀合化学]2015,26,2554)、形成甲酰甘氨酸的酶(Drake,P.M.等人,Bioconjugate chemistry[生物缀合化学]2014,25,1331)、转谷氨酰胺酶(Strop,P.等人,Chemistry&biology[化学和生物学]2013,20,161)、分选酶(Beerli,R.R.；Hell,T.；Merkel,A.S.；Grawunder,U.PloS one[公共科学图书馆·综合]2015,10,e0131177)或其他酶促缀合策略进行的缀合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白质链的合成接头来相连，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(“scFv”)；参见例如，Bird等人,Science[科学]242:423-426,1988；和Huston等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国家科学院院刊]85:5879-5883,1988)。术语“抗原结合片段”也意在涵盖此类单链抗体。这些抗原结合片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。
抗体片段或抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。可以将抗原结合片段移植到基于多肽如III型纤连蛋白(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，该专利描述了纤连蛋白多肽单体)。
可以将抗体片段或抗原结合片段掺入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,Protein Eng.[蛋白质工程]8:1057-1062,1995；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有基本上相同的氨基酸序列或衍生自相同遗传源的多肽，包括抗体和抗原结合片段等。此术语还包括具有单分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”包括具有可变区的抗体，其中框架和CDR区均衍生自人源序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自此类人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如如Knappik等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]296:57-86,2000中所述。
本披露的人抗体可以包含不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机诱变或位点特异性诱变、或通过在体内体细胞突变、或保守取代来引入突变以促进稳定性或生产)。
如本文所用，术语“识别”是指发现其表位并与之相互作用(例如，结合)的抗体或其抗原结合片段，无论该表位是否为线性或构象的。术语“表位”是指抗原上与本披露的抗体或抗原结合片段特异性结合的位点。表位可以从连续氨基酸或因蛋白质的立体折叠而并置的非连续氨基酸中形成。从连续氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂时保留，而因立体折叠形成的表位用变性溶剂处理时一般丧失。表位典型地包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14或15个处于独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术，例如，x射线结晶学和二维核磁共振(参见，例如Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology[分子生物学中的方法中的表位映射协议],第66卷,G.E.Morris编辑(1996))。“互补位”是识别抗原表位的抗体部分。
在描述抗原(例如，蛋白质)与抗体、抗体片段或抗体衍生的结合剂之间相互作用的语境中使用时，短语“特异性结合”或“选择性结合”是指确定抗原在蛋白质异质群体和其他生物制品中例如在生物样品(例如，血液、血清、血浆或组织样品)中存在的结合反应。因此，在某些指明的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合至少两倍于背景并且这些抗体或结合剂基本上不以显著的量与样品中存在的其他抗原结合。在一个方面，在某些指明的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合至少10倍于背景并且这些抗体或结合剂基本上不以显著的量与样品中存在的其他抗原结合。在这类条件下与抗体或结合剂特异性结合可能需要已经就其针对选择特定蛋白质的特异性选择抗体或结合剂。如果需要或适当，可以通过扣除与来自其他物种(例如，小鼠或大鼠)或其他亚型的分子交叉反应的抗体，实现这种选择。可替代地，在一些方面，选择与某些所期望分子交叉反应的抗体或抗体片段。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与抗原之间在单个抗原位点处相互作用的强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力在许多位点处与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。然而，特异性结合一种抗原的分离的抗体可以对其他抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学品。
术语“相应的人种系序列”是指编码人可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列，与由人种系免疫球蛋白可变区序列编码的其他全部可变区氨基酸序列相比，该人可变区氨基酸序列或子序列与参考可变区氨基酸序列或子序列共有确定的最高氨基酸序列同一性。相应的人种系序列还可以是指与全部其他评价的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列。相应的人种系序列可以仅是框架区、仅是互补性决定区、是框架区和互补性决定区、可变区段(如上文所定义)，或包含可变区的序列或子序列的其他组合。可以使用本文所述的方法，例如，使用BLAST、ALIGN或本领域已知的另一种比对算法比对两个序列，确定序列同一性。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
多种免疫测定方式可以用来选择与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规地用来选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(关于可以用来确定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件的描述，参见例如Harlow和Lane,Using Antibodies,ALaboratory Manual[使用抗体：实验室手册](1998))。典型地，特异性或选择性结合反应将产生高于背景信号至少2倍和更典型地高于背景至少10至100倍的信号。
术语“平衡解离常数(KD[M])”是指解离速率常数(kd[s-1])除以缔合速率常数(ka[s-1,M-1])。可以使用本领域的任何已知方法，测量平衡解离常数。本披露的抗体通常将具有小于约10-7或10-8M，例如，小于约10-9M或10-10M，在一些方面，小于约10-11M、10-12M或10-13M的平衡解离常数。
术语“生物利用率”是指施用至患者的给定量的药物的全身性利用率(即，血液/血浆水平)。生物利用率是一个绝对术语，该绝对术语指示从所施用剂型到达总循环的药物时间(速率)和总量(程度)的度量。
如本文所用，短语“基本上由……组成”是指方法或组合物中所包含的活性药剂以及对该方法或组合物的预期目的而言无活性的任何赋形剂的类属或物种。在一些方面，短语“基本上由……组成”明确地排除了包含除本披露的抗体药物缀合物之外的一种或多种额外活性剂。在一些方面，短语“基本上由……组成”明确地排除了包含除本披露的抗体药物缀合物和第二共同施用的药剂之外的一种或多种额外活性剂。
术语“氨基酸”是指天然存在的、合成的和非天然的氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-邻磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的α-碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有如下结构的化合物，该结构与氨基酸的一般化学结构不同但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。对于特定核酸序列，保守修饰的变体是指那些编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或在该核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质均可以由多个功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，该密码子可以改变为任何所述相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，它们是保守修饰变异中的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG--通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和TGG--通常是色氨酸的唯一密码子)均可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每一种沉默变异。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的单独取代、缺失或添加，它们导致某个氨基酸取代为化学上相似的氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。此类保守修饰的变体相对于多态性变体、物种间同源物和等位基因是额外的并且不排除它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins[蛋白质](1984))。在一些方面，术语“保守性序列修饰”用来指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
如本文所用，术语“优化的”是指已经改变核苷酸序列以使用在生产性细胞或生物体(通常是真核细胞，例如酵母细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、真菌细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中为优选的密码子编码氨基酸序列。优化的核苷酸序列被工程化以完全或尽可能多地保留最初由起始核苷酸序列编码的氨基酸序列，该起始核苷酸序列也称为“亲本”序列。
在两个或更多个核酸序列或多肽序列的语境中，术语“相同百分比”或“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列相同的程度。如果两个序列在正在比较的区域上具有相同的氨基酸序列或核苷酸序列，则它们是“相同的”。当在比较窗口或指定区域内进行比较和比对以寻求使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的最大对应时，如果两个序列具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域上或当没有规定时则在整个序列上，60％同一性，任选65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度为至少约30个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，测试序列与该参考序列比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用，“比较窗口”包括提及选自下组的多个邻接位置中的任何一个的区段，该组由从20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150组成，其中在两个序列最佳比对后，可以将序列与相同数量的邻接位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是熟知的。例如通过Smith和Waterman Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c(1970)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学期刊]48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性方法研究，通过这些算法(威斯康星州麦迪逊的科学大道575号遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)的计算机实现，或通过手动比对和目测检查(参见例如，Brent等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南],2003)，可以进行用于比较的序列的最佳比对。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410,1990。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开地获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，所述长度为W的短字匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻域字命中点作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。字命中点沿着每个序列在两个方向上扩展，远至可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当出现以下情形时，字命中点向各方向的延伸终止：累积比对得分从其最大获得值跌落数量X；由于一个或多个负分残基比对的累积，累积得分走向零或更低；或到达任一序列的一端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787,1993)。BLAST算法提供的一种相似度量度是最小总和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用已并入ALIGN算法(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学],4:11-17,(1988)的算法，利用PAM120权重残基表、空位长度罚分12以及空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已经并入GCG软件包中的GAP程序(可从www.gcg.com获得)中的Needleman和Wunsch,J.Mol,Biol.[分子生物学杂志]48:444-453,(1970)算法，利用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6来确定。
除了上述序列同一性百分比之外，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体进行免疫交叉反应，如下所述。因此，多肽典型地与第二多肽基本上相同，例如其中两种肽仅通过保守取代而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或它们的补体在严格条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列基本上相同的又另一个指示是可使用相同的引物来扩增序列。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，该核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、和互补序列以及明确指明的序列。具体地，如下文详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而实现，在这些序列中，一个或多个所选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,(1991)Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081；Ohtsuka等人,(1985)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608；和Rossolini等人,(1994)Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98)。
术语“可操地连接”在核酸的语境中是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。典型地，它是指转录调节序列与已转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列在适当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子或增强子序列与编码序列可操作地连接。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调节序列与转录序列在物理上邻接，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调控序列如增强子不需要在物理上邻接或位于极为接近这些转录调控序列增强其转录的编码序列的位置。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外说明，否则特定的多肽序列还隐含地涵盖其保守性修饰的变体。
如本文所用，术语“缀合物”或“抗体药物缀合物”是指抗体或其抗原结合片段与另一种药剂如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针等连接。该连接可以是共价键或非共价相互作用，如借助静电力。可以采用本领域已知的多种接头以形成缀合物。另外地，可以将缀合物以可能是从编码缀合物的多核苷酸表达的融合蛋白的形式提供。如本文所用，“融合蛋白”是指通过连接最初编码分离的蛋白质(包括肽和多肽)的两个或更多个基因或基因片段产生的蛋白质。融合基因的翻译产生具有从每种原始蛋白质衍生的功能特性的单一蛋白。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物如非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。
如本文所用，术语“毒素”、“细胞毒素”或“细胞毒性剂”是指对细胞的生长和增殖有害并可以发挥作用以减少、抑制或摧毁细胞或恶性肿瘤的任何药剂。
如本文所用，术语“抗癌剂”是指可以用来治疗细胞增殖性障碍如癌症的任何药剂，包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂、放射疗法和放射治疗剂、靶向抗癌剂和免疫治疗剂。
如本文所用，术语“药物部分”或“有效负载”是指与抗体或抗原结合片段缀合或适用于与抗体或抗原结合片段缀合的化学部分，并且可以包括任何治疗剂或诊断剂和具有所期望的治疗或诊断特性的本文披露的抗体药物缀合物的代谢物，例如，抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂)或麻醉剂。在某些方面，药物部分选自Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞司他汀、多拉司他汀(dolastatin)、类美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂和DHFR抑制剂。用于将这些药物中每种药物连接至与本披露抗体和方法相容的接头的方法是本领域已知的。例如参见，Singh等人,(2009)Therapeutic Antibodies:Methods and Protocols[治疗性抗体：方法和方案],第525卷,445-457。此外，有效负载可以是生物物理探针、荧光团、自旋标记、红外探针、亲和探针、螯合剂、光谱探针、放射性探针、脂质分子、聚乙二醇、聚合物、自旋标记、DNA、RNA、蛋白质、肽、表面、抗体、抗体片段、纳米粒子、量子点、脂质体、PLGA粒子、糖或多糖。
术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，其细胞未移行至受试者身体中除原始肿瘤部位之外部位的那些)和继发性恶性肿瘤(例如，因转移、肿瘤细胞移行至与原始肿瘤部位不同的继发部位而产生的那些)。
术语“cKIT”(也称为KIT、PBT、SCFR、C-Kit、CD117)是指一种作为受体酪氨酸激酶III家族成员的酪氨酸激酶受体。人cKIT同种型的核酸和氨基酸序列是已知的，并且已以以下登录号公布于GenBank中：
NM_000222.2→NP_000213.1肥大/干细胞生长因子受体Kit同种型1前体；
NM_001093772.1→NP_001087241.1肥大/干细胞生长因子受体Kit同种型2前体。
在结构上，cKIT受体是I型跨膜蛋白，并且含有信号肽、在细胞外结构域中的5个Ig样C2结构域，并且在其细胞内结构域中具有蛋白激酶结构域。如本文所用，将术语“cKIT”用于共同指cKIT蛋白质的任何天然存在的同种型、或其变体。
术语“变体”是指与参考多肽具有基本上相同的氨基酸序列、或由基本上相同的核苷酸序列编码，并且能够具有参考多肽的一种或多种活性的多肽。例如，变体与参考多肽可以具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，同时保留参考多肽的一种或多种活性。
如本文所用，术语任何疾病或障碍的“治疗(treat、treating或treatment)”在一个方面是指改善疾病或障碍(即，减慢或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个方面，“治疗”是指缓解或改善至少一种身体参数(包括不能被患者辨别的那些)。在又另一个方面，“治疗”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)或二者调节疾病或障碍。在又另一个方面，“治疗”是指预防或延迟该疾病或障碍的发病或发展或进展。
术语“治疗可接受量”或“治疗有效剂量”可互换地指足以实现所期望结果(即，肿瘤尺寸减小、抑制肿瘤生长、防止转移、抑制或防止病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)的量。在一些方面，治疗可接受量不诱导或不引起不期望的副作用。可以通过首先施用低剂量并且随后递增增加该剂量直至实现所期望效果来确定治疗可接受量。本披露分子的“治疗有效剂量”可以分别防止疾病症状发作或导致疾病症状的严重程度下降，这些疾病症状包括与癌症相关的症状。
术语“共同施用”是指个体的血液中同时存在两种活性药剂。共同施用的活性药剂可以并行或依序递送。
如本文所用，术语“硫醇-马来酰亚胺”是指通过硫醇与马来酰亚胺反应形成的基团，具有以下该通式：
Figure BDA0002904476810000261
其中Y和Z是经由硫醇-马来酰亚胺键连接的基团，并且可以包含接头组分、抗体或有效负载。硫醇-马来酰亚胺可以形成以下开环结构
Figure BDA0002904476810000262
如本文所用，“可裂解的”是指通过共价连接连接两个部分，但是在生理学相关条件下分解以切断部分之间的共价连接的连接基团或接头组分，典型地，与在细胞外环境时相比可裂解的连接基团在细胞内环境内更快速地体内切断，导致有效负载的释放优先发生在靶细胞内。裂解可以是酶促的或非酶促的，但通常从抗体释放有效负载而不降解抗体。裂解可以留下连接基团或接头组分的一些部分连接至有效负载上，或者它可以释放不具有连接基团的任何残基的有效负载。
如本文所用，“不可裂解的”是指在生理条件下不特别易于分解的连接基团或接头基团，例如，它至少与缀合物的抗体或抗原结合片段部分一样稳定。此类连接基团有时被称为“稳定的”，这意味着它们足以抵抗降解以保持有效负载与抗体或抗原结合片段连接，直到抗体或抗原结合片段本身至少部分降解，即，抗体或抗原结合片段的降解在体内裂解连接基团之前。具有稳定或不可裂解的连接基团的ADC的抗体部分的降解可以留下连接基团的一些或全部(例如，来自抗体的一个或多个氨基酸基团)连接至递送在体内的有效负载或药物部分上。
药物部分(D)
在一个方面，本发明的药物部分是具有式(A)的化合物：
Figure BDA0002904476810000271
其中：
R1是
Figure BDA0002904476810000272
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
在一个方面，本发明的药物部分是具有式(B)的化合物：
Figure BDA0002904476810000281
其中：
R1是
Figure BDA0002904476810000282
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
本发明的药物部分的某些方面及实例是提供在额外的枚举型实施例的下列列表中。应认识到，每个实施例中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供本发明的另外实施例。
实施例1.具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(A-1)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000283
其中：
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例2.具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(A-2)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000291
其中：
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例3.具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(A-3)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000292
其中：
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例2.具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(A-4)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000301
其中：
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例3.具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或C1-C6烷基。
实施例4.具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或甲基。
实施例5.具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H。
实施例6.具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是甲基。
实施例7.具有式(A)、式(A-1)或式(A-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000302
实施例8.具有式(A)、式(A-1)或式(A-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000311
实施例9.具有式(A)、式(A-1)或式(A-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000312
实施例10.具有式(A)、式(A-1)或式(A-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000313
实施例11.具有式(A)、式(A-2)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000314
实施例12.具有式(A)、式(A-2)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000315
实施例13.具有式(A)、式(A-2)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000321
实施例14.具有式(A)、式(A-2)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000322
实施例15.具有式(B)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(B-1)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000323
其中：
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例16.具有式(B)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(B-2)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000324
其中：
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例17.具有式(B)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(B-3)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000331
其中：
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例18.具有式(B)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(B-4)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000332
其中：
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例19.具有式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或C1-C6烷基。
实施例20.具有式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或甲基。
实施例21.具有式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H。
实施例22.具有式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是甲基。
实施例23.具有式(B)、式(B-1)或式(B-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000341
实施例24具有式(B)、式(B-1)或式(B-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000342
实施例25.具有式(B)、式(B-1)或式(B-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000343
实施例26.具有式(B)、式(B-1)或式(B-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000351
实施例27.具有式(B)、式(B-2)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000352
实施例28.具有式(B)、式(B-2)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000353
实施例29.具有式(B)、式(B-2)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000354
实施例30.具有式(A)、式(A-2)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000355
接头-药物部分(LB-(D)n)
在一个方面，本发明的接头-药物部分包含一种或多种共价连接至接头(LB)的细胞毒素，其中该一种或多种细胞毒素独立地选自具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)、式(A-4)、式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)或式(B-4)的化合物、或实施例7至14中任一项或实施例23至30中任一项所述的化合物。
在一个方面，本发明的接头-药物部分包含一种或多种共价连接至接头(LB)的细胞毒素，其中该一种或多种细胞毒素独立地选自具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)或式(A-4)的化合物、或实施例7至14中任一项所述的化合物。
在一个方面，本发明的接头-药物部分包含一种或多种共价连接至接头(LB)的细胞毒素，其中该一种或多种细胞毒素独立地选自具有式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)或式(B-4)的化合物、或实施例23至30中任一项所述的化合物。
在一个方面，本发明的接头-药物部分是具有式(C)的结构的化合物，或其立体异构体或药学上可接受的盐，
Figure BDA0002904476810000361
其中：
RA是
Figure BDA0002904476810000362
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
R5是-L1R14、-L1R24、-L1R34或-L1R44；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R14的连接点；
X1是
Figure BDA0002904476810000371
Figure BDA0002904476810000372
其中**指示与-NH-或与X2的连接点；
X2是
Figure BDA0002904476810000373
其中**指示与-NH-的连接点；
X3是
Figure BDA0002904476810000374
其中**指示与-NH-的连接点；
X4是
Figure BDA0002904476810000375
Figure BDA0002904476810000381
Figure BDA0002904476810000382
其中*指示连接点朝向R14、R24、R34或R44；
R14是
Figure BDA0002904476810000383
-N3、-ONH2、-NR6C(＝O)CH＝CH2、SH、-SSR7、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR6S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR6C(＝O)CH2Br、-NR6C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-C(＝O)NHNH2、
Figure BDA0002904476810000384
-CO2H、-NH2、
Figure BDA0002904476810000385
Figure BDA0002904476810000386
Figure BDA0002904476810000391
R24是
Figure BDA0002904476810000392
Figure BDA0002904476810000393
R34是-N3、-ONH2、-NR7C(＝O)CH＝CH2、-C(＝O)NHNH2、-CO2H、-NH2、
Figure BDA0002904476810000394
R44是
Figure BDA0002904476810000395
-NR7C(＝O)CH2R8；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
R7是2-吡啶基或4-吡啶基；
R8是-S(CH2)nCHR9NH2；
R9是-C(＝O)OR7；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
本发明的接头-药物部分的某些方面及实例是提供在额外的枚举型实施例的下列列表中。应认识到，每个实施例中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供本发明的另外实施例。
实施例31.具有式(C)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(C-1)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000401
其中：R2和R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例32.具有式(C)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(C-2)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000402
其中：R2和R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例33.具有式(C)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(C-3)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000411
其中：R2和R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例32.具有式(C)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(C-4)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000412
其中：R2和R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例33.具有式(C)、式(C-1)、式(C-2)、式(C-3)或式(C-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或C1-C6烷基。
实施例34.具有式(C)、式(C-1)、式(C-2)、式(C-3)或式(C-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或甲基。
实施例35.具有式(C)、式(C-1)、式(C-2)、式(C-3)或式(C-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H。
实施例36.具有式(C)、式(C-1)、式(C-2)、式(C-3)或式(C-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是甲基。
实施例37.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(C-5)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000413
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例38.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(C-6)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000421
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例39.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(C-7)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000422
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例40.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(C-8)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000423
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例41.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(C-9)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000424
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例42.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(C-10)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000431
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例43.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(C-11)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000432
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例44.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(C-12)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000433
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例45.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)、或如实施例37所述的化合物，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000434
实施例46.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)、或如实施例37所述的化合物，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000441
实施例47.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)、或如实施例38所述的化合物，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000442
实施例48.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)、或如实施例38所述的化合物，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000443
在一个方面，本发明的接头-药物部分是具有式(C)的结构的化合物，或其立体异构体或药学上可接受的盐，
Figure BDA0002904476810000444
其中：
RA是
Figure BDA0002904476810000445
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
R5是-L1R14、-L1R24、-L1R34或-L1R44；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R14的连接点；
X1是
Figure BDA0002904476810000451
Figure BDA0002904476810000452
其中**指示与-NH-或与X2的连接点；
X2是
Figure BDA0002904476810000453
其中**指示与-NH-的连接点；
X3是
Figure BDA0002904476810000454
其中**指示与-NH-的连接点；
X4是
Figure BDA0002904476810000461
Figure BDA0002904476810000462
Figure BDA0002904476810000463
其中*指示连接点朝向R14、R24、R34或R44；
R14是
Figure BDA0002904476810000464
-N3、-ONH2、-NR6C(＝O)CH＝CH2、SH、-SSR7、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR6S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR6C(＝O)CH2Br、-NR6C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-C(＝O)NHNH2、
Figure BDA0002904476810000465
-CO2H、-NH2、
Figure BDA0002904476810000466
Figure BDA0002904476810000467
Figure BDA0002904476810000471
R24是
Figure BDA0002904476810000472
Figure BDA0002904476810000473
R34是-N3、-ONH2、-NR7C(＝O)CH＝CH2、-C(＝O)NHNH2、-CO2H、-NH2、
Figure BDA0002904476810000474
R44是
Figure BDA0002904476810000475
或-NR7C(＝O)CH2R8；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
R7是2-吡啶基或4-吡啶基；
R8是-S(CH2)nCHR9NH2；
R9是-C(＝O)OR7；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
本发明的接头-药物部分的某些方面及实例是提供在额外的枚举型实施例的下列列表中。应认识到，每个实施例中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供本发明的另外实施例。
实施例49.具有式(D)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(D-1)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000481
其中：R2和R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例50.具有式(D)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(D-2)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000482
其中：R2和R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例51.具有式(D)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(D-3)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000491
其中：R2和R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例52.具有式(D)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(D-4)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000492
其中：R2和R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例53.具有式(D)、式(D-1)、式(D-2)、式(D-3)或式(D-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或C1-C6烷基。
实施例54.具有式(D)、式(D-1)、式(D-2)、式(D-3)或式(D-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或甲基。
实施例55.具有式(D)、式(D-1)、式(D-2)、式(D-3)或式(D-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H。
实施例56.具有式(D)、式(D-1)、式(D-2)、式(D-3)或式(D-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是甲基。
实施例57.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(D-5)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000493
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例58.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(D-6)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000501
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例59.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(D-7)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000502
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例60.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(D-8)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000503
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例61.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(D-9)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000504
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例62.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(D-10)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000511
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例63.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(D-11)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000512
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例64.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，具有式(D-12)的结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002904476810000513
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例65.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)、或如实施例57所述的化合物，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000514
实施例66.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)、或如实施例57所述的化合物，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000521
实施例67.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)、或如实施例58所述的化合物，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000522
实施例68.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)、或如实施例58所述的化合物，其中该化合物是
Figure BDA0002904476810000523
抗体药物缀合物
本披露提供了抗体药物缀合物，其中特异性结合cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)任选地通过接头与药物部分(例如细胞毒性剂)连接。在一个方面，抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)通过接头经由共价连接与作为细胞毒性剂的药物部分连接。
抗体药物缀合物可以选择性地将细胞毒性剂递送至表达cKIT的细胞，例如造血干细胞，从而选择性地消融患者，例如造血干细胞移植受者中的那些细胞。优选地，cKIT抗体药物缀合物具有短的半衰期并且将从患者的循环中清除，因此它们可用于在造血干细胞移植之前调理造血干细胞移植受者。
在一些实施例中，本文披露的cKIT抗体药物缀合物被修饰以甚至当交联和/或多聚化成较大的复合物时也具有降低的诱导肥大细胞脱粒的能力。例如，本文披露的cKIT抗体药物缀合物被修饰以甚至当交联和/或多聚化成较大的复合物时也具有降低的诱导肥大细胞脱粒的能力，与全长cKIT抗体、其F(ab’)2或F(ab)2片段、或缀合物相比，该能力降低、降低约或降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。在一些实施例中，本文披露的cKIT抗体药物缀合物可以包含抗cKIT Fab或Fab’片段。在一些实施例中，本文披露的抗cKIT抗体药物缀合物甚至当交联和/或多聚化成较大的复合物时也可以具有诱导肥大细胞脱粒的极小活性，例如在β-己糖胺酶释放测定中，基线校正的O.D.读出小于0.25，例如小于0.2、小于0.15、或小于0.1。
在一些实施例中，本文提供了缀合物，这些缀合物包含特异性结合cKIT、任选地通过接头与药物部分(例如细胞毒性剂)连接的抗体片段(例如Fab或Fab’)(抗cKIT Fab或Fab’)。如本文所述，此类抗cKIT Fab或Fab’-毒素缀合物能够消融体外和体内的人HSC细胞，但甚至当交联和/或多聚化成较大的复合物时也不引起肥大细胞脱粒。
在一个方面，本披露提供了一种具有式(I)的缀合物：
A-(LB-(D)n)y 式(I)；
其中：
A是特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab或Fab’)；
LB是接头；
D是细胞毒性剂；
n是从1至10的整数，并且
y是从1至10的整数，
其中接头-药物部分(LB-(D)n)共价连接至抗体片段(A)。
在一个方面，本披露涉及一种具有式(II)的缀合物：
Figure BDA0002904476810000531
A1是特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab或Fab’)或链(例如HC或LC)；
A2是特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab或Fab’)或链(例如HC或LC)；
LB是接头；
D是细胞毒性剂，并且
n是从1至10的整数，
其中接头-药物部分(LB-(D)n)共价偶联抗体片段A1和A2。
在一个方面，本发明的缀合物包含一种或多种共价连接至接头(LB)的细胞毒素，其中该一种或多种细胞毒素独立地选自具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)、式(A-4)、式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)或式(B-4)的化合物、或如实施例7至14中任一项或如实施例23至30中任一项所述的化合物。
在一个方面，本发明的缀合物包含一种或多种共价连接至接头(LB)的细胞毒素，其中该一种或多种细胞毒素独立地选自具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)或式(A-4)的化合物、或如实施例7至14中任一项所述的化合物。
在一个方面，本发明的缀合物包含一种或多种共价连接至接头(LB)的细胞毒素，其中该一种或多种细胞毒素独立地选自具有式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)或式(B-4)的化合物、或如实施例23至30中任一项所述的化合物。
在具有式(I)的缀合物中，一个或多个接头-药物部分(LB-(D)n)可以共价连接至抗体片段A(例如Fab或Fab’)，从而通过接头LB将一个或多个药物部分D共价连接至抗体片段A(例如Fab或Fab’)。LB是能够将抗体片段A(例如Fab或Fab’)与一个或多个药物部分D连接的任何化学部分。具有式(I)的缀合物(其中一个或多个药物部分D共价连接至抗体片段A(例如Fab或Fab’))可以使用具有一个或多个相同或不同的反应性官能团的双功能或多功能接头试剂形成。双功能或多功能接头试剂的反应性官能团之一用于与抗体片段A上的基团例如硫醇或胺(例如半胱氨酸、N末端或氨基酸侧链如赖氨酸)反应以与LB接头的一端形成共价键。双功能或多功能接头试剂的此类反应性官能团包括但不限于马来酰亚胺、硫醇和NHS酯。双功能或多功能接头试剂的一个或多个其他反应性官能团用于将一个或多个药物部分D共价连接至接头LB。
在具有式(II)的缀合物中，通过抗体片段A1和A2上的侧链硫醇与1,3-二卤代丙酮(如1,3-二氯丙酮、1,3-二溴丙酮、1,3-二碘丙酮)和1,3-二羟基丙酮的二磺酸酯的反应形成酮桥，该酮桥从而共价偶联抗体片段A1和A2。该酮桥部分用于通过接头LB将一个或多个药物部分D共价连接至抗体片段A1和A2。LB是能够将抗体片段A1和A2与一个或多个药物部分D连接的任何化学部分。具有式(II)的缀合物(其中一个或多个药物部分D共价连接至抗体片段A1和A2)可以使用具有一个或多个相同或不同的反应性官能团的双功能或多功能接头试剂形成。在一个实施例中，双功能或多功能接头试剂的一个反应性官能团是烷氧基胺，该烷氧基胺用于与酮桥反应以与接头LB的一端形成肟键，并且双功能或多功能接头试剂的一个或多个其他反应性官能团用于将一个或多个药物部分D共价连接至接头LB。在另一个实施例中，双功能或多功能接头试剂的一个反应性官能团是肼，该肼用于与酮桥反应以与接头LB的一端形成腙键，并且双功能或多功能接头试剂的一个或多个其他反应性官能团用于将一个或多个药物部分D共价连接至接头LB。
在一个方面，LB是可裂解接头。在另一个方面，LB是不可裂解接头。在一些方面，LB是酸不稳定接头、光不稳定接头、肽酶可裂解接头、酯酶可裂解接头、糖苷酶可裂解接头、磷酸二酯酶可裂解接头、二硫键可还原接头、亲水接头、或基于二羧酸的接头。
虽然对于特定缀合物分子而言，药物对抗体比率具有确切的整数值(例如，在式(I)中为n和y的乘积并且在式(II)中为“n”)，但是应理解当用来描述含有许多分子的样品时，该值将经常是平均值，这归因于典型地与缀合步骤相关的某种程度的非均匀性。缀合物样品的平均载量在本文中称为药物对抗体(或Fab’)比率或“DAR”。在一些方面，DAR在约1与约5之间，并且典型地是约1、2、3或4。在一些方面，按重量计至少50％的样品是具有平均DAR加或减2的化合物，并且优选地至少50％的样品是含有平均DAR加或减1的缀合物。其他方面包括其中DAR是约2的缀合物。在一些方面，“约y”的DAR意指DAR的测量值在式(I)中n和y的乘积的20％内。在一些方面，“约n”的DAR意指DAR的测量值在式(II)中n的20％内。
在一个方面，在具有式(I)的缀合物中药物对抗体片段(Fab或Fab’)的平均摩尔比(即，n和y的乘积(也称为药物对抗体比率(DAR)的平均值)是约1至约10、约1至约6(例如0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0)、约1至约5、约1.5至约4.5、或约2至约4。
在一个方面，在具有式(II)的缀合物中药物对抗体片段A1和A2的平均摩尔比(即，n(也称为药物对抗体比率(DAR)的平均值)是约1至约10、约1至约6(例如0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0)、约1至约5、约1.5至约4.5、或约2至约4。
在由本披露提供的一个方面，缀合物具有实质上高的纯度并且具有以下特征中的一个或多个：(a)大于约90％(例如大于或等于约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)、优选大于约95％的缀合物种类是单体的，(b)缀合物制剂中的未缀合的接头水平小于约10％(例如小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或0％)(相对于总接头)，(c)小于10％的缀合物种类是交联的(例如小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或0％)，(d)缀合物制剂中的游离药物(例如澳瑞司他汀、鹅膏蕈碱、类美登素或皂草素)水平小于约2％(例如小于或等于约1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、或0％)(相对于总细胞毒性剂的mol/mol)。
在一个方面，本发明的缀合物具有式(E)的结构：
Figure BDA0002904476810000571
其中：
A表示特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab或Fab’)；
y是从1至10的整数；
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的连接点；
X1是
Figure BDA0002904476810000572
Figure BDA0002904476810000581
其中**指示与-NH-或与X2的连接点；
X2是
Figure BDA0002904476810000582
其中**指示与-NH-的连接点；
X3是
Figure BDA0002904476810000583
其中**指示与-NH-的连接点；
X4是
Figure BDA0002904476810000584
Figure BDA0002904476810000585
Figure BDA0002904476810000586
其中*指示连接点朝向R114；
R114是
Figure BDA0002904476810000587
-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、
Figure BDA0002904476810000591
Figure BDA0002904476810000592
其中*指示与A的连接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
在一个方面，本发明的缀合物具有式(F)的结构：
Figure BDA0002904476810000601
其中：
A表示特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab或Fab’)；
y是从1至10的整数；
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的连接点；
X1是
Figure BDA0002904476810000611
Figure BDA0002904476810000612
其中**指示与-NH-或与X2的连接点；
X2是
Figure BDA0002904476810000613
其中**指示与-NH-的连接点；
X3是
Figure BDA0002904476810000614
其中**指示与-NH-的连接点；
X4是
Figure BDA0002904476810000615
Figure BDA0002904476810000616
Figure BDA0002904476810000617
其中*指示连接点朝向R114；
R114是
Figure BDA0002904476810000621
-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、
Figure BDA0002904476810000622
Figure BDA0002904476810000623
其中*指示与A的连接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
在一个方面，本发明的缀合物具有式(G)的结构：
Figure BDA0002904476810000631
其中：
A表示特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab或Fab’)；
y是从1至10的整数；
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的连接点；
X1是
Figure BDA0002904476810000641
Figure BDA0002904476810000642
其中**指示与-NH-或与X2的连接点；
X2是
Figure BDA0002904476810000643
其中**指示与-NH-的连接点；
X3是
Figure BDA0002904476810000644
其中**指示与-NH-的连接点；
X4是
Figure BDA0002904476810000645
Figure BDA0002904476810000651
Figure BDA0002904476810000652
其中*指示连接点朝向R114；
R114是
Figure BDA0002904476810000653
-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、
Figure BDA0002904476810000654
Figure BDA0002904476810000661
Figure BDA0002904476810000662
其中*指示与A的连接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
在一个方面，本发明的缀合物具有式(H)的结构：
Figure BDA0002904476810000663
其中：
A表示特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab或Fab’)；
y是从1至10的整数；
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的连接点；
X1是
Figure BDA0002904476810000671
Figure BDA0002904476810000672
其中**指示与-NH-或与X2的连接点；
X2是
Figure BDA0002904476810000673
其中**指示与-NH-的连接点；
X3是
Figure BDA0002904476810000674
其中**指示与-NH-的连接点；
X4是
Figure BDA0002904476810000681
Figure BDA0002904476810000682
Figure BDA0002904476810000683
其中*指示连接点朝向R114；
R114是
Figure BDA0002904476810000684
-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、
Figure BDA0002904476810000685
Figure BDA0002904476810000691
Figure BDA0002904476810000692
其中*指示与A的连接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
本发明的缀合物的某些方面及实例是提供在额外的枚举型实施例的下列列表中。应认识到，每个实施例中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供本发明的另外实施例。
实施例69.具有式(E)的结构的缀合物是具有式(E-1)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000701
其中：R2、R114、A、y和L1是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例70.具有式(F)的结构的缀合物是具有式(F-1)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000702
其中：R2、R114、A、y和L1是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例71.具有式(G)的结构的缀合物是具有式(G-1)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000703
其中：R2、R114、A、y和L1是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例72.具有式(H)的结构的缀合物是具有式(H-1)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000704
其中：R2、R114、A、y和L1是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例73.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)或如实施例69至72中任一项所述的缀合物，其中R2是H或C1-C6烷基。
实施例74.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)或如实施例69至72中任一项所述的缀合物，其中R2是H或甲基。
实施例75.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)或如实施例69至72中任一项所述的缀合物，其中R2是H。
实施例76.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)或如实施例69至72中任一项所述的缀合物，其中R2是甲基。
实施例77.具有式(E)的结构的缀合物是具有式(E-2)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000711
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例78.具有式(E)的结构的缀合物是具有式(E-3)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000712
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例79.具有式(E)或式(E-1)的结构的缀合物是具有式(E-4)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000721
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例80.具有式(E)或式(E-1)的结构的缀合物是具有式(E-5)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000722
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例81.具有式(F)的结构的缀合物是具有式(F-2)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000723
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例82.具有式(F)的结构的缀合物是具有式(F-3)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000724
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例83.具有式(F)或式(F-1)的结构的缀合物是具有式(F-4)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000731
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例84.具有式(F)或式(F-1)的结构的缀合物是具有式(F-5)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000732
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例85.具有式(G)的结构的缀合物是具有式(G-2)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000733
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例86.具有式(G)的结构的缀合物是具有式(G-3)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000741
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例87.具有式(G)或式(G-1)的结构的缀合物是具有式(G-4)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000742
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例88.具有式(G)或式(G-1)的结构的缀合物是具有式(G-5)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000743
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例89.具有式(H)的结构的缀合物是具有式(H-2)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000744
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例90.具有式(H)的结构的缀合物是具有式(H-3)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000751
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例91.具有式(H)或式(H-1)的结构的缀合物是具有式(H-4)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000752
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例92.具有式(H)或式(H-1)的结构的缀合物是具有式(H-5)的结构的缀合物：
Figure BDA0002904476810000753
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例93.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至92中任一项所述的缀合物，其中：
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**或-X1C(＝O)(CH2)m-**，其中**指示与R114的连接点；
并且
X1是
Figure BDA0002904476810000761
Figure BDA0002904476810000762
其中**指示与-NH-或与X2的连接点。
实施例94.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至92中任一项所述的缀合物，其中：
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**，其中**指示与R114的连接点；
并且
X1是
Figure BDA0002904476810000763
Figure BDA0002904476810000764
其中**指示与-NH-或与X2的连接点。
实施例95.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至94中任一项所述的缀合物，每个m独立地选自1、2、3、4、5和6。
实施例96.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至94中任一项所述的缀合物，每个m独立地选自1、2、3、4和5。
实施例97.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至94中任一项所述的缀合物，每个m独立地选自1、2、3和4。
实施例98.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至94中任一项所述的缀合物，每个m独立地选自1、2和3。
实施例99.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至94中任一项所述的缀合物，每个m独立地选自1和2。
实施例100.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至99中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
实施例101.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至99中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。
实施例102.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至99中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
实施例103.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至99中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
实施例104.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至99中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7和8。
实施例105.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至99中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5、6和7。
实施例106.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至99中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5和6。
实施例107.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至99中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4和5。
实施例108.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至99中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3和4。
实施例109.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至99中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2和3。在上述实施例中的每一项中，每个n独立地选自1和2。
实施例110.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至109中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
实施例111.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至109中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。
实施例112.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至109中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
实施例113.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至109中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
实施例114.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至109中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5、6、7和8。
实施例115.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至109中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5、6和7。
实施例116.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至109中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5和6。
实施例117.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至109中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4和5。
实施例118.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至109中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3和4。
实施例119.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至109中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2和3。
实施例120.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至109中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1和2。
实施例121.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至120中任一项所述的缀合物，其中：
L1是
Figure BDA0002904476810000791
其中**指示与-NH-或与X2的连接点。
实施例121.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至120中任一项所述的缀合物，其中：
L1是
Figure BDA0002904476810000792
其中**指示与-NH-或与X2的连接点。
实施例122.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例69至121中任一项所述的缀合物，其中：
R114是
Figure BDA0002904476810000793
其中*指示与A的连接点。
实施例123.具有式(E)、式(E-1)、式(E-2)和式(E-4)的缀合物，该缀合物选自：
Figure BDA0002904476810000801
Figure BDA0002904476810000802
并且
Figure BDA0002904476810000803
其中y和A是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例124.具有式(E)、式(E-1)、式(E-3)和式(E-5)的缀合物，该缀合物选自：
Figure BDA0002904476810000804
Figure BDA0002904476810000805
并且
Figure BDA0002904476810000811
其中y和A是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例125.具有式(F)、式(F-1)、式(F-2)和式(F-4)的缀合物，该缀合物选自：
Figure BDA0002904476810000812
Figure BDA0002904476810000813
以及
Figure BDA0002904476810000814
其中y和A是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例126.具有式(F)、式(F-1)、式(F-3)和式(F-5)的缀合物，该缀合物选自：
Figure BDA0002904476810000821
Figure BDA0002904476810000822
以及
Figure BDA0002904476810000823
其中y和A是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例127.具有式(G)、式(G-1)、式(G-2)和式(G-4)的缀合物，该缀合物选自：
Figure BDA0002904476810000824
Figure BDA0002904476810000831
并且
Figure BDA0002904476810000832
其中y和A是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例128.具有式(G)、式(G-1)、式(G-3)和式(G-5)的缀合物，该缀合物选自：
Figure BDA0002904476810000833
Figure BDA0002904476810000834
并且
Figure BDA0002904476810000835
其中y和A是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例129.具有式(H)、式(H-1)、式(H-2)和式(H-4)的缀合物，该缀合物选自：
Figure BDA0002904476810000841
Figure BDA0002904476810000842
以及
Figure BDA0002904476810000843
其中y和A是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例130.具有式(H)、式(H-1)、式(H-3)和式(H-5)的缀合物，该缀合物选自：
Figure BDA0002904476810000844
Figure BDA0002904476810000851
以及
Figure BDA0002904476810000852
其中y和A是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
本文披露的具有任一种式(如式(A)、式(B)、式(C)、式(D)、式(E)、式(F)、式(G)和式(H))的化合物可以使用在以下实例中所述的方法产生。以下实例旨在说明本发明，而不应被解释为对其的限制。温度以摄氏度给出。如果没有另外提及，所有蒸发都在减压下进行，典型地在约15mm Hg与100mm Hg(＝20-133mbar)之间。终产物、中间体和起始物质的结构通过标准分析方法(例如，微量分析和光谱特征(例如，MS、IR、NMR))确认。使用的缩写是本领域常规的缩写。
缩写：
Figure BDA0002904476810000853
Figure BDA0002904476810000861
用以合成本发明的化合物的所有起始材料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂及催化剂是可商购获得的或者可通过本领域的普通技术人员已知的有机合成方法产生或可以通过如本文描述的有机合成方法产生。
中间体的合成
(S)-(3-(2-氨基-3-羟丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-1)的合成
Figure BDA0002904476810000862
步骤1：在0℃下在搅拌下将在THF中的BH3(1M，10ml)添加至在THF(10ml)中的(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(3-硝基苯基)丙酸(562mg，1.81mmol)中。然后将反应物在50℃下搅拌1h。将反应混合物在0℃下冷却，用水淬灭，用EtOAc稀释并且用10％K2CO3水溶液洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将粗制物通过硅胶柱(30％-70％EtOAc-己烷)纯化，获得作为白色固体的(S)-(1-羟基-3-(3-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 319.1(M+Na)。停留时间1.183分钟。1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ8.13-8.04(m,2H),7.57(d,J＝7.7Hz,1H),7.46(dd,J＝8.9,7.6Hz,1H),4.76(s,1H),3.87(dq,J＝8.0,4.6,4.1Hz,1H),3.69(dd,J＝10.9,3.9Hz,1H),3.58(dd,J＝10.8,4.7Hz,1H),2.97(td,J＝13.1,12.5,7.3Hz,2H),1.37(s,9H)。
步骤2：向在乙腈(5ml)中的(S)-(1-羟基-3-(3-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.31g，1.0mmol)中添加10％盐酸(5ml)。将反应混合物在rt下搅拌48h并且然后浓缩，得到作为HCl盐的(S)-2-氨基-3-(3-硝基苯基)丙-1-醇。MS m/z 197.2(M+H)。保留时间0.775min。
步骤3：将(S)-2-氨基-3-(3-硝基苯基)丙-1-醇HCl盐(0.243g，1.046mmol)溶解于MeOH(10ml)中并且添加10％钯碳(50mg，0.047mmol)。附接2L氢气球。将反应物用H2吹扫三次并且然后在rt下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将反应物通过硅藻土垫过滤并且浓缩，得到作为HCl盐的(S)-2-氨基-3-(3-氨基苯基)丙-1-醇。MS m/z 167.2(M+H)。保留时间0.373min。
步骤4：将(S)-2-氨基-3-(3-氨基苯基)丙-1-醇HCl盐(0.212g，1.046mmol)和Boc2O(228mg，1.05mmol)和二噁烷-水-AcOH(10:9:1，20ml)合并并且在rt下搅拌3天。LCMS指示反应完成75％。添加另外的Boc2O(150mg)并且将反应再搅拌6h。然后将反应混合物浓缩并且用制备型HPLC(具有0.05％TFA的10％-40％乙腈水溶液)纯化，得到作为油状物的(S)-(3-(2-氨基-3-羟丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-1)。MS m/z 267.2(M+H)。保留时间1.011min。
(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(i-2)的合成
Figure BDA0002904476810000881
步骤1：将Dil-OtBu HCl盐(
Figure BDA0002904476810000882
388mg，0.982mmol)、(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(
Figure BDA0002904476810000883
287mg，1.19mmol)、HATU(411mg，1.08mmol)和DIEA(0.42ml，2.38mmol)和DMF(5ml)合并并且在rt下搅拌30min。将反应混合物用水(10ml)稀释并且通过RP-C18 ISCO纯化，得到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-(叔丁氧基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯
Figure BDA0002904476810000884
MS(m+1)＝582.5，HPLC峰值RT＝1.542min
步骤2：将步骤1中获得的产物(540mg，0.93mmol)在4M HCl的1.4-二噁烷溶液(10ml)中在rt下搅拌过夜。将反应混合物浓缩，得到(3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸，
Figure BDA0002904476810000885
MS(m+1)＝426.2，HPLC峰值RT＝0.736min
步骤3：将步骤2中获得的产物(430mg，0.93mmol)、37％甲醛溶液(0.38ml，4.7mmol)、乙酸(0.27ml，4.65mmol)、NaBH3CN(585mg，9.31mmol)和MeOH(10ml)合并并且在rt下搅拌30min并且然后浓缩。将残余物通过RP-C18 ISCO纯化，得到450mg作为TFA盐的(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(i-2)。将TFA盐用10ml 12N HCl溶液处理并且浓缩两次，得到(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸HCl盐。MS(m+1)＝440.2，HPLC峰值RT＝0.754min。
Dap-OMe的合成：((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酸甲酯)(i-3)
Figure BDA0002904476810000891
步骤1：将Boc-Dap-OH(
Figure BDA0002904476810000892
3.11g，10.8mmol)、K2CO3(2.99g，21.6mmol)、碘甲烷(2.95g)和丙酮(55mL)合并。将反应物在20℃下搅拌2h。将另外的甲基碘(2.28g)添加至反应物中并且将反应物在40℃下搅拌3h。将反应混合物浓缩。将残余物在200mL EtOAc与100mL H2O之间分配。将有机层分离，用50mL饱和的NaCl水溶液洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩，提供作为黄色油状物的Boc-Dap-OMe，
Figure BDA0002904476810000893
MS(ESI+)m/z计算值324.2，实测值324.2(M+23)。保留时间1.245min。
步骤2：将Boc-Dap-OMe(3.107g，10.3mmol)与HCl的乙醚溶液(2M，10mL)合并并且浓缩。重复该操作。在第7次处理后反应完成。在浓缩之后获得作为白色固体的Dap-OMe(i-3)的HCl盐。MS(ESI+)m/z计算值202.1，实测值202.2(M+1)。保留时间0.486min。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.065-4.041(m,1H),3.732(br.s,1H),3.706(s,3H),3.615(s,3H),3.368(br.s,1H),3.314(br.s,1H),2.795(q,1H,J＝6.8Hz),2.085-1.900(m,4H),1.287(d,3H,J＝7.2Hz)。
(S)-(3-(2-氨基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-4)的合成
Figure BDA0002904476810000901
步骤1：在RT下向2-(3-硝基苯基)乙酸(3g，16.56mmol)在DMF(无水，17ml)的溶液中添加HATU(6.93g，18.22mmol)、N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(1.615g，16.56mmol)和DIPEA(14.46ml，83mmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物高真空浓缩以去除大部分溶剂。然后将残余物在DCM与水之间萃取。将水相用DCM萃取2次。将合并的DCM相真空浓缩。将残余物通过硅胶快速柱(EtOAc/庚烷0％-70％，然后70％)分离，获得3.5g作为白色固体的N-甲氧基-N-甲基-2-(3-硝基苯基)乙酰胺。MS m/z 225.1(M+1)。保留时间1.09min。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.28-8.09(m,2H),7.67(m,1H),7.63-7.46(m,1H),3.90(s,2H),3.74(s,3H),3.24(s,3H)。
步骤2：在N2气氛下在-78℃(丙酮-干冰浴)下向TMEDA(2.63mL，17.39mmol)在THF(无水，30ml)中的溶液中逐滴添加正丁基锂(2.5M，在己烷中)(1.028g，16.06mmol)。然后还在-78℃下将2-溴噻唑(2.63g，16.06mmol)逐滴添加至反应混合物中。将反应混合物在-78℃下搅拌1h。在-78℃下将N-甲氧基-N-甲基-2-(3-硝基苯基)乙酰胺(3g，13.38mmol)在THF(30ml)中的混合物逐滴添加至反应混合物中。将反应混合物在-78℃下搅拌1h，然后在-10℃(丙酮-冰浴)下搅拌2h。将反应混合物通过添加饱和KHSO4水溶液淬灭，然后用EtOAc萃取3次。将合并的EtOAc相经饱和NaCl、NaSO4干燥，并且浓缩。将残余物通过硅胶快速柱(EtOAc/庚烷0％-30％，然后30％)分离，获得1.95g作为浅黄色油状物的2-(3-硝基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-酮。MS m/z 249.0(M+1)。保留时间1.34min。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.33-8.22(m,1H),8.17(ddd,J＝8.1,2.3,1.0Hz,1H),8.10(d,J＝3.0Hz,1H),7.79-7.67(m,2H),7.54(t,J＝7.9Hz,1H),4.62(s,2H)。
步骤3：在N2气氛下在0℃(冰水浴)下向(+)-DIP-氯化物TM(9.22g，28.8mmol)在乙醚(7ml)中的溶液中逐滴添加2-(3-硝基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-酮(2.38g，9.59mmol)在乙醚(37ml)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌24h。然后在水-冰浴中将混合物用在10℃下的10％NaOH和30％H2O2的30ml(1:1)混合物中和。将混合物在RT下搅拌1h。然后将混合物用水稀释，用EtOAc萃取3次。将合并的EtOAc相用饱和K2CO3、饱和NaCl洗涤，并且经NaSO4干燥，并且浓缩。将残余物通过硅胶快速柱(EtOAc/庚烷0％-60％，然后60％)分离，获得1.639g作为浅黄色固体的(R)-2-(3-硝基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-醇。MS m/z 251.1(M+1)。保留时间1.09min。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.33-8.07(m,2H),8.07-7.80(m,1H),7.74-7.55(m,1H),7.55-7.36(m,2H),5.55(dd,J＝7.9,4.1Hz,1H),4.48(s,1H),3.53(dd,J＝13.9,4.0Hz,1H),3.32(dd,J＝13.9,8.1Hz,1H)。92％e.e.，通过手性SFC确定的。
步骤4：向(R)-2-(3-硝基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-醇(1.636g，6.54mmol)在MeOH(20ml)中的溶液中添加Pd/C(10％，0.696g，0.654mmol)。在三次真空/H2循环后，向反应混合物中通入H2(1atm)，并且将反应混合物在RT下搅拌。在过夜搅拌后，将反应混合物通过硅藻土过滤并且用MeOH洗涤。将滤液真空浓缩，获得1.3g作为固体的(R)-2-(3-氨基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-醇，将该固体不经进一步纯化而直接用于下一个步骤。MS m/z 221.1(M+1)。保留时间0.50min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.72(d,J＝3.2Hz,1H),7.59(d,J＝3.2Hz,1H),6.88(t,J＝7.7Hz,1H),6.46(t,J＝1.9Hz,1H),6.42-6.29(m,2H),6.14(d,J＝5.7Hz,1H),5.03-4.78(m,3H),3.03(dd,J＝13.7,4.0Hz,1H),2.72(dd,J＝13.7,8.7Hz,1H)。
步骤5：向(R)-2-(3-氨基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-醇(1.3g，5.92mmol)在二噁烷/水(1/1，16ml/16ml)中的混合物中添加Boc2O(1.512ml，6.51mmol)和NaOH(0.284g，7.10mmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。向反应混合物中添加10ml水，然后用EtOAc(3×40ml)萃取。将有机相合并，经Na2SO4干燥，然后真空浓缩。然后将残余物通过硅胶快速柱(EtOAc/庚烷0％至80％，然后80％)分离，获得1.24g作为固体的(R)-(3-(2-羟基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 321.3(M+1)。保留时间1.26min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.24(s,1H),7.73(d,J＝3.2Hz,1H),7.60(d,J＝3.3Hz,1H),7.39(t,J＝1.8Hz,1H),7.25(ddd,J＝8.2,2.3,1.1Hz,1H),7.11(t,J＝7.8Hz,1H),6.80(dt,J＝7.7,1.2Hz,1H),6.20(d,J＝5.7Hz,1H),4.97(ddd,J＝8.6,5.7,4.0Hz,1H),3.13(dd,J＝13.7,4.0Hz,1H),2.83(dd,J＝13.7,8.7Hz,1H),1.47(s,9H)。
步骤6：在N2气氛下向(R)-(3-(2-羟基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.2g，3.75mmol)在THF(无水，25ml)中的冰-水浴冷却的溶液中添加PPh3(1.670g，6.37mmol)。然后在0℃下逐滴添加DEAD(40％wt，在甲苯中)(2.90ml，6.37mmol)，之后逐滴添加DPPA(1.372ml，6.37mmol)。然后移除冷浴。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩，并且然后进行快速硅胶柱分离(EtOAc/庚烷0％至30％，然后30％)，获得1.03g作为油状物的(S)-(3-(2-叠氮基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z346.3(M+1)。保留时间1.55min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.29(s,1H),7.86(d,J＝3.2Hz,1H),7.76(d,J＝3.2Hz,1H),7.41(t,J＝1.9Hz,1H),7.29(ddd,J＝8.3,2.2,1.1Hz,1H),7.16(t,J＝7.8Hz,1H),6.86(dt,J＝7.9,1.2Hz,1H),5.31(dd,J＝8.7,5.7Hz,1H),3.17(d,J＝5.3Hz,1H),3.09(dd,J＝13.9,8.7Hz,1H),1.47(s,9H)。
步骤7：向(S)-(3-(2-叠氮基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(861mg，2.493mmol)在MeOH(4ml)中的溶液中添加Pd/C(10％湿的，265mg，0.249mmol)。在三次真空/H2循环后，向反应混合物中通入H2(1atm)，并且将反应混合物在RT下搅拌。在过夜搅拌后，将反应混合物浓缩并且然后通过硅藻土过滤并且用MeOH洗涤。将滤液真空浓缩，获得781mg作为粘性油状物的(S)-(3-(2-氨基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-4)。MS m/z 320.2(M+1)。保留时间0.91min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.26(s,1H),7.71(d,J＝3.3Hz,1H),7.55(d,J＝3.3Hz,1H),7.36(t,J＝1.9Hz,1H),7.26(dt,J＝8.3,1.5Hz,1H),7.13(t,J＝7.8Hz,1H),6.78(dt,J＝7.6,1.3Hz,1H),4.31(dd,J＝8.7,4.7Hz,1H),3.14(dd,J＝21.2,5.0Hz,1H),2.73(dd,J＝13.4,8.7Hz,1H),2.11(s,2H),1.47(s,9H)。
示例性药物部分的合成
实例A：
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-氨基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(C1)的合成
Figure BDA0002904476810000931
步骤1：向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(250mg，0.346mmol)在DMF(4ml)中的溶液中添加(S)-(3-(2-氨基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-4)(110mg，0.346mmol)、HATU(158mg，0.415mmol)和DIPEA(362μl，2.075mmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩。然后将残余物溶解于MeOH中，并且通过ISCO gold C-18 100克反相柱(MeCN/H2O0％-100％)分离，获得173mg作为白色粉末的(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 911.0(M+1)。保留时间1.15min。
步骤2：将(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(173mg，0.190mmol)溶解于1ml二噁烷中，然后将10ml 4N HCl的二噁烷溶液添加至混合物中。将反应混合物在室温下搅拌30min。将反应混合物高真空浓缩，并且然后在饱和NaHCO3与DCM之间分配以使水相pH为8。将碱性水相用DCM萃取3次。将合并的DCM相经饱和NaCl和Na2SO4干燥，并且然后高真空浓缩，获得155mg作为固体的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-氨基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺。MS m/z810.5(M+1)。保留时间0.90min。
实例B：
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-氨基苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(C2)的合成
Figure BDA0002904476810000941
步骤1：将DIEA(0.105ml，0.60mmol)和HATU(45.5mg，0.12mmol)添加至在DMF(2ml)中的(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(i-2)(57mg，0.12mmol)中。将反应混合物在rt下搅拌5min并且然后添加在DMF(1ml)中的DapOMe(i-3)(28.5mg，0.12mmol)。将反应混合物在rt下搅拌1h并且然后通过制备型HPLC(含有0.05％TFA的10％-50％乙腈-H2O)纯化，获得(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯。MS m/z 623.5(M+H)。保留时间1.225min。
步骤2：将LiOH(30mg，1.25mmol)添加至在MeOH-H2O(1:1，4ml)中的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(43.2mg，0.059mmol)中。将反应混合物在rt下搅拌18h，浓缩并且用HCl(1N，1ml)酸化。将粗制物通过制备型HPLC(含有0.05％TFA的10％-38％乙腈-H2O)纯化，获得作为TFA盐的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸。MS m/z 609.5(M+H)。保留时间0.962min。
步骤3：向在DMF(1ml)中的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(45.7mg，0.063mmol)中添加DIEA(0.055ml，0.32mmol)和HATU(24.0mg，0.063mmol)。将反应混合物在rt下搅拌10min并且然后添加至在DMF(1ml)中的(S)-(3-(2-氨基-3-羟丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯TFA盐(i-1)(24.1mg，0.063mmol)中。将反应混合物在rt下搅拌1h并且然后浓缩。将粗制物通过制备型HPLC(含有0.05％TFA的20％-70％乙腈-H2O)纯化，获得作为TFA盐的(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-羟丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 857.5(M+H)。保留时间1.145min。
步骤4：将(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-羟丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(61.4mg，0.063mmol)在具有5％HCl的乙腈-水(1:1，4ml)中的溶液在rt下搅拌24h。然后将反应混合物浓缩并且通过制备型HPLC(含有0.05％TFA的10％-30％乙腈-H2O)纯化，得到作为TFA盐的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-氨基苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(C2)。MS m/z 757.5(M+H)。保留时间0.744min。
示例性接头-药物化合物的合成
实例C：
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(LP1)的合成
Figure BDA0002904476810000961
步骤1：向(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-氨基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(C1)(154mg，0.190mmol)和Boc-Val-Cit-OH(
Figure BDA0002904476810000971
92mg，0.247mmol)在DCM(5ml)/MeOH(0.1ml)中的混合物中添加EEDQ(94mg，0.380mmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩。然后将残余物溶解于MeOH中，并且通过ISCO gold C-18 50克反相柱(含有0.05％TFA的MeCN/H2O，0％-100％)分离，获得232mg作为TFA盐的((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 1167.3(M+1)。保留时间1.10min。
步骤2：在0℃下在冰-水浴的情况下将((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(232mg，0.181mmol)添加至TFA/DCM(25％，6ml)的冷溶液中，然后将混合物在0℃下搅拌15min，然后温热至RT。将混合物在RT下搅拌30min。将反应混合物真空浓缩。然后将残余物溶解于DMSO中并且通过ISCO gold C-18 50克反相柱(含有0.05％TFA的MeCN/H2O，0％-100％)分离，获得219mg作为TFA盐的((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺。MS m/z 1067.2(M+1)。保留时间0.88min。
步骤3：将((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(219mg 0.18mmol)溶解于DMF(2ml)中，然后添加MAL-PEG1-NHS酯(
Figure BDA0002904476810000981
73.1mg，0.236mmol)和DIPEA(190μl，1.087mmol)。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物真空浓缩。然后将残余物溶解于DMSO中并且通过ISCO goldC-18 50克反相柱(含有0.05％TFA的MeCN/H2O，0％-100％)分离，获得174mg作为TFA盐的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(LP1)。MS m/z 1262.4(M+1)。保留时间1.02min。
实例D：
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(LP2)的合成
Figure BDA0002904476810000982
步骤1：向Fmoc-Cit-OH(
Figure BDA0002904476810000991
10.0mg，0.025mmol)在DMF(1ml)中的溶液中添加DIEA(13.0mg，0.10mmol)并且然后添加HATU(9.6mg，0.025mmol)，并且将反应混合物在rt下搅拌5min并且然后将溶液添加至(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-氨基苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(C2)(20mg，0.025mmol)中。将该反应混合物在rt下搅拌1小时并且然后使用C18柱通过反相HPLC纯化，用含有0.05％TFA的10％-45％乙腈-H2O洗脱。将含有所期望产物的级分浓缩，获得作为TFA盐的((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-羟丙基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。LCMS MS m/z 1136.6(M+1)，保留时间1.042分钟。
步骤2：将((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-羟丙基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(31.5mg，0.025mmol)TFA盐溶解于MeOH(1mL)中。然后添加Pd/C(10mg，9.40μmol)。附接2L氢气球并且将反应混合物用H2真空吹扫三次并且然后在rt下在H2下搅拌30min。然后将催化剂通过硅藻土过滤去除并且将混合物浓缩并用1N NaOH处理。将粗制混合物使用C18柱通过反相HPLC纯化，用含有0.05％TFA的5％-37％乙腈-H2O洗脱。将含有所期望产物的级分冻干，获得作为TFA盐的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-氨基-5-脲基戊酰胺基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺。LCMS m/z
914.6(M+1)，保留时间0.773min。
步骤3：向Cbz-Val-OH(
Figure BDA0002904476810001001
2.6mg，0.011mmol)在DMF(1ml)中的溶液中添加DIEA(0.011ml，0.061mmol)并且然后添加HATU(3.86mg，0.011mmol)。将反应混合物在rt下搅拌5min并且然后添加至(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-氨基-5-脲基戊酰胺基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(11.6mg，0.011mmol)TFA盐在DMF(1ml)中的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌1小时并且然后将粗制物使用C18柱通过反相HPLC纯化，用含有0.05％TFA的10％-50％乙腈-H2O洗脱。将含有所期望产物的级分冻干，获得作为TFA盐的((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-羟丙基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸苄酯。LCMS m/z 1147.6(M+1)，保留时间0.986min。
步骤4：将((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-羟丙基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸苄酯(7.7mg，0.006mmol)TFA盐溶解于MeOH(2ml)中并且然后添加Pd/C(5mg，4.70μmol)。附接2L氢气球并且将反应混合物用H2真空吹扫三次并且然后在H2下搅拌30min。LCMS指示反应完成。然后将催化剂通过硅藻土过滤去除并且然后将混合物浓缩，得到作为TFA盐的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺。LCMS m/z 1013.6(M+1)停留时间0.774min。
步骤5：向Mal-PEG1-酸(
Figure BDA0002904476810001011
1.0mg，0.005mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液中添加DIEA(2.8mg，0.022mmol)并且然后添加HATU(1.8mg，0.005mmol)。将反应物在rt下搅拌5min并且然后添加至(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(4.8mg，0.005mmol)TFA盐在DMF(1ml)中的溶液中。将反应物在rt下搅拌1小时并且然后将粗制物使用C18柱通过反相HPLC纯化，用含有0.05％TFA的10％-38％乙腈-H2O洗脱。将含有所期望产物的级分冻干，获得作为TFA盐的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(LP-2)。LCMSm/z 1208.5(M+1)停留时间0.882min。3.ADC的缀合和制备
用于制备具有式(I)的抗体缀合物的方法
用于形成具有式(I)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案1中：
方案1
A-(RGl)y+y(RG2-LB-(D)n)→A-(LB-(D)n)y 式(I)
其中：RG1是反应性基团(仅举例来说，硫醇或胺或酮)，该反应性基团与连接至接头-药物部分的相容性反应性基团RG2反应，从而将抗体片段A与一个或多个接头-药物部分共价连接。RG1和RG2基团的此类反应的非限制性实例是马来酰亚胺(RG2)与硫醇(RG1)反应得到琥珀酰亚胺环，或羟胺(RG2)与酮(RG1)反应得到肟。
用于形成具有式(II)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案2中：
方案2
Figure BDA0002904476810001021
其中：A1、A2、LB、D和n如本文所定义的，1,3-二卤代丙酮选自1,3-二氯丙酮、1,3-二溴丙酮和1,3-二碘丙酮，并且还原步骤使用选自二硫苏糖醇(DTT)和三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)的还原剂完成。
ADC的缀合和制备
用于制备具有式(I)的抗体缀合物的方法
用于形成具有式(I)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案1中：
方案1
A-(RG1)y+y(RG2-LB-(D)n)→A-(LB-(D)n)y 式(I)
其中：RG1是反应性基团(仅举例来说，硫醇或胺或酮)，该反应性基团与连接至接头-药物部分的相容性反应性基团RG2反应，从而将抗体片段A与一个或多个接头-药物部分共价连接。RG1和RG2基团的此类反应的非限制性实例是马来酰亚胺(RG2)与硫醇(RG1)反应得到琥珀酰亚胺环，或羟胺(RG2)与酮(RG1)反应得到肟。
用于形成具有式(II)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案2中：
方案2
Figure BDA0002904476810001031
其中：A1、A2、LB、D和n如本文所定义的，1,3-二卤代丙酮选自1,3-二氯丙酮、1,3-二溴丙酮和1,3-二碘丙酮，并且还原步骤使用选自二硫苏糖醇(DTT)和三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)的还原剂完成。
用于形成具有式(E)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案3中：
方案3
Figure BDA0002904476810001032
其中：R5是-L1R14、-L1R24、-L1R34或-L1R44并且RG1是反应性基团(仅举例来说，硫醇或胺或酮)，该反应性基团与具有式(C-1)的化合物的相容性R14、R24、R34或R44基团反应形成相应的R114基团。举例来说，马来酰亚胺与硫醇反应得到琥珀酰亚胺环，或者羟胺与酮反应得到肟。A、y、L1、R2、R5和R114如本文所定义的。
用于形成具有式(F)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案4中：
方案4
Figure BDA0002904476810001041
其中：R5是-L1R14、-L1R24、-L1R34或-L1R44并且RG1是反应性基团(仅举例来说，硫醇或胺或酮)，该反应性基团与具有式(C-2)的化合物的相容性R14、R24、R34或R44基团反应形成相应的R114基团。举例来说，马来酰亚胺与硫醇反应得到琥珀酰亚胺环，或者羟胺与酮反应得到肟。A、y、L1、R2、R5和R114如本文所定义的。
用于形成具有式(G)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案5中：
方案5
Figure BDA0002904476810001042
其中：R5是-L1R14、-L1R24、-L1R34或-L1R44并且RG1是反应性基团，例如仅是硫醇或胺或酮，该反应性基团与具有式(D-1)的化合物的相容性R14、R24、R34或R44基团反应形成相应的R114基团。举例来说，马来酰亚胺与硫醇反应得到琥珀酰亚胺环，或者羟胺与酮反应得到肟。A、y、L1、R2、R5和R114如本文所定义的。
用于形成具有式(H)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案6中：
方案6
Figure BDA0002904476810001043
其中：R5是-L1R14、-L1R24、-L1R34或-L1R44并且RG1是反应性基团，例如仅是硫醇或胺或酮，该反应性基团与具有式(D-2)的化合物的相容性R14、R24、R34或R44基团反应形成相应的R114基团。举例来说，马来酰亚胺与硫醇反应得到琥珀酰亚胺环，或者羟胺与酮反应得到肟。A、y、L1、R2、R5和R114如本文所定义的。
4.对所期望抗cKIT ADC的表征和选择
ADC的DAR和聚集性的确定
通过液相色谱-质谱法(LC-MS)评价cKIT ADC的DAR值。从针对还原和去糖基化(适当时，即当包含Fc时)样品的LC-MS数据外推化合物对抗体比率。LC-MS允许定量缀合物样品中连接至抗体的接头-有效负载(化合物)的平均分子数。
使用分析方法评价本发明的抗体药物缀合物。这种分析方法和结果可以证明缀合物具有有利的特性，例如使它们更容易制造、更容易施用至患者、对患者更有效和/或潜在更安全的特性。一个实例是通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定分子大小，其中样品中所期望抗体种类的量相对于样品中存在的高分子量污染物(例如，二聚体、多聚体或聚集抗体)或低分子量污染物(例如，抗体片段、降解产物或单独抗体链)的量来确定。通常，期望具有更高量的单体和更低量的例如聚集的抗体，这是由于例如聚集体对抗体样品的其他特性的影响，这些其他特性如但不限于清除率、免疫原性和毒性。另一个实例是通过疏水相互作用色谱法(HIC)测定疏水性，其中相对于一组已知特性的标准抗体评估样品的疏水性。通常，期望具有低疏水性，这是由于疏水性对抗体样品的其他特性的影响，这些其他特性如但不限于聚集性、随时间的聚集性、对表面的粘附性、肝毒性、清除率和药代动力学暴露。参见Damle,N.K.,Nat Biotechnol.[自然生物技术]2008；26(8):884-885；Singh,S.K.,Pharm Res.[药物研究]2015；32(11):3541-71。
对抗cKIT ADC的选择
为了选择适用于本文所述方法中的抗cKIT ADC，可以使用体外人造血干细胞杀伤试验来筛选抗cKIT ADC的功效和效力。例如，实例5中描述的方法可用于筛选抗cKIT ADC。可基于EC50，例如抗cKIT ADC具有小于500μg/ml，例如小于100μg/ml、小于50μg/ml、小于10μg/ml、或小于5μg/ml的EC50，来选择合适的抗cKIT ADC。
此外，据报道cKIT在肥大细胞上表达，而cKIT的配体干细胞因子(SCF)在体外和体内诱导大鼠腹膜肥大细胞的直接脱粒(Taylor等人,Immunology[免疫学].1995年11月；86(3):427-33)。SCF还在体内诱导人肥大细胞脱粒(Costa等人,J Exp Med.[实验医学杂志]1996；183(6):2681-6)。为了避免移植受者中肥大细胞脱粒引起的潜在有害影响，可以测试所选择的cKIT ADC在体外诱导肥大细胞脱粒的能力。例如，实例6中描述的实验可用于筛选cKITADC，并且可基于极小肥大细胞脱粒，例如，在β-己糖胺酶释放测定中基线校正的O.D.读出小于0.25，例如小于0.2、小于0.15或小于0.1，来选择合适的抗cKIT ADC。
cKIT抗体和抗体片段
本披露提供了特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。本披露的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包括但不限于下文所述的人单克隆抗体或其片段。
在一些实施例中，本披露的抗cKIT抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)甚至当交联和/或多聚化成较大的复合物时也具有与全长抗cKIT抗体相比降低的引起肥大细胞脱粒的能力。在一些实施例中，本文披露的抗cKIT抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)被修饰以甚至当交联和/或多聚化成较大的复合物时也具有降低的诱导肥大细胞脱粒的能力。例如，本文披露的抗cKIT抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)被修饰以甚至当交联和/或多聚化成较大的复合物时也具有降低的诱导肥大细胞脱粒的能力，与全长抗cKIT抗体或其F(ab’)2或F(ab)2片段相比，该能力降低、降低约或降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。在一些实施例中，本文披露的抗cKIT抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)可以包含抗cKIT Fab或Fab’片段。在一些实施例中，本文披露的抗cKIT抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)甚至当交联和/或多聚化成较大的复合物时也可以具有诱导肥大细胞脱粒的极小能力，例如在β-己糖胺酶释放测定中，基线校正的O.D.读出小于0.25，例如小于0.2、小于0.15、或小于0.1。
本文提供的抗体药物缀合物包含结合人cKIT的抗体片段(例如Fab或Fab’)。在一些实施例中，本文提供的抗体药物缀合物包含特异性结合人cKIT的人或人源化抗体片段(例如Fab或Fab’)。在一些实施例中，本文提供的抗体药物缀合物包含特异性结合人cKIT的人或人源化Fab’。在一些实施例中，本文提供的抗体药物缀合物包含特异性结合人cKIT的人或人源化Fab。
在一些实施例中，特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含具有表1中所述的任何VH结构域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:10、36、54、69、95)的VH结构域。其他合适的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)可以包含与表1中所述的任何VH结构域具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VH结构域。
在一些实施例中，特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含具有表1中列出的任一个VH CDR(或HCDR)的氨基酸序列的VH CDR(或HCDR)。在特定方面，本披露提供了抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)，该抗体或抗体片段包含以下(或另选地，由以下组成)：一个、两个、三个、四个、五个或更多个具有表1中列出的任一个VH CDR(或HCDR)的氨基酸序列的VH CDR(或HCDR)。
在一些实施例中，特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含具有表1中所述的任何VL结构域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:23、47、82、108)的VL结构域。其他合适的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)可以包含与表1中所述的任何VL结构域具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL结构域。
在一些实施例中，特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含具有表1中列出的任一个VL CDR(或LCDR)的氨基酸序列的VL CDR(或LCDR)。在特定方面，本披露提供了抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)，该抗体或抗体片段包含以下(或另选地，由以下组成)：一个、两个、三个、四个、五个或更多个具有表1中列出的任一个VL CDR(或LCDR)的氨基酸序列的VL CDR(或LCDR)。
本文披露的其他抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含如下氨基酸，这些氨基酸已经突变，但在CDR区中与表1中所述的序列中绘示的CDR区具有至少60％、70％、80％、90％或95％序列同一性。在一些方面，它包括突变氨基酸序列，其中当与表1所述序列中绘示的CDR区相比时，CDR区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已经突变。
本披露还提供了编码特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的VH、VL、重链和轻链的核酸序列。此类核酸序列可以针对哺乳动物细胞中的表达进行优化。
表1.示例性抗cKIT抗体和抗体片段的序列
Figure BDA0002904476810001081
Figure BDA0002904476810001091
Figure BDA0002904476810001101
Figure BDA0002904476810001111
Figure BDA0002904476810001121
Figure BDA0002904476810001131
Figure BDA0002904476810001141
Figure BDA0002904476810001151
Figure BDA0002904476810001161
Figure BDA0002904476810001171
Figure BDA0002904476810001181
Figure BDA0002904476810001191
Figure BDA0002904476810001201
Figure BDA0002904476810001211
Figure BDA0002904476810001221
Figure BDA0002904476810001231
Figure BDA0002904476810001241
Figure BDA0002904476810001251
Figure BDA0002904476810001261
Figure BDA0002904476810001271
Figure BDA0002904476810001281
Figure BDA0002904476810001291
Figure BDA0002904476810001301
Figure BDA0002904476810001311
Figure BDA0002904476810001321
Figure BDA0002904476810001331
Figure BDA0002904476810001341
Figure BDA0002904476810001351
Figure BDA0002904476810001361
Figure BDA0002904476810001371
Figure BDA0002904476810001381
Figure BDA0002904476810001391
Figure BDA0002904476810001401
Figure BDA0002904476810001411
Figure BDA0002904476810001421
Figure BDA0002904476810001431
Figure BDA0002904476810001441
Figure BDA0002904476810001451
Figure BDA0002904476810001461
本文披露的其他抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包括如下那些抗体或抗体片段，其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已经突变，但与表1中所述的序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％同一性。在一些方面，它包括突变氨基酸序列，其中当与表1所述序列中绘示的可变区相比时，可变区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已经突变，同时保留基本上相同的治疗活性。
因为这些抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)中的每一种均可以结合cKIT，所以VH、VL、重链和轻链序列(氨基酸序列和编码氨基酸序列的核苷酸序列)可以“混合且匹配”以产生其他结合cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)。可以使用本领域已知的结合测定(例如，ELISA和实例部分中描述的其他测定)来测试这种“混合且匹配的”结合cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)。当这些链被混合且匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列应当用结构上相似的VH序列替代。同样，来自特定重链/轻链配对的重链序列应当替换为结构上相似的重链序列。同样，来自特定VH/VL配对的VL序列应当用结构上相似的VL序列替代。同样，来自特定重链/轻链配对的轻链序列应当替换为结构上相似的轻链序列。
因此，在一个方面，本披露提供了一种分离的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)，该分离的抗体或抗体片段具有：重链可变区，该重链可变区包含选自由SEQ ID NO:10、36、54、69和95(表1)组成的组的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:23、47、82和108(表1)组成的组的氨基酸序列；其中抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)特异性结合人cKIT。
在另一个方面，本披露提供了一种分离的抗体，该分离的抗体具有：重链，该重链包含选自由SEQ ID NO:12、38、56、71和97组成的组的氨基酸序列；和轻链，该轻链包含选自由SEQ ID NO:25、49、84和110组成的组的氨基酸序列。
在另一个方面，本披露提供了一种分离的抗体片段(例如Fab’)，该分离的抗体片段具有：重链，该重链包含选自由SEQ ID NO:14、40、58、73和99组成的组的氨基酸序列；和轻链，该轻链包含选自由SEQ ID NO:25、49、84和110组成的组的氨基酸序列。
在另一个方面，本披露提供了结合cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)，该抗体或抗体片段包含如表1中所述的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3、或其组合。抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的VH CDR1(或HCDR1)的氨基酸序列在SEQ ID NO:1、4、6、7、27、30、32、33、60、63、65、66、86、89、91和92中示出。抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的VH CDR2(或HCDR2)的氨基酸序列在SEQ ID NO:2、5、8、28、31、34、51、52、53、61、64、67、87、90和93中示出。抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的VH CDR3(或HCDR3)的氨基酸序列在SEQ ID NO:3、9、29、35、62、68、88和94中示出。抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的VL CDR1(或LCDR1)的氨基酸序列在SEQ ID NO:16、19、22、42、44、46、75、78、81、101、104和107中示出。抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的VL CDR2(或LCDR2)的氨基酸序列在SEQ ID NO:17、20、76、79、102和105中示出。抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的VL CDR3(或LCDR3)的氨基酸序列在SEQ ID NO:18、21、43、45、77、80、103和106中示出。
鉴于这些抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)中的每一种均可以结合人cKIT并且抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区提供，VH CDR1、2和3序列(或HCDR1、2、3)以及VL CDR1、2和3序列(或LCDR1、2、3)可以“混合且匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以混合且匹配)，但每种抗体必须含有VH CDR1、2和3以及VL CDR1、2和3以产生结合cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)。可以使用本领域已知的结合测定来测试这种“混合且匹配的”结合cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)。当混合并匹配VH CDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当替换为一种或多种结构上相似的CDR序列。同样，当混合并匹配VL CDR序列时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当替换为一种或多种结构上相似的CDR序列。对于普通技术人员来说容易清楚的是，可以通过用来自本文所示CDR序列的结构相似序列取代一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新颖的VH和VL序列。
因此，本披露提供了一种分离的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)，该分离的抗体或抗体片段包含重链CDR1(HCDR1)，该重链CDR1包含选自由SEQ ID NO:1、4、6、7、27、30、32、33、60、63、65、66、86、89、91和92组成的组的氨基酸序列；重链CDR2(HCDR2)，该重链CDR2包含选自由SEQ ID NO:2、5、8、28、31、34、51、52、53、61、64、67、87、90和93组成的组的氨基酸序列；重链CDR3(HCDR3)，该重链CDR3包含选自由SEQ ID NO:3、9、29、35、62、68、88和94组成的组的氨基酸序列；轻链CDR1(LCDR1)，该轻链CDR1包含选自由SEQ ID NO:16、19、22、42、44、46、75、78、81、101、104和107组成的组的氨基酸序列；轻链CDR2(LCDR2)，该轻链CDR2包含选自由SEQ ID NO:17、20、76、79、102和105组成的组的氨基酸序列；和轻链CDR3(LCDR3)，该轻链CDR3包含选自由SEQ ID NO:18、21、43、45、77、80、103和106组成的组的氨基酸序列；其中抗体特异性结合cKIT。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:1的HCDR1；SEQ ID NO:2的HCDR2；SEQ ID NO:3的HCDR3；SEQ ID NO:16的LCDR1；SEQID NO:17的LCDR2；和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:4的HCDR1；SEQ ID NO:5的HCDR2；SEQ ID NO:3的HCDR3；SEQ ID NO:19的LCDR1；SEQID NO:20的LCDR2；和SEQ ID NO:21的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:6的HCDR1；SEQ ID NO:2的HCDR2；SEQ ID NO:3的HCDR3；SEQ ID NO:16的LCDR1；SEQID NO:17的LCDR2；和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:8的HCDR2；SEQ ID NO:9的HCDR3；SEQ ID NO:22的LCDR1；SEQID NO:20的LCDR2；和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:27的HCDR1；SEQ ID NO:28的HCDR2；SEQ ID NO:29的HCDR3；SEQ ID NO:42的LCDR1；SEQ ID NO:17的LCDR2；和SEQ ID NO:43的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:30的HCDR1；SEQ ID NO:31的HCDR2；SEQ ID NO:29的HCDR3；SEQ ID NO:44的LCDR1；SEQ ID NO:20的LCDR2；和SEQ ID NO:45的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:32的HCDR1；SEQ ID NO:28的HCDR2；SEQ ID NO:29的HCDR3；SEQ ID NO:42的LCDR1；SEQ ID NO:17的LCDR2；和SEQ ID NO:43的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:33的HCDR1；SEQ ID NO:34的HCDR2；SEQ ID NO:35的HCDR3；SEQ ID NO:46的LCDR1；SEQ ID NO:20的LCDR2；和SEQ ID NO:43的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:1的HCDR1；SEQ ID NO:51的HCDR2；SEQ ID NO:3的HCDR3；SEQ ID NO:16的LCDR1；SEQID NO:17的LCDR2；和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:4的HCDR1；SEQ ID NO:52的HCDR2；SEQ ID NO:3的HCDR3；SEQ ID NO:19的LCDR1；SEQID NO:20的LCDR2；和SEQ ID NO:21的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:6的HCDR1；SEQ ID NO:51的HCDR2；SEQ ID NO:3的HCDR3；SEQ ID NO:16的LCDR1；SEQID NO:17的LCDR2；和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:7的HCDR1；SEQ ID NO:53的HCDR2；SEQ ID NO:9的HCDR3；SEQ ID NO:22的LCDR1；SEQID NO:20的LCDR2；和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:60的HCDR1；SEQ ID NO:61的HCDR2；SEQ ID NO:62的HCDR3；SEQ ID NO:75的LCDR1；SEQ ID NO:76的LCDR2；和SEQ ID NO:77的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:63的HCDR1；SEQ ID NO:64的HCDR2；SEQ ID NO:62的HCDR3；SEQ ID NO:78的LCDR1；SEQ ID NO:79的LCDR2；和SEQ ID NO:80的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:65的HCDR1；SEQ ID NO:61的HCDR2；SEQ ID NO:62的HCDR3；SEQ ID NO:75的LCDR1；SEQ ID NO:76的LCDR2；和SEQ ID NO:77的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:66的HCDR1；SEQ ID NO:67的HCDR2；SEQ ID NO:68的HCDR3；SEQ ID NO:81的LCDR1；SEQ ID NO:79的LCDR2；和SEQ ID NO:77的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:86的HCDR1；SEQ ID NO:87的HCDR2；SEQ ID NO:88的HCDR3；SEQ ID NO:101的LCDR1；SEQ ID NO:102的LCDR2；和SEQ ID NO:103的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:89的HCDR1；SEQ ID NO:90的HCDR2；SEQ ID NO:88的HCDR3；SEQ ID NO:104的LCDR1；SEQ ID NO:105的LCDR2；和SEQ ID NO:106的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:91的HCDR1；SEQ ID NO:87的HCDR2；SEQ ID NO:88的HCDR3；SEQ ID NO:101的LCDR1；SEQ ID NO:102的LCDR2；和SEQ ID NO:103的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含SEQID NO:92的HCDR1；SEQ ID NO:93的HCDR2；SEQ ID NO:94的HCDR3；SEQ ID NO:107的LCDR1；SEQ ID NO:105的LCDR2；和SEQ ID NO:103的LCDR3。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区(VH)，和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH，和含有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有选自SEQ IDNO:119、120或121的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有选自SEQ IDNO:125、126或127的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有选自SEQ IDNO:131、132或133的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有选自SEQ IDNO:137、138或139的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab’)包含含有选自SEQ IDNO:142、143或144的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体包含含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体包含含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，该特异性结合人cKIT的抗体包含含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的轻链。
在某些方面，该特异性结合人cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)是表1中所述的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)。
1.结合相同表位的抗体
本披露提供了特异性结合人cKIT受体的细胞外结构域内的表位的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)。在某些方面，抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)可以结合人cKIT细胞外结构域的结构域1-3内的表位。
本披露还提供了与表1中所述的抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)结合相同的表位的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)。因此，另外的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)可以基于它们在cKIT结合测定中与其他抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的交叉竞争(例如，以统计学上显著的方式竞争性地抑制其他抗体或抗体片段的结合)的能力进行鉴定。在国际专利申请号WO 2003/48731中描述了基于抗体的交叉竞争将这些抗体“分箱”的高通量方法。测试抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)抑制本文披露的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)结合cKIT蛋白(例如人cKIT)的能力证明了测试抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)可以与该抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)竞争结合cKIT；根据非限制性理论，这种抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)可以结合cKIT蛋白上与该抗体或抗体片段竞争的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)相同或相关(例如，结构上相似或空间上接近)的表位。在某些方面，结合cKIT上与本文披露的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)相同的表位的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)是人或人源化抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)。这种人或人源化抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)可以如本文所述那样制备和分离。
2.框架的修饰
本文披露的抗体药物缀合物可以包含经修饰的结合cKIT的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)，该抗体或抗体片段包含对VH和/或VL内的框架残基的修饰，例如以改善抗体药物缀合物的特性。
在一些实施例中，进行框架修饰以降低抗体或抗体药物缀合物的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。可以通过将抗体框架序列与衍生出抗体的种系序列进行比较来鉴定此类残基。为了使框架区序列“匹配”于所期望的种系构型，可以通过例如定点诱变将残基“回复突变”为相应的种系序列。此类“回复突变的”抗体或抗体药物缀合物也旨在为本发明所涵盖。
另一种类型的框架修饰包括使框架区内、或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以去除T细胞表位，从而降低抗体或抗体药物缀合物的潜在免疫原性。这种方法也称为“去免疫化”，并且在Carr等人的美国专利公开号2003/0153043中有进一步详细描述。
除了在框架区或CDR区内进行的修饰之外或作为在框架区或CDR区内进行的修饰的替代方案，可以将抗体工程化以改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定。此外，抗体可以经化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以连接至抗体)或经修饰以改变其糖基化，从而再次改变抗体的一种或多种功能特性。下文进一步详细描述这些方面的每一项。
在一个方面，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。这种方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利号5,677,425中。将CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数目改变，以例如有利于轻链和重链的组装、以增加或减少抗体的稳定性、或以使得缀合至另一分子。
在一些实施例中，本文披露的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包括经修饰或经工程化的氨基酸残基，例如一个或多个半胱氨酸残基，以作为用于缀合至药物部分的位点(Junutula JR等人:Nat Biotechnol[自然生物技术]2008,26:925-932)。在一个实施例中，本发明提供了一种经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)，该经修饰的抗体或抗体片段包含在本文所述的位置处用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代。用于半胱氨酸取代的位点是在抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的恒定区中并且因此适用于多种抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)，并且选择位点以提供稳定且均匀的缀合物。经修饰的抗体或片段可以具有一个、两个或更多个半胱氨酸取代，并且这些取代可以与如本文所述的其他修饰和缀合方法组合使用。用于将半胱氨酸插入在抗体的特定位置处的方法是本领域已知的，参见例如Lyons等人,(1990)Protein Eng.[蛋白质工程],3:703-708、WO 2011/005481、WO2014/124316、WO2015/138615。在某些实施例中，经修饰的抗体包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体的重链的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、191、195、197、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400和422，并且其中位置是根据EU系统编号的。在某些实施例中，经修饰的抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体片段(例如Fab或Fab’)的重链的位置121、124、152、153、155、157、164、169、171、174、189和207，并且其中位置是根据EU系统编号的。在某些实施例中，经修饰的抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体片段(例如Fab或Fab’)的重链的位置124、152、153、155、157、164、174、189和207，并且其中位置是根据EU系统编号的。
在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的轻链的位置107、108、109、114、126、127、129、142、143、145、152、154、156、157、159、161、165、168、169、170、182、183、188、197、199和203，其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是人κ轻链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的轻链的位置107、108、114、126、127、129、142、159、161、165、183和203，其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是人κ轻链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的轻链的位置114、129、142、145、152、159、161、165和197，其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是人κ轻链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的轻链的位置107、108、109、126、143、145、152、154、156、157、159、182、183、188、197、199和203，其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是人κ轻链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的轻链的位置145、152和197，其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是人κ轻链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的轻链的位置114和165，其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是人κ轻链。
在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的轻链的位置143、145、147、156、159、163、168，其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是人λ轻链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的轻链的位置143(根据EU编号)处的半胱氨酸，其中轻链是人λ轻链。
在某些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在其恒定区上用半胱氨酸对两个或更多个氨基酸的取代的组合，并且位置组合可以选自上文列出的任一个位置。
在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在以下位置中的一个或多个处的半胱氨酸：重链的位置124、重链的位置152、重链的位置153、重链的位置155、重链的位置157、重链的位置164、重链的位置174、轻链的位置114、轻链的位置129、轻链的位置142、轻链的位置159、轻链的位置161、或轻链的位置165，并且其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在以下位置中的四个处的半胱氨酸：重链的位置124、重链的位置152、重链的位置153、重链的位置155、重链的位置157、重链的位置164、重链的位置174、轻链的位置114、轻链的位置129、轻链的位置142、轻链的位置159、轻链的位置161、或轻链的位置165，并且其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。
在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在重链的位置152处的半胱氨酸，其中位置是根据EU系统编号的。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在重链的位置124处的半胱氨酸，其中位置是根据EU系统编号的。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在轻链的位置165处的半胱氨酸，其中位置是根据EU系统编号的并且其中轻链是κ链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在轻链的位置114处的半胱氨酸，其中位置是根据EU系统编号的并且其中轻链是κ链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在轻链的位置143处的半胱氨酸，其中位置是根据EU系统编号的并且其中轻链是λ链。
在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在重链的位置152处和在轻链的位置165处的半胱氨酸，并且其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在重链的位置152处和在轻链的位置114处的半胱氨酸，并且其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在重链的位置152处和在轻链的位置143处的半胱氨酸，并且其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是λ链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在重链的位置124和位置152处的半胱氨酸，并且其中位置是根据EU系统编号的。
在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在以下位置中的一个或多个处的半胱氨酸：重链的位置155、重链的位置189、重链的位置207、轻链的位置145、轻链的位置152、或轻链的位置197，并且其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在以下位置中的两个或更多个(例如2、3、4个)处的半胱氨酸：重链的位置155、重链的位置189、重链的位置207、轻链的位置145、轻链的位置152、或轻链的位置197，并且其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。
在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在以下位置中的一个或多个处的半胱氨酸：重链的位置124、重链的位置152、重链的位置153、重链的位置155、重链的位置157、重链的位置164、重链的位置174、轻链的位置114、轻链的位置129、轻链的位置142、轻链的位置159、轻链的位置161、或轻链的位置165，并且其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)包含在以下位置中的两个或更多个(例如2、3、4个)处的半胱氨酸：重链的位置124、重链的位置152、重链的位置153、重链的位置155、重链的位置157、重链的位置164、重链的位置174、轻链的位置114、轻链的位置129、轻链的位置142、轻链的位置159、轻链的位置161、或轻链的位置165，并且其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。
在一些实施例中，特异性结合人cKIT的经修饰的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ IDNO:118的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，特异性结合人cKIT的经修饰的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ IDNO:118的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，特异性结合人cKIT的经修饰的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ IDNO:124的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，特异性结合人cKIT的经修饰的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ IDNO:124的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，特异性结合人cKIT的经修饰的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ IDNO:130的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，特异性结合人cKIT的经修饰的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ IDNO:130的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，特异性结合人cKIT的经修饰的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ IDNO:136的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，特异性结合人cKIT的经修饰的抗体片段(例如Fab)包含含有SEQ IDNO:141的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:145的氨基酸序列的轻链。
3.cKIT抗体或抗体片段的产生
可以通过本领域已知的任何手段产生抗cKIT抗体或抗体片段(例如，Fab或Fab’)，这些手段包括但不限于重组表达、化学合成或酶促消化全长单克隆抗体，这些全长单克隆抗体可以通过例如杂交瘤或重组产生获得。重组表达可以来自本领域已知的任何适当宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞，或由无细胞系统(例如苏特罗公司(Sutro)的Xpress CFTM平台，http://www.sutrobio.com/technology/)制备。
本披露进一步提供了编码本文所述的抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的多核苷酸，例如，编码包含如本文所述的互补性决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。在一些方面，编码重链可变区(VH)的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:11、37、55、70和96组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码轻链可变区(VL)的多核苷酸与选自由SEQ IDNO:24、48、83和109组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些方面，编码抗体重链的多核苷酸与SEQ ID NO:13、39、57、72和98的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码抗体轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:26、50、85和111的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些方面，编码Fab’重链的多核苷酸与SEQ ID NO:15、41、59、74和100的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码Fab’轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:26、50、85和111的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
本披露的多核苷酸可以仅编码抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的可变区序列。它们还可以编码抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的可变区和恒定区。一些多核苷酸序列编码包含一种所例举抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的重链和轻链的可变区的多肽。
多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变编码抗cKIT抗体或其结合片段的现有序列(例如，如下文实例中所述的序列)来产生。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法完成，这些方法如Narang等人,Meth.Enzymol.[酶学方法]68:90,1979的磷酸三酯方法；Brown等人,Meth.Enzymol.[酶学方法]68:109,1979的磷酸二酯方法；Beaucage等人,Tetra.Lett.[四面体通讯],22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺方法；以及美国专利号4,458,066的固体支持物方法。通过PCR将突变引入至多核苷酸序列可以如以下中所述那些进行：例如，PCR Technology:Principles and Applications for DNAAmplification[PCR技术：DNA扩增的原理和应用],H.A.Erlich(编辑),Freeman Press[弗里曼出版社],纽约,纽约州,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications[PCR方案：方法和应用指南],Innis等人(编辑),Academic Press[学术出版社],San Diego,CA[加利福尼亚州圣地亚哥],1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]19:967,1991；和Eckert等人,PCR Methods and Applications[PCR方法和应用]1:17,1991。
在本披露中还提供了用于产生上文所述的抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的表达载体和宿主细胞。多种表达载体可以用来表达编码抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的多核苷酸。基于病毒的载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体(典型地具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)以及人类人工染色体(参见例如，Harrington等人,Nat Genet.[自然遗传学]15:345,1997)。例如，可用于哺乳动物(例如人)细胞中表达抗cKIT多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州圣地亚哥)、MPSV载体和本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBPEB病毒、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)(SFV)的载体。参见，Brent等人,同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.[微生物学年鉴]49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell[细胞]68:143,1992。
表达载体的选择取决于待表达该载体的预期宿主细胞。典型地，表达载体含有与编码抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)的多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些方面，使用诱导型启动子以防止插入的序列在诱导条件之外的条件下表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可以在非诱导条件下、而不在偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体的情况下扩大经转化的生物体的培养。除启动子之外，也可能要求或需要其他调节元件用于高效表达抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)。这些元件典型地包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子，可以提高表达效率(参见例如，Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.[细胞分化中的结果和问题]20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置，以与通过插入的抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)序列编码的多肽形成融合蛋白。更经常地，插入的抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)序列在包含在载体中之前与信号序列连接。待用来接受编码抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)轻链可变结构域和重链可变结构域的序列的载体有时还编码恒定区或其部分。此类载体允许将可变区表达为具有恒定区的融合蛋白，从而导致产生完整抗体或其片段。
用于携带并表达抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆并表达本披露多核苷酸的原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括杆菌(如枯草杆菌)和其他肠杆菌科(如沙门氏菌属、沙雷氏菌属)以及各种假单胞菌属的种。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，这些表达载体典型地含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制的起点)。此外，将存在任何数量的各种公知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子典型地任选使用操纵基因序列控制表达，并且具有核糖体结合位点序列等，以用于启动和完成转录和翻译。也可以采用其他微生物，如酵母来表达抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)多肽。也可以使用与杆状病毒载体组合的昆虫细胞。
在其他方面，哺乳动物宿主细胞用来表达并产生本披露的抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，如实例中所述的骨髓瘤杂交瘤克隆)或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，下文例举的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常的必死或正常或异常的永生的动物或人类细胞。例如，已经开发出能够分泌完整免疫球蛋白的众多合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。利用哺乳动物组织细胞培养物表达多肽在例如Winnacker,From Genes to Clones[从基因到克隆],VCH出版商,纽约,纽约州,1987中进行了大体论述。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包含表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见例如，Queen等人,Immunol.Rev.[免疫学评论]89:49-68,1986)，和必要的处理信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或衍生自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调控的或可调节的。可用启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人CMV立即早期启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其他细胞宿主(通常参见Sambrook等人，同上)。其他方法包括例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、冲击法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合物(Elliot和O'Hare,Cell[细胞]88:223,1997)、药剂增强的DNA摄取和离体转导。对于重组蛋白的长期高产量生产，通常期望稳定的表达。例如，可以使用含有病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因的表达载体，制备稳定表达抗cKIT抗体或抗体片段(例如Fab或Fab’)链的细胞系。在引入载体之后，可以使细胞在富集的培养基中生长1-2天，之后将它们转换至选择性培养基。选择性标记物的目的是赋予选择抗性，并且它的存在允许在选择性培养基中成功地表达引入的序列的细胞的生长。可以使用适合于细胞类型的组织培养技术来增殖抗性、稳定转染的细胞。
抗体片段，如Fab或Fab’可通过使用酶如木瓜蛋白酶(用于产生Fab片段)或胃蛋白酶(用于产生Fab’片段)等蛋白水解裂解免疫球蛋白分子来产生。与Fab片段相比，Fab'片段还含有铰链区，该铰链区包含在免疫球蛋白分子的两个重链之间形成二硫键的两个天然半胱氨酸。
治疗用途
本披露的缀合物可用于多种应用，包括但不限于用于在有需要的患者(例如造血干细胞移植受者)中消融造血干细胞。因此，本文提供了通过以下方式在有需要的患者中消融造血干细胞的方法：向患者施用有效量的本文所述的任何缀合物。本文还提供了通过以下方式调理造血干细胞移植患者(例如，移植受者)的方法：向患者施用有效量的本文所述的任何缀合物，并且在对患者进行造血干细胞移植之前允许有足够的时间段来使缀合物从患者的循环中清除。缀合物可以静脉内施用至患者。还提供了本文所述的缀合物或药物组合物中的任一种用于在有需要的患者中消融造血干细胞的用途。进一步提供了本文所述的缀合物或药物组合物中的任一种在制造用于在有需要的患者中消融造血干细胞的药物中的用途。
内源性造血干细胞通常驻留于骨髓窦内。干细胞所驻留的这种物理环境被称为干细胞微环境或干细胞生态位。涉及该生态位的基质细胞和其他细胞提供了可溶性和结合因子，这些因子具有多种作用。已经提出了各种模型用于造血干细胞与它们的生态位之间的相互作用。例如，已经提出了一种模型，其中当干细胞分裂时，只有一个子代留在生态位中而另一个子细胞离开生态位以进行分化。已经提出通过选择性消耗内源性造血干细胞，从而开放用于植入供者干细胞的干细胞生态位，可以增强植入效率(参见例如，WO 2008/067115)。
造血干细胞(HSC)移植、或骨髓移植(如前所述)是用于影响身体的血液干细胞的大范围疾病的既定疗法，这些疾病如白血病、严重贫血、免疫缺陷和一些酶缺乏病。这些疾病常常导致患者需要用新的健康血细胞替代其骨髓。
HSC移植常常是同种异体的，这意味着患者接受来自同一物种的另一个体的干细胞，该另一个体是兄弟姐妹、匹配亲缘、半相合亲缘或非亲缘的志愿者供者。据估计，大约30％需要造血干细胞移植的患者可以具有其组织类型合适的兄弟姐妹。另外70％的患者必须依靠非亲缘志愿者供者的匹配或者半相合亲缘供者的可得性。重要的是，供者细胞和患者细胞的特征是相当的。造血干细胞移植也可以是自体的，其中移植的细胞源自受试者自身，即供者和受者是同一个体。此外，移植可以是同基因的，即来自遗传上相同的个体，如双胞胎。在另一个方面，移植可以是异种的，即源自不同的物种，如对于器官移植，当没有足够的相同物种的供者时，该移植是令人感兴趣的。
在HSC移植之前，患者通常经历预处理或调理方法。这种预处理或调理的目的是尽可能多地去除体内不需要的细胞(例如，恶性/癌细胞)，以最小化排斥，和/或通过消耗内源性HSC来开放干细胞生态位，以便将供者干细胞高效植入到这些生态位中。然后将供者的健康HSC静脉内、或在一些情况下骨内给予至患者。然而，许多风险与HSC移植相关，包括移植不良、免疫排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、或感染。尽管供者细胞和患者细胞在组织类型方面似乎等同，例如，MHC分子匹配(或半相合)；但这些个体之间仍然存在免疫细胞可视为危险的微小差异。这意味着新的免疫系统(来自新干细胞的白细胞)将新身体视为“外来的”，从而引发免疫攻击。这种称为移植物抗宿主病(GVHD)的反应可能变得危及患者的生命。HSC移植后的患者在新骨髓开始发挥作用之前由于缺乏白细胞而具有增加的感染风险。在某些情况下，这段时间可持续数月，直到新的免疫系统成熟为止。其中一些机会性感染可能是危及生命的。
因此，需要改进调理和移植方法并且降低与HSC移植相关的风险并增加其对各种障碍的有效性。本文提供了新的抗体药物缀合物，这些抗体药物缀合物通过在移植之前特异性杀伤受者的内源性HSC而不是所有其他免疫细胞，就在移植后保持部分活性免疫防御以对抗感染，但由于受试者无法从其自身的HSC中形成新的免疫细胞而同时提供间接免疫抑制作用。由于该预处理可比化学疗法或放射更温和，并且副作用不太严重，因此可能在移植患者中诱导较少的GVHD。
本文所述的抗体药物缀合物可用于例如在造血干细胞移植之前的预处理/调理方法中消融内源性造血干细胞。例如，本发明的缀合物可用于治疗其中干细胞移植可能有益的任何非恶性病症/障碍，如严重再生障碍性贫血(SAA)、维斯科特-奥尔德里奇综合征(WiskottAldrich Syndrome)、胡勒尔综合征(Hurlers Syndrome)、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(FHL)、慢性肉芽肿病(CGD)、柯士文综合征(Kostmanns syndrome)、严重免疫缺陷综合症(SCID)、其他自身免疫性障碍，如SLE、多发性硬化症、IBD、克罗恩病、溃疡性结肠炎、舍格伦综合征(Sjogrens syndrome)、血管炎、狼疮、重症肌无力、韦格纳病(Wegenersdisease)、先天性代谢异常和/或其他免疫缺陷。
此外，本发明的缀合物可用于治疗其中干细胞移植可能有益的任何恶性病症/障碍，如血液病、血液恶性肿瘤或实体瘤(例如，肾癌、肝癌、胰腺癌)。可以用要求保护的方法和抗体治疗的常见类型的血液疾病/恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤和骨髓增生异常综合征。白血病是一种血液或骨髓的癌症类型，其特征是未成熟白细胞(称为胚细胞)异常增加，并且术语白血病包括：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)和其他白血病，如毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞白血病和成人T细胞白血病。在本发明的一个方面，治疗的白血病是急性白血病。在另一个方面，白血病是ALL、AML或AMoL。淋巴瘤包括前体T细胞白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、MALT淋巴瘤、蕈样真菌病、外周T细胞淋巴瘤非特指型、结节性硬化型霍奇金淋巴瘤、混合细胞亚型霍奇金淋巴瘤。骨髓增生异常综合征(MDS)是当骨髓中的血液形成细胞受损时发生的一组病症的名称。这种损伤导致一种或多种血细胞数量较少。MDS细分为7个类别；难治性血细胞减少症伴单系发育异常(RCUD)、难治性贫血伴环状铁粒幼红细胞(RARS)、难治性血细胞减少症伴多系发育异常(RCMD)、难治性贫血伴原始细胞增多1型(RAEB-1)、难治性贫血伴原始细胞增多2型(RAEB-2)、未分类的骨髓增生异常综合征(MDS-U)和与孤立del(5q)相关的骨髓增生异常综合征。
在一些实施例中，需要消融造血干细胞的患者(例如，造血干细胞移植受者)可具有先天性免疫缺陷疾病、自身免疫性障碍、造血障碍或先天性代谢异常。
在一些实施例中，造血障碍可选自以下中的任一种：急性髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、骨髓增生性障碍、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、再生障碍性贫血、单纯红细胞再生障碍、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、范可尼贫血、重型地中海贫血、镰状细胞贫血、严重联合免疫缺陷、维斯科特-奥尔德里奇综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症。
先天性代谢异常也称为遗传性代谢疾病(IMB)或先天性代谢性疾病，是一类遗传性疾病，包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢、有机酸代谢的先天性障碍、或溶酶体贮积病。在一些实施例中，先天性代谢异常选自粘多糖贮积症、戈谢病(Gaucher disease)、异染性脑白质营养不良或肾上腺脑白质营养不良。
在一些实施例中，本文所述的抗体药物缀合物可用于消融内源性造血干细胞，以作为在先前已针对本文披露的疾病或病症用自体干细胞移植进行治疗的患者中进行同种异体干细胞移植之前的降低强度的调理方法。例如，本文所述的抗体药物缀合物可在同种异体干细胞移植中用于先前已用自体干细胞移植治疗的患者，如Chen等人,Biol Blood MarrowTransplant[血液与骨髓移植生物学]21(2015)1583e1588中所述。在一些实施例中，可以在患者接受自体干细胞移植后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间，进行同种异体干细胞移植。
此外，本发明的缀合物可用于治疗胃肠道间质瘤(GIST)，如cKIT阳性的GIST。在一些实施例中，本发明的缀合物可用于治疗表达野生型cKIT的GIST。在一些实施例中，本发明的缀合物可用于治疗对治疗例如伊马替尼
Figure BDA0002904476810001691
有抗性的GIST。
组合疗法
在某些情况下，本披露的抗体药物缀合物可以与另一种调理方案(如放射疗法或化学疗法)组合使用。
在某些情况下，本披露的抗体药物缀合物可以与另一种治疗剂(如抗癌剂、抗恶心剂(或止吐剂)、止痛剂、动员剂或其组合)组合使用。
考虑用于组合疗法中的一般化学治疗剂包括阿那曲唑
Figure BDA0002904476810001692
比卡鲁胺
Figure BDA0002904476810001693
硫酸博莱霉素
Figure BDA0002904476810001694
白消安
Figure BDA0002904476810001695
白消安注射液
Figure BDA0002904476810001696
卡培他滨
Figure BDA0002904476810001697
N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
Figure BDA0002904476810001698
卡莫司汀
Figure BDA0002904476810001699
苯丁酸氮芥
Figure BDA00029044768100016910
顺铂
Figure BDA00029044768100016911
克拉屈滨
Figure BDA00029044768100016912
环孢霉素(
Figure BDA00029044768100016913
或
Figure BDA00029044768100016914
)、环磷酰胺(
Figure BDA00029044768100016915
或
Figure BDA00029044768100016916
)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷
Figure BDA00029044768100016917
阿糖胞苷脂质体注射液
Figure BDA00029044768100016918
达卡巴嗪
Figure BDA00029044768100016919
更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素
Figure BDA00029044768100016920
柠檬酸柔红霉素脂质体注射液
Figure BDA00029044768100016921
地塞米松、多西他赛
Figure BDA00029044768100016922
盐酸阿霉素
Figure BDA00029044768100016923
依托泊苷
Figure BDA00029044768100016924
磷酸氟达拉滨
Figure BDA00029044768100016925
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00029044768100016926
氟他胺
Figure BDA00029044768100016927
替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(双氟脱氧胞苷)、羟基脲
Figure BDA00029044768100016928
伊达比星
Figure BDA00029044768100016929
异环磷酰胺
Figure BDA00029044768100016930
伊立替康
Figure BDA00029044768100016931
L-天冬酰胺酶
Figure BDA0002904476810001701
亚叶酸钙、美法仑
Figure BDA0002904476810001702
6-巯嘌呤
Figure BDA0002904476810001703
甲氨蝶呤
Figure BDA0002904476810001704
米托蒽醌
Figure BDA0002904476810001705
mylotarg、紫杉醇
Figure BDA0002904476810001706
phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁(pentostatin)、聚苯丙生(polifeprosan)20与卡莫司汀的植入物
Figure BDA0002904476810001707
枸橼酸它莫西芬
Figure BDA0002904476810001708
替尼泊苷
Figure BDA0002904476810001709
6-硫代鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明
Figure BDA00029044768100017010
注射用盐酸托泊替康
Figure BDA00029044768100017011
长春花碱
Figure BDA00029044768100017012
长春新碱
Figure BDA00029044768100017013
和长春瑞滨
Figure BDA00029044768100017014
在一些实施例中，本披露的抗体药物缀合物可以与CD47阻断剂，例如抗CD47抗体或其片段组合使用。据报道，阻断CD47与信号调节蛋白α(SIRPα)之间相互作用的抗CD47微体可以通过裸抗c-Kit抗体增强内源性HSC的消耗(Chhabra等人,Science TranslationalMedicine[科学转化医学]8(351),351ra105)。
在一些实施例中，本披露的抗体药物缀合物可以与另一种特异性结合造血干细胞或造血祖细胞的抗体或其片段组合使用，该抗体或其片段例如抗CD45抗体或其片段、抗CD34抗体或其片段、抗CD133抗体或其片段、抗CD59抗体或其片段、或抗CD90抗体或其片段。在一些实施例中，本披露的抗体药物缀合物可以与Dyrk1a抑制剂组合使用，该Dyrk1a抑制剂如哈尔明碱、INDY，ML 315盐酸盐、ProINDY、TocrisTM TC-S 7044、TocrisTM TG 003、FINDY、TBB、DMAT、CaNDY等。
在一些实施例中，本披露的抗体药物缀合物可以与以下组合使用：一种或多种免疫抑制剂如糖皮质激素，例如泼尼松、地塞米松和氢化可的松；细胞抑制剂，例如烷化剂、抗代谢物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯嘌呤、更生霉素等；作用于免疫亲和素的药物，例如他克莫司(
Figure BDA00029044768100017015
Astograf
Figure BDA00029044768100017016
或Envarsus
Figure BDA00029044768100017017
)、西罗莫司(雷帕霉素或
Figure BDA00029044768100017018
)和依维莫司；干扰素；药片类药物；TNF结合蛋白；麦考酚酯；芬戈莫德；多球壳菌素；等等。在一些实施例中，本披露的抗体药物缀合物可以与一种或多种特异性消耗T细胞的药剂组合使用，该一种或多种药剂如氟达拉滨、环孢素、抗CD52抗体(例如阿仑单抗)、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗-CD3抗体或其片段、抗CD4抗体或其片段、抗CD8抗体或其片段、或抗人TCRα/β抗体或其片段。T细胞消耗疗法可以减少宿主抗移植物的反应，该反应可能导致移植物的排斥。
在一些实施例中，本披露的抗体药物缀合物可以与一种或多种选自以下的药剂组合使用：普乐沙福(plerixafor)(也称为AMD3100、
Figure BDA0002904476810001711
)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，例如沙格司亭
Figure BDA0002904476810001712
或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，例如非格司亭或培非格司亭
Figure BDA0002904476810001713
Figure BDA0002904476810001714
在一个方面，本披露的抗体药物缀合物在药物组合配制品或作为组合疗法的给药方案中与具有抗癌特性的第二化合物组合。药物组合配制品或给药方案的第二化合物可以对该组合的缀合物具有互补活性，使得它们不彼此不利地影响。
如本文所用，术语“药物组合”是指在一个剂量单位形式中的固定组合、或用于组合施用的非固定组合或成套药盒，其中两种或更多种治疗剂可以在同一时间独立地施用或在时间间隔内分别施用，特别地其中这些时间间隔允许组合配偶体显示合作性例如协同效应。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗本披露中描述的治疗性病症或障碍。这种施用涵盖以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，如以具有固定比率的活性成分的单个胶囊施用。可替代地，这种施用涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如，胶囊、粉末和液体)中共同施用。可以将粉末和/或液体在施用之前重构或稀释到所需的剂量。此外，这类施用也涵盖在大致相同的时间或在不同的时间顺序使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文所述的病症或障碍方面提供药物组合的有益作用。
组合疗法可以提供“协同”并且证明是“协同的”，即，当活性成分一起使用时所实现的效应大于由分别使用这些化合物所产生的效应的总和。当将活性成分为下述情形时可以获得协同效应：(1)以组合的单位剂量配制品的形式共同配制并同时施用或递送；(2)以单独配制品的形式交替或平行递送；或(3)通过一些其他方案进行。当以交替疗法递送时，可以在依序(例如通过在单独注射器中不同的注射)施用或递送化合物时获得协同效应。通常，在交替疗法期间，将有效剂量的每种活性成分依序地即顺次地施用，而在组合疗法中，将有效剂量的两种或更多种活性成分一起施用。
药物组合物
为了制备包含一种或多种本文所述的抗体药物缀合物的药物或无菌组合物，可以将提供的一种或多种缀合物与药学上可接受的载剂或赋形剂混合。
治疗剂和诊断剂的配制品可以通过与生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂以例如冻干粉末、浆液、水性溶液、洗剂或悬浮液的形式混合来制备(参见例如，Hardman等人,Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics[古德曼·吉尔曼治疗学的药理学基础],McGraw-Hill[麦格劳-希尔集团],纽约,纽约州,2001；Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践],Lippincott,Williams,and Wilkins[利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司],纽约,纽约州,2000；Avis等人(编辑),Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications[药物剂型：肠胃外药物],Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司],纽约,1993；Lieberman等人(编辑.),Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets[药物剂型：片剂],Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司],纽约,1990；Lieberman等人(编辑)Pharmaceutical Dosage Forms:DisperseSystems[药物剂型：分散系统],Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司],纽约,1990；Weiner和Kotkoskie,Excipient Toxicity and Safety[赋形剂毒性和安全性],Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司],Inc.,纽约,纽约州,2000)。
在一些实施例中，包含本发明的抗体缀合物的药物组合物是冻干物制剂。在某些实施例中，包含抗体缀合物的药物组合物是在小瓶中的含有抗体缀合物、组氨酸、蔗糖和聚山梨醇酯20的冻干物。在某些实施例中，包含抗体缀合物的药物组合物是在小瓶中的含有抗体缀合物、琥珀酸钠和聚山梨醇酯20的冻干物。在某些实施例中，包含抗体缀合物的药物组合物是在小瓶中的含有抗体缀合物、海藻糖、柠檬酸盐和聚山梨醇酯8的冻干物。冻干物可以例如用水、盐水重构用于注射。在一个具体实施例中，溶液包含pH为约5.0的抗体缀合物、组氨酸、蔗糖和聚山梨醇酯20。在另一个具体实施例中，溶液包含抗体缀合物、琥珀酸钠和聚山梨醇酯20。在另一个具体实施例中，溶液包含pH为约6.6的抗体缀合物、脱水海藻糖、柠檬酸盐脱水物、柠檬酸和聚山梨醇酯8。为了静脉内施用，将获得的溶液通常进一步稀释于载剂溶液中。
为治疗剂选择施用方案取决于几种因素，包括实体的血清或组织周转速率、症状水平、实体的免疫原性和生物基质中的靶细胞可及性。在某些实施例中，施用方案使递送至患者的治疗剂的量最大化，与可接受水平的副作用一致。因此，递送的生物制品的量部分地取决于具体实体和正在治疗的病症的严重程度。选择适当剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南是可获得的(参见例如，Wawrzynczak,Antibody Therapy[抗体疗法],Bios ScientificPub.Ltd[Bios科学出版社有限公司],Oxfordshire[牛津郡],英国,1996；Kresina(编辑),Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis[单克隆抗体、细胞因子和关节炎],Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司],纽约,纽约州,1991；Bach(编辑),MonoclonalAntibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases[自免疫疾病中的单克隆抗体和肽疗法],Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司],纽约,纽约州,1993；Baert等人,NewEngl.J.Med.[新英格兰医学杂志]348:601-608,2003；Milgrom等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]341:1966-1973,1999；Slamon等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]344:783-792,2001；Beniaminovitz等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]342:613-619,2000；Ghosh等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]348:24-32,2003；Lipsky等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]343:1594-1602,2000)。
由临床医生，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗或预计影响治疗的参数或因素确定适当的剂量。通常，剂量始于或多或少小于最佳剂量的量并此后将它以小增量增加，直至相对于任何不利副作用，实现所期望的或最佳的效果。重要的诊断量值包括症状(例如炎症)的那些量值或产生的炎性细胞因子的水平。
可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，该活性成分的量有效地实现对于特定的患者、组合物和施用方式的所期望的治疗应答，而对患者没有毒性。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用特定组合物组合的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史、以及医学领域中已知的类似因素。
包含本发明的抗体缀合物的组合物可通过连续输注提供，或通过例如一天、一周、或每周1-7次、每一周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、或每八周一次的间隔剂量提供。剂量可以静脉内、皮下或骨内方式提供。特定剂量方案是一个涉及避免明显不希望的副作用的最大剂量或给药频率的方案。
对于本发明的抗体缀合物，施用至患者的剂量可以是0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。该剂量可以在0.001mg/kg患者体重与50mg/kg患者体重之间、在0.005mg/kg患者体重与20mg/kg患者体重之间、在0.01mg/kg患者体重与20mg/kg患者体重之间、在0.02mg/kg患者体重与10mg/kg患者体重之间、在0.05mg/kg患者体重与5mg/kg患者体重之间、在0.1mg/kg患者体重与10mg/kg患者体重之间、在0.1mg/kg患者体重与8mg/kg患者体重之间、在0.1mg/kg患者体重与5mg/kg患者体重之间、在0.1mg/kg患者体重与2mg/kg患者体重之间、在0.1mg/kg患者体重与1mg/kg患者体重之间。可以使用以千克(kg)计的患者体重乘以按mg/kg计的待施用的剂量，计算抗体缀合物的剂量。
可以重复本发明的抗体缀合物的剂量并且各次施用可以相隔少于1天、至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月、4个月、5个月、或至少6个月。在一些实施例中，本发明的抗体缀合物每周施用两次、每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次或较小频率地施用。
特定患者的有效量可以根据如以下的因素改变：所治疗的病症、患者的总体健康状况、施用的方法、途径和剂量和副作用的严重程度(参见，例如，Maynard等人,A Handbook ofSOPs for Good Clinical Practice[用于良好临床实践的SOP指南],Interpharm Press[国际药物出版社],Boca Raton,Fla.[佛罗里达州波卡拉顿],1996；Dent,GoodLaboratory and Good Clinical Practice[良好实验和良好临床实践],Urch Publ.[厄奇出版社],伦敦,英国,2001)。
施用途径可以是通过例如局部或皮肤应用、通过皮下、静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑脊内、病灶内施用进行的注射或输注、或通过缓释系统或植入物(参见例如，Sidman等人,Biopolymers[生物聚合物]22:547-556,1983；Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.[生物医学材料研究杂志]15:167-277,1981；Langer,Chem.Tech.[化学技术]12:98-105,1982；Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82:3688-3692,1985；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4030-4034,1980；美国专利号6,350,466和6,316,024)。必要时，组合物也可以包含增溶剂或用于减轻注射部位疼痛的局部麻醉药如利多卡因，或两者。此外，也可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或雾化器以及具有雾化剂的配制品。参见例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572,WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，将这些专利中的每一个通过引用以其整体并入本文。
用于与第二治疗剂，例如细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或放射(如全身放射治疗(TBI))共同施用或治疗的方法是本领域已知的(参见例如，Hardman等人,(编辑)(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics[古德曼吉尔曼治疗学的药理基础],增刊第10版,McGraw-Hill[麦格劳-希尔集团],纽约,纽约州；Poole和Peterson(编辑)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A PracticalApproach[药物治疗学高级实践：实践方法],Lippincott,Williams&Wilkins[利平科特威廉姆斯和威尔金斯出版社],Phila.,Pa.[宾夕法尼亚州费城]；Chabner和Longo(编辑)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy[癌症化学疗法和生物疗法],Lippincott,Williams&Wilkins[利平科特威廉姆斯和威尔金斯出版社],Phila.,Pa.[宾夕法尼亚州费城])。治疗剂的有效量可以将症状减少至少10％；至少20％；至少约30％；至少40％、或至少50％。
可以与本发明的抗体缀合物组合施用的另外疗法可以与本发明的抗体缀合物相隔少于5分钟、相隔少于30分钟、相隔1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔约12小时至18小时、相隔18小时至24小时、相隔24小时至36小时、相隔36小时至48小时、相隔48小时至52小时、相隔52小时至60小时、相隔60小时至72小时、相隔72小时至84小时、相隔84小时至96小时、或相隔96小时至120小时进行施用。两种或更多种疗法可以在同一患者访视中施用。
本发明提供了用于向有需要的受试者单独或与其他疗法组合施用包含本发明的抗体缀合物的药物组合物的方案。本发明的组合疗法的疗法可以同时或依序施用至受试者。本发明的组合疗法的疗法也可以循环施用。循环疗法涉及施用第一疗法一段时间，随后施用第二疗法一段时间并重复这种依序施用，即，该循环，以减少对一种疗法(例如药剂)的耐药性形成，以避免或减少一种疗法(例如药剂)的副作用和/或以改善疗法的功效。
本发明的组合疗法的疗法可以并行施用至受试者。
术语“并行”不限于在完全相同的时间施用疗法，而是意指将包含抗体或其片段的药物组合物以这样的顺序并在这样的时间间隔内施用至受试者，该顺序和该时间间隔使得本发明的抗体或抗体缀合物可以与一种或多种其他疗法一起发挥作用，以提供与如果另外施用它们相比增加的益处。例如，可以将每种疗法在相同的时间或以任何次序依序在不同的时间点施用至受试者；然而，如果不在相同的时间施用，则它们应当在时间上充分接近地施用，从而以提供所期望的治疗效果。可以将每种疗法以任何适当的形式和通过任何合适的途径分别施用至受试者。在各种实施例中，将疗法相隔少于5分钟、相隔少于15分钟、相隔少于30分钟、相隔少于1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔24小时、相隔48小时、相隔72小时、或相隔1周施用至受试者。在其他实施例中，将两种或更多种疗法在同一患者访视中施用。
组合疗法可以在相同的药物组合物中施用至受试者。可替代地，组合疗法的治疗剂可以在单独的药物组合物中并行施用至受试者。治疗剂可以通过相同或不同施用途径施用至受试者。
应理解，本文描述的实例和实施例仅用于举例说明目的，其各种修饰或改变对于本领域技术人员将是明了的，并包括在本申请的精神和范围内和所附权利要求书的范围内。
实例
实例1：抗cKIT ADC的产生
具有或不具有位点特异性半胱氨酸突变的抗cKit抗体和抗体片段的制备
人抗cKIT抗体和抗体片段如先前在WO 2014150937和WO 2016020791中所述那样产生。
从在基于噬菌体展示的筛选中分离的载体扩增编码抗cKit抗体的重链和轻链的可变区的DNA，并且将该DNA克隆到含有人IgG1重链和人κ轻链或λ轻链的恒定区的哺乳动物表达载体中。载体含有CMV启动子和针对重链的信号肽(MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO:149)和针对轻链的MSVLTQVLALLLLWLTGTRC(SEQ ID NO:150)，以及用于在细菌宿主(例如大肠杆菌DH5α细胞)中扩增DNA、在哺乳动物细胞(例如HEK293细胞)中瞬时表达，或稳定转染到哺乳动物细胞(例如CHO细胞)中的适当信号和选择序列。为了引入Cys突变，使用设计用于取代重链或轻链编码序列的恒定区中的某一位点处的单一Cys残基的寡核苷酸进行定点诱变PCR。Cys取代突变的实例是重链的E152C或S375C；κ轻链的E165C或S114C；或λ轻链的A143C(所有EU编号)。在一些情况下，组合两个或更多个Cys突变以制备具有多个Cys取代的抗体，例如HC-E152C-S375C、λLC-A143C-HC-E152C、κLC-E165C-HC-E152C或κL-S114C-HC-E152C(所有EU编号)。为了产生编码抗体片段的质粒，用设计用于去除或修饰重链恒定区的一部分的寡核苷酸进行诱变PCR。例如，进行PCR以去除重链恒定区的残基222-447(EU编号)，使得终止密码子直接在残基221(EU编号)之后编码，以制备Fab片段的表达构建体。例如，进行PCR以去除重链恒定区的残基233-447(EU编号)，使得终止密码子直接在残基232(EU编号)之后编码，以制备包含IgG1铰链的两个Cys残基的Fab’片段的表达构建体。
通过使用如前所述的瞬时转染方法共转染重链和轻链质粒，在293FreestyleTM细胞中表达抗cKit抗体、抗体片段和Cys突变抗体或抗体片段(Meissner等人,BiotechnolBioeng.[生物技术与生物工程]75:197-203(2001))。使用适当的树脂如蛋白A、蛋白G、Capto-L或LambdaFabSelect树脂，通过标准亲和色谱法从细胞上清液中纯化表达的抗体。可替代地，通过将重链载体和轻链载体共转染到CHO细胞中，在CHO中表达抗cKit抗体、抗体片段和Cys突变抗体或抗体片段。对细胞进行选择，并且然后在针对抗体产生优化的条件下培养稳定转染的细胞。如上所述从细胞上清液中纯化抗体。
抗cKit抗体和抗体片段的还原、再氧化和与毒素的缀合
使用先前(例如，在WO 2014124316、WO 2015138615、Junutula JR等人,NatureBiotechnology[自然生物技术]26:925-932(2008)中)描述的方法将由用于对抗体或抗体片段上的硫醇基团(Cys侧链)反应的反应性部分(例如马来酰亚胺基团)、如所述的接头和功能部分(如澳瑞司他汀或其他毒素)组成的化合物与抗体中天然的Cys残基或工程化到抗体中的Cys残基缀合。
因为在哺乳动物细胞中表达的抗体中的工程化Cys残基在生物合成期间通过加合物(二硫化物)如谷胱甘肽(GSH)和/或半胱氨酸修饰(Chen等人2009)，所以最初表达的经修饰的Cys对硫醇反应性试剂(如马来酰亚胺基或溴乙酰胺或碘乙酰胺基团)不起反应。为了缀合工程化的Cys残基，需要通过还原二硫化物除去谷胱甘肽或半胱氨酸加合物，这通常需要还原表达的抗体中的所有二硫化物。因为抗体和抗体片段中的天然Cys残基通常与抗体或抗体片段中的其他Cys残基形成二硫键，所以它们也对硫醇反应性试剂不起反应，直到二硫化物被还原。二硫化物的还原可以通过首先将抗体暴露于还原剂如二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸或三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)来完成。任选地，可以去除还原剂以允许再氧化抗体或抗体片段的所有天然二硫键，从而恢复和/或稳定化功能性抗体结构。
在抗体或抗体片段仅在工程化Cys残基处缀合的情况下，为了还原天然二硫键和一个或多个工程化Cys残基的半胱氨酸或GSH加合物之间的二硫键，将新鲜制备的DTT添加至纯化的Cys突变抗体中，至最终浓度为10mM或20mM。在将抗体与DTT在37℃下孵育1小时后，将混合物用PBS透析3天，每天更换缓冲液以除去DTT并再次氧化天然二硫键。通过反相HPLC监测再氧化过程，该反相HPLC能够将抗体四聚体与各个重链和轻链分子分离。在加热至80℃的PRLP-S 4000A柱(50mm×2.1mm，安捷伦(Agilent))上分析反应物，并且通过含有0.1％TFA的30％-60％乙腈的水溶液的线性梯度进行柱洗脱，流速为1.5ml/min。在280nm处监测来自柱的蛋白质的洗脱。使透析继续直至再氧化完成。再氧化恢复链内和链间二硫化物，而透析允许与新引入的一个或多个Cys残基连接的半胱氨酸和谷胱甘肽透析掉。再氧化后，将含马来酰亚胺的化合物以典型地为1.5:1、2:1、或5:1的与工程化Cys的比率添加至在PBS缓冲液(pH 7.2)中的再氧化抗体或抗体片段中，并且进行孵育1小时。典型地，通过标准方法在蛋白A或其他适当的树脂上纯化除去过量的游离化合物，然后将缓冲液更换成PBS。
可替代地，使用树脂上方法还原并再氧化具有工程化Cys位点的抗体或抗体片段。将蛋白A琼脂糖珠(每10mg抗体1ml)在PBS(无钙或镁盐)中平衡，并且然后以分批模式添加至抗体样品中。通过将850mg半胱氨酸HCl溶解在10ml通过将3.4g NaOH添加至250ml 0.5M磷酸钠pH 8.0中制备的溶液中制备0.5M半胱氨酸原液，并且然后将20mM半胱氨酸添加至抗体/珠中，并且在室温下轻轻混合30-60分钟。将珠加载到重力柱上并且在不到30分钟内用50床体积的PBS洗涤。然后用重悬于一个床体积的PBS中的珠对柱封顶。为了调节再氧化速率，任选地添加50nM至1μM氯化铜。通过以下方式监测再氧化过程：通过取出树脂的小测试样品、在IgG洗脱缓冲液(赛默公司(Thermo))中洗脱、并如上所述通过RP-HPLC分析。一旦再氧化进行到所期望的完全性，可以通过添加相对于工程化半胱氨酸2-3摩尔过量的化合物立即引发缀合，并且使混合物在室温下反应5-10分钟，然后用至少20个柱体积的PBS洗涤柱。用IgG洗脱缓冲液洗脱抗体缀合物，并且用0.1体积0.5M磷酸钠pH 8.0中和，并且将缓冲液更换成PBS。在一些情况下，不是在树脂上引发与抗体的缀合，而是用至少20个柱体积的PBS洗涤柱，并且用IgG洗脱缓冲液洗脱抗体并用pH 8.0的缓冲液中和。然后将抗体用于缀合反应或快速冷冻以备将来使用。
在一些情况下，在不存在工程化Cys残基的情况下，或者在也引导与工程化Cys残基的缀合的同时，期望与天然Cys残基，如通常形成重链与轻链链间二硫键的那些Cys残基和抗体铰链区中通常形成重链与重链链间二硫键的Cys残基缀合。在这些情况下，通过向二硫键添加5倍过量的TCEP来还原抗体或抗体片段，并且将样品在37℃下孵育1小时。然后将样品立即缀合或在<-60℃下冷冻以备将来缀合。将含马来酰亚胺的化合物以典型地2:1的与Cys残基的比率添加至在PBS缓冲液(pH7.2)中的抗体或抗体片段中，并且进行孵育1小时。典型地，通过脱盐柱除去过量的游离化合物，之后将缓冲液更大量地更换成PBS。
由全长抗体产生抗体片段
在一些情况下，通过如上所述遗传操纵抗体重链编码序列，使得表达产物是抗体片段，来产生抗体片段。在其他情况下，通过酶消化全长抗体产生抗体。
为了产生包含起始抗体的残基1-222(EU编号)的Fab片段，根据制造商的方案用固定的木瓜蛋白酶树脂(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))处理完整抗体。简而言之，通过在消化缓冲液中平衡新鲜溶解的20mM半胱氨酸-HCl以调节至pH 7.0来制备固定化木瓜蛋白酶树脂。将抗体调节至大约10mg/ml并将缓冲液交换成消化缓冲液，并且以4mgIgG/ml树脂的比率添加至树脂中并在37℃下孵育5-7小时。然后除去树脂，并且通过适当的亲和树脂纯化抗体片段，例如通过与蛋白A树脂结合将完整的IgG和Fc片段与Fab片段分离，或通过尺寸排阻色谱法进行分离。
为了产生包含起始抗体的残基1-236(EU编号)的F(ab’)2片段，用蛋白水解酶处理完整抗体。简而言之，将抗体在PBS中以大约10mg/ml制备。将酶以1:100重量/重量比添加，并且在37℃下孵育2小时。通过适当的亲和树脂纯化抗体片段，例如通过与蛋白A树脂结合将完整的IgG和Fc片段与Fab’片段分离，或通过尺寸排阻色谱法进行分离。
抗cKit-毒素抗体和抗体片段缀合物的特性
分析抗体和抗体片段缀合物以确定缀合的程度。从针对还原和去糖基化(适当时)样品的LC-MS数据外推化合物对抗体比率。LC/MS允许定量缀合物样品中连接至抗体的接头-有效负载(化合物)的平均分子数。高压液相色谱法(HPLC)将抗体分离成轻链和重链，并且在还原条件下，根据每条链的接头-有效负载基团的数量分离重链(HC)和轻链(LC)。质谱数据能够鉴定混合物中的组分种类，例如LC、LC+1、LC+2、HC、HC+1、HC+2等。根据LC和HC链上的平均负载，可以计算抗体缀合物的平均化合物对抗体比率。给定缀合物样品的化合物对抗体比率表示与含有两条轻链和两条重链的四聚体抗体连接的化合物(接头-有效负载)分子的平均数。
使用分析型尺寸排阻色谱法(AnSEC)在Superdex 200 10/300GL(GE医疗集团(GEHealthcare))和/或蛋白质KW-803 5μm 300×8mm(昭和电工公司(Shodex))柱上概要分析缀合物；基于分析型尺寸排阻色谱法分析聚集性。
示例性抗cKIT Fab-毒素缀合物的制备
为了产生抗cKIT Fab’-毒素DAR4缀合物或抗Her2 Fab-毒素DAR4对照缀合物，用蛋白水解酶消化50mg全长IgG(WT，未引入半胱氨酸)。在Superdex-S200(GE医疗集团)柱上通过SEC纯化F(ab’)2片段。可替代地，为了产生抗HER2对照缀合物或抗cKit Fab’-毒素DAR4缀合物，将编码Fab’HC的载体与编码Fab’LC的载体共转染在CHO中。通过在蛋白G树脂上捕获来纯化表达的Fab’。F(ab’)2或Fab’通过添加TCEP(相对于链间二硫化物5倍过量)进行还原，并且立即与本发明化合物(相对于游离Cys残基2.5倍过量)反应。通过RP-HPLC监测反应，并且添加另外的1x当量化合物直至反应完成。通过PD10脱盐柱(GE医疗集团)除去游离化合物。通过实验确定DAR≥3.9。在所提供的实例中进一步研究的特异性缀合物列于表2中。
为了产生抗cKIT Fab-毒素DAR2缀合物，将编码具有引入的Cys残基的Fab HC(根据EU编号具有E152C的HC 1-221)的载体与编码具有引入的Cys残基(根据EU编号的κLC K107C、κLC S114C、或κLC E165C)的Fab LC的载体共转染在HEK293中。为了产生抗Her2 Fab-毒素DAR2缀合物，将编码具有引入的Cys残基的Fab HC(根据EU编号具有E152C和C末端His6标签(SEQ ID NO:151)的HC 1-222)的载体与编码具有引入的Cys残基(根据EU编号的κLCK107C、κLC S114C、或κLC E165C)的Fab LC的载体共转染在HEK293中。通过在Capto-L树脂(GE医疗集团)上捕获并用标准IgG洗脱缓冲液(赛默公司)洗脱来纯化表达的Fab。使用Amicon ultra装置将Fab缓冲液更换成PBS。将Fab用DTT还原并且在室温下再氧化。在链间二硫键重新形成后，将Fab与化合物6(相对于游离Cys残基3倍过量)缀合。使反应在室温下进行30min，并且通过RP-HPLC监测，在310nm处检测。将缀合的Fab在蛋白A(抗her2)或capto-L(抗cKit)树脂上纯化，并且用PBS+1％Triton X-100洗涤，并用大量的PBS洗涤，然后在IgG洗脱缓冲液中洗脱。然后使用Amicon ultra装置将Fab缓冲液更换成PBS。在所提供的实例中进一步研究的特异性缀合物列于下表2中，具有实验确定的DAR值。
为了产生抗cKIT F(ab’)2-毒素DAR2缀合物，将编码具有引入的Cys残基(根据EU编号的E152C和S375C)的HC的载体与编码Fab LC的载体共转染在CHO中。为了产生抗Her2 F(ab’)2-毒素DAR2对照缀合物，将编码具有引入的Cys残基(根据EU编号的E152C和S375C)的HC的载体与编码Fab LC的载体共转染在HEK293中。通过在蛋白A或mabselectsure树脂(GE医疗集团)上捕获并用标准IgG洗脱缓冲液(赛默公司)洗脱来纯化表达的IgG。将全长IgG在室温下用DTT还原，并且在如通过RP-HPLC监测除去DTT后再氧化。然后用蛋白水解酶消化再氧化的IgG以产生F(ab’)2片段。对于抗cKIT片段，使用Amicon ultra装置将F(ab’)2缓冲液更换成PBS。对于抗HER2片段，通过制备型HIC富集F(ab’)2级分，并且然后使用Amiconultra装置将缓冲液更换成PBS。使F(ab’)2与化合物(LP1)或化合物(LP2)(相对于游离Cys残基4倍过量)缀合。使反应在室温下进行30min，并且通过RP-HPLC监测，在310nm处检测。将缀合的F(ab’)2在Capto-L树脂上纯化(抗cKit抗体3)，并且用PBS+1％Triton X-100洗涤，并用大量的PBS洗涤，然后在IgG洗脱缓冲液中或通过制备型SEC洗脱(抗her2和抗cKIT抗体4)。然后使用Amicon Ultra装置浓缩F(ab’)2并将缓冲液更换成PBS。在所提供的实例中进一步研究的特异性缀合物列于下表2中，具有实验确定的DAR值。
表2.示例性抗cKIT或对照缀合物
Figure BDA0002904476810001841
Figure BDA0002904476810001851
Figure BDA0002904476810001861
Figure BDA0002904476810001871
实例2：用于结合测定的人、食蟹猴、小鼠和大鼠cKIT细胞外结构域蛋白，以及cKIT亚结 构域1-3和4-5的产生
基于来自GenBank或Uniprot数据库的氨基酸序列，基因合成了人、小鼠和大鼠cKIT细胞外结构域(ECD)(参见下表3)。基于使用来自各种食蟹猴组织的mRNA产生的氨基酸序列信息，基因合成了食蟹猴cKIT和1个ECD cDNA模板(例如Zyagen Laboratories；下表4)。将所有合成的DNA片段克隆到合适的表达载体中，例如，基于hEF1-HTLV的载体(pFUSE-mIgG2A-Fc2)，该载体具有C末端标签以允许纯化。
表3人、小鼠、大鼠cKIT构建体的序列
Figure BDA0002904476810001881
Figure BDA0002904476810001891
Figure BDA0002904476810001901
Figure BDA0002904476810001911
表4食蟹猴cKIT蛋白的序列
Figure BDA0002904476810001912
Figure BDA0002904476810001921
重组cKIT ECD蛋白的表达
将期望的cKIT重组蛋白在先前适于悬浮培养的HEK293衍生细胞系(293FS)中表达，并且在无血清培养基FreeStyle-293(吉博克公司(Gibco)，目录号12338018)中生长。将小规模和大规模蛋白质产生均经由瞬时转染进行，并且在多个摇瓶(Nalgene)中进行，每个高达1L，使用
Figure BDA0002904476810001926
(生命技术公司(Life Technologies)，目录号12347019)作为质粒载体。将总DNA和293Fectin以1:1.5(w:v)的比率使用。DNA对培养物的比率为1mg/L。将细胞培养物上清液在转染后3-4天收获，离心并无菌过滤，之后进行纯化。
加标签的EDC蛋白纯化
将重组的加Fc标签的cKIT细胞外结构域蛋白(例如，人cKIT ECD-Fc、人cKIT(ECD亚结构域1-3、4-5)-Fc、食蟹猴cKIT-mFc、大鼠cKIT-mFc、小鼠cKIT-mFc)从细胞培养上清液中纯化。使澄清的上清液通过已用PBS平衡的蛋白A
Figure BDA0002904476810001922
柱。在洗涤至基线后，将结合的物质用Pierce
Figure BDA0002904476810001923
低pH洗脱缓冲液或100mM甘氨酸(pH 2.7)洗脱，并且立即用1/8洗脱体积的1M Tris pH 9.0中和。如果需要，使用具有10kD或30kD标称分子量截留值的
Figure BDA0002904476810001924
Ultra 15mL离心浓缩器浓缩汇集的蛋白质。然后使用
Figure BDA0002904476810001925
200 26/60柱通过SEC纯化汇集物以除去聚集体。然后通过SDS-PAGE和SEC-MALLS(多角度激光散射)表征纯化的蛋白质。使用通过Vector NTI从序列计算的理论吸收系数，通过280nm处的吸光度测定浓度。
实例3：cKIT Fab与cKIT ECD亚结构域的结合
为了帮助确定cKIT抗体的结合位点，将人cKIT ECD分成亚结构域1-3(配体结合结构域)和亚结构域4-5(二聚化结构域)。为了确定结合哪个亚结构域，采用夹心ELISA测定。将在1X磷酸盐缓冲盐水中稀释的1μg/ml ECD(对应于cKIT亚结构域1-3、亚结构域4-5或全长cKIT ECD)包被在96孔
Figure BDA0002904476810001931
4-HBX平板上(赛默科技公司(Thermo Scientific)目录号3855，伊利诺伊州罗克福德(Rockford,IL))并且在4℃下孵育过夜。将板用洗涤缓冲液(具有0.01％吐温-20(伯乐公司(Bio-Rad)101-0781)的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS))洗涤三次。将板用在1XPBS中稀释的280μl/孔3％牛血清白蛋白在室温下封闭2小时。将板用洗涤缓冲液洗涤三次。在洗涤缓冲液中在2μg/ml下以5倍稀释度针对8个点制备抗体，并且将这些抗体以100μl/孔一式三份添加至ELISA板中。将板在室温下、在以200rpm振荡的轨道式振荡器上孵育1小时。用洗涤缓冲液将测定板洗涤三次。将二抗F(ab’)2片段山羊抗人IgG(H+L)(杰克森免疫研究公司(Jackson Immunoresearch)目录号109-036-088，宾夕法尼亚州西格罗夫(West Grove,PA))在洗涤缓冲液中以1:10,0000制备，并且以100μl/孔添加至ELISA板中。将板与二抗一起在室温下孵育1小时，在轨道振荡器上以200rpm振荡。用洗涤缓冲液将测定板洗涤三次。为了形成ELISA信号，将100μl/孔的Sure
Figure BDA0002904476810001932
TMB底物(KPL目录号52-00-03，马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg,MD))添加至板中，并且在室温下孵育10分钟。为了终止反应，向每个孔中添加50μl的1N盐酸。使用分子仪器公司(Molecular Devices)
Figure BDA0002904476810001933
M5板读出器在450nm下测量吸光度。为了确定每种抗体的结合应答，对光密度测量值求平均，产生标准偏差值并使用Excel作图。单独的抗cKIT抗体与cKIT的结合特征可以在表6中找到。
实例4：cKIT抗体的亲和力测量
使用
Figure BDA0002904476810001934
2000仪器(GE医疗集团，宾夕法尼亚州匹兹堡市(Pittsburgh,PA))和CM5传感器芯片，使用SPR技术测定抗体对cKIT种类直向同源物以及人cKIT的亲和力。
简而言之，使用补充有2％
Figure BDA0002904476810001941
封闭缓冲液(Li-Cor Biosciences，内布拉斯加州林肯(Lincoln,NE))的HBS-P(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P20)作为所有实验的运行缓冲液。通过响应单位(RU)测量固定化水平和分析物相互作用。进行预试验以测试和证实固定化抗人Fc抗体(目录号BR100839，GE医疗集团，宾夕法尼亚州匹兹堡市)和捕获测试抗体的可行性。
对于动力学测量，进行实验，其中经由固定化的抗人Fc抗体将抗体捕获到传感器芯片表面，并且测定cKIT蛋白在游离溶液中结合的能力。简而言之，将pH 5下的25μg/ml抗人Fc抗体通过胺偶联固定化在CM5传感器芯片上，在两个流动池上的流速为5μl/min，至达到10,500RU。然后以10μl/min注射0.1-1μg/ml的测试抗体，持续1分钟。捕获的抗体水平通常保持在200RU以下。随后，将3.125-50nM的cKIT受体细胞外结构域(ECD)以2倍系列稀释，并且以40μl/min的流速在参比流动池和测试流动池上注射3分钟。下面列出了测试的ECD表(表5)。跟踪ECD结合的解离10分钟。在每个注射循环后，将芯片表面用3M MgCl2以10μl/min再生30秒。所有实验均在25℃下进行，并且响应数据用简单的1:1交互作用模型全面拟合(使用Scrubber
Figure BDA0002904476810001943
软件版本2.0b(BioLogic软件))以获得缔合速率(ka)、解离速率(kd)和亲和力(KD)。表6列出了所选择的抗cKIT抗体的结构域结合和亲和力。
表5cKIT ECD同种型和来源
Figure BDA0002904476810001942
Figure BDA0002904476810001951
表6-抗体亲和力和交叉反应性
Figure BDA0002904476810001952
实例5通过cKIT ADC进行的体外人HSC细胞杀伤测定
体外HSC生活力测定
从HemaCare(目录号M001F-GCSF-3)获得人动员的外周血造血干细胞(HSC)。将每个约1百万个细胞的小瓶解冻并且稀释到10ml的1X HBSS中并以1200rpm离心7分钟。将细胞沉淀重悬于18ml含有三种生长因子的生长培养基中(StemSpan SFEM(干细胞技术有限公司(StemCell Technologies)，目录号09650)，具有各50ng/ml的TPO(R&D Systems，目录号288-TP)、Flt3配体(生命技术公司，目录号PHC9413)、和IL-6(生命技术公司，目录号PHC0063)，补充有氨基酸(吉博克公司，目录号10378-016))。
将测试试剂一式两份地稀释到384孔黑色测定板中，终体积为5μl，从10μg/ml开始并且使用1:3系列稀释度。将来自上面的细胞以45μl的最终体积添加至每个孔中。将细胞在37℃和5％氧气下孵育7天。在培养结束时，通过将测定板以1200rpm离心4分钟来收获细胞用于染色。然后吸出上清液并且将细胞洗涤并转移到不同的384孔板(莱娜第一生化有限公司(Greiner Bio-One)TC处理的黑色透明平板，目录号781092)。
对于人细胞测定，将每个孔用抗CD34-PerCP(贝克顿-迪金森公司(BectonDickinson)，目录号340666)和抗CD90-APC(贝克顿-迪金森公司，目录号559869)染色、洗涤，并重悬于FACS缓冲液中至终体积为50μl。然后在贝克顿-迪金森公司Fortessa流式细胞仪上分析细胞并且进行定量分析。
如在该测定中确定的，识别cKIT的抗体和抗体片段的毒素缀合物杀伤HSC。通过FACS定量细胞显示用抗cKIT-毒素缀合物处理的孔中的活细胞少于用PBS处理或用抗体或抗体片段的同种型对照毒素缀合物处理的对照孔中的活细胞。数据示出在图1中并汇总在表7中。本文使用的命名约定是J#，对应于表2中描述的特定缀合物编号。
表7.在抗-cKIT Fab-毒素缀合物处理后的细胞生活力
Figure BDA0002904476810001961
Figure BDA0002904476810001971
实例6对人肥大细胞脱粒的体外测定
使用来自动员的外周血的CD34+祖细胞产生成熟肥大细胞。将CD34+细胞在补充有以下的StemSpan SFEM(干细胞技术有限公司)中培养：重组人干细胞因子(rhSCF，50ng/ml，吉博克公司)、重组人白介素6(rhIL-6，50ng/ml，吉博克公司)、重组人IL-3(30ng/ml，派普泰克公司(Peprotech))、GlutaMAX(2nM，吉博克公司)、青霉素(100U/ml，海克隆公司(Hyclone))和链霉素(100μg/ml，海克隆公司)。仅在培养的第一周期间添加重组hIl-3。第3周后，每周用含有rhIL-6(50ng/ml)和rhSCF(50ng/ml)的新鲜培养基更换一半培养基。通过高亲和力IgE受体(FCεRI，eBioscience)和CD117(BD)的表面染色评价成熟的肥大细胞纯度。使用在培养的第8周与第12周之间的细胞。
将衍生的肥大细胞洗涤一次以除去SCF，并且将所需量的细胞在含有rhIL-6(50ng/ml)、有或没有rhSCF(50ng/ml)的肥大细胞培养基中孵育过夜。作为肥大细胞脱粒的阳性对照，将一部分细胞用人骨髓瘤IgE(100ng/ml，EMD密理博公司(EMD Millipore))敏化。第二天，在补充有0.04％牛血清白蛋白(BSA，西格玛公司)的HEPES脱粒缓冲液(10mM HEPES、137mM NaCl、2.7mM KCl、0.4mM磷酸氢二钠、5.6mM葡萄糖，pH调节为7.4并且与1.8mM氯化钙和1.3mM硫酸镁混合)中制备抗cKIT抗体或其抗体片段或毒素缀合物、小鼠单克隆抗人IgG1(Fab特异性，西格玛公司)、山羊抗人IgE(艾博抗公司(Abcam))和化合物48/80(西格玛公司)稀释液。将测试试剂和抗IgG1在V底384孔测定板中混合在一起，同时单独测试抗IgE和化合物48/80。将测定板在37℃下孵育30min。在孵育期间，用HEPES脱粒缓冲液+0.04％BSA洗涤细胞3次以除去培养基和未结合的IgE。将细胞重悬于HEPES脱粒缓冲液+0.04％BSA中，并且以每孔3000个细胞接种在测定板中，最终反应体积为50μl。用IgE敏化的细胞仅与抗IgE一起用作脱颗粒的阳性对照。将测定板在37℃下孵育30min以发生脱粒。在该孵育期间，将对硝基-N-乙酰基-β-D-葡糖胺(pNAG，西格玛公司)缓冲液通过在柠檬酸盐缓冲液(40mM柠檬酸、20mM磷酸氢二钠，pH 4.5)中超声处理3.5mg/ml pNAG来制备。通过将20μl细胞上清液与40μl pNAG溶液在平底384孔板中混合来测量β-己糖胺酶释放。将该板在37℃下孵育1.5小时，并且通过添加40μl终止溶液(400mM甘氨酸，pH 10.7)终止反应。使用板读出器在λ＝405nm处读出吸光度，其中参比滤光器在λ＝620nm处。
表8中描述了肥大细胞脱粒测定中使用的全长IgG对照。
表8.肥大细胞脱粒测定中使用的全长IgG对照
Figure BDA0002904476810001981
Figure BDA0002904476810001991
实例7对全长抗cKIT抗体及其F(ab’)2和Fab片段进行的人肥大细胞脱粒的体外测定
如实例6中所述，产生成熟肥大细胞并且用抗cKIT抗体和F(ab’)2和Fab片段测试。
如图2A-2C中所示，全长抗cKIT抗体4和F(ab’4)2片段在交联时引起肥大细胞脱粒，而在所有测试浓度下的Fab4(HC-E152C)片段没有触发肥大细胞脱粒。图2D-2F显示全长抗cKIT抗体1和F(ab’1)2片段在交联时引起肥大细胞脱粒，而在所有测试浓度下的Fab1(HC-E152C)片段没有触发肥大细胞脱粒。图2G-2I显示全长抗cKIT抗体2和F(ab’2)2片段在交联时引起肥大细胞脱粒，而在所有测试浓度下的Fab2(HC-E152C)片段没有触发肥大细胞脱粒。图2J-2L显示全长抗cKIT抗体3和F(ab’3)2片段在交联时引起肥大细胞脱粒，而在所有测试浓度下的Fab3(HC-E152C)片段没有触发肥大细胞脱粒。这表明Fab片段甚至当结合并多聚化成较大的复合物(如在患者形成或具有预先存在的识别Fab片段的抗药物抗体的情况下可以观察到的)时也不会引起肥大细胞脱粒。另一方面，当结合并多聚化成较大的复合物时，F(ab’)2确实引起水平与全长抗cKIT抗体类似的肥大细胞脱粒。
实例8从小鼠宿主中体外消融人HSC
为了评估测试试剂对人HSC的体内功效，从杰克逊实验室(Jackson Laborator)购买用人CD34+细胞人源化的严重免疫受损的NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ小鼠。通过血液样品的流式细胞术确定人类嵌合性百分比。为此，将血液用以下抗体染色：抗人CD45-e450(eBioscience，目录号48-0459-42)、抗小鼠CD45-APC(贝克顿-迪金森公司，目录号559864)、抗人CD33-Pe(贝克顿-迪金森公司，目录号347787)、抗-人CD19-FITC(贝克顿-迪金森公司，目录号555422)和抗人CD3-PeCy7(贝克顿-迪金森公司，目录号557851)。一旦确认人类嵌合性，将人源化NSG小鼠腹膜内每天两次(b.i.d)给予测试试剂药物。给药后重新评估人类嵌合性的程度。为了评估人HSC的存在或不存在，将小鼠安乐死并且将骨髓分离并用以下抗体染色：抗人CD45-e450(eBioscience，目录号48-0459-42)、抗小鼠CD45-APC(贝克顿-迪金森公司，目录号559864)、抗人CD34-PE(贝克顿-迪金森公司，目录号348057)、抗人CD38-FITC(贝克顿-迪金森公司，目录号340926)、抗人CD11b-PE(贝克顿-迪金森公司，目录号555388)、抗人CD33-PeCy7(贝克顿-迪金森公司，目录号333946)、抗人CD19-FITC(贝克顿-迪金森公司，目录号555412)和抗人CD3-PeCy7(贝克顿-迪金森公司，目录号557851)。将细胞群经由流式细胞术评估并且用FlowJo分析。
在一个特定实验中，向小鼠每天两次给予10mg/kg抗cKIT缀合物J26、J29或J30或同种型对照缀合物J31，持续2天。在第21天对小鼠进行安乐死并且分析它们的骨髓。如图3所示，用抗cKIT缀合物J26、J29或J30处理的小鼠显示减少的人HSC(人CD45+、人CD34+、人CD38-)，而用同种型对照缀合物J31处理的小鼠显示可变的嵌合性。
该实验显示抗cKit Fab’-毒素缀合物能够从骨髓中消耗HSC。抗cKIT Fab’-澳瑞司他汀缀合物(例如，J26、J29、J30)能够消融体内的人HSC。
除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与熟悉本披露所属领域的技术人员通常理解的相同含义。
除非另外指明，否则没有详细地具体描述的所有方法、步骤、技术和操作可以并且已经按照本身已知的方式进行，这应是技术人员所清楚的。再次对例如本文提及的标准手册和普通背景技术和其中引用的另外的参考文献进行引用。除非另外指明，否则本文引用的每个参考文献都通过引用以其整体而并入。
本发明的权利要求是非限制性的并且提供于下文中。
尽管本文已经详细披露了具体方面和权利要求，但是这仅是出于说明的目的以举例方式来进行的，并且这并不旨在对所附权利要求的范围或任何相应的未来申请的权利要求主题的范围加以限制。具体而言，本发明人考虑到，在不脱离如由权利要求定义的本披露的精神和范围的情况下，可以对本披露进行多种替代、改变和修饰。核酸起始材料、目的克隆或文库类型的选择被认为对于具有本文描述的方面的知识的本领域普通技术人员而言是常规的。其他方面、优点和修饰被认为落入下列权利要求的范围内。使用不超过常规的实验，本领域技术人员应认识到或能够确认本文描述的本发明的具体方面的很多等效物。此类等效物旨在为下列权利要求所涵盖。在今后提交的相应申请中重写权利要求的范围可能是由于不同国家专利法的限制，而不应当被理解为放弃权利要求的主题。
Figure IDA0002904476850000011
Figure IDA0002904476850000021
Figure IDA0002904476850000031
Figure IDA0002904476850000041
Figure IDA0002904476850000051
Figure IDA0002904476850000061
Figure IDA0002904476850000071
Figure IDA0002904476850000081
Figure IDA0002904476850000091
Figure IDA0002904476850000101
Figure IDA0002904476850000111
Figure IDA0002904476850000121
Figure IDA0002904476850000131
Figure IDA0002904476850000141
Figure IDA0002904476850000151
Figure IDA0002904476850000161
Figure IDA0002904476850000171
Figure IDA0002904476850000181
Figure IDA0002904476850000191
Figure IDA0002904476850000201
Figure IDA0002904476850000211
Figure IDA0002904476850000221
Figure IDA0002904476850000231
Figure IDA0002904476850000241
Figure IDA0002904476850000251
Figure IDA0002904476850000261
Figure IDA0002904476850000271
Figure IDA0002904476850000281
Figure IDA0002904476850000291
Figure IDA0002904476850000301
Figure IDA0002904476850000311
Figure IDA0002904476850000321
Figure IDA0002904476850000331
Figure IDA0002904476850000341
Figure IDA0002904476850000351
Figure IDA0002904476850000361
Figure IDA0002904476850000371
Figure IDA0002904476850000381
Figure IDA0002904476850000391
Figure IDA0002904476850000401
Figure IDA0002904476850000411
Figure IDA0002904476850000421
Figure IDA0002904476850000431
Figure IDA0002904476850000441
Figure IDA0002904476850000451
Figure IDA0002904476850000461
Figure IDA0002904476850000471
Figure IDA0002904476850000481
Figure IDA0002904476850000491
Figure IDA0002904476850000501
Figure IDA0002904476850000511
Figure IDA0002904476850000521
Figure IDA0002904476850000531
Figure IDA0002904476850000541
Figure IDA0002904476850000551
Figure IDA0002904476850000561
Figure IDA0002904476850000571
Figure IDA0002904476850000581
Figure IDA0002904476850000591
Figure IDA0002904476850000601
Figure IDA0002904476850000611
Figure IDA0002904476850000621
Figure IDA0002904476850000631
Figure IDA0002904476850000641
Figure IDA0002904476850000651
Figure IDA0002904476850000661

Claims (41)

1.一种具有式(I)的缀合物或其药学上可接受的盐；
A-(LB-(D)n)y
式(I)
其中：
A是特异性结合人cKIT的抗体片段；
LB是接头；
n是从1至10的整数；
y是从1至10的整数，并且
D是选自具有式(A)的化合物的细胞毒性剂：
Figure FDA0002904476800000011
其中：
R1是
Figure FDA0002904476800000012
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
或者D是选自具有式(B)的化合物的细胞毒性剂：
Figure FDA0002904476800000013
其中：
R1是
Figure FDA0002904476800000021
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8。
3.如权利要求1或2所述的缀合物，其中y是1、2、3或4。
4.如权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中每个LB独立地选自可裂解接头或不可裂解接头。
5.如权利要求1至4中任一项所述的缀合物，其中每个LB是可裂解接头。
6.如权利要求1至4中任一项所述的缀合物，其中每个LB是不可裂解接头。
7.一种具有式(E)的结构的缀合物：
Figure FDA0002904476800000022
其中：
A表示特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab或Fab’)；
y是从1至10的整数；
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的连接点；
X1是
Figure FDA0002904476800000031
Figure FDA0002904476800000032
Figure FDA0002904476800000033
其中**指示与-NH-或与X2的连接点；
X2是
Figure FDA0002904476800000034
其中**指示与-NH-的连接点；
X3是
Figure FDA0002904476800000041
其中**指示与-NH-的连接点；
X4是
Figure FDA0002904476800000042
Figure FDA0002904476800000043
Figure FDA0002904476800000044
其中*指示连接点朝向R114；
R114是
Figure FDA0002904476800000045
-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、
Figure FDA0002904476800000046
Figure FDA0002904476800000051
Figure FDA0002904476800000052
其中*指示与A的连接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
8.如权利要求7所述的缀合物，该缀合物选自
Figure FDA0002904476800000061
Figure FDA0002904476800000062
以及
Figure FDA0002904476800000063
其中：
A表示特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab或Fab’)，并且
y是从1至10的整数。
9.一种具有式(G)的结构的缀合物：
Figure FDA0002904476800000064
其中：
A表示特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab或Fab’)；
y是从1至10的整数；
R2是H、C1-C6烷基、-C(＝O)R3、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR4、-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的连接点；
X1是
Figure FDA0002904476800000071
Figure FDA0002904476800000072
Figure FDA0002904476800000073
其中**指示与-NH-或与X2的连接点；
X2是
Figure FDA0002904476800000074
其中**指示与-NH-的连接点；
X3是
Figure FDA0002904476800000081
其中**指示与-NH-的连接点；
X4是
Figure FDA0002904476800000082
Figure FDA0002904476800000083
Figure FDA0002904476800000084
其中*指示连接点朝向R114；
R114是
Figure FDA0002904476800000085
-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、
Figure FDA0002904476800000086
Figure FDA0002904476800000091
Figure FDA0002904476800000092
其中*指示与A的连接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
10.如权利要求9所述的缀合物，该缀合物选自
Figure FDA0002904476800000101
Figure FDA0002904476800000102
以及
Figure FDA0002904476800000103
其中：
A表示特异性结合人cKIT的抗体片段(例如Fab或Fab’)，并且
y是从1至10的整数。
11.如权利要求1至10中任一项所述的缀合物，其中该抗体片段特异性结合人cKIT的细胞外结构域(SEQ ID NO:112)。
12.如权利要求1至10中任一项所述的缀合物，其中该抗体片段特异性结合人cKIT的结构域1-3(SEQ ID NO:113)中的表位。
13.如权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中该抗体片段是Fab或Fab’。
14.如权利要求1至10或权利要求13中任一项所述的缀合物，其中该抗体片段选自以下中的任一种：
(1)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1(重链互补性决定区1)、(b)SEQ ID NO:2的HCDR2(重链互补性决定区2)、和(c)SEQID NO:3的HCDR3(重链互补性决定区3)；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:16的LCDR1(轻链互补性决定区1)、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2(轻链互补性决定区2)、和(f)SEQ ID NO:18的LCDR3(轻链互补性决定区3)；
(2)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:4的HCDR1、(b)SEQ ID NO:5的HCDR2、(c)SEQ ID NO:3的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:19的LCDR1、(e)SEQ ID NO:20的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:21的LCDR3；
(3)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:6的HCDR1、(b)SEQ ID NO:2的HCDR2、(c)SEQ ID NO:3的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:16的LCDR1、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:18的LCDR3；
(4)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:22的LCDR1、(e)SEQ ID NO:20的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:18的LCDR3；
(5)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:27的HCDR1、(b)SEQ ID NO:28的HCDR2、(c)SEQ ID NO:29的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:42的LCDR1、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:43的LCDR3；
(6)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:30的HCDR1、(b)SEQ ID NO:31的HCDR2、(c)SEQ ID NO:29的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:44的LCDR1、(e)SEQ ID NO:20的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:45的LCDR3；
(7)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:32的HCDR1、(b)SEQ ID NO:28的HCDR2、(c)SEQ ID NO:29的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:42的LCDR1、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:43的LCDR3；
(8)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:33的HCDR1、(b)SEQ ID NO:34的HCDR2、(c)SEQ ID NO:35的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:46的LCDR1、(e)SEQ ID NO:20的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:43的LCDR3；
(9)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1、(b)SEQ ID NO:51的HCDR2、(c)SEQ ID NO:3的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:16的LCDR1、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:18的LCDR3；
(10)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:4的HCDR1、(b)SEQ ID NO:52的HCDR2、(c)SEQ ID NO:3的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:19的LCDR1、(e)SEQ ID NO:20的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:21的LCDR3；
(11)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:6的HCDR1、(b)SEQ ID NO:51的HCDR2、(c)SEQ ID NO:3的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:16的LCDR1、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:18的LCDR3；
(12)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:53的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:22的LCDR1、(e)SEQ ID NO:20的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:18的LCDR3；
(13)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:60的HCDR1、(b)SEQ ID NO:61的HCDR2、(c)SEQ ID NO:62的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:75的LCDR1、(e)SEQ ID NO:76的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:77的LCDR3；
(14)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:63的HCDR1、(b)SEQ ID NO:64的HCDR2、(c)SEQ ID NO:62的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:78的LCDR1、(e)SEQ ID NO:79的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:80的LCDR3；
(15)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:61的HCDR2、(c)SEQ ID NO:62的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:75的LCDR1、(e)SEQ ID NO:76的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:77的LCDR3；
(16)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:66的HCDR1、(b)SEQ ID NO:67的HCDR2、(c)SEQ ID NO:68的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:81的LCDR1、(e)SEQ ID NO:79的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:77的LCDR3；
(17)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:86的HCDR1、(b)SEQ ID NO:87的HCDR2、(c)SEQ ID NO:88的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:101的LCDR1、(e)SEQ ID NO:102的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:103的LCDR3；
(18)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:89的HCDR1、(b)SEQ ID NO:90的HCDR2、(c)SEQ ID NO:88的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:104的LCDR1、(e)SEQ ID NO:105的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:106的LCDR3；
(19)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:91的HCDR1、(b)SEQ ID NO:87的HCDR2、(c)SEQ ID NO:88的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:101的LCDR1、(e)SEQ ID NO:102的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:103的LCDR3；
(20)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:92的HCDR1、(b)SEQ ID NO:93的HCDR2、(c)SEQ ID NO:94的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:107的LCDR1、(e)SEQ ID NO:105的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:103的LCDR3；
(21)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含含有SEQ ID NO:10的重链可变区(VH)，和含有SEQID NO:23的轻链可变区(VL)；
(22)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含含有SEQ ID NO:36的VH，和含有SEQ ID NO:47的VL；
(23)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含含有SEQ ID NO:54的VH，和含有SEQ ID NO:23的VL；
(24)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含含有SEQ ID NO:69的VH，和含有SEQ ID NO:82的VL；
(25)Fab或Fab’，该Fab或Fab’包含含有SEQ ID NO:95的VH，和含有SEQ ID NO:108的VL；
(26)Fab’，该Fab’包含含有SEQ ID NO:14的重链，和含有SEQ ID NO:25的轻链；
(27)Fab’，该Fab’包含含有SEQ ID NO:40的重链，和含有SEQ ID NO:49的轻链；
(28)Fab’，该Fab’包含含有SEQ ID NO:58的重链，和含有SEQ ID NO:25的轻链；
(29)Fab’，该Fab’包含含有SEQ ID NO:73的重链，和含有SEQ ID NO:84的轻链；
(30)Fab’，该Fab’包含含有SEQ ID NO:99的重链，和含有SEQ ID NO:110的轻链；
(31)Fab，该Fab包含含有SEQ ID NO:118的重链，和含有SEQ ID NO:122的轻链；
(32)Fab，该Fab包含含有SEQ ID NO:118的重链，和含有SEQ ID NO:123的轻链；
(33)Fab，该Fab包含含有SEQ ID NO:124的重链，和含有SEQ ID NO:128的轻链；
(34)Fab，该Fab包含含有SEQ ID NO:124的重链，和含有SEQ ID NO:129的轻链；
(35)Fab，该Fab包含含有SEQ ID NO:130的重链，和含有SEQ ID NO:134的轻链；
(36)Fab，该Fab包含含有SEQ ID NO:130的重链，和含有SEQ ID NO:135的轻链；
(37)Fab，该Fab包含含有SEQ ID NO:136的重链，和含有SEQ ID NO:140的轻链；
(38)Fab，该Fab包含含有SEQ ID NO:141的重链，和含有SEQ ID NO:145的轻链；
(39)Fab，该Fab包含含有选自SEQ ID NO:119、120或121的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链；
(40)Fab，该Fab包含含有选自SEQ ID NO:125、126或127的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链；
(41)Fab，该Fab包含含有选自SEQ ID NO:131、132或133的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链；
(42)Fab，该Fab包含含有选自SEQ ID NO:137、138或139的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链；或
(43)Fab，该Fab包含含有选自SEQ ID NO:142、143或144的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的轻链。
15.如权利要求1至14中任一项所述的缀合物，其中该抗体片段是人或人源化Fab或Fab’。
16.如权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中该抗体片段是Fab’并且该接头(LB)连接至该Fab’的铰链区中的天然半胱氨酸残基。
17.如权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中该抗体片段包含至少一个引入到恒定区中的非天然半胱氨酸，并且该接头(LB)连接至该非天然半胱氨酸。
18.如权利要求7至10中任一项所述的缀合物，其中该抗体片段是Fab’并且R114连接至该Fab’的铰链区中的天然半胱氨酸残基。
19.如权利要求7至10中任一项所述的缀合物，其中该抗体片段包含至少一个引入到恒定区中的非天然半胱氨酸，并且R114连接至该非天然半胱氨酸。
20.如权利要求17或19中任一项所述的缀合物，其中该抗体片段包含在以下位置(所有位置根据EU编号)中的一个或多个处的半胱氨酸：
(a)重链的位置152，
(b)κ轻链的位置114或165，或
(c)λ轻链的位置143。
21.如权利要求1至20中任一项所述的缀合物，其中该缀合物的半衰期小于约24-48小时。
22.如权利要求1至21中任一项所述的缀合物，其中该缀合物不诱导肥大细胞脱粒。
23.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1至22中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的载剂。
24.如权利要求23所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含另一种治疗剂。
25.如权利要求23或24所述的药物组合物，其中该组合物是冻干物。
26.一种在有需要的患者中消融造血干细胞的方法，该方法包括向该患者施用有效量的如权利要求1-22中任一项所述的缀合物、或如权利要求23或24所述的药物组合物。
27.如权利要求26所述的方法，其中该患者是造血干细胞移植受者。
28.如权利要求27所述的方法，其中该方法是在向该患者造血干细胞移植之前进行。
29.一种调理造血干细胞移植患者的方法，该方法包括：向该患者施用有效量的如权利要求1-22中任一项所述的缀合物、或如权利要求23或24所述的药物组合物，并且在对该患者进行造血干细胞移植之前允许有足够的时间段来使这些缀合物从该患者的循环中清除。
30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中该患者患有先天性免疫缺陷疾病、自身免疫性障碍、造血障碍、先天性代谢异常、或先前已用自体干细胞移植治疗。
31.如权利要求30所述的方法，其中该造血障碍选自：急性髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、骨髓增生性障碍、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、再生障碍性贫血、单纯红细胞再生障碍、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、范可尼贫血、重型地中海贫血、镰状细胞贫血、严重联合免疫缺陷、维斯科特-奥尔德里奇综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症。
32.如权利要求30所述的方法，其中该先天性代谢异常选自粘多糖贮积症、戈谢病、异染性脑白质营养不良或肾上腺脑白质营养不良。
33.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中该患者患有选自以下的非恶性疾病或病症：严重再生障碍性贫血(SAA)、维斯科特-奥尔德里奇综合征、胡勒尔综合征、FHL、CGD、柯士文综合征、严重免疫缺陷综合症(SCID)、其他自身免疫性障碍，如SLE、多发性硬化症、IBD、克罗恩病、舍格伦综合征、血管炎、狼疮、重症肌无力、韦格纳病、先天性代谢异常和/或其他免疫缺陷。
34.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中该患者患有选自以下的恶性疾病或病症：骨髓增生异常综合征(MDS)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病、前体T细胞白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、MALT淋巴瘤、蕈样真菌病、外周T细胞淋巴瘤非特指型、结节性硬化型霍奇金淋巴瘤、混合细胞亚型霍奇金淋巴瘤。
35.如权利要求1-22中任一项所述的缀合物、或如权利要求23或24所述的药物组合物用于在有需要的患者中消融造血干细胞的用途。
36.如权利要求1-22中任一项所述的缀合物、或如权利要求23或24所述的药物组合物在制造用于在有需要的患者中消融造血干细胞的药物中的用途。
37.一种抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段特异性结合人cKIT，其中该抗体或抗体片段选自以下中的任一种：
(1)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1(重链互补性决定区1)、(b)SEQ ID NO:2的HCDR2(重链互补性决定区2)、和(c)SEQ ID NO:3的HCDR3(重链互补性决定区3)；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:16的LCDR1(轻链互补性决定区1)、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2(轻链互补性决定区2)、和(f)SEQ ID NO:18的LCDR3(轻链互补性决定区3)；
(2)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:4的HCDR1、(b)SEQ ID NO:5的HCDR2、(c)SEQ ID NO:3的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:19的LCDR1、(e)SEQ ID NO:20的LCDR2、和(f)SEQ IDNO:21的LCDR3；
(3)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:6的HCDR1、(b)SEQ ID NO:2的HCDR2、(c)SEQ ID NO:3的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:16的LCDR1、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2、和(f)SEQ IDNO:18的LCDR3；
(4)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:22的LCDR1、(e)SEQ ID NO:20的LCDR2、和(f)SEQ IDNO:18的LCDR3；
(5)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:27的HCDR1、(b)SEQ ID NO:28的HCDR2、(c)SEQ ID NO:29的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:42的LCDR1、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:43的LCDR3；
(6)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:30的HCDR1、(b)SEQ ID NO:31的HCDR2、(c)SEQ ID NO:29的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:44的LCDR1、(e)SEQ ID NO:20的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:45的LCDR3；
(7)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:32的HCDR1、(b)SEQ ID NO:28的HCDR2、(c)SEQ ID NO:29的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:42的LCDR1、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:43的LCDR3；
(8)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:33的HCDR1、(b)SEQ ID NO:34的HCDR2、(c)SEQ ID NO:35的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:46的LCDR1、(e)SEQ ID NO:20的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:43的LCDR3；
(9)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:60的HCDR1、(b)SEQ ID NO:61的HCDR2、(c)SEQ ID NO:62的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:75的LCDR1、(e)SEQ ID NO:76的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:77的LCDR3；
(10)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:63的HCDR1、(b)SEQ ID NO:64的HCDR2、(c)SEQ ID NO:62的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:78的LCDR1、(e)SEQ ID NO:79的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:80的LCDR3；
(11)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:61的HCDR2、(c)SEQ ID NO:62的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:75的LCDR1、(e)SEQ ID NO:76的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:77的LCDR3；
(12)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:66的HCDR1、(b)SEQ ID NO:67的HCDR2、(c)SEQ ID NO:68的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:81的LCDR1、(e)SEQ ID NO:79的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:77的LCDR3；
(13)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:86的HCDR1、(b)SEQ ID NO:87的HCDR2、(c)SEQ ID NO:88的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:101的LCDR1、(e)SEQ ID NO:102的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:103的LCDR3；
(14)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:89的HCDR1、(b)SEQ ID NO:90的HCDR2、(c)SEQ ID NO:88的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:104的LCDR1、(e)SEQ ID NO:105的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:106的LCDR3；
(15)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:91的HCDR1、(b)SEQ ID NO:87的HCDR2、(c)SEQ ID NO:88的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:101的LCDR1、(e)SEQ ID NO:102的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:103的LCDR3；
(16)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:92的HCDR1、(b)SEQ ID NO:93的HCDR2、(c)SEQ ID NO:94的HCDR3；和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:107的LCDR1、(e)SEQ ID NO:105的LCDR2、和(f)SEQ ID NO:103的LCDR3；
(17)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:10的重链可变区(VH)，和含有SEQ ID NO:23的轻链可变区(VL)；
(18)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:36的VH，和含有SEQ IDNO:47的VL；
(19)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:69的VH，和含有SEQ IDNO:82的VL；
(20)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:95的VH，和含有SEQ IDNO:108的VL；
(21)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:14的重链，和含有SEQID NO:25的轻链；
(22)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:40的重链，和含有SEQID NO:49的轻链；
(23)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:73的重链，和含有SEQID NO:84的轻链；
(24)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:99的重链，和含有SEQID NO:110的轻链；
(25)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:118的重链，和含有SEQID NO:122的轻链；
(26)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:118的重链，和含有SEQID NO:123的轻链；
(27)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:124的重链，和含有SEQID NO:128的轻链；
(28)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:124的重链，和含有SEQID NO:129的轻链；
(29)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:130的重链，和含有SEQID NO:134的轻链；
(30)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:130的重链，和含有SEQID NO:135的轻链；
(31)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:136的重链，和含有SEQID NO:140的轻链；
(32)抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO:141的重链，和含有SEQID NO:145的轻链；
(33)抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO:12的重链，和含有SEQ ID NO:25的轻链；
(34)抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO:38的重链，和含有SEQ ID NO:49的轻链；
(35)抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO:71的重链，和含有SEQ ID NO:84的轻链；或
(36)抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO:97的重链，和含有SEQ ID NO:110的轻链。
38.一种核酸，该核酸编码如权利要求37所述的抗体或抗体片段。
39.一种载体，该载体包含如权利要求38所述的核酸。
40.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求39所述的载体。
41.一种用于产生抗体或抗体片段的方法，该方法包括培养如权利要求40所述的宿主细胞，并且从该培养中回收该抗体或抗体片段。
CN201980048184.XA 2018-06-20 2019-06-19 用于消融造血干细胞的抗体药物缀合物 Pending CN112437675A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862687382P 2018-06-20 2018-06-20
US62/687,382 2018-06-20
PCT/IB2019/055178 WO2019244082A2 (en) 2018-06-20 2019-06-19 Antibody drug conjugates for ablating hematopoietic stem cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112437675A true CN112437675A (zh) 2021-03-02

Family

ID=67847756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980048184.XA Pending CN112437675A (zh) 2018-06-20 2019-06-19 用于消融造血干细胞的抗体药物缀合物

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20210228731A1 (zh)
EP (1) EP3810205A2 (zh)
JP (1) JP2021527429A (zh)
KR (1) KR20210024542A (zh)
CN (1) CN112437675A (zh)
AR (1) AR115571A1 (zh)
AU (1) AU2019291565A1 (zh)
CA (1) CA3103939A1 (zh)
IL (1) IL279440A (zh)
TW (1) TW202014209A (zh)
UY (1) UY38265A (zh)
WO (1) WO2019244082A2 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2023006010A (es) 2020-11-24 2023-06-08 Novartis Ag Anticuerpos anti-cd48, conjugados de anticuerpo-farmaco, y usos de los mismos.
KR102544135B1 (ko) * 2022-01-26 2023-06-19 주식회사 노벨티노빌리티 c-Kit을 표적으로 하는 면역접합체

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004002425A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Bio Transplant, Inc. Process for promoting graft acceptance by depletion of hematopoietic stem cells
WO2008067115A2 (en) * 2006-11-03 2008-06-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective immunodepletion of endogenous stem cell niche for engraftment
CN105007950A (zh) * 2013-03-15 2015-10-28 诺华股份有限公司 抗体药物缀合物
WO2016020791A1 (en) * 2014-08-05 2016-02-11 Novartis Ag Ckit antibody drug conjugates
CN105899526A (zh) * 2013-12-17 2016-08-24 诺华股份有限公司 细胞毒性肽和其缀合物
WO2016203432A1 (en) * 2015-06-17 2016-12-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
CN106659800A (zh) * 2014-03-12 2017-05-10 诺华股份有限公司 用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点
WO2017219029A2 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of cd117+cells
CN108137648A (zh) * 2015-04-06 2018-06-08 哈佛学院校长同事会 用于非清髓性预处理的组合物和方法

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
CA2109528A1 (en) 1991-05-01 1992-11-02 Gregory A. Prince A method for treating infectious respiratory diseases
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US6132764A (en) 1994-08-05 2000-10-17 Targesome, Inc. Targeted polymerized liposome diagnostic and treatment agents
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
AU2063197A (en) 1996-03-04 1997-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Materials and methods for enhancing cellular internalization
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
ATE287257T1 (de) 1997-01-16 2005-02-15 Massachusetts Inst Technology Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
JP2002512624A (ja) 1997-05-21 2002-04-23 バイオベーション リミテッド 非免疫原性タンパク質の製造方法
US6673901B2 (en) 1997-06-12 2004-01-06 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
JP2002518432A (ja) 1998-06-24 2002-06-25 アドバンスト インハレーション リサーチ，インコーポレイテッド 吸入器から放出される大多孔性粒子
WO2003048731A2 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
EP2711018A1 (en) 2009-06-22 2014-03-26 MedImmune, LLC Engineered Fc regions for site-specific conjugation
MX2015010146A (es) 2013-02-08 2016-05-31 Novartis Ag Sitios especificos para modificar anticuerpos para hacer inmunoconjugados.
JOP20190155A1 (ar) * 2016-12-21 2019-06-23 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لإزالة خلايا جذعية مكونة للدم

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004002425A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Bio Transplant, Inc. Process for promoting graft acceptance by depletion of hematopoietic stem cells
WO2008067115A2 (en) * 2006-11-03 2008-06-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective immunodepletion of endogenous stem cell niche for engraftment
CN105007950A (zh) * 2013-03-15 2015-10-28 诺华股份有限公司 抗体药物缀合物
CN105899526A (zh) * 2013-12-17 2016-08-24 诺华股份有限公司 细胞毒性肽和其缀合物
CN106659800A (zh) * 2014-03-12 2017-05-10 诺华股份有限公司 用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点
WO2016020791A1 (en) * 2014-08-05 2016-02-11 Novartis Ag Ckit antibody drug conjugates
CN108137648A (zh) * 2015-04-06 2018-06-08 哈佛学院校长同事会 用于非清髓性预处理的组合物和方法
WO2016203432A1 (en) * 2015-06-17 2016-12-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
WO2017219029A2 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of cd117+cells

Also Published As

Publication number Publication date
TW202014209A (zh) 2020-04-16
AU2019291565A1 (en) 2021-01-07
CA3103939A1 (en) 2019-12-26
JP2021527429A (ja) 2021-10-14
WO2019244082A3 (en) 2020-03-05
US20210228731A1 (en) 2021-07-29
UY38265A (es) 2020-01-31
WO2019244082A2 (en) 2019-12-26
IL279440A (en) 2021-01-31
EP3810205A2 (en) 2021-04-28
KR20210024542A (ko) 2021-03-05
AR115571A1 (es) 2021-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110099697B (zh) 用于消融造血干细胞的抗体药物缀合物
EP2788379B1 (en) Pdgf receptor beta binding polypeptides
JP2021523874A (ja) 抗メソセリン抗体およびその抗体薬物コンジュゲート
CN113366016B (zh) 抗人白细胞介素5(il-5)单克隆抗体及其应用
KR102602564B1 (ko) 인터루킨-6의 인간 수용체에 결합가능한 항체 또는 항원 결합성 단편
EP3310816B1 (en) Cys80 conjugated immunoglobulins
CN112437675A (zh) 用于消融造血干细胞的抗体药物缀合物
US20220162308A1 (en) Anti-cd48 antibodies, antibody drug conjugates, and uses thereof
RU2781444C2 (ru) Конъюгаты антитела и лекарственного средства для разрушения гемопоэтических стволовых клеток
EA044279B1 (ru) Конъюгаты антитела и лекарственного средства для разрушения гемопоэтических стволовых клеток
NZ794433A (en) Antibody drug conjugates for ablating hematopoietic stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination