EA044279B1 - Конъюгаты антитела и лекарственного средства для разрушения гемопоэтических стволовых клеток - Google Patents
Конъюгаты антитела и лекарственного средства для разрушения гемопоэтических стволовых клеток Download PDFInfo
- Publication number
- EA044279B1 EA044279B1 EA201991526 EA044279B1 EA 044279 B1 EA044279 B1 EA 044279B1 EA 201991526 EA201991526 EA 201991526 EA 044279 B1 EA044279 B1 EA 044279B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- fab
- light chain
- heavy chain
- variable region
- Prior art date
Links
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 title description 63
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 title description 45
- 230000006378 damage Effects 0.000 title description 14
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title description 14
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 287
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 287
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 263
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 201
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 175
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 76
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 53
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 49
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 42
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 41
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 claims description 34
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 32
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 30
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 28
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 24
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 23
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 22
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 22
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 20
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims description 19
- 108010044540 auristatin Proteins 0.000 claims description 14
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 12
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 claims description 10
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 108010027164 Amanitins Proteins 0.000 claims description 9
- CIORWBWIBBPXCG-JZTFPUPKSA-N amanitin Chemical compound O=C1N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N2CC(O)C[C@H]2C(=O)N[C@@H](C(C)[C@@H](O)CO)C(=O)N[C@@H](C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@H]1CS(=O)C1=C2C2=CC=C(O)C=C2N1 CIORWBWIBBPXCG-JZTFPUPKSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 7
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 claims description 4
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 2
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 157
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 108
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 105
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 93
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 92
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 88
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 81
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 80
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 79
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 74
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 63
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 59
- -1 Tian Chemical class 0.000 description 57
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 56
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 56
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 54
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 54
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 48
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 48
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 46
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 45
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 43
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 43
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 42
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 41
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 41
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 41
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 41
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 40
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 34
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 31
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 30
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 29
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 29
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 26
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 25
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 24
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 22
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 22
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 21
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 19
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 19
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 19
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 18
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 18
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 18
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 17
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 17
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 17
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 17
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 16
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 16
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 16
- 101100220044 Homo sapiens CD34 gene Proteins 0.000 description 15
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 15
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 15
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-diisopropylethylamine Substances CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 14
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 13
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 13
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 13
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 13
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 12
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102100032528 C-type lectin domain family 11 member A Human genes 0.000 description 12
- 101710167766 C-type lectin domain family 11 member A Proteins 0.000 description 12
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 238000013461 design Methods 0.000 description 12
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 12
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 12
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N hydroxylamine group Chemical group NO AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical group O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 11
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 11
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 11
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 10
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 10
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 10
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101100330725 Arabidopsis thaliana DAR4 gene Proteins 0.000 description 9
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 9
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 9
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 9
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 9
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 9
- VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 2-[4-[4-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]butanoyloxy]ethyl (5z,8z,11z,14z)-icosa-5,8,11,14-tetraenoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)OCCOC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 8
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 8
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 8
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 8
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 8
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 8
- AOJDZKCUAATBGE-UHFFFAOYSA-N bromomethane Chemical compound Br[CH2] AOJDZKCUAATBGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 7
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 6
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 6
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 6
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010000871 Acute monocytic leukaemia Diseases 0.000 description 5
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 5
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 5
- 208000035489 Monocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 102000007478 beta-N-Acetylhexosaminidases Human genes 0.000 description 5
- 108010085377 beta-N-Acetylhexosaminidases Proteins 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 5
- 208000015978 inherited metabolic disease Diseases 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 5
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- AIQKYLNXJKSLHP-NSHDSACASA-N (2S)-2-amino-N-(3-azidopropylsulfonyl)-3-phenylpropanamide Chemical compound N[C@H](C(=O)NS(=O)(=O)CCCN=[N+]=[N-])CC1=CC=CC=C1 AIQKYLNXJKSLHP-NSHDSACASA-N 0.000 description 4
- SUNMBRGCANLOEG-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloroacetone Chemical compound ClCC(=O)CCl SUNMBRGCANLOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBRIOBHILRGDPP-UHFFFAOYSA-N 3-azidopropane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN=[N+]=[N-] DBRIOBHILRGDPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FVRXLSOOPLSSNW-UHFFFAOYSA-N 3-azidopropane-1-sulfonyl chloride Chemical compound ClS(=O)(=O)CCCN=[N+]=[N-] FVRXLSOOPLSSNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 4
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 101100330723 Arabidopsis thaliana DAR2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100480489 Arabidopsis thaliana TAAC gene Proteins 0.000 description 4
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 4
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 4
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100040870 Glycine amidinotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 4
- 101000893303 Homo sapiens Glycine amidinotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical group CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 4
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- VSPMNQQOQWDCQX-UHFFFAOYSA-N diazonio(3-sulfamoylpropyl)azanide Chemical compound NS(=O)(=O)CCCN=[N+]=[N-] VSPMNQQOQWDCQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 125000000717 hydrazino group Chemical group [H]N([*])N([H])[H] 0.000 description 4
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 208000016245 inborn errors of metabolism Diseases 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N methanol-d1 Chemical compound [2H]OC OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Chemical group 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 4
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 description 4
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- ONDSBJMLAHVLMI-UHFFFAOYSA-N trimethylsilyldiazomethane Chemical compound C[Si](C)(C)[CH-][N+]#N ONDSBJMLAHVLMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- OCXHPHOVIMNVPQ-UTHKHBGESA-N (2r,3r)-3-methoxy-3-[(2s)-1-[(3r,4s,5s)-3-methoxy-5-methyl-4-[methyl-[(2s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoyl]amino]heptanoyl]pyrrolidin-2-yl]-2-methylpropanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(O)=O OCXHPHOVIMNVPQ-UTHKHBGESA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 3
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 3
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 3
- 108010029961 Filgrastim Proteins 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010051066 Gastrointestinal stromal tumour Diseases 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 3
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 208000001019 Inborn Errors Metabolism Diseases 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 3
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 3
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 206010072684 Refractory cytopenia with unilineage dysplasia Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 3
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 238000012436 analytical size exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 3
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 3
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- YIQPUIGJQJDJOS-UHFFFAOYSA-N plerixafor Chemical compound C=1C=C(CN2CCNCCCNCCNCCC2)C=CC=1CN1CCCNCCNCCCNCC1 YIQPUIGJQJDJOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000003405 preventing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 210000000603 stem cell niche Anatomy 0.000 description 3
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- ZYJPUMXJBDHSIF-NSHDSACASA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZYJPUMXJBDHSIF-NSHDSACASA-N 0.000 description 2
- VNTHYLVDGVBPOU-QQYBVWGSSA-N (7s,9s)-9-acetyl-7-[(2r,4s,5s,6s)-4-amino-5-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-6,9,11-trihydroxy-4-methoxy-8,10-dihydro-7h-tetracene-5,12-dione;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 VNTHYLVDGVBPOU-QQYBVWGSSA-N 0.000 description 2
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 2
- LQQKDSXCDXHLLF-UHFFFAOYSA-N 1,3-dibromopropan-2-one Chemical compound BrCC(=O)CBr LQQKDSXCDXHLLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKARNAREDZHGLR-UHFFFAOYSA-N 1,3-diiodopropan-2-one Chemical compound ICC(=O)CI OKARNAREDZHGLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OBYJFWVFCFYKNY-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynylpyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1CC#C OBYJFWVFCFYKNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004214 1-pyrrolidinyl group Chemical group [H]C1([H])N(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 2,2,5,8-tetramethyl-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical compound C1CC(C)(C)OC2=C1C(C)=C(O)C=C2C MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- YTZFUAXOTCJZHP-UHFFFAOYSA-N 3-[2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)ethoxy]propanoic acid Chemical compound OC(=O)CCOCCN1C(=O)C=CC1=O YTZFUAXOTCJZHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WUIABRMSWOKTOF-OYALTWQYSA-N 3-[[2-[2-[2-[[(2s,3r)-2-[[(2s,3s,4r)-4-[[(2s,3r)-2-[[6-amino-2-[(1s)-3-amino-1-[[(2s)-2,3-diamino-3-oxopropyl]amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2r,3s,4s,5r,6r)-4-carbamoyloxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)ox Chemical compound OS([O-])(=O)=O.N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1NC=NC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C WUIABRMSWOKTOF-OYALTWQYSA-N 0.000 description 2
- AUDYZXNUHIIGRB-UHFFFAOYSA-N 3-thiophen-2-ylpyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C=2SC=CC=2)=C1 AUDYZXNUHIIGRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000339 4-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 2
- 101800002638 Alpha-amanitin Proteins 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 2
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 2
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N Capecitabine Chemical compound C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N Cladribine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(Cl)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 101150034590 DAR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 235000014066 European mistletoe Nutrition 0.000 description 2
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 2
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 2
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- BXNJHAXVSOCGBA-UHFFFAOYSA-N Harmine Chemical compound N1=CC=C2C3=CC=C(OC)C=C3NC2=C1C BXNJHAXVSOCGBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000002268 Hexosaminidases Human genes 0.000 description 2
- 108010000540 Hexosaminidases Proteins 0.000 description 2
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000863873 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Proteins 0.000 description 2
- VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N Hydroxyurea Chemical compound NC(=O)NO VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N Idarubicin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical group CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 101710181812 Methionine aminopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 101100174574 Mus musculus Pikfyve gene Proteins 0.000 description 2
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 2
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 208000033759 Prolymphocytic T-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- 206010038272 Refractory anaemia with ringed sideroblasts Diseases 0.000 description 2
- 208000033501 Refractory anemia with excess blasts Diseases 0.000 description 2
- 235000012300 Rhipsalis cassutha Nutrition 0.000 description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 2
- RXGJTYFDKOHJHK-UHFFFAOYSA-N S-deoxo-amaninamide Natural products CCC(C)C1NC(=O)CNC(=O)C2Cc3c(SCC(NC(=O)CNC1=O)C(=O)NC(CC(=O)N)C(=O)N4CC(O)CC4C(=O)NC(C(C)C(O)CO)C(=O)N2)[nH]c5ccccc35 RXGJTYFDKOHJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 101100393304 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GPD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 2
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 208000034972 Sudden Infant Death Diseases 0.000 description 2
- 206010042440 Sudden infant death syndrome Diseases 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 208000026651 T-cell prolymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 102100029948 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000221012 Viscum Species 0.000 description 2
- 208000006110 Wiskott-Aldrich syndrome Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 208000013685 acquired idiopathic sideroblastic anemia Diseases 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004007 alpha amanitin Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- CIORWBWIBBPXCG-SXZCQOKQSA-N alpha-amanitin Chemical compound O=C1N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N2C[C@H](O)C[C@H]2C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](O)CO)C(=O)N[C@@H](C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@H]1C[S@@](=O)C1=C2C2=CC=C(O)C=C2N1 CIORWBWIBBPXCG-SXZCQOKQSA-N 0.000 description 2
- CIORWBWIBBPXCG-UHFFFAOYSA-N alpha-amanitin Natural products O=C1NC(CC(N)=O)C(=O)N2CC(O)CC2C(=O)NC(C(C)C(O)CO)C(=O)NC(C2)C(=O)NCC(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NCC(=O)NC1CS(=O)C1=C2C2=CC=C(O)C=C2N1 CIORWBWIBBPXCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N anastrozole Chemical compound N#CC(C)(C)C1=CC(C(C)(C#N)C)=CC(CN2N=CN=C2)=C1 YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 125000001951 carbamoylamino group Chemical group C(N)(=O)N* 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 229940001468 citrate Drugs 0.000 description 2
- 229960002436 cladribine Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 229920002055 compound 48/80 Polymers 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 2
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 2
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 229960005304 fludarabine phosphate Drugs 0.000 description 2
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N geranyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N hydrazine group Chemical group NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N ifosfamide Chemical compound ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 2
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 2
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010022050 mistletoe lectin I Proteins 0.000 description 2
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 108010010621 modeccin Proteins 0.000 description 2
- 239000009562 momordin Substances 0.000 description 2
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 208000016586 myelodysplastic syndrome with excess blasts Diseases 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 108010044644 pegfilgrastim Proteins 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002169 plerixafor Drugs 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 108010038379 sargramostim Proteins 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 2
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 description 2
- FQZYTYWMLGAPFJ-OQKDUQJOSA-N tamoxifen citrate Chemical compound [H+].[H+].[H+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 FQZYTYWMLGAPFJ-OQKDUQJOSA-N 0.000 description 2
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 2
- PQQDXPZRVKVGDZ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl n-(4-sulfanylbutyl)carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCCCS PQQDXPZRVKVGDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GINSRDSEEGBTJO-UHFFFAOYSA-N thietane 1-oxide Chemical compound O=S1CCC1 GINSRDSEEGBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ORYDPOVDJJZGHQ-UHFFFAOYSA-N tirapazamine Chemical compound C1=CC=CC2=[N+]([O-])C(N)=N[N+]([O-])=C21 ORYDPOVDJJZGHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229940074410 trehalose Drugs 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-CFWMRBGOSA-N vinblastine Chemical compound C([C@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-CFWMRBGOSA-N 0.000 description 2
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 229960005502 α-amanitin Drugs 0.000 description 2
- IFAMSTPTNRJBRG-YIZRAAEISA-N (1s,2s,4r)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]-3-azabicyclo[2.2.1]heptane-2-carboxylic acid Chemical compound C1C[C@@H]2[C@@H](C(O)=O)N(C(=O)OC(C)(C)C)[C@H]1C2 IFAMSTPTNRJBRG-YIZRAAEISA-N 0.000 description 1
- GCSZJMUFYOAHFY-SDQBBNPISA-N (1z)-1-(3-ethyl-5-hydroxy-1,3-benzothiazol-2-ylidene)propan-2-one Chemical compound C1=C(O)C=C2N(CC)\C(=C\C(C)=O)SC2=C1 GCSZJMUFYOAHFY-SDQBBNPISA-N 0.000 description 1
- BGVLELSCIHASRV-QPEQYQDCSA-N (1z)-1-(3-ethyl-5-methoxy-1,3-benzothiazol-2-ylidene)propan-2-one Chemical compound C1=C(OC)C=C2N(CC)\C(=C\C(C)=O)SC2=C1 BGVLELSCIHASRV-QPEQYQDCSA-N 0.000 description 1
- JKHVDAUOODACDU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O JKHVDAUOODACDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IADUWZMNTKHTIN-MLSWMBHTSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[[3-[3-[[(2S)-1-[[(1S,2R,3S,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl]oxy]-1-oxopropan-2-yl]-methylamino]-3-oxopropyl]sulfanyl-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl]methyl]cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound CO[C@@H]1\C=C\C=C(C)\Cc2cc(OC)c(Cl)c(c2)N(C)C(=O)C[C@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(=O)CCSC2CC(=O)N(CC3CCC(CC3)C(=O)ON3C(=O)CCC3=O)C2=O)[C@]2(C)O[C@H]2[C@H](C)[C@@H]2C[C@@]1(O)NC(=O)O2 IADUWZMNTKHTIN-MLSWMBHTSA-N 0.000 description 1
- NAALWFYYHHJEFQ-ZASNTINBSA-N (2s,5r,6r)-6-[[(2r)-2-[[6-[4-[bis(2-hydroxyethyl)sulfamoyl]phenyl]-2-oxo-1h-pyridine-3-carbonyl]amino]-2-(4-hydroxyphenyl)acetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Chemical compound N([C@@H](C(=O)N[C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)C(C(N1)=O)=CC=C1C1=CC=C(S(=O)(=O)N(CCO)CCO)C=C1 NAALWFYYHHJEFQ-ZASNTINBSA-N 0.000 description 1
- XSPUSVIQHBDITA-KXDGEKGBSA-N (6r,7r)-7-[[(2e)-2-(2-amino-1,3-thiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetyl]amino]-3-[(5-methyltetrazol-2-yl)methyl]-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)/C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CN1N=NC(C)=N1 XSPUSVIQHBDITA-KXDGEKGBSA-N 0.000 description 1
- FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N (8S)-3-(2-deoxy-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][1,3]diazepin-8-ol Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NCC2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LKJPYSCBVHEWIU-KRWDZBQOSA-N (R)-bicalutamide Chemical compound C([C@@](O)(C)C(=O)NC=1C=C(C(C#N)=CC=1)C(F)(F)F)S(=O)(=O)C1=CC=C(F)C=C1 LKJPYSCBVHEWIU-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025573 1-alkyl-2-acetylglycerophosphocholine esterase Human genes 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- WGGFHAVVTPGHRD-UHFFFAOYSA-N 2-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethanamine Chemical compound NCCSSC1=CC=CC=N1 WGGFHAVVTPGHRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZDFGHZZPBUTGP-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-(4-isothiocyanatophenyl)propyl]-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C(C)CN(CC(O)=O)CC(N(CC(O)=O)CC(O)=O)CC1=CC=C(N=C=S)C=C1 FZDFGHZZPBUTGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JUIKUQOUMZUFQT-UHFFFAOYSA-N 2-bromoacetamide Chemical compound NC(=O)CBr JUIKUQOUMZUFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MMBZCFJKAQZVNI-VPENINKCSA-N 4-amino-5,6-difluoro-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound FC1=C(F)C(N)=NC(=O)N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 MMBZCFJKAQZVNI-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JQSJAVBMIMDUFO-UHFFFAOYSA-N 5-(1,3-benzodioxol-5-yl)-n-[(3,5-dichlorophenyl)methyl]pyrimidin-4-amine Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC(CNC=2C(=CN=CN=2)C=2C=C3OCOC3=CC=2)=C1 JQSJAVBMIMDUFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(6-hydrazinyl-6-oxohexyl)pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)NN)SC[C@@H]21 IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 0.000 description 1
- WOJKKJKETHYEAC-UHFFFAOYSA-N 6-Maleimidocaproic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O WOJKKJKETHYEAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940121819 ATPase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 201000011452 Adrenoleukodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000009746 Adult T-Cell Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 206010002965 Aplasia pure red cell Diseases 0.000 description 1
- 101100004408 Arabidopsis thaliana BIG gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036170 B-Cell Marginal Zone Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 208000031872 Body Remains Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 description 1
- 101100069853 Caenorhabditis elegans hil-3 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N Capecitabine Natural products C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1C1C(O)C(O)C(C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 206010053138 Congenital aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000578 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p21 Human genes 0.000 description 1
- 108010016788 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p21 Proteins 0.000 description 1
- 102100024457 Cyclin-dependent kinase 9 Human genes 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 239000012624 DNA alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940126161 DNA alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012623 DNA damaging agent Substances 0.000 description 1
- 239000012625 DNA intercalator Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 208000027219 Deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000010777 Disulfide Reduction Effects 0.000 description 1
- MWWSFMDVAYGXBV-RUELKSSGSA-N Doxorubicin hydrochloride Chemical compound Cl.O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MWWSFMDVAYGXBV-RUELKSSGSA-N 0.000 description 1
- 101100485279 Drosophila melanogaster emb gene Proteins 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N Everolimus Chemical compound C1C[C@@H](OCCO)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N 0.000 description 1
- 102100029095 Exportin-1 Human genes 0.000 description 1
- 206010061850 Extranodal marginal zone B-cell lymphoma (MALT type) Diseases 0.000 description 1
- 201000004939 Fanconi anemia Diseases 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 description 1
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- RERZNCLIYCABFS-UHFFFAOYSA-N Harmaline hydrochloride Natural products C1CN=C(C)C2=C1C1=CC=C(OC)C=C1N2 RERZNCLIYCABFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 208000017605 Hodgkin disease nodular sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000942297 Homo sapiens C-type lectin domain family 11 member A Proteins 0.000 description 1
- 101000980930 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000684208 Homo sapiens Prolyl endopeptidase FAP Proteins 0.000 description 1
- 101000841411 Homo sapiens Protein ecdysoneless homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 description 1
- 101100448208 Human herpesvirus 6B (strain Z29) U69 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000015178 Hurler syndrome Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N Idarubicin Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010016648 Immunophilins Proteins 0.000 description 1
- 102000000521 Immunophilins Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010062018 Inborn error of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229940124179 Kinesin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100027629 Kinesin-like protein KIF11 Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000000415 L-cysteinyl group Chemical group O=C([*])[C@@](N([H])[H])([H])C([H])([H])S[H] 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical group C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Chemical group CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000006404 Large Granular Lymphocytic Leukemia Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000035809 Lymphohistiocytosis Diseases 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 201000003791 MALT lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100028198 Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101710087603 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Proteins 0.000 description 1
- 201000011442 Metachromatic leukodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 229940119336 Microtubule stabilizer Drugs 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 208000002678 Mucopolysaccharidoses Diseases 0.000 description 1
- 206010056886 Mucopolysaccharidosis I Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 208000014767 Myeloproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- ZZIKIHCNFWXKDY-UHFFFAOYSA-N Myriocin Natural products CCCCCCC(=O)CCCCCCC=CCC(O)C(O)C(N)(CO)C(O)=O ZZIKIHCNFWXKDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMEUPOROMBPSRB-AWEZNQCLSA-N N(=[N+]=[N-])CCCS(=O)(=O)NC([C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(OC(C)(C)C)=O)=O Chemical compound N(=[N+]=[N-])CCCS(=O)(=O)NC([C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(OC(C)(C)C)=O)=O BMEUPOROMBPSRB-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- LKJPYSCBVHEWIU-UHFFFAOYSA-N N-[4-cyano-3-(trifluoromethyl)phenyl]-3-[(4-fluorophenyl)sulfonyl]-2-hydroxy-2-methylpropanamide Chemical compound C=1C=C(C#N)C(C(F)(F)F)=CC=1NC(=O)C(O)(C)CS(=O)(=O)C1=CC=C(F)C=C1 LKJPYSCBVHEWIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000000733 Paroxysmal Hemoglobinuria Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 208000027190 Peripheral T-cell lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- 102100036050 Phosphatidylinositol N-acetylglucosaminyltransferase subunit A Human genes 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100023832 Prolyl endopeptidase FAP Human genes 0.000 description 1
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000012515 Protein kinase domains Human genes 0.000 description 1
- 108050002122 Protein kinase domains Proteins 0.000 description 1
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 229940122277 RNA polymerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000009527 Refractory anemia Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101100485284 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CRM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 208000031672 T-Cell Peripheral Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000173 T-lymphoid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 101710192266 Tegument protein VP22 Proteins 0.000 description 1
- 206010043391 Thalassaemia beta Diseases 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 101150094313 XPO1 gene Proteins 0.000 description 1
- VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N Yttrium-90 Chemical compound [90Y] VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- RLEOCVDWLAYGRX-AUWJEWJLSA-N [(2z)-3-ethyl-2-(2-oxopropylidene)-1,3-benzothiazol-5-yl] acetate Chemical compound C1=C(OC(C)=O)C=C2N(CC)\C(=C\C(C)=O)SC2=C1 RLEOCVDWLAYGRX-AUWJEWJLSA-N 0.000 description 1
- SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N [amino(ethoxy)phosphanyl]oxyethane Chemical compound CCOP(N)OCC SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PDKXJKWLFFZPPF-UHFFFAOYSA-N [dimethylamino-(3-oxidotriazolo[4,5-b]pyridin-3-ium-1-yl)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(C(N(C)C)=[N+](C)C)N=[N+]([O-])C2=N1 PDKXJKWLFFZPPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000011374 additional therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000362 adenosine triphosphatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 229940064305 adrucil Drugs 0.000 description 1
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 229960000548 alemtuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229940098174 alkeran Drugs 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005262 alkoxyamine group Chemical group 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000037354 amino acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 229960002932 anastrozole Drugs 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000001062 anti-nausea Effects 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 230000001494 anti-thymocyte effect Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002111 antiemetic agent Substances 0.000 description 1
- 229940125683 antiemetic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940078010 arimidex Drugs 0.000 description 1
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 description 1
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 229960000997 bicalutamide Drugs 0.000 description 1
- 229940108502 bicnu Drugs 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- SBDRQKOWDZWHOK-UHFFFAOYSA-N bis(2,3,5,6-tetrafluorophenyl) pentanedioate Chemical compound C(CCCC(=O)OC1=C(C(=CC(=C1F)F)F)F)(=O)OC1=C(C(=CC(=C1F)F)F)F SBDRQKOWDZWHOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004395 bleomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 229940111214 busulfan injection Drugs 0.000 description 1
- 229940112133 busulfex Drugs 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- KVUAALJSMIVURS-ZEDZUCNESA-L calcium folinate Chemical compound [Ca+2].C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C([O-])=O)C=C1 KVUAALJSMIVURS-ZEDZUCNESA-L 0.000 description 1
- 235000008207 calcium folinate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011687 calcium folinate Substances 0.000 description 1
- 229940088954 camptosar Drugs 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 125000001369 canonical nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004117 capecitabine Drugs 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229940097647 casodex Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000012829 chemotherapy agent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000002435 cytoreductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 229960003334 daunorubicin citrate Drugs 0.000 description 1
- 229960003109 daunorubicin hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 229940107841 daunoxome Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 229940070968 depocyt Drugs 0.000 description 1
- 230000036576 dermal application Effects 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- SLPJGDQJLTYWCI-UHFFFAOYSA-N dimethyl-(4,5,6,7-tetrabromo-1h-benzoimidazol-2-yl)-amine Chemical compound BrC1=C(Br)C(Br)=C2NC(N(C)C)=NC2=C1Br SLPJGDQJLTYWCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- AMRJKAQTDDKMCE-UHFFFAOYSA-N dolastatin Chemical compound CC(C)C(N(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)N(C)C(C(C)C)C(OC)CC(=O)N1CCCC1C(OC)C(C)C(=O)NC(C=1SC=CN=1)CC1=CC=CC=C1 AMRJKAQTDDKMCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930188854 dolastatin Natural products 0.000 description 1
- 229960002918 doxorubicin hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 229940099302 efudex Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 229940073038 elspar Drugs 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 1
- 229960005167 everolimus Drugs 0.000 description 1
- 108700002148 exportin 1 Proteins 0.000 description 1
- 229960004177 filgrastim Drugs 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 229960000556 fingolimod Drugs 0.000 description 1
- KKGQTZUTZRNORY-UHFFFAOYSA-N fingolimod Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(CCC(N)(CO)CO)C=C1 KKGQTZUTZRNORY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 229960002074 flutamide Drugs 0.000 description 1
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 229960003297 gemtuzumab ozogamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 229940080856 gleevec Drugs 0.000 description 1
- 229940084910 gliadel Drugs 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001173 gonocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- VJHLDRVYTQNASM-UHFFFAOYSA-N harmine Natural products CC1=CN=CC=2NC3=CC(=CC=C3C=21)OC VJHLDRVYTQNASM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003481 heat shock protein 90 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003258 hemophagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000013542 high molecular weight contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000052645 human CD38 Human genes 0.000 description 1
- 102000047791 human ECD Human genes 0.000 description 1
- 102000053391 human F Human genes 0.000 description 1
- 108700031895 human F Proteins 0.000 description 1
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940116886 human interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 229940096120 hydrea Drugs 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229960001330 hydroxycarbamide Drugs 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 229940099279 idamycin Drugs 0.000 description 1
- 229960000908 idarubicin Drugs 0.000 description 1
- 229940090411 ifex Drugs 0.000 description 1
- 229960001101 ifosfamide Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 1
- YLMAHDNUQAMNNX-UHFFFAOYSA-N imatinib methanesulfonate Chemical compound CS(O)(=O)=O.C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 YLMAHDNUQAMNNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 208000033065 inborn errors of immunity Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 210000004495 interstitial cells of cajal Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical group NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 208000037393 large granular lymphocyte leukemia Diseases 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002293 leucovorin calcium Drugs 0.000 description 1
- 229940063725 leukeran Drugs 0.000 description 1
- 229940087875 leukine Drugs 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M lithium hydroxide Inorganic materials [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000013541 low molecular weight contaminant Substances 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 229940124302 mTOR inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000003628 mammalian target of rapamycin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 208000020968 mature T-cell and NK-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- SWVMLNPDTIFDDY-FVGYRXGTSA-N methyl (2s)-2-amino-3-phenylpropanoate;hydrochloride Chemical class Cl.COC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 SWVMLNPDTIFDDY-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O methylsulfide anion Chemical compound [SH2+]C LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000002500 microbody Anatomy 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000001459 mortal effect Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229940074923 mozobil Drugs 0.000 description 1
- 206010028093 mucopolysaccharidosis Diseases 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 229940014456 mycophenolate Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 201000005962 mycosis fungoides Diseases 0.000 description 1
- 229940090009 myleran Drugs 0.000 description 1
- ZZIKIHCNFWXKDY-GNTQXERDSA-N myriocin Chemical compound CCCCCCC(=O)CCCCCC\C=C\C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@](N)(CO)C(O)=O ZZIKIHCNFWXKDY-GNTQXERDSA-N 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229940086322 navelbine Drugs 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 125000001971 neopentyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940063121 neoral Drugs 0.000 description 1
- 229940071846 neulasta Drugs 0.000 description 1
- 229940029345 neupogen Drugs 0.000 description 1
- 229940085033 nolvadex Drugs 0.000 description 1
- 229940005483 opioid analgesics Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 201000003045 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- HQQSBEDKMRHYME-UHFFFAOYSA-N pefloxacin mesylate Chemical compound [H+].CS([O-])(=O)=O.C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCN(C)CC1 HQQSBEDKMRHYME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001373 pegfilgrastim Drugs 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960002340 pentostatin Drugs 0.000 description 1
- FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N pentostatin Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC[C@H]2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000000079 pharmacotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229940063179 platinol Drugs 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940072288 prograf Drugs 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 229940117820 purinethol Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229940099538 rapamune Drugs 0.000 description 1
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000013557 residual solvent Substances 0.000 description 1
- 229940053174 restasis Drugs 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 229940063122 sandimmune Drugs 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 229960002530 sargramostim Drugs 0.000 description 1
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000011450 sequencing therapy Methods 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 235000019187 sodium-L-ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011755 sodium-L-ascorbate Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001324 spliceosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000024642 stem cell division Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007801 sublethal irradiation Methods 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 description 1
- 229960003454 tamoxifen citrate Drugs 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-XAZOAEDWSA-N taxol® Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(CC(C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3(C21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-XAZOAEDWSA-N 0.000 description 1
- 229940063683 taxotere Drugs 0.000 description 1
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 1
- 229950002376 tirapazamine Drugs 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229960002190 topotecan hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001296 transplacental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- GBABOYUKABKIAF-IELIFDKJSA-N vinorelbine Chemical compound C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC GBABOYUKABKIAF-IELIFDKJSA-N 0.000 description 1
- 229960002066 vinorelbine Drugs 0.000 description 1
- CILBMBUYJCWATM-PYGJLNRPSA-N vinorelbine ditartrate Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC CILBMBUYJCWATM-PYGJLNRPSA-N 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
- 229940053867 xeloda Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940007162 zarxio Drugs 0.000 description 1
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Заявка на данный патент испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент
США № 62/437622, поданной 21 декабря 2016 г., и предварительной заявки на патент США № 62/520854, поданной 16 июня 2017 г., содержание которых тем самым включено посредством ссылки во всей своей полноте.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение направлено на конъюгаты антитела к cKIT и лекарственного средства и пути их применения для разрушения гемопоэтических стволовых клеток у пациента, нуждающегося в этом, например, реципиента трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и тем самым включен посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная ASCIIкопия, созданная 14 декабря 2017 г., имеет название PAT057400-WO-PCT_SL.txt и размер 209938 байт.
Предпосылки изобретения cKIT (CD117) представляет собой одиночную трансмембранную рецепторную тирозинкиназу, которая связывается с лигандом, фактором роста стволовых клеток (SCF). SCF индуцирует гомодимеризацию cKIT, что активирует ее тирозинкиназную активность и приводит к передаче сигналов через пути как PB-АКТ, так и МАРК (Kindblom et al., Am J. Path. 1998, 152 (5): 1259). cKIT первоначало была открыта в качестве онкогена в виде усеченной формы, экспрессируемой ретровирусом кошек (Besmer et al., Nature 1986, 320:415-421). Клонирование соответствующего человеческого гена показало, что cKIT является представителем класса рецепторных тирозинкиназ III типа, в состав которого входят такие представители семейства, как FLT3, рецептор CSF-1 и рецептор PDGF. cKIT необходима для развития гемопоэтических клеток, гоноцитов, мастоцитов и меланоцитов. Гемопоэтические клетки-предшественники, например гемопоэтические стволовые клетки (HSC), в костном мозге экспрессируют cKIT на высоком уровне на поверхности клеток. Кроме того, cKIT экспрессируют мастоциты, меланоциты в коже и интерстициальные клетки Кахаля в желудочно-кишечном тракте.
Гемопоэтические стволовые клетки (HSC) способны восстанавливать все клеточные элементы крови и иммунные клетки у реципиента трансплантации и, следовательно, обладают огромным терапевтическим потенциалом. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток широко применяется в качестве видов терапии при лейкозе, лимфоме и других заболеваниях, представляющих угрозу для жизни. Однако с такой трансплантацией ассоциировано множество рисков, в том числе плохое приживление, иммунологическое отторжение, реакция трансплантат против хозяина (GVHD) или инфекция. Чтобы предотвратить иммунологическое отторжение трансплантата при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, обычно необходимо кондиционирование реципиента с помощью видов циторедуктивного лечения. Современные схемы кондиционирования зачастую настолько токсичны для хозяина, что они противопоказаны большим группам пациентов, которые нуждаются в трансплантации, и/или не могут обеспечиваться в достаточных количествах, чтобы предотвратить реакцию трансплантат против хозяина. Таким образом, существует необходимость в улучшении способов кондиционирования и трансплантации, а также уменьшении рисков, ассоциированных с трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток, и повышении ее эффективности при различных нарушениях.
Краткое описание изобретения
В настоящем изобретении предусмотрены конъюгаты антитела и лекарственного средства, где антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, соединены с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство (например, цитотоксическое средство), необязательно через линкер. Такие конъюгаты антитела и лекарственного средства могут селективно доставлять цитотоксическое средство к клеткам, экспрессирующим cKIT, например, гемопоэтическим стволовым клеткам, тем самым селективно разрушая эти клетки у пациента, например, реципиента трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Предпочтительно конъюгаты антитела к cKIT и лекарственного средства обладают такими фармакокинетическими свойствами, что они не будут присутствовать и/или не будут активны в кровяном русле пациента в течение длительного времени, поэтому их можно применять для кондиционирования реципиентов трансплантации гемопоэтических стволовых клеток перед трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены конъюгаты, содержащие фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT, соединенный с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство (например, цитотоксическое средство), необязательно через линкер. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что полноразмерные антитела к cKIT (например, полноразмерные IgG), их фрагменты F(ab')2 и конъюгаты с токсинами вызывают дегрануляцию мастоцитов, а конъюгаты Fab' или Fab к cKIT и токсина не вызывают дегрануляцию мастоцитов, даже будучи сшитыми и/или мульмеризованными в более крупные комплексы, как можно было бы наблюдать в случае, когда у пациента выработались или имелись предсуществующие антитела к лекарственному средству, распознающие фрагменты Fab. В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие конъюгаты антитела и лекарственного средства, и способы изготов- 1 044279 ления и применения таких фармацевтических композиций для разрушения гемопоэтических стволовых клеток у пациента, нуждающегося в этом, например, реципиента трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
(С):
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на конъюгат формулы (I): A-(LB-(D)n)y Формула (I), где А представляет собой фрагмент антитела, который специфически связывается с cKIT человека; LB представляет собой линкер;
D представляет собой цитотоксическое средство;
n составляет целое число от 1 до 10, а y составляет целое число от 1 до 10.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на конъюгат, имеющий структуру формулы
где A, L20, y и R2 являются такими, как определено в данном документе.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на конъюгат, имеющий структуру формулы (D):
где A, L30, y, R1 и R2, являются такими, как определено в данном документе.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на конъюгат, имеющий структуру формулы (Е):
где A, L40, y, X, R5 и R6, являются такими, как определено в данном документе.
В другом аспекте в данном документе предусмотрены антитела и фрагменты антител (например,
Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека. Такие антитела и фрагменты антител (например, Fab или Fab') к cKIT можно применять в любом из конъюгатов, описанных в данном доку менте.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, представляют собой антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с внеклеточным доменом cKIT человека (SEQ ID NO: 112).
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, представляют собой антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с эпитопом в доменах 1-3 cKIT человека (SEQ ID NO: 113).
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, представляют собой антитело или фрагмент анти- 2 044279 тела (например, Fab или Fab'), описанные в табл. 1.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 1, HCDR2 под
SEQ ID NO: 2; HCDR3 под SEQ ID NO: 3; LCDR1 под SEQ ID NO: 16; LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и
LCDR3 под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 4, HCDR2 под SEQ ID NO: 5; HCDR3 под SEQ ID NO: 3; LCDR1 под SEQ ID NO:19; LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и LCDR3 под SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 6, HCDR2 под SEQ ID NO: 2; HCDR3 под SEQ ID NO: 3; LCDR1 под SEQ ID NO:16; LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и LCDR3 под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 7, HCDR2 под SEQ ID NO: 8; HCDR3 под SEQ ID NO: 9; LCDR1 под SEQ ID NO: 22; LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и LCDR3 под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 27, HCDR2 под SEQ ID NO: 28; HCDR3 под SEQ ID NO: 29; LCDR1 под SEQ ID NO: 42; LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и LCDR3 под SEQ ID NO: 43.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 30, HCDR2 под SEQ ID NO: 31; HCDR3 под SEQ ID NO: 29; LCDR1 под SEQ ID NO: 44; LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и LCDR3 под SEQ ID NO: 45.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 32, HCDR2 под SEQ ID NO: 28; HCDR3 под SEQ ID NO: 29; LCDR1 под SEQ ID NO: 42; LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и LCDR3 под SEQ ID NO: 43.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 33, HCDR2 под SEQ ID NO: 34; HCDR3 под SEQ ID NO: 35; LCDR1 под SEQ ID NO: 46; LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и LCDR3 под SEQ ID NO: 43.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 1, HCDR2 под SEQ ID NO: 51; HCDR3 под SEQ ID NO: 3; LCDR1 под SEQ ID NO: 16; LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и LCDR3 под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 4, HCDR2 под SEQ ID NO: 52; HCDR3 под SEQ ID NO: 3; LCDR1 под SEQ ID NO: 19; LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и LCDR3 под SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 6, HCDR2 под SEQ ID NO: 51; HCDR3 под SEQ ID NO: 3; LCDR1 под SEQ ID NO: 16; LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и LCDR3 под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 7, HCDR2 под SEQ ID NO: 53; HCDR3 под SEQ ID NO: 9; LCDR1 под SEQ ID NO: 22; LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и LCDR3 под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 60, HCDR2 под SEQ ID NO: 61; HCDR3 под SEQ ID NO: 62; LCDR1 под SEQ ID NO: 75; LCDR2 под SEQ ID NO: 76 и LCDR3 под SEQ ID NO: 77.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 63, HCDR2 под SEQ ID NO: 64; HCDR3 под SEQ ID NO: 62; LCDR1 под SEQ ID NO: 78; LCDR2 под SEQ ID NO: 79 и LCDR3 под SEQ ID NO: 80.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 61; HCDR3 под SEQ ID NO: 62; LCDR1 под SEQ ID NO: 75; LCDR2 под SEQ ID NO: 76 и LCDR3 под SEQ ID NO: 77.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'),
- 3 044279 которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 66, HCDR2 под
SEQ ID NO: 67; HCDR3 под SEQ ID NO: 68; LCDR1 под SEQ ID NO: 81; LCDR2 под SEQ ID NO: 79 и
LCDR3 под SEQ ID NO: 77.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 86, HCDR2 под SEQ ID NO: 87; HCDR3 под SEQ ID NO: 88; LCDR1 под SEQ ID NO: 101; LCDR2 под SEQ ID NO: 102 и LCDR3 под SEQ ID NO: 103.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 89, HCDR2 под SEQ ID NO: 90; HCDR3 под SEQ ID NO: 88; LCDR1 под SEQ ID NO: 104; LCDR2 под SEQ ID NO: 105 и LCDR3 под SEQ ID NO: 106.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 91, HCDR2 под SEQ ID NO: 87; HCDR3 под SEQ ID NO: 88; LCDR1 под SEQ ID NO: 101; LCDR2 под SEQ ID NO: 102 и LCDR3 под SEQ ID NO: 103.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 92, HCDR2 под SEQ ID NO: 93; HCDR3 под SEQ ID NO: 94; LCDR1 под SEQ ID NO: 107; LCDR2 под SEQ ID NO: 105 и LCDR3 под SEQ ID NO: 103.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 36, и VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 47.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 54, и VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 69, и VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 82.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 95, и VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 49.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 58, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 73, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 84.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 99, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 110.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 118, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ
- 4 044279
ID NO: 122.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 118, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ
ID NO: 123.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 124, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 128.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 124, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 129.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 130, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 134.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 130, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 135.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 136, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 140.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 141, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 145.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 119, 120 или 121, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 125, 126 или 127, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 49.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 131, 132 или 133, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 137, 138 или 139, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 84.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 142, 143 или 144, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 110.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 49.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 71, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 84.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с cKIT чело- 5 044279 века, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 97, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 110.
В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены конъюгаты, содержащие фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT (Fab или Fab' к cKIT), соединенный с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство (например, цитотоксическое средство), необязательно через линкер. Fab или Fab' к cKIT могут быть любыми из Fab или Fab', описанных в данном документе, например, любыми из Fab или Fab' в табл. 1. Как описано в данном документе, такие конъюгаты Fab' или Fab к cKIT и токсина могут разрушать человеческие клетки HSC in vitro и in vivo, но не вызывают дегрануляцию мастоцитов, даже будучи сшитыми и/или мультимеризованными в более крупные комплексы.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой линейный график, на котором показано, что все протестированные конъюгаты Fab'-(1) к cKIT и DAR4 (подробности состава конъюгатов см. в табл. 2) уничтожали человеческие стволовые клетки и клетки-предшественники (cKIT+/ CD90+ клетки) in vitro, показывая примерно одинаковую активность: J3 (квадраты); J2 (треугольники, направленные вверх); J1 (треугольники, направленные вниз). Контрольный ADC, J6 (ромбы), не уничтожал человеческие HSC в сравнении с PBSконтролем (круги).
Фиг. 2 представляет собой линейный график, на котором показано, что как конъюгат J4 (квадраты), так и конъюгат J5 (треугольники), связывающие cKIT, приводили к цитолизу мышиных долгосрочных HSC (cKIT+ клетки). В данном анализе цитолиза мышиных HSC более активным был J5 (треугольники), а не J4 (квадраты). Контрольный ADC, J6 (ромбы), не приводил к цитолизу мышиных HSC в сравнении с PBS-контролем (круги).
Фиг. 3A-3L представляют собой линейные графики, на которых показаны типичные результаты in vitro анализов дегрануляции человеческих мастоцитов, в которых применяли человеческие мастоциты, полученные из HSC периферической крови, и высвобождение бета-гексозаминидазы в качестве регистрируемой величины (оцениваемой по поглощению при 405 нм с вычитанием исходного уровня, основанного на эталонном поглощении при 620 нм). Данные, показанные здесь, собирали в отсутствие SCF. Фиг. 3А представляет собой линейный график, на котором показано титрование либо конъюгатов Fab'- (1) к cKIT и DAR4 (закрашенные символы, сплошные линии), либо полноразмерных антител к cKIT (незакрашенные символы, пунктирные линии) в виде различных клонов, связывающих cKIT: Ab4/Fab'4 к cKIT (круги), Ab3/Fab'3 к cKIT(квадраты), Ab2/Fab'2 к cKIT (треугольники, направленные вверх), Ab1/Fab'1 к cKIT (треугольники, направленные вниз), и контрольных Ab/Fab' к Her2 (ромбы). Фиг. 3В представляет собой линейный график, на котором показано титрование антитела к IgE, в качестве положительного контроля дегрануляции мастоцитов. Дегрануляцию мастоцитов наблюдали при всех протестированных концентрациях антитела к IgE. Фиг. 3C-3J представляют собой линейные графики, на которых показан уровень дегрануляции мастоцитов, запускаемой конъюгатами Fab'-(1) к cKIT и DAR4 (описаны в табл. 2) или контрольными Ab к cKIT, представляющими собой полноразмерные IgG (описаны в табл. 8), при различных концентрациях: отсутствии (незакрашенные ромбы и пунктирные линии); 0,006 нМ (треугольники); 0,098 нМ (ромбы); 1,56 нМ (круги) и 25 нМ (квадраты), когда тестируемые средства были сшиты с применением антитела, специфического в отношении части Fab на антителах-тестируемых средствах (титр нанесен на ось x). На фиг. 3С и 3D показано, что дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием конъюгата J4 при всех протестированных концентрациях (фиг. 3С), в то время как полноразмерное Ab4 к cKIT, будучи сшитым, вызывало дегрануляцию мастоцитов (фиг. 3D). На фиг. 3Е и 3F показано, что дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием конъюгата J1 при всех протестированных концентрациях (фиг. 3Е), в то время как полноразмерное Ab1 к cKIT, будучи сшитым, вызывало дегрануляцию мастоцитов (фиг. 3F). На фиг. 3G и 3Н показано, что дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием конъюгата J2 при всех протестированных концентрациях (фиг. 3G), в то время как полноразмерное Ab2 к cKIT, будучи сшитым, вызывало дегрануляцию мастоцитов (фиг. 3Н). На фиг. 3I и 3J показано, что дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием конъюгата J3 при всех протестированных концентрациях (фиг. 3I), в то время как полноразмерное Ab3 к cKIT, будучи сшитым, вызывало дегрануляцию мастоцитов (фиг. 3J). Фиг. 3K и 3L представляют собой линейные графики, на которых показано, что контрольный конъюгат J6 (фиг. 3K) или полноразмерное антитело к Her2 (фиг. 3L), будучи сшитыми, не вызывали дегрануляцию мастоцитов.
Фиг. 4 представляет собой точечную диаграмму, на которой показаны относительные количества человеческих HSC, присутствующих в костном мозге гуманизированных мышей NSG после обработки различными средствами. Конъюгат J7 разрушал человеческие HSC (квадраты) в сравнении с PBSконтролем (круги), в то время как контрольный конъюгат J8 (ромбы) не разрушал человеческие HSC в костном мозге.
Фиг. 5 представляет собой точечную диаграмму, на которой показаны относительные количества человеческих HSC, присутствующих в костном мозге гуманизированных мышей NSG после обработки различными средствами. Конъюгаты Fab'-(1) к cKIT и DAR4 разрушали человеческие HSC в сравнении с PBS-контролем (круги). Протестированные конъюгаты, связывающие cKIT (описаны в табл. 2), были
- 6 044279 следующими: J3 (квадраты); J2 (треугольники, направленные вверх); J1 (треугольники, направленные вниз). У контрольных мышей, обработанных с помощью J6 (ромбы), разрушение человеческих HSC в костном мозге не наблюдали.
Фиг. 6 представляет собой столбчатый график, на котором показаны относительные количества HSC, присутствующих в костном мозге мышей С57В1/6 после обработки различными средствами. Столбик Л=мыши, обработанные конъюгатом J4, столбик В=мыши, обработанные конъюгатом J5, столбик С=мыши, обработанные PBS.
Фиг. 7A-7I представляют собой линейные графики, на которых показаны типичные результаты in vitro анализов дегрануляции человеческих мастоцитов, в которых применяли человеческие мастоциты, полученные из HSC периферической крови, и высвобождение бета-гексозаминидазы в качестве регистрируемой величины (оцениваемой по поглощению при 405 нм с вычитанием исходного уровня, основанного на эталонном поглощении при 620 нм). Данные, показанные здесь, собирали в отсутствие SCF. На линейных графиках показан уровень дегрануляции мастоцитов, запускаемой под действием антител или фрагментов антител при различных концентрациях: 0,006 нМ (треугольники); 0,098 нМ (ромбы); 1,6 нМ (круги) и 25 нМ (квадраты), когда тестируемые средства были сшиты с применением антитела, специфического в отношении части Fab на антителах-тестируемых средствах (титр нанесен на ось x). На фиг. 7А7С показано, что полноразмерное ЛЬ4 к cKIT (HC-E152C-S375C) (фиг. 7А) и фрагмент F(ab'4)2 к cKIT (НС-Е152С), конъюгированный с соединением (4) (фиг. 7В), будучи сшитыми, вызывали дегрануляцию мастоцитов, при этом дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием фрагмента Fab4 (HCЕ152С) при всех протестированных концентрациях (фиг. 7С). На фиг. 7D-7F показано, что полноразмерное ЛЬ3 к cKIT (HC-E152C-S375C) (фиг. 7D) и фрагмент F(ab'3)2 (HC-E152C), конъюгированный с соединением (5) (фиг. 7Е), будучи сшитыми, вызывали дегрануляцию мастоцитов, при этом дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием фрагмента Fab3 (E152C), конъюгированного с соединением (4), при всех протестированных концентрациях (фиг. 7F). Фиг. 7G-7I представляют собой линейные графики, на которых показано, что антитело к Her2 (HC-E152C-S375C) (фиг. 7G), фрагмент F(ab')2 к Her2 (HC-E152C), конъюгированный с соединением (4) (фиг. 7Н), или фрагмент Fab к Her2 (HC-E152C), конъюгированный с соединением (7) (фиг. 7I), будучи сшитыми, не вызывали дегрануляцию мастоцитов.
Фиг. 8A-8O представляют собой линейные графики, на которых показаны типичные результаты in vitro анализов дегрануляции человеческих мастоцитов, в которых применяли человеческие мастоциты, полученные из HSC периферической крови, и высвобождение бета-гексозаминидазы в качестве регистрируемой величины (оцениваемой по поглощению при 405 нм с вычитанием исходного уровня, основанного на эталонном поглощении при 620 нм). Данные, показанные здесь, собирали в отсутствие SCF. На линейных графиках показан уровень дегрануляции мастоцитов, запускаемой под действием антител или фрагментов антител при различных концентрациях: 0,006 нМ (треугольники); 0,098 нМ (ромбы); 1,6 нМ (круги) и 25 нМ (квадраты), когда тестируемые средства были сшиты с применением антитела, специфического в отношении части Fab на антителах-тестируемых средствах (титр нанесен на ось x). В качестве эталонного значения на каждый график нанесены результаты для сшивающего антитела отдельно (незакрашенные ромбы, пунктирная линия). На фиг. 8А-8С показано, что полноразмерное ЛЬ4 к cKIT (фиг. 8А) и фрагмент F(ab'4)2 к cKIT (фиг. 8В), будучи сшитыми, вызывали дегрануляцию мастоцитов, при этом дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием фрагмента Fab4 к cKIT (HC-E152C) при всех протестированных концентрациях (фиг. 8С). На фиг. 8D-8F показано, что полноразмерное ЛЬ1 к cKIT (фиг. 8D) и фрагмент F(ab'1)2 к cKIT (фиг. 8Е), будучи сшитыми, вызывали дегрануляцию мастоцитов, при этом дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием фрагмента Fab1 к cKIT (HCE152C) при всех протестированных концентрациях (фиг. 8F). На фиг. 8G-8I показано, что полноразмерное ЛЬ2 к cKIT (фиг. 8G) и фрагмент F(ab'2)2 к cKIT (фиг. 8Н), будучи сшитыми, вызывали дегрануляцию мастоцитов, при этом дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием фрагмента Fab2 к cKIT (HC-E152C) при всех протестированных концентрациях (фиг. 8I). На фиг. 8J-8L показано, что полноразмерное ЛЬЗ к cKIT (фиг. 8J) и фрагмент F(ab'3)2 к cKIT (фиг. 8K) вызывали дегрануляцию мастоцитов, будучи сшитыми, при этом отсутствовала дегрануляция мастоцитов, запускаемая фрагментом Fab3 к cKIT (HC-E152C) при всех протестированных концентрациях (фиг. 8L). Фиг. 8М-8О представляют собой линейные графики, на которых показано, что антитело к Her2 (фиг. 8М), фрагмент F(ab')2 к Her2 (фиг. 8N) или фрагмент Fab к Her2 (HC-E152C) (фиг. 8O), будучи сшитыми, не вызывали дегрануляцию мастоцитов.
Фиг. 9А-9С представляют собой результаты in vitro анализов цитолиза с применением человеческих клеток. Мобилизированные HSC периферической крови культивировали с факторами роста и указанным тестируемым средством в течение 7 дней и жизнеспособность измеряли с помощью проточной цитометрии и подсчета клеток. Тестируемые средства, представляющие собой Fab' к cKIT и DAR4, получали с различными Fab: Fab'1 (фиг. 9А), Fab'2 (фиг. 9В) или Fab'3 (фиг. 9С) к cKIT. Протестированными полезными нагрузками были С1 (незакрашенный квадрат), mc-MMAF (незакрашенный круг), С5 (ромб) или С2 (треугольник). Данные представлены в виде среднего значения со стандартным отклонением, а 3параметрическую кривую ответа аппроксимировали по трем повторностям, измеренным в одном эксперименте.
- 7 044279
Фиг. 10A-10D представляют собой линейные графики, на которых показана временная динамика формирования химеризма донорских клеток в образцах крови, взятых у подвергнутых трансплантации мышей. Мышам C57BL/6J (n=5 в группе, обрабатываемой антителом к cKIT, или n=2 в группе, обрабатываемой PBS) вводили дозу 10 мг/кг Fab'5 к CKIT-DAR4-C1 (треугольники), 20 мг/кг Fab'5 к CKITDAR4-C1 (круги) или PBS (квадраты) в виде инфузии на протяжении семи дней, а затем подвергали трансплантации донорских CD45.1+ клеток спустя два дня. Двух контрольных животных облучали при 1100 рад (ромбы) за один день до проведения трансплантации. На линейных графиках показан процент донорских клеток (CD45.1+), измеренный в популяции всех клеток (фиг. 10A), миелоидных клеток (фиг. 10В), В-клеток (фиг. 10С) или Т-клеток (фиг. 10D), по результатам FACS-анализа образцов крови, взятых в каждый момент времени. Данные представлены в виде среднего значения со стандартной ошибкой.
Фиг. 11А-11В представляют собой столбчатые графики, на которых показан химеризм донорских клеток в образцах крови, взятых у подвергнутых трансплантации мышей. Мышам C57BL/6J (n=5 для группы, обрабатываемой антителом к cKIT, или n=2 для группы, обрабатываемой PBS) вводили дозу 10 мг/кг Fab'5 к CKIT-DAR4-C1 (горизонтальные полоски), 20 мг/кг Fab'5 к CKIT-DAR4-C1 (вертикальные полоски), 40 мг/кг Fab'5 к CKIT-DAR4-C1 (закрашенные), 40 мг/кг Fab'5' к cKIT-DAR4-mc-MMAF (шахматный узор) или PBS (незакрашенные, черная граница) в виде инфузии в течение пяти дней, а затем трансплантировали через один день донорские CD45.1+ клетки. Двух контрольных животных облучали при 1100 рад (заштрихованные) за один день до проведения трансплантации. На графиках показан процент донорских клеток (CD45.1+), измеренный в популяции всех клеток (фиг. 11А) или миелоидных клеток (фиг. 11В), по результатам FACS-анализа образцов крови, взятых в день 28 (левый столбик для каждой группы) или день 56 (правый столбик для каждой группы) после трансплантации. Данные представлены в виде среднего значения со стандартной ошибкой.
Фиг. 12А-12В представляют собой линейные графики, на которых показана временная динамика формирования химеризма онорских клеток в образцах крови, взятых у подвергнутых трансплантации мышей. Мышей C57BL/6J (n=5 для группы, обрабатываемой средством, связывающимся с cKIT, или n=2 для группы, обрабатываемой PBS) облучали при 300 рад и через три дня или не вводили (квадраты), или вводили дозу 10 мг/кг Fab'5 к CKIT-DAR4-C1 (треугольники) или 20 мг/кг Fab'5 к CKIT-DAR4-C1 (круги) в виде инфузии на протяжении трех дней и затем трансплантировали через два дня донорские CD45.1+ клетки. Дополнительной группе из 5 животных вводили только дозу 10 мг/кг Fab' 5 к CKITDAR4-C1 (незакрашенные квадраты) в виде инфузии на протяжении трех дней и затем проводили трансплантацию через два дня. Двух контрольных животных облучали при 1100 рад (ромбы) за один день до трансплантации, а двух контрольных животных не подвергали обработке (незакрашенные ромбы) до трансплантации. На линейных графиках показан процент донорских клеток (CD45.1+), измеренный в популяции всех клеток (фиг. 12А) или миелоидных клеток (фиг. 12В), по результатам FACS-анализа образцов крови, взятых в каждый момент времени. Данные представлены в виде среднего значения со стандартной ошибкой.
Фиг. 13 представляет собой точечную диаграмму, на которой показаны относительные количества человеческих HSC, присутствующих в костном мозге гуманизированных мышей NSG после обработки различными средствами. Конъюгаты Fab' к cKIT и DAR4 разрушали человеческие HSC в сравнении с PBS-контролем (ромбы). Протестированные конъюгаты, связывающие cKIT (описаны в табл. 2), были следующими: JW (круги); JX (квадраты); JY (треугольники, направленные вверх); JZ (треугольники, направленные вниз).
Подробное описание
В настоящем изобретении предусмотрены конъюгаты антитела и лекарственного средства, где антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, соединены с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство (например, цитотоксическое средство), необязательно через линкер. Такие конъюгаты антитела и лекарственного средства могут селективно доставлять цитотоксическое средство к клеткам, экспрессирующим cKIT, например, гемопоэтическим стволовым клеткам, тем самым селективно разрушая эти клетки у пациента, например, реципиента трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Предпочтительно конъюгаты антитела к cKIT и лекарственного средства обладают такими фармакокинетическими свойствами, что они не будут присутствовать и/или не будут активны в кровяном русле пациента в течение длительного времени, поэтому их можно применять для кондиционирования реципиентов трансплантации гемопоэтических стволовых клеток перед трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены конъюгаты, содержащие фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT, соединенный с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство (например, цитотоксическое средство), необязательно через линкер. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что полноразмерные антитела к cKIT (например, полноразмерные IgG), их фрагменты F(ab')2 и конъюгаты с токсинами вызывают дегрануляцию мастоцитов, а конъюгаты Fab' или Fab к cKIT и токсина не вызывают дегрануляцию мастоцитов, даже будучи сшитыми и/или мульмеризованными в более крупные комплексы, как можно было бы наблюдать в случае, когда у пациента выработались или имелись предсуществующие антитела к лекарственному средст- 8 044279 ву, распознающие фрагменты Fab. В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие конъюгаты антитела и лекарственного средства, и способы изготовления и применения таких фармацевтических композиций для разрушения гемопоэтических стволовых клеток у пациента, нуждающегося в этом, например, реципиента трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
Определения.
Если не указано иное, подразумевается, что следующие термины и фразы, используемые в данном документе, имеют следующие значения.
Термин алкил относится к одновалентной насыщенной углеводородной цепи, содержащей указанное число атомов углерода. Например, С1-6алкил относится к алкильной группе, содержащей от 1 до 6 атомов углерода. Алкильная группа может быть прямой или разветвленной. Типичная разветвленная алкильная группа содержит одну, две или три ветви. Примеры алкильных групп включают без ограничения, метил, этил, пропил (н-пропил и изопропил), бутил (н-бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил), пентил (н-пентил, изопентил и неопентил) и гексил.
Используемый в данном документе термин антитело относится к белковой или полипептидной последовательности, происходящей из молекулы иммуноглобулина, которая специфически связывается с антигеном. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными, многоцепочечными или одноцепочечными или интактными иммуноглобулинами, и могут происходить из природных источников или из рекомбинантных источников. Встречающееся в природе антитело представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой посредством дисульфидных связей. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в данном документе как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в данном документе как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые чередуются с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, в том числе с различными клетками иммунной системы (например, эффекторными клетками) и первым компонентом (C1q) классической системы комплемента. Антитело может быть моноклональным антителом, человеческим антителом, гуманизированным антителом, антителом верблюдовых или химерным антителом. Антитела могут относиться к любому изотипу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу.
Определяющие комплементарность домены или определяющие комплементарность области (CDR) взаимозаменяемо относятся к гипервариабельным областям VL и VH. У цепей антитела CDR представляют собой сайт для связывания белка-мишени, который обуславливает специфичность в отношении такого белка-мишени. В каждой человеческой VL или VH имеется по три CDR (CDR1-3, пронумерованные последовательно от N-конца), составляющие приблизительно 15-20% от вариабельных доменов. CDR могут обозначаться согласно области, к которой они принадлежат, и согласно порядку, в котором они расположены. Например, оба VHCDR1 или HCDR1 относятся к первой CDR вариабельной области тяжелой цепи. CDR являются структурно комплементарными эпитопу белка-мишени и, таким образом, непосредственно ответственны за специфичность связывания. Остальные отрезки VL или VH, так называемые каркасные области, проявляют меньшую изменчивость аминокислотной последовательности (Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000).
Точные границы аминокислотной последовательности указанной CDR могут быть определены с использованием любой из ряда широко известных схем, в том числе описанных в Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации по Kabat), Al-Lazikani et al. (1997) JMB 273, 927-948 (схема нумерации по Chothia), а также нумерация ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Сотр. Immunol., 27, 55-77 (2003) (схема нумерации IMGT). Например, в случае классических форматов согласно Kabat аминокислотные остатки CDR в домене тяжелой вариабельной цепи (VH) имеют номера 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); а аминокислотные остатки CDR в домене легкой вариабельной цепи (VL) имеют номера 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3). Согласно Chothia аминокислоты CDR в VH имеют номера 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); а аминокислотные остатки в VL имеют номера 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3). Объединяя определения CDR по Kabat и по Chothia, CDR состоят из аминокислотных остатков 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в человеческой VH и аминокислотных остатков 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в человеческой VL. Согласно IMGT
- 9 044279 аминокислотные остатки CDR в VH имеют номера примерно 26-35 (CDR1), 51-57 (CDR2) и 93-102 (CDR3), а аминокислотные остатки CDR в VL имеют номера примерно 27-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) и 8997 (CDR3) (нумерация в соответствии с Kabat). Согласно IMGT области CDR антитела можно определять с применением программы IMGT/DomainGap Align.
Как легкая, так и тяжелая цепи подразделяются на области структурной и функциональной гомологии. Термины константный и вариабельный применяются в функциональном смысле. В связи с этим следует понимать, что вариабельные домены из частей как легкой (VL), так и тяжелой (VH) цепей определяют распознавание антигена и специфичность в его отношении. Напротив, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепи (CH1, CH2 или СН3 и в некоторых случаях СН4) придают важные биологические свойства, такие как секреция, перемещение через плаценту, связывание с рецептором FcRn, период полувыведения, фармакокинетические свойства и т. п. Принято, что номера доменов константной области увеличиваются по мере их удаления от антигенсвязывающего сайта или амино-конца антитела. N-конец представляет собой вариабельную область, а на С-конце находится константная область; домены СН3 и CL фактически содержат карбокси-концевые домены тяжелой и легкой цепи, соответственно.
Используемый в данном документе термин фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент относится к одной или нескольким частям антитела, которые сохраняют способность специфически взаимодействовать (например, посредством связывания, стерического несоответствия, стабилизации/дестабилизации, пространственного распределения) с эпитопом антигена (например, cKIT). Примеры фрагментов антител включают без ограничения фрагмент Fab, который представляет собой одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1; фрагмент Fab', который представляет собой одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL, CH1 и шарнирной области; фрагмент F(ab')2, который представляет собой двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; полуантитело, которое включает одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, соединенные дисульфидным мостиком; одноплечевое антитело, которое содержит фрагмент Fab, присоединенный к области Fc; антитело с удаленным доменом СН2, которое содержит два фрагмента Fab, присоединенные к димерам домена СН3 (см. Glaser, J Biol Chem. 2005; 280 (50):41494-503); одноцепочечный Fv (scFv); соединенный дисульфидным мостиком Fv (sdFv); фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1; фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одноплечевого антитела; фрагмент dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), который состоит из домена VH; и выделенную определяющую комплементарность область (CDR) или другие эпитопсвязывающие фрагменты антитела. Например, фрагмент Fab может содержать аминокислотные остатки 1-222 (нумерация EU) тяжелой цепи антитела; в то время как фрагмент Fab' может содержать аминокислотные остатки 1-236 (нумерация EU) тяжелой цепи антитела. Фрагмент Fab или Fab' антитела может быть получен рекомбинантным путем или посредством ферментативного расщепления исходного антитела. Получаемые рекомбинантным путем Fab или Fab' можно конструировать, чтобы ввести аминокислоты для сайт-специфической конъюгации, такие как цистеины (Junutula, J. R.; et al., Nature biotechnology 2008, 26, 925), пирролинкарбоксилизины (Ou, W. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108 (26):10437-42) или неприродные аминокислоты (например, Tian, F. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2014, 111, 1766, Axup, J. Y. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2012, 109, 16101. Аналогичным образом можно добавлять мутации или пептидные метки для облегчения конъюгации за счет фосфопантетеинтрансфераз (Grunewald, J. et al., Bioconjugate chemistry 2015, 26, 2554), формилглицинобразующего фермента (Drake, P. M. et al., Bioconjugate chemistry 2014, 25, 1331), трансглютаминаз (Strop, P. et al., Chemistry & Bioconjugate chemistry 2013, 20, 161), сортазы (Beerli, R. R.; Hell, Т.; Merkel, A. S.; Grawunder, U. PloS one 2015, 10, e0131177) или других стратегий конъюгации с применением ферментов. Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно соединить с применением рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, который обеспечивает их получение в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH соединяются попарно с образованием одновалентной молекулы (известной как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al., Science 242:423-426, 1988; и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:58795883, 1988). Предусматривается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином антигенсвязывающий фрагмент. Такие антигенсвязывающие фрагменты получают с применением традиционных методик, известных специалистам в данной области техники, и фрагменты подвергают скринингу на применимость таким же способом, что и интактные антитела.
Фрагменты антител или антигенсвязывающие фрагменты также можно вводить в состав однодоменных антител, максител, минител, нанотел, интрател, диател, триател, тетрател, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Антигенсвязывающие фрагменты можно прививать на остовы на основе полипептидов, таких как фибронектин типа III (Fn3) (см. патент США № 6703199, в котором описаны монотела на основе полипептида фибронектина).
Фрагменты антител или антигенсвязывающие фрагменты можно вводить в состав одноцепочечных молекул, содержащих пару тандемных сегментов Fv (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей (Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995; и патент США № 5641870).
Используемый в данном документе термин моноклональное антитело или композиция на основе
- 10 044279 моноклонального антитела относится к полипептидам, включающим антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые характеризуются практически идентичной аминокислотной последовательностью или происходят из одного генетического источника. Данный термин также охватывает препараты молекул антител одного молекулярного состава. Композиция на основе моноклонального антитела проявляет одну специфичность и аффинность связывания в отношении конкретного эпитопа.
Используемый в данном документе термин человеческое антитело охватывает антитела, имеющие вариабельные области, в которых как каркасные области, так и CDR получены из последовательностей, происходящих от человека. Кроме того, если антитело содержит константную область, то константная область также происходит из таких человеческих последовательностей, например, последовательностей зародышевой линии человека, или мутантных версий последовательностей зародышевой линии человека, или антитела, содержащего консенсусные каркасные последовательности, полученные за счет анализа человеческих каркасных последовательностей, например, как описано в Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000.
Человеческие антитела по настоящему описанию могут содержать аминокислотные остатки, закодированные в человеческих последовательностях (например, мутации, введенные посредством случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или за счет соматических мутаций in vivo, или консервативные замены, которые содействуют стабильности или облегчают изготовление).
Используемый в данном документе термин распознавать относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые отыскивают свой эпитоп и взаимодействуют (например, связываются) с ним, независимо от того является ли эпитоп линейным или конформационным. Термин эпитоп относится к сайту на антигене, с которым специфически связываются антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Эпитопы могут быть образованы как смежными аминокислотами, так и несмежными аминокислотами, размещаемыми рядом за счет третичной укладки белка. Эпитопы, образуемые из смежных аминокислот, как правило, сохраняются при воздействии денатуририрующих растворителей, в то время как эпитопы, образуемые за счет третичной укладки, как правило, утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают методики из уровня техники, например, рентгеноструктурную кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс (см., например, Epitope Mapping Protocols в Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)). Паратоп представляет собой часть антитела, которая распознает эпитоп антигена.
Фраза специфически связывает или селективно связывает, когда она применяется в контексте описания взаимодействия между антигеном (например, белком) и антителом, фрагментом антитела или связывающим средством, происходящим из антитела, относится к реакции связывания, которая является определяющей для установления присутствия антигена в неоднородной популяции белков и других биологических веществ, например, в биологическом образце, например, крови, сыворотке, плазме или образце ткани. Таким образом, при некоторых обозначенных условиях проведения иммунологического анализа антитела или связывающие средства, характеризующиеся конкретной специфичностью связывания, связываются с конкретным антигеном в по меньшей мере два раза сильнее, чем фоновый уровень, и практически не связываются в значительном количестве с другими антигенами, присутствующими в образце. В одном аспекте при обозначенных условиях иммунологического анализа антитело или связывающее средство с конкретной специфичностью связывания связывается с конкретным антигеном в по меньшей мере десять (10) раз сильнее относительно фонового уровня, и практически не связывается в значительном количестве с другими антигенами, присутствующими в образце. Специфическое связывание с антителом или связывающим средством в таких условиях может предусматривать то, что антитело или средство должно отбираться за его специфичность в отношении конкретного белка. При желании или необходимости данный отбор можно проводить путем отбрасывания антител, которые вступают в перекрестные реакции с молекулами от другого вида (например, мыши или крысы) или других подтипов. В качестве альтернативы в некоторых аспектах отбирают антитела или фрагменты антител, которые вступают в перекрестные реакции с некоторыми требуемыми молекулами.
Используемый в данном документе термин аффинность относится к силе взаимодействия между антителом и антигеном в отдельных антигенных сайтах. В пределах каждого антигенного сайта вариабельная область плеча антитела взаимодействует с антигеном посредством слабых нековалентных сил в многочисленных сайтах; чем больше взаимодействий, тем сильнее аффинность.
Термин выделенное антитело относится к антителу, которое практически не содержит других антител с отличающейся антигенной специфичностью. Однако выделенное антитело, которое специфически связывается с одним антигеном, может характеризоваться перекрестной реактивностью в отношении других антигенов. Более того, выделенное антитело может практически не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.
Термин соответствующая последовательность зародышевой линии человека относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность или подпоследовательность человеческой вариабельной области, которые обладают самой высокой установленной иден- 11 044279 точностью аминокислотной последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью или подпоследовательностью вариабельной области в сравнении со всеми другими известными аминокислотными последовательностями вариабельной области, закодированными в последовательностях вариабельной области иммуноглобулина зародышевой линии человека. Соответствующая последовательность зародышевой линии человека также может относиться к аминокислотной последовательности или подпоследовательности человеческой вариабельной области, характеризующимися самой высокой идентичностью аминокислотной последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью или подпоследовательностью вариабельной области в сравнении со всеми другими подвергнутыми оценке аминокислотными последовательностями вариабельной области. Соответствующей последовательностью зародышевой линии человека могут быть только каркасные области, только определяющие комплементарность области, каркасные и определяющие комплементарность области, вариабельный сегмент (как определено выше) или другие комбинации последовательностей или подпоследовательностей, которые содержат вариабельную область. Идентичность последовательности может быть определена с применением способов, описанных в данном документе, например, выравнивания двух последовательностей с применением BLAST, ALIGN или другого алгоритма выравнивания, известного из уровня техники. Соответствующая последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность зародышевой линии человека может характеризоваться по меньшей мере приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательностью вариабельной области.
Целый ряд форматов иммунологического анализа может применяться для отбора антител, характеризующихся специфической иммунной реактивностью в отношении конкретного белка. Например, твердофазные иммунологические анализы ELISA традиционно применяются для отбора антител, характеризующихся специфической реактивностью в отношении белка (см., например, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998), где описаны форматы и условия иммунологического анализа, которые можно применять для определения специфической иммунной реактивности). Как правило, реакция специфического или селективного связывания будет приводить к сигналу, в по меньшей мере два раза превышающему фоновый уровень, и, более типично, в по меньшей мере 10-100 раз превышающему фоновый уровень.
Термин равновесная константа диссоциации (KD [М]) относится к константе скорости диссоциации (kd [с-1] ), поделенной на константу скорости ассоциации (kd [с-1, M-1]). Равновесные константы диссоциации могут быть измерены с применением любого способа, известного из уровня техники. Обычно антитела по настоящему изобретению будут характеризоваться равновесной константой диссоциации, составляющей менее приблизительно 10-7 или 10-8 М, например, менее приблизительно 10-9 М или 10-10 М, в некоторых аспектах менее приблизительно 10-11 М, 10-12 М или 10-13 М.
Термин ''биодоступность'' относится к системной доступности (т. е. уровням в крови/плазме) заданного количества лекарственного средства, вводимого пациенту. Биодоступность представляет собой абсолютный термин, обозначающий показатель как времени (скорости), в течение которого лекарственное средство достигает общего кровообращения из введенной лекарственной формы, так и общего количества (степени) лекарственного средства в нем.
Используемая в данном документе фраза состоящий фактически из относится к родам или видам активных фармацевтических средств, включенных в способ или композицию, а также любым вспомогательным веществам, не проявляющим активность в отношении намеченной цели применения способов или композиций. В некоторых аспектах фраза состоящий фактически из однозначно исключает включение одного или нескольких дополнительных активных средств, отличных от конъюгата антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению. В некоторых аспектах фраза состоящий фактически из однозначно исключает включение одного или нескольких дополнительных активных средств, отличных от конъюгата антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению и второго средства, вводимого совместно.
Термин аминокислота относится к встречающимся в природе, синтетическим и неприродным аминокислотам, а также аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют подобно встречающимся в природе аминокислотам. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, закодированные в генетическом коде, а также такие аминокислоты, которые были впоследствии модифицированы, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые характеризуются такой же основной химической структурой, что и встречающаяся в природе аминокислота, то есть имеют α-углерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например, к гомосерину, норлейцину, метионинсульфоксиду, метионинметилсульфонию. Такие аналоги имеют модифицированные Rгруппы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют подобно встречающейся в природе аминокислоте.
- 12 044279
Термин консервативно модифицированный вариант применяется в отношении как аминокислотных последовательностей, так и последовательностей нуклеиновой кислоты. Применительно к конкретным последовательностям нуклеиновой кислоты, консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или фактически идентичные аминокислотные последовательности, или же, если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, к фактически идентичным последовательностям. Вследствие вырожденности генетического кода любой заданный белок кодируется большим количеством функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, все из кодонов GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, в котором кодоном задан аланин, кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновой кислоты являются молчащими вариациями, которые представляют собой одну разновидность вариаций с консервативными модификациями. В данном документе каждая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалист в данной области будет осознавать, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован с получением функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, неявно определена в каждой описанной последовательности.
В случае полипептидных последовательностей консервативно модифицированные варианты охватывают отдельные замены, делеции или добавления в полипептидной последовательности, которые приводят к замене аминокислоты на аналогичную по химическим свойствам аминокислоту. Таблицы консервативных замен, обеспечивающие функционально аналогичные аминокислоты, хорошо известны из уровня техники. Такие консервативно модифицированные варианты дополняют, а не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели. Следующие восемь групп содержат аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга: 1) аланин (А), глицин (G); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); б) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серии (S), треонин (Т); и 8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, Creighton, Proteins (1984)). В некоторых аспектах термин консервативные модификации последовательности используется для обозначения аминокислотных модификаций, которые не оказывают значительного влияния на характеристики связывания у антитела, содержащего аминокислотную последовательность, или не изменяют их.
Используемый в данном документе термин оптимизированная относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, которая была изменена с применением кодонов, предпочтительных в продуцирующих клетке или организме, обычно в эукариотической клетке, например, дрожжевой клетке, клетке Pichia, грибной клетке, клетке Trichoderma, клетке яичника китайского хомячка (СНО) или человеческой клетке. Оптимизированную нуклеотидную последовательность конструируют таким образом, чтобы полностью или насколько это возможно сохранить аминокислотную последовательность, изначально закодированную в исходной нуклеотидной последовательности, которая также известна как родительская последовательность.
Термины процент идентичности или процентная идентичность, в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей, относятся к степени, в которой две или более последовательности или подпоследовательности являются одинаковыми. Две последовательности являются идентичными, если они имеют одинаковую последовательность из аминокислот или нуклеотидов на протяжении области, подлежащей сравнению. Две последовательности являются практически идентичными, если две последовательности имеют указанную процентную долю аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (т. е. 60% идентичность, необязательно 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% идентичность на протяжении указанной области или, если не указано, на протяжении всей последовательности), при сравнении и выравнивании для обеспечения максимального соответствия на протяжении окна сравнения или обозначенной области, как измерено с применением одного из следующих алгоритмов сравнения последовательности или посредством ручного выравнивания и визуального просмотра. Необязательно идентичность существует на протяжении области, длина которой составляет по меньшей мере приблизительно 30 нуклеотидов (или 10 аминокислот), или более предпочтительно на протяжении области, длина которой составляет 100-500 или 1000 или более нуклеотидов (или 20, 50, 200 или более аминокислот).
При сравнении последовательностей обычно одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, если необходимо, устанавливают координаты подпоследовательностей и устанавливают программные параметры алгоритма для анализа последовательностей. Могут применяться программные параметры по умолчанию или можно устанавливать альтернативные параметры. На основании программных параметров алгоритм сравнения последовательностей затем рассчитывает значения процента идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей относительно эталонной по
- 13 044279 следовательности.
Используемое в данном документе окно сравнения предусматривает ссылку на сегмент из любого количества смежных положений, выбранных из группы, состоящей из от 20 до 600, обычно от приблизительно 50 до приблизительно 200, чаще от приблизительно 100 до приблизительно 150, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью с таким же количеством смежных положений, после того как две последовательности подвергли оптимальному выравниванию. Способы выравнивания последовательностей для проведения сравнения хорошо известны из уровня техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма поиска локальной гомологии Смита-Уотермана, Adv. Appl. Math. 2:482c (1970), с помощью алгоритма выравнивания областей гомологии Нидлмана-Вунша, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью способа поиска сходства Пирсона-Липмана, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), с помощью компьютерных реализаций таких алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в составе пакета программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мэдисон, Висконсин) или с помощью ручного выравнивания и визуального просмотра (см., например, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003).
Два примера алгоритмов, которые подходят для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, представляют собой алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; и Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403410, 1990, соответственно. Программное обеспечение для осуществления анализов BLAST является общедоступным от Национального центра биотехнологической информации. На первом этапе данный алгоритм предусматривает идентификацию пар последовательностей с высоким показателем сходства (HSP) за счет идентификации коротких слов длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому пороговому баллу Т с положительным значением при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т известен под названием пороговый балл соседних слов (Altschul et al., выше). Эти первоначальные совпадения соседних слов выступают в качестве затравок для начала поисков, чтобы найти более длинные HSP, содержащие их. Совпадения слов продлеваются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока может увеличиваться суммарный балл выравнивания. Суммарные баллы рассчитывают с применением, в случае нуклеотидных последовательностей, параметров М (вознаграждающий балл за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). В случае аминокислотных последовательностей для подсчета суммарного балла применяют матрицу замен. Продление совпадений слов в каждом направлении останавливается, когда суммарный балл выравнивания уменьшается на величину X относительно своего максимального достигнутого значения; суммарный балл стремится к нулю или ниже вследствие накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательными баллами; или достигается конец любой из последовательностей. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) в качестве параметров по умолчанию применяется длина слова (W), составляющая 11, ожидание (Е), составляющее 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих нитей. В случае аминокислотных последовательностей в программе BLASTP в качестве параметров по умолчанию применяется длина слова, составляющая 3, и ожидание (Е), составляющее 10, и матрица замен BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915), выравнивания (В), составляющие 50, ожидание (Е), составляющее 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих нитей.
Алгоритм BLAST также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Одной мерой сходства, предусмотренной в алгоритме BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая указывает на вероятность, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями возникло случайно. Например, нуклеиновая кислота считается схожей с эталонной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет менее приблизительно 0,2, более предпочтительно менее приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно менее приблизительно 0,001.
Процентную идентичность между двумя аминокислотными последовательностями также можно определить с использованием алгоритма из Е. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci. 4:11-17, (1988) который был включен в программу ALIGN (версия 2.0), с применением таблицы весов замен остатков РАМ120, штрафа за продление гэпа, составляющего 12, и штрафа за открытие гэпа, составляющего 4. Кроме того, процентная идентичность между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с применением алгоритма Нидлмана-Вунша, J. Mol. Biol. 48:444-453, (1970), который был включен в программу GAP в составе пакета программного обеспечения GCG (доступного на www.gcg.com), с применением либо матрицы Blossom 62, либо матрицы РАМ250, и также штрафа за открытие гэпа, составляющего 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и штрафа за продление гэпа, составляющего 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Помимо процента идентичности последовательностей, упомянутого выше, еще одним показателем
- 14 044279 того, что две последовательности нуклеиновой кислоты или полипептида являются практически идентичными, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, является иммунологически перекрестно реактивным с антителами, выработка которых индуцирована полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид, как правило, является практически идентичным второму полипептиду, например, если два пептида отличаются только консервативными заменами. Другим показателем того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются практически идентичными, является то, что две молекулы или их комплементарные цепи гибридизируются друг с другом в жестких условиях, как описано ниже. Еще одним показателем того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются практически идентичными, является то, что для амплификации последовательности могут применяться одни и те же праймеры.
Термин нуклеиновая кислота используется в данном документе взаимозаменяемо с термином полинуклеотид и относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и полимерам на их основе в одно- или двухнитевой форме. Термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки или связи в остове, которые являются синтетическими, встречающимися в природе и не встречающимися в природе, которые характеризуются свойствами связывания, подобными эталонной нуклеиновой кислоте, и которые метаболизируются подобно эталонным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают без ограничения фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-O-метилрибонуклеотиды, пептидонуклеиновые кислоты (PNA).
Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также в неявном виде охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены на основе вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, а также последовательность, указанную явным образом. А именно, как подробно описано ниже, замены на основе вырожденных кодонов можно проводить за счет создания последовательностей, в которых третье положение в одном или нескольких выбранных (или всех) кодонах заменено на любой из канонических нуклеозидов и/или остаток дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).
В контексте нуклеиновых кислот термин функционально связанный относится к функциональной взаимосвязи двух или более сегментов полинуклеотида (например, ДНК). Как правило, он относится к функциональной взаимосвязи регулирующей транскрипцию последовательности с транскрибируемой последовательностью. Например, промоторная или энхансерная последовательность является функционально связанной с кодирующей последовательностью, если она стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в соответствующей клетке-хозяине или другой системе экспрессии. Обычно регулирующие транскрипцию промоторные последовательности, которые являются функционально связанными с транскрибируемой последовательностью, являются физически смежными с транскрибируемой последовательностью, т. е. они функционируют в цис-положении. Однако некоторые регулирующие транскрипцию последовательности, такие как энхансеры, не обязательно должны быть физически смежными или располагаться в непосредственной близости от кодирующих последовательностей, транскрипцию которых они усиливают.
Термины полипептид и белок используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины применимы к полимерам из аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также к полимерам из встречающихся в природе аминокислот и полимеру из не встречающихся в природе аминокислот. Если не указано иное, конкретная полипептидная последовательность также в неявном виде охватывает ее консервативно модифицированные варианты.
Используемый в данном документе термин конъюгат или конъюгат антитела и лекарственного средства относится к связи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с другим средством, таким как химиотерапевтическое средство, токсин, иммунотерапевтическое средство, зонд для визуализации и т. п. Связь может представлять собой ковалентные связи или нековалентные взаимодействия, такие как посредством электростатических сил. Для образования конъюгата могут использоваться различные линкеры, известные из уровня техники. Кроме того, конъюгат может предусматриваться в форме слитого белка, который может экспрессироваться с полинуклеотида, кодирующего конъюгат. Используемый в данном документе слитый белок относится к белкам, созданным за счет соединения двух или более генов или фрагментов генов, которые изначально кодировали отдельные белки (в том числе пептиды и полипептиды). Трансляция слитого гена приводит к единому белку с функциональными свойствами, происходящими из каждого из исходных белков.
Термин субъект охватывает человека и отличных от человека животных. Отличные от человека животные охватывают всех позвоночных, например, млекопитающих и отличных от млекопитающих животных, как, например, отличных от человека приматов, овцу, собаку, корову, кур, амфибий и рептилий. За исключением случаев, когда это отмечается, термины пациент или субъект используются в данном документе взаимозаменяемо.
- 15 044279
Используемый в данном документе термин токсин, цитотоксин или цитотоксическое средство относится к любому средству, которое является вредным для роста и пролиферации клеток и которое может функционировать с уменьшением, ингибированием или разрушением клетки или злокачественной опухоли.
Используемый в данном документе термин противораковое средство относится к любому средству, которое может использоваться для лечения нарушения пролиферации клеток, такого как рак, в том числе без ограничения к цитотоксическим средствам, химиотерапевтическим средствам, лучевой терапии и средствам для лучевой терапии, нацеливающим противораковым средствам и иммунотерапевтическим средствам.
Используемый в данном документе термин фрагмент, представляющий собой лекарственное средство или полезная нагрузка относится к химическому фрагменту, который конъюгирован с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, и может охватывать любое терапевтическое или диагностическое средство, например, противораковое, противовоспалительное, противоинфекционное (например, противогрибковое, антибактериальное, антипаразитарное, противовирусное) или анестетическое средство. В определенных аспектах фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, выбран из ингибитора Eg5, ингибитора V-АТФазы, ингибитора HSP90, ингибитора IAP, ингибитора mTor, стабилизатора микротрубочек, дестабилизатора микротрубочек, ауристатина, доластатина, майтанзиноида, MetAP (метионинаминопептидаза), ингибитора ядерного экспорта белков CRM1, ингибитора DPPIV, ингибитора реакций переноса фосфорила в митохондриях, ингибитора синтеза белков, ингибитора киназ, ингибитора CDK2, ингибитора CDK9, ингибитора протеасом, ингибитора кинезина, ингибитора HDAC, ДНКповреждающего средства, ДНК-алкилирующего средства, ДНК-интеркалятора, средства, связывающего малую бороздку ДНК, ингибитора РНК-полимеразы, аманитина, ингибитора сплайсосомы, ингибитора топоизомеразы и ингибитора DHFR. Способы прикрепления каждого из них к линкеру, совместимому с антителами и способом по настоящему изобретению, известны из уровня техники. См., например, Singh et al. (2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, vol. 525, 445-457. Кроме того, полезная нагрузка может представлять собой зонд для биофизического обнаружения, флуорофор, спиновую метку, зонд для инфракрасного обнаружения, зонд для обнаружения аффинности, хелатор, зонд для спектроскопического обнаружения, радиоактивный зонд, липидную молекулу, полиэтиленгликоль, полимер, спиновую метку, ДНК, РНК, белок, пептид, поверхность, антитело, фрагмент антитела, наночастицу, квантовую точку, липосому, частицу PLGA, сахарид или полисахарид.
Термин рак охватывает первичные злокачественные опухоли (например, опухоли, клетки которых не мигрировали в локализации в организме субъекта, отличные от локализации исходной опухоли) и вторичные злокачественные опухоли (например, опухоли, развившиеся за счет метастазирования, миграции опухолевых клеток во вторичные локализации, которые отличны от локализации исходной опухоли).
Термин cKIT (также известный как KIT, PBT, SCFR, C-Kit, CD117) относится к тирозинкиназному рецептору, который является представителем семейства III рецепторных тирозинкиназ. Последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности изоформ cKIT человека известны и были опубликованы в GenBank под следующими № доступа:
NM_000222.2^NP_000213.1 предшественник изоформы 1 рецептора Kit фактора роста мастоцитов/стволовых клеток;
NM_001093772.1^NP_001087241.1 предшественник изоформы 2 рецептора Kit фактора роста мастоцитов/стволовых клеток.
По своей структуре рецептор cKIT представляет собой трансмембранный белок I типа, и он содержит сигнальный пептид, 5 Ig-подобных доменов С2 во внеклеточном домене и имеет протеинкиназный домен в своем внутриклеточном домене. Используемый в данном документе термин cKIT применяют для совместного обозначения всех встречающихся в природе изоформ белка cKIT или его вариантов.
Термин вариант относится к полипептиду, который имеет практически идентичную аминокислотную последовательность с эталонным полипептидом, или кодируется практически идентичной нуклеотидной последовательностью и может характеризоваться одной или несколькими активностями эталонного полипептида. Например, вариант может характеризоваться приблизительно 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более высокой идентичностью последовательности с эталонным полипептидом, при этом он сохраняет одну или несколько активностей эталонного полипептида.
Используемые в данном документе термины лечить, осуществление лечения или лечение любого заболевания или нарушения в одном аспекте относится к уменьшению тяжести заболевания или нарушения (т. е. замедлению, или остановке, или снижению развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом аспекте лечить, осуществление лечения или лечение относятся к облегчению или уменьшению тяжести по меньшей мере одного физического параметра, в том числе таких, которые могут быть не очевидными для пациента. В еще одном аспекте лечить, осуществление лечения или лечение относятся к модулированию заболевания или нарушения либо физическому (например, стабилизации очевидного симптома), либо физиологическому (например, стабилизации физического параметра), либо обоим. В еще одном аспекте лечить, осуществление лече- 16 044279 ния или лечение относятся к предотвращению или отсрочке проявления, или развития, или прогрессирования заболевания или нарушения.
Термин терапевтически приемлемое количество или терапевтически эффективная доза взаимозаменяемо относится к количеству, достаточному для произведения требуемого результата (т. е. уменьшения размера опухоли, ингибирования роста опухоли, предотвращения метастазирования, ингибирования или предотвращения вирусной, бактериальной, грибковой или паразитарной инфекции). В некоторых аспектах терапевтически приемлемое количество не индуцирует или не вызывает нежелательные побочные эффекты. Терапевтически приемлемое количество можно определять, вводя вначале низкую дозу, а затем постепенно увеличивая данную дозу до тех пор, пока не будет достигнут требуемый эффект. Терапевтически эффективная доза молекул по настоящему изобретению может предотвращать проявление или, соответственно, приводить к уменьшению тяжести симптомов заболевания, в том числе симптомов, ассоциированных с раком.
Термин совместное введение относится к одновременному присутствию двух активных средств в крови индивидуума. Активные средства, которые вводятся совместно, могут доставляться одновременно или последовательно.
Используемый в данном документе термин тиол-малеимид относится к группе, образуемой за счет реакции тиола с малеимидом, имеющей такую общую формулу:
где Y и Z представляют собой группы, подлежащие соединению с помощью тиол-малеимидной связи, и они могут предусматривать линкерные компоненты, антитела или полезные нагрузки. Тиолмалеимид может формировать следующие структуры с открытым кольцом
Используемый в данном документе расщепляемый относится к связывающей группе или линкерному компоненту, которые соединяют два фрагмента за счет ковалентных связей, но распадаются с разрывом ковалентной связи между фрагментами при физиологически соответствующих условиях, как правило расщепляемая связывающая группа разрывается in vivo быстрее во внутриклеточной среде, чем при нахождении вне клетки, что вызывает предпочтительное высвобождение полезной нагрузки внутри целевой клетки. Расщепление может быть ферментативным или неферментативным, но обычно приводит к высвобождению полезной нагрузки из антитела без разрушения антитела. При расщеплении некоторая часть связывающей группы или линкерного компонента может оставаться присоединенной к полезной нагрузке, или высвобождение полезной нагрузки может происходить без какого-либо остатка связывающей группы.
Используемый в данном документе нерасщепляемый относится к связывающей группе или линкерному компоненту, которые практически не подвергаются распадению при физиологических условиях, например, они устойчивы по меньшей мере в такой же степени, что и часть конъюгата, представляющая собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент. Такие связывающие группы иногда называют устойчивыми, это означает, что они в достаточной степени устойчивы к разрушению, чтобы удержать полезную нагрузку, присоединенной к антителу или антигенсвязывающему фрагменту до тех пор, пока антитело или антигенсвязывающий фрагмент сами по себе по меньшей мере частично не разрушатся, т. е. разрушение антитела или антигенсвязывающего фрагмента предшествует расщеплению связывающей группы in vivo. При разрушении части, представляющей собой антитело, у ADC с устойчивой или нерасщепляемой связывающей группой часть или вся связывающая группа, например, одна или несколько аминокислотных групп из антитела, могут оставаться присоединенными к полезной нагрузке или фрагменту, представляющему собой лекарственное средство, которые доставляются in vivo.
Фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство (LB-(D)n)
В одном аспекте фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство по настоящему изобретению, предусматривает один или несколько цитотоксинов, ковалентно присоединенных к линкеру (LB), где один или несколько цитотоксинов независимо выбраны из ауристатина, аманитина, майтанзиноида и сапорина.
В другом аспекте фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство по настоящему изобретению, предусматривает один или несколько цитотоксинов, ковалентно присоединенных к линкеру (LB), где один или несколько цитотоксинов независимо выбраны ауристатина и аманитина.
В одном аспекте фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство по настоящему изобретению, предусматривает один или несколько цитотоксинов, ковалентно присоединенных к линкеру (LB), где линкер (LB) представляет собой расщепляемый линкер, а один или несколько цитотоксинов
- 17 044279 независимо выбраны из ауристатина, аманитина, майтанзиноида и сапорина.
В другом аспекте фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство по настоящему изобретению, предусматривает один или несколько цитотоксинов, ковалентно присоединенных к линкеру (LB), где линкер (LB) представляет собой расщепляемый линкер, а один или несколько цитотоксинов независимо выбраны из ауристатина и аманитина.
В одном аспекте фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство по настоящему изобретению, предусматривает один или несколько цитотоксинов, ковалентно присоединенных к линкеру (LB), где линкер (LB) представляет собой нерасщепляемый линкер, а один или несколько цитотоксинов независимо выбраны из ауристатина, аманитина, майтанзиноида и сапорина.
В другом аспекте фрагмент, представляющий собой лекарственное средство (D), представляет собой белковый токсин, выбранный из сапорина, противовирусного белка лаконоса (PAP), бриодина 1, буганина, гелонина, рицина, абрина, лектина омелы, модекцина, волкенсина, аспарина, момордина, эбулина, вискумина, шигатоксина, дифтерийного токсина (DT) или экзотоксина Pseudomonas (PE). Такие белковые токсины способны приводить к цитолизу клеток за счет инактивации рибосомы или ингибирования синтеза белков путем нарушения функции фактора элонгации 2 (EF2) (см. Kreitman et al., Immunotoxins for targeted cancer therapy, The AAPS Journal 2006; 8 (3) Article 63; Gadadhar and Karande, Targeted Cancer Therapy: History and Development of Immunotoxins, глава 1 в Resistance to Immunotoxins in Cancer Therapy, pp 1-31). В некоторых вариантах осуществления белковый токсин представляет собой сапорин. Такой белковый токсин может быть ковалентно присоединен к расщепляемому или нерасщепляемому линкеру (LB).
В другом аспекте фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство по настоящему изобретению, предусматривает один или несколько цитотоксинов, ковалентно присоединенных к линкеру (LB), где линкер (LB) представляет собой нерасщепляемый линкер, а один или несколько цитотоксинов независимо выбраны из ауристатина или аманитина.
В одном аспекте фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство по настоящему изобретению, представляет собой соединение, имеющее структуру формулы (А), или его стереоизомеры или фармацевтически приемлемые соли,
Н
R44 О где R1 представляет собой
R1 представляет собой
и R3 представляет собой -OH; или и R3 представляет собой -L5R14;
R2 представляет собой С1-С6алкил;
R4 представляет собой -L1R14, -L2R24, -L2R34 или -L3R44;
L1 представляет собой -((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-, -((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -((CH2)mO)p(CH2)m-, 4CH2)m-, -(CH2)mX1(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -((CH2)mO)p(CH2)mNHC(=O)(CH2)m, -((CH2)mO)pCH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -X3X4C(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-, -X3X4C(=O)(CH2)m-, -X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-, -(CH2)mC(R7)2-, -(CH2)mC(R7)2SS(CH2)mNHC(=O)(CH2)m- или
- (CH2)mX3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-;
L2 представляет собой -((CH2)mO)p(CH2)m-, -(CH2)mX1(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -((CH2)mO)p(CH2)mNHC(=O)(CH2)m,
- ((CH2)mO)pCH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -X3X4C(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-, -X3X4C(=O)(CH2)m-,
- X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-, -(CH2)mC(R7)2-,
- (CH2)mC(R7)2SS(CH2)mNHC(=O)(CH2)m- или -(CH2)mX3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2^
L3 представляет собой -((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-, -((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -((CH2)mO)p(CH2)m-, -(CH2)m-, -(CH2)mX1(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -((CH2)mO)p(CH2)mNHC(=O)(CH2)m, -((CH2)mO)pCH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -X3X4C(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-, -X3X4C(=O)(CH2)m-, -X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-, -(CH2)mC(R7)2-, -(CH2)mC(R7)2SS(CH2)mNHC(=O)(CH2)m- или
- (CH2)mX3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-;
L4 представляет собой -(CH2)m-;
L5 представляет собой -NHS(=O)2(CH2)mX1L4, -NH((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-,
- 18 044279
-NH((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -NH((CH2)mO)p(CH2)m-, -NH(CH2)m-, -NH(CH2)mXi(CH2)m-,
-NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-,
-NH((CH2)mO)p(CH2)mNHC(=O)(CH2)m, -NH((CH2)mO)pCH2)mC(=O)NH(CH2)m—, -NH(CH2)nC(R7)2-,
-NH(CH2)mC(R7)2SS(CH2)mNHC(=O)(CH2)m- ИЛИ -NH(CH2)mX3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2^
X1 представляет собой
* указывает на точку присоединения к L4;
Х2 представляет R11 О Лч -а-О XXn Ху Αν VC R или Х3 представляет собой О он «ΛΛ° °Y^OH он /А уо, I х-о. А % II н \ о ИЛИ 4 h2n^o HN Аг о Х4 представляет собой ри. з Ί и 9. ч? ь ΆγΧ X NH2 f nh2 аЧЛ м о 1 · или ' 0 ц R14 представляет собой о | R11 R10 IL Ά _ar10/\ n * XxaVn* // η \ L X -N ( ΧκίΝ κΆ ν· Г- . >Vn , \__Z^N R X , собой ’ ' ' ,(R12)l-2 z * . ' где * указывает на точку присоединения к L4; он но-уХон °Хон Хл vXXiV н , н , О он ноЧТ™ °Y^OH j3a Η ; ο^νη2 ΝΗ , и , ΛΛ > r -N3, -ONH2, -NR7C(=O)CH=CH2, SH, -SSR13, -S(=O)2(CH=CH2), |
- 19 044279
-NHC(=O)CH2I,
-NHC(=O)CH2Br,
-C(=O)NHNH2, . -CO2H, -NH2,
R7 I N
-NR7S(=O)2(CH=CH2), -NR7C(=O)CH2Br, -NR7C(=O)CH2I,
R34 представляет собой -N3, -ONH2, -NR7C(=O)CH=CH2, -C(=O)NHNH2, -CO2H, -NH2, р F
R24 представляет собой о или
О’
- 20 044279
R44 представляет собой -NR7C(=O)CH2R8;
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6-алкила;
R8 представляет собой -S(CH2)nCHR9NH2;
R9 представляет собой -C(=O)OR7;
каждый R10 независимо выбран из Н, С1-С6-алкила, F, Cl и -OH;
каждый R11 независимо выбран из Н, C1-C6-алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN,
-NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Н, C1-6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1-4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и С1-4алкила, замещенного C(=O)OH;
R13 представляет собой 2-пиридил или 4-пиридил;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый р независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
В другом аспекте фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство по настоящему изобретению, представляет собой соединение, имеющее структуру формулы (В), или его стереоизомеры или фармацевтически приемлемые соли,
где R54 представляет собой -L6R14, -L7R24, -L7R34 или -L8R44;
X представляет собой S(=O), S(=O)2 или S;
R5 представляет собой Н, -СН3 или -CD3;
R6 или -NH2 или -OH;
L6 представляет собой -((CH^mO^CH^mX^-, -((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-,
- L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-, -L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mX2L4—, -((CH2)mO)p(CH2)m-, -(CH2)m—, -(CH2)mX1(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m—, —(CH2)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)m—, -((CH2)mO)p(CH2)mNHC(=O)(CH2)m, —((CH2)mO)pCH2)mC(=O)NH(CH2)m—, -(CH2)mC(R7)2- или
- (CH2)mC(R7)2SS(CH2)mNHC(=O)(CH2)m—;
L7 представляет собой -((CH2)mO)p(CH2)m-, -(CH2)mX1(CH2)m-, -L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)m—, - L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, —(CH2)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)m—, -((CH2)mO)p(CH2)mNHC(=O)(CH2)m, -(№0),^^^ —(СВД^ или
- (CH2)mC(R7)2SS(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-;
L8 представляет собой -((CH2)mO)p(CH2)mX1L4—, —((CH2)mO)p(CH2)mX2L4—,
- L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-, -L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -((CH2)mO)p(CH2)m-, -(CH2)m-, -(CH2)mX1(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, (CH2)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -((CH2)mO)p(CH2)mNHC(=O)(CH2)m, —((CH2)mO)pCH2)mC(=O)NH(CH2)m—, -(CH2)mC(K7)2- или
- (CH2)mC(R7)2SS(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-;
L4 представляет собой -(CH2)m-;
X1 представляет собой
- 21 044279
* указывает на точку присоединения к L4;
представляет собой
R11
Х2
R
R'
или N 1 ’ / где * указывает на точку присоединения к L4;
О
R14 представляет -NR7S(=O)2(CH=CH2),
-C(=O)NHNH2, ' -N3, -ONH2, -NR7C(=O)CH=CH2, SH, -SSR13, -S(=O)2(CH=CH2),
-NHC(=O)CH2I,
-NR7C(=O)CH2Br, -NR7C(=O)CH2I, -NHC (=O)CH2Br, собой o
r -CO2H, -NH2,
- 22 044279
R24 представляет собой
-NR7C(=O)CH=CH2,
R34 представляет собой -N3, -ONH2,
-CO2H, -NH2,
-C(=O)NHNH2,
собой или
R44 представляет
-NR7C(=O)CH2R8;
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6алкила;
R8 представляет собой -S(CH2)nCHR9NH2;
R9 представляет собой -C(=O)OR7;
каждый R10 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl и -OH;
каждый R11 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Н, С1.6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1-4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и С1-4алкила, замещенного С(=О)ОН;
R13 представляет собой 2-пиридил или 4-пиридил;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый р независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Определенные аспекты и примеры фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство по настоящему изобретению, предусмотрены в следующем перечне дополнительных пронумерованных вариантов осуществления. Следует понимать, что признаки, указанные в каждом варианте осуществления, можно объединять с другими указанными признаками с получением дополнительных вариантов осуществления настоящего изобретения.
Вариант осуществления 1. Соединение формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль, имеющее структуру формулы (А-1) или ее фармацевтически приемлемой соли:
R' где R4 является таким, как определено выше.
Формула (А-1),
- 23 044279
Вариант осуществления 2. Соединение формулы (А) или его фармацевтически приемлемая имеющее структуру формулы (А-2) или формулы (А-3) или их фармацевтически приемлемой соли:
соль,
Формула (А—2), (А-3) , где L5 и R14 являются такими, как определено выше.
Вариант осуществления 3. Соединение формулы (А) или его фармацевтически приемлемая имеющее структуру формулы (А-1а) или ее фармацевтически приемлемой соли:
соль,
Формула (А-1а), где R4 является таким, как определено выше.
Вариант осуществления 4. Соединение формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль, имеющее структуру формулы (А-2а) или формулы (А-3а) или их фармацевтически приемлемой соли:
где L5 и R14 являются такими, как определено выше.
Вариант осуществления 5. Соединение формулы (А), формулы (А-1) или формулы (А-1a) или его фармацевтически приемлемая соль, где:
L1 -(CH2)m-,
R4 представляет собой -L1R14, -L2R24, -L2R34 или -L3R представляет собой -((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-, ;
-((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -((CH2)mO)p(CH2)m-,
-X3X4C(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-, -X3X4C(=O)(CH2)m-, -X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-,
-X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-;
L2 представляет собой -((CH2)mO)p(CH2)m-;
L3 представляет собой -((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-, -((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -((CH2)mP)p(CH2)m-,
-(CH2)m-, -X3X4C(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-, -X3X4C(=O)(CH2)m-,
-X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-;
L4 представляет собой -(CH2)m-;
-X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-,
X1 представляет собой
- 24 044279 где * указывает на точку присоединения к L4;
собой
Х2 собой
Х3 представляет
представляет
где * указывает на точку присоединения к L4;
Х4 представляет собой
о
R14 представляет собой 0 , -N3, -ONH2, -NR7C(=O)CH=CH2, SH, -S(=O2(CH=CH2),
-NR7S(=O)2(CH=CH2), -NR7C(=O)CH2Br, -NR7C(=O)CH2I, -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -C(O)NHNH2,
-CO2H, -NH2,
- 25 044279
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6алкила;
R8 представляет собой -S(CH2)nCHR9NH2;
R9 представляет собой -C(=O)OR7;
каждый R10 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl и -OH;
- 26 044279 каждый R11 независимо выбран из H, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -CN,
-NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Η, С1.6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -С(=О)ОН, бензила, замещенного -С(=О)ОН, С|_4алкокси, замещенного -С(=О)ОН, и С|_4алкила, замещенного С(=О)ОН;
каждый ш независимо выбран из 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый р независимо выбран из 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 6. Соединение формулы (А), формулы (А-2), формулы (А-3), формулы (А2а) или формулы (A-За) или его фармацевтически приемлемая соль, где L4 представляет собой -(CH2)m-;
L5 представляет собой
-NHS(=O)2(CH2)mXiL4,
-NH((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -ХН((СН2)тО)р(СН2)т-или -NH(CH2)m-;
-NH((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-, представляет собой
Xl
О
(R12)l-2 n-n ' где * указывает на точку присоединения к L4;
собой р10 г, / рЮ ) т >
R11
R11
представляет
R
'где о * указывает на точку присоединения к L4;
R14 представляет собой °
-N3, -ONH2, -NR7C(=O)CH=CH2, sh,
-S(=O)2(CH=CH2),
-NR7S(=O)2(CH=CH2), -NR7C(=O)CH2Br, -NR7C(=O)CH2I, -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -C(O)NHNH2,
R7
N ° , -СО2Н, -NH2,
н
F
F и ОН ОО П I II II
Ж όίόι о
nh2
HO^|J HO'
-27044279
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6алкила;
каждый R10 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl и -OH;
каждый R11 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Н, С1-6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1-4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и C1-4алкила, замещенного C(=O)OH;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 7. Соединение формулы (А), формулы (А-1) или формулы (А-1a) или его фармацевтически приемлемая соль, где
R4 представляет собой -L1R14;
L1 представляет собой -((G^mO^C^^X^-, -((СН2)mO)p(СН2)m-или -(0¾%%
L4 представляет собой -(СН2)т-;
L5 представляет собой -NHS(=O)2(СН2)mX1L4;
X1 представляет собой ' где * указывает на точку присоединения к L4;
R14 представляет собой каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый р независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 8. Соединение формулы (А), формула (А-2), формулы (А-3), формулы (А2а) или формулы (А-3а) или его фармацевтически приемлемая соль, где
L4 представляет собой -(СН2)т-;
L5 представляет собой -NHS(=O)2(СН2)mX1L4;
N—
X1 представляет собой ' где * указывает на точку присоединения к L4;
- 28 044279
Вариант осуществления 10. Соединение формулы (В) или его фармацевтически приемлемая соль, имеющее структуру формулы (В-1) или ее фармацевтически приемлемой соли:
R14 представляет собой каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый р независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 9. Соединение формулы (А), выбранное из:
где R54, R5 и R6, являются такими, как определено выше.
Вариант осуществления 11. Соединение формулы (В) или его фармацевтически приемлемая соль, имеющее структуру формулы (В-1а) или ее фармацевтически приемлемой соли:
- 29 044279 где R54, R5 и R6, являются такими, как определено выше.
Вариант осуществления 12. Соединение формулы (В), формулы (В-1) или формулы (В-1a) или его фармацевтически приемлемая соль, где R54 представляет собой -L6R14, -L7R24, -L7R34 или -L8R44;
R5 представляет собой Н, -СН3 или -CD3;
R6 или -NH2 или -OH;
L6 представляет собой -((СН2)mO)p(CH2)mX1L4-, -((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-,
-L4NHC(=O)NH((СН2)mO)р(СН2)mX1L4-, -L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -((СН2)mO)p(CH2)m- или -(СН2)т-;
L7 представляет собой -((СН2)mO)p(СН2)m-;
L8 представляет собой -((СН2)mO)p(CH2)mX1L4-, -((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -((CH2)mO)p(CH2)m-, -(СН2)m-; L4 представляет собой -(СН2)m-;
L4 представляет собой -(СН2)m-;
R14 представляет собой
указывает на точку присоединения к L4;
-S(=O)2(CH=CH2),
-N3, -ONH2, -NR7C (=O) СН=СН2, SH,
-NR7S(=O)2(CH=CH2), -NR7C(=O)CH2Br, NR7C(=O)CH2I, -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -C(O)NHNH2,
' -CO2H, -NH2,
- 30 044279
или
каждый R7 независимо выбран из H и С1-Сб-алкила;
R8 представляет собой -S(CH2)nCHR9NH2;
R9 представляет собой -C(=O)OR7;
каждый R10 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl и -OH;
- 31 044279 каждый R11 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN,
-NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Н, С1-6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1-4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и C1-4алкила, замещенного C(=O)OH;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый р независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 13. Соединение формулы (В), формулы (В-1) или формулы (В-1a) или его фармацевтически приемлемая соль, где R54 представляет собой -L6R14;
R5 представляет собой -СН3;
R6 представляет собой -NH2;
L6 представляет собой -((СН2)mO)p(CH2)mX1L4-, -((CH2)mO)p(CH2)m-,
-L4NHC(=O)NH((СН2)mO)р(СН2)mX1L4-, -L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -(СНХ-;
L4 представляет собой -(СН2)m-;
*
N
Х1 представляет собой ' где * указывает на точку присоединения к L4;
R14 представляет собой каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый р независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 14. Соединение формулы (В), выбранное из:
В другом аспекте фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство по настоящему изобретению, выбран из:
- 32 044279
В другом аспекте фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство по настоящему изобретению, выбран из:
Конгьюгаты антитела и лекарственного средства.
В настоящем изобретении предусмотрены конъюгаты антитела и лекарственного средства, где антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT, соединены с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство (например, цитотоксическое средство), необязательно через линкер. В одном аспекте антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') соединены посредством ковалентной связи за счет линкера с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, которое представляет собой цитотоксическое средство.
Конъюгаты антитела и лекарственного средства могут селективно доставлять цитотоксическое средство к клеткам, экспрессирующим cKIT, например, гемопоэтическим стволовым клеткам, тем самым
- 33 044279 селективно разрушая эти клетки у пациента, например, реципиента трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Предпочтительно конъюгаты антитела к cKIT и лекарственного средства характеризуются коротким периодом полувыведения и будут выводиться из кровяного русла пациента, поэтому их можно применять для кондиционирования реципиентов трансплантации гемопоэтических стволовых клеток до трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
В некоторых вариантах осуществления конъюгаты антитела к cKIT и лекарственного средства, раскрытые в данном документе, модифицированы, чтобы характеризоваться сниженной способностью индуцировать дегрануляцию мастоцитов, даже будучи сшитыми и/или мультимеризованными в более крупные комплексы. Например, конъюгаты антитела к cKIT и лекарственного средства, раскрытые в данном документе, модифицированы, чтобы характеризоваться сниженной способностью индуцировать дегрануляцию мастоцитов, то есть она снижена на приблизительно или по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% в сравнении с полноразмерным антителом к cKIT, фрагментом F(ab')2 или F(ab)2 или их конъюгатом, даже будучи сшитыми и/или мультимеризованными в более крупные комплексы. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты антитела к cKIT и лекарственного средства, раскрытые в данном документе, могут содержать фрагмент Fab или Fab' к cKIT. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты антитела к cKIT и лекарственного средства, раскрытые в данном документе, могут характеризоваться минимальной активностью индуцирования дегрануляции мастоцитов, например, скорректированной по исходному уровню регистрируемой величиной O.D., составляющей менее 0,25, например, менее 0,2, менее 0,15 или менее 0,1, в анализе высвобождения гексозаминидазы, даже будучи сшитыми и/или мультимеризованными в более крупные комплексы.
В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены конъюгаты, содержащие фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT (Fab или Fab' к cKIT), соединенный с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство (например, цитотоксическое средство), необязательно через линкер. Как описано в данном документе, такие конъюгаты Fab' или Fab к cKIT и токсина могут разрушать человеческие клетки HSC in vitro и in vivo, но не вызывают дегрануляцию мастоцитов, даже будучи сшитыми и/или мульмеризованными в более крупные комплексы.
В одном аспекте раскрытия предусмотрен конъюгат формулы (I):
A-(LB-(D)n)y Формула (I), где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека;
LB представляет собой линкер;
D представляет собой цитотоксическое средство;
n составляет целое число от 1 до 10, и y составляет целое число от 1 до 10, где фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство (LB-(D)n), ковалентно присоединен к фрагменту антитела (А).
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на конъюгат формулы (II):
а2—s—ч __2=N—о—LB-(D)n
Ai Формула (II);
А1 представляет собой фрагмент (например, Fab или Fab') или цепь антитела (например, НС или LC), которые специфически связываются с cKIT человека;
А2 представляет собой фрагмент (например, Fab или Fab') или цепь антитела (например, НС или LC), которые специфически связываются с cKIT человека;
LB представляет собой линкер;
D представляет собой цитотоксическое средство, и n составляет целое число от 1 до 10, где фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство (LB-(D)n), ковалентно спаривает фрагменты антитела А1 и А2.
В одном аспекте один из нескольких фрагментов, представляющих собой лекарственные средства D, в конъюгатах формулы (I) и формулы (II) независимо выбран из ауристатина, аманитина, майтанзиноида и сапорина.
В другом аспекте один из нескольких фрагментов, представляющих собой лекарственные средства D, в конъюгатах формулы (I) независимо выбраны из ауристатина и аманитина.
В конъюгатах формулы (I) один или несколько фрагментов, представляющих собой линкерлекарственное средство (LB-(D)n), могут быть ковалентно присоединены к фрагменту антитела, А (например Fab или Fab'), тем самым соединяя ковалентной связью один или несколько фрагментов, представляющих собой лекарственные средства D, с фрагментом антитела А (например Fab или Fab') через линкер LB. LB представляет собой любой химический фрагмент, который способен соединить фрагмент антитела, А (например, Fab или Fab') с одним или несколькими фрагментами, представляющими собой
- 34 044279 лекарственные средства D. Конъюгаты формулы (I), где один или несколько фрагментов, представляющих собой лекарственные средства D, ковалентно связаны с фрагментом антитела А (например Fab или Fab'), могут быть образованы с применением реагента на основе бифункционального или мультифункционального линкера, имеющего одну или несколько реакционноспособных функциональных групп, которые являются одинаковыми или различными. Одну из реакционноспособных функциональных групп реагента на основе бифункционального или мультифункционального линкера применяют для осуществления реакции с группой на фрагменте антитела, А, в качестве примера, тиольной или аминной (например, на цистеине, N-конце или боковой цепи аминокислоты, такой как лизин), с образованием ковалентной связи с одним концом линкера LB. Такие реакционноспособные функциональные группы реагента на основе бифункционального или мультифункционального линкера включают без ограничения малеимидную, тиольную и NHS-сложноэфирную. Другую реакционноспособную функциональную группу или группы реагента на основе бифункционального или мультифункционального линкера применяют для ковалентного присоединения одного или нескольких фрагментов, представляющих собой лекарственные средства D, к линкеру LB.
В конъюгатах формулы (II) кетоновый мостик образуется за счет реакции боковых тиолов на фрагментах антитела А1 и А2 и 1,3-дигалогенацетона, такого как 1,3-дихлорацетон, 1,3-дибромацетон, 1,3дийодацетон и биссульфонатные сложные эфиры 1,3-дигидроксиацетона, который тем самым ковалентно спаривает фрагменты антитела А1 и А2. Данный фрагмент, представляющий собой кетоновый мостик, применяют для ковалентного присоединения одного или нескольких фрагментов, представляющих собой лекарственные средства D, к фрагментам антитела A1 и А2 через линкер LB. LB представляет собой любой химический фрагмент, который способен соединить фрагмент антитела, A1 и А2, с одним или несколькими фрагментами, представляющими собой лекарственные средства D. Конъюгаты формулы (II), где один или несколько фрагментов, представляющих собой лекарственные средства D, ковалентно связаны с фрагментами антитела A1 и А2, могут быть образованы с применением реагента на основе бифункционального или мультифункционального линкера, имеющего одну или несколько реакционноспособных функциональных групп, которые являются одинаковыми или различными. В одном варианте осуществления одна из реакционноспособных функциональных групп реагента на основе бифункционального или мультифункционального линкера представляет собой алкоксиамин, который применяют для осуществления реакции с кетоновым мостиком с образованием оксимной связи с одним концом линкера LB, а другую реакционноспособную функциональную группу или группы реагента на основе бифункционального или мультифункционального линкера применяют для ковалентного присоединения одного или нескольких фрагментов, представляющих собой лекарственные средства D, к линкеру LB. В другом варианте осуществления одна из реакционноспособных функциональных групп реагента на основе бифункционального или мультифункционального линкера представляет собой гидразин, который применяют для осуществления реакции с кетоновым мостиком с образованием гидразоновой связи с одним концом линкера LB, а другую реакционноспособную функциональную группу или группы реагента на основе бифункционального или мультифункционального линкера применяют для ковалентного присоединения одного или нескольких фрагментов, представляющих собой лекарственные средства D, к линкеру LB.
В одном аспекте LB представляет собой расщепляемый линкер. В другом аспекте LB представляет собой нерасщепляемый линкер. В некоторых аспектах LB представляет собой кислотолабильный линкер, фотолабильный линкер, расщепляемый пептидазами линкер, расщепляемый эстеразами линкер, расщепляемый гликозидазами линкер, расщепляемый фосфодиэстеразами линкер, линкер с восстанавливаемой дисульфидной связью, гидрофильный линкер или линкер на основе дикарбоновой кислоты.
В другом аспекте фрагмент, представляющий собой лекарственное средство (D), представляет собой белковый токсин, выбранный из сапорина, противовирусного белка лаконоса (PAP), бриодина 1, буганина, гелонина, рицина, абрина, лектина омелы, модекцина, волкенсина, аспарина, момордина, эбулина, вискумина, шигатоксина, дифтерийного токсина (DT) или экзотоксина Pseudomonas (РЕ). Такие белковые токсины способны приводить к цитолизу клеток за счет инактивации рибосомы или ингибирования синтеза белков путем нарушения функции фактора элонгации 2 (EF2) (см. Kreitman et al., Immunotoxins for targeted cancer therapy, The AAPS Journal 2006; 8 (3) Article 63; Gadadhar and Karande, Targeted Cancer Therapy: History and Development of Immunotoxins, Глава 1 в Resistance to Immunotoxins in Cancer Therapy, pp 1-31). В некоторых вариантах осуществления белковый токсин представляет собой сапорин. Белковый токсин может быть присоединен фрагменту антитела к cKIT (А) ковалентно через расщепляемый или нерасщепляемый линкер (LB). В некоторых вариантах осуществления белковый токсин соединен с фрагментом антитела к cKIT через дисульфидную или тиоэфирную связь.
Хотя в конкретной молекуле конъюгата отношение лекарственного средства к антителу имеет точное целочисленное значение (например, произведение n и у в формуле (I) и n в формуле (II)), известно, что зачастую значение будет представлять собой среднее значение, когда его применяют для описания образца, содержащего множество молекул, вследствие некоторой степени неоднородности, обычно сопряженной со стадией конъюгации. Средняя нагрузка для образца конъюгата обозначается в данном документе как отношение лекарственного средства к антителу (или Fab') или DAR. В некоторых аспектах DAR составляет от приблизительно 1 до приблизительно 5, и обычно составляет приблизительно 1, 2, 3
- 35 044279 или 4. В некоторых аспектах по меньшей мере 50% образца по весу составляет соединение, характеризующееся средним DAR плюс или минус 2, и предпочтительно по меньшей мере 50% образца составляет конъюгат, который подразумевает среднее DAR плюс или минус 1. Другие аспекты включают конъюгаты, в которых DAR составляет приблизительно 2. В некоторых аспектах DAR, составляющее приблизительно y, означает, что измеренное значение DAR находится в пределах 20% от произведения n и y в формуле (I). В некоторых аспектах DAR, составляющее приблизительно n, означает, что измеренное значение DAR находится в пределах 20% от n в формуле (II).
В одном аспекте среднее молярное отношение лекарственного средства к фрагменту антитела (Fab или Fab') в конъюгатах формулы (I) (т. е. среднее значение произведения n и у, также известное как отношение лекарственного средства к антителу (DAR)) составляет от приблизительно 1 до приблизительно 10, от приблизительно 1 до приблизительно 6 (например, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0), от приблизительно 1 до приблизительно 5, от приблизительно 1,5 до приблизительно 4,5 или от приблизительно 2 до приблизительно 4.
В одном аспекте среднее молярное отношение лекарственного средства к фрагментам антитела А1 и А2 в конъюгатах формулы (II) (т. е. среднее значение n, также известное как отношение лекарственного средства к антителу (DAR)) составляет от приблизительно 1 до приблизительно 10, от приблизительно 1 до приблизительно 6 (например, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0), от приблизительно 1 до приблизительно 5, от приблизительно 1,5 до приблизительно 4,5 или от приблизительно 2 до приблизительно 4.
В одном аспекте предусмотренный в настоящем изобретении конъюгат характеризуется в значительной степени высокой чистотой и имеет один или несколько из следующих признаков: (а) более приблизительно 90% (например, больше или равно приблизительно 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%), предпочтительно более приблизительно 95% разновидностей конъюгата являются мономерными, (b) уровень неконъюгированного линкера в препарате конъюгата составляет менее приблизительно 10% (например, меньше или равно приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0%) (относительно общего количества линкера), (с) менее 10% молекул конъюгата являются сшитыми (например, менее или равно приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0%), (d) уровень свободного лекарственного средства (например, ауристатина, аманитина, майтанзиноида или сапорина) в препарате конъюгата составляет менее приблизительно 2% (например, меньше или равно приблизительно 11,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 или 0%) (моль/моль относительно общего количества цитотоксического средства).
В одном аспекте конъюгаты по настоящему изобретению имеют структуру формулы (С):
где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека; y составляет целое число от 1 до 10; R2 представляет собой С1-С6алкил; L20 представляет собой -L1R40;
L1 представляет собой -((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-, -((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -((CH2)mO)p(CH2)m-,
-(CH2)m-, -(CH2)mX1(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -((CH2)mO)p(CH2)mNHC(=O)(CH2)m, -((CH2)mO)pCH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -X3X4C(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-, -X3X4C(=O)(CH2)m-, -X3C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)m-, -X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-, -(CH2)mC(R7)2-, -(CH2)mC(R7)2SS(CH2)mNHC(=O)(CH2)m- или
-(CH2)mX3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-;
L4 представляет собой -(CH2)m;
X1 представляет собой
- 36 044279
* указывает на точку присоединения к L4;
собой
' где * указывает на точку присоединения к L4;
собой
Х3 представляет о он о он
Х4 представляет собой
R40 представляет собой
-NR7C(=O)CH2-,
-NHC(=O)CH2-, -S(=O)2CH2CH2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2-, -NR7S(=O)2CH2CH2, -NR7C(=O)CH2CH2-, -NH-,
-С(=О)-, -NHC(=O)-, -CH2NHCH2CH2-, -NHCH2CH2-, -S-,
- 37 044279
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6алкила;
каждый R10 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl и -OH;
каждый R11 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN,
-NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Н, С1-6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1-4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и C1-4алкила, замещенного С(=О)ОН;
каждый R15 независимо выбран из Н, -СН3 и фенила;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
В другом аспекте конъюгаты по настоящему изобретению имеют структуру формулы (D):
где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека; y составляет целое число от 1 до 10;
R1 представляет собой
R2 представляет собой С1-С6алкил;
L30 представляет собой -L5R40;
L4 представляет собой -(СН2)Ш;
- 38 044279
L5 представляет собой -NHS^O^^^^, -ХН((СН2)тО)р(СН2)тХЖ—,
-NH((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -NH((CH2)mO)p(CH2)m-, -NH(CH2)m-, -NH(CH2)mX1(CH2)m—,
-NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -NH(CH2)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-,
-NH((CH2)mO)p(CH2)mNHC(=O)(CH2)m, -NH((CH2)mO)pCH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -NH(CH2)nC(R7)2-,
-NH(CH2)mC(R7)2SS(CH2)mNHC(=O)(CH2)m- или -NH(CH2)mX3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-;
R11 собой
R'
X1 представляет
где * указывает на точку присоединения к L4;
X2
R'
представляет R11
N или собой
* указывает на точку присоединения к L4;
собой
Х3 представляет
Х4 представляет собой
- 39 044279
R40 представляет собой ' -NR7C(=O)CH2-,
-NHC(=O)CH2-, -S(=O)2CH2CH2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2-, -NR7S(=O)2CH2CH2, -NR7C(=O)CH2CH2-, -NH-,
-C(=O)-, -NHC(=O)-, -CH2NHCH2CH2-, -NHCH2CH2-, -S-,
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6алкила;
каждый R10 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl и -OH;
каждый R11 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 и -OH;
- 40 044279 каждый R12 независимо выбран из Н, С1-6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1-4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и C1-4алкила, замещенного C(=O)OH;
каждый R15 независимо выбран из Н, -СН3 и фенила;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
В другом аспекте конъюгаты по настоящему изобретению имеют структуру формулы (Е):
где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека; y составляет целое число от 1 до 10;
X представляет собой S(=O), S(=O)2 или S;
R5 представляет собой Н, -СН3 или -CD3;
R6 представляет собой -NH2 или -OH;
L40 представляет собой -L6R40;
L6 представляет собой -((СН2)mO)p(CH2)mX1L4-, -((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-,
-L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-, -L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -((CH2)mO)p(CH2)m-, -(CH2)m-, -(CH2)mX1(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-, -(CH2)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)m-, -((CH2)mO)p(CH2)mNHC(=O)(CH2)m, -((CH2)mO)pCH2)mC(=O)NH(CH2)m-, W,» или (CH2)mC(R7)2SS(CH2)mNHC(=O)(CH2)m-;
L4 представляет собой -(CH2)m;
- 41 044279
R40 представляет собой
A -NR7C(=O)CH2-,
-NHC(=O)CH2-, -S(=O)2CH2CH2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2-, -NR7S(=O)2CH2CH2, -NR7C(=O)CH2CH2-, -NH-,
-C(=O)-, -NHC(=O)-, -CH2NHCH2CH2-, -NHCH2CH2-, -S-,
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6алкила;
каждый R10 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl и -OH;
каждый R11 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Н, С1-6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1-4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и C1-4алкила, замещенного С(=О)ОН;
каждый R15 независимо выбран из Н, -СН3 и фенила;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Определенные аспекты и примеры конъюгатов согласно настоящему изобретению предусмотрены в следующем перечне дополнительных пронумерованных вариантов осуществления. Следует понимать, что признаки, указанные в каждом варианте осуществления, можно объединять с другими указанными признаками с получением дополнительных вариантов осуществления настоящего изобретения.
Вариант осуществления 15. Конъюгат, имеющий структуру формулы (С), представляет собой конъюгат, имеющий структуру формулы (С-1):
- 42 044279
где А, у, и L20 являются такими, как определено выше.
Вариант осуществления 16. Конъюгат, имеющий структуру формулы (С) или формулы (С-1), где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека;
у составляет целое число от 1 до 10; L20 представляет собой -L1R40;
L1 представляет собой -((CH^O^CH)^^-, -((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -((CH2)mO),(CH2)m-, -(CH2)m-, -ХзХ4С(=О)((СН2)тО)р(СН2)т—, —ХзХ4С(=О)(СН2)т—, -X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)(CH2)m—, -X3C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m-;
L4 представляет собой -(CH2)m;
собой
X1 представляет
собой где * указывает на точку присоединения к L4;
Х2 представляет
где * указывает на точку присоединения к L4;
собой
Х3 представляет
- 43 044279
Х4 представляет собой
R40 представляет собой ' -NR7C(=O)CH2-,
-NHC(=O)CH2-, -S(=O)2CH2CH2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2-, -NR7S(=O)2CH2CH2, -NR7C(=O)CH2CH2-, -NH-,
-C(=O)-, -NHC(=O)-, -CH2NHCH2CH2-, -NHCH2CH2-, -S-,
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6алкила;
каждый R10 независимо выбран из Н, C1-C6-алкила, F, Cl и -OH;
каждый R11 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Н, С1.6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1.4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и C1.4aлкилa, замещенного С(=О)ОН;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 17. Конъюгат, имеющий структуру формулы (С) или формулы (С-1), где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с
- 44 044279 cKIT человека;
у составляет целое число от 1 до 10;
L20 представляет собой -L1R40;
Li представляет собой -((CH2)mO)p(CH2)mXiL4-, ((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -((CH2)mO)p(CH2)m- или -(CH2)m-;
L4 представляет собой -(CH2)m;
представляет собой
Xi
R11
R
ИЛИ
N / где * указывает на точку присоединения к L4;
представляет собой
Х2
N'l или
R40 представляет собой ' где * указывает на точку присоединения к L4;
f -NR7C(=O)CH2-,
-NHC(=O)CH2-, -S(=O)2CH2CH2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2-, -NR7S(=O)2CH2CH2, -NR7C(=O)CH2CH2-, -NH-,
-C(=O)-, -NHC(=O)-, -CH2NHCH2CH2-, -NHCH2CH2-, -S-,
- 45 044279
R11
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6алкила;
каждый R10 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl и -OH;
каждый R11 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Н, С1-6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1-4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и C1-4алкила, замещенного С(=О)ОН;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 18. Конъюгат, имеющий структуру формулы (С) или формулы (С-1), где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека;
y составляет целое число от 1 до 10;
L20 представляет собой -L1R40;
L1 представляет собой -((G^mO^C^mX^-, -((СН2)mO)p(СН2)m- или -(G^m-;
L4 представляет собой
X1 представляет собой (CH2)m;
* < J > где * указывает на точку присоединения к L4;
R40 представляет собой каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 19. Конъюгат, имеющий структуру формулы (G) или формулы (С-1), выбранный из:
- 46 044279
20. Конъюгат, имеющий структуру формулы (D), представляет собой
Вариант осуществления конъюгат, имеющий структуру формулы (D-1) или формулы (D-2):
Формула (D-1),
где А, у и L30 являются такими, как определено выше.
Вариант осуществления 21. Конъюгат, имеющий структуру формулы (D), представляет собой конъюгат, имеющий структуру формулы (D-1a) или формулы (D-2a):
- 47 044279
где А, у и L30 являются такими, как определено выше.
Вариант осуществления 22. Конъюгат, имеющий структуру формулы (D), формулы (D-1), формулы (D-2), формулы (D-1a) или формулы (D-2a), где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека;
y составляет целое число от 1 до 10;
L30 представляет собой -L5R40;
L4 представляет собой -(СН2)m;
L5 представляет собой
-NHS(=O)2(CH2%XiL4,
-NH((CH2)mO)p(CH2%X2L4-, -NH((CH2%O)p(CH2)m-™ -NH(CH2%-;
-NH((CH2%O)p(CH2)mX1L4-, представляет собой
R'
R
X1
R’
R'
или
Х2
представляет R11 собой ' где * указывает на точку присоединения к L4;
r40 представляет собой
ИЛИ ’ где * указывает на точку присоединения к L4;
-NR7C(=O)CH2-,
-NHC(=O)CH2-, -S(=O)2CH2CH2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2-, -NR7S(=O)2CH2CH2, -NR7C(=O)CH2CH2-, -nh-,
-C(=O)-, -NHC(=O)-, -CH2NHCH2CH2-, -NHCH2CH2-, -s-,
- 48 044279
R11
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6алкила;
каждый R10 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl и -OH;
каждый R11 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Н, С1-6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1-4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и C1-4αлкила, замещенного C(=O)OH;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 23. Конъюгат, имеющий структуру формулы (D), формулы (D-1), формулы (D-2), формулы (D-1a) или формулы (D-2a), где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека;
y составляет целое число от 1 до 10;
L30 представляет собой -L5R40;
L4 представляет собой -(СН2)m;
L5 представляет собой -NHS(=O)2(СН2)mX1L4, -NH((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-,
-NH((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -NH((CH2)mO)p(CH2)m-или -NH(CH2)m-;
X1 представляет R11 о Ax W .<v Апл A d1 1 A/ ИЛИ Х2 представляет | R ΛθχΟ * * I nA/ An V A Aki \ J (YU A ( T > ,ΑΑ A r - A x An R11 X собой · ' --- ' ' (^1-2 N' , где * указывает на точку присоединения к L4; R11 , р 10 г, , । /X. % ΑΑν rN* AAv-nx А А \ X > ί X ы АА А An A An h X собой ' ' ' |
- 49 044279
-NHC(=O)CH2-, -S(=O)2CH2CH2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2-, -NR7S(=O)2CH2CH2, -NR7C(=O)CH2CH2-, -NH-,
-C(=O)-, -NHC(=O)-, -ch2nhch2ch2-, -nhch2ch2-, -S-,
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6алкила;
каждый R10 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl и -OH;
каждый R11 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Н, С1-6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1-4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и C1-4алкила, замещенного C(=O)OH;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 24. Конъюгат, имеющий структуру формулы (D), формулы (D-1), формулы (D-2), формулы (D-1a) или формулы (D-2a), где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека;
y составляет целое число от 1 до 10;
L30 представляет собой -L5R40;
L4 представляет собой -(СН2)m;
L5 представляет собой -NHS(=O)2(СН2)mX1L4;
- 50 044279
X1 представляет собой ' где * указывает на точку присоединения к L4;
R40 представляет собой каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 25. Конъюгат, имеющий структуру формулы (D), формулы (D-1), формулы (D-2), формулы (D-1a) или формулы (D-2a), выбранный из:
Конъюгат, имеющий структуру формулы
Вариант осуществления 26.
(Е), представляет собой конъюгат, имеющий структуру формулы (Е-1):
- 51 044279
A
Формула (E-l), где А, у, R5, R6 и L4o являются такими, как определено выше.
Вариант осуществления 27. Конъюгат, имеющий структуру формулы (Е), представляет собой конъюгат, имеющий структуру формулы (Е-1а):
A
Формула (Е-1а), где А, у, R5, R6 и L40 являются такими, как определено выше.
Вариант осуществления 28. Конъюгат, имеющий структуру формулы (Е), формулы (Е-1) или формулы (Е-1а), где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека;
y составляет целое число от 1 до 10;
R5 представляет собой Н, -СН3 или -CD3;
R6 представляет собой -NH2 или -OH;
L40 представляет собой -L6R40;
L6 представляет собой -((^^Ο^Η)^^-, -((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-,
-L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-, -L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2№ -((CH2)mO)p(CH2)m— или
-(CH2)m-;
- 52 044279 представляет собой
Х2
N'1 или
R40 представляет собой ' где * указывает на точку присоединения к L4;
f -NR7C(=O)CH2-,
-NHC(=O)CH2-, -S(=O)2CH2CH2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2-, -NR7S(=O)2CH2CH2, -NR7C(=O)CH2CH2-, -NH-,
-С(=О)-, -NHC(=O)-, -CH2NHCH2CH2-, -NHCH2CH2-, -S-,
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6алкила;
каждый R10 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl и -OH;
каждый R11 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN,
-NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Н, С1-6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1-4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и C1-4алкила, замещенного С(=О)ОН;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 29. Конъюгат, имеющий структуру формулы (Е), формулы (Е-1) или формулы (Е-1а), где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека;
y составляет целое число от 1 до 10;
R5 представляет собой Н, -СН3 или -CD3;
R6 представляет собой -NH2 или -OH;
L40 представляет собой -L6R40;
L6 представляет собой -((СЩ^О^СЩ^ХЖ-, -((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-,
-L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mX1L4-, -L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mX2L4-, -((CH2)mO)p(CH2)m- или -(CH2)m-;
L4 представляет собой -(CH2)m;
X1 представляет собой
R11
ИЛИ
* указывает на точку присоединения к L4;
- 53 044279 представляет R11 собой
Х2
R'
R40 или ' где * указывает на точку присоединения к L4;
г -NR7C(=O)CH2-, представляет собой
-NHC(=O)CH2-, -S(=O)2CH2CH2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2-, -NR7S(=O)2CH2CH2, -NR7C(=O)CH2CH2-, -NH-,
-C(=O)-, -NHC(=O)-, -CH2NHCH2CH2-, -NHCH2CH2-, -S-,
каждый R7 независимо выбран из H и С1-С6алкила;
каждый R10 независимо выбран из Н, C1-C6-алкила, F, Cl и -OH;
каждый R11 независимо выбран из Н, С1-С6алкила, F, Cl, -NH2, -ОСН3, -ОСН2СН3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 и -OH;
каждый R12 независимо выбран из Н, С1-6алкила, фтора, бензилокси, замещенного -C(=O)OH, бензила, замещенного -C(=O)OH, С1-4алкокси, замещенного -C(=O)OH, и C1-4алкила, замещенного С(=О)ОН;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 30. Конъюгат, имеющий структуру формулы (Е), формулы (Е-1) или формулы (Е-1а), где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека;
y составляет целое число от 1 до 10;
- 54 044279
R5 представляет собой -СН3;
R6 представляет собой -NH2; L40 представляет собой -L6R40;
L6 представляет собой -((CH^O^CH)^^-, -((CH2)mO)p(CH2)m-,
-L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mXiL4-, -L4NHC(=O)NH((CH2)mO)p(CH2)mX2L4- или -(CH2V;
L4 представляет собой -(CH2)m;
*
ΖΝ
X1 представляет собой ' где * указывает на точку присоединения к L4;
О — ЛЛЛЛЛАЛ
О // о I
КХ . КХ Ν'0 +у ж? а а
R40 представляет собой 0 · 0 ' о , X X или 11 ;
каждый m независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, и каждый p независимо выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Вариант осуществления 31. Конъюгат, имеющий структуру формулы (Е), формулы (Е-1) или формулы (Е-1а), выбранный из:
- 55 044279
В другом аспекте конъюгат антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению выбран из:
- 56 044279
- 57 044279
- 58 044279
где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, и y составляет целое число от 1 до 10.
В другом аспекте конъюгат антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению выбран из:
- 59 044279
где А представляет собой фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), который специфически свя- 60 044279 зывается с cKIT человека, и у составляет целое число от 1 до 10.
Синтез иллюстративных соединений линкер-лекарственное средство.
Пример 1. Синтез (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(2-(2,5-диоксо-2,5дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси)пропаноил)-2-азабицикло[2.2.1]гептан-3-карбоксамидо)-N,3диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3фенилпропановой кислоты (С1)
Стадия 1. К раствору BocVal-Dil-Dap-OH (1,00 г, 1,75 ммоль) в К,Х-диметилформамиде (DMF, 20,0 мл) при 0°С добавляли К,К-диизопропилэтиламин (DIEA, 0,677 г, 5,25 ммоль) и 1[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний 3-оксида гексафторфосфат (HATU) (0,731 г, 1,93 ммоль). Затем полученный раствор перемешивали в течение 5 мин и добавляли к раствору HCl-соли метилового сложного эфира L-фенилаланина (0,377 г, 1,75 ммоль) и DIEA (0,226 г, 1,75 ммоль) в DMF (5,0 мл) при 0°С. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение дополнительных 30 мин и затем концентрировали. Остаток очищали посредством HPLC с обращенной фазой с применением системы ISCO, колонка С18, элюировали с помощью 20-90% ацетонитрила в воде с получением BocVal-Dil-Dap-PheOMe: MS масса/заряд 733,4 (М+1); время удерживания 1,47 минуты.
Стадия 2. К раствору BocVal-Dil-Dap-PheOMe (0,683 г, 0,932 ммоль), полученному на стадии 1, в метаноле (20 мл) добавляли HCl (4 н. в 1,4-диоксане, 16 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 7 ч и концентрировали. Остаток растворяли в диоксане и лиофилизировали с получением HCl-соли Val-Dil-Dap-PheOMe: MS масса/заряд 633,4 (M+1); время удерживания 0,96 мин.
Стадия 3. (1R,3S,4S)-N-Boc-2-азαбицикло[2.2.1]гептан-3-карбоновую кислоту (12,6 мг, 0,052 ммоль) растворяли в DMF (1 мл) в 15-мл круглодонной колбе. Добавляли DIEA (12,3 мг, 0,095 ммоль) и HATU (19 мг, 0,050 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и добавляли HCl-соль Val-DilDap-PheOMe (30 мг, 0,090 ммоль) в DMF (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч. С помощью LCMS-анализа определили, что реакция завершена, и полученную смесь очищали посредством HPLC с обращенной фазой с применением колонки С18, элюировали с помощью 20-90% ацетонитрила в Н2О, содержащей 0,05% трифторуксусной кислоты (TFA). Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяли и концентрировали с получением (1R,3S,4S)-трет-бутил 3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-метокси-1((S)-2-(( 1 R,2R)-1 -метокси-3 -(((S)-1 -метокси-1 -оксо-3 -фенилпропан-2-ил)амино)-2-метил-3 оксопропил)пирролидин-1 -ил)-5 -метил-1 -оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3 -метил-1 -оксобутан-2ил)карбамоил)-2-азабицикло[2.2.1]гептан-2-карбоксилата: MS масса/заряд 856,6 (M+1); время удерживания 1,67 мин.
Стадия 4. Продукт, полученный на стадии 3, растворяли в дихлорметане (DCM) (2,0 мл) и обрабатывали с помощью TFA (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. LCMS-анализ показал, что реакция завершена. Реакционную смесь концентрировали с помощью роторного испарителя с получением (S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2азабицикло[2.2.1 ]гептан-3 -карбоксамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3 -метокси-5метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата в виде TFAсоли: MS масса/заряд 756,6 (M+1); время удерживания 1,22 мин.
Стадия 5. В 25-мл круглодонную колбу добавляли TFA-соль (S)-метил 2-((2R,3R)-3-((S)-1((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-азабицикло[2.2.1]гептан-3-карбоксамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата (38,4 мг, 0,044 ммоль), моногидрат LiOH (50,0 мг, 1,19 ммоль) и смесь растворителей МеОН-Н2О (2:1, 4,0 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 60 ч. С помощью LC-MS-анализа определили, что реакция завершена. Реакционную смесь концентрировали и очищали посредством HPLC с обращенной фазой, колонка С18, элюировали с помощью ацетонитрила в Н2О (10-70%), содержащей 0,05% TFA. Фракции, содержащие требуемый продукт объединяли и концентрировали с получением (S)-2((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-азабицикло[2.2.1]геπmан-3-карбоксамидо)-N,3диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3фенилпропановой кислоты в виде TFA-соли, MS масса/заряд 742,5 (M+1). Время удерживания 1,15 мин.
Стадия 6. К раствору 3-(2-(малеимидо)этокси)пропановой кислоты (2,2 мг, 0,010 ммоль) в DMF (1 мл) добавляли HATU (3,7 мг, 0,0098 ммоль) и DIEA (3,6 мг, 0,028 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 5 мин и затем добавляли (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2азабицикло[2.2.1 ]гептан-3 -карбоксамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3 -метокси-5метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту (8 мг, 0,0093 ммоль) в DMF (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при rt в течение 1 ч и затем концен- 61 044279 трировали и очищали посредством препаративной HPLC (10-60% ацетонитрила в Н2О, содержащей
0,05% TFA) с получением (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(2-(2,5-дuокCO-2,5дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси)пропаноил)-2-азабицикло[2.2.1]гептан-3-карбоксамидо)-N,3диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3фенилпропановой кислоты (C1). MS масса/заряд 937,5 (М+Н). Время удерживания 1,138 мин.
Пример 2. (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(( 1 R,3S,4S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Нпиррол-1-ил)гексаноил)-2-азабицикло[2.2.1]гептан-3-карбоксамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота (С2)
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дuгидро-1Н-пuррол-1ил)гексаноuл)-2-азαбицuкло[2.2.1]гептαн-3-карбоксамидо)-N,3-дuметилбутанамидо)-3-метокси-5метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановую кислоту (2) получали в соответствии со способом из примера 1, за исключением того, что на стадии 6 6-(2,5-диоксо2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановую кислоту (ЕМСА) (1,2 мг, 0,0058 ммоль) в DMF (1,0 мл) применяли вместо 3-(2-(малеимидо)этокси)пропановой кислоты. (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил)-2-азабицикло[2.2.1]гептан-3карбоксамидо)-N,3-диметилбутанαмидо)-3 -метокси-5 -метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3 -метокси-2метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота (2) MS масса/заряд 935,6 (M+1). Время удерживания 1,17 мин.
Пример 3. (1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1 -((S)-2-(( 1 R,2R)-3-(((S)-N-1 -(3-(4-((2,5-диоксо-2,5дигидро-1 Н-пиррол-1 -ил)метил)- 1Н-1,2,3-триазол-1 -ил)пропилсульфонамидо)-1 -оксо-3-фенилпропан-2ил)амино)-1 -метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3-метокси-5-метил-1 -оксогептан-4ил)(метил)амино)-3 -метил-1 -оксобутан-2-ил)-2-метил-2-азабицикло[2.2.1 ] гептан-3 -карбоксамид (С3)
Стадия 1. К перемешиваемому раствору азида натрия (3,50 г, 53,8 ммоль) в воде (25 мл) добавляли раствор 1,3-пропансульфона (6,10 г, 50,0 ммоль) в ацетоне (25 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч и концентрировали до сухого состояния. Полученное твердое вещество суспендировали в диэтиловом эфире (100 мл) и перемешивали с обратным холодильником в течение 1 ч. Суспензию охлаждали до комнатной температуры и твердое вещество собирали фильтрацией, промывали с помощью ацетона и диэтилового эфира и высушивали под вакуумом с получением 3азидо-1-пропансульфоновой кислоты. MS масса/заряд 188,1(M+1).
1H ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 3,47 (t, J=6,8 Гц, 2Н), 2,87 (t, J=7,6 Гц, 2Н), 2,07-2,00 (m, 2H).
Стадия 2. 3-азидо-1-пропансульфоновую кислоту (2,07 г, 13,0 ммоль) суспендировали в толуоле. Добавляли PCl5 (2,61 г, 13,0 ммоль). Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 3 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и фильтровали для удаления нерастворимых веществ. Осадок на фильтре промывали с помощью DCM. Объединенные фильтраты концентрировали с получением 3-азидопропан-1-сульфонилхлорида в виде темно-желтого масла, которое применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.
Стадия 3. К NH4OH (5 мл), охлажденному до 0°С, добавляли 3-азидопропан-1-сульфонилхлорид (1,75 г, 9,53 ммоль). Спустя 10 мин реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали при той же температуре в течение 3 ч. Маслянистая смесь стала прозрачной. Реакционную смесь трижды экстрагировали с помощью EtOAc. Органическую фазу промывали с помощью солевого раствора, высушивали над безводным MgSO4 и концентрировали. Остаточный растворитель дополнительно удаляли под высоким вакуумом в течение 18 ч с получением 3-азидопропан-1-сульфонамида. MS масса/заряд 187,1 (M+1). 1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 4,83 (s, 2Н), 3,51 (t, J=6,4 Гц, 2Н), 3,23 (t, J=7,6 Гц, 2Н), 2,17-2,10 (m, 2H).
Стадия 4. (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-фенилπроπановую кислоту (100 мг, 0,38 ммоль) растворяли в DMF (4 мл), с последующим добавлением DIEA (0,395 мл, 2,26 ммоль) и HATU (358 мг, 0,940 ммоль). Спустя 15 мин добавляли 3-азидопропан-1-сульфонамид (186 мг, 1,13 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч, при этом с помощью LCMS-анализа определили завершение реакции в это время. Затем полученную смесь очищали посредством HPLC с обращенной фазой с применением колонки С18, элюировали с помощью 10-90% ацетонитрила в Н2О, содержащей 0,05% TFA. Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяли и лиофилизировали с получением (S)-трет-бутил
- 62 044279 (1-(3-азидопропилсульфонамидо)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)карбамата. MS масса/заряд 312,1 (М+1Вос). Время удерживания 1,15 мины. Полученный таким образом продукт (72,4 мг, 0,176 ммоль) растворяли в 3 М метанольной HCl (5 мл). Растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток поглощали в ацетонитриле и Н2О и лиофилизировали с получением (S)-2-амино-N-((3-азидопропил)сульфонил)3-фенилпропанамида в виде розовато-желтоватого твердого вещества. MS масса/заряд 312,1 (M+1).
1H ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,42-7,31 (m, 5H), 4,16-4,13 (m, 1H), 3,51-3,47 (m, 4H), 3,32-3,26 (m, 1H), 3,13-3,08 (m, 1H), 2,00-1,94 (m, 2H).
Стадия 5. К Boc-Val-Dil-Dap-OH (195 мг, 0,34 ммоль), растворенному в DMF (4 мл), добавляли DIEA (132 мг, 1,02 ммоль) и HATU (108 мг, 0,28 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 15 минут при комнатной температуре перед добавлением (S)-2-амино-N-((3-азидопропил)сульфонил)-3фенилпропанамида (59,2 мг, 0,17 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение дополнительных 2 ч при комнатной температуре. А затем очищали посредством HPLC с обращенной фазой с получением требуемого продукта (95 мг, выход 65, MS масса/заряд 865,4 (M+1), время удерживания 1,43 мин). Продукт растворяли в 3 М HCl в МеОН (3 мл). Растворители удаляли под вакуумом. Затем к остатку добавляли ацетонитрил и Н2О и раствор лиофилизировали с получением требуемого продукта, (S)-1(((3R,4S,5S)-1 -((S)-2-(( 1 R,2R)-3-(((S)-N -1-(3 -азидопропилсульфонамидо)-1 -оксо-3 -фенилпропан-2ил)амино)-1 -метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3 -метокси-5-метил-1 -оксогептан-4ил)(метил)амино)-2-амино-3-метил-1-оксобутана. MS масса/заряд 765,4 (M+1). Время удерживания 1,04 мин.
Стадия 6. К (1R,3S,4S)-2-(трет-бутоксикарбонил)-2-азабицикло[2.2.1]гептан-3-карбоновой кислоте (16,5 мг, 0,068 ммоль) в DMF (2,0 мл) добавляли DIEA (17,6 мг, 0,137 ммоль) и HATU (21,6 мг, 0,057 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут перед добавлением (S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-азидопропилсульфонамидо)-1-оксо-3фенилпропан-2-ил)амино)-1 -метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3 -метокси-5-метил-1 оксогептан-4-ил)(метил)амино)-2-амино-3-метил-1-оксобутана (20 мг, TFA-соль, 0,023 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре, при этом с помощью LCMSанализа определили завершение реакции в это время. Затем полученную смесь очищали посредством HPLC с обращенной фазой с применением колонки С18, элюировали с помощью 10-90% ACN в Н2О, содержащей 0,05% TFA. Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяли и лиофилизировали с получением (1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-азидопропилсульфонамидо)1 -оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1 -метокси-2-метил-3 -оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3 -метокси-5метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)-2-(трет-бутоксикарбонил)-2азабицикло[2.2.1]гептан-3-карбоксамида. MS масса/заряд 988,5 (M+1). Время удерживания 1,51 мин. Полученный таким образом продукт (9,4 мг, 0,0095 ммоль) растворяли в метанольной HCl (3 М, 2,0 мл). Растворитель удаляли медленно при пониженном давлении. Остаток растворяли в ацетонитриле и Н2О и лиофилизировали с получением (1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3азидопропилсульфонамидо)-1 -оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1 -метокси-2-метил-3оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3-метокси-5-метил-1 -оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3 -метил-1 оксобутан-2-ил)-2-азабицикло[2.2.1]гептан-3-карбоксамида в виде HCl-соли. MS масса/заряд 888,5 (M+1). Время удерживания 1,10 мин.
Стадия 7. (1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3азидопропилсульфонамидо)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3-метокси-5-метил-1 -оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3 -метил-1 оксобутан-2-ил)-2-азабицикло[2.2.1]гептан-3-карбоксамид (8,8 мг, 0,0099 ммоль) растворяли в МеОН (2,0 мл). Добавляли параформальдегид (10,1 мг, 0,337 ммоль) и уксусную кислоту (0,0102 мл), а затем цианоборгидрид натрия (21,2 мг, 0,337 ммоль). Реакционную смесь нагревали при 50°С с перемешиванием в течение 1 ч. Добавляли дополнительный параформальдегид (10,1 мг, 0,337 ммоль), уксусную кислоту (0,0102 мл) и цианоборгидрид натрия (21,2 мг, 0,337 ммоль). Спустя 1 ч при 50°С с помощью LCMSанализа определили завершение реакции. Затем полученную смесь очищали посредством HPLC с обращенной фазой с применением колонки С18, элюировали с помощью 10-90% ACN в Н2О, содержащей 0,05% TFA. Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяли и лиофилизировали с получением (1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-азидопропилсульфонамидо)-1-оксо-3фенилпропан-2-ил)амино)-1 -метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3 -метокси-5-метил-1 оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)-2-метил-2-азабицикло[2.2.1]гептан-3карбоксамида. MS масса/заряд 902,5 (M+1). Время удерживания 1,12 мин.
Стадия 8. Раствор (1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3азидопропилсульфонамидо)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3-метокси-5-метил-1 -оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3 -метил-1 оксобутан-2-ил)-2-метил-2-азабицикло[2.2.1]гептан-3-карбоксамида (5,2 мг, 0,0058 ммоль), 1-(проп-2-ин1-ил)-1Н-пиррол-2,5-диона (1,56 мг, 0,012 ммоль) и CuSo4 (0,7 мг, 0,004 ммоль) в DMF (2,0 мл) и Н2О (0,5 мл) обрабатывали натриевой солью L-аскорбиновой кислоты (2,5 мг, 0,014 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли дополнительные CuSO4 (0,7 мг, 0,004 ммоль) и на- 63 044279 триевую соль L-аскорбиновой кислоты (2,5 мг, 0,014 ммоль). После дополнительных 2 ч при комнатной температуре с помощью LCMS-анализа определили завершение реакции. Затем полученную смесь очищали посредством HPLC с обращенной фазой с применением колонки С18, элюировали с помощью 1090% ацетонитрила в Н2О, содержащей 0,05% TFA. Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяли и лиофилизировали с получением (1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1 Н-пиррол-1 -ил)метил)-1Н-1,2,3-триазол-1 -ил)пропилсульфонамидо)-1 -оксо-3 фенилпропан-2-ил)амино)-1 -метокси-2-метил-3 -оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3 -метокси-5-метил-1 оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)-2-метил-2-азабицикло[2.2.1]гептан-3карбоксамида (С3). MS масса/заряд 1037,4 (M+1). Время удерживания 1,00 мин.
Пример 4. Синтез (S)-2-((бис(диметиламино)метилен)амино)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3(((S)-N-1 -(3 -(4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1 Н-пиррол-1 -ил)метил)-1Н-1,2,3-триазол-1 ил)пропилсульфонамидо)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3 -метокси-5 -метил-1 -оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1 оксобутана (С4)
Стадия 1. К перемешиваемому раствору азида натрия (3,5 г, 54 ммоль) в воде (25 мл) добавляли раствор 1,3-пропансульфона (6,1 г, 50 ммоль) в ацетоне (25 мл). Реакционную смесь перемешивали при rt в течение 24 ч и концентрировали. Полученное твердое вещество суспендировали в диэтиловом эфире (100 мл) и перемешивали с обратным холодильником в течение 1 ч. Суспензию охлаждали до rt. Твердое вещество собирали фильтрацией, промывали с помощью ацетона и диэтилового эфира и высушивали под вакуумом с получением 3-азидо-1-пропансульфоновой кислоты. MS масса/заряд 188,1 (М+23).
1H ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 3,47 (t, J=6,8 Гц, 2Н), 2,87 (t, J=7,6 Гц, 2Н), 2,07-2,00 (m, 2H).
Стадия 2. 3-азидо-1-пропансульфоновую кислоту (2,07 г, 13 ммоль) суспендировали в толуоле. Добавляли PCl5 (2,61 г, 13 ммоль). Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 3 ч. Реакционную смесь охлаждали до rt. Нерастворимые вещества удаляли фильтрацией и промывали с помощью DCM. Объединенный фильтрат концентрировали с получением 3-азидопропан-1-сульфонилхлорида в виде желто-коричневого масла, которое применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.
Стадия 3. NH4OH (28, 5 мл) охлаждали до 0°С. Добавляли 3-азидопропан-1-сульфонилхлорид (1,75 г, 9,53 ммоль). Спустя 10 мин реакционную смесь нагревали до rt и затем перемешивали в течение 3 ч при rt. Две фазы становились однородными. Реакционную смесь трижды экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические фазы промывали с помощью солевого раствора, высушивали над MgSO4 и концентрировали на роторном испарителе, а затем с применением высокого вакуума в течение 18 ч с получением 3-азидопропан-1-сульфонамида. MS масса/заряд 187,1 (М+23).
1H ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 4,83 (s, 2H), 3,51 (t, J=6,4 Гц, 2Н), 3,23 (t, J=7,6 Гц, 2Н), 2,17-2,10 (m, 2H).
Стадия 4. (S)-2-((трет-бутоксuкарбонил)амuно)-3-фенилпропановую кислоту (100 мг, 0,38 ммоль) растворяли в DMF (4 мл). Добавляли DIEA (0,395 мл, 2,26 ммоль) и HATU (358 мг, 0,94 ммоль). Спустя 15 мин добавляли 3-азидопропан-1-сульфонамид (186 мг, 1,13 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч. С помощью LCMS определили завершение реакции. Реакционную смесь очищали посредством препаративной HPLC с применением 10-90% градиента с получением (S)-трет-бутил-(1-(3азидопропилсульфонамидо)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)карбамата. MS масса/заряд 312,1 (М+1-Вос). Время удерживания 1,15 мин. Полученный таким образом продукт (72,4 мг, 0,176 ммоль) растворяли в метанольной HCl (3 М, 5 мл). Растворитель удаляли выпариванием. Остаток лиофилизировали из ацетонитрила и H2O с получением (S)-2-амино-N-((3-азидопропил)сульфонил)-3-фенилпропанамида в виде розовато-желтоватого твердого вещества. MS масса/заряд 312,1 (M+1).
1H ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,42-7,31 (m, 5H), 4,16-4,13 (m, 1H), 3,51-3,47 (m, 4H), 3,32-3,26 (m, 1H), 3,13-3,08 (m, 1H), 2,00-1,94 (m, 2H).
Стадия 5. К Boc-Val-Dil-Dap-OH (195 мг, 0,34 ммоль) в DMF (4 мл) добавляли DIEA (132 мг, 1,02 ммоль) и HATU (108 мг, 0,28 ммоль). Их перемешивали 15 мин при rt. Добавляли (S)-2-амино-N-((3азидопропил)сульфонил)-3-фенилпропанамид (59,2 мг, 0,17 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при rt. Неочищенный материал очищали посредством препаративной HPLC с получением требуемого продукта (95 мг, выход 65, MS масса/заряд 865,4 (M+1), время удерживания 1,43 минуты). Продукт растворяли в 3 М HCl в МеОН (3 мл). Растворители удаляли выпариванием. Остаток лиофилизировали из ацетонитрила в воде с получением (S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3азидопропилсульфонамидо)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3 -метокси-5 -метил-1 -оксогептан-4-ил)(метил)амино)-2-амино-3 -метил-1 оксобутана,
- 64 044279
в виде HCl-соли, MS масса/заряд 765,4 (M+1), время удерживания 1,04 мин.
Стадия 6. К HCl-соли (S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3азидопропилсульфонамидо)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3 -метокси-5 -метил-1 -оксогептан-4-ил)(метил)амино)-2-амино-3 -метил-1 оксобутана (20 мг, 0,025 ммоль) в DMF (2 мл) добавляли DIEA (0,024 мл, 0,14 ммоль) и HATU (21,6 мг, 0,057 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при rt в течение 2 ч. С помощью LCMS определили завершение реакции. Затем полученную смесь очищали посредством препаративной HPLC с применением 10-90% градиента с получением (S)-2-((бис(диметиламино)метилен)амино)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-αзидопропилсульфонамидо)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1оксобутана в виде TFA-соли. MS масса/заряд 863,5 (M+1). Время удерживания 1,169 мин.
Стадия 7. TFA-соль (S)-2-((бис(диметиламино)метилен)амино)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3(((S)-N-1 -(3 -азидопропилсульфонамидо)-1 -оксо-3 -фенилпропан-2-ил)амино)-1 -метокси-2-метил-3 оксопропил)пирролидин-1 -ил)-3 -метокси-5 -метил-1 -оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1 оксобутана (87,4 мг, 0,089 ммоль) и 1-(проп-2-ин-1-ил)-1Н-пиррол-2,5-дион (24,2 мг, 0,0179 ммоль) суспендировали в t-BuOH и воде из расчета по 3,0 мл каждого. Реакционный сосуд пять раз заполняли N2 с помощью вакуум-наполнительного цикла с N2. Последовательно добавляли дегазированные растворы Lаскорбата натрия (17,7 мг, 0,089 ммоль) в Н2О (2,4 мл) и CuSO4 (2,86 мг, 0,018 ммоль) в Н2О (0,6 мл) и реакционную смесь перемешивали при rt в течение 5 ч. С помощью LCMS определили завершение реакции. Неочищенный материал очищали посредством препаративной HPLC с применением 20-45% градиента с получением (S)-2-((бис(диметиламино)метилен)амино)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N1-(3-(4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)пропилсульфонамидо)-1оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутана (С4) в виде TFA-соли. MS масса/заряд 998,5 (M+1). Время удерживания 1,014 мин.
Пример 5. Синтез 6'O-метил-7'С-((23-(4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)-1Н-1,2,3триазол-1-ил)-3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозантио)метил)-а-аманитина (С5), 7'С-((23-азидо3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозантио)метил)-а-аманитина (А-3) и 6'O-метил-7'С-((23-азидо3,6,9,12,15,18,21 -гептаоксатрикозантио)метил)-а-аманитина (А4)
Стадия 1. Формальдегид (0,035 мл, 0,44 ммоль) и 23-азидо-3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозан-1тиол (35 мг, 0,11 ммоль) добавляли к раствору α-аманитина (20 мг, 0,022 ммоль) в МеОН (2 мл). К реакционной смеси добавляли триэтиламин (1,2 мл, 8,7 ммоль) и уксусную кислоту (0,25 мл, 4,4 ммоль) и трижды продували N2-газом. Реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение 2 дней. После концентрирования под вакуумом затем остаток очищали посредством HPLC и лиофилизировали с получением 7'С-((23-азидо-3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозантио)метил)-а-аманитина. MS (m+1) = 1342,4, RT пика при HPLC=0,834 мин.
1Н ЯМР (MeOD, 500 МГц) δ 10,65 (s, 1H), 8,81 (m, 1H), 8,59 (d, 1H, J=2,0 Гц), 8,45 (m, 2Н), 8,33 (s, 1H), 8,14 (d, 1H, J=10,5 Гц), 8,00 (d, 1H, J=12,0 Гц), 7,90 (d, 1H, J=11,0 Гц), 7,67 (s, 1H), 7,48 (d, 1H, J=11,0 Гц), 6,69 (d, 1Н, J=10,5 Гц), 5,25 (m, 1Н), 5,12 (m, 1Н), 4,74 (bs, 1H), 4,61 (dd, 1H, J=6,5 и 12,0 Гц), 4,51 (m, 2Н), 4,29 (dd, 1H, J=10,5 и 23,0 Гц), 4,09 (m, 3Н), 3,92 (m, 1Н), 3,38-3,73 (m, 43Н), 3,29 (m, 2Н), 3,21 (m, 1Н), 3,06 (m, 1Н), 3,12 (m, 1Н), 2,91 (m, 1Н), 2,56 (m, 2Н), 2,39 (m, 2Н), 2,00 (m, 1Н), 1,60 (m, 2Н), 1,15 (m, 1Н), 0,94 (d, 3Н, J=9,0 Гц), 0,85 (m, 6Н).
Стадия 2: 7'С-((23-азидо-3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозантио)метил)-а-аманитин (14,0 мг, 0,011 ммоль) и DMSO (1 мл) обрабатывали с помощью метилйодида (0,0007 мл) и K2CO3 (1,5 мг) при rt и перемешивали при rt в течение 1 ч. Дополнительные метилйодид (0,0007 мл) и K2CO3 (1,5 мг) добавляли при rt и перемешивали при rt в течение 2 ч. Дополнительные метилйодид (0,0007 мл) и K2CO3 (1,5 мг) снова добавляли при rt и перемешивали при rt в течение 2 ч. Затем реакционную смесь очищали посред- 65 044279 ством RP-C18 ISCO и лиофилизировали с получением 6'О-метил-7'С-((23-азидо-3,6,9,12,15,18,21гептаоксатрикозантио)метил)-а-аманитина. MS (m+2/2) = 679,0, RT пика при HPLC=0,887 мин.
1Н ЯМР (MeOD, 500 МГц) δ 10,75 (s, 1Н), 8,83 (m, 1H), 8,64 (d, 1H, J=2,0 Гц), 8,52 (d, 1H, J=10,0 Гц), 8,47 (d, 1H, J=3,5 Гц), 8,36 (s, 1H), 8,18 (d, 1H, J=8,5 Гц), 8,05 (d, 1H, J=9,5 Гц), 7,96 (d, 1H, J=9,0 Гц), 7,70 (d, 1Н, J=9,0 Гц), 7,69 (s, 1H), 6,98 (d, 1H, J=9,0 Гц), 5,33 (m, 1Н), 5,18 (m, 1Н), 4,80 (bs, 1H), 4,68 (dd, 1H, J=5,5 и 9,5 Гц), 4,56 (m, 2Н), 4,35 (dd, 1H, J=9,0 и 18,5 Гц), 4,10-4,21 (m, 3Н), 3,97 (m, 1Н), 3,92 (s, 3Н), 3,45-3,79 (m, 42Н), 3,35-3,44 (m, 3Н), 3,11 (m, 1Н), 2,96 (m, 1Н), 2,61 (m, 2Н), 2,44 (m, 2Н), 2,06 (m, 1Н), 1,65 (m, 2Н), 1,21 (m, 1Н), 0,99 (d, 3Н, J=7,0 Гц), 0,90 (m, 6Н).
Стадия 3. 6'О-метил-7'С-((23-азидо-3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозантио)метил)-а-аманитин (8 мг, 0,006 ммоль) и 1-(проп-2-ин-1-ил)-1Н-пиррол-2,5-дион (2 мг, 0,012 ммоль) добавляли к трет-бутанолу (0,5 мл) и реакционную смесь пять раз продували ^-газом. Затем добавляли натриевую соль Lаскорбиновой кислоты (1 мг, 0,006 ммоль), CuSO4 (0,2 мг, 0,0012 ммоль) и 0,5 мл Н2О. Реакционную смесь пять раз продували N2-газом и перемешивали при rt в течение 4 ч и затем очищали посредством RP-C18 ISCO с получением 6'O-метил-7'С-((23-(4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)-1Н1,2,3-триазол-1-ил)-3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозантио)метил)-а-аманитина (С5). MS (m+2/2) =746,5, RT пика при HPLC=0,850 мин.
1Н ЯМР (MeOD, 500 МГц) δ 10,74 (s, 1H), 8,83 (m, 1H), 8,63 (d, 1H, J=2,0 Гц), 8.51 (d, 1H, J=10,0 Гц), 8,47 (d, 1H, J=3,5 Гц), 8,36 (s, 1H), 8,17 (d, 1H, J=8,5 Гц), 8,04 (d, 1H, J=10,0 Гц), 7,96 (d, 1H, J=9,5 Гц), 7,94 (s, 1H), 7,69 (d, 1H, J=9, 0 Гц), 6,97 (d, 1H, J=9,0 Гц), 6,83 (s, 2Н), 5,34 (m, 1Н), 5,17 (m, 1Н), 4,79 (bs, 1Н), 4,75 (s, 2Н), 4,68 (dd, 1Н, J=5,0 и 9,5 Гц), 4,56 (m, 2Н), 4.52 (t, 1H, J=5,0 Гц), 4,34 (dd, 1H, J=9,0 и 18,5 Гц), 4,08-4,20 (m, 3Н), 3,97 (m, 1Н), 3,91 (s, 3H), 3,39-3,78 (m, 38Н), 3,10 (m, 1Н), 2,94 (dd, 1H, J=14,0 и 15,0 Гц), 2,61 (m, 2Н), 2,41 (m, 2Н), 2,05 (m, 1Н), 1,57-1,68 (m, 2Н), 1,20 (m,1Н), 0,99 (d, 3Н, J=7,0 Гц), 0,91 (m, 6Н).
Пример 6. Синтез 6'O-метил-7'С-((4-(3-(23-((4-малеимидо)метил-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозил)уреидо)бутилтио)метил)-а-аманитина (С6) он
Стадия 1. Формальдегид (0,027 мл, 0,33 ммоль) и трет-бутил-(4-меркаптобутил)карбамат (i-7) (34 мг, 0,16 ммоль) добавляли к раствору α-аманитина (А) (15 мг, 0,016 ммоль) в МеОН (5 мл) и триэтиламине (0,46 мл, 3,26 ммоль) в 40-мл флаконе и реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение 3 дней. После концентрирования под вакуумом остаток растворяли в 2 мл МеОН и добавляли 408 мкл 2 М триметилсилилдиазометана в диэтиловом эфире и смесь перемешивали в течение 2 ч при rt. Затем добавляли еще 408 мкл 2 М триметилсилилдиазометана в диэтиловом эфире и перемешивали при rt в течение 2 ч. Реакционную смесь очищали посредством HPLC и лиофилизировали с получением 6'O-метил-7'С ((4-Гбутоксикарбониламинобутилтио)метил)-а-аманитина (А-4)
MS (m+2-boc/2)=525,8, RT пика при HPLC=0,936 мин.
1Н ЯМР (MeOD-d4, 400 МГц) δ 10,78 (s, 1Н), 8,84 (m, 1H), 8,59 (d, 1H, J=2,4 Гц), 8,48 (s, 1H), 8,46 (d, 1H, J=14,4 Гц), 8,35 (s, 1H), 8,15 (d, 1H, J=8,8 Гц), 8,01 (d, 1H, J=10,0 Гц), 7,92 (d, 1H, J=8,8 Гц), 7,69 (s, 1H), 7,63 (d, 1Н, J=8,8 Гц), 6,92 (d, 1Н, J=8,8 Гц), 5,28 (m, 1Н), 5,13 (m, 1Н), 4,73 (bs, 1H), 4,61 (dd, 1H, J=5, 6 и 8,4 Гц), 4,51 (m, 2Н), 4,30 (dd, 1Н, J=8,8 и 18,4 Гц), 4,12 (m, 1Н), 4,04 (d, 1H, J=13,2 Гц), 3,94 (d, 1Н, J=13,2 Гц), 3,92 (m, 1Н), 3,86 (s, 3H), 3,35-3,75 (m, 14Н), 3,05 (m, 1Н), 2,92 (m, 3Н), 2,49 (m, 4Н), 2,00 (m, 1Н), 1,39-1,65 (m, 8Н), 1,37 (s, 9Н), 1,15 (m, 1Н), 0,93 (d, 3Н, J=7,2 Гц), 0,84 (m, 6Н).
Стадия 2: TFA (1 мл) добавляли к 8 мг соединения (А-4) в 40-мл флаконе и полученный раствор оставляли отстоятся при rt в течение 2 мин, а затем концентрировали под вакуумом с получением 6'O
- 66 044279 метил-7 'С-((4-аминобутилтио)метил)-а-аманитина (А-5)
который применяли без дополнительной очистки. MS (m+1)=1050,4, RT пика при HPLC=0,635 мин.
1Н ЯМР (MeOD-d4, 400 МГц) δ 8,87 (m, 1H), 8,58 (d, 1H, J=2,4 Гц), 8,48 (d, 1H, J=10,4 Гц), 8,44 (d, 1H, J=1,6 Гц), 8,16 (d, 1H, J=8,4 Гц), 7,97 (d, 1H, J=9, 6 Гц), 7,94 (d, 1H, J=9,2 Гц), 7,62 (d, 1H, J=8,8 Гц), 6,92 (d, 1H, J=9,2 Гц), 5,25 (m, 1H), 5,13 (m, 1H), 4,73 (m, 1H), 4,60 (dd, 1H, J=5,6 и 9,2 Гц), 4,49 (m, 2H), 4,28 (dd, 1H, J=8,8 и 18,4 Гц), 4,12 (m, 1H), 4,04 (d, 1H, J=13,2 Гц), 3,99 (s, 2H), 3,92 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 3,83 (s, 1H), 3,60-3,72 (m, 4H), 3,30-3,60 (m, 10H), 3,00-3,20 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,76 (m, 2H), 2,00 (m, 1H), 1,50-1,75 (m, 7H), 1,16 (d, 1H, J=5,6 Гц), 1,24 (d, 2H, J=7,6 Гц), 1,15 (m, 1H), 0,94 (d, 3H, J=6,8 Гц), 0,85 (m, 6H).
Стадия 3. Триэтиламин (3 мкл, 18 мкмоль) добавляли к раствору соединения (А-5) (7,5 мг, 7 мкмоль) и 4-нитрофенил-(23-(4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозил)карбамата (5,0 мг, 7 мкмоль) в DMF (1 мл) и реакционную смесь перемешивали при rt в течение 2 ч, очищали посредством HPLC и лиофилизировали с получением 6'Oметил-7'С-((4-(3-(23-((4-малеимидо)метил-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)-3,6,9,12,15,18,21-гептаоксатрикозил) уреидо)бутилтио)метил)-а-аманитина (С6). MS (m+2/2)=803,5, RT пика при HPLC=0,834 минуты, 1Н ЯМР (MeOD-d4, 400 МГц) δ 10,76 (s, 1H), 8,84 (m, 1H), 8,59 (d, 1H, J=2,0 Гц), 8,49 (s, 1H), 8,47 (d, 1H, J=8,0 Гц), 8,15 (d, 1H, J=8,4 Гц), 8,01 (d, 1H, J=9,6 Гц), 7,92 (d, 1H, J=8,8 Гц), 7,90 (s, 1H), 7,63 (d, 1H, J=8,8 Гц), 6,92 (d, 1H, J=9,2 Гц), 6,79 (s, 2H), 5,28 (m, 1Н), 5,13 (m, 1Н), 4,74 (m, 1Н), 4,71 (s, 2H), 4,62 (dd, 1Н, J=5,2 и 9,6 Гц), 4,49 (m, 4Н), 4,30 (dd, 1H, J=8,8 и 18,4 Гц), 4,14 (m, 1Н), 4,04 (d, 1H, J=13,2 Гц), 3,94 (d, 1H, J=13,2 Гц), 3,92 (m, 1Н), 3,85 (s, 3Н), 3,80 (t, 2H, J=4,8 Гц), 3,35-3,75 (m, 38Н), 2,90-3,10 (m, 4Н), 2,92 (m, 1Н), 2,40 (m, 4Н), 2,01 (m, 1Н), 1,38-1,65 (m, 6Н), 1,15 (m, 1Н), 0,94 (d, 3Н, J=6,8 Гц), 0,85 (m, 6Н).
Пример 7. Синтез тетрафторфенилового сложного эфира 6'О-метил-7'С-((4-(3(карбокси)пропанкарбоксамидо)бутилтио)метил)-а-аманитина (С7)
(А-5) (5 мг, 5 мкмоль) и DMF (1 мл) объединяли в 40-мл флаконе с получением прозрачного раствора. Добавляли бис(2,3,5,6-тетрафторфенил)глутарат (2 мг, 5 мкмоль) и DIEA (4 мкл, 20 мкмоль). После этого реакционную смесь перемешивали при rt в течение 2 ч, реакционную смесь очищали посредством HPLC с получением тетрафторфенилового сложного эфира 6'O-метил-7'С-((4-(3 (карбокси)пропанкарбоксамидо)бутилтио)метил)-а-аманитина (С-7). MS (m+1)=1313,3, RT пика при HPLC=0,996 мин.
1Н ЯМР (MeOD, 400 МГц) δ 10,78 (s, 1H), 8,85 (m, 1H), 8,59 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,47 (d, 1H, J=10,0 Гц), 8,35 (bs, 1H), 8,15 (d, 1Н, J=8,0 Гц), 8,01 (d, 1H, J=9,6 Гц), 7,93 (d, 1H, J=8,8 Гц), 7,69 (bs, 1Н), 7,63 (d, 1Н, J=8,8 Гц), 7,36 (m, 1Н), 6,92 (d, 1Н, J=8,8 Гц), 5,27 (m, 1Н), 5,14 (m, 1Н), 4,75 (bs, 1H), 4,61 (dd, 1Н, J=5,2 и 9,6 Гц), 4,51 (m, 2Н), 4,30 (dd, 1H, J=8,4 и 18,0 Гц), 4,12 (m,1Н), 4,00 (d, 1H, J=13,2 Гц), 3,95 (d, 1H, J=13,2 Гц), 3,91 (m, 1Н), 3,85 (s, 3Н), 3,34-3,70 (m, 9Н), 3,08 (m, 4Н), 2,91 (m, 1Н), 2,73 (t, 2H, J=14,4 Гц), 1,98 (t, 2H, J=7,6 Гц), 1,92-2,04 (m, 1Н), 1,40-1,60 (m, 6Н), 1,16 (m, 1Н), 0,94 (d, 3Н, J=6,8 Гц), 0,87 (m, 6Н).
Другие соединения формулы (А), формулы (В), формулы (А-1), формулы (А-2), формулы (А-3), формулы (В-1), формулы (А-1а), формулы (А-2а), формулы (А-3а) или формулы (В-1a) можно получать с применением способов из примеров 1-7 и подходящих исходных материалов.
- 67 044279
Пример 8. Получение линкера-полезной нагрузки MPET-DM4
Аналитические способы.
Если не указано иное, в получении промежуточных соединений и примерах применяли следующие способы HPLC и HPLC/MS.
Анализ LC/MS осуществляли на системе Agilent 1200sl/6140. Колонка: Waters Acquity HSS ТЗ С18, 50x2,0, 1,8 мкм. Подвижная фаза: А) Н2О+0,05% TFA; В: ацетонитрил+0,035% TFA.
Параметры работы насоса:___________________________________________________
Время | А% | В% | Расход (мл/мин) |
0 | 90 | 10 | 0, 9 |
1,35 | 0 | 100 | 0, 9 |
1,36 | 0 | 100 | 0, 9 |
1,95 | 0 | 100 | 0, 9 |
1,96 | 90 | 10 | 0, 9 |
2,0 | 90 | 10 | 0, 9 |
Обнаружение: Диодно-матричный УФ-детектор при 190-400 нм.
Сканирование при MS: 200-1350 amu ELSD: 60°C.
Параметры MS:_______________________________________
Полярность | Положительная |
Сушильный газ | 12 |
Давление распылителя | 50 |
Температура сушильного газа | 350 |
Напряжение на капилляре | 3000 |
(14S,16S,32S,33S,2R,4S,10Е,12Е,14R)-86-хлор-14-гидрокси-85,14-диметокси-33,2,7,10-тетраметил12,6-диоксо-7-аза-1(6,4)-оксазинана-3(2,3)-оксирана-8(1,3)-бензолациклотетрадекафан-10,12-диен-4-ил N-(4-((2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропанамидо)этил)дисульфанил)-4метилпентаноил)-N-метил-L-αланинат
Стадия 1. Получение (14S,16S,32S,33S,2R,4S,10Е,12Е,14R)-86-хлор-14-гидроkси-85,14-диметокси33,2,7,10-тетраметил-12,6-диоксо-7-аза-1(6,4)-оксазинана-3(2,3)-оксирана-8(1,3)бензолациклотетрадекафан-10,12-диен-4-ил N-(4-((2-аминоэтил)дисульфанил)-4-метилпентаноил)-Nметил-L-аланината.
К DM4 (480 мг, 0,62 ммоль), растворенному в PBS-буфере (10,5 мл) и безводном THF (21 мл), добавляли 2-(пиридин-2-илдисульфанил)этан-1-амин (151 мг, 0,68 ммоль) и DIEA (0,27 мл, 1,54 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30
- 68 044279 мин и концентрировали под вакуумом. Водный остаток разбавляли с помощью CH3CN (1 мл) и Н2О (2 мл) и очищали посредством ISCO с обращенной фазой, элюировали с помощью 10-60% ацетонитрила в
Н2О, содержащей 0,05% TFA. Фракции, содержащие требуемый продукт, лиофилизировали с получением требуемого продукта (555 мг, выход 93%).
1H ЯМР (400 МГц, MeOD-d4) δ ppm 0,83 (s, 3Н) 1,21 (d, J=5,0 Гц, 3H), 1,25 (s, 3Н), 1,28 (s, 3Н), 1,30 (d, J=5,0 Гц, 3 H), 1,45-1,55 (m, 3 Н), 1,67 (s, 3 Н), 1,84-1,88 (m, 1Н), 1,95-2,01 (m, 1Н), 2,14 (dd, J=5,0 и 15,0 Гц, 1Н), 2,37-2,43 (m, 1H), 2,53-2,59 (m, 1H), 2,64 (dd, J=10,0 и 15,0 Гц, 1Н), 2,82-2,89 (m, 5Н), 2,91 (d, J=10,0 Гц, 1Н), 3,16 (dd, J=5,0 и 10,0 Гц, 2Н), 3,20 (s, 3Н), 3,23 (d, J=10,0 Гц, 1Н), 3,35 (s, 3Н), 3,55 (d, J=5,0 Гц, 1Н), 3,58 (d, J=10,0 Гц, 1Н), 4,15-4,20 (m, 1Н), 4,64 (dd, J=5,0 и 10,0 Гц, 1Н), 5,43 (q, J=5,0 Гц, 2Н), 5,66 (dd, J=10,0 и 15,0 Гц, 1Н), 6,58 (dd, J=10,0 и 15,0 Гц, 1Н), 6,65 (d, J=10,0 Гц, 1Н), 6,66 (s, 1H), 7,11 (bs, 1H), 7,28 (bs, 1H); MS масса/заряд 855,3 (М+Н), Время удерживания 0,988 мин.
Стадия 2. Получение (14S,16S,32S,33S,2R,4S,10Е,12Е,14R)-86-хлор-14-гидрокси-85,14-диметокси33,2,7,10-тетраметил-12,6-диоксо-7-аза-1(6,4)-оксазинана-3(2,3)-оксирана-8(1,3)бензолациклотетрадекафан-10,12-диен-4-ил N-(4-((2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1 Н-пиррол-1 ил)пропанамидо)этил)дисульфанил)-4-метилпентаноил)-N-метил-L-аланината.
К (14S,16S,32S,33S,2R,4S,10Е,12Е,14R)-86-хлор-14-гидрокси-85,14-диметокси-33,2,7,10тетраметил-12,6-диоксо-7-аза-1(6,4)-оксазинана-3(2,3)-оксирана-8(1,3)-бензолациклотетрадекафан-10,12диен-4-ил N-(4-((2-аминоэтил)дисульфанил)-4-метилпентаноил)-N-метил-L-аланинату (555 мг, 0,57 ммоль), растворенному в безводном DMSO (7 мл), добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-ил 3-(2,5-диоксо2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропаноат (171 мг, 0,63 ммоль) и DIEA (249 мл, 1,43 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин и нейтрализовали с применением TFA. Смесь охлаждали до 0°С с помощью бани со льдом, с последующим добавлением CH3CN (2 мл) и Н2О (7 мл), а затем очищали посредством ISCO с обращенной фазой, элюируя с помощью 10-70% ацетонитрила в Н2О, содержащей 0,05% TFA. Фракции, содержащие требуемый продукт, лиофилизировали с получением требуемого продукта (430 мг, выход 66%).
1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ ppm 0,81 (s, 3H), 1,23 (s, 3H), 1,24 (s, 3H), 1,25 (s, 1H), 1,28 (d, J=5,0 Гц, 3H), 1,31 (d, J=5,0 Гц, 3H), 1,43-1,49 (m, 1Н), 1,61 (d, J=15,0 Гц, 1H), 1,64 (s, 3H), 1,81-1,87 (m, 1H), 1,942,01 (m, 1H), 2,19 (dd, J=5,0 и 15,0 Гц, 1H), 2,30-2,36 (m, 1H), 2,54 (t, J=5,0 Гц, 2H), 2,61 (dd, J=10,0 и 15,0 Гц, 1H), 2,70 (t, J=5,0 Гц, 2H), 2,88 (s, 3H), 3,00 (d, J=10,0 Гц, 1H), 3.13 (d, J=10,0 Гц, 1H), 3,21 (s, 3H), 3,55 (s, 3H), 3,45 (q, J=5,0 Гц, 2H), 3,49 (d, J=5,0 Гц, 1H), 3,62 (d, J=10,0 Гц, 1H), 3,83 (t, J=5,0 Гц, 1H), 3,98 (s, 3H), 4,32 (m, 1H), 4,8=5,0 и 10,0 Гц, 1H), 5,28 (d, J=5,0 Гц, 1H), 5,66 (dd, J=10,0 и 15,0 Гц, 1H), 6,22 (bs, 1H), 6,42 (dd, J=10,0 и 15,0 Гц, 1H), 6,50 (s, 1H), 6,63 (s, 1H), 6,66 (d, J=10,0 Гц, 1H), 6,70 (s, 2H), 6,83 (s, 1H); MS масса/заряд 988,3 (М+Н-Н2О), Время удерживания 1.145 мин.
3. Конъюгация и получение ADC.
Способы получения конъюгата антитела формулы (I) Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (I) показана на схеме 1 ниже.
Схема 1
A—(RG0y + y^RG2-LB-(D)nj-------- A-<LB-(D)n)y
Формула (I) где RG1 представляет собой реакционноспособную группу, исключительно в качестве примера тиольную, или аминную, или кетоновую, которая реагирует с совместимой реакционноспособной группой, RG2, присоединенной к фрагменту, представляющему собой линкер-лекарственное средство, обеспечивая тем самым ковалентную связь фрагмента антитела, А, с одним или несколькими фрагментами, представляющими собой линкер-лекарственное средство. Неограничивающими примерами таких реакций с участием групп RG1 и RG2 является малеимидная группа (RG2), реагирующая с тиольной группой (RG1) с получением сукцинимидного кольца, или гидроксиламинная группа (RG2), реагирующая с кетоновой группой (RG1) с получением оксима.
Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (II) показана на схеме 2 ниже/
Схема 2 h2n А s восстанов- А SH д s—< b-LB-(D)n ArS—.
1 ι ление 1 1,3-дигалогенацетон 1 X=o -----5---% 1 O-LB-(D)r a2-s a2-sh или a2-s a2 s биссульфонатные сложные Формула (II) эфиры 1,3-дигидроксиацетона где A1, A2, LB, D и n являются такими, как определено в данном документе, 1,3-дигалогенацетон выбран из 1,3-дихлорацетона, 1,3-дибромацетона и 1,3-дийодацетона, а стадия восстановления осуществляется с применением восстановителя, выбранного из дитиотреитола (DTT) и трис(2карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида (ТСЕР-HCl).
Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (С) показана на схеме 3 ниже.
- 69 044279
Схема 3
где L20 представляет собой -L1R40; R4 представляет собой -L1R14, -L2R24 или -L2R34, a RG1 представляет собой реакционноспособную группу, исключительно в качестве примера тиольную, или аминную, или кетоновую, которая реагирует с совместимой группой R14, R24 или R34 соединения формулы (А) с образованием соответствующей группы R40. В качестве примера, малеимидная группа реагирует с ти ольной с получением сукцинимидного кольца, или гидроксиламинная группа реагирует с кетоновой с получением оксима. A, R2, L1, L2, R14, R24, R34 и R40 являются такими, как определено в данном докумен те.
Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (С-1) показана на схеме 4 ниже.
Схема 4
где L20 представляет собой -L1R40; R4 представляет собой -L1R14, -L2R24 или -L2R34, a RG1 представляет собой реакционноспособную группу, которая реагирует с совместимой группой R14, R24 или R34 соединения формулы (А-1) с образованием соответствующей группы R40. В качестве примера, малеимидная группа реагирует с тиольной с получением сукцинимидного кольца, или гидроксиламинная группа реагирует с кетоновой с получением оксима. A, L1, L2, R14, R24, R34 и R40 являются такими, как определе но в данном документе.
Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (С-1а) показана на схеме 5 ниже.
Схема 5
где L20 представляет собой -L1R40; R4 представляет собой -L1R14, -L2R24 или -L2R34 и RG1 представляет собой реакционноспособную группу, исключительно в качестве примера тиольную, или аминную, или кетоновую, которая реагирует с совместимой группой R14, R24 или R34 соединения формулы (А-1a) с образованием соответствующей группы R40. В качестве примера, малеимидная группа реагирует с ти ольной с получением сукцинимидного кольца, или гидроксиламинная группа реагирует с кетоновой с получением оксима. A, L1, L2, R14, R24, R34 и R40 являются такими, как определено в данном документе.
Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (D) показана на схеме 6 ниже.
- 70 044279
Схема 6
R5 представляет собой 5 где L30 представляет собой -L5R40; R3 представляет собой -L5R14, a RGi представляет собой реакционноспособную группу, исключительно в качестве примера тиольную, или аминную, или кетоновую, которая реагирует с совместимой группой R14 соединения формулы (А) с образованием соответствующей группы R40. В качестве примера, малеимидная группа реагирует с тиольной с получением сукцинимидного кольца, или гидроксиламинная группа реагирует с кетоновой с получением оксима. A, R2, L5, R14 и R40 являются такими, как определено в данном документе.
Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (D-1) показана на схеме 7 ниже.
Схема 7
где L30 представляет собой -L5R40, a RG1 представляет собой реакционноспособную группу, исключительно в качестве примера тиольную, или аминную, или кетоновую, которая реагирует с совместимой группой R14 соединения формулы (А-2) с образованием соответствующей группы R40. В качестве примера, малеимидная группа реагирует с тиольной с получением сукцинимидного кольца, или гидроксиламинная группа реагирует с кетоновой с получением оксима. A, L5, R14 и R40 являются такими, как определено в данном документе.
Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (D-1a) показана на схеме 8 ниже.
Схема 8
где L30 представляет собой -L5R40, a RG1 представляет собой реакционноспособную группу, исключительно в качестве примера тиольную, или аминную, или кетоновую, которая реагирует с совместимой группой R14 соединения формулы (А-2) с образованием соответствующей группы R40. В качестве примера, малеимидная группа реагирует с тиольной с получением сукцинимидного кольца, или гидроксиламинная группа реагирует с кетоновой с получением оксима. A, L5, R14 и R40 являются такими, как определено в данном документе.
Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (D-2) показана на схеме 9 ниже.
Схема 9
где L30 представляет собой -L5R40, a RG1 представляет собой реакционноспособную группу, исключительно в качестве примера тиольную, или аминную, или кетоновую, которая реагирует с совместимой группой R14 соединения формулы (А-3) с образованием соответствующей группы R40. В качестве примера, малеимидная группа реагирует с тиольной с получением сукцинимидного кольца, или гидроксиламинная группа реагирует с кетоновой с получением оксима. A, L5, R14 и R40 являются такими, как определено в данном документе.
Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (D-2a) показана на схеме 10 ниже.
- 71 044279
Схема 10
где L30 представляет собой -L5R40, a RG1 представляет собой реакционноспособную группу, исключительно в качестве примера тиольную, или аминную, или кетоновую, которая реагирует с совместимой группой R14 соединения формулы (А-3а) с образованием соответствующей группы R40. В качестве примера, малеимидная группа реагирует с тиольной с получением сукцинимидного кольца, или гидроксиламинная группа реагирует с кетоновой с получением оксима. A, L5, R14 и R40 являются такими, как опре делено в данном документе.
Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (Е) показана на схеме 11 ниже.
Схема 11
где L40 представляет собой -L6R40, R54 представляет собой -L6R14, -L7R24 или -L7R34 и RG1 представляет собой реакционноспособную группу, исключительно в качестве примера тиольную, или аминную, или кетоновую, которая реагирует с совместимой группой R14, R24 или R34 соединения формулы (В) с образованием соответствующей группы R40. В качестве примера, малеимидная группа реагирует с тиольной с получением сукцинимидного кольца, или гидроксиламинная группа реагирует с кетоновой с получением оксима. А, X, R5, R6, L6, L7, R14, R24, R34 и R40 являются такими, как определено в данном документе.
Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (Е-1) показана на схеме 12 ниже.
Схема 12
где L40 представляет собой -L6R40; R54 представляет собой -L6R14, -L7R24 или -L7R34 и RG1 представляет собой реакционноспособную группу, исключительно в качестве примера тиольную, или аминную, или кетоновую, которая реагирует с совместимой группой R14, R24 или R34 соединения формулы (В-1) с образованием соответствующей группы R40. В качестве примера, малеимидная группа реагирует с тиольной с получением сукцинимидного кольца, или гидроксиламинная группа реагирует с кетоновой с получением оксима. А, у, R5, R6, L6, L7, R14, R24, R34 и R40 являются такими, как определено в данном документе.
Общая схема реакции образования конъюгатов формулы (Е-1а) показана на схеме 13 ниже.
- 72 044279
Схема 13
где L40 представляет собой -L6R40; R54 представляет собой -L6R14, -L7R24 или -L7R34 и RG1 представляет собой реакционноспособную группу, исключительно в качестве примера тиольную, или аминную, или кетоновую, которая реагирует с совместимой группой R14, R24 или R34 соединения формулы (В-1a) с образованием соответствующей группы R40. В качестве примера, малеимидная группа реагирует с тиольной с получением сукцинимидного кольца, или гидроксиламинная группа реагирует с кетоновой с получением оксима. А, у, R5, R6, L6, L7, R14, R24, R34 и R40 являются такими, как определено в данном до кументе.
Общая схема реакции образования конъюгатов, содержащих майтанзиноидный фрагмент, показана на схеме 14 ниже.
Схема 14
где один или несколько NHS-сложных эфиров одного или нескольких линкеров-полезных нагрузок реагируют с одним или несколькими свободными аминами на А (т. е. (A'-(NH2)y), с образованием тем самым конъюгата. А является таким, как определено в данном документе, а А' представляет собой часть А, которая не содержит фрагмент, представляющий собой свободный амин.
Общая схема реакции образования конъюгатов, содержащих майтанзиноидный фрагмент, показана на схеме 15 ниже.
Схема 15
где один или несколько NHS-сложных эфиров одного или нескольких линкеров-полезных нагрузок
- 73 044279 реагируют с одним или несколькими свободными аминами на А (т. е. (A'-(NH2)y), с образованием тем самым конъюгата. А является таким, как определено в данном документе, а А' представляет собой часть
А, которая не содержит фрагмент, представляющий собой свободный амин.
Общая схема реакции образования конъюгатов, содержащих майтанзиноидный фрагмент, показана на схеме 16 ниже.
Схема 16
где один или несколько NHS-сложных эфиров одного или нескольких линкеров-полезных нагрузок реагируют с одним или несколькими свободными аминами на А (т. е. (A'-(NH2)y), с образованием тем самым конъюгата. А является таким, как определено в данном документе, а А' представляет собой часть А, которая не содержит фрагмент, представляющий собой свободный амин.
Общая схема реакции образования конъюгатов, содержащих майтанзиноидный фрагмент, показана на схеме 17 ниже.
Схема 17
где один или несколько малеимидов одного или нескольких линкеров-полезных нагрузок реагируют с одним или несколькими свободными тиолами на А (т. е. (A'-(SH)y), с образованием тем самым конъюгата. А является таким, как определено в данном документе, а А' представляет собой часть А, которая не содержит фрагмент, представляющий собой свободный тиол.
4. Определение характеристик и отбор требуемых ADC к Ckit.
Определение DAR и агрегация ADC.
Значение DAR ADC к cKIT оценивали посредством жидкостной хроматографии-массспектрометрии (LC-MS). Отношение соединения-к-антителу экстраполировали на основании данных LCMS для восстановленных и дегликозилированных образцов (в соответствующих случаях, т. е. если включена Fc). LC-MS обеспечивает возможность получения количественной оценки среднего количества молекул линкер-полезная нагрузка (соединение), присоединенных к антителу в образце конъюгата.
Конъюгаты антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению оценивали с применением аналитических способов. Такие аналитическая методология и результаты могут продемонстрировать, что конъюгаты обладают благоприятными свойствами, например, свойствами, которые смогут облегчить их изготовление, облегчить введение пациентам, сделают их более эффективными и/или потенциально более безопасными для пациентов. Одним примером является определение молекулярного размера посредством эксклюзионной хроматографии (SEC), где количество требуемых молекул антитела в образце определено относительно количества высокомолекулярных загрязнителей (например, димера,
- 74 044279 мультимера или агрегированного антитела) или низкомолекулярных загрязнителей (например, фрагментов антител, продуктов распада или отдельных цепей антитела), присутствующих в образце. Обычно, желательно, например, чтобы они имели более высокие количества мономера и более низкие количества агрегированного антитела, например, вследствие воздействия агрегатов на другие свойства образца антитела, такие как без ограничения скорость выведения, иммуногенность и токсичность. Дополнительным примером является определение гидрофобности посредством хроматографии гидрофобных взаимодействий (HIC), где гидрофобность образца оценивают относительно набора стандартных антител с известными свойствами. Обычно, желательно, чтобы они характеризовались низкой гидрофобностью, вследствие воздействия гидрофобности на другие свойства образца антитела, такие как без ограничения агрегация, агрегация с течением времени, прилипание к поверхности, гепатотоксичность, скорости выведения и фармакокинетический профиль. См. Damle, N.K., Nat Biotechnol. 2008; 26 (8):884-885; Singh, S.K., Pharm Res. 2015; 32 (11):3541-71.
Отбор ADC к cKIT.
Для отбора ADC к cKIT, подходящих для применения в способах, описанных в данном документе, можно применять in vitro анализ цитолиза человеческих гемопоэтических стволовых клеток для проведения скрининга ADC к cKIT в отношении их эффективности и активности. Например, способы, описанные в примере 5, можно применять для проведения скрининга ADC к cKIT. Подходящие ADC к cKIT могут отбираться на основе ЕС50, например, ADC к cKIT с ЕС50, составляющей менее 500 мкг/мл, например, менее 100 мкг/мл, менее 50 мкг/мл, менее 10 мкг/мл или менее 5 мкг/мл.
Кроме того, сообщалось, что cKIT экспрессируется на мастоцитах, а фактор роста стволовых клеток (SCF), лиганд cKIT, индуцирует непосредственную дегрануляцию перитонеальных крысиных мастоцитов in vitro и in vivo (Taylor et al., Immunology. 1995 Nov; 86(3):427-33). SCF также индуцирует дегрануляцию человеческих мастоцитов in vivo (Costa et al., J Exp Med. 1996; 183(6): 2681-6). Чтобы избежать потенциальных вредных эффектов, вызванных дегрануляцией мастоцитов у реципиентов трансплантации, отбираемые ADC к cKIT можно тестировать в отношении их способности индуцировать дегрануляцию мастоцитов in vitro. Например, эксперименты, описанные в примере 6, можно применять для проведения скрининга ADC к cKIT и подходящие ADC к cKIT можно отбирать на основании минимальной дегрануляции мастоцитов, например, скорректированной по исходному уровню регистрируемой величины O.D, составляющей менее 0,25, например, менее 0,2, менее 0,15 или менее 0,1, в анализе высвобождения бета-гексозаминидазы.
Антитело и фрагменты антител к cKIT.
В настоящем изобретении предусмотрены антитела или фрагменты антител (например, антигенсвязывающие фрагменты), которые специфически связываются с cKIT человека. Антитела или фрагменты антител (например, антигенсвязывающие фрагменты) по настоящему изобретению включают без ограничения человеческие моноклональные антитела или их фрагменты, описанные ниже.
В некоторых вариантах осуществления раскрытые в настоящем изобретении антитела или фрагменты антител (например, антигенсвязывающие фрагменты) к cKIT характеризуются сниженной способностью вызывать дегрануляцию мастоцитов, даже будучи сшитыми и/или мультимеризованными в более крупные комплексы, в сравнении с полноразмерным антителом к cKIT. В некоторых вариантах осуществления антитела или фрагменты антител (например, антигенсвязывающие фрагменты) к cKIT, раскрытые в данном документе, модифицированы, чтобы характеризоваться сниженной способностью индуцировать дегрануляцию мастоцитов, даже будучи сшитыми и/или мультимеризованными в более крупные комплексы. Например, антитела или фрагменты антител (например, антигенсвязывающие фрагменты) к cKIT, раскрытые в данном документе, модифицированы, чтобы характеризоваться сниженной способностью индуцировать дегрануляцию мастоцитов, даже будучи сшитыми и/или мультимеризованными в более крупные комплексы, то есть она снижена на приблизительно или по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% в сравнении с полноразмерным антителом или его фрагментом F(ab')2 или F(ab)2 к cKIT. В некоторых вариантах осуществления антитела или фрагменты антитела (например, антигенсвязывающие фрагменты) к cKIT, раскрытые в данном документе, могут содержать фрагмент Fab или Fab' к cKIT. В некоторых вариантах осуществления антитела или фрагменты антител (например, антигенсвязывающие фрагменты) к cKIT, раскрытые в данном документе, могут характеризоваться минимальной активностью индуцирования дегрануляции мастоцитов, например, скорректированной по исходному уровню регистрируемой величиной O.D., составляющей менее 0,25, например, менее 0,2, менее 0,15 или менее 0,1, в анализе высвобождения гексозаминидазы, даже будучи сшитыми и/или мультимеризованными в более крупные комплексы.
Конъюгаты антитела и лекарственного средства, предусмотренные в данном документе, включают фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), связывающий cKIT человека. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты антитела и лекарственного средства, предусмотренные в данном документе, включают фрагмент человеческого или гуманизированного антитела (например, Fab или Fab'), который специфически связывается с cKIT человека. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты антитела и лекарственного средства, предусмотренные в данном документе, включают человеческий или гуманизированный Fab', который специфически связывается с cKIT человека. В некоторых вариантах осуществ- 75 044279 ления конъюгаты антитела и лекарственного средства, предусмотренные в данном документе, включают человеческий или гуманизированный Fab, который специфически связывается с cKIT человека.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат домен VH, имеющий аминокислотную последовательность любого из доменов VH, описанных в табл. 1 (например, SEQ ID NO: 10, 36, 54, 69, 95). Другие подходящие антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') могут содержать домен VH, который характеризуется по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, или 99 процентной идентичностью последовательности с любым из доменов VH, описанных в табл. 1.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат CDR VH (или HCDR), имеющую аминокислотную последовательность любой из CDR VH (или HCDR), перечисленных в табл. 1. В конкретных аспектах настоящего изобретения предусмотрены антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), содержащие (или в качестве альтернативы состоящие из) один, два, три, четыре, пять или более CDR VH (или HCDR), имеющих аминокислотную последовательность любой из CDR VH (или HCDR), перечисленных в табл. 1.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат домен VL, имеющий аминокислотную последовательность любого из доменов VL, описанных в табл. 1 (например, SEQ ID NO: 23, 47, 82, 108). Другие подходящие антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') могут содержать домен VL, который характеризуется по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью последовательности с любым из доменов VL, описанных в табл. 1.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат CDR VL (или LCDR), имеющую аминокислотную последовательность любой из CDR VL (или LCDR), перечисленных в табл. 1. В конкретных аспектах настоящего изобретения предусмотрены антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), содержащие (или в качестве альтернативы состоящие из) один, два, три, четыре, пять или более CDR VL (или LCDR), имеющих аминокислотную последовательность любой из CDR VL (или LCDR), перечисленных в табл. 1.
Другие антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') к cKIT, раскрытые в данном документе, содержат аминокислоты, которые были подвергнуты мутации, но при этом они все еще характеризуются по меньшей мере 60, 70, 80, 90 или 95 процентной идентичностью последовательностей в областях CDR с областями CDR, отраженными в последовательностях, описанных в табл. 1. В некоторых аспектах они содержат мутантные аминокислотные последовательности, в которых не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот были подвергнуты мутации в областях CDR в сравнении с областями CDR, отраженными в последовательности, описанной в табл. 1.
В настоящем изобретении также предусмотрены последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют VH, VL, тяжелую цепь и легкую цепь антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека. Такие последовательности нуклеиновой кислоты могут быть оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих.
Таблица 1
Последовательности иллюстративных антител и фрагментов антител к cKIT
Abl/Fabl/Fab’l к cKIT | ||
SEQ ID NO: 1 | HCDR1 (Rabat) | SYAIS |
SEQ ID NO: 2 | HCDR2 (Rabat) | VIFPAEGAPGYAQRFQG |
SEQ ID NO: 3 | HCDR3 (Rabat) | GGYISDFDV |
SEQ ID NO: 4 | HCDR1 (Chothia) | GGTFSSY |
SEQ ID NO: 5 | HCDR2 (Chothia) | FPAEGA |
SEQ ID NO: 3 | HCDR3 (Chothia) | GGYISDFDV |
SEQ ID | HCDR1 | GGTFSSYAIS |
- 76 044279
NO: SEQ NO: | 6 | (комбинирован ная) HCDR2 (комбинирован ная) | VIFPAEGAPGYAQKFQG | ||
2 | ID | ||||
SEQ NO: | 3 | ID | HCDR3 (комбинирован ная) | GGYISDFDV | |
SEQ NO: | 7 | ID | HCDR1 | (IMGT) | GGTFSSYA |
SEQ NO: | 8 | ID | HCDR2 | (IMGT) | IFPAEGAP |
SEQ NO: | 9 | ID | HCDR3 | (IMGT) | ARGGYISDFDV |
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWV | |||||
SEQ NO: | 10 | ID | VH | RQAPGQGLEWMGVIFPAEGAPGYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSS CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAA AACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAGCATC CGGAGGGACGTTTAGCAGCTATGCGATTAGCTGGGTG CGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCG | |
SEQ NO: | 11 | ID | ДНК VH | TTATCTTCCCGGCTGAAGGCGCTCCGGGTTACGCCCA GAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAA AGCACCAGCACCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGC GCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGG TGGTTACATCTCTGACTTCGATGTTTGGGGCCAAGGC ACCCTGGTGACTGTTAGCTCA QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGVIFPAEGAPGYAQKFQGRVTITADE | |
SEQ NO: | 12 | ID | НС АЬ | STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE |
- 77 044279
VTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK | ||
SEQ ID NO: 13 | ДНК НС Ab | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAA AACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAGCATC CGGAGGGACGTTTAGCAGCTATGCGATTAGCTGGGTG CGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCG TTATCTTCCCGGCTGAAGGCGCTCCGGGTTACGCCCA GAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAA AGCACCAGCACCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGC GCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGG TGGTTACATCTCTGACTTCGATGTTTGGGGCCAAGGC ACCCTGGTGACTGTTAGCTCAGCTAGCACCAAGGGCC CCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTAC TTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAG GACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACT CTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGC CGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGC GTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGA CCTATATCTG СAAC G T GAAC CACAAG С С CAG СAACAC CAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGAC AAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAAC TGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAA G С С CAAG GACAC С С T GAT GAT CAG CAGGAC С С С C GAG GTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACC CAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAG TACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCG TGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAA GTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATC GAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGG AGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGA |
- 78 044279
GATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTG AAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGG AGAG СAAC G G С CAG С С C GAGAACAAC TACAAGAC CAC CCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTG TACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGC AGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGC С С T G CACAAC СAC ТАСAC С CAGAAG T С С С T GAG С С T G AGCCCCGGCAAG | ||
SEQ ID NO: 14 | HC (EU236) Fab’ | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGVIFPAEGAPGYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLG |
SEQ ID NO: 15 | ДНК HC Fab’ | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAA AACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAGCATC CGGAGGGACGTTTAGCAGCTATGCGATTAGCTGGGTG CGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCG TTATCTTCCCGGCTGAAGGCGCTCCGGGTTACGCCCA GAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAA AGCACCAGCACCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGC GCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGG TGGTTACATCTCTGACTTCGATGTTTGGGGCCAAGGC ACCCTGGTGACTGTTAGCTCAGCTAGCACCAAGGGCC CCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTAC TTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAG GACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACT CTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGC CGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGC GTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGA CCTATATCTG CAAC G T GAAC CACAAG С С CAG CAACAC CAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGAC AAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAAC TGCTGGGA |
- 79 044279
SEQ ID NO: 118 | Cys- HC(EU221)-HC- E152C (EU) Fab | QVQLVQSGAEVRRPGSSVRVSCRASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGVIFPAEGAPGYAQRFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSSASTRGPSVFPLAPSSRSTSGGTAALGCLVR DYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVDRRVEPRSCD |
SEQ ID NO: 119 | HC(EU230) Fab’ | QVQLVQSGAEVRRPGSSVRVSCRASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGVIFPAEGAPGYAQRFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSSASTRGPSVFPLAPSSRSTSGGTAALGCLVR DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVDRRVEPRSCD RTHTCPPCP |
SEQ ID NO: 120 | HC(EU232) Fab’ | QVQLVQSGAEVRRPGSSVRVSCRASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGVIFPAEGAPGYAQRFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSSASTRGPSVFPLAPSSRSTSGGTAALGCLVR DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVDRRVEPRSCD RTHTCPPCPAP |
SEQ ID NO: 121 | HC (EU236)-Pro Fab’ | QVQLVQSGAEVRRPGSSVRVSCRASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGVIFPAEGAPGYAQRFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSSASTRGPSVFPLAPSSRSTSGGTAALGCLVR DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVDRRVEPRSCD RTHTCPPCPAPELLGP |
SEQ ID NO: 16 | LCDR1 (Rabat) | RASQSISNYLA |
SEQ ID NO: 17 | LCDR2 (Rabat) | DASSLQS |
SEQ ID NO: 18 | LCDR3 (Rabat) | QQYYYESIT |
SEQ ID NO: 19 | LCDR1 (Chothia) | SQSISNY |
- 80 044279
SEQ ID NO: 2 0 | LCDR2 (Chothia) | DAS |
SEQ ID NO: 21 | LCDR3 (Chothia) | YYYESI |
SEQ ID NO: 16 | LCDR1 (комбинирован ная) | RASQSISNYLA |
SEQ ID NO: 17 | LCDR2 (комбинирован ная) | DASSLQS |
SEQ ID NO: 18 | LCDR3 (комбинирован ная) | QQYYYESIT |
SEQ ID NO: 22 | LCDR1 (IMGT) | QSISNY |
SEQ ID NO: 2 0 | LCDR2 (IMGT) | DAS |
SEQ ID NO: 18 | LCDR3 (IMGT) | QQYYYESIT |
SEQ ID NO: 2 3 | VL (каппа- цепь ) | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLAWYQ QKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQYYYESITFGQGTKVEIK |
SEQ ID NO: 2 4 | ДНК VL | GAT AT С C AGAT GAC С C AGAG С С C GAG CAG С С T GAG C G CCAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCAGAGC CAG C CAG TCTATTTC TAAC TACCTGGCTTGGTAC CAG CAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTATTAATCTACG ACGCTTCTTCTCTGCAAAGCGGCGTGCCGAGCCGCTT TAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTAGCTCTCTGCAACCGGAAGACTTTGCGACCTATT AT T G C CAG CAG TAG TAG TAG GAAT СТАТ САС С T T T G G CCAGGGCACGAAAGTTGAAATTAAA |
SEQ ID NO: 2 5 | LC (каппа- цепь) Ab/Fab' | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLAWYQ QKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQYYYESITFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW |
- 81 044279
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | ||
SEQ ID NO: 2 6 | ДНК LC Ab/Fab’ | GAT AT С C AGAT GAG С C AGAG С С C GAG GAG С С T GAG C G CCAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCAGAGC GAG C GAG TCTATTTC TAAC TACCTGGCTTGGTAC GAG CAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTATTAATCTACG ACGCTTCTTCTCTGCAAAGCGGCGTGCCGAGCCGCTT TAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTAGCTCTCTGCAACCGGAAGACTTTGCGACCTATT AT T G C GAG GAG TAG TAG TAG GAAT СТАТ САС С T T T G G CCAGGGCACGAAAGTTGAAATTAAACGTACGGTGGCC GCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGC AGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCT GAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGG AAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGG AGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTA CAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGAC TACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCC ACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAA CAGGGGCGAGTGC |
SEQ ID NO: 122 | Cys-LC-E165C (EU) Fab | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLAWYQ QKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQYYYESITFGQGTKVEIKRTVA APSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTCQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
SEQ ID NO: 123 | Cys-LC-S114C (EU) Fab | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLAWYQ QKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQYYYESITFGQGTKVEIKRTVA APCVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
Ab2/Fab2/Fab’2 к cKIT | ||
SEQ ID NO: 2 7 | HCDR1 (Rabat) | SHALS |
- 82 044279
SEQ ID NO: 2 8 | HCDR2 (Kabat) | GIIPS FGTADYAQKFQG |
SEQ ID NO: 2 9 | HCDR3 (Kabat) | GLYDFDY |
SEQ ID NO: 3 0 | HCDR1 (Chothia) | GGTFSSH |
SEQ ID NO: 31 | HCDR2 (Chothia) | IPSFGT |
SEQ ID NO: 2 9 | HCDR3 (Chothia) | GLYDFDY |
SEQ ID NO: 32 | HCDR1 (комбинирован ная) | GGTFSSHALS |
SEQ ID NO: 2 8 | HCDR2 (комбинирован ная) | GIIPS FGTADYAQKFQG |
SEQ ID NO: 2 9 | HCDR3 (комбинирован ная) | GLYDFDY |
SEQ ID NO: 33 | HCDR1 (IMGT) | GGTFSSHA |
SEQ ID NO: 34 | HCDR2 (IMGT) | IIPSFGTA |
SEQ ID NO: 35 | HCDR3 (IMGT) | ARGLYDFDY |
SEQ ID NO: 3 6 | VH | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSHALSWV RQAPGQGLEWMGGIIPS FGTADYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYDFDYWGQGTL VTVSS |
SEQ ID NO: 37 | ДНК VH | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAA AACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAGCATC CGGAGGGACGTTTTCTTCTCATGCTCTGTCTTGGGTG CGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCG GTATCATCCCGTCTTTCGGCACTGCGGACTACGCCCA GAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAA |
- 83 044279
AGCACCAGCACCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGC GCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGG TCTGTACGACTTCGACTACTGGGGCCAAGGCACCCTG GTGACTGTTAGCTCA | ||
SEQ ID NO: 3 8 | HC Ab | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSHALSWV RQAPGQGLEWMGGIIPS FGTADYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYDFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK |
SEQ ID NO: 3 9 | ДНК HC Ab | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAA AACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAGCATC CGGAGGGACGTTTTCTTCTCATGCTCTGTCTTGGGTG CGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCG GTATCATCCCGTCTTTCGGCACTGCGGACTACGCCCA GAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAA AGCACCAGCACCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGC GCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGG TCTGTACGACTTCGACTACTGGGGCCAAGGCACCCTG GTGACTGTTAGCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCG TGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGG CGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTAC TTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGG CTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCT GCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTG ACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATA T С T G CAAC G T GAAC CACAAG С С CAG CAACAC CAAG G T G GACAAGAGAG T G GAG С С CAAGAG С T GC GACAAGAC C |
- 84 044279
CACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGG GAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAA GGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACC TGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGG TGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA СAAC G С CAAGAC CAAG С С CAGAGAG GAG CAG TACAAC AGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGC ACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAA AGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAG ACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCC AGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGAC CAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGC TTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA AC G G С CAG С С C GAGAACAAC TAGAAGAC СAC С С С С С C AGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGC AAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCA ACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCA CAAC САС TACAC C CAGAAG T С С С T GAGC С T GAGC С С C GGCAAG | ||
SEQ ID NO: 4 0 | HC (EU236) Fab’ | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSHALSWV RQAPGQGLEWMGGIIPS FGTADYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYDFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLG |
SEQ ID NO: 41 | ДНК HC Fab’ | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAA AACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAGCATC CGGAGGGACGTTTTCTTCTCATGCTCTGTCTTGGGTG CGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCG GTATCATCCCGTCTTTCGGCACTGCGGACTACGCCCA GAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAA AGCACCAGCACCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGC GCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGG TCTGTACGACTTCGACTACTGGGGCCAAGGCACCCTG |
- 85 044279
GTGACTGTTAGCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCG TGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGG CGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTAC TTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGG CTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCT GCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTG ACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATA T С T G СAAC G T GAAC CACAAG С С CAG СAACAC CAAG G T G GACAAGAGAG T G GAG С С CAAGAG С T GC GACAAGAC C CACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGG GA | ||
SEQ ID NO: 124 | Cys- HC(EU221)-HC- E152C (EU) Fab | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSHALSWV RQAPGQGLEWMGGIIPS FGTADYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYDFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD |
SEQ ID NO: 125 | HC(EU230) Fab’ | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSHALSWV RQAPGQGLEWMGGIIPS FGTADYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYDFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKT HTCPPCP |
SEQ ID NO: 126 | HC(EU232) Fab’ | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSHALSWV RQAPGQGLEWMGGIIPS FGTADYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYDFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKT HTCPPCPAP |
SEQ ID NO: 127 | HC(EU236)-Pro Fab’ | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSHALSWV RQAPGQGLEWMGGIIPS FGTADYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYDFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY |
- 86 044279
FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVDRRVEPRSCDRT HTCPPCPAPELLGP | ||
SEQ ID NO: 42 | LCDR1 (Rabat) | RASQDISQDLA |
SEQ ID NO: 17 | LCDR2 (Rabat) | DASSLQS |
SEQ ID NO: 4 3 | LCDR3 (Rabat) | QQYYYLPST |
SEQ ID NO: 4 4 | LCDR1 (Chothia) | SQDISQD |
SEQ ID NO: 2 0 | LCDR2 (Chothia) | DAS |
SEQ ID NO: 4 5 | LCDR3 (Chothia) | YYYLPS |
SEQ ID NO: 42 | LCDR1 (комбинирован ная) | RASQDISQDLA |
SEQ ID NO: 17 | LCDR2 (комбинирован ная) | DASSLQS |
SEQ ID NO: 4 3 | LCDR3 (комбинирован ная) | QQYYYLPST |
SEQ ID NO: 4 6 | LCDR1 (IMGT) | QDISQD |
SEQ ID NO: 2 0 | LCDR2 (IMGT) | DAS |
SEQ ID NO: 4 3 | LCDR3 (IMGT) | QQYYYLPST |
SEQ ID NO: 4 7 | VL (каппа- цепь ) | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISQDLAWYQ QRPGRAPRLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFAVYYCQQYYYLPSTFGQGTRVEIR |
SEQ ID NO: 4 8 | ДНК VL | GAT AT С C AGAT GAC С C AGAG С С C GAG CAG С С T GAG C G CCAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCAGAGC |
- 87 044279
CAGCCAGGACATTTCTCAGGACCTGGCTTGGTACCAG CAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTATTAATCTACG ACGCTTCTTCTCTGCAAAGCGGCGTGCCGAGCCGCTT TAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTAGCTCTCTGCAACCGGAAGACTTTGCGGTGTATT ATTGCCAGCAGTACTACTACCTGCCGTCTACCTTTGG CCAGGGCACGAAAGTTGAAATTAAA | ||
SEQ ID NO: 4 9 | LC (каппа- цепь) Ab/Fab' | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISQDLAWYQ QKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFAVYYCQQYYYLPSTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
SEQ ID NO: 50 | ДНК LC Ab/Fab’ | GAT AT С C AGAT GAG С C AGAG GCG GAG GAG С С T GAG C G CCAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCAGAGC CAGCCAGGACATTTCTCAGGACCTGGCTTGGTACCAG CAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTATTAATCTACG ACGCTTCTTCTCTGCAAAGCGGCGTGCCGAGCCGCTT TAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTAGCTCTCTGCAACCGGAAGACTTTGCGGTGTATT ATTGCCAGCAGTACTACTACCTGCCGTCTACCTTTGG CCAGGGCACGAAAGTTGAAATTAAACGTACGGTGGCC GCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGC AGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCT GAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGG AAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGG AGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTA CAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGAC TACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCC ACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAA CAGGGGCGAGTGC |
SEQ ID NO: 128 | Cys-LC-E165C (EU) Fab | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISQDLAWYQ QKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFAVYYCQQYYYLPSTFGQGTKVEIKRTVA APSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW |
-88044279
RVDNALQSGNSQESVTCQDSRDSTYSLSSTLTLSRAD YERHRVYACEVTHQGLSSPVTRSFNRGEC | ||
SEQ ID NO: 129 | Cys-LC-S114C (EU) Fab | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISQDLAWYQ QRPGRAPRLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFAVYYCQQYYYLPSTFGQGTRVEIRRTVA APCVFIFPPSDEQLRSGTASWCLLNNFYPREARVQW RVDNALQSGNSQESVTEQDSRDSTYSLSSTLTLSRAD YERHRVYACEVTHQGLSSPVTRSFNRGEC |
Ab3/Fab3/Fab'3 к cKIT | ||
SEQ ID NO: 1 | HCDR1 (Rabat) | SYAIS |
SEQ ID NO: 51 | HCDR2 (Rabat) | TIGPFEGQPRYAQRFQG |
SEQ ID NO: 3 | HCDR3 (Rabat) | GGYISDFDV |
SEQ ID NO: 4 | HCDR1 (Chothia) | GGTFSSY |
SEQ ID NO: 52 | HCDR2 (Chothia) | GPFEGQ |
SEQ ID NO: 3 | HCDR3 (Chothia) | GGYISDFDV |
SEQ ID NO: 6 | HCDR1 (комбинирован ная) | GGTFSSYAIS |
SEQ ID NO: 51 | HCDR2 (комбинирован ная) | TIGPFEGQPRYAQRFQG |
SEQ ID NO: 3 | HCDR3 (комбинирован ная) | GGYISDFDV |
SEQ ID NO: 7 | HCDR1 (IMGT) | GGTFSSYA |
SEQ ID NO: 53 | HCDR2 (IMGT) | IGPFEGQP |
SEQ ID | HCDR3 (IMGT) | ARGGYISDFDV |
- 89 044279
NO: 9 | ||
SEQ ID NO: 54 | VH | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGTIGPFEGQPRYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSS |
SEQ ID NO: 55 | ДНК VH | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAA AACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAGCATC CGGAGGGACGTTTAGCAGCTATGCGATTAGCTGGGTG CGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCA CTATCGGTCCGTTCGAAGGCCAGCCGCGTTACGCCCA GAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAA AGCACCAGCACCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGC GCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGG TGGTTACATCTCTGACTTCGATGTTTGGGGCCAAGGC ACCCTGGTGACTGTTAGCTCA |
SEQ ID NO: 5 6 | HC Ab | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGTIGPFEGQPRYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK |
SEQ ID NO: 57 | ДНК HC Ab | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAA AACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAGCATC CGGAGGGACGTTTAGCAGCTATGCGATTAGCTGGGTG CGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCA CTATCGGTCCGTTCGAAGGCCAGCCGCGTTACGCCCA GAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAA AGCACCAGCACCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGC |
- 90 044279
GCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGG TGGTTACATCTCTGACTTCGATGTTTGGGGCCAAGGC ACCCTGGTGACTGTTAGCTCAGCTAGCACCAAGGGCC CAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTAC TTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAG GACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACT CTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGC CGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGC GTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGA ССTATATСTGСAACGTGAACCACAAGССCAGСAACAC CAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGAC AAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAAC TGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAA G С С CAAG GAGAC С С T GAT GAT CAG CAGGAC С С С C GAG GTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACC CAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAG TACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCG TGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAA GTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATC GAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGG AGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTG AAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGG AGAG GAAC G G C GAG С С C GAGAACAAC TACAAGAC CAC CCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTG TACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGC AGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGC С С T G CACAAC СAC ТАСAC С CAGAAG T С С С T GAG С С T G AGCCCCGGCAAG | ||
SEQ ID NO: 58 | HC (EU236) Fab’ | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGTIGPFEGQPRYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS |
- 91 044279
WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLG | ||
SEQ ID NO: 59 | ДНК HC Fab' | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAA AACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAGCATC CGGAGGGACGTTTAGCAGCTATGCGATTAGCTGGGTG CGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCA CTATCGGTCCGTTCGAAGGCCAGCCGCGTTACGCCCA GAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAA AGCACCAGCACCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGC GCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGG TGGTTACATCTCTGACTTCGATGTTTGGGGCCAAGGC ACCCTGGTGACTGTTAGCTCAGCTAGCACCAAGGGCC CAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTAC TTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAG GACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACT CTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGC CGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGC GTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGA ССTATATСTGCAACGTGAACCACAAGССCAGCAACAC CAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGAC AAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAAC TGCTGGGA |
SEQ ID NO: 130 | Cys- HC(EU221)-HC- E152C (EU) Fab | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGTIGPFEGQPRYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD |
SEQ ID NO: 131 | HC(EU230) Fab’ | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGTIGPFEGQPRYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD KTHTCPPCP |
- 92 044279
SEQ ID NO: 132 | HC(EU232) Fab’ | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGTIGPFEGQPRYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD КТНТСРРСРАР |
SEQ ID NO: 133 | HC (EU236)-Pro Fab’ | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWV RQAPGQGLEWMGTIGPFEGQPRYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYISDFDVWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGP |
SEQ ID NO: 16 | LCDR1 (Kabat) | RASQSISNYLA |
SEQ ID NO: 17 | LCDR2 (Kabat) | DASSLQS |
SEQ ID NO: 18 | LCDR3 (Kabat) | QQYYYESIT |
SEQ ID NO: 19 | LCDR1 (Chothia) | SQSISNY |
SEQ ID NO: 2 0 | LCDR2 (Chothia) | DAS |
SEQ ID NO: 21 | LCDR3 (Chothia) | YYYESI |
SEQ ID NO: 16 | LCDR1 (комбинирован ная) | RASQSISNYLA |
SEQ ID NO: 17 | LCDR2 (комбинирован ная) | DASSLQS |
SEQ ID NO: 18 | LCDR3 (комбинирован ная) | QQYYYESIT |
- 93 044279
SEQ NO: | 22 | ID | LCDR1 | (IMGT) | QSISNY |
SEQ NO: | 20 | ID | LCDR2 | (IMGT) | DAS |
SEQ NO: | 18 | ID | LCDR3 | (IMGT) | QQYYYESIT |
SEQ NO: | 23 | ID | VL цепь ) | (каппа- | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLAWYQ QKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQYYYESITFGQGTKVEIK GATAT С CAGAT GAG С CAGAG С С C GAG GAG OCT GAG C G CCAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCAGAGC GAG C GAG TCTATTTC TAAC TACCTGGCTTGGTAC GAG |
SEQ NO: | 24 | ID | ДНК VL | CAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTATTAATCTACG ACGCTTCTTCTCTGCAAAGCGGCGTGCCGAGCCGCTT TAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTAGCTCTCTGCAACCGGAAGACTTTGCGACCTATT AT T G C GAG GAG TAG TAG TAG GAAT СТАТ САС C Τ T T G G CCAGGGCACGAAAGTTGAAATTAAA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLAWYQ QKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT | |
SEQ | ID | LC | (каппа- | ISSLQPEDFATYYCQQYYYESITFGQGTKVEIKRTVA | |
NO: | 25 | цепь) . | Ab/Fab’ | APSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW | |
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD | |||||
YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | |||||
GATAT С CAGAT GAC С CAGAG С С C GAG CAG С С T GAG C G | |||||
CCAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCAGAGC | |||||
CAG C CAG TCTATTTC TAAC TACCTGGCTTGGTAC CAG | |||||
CAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTATTAATCTACG | |||||
SEQ NO: | 26 | ID | ДНК Ab/Fab | LC ! | ACGCTTCTTCTCTGCAAAGCGGCGTGCCGAGCCGCTT TAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTAGCTCTCTGCAACCGGAAGACTTTGCGACCTATT AT T G C CAG CAG TAG TAG TAG GAAT СТАТ САС C Τ T T G G CCAGGGCACGAAAGTTGAAATTAAACGTACGGTGGCC GCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGC AGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCT |
- 94 044279
GAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGG AAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGG AGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTA CAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGAC TACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCC ACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAA CAGGGGCGAGTGC | ||
SEQ ID NO: 134 | Cys-LC-E165C (EU) Fab | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLAWYQ QRPGRAPRLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT IS SLQPEDFATYYCQQYYYESIT FGQGTRVEIRRTVA APSVFIFPPSDEQLRSGTASWCLLNNFYPREARVQW RVDNALQSGNSQESVTCQDSRDSTYSLSSTLTLSRAD YERHRVYACEVTHQGLSSPVTRSFNRGEC |
SEQ ID NO: 135 | Cys-LC-S114C (EU) Fab | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLAWYQ QRPGRAPRLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT IS SLQPEDFATYYCQQYYYESIT FGQGTRVEIRRTVA APCVFI FPPSDEQLRSGTASWCLLNNFYPREARVQW RVDNALQSGNSQESVTEQDSRDSTYSLSSTLTLSRAD YERHRVYACEVTHQGLSSPVTRSFNRGEC |
Ab4/Fab4/Fab'4 к cKIT | ||
SEQ ID NO: 60 | HCDR1 (Rabat) | TNSAAWN |
SEQ ID NO: 61 | HCDR2 (Rabat) | RIYYRS QWLNDYAVSVRS |
SEQ ID NO: 62 | HCDR3 (Rabat) | QLTYPYTVYHRALDV |
SEQ ID NO: 63 | HCDR1 (Chothia) | GDSVSTNSA |
SEQ ID NO: 64 | HCDR2 (Chothia) | YYRSQWL |
SEQ ID NO: 62 | HCDR3 (Chothia) | QLTYPYTVYHRALDV |
SEQ ID NO: 65 | HCDR1 (комбинирован ная) | GDSVSTNSAAWN |
- 95 044279
SEQ ID NO: 61 | HCDR2 (комбинирован ная) | RIYYRS QWLNDYAVSVKS |
SEQ ID NO: 62 | HCDR3 (комбинирован ная) | QLTYPYTVYHKALDV |
SEQ ID NO: 6 6 | HCDR1 (IMGT) | GDSVSTNSAA |
SEQ ID NO: 67 | HCDR2 (IMGT) | IYYRSQWLN |
SEQ ID NO: 68 | HCDR3 (IMGT) | ARQLTYPYTVYHKALDV |
SEQ ID NO: 69 | VH | QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSTNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRIYYRSQWLNDYAVSVKSRITIN PDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARQLTYPYTVYH KALDVWGQGTLVTVSS |
SEQ ID NO: 7 0 | ДНК VH | CAGGTGCAATTGCAGCAGAGCGGTCCGGGCCTGGTGA AACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCGATTTC CGGAGATAGCGTGAGCACTAACTCTGCTGCTTGGAAC TGGATTCGTCAGAGCCCGAGCCGTGGCCTCGAGTGGC TGGGCCGTATCTACTACCGTAGCCAGTGGCTGAACGA CTATGCCGTGAGCGTGAAAAGCCGCATTACCATTAAC CCGGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGCAACTGA ACAGCGTGACCCCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTG CGCGCGTCAGCTGACTTACCCGTACACTGTTTACCAT AAAGCTCTGGATGTTTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCA CCGTCTCCTCG |
SEQ ID NO: 71 | HC Ab | QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSTNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRIYYRSQWLNDYAVSVKSRITIN PDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARQLTYPYTVYH KALDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN |
- 96 044279
AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK | ||
SEQ ID NO: 72 | ДНК HC Ao | CAGGTGCAATTGCAGCAGAGCGGTCCGGGCCTGGTGA AACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCGATTTC CGGAGATAGCGTGAGCACTAACTCTGCTGCTTGGAAC TGGATTCGTCAGAGCCCGAGCCGTGGCCTCGAGTGGC TGGGCCGTATCTACTACCGTAGCCAGTGGCTGAACGA CTATGCCGTGAGCGTGAAAAGCCGCATTACCATTAAC CCGGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGCAACTGA ACAGCGTGACCCCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTG CGCGCGTCAGCTGACTTACCCGTACACTGTTTACCAT AAAGCTCTGGATGTTTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCA CCGTCTCCTCGGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTT CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGA ACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCC CCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCT GACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAG AGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAG TGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTG CAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAGAG T G GAG С С CAAGAG С T G C GACAAGAC С CACA CCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGG GCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGAC ACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCG TGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAAC GCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCA CCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCA GGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTC TCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAA TCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGT GTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAG |
- 97 044279
AACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCT ACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGG С CAG С С C GAGAACAAC TACAAGAC СAC С С С С С CAG T G CTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGC TGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGT GTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAC CACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCA AG | ||
SEQ ID NO: 7 3 | HC (EU236) Fab' | QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSTNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRIYYRSQWLNDYAVSVKSRITIN PDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARQLTYPYTVYH KALDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG |
SEQ ID NO: 7 4 | ДНК HC Fab’ | CAGGTGCAATTGCAGCAGAGCGGTCCGGGCCTGGTGA AACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCGATTTC CGGAGATAGCGTGAGCACTAACTCTGCTGCTTGGAAC TGGATTCGTCAGAGCCCGAGCCGTGGCCTCGAGTGGC TGGGCCGTATCTACTACCGTAGCCAGTGGCTGAACGA CTATGCCGTGAGCGTGAAAAGCCGCATTACCATTAAC CCGGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGCAACTGA ACAGCGTGACCCCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTG CGCGCGTCAGCTGACTTACCCGTACACTGTTTACCAT AAAGCTCTGGATGTTTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCA CCGTCTCCTCGGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTT CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGA ACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCC CCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCT GACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAG AGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAG TGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTG CAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAGAG T G GAG С С CAAGAG С T G C GACAAGAC С CACA CCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGA |
- 98 044279
SEQ ID NO: 136 | Cys- HC(EU221)-HC- E152C (EU) Fab | QVQLQQSGPGLVRPSQTLSLTCAISGDSVSTNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRIYYRSQWLNDYAVSVRSRITIN PDTSRNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARQLTYPYTVYH RALDVWGQGTLVTVSSASTRGPSVFPLAPSSRSTSGG TAALGCLVRDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVD RRVEPRSCD |
SEQ ID NO: 137 | HC(EU230) Fab’ | QVQLQQSGPGLVRPSQTLSLTCAISGDSVSTNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRIYYRSQWLNDYAVSVRSRITIN PDTSRNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARQLTYPYTVYH RALDVWGQGTLVTVSSASTRGPSVFPLAPSSRSTSGG TAALGCLVRDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVD RRVEPRSCDRTHTCPPCP |
SEQ ID NO: 138 | HC(EU232) Fab’ | QVQLQQSGPGLVRPSQTLSLTCAISGDSVSTNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRIYYRSQWLNDYAVSVRSRITIN PDTSRNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARQLTYPYTVYH RALDVWGQGTLVTVSSASTRGPSVFPLAPSSRSTSGG TAALGCLVRDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVD RRVEPRSCDRTHTCPPCPAP |
SEQ ID NO: 139 | HC(EU236)-Pro Fab’ | QVQLQQSGPGLVRPSQTLSLTCAISGDSVSTNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRIYYRSQWLNDYAVSVRSRITIN PDTSRNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARQLTYPYTVYH RALDVWGQGTLVTVSSASTRGPSVFPLAPSSRSTSGG TAALGCLVRDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVD RRVEPRSCDRTHTCPPCPAPELLGP |
SEQ ID NO: 7 5 | LCDR1 (Rabat) | SGDNLGDQYVS |
SEQ ID NO: 7 6 | LCDR2 (Rabat) | DDTDRPS |
SEQ ID NO: 7 7 | LCDR3 (Rabat) | QSTDSRSW |
SEQ ID | LCDR1 | DNLGDQY |
- 99 044279
NO: 7 8 | (Chothia) | |
SEQ ID NO: 7 9 | LCDR2 (Chothia) | DDT |
SEQ ID NO: 8 0 | LCDR3 (Chothia) | TDSKSV |
SEQ ID NO: 7 5 | LCDR1 (комбинирован ная) | SGDNLGDQYVS |
SEQ ID NO: 7 6 | LCDR2 (комбинирован ная) | DDTDRPS |
SEQ ID NO: 7 7 | LCDR3 (комбинирован ная) | QSTDSKSW |
SEQ ID NO: 81 | LCDR1 (IMGT) | NLGDQY |
SEQ ID NO: 7 9 | LCDR2 (IMGT) | DDT |
SEQ ID NO: 7 7 | LCDR3 (IMGT) | QSTDSKSW |
SEQ ID NO: 82 | VL (лямбда- цепь ) | DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNLGDQYVSWYQQ KPGQAPVLVIYDDTDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAEDEADYYCQSTDSKSWFGGGTKLTVL |
SEQ ID NO: 8 3 | ДНК VL | GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGTGA GCCCGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCGGCGA TAAC С T G G G T GAC СAATAC GTTTCTTGGTAC CAG CAG AAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGATCTACGACG ACACTGACCGTCCGAGCGGCATCCCGGAACGTTTTAG CGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATT AGCGGCACCCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTACT GCCAGTCTACTGACTCTAAATCTGTTGTGTTTGGCGG CGGCACGAAGTTAACCGTCCTA |
SEQ ID NO: 8 4 | LC (лямбда- цепь) Ab/Fab' | DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNLGDQYVSWYQQ KPGQAPVLVIYDDTDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAEDEADYYCQSTDSKSWFGGGTKLTVLGQPKA |
- 100 044279
APSVTLFPPSSEELQANRATLVCLISDFYPGAVTVAW RADSSPVRAGVETTTPSRQSNNRYAASSYLSLTPEQW RSHRSYSCQVTHEGSTVERTVAPTECS | ||
SEQ ID NO: 8 5 | ДНК LC Ab/Fab’ | GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGTGA GCCCGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCGGCGA TAAC С T G G G T GAG СAATAC GTTTCTTGGTAC CAG CAG AAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGATCTACGACG ACACTGACCGTCCGAGCGGCATCCCGGAACGTTTTAG CGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATT AGCGGCACCCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTACT GCCAGTCTACTGACTCTAAATCTGTTGTGTTTGGCGG CGGCACGAAGTTAACCGTCCTAGGCCAGCCTAAGGCC GCTCCCTCCGTGACCCTGTTCCCCCCCAGCTCCGAGG AACTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGAT CAGCGACTTCTACCCTGGCGCCGTGACCGTGGCCTGG AAGGCCGACAGCAGCCCCGTGAAGGCCGGCGTGGAGA CAAC СAC С С С CAG CAAG CAGAG CAACAACAAG TAC G C CGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAGTGG AAGAG С CACAGAAG C TAGAG С T G С CAGG T СAC С CAC G AGGGCAGCACCGTGGAGAAAACCGTGGCCCCCACCGA GTGCAGC |
SEQ ID NO: 140 | Cys-LC (лямбда- цепь )-Al43C (EU) Fab | DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNLGDQYVSWYQQ RPGQAPVLVIYDDTDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAEDEADYYCQSTDSRSWFGGGTRLTVLGQPRA APSVTLFPPSSEELQANRATLVCLISDFYPGCVTVAW RADSSPVRAGVETTTPSRQSNNRYAASSYLSLTPEQW RSHRSYSCQVTHEGSTVERTVAPTECS |
Ab5/Fab5/Fab’5 к cKIT | ||
SEQ ID NO: 8 6 | HCDR1 (Rabat) | NYWIA |
SEQ ID NO: 8 7 | HCDR2 (Rabat) | IIYPSNSYTLYSPSFQG |
SEQ ID NO: 8 8 | HCDR3 (Rabat) | VPPGGSISYPAFDH |
SEQ ID | HCDR1 | GYSFTNY |
- 101 044279
NO: 8 9 | (Chothia) | |
SEQ ID NO: 90 | HCDR2 (Chothia) | YPSNSY |
SEQ ID NO: 8 8 | HCDR3 (Chothia) | VPPGGSISYPAFDH |
SEQ ID NO: 91 | HCDR1 (комбинирован ная) | GYSFTNYWIA |
SEQ ID NO: 8 7 | HCDR2 (комбинирован ная) | IIYPSNSYTLYSPSFQG |
SEQ ID NO: 8 8 | HCDR3 (комбинирован ная) | VPPGGSISYPAFDH |
SEQ ID NO: 92 | HCDR1 (IMGT) | GYSFTNYW |
SEQ ID NO: 93 | HCDR2 (IMGT) | IYPSNSYT |
SEQ ID NO: 94 | HCDR3 (IMGT) | ARVPPGGSISYPAFDH |
SEQ ID NO: 95 | VH | QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYWIAWV RQMPGKGLEWMGIIYPSNSYTLYSPSFQGQVTISADK SISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVPPGGSISYPAFD HWGQGTLVTVSS |
SEQ ID NO: 9 6 | ДНК VH | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCGGAAGTGAAAA AACCGGGCGAAAGCCTGAAAATTAGCTGCAAAGGCTC CGGATATAGCTTCACTAACTACTGGATCGCTTGGGTG CGCCAGATGCCGGGCAAAGGTCTCGAGTGGATGGGCA TCATCTACCCGTCTAACAGCTACACCCTGTATAGCCC GAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCATTAGCGCGGATAAA AGCATCAGCACCGCGTATCTGCAATGGAGCAGCCTGA AAGCGAGCGATACCGCGATGTATTATTGCGCGCGTGT TCCGCCGGGTGGTTCTATCTCTTACCCGGCTTTCGAT CATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCTCA |
SEQ ID | НС Ab | QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYWIAWV |
- 102 044279
NO: 97 | RQMPGKGLEWMGIIYPSNSYTLYSPSFQGQVTISADK SISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVPPGGSISYPAFD HWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK | |
SEQ ID NO: 98 | ДНК HC Ab | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCGGAAGTGAAAA AACCGGGCGAAAGCCTGAAAATTAGCTGCAAAGGCTC CGGATATAGCTTCACTAACTACTGGATCGCTTGGGTG CGCCAGATGCCGGGCAAAGGTCTCGAGTGGATGGGCA TCATCTACCCGTCTAACAGCTACACCCTGTATAGCCC GAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCATTAGCGCGGATAAA AGCATCAGCACCGCGTATCTGCAATGGAGCAGCCTGA AAGCGAGCGATACCGCGATGTATTATTGCGCGCGTGT TCCGCCGGGTGGTTCTATCTCTTACCCGGCTTTCGAT CATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCTCAG CTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCC CAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTG GGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGA CAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGT GCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTG TACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCT CTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCA CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAG CCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCT GCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTT CCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATC AGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACG TGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTA |
- 103 044279
CGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAG CCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGG TGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAA CGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCC CTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCA AGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCC CCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCC CTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAA CAAC TACAAGAC СAC С С С С С CAG T G С T G GACAG C GAC GGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACA AGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAG C G T GAT G CAC GAG G С С С T G CACAAC СAC ТАСAC С CAG AAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG | ||
SEQ ID NO: 99 | HC (EU236) Fab’ | QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYWIAWV RQMPGKGLEWMGIIYPSNSYTLYSPSFQGQVTISADK SISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVPPGGSISYPAFD HWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLG |
SEQ ID NO: 100 | ДНК HC Fab’ | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCGGAAGTGAAAA AACCGGGCGAAAGCCTGAAAATTAGCTGCAAAGGCTC CGGATATAGCTTCACTAACTACTGGATCGCTTGGGTG CGCCAGATGCCGGGCAAAGGTCTCGAGTGGATGGGCA TCATCTACCCGTCTAACAGCTACACCCTGTATAGCCC GAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCATTAGCGCGGATAAA AGCATCAGCACCGCGTATCTGCAATGGAGCAGCCTGA AAGCGAGCGATACCGCGATGTATTATTGCGCGCGTGT TCCGCCGGGTGGTTCTATCTCTTACCCGGCTTTCGAT CATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCTCAG CTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCC CAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTG GGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGA CAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGT |
- 104 044279
Cys- | GCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTG TACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCT CTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCA CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAG CCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCT GCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGA QVQLVQSGAEVRRPGESLRISCRGSGYSFTNYWIAWV RQMPGRGLEWMGIIYPSNSYTLYSPSFQGQVTISADR SISTAYLQWSSLRASDTAMYYCARVPPGGSISYPAFD | |
SEQ ID NO: 141 | HC(EU221)-HC- E152C (EU) Fab | HWGQGTLVTVSSASTRGPSVFPLAPSSRSTSGGTAAL GCLVRDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVDRRVE PRSCD QVQLVQSGAEVRRPGESLRISCRGSGYSFTNYWIAWV RQMPGRGLEWMGIIYPSNSYTLYSPSFQGQVTISADR SISTAYLQWSSLRASDTAMYYCARVPPGGSISYPAFD |
SEQ ID NO: 142 | HC(EU230) Fab’ | HWGQGTLVTVSSASTRGPSVFPLAPSSRSTSGGTAAL GCLVRDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVDRRVE PRSCDRTHTCPPCP QVQLVQSGAEVRRPGESLRISCRGSGYSFTNYWIAWV RQMPGRGLEWMGIIYPSNSYTLYSPSFQGQVTISADR SISTAYLQWSSLRASDTAMYYCARVPPGGSISYPAFD |
SEQ ID NO: 143 | HC(EU232) Fab’ | HWGQGTLVTVSSASTRGPSVFPLAPSSRSTSGGTAAL GCLVRDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVDRRVE PRSCDRTHTCPPCPAP QVQLVQSGAEVRRPGESLRISCRGSGYSFTNYWIAWV RQMPGRGLEWMGIIYPSNSYTLYSPSFQGQVTISADR SISTAYLQWSSLRASDTAMYYCARVPPGGSISYPAFD |
SEQ ID NO: 144 | HC(EU236)-Pro Fab’ | HWGQGTLVTVSSASTRGPSVFPLAPSSRSTSGGTAAL GCLVRDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHRPSNTRVDRRVE PRSCDRTHTCPPCPAPELLGP |
SEQ ID | LCDR1 (Rabat) | SGDNIGSIYAS |
- 105 044279
NO: 101 | ||
SEQ ID NO: 102 | LCDR2 (Rabat) | RDNRRPS |
SEQ ID NO: 103 | LCDR3 (Rabat) | SVTDMEQHSV |
SEQ ID NO: 104 | LCDR1 (Chothia) | DNIGSIY |
SEQ ID NO: 105 | LCDR2 (Chothia) | RDN |
SEQ ID NO: 10 6 | LCDR3 (Chothia) | TDMEQHS |
SEQ ID NO: 101 | LCDR1 (комбинирован ная) | SGDNIGSIYAS |
SEQ ID NO: 102 | LCDR2 (комбинирован ная) | RDNRRPS |
SEQ ID NO: 103 | LCDR3 (комбинирован ная) | SVTDMEQHSV |
SEQ ID NO: 107 | LCDR1 (IMGT) | NIGSIY |
SEQ ID NO: 105 | LCDR2 (IMGT) | RDN |
SEQ ID NO: 103 | LCDR3 (IMGT) | SVTDMEQHSV |
SEQ ID NO: 108 | VL (лямбда- цепь ) | DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGSIYASWYQQ RPGQAPVLVIYRDNRRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAEDEADYYCSVTDMEQHSVFGGGTRLTVL |
SEQ ID NO: 109 | ДНК VL | GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGTGA GCCCGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCGGCGA TAACAT CGGTTCTATCTACGCTTCTTGGTAC CAG CAG AAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGATCTACCGTG ACAACAAACGTСCGAGCGGCATССCGGAACGTTTTAG CGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATT |
- 106 044279
SEQ NO: | НО | ID | AGCGGCACCCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTACT GCTCCGTTACTGACATGGAACAGCATTCTGTGTTTGG CGGCGGCACGAAGTTAACCGTCCTA DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGSIYASWYQQ KPGQAPVLVIYRDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAEDEADYYCSVTDMEQHSVFGGGTKLTVLGQPK AAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVA WKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS | |
LC (лямбда- | ||||
цепь) Ab/Fab' | ||||
SEQ | ID | ДНК LC | GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGTGA GCCCGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCGGCGA TAACAT CGGTTCTATCTACGCTTCTTGGTAC CAG CAG AAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGATCTACCGTG ACAACAAACGTСCGAGCGGCATССCGGAACGTTTTAG CGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATT AGCGGCACCCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTACT GCTCCGTTACTGACATGGAACAGCATTCTGTGTTTGG CGGCGGCACGAAGTTAACCGTCCTAGGCCAGCCTAAG | |
NO: | 111 | Ab/Fab' | GCCGCTCCCTCCGTGACCCTGTTCCCCCCCAGCTCCG | |
SEQ | ID | Cys-LC (лямбда- | AGGAACTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTGTGCCT GATCAGCGACTTCTACCCTGGCGCCGTGACCGTGGCC TGGAAGGCCGACAGCAGCCCCGTGAAGGCCGGCGTGG AGACAAC СAC С С С CAG CAAG CAGAG CAACAACAAGTA CGCCGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAG TGGAAGAGCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACCC ACGAGGGCAGCACCGTGGAGAAAACCGTGGCCCCCAC CGAGTGCAGC DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGSIYASWYQQ KPGQAPVLVIYRDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAEDEADYYCSVTDMEQHSVFGGGTKLTVLGQPK | |
NO: | 145 | цепь )-A144C | AAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGCVTVA | |
(EU) Fab | WKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS |
Другие антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') к cKIT, раскрытые в данном документе, включают такие, в которых аминокислоты или нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислоты, были подвергнуты мутации, но при этом они все еще характеризуются по меньшей мере 60, 70, 80, 90 или 95 процентной идентичностью с последовательностями, описанными в табл. 1. В некоторых аспектах они охватывают мутантные аминокислотные последовательности, в которых не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот были подвергнуты мутации в вариабельных областях в сравнении с вариабельными областями CDR, отраженными в последовательности, описанной в табл. 1, при этом они сохраняют практически такую же терапевтическую активность.
Поскольку каждое из таких антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') может связываться с cKIT, последовательности VH, VL, тяжелой цепи и легкой цепи (аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности) можно подвергать смешиванию и подбору для создания других антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), связывающих cKIT. Такие подвергнутые смешиванию и подбору антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), связывающие cKIT, можно тестировать с применением анализов связывания, известных из уровня техники (например, разновидностей ELISA и других анализов, описанных в разделе Примеры). Когда такие цепи подвергают смешиванию и подбору, последовательность VH из конкретной пары VH/VL следует заменить структурно подобной последовательностью VH. Аналогичным образом, последовательность тяжелой цепи из конкретной пары тяжелая цепь/легкая цепь
- 107 044279 следует заменить структурно подобной последовательностью тяжелой цепи. Аналогичным образом, последовательность VL из конкретной пары VH/VL следует заменить структурно подобной последовательностью VL. Аналогичным образом, последовательность легкой цепи из конкретной пары тяжелая цепь/легкая цепь следует заменить структурно подобной последовательностью легкой цепи.
Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены выделенное антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), имеющие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 36, 54, 69 и 95 (табл. 1); и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 47, 82 и 108 (табл. 1); где антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') специфически связываются с cKIT человека.
В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрено выделенное антитело, имеющее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 38, 56, 71 и 97; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, 49, 84 и 110.
В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен выделенный фрагмент антитела (например, Fab'), имеющий тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 40, 58, 73 и 99; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, 49, 84 и 110.
В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрены антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), связывающие cKIT, которые содержат CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи, описанные в табл. 1, или их комбинации. Аминокислотные последовательности CDR1 VH (или HCDR1) антител или фрагментов антител (например, Fab или Fab') показаны под SEQ ID NO: 1, 4, 6, 7, 27, 30, 32, 33, 60, 63, 65, 66, 86, 89, 91 и 92. Аминокислотные последовательности CDR2 VH (или HCDR2) антител или фрагментов антител (например, Fab или Fab') и показаны под SEQ ID NO: 2, 5, 8, 28, 31, 34, 51, 52, 53, 61, 64, 67, 87, 90 и 93. Аминокислотные последовательности CDR3 VH (или HCDR3) антител или фрагментов антител (например, Fab или Fab') показаны под SEQ ID NO: 3, 9, 29, 35, 62, 68, 88 и 94. Аминокислотные последовательности CDR1 VL (или LCDR1) антител или фрагментов антител (например, Fab или Fab') показаны под SEQ ID NO: 16, 19, 22, 42, 44, 46, 75, 78, 81, 101, 104 и 107. Аминокислотные последовательности CDR2 VL (или LCDR2) антител или фрагментов антител (например, Fab или Fab') показаны под SEQ ID NO: 17, 20, 76, 79, 102 и 105. Аминокислотные последовательности CDR3 VL (или LCDR3) антител или фрагментов антител (например, Fab или Fab') показаны под SEQ ID NO: 18, 21, 43, 45, 77, 80, 103 и 106.
С учетом того, что каждое из таких антител или фрагментов антител (например, Fab или Fab') может связываться с cKIT человека, и что специфичность связывания с антигеном обеспечивается, в первую очередь, областями CDR1, 2 и 3, последовательности CDR1, 2 и 3 VH (или HCDR1, 2, 3) и последовательности CDR1, 2 и 3 VL (или LCDR1, 2, 3) можно подвергать смешиванию и подбору (т. е. CDR из различных антител можно подвергать смешиванию и подбору, хотя каждое антитело должно содержать CDR1, 2 и 3 VH и CDR1, 2 и 3 VL для создания антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), связывающих cKIT. Такие подвергнутые смешиванию и подбору антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), связывающие cKIT, можно тестировать с применением анализов связывания, известных из уровня техники. Когда последовательности CDR VH подвергают смешиванию и подбору, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 из конкретной последовательности VH следует заменить структурно подобной(-ыми) последовательностью(-ими) CDR. Аналогичным образом, когда последовательности CDR VL подвергают смешиванию и подбору, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 из конкретной последовательности VL следует заменить структурно подобной(-ыми) последовательностью(-ями) CDR. Рядовому специалисту в данной области техники будет совершенно очевидно, что новые последовательности VH и VL можно создавать путем замены одной или нескольких последовательностей областей CDR VH и/или VL структурно подобными последовательностями из последовательностей CDR, показанных в данном документе.
Соответственно в настоящем изобретении предусмотрены выделенные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), содержащие CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 4, 6, 7, 27, 30, 32, 33, 60, 63, 65, 66, 86, 89, 91 и 92; CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 5, 8, 28, 31, 34, 51, 52, 53, 61, 64, 67, 87, 90 и 93; CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 9, 29, 35, 62, 68, 88 и 94; CDR1 легкой цепи (LCDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 19, 22, 42, 44, 46, 75, 78, 81, 101, 104 и 107; CDR2 легкой цепи (LCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, 20, 76, 79, 102 и 105; и CDR3 легкой цепи (LCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, 21, 43, 45, 77, 80, 103 и 106; где антитело специфически связывает cKIT.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'),
- 108 044279 которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 1, HCDR2 под
SEQ ID NO: 2; HCDR3 под SEQ ID NO: 3; LCDR1 под SEQ ID NO:16; LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и
LCDR3 под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 4, HCDR2 под SEQ ID NO: 5; HCDR3 под SEQ ID NO: 3; LCDR1 под SEQ ID NO:19; LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и LCDR3 под SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 6, HCDR2 под SEQ ID NO: 2; HCDR3 под SEQ ID NO: 3; LCDR1 под SEQ ID NO:16; LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и LCDR3 под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 7, HCDR2 под SEQ ID NO: 8; HCDR3 под SEQ ID NO: 9; LCDR1 под SEQ ID NO: 22; LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и LCDR3 под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 27, HCDR2 под SEQ ID NO: 28; HCDR3 под SEQ ID NO: 29; LCDR1 под SEQ ID NO: 42; LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и LCDR3 под SEQ ID NO: 43.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 30, HCDR2 под SEQ ID NO: 31; HCDR3 под SEQ ID NO: 29; LCDR1 под SEQ ID NO: 44; LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и LCDR3 под SEQ ID NO: 45.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 32, HCDR2 под SEQ ID NO: 28; HCDR3 под SEQ ID NO: 29; LCDR1 под SEQ ID NO: 42; LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и LCDR3 под SEQ ID NO: 43.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 33, HCDR2 под SEQ ID NO: 34; HCDR3 под SEQ ID NO: 35; LCDR1 под SEQ ID NO: 46; LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и LCDR3 под SEQ ID NO: 43.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 1, HCDR2 под SEQ ID NO: 51; HCDR3 под SEQ ID NO: 3; LCDR1 под SEQ ID NO: 16; LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и LCDR3 под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 4, HCDR2 под SEQ ID NO: 52; HCDR3 под SEQ ID NO: 3; LCDR1 под SEQ ID NO: 19; LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и LCDR3 под SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 6, HCDR2 под SEQ ID NO: 51; HCDR3 под SEQ ID NO: 3; LCDR1 под SEQ ID NO: 16; LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и LCDR3 под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 7, HCDR2 под SEQ ID NO: 53; HCDR3 под SEQ ID NO: 9; LCDR1 под SEQ ID NO: 22; LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и LCDR3 под SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 60, HCDR2 под SEQ ID NO: 61; HCDR3 под SEQ ID NO: 62; LCDR1 под SEQ ID NO: 75; LCDR2 под SEQ ID NO: 76 и LCDR3 под SEQ ID NO: 77.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 63, HCDR2 под SEQ ID NO: 64; HCDR3 под SEQ ID NO: 62; LCDR1 под SEQ ID NO: 78; LCDR2 под SEQ ID NO: 79 и LCDR3 под SEQ ID NO: 80.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 65, HCDR2 под SEQ ID NO: 61; HCDR3 под SEQ ID NO: 62; LCDR1 под SEQ ID NO: 75; LCDR2 под SEQ ID NO: 76 и LCDR3 под SEQ ID NO: 77.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 66, HCDR2 под SEQ ID NO: 67; HCDR3 под SEQ ID NO: 68; LCDR1 под SEQ ID NO: 81; LCDR2 под SEQ ID NO: 79 и
- 109 044279
LCDR3 под SEQ ID NO: 77.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 86, HCDR2 под
SEQ ID NO: 87; HCDR3 под SEQ ID NO: 88; LCDR1 под SEQ ID NO: 101; LCDR2 под SEQ ID NO: 102 и
LCDR3 под SEQ ID NO: 103.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 89, HCDR2 под SEQ ID NO: 90; HCDR3 под SEQ ID NO: 88; LCDR1 под SEQ ID NO: 104; LCDR2 под SEQ ID NO: 105 и LCDR3 под SEQ ID NO: 106.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 91, HCDR2 под SEQ ID NO: 87; HCDR3 под SEQ ID NO: 88; LCDR1 под SEQ ID NO: 101; LCDR2 под SEQ ID NO: 102 и LCDR3 под SEQ ID NO: 103.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат HCDR1 под SEQ ID NO: 92, HCDR2 под SEQ ID NO: 93; HCDR3 под SEQ ID NO: 94; LCDR1 под SEQ ID NO: 107; LCDR2 под SEQ ID NO: 105 и LCDR3 под SEQ ID NO: 103.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 36, и VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 47.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 54, и VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 69, и VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 82.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 95, и VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 108.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 49.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 58, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 73, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 84.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 99, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 110.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 119, 120 или 121, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически
- 110 044279 связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 125, 126 или 127, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 49.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 131, 132 или 133, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 137, 138 или 139, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 84.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (например, Fab'), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 142, 143 или 144, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 110.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 49.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 71, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 84.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 97, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 110.
В определенных аспектах антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с cKIT человека, представляют собой антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), описанные в табл. 1.
1. Антитела, которые связываются с одним и тем же эпитопом.
В настоящем изобретении предусмотрены антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые специфически связываются с эпитопом в пределах внеклеточного домена рецепторной cKIT человека. В определенных аспектах антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') могут связываться с эпитопом в пределах доменов 1-3 внеклеточного домена cKIT человека.
В настоящем изобретении также предусмотрены антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые связываются с тем же эпитопом, что и антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') к cKIT, описанные в табл. 1. Следовательно, дополнительные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') можно идентифицировать на основании их способности к перекрестной конкуренции (например, к конкурентному ингибированию связывания, статистически значимым образом) с другим антителом или фрагментом антитела (например, Fab или Fab') в анализах связывания cKIT. Высокопроизводительный способ сортировки антител на основании их перекрестной конкуренции описан в международной заявке на патент № WO 2003/48731. Способность тестируемых антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') ингибировать связывание антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), раскрытых в данном документе, с белком cKIT (например, cKIT человека) демонстрирует, что тестируемые антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') могут конкурировать с данными антителом или фрагментом антитела (например, Fab или Fab') за связывании с cKIT; при этом, согласно неограничивающей теории, такие антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') могут связываться с одним и тем же или родственным (например, структурно подобным или пространственно близким) эпитопом на белке cKIT, что и антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), с которыми они конкурируют. В определенном аспекте антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), которые связываются с тем же эпитопом на cKIT, что и антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), раскрытые в данном документе, представляют собой человеческие или гуманизированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'). Такие человеческие или гуманизированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') могут быть получены и выделены, как описано в данном документе.
2. Модификация каркасной области.
Конъюгаты антитела и лекарственного средства, раскрытые в данном документе, могут содержать модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), связывающие cKIT, кото- 111 044279 рые содержат модификации каркасных остатков в пределах VH и/или VL, например, для улучшения свойств конъюгата антитела и лекарственного средства.
В некоторых вариантах осуществления модификации каркасной области осуществляют для снижения иммуногенности антитела или конъюгата антитела и лекарственного средства. Например, один подход заключается в том, что один или несколько каркасных остатков мутируют к первоначальному виду в направлении соответствующей последовательности зародышевой линии. Такие остатки могут быть идентифицированы посредством сравнения каркасных последовательностей антитела с последовательностями зародышевой линии, из которых происходит антитело. Чтобы последовательности каркасной области соответствовали требуемой конфигурации зародышевой линии, остатки могут быть мутированы к первоначальному виду в направлении соответствующей последовательности зародышевой линии, например, посредством сайт-направленного мутагенеза. Подразумевается, что такие подвергнутые мутации к первоначальному виду антитела или конъюгаты антитела и лекарственного средства также охватываются настоящим изобретением.
Другой тип модификации каркасной области предусматривает мутацию одного или нескольких остатков в пределах каркасной области или даже в пределах одной или нескольких областей CDR, чтобы удалить Т-клеточные эпитопы, со снижением тем самым потенциальной иммуногенности антитела или конъюгата антитела и лекарственного средства. Данный подход также называют деиммунизацией, и он более подробно описан в публикации заявки на патент США № 2003/0153043 от Carr et al.
В качестве дополнения или альтернативы модификациям, осуществляемым в пределах каркасных областей или областей CDR, антитела можно конструировать таким образом, чтобы изменить одно или несколько функциональных свойств антитела, таких как период полувыведения из сыворотки крови, фиксация комплемента. Кроме того, антитело может быть модифицировано химически (например, к антителу можно присоединять один или несколько химических фрагментов), или оно может быть модифицировано для изменения характера его гликозилирования, чтобы, опять-таки, изменить одно или несколько функциональных свойств антитела. Каждый из таких аспектов более подробно описан ниже.
В одном аспекте шарнирную область СН1 модифицируют таким образом, что меняется количество цистеиновых остатков в шарнирной области, например, увеличивается или уменьшается. Данный подход дополнительно описан в патенте США № 5677425 от Bodmer et al. Количество цистеиновых остатков шарнирной области СН1 изменяют, например, чтобы облегчить сборку легкой и тяжелой цепей, чтобы увеличить или уменьшить стабильность антитела, или чтобы обеспечить возможность конъюгации с другой молекулой.
В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), раскрытые в данном документе, содержат модифицированные или введенные путем конструирования аминокислотные остатки, например, один или несколько цистеиновых остатков, в качестве сайтов для конъюгации с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство (Junutula JR, et al.: Nat Biotechnol 2008, 26:925-932). В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), содержащие замену одной или нескольких аминокислот на цистеин в положениях, описанных в данном документе. Сайты для цистеиновой замены расположены в константных областях антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') и, таким образом, применимы к множеству антител или фрагментов антител (например, Fab или Fab'), и сайты выбирают для обеспечения устойчивых и однородных конъюгатов. Модифицированные антитело или фрагмент могут иметь одну, две или более цистеиновых замен, и такие замены могут применяться в комбинации с другими способами модификации и конъюгации, описанными в данном документе. Способы для вставки цистеина в специфические местоположения антитела известны из уровня техники, см., например, Lyons et al. (1990) Protein Eng., 3:703-708, WO 2011/005481, WO2014/124316, WO 2015/138615. В некоторых вариантах осуществления модифицированное антитело содержит замену одной или нескольких аминокислот на цистеин в своей константной области в положении, выбранном из 117, 119, 121, 124, 139, 152, 153, 155, 157, 164, 169, 171, 174, 189, 191, 195, 197, 205, 207, 246, 258, 269, 274, 286, 288, 290, 292, 293, 320, 322, 326, 333, 334, 335, 337, 344, 355, 360, 375, 382, 390, 392, 398, 400 и 422 тяжелой цепи антитела, и где нумерация положений соответствует системе EU. В некоторых вариантах осуществления модифицированный фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержит замену одной или нескольких аминокислот на цистеин в своей константной области в положении, выбранном из 121, 124, 152, 153, 155, 157, 164, 169, 171, 174, 189 и 207 тяжелой цепи фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), и где нумерация положений соответствует системе EU. В некоторых вариантах осуществления модифицированный фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержит замену одной или нескольких аминокислот на цистеин в своей константной области в положении, выбранном из 124, 152, 153, 155, 157, 164, 174, 189 и 207 тяжелой цепи фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), и где нумерация положений соответствует системе EU.
В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат замену одной или нескольких аминокислот на цистеин в своей константной области в положении, выбранном из 107, 108, 109, 114, 126, 127, 129, 142, 143, 145, 152, 154, 156, 157, 159, 161, 165, 168, 169, 170, 182, 183, 188, 197, 199, и 203 легкой цепи антитела или фрагмента анти- 112 044279 тела (например, Fab или Fab'), где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой человеческую легкую каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат замену одной или нескольких аминокислот на цистеин в своей константной области в положении, выбранном из 107, 108, 114, 126, 127, 129, 142, 159, 161, 165, 183 и 203 легкой цепи антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой человеческую легкую каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат замену одной или нескольких аминокислот на цистеин в своей константной области в положении, выбранном из 114, 129, 142, 145, 152, 159, 161, 165 и 197 легкой цепи антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой человеческую легкую каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат замену одной или нескольких аминокислот на цистеин в своей константной области в положении, выбранном из 107, 108, 109, 126, 143, 145, 152, 154, 156, 157, 159, 182, 183, 188, 197, 199 и 203 легкой цепи антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой человеческую легкую каппацепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат замену одной или нескольких аминокислот на цистеин в своей константной области в положении, выбранном из 145, 152 и 197 легкой цепи антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой человеческую легкую каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат замену одной или нескольких аминокислот на цистеин в своей константной области в положении, выбранном из 114 и 165 легкой цепи антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой человеческую легкую каппа-цепь.
В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат замену одной или нескольких аминокислот на цистеин в своей константной области в положении, выбранном из 143, 145, 147, 156, 159, 163, 168 легкой цепи антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой человеческую легкую каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеин в положении 143 (согласно нумерации EU) легкой цепи антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab'), где легкая цепь представляет собой человеческую легкую лямбда-цепь.
В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат комбинацию из замен двух или более аминокислот на цистеин в своих константных областях, и комбинация положений может быть выбрана из любого из положений, перечисленных выше.
В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеин в одном или нескольких из следующих положений: положение 124 тяжелой цепи, положение 152 тяжелой цепи, положение 153 тяжелой цепи, положение 155 тяжелой цепи, положение 157 тяжелой цепи, положение 164 тяжелой цепи, положение 174 тяжелой цепи, положение 114 легкой цепи, положение 129 легкой цепи, положение 142 легкой цепи, положение 159 легкой цепи, положение 161 легкой цепи или положение 165 легкой цепи, и где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеин в четырех из следующих положений: положение 124 тяжелой цепи, положение 152 тяжелой цепи, положение 153 тяжелой цепи, положение 155 тяжелой цепи, положение 157 тяжелой цепи, положение 164 тяжелой цепи, положение 174 тяжелой цепи, положение 114 легкой цепи, положение 129 легкой цепи, положение 142 легкой цепи, положение 159 легкой цепи, положение 161 легкой цепи или положение 165 легкой цепи, и где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой каппа-цепь.
В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеин в положении 152 тяжелой цепи, где нумерация положений соответствует системе EU. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеин в положении 124 тяжелой цепи, где нумерация положений соответствует системе EU. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеин в положении 165 легкой цепи, где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеин в положении 114 легкой цепи, где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеин в поло- 113 044279 жении 143 легкой цепи, где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой лямбда-цепь.
В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеины в положении 152 тяжелой цепи и положении 165 легкой цепи, и где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеины в положении 152 тяжелой цепи и положении 114 легкой цепи, и где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеины в положении 152 тяжелой цепи и положении 143 легкой цепи, и где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой лямбда-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеины в положении 124 и положении 152 тяжелой цепи, и где нумерация положений соответствует системе EU.
В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеин в одном или нескольких из следующих положений: положение 155 тяжелой цепи, положение 189 тяжелой цепи, положение 207 тяжелой цепи, положение 145 легкой цепи, положение 152 легкой цепи или положение 197 легкой цепи, и где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеин в двух или более (например, 2, 3, 4) из следующих положений: положение 155 тяжелой цепи, положение 189 тяжелой цепи, положение 207 тяжелой цепи, положение 145 легкой цепи, положение 152 легкой цепи или положение 197 легкой цепи, и где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой каппа-цепь.
В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеин в одном или нескольких из следующих положений: положение 124 тяжелой цепи, положение 152 тяжелой цепи, положение 153 тяжелой цепи, положение 155 тяжелой цепи, положение 157 тяжелой цепи, положение 164 тяжелой цепи, положение 174 тяжелой цепи, положение 114 легкой цепи, положение 129 легкой цепи, положение 142 легкой цепи, положение 159 легкой цепи, положение 161 легкой цепи или положение 165 легкой цепи, и где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') содержат цистеин в двух или более (например, 2, 3, 4) из следующих положений: положение 124 тяжелой цепи, положение 152 тяжелой цепи, положение 153 тяжелой цепи, положение 155 тяжелой цепи, положение 157 тяжелой цепи, положение 164 тяжелой цепи, положение 174 тяжелой цепи, положение 114 легкой цепи, положение 129 легкой цепи, положение 142 легкой цепи, положение 159 легкой цепи, положение 161 легкой цепи или положение 165 легкой цепи, и где нумерация положений соответствует системе EU, и где легкая цепь представляет собой каппа-цепь.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 118, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 122.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 118, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 123.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 124, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 128.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 124, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 129.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 130, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 134.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 130, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 135.
- 114 044279
В некоторых вариантах осуществления модифицированный фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 136, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 140.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный фрагмент антитела (например, Fab), который специфически связывается с cKIT человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 141, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 145.
3. Получение антител или фрагментов антител к cKIT.
Антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') к cKIT можно получать с помощью любых средств, известных из уровня техники, в том числе без ограничения рекомбинантной экспрессии, химического синтеза или ферментативного расщепления полноразмерных моноклональных антител, которые могут быть получены например, с помощью гибридомы или рекомбинантного получения. Рекомбинантная экспрессия может происходить в любых подходящих клетках-хозяевах, известных из уровня техники, например, клетках-хозяевах, представляющих собой клетки млекопитающих, бактериальных клетках-хозяевах, дрожжевых клетках-хозяевах, клетках-хозяевах, представляющих собой клетки насекомых, или выполняться в бесклеточной системе (например, платформа Sutro's Xpress CF™, http://www.sutrobio.com/technology/).
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab'), описанные в данном документе, например, полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области или сегменты тяжелой или легкой цепей, содержащие определяющие комплементарность области, описанные в данном документе. В некоторых аспектах полинуклеотид, кодирующий вариабельные области тяжелой цепи (VH), характеризуется по меньшей мере 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 37, 55, 70 и 96. В некоторых аспектах полинуклеотид, кодирующий вариабельные области легкой цепи (VL), характеризуется по меньшей мере 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 48, 83 и 109.
В некоторых аспектах полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела, характеризуется по меньшей мере 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом под SEQ ID NO: 13, 39, 57, 72 и 98. В некоторых аспектах полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела, характеризуется по меньшей мере 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом под SEQ ID NO: 26, 50, 85 и 111.
В некоторых аспектах полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь Fab', характеризуется по меньшей мере 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом под SEQ ID NO: 15, 41, 59, 74 и 100. В некоторых аспектах полинуклеотид, кодирующий легкую цепь Fab', характеризуется по меньшей мере 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом под SEQ ID NO: 26, 50, 85 и 111.
Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут кодировать только последовательность вариабельной области антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') к cKIT. Они также могут кодировать как вариабельную область, так и константную область антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab'). Некоторые из полинуклеотидных последовательностей кодируют полипептид, который содержит вариабельные области как тяжелой цепи, так и легкой цепи одного из иллюстративных антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') к cKIT.
Полинуклеотидные последовательности можно получать с помощью твердофазного синтеза ДНК de novo или с помощью ПЦР-мутагенеза существующей последовательности (например, последовательностей, которые описаны в примерах ниже), кодирующей антитело к cKIT или его связывающий фрагмент. Прямой химический синтез нуклеиновых кислот можно осуществлять с помощью способов, известных из уровня техники, таких как фосфотриэфирный способ из Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979; фосфодиэфирный способ из Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; диэтилфосфорамидитный способ из Beaucage et al., Tetra Lett., 22:1859, 1981; и способ с использованием твердой подложки из патента США № 4458066. Введение мутаций в полинуклеотидную последовательность с помощью ПЦР можно осуществлять, как описано, например, в PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; и Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.
Также в настоящем изобретении предусмотрены векторы экспрессии и клетки-хозяева для получения антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') к cKIT, описанных выше. Различные векторы экспрессии могут использоваться для экспрессии полинуклеотидов, кодирующих антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') к cKIT. Как вирусные, так и невирусные векторы экспрессии
- 115 044279 можно применять для получения антител в клетке-хозяине, представляющей собой клетку млекопитающего. Невирусные векторы и системы включают плазмиды, эписомные векторы, как правило, с кассетой экспрессии для экспрессии белка или РНК, а также искусственные человеческие хромосомы (см., например, Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997). Например, невирусные векторы, применимые для экспрессии полинуклеотидов и полипептидов, связывающих cKIT, в клетках млекопитающих (например, человеческих), включают pThioHis А, В и С, pcDNA3.1/His, pEBVHis А, В и С (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), векторы MPSV и многочисленные другие векторы, известные из уровня техники для экспрессии других белков. Применимые вирусные векторы включают векторы на основе ретровирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вирусов герпеса, векторы на основе SV40, папилломавируса, вируса Эпштейна-Барр НВР, векторы на основе вируса коровьей оспы и вируса леса Семлики (SFV). См., Brent et al., выше; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; и Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.
Выбор вектора экспрессии зависит от предполагаемых клеток-хозяев, в которых следует экспрессировать вектор. Как правило, векторы экспрессии содержат промотор и другие регуляторные последовательности (например, энхансеры), которые функционально связаны с полинуклеотидами, кодирующими антитело или фрагмент антитела (например, Fab или Fab') к cKIT. В некоторых аспектах индуцируемый промотор используют для предотвращения экспрессии встроенных последовательностей в условиях, отличающихся от индуцирующих. Индуцируемые промоторы включают, например, арабинозный, lacZ, металлотионеиновый промотор или промотор белка теплового шока. Культуры трансформированных организмов можно размножать в неиндуцирующих условиях без смещения популяции в направлении кодирующих последовательностей, продукты экспрессии которых лучше переносятся клеткамихозяевами. Для эффективной экспрессии антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') к cKIT кроме промоторов также могут быть необходимы или требоваться другие регуляторные элементы. Такие элементы, как правило, включают кодон инициации трансляции ATG и смежный сайт связывания рибосомы или другие последовательности. Кроме того, эффективность экспрессии можно повысить за счет включения энхансеров, соответствующих применяемой клеточной системе (см., например, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; и Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Например, для повышения экспрессии в клетках-хозяевах, представляющих собой клетки млекопитающих, можно применять энхансер SV40 или энхансер CMV.
В векторах экспрессии также может быть предусмотрено положение сигнальной последовательности секреции для образования слитого белка с полипептидами, кодируемыми вставленными последовательностями антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') к cKIT. Чаще встраиваемые последовательности антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') к cKIT связывают с сигнальными последовательностями перед включением в вектор. Векторы, подлежащие применению для получения последовательностей, кодирующих вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') к cKIT, иногда также кодируют константные области или их части. Такие векторы обеспечивают возможность экспрессии вариабельных областей в виде слитых белков с константными областями, приводя тем самым к получению интактных антител или их фрагментов.
Клетки-хозяева, несущие и экспрессирующие цепи антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') к cKIT, могут быть или прокариотическими, или эукариотическими. Е. coli является одним прокариотическим хозяином, применимым для клонирования и экспрессии полинуклеотидов по настоящему изобретению. Другие подходящие для применения микробные хозяева включают бацилл, таких как Bacillus subtilis, и других энтеробактерий, таких как Salmonella, Serratia и различные виды Pseudomonas. Для этих прокариотических хозяев также можно создать векторы экспрессии, которые, как правило, содержат последовательности для управления экспрессией, совместимые с клеткой-хозяином (например, точку начала репликации). Кроме того, будет присутствовать любое количество разнообразных хорошо известных промоторов, как, например, лактозная промоторная система, триптофановая (trp) промоторная система, бета-лактамазная промоторная система или промоторная система из фага лямбда. Как правило, промоторы управляют экспрессией, необязательно с помощью операторной последовательности, и имеют последовательности сайта связывания рибосомы и т. п. для инициации и завершения транскрипции и трансляции. Другие микроорганизмы, такие как дрожжи, также можно использовать для экспрессии полипептидов антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') к cKIT. Также можно применять клетки насекомых в сочетании с бакуловирусными векторами.
В других аспектах для экспрессии и получения полипептидов антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') к cKIT по настоящему изобретению применяют клетки-хозяева, представляющие собой клетки млекопитающих. Например, они могут представлять собой либо линию клеток гибридомы, экспрессирующих эндогенные гены иммуноглобулинов (например, клоны гибридомы из клеток миеломы, как описано в примерах), либо линию клеток млекопитающих, несущих экзогенный вектор экспрессии (например, клетки миеломы SP2/0, приведенные в качестве примера ниже). Они охватывают любые нормальные мортальные или нормальные или аномальные иммортальные клетки животных или человека. Например, был разработан ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных секретировать интактные иммуноглобулины, в том числе линии клеток СНО, различные линии клеток COS, клетки
- 116 044279
HeLa, линии клеток миеломы, трансформированные В-клетки и гибридомы. Применение тканевой культуры клеток млекопитающих для экспрессии полипептидов в общих чертах обсуждается, например, в Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Векторы экспрессии для клетокхозяев, представляющих собой клетки млекопитающих, могут включать последовательности для управления экспрессией, такие как точка начала репликации, промотор и энхансер (см., например, Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986), и необходимые сайты, несущие информацию для процессинга, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминатора транскрипции. Такие векторы экспрессии обычно содержат промоторы, происходящие из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих. Подходящие промоторы могут быть конститутивными, специфическими в отношении типа клеток, специфическими в отношении стадии развития и/или модулируемыми или регулируемыми. Применимые промоторы включают без ограничения металлотионеиновый промотор, конститутивный большой поздний промотор аденовируса, индуцируемый дексаметазоном промотор MMTV, промотор SV40, промотор polIII MRP, конститутивный промотор MPSV, индуцируемый тетрациклином промотор CMV (такой как немедленно-ранний промотор CMV человека), конститутивный промотор CMV и комбинации промотор-энхансер, известные из уровня техники.
Способы введения векторов экспрессии, содержащих представляющие интерес полинуклеотидные последовательности, варьируют в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, трансфекцию с использованием хлорида кальция обычно используют для прокариотических клеток, тогда как обработку фосфатом кальция или электропорацию можно применять для других клеток-хозяев (см. в общих чертах Sambrook et al., выше). Другие способы включают, например, электропорацию, обработку фосфатом кальция, трансформацию, опосредованную липосомами, инъекцию и микроинъекцию, баллистические способы, виросомы, иммунолипосомы, конъюгаты поликатион:нуклеиновая кислота, депротеинизированную ДНК, искусственные вирионы, слияние со структурным белком VP22 вируса герпеса (Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), усиленное средством поглощение ДНК и трансдукцию ex vivo. Чтобы обеспечить длительное получение рекомбинантных белков с высоким выходом, зачастую будет требоваться стабильная экспрессия. Например, линии клеток, которые стабильно экспрессируют цепи антитела или фрагмента антитела (например, Fab или Fab') к cKIT, могут быть получены с применением векторов экспрессии, которые содержат вирусные точки начала репликации или эндогенные элементы экспрессии и ген селектируемого маркера. После введения вектора клетки можно оставить расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде перед их переносом на селективную среду. Задачей селектируемого маркера является придание устойчивости к факторам отбора, и его присутствие обеспечивает возможность роста клеток, которые успешно экспрессируют введенные последовательности, в селективных средах. Пролиферацию устойчивых стабильно трансфицированных клеток можно обеспечивать с применением методик тканевой культуры, соответствующих типу клеток.
Фрагменты антитела, такие как Fab или Fab', можно получать за счет протеолитического расщепления молекул иммуноглобулина с применением ферментов, таких как папаин (для получения фрагментов Fab) или пепсин (для получения фрагменты Fab') и т. д. В сравнении с фрагментами Fab фрагменты Fab' также содержат шарнирную область, которая содержит два природных цистеина, образующих дисульфидные связи между двумя тяжелыми цепями молекулы иммуноглобулина.
Пути терапевтического применения.
Конъюгаты по настоящему изобретению применимы при целом ряде применений, в том числе без ограничения для разрушения гемопоэтических стволовых клеток у пациента, нуждающегося в этом, например, реципиента трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Соответственно, в данном документе предусмотрены способы разрушения гемопоэтических стволовых клеток у пациента, нуждающегося в этом, посредством введения пациенту эффективного количества любого из конъюгатов, описанных в данном документе. В данном документе также предусмотрены способы кондиционирования пациента, подлежащего трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (например, реципиента трансплантации), посредством введения пациенту эффективного количества любого из конъюгатов, описанных в данном документе, и обеспечения достаточного периода времени, чтобы конъюгаты вывелись из кровяного русла пациента перед проведением трансплантации гемопоэтических стволовых клеток пациенту. Конъюгаты можно вводить пациенту внутривенно. Также предусмотрено применение любых из конъюгатов или фармацевтических композиций, описанных в данном документе, для разрушения гемопоэтических стволовых клеток у пациента, нуждающегося в этом. Дополнительно предусмотрено применение любых из конъюгатов или фармацевтических композиций, описанных в данном документе, при изготовлении лекарственного препарата для разрушения гемопоэтических стволовых клеток у пациента, нуждающегося в этом.
Эндогенные гемопоэтические стволовые клетки обычно постоянно находятся внутри синусов костного мозга. Данное физическое окружение, в котором постоянно находятся стволовые клетки, называют микроокружением стволовых клеток или нишей стволовых клеток. Клетки стромы и другие клетки, входящие в состав данной ниши, обеспечивают растворимые и связанные факторы, которые оказывают множество эффектов. Были выказаны предположения о различных моделях взаимодействия гемопоэти
- 117 044279 ческих стволовых клеток и их ниши. Например, была предложена модель, согласно которой во время деления стволовой клетки только одна дочерняя клетка остается в нише, а другая дочерняя клетка покидает нишу для дифференцировки. Было высказано предположение, что эффективность приживления можно увеличивать при селективном разрушении эндогенных гемопоэтических стволовых клеток, открывая тем самым ниши стволовых клеток для приживления донорских стволовых клеток (см., например, WO 2008/067115).
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSC) или трансплантация костного мозга (как она называлась раньше) представляет собой общепринятый вид лечения целого ряда заболеваний, поражающих кроветворные стволовые клетки организма, таких как виды лейкоза, виды тяжелой анемии, дефекты иммунной защиты и некоторые заболевания дефицита ферментов. Такие заболевания зачастую приводят к тому, что пациент нуждается в замене своего костного мозга на новые здоровые клетки крови.
Трансплантация HSC зачастую является аллогенной, это означает, что пациент получает стволовые клетки от другого индивидуума того же вида, кого-нибудь одного из сиблинга, совместимого родственного, идентичного по гаплотипу родственного или неродственного донора-добровольца. По оценкам у приблизительно 30% пациентов, нуждающихся в трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, имеется в распоряжении сиблинг, чей тип ткани является подходящим. Остальные 70% пациентов должны полагаться на совместимость с неродственным донором-добровольцем или доступность идентичного по гаплотипу родственного донора. Важно, чтобы характеристики клеток донора и пациента были сопоставимыми. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток также может быть аутогенной, при которой трансплантируемые клетки получены от самого субъекта, т. е. донор и реципиент являются одним и тем же индивидуумом. Кроме того, трансплантации могут быть сингенными, т. е. от генетически идентичного индивидуума, такого как близнец. В дополнительном аспекте трансплантации могут быть ксеногенными, т. е. трансплантат получен от другого вида, что представляет интерес при отсутствии достаточного числа доноров того же вида, например, как в случае трансплантаций органов.
Перед трансплантацией HSC пациенты обычно подвергаются способу предварительной обработки или кондиционирования. Цель данных предварительной обработки или кондиционирования заключается в удалении как можно большего числа нежелательных клеток (например, злокачественных/раковых клеток) в организме, сведении к минимуму отторжения и/или открытия ниши стволовых клеток путем разрушения эндогенных HSC для эффективного приживления донорских стволовых клеток в данные ниши. После этого здоровые HSC донора вводят пациенту внутривенно или, в некоторых случаях, внутрикостно. Однако с трансплантацией HSC ассоциировано множество рисков, в том числе плохое приживление, иммунологическое отторжение, реакция трансплантат против хозяина (GVHD) или инфекция. Хотя клетки донора и пациента выглядят одинаковыми в контексте типа ткани, например, совпадают (или идентичны по гаплотипу) молекулы МНС; между такими индивидуумами имеются небольшие отличия, которые иммунные клетки могут воспринимать как опасные. Это означает, что новая иммунная система (белые кровяные клетки из новых стволовых клеток) воспринимает новое тело как чужеродное, что провоцирует иммунную атаку. Данная реакция, называемая реакция трансплантат против хозяина (GVHD), может представлять угрозу для жизни пациента. Для пациентов после трансплантации HSC также характерен повышенный риск инфекций вследствие отсутствия белых кровяных клеток до того, как новый костный мозг начнет функционировать. В некоторых случаях этот период может продолжаться много месяцев до тех пор, пока новая иммунная система не созреет. Некоторые из таких оппортунистических инфекций могут представлять угрозу для жизни.
Таким образом, существует необходимость в улучшении способов кондиционирования и трансплантации, а также уменьшении рисков, ассоциированных с трансплантацией HSC и повышении ее эффективности при различных нарушениях. В данном документе предусмотрены новые конъюгаты антитела и лекарственного средства, которые, за счет специфического цитолиза эндогенных HSC реципиента, а не всех остальных иммунных клеток, перед трансплантацией, поддерживают частично активную иммунную защиту для борьбы с инфекциями сразу после трансплантации, но в то же время обеспечивают непрямой иммуносупрессорный эффект вследствие неспособности субъекта формировать новые иммунные клетки из своих собственных HSC. Поскольку предварительная обработка может быть более слабой, чем химиотерапия или облучение, и приводить к менее серьезным побочным эффектам, она может индуцировать меньше GVHD у пациентов, подвергнутых трансплантации.
Конъюгаты антитела и лекарственного средства, описанные в данном документе, можно было бы применять для разрушения эндогенной гемопоэтической стволовой клетки, например, в способе предварительной обработки/кондиционирования перед трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток. Например, конъюгаты по настоящему изобретению можно было бы применять для лечения любого злокачественного состояния/нарушения, при котором могла бы принести пользу трансплантация стволовых клеток, такого как тяжелая апластическая анемия (SAA), синдром Вискотта-Олдрича, синдром Гурлера, наследственный гематофагоцитарный лимфогистиоцитоз (FHL), хронический гранулематоз (CGD), синдром Костмана, тяжелый иммунодефицитный синдром (SCID), другие аутоиммунные нарушения, такие как SLE, рассеянный склероз, IBD, болезнь Крона, язвенный колит, синдром Шегрена, васкулит, волчан- 118 044279 ка, миастения гравис, болезнь Вегенера, врожденные нарушения обмена веществ и/или другие иммунодефициты.
Кроме того, конъюгаты по настоящему изобретению можно было бы применять для лечения любого злокачественного состояния/нарушения, при котором могла бы принести пользу трансплантация стволовых клеток, такого как гематологические заболевания, гематологические злокачественные опухоли или солидные опухоли (например, рак почки, рак печени, рак поджелудочной железы). Распространенные типы гематологических заболеваний/злокачественных опухолей, которые можно было бы лечить с помощью заявленных способов и антител, представляют собой лейкозы, лимфомы и миелодиспластические синдромы. Лейкоз представляет собой тип рака крови или костного мозга, который характеризуется аномальным увеличением числа незрелых белых кровяных клеток, называемых бластные клетки, и термин лейкоз охватывает острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелогенный лейкоз (AML), острый моноцитарный лейкоз (AMoL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелогенный лейкоз (CML) и другие лейкозы, такие как волосатоклеточный лейкоз (HCL), Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз (T-PLL), лейкоз из больших зернистых лимфоцитов и Т-клеточный лейкоз взрослых. В одном аспекте настоящего изобретения подвергаемый лечению лейкоз представляет собой острый лейкоз. В дополнительном аспекте лейкоз представляет собой ALL, AML или AMoL. Лимфомы охватывают лейкоз/лимфому из предшественников Т-клеток, лимфому Беркитта, фолликулярную лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз/лимфому, лимфому MALT, фунгоидный микоз, неуточненную периферическую Т-клеточную лимфому, форму ходжкинской лимфомы с нодулярным склерозом, смешанноклеточный подтип ходжкинской лимфомы. Миелодиспластический синдром (MDS)-это название группы состояний, которые наблюдаются при повреждении кроветворных клеток в костном мозге. Такое повреждение приводит к низким количествам одного или нескольких типов клеток крови. MDS подразделяется на 7 категорий: рефрактерная цитопения с однолинейной дисплазией (RCUD), рефрактерная анемия с кольцевидными сидеробластами (RARS), рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией (RCMD), рефрактерная анемия с избытком бластов-1 (RAEB-1), рефрактерная анемия с избытком бластов-2 (RAEB-2), неклассифицированный миелодиспластический синдром(MDS-U) и миелодиспластический синдром, ассоциированный с выделенной del (5q).
В некоторых вариантах осуществления пациент, нуждающийся в разрушении гемопоэтических стволовых клеток (например, реципиент трансплантации гемопоэтических стволовых клеток), может иметь наследственное иммунодефицитное заболевание, аутоиммунное нарушение, нарушение гемопоэза или врожденные нарушения обмена веществ.
В некоторых вариантах осуществления нарушение гемопоэза может быть выбрано из любого из следующих: острого миелоидного лейкоза (AML), острого лимфобластного лейкоза (ALL), острого моноцитарного лейкоза (AMoL), хронического миелоидного лейкоза (CML), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), миелопролиферативных нарушений, миелодиспластических синдромов, множественной миеломы, неходжкинской лимфомы, болезни Ходжкина, апластической анемии, истинной эритроцитарной аплазии, пароксизмальной ночной гемоглобинурии, анемии Фанкони, большой талассемии, серповидноклеточной анемии, тяжелого комбинированного иммунодефицита, синдрома Вискотта-Олдрича, гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза.
Врожденные нарушения обмена веществ, также известные как наследственные метаболические заболевания (IMB) или присутствующие при рождении метаболические заболевания, которые представляют собой класс генетических заболеваний, охватывают присутствующие при рождении нарушения углеводного метаболизма, метаболизма аминокислот, метаболизма органических кислот или болезни лизосомного накопления. В некоторых вариантах осуществления врожденные нарушения обмена веществ выбраны из мукополисахаридоза, болезни Гоше, метахроматических лейкодистрофий или адренолейкодистрофий.
Кроме того, конъюгаты по настоящему изобретению можно было бы применять для лечения гастроинтестинальной стромальной опухоли (GIST), такой как GIST, которая является положительной по cKIT. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты по настоящему изобретению можно было бы применять для лечения GIST, которая экспрессирует cKIT дикого типа. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты по настоящему изобретению можно было бы применять для лечения GIST, которая является резистентной к средству лечения, например, иматинибу (Glivec®/Gleevec®).
Комбинированная терапия.
В некоторых случаях конъюгат антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению может применяться в комбинации с другой схемой кондиционирования, такой как лучевая терапия или химиотерапия.
В некоторых случаях конъюгат антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению может применяться в комбинации с другим терапевтическим средством, таким как противораковое средство, средство против тошноты (или противорвотное средство), обезболивающее, мобилизирующее средство или их комбинации.
Распространенные химиотерапевтические средства, рассматриваемые для применения в видах ком- 119 044279 бинированной терапии, включают анастрозол (Arimidex®), бикалутамид (Casodex®), блеомицина сульфат (Blenoxane®), бусульфан (Myleran®), бусульфан в виде инъекции (Busulfex®), капецитабин (Xeloda®), №-пентоксикарбонил-5-дезокси-5-фторцитидин, карбоплатин (Paraplatin®), кармустин (BiCNU®), хлорамбуцил (Leukeran®), цисплатин (Platinol®), кладрибин (Leustatin®), циклоспорин (Sandimmune®, Neoral® или Restasis®), циклофосфамид (Cytoxan® или Neosar®), цитарабин, цитозина арабинозид (Cytosar-U®), цитарабин в виде липосомной инъекции (DepoCyt®), дакарбазин (DTIC-Dome®), дактиномицин (актиномицин D, Cosmegan), даунорубицина гидрохлорид (Cerubidine®), даунорубицина цитрат в виде липосомной инъекции (DaunoXome®), дексаметазон, доцетаксел (Taxotere®), доксорубицина гидрохлорид (Adriamycin®, Rubex®), этопозид (Vepesid®), флударабина фосфат (Fludara®), 5фторурацил (Adrucil®, Efudex®), флутамид (Eulexin®), тезацитибин, гемцитабин (дифтордезоксицитидин), гидроксимочевину (Hydrea®), идарубицин (Idamycin®), ифосфамид (IFEX®), иринотекан (Camptosar®), L-аспарагиназу (ELSPAR®), лейковорин кальция, мелфалан (Alkeran®), 6-меркаптопурин (Purinethol®), метотрексат (Folex®), митоксантрон (Novantrone®), милотарг, паклитаксел (Taxol®), феникс (иттрий 90/MX-DTPA), пентостатин, полифероспан 20 с имплантатом кармустина (Gliadel®), тамоксифена цитрат (Nolvadex®), тенипозид (Vumon®), 6-тиогуанин, тиотепу, тирапазамин (Tirazone®), топотекана гидрохлорид для инъекции (Hycamptin®), винбластин (Velban®), винкристин (Oncovin®) и винорелбин (Navelbine®).
В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению может применяться в комбинации с блокатором CD47, например, антителом к CD47 или его фрагментом. Сообщалось, что микротело к CD47, которое блокирует взаимодействие между CD47 и сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa), может повышать разрушение эндогенных HSC под действием голого антитела к c-Kit (Chhabra et al., Science Translational Medicine 8 (351), 351ra105).
В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению может применяться в комбинации с другим антителом или его фрагментом, которые специфически связываются с гемопоэтическими стволовыми клетками или гемопоэтическими клеткамипредшественниками, например, антителом к CD45 или его фрагментом, антителом к CD34 или его фрагментом, антителом к CD133 или его фрагментом, антителом к CD59 или его фрагментом или антителом к CD90 или его фрагментом. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению могут применяться в комбинации с ингибитором Dyrkla, таким как Harmine, INDY, ML315 гидрохлорид, ProINDY, Tocris™ TC-S 7044, Tocris™ TG 003, FINDY, TBB, DMAT, CaNDY и т. д.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению может применяться в комбинации с одним или нескольким иммуносупрессорами, такими как глюкокортикоиды, например, преднизон, дексаметазон и гидрокортизон; цитостатиками, например, алкилирующими средствами, антиметаболитами, метотрексатом, азатиоприном, меркаптопурином, дактиномицином и т. д.; лекарственными средствами, действующими на иммунофилины, например, такролимусом (Prograf®, Astograf XL® или Envarsus XR®), сиролимусом (рапамицин или Rapamune®) и эверолимусом; интерферонами; опиоидами; TNF-связывающими белками; микофенолатом; финголимодом; мириоцином и т.д. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению может применяться в комбинации с одним или несколькими средствами, которые специфически истощают Т клетки, такими как флударабин, циклоспорин, антитело к CD52, например, алемтузумаб, антитимоцитарный глобулин (ATG), антитело к CD3 или его фрагмент, антитело к CD4 или его фрагмент, антитело к CD8 или его фрагмент или антитело к TCR α/β человека или его фрагмент. Виды терапии, направленные на истощение Т-клеток, могут снижать реакцию хозяин против трансплантата, которая могла бы приводить к отторжению трансплантата.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению может применяться в комбинации с одним или несколькими средствами, выбранными из плериксафора (также известного как AMD3100, Mozobil®), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), например, сарграмостима (Leukine®), или гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), например, филграстима или пегфилграстима (Zarzio®, Zarxio®, Neupogen®, Neulasta®, Nufil®, Religrast®, Emgrast®, Neukine®, Grafeel®, Imumax®, Filcad®).
В одном аспекте конъюгат антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению объединен в фармацевтическом комбинированном составе со вторым соединением, характеризующимся противораковыми свойствами, или схема введения доз предусматривает комбинированную терапию с ним. Второе соединение фармацевтического комбинированного состава или схемы введения доз может характеризоваться видами активности, которые взаимно дополняют конъюгат из комбинации, вследствие чего они не оказывают неблагоприятного эффекта друг на друга.
Используемый в данном документе термин фармацевтическая комбинация относится либо к фиксированной комбинации в форме единицы дозирования, либо к нефиксированной комбинации или набору из частей для комбинированного введения, где два или более терапевтических средств могут вводить- 120 044279 ся независимо в одно и то же время или по отдельности в пределах временных интервалов, в частности, когда такие временные интервалы обеспечивают возможность демонстрации кооперативного, например синергетического, эффекта партнеров по комбинации.
Термин комбинированная терапия относится к введению двух или более терапевтических средств для лечения терапевтического состояния или нарушения, описанного в настоящем изобретении. Такое введение охватывает совместное введение этих терапевтических средств практически одновременно, например, в одной капсуле, имеющей фиксированное отношение активных ингредиентов. В качестве альтернативы такое введение охватывает совместное введение в виде нескольких или отдельных контейнеров (например, капсулы, порошки и жидкости) для каждого активного ингредиента. Порошки и/или жидкости могут быть восстановлены или разбавлены до требуемой дозы перед введением. Кроме того, такое введение также охватывает применение каждого типа терапевтического средства последовательным образом, либо приблизительно в одно и то же время, либо в разное время. В любом случае схема лечения будет обеспечивать приносящие пользу эффекты комбинации лекарственных средств при лечении состояний или нарушений, описанных в данном документе.
Комбинированная терапия может обеспечивать синергию и оказаться синергетической, т. е. эффект, достигаемый, когда активные ингредиенты применяются вместе, превышает сумму эффектов, которые являются результатом применения соединений по отдельности. Синергетический эффект может быть достигнут, когда активные ингредиенты: (1) составлены вместе и вводятся или доставляются одновременно в виде комбинированного состава с однократной дозой; (2) доставляются по очереди или параллельно как отдельные составы или (3) применяется какая-либо другая схема. При доставке в виде терапии с чередованием синергетический эффект может достигаться, когда соединения вводят или доставляют одно за другим, например, посредством различных инъекций в отдельных шприцах. В целом, во время терапии с чередованием эффективную дозу каждого активного ингредиента вводят одну за другой, т. е. сериями, в то время как при комбинированной терапии эффективную дозу двух или более активных ингредиентов вводят вместе.
Фармацевтические композиции.
Чтобы приготовить фармацевтические или стерильные композиции, содержащие один или несколько конъюгатов антитела и лекарственного средства, описанных в данном документе, предусмотренный(ые) конъюгат(ы) может(могут) смешиваться с фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным веществом.
Составы терапевтических и диагностических средств могут быть получены путем смешивания с физиологически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами в форме, например, лиофилизированных порошков, взвесей, водных растворов, лосьонов или суспензий (см., например, Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y., 2000; Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993; Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY, 1990; Lieberman, et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990; Weiner and Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2000).
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат антитела по настоящему изобретению, представляет собой лиофилизированный препарат. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат антитела, представляет собой лиофилизат во флаконе, содержащем конъюгат антитела, гистидин, сахарозу и полисорбат 20. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат антитела, представляет собой лиофилизат во флаконе, содержащем конъюгат антитела, сукцинат натрия и полисорбат 20. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат антитела, представляет собой лиофилизат во флаконе, содержащем конъюгат антитела, трегалозу, цитрат и полисорбат 8. Лиофилизат может быть восстановлен, например, с помощью воды, солевого раствора для инъекции. В конкретном варианте осуществления раствор содержит конъюгат антитела, гистидин, сахарозу и полисорбат 20 при pH, составляющем приблизительно 5,0. В другом специфическом варианте осуществления раствор содержит конъюгат антитела, сукцинат натрия и полисорбат 20. В другом специфическом варианте осуществления раствор содержит конъюгат антитела, дегидрат трегалозы, дегидрат цитрата, лимонную кислоту и полисорбат 8 при pH, составляющем приблизительно 6,6. Для внутривенного введения полученный раствор обычно будут дополнительно разбавлять в растворе носителя.
Выбор схемы введения для терапевтического средства зависит от нескольких факторов, в том числе интенсивности метаболизма сыворотки или ткани для объекта, уровня симптомов, иммуногенности объекта и доступности клеток-мишеней в биологической матрице. В некоторых вариантах осуществления схема введения максимизирует количество терапевтического средства, доставляемого пациенту, в соответствии с приемлемым уровнем побочных эффектов. Соответственно, количество доставляемого биологического средства частично зависит от конкретного объекта и тяжести состояния, подлежащего лечению. Руководства по подбору подходящих доз антител, цитокинов и малых молекул являются доступными (см., например, Wawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996;
- 121 044279
Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993; Baert et al., New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003; Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999; Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med. 342:613619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003; Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000).
Определение подходящей дозы выполняет лечащий врач, например, с применением параметров или факторов, которые, как известно или ожидаемо из уровня техники, воздействуют на лечение или, как прогнозируют, воздействуют на лечение. Обычно начинают дозирование с количества, несколько меньшего, чем оптимальная доза, и после этого ее повышают небольшими шагами до тех пор, пока не достигается требуемый или оптимальный эффект по сравнению с любыми отрицательными побочными эффектами. Важные диагностические показатели включают, например, показатели, являющиеся симптомами воспаления или уровень продуцируемых воспалительных цитокинов.
Фактические уровни дозы активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут варьироваться для того, чтобы получить количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента, эффективным в отношении композиции и способа введения, при этом не токсично для пациента. Выбранный уровень дозы будет зависеть от ряда фармакокинетических факторов, в том числе активности конкретных используемых композиций по настоящему изобретению, пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, длительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, применяемых в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, массы тела, состояния, общего состояния здоровья и анамнеза пациента, подлежащего лечению, и аналогичных факторов, известных в области техники медицины.
Композиции, содержащие конъюгат антитела по настоящему изобретению, могут вводиться в помощью непрерывной инфузии или с помощью доз с интервалами, составляющими, например, один день, одну неделю, или вводиться 1-7 раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели, раз в четыре недели, раз в пять недель, раз в шесть недель, раз в семь недель или раз в восемь недель. Дозы могут вводиться внутривенно, подкожно или внутрикостно. Специфический протокол введения доз является таким, который предусматривает максимальную дозу или частоту введения доз, которые позволяют избежать значительных нежелательных побочных эффектов.
Для конъюгатов антитела по настоящему изобретению доза, вводимая пациенту, может составлять от 0,0001 мг/кг до 100 мг/кг массы тела пациента. Доза может составлять от 0,001 мг/кг до 50 мг/кг, от 0,005 мг/кг до 20 мг/кг, от 0,01 мг/кг до 20 мг/кг, от 0,02 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,05 до 5 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 8 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 2 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг массы тела пациента. Доза конъюгата антитела может быть рассчитана с применением массы пациента в килограммах (кг), умноженной на подлежащую введению дозу в мг/кг.
Дозы конъюгатов антитела по настоящему изобретению могут быть повторными, а введения могут быть разделены менее чем 1 днем, по меньшей мере 1 днем, 2 днями, 3 днями, 5 днями, 10 днями, 15 днями, 30 днями, 45 днями, 2 месяцами, 75 днями, 3 месяцами, 4 месяцами, 5 месяцами или по меньшей мере 6 месяцами. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела по настоящему изобретению вводят два раза в неделю, раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели, раз в четыре недели или менее часто.
Эффективное количество для конкретного пациента может варьироваться в зависимости от таких факторов, как подлежащее лечению состояние, общее состояние здоровья пациента, способ, путь и доза введения и тяжесть побочных эффектов (см., например, Maynard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK, 2001).
Путем введение может быть, например, местное нанесение или нанесение на кожу, инъекция или инфузия посредством подкожного, внутривенного, внутрибрюшинного, внутримозгового, внутримышечного, внутриглазного, внутриартериального, внутриспинномозгового, внутриочагового введения, или системы замедленного высвобождения или имплантат (см., например, Sidman et al., Biopolymers 22:547556, 1983; Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:40304034, 1980; патенты США № 6350466 и 6316024). При необходимости композиция может также содержать солюбилизирующее средство и местный анестетик, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции, или их оба. Кроме того, также можно использовать ингаляционное введение, например, за счет применения ингалятора или распылителя и состава со средством в виде аэрозоля. См., например, патенты США № 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 и 4880078; и публикации согласно РСТ № WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Способы совместного введения или лечения с применением второго терапевтического средства, например, цитокина, стероида, химиотерапевтического средства, антибиотика, или облучения (такого как
- 122 044279 тотальное облучение тела (TBI)), известны из уровня техники (см., например, Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.). Эффективное количество терапевтического средства может снижать симптомы на по меньшей мере 10%; по меньшей мере 20%; по меньшей мере приблизительно 30%; по меньшей мере 40% или по меньшей мере 50%.
Дополнительные виды терапии, которые можно применять в комбинации с конъюгатами антитела по настоящему изобретению, можно применять с интервалом менее 5 мин, с интервалом менее 30 мин, с интервалом 1 ч, с интервалом приблизительно 1 ч, с интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 2 ч, с интервалом от приблизительно 2 ч до приблизительно 3 ч, с интервалом от приблизительно 3 ч до приблизительно 4 ч, с интервалом от приблизительно 4 ч до приблизительно 5 ч, с интервалом от приблизительно 5 ч до приблизительно 6 ч, с интервалом от приблизительно 6 ч до приблизительно 7 ч, с интервалом от приблизительно 7 ч до приблизительно 8 ч, с интервалом от приблизительно 8 ч до приблизительно 9 ч, с интервалом от приблизительно 9 ч до приблизительно 10 ч, с интервалом от приблизительно 10 ч до приблизительно 11 ч, с интервалом от приблизительно 11 ч до приблизительно 12 ч, с интервалом от приблизительно 12 ч до 18 ч, с интервалом от 18 ч до 24 ч, с интервалом от 24 ч до 36 ч, с интервалом от 36 ч до 48 ч, с интервалом от 48 ч до 52 ч, с интервалом от 52 ч до 60 ч, с интервалом от 60 ч до 72 ч, с интервалом от 72 ч до 84 ч, с интервалом от 84 ч до 96 ч или с интервалом от 96 ч до 120 ч от введения конъюгатов антитела по настоящему изобретению. Два или более видов терапии могут применяться во время одного и того же визита пациента.
В настоящем изобретении предусмотрены протоколы для введения субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей конъюгаты антитела по настоящему изобретению, отдельно или в комбинации с другими видами терапии. Виды терапии из видов комбинированной терапии по настоящему изобретению могут применяться в отношении субъекта одновременно или последовательно. Терапию из видов комбинированной терапии по настоящему изобретению также можно применять циклически. Циклическая терапия предусматривает введение первого средства терапии в течение некоторого периода времени, а затем введения второго средства терапии в течение некоторого периода времени и повторения такого последовательного введения, т. е. цикла, с целью снижения развития устойчивости к одному из видов терапии (например, средствам), для недопущения или снижения побочных эффектов одного из видов терапии (например, средств) и/или для улучшения эффективности видов терапии.
Виды терапии из видов комбинированной терапии по настоящему изобретению можно применять в отношении субъекта одновременно.
Термин одновременно не ограничивается применением видов терапии точно в одно и то же время, а скорее означает, что фармацевтическую композицию, содержащую антитела или их фрагменты по настоящему изобретению, вводят субъекту последовательно и в течение временного интервала таким образом, чтобы антитела или конъюгаты антитела по настоящему изобретению могли действовать вместе с другим(-и) видом(-ами) терапии для обеспечения большей пользы, чем если бы их вводили иным способом. Например, каждый вид терапии может применяться в отношении субъекта в одно и то же время или последовательно в любом порядке в различные моменты времени; однако, если их не применяют в одно и то же время, их следует применять достаточно близко по времени, чтобы обеспечить требуемый терапевтический эффект. Каждый вид терапии можно применять в отношении субъекта по отдельности, в любой подходящей форме и с помощью любого подходящего пути. В различных вариантах осуществления виды терапии применяют в отношении субъекта с интервалом менее 5 мин, с интервалом менее 15 мин, с интервалом менее 30 мин, с интервалом менее 1 ч, с интервалом приблизительно 1 час, с интервалом от приблизительно 1 ч до приблизительно 2 ч, с интервалом от приблизительно 2 ч до приблизительно 3 ч, с интервалом от приблизительно 3 ч до приблизительно 4 ч, с интервалом от приблизительно 4 ч до приблизительно 5 ч, с интервалом от приблизительно 5 ч до приблизительно 6 ч, с интервалом от приблизительно 6 ч до приблизительно 7 ч, с интервалом от приблизительно 7 ч до приблизительно 8 ч, с интервалом от приблизительно 8 ч до приблизительно 9 ч, с интервалом от приблизительно 9 ч до приблизительно 10 ч, с интервалом от приблизительно 10 ч до приблизительно 11 ч, с интервалом от приблизительно 11 ч до приблизительно 12 ч, с интервалом 24 ч, с интервалом 48 ч, с интервалом 72 часа или с интервалом 1 неделя. В других вариантах осуществления два или более видов терапии применяются во время одного и того же визита пациента.
Виды комбинированной терапии могут вводиться субъекту в одной фармацевтической композиции. В качестве альтернативы терапевтические средства из видов комбинированной терапии могут вводиться субъекту одновременно в отдельных фармацевтических композициях. Терапевтические средства могут вводиться субъекту с помощью одного и того же или различных путей введения.
Следует понимать, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей, и что различные модификации или изменения в их свете будут предложены специалистам в данной области техники и должны быть включены в сущность и об
- 123 044279 ласть действия настоящего патента и объем прилагаемой формулы изобретения.
Примеры
Пример 1. Получение ADC к cKIT.
Получение антител и фрагментов антител к cKIT, содержащих сайт-специфические цистеиновые мутации, или без них.
Человеческие антитела и фрагменты антител к cKIT получали, как описано ранее в WO 2014150937 и WO 2016020791.
ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела к cKIT, амплифицировали из вектора, выделенного в скрининге на основе фагового дисплея, и клонировали в векторы экспрессии для клеток млекопитающих, которые содержат константные области тяжелой цепи человеческого IgG1 и человеческой легкой каппа-цепи или легкой лямбда-цепи. Векторы содержат промотор CMV и сигнальный пептид (MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 151) для тяжелой цепи и MSVLTQVLALLLLWLTGTRC (SEQ ID NO: 152) для легкой цепи, а также соответствующие сигнальную последовательность и последовательность отбора для амплификации ДНК в бактериальном хозяине, например, клетках DH5альфа Е. coli, временной экспрессии в клетках млекопитающих, например, клетках НЕК293, или стабильной трансфекции в клетки млекопитающих, например, клетки СНО. Для введения Cys-мутаций ПЦР с сайт-направленным мутагенезом проводили с применением олигонуклеотидов, разработанных для замены одиночных Cys-остатков в определенном сайте в константных областях кодирующих последовательностей тяжелой цепи или легкой цепи. Примерами мутаций с Cys-заменой являются Е152С или S375C в тяжелой цепи; Е165С или S114C в легкой каппа-цепи или А143С в легкой лямбда-цепи (все нумерация EU). В некоторых случаях две или более Cys-мутаций объединяли, чтобы получить антитело с несколькими Cys-заменами, например, HC-E152C-S375C, лямбда-LC-А143С-НС-Е152С, каппа-LC-Е165С-НС-Е152С или каппа-LC-S114C-HC-E152C (все нумерация EU). Для получения плазмид, кодирующих фрагменты антител, ПЦР с мутагенезом проводили с олигонуклеотидами, разработанными для удаления или модификации части константной области тяжелой цепи. Например, осуществляли ПЦР с удалением остатков 222-447 (нумерация EU) константной области тяжелой цепи, чтобы непосредственно после остатка 221 (нумерация EU) был закодирован стоп-кодон, с целью осуществления экспрессии конструкции с получением фрагмента Fab. Например, осуществляли ПЦР с удалением остатков 233-447 (нумерация EU) константной области тяжелой цепи, чтобы непосредственно после остатка 232 (нумерация EU) был закодирован стоп-кодон, с целью осуществления экспрессии конструкции с получением фрагмента Fab', содержащего два Cys-остатка шарнирной области IgG1.
Антитела, фрагменты антител и Cys-мутантные антитела или фрагменты антител к cKIT экспрессировали в клетках 293 Freestyle™ за счет совместной трансфекции плазмид для тяжелой цепи и легкой цепи с применением способов временной трансфекции, описанных ранее (Meissner, et al., Biotechnol Bioeng. 75:197-203 (2001)). Экспрессированные антитела очищали из клеточных супернатантов с помощью стандартных способов аффинной хроматографии с применением подходящей смолы, такой как смолы с белком А, белком G, Capto-L или LambdaFabSelect. В качестве альтернативы антитела, фрагменты антител и Cys-мутантные антитела или фрагменты антител к cKIT экспрессировали в клетках СНО за счет совместной трансфекции вектора для тяжелой цепи и вектора для легкой цепи в клетки СНО. Клетки проходили отбор, а затем стабильно трансфицированные клетки культивировали в условиях, оптимизированных для выработки антител. Антитела очищали из клеточных супернатантов, как указано выше.
Восстановление, повторное окисление и конгьюгация антител и фрагментов антител к cKIT с токсинами.
Соединения, содержащие реакционноспособный фрагмент, например малеимидную группу, вступающий в реакцию с тиольной группой (боковая цепь Cys) на антителе или фрагменте антитела, описанный линкер и функциональный фрагмент, такой как ауристатин или другой токсин, конъюгировали с Cys-остатками, нативными или введенными путем конструирования в антитело, с применением способов, описанных ранее (например, в WO 2014124316, WO 2015138615, Junutula JR, et al., Nature Biotechnology 26:925-932 (2008)).
Поскольку введенные путем конструирования Cys-остатки в антителах, экспрессируемых в клетках млекопитающих, во время биосинтеза модифицируются за счет аддуктов (дисульфидов), таких как глутатион (GSH) и/или цистеин (Chen et al., 2009), изначально экспрессированный модифицированный Cys не реагирует с реагентами, вступающими в реакцию с тиолами, такими как малеимидо- или бромацетамидная или йодацетамидная группы. Для осуществления конъюгации по введенным путем конструирования Cys-остаткам глутатионовый или цистеиновый аддукты должны быть удалены путем восстановления дисульфидов, что обычно вызывает восстановление всех дисульфидов в экспрессированном антителе. Поскольку нативные Cys-остатки в антителах и фрагментах антител обычно образуют дисульфидные связи с другими Cys-остатками в антителе или фрагменте антитела, они также не реагируют с реагентами, вступающими в реакцию с тиолами, пока дисульфиды не восстановлены. Восстановление дисульфидов можно осуществлять вначале путем воздействия на антитело восстановителем, таким как дитиотреитол (DTT), цистеин или трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид (ТСЕР-HCl). Необязательно восстановитель можно удалять, чтобы обеспечить возможность повторного окисления всех нативных дисуль- 124 044279 фидных связей антитела или фрагмента антитела для возобновления и/или стабилизации функциональной структуры антитела.
В случаях, когда антитело или фрагмент антитела конъюгировали только по введенным путем конструирования Cys-остаткам, для восстановления нативных дисульфидных связей и дисульфидной связи между цистеиновым или GSH аддуктами у введенного(-ых) путем конструирования Cys-остатка(-ов) к очищенным антителам с Cys-мутацией добавляли свежеполученный DTT до конечной концентрации, составляющей 10 мМ или 20 мМ. После инкубации антитела с DTT при 37°С в течение 1 ч смеси диализировали против PBS в течение трех дней с ежедневной заменой буфера для удаления DTT и повторного окисления нативных дисульфидных связей. Процесс повторного окисления отслеживали с помощью HPLC с обращенной фазой, которая позволяла разделять тетрамеры антитела и отдельные молекулы тяжелой и легкой цепи Реакционные смеси анализировали на колонке PRLP-S 4000A (50 ммх 2,1 мм, Agilent), нагретой до 80°С, и элюирование в колонке проводили с помощью линейного градиента 30-60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% TFA, при расходе 1,5 мл/мин. Элюирование белков из колонки отслеживали при 280 нм. Обеспечивали продолжения диализа до тех пор, пока не завершалось повторное окисление. Повторное окисление возобновляет внутрицепочечные и межцепочечные дисульфиды, при этом диализ обеспечивает возможность того, что цистеины и глутатионы, присоединенные к вновь введенному(-ым) Cys-остатку(-ам), вымываются при диализе. После повторного окисления к повторно окисленным антителам или фрагментам антител в PBS-буфере (pH 7,2) добавляли малеимидсодержащие соединения, как правило, при отношениях 1,5:1, 2:1 или 5:1 к введенному путем конструирования Cys, и инкубации проводили в течение 1 ч. Как правило, избыток свободного соединения удаляли очисткой с пропусканием через белок А или другую подходящую смолу с помощью стандартных способов, а затем заменой буфера на PBS.
В качестве альтернативы, антитела или фрагменты антител с сайтами введенного путем конструирования Cys восстанавливали и повторно окисляли с применением способа на смоле. Сефарозные гранулы с белком А (1 мл на 10 мг антитела) уравновешивали в PBS (не содержащем солей кальция или магния) и затем добавляли в образец антитела партиями. Исходный 0,5 М раствор цистеина получали путем растворения 850 мг цистеина-HCl в 10 мл раствора, полученного добавлением 3,4 г NaOH к 250 мл 0,5 М фосфата натрия, pH 8,0, а затем 20 мМ цистеина добавляли к взвеси антитело/гранулы и аккуратно смешивали при комнатной температуре в течение 30-60 мин. Гранулы загружали на колонку с гравитационным элюированием и промывали с помощью 50 объемов слоя PBS за менее чем 30 мин. Затем колонку уплотняли гранулами, ресуспендированными в одном объеме слоя PBS. Для модуляции степени повторного окисления необязательно добавляли от 50 нМ до 1 мкМ хлорида меди. Прогресс повторного окисления отслеживали путем изъятия небольшого тестируемого образца из смолы, элюирования в буфере для элюирования IgG (Thermo) и анализа с помощью RP-HPLC, как описано выше. Как только повторное окисление продвигалось до требуемой полноты, можно было инициировать конъюгацию путем непосредственного добавления 2-3 молярного избытка соединения относительно введенных путем конструирования цистеинов и обеспечения возможности прохождения реакции в смеси в течение 5-10 мин при комнатной температуре перед промывкой колонки с помощью по меньшей мере 20 объемов колонки PBS. Конъюгаты антитела элюировали с помощью буфера для элюирования IgG и нейтрализовали с помощью 0,1 объема 0,5 М фосфата натрия, pH 8,0, и проводили замену буфера на PBS. В некоторых случаях, вместо инициирования конъюгации с антителом на смоле колонку промывали с помощью по меньшей мере 20 объемов колонки PBS, и антитело элюировали с помощью буфера для элюирования IgG и нейтрализовали с помощью буфера с pH 8,0. Затем антитела либо применяли для реакций конъюгации, либо подвергали мгновенному замораживанию для будущего применения.
В некоторых случаях требовалась конъюгация по нативным Cys-остаткам, таким как остатки, которые обычно образуют межцепочечную дисульфидную связь между тяжелой цепью и легкой цепью, и Cys-остатки в шарнирной области антитела, которые обычно образуют межцепочечные дисульфидные связи между тяжелой цепью и тяжелой цепью, в отсутствие введенных путем конструирования Cysостатков или одновременно с конъюгацией, также направленной на введенные путем конструирования Cys-остатки. В таких случаях антитело или фрагмент антитела восстанавливали путем добавления 5кратного избытка ТСЕР относительно дисульфидных связей и инкубации образца при 37°С в течение 1 ч. Затем образцы непосредственно подвергали конъюгации или замораживали при < -60°С для будущей конъюгации. К антителам или фрагментам антител в PBS-буфере (pH 7,2) добавляли малеимидсодержащие соединения, как правило, при отношениях 2:1 к Cys-остаткам, применяемым для конъюгации, и инкубации проводили в течение 1 ч. Как правило, избыток свободного соединения удаляли с помощью обессоливающей колонки, а затем более интенсивной заменой буфера на PBS.
Конъюгация по лизиновым остаткам может проводиться за счет осуществления реакции антител или фрагментов антитела с соединением линкер-лекарственное средство, которое содержит группу, реагирующую с аминной группой, такую как NHS-сложноэфирная или тетрафторфенилсложноэфирная (например, соединение (7), SMCC-DM1, сульфо-SPDB-DM4 или SPDB-DM4). В качестве примера соединение (7) конъюгировали по лизиновым остаткам на Fab к HER2-HC-E152C. Конкретно, Fab к HER2-HCE152C экспрессировали с помощью временной трансфекции в клетках НЕК293. Fab захватывали из сре- 125 044279 ды с помощью аффинной очистки с capto-L (GE Healthcare), элюировали в буфер для элюирования IgG (Pierce) и проводили замену буфера на PBS с помощью ультрацентрифужного концентратора (Amicon). К раствору Fab (5,8 мг/мл) добавляли 2-кратный молярный избыток соединения (7). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин и затем смесь гасили с помощью 50 мМ Tris, pH 8. Затем полученный конъюгат очищали с помощью препаративной SEC в PBS.
Получение фрагментов антител из полноразмерных антител.
В некоторых случаях фрагменты антител получали путем генетической манипуляции с кодирующей последовательностью тяжелой цепи антитела, как описано выше, вследствие чего продуктом экспрессии был фрагмент антитела. В других случаях антитела получали путем ферментативного расщепления полноразмерных антител.
Для получения фрагментов Fab, содержащих остатки 1-222 (нумерация EU) исходного антитела, полноразмерное антитело обрабатывали смолой с иммобилизированным папаином (ThermoFisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, смолу с иммобилизированным папаином готовят путем уравновешивания в буфере для расщепления из свежерастворенного 20 мМ цистеина-HCl, доведенного до pH 7,0. Содержание антитела доводят до примерно 10 мг/мл и проводят замену буфера на буфер для расщепления и добавляют к смоле при отношении, составляющем 4 мг IgG на мл смолы, и инкубируют при 37°С в течение 5-7 ч. Затем смолу удаляют и фрагмент антитела очищают с помощью любой из подходящих аффинных смол, например, интактный IgG и фрагмент Fc отделяют от фрагмента Fab за счет связывания со смолой с белком А, или разделение проводят с помощью эксклюзионной хроматографии.
Для получения фрагментов F(ab')2, содержащих остатки 1-236 (нумерация EU) исходного антитела, полноразмерное антитело обрабатывали с помощью протеолитического фермента. Вкратце, антитело готовят в PBS из расчета примерно 10 мг/мл. Фермент добавляют при отношении 1:100 вес/вес и инкубируют в течение 2 ч при 37°С. Фрагмент антитела очищают с помощью любой из подходящих аффинных смол, например, интактный IgG и фрагмент Fc отделяют от фрагмента Fab за счет связывания со смолой с белком А, или разделение проводят с помощью эксклюзионной хроматографии.
Свойства конгьюгатов токсина и антитела и фрагмента антитела к cKIT.
Конъюгаты антитела и фрагмента антитела анализировали для определения степени конъюгации. Отношение соединения-к-антителу экстраполировали на основании данных LC-MS для восстановленных и дегликозилированных образцов (в соответствующих случаях). LC/MS обеспечивает возможность получения количественной оценки среднего количества молекул линкер-полезная нагрузка (соединение), присоединенных к антителу в образце конъюгата. Жидкостная хроматография при высоких давлениях (HPLC) разделяет антитело на легкую и тяжелую цепи, а при восстанавливающих условиях разделяет тяжелую цепь (НС) и легкую цепь (LC) в соответствии с количеством групп линкер-полезная нагрузка на цепь. Данные масс-спектров позволяют идентифицировать разновидности компонентов в смеси, например, LC, LC+1, LC+2, НС, НС+1, НС+2 и т. д. На основании средней нагрузки на цепях LC и НС для конъюгата антитела можно рассчитать среднее отношение соединения к антителу. Отношение соединения-к-антителу для указанного образца конъюгата представляет собой среднее количество молекул соединения (линкер-полезная нагрузка), присоединенных к тетрамерному антителу, содержащему две легкие цепи и две тяжелые цепи.
Профиль конъюгатов определяли с применением аналитической эксклюзионной хроматографии (AnSEC) на колонках Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) и/или Protein KW-803 5 мкм 300x8 мм (Shodex); агрегацию анализировали на основании аналитической эксклюзионной хроматографии.
Получение иллюстративных конъюгатов Fab cKIT и токсина Для получения конъюгатов Fab' к cKIT и токсина DAR4 или контрольного конъюгата Fab к Her2 и токсина DAR4, 50 мг полноразмерного IgG (WT, без введенных цистеинов) расщепляли с помощью протеолитического фермента. Фрагмент F(ab')2 очищали посредством SEC на колонке Superdex-S200 (GE Healthcare). В качестве альтернативы для получения контрольных конъюгатов, связывающихся с HER2, или конъюгатов Fab' к cKIT и токсина DAR4 вектор, кодирующий НС Fab', трансфицировали в клетки СНО совместно с вектором, кодирующим LC Fab'. Экспрессированный Fab' очищали посредством захвата на смоле с белком G. F(ab')2 или Fab' восстанавливали путем добавления ТСЕР (5x избыток относительно числа межцепочечных дисульфидов) и проводили непосредственную реакцию с соединением по настоящему изобретению (2,5x избыток относительно числа свободных Cys-остатков). Протекание реакции отслеживали с помощью RP-HPLC, и дополнительные 1x эквиваленты соединения добавляли до завершения реакции. Свободное соединение удаляли с помощью обессоливающей колонки PD10 (GE Healthcare). Экспериментально определили, что DAR составляло >3,9. Специфические конъюгаты, исследованные дополнительно в предусмотренных примерах, перечислены в табл. 2.
Для получения конъюгатов Fab к cKIT и токсина DAR2 вектор, кодирующий НС Fab с введенным Cys-остатком (НС 1-221 с Е152С согласно нумерации EU) трансфицировали в клетки НЕК293 совместно с вектором, кодирующим LC Fab с введенным Cys-остатком (каппа-LC К1О7С, каппа-LC S114C или каппа-LC Е165С согласно нумерации EU). Для получения контрольных конъюгатов Fab к Her2 и токсина
- 126 044279
DAR2 вектор, кодирующий НС Fab с введенным Cys-остатком (НС 1-222 с Е152С согласно нумерации EU и С-концевая His6-MeTKa (SEQ ID NO: 162)) трансфицировали в клетки НЕК293 совместно с вектором, кодирующим LC Fab с введенным Cys-остатком (каппа-LC К1О7С, каппа-LC S114C или каппа-LC Е165С согласно нумерации EU). Экспрессированные Fab очищали посредством захвата на смоле с CaptoL (GE Healthcare) и элюирования с помощью стандартного буфера для элюирования IgG (Thermo). Для Fab проводили замену буфера на PBS с применением устройства Amicon ultra. Fab восстанавливали с помощью DTT и обеспечивали возможность повторного окисления при комнатной температуре. После повторного образования межцепочечной дисульфидной связи Fab конъюгировали с соединением 6 (3х избыток относительно числа свободных Cys-остатков). Обеспечивали возможность протекания реакции в течение 30 мин при комнатной температуре и ее отслеживали с помощью RP-HPLC с обнаружением при 310 нм. Конъюгированные Fab очищали пропусканием через смолы с белком А (связывает her2) или capto-L (связывает cKIT) и промывали с помощью PBS+1% Triton X-100 и промывали с помощью большого количества PBS перед проведением элюирования в буфере для элюирования IgG. Затем для Fab проводили замену буфера на PBS с применением устройства Amicon Ultra. Специфические конъюгаты, исследованные дополнительно в предусмотренных примерах, перечислены в табл. 2 ниже с экспериментально определенными значениями DAR.
Для получения конъюгатов F(ab')2 к cKIT и токсина DAR2 вектор, кодирующий НС с введенными Cys-остатками (Е152С и S375C согласно нумерации EU), трансфицировали в клетки СНО совместно с вектором, кодирующим LC Fab. Для получения контрольных конъюгатов F(ab')2 к Her2 и токсина DAR2 вектор, кодирующий НС с введенными Cys-остатками (Е152С и S375C согласно нумерации EU), трансфицировали в клетки НЕК293 совместно с вектором, кодирующим LC Fab. Экспрессированные IgG очищали посредством захвата на смоле с белком А или смоле MabSelectSure (GE Healthcare) и элюирования с помощью стандартного буфера для элюирования IgG (Thermo). Полноразмерные IgG восстанавливали с помощью DTT при комнатной температуре и повторно окисляли после удаления DTT, что отслеживали с помощью RP-HPLC. Затем повторно окисленные IgG расщепляли с помощью протеолитического фермента для получения фрагментов F(ab')2. В случае фрагментов, связывающих cKIT, для F(ab')2 проводили замену буфера на PBS с применением устройства Amicon ultra. В случае фрагментов, связывающих HER2, фракцию F(ab')2 обогащали с помощью препаративной HIC, а затем проводили замену буфера на PBS с применением устройства Amicon ultra. F(ab')2 конъюгировали с соединением 4 или соединением 5 (4х избыток относительно числа свободных Cys-остатков). Обеспечивали возможность протекания реакции в течение 30 мин при комнатной температуре и ее отслеживали с помощью RP-HPLC с обнаружением при 310 нм. Конъюгированные F(ab')2 очищали пропусканием через смолы с capto-L (Ab3 к cKIT), и промывали с помощью PBS+1% Triton X-100, и промывали с помощью большого количества PBS перед элюированием в буфере для элюирования IgG или с помощью препаративной SEC (антитело к her2 и Ab4 к cKIT). Затем F(ab')2 концентрировали и проводили замену буфера на PBS с применением устройства Amicon Ultra. Специфические конъюгаты, исследованные дополнительно в предусмотренных примерах, перечислены в табл. 2 ниже с экспериментально определенными значениями DAR.
Для получения конъюгатов Fab к cKIT и токсина DAR1 вектор, кодирующий НС с введенными Cysостатками (Е152С согласно нумерации EU), трансфицировали в клетки НЕК293 совместно с вектором, кодирующим LC Fab. Экспрессированные IgG очищали посредством захвата на смоле с белком A (GE Healthcare) и элюирования с помощью стандартного буфера для элюирования IgG (Thermo). Полноразмерные IgG восстанавливали с помощью DTT при комнатной температуре и повторно окисляли после удаления DTT, что отслеживали с помощью RP-HPLC. IgG расщепляли с помощью иммобилизированного папаина (Thermo) для получения фрагмента Fab. Для Fab проводили замену буфера на PBS с применением устройства Amicon ultra. Fab конъюгировали с соединением 4 (4х избыток относительно числа свободных Cys-остатков). Обеспечивали возможность протекания реакции в течение 30 мин при комнатной температуре и ее отслеживали с помощью RP-HPLC с обнаружением при 310 нм. Конъюгированные Fab очищали посредством препаративной SEC в PBS.
Для получения контрольных конъюгатов Fab к Her2 и токсина DAR1 вектор, кодирующий НС Fab с введенными Cys-остатками (Е152С согласно нумерации EU), трансфицировали в клетки НЕК293 совместно с вектором, кодирующим LC Fab. Экспрессированные Fab очищали посредством захвата на смоле с Capto-L (GE Healthcare) и элюирования с помощью стандартного буфера для элюирования IgG (Thermo). Для Fab проводили замену буфера на PBS с применением устройства Amicon ultra. Fab конъюгировали с соединением 7 (2х молярный избыток относительно числа Fab). Обеспечивали возможность протекания реакции в течение 30 мин при комнатной температуре и ее отслеживали с помощью RP-HPLC с обнаружением при 310 нм. Конъюгацию останавливали с помощью 50 мМ Tris, pH 8,0. Конъюгированные Fab очищали посредством препаративной SEC в PBS.
- 127 044279
Таблица 2
Иллюстративные конъюгаты, связывающие cKIT, или контрольные конъюгаты
№ конъюг ата | Фрагмент антитела | Способ конъюгации | Последовател ьность НС фрагмента антитела | Последовате льность LC фрагмента антитела | Полезная нагрузка | DAR |
л | Fab'1 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину* | SEQ ID NO: 14 | SEQ ID NO: 25 | Соединение (1) | 4 |
J2 | Fab'2 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 40 | SEQ ID NO: 49 | Соединение (1) | 4 |
J3 | Fab'3 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 58 | SEQ ID NO: 25 | Соединение (1) | 4 |
J4 | Fab'4 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 73 | SEQ ID NO: 84 | Соединение (1) | 4 |
J5 | Fab'5 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 99 | SEQ ID NO: 110 | Соединение (1) | 4 |
J6 | Fab' к Her2 | Конъюгация по нативному цистеину | EVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAA SGFNIKDTYIHW VRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRY ADSVKGRFTISA | DIQMTQSPSSL SASVGDRVTIT CRASQDVNTAV AWYQQKPGKAP KLLIYSASFLY SGVPSRFSGSR | Соединение (1) | 4 |
- 128 044279
DTSKNTAYLQMN SLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMD YWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVP SSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 146) | SGTDFTLTISS LQPEDFATYYC QQHYTTPPTFG QGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPS DEQLKSGTASV VCLLNNFYPRE AKVQWKVDNAL QSGNSQESVTE QDSKDSTYSLS STLTLSKADYE KHKVYACEVTH QGLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO: 147) | |||||
J7 | Fab3 к cKIT | По введенным путем конструирован ия цистеинам в положении НС-Е152С и LC-E165C (EU) | SEQ ID NO: 130 | SEQ ID NO: 134 | Соединение (6) | 1,7 |
J8 | Fab к Her2 | По введенным путем конструирован ия цистеинам в положении НС-Е152С и LC-K107C (EU) | EVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAA SGFNIKDTYIHW VRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRY ADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMN SLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMD YWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPCP VTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVP SSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKHHH | DIQMTQSPSSL SASVGDRVTIT CRASQDVNTAV AWYQQKPGKAP KLLIYSASFLY SGVPSRFSGSR SGTDFTLTISS LQPEDFATYYC QQHYTTPPTFG QGTKVEICRTV AAPSVFIFPPS DEQLKSGTASV VCLLNNFYPRE AKVQWKVDNAL QSGNSQESVTE QDSKDSTYSLS STLTLSKADYE KHKVYACEVTH QGLSSPVTKSF | Соединение (6) | 1,8 |
- 129 044279
ннн (SEQ ID NO: 148) | NRGEC (SEQ ID NO: 149) | |||||
J9 | F(ab ' 4)2 к cKIT | По введенным путем конструирован ия цистеинам в положении НС-Е152С (EU) | QVQLQQSGPGLV KPSQTLSLTCAI SGDSVSTNSAAW NWIRQSPSRGLE WLGRIYYRSQWL NDYAVSVKSRIT INPDTSKNQFSL QLNSVTPEDTAV YYCARQLTYPYT VYHKALDVWGQG TLVTVSSastkg psvfplapssks tsggtaalgclv kdyfpCpvtvsw nsgaltsgvhtf pavlqssglysl ssvvtvpssslg tqtyi cnvnhkp sntkvdkrvepk scdkthtcppcp apellg (SEQ ID NO: 153) | SEQ ID NO: 84 | Соединение (4) | 1,9 |
ЛО | F(ab'3)2 к cKIT | По введенным путем конструирован ия цистеинам в положении НС-Е152С (EU) | QVQLVQSGAEVK KPGSSVKVSCKA SGGTFSSYAISW VRQAPGQGLEWM GTIGPFEGQPRY AQKFQGRVTITA DESTSTAYMELS SLRSEDTAVYYC ARGGYISDFDVW GQGTLVTVSSas tkgpsvfplaps skstsggtaalg clvkdyfpCpvt vswnsgaltsgv htfpavlqssgl yslssvvtvpss | SEQ ID NO: 25 | Соединение (5) | 2 |
- 130 044279
slgtqtyicnvn hkpsntkvdkrv epkscdkthtcp pcpapellg (SEQ ID NO: 154) | ||||||
Jll | Fab3 к cKIT | По введенным путем конструирован ия цистеинам в положении НС-Е152С (EU) | QVQLVQSGAEVK KPGSSVKVSCKA SGGTFSSYAISW VRQAPGQGLEWM GTIGPFEGQPRY AQKFQGRVTITA DESTSTAYMELS SLRSEDTAVYYC ARGGYISDFDVW GQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALG CLVKDYFPcPVT VSWNS GALTS GV HTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSS SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKV EPKSCDKTH (SEQ ID NO: 155) | SEQ ID NO: 25 | Соединение (4) | 0,9 |
J12 | F(ab')2 к Her2 | По введенным путем конструирован ия цистеинам в положении НС-Е152С (EU) | EVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAA SGFNIKDTYIHW VRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRY ADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMN SLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMD YWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPCP VTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSS | SEQ ID NO: 147 | Соединение (4) | 1,7 |
- 131 044279
GLYSLSSWTVP SSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 156) | ||||||
J13 | Fab к Her2 | По введенным путем конструирован ия цистеинам в положении НС-Е152С (EU) | EVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAA SGFNIKDTYIHW VRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRY ADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMN SLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMD YWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPCP VTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVP SSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDK KVEPKSCDK (SEQ ID NO: 157) | SEQ ID NO: 147 | Соединение (7) | 0,9 |
J14 | Fab'1 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 14 | SEQ ID NO: 25 | mc-MMAF | 4 |
J15 | Fab'1 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 14 | SEQ ID NO: 25 | Соединение (5) | 4 |
J16 | Fab'1 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 14 | SEQ ID NO: 25 | Соединение (2) | 4 |
J17 | Fab'2 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 40 | SEQ ID NO: 49 | mc-MMAF | 4 |
J18 | Fab'2 к cKIT | Конъюгация по нативному | SEQ ID NO: 40 | SEQ ID NO: 49 | Соединение (5) | 4 |
- 132 044279
цистеину | ||||||
J19 | Fab'2 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 40 | SEQ ID NO: 49 | Соединение (2) | 4 |
J2 0 | Fab'3 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 132 | SEQ ID NO: 25 | mc-MMAF | 4 |
J21 | Fab'3 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 58 | SEQ ID NO: 25 | Соединение (5) | 4 |
J22 | Fab'3 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 132 | SEQ ID NO: 25 | Соединение (2) | 4 |
Fab4 к cKIT | НС-Е152С (EU) | QVQLQQSGPGLV KPSQTLSLTCAI SGDSVSTNSAAW NWIRQSPSRGLE WLGRIYYRSQWL NDYAVSVKSRIT INPDTSKNQFSL QLNSVTPEDTAV YYCARQLTYPYT VYHKALDVWGQG TLVTVSSastkg psvfplapssks tsggtaalgclv kdyfpCpvtvsw nsgaltsgvhtf pavlqssglysl ssvvtvpssslg tqtyi cnvnhkp sntkvdkrvepk scdk (SEQ ID NO: 158) | SEQ ID NO: 84 | Отсутствуе τ | ||
Fabl к cKIT | НС-Е152С (EU) | QVQLVQSGAEVK KPGSSVKVSCKA SGGTFSSYAISW VRQAPGQGLEWM GVIFPAEGAPGY AQKFQGRVTITA DESTSTAYMELS SLRSEDTAVYYC | SEQ ID NO: 25 | Отсутствуе τ |
- 133 044279
ARGGYISDFDVW GQGTLVTVSSas tkgpsvfplaps skstsggtaalg clvkdyfpCpvt vswnsgaltsgv htfpavlqssgl yslssvvtvpss slgtqtyicnvn hkpsntkvdkrv epkscdk (SEQ ID NO: 159) | ||||||
Fab2 к cKIT | HC-E152C (EU) | QVQLVQSGAEVK KPGSSVKVSCKA SGGTFSSHALSW VRQAPGQGLEWM GGIIPSFGTADY AQKFQGRVTITA DESTSTAYMELS SLRSEDTAVYYC ARGLYDFDYWGQ GTLVTVSSastk gpsvfplapssk stsggtaalgcl vkdyfpCpvtvs wnsgaltsgvht fpavlqssglys Issvvtvpsssl gtqtyicnvnhk psntkvdkrvep kscdk (SEQ ID NO: 160) | SEQ ID NO: 49 | Отсутствуе T | ||
Fab3 к cKIT | HC-E152C (EU) | QVQLVQSGAEVK KPGSSVKVSCKA SGGTFSSYAISW VRQAPGQGLEWM GTIGPFEGQPRY AQKFQGRVTITA DESTSTAYMELS SLRSEDTAVYYC ARGGYISDFDVW GQGTLVTVSSAS | SEQ ID NO: 25 | Отсутствуе T |
- 134 044279
TKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALG CLVKDYFPCPVT VSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSS SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKV EPKSCDK (SEQ ID NO: 161) | ||||||
Fab к Нег2 | HC-E152C (EU) | SEQ ID NO: 157 | SEQ ID NO: 147 | Отсутствуе T | ||
Fab'5 к cKIT | Конъюгация no нативному цистеину | SEQ ID NO: 143 | SEQ ID NO: 110 | Соединение (1) | 3,9 | |
Fab'5 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 143 | SEQ ID NO: 110 | Соединение (1) | 3,7 | |
Fab'5 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 143 | SEQ ID NO: 110 | mc-MMAF | 4 | |
JW | Fab'2 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 126 | SEQ ID NO: 49 | Соединение (1) | 3,9 |
JX | Fab'2 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 126 | SEQ ID NO: 49 | mc-MMAF | 3,9 |
JY | Fab'3 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 132 | SEQ ID NO: 25 | Соединение (1) | 3,9 |
JZ | Fab'3 к cKIT | Конъюгация по нативному цистеину | SEQ ID NO: 132 | SEQ ID NO: 25 | mc-MMAF | 3,9 |
* Конъюгация по нативному Cys означает, что лекарственное средство присоединено к фрагменту антитела в положении одного или нескольких нативных цистеиновых остатков, выбранных из LC-214C и НС-220С-226С-229С (нумерация всех положений согласно EU).
Пример 2. Получение белков внеклеточного домена cKIT человека, яванского макака, мыши и крысы, а также субдоменов 1-3 и 4-5 cKIT для анализов связывания.
Гены внеклеточных доменов (ECD) cKIT человека, мыши и крысы синтезировали на основании аминокислотных последовательностей из баз данных GenBank или Uniprot (см. табл. 3 ниже). Ген на основе кДНК-шаблона для cKIT и 1 ECD яванского макака синтезировали на основании информации об аминокислотных последовательностях, полученной с применением мРНК из различных тканей яванского макака (например, полученных из Zyagen Laboratories; табл. 4 ниже). Все синтезированные фрагменты ДНК клонировали в подходящие векторы экспрессии, например, вектор на основе hEF1-HTLV (pFUSEmIgG2A-Fc2) с С-концевыми метками для обеспечения возможности очистки.
- 135 044279
Таблица 3
Последовательности конструкций на основе cKIT человека, мыши, крысы
Название | Описание | Номер доступа | SEQ ID NO: |
D1-5 (внеклеточ ный домен) cKIT человека | Вариант 2 транскрипта cKIT человека, остатки 26-520-ΜΕΤΚΆ QPSVSPGEPSPPSIHPGKSDLIVRVGDEIR LLCTDPGFVKWTFEILDETNENKQNEWITE KAEATNTGKYTCTNKHGLSNSIYVFVRDPA KLFLVDRSLYGKEDNDTLVRCPLTDPEVTN YSLKGCQGKPLPKDLRFIPDPKAGIMIKSV KRAYHRLCLHCSVDQEGKSVLSEKFILKVR PAFKAVPWSVSKASYLLREGEEFTVTCTI KDVS S SVYS TWKRENS QTKLQEKYNSWHHG DFNYERQATLTIS SARVNDSGVFMCYANNT FGSANVTTTLEWDKGFINIЕРМИНУТЫТТ VFVNDGENVDLIVEYEAFPKPEHQQWIYMN RTFTDKWEDYPKSENESNIRYVSELHLTRL KGTEGGTYTFLVSNSDVNAAIAFNVYVNTK PEILTYDRLVNGMLQCVAAGFPEPTIDWYF CPGTEQRCSASVLPVDVQTLNSSGPPFGKL WQS SIDS SAFKHNGTVECKAYNDVGKT SA YFNFAFKEQIHPHTLFTPRSHHHHHH | NM_001093772 | 112 |
Dl-3 cKIT человека | Вариант 1 транскрипта cKIT человека остатки 26-311-МЕТКА QPSVSPGEPSPPSIHPGKSDLIVRVGDEIR | NM_000222 | 113 |
- 136 044279
D4-5 | cKIT | LLCTDPGFVKWTFEILDETNENKQNEWITE KAEATNTGKYTCTNKHGLSNSIYVFVRDPA KLFLVDRSLYGKEDNDTLVRCPLTDPEVTN YSLKGCQGKPLPKDLRFIPDPKAGIMIKSV KRAYHRLCLHCSVDQEGKSVLSEKFILKVR PAFKAVPWSVSKASYLLREGEEFTVTCTI KDVS S SVYS TWKRENS QTKLQEKYNSWHHG DFNYERQATLTIS SARVNDSGVFMCYANNT FGSANVTTTLEVVDKGRSHHHHHH Вариант 1 транскрипта cKIT человека, остатки 311-524МЕТКА GEINI FPMHHYTblTTVFVNDGENVDLIVEY EAFPKPEHQQWIYMNRTFTDKWEDYPKSEN ESNIRYVSELHLTRLKGTEGGTYTFLVSNS | NM 000222 | 114 |
человека | DVNAAIAFNVYVNTKPEILTYDRLVNGMLQ CVAAGFPEPTIDWYFCPGTEQRCSASVLPV DVQTLNS S GPP FGKLWQS SI DS SAFKHNG TVE CKAYNDVGKT SAY FNFAFKGNNKE QIH PHTLFTPRSHHHHHH Вариант 1 транскрипта cKIT мыши, остатки 26-527-МЕТКА SQPSASPGEPSPPSIHPAQSELIVEAGDTL SLTCIDPDFVRWTFKTYFNEMVENKKNEWI QEKAEATRTGTYTCSNSNGLTSSIYVFVRD PAKL FLVGL P L FGKE D S DALVRC P L T D P QV SNYSLIECDGKSLPTDLTFVPNPKAGITIK | |||
Dl-5 мыши | cKIT | NVKRAYHRLCVRCAAQRDGTWLHSDKFTLK VRAAIKAIPWSVPETSHLLKKGDTFTWC TIKDVSTSVNSMWLKMNPQPQHIAQVKHNS WHRGDFNYERQETLTISSARVDDSGVFMCY ANNTFGSANVTTTLKVVEKGFINISPVKNT TVFVTDGENVDLWEYEAYPKPEHQQWIYM NRT S ANKGKDYVKSDNKSNIRYVNQLRL TR LKGTEGGTYT FLVSNS DASASVT FNVYVNT | NM_001122733 | 115 |
- 137 044279
KPEILTYDRLINGMLQCVAEGFPEPTIDWY ЕСТ GAE QRC T T PVS PVDVQVQNVSVS P FGK LWQS SIDS SVFRHNGTVECKASNDVGKS S AFFNFAFKEQIQAHTLFTPLEVLFQGPRSP RGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPK IKDVLMIS L S PIVTCVVVDVS E DDPDVQIS WFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRWSAL PIQHQDWMS GKE FKCKVNNKDL PAPIERTI SKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLT CMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEP VLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCS WHEGLHNHHTTKSFSRTPGK | |||
Dl-5 cKIT крысы | cKIT крысы, остатки 25-526- МЕТКА SQPSASPGEPSPPSIQPAQSELIVEAGDTI RLTCTDPAFVKWTFEILDVRIENKQSEWIR EKAEATHTGKYTCVSGSGLRSSIYVFVRDP AVLFLVGLPLFGKEDNDALVRCPLTDPQVS NYSLIECDGKSLPTDLKFVPNPKAGITIKN VKRAYHRLCIRCAAQREGKWMRSDKFTLKV RAAIKAIPWSVPETSHLLKEGDTFTVICT IKDVSTSVDSMWIKLNPQPQSKAQVKRNSW HQGDFNYERQETLTISSARVNDSGVFMCYA NNTFGSANVTTTLKWEKGFINIFPVKNTT VFVTDGENVDLWEFEAYPKPEHQQWIYMN RTPTNRGEDYVKSDNQSNIRYVNELRLTRL KGTEGGTYTFLVSNSDVSASVTFDVYVNTK PEILTYDRLMNGRLQCVAAGFPEPTIDWYF С T GAE QRC TVPVP PVDVQIQNASVS P FGKL WQSSIDS SVFRHNGTVECKASNAVGKSSA FFNFAFKGNSKEQIQPHTLFTPRSLEVLFQ GPGSPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPK IKDVLMIS L S PMVT CVVVDVS E DDPDVQIS WFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRWSAL PIQHQDWMS GKE FKCKVNNRALPS PIEKTI | NM_022264 | 116 |
SKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLT CMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTAT VLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACS WHEGLHNHLTTKTISRSLGK |
- 138 044279
Таблица 4
Последовательности белка cKIT яванского макака
Конструкция | Аминокислотная последовательность в формате однобуквенного кода, сигнальный пептид подчеркнут cKIT яванского макака, остатки 25-520- МЕТКА | SEQ ID NO |
Dl-5 cKIT яванского макака | MYRMQLLSCIALSLALVTNSQPSVSPGEPSPPSIHPAKSELI VRVGNEIRLLCIDPGFVKWT ЕЕILDE TNENKQNEWIТЕКАЕА TNTGKYTCTNKHGLSSSIYVFVRDPAKLFLVDRSLYGKEDND TLVRCPLTDPEVTSYSLKGCQGKPLPKDLRFVPDPKAGITIK SVKRAYHRLCLHCSADQEGKSVLSDKFILKVRPAFKAVPWS VSKASYLLREGEEFTVTCTIKDVSSSVYSTWKRENSQTKLQE KYNSWHHGDFNYERQATLTISSARVNDSGVFMCYANNTFGSA NVTTTLEWDKGFINI FPMHHyTbITTVFVNDGENVDLIVEYE AFPKPEHQQWIYMNRTFTDKWEDYPKSENESNIRYVSELHLT RLKGTEGGTYTFLVSNSDVNASIAFNVYVNTKPEILTYDRLV NGMLQCVAAGFPEPTIDWYFCPGTEQRCSASVLPVDVQTLNA S GPP FGKLWQS SI DS SAFKHNGTVECKAYNDVGKT SAYFNF AFKGNNKEQIHPHTLFTPRSHHHHHH | 117 |
Экспрессия рекомбинантных белков ECD cKIT.
Требуемые рекомбинантные белки cKIT экспрессировали в линиях клеток, происходящих от клеток НЕК293 (293FS), предварительно адаптированных для суспензионного культивирования и выращиваемых в бессывороточной среде FreeStyle-293 (Gibco, № по каталогу 12338018). Получение белка как в малом масштабе, так и в большом масштабе осуществляли посредством временной трансфекции и проводили в нескольких смесительных колбах (Nalgene), объемом не более 1 л каждая, с 293Fectin® (Life Technologies, № по каталогу 12347019) в качестве переносчика плазмид. Общую ДНК и 293Fectin применяли при отношении 1:1,5 (вес:объем). Отношение ДНК к культуре составляло 1 мг/л. Супернатанты культуры клеток собирали через 3-4 дня после трансфекции, центрифугировали и стерилизовали фильтрацией до очистки.
Очистка меченых белков ECD.
Рекомбинантные белки внеклеточного домена cKIT с Fc-меткой (например, ECD-Fc cKIT человека, cKIT человека (субдомены 1-3, 4-5 ECD)-Fc, cKIT яванского макака-mFc, cKIT крысы-mFc, cKIT мышиmFc) очищали из супернатанта культуры клеток. Просветленный супернатант пропускали через колонку Sepharose® с белком А, которая была уравновешена с помощью PBS. После промывки до исходного уровня связанный материал элюировали с помощью буфера для элюирования Pierce Immunopure® с низким pH или 100 мМ глицина (pH 2,7) и сразу нейтрализовали с помощью 1/8 объема элюирования 1 М Tris, pH 9,0. Объединенный белок концентрировали при необходимости с применением 15-мл центрифужных концентраторов Amicon® Ultra с отсечением по номинальной молекулярной массе 10 кДа или 30 кДа. Затем пулы очищали с помощью SEC с применением колонки Superdex® 200 26/60 для удаления агрегатов. Затем характеристики очищенного белка определяли с помощью SDS-PAGE и SEC-MALLS (многоугловое лазерное светорассеяние). Концентрацию определяли по поглощению при 280 нм с применением теоретических коэффициентов поглощения, рассчитанных на основании последовательности с помощью Vector NTI.
Пример 3. Связывание Fab к cKIT с субдоменами ECD cKIT.
Чтобы улучшить определение сайтов связывания Ab к cKIT, ECD cKIT человека разделяли на субдомены 1-3 (домен связывания лиганда) и субдомены 4-5 (домен димеризации). Чтобы определить, какие субдомены связывались, использовали анализ сэндвич-ELISA. 1 мкг/мл ECD, разбавленных в 1х забуференным фосфатом солевом растворе, соответствующих субдоменам 1-3, субдоменам 4-5 cKIT или полноразмерному ECD cKIT, покрывали 96-луночные планшеты Immulon® 4-HBX (Thermo Scientific, № по каталогу 3855, Рокфорд, Иллинойс) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали трижды с помощью буфера для промывки (1х забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) с 0,01% Tween-20 (Bio-Rad 101-0781)). Планшеты блокировали с помощью 280 мкл/лунка 3% бычьего сывороточного альбумина, разбавленного в 1х PBS, в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали трижды с помощью буфера для промывки. Антитела готовили из расчета 2 мкг/мл в буфере для промывки с 5-кратными разбавлениями для получения 8 точек и добавляли в планшеты для ELISA из расчета 100 мкл/лунка в трех повторностях. Планшеты инкубировали на орбитальном шейкере со встря
- 139 044279 хиванием при 200 об/мин в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты для анализа промывали трижды с помощью буфера для промывки. Вторичное антитело, фрагмент козьего антитела F(ab')2 к человеческому IgG (H+L) (Jackson Immunoresearch, № по каталогу 109-036-088, Вест-Грув, Пенсильвания), готовили при отношении 1: 10000 в буфере для промывки и добавляли в планшеты для ELISA из расчета 100 мкл/лунка. Планшеты инкубировали с вторичным антителом в течение 1 ч при комнатной температуре со встряхиванием при 200 об/мин на орбитальном шейкере. Планшеты для анализа промывали трижды с помощью буфера для промывки. Для проявления сигнала ELISA в планшеты добавляли по 100 мкл/лунка ТМВ-субстрата Sure blue ® (KPL, № по каталогу 52-00-03, Гейтерсбург, Мэриленд) и обеспечивали возможность инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре. Для остановки реакции в каждую лунку добавляли по 50 мкл 1 н. хлористоводородной кислоты. Поглощение измеряли при 450 нм с применением планшет-ридера SpectraMax® M5 от Molecular Devices. Чтобы определить ответ на связывание для каждого антитела, показатели оптической плотности усредняли, получали стандартное отклонение значений и наносили на график с применением Excel. Характеристики связывания с cKIT для индивидуальных антител к cKIT можно найти в табл. 5.
Пример 4. Показатели аффинности антител к cKIT.
Аффинность антител в отношении ортологов cKIT разных видов, а также в отношении cKIT человека определяли с применением технологии SPR с применением устройства Biacore® 2000 (GE Healthcare, Питтсбург, Пенсильвания) и сенсорных чипов СМ5.
Вкратце, в качестве подвижного буфера для всех экспериментов применяли HBS-P (0,01 М HEPES, pH 7,4, 0,15 М NaCl, 0,005% Surfactant P20), дополненный 2% блокирующего буфера Odyssey® (Li-Cor Biosciences, Линкольн, Невада). Уровень иммобилизации и взаимодействий аналитов измеряли по единицам ответа (RU). Пилотные эксперименты осуществляли для тестирования и подтверждения применимости иммобилизации антитела к человеческой Fc-области (номер по каталогу BR100839, GE Healthcare, Питтсбург, Пенсильвания) и захвата тестируемых антител.
Для измерения кинетических показателей осуществляли эксперименты, в которых антитела захватывали на поверхности сенсорного чипа посредством иммобилизированного антитела к человеческой Fcобласти, и определяли способность связывания белков cKIT в свободном растворе. Вкратце, 25 мкг/мл антитела к человеческой Fc-области, pH 5, иммобилизировали на сенсорном чипе СМ5 за счет иммобилизации по аминной группе, при расходе, составляющем 5 мкл/мин, в обеих проточных ячейках до достижения 10500 RU. Затем инъецировали 0,1-1 мкг/мл тестируемых антител при расходе 10 мкл/мин в течение 1 мин. Уровни захваченных антител обычно поддерживали ниже 200 RU. Впоследствии внеклеточные домены (ECD) рецептора cKIT разбавляли в виде серии 2-кратных разведений с концентрацией 3,125-50 нМ и инъецировали при расходе, составляющем 40 мкл/мин, в течение 3 мин через обе эталонную и тестируемую проточные ячейки. Протестированные ECD перечислены в табл. ниже (табл. 5). Диссоциацию связывания ECD отслеживали в течение 10 мин. После каждого цикла впрыскиваний поверхность чипа регенерировали с помощью 3 М MgCl2 при расходе 10 мкл/мин в течение 30 с. Все эксперименты осуществляли при 25°С и данные ответа глобально аппроксимировали с простой моделью взаимодействия 1:1 (с применением программного обеспечения Scrubber 2®, версия 2.0b (BioLogic Software), для получения оценок константы ассоциации (ka), константы диссоциации (kd) и аффинности (KD). В табл. 6 перечислены связывание доменов и аффинность для выбранных антител к cKIT.
Таблица 5
Изотип и источник ECD cKIT
Изотип ECD | Метка | Источник | |||
Человек | С-концевая ID NO: 162) | 6x | His | (SEQ | Конструкция Novartis |
Яванский макак | С-концевая ID NO: 162) | 6x | His | (SEQ | Конструкция Novartis |
Мышь | С-концевая ID NO: 162) | 6x | His | (SEQ | Sino Biological Inc (номер по каталогу 50530-M08H) |
Крыса | С-концевая | mFc | Конструкция Novartis |
- 140 044279
Таблица 6
Аффинность и перекрестная реактивность антител
АЬ | Связывание домена cKIT | KD (пМ) с ECD cKIT человека в SET | KD (пМ) с ECD cKIT яванского макака в SET | Реактивност ь в отношении cKIT мыши | Реактивное ть в отношении cKIT крысы |
Abi к cKIT | D1-3 | 94 | 170 | Не реагирует | Не реагирует |
АЬ2 к cKIT | D1-3 | 7 | 10 | Не реагирует | Не реагирует |
АЬЗ к cKIT | D1-3 | 160 | 52 | Не реагирует | Не реагирует |
АЬ4 к cKIT | D4-5 | 2400 | 140 | Да | Да |
АЬ5 к cKIT | D1-3 | 110 | 180 | Да | Да |
Пример 5. In vitro анализы цитолиза человеческих и мышиных клеток под действием ADC, связывающих cKIT In vitro анализы жизнеспособности HSC.
Человеческие мобилизированные гемопоэтические стволовые клетки (HSC) периферической крови получали из HemaCare (номер по каталогу M001F-GCSF-3). Каждый флакон, содержащий ~1 миллион клеток, оттаивали и разбавляли в 10 мл 1х HBSS и центрифугировали в течение 7 мин при 1200 об/мин. Клеточный осадок ресуспендировали в 18 мл ростовой среды, содержащей три фактора роста (StemSpan SFEM (StemCell Technologies, номер по каталогу 09650) с 50 нг/мл каждого из ТРО (R&D Systems, номер по каталогу 288-ТР) лиганда Flt3 (Life Technologies, номер по каталогу РНС9413) и IL-6 (Life Technologies, номер по каталогу РНС0063), дополненная аминокислотами (Gibco, номер по каталогу 10378-016)).
Клетки костного мозга от мышей C57BL/6J собирали из бедренных и большеберцовых костей, ресуспендировали в IMDM (HyClone, номер по каталогу SH30228.01) и объединяли. Клетки центрифугировали в течение 10 мин при 300 д. Клеточный осадок ресуспендировали в буфере AutoMACS (1х PBS+0,5% BSA+2 мМ EDTA) при концентрации 100 миллионов клеток в 40 мкл. Смесь антител для истощения по линии дифференцировки (Miltenyi, номер по каталогу 130-090-858) добавляли при концентрации 10 мкл на 100 миллионов клеток. Клетки инкубировали в течение 10 мин в холодной комнате перед добавлением 30 мкл буфера AutoMACS и 20 мкл биотинилированных магнитных гранул на 100 миллионов клеток. Данную новую суспензию инкубировали в холодной комнате в течение 15 мин. Клетки центрифугировали в течение 10 мин при 300 g. Осадок ресуспендировали в 2 мл буфера AutoMACS и пропускали через фильтр для клеток. Клетки отбирали на AutoMACS с применением протокола истощения. Отрицательную фракцию из сортера центрифугировали в течение 10 мин при 300 g и ресуспендировали в 1 мл HBSS. Ресуспендированные клетки окрашивали с помощью антитела к CD45-PerCPCy5.5 (Becton Dickinson, номер по каталогу 550994), антитела к CD48-FITC (eBioscience, номер по каталогу 11-0481-82), антитела к CD150-PE (BioLegend, номер по каталогу 115904) и антитела к Sca-1 (Becton Dickinson, номер по каталогу 560653). Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, центрифугировали в течение 5 мин при 300 g и ресуспендировали в 700 мкл буфера FACS для сортировки. Sca-1+ клетки были положительными при сортировке на FACS Aria. После сортировки клетки помещали в ростовые среды, содержащие три фактора роста (StemSpan SFEM с 50 нг/мл ТРО (R&D Systems, номер по каталогу 288-ТР), лиганда Flt3 (Life Technologies, номер по каталогу РНС9413) и IL-6 (Life Technologies, номер по каталогу РНС0063), дополненная аминокислотами (Gibco, номер по каталогу 10378-016)).
Тестируемые средства разбавляли в двух повторностях в 384-луночном черном планшете для анализа при конечном объеме, составляющем 5 мкл, начиная с 10 мкг/мл и последовательно разводя 1:3. Клетки, полученные выше, добавляли в каждую лунку при конечном объеме, составляющем 45 мкл. Клетки инкубировали при 37°С и 5% кислорода в течение 7 дней. В конце культивирования клетки собирали для окрашивания путем центрифугирования планшета для анализа в течение 4 мин при 1200 об/мин. Затем супернатанты аспирировали, а клетки промывали и переносили в другой 384-луночный планшет (Greiner Bio-One, обработанный для ТС, с черными прозрачными лунками с плоским дном, номер по каталогу 781092).
В случае анализов с человеческими клетками каждую лунку окрашивали с помощью антитела к CD34-PerCP (Becton Dickinson, номер по каталогу 340666) и антитела к CD90-APC (Becton Dickinson, номер по каталогу 559869), промывали и ресуспендировали в буфере FACS до конечного объема, составляющего 50 мкл. В случае анализов с мышиными клетками каждую лунку окрашивали с помощью антитела к CD45-PerCP-Cy5.5 (Becton Dickinson, номер по каталогу 550994), антитела к CD48-FITC (eBioscience, номер по каталогу 11-0481-82), антитела к CD150-PE (BioLegend, номер по каталогу 115904),
- 141 044279 антитела к cKIT-АРС (Becton Dickinson, номер по каталогу 553356) и антитела к Sca-1 (Becton Dickinson, номер по каталогу 560653), промывали и ресуспендировали в буфере FACS до конечного объема, составляющего 50 мкл. Затем клетки анализировали на проточном цитометре Becton Dickinson Fortessa и проводили количественную оценку анализа.
Конъюгаты токсина с антителами и фрагментами антител, распознающими cKIT, приводили к цитолизу HSC, как определено в данном анализе. Количественная оценка клеток с помощью FACS показала меньшее число жизнеспособных клеток в лунках, обработанных с помощью конъюгатов токсина, связывающих cKIT, чем в контрольных лунках, обработанных с помощью PBS или конъюгатов токсина с антителами и фрагментами антител изотипического контроля. Данные показаны на фиг. 1, фиг. 2 и фиг. 9 и обобщены в табл. 7. Используемое в данном документе условное название J№ соответствует специфическому № конъюгата, описанному в табл. 2.
Таблица 7
Жизнеспособность клеток после обработки конъюгатами Fab к cKIT и токсина
Протестированный конъюгат | Популяция клеток | ЕС50 (нг/мл) |
Человеческие общие ядерные клетки | 45 | |
J3 | Человеческие CD34+ клетки | 8 |
Человеческие CD90+ клетки | 12 | |
Человеческие общие ядерные клетки | 58 | |
J2 | Человеческие CD34+ клетки | 11 |
Человеческие CD90+ клетки | 16 | |
Человеческие общие ядерные клетки | 48 | |
Л | Человеческие CD34+ клетки | 11 |
Человеческие CD90+ клетки | 13 | |
Мышиные общие ядерные клетки | 3800 | |
J4 | Мышиные CD45+ клетки | 3800 |
Мышиные сК1Т+ клетки | 8 | |
Мышиные общие ядерные клетки | 210 | |
J5 | Мышиные CD45+ клетки | 210 |
Мышиные сК1Т+ клетки | 120 | |
J14 | Человеческие общие ядерные клетки | 7 |
Человеческие CD34+ клетки | 10 |
- 142 044279
Человеческие CD90+ клетки | 11 | |
J15 | Человеческие общие ядерные клетки | 6 |
Человеческие CD34 + клетки | 5 | |
Человеческие CD90+ клетки | 1 | |
J16 | Человеческие общие ядерные клетки | 6 |
Человеческие CD34+ клетки | 7 | |
Человеческие CD90+ клетки | 9 | |
J17 | Человеческие общие ядерные клетки | 12 |
Человеческие CD34+ клетки | 16 | |
Человеческие CD90+ клетки | 37 | |
J18 | Человеческие общие ядерные клетки | 15 |
Человеческие CD34+ клетки | 11 | |
Человеческие CD90+ клетки | 3 | |
J19 | Человеческие общие ядерные клетки | 14 |
Человеческие CD34+ клетки | 16 | |
Человеческие CD90+ клетки | 23 | |
J2 0 | Человеческие общие ядерные клетки | 20 |
Человеческие CD34+ клетки | 25 | |
Человеческие CD90+ клетки | 72 | |
J21 | Человеческие общие ядерные клетки | 154 |
Человеческие CD34+ клетки | 88 | |
Человеческие CD90+ клетки | 22 | |
J22 | Человеческие общие ядерные клетки | 8 |
Человеческие CD34+ клетки | 10 | |
Человеческие CD90+ клетки | 17 |
Пример 6. In vitro анализ дегрануляции человеческих мастоцитов.
Зрелые мастоциты получали с применением CD34+ предшественников из мобилизированной периферической крови. CD34+ клетки культивировали в StemSpan SFEM (StemCell Technologies), дополненной рекомбинантным человеческим фактором роста стволовых клеток (rhSCF, 50 нг/мл, Gibco), рекомбинантным человеческим интерлейкином 6 (rhIL-6, 50 нг/мл, Gibco), рекомбинантным человеческим IL-3 (30 нг/мл, Peprotech), GlutaMAX (2 нМ, Gibco), пенициллином (100 Ед/мл, Hyclone) и стрептомицином (100 мкг/мл, Hyclone). Рекомбинантный hIl-З добавляли только во время первой недели культивирования. После третьей недели половину среды заменяли еженедельно свежей средой, содержащей rhIL-6 (50 нг/мл) и rhSCF (50 нг/мл). Чистоту зрелых мастоцитов оценивали по окрашиванию на поверхности клеток высокоаффинного рецептора IgE (FCsRI, eBioscience) и CD117 (BD). Применяли клетки на 8-12 неделе культивирования.
Полученные мастоциты промывали один раз для удаления SCF и требуемое количество клеток инкубировали в течение ночи в среде для мастоцитов, содержащей rhIL-6 (50 нг/мл) с rhSCF (50 нг/мл) или без него. В качестве положительного контроля дегрануляции мастоцитов порцию клеток сенсибилизировали с помощью человеческого IgE миеломы (100 нг/мл, EMD Millipore). На следующий день готовили разбавления антитела или фрагментов антител к cKIT или их конъюгатов с токсином, мышиного моноклонального антитела к человеческому IgGl (Fab-специфическое, Sigma), козьего антитела к человеческому IgE (Abeam) и соединения 48/80 (Sigma) в буфере HEPES для дегрануляции (10 мМ HEPES, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ КС1, 0,4 мМ двухосновного фосфата натрия, 5,6 мМ глюкозы, pH доведен до 7,4, и смешанный с 1,8 мМ хлорида кальция и 1,3 мМ сульфата магния), дополненном 0,04% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma). Тестируемые средства и антитела к IgGl смешивали вместе в 384луночном планшете для анализа с лунками с V-образным дном, при этом антитела к IgE и соединение 48/80 тестировали отдельно. Планшет для анализа инкубировали 30 мин при 37°С. Во время инкубации клетки промывали 3 раза с помощью буфера HEPES для дегрануляции+0,04% BSA для удаления среды и несвязанного IgE. Клетки ресуспендировали в буфере HEPES для дегрануляции+0,04% BSA и высевали из расчета 3000 клеток на лунку в планшет для анализа при конечном объеме реакционной смеси, составляющем 50 мкл. Клетки, которые сенсибилизировали с помощью IgE, применяли только с антителом к IgE в качестве положительного контроля дегрануляции. Чтобы произошла дегрануляция, планшет для анализа инкубировали 30 мин при 37°С. Во время данной инкубации буфер р-нитро-М-ацетил-З-Оглюкозамина (pNAG, Sigma) готовили путем обработки ультразвуком 3,5 мг/мл pNAG в цитратном бу-143044279 фере (40 мМ лимонной кислоты, 20 мМ двухосновного фосфата натрия, pH 4,5). Высвобождение βгексозаминидазы измеряли путем смешивания 20 мл супернатанта клеток с 40 мкл раствора pNAG в 384луночном планшете с лунками с плоским дном. Данный планшет инкубировали в течение 1,5 ч при 37°С и реакцию останавливали добавлением 40 мкл стоп-раствора (400 мМ глицин, pH 10,7). Поглощение считывали с применением планшет-ридера при λ=405 нм с эталонным фильтром при λ=620 нм.
Контроли в виде полноразмерных IgG, применяемые в анализах дегрануляции мастоцитов, описаны в табл. 8.
Таблица 8
Контроли в виде полноразмерных IgG, применяемые в анализах дегрануляции мастоцитов
Название | Последовательность НС | Последовате льность LC | |
Контрольный IgG для Л | Abi к cKIT | SEQ ID NO: 12 | SEQ ID NO: 25 |
Контрольный IgG для J2 | АЬ2 к cKIT | SEQ ID NO: 38 | SEQ ID NO: 49 |
Контрольный IgG для J3 | АЬЗ к cKIT | SEQ ID NO: 56 | SEQ ID NO: 25 |
Контрольный IgG для J4 | АЬ4 к cKIT | SEQ ID NO: 71 | SEQ ID NO: 84 |
Контрольный IgG для J6 | Антитело к Нег2 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFN IKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNG YTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMN SLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 150) | SEQ ID NO: 147 |
Как показано на фиг. 3А, некоторые клоны класса антагонистических антител к cKIT с меньшей вероятностью вызывают дегрануляцию мастоцитов. Можно дополнительно предположить, что фрагмент Fab или Fab' не может вызывать дегрануляцию мастоцитов. После сшивания с Fab-специфическим антителом (фиг. 3C-3J) полноразмерный IgG, в отличие от формата Fab' к cKIT-токсин DAR4, демонстрирует усиление дегрануляции. Это позволяет предположить, что фрагмент Fab' не вызывает дегрануляцию мастоцитов, даже будучи сшитым и мультимеризованным в более крупные комплексы, которые можно было бы наблюдать в случае, когда у пациента выработались или имелись предсуществующие антитела к лекарственному средству, распознающие фрагменты Fab или Fab'.
Пример 7. In vivo разрушение человеческих HSC из хозяина-мыши.
Чтобы оценить эффективность тестируемых средств в отношении человеческих HSC in vivo, мышам, имеющим тяжелую иммунную недостаточность (NOD.Cg-PrkdcsCid IL2rgtm1w'1/SzJ, Jackson Laboratory, номер артикула 005557, также известные как NSG), трансплантировали человеческие HSC после проведения сублетального облучения (250 рад в виде гамма-облучения 137Cs). CD34+ гемопоэтические стволовые клетки (HSC) получали от AllCells (номер по каталогу CB008F-S). Каждый флакон, содержащий ~1 миллион клеток, оттаивали, разбавляли в 10 мл 1х HBSS и центрифугировали в течение 7 мин при 1200 об/мин. Клеточный осадок ресуспендировали в HBSS из расчета 100000 клеток/мл. Через 24 ч после облучения всего 20000 клеток на мышь трансплантировали путем инъекции в ретро- 144 044279 орбитальный синус. Человеческим HSC обеспечивали возможность приживления у мышей NSG в течение по меньшей мере 4 недель. Процент химеризма человеческих клеток определяли с помощью проточной цитометрии образцов крови. Для этого кровь окрашивали с помощью следующих антител: антитела к CD45 человека-е450 (eBioscience, № по каталогу 48-0459-42), антитела к CD45 мыши-АРС (Becton Dickinson, № по каталогу 559864), антитела к CD33 человека-Ре (Becton Dickinson, № по каталогу 347787), антитела к CD19 человека-FITC (Becton Dickinson, № по каталогу 555422) и антитела к CD3 человека-РеСу7 (Becton Dickinson, № по каталогу 557851). Как только химеризм человеческих клеток был подтвержден, гуманизированным мышам NSG вводили дозу тестируемого средства внутрибрюшинно, b.i.d. Степень химеризма человеческих клеток повторно оценивали после введения дозы. Чтобы оценить присутствие или отсутствие человеческих HSC, мышей умерщвляли и костный мозг выделяли и окрашивали с помощью следующих антител: антитела к CD45 человека-е450 (eBioscience, № по каталогу 480459-42), антитела к CD45 мыши-АРС (Becton Dickinson, № по каталогу 559864), антитела к CD34 человека-РЕ (Becton Dickinson, № по каталогу 348057), антитела к CD38 человека-FITC (Becton Dickinson, № по каталогу 340926), антитела к CD11b человека-РЕ (Becton Dickinson, № по каталогу 555388), антитела к CD33 человека-РеСу7 (Becton Dickinson, № по каталогу 333946), антитела к CD19 человека-FITC (Becton Dickinson, № по каталогу 555412) и антитела к CD3 человека-РеСу7 (Becton Dickinson, № по каталогу 557851). Популяции клеток оценивали посредством проточной цитометрии и анализировали с помощью FlowJo.
В одном конкретном эксперименте мышам вводили дозу 10 мг/кг конъюгата J7 (описанного в табл. 2) дважды в день в течение 1, 2 или 4 дней или конъюгата антитела изотипического контроля J8 дважды в день в течение 4 дней. Мышей умерщвляли в день 21 и их костный мозг анализировали. Как показано на фиг. 4, у мышей, обработанных с помощью конъюгата J7 в течение даже 1 дня, показано разрушение человеческих HSC (человеческие CD45+ клетки, человеческие CD34+ клетки, человеческие CD38- клетки), при этом у мышей, обработанных с помощью конъюгата с антителом изотипического контроля, J8, показан неоднородный химеризм, по-видимому, обусловленный неоднородностью при проведении гуманизации перед обработкой, на основании сравнения с группой, обработанной средой-носителем (PBS).
В одном конкретном эксперименте мышам вводили дозу 10 мг/кг конъюгата, связывающего cKIT, J1, J2 или J3, или конъюгата антитела изотипического контроля J6 в течение 2 дней. Мышей умерщвляли в день 21 и их костный мозг анализировали. Как показано на фиг. 5, у мышей, обработанных с помощью конъюгата, связывающего cKIT, J1, J2, или J3, показано снижение числа человеческих HSC (человеческие CD45+ клетки, человеческие CD34+ клетки, человеческие CD38- клетки), при этом у мышей, обработанных с помощью конъюгата антитела изотипического контроля, J6, показан неоднородный химеризм.
В одном конкретном эксперименте мышам вводили дозу 10 мг/кг конъюгата, связывающего cKIT, JW, JX, JY или JZ, в течение 2 дней. Мышей умерщвляли в день 21 и их костный мозг анализировали. Как показано на фиг. 13, у мышей, обработанных с помощью конъюгата, связывающего cKIT, JW, JX, JY или JZ, показано снижение числа человеческих HSC (человеческие CD45+ клетки, человеческие CD34+ клетки, человеческие CD38- клетки).
Вместе взятые, данные три эксперимента показывают, что конъюгаты Fab к cKIT и токсина или Fab' к cKIT и токсина могли разрушать HSC из костного мозга. Как конъюгаты Fab к cKIT и аманитина (например, J7), так и конъюгаты Fab' к cKIT и ауристатина (например, J1, J2, J3, JW, JX, JY) могли разрушать человеческие HSC in vivo.
Пример 8. In vivo разрушение мышиных HSC у иммунокомпетентных мышей.
Чтобы оценить эффективность тестируемых средств в отношении мышиных HSC in vivo, мышам C57BL/6J (самцы, возраст 10 недель, Jackson Laboratory, № артикула 000664) вводили дозу тестируемого средства внутрибрюшинно, b.i.d. Гематологический профиль определяли не ранее чем через один день после введения последней дозы или не позднее чем через 21 день после введения последней дозы с помощью стандартных способов. Чтобы оценить присутствие или отсутствие мышиных HSC, мышей умерщвляли и костный мозг выделяли и окрашивали с помощью следующих антител: антитела к CD45 мыши-PerCP-Су5.5 (Becton Dickinson, № по каталогу 550994), антитела к cKIT мыши-АРС (Becton Dickinson, № по каталогу 553356), антитела к CD48 мыши-FITC (eBioscience, № по каталогу 11-0481-82), антитела к CD150 мыши-РЕ (BioLegend, № по каталогу 115904), антитела к Sca мыши-V450 (Becton Dickinson, № по каталогу 560653), антитела к Lin мыши-биотина (Miltenyi, № по каталогу 120-001-547) и РеСу7-стрептавидина (Becton Dickinson, № по каталогу 557598). Популяции клеток оценивали посредством проточной цитометрии и анализировали с помощью FlowJo.
В одном конкретном эксперименте мышам дважды в день вводили дозу 10 мг/кг конъюгата, связывающего cKIT, J4 или J5 (описан в табл. 2), или PBS в течение 4 дней. Мышей умерщвляли в день 13 для проведения анализа костного мозга. У групп, обработанных с помощью конъюгата, связывающего cKIT, J4 или J5, показано значительное снижение уровней стволовых клеток и клеток-предшественников (cKIT+) в костном мозге по сравнению с контрольной группой, обработанной с помощью PBS (фиг. 6), это показывает, что обработка с помощью конъюгатов Fab' к cKIT и ауристатина, таких как J4 или J5, могла разрушать HSC in vivo у нормальных мышей.
- 145 044279
Чтобы определить, является ли разрушение под действием конъюгатов антител или фрагментов антител к cKIT по настоящему изобретению достаточным для обеспечения трансплантации, мышам, обработанным, как описано выше, впоследствии можно проводить трансплантацию HSC. Например, мышам CD45.2, обработанным с помощью конъюгата Fab' к cKIT и токсина, можно трансплантировать донорские HSC, которые могут быть взяты от мышей CD45.1, через примерно одну неделю после введения дозы. В другом примере мышей, обработанных с помощью конъюгата Fab' к cKIT и токсина, можно обрабатывать с помощью иммуносупрессорного средства, такого как средство, вызывающее истощение Тклеток, через примерно одну неделю после введения дозы и за примерно 1-2 дня до проведения трансплантации донорских HSC, которые получены от мышей CD45.1. Одним способом истощения Т-клеток является введение мышам антитела к β-цепи TCR мыши (клон Н57-597; Biolegend) с дозой 0,5 мг на мышь, q.i.d., в течение двух дней. Истощение Т-клеток можно подтвердить путем отбора образца крови для определения гематологического профиля после введения дозы. В таких примерах прогресс трансплантации будут отслеживать путем отыскания химеризма CD45.1 клеток в образцах крови. В таких примерах успех трансплантации можно определять путем умерщвления мышей через примерно 3-4 месяца или 5-6 месяцев после трансплантации для проведения анализа костного мозга с отысканием популяции CD45.1 и CD45.2 HSC. В качестве альтернативы успешную трансплантацию можно определить путем умерщвления мышей через по меньшей мере 4 или 6 месяцев после первичной трансплантации, а также за счет осуществления вторичной трансплантации полностью облученным мышам-хозяевам и отыскания химеризма CD45.1 в образцах крови после вторичной трансплантации.
Пример 9. In vitro анализ дегрануляции человеческих мастоцитов под действием полноразмерного антитела к cKIT, его фрагментов F(ab')2 и Fab и его конъюгатов.
Зрелые мастоциты получали и тестировали с применением антитела к cKIT и его фрагментов F(ab')2 и Fab или конъюгатов с токсином, как описано в примере 6.
Как показано на фиг. 7А-7С, полноразмерное Ab4 (HC-E152C-S375C) к cKIT и фрагмент F(ab'4)2 (HC-E152C), конъюгированный с соединением (4), будучи сшитыми, вызывали дегрануляцию мастоцитов, при этом дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием фрагмента Fab4 (HC-E152C) при всех протестированных концентрациях. На фиг. 7D-7F показано, что полноразмерное Ab3 (HC-E152CS375C) к cKIT и фрагмент F(ab'3)2 (HC-E152C), конъюгированный с соединением (3), будучи сшитыми, вызывали дегрануляцию мастоцитов, при этом дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием фрагмента Fab3 (E152C), конъюгированного с соединением (4), при всех протестированных концентрациях. Это позволяет предположить, что фрагмент Fab или его конъюгаты не вызывают дегрануляцию мастоцитов, даже будучи сшитыми и/или мульмеризованными в более крупные комплексы, как можно было бы наблюдать в случае, когда у пациента выработались или имелись предсуществующие антитела к лекарственному средству, распознающие фрагменты Fab. С другой стороны, фрагменты F(ab')2 и конъюгаты действительно вызывают дегрануляцию мастоцитов на уровне, аналогичном полноразмерному антителу к cKIT, будучи связанными и мультимеризованными в более крупные комплексы.
Пример 10. In vitro анализ дегрануляции человеческих мастоцитов под действием полноразмерного антитела к cKIT и его фрагментов F(ab')2 и Fab.
Зрелые мастоциты получали и тестировали с применением антитела к cKIT и его фрагментов F(ab')2 и Fab к cKIT, как описано в примере 6.
Как показано на фиг. 8А-8С, полноразмерное Ab4 к cKIT и фрагмент F(ab'4)2, будучи сшитыми, вызывали дегрануляцию мастоцитов, при этом дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием фрагмента Fab4 (HC-E152C) при всех протестированных концентрациях. На фиг. 8D-8F показано, что полноразмерное Ab1 к cKIT и фрагмент F(ab'1)2, будучи сшитыми, вызывали дегрануляцию мастоцитов, при этом дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием фрагмента Fab1 (HC-E152C) при всех протестированных концентрациях. На фиг. 8G-8I показано, что полноразмерное Ab2 к cKIT и фрагмент F(ab'2)2, будучи сшитыми, вызывали дегрануляцию мастоцитов, при этом дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием фрагмента Fab2 (HC-E152C) при всех протестированных концентрациях. На фиг. 8J-8L показано, что полноразмерное Ab3 к cKIT и фрагмент F(ab'3)2, будучи сшитыми, вызывали дегрануляцию мастоцитов, при этом дегрануляция мастоцитов не запускалась под действием фрагмента Fab3 (HC-E152C) при всех протестированных концентрациях. Это позволяет предположить, что фрагменты Fab не вызывают дегрануляцию мастоцитов, даже будучи сшитыми и/или мульмеризованными в более крупные комплексы, как можно было бы наблюдать в случае, когда у пациента выработались или имелись предсуществующие антитела к лекарственному средству, распознающие фрагменты Fab. С другой стороны, фрагменты F(ab')2 действительно вызывают дегрануляцию мастоцитов на уровне, аналогичном полноразмерному антителу к cKIT, будучи связанными и мультимеризованными в более крупные комплексы.
Пример 11. Трансплантация сингенного костного мозга иммунокомпетентным мышам.
В конкретном эксперименте мышам C57BL/6J (CD45.2, самцы, возраст 10 недель, Jackson Laboratory, № артикула 000664) вводили дозу 2,5, 5 или 10 мг/мл Fab'5-(1) к c-KIT (Fab'-DAR4) с помощью мини-насоса (Alzet, № по каталогу 2001), размещенного подкожно в области спины. В мини-насосе удерживался объем 200 мкл, и он выполнял инфузию с постоянным расходом, составляющим 1 мкл/ч, в тече
- 146 044279 ние курса продолжительностью 7 дней. Через семь дней после имплантации мини-насос затем удаляли, чтобы прекратить любое дополнительное введение лекарственного средства. Через сорок восемь часов после удаления мини-насоса мышам трансплантировали костный мозг от мышей-доноров, которые были конгенными по маркерам CD45 (CD45.1, В6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ, самцы, возраст 10 недель, Jackson Laboratory, № артикула 002014). Прогресс трансплантации отслеживали в периферической крови путем отыскания химеризма CD45.1 клеток с интервалами в один месяц. В данном эксперименте химеризм крови отслеживали в течение 4 месяцев, как показано на фиг. 10. Химеризм в периферической крови оценивали с помощью проточной цитометрии. Образцы крови окрашивали с помощью антитела к mCD45.1-PerCP-Cy5.5 (1:100, BD № 560580), антитела к mCD45.2-BUV395 (1:100, BD № 564616), антитела к Мас-РЕ (1:500, BD № 553331), антитела к GR1-FITC (1:100, BD № 553127), антитела к В220-АРС (1:400, BD № 553092) и антитела к CD3-V450 (1:100, BD № 560801), данные получали на проточном цитометре Fortessa (Becton Dickinson) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar). Уровень химеризма определяли путем сравнения с популяциями, которые были положительными или по CD45.2 (хозяин), или по CD45.1 (донор). Общий уровень донорского химеризма представлен для общей популяции белых кровяных клеток. Кроме того, субпопуляции Т- клеток, В-клеток и миелоидных клеток дополнительно оценивали в отношении донорского химеризма. Донорский химеризм Тклеток был основан на отыскании CD45.2 (хозяин) или CD45.1 (донор) на CD3+ клетках. Донорский химеризм В-клеток был основан на отыскании CD45.2 (хозяин) или CD45.1 (донор) на CD45R+ клетках. Химеризм миелоидных клеток был основан на отыскании CD45.2 (хозяин) или CD45.2 (донор) на Мас1+/Gr-1+ клетках. Данный эксперимент показывает, что у мышей, кондиционированных с помощью конъюгата Fab' к cKIT, могут приживаться донорские клетки, которые воссоздают линии миелоидных клеток, В-клеток и Т-клеток, что является показателем успешного приживления HSC.
В другом эксперименте мышам C57BL/6J (CD45.2, самцы, возраст 10 недель, Jackson Laboratory, № артикула 000664) вводили дозу 2,5, 5 или 10 мг/мл Fab'5-(1) к c-KIT (Fab'-DAR4) или 10 мг/мл Fab'5 к cKIT-mc-MMAF (Fab'-DAR4) с помощью мини-насоса (Alzet, № по каталогу 2001), размещенного подкожно в области спины. В мини-насосе удерживался объем 200 мкл, и он выполнял инфузию с постоянным расходом, составляющим 1 мкл/ч, в течение курса продолжительностью 7 дней. Через пять дней после имплантации мини-насос затем удаляли, чтобы прекратить любое дополнительное введение лекарственного средства. Не позднее чем через 24 ч после удаления мини-насоса затем мышам трансплантировали костный мозг от мышей-доноров, которые были конгенными по маркерам CD45 (CD45.1, B6.SJLPtprca Pepcb/BoyJ, самцы 10 недель, Jackson Laboratory, № артикула 002014). Прогресс трансплантации отслеживали в периферической крови путем отыскания химеризма CD45.1 клеток с интервалами в один месяц. В данном эксперименте химеризм крови отслеживали в течение 2 месяцев, как показано на фиг. 11. Химеризм в периферической крови оценивали с помощью проточной цитометрии. Образцы крови окрашивали с помощью антитела к mCD45.1-PerCP-Су5.5 (1:100, BD № 560580), антитела к mCD45.2BUV395 (1:100, BD № 564616), антитела к Мас-РЕ (1:500, BD № 553331), антитела к GR1-FITC (1:100, BD № 553127), антитела к В220-АРС (1:400, BD № 553092) и антитела к CD3-V450 (1:100, BD № 560801), данные получали на проточном цитометре Fortessa (Becton Dickinson) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar). Уровень химеризма определяли путем сравнения с популяциями, которые были положительными или по CD45.2 (хозяин), или по CD45.1 (донор). Общий уровень донорского химеризма представлен для общей популяции белых кровяных клеток. Кроме того, миелоидные клетки в периферической крови дополнительно оценивали в отношении донорского химеризма. Химеризм миелоидных клеток был основан на отыскании CD45.2 (хозяин) или CD45.2 (донор) на Mac-1+/Gr-1+ клетках. Данный эксперимент показывает, что у мышей, кондиционированных с помощью конъюгата Fab' к cKIT, могут успешно приживаться донорские клетки, которые восполняют миелоидный компартмент в той же степени, что и у мышей, кондиционированных с помощью летального облучения (фиг. 11В). Более низкие уровни общего донорского химеризма у мышей, кондиционированных с помощью средства, связывающего cKIT, по сравнению с облученными мышами (фиг. 11А), по-видимому, обусловлены более целенаправленно действующей природой кондиционирующего средства, связывающего cKit, которое не удаляет долгоживущие CD45.2+ В-клетки и Т-клетки из кровотока.
В другом эксперименте мышей C57BL/6J (CD45.2, самцы, возраст 10 недель, Jackson Laboratory, № артикула 000664) облучали при 300 рад. Спустя три дня им вводили дозу 2,5 или 5 мг/мл Fab'5-(1) к cKIT (Fab'-DAR4) с помощью мини-насоса (Alzet, № по каталогу 2001), размещенного подкожно в области спины. Одну группу обрабатывали только с помощью облучения, и одну группу обрабатывали только с помощью 2,5 мг/мл Fab'5-(1) к c-KIT (Fab'-DAR4). В мини-насосе удерживался объем 200 мкл, и он выполнял инфузию с постоянным расходом, составляющим 1 мкл/ч, в течение курса продолжительностью 7 дней. Через три дня после имплантации мини-насос затем удаляли, чтобы прекратить любое дополнительное введение лекарственного средства. Не позднее чем через 48 ч после удаления мини-насоса затем мышам трансплантировали костный мозг от мышей-доноров, которые были конгенными по маркерам CD45 (CD45.1, В6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ, самцы 10 недель, Jackson Laboratory, № артикула 002014). Прогресс трансплантации отслеживали в периферической крови путем отыскания химеризма CD45.1 клеток с интервалами в один месяц. В данном эксперименте химеризм крови отслеживали в течение 4 месяцев,
- 147 -
Claims (35)
- как показано на фиг. 12. Химеризм в периферической крови оценивали с помощью проточной цитометрии. Образцы крови окрашивали с помощью антитела к mCD45.1-PerCP-Су5.5 (1:100, BD № 560580), антитела к mCD45.2-BUV395 (1:100, BD № 564616), антитела к Мас-РЕ (1:500, BD № 553331), антитела к GR1-FITC (1:100, BD № 553127), антитела к В220-АРС (1:400, BD № 553092) и антитела к CD3-V450 (1:100, BD № 560801), данные получали на проточном цитометре Fortessa (Becton Dickinson) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar). Уровень химеризма определяли путем сравнения с популяциями, которые были положительными или по CD45.2 (хозяин), или по CD45.1 (донор). Общий уровень донорского химеризма представлен для общей популяции белых кровяных клеток. Кроме того, миелоидные клетки в периферической крови дополнительно оценивали в отношении донорского химеризма. Химеризм миелоидных клеток был основан на отыскании CD45.2 (хозяин) или CD45.2 (донор) на Mac-1+/Gr-1+ клетках. Данный эксперимент показывает, что конъюгат Fab' к cKIT можно применять в качестве кондиционирующего средства в комбинации с другими средствами, такими как низкодозовое облучение, и что у мышей, кондиционированных таким способом, могут успешно приживаться донорские клетки.Если не определено иное, технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение.Если не указано иное, все способы, стадии, методики и манипуляции, которые конкретно не описаны подробно, можно было осуществлять и их осуществляли широко известным способом, как будет ясно специалисту в данной области техники. Например, снова сделана ссылка на стандартные руководства и общий уровень техники, упоминаемый в данном документе, а также на дополнительные литературные источники, цитируемые в данном документе. Если не указано иное, каждый из литературных источников, цитируемых в данном документе, включен посредством ссылки во всей своей полноте.Пункты формулы изобретения являются неограничивающими и представлены ниже.Хотя конкретные аспекты и пункты формулы изобретения были подробно раскрыты в данном документе, это было выполнено в качестве примера лишь в целях иллюстрации, и не предназначено для ограничений с точки зрения объема прилагаемой формулы изобретения или объема объекта формулы изобретения с любым соответствующим будущим применением. В частности, авторы настоящего изобретения подразумевают, что различные замены, изменения и модификации могут быть выполнены в настоящем изобретении без отклонения от сути и объема настоящего изобретения, определяемого формулой изобретения. Считается, что выбор исходного материала в виде нуклеиновой кислоты, представляющего интерес клона или типа библиотеки, является обычным делом для рядового специалиста в данной области техники, располагающего сведениями об аспектах, описанных в данном документе. Считается, что другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема следующей формулы изобретения. Специалистам в данной области техники будут понятны многие эквиваленты конкретных аспектов настоящего изобретения, описанного в данном документе, или путем проведения всего лишь обычных экспериментов они будут способны установить такие эквиваленты. Предусмотрено, что такие эквиваленты охвачены следующей формулой изобретения. Изменение объема пункта формулы изобретения в позднее поданных соответствующих заявках может быть обусловлено ограничениями патентных законов различных стран и не должно пониматься как отказ от объекта формулы изобретения.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Конъюгат формулы (I) или его фармацевтически приемлемая сольA-(LB-(D)n)y Формула (I), где А представляет собой фрагмент антитела, который специфически связывается с рецепторной тирозинкиназой (cKIT) человека, где фрагмент антитела выбран из любого из следующих:(1) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 (определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи) под SEQ ID NO: 1, (b) HCDR2 (определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи) под SEQ ID NO: 2 и (с) HCDR3 (определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи) под SEQ ID NO: 3; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 (определяющую комплементарность область 1 легкой цепи) под SEQ ID NO: 16, (е) LCDR2 (определяющую комплементарность область 2 легкой цепи) под SEQ ID NO: 17 и (f) LCDR3 (определяющую комплементарность область 3 легкой цепи) под SEQ ID NO: 18;
- (2) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 4, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 5, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 3; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 19, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 21;
- (3) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 6, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 2, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 3; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 16, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 18;- 148 044279
- (4) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 7, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 8, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 9; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 22, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и (f)LCDR3 под SEQ ID NO: 18;
- (5) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 27, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 28, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 29; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 42, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 43;
- (6) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 30, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 31, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 29; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 44, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 45;
- (7) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 32, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 28, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 29; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 42, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 17 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 43;
- (8) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 33, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 34, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 35; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 46, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 20 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 43;
- (9) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 60, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 61, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 62; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 75, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 76 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 77;
- (10) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 63, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 64, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 62; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 78, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 79 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 80;
- (11) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 65, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 61, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 62; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 75, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 76 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 77;
- (12) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 66, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 67, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 68; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 81, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 79 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 77;
- (13) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 86, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 87, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 88; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 101, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 102 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 103;
- (14) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 89, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 90, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 88; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 104, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 105 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 106;
- (15) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 91, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 87, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 88; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 101, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 102 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 103;
- (16) Fab или Fab', содержащих (i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) HCDR1 под SEQ ID NO: 92, (b) HCDR2 под SEQ ID NO: 93, (с) HCDR3 под SEQ ID NO: 94; и (ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит (d) LCDR1 под SEQ ID NO: 107, (е) LCDR2 под SEQ ID NO: 105 и (f) LCDR3 под SEQ ID NO: 103;
- (17) Fab или Fab', содержащих вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит SEQ ID NO: 23;
- (18) Fab или Fab', содержащих VH, которая содержит SEQ ID NO: 36, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 47;
- (19) Fab или Fab', содержащих VH, которая содержит SEQ ID NO: 69, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 82;
- (20) Fab или Fab', содержащих VH, которая содержит SEQ ID NO: 95, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 108;
- (21) Fab', содержащего тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 14, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 25;- 149 044279
- (22) Fab', содержащего тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 49;
- (23) Fab', содержащего тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 73, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 84;
- (24) Fab', содержащего тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 99, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 110;
- (25) Fab, содержащего тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 118, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 122;
- (26) Fab, содержащего тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 118, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 123;
- (27) Fab, содержащего тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 124, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 128;
- (28) Fab, содержащего тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 124, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 129;
- (29) Fab, содержащего тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 130, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 134;
- (30) Fab, содержащего тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 130, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 135;
- (31) Fab, содержащего тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 136, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 140;
- (32) Fab, содержащего тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 141, и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 145;
- (33) Fab, содержащего тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 119, 120 или 121, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25;
- (34) Fab, содержащего тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 125, 126 или 127, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 49;
- (35) Fab, содержащего тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 137, 138 или 139, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 84; или (36) Fab, содержащего тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 142, 143 или 144, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 110;LB представляет собой линкер;D представляет собой цитотоксическое средство;n составляет целое число от 1 до 10, и y составляет целое число от 1 до 10.2. Конъюгат по п.1, где n составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.3. Конъюгат по п.1 или 2, где каждый D представляет собой цитотоксическое средство, независимо выбранное из ауристатина, аманитина, майтанзиноида или сапорина.4. Конъюгат по любому из пп.1-3, где каждый LB независимо выбран из расщепляемого линкера или нерасщепляемого линкера.5. Конъюгат по любому из пп.1-4, выбранный из:- 150 044279- 151 0442796. Конъюгат по любому из пи. 1-5, где фрагмент антитела специфически связывается с внеклеточным доменом cKIT человека (SEQ ID NO: 112).7. Конъюгат по любому из пп.1-5, где фрагмент антитела специфически связывается с эпитопом в доменах 1-3 cKIT человека (SEQ ID NO: 113).8. Конъюгат по любому из пи. 1-7, где фрагмент антитела представляет собой Fab или Fab'.9. Конъюгат по любому из пи. 1-8, где фрагмент антитела представляет собой человеческие или гуманизированные Fab или Fab'.10. Конъюгат по любому из пи. 1-9, где фрагмент антитела представляет собой Fab', а линкер (LB) присоединен к нативному цистеиновому остатку в шарнирной области Fab'.И. Конъюгат по любому из пп.1-8, где фрагмент антитела содержит по меньшей мере один ненативный цистеин, введенный в константную область, а линкер (LB) присоединен к ненативному цистеину.12. Конъюгат по любому из пи. 1-11, где фрагмент антитела содержит цистеин в одном или нескольких из следующих положений (нумерация всех положений согласно EU):(а) положение 152 тяжелой цепи, (Ь) положение 114 или 165 легкой каппа-цепи или (с) положение 143 легкой лямбда-цепи.13. Конъюгат по любому из пи. 1-12, где период полувыведения конъюгата составляет менее приблизительно 24-48 ч.- 152-
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/437,622 | 2016-12-21 | ||
US62/520,854 | 2017-06-16 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044279B1 true EA044279B1 (ru) | 2023-08-10 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2017383458B2 (en) | Antibody drug conjugates for ablating hematopoietic stem cells | |
US20220153876A1 (en) | Bispecific antibodies for use in stem cell transplantation | |
TWI657096B (zh) | 對表皮生長因子受體變異體iii具特異性之抗體類及彼等之用途 | |
JP2019047807A (ja) | Pdgf受容体ベータ結合ポリペプチド | |
TW202330036A (zh) | 抗體-藥物結合物之製造方法 | |
JP2021166538A (ja) | ブラジキニンb1受容体リガンドに対する抗体 | |
CN106659790A (zh) | 抗cdh6抗体药物缀合物 | |
JP2020503258A (ja) | Asct2特異的結合分子及びその使用 | |
AU2014361856A1 (en) | Novel anti-DPEP3 antibodies and methods of use | |
US20220073608A1 (en) | Sema4d antibody, preparation method therefor and use thereof | |
US20210228731A1 (en) | Antibody drug conjugates for ablating hematopoietic stem cells | |
RU2781444C2 (ru) | Конъюгаты антитела и лекарственного средства для разрушения гемопоэтических стволовых клеток | |
EA044279B1 (ru) | Конъюгаты антитела и лекарственного средства для разрушения гемопоэтических стволовых клеток | |
NZ794433A (en) | Antibody drug conjugates for ablating hematopoietic stem cells |