CN105899526A - 细胞毒性肽和其缀合物 - Google Patents
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Abstract
文中公开了新的文中所述的式(I)的细胞毒性肽以及所述肽在制备免疫缀合物(即抗体药物缀合物)中的用途。文中还描述了免疫缀合物(即抗体药物缀合物)，其包含与抗原结合部分例如抗体连接的所述新细胞毒性肽；其中所述免疫缀合物可用于治疗细胞增殖性病症。本发明还提供包含这些免疫缀合物的药物组合物、包含免疫缀合物以及治疗共活性剂的组合物和使用这些免疫缀合物和组合物用于治疗细胞增殖病症的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年12月17日提交的美国临时申请号61/917293的权益，将其全部引入文中作为参考。
发明领域
本发明提供为抗-有丝分裂的细胞毒性肽并且可用于治疗细胞增殖性病症的化合物。本发明还包括包含与抗原结合部分连接的所述细胞毒性肽的缀合物以及含有这些缀合物的药物组合物。还包括使用这些化合物和缀合物治疗细胞增殖病症包括癌症的方法。
背景
用于将细胞增殖抑制剂和/或细胞毒性物质靶向递送至特定细胞的抗体-药物缀合物(ADCs)的应用已经成为重要研究的焦点。抗体-药物缀合物(Antibody-DrugConjugate),Methods in Molecular Biology,Vol.1045,编辑L.Ducry,Humana Press(2013)。ADCs包含因其与靶向治疗干预的细胞结合的能力而被选取的抗体，所述抗体连接至因其细胞抑制活性或细胞毒活性而被选取的药物。从而，抗体与靶向细胞的结合使药物递送至需要其治疗效果的位置。
已经公开了在ADCs中使用的识别并选择性结合至靶细胞如癌症细胞的许多抗体，还已描述了用于将有效载荷(药物)化合物例如细胞毒素连接至抗体的许多方法。尽管对于ADCs已经做了大量工作，但是只有很少类的细胞增殖抑制剂已经被广泛用作ADC有效载荷。尽管在美国批准用于人的第一个ADC在2000年上市(并且随后退市)，但是十年后，仅少数化学类别的药物化合物(Maytansinoids、Auristatins、刺孢霉素(calicheamycins)和多卡米星)已经作为ADC的有效载荷进入临床实验。Antibody-Drug Conjugates:the NextGeneration of Moving Parts,A.Lash,Start-Up,2011年12月,1-6。由于ADC作为治疗剂特别是用于治疗癌症的广泛认可的价值，因此仍需要用作ADC中的有效载荷的具有改善的性质的细胞毒性肽。
发明内容
文中提供的本发明包括细胞毒性肽和使用此类细胞毒性肽作为抗体-药物缀合物(ADC)的药物组件的方法。本发明包括新细胞毒性肽和此类新细胞毒性肽作为ADC的有效载荷的用途。本发明还包括可用于将此类新细胞毒性肽引入ADC中的方法和中间体，以及使用所述新化合物和缀合物治疗细胞增殖病症的方法。所述细胞毒性肽是通过阻断微管蛋白的聚合，从而阻断核迁移及核和细胞分裂而抑制细胞分裂的抗有丝分裂剂。
本发明的一个方面为具有式(I)结构的细胞毒性肽或其立体异构体以及其药学上可接受的盐，
其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的，或各自被R7和0-3个独立选自R5和R6的取代基取代，或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NR12(CH2)mR16、-LR9、-NHS(O)2R11、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(＝O)2LR9、
R5是C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被–CN、-C(＝O)NH2或1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R7是LR9；
R8是H或LR9；
各L独立地选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
R9是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR15、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R10、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R10是
各R11独立地选自C1-C6烷基和任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、被苯基取代的咪唑基、被苯基取代的二唑基、吡唑基、咪啶基、
-CH2S(＝O)2NH2、-CH2S(＝O)2NHLR9、-LR9或–X4LR9；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是2-吡啶基或4-吡啶基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR9取代；
各R19是H或C1-C6烷基；
X3是X4是
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。在上述方面的一个实施方案中，
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的，或各自被R7和0-3个独立选自R5和R6的取代基取代，或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NR12(CH2)mR16、-LR9、-NHS(O)2R11、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(＝O)2LR9、
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R7是LR9；
R8是H或LR9；
各L独立地选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
R9是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR15、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R10、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R10是
各R11独立地选自C1-C6烷基和任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、 -LR9或–X4LR9；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是2-吡啶基或4-吡啶基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR9取代；
X3是X4是
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在具有式(I)结构的细胞毒性肽的该方面的某些实施方案中，
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R11、
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R8是H；
各R11独立地选自C1-C6烷基和任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是2-吡啶基或4-吡啶基；
R16是未取代的N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在具有式(I)结构的细胞毒性肽的该方面的某些实施方案中，是具有式(Ia)结构的细胞毒性肽:
在具有式(I)或式(Ia)结构的细胞毒性肽的该方面的其它实施方案中，是具有式(Ib)结构的细胞毒性肽:
在具有式(I)结构的细胞毒性肽的该方面的其它实施方案中，是具有式(Ic)结构的细胞毒性肽:
在具有式(I)或式(Ic)结构的细胞毒性肽的该方面的其它实施方案中，是具有式(Id)结构的细胞毒性肽:
在具有式(I)结构的细胞毒性肽的该方面的其它实施方案中，是具有式(Ie)结构的细胞毒性肽:
在具有式(I)或式(Ie)结构的细胞毒性肽的该方面的其它实施方案中，是具有式(If)结构的细胞毒性肽:
本发明提供免疫缀合物(文中也称为ADC)，其包含与抗原结合部分例如抗体或抗体片段连接的细胞毒性肽。包含细胞毒性肽的这些缀合物可用于治疗细胞增殖病症，特别是当所述细胞毒性肽连接至识别癌症细胞的抗体并因此促使该细胞毒性肽递送至用于攻击的靶细胞时。所述免疫缀合物尤其是可用于治疗某些文中进一步详述的癌症。文中提供的数据证实这些免疫缀合物是有效的细胞增殖抑制剂；不受理论约束，据认为它们的活性是由于抑制细胞中微管蛋白的聚合。
本发明的免疫缀合物的一个方面包括式(II)的免疫缀合物:
其中:
Ab表示抗原结合部分；
L选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
y是1至16的整数；
R101是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基二价基团，其中所述6元杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1或C-连接至L1的，且所述6元杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或R101是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团，其中5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1或C-连接至L1的，且5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、或-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R11或
R5是C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基，
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R11是C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、被苯基取代的咪唑基、被苯基取代的二唑基、吡唑基、咪啶基、 -CH2S(＝O)2NH2,；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
R19是H或C1-C6烷基；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
本发明的免疫缀合物的一个方面包括式(II)的免疫缀合物:
其中:
Ab表示抗原结合部分；
L选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
y是1至16的整数；
R101是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基二价基团，其中所述6元杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1或C-连接至L1的，且所述6元杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或R101是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团，其中5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1或C-连接至L1的，且5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、或-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R11或
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R11是C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
本发明的免疫缀合物的另一个方面中是具有式(III)结构的免疫缀合物:
其中:
Ab表示抗原结合部分；
L选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
y是1至16的整数；
R1是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述6元杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或R1是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中5-8元稠合的二环杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R11是C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
R17是键、-NH-、-NHS(＝O)2-、
R18是键、或-CH2S(＝O)2NH-；
R19是H或C1-C6烷基；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
本发明的免疫缀合物的另一个方面是具有式(III)结构的免疫缀合物:
其中:
Ab表示抗原结合部分；
L选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
y是1至16的整数；
R1是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述6元杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或R1是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中5-8元稠合的二环杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R11是C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
R17是键、-NH-、-NHS(＝O)2-、
R18是键、
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
本发明提供采用式(I)的细胞毒性肽作为待被递送的有效载荷(药物)制备此类ADC的方法。在此类细胞毒性肽中，N-端或C-端已经被修饰以具有反应性官能团和任选的一个或多个连接体构件，以便于使所述细胞毒性肽直接或间接连接至抗体或抗体或抗原结合片段，例如上面描述的式(I)的细胞毒性肽的第二和第三个方面。此外，本发明提供使用这些ADCs治疗细胞增殖病症的方法。
在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物，所述免疫缀合物混合有至少一种药学上可接受的载体或赋形剂，任选混合有两种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂，并提供使用这些组合物治疗细胞增殖病症的方法。
在另一方面，本发明提供治疗特征在于过度或不希望的细胞增殖的疾患的方法，其包括向需要此治疗的个体施用有效量的式(II)或式(III)的免疫缀合物。治疗的个体可以是哺乳动物，并优选是人。可被文中描述的免疫缀合物和方法治疗的疾患包括各种形式的癌症，例如胃瘤、骨髓瘤、结肠瘤、鼻咽瘤、食道瘤和前列腺瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如髓性白血病、淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多毛细胞白血病)、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、多发性骨髓瘤、膀胱瘤、肾瘤、胃瘤(例如胃肠道间质瘤(GIST))、肝癌、黑色素瘤和胰腺癌以及肉瘤。能够用这些方法和组合物治疗的其它细胞增殖病症包括糖尿病视网膜病变、肝和肺纤维化、肖格伦(Sjogren)综合征和红斑狼疮。
本发明包括文中描述的式(I)-(III)和其子式的组合物和所立体异构体(包括非对映异构体和对映异构体)、互变异构体和其同位素富集形式(包括氘取代)以及这些化合物的药学上可接受的盐。本发明还包括式(I)(或其子式)和其盐特别是药学上可接受的盐的多晶型物。
附图简述
图1.抗-Her2Cys(A)和A1/ybbR标签(B)突变体ADCs与MDA-MB-231克隆40、抗-Her2Cys(C)和A1/ybbR标签(D)突变体ADCs与MDA-MB-231克隆16、抗-Her2Cys(E)和A1/ybbR标签(F)突变体ADCs与HCC1954以及抗-Her2Cys(G)和A1/ybbR标签(H)突变体ADCs与JimT-1细胞的体外细胞增殖测定。
图2.抗体20507-HC-E152C-10(A)、抗体20507-HC-S375C-47(B)、抗体20507-HC-ins388-A1-20(C)和抗体20507-HC-ins388-A1-49-22(D)ADCs的体外细胞增殖测定。
图3.抗-Her2-LC-S159C-10(A)、抗-Her2-LC-S159C-47(B)、抗-Her2-LC-S159C-77(C)、抗-Her2-LC-S159C-80(D)、抗-Her2-LC-S159C-79(E)、抗-Her2-LC-S159C-78(F)、抗-Her2-LC-S159C-14(G)、抗-Her2-HC-E152C-S375C-10(H)和抗-Her2-10(I)在幼稚小鼠中的药代动力学研究。
图4.抗体20507-HC-E152C-10(A)、抗体20507-LC-K107C-47(B)、抗体20507-HC-ins388-A1-20(C)、抗体20507-HC-E152C-S375C-10(D)、抗体20507-10(E)、抗-Her2-HC-ins388-ybbR-20(G)、抗体20507-HC-ins388-A1-49-22(H)、抗-Her2-HC-ins388-A1-49-22(I)、和抗-Her2-HC-ins388-ybbR-(i-11)-75(J)ADCs在幼稚小鼠中以1mg/kg剂量的药代动力学研究。在荷瘤小鼠中在10mg/kg的剂量进行抗体20507-HC-ins388-A1-20(F)的药代动力学研究。
图5.ADCs的体外稳定性研究。在37℃在具有不同pH的缓冲液中孵育的抗-Her2-LC-S159C-10的有效载荷保留的时程(A)，在37℃在具有不同pH的缓冲液中孵育的抗-Her2-LC-S159C-10的琥珀酰亚胺环水解的时程(B)、在37℃在具有不同pH的缓冲液中孵育的抗-Her2-LC-S159C-47的有效载荷保留的时程(C)，在37℃在具有不同pH的缓冲液中孵育的抗-Her2-LC-S159C-47的琥珀酰亚胺环水解的时程(D)，在pH8.5缓冲液中在37℃孵育24小时的抗-Her2-LC-S159C-10、抗-Her2-LC-S159C-77、抗-Her2-LC-S159C-80、抗-Her2-LC-S159C-79、抗-Her2-LC-S159C-78和抗-Her2-LC-S159C-14的有效载荷保留率(E)，在pH8.5缓冲液中在37℃孵育24小时的抗-Her2-LC-S159C-10、抗-Her2-LC-S159C-77、抗-Her2-LC-S159C-80、抗-Her2-LC-S159C-79、抗-Her2-LC-S159C-78和抗-Her2-LC-S159C-14的琥珀酰亚胺环水解程度(F)。
图6.抗体20507ADCs在H526肿瘤模型中的体内效力研究。(A)抗体20507-HC-E152C-10和抗体20507-HC-E152C-MMAF ADCs。(B)抗体20507-HC-E152C-10、抗体20507-HC-ins388-A1-20和抗体20507-LC-S159C-MMAF ADCs。(C)抗体20507-HC-E152C-S375C-10和抗体20507-10。(D)抗体20507-HC-E152C-10、抗体20507-HC-ins388-A1-49-22和抗-Her2-HC-ins388-A1-49-22ADCs。
详细说明
除非另外明确提供定义外，应用下面的定义。
术语“氨基酸”指典型的、合成的和非天然的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其以与典型氨基酸类似的方式起作用。典型氨基酸是由遗传密码编码的蛋白质生成的氨基酸并包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸，以及硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸及吡咯啉-羧基-赖氨酸。氨基酸类似物指与典型氨基酸具有相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是与典型氨基酸保持相同的基本化学结构。
文中使用的术语“抗原结合部分(antigen binding moiety)”涉及能够特异性与抗原结合的部分，并且包括且不限于抗体和抗体片段。如本文所用的术语“抗体”指能够非共价、可逆地并以特异性方式结合对应的抗原的免疫球蛋白家族的多肽。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每一条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每一条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域，CL构成。VH和VL区可以进一步细分为称为互补性决定区(CDR)的高变异性的区域，其散布于称为构架区(FR)的更保守的区域。每一VH和VL由三个CDRs和四个FRs构成，从氨基端向羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(CIq)的结合。
术语“抗体”包括，但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、嵌合抗体，和抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如，本发明抗体的抗-Id抗体)。抗体可以是任何同种型/类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
轻链和重链均分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”是功能性使用的。在这方面，将理解轻(VL)链和重(VH)链部分的可变域都决定抗原识别和特异性。相反，轻链的恒定域(CL)和重链的恒定域(CH1、CH2或CH3)赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。根据惯例，恒定区结构域的编号随着它们从抗体的抗原结合位点或氨基末端变得更远而增加。N-端是可变区并且C-端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端结构域。
如本文所用，术语“抗原结合片段”指抗体的一个或多个部分，其保留与抗原的表位(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)特异性相互作用的能力。结合片段的实例包括，但不限于单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单条臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段(Ward等,Nature 341:544-546,1989)，其由VH结构域组成；和分离的互补性决定区(CDR)，或抗体的其他表位结合片段。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是可以使用重组方法，通过合成连接体将它们连接，所述合成连接体使得它们被制备成单条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(“scFv”)；参见例如Bird等,Science 242:423-426,1988；和Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988)。此类单链抗体也旨在包括在术语“抗原结合片段”中。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗原结合片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的有用性。
抗原结合片段也可以掺入到单结构域抗体、大抗体(maxibodies)、微抗体(minibodies)、纳米抗体(nanobodies)、胞内抗体(intrabodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、v-NAR和bis-scFv(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原结合片段可以嫁接到基于多肽的支架，如纤连蛋白III型(Fn3)上(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单抗体)。
抗原结合片段可以掺入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等,Protein Eng.8:1057-1062,1995；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指这样的多肽，其包括具有基本相同的氨基酸序列或来自相同遗传来源的抗体和抗原结合片段。该术语还包括单一分子组合物的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物对特定表位展示单一的结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”包括具有这样的可变区的抗体，其中两个构架和CDR区来自人起源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么该恒定区也来自此类人序列，例如，人种系序列，或人种系序列的突变形式或含有来自人构架序列分析的共有构架序列的抗体，例如如Knappik等,J.Mol.Biol.296:57-86,2000)中所述。
本发明的人抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点定向诱变或通过体内体细胞突变引入的突变，或取代以促进稳定性或制造)。
如本文所用，术语“人源化”抗体指保留非人抗体的反应性同时在人中免疫原性较低的抗体。这例如通过保留非人CDR区并利用其人对应物替换抗体的剩余部分来实现。参见例如，Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994)。
当在描述抗原(例如蛋白质或聚糖)与抗体、抗体片段或衍生自抗体的结合物质的相互作用的情况下使用时，术语“特异性结合”或“选择性结合”是指在蛋白质和其它生物制品的异质群体中例如在生物样品例如血液、血清、血浆或组织样品中确定抗原存在的结合反应。因此，在某些指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合物质以至少两倍于背景与特定抗原结合，并且基本上不与样品中存在的其它抗原以显著量结合。在一个实施方案中，在指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合物质以至少十(10)倍于背景与特定抗原结合，并且基本上不与样品中存在的其它抗原以显著量结合。在些类条件下与抗体或结合物质的特异性结合可能需要所述抗体或结合物质已就其对特定蛋白质的特异性被选择。在需要或适当时，该选择可以通过扣除与来自其它物种(例如小鼠或大鼠)或其它亚类的分子交叉反应的抗体来实现。或者，在一些实施方案中，选择与某些希望的分子交叉反应的抗体或抗体片段。
许多免疫测定版式可以用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定被常规用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(参见例如Harlow&Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998)，对于能够用于测定特异性免疫反应的免疫测定版式和条件的描述(for a description of immunoassay formats andconditions that can be used to determine specific immunoreactivity))。典型地，特异性或选择性结合反应将产生比背景信号高至少两倍的信号，并且更典型地比背景高至少10-100倍。
如本文所用的术语“亲和力”指单一抗原位点上抗体与抗原的相互作用强度。在每一个抗原位点内，抗体“臂”的可变区在多个位点上通过弱的非共价力与抗原相互作用；相互作用越强，亲和力越强。
术语“分离的抗体”指基本没有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。然而，特异性结合一个抗原的分离的抗体可能与其他抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上没有其他细胞物质和/或化学品。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用到典型氨基酸聚合物以及非典型氨基酸聚合物。除非另有指出，特定的多肽序列也暗中包括其修饰的变体。
如本文所用的术语“免疫缀合物”或“抗体-药物-缀合物”涉及抗原结合部分例如抗体或其抗原结合片段与式(I)的细胞毒性肽的连接(linkage)。该连接可以通过共价键，或非共价相互作用，并且可以包括螯合作用。可以使用多种本领域所知的连接体(linker)以形成免疫缀合物。
如本文所用的术语“细胞毒素”或“细胞毒性剂”指对细胞的生长和增殖有害并且可能作用以减少、抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的任何物质。
如本文所用的术语“抗癌剂”指可以用于治疗细胞增殖性病症，如癌症的任何物质，包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂、放疗和放射治疗剂、靶向抗癌剂和免疫治疗剂。
文中所用的术语“药物部分”或“有效载荷”指缀合或能够缀合抗体或抗原结合片段以形成免疫缀合物的化学部分，并且可以包括用于连接抗体或抗原结合片段的任何部分。例如，“药物部分”或“有效载荷”包括但不限于文中描述的细胞毒性肽。本发明的免疫缀合物包含一个或多个文中所述的细胞毒性肽作为有效载荷，但也可以包含一个或多个其它有效载荷。其它有效载荷包括，例如，药物部分或有效载荷可以是抗癌剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或麻醉剂。在某些实施方案中，药物部分选自Eg5抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、阿里他汀(auristatin)、多拉司他汀、美坦生类化合物(maytansinoid)、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂和DHFR抑制剂。合适的实例包括刺孢霉素，如γ-刺孢霉素；和美坦生类化合物，如DM1、DM3和DM4。用于将这些中的每一个连接到与本发明的抗体和方法相容的连接体上的方法为本领域所知。参见例如Singh等,(2009)Therapeutic Antibodies:Methods and Protocols,第525卷,445-457。
“肿瘤”涉及赘生细胞生长和增殖，不管是恶性的还是良性的，以及所有前癌和癌细胞和组织。
术语“抗肿瘤活性”意指肿瘤细胞增殖速度、活力或转移活性的降低。显示抗肿瘤活性的可能方式是显示在治疗过程中发生的异常细胞的生长速度降低或肿瘤大小稳定或减少。可以使用公认的体外或体内肿瘤模型包括但不限于异种移植物模型、同种异体移植物模型、MMTV模型和本领域已知的其他已知模型评估该活性以研究抗肿瘤活性。
术语“恶性肿瘤”指非良性肿瘤或癌症。如本文所用，术语“癌症”包括以失调的或不受控的细胞生长为特征的恶性肿瘤。示例性癌症包括：癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。
术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，其细胞还没有迁移到个体身体的除了原发肿瘤的位点之外的位点的那些肿瘤)和继发性恶性肿瘤(例如，起源于转移的那些肿瘤，所述转移是肿瘤细胞迁移到不同于原发肿瘤位点的第二位点上)。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等及其组合，其为本领域技术人员所知(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版.MackPrinting Company,1990,第1289-1329页)。除了与活性成分不相容的情况之外，考虑任一常规载体在治疗或药物组合物中的应用。
术语本发明化合物的“治疗有效量”指将引起个体的生物或医学应答，例如酶或蛋白质活性的降低或抑制，或改善症状，缓解状况，减缓或延迟疾病进程，或预防疾病等的本发明化合物的量。在一个非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”指当向个体施用时，有效地至少部分缓解、抑制、预防和/或改善状况或病症或疾病的本发明化合物的量。
如文中所用，术语“个体”是指动物。典型地，动物是哺乳动物。个体也指例如灵长类动物(例如人，男性或女性)、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施方案中，个体是灵长类动物。在一些具体实施方案中，个体是人。
如本文所用，术语“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibiting)”指给定状况、症状或病症或疾病的减轻或抑制，或生物活性或过程的基线活性的显著降低。
如本文所用，术语任何疾病或病症的“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”在一个实施方案中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或降低疾病的发生或其至少一种临床症状)。在另一实施方案中，“治疗”指缓解或改善至少一个物理参数，包括患者可能不能辨别的那些。在又一实施方案中，“治疗”指身体上(例如稳定可辨别的症状)、生理上(例如稳定身体参数)或通过两者调节疾病或病症。在又一实施方案中，“治疗”指预防或延迟疾病或病症的进展。
如本文所用，如果个体将在生物学上、医学上或生活质量上从该治疗中受益，那么该个体是“需要”治疗的。
如本文所用，将理解术语“a”、“an”、“the”和本发明上下文中(尤其是在权利要求上下文中)使用的类似术语涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明确地相互矛盾。
在某些实施方案中，根据例如1、2、3、4、5、6、7或8或12或16的“细胞毒性肽-与-抗体”比描述修饰的本发明的免疫缀合物；该比例对应于式(II)和式(III)中的“y”。而对于具体缀合物分子该比例具有整数值，应当理解，由于免疫缀合物的样品中的一些不均匀度，典型地，使用平均值描述含有许多分子的样品。免疫缀合物的样品的平均负载在文中称为“药物与抗体比”或DAR。在一些实施方案中，DAR是约1至约16，并且典型地是约1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，至少50％重量的样品是具有平均DAR加或减2的化合物，并且优选至少50％的样品是具有平均DAR加或减1.5的产品。优选的实施方案包括其中DAR是约2至约8例如约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8的免疫缀合物。在这些实施方案中，“约q”的DAR意指DAR的测量值在q的±20％内或优选在q的±10％内。
如本文所用，术语“光学异构体”或“立体异构体”指对于本发明的给定化合物可能存在的多种立体异构构型中的任何一种，并包括几何异构体。应理解，取代基可以连接在碳原子的手性中心。术语“手性”指这样的分子，其对于其镜像配偶体具有非可重叠性的性质，而术语“非手性”指这样的分子，其对于其镜像配偶体是可重叠的。因而，本发明包括化合物的对映异构体、非对映异构体或外消旋物。“对映异构体”是彼此为非重叠的镜像的一对立体异构体。一对对映异构体的1：1混合物是“外消旋”混合物。适当时，该术语用于指定外消旋混合物。“非对映异构体”是这样的立体异构体，其具有至少两个不对称原子，但其彼此不是镜像。根据Cahn-lngold-Prelog R-S系统指定绝对立体化学。当化合物是纯的对映异构体时，可以通过R或S指定每个手性碳上的立体化学。其绝对构型未知的拆分的化合物可以根据它们在钠D线的波长上旋转平面偏振光的方向(右旋或左旋)被指定为(+)或(-)。本文所述的某些化合物含有一个或多个不对称中心或轴并因此产生对映异构体、非对映异构体，和在绝对立体化学方面可被定义为(R)-或(S)-的其他立体异构形式。
根据起始材料和方法的选择，化合物可以以可能的异构体之一或其混合物的形式存在，例如作为纯的旋光异构体，或作为异构体混合物，如外消旋物和非对映异构体混合物，这取决于不对称碳原子的数量。本发明旨在包括所有此类可能的异构体，包括外消旋混合物、非对映异构体混合物和光学上纯的形式，除非另外说明，例如指明具体异构体时。可以使用手性合成子或手性试剂制备旋光活性的(R)-和(S)-异构体，或可以使用常规技术进行拆分。如果化合物含有双键，那么取代基可以是E或Z构型。如果化合物含有二取代的环烷基，那么所述环烷基取代基可以具有顺式或反式构型。也旨在包括所有的互变异构形式。
如本文所用，术语“盐”指本发明化合物的酸加成盐或碱加成盐。“盐”特别包括“药学上可接受的盐”。术语“药学上可接受的盐”指这样的盐，其保留本发明化合物的生物有效性和性质并且其通常不是生物学上的或其他方面不想要的。在许多情况下，本发明的化合物由于存在氨基和/或羧基或与其类似的基团能够形成酸盐和/或碱盐。
可以利用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴化物、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/氢氯化物、氯茶碱(chlorotheophyllinate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘化物/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
可以由其衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。
可以由其衍生盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、羟乙酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可以利用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。
可以由其衍生盐的无机碱包括例如铵盐和来自周期表第I列至第XII列的金属。在某些实施方案中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别合适的盐包括铵、钾、钠、钙和镁盐。
可以由其衍生盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺，包括天然存在的取代的胺、环胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星(benzathine)、胆碱盐(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨基丁三醇。
可以通过常规的化学方法，从碱部分或酸部分合成本发明的药学上可接受的盐。一般地，可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学量的适当碱(如Na、Ca、Mg或K氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应，或通过使这些化合物的游离碱形式与化学量的适当酸反应来制备此类盐。此类反应通常在水或有机溶剂，或两者的混合物中进行。一般地，当可应用时，使用非水介质，像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是合乎需要的。例如可以在“Remington's Pharmaceutical Sciences”,第20版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,(1985)；和Stahl和Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)中发现另外的合适盐的列表。
本文给出的任何式也旨在代表化合物的未标记形式以及同位素标记形式。同位素标记的化合物具有本文给出的式描述的结构，除了一个或多个原子被具有所选原子量或质量数的原子替换。可以掺入到本发明化合物中的同位素的实例分别包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，如2H、3H、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl、125I。本发明包括多种同位素标记的如本文定义的化合物，例如放射性同位素如3H和14C存在的那些化合物，或非放射性同位素如2H和13C存在的那些化合物。此类同位素标记的化合物可用于代谢研究(利用14C)、反应动力学研究(利用例如2H或3H)、检测或成像技术，如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，包括药物或底物组织分布测定，或患者的放射性治疗中。具体而言，18F或标记的化合物对于PET或SPECT研究是特别合乎需要的。一般可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例和制备中描述的那些类似的方法，使用适当同位素标记的试剂代替先前使用的非标记试剂来制备式(I)的同位素标记的化合物。
此外，利用较重同位素，特别是氘(即，2H或D)的取代可以提供起因于更高代谢稳定性的某些治疗优势，例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求或治疗指数的改善。可以通过同位素富集因子定义该较重同位素，尤其是氘的浓度。如本文所用的术语“同位素富集因子”表示同位素丰度与指定同位素的天然丰度之间的比例。如果本发明的化合物中的取代基被指示为氘，那么该化合物对每一个指定的氘原子，具有至少3500(在每个指定的氘原子上52.5％氘掺入)、至少4000(60％氘掺入)、至少4500(67.5％氘掺入)、至少5000(75％氘掺入)、至少5500(82.5％氘掺入)、至少6000(90％氘掺入)、至少6333.3(95％氘掺入)、至少6466.7(97％氘掺入)、至少6600(99％氘掺入)或至少6633.3(99.5％氘掺入)的同位素富集因子。
根据本发明的药学上可接受的溶剂合物包括其中结晶溶剂可能被同位素取代的(例如D2O、d6-丙酮、d6-DMSO)的那些以及具有非富集溶剂的溶剂合物。
含有能够充当氢键的供体和/或受体的基团的本发明化合物即式(I)化合物可能能够与适当的共晶形成剂形成共晶。这些共晶可以通过已知的共晶形成方法由式(I)化合物制备。此类方法包括研磨、加热、共升华、共熔或在结晶条件下使式(I)化合物与共晶形成剂在溶液中接触，并分离由此形成的共晶。适当的共晶形成剂包括WO 2004/078163中描述的那些。因此，本发明还提供包含式(I)化合物的共晶。
本发明化合物的任何不对称原子(例如碳等)能够以外消旋物或对映异构体富集形式例如(R)-、(S)-或(R,S)-构型存在。在某些实施方案中，各不对称原子具有(R)-或(S)-构型的至少50％对映异构体过量、至少60％对映异构体过量、至少70％对映异构体过量、至少80％对映异构体过量、至少90％对映异构体过量、至少95％对映异构体过量或至少99％对映异构体过量；即对于光学活性化合物，通常优选使用一种对映异构体，而基本排除另一对映异构体。如果可能的话，在具有不饱和双键的原子处的取代基可以以顺-(Z)-或反-(E)-形式存在。
因此，如文中所用，本发明的化合物能够为可能的异构体、旋转异构体、阻转异构体、互变异构体之一或其混合物形式的，例如基本上纯的几何(顺或反)异构体、非对映异构体、光学异构体(对映异构体)、外消旋物或其混合物。如文中所用，“基本上纯的”或“基本上没有其它异构体”意指产品含有相对于优选的异构体的量的少于5％重量、并优选少于2％重量的其它异构体。
可以基于组分的物理化学差异例如通过色谱法和/或分步结晶将任何得到的异构体的混合物分离为纯的或基本上纯的几何或光学异构体、非对映异构体、外消旋物。
任何得到的终产物或中间体的外消旋物可以通过已知方法被拆分为光学异构体，例如通过分离其与光学活性酸或碱获得的非对映异构体盐并释放光学活性酸性或碱性化合物。特别是，碱性部分因此可以用于将本发明的化合物拆分为它们的光学对映异构体，例如通过分步结晶与光学活性酸形成的盐，所述光学活性酸例如是酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二乙酰基酒石酸、二-O,O'-p-甲苯酰酒石酸、扁桃酸、苹果酸或樟脑-10-磺酸。还可通过手性色谱法例如采用手性吸附剂的高压液相色谱(HPLC)拆分外消旋产物。
此外，本发明的化合物包括它们的盐还可以以它们的水合物的形式获得或包含用于它们结晶的其它溶剂。本发明的化合物可固有地或通过设计与药学上可接受的溶剂(包括水)形成溶剂合物；因此，本发明旨在包括溶剂化的和非溶剂化的形式。术语“溶剂合物”是指本发明化合物(包括其药学上可接受的盐)与一个或多个溶剂分子的分子复合物。此类溶剂分子是在制药领域中通常使用的那些，已知其对于接受者是无害的，例如水、乙醇等。术语“水合物”是指其中溶剂分子是水的所述复合物。
本发明的式(I)化合物包括其盐、水合物和溶剂合物可以固有地或通过设计形成多晶型物。
文中所用的术语“硫醇-马来酰亚胺”是指硫醇与马来酰亚胺反应形成的基团，其具有下面通式
其中Y和Z是通过硫醇-马来酰亚胺连接部分而被连接的基团，并且可以包含连接体构件、抗体或有效载荷。
文中所用的“可裂解的”是指通过共价连接来连接两个部分但在生理相关条件下断裂以分开所述部分间的共价连接的连接体或连接体构件，典型地，可裂解的连接体在细胞内环境比在细胞外时更快速地在体内分开，使优选在靶细胞内发生有效载荷的释放。裂解可以是酶促的或非-酶促的，但是通过在不降解抗体的情况下从抗体释放有效载荷。裂解可能使连接体或连接体构件的一些部分留在有效载荷上，或其可能释放有效载荷，而没有连接体的任何残留部分或构件。
文中所用的“Pcl”是指吡咯啉羧基赖氨酸，例如其中R20是H，当掺入肽中时其具有下式：
其中R20是甲基的相应化合物是吡咯赖氨酸。
文中所用的“非-可裂解的”是指在生理条件下对裂解尤其不敏感的连接体或连接体构件，例如其至少与免疫缀合物的抗体或抗原结合片段部分一样稳定。此类连接体有时称为“稳定的”，意指它们足以抵抗降解以保持有效载荷连接至抗原结合部分Ab，直到Ab本身至少部分降解，即在体内Ab的降解在连接体的裂解之前。具有稳定的或非-可裂解的连接体的ADC的抗体部分的降解可能使连接体的部分或全部和来自抗体的一个或多个氨基酸基团连接至体内递送的有效载荷或药物部分。
如文中所用，术语"C1-C3烷基"、"C2-C3烷基"、"C1-C4烷基"、"C1-C5烷基"、"C1-C6烷基"和"C2-C6烷基"是指分别含有1-3个碳原子、2-3个碳原子、1-4个碳原子、1-5个碳原子、1-6碳原子或2-6个碳原子的完全饱和的支链或直链烃。"C1-C3烷基"基团的非限制实例包括甲基、乙基、正丙基和异丙基。"C2-C3烷基"基团的非限制实例包括乙基、正丙基和异丙基。"C1-C4烷基"基团的非限制实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。"C1-C5烷基"基团的非限制实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和异戊基。"C1-C6烷基"基团的非限制实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和己基。"C2-C6烷基"基团的非限制实例包括乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和己基。
如文中所用，术语“亚烷基”是指具有1-10个碳原子和两个与其它特征连接的开放价键的二价烷基基团。除非另外提供，亚烷基是指具有1-10个碳原子、1-6个碳原子或1-4个碳原子的基团。亚烷基的代表性实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚异丙基、亚正丁基、亚仲丁基、亚异丁基、亚叔丁基、亚正戊基、亚异戊基、亚新戊基、亚正己基、3-甲基亚己基、2,2-二甲基亚戊基、2,3-二甲基亚戊基、亚正庚基、亚正辛基、亚正壬基、亚正癸基等。
如文中所用，术语"C1-C3烷氧基"、"C2-C3烷氧基"、"C1-C4烷氧基"、"C1-C5烷氧基"、"C1-C6烷氧基"和"C2-C6烷氧基"分别是指基团-O-C1-C3烷基、-O-C2-C3烷基、-O-C1-C4烷基、-O-C1-C5烷基、-O-C1-C6烷基和–O-C2-C6烷基，其中所述基团"C1-C3烷基"、"C2-C3烷基"、"C1-C4烷基"、"C1-C5烷基"、"C1-C6烷基"和"C2-C6烷基”如文中所定义。"C1-C3烷氧基"基团的非限制实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基和异丙氧基。"C2-C3烷氧基"基团的非限制实例包括乙氧基、正丙氧基和异丙氧基。"C1-C4烷氧基"基团的非限制实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。"C1-C5烷氧基"基团的非限制实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊基氧基和异戊基氧基。"C1-C6烷氧基"基团的非限制实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊基氧基、异戊基氧基和己基氧基。"C2-C6烷氧基"基团的非限制实例包括乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊基氧基、异戊基氧基和己基氧基。
如文中所用，术语“卤素”(或卤代)是指氟、溴、氯或碘，特别是氟或氯。卤素取代的基团和部分例如被卤素取代的烷基(卤代烷基)可以是单、多或全卤化的。
如文中所用，术语“杂原子”是指氮(N)、氧(O)或硫(S)原子，特别是氮或氧，除非另外提供。
文中所用的术语“4-8元杂环烷基”是指饱和的4-8元单环烃环结构，其中该烃环结构的1-2个环碳被1-2个NR基团替换，其中R是氢、键、文中定义的R5基团或文中定义的R7基团。如文中所用，4-8元杂环烷基基团的非限制实例包括氮杂环丁烷基、氮杂环丁烷-1-基、氮杂环丁烷-2-基、氮杂环丁烷-3-基、吡咯烷基、吡咯烷-1-基、吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、吡咯烷-4-基、吡咯烷-5-基、哌啶基、哌啶-1-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、哌啶-5-基、哌啶-6-基、哌嗪基、哌嗪-1-基、哌嗪-2-基、哌嗪-3-基、哌嗪-4-基、哌嗪-5-基、哌嗪-6-基、氮杂环庚烷基、氮杂环庚烷-1-基、氮杂环庚烷-2-基、氮杂环庚烷-3-基、氮杂环庚烷-4-基、氮杂环庚烷-5-基、氮杂环庚烷-6-基和氮杂环庚烷-7-基。
文中所用的术语“6元杂环烷基”是指饱和的6元单环烃环结构，其中该烃环结构的1-2个环碳被1-2个NR基团替换，其中R是氢、键、文中定义的R5基团或文中定义的R7基团。如文中所用，6元杂环烷基基团的非限制实例包括哌啶基、哌啶-1-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、哌啶-5-基、哌啶-6-基、哌嗪基、哌嗪-1-基、哌嗪-2-基、哌嗪-3-基、哌嗪-4-基、哌嗪-5-基和哌嗪-6-基。
文中所用的术语“5-8元稠合的二环杂环烷基”是指饱和的5-8元稠合的二环烃环结构，其中该烃环结构的1-2个环碳被1-2个NR基团替换，其中R是氢、键、文中定义的R5基团或文中定义的R7基团。如文中所用，5-8元稠合的二环杂环烷基基团的非限制实例包括3-氮杂二环[3.1.0]己基和3-氮杂二环[4.1.0]庚基。
文中使用的免疫缀合物命名规则是抗体-化合物编号，其中化合物编号是指用于与特定抗体缀合的式(I)化合物。
连接体
文中提供用作ADC有效载荷的细胞毒性肽可以连接至连接体L或直接连接至抗原结合部分。用于此类ADC的适当的连接体是本领域众所周知的，并且能够用于本发明的缀合物中。连接体L可以在抗原结合部分的任何适当的可用位置上连接至抗原结合部分：典型地，L连接到可用的氨基氮原子(即伯或仲胺，而不是酰胺)或羟基氧原子或可用的巯基，例如在半胱氨酸上。连接体L与文中提供的细胞毒性肽可以在细胞毒性肽的N-端或细胞毒性肽的C-端连接。用于ADC的各种连接体是已知的(参见例如Lash,Antibody-DrugConjugates:the Next Generation of Moving Parts,Start-Up,Dec.2011,1-6)，并且能够用于本发明的范围内的缀合物中。
式(I)、式(II)和式(III)中的连接体L是包含一个或多个连接体构件L1、L2、L3、L4、L5、L6等的连接部分。在某些实施方案中，连接体构件可以代表将其侧面基团连接在一起的键。在某些实施方案中，L是-*L1L2L3L4L5L6-，其中*表示与本发明的细胞毒性肽的连接位点。在某些实施方案中，连接体构件可以代表将其侧面基团连接在一起的键。在某些实施方案中，L是-*L1L2L3L4L5-，其中*表示与本发明的细胞毒性肽的连接位点。在某些实施方案中，连接体构件可以代表将其侧面基团连接在一起的键。在某些实施方案中，L是-*L1L2L3L4-，其中*表示与本发明的细胞毒性肽的连接位点。在某些实施方案中，连接体构件可以代表将其侧面基团连接在一起的键。在某些实施方案中，L是-*L1L2L3-，其中*表示与本发明的细胞毒性肽的连接位点。在一优选的实施方案中，L是-*L1L2-，其中*表示与本发明的细胞毒性肽的连接位点。在某些实施方案中，L是-L1-。一些优选的连接体和连接体构件描述在文中。
式(I)、式(II)和式(III)中的连接体L可以是二价的，意味着其可以用于每一连接体将仅一个有效载荷连接至抗原结合部分；或其可以是三价的，其每一连接体能够将两个有效载荷连接至抗原结合部分；或其可以是多价的。三价、四价和多价连接体可以用于增加抗原结合部分(例如抗体)上的有效载荷(药物)的负载，从而增加药物与抗体比(DAR)，而不需要额外的用于连接多个连接体的抗体上的位点。此类连接体的实例列在BioconjugateChem.,1999Mar-Apr；10(2):279-88；US6638499；Clin Cancer Res October 15,2004 10；7063；和WO2012/113847A1中。
用于式(I)化合物和式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L可以是可裂解的或非-可裂解的。可裂解的连接体例如含有腙、二硫化物、二肽Val-Cit的那些以及含有葡糖苷酸酶-可裂解的p-氨基苄基氧基羰基部分的那些是众所周知的并且可以使用。参见例如Ducry,等人,Bioconjugate Chem.vol.21,5-13(2010)。对于包含可裂解的连接体的免疫缀合物，连接体在体内是基本稳定的，直到免疫缀合物与细胞结合或进入细胞中，在此时细胞内酶或细胞内化学条件(pH、减少的容量(capacity))裂解连接体以游离细胞毒性肽。
或者，非-可裂解的连接体可用于式(I)化合物和式(II)和式(III)的免疫缀合物中。非-可裂解的连接体缺少设计在细胞中降解因此它们的结构能够实质上变化的结构构件。参见例如Ducry,等人,Bioconjugate Chem.,vol.21,5-13(2010)。据信这些免疫缀合物进入靶细胞，并且进行抗体的蛋白水解降解而不是连接体的分解；因此至少连接体的一部分或全部，以及甚至抗体或抗体片段中的一些可以保持与有效载荷连接。
式(I)化合物和式(II)和式(III)的免疫缀合物中的连接体L典型地通常包含两个或更多个连接体构件，可以对其进行选择以方便缀合物的组装，或可以对它们选择以影响缀合物的性质。用于形成连接体L的适当的连接体构件是本领域已知的，构建连接体L的方法也是本领域已知的。连接体构件可包括通常用于将基团与氨基酸连接的基团、间隔体例如亚烷基基团和环氧乙烷低聚体、氨基酸和至多约4个氨基酸长度的短肽；键；和羰基、氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、酯和酰胺连接(linkage)等。连接体构件可包括硫醇-马来酰亚胺基团、硫醚、酰胺和酯；在靶细胞之内、之上或周围条件下容易体内裂解的基团，例如二硫化物、腙、二肽如Val-Cit、取代的苄基氧基羰基基团等；在相对于抗原结合部分的适当位置定向有效载荷的间隔体，例如苯基、杂芳基、环烷基或杂环基环和亚烷基链；和/或提高药代动力学性质的基团例如被一个或多个极性基团(羧基、磺酸盐、羟基、胺、氨基酸、糖)取代的亚烷基和含有一个或多个代替亚甲基基团的–NH-或–O-的亚烷基链，例如乙二醇醚(-CH2CH2O-)p，其中p是1-10，其可以提高溶解度或降低分子间聚集，例如。
此外，连接体构件可以包含通过两个反应基团间的反应容易形成的化学部分。此类化学部分的非限制实例列在表1中。
表1
其中：表1中的R32是H、C1-4烷基、苯基、嘧啶或吡啶；表1中的R35是H、C1-6烷基、苯基或被1-3个–OH基团取代的C1-4烷基；表1中的各R36独立地选自H、C1-6烷基、氟、被–C(＝O)OH取代的苄基氧基、被–C(＝O)OH取代的苄基、被–C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；表1中的R37独立地选自H、苯基和吡啶，表1中的各R5独立地选自H或C1-6烷基；表1中的R12是H、-CH3或苯基；表1中的R50是H或硝基。
在一些实施方案中，式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L的连接体构件是反应性官能团与通常用于缀合的氨基酸侧链之一(例如半胱氨酸的硫醇、赖氨酸的游离–NH2、或改造至抗体中的Pcl或Pyl基团)反应形成的基团。参见例如Ou,等人,PNAS 108(26),10437-42(2011)。通过与抗原结合部分的半胱氨酸残基反应形成的连接体构件包括但不限于 通过与抗原结合部分的赖氨酸残基的–NH2反应形成的连接体构件，其中各p是1-10，且各R独立地是H或C1-4烷基(优选甲基)，包括但不限于 通过与Pcl或Pyl基团反应形成的连接体构件包括但不限于其中R20是H或Me，且R30是H、Me或苯基，对于连接，其中显示的酰基基团连接至改造的抗体中Pcl或Pyl的赖氨酸部分。通过Ab二硫化物桥和含有羟胺的式(I)化合物反应形成的连接体构件是通过Ab二硫化物桥和含有羟胺的式(I)化合物反应形成的连接体构件是
在一些实施方案中，式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L的连接体构件包括例如亚烷基基团-(CH2)n-(其中n典型地是1-10或1-6)、乙二醇单元(-CH2CH2O-)n(其中n是1-20，典型地是1-10或1-6)、-O-、-S-、羰基(-C(＝O)-)、酰胺–C(＝O)-NH-或–NH-C(＝O)-、酯–C(＝O)-O-或–O-C(＝O)-、具有两个可用的连接点的环系统例如选自以下的二价环：苯基(包括1,2-1,3-和1,4-二-取代的苯基)、C5-6杂芳基、C3-8环烷基包括1,1-二取代的环丙基、环丁基、环戊基或环己基和1,4-二取代的环己基和C4-8杂环基环和下面描述的具体实例；氨基酸–NH-CHR*-C＝O-或–C(＝O)-CHR*-NH-或具有式[N]–CHR*-C(＝O)-的衍生自连接至相邻结构的N(例如马来酰亚胺氮)的氨基酸的基团，其中R*是已知氨基酸(经常是典型氨基酸之一，例如trp、ala、asp、lys、gly等，但也包括例如正缬氨酸、正亮氨酸、高丝氨酸、高半胱氨酸、苯基甘氨酸、瓜氨酸和其它通常提到的α-氨基酸)的侧链、已知氨基酸的多肽(例如二肽、三肽、四肽等)、硫醇-马来酰亚胺连接部分(来自–SH与马来酰亚胺的加成)、-S-CR2-和其它硫醚例如-S-CR2-C(＝O)-或-C(＝O)-CR2-S-其中R在各次出现时独立地是H或C1-4烷基、-CH2-C(＝O)-和二硫化物(-S-S-),以及这些中任何一个与下面描述的其它连接体构件的组合，所述其它连接体构件例如键、非-酶促可裂解的连接体、非-可裂解的连接体、酶促可裂解的连接体、光-稳定的连接体、光-可裂解的连接体或包含自毁(self-immolative)间隔体的连接体。
在某些实施方案中，式(I)化合物以及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L是-*L1L2L3L4L5L6-，其中*表示与本发明的细胞毒性肽的连接位点。在某些实施方案中，式(I)化合物以及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L是-*L1L2L3L4L5-，其中*表示与本发明的细胞毒性肽的连接位点。在某些实施方案中，式(I)化合物以及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L是-*L1L2L3L4-，其中*表示与本发明的细胞毒性肽的连接位点。在某些实施方案中，式(I)化合物以及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L是-*L1L2L3-，其中*表示与本发明的细胞毒性肽的连接位点。在一优选的实施方案中，式(I)化合物以及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L是-*L1L2-，其中*表示与本发明的细胞毒性肽的连接位点。在某些实施方案中，式(I)化合物的连接体L是-L1-。
式(I)化合物以及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体构件L1选自-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-,-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-,C(＝O)NR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mX3((CH2)mO)n-，-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mS(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mNR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-，-NR12(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)m-，-(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-，-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(C(R12)2)m-，-(CH2CH2O)n-，-(OCH2CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX2(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-，-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-，-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-，-C(＝O)CHRaaNR12-，-CHRaaC(＝O)-，-C(＝O)NR12-，-C(＝O)O-，-S-，-SCH2(C＝O)NR12-，-NR12C(＝O)CH2S-，-S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2-，-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，-NR12C(＝S)-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-，
其中:
R20是H或Me，且R30是H、-CH3或苯基；
R21是
各R25独立地选自H或C1-4烷基；
Raa是氨基酸的侧链，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯基甘氨酸和叔丁基甘氨酸；
R32独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R33独立地选自 且
R34独立地选自H、C1-4烷基和C1-6卤代烷基；
X1是自毁间隔体，其选自
X2是选自以下的二肽：
X3是X4是
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
式(I)化合物及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体构件L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键、-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m--C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mX3((CH2)mO)n-，C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mS(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mNR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-，-NR12(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)m-，-(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-，-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(C(R12)2)m-，-(CH2CH2O)n-，-(OCH2CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-，-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-，-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-，-C(＝O)CHRaaNR12-，-CHRaaC(＝O)-，-C(＝O)NR12-，-C(＝O)O-，-S-，-SCH2(C＝O)NR12-，-NR12C(＝O)CH2S-，-S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2-，-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，-NR12C(＝S)-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-，
其中:
R20是H或Me，且R30是H、-CH3或苯基；
R21是
各R25独立地选自H或C1-4烷基；
Raa是氨基酸的侧链，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯基甘氨酸和叔丁基甘氨酸；
R32独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R33独立地选自 且
R34独立地选自H、C1-4烷基和C1-6卤代烷基；
X1是自毁间隔体，其选自
X2是选自以下的二肽：
X3是且X4是
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
细胞毒性肽
本发明的细胞毒性肽或其立体异构体以及其药学上可接受的盐是具有式(I)结构的化合物
其中：
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的，或各自被R7和0-3个独立选自R5和R6的取代基取代，或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NR12(CH2)mR16、-LR9、-NHS(O)2R11、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(＝O)2LR9、
R5是C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被–CN、-C(＝O)NH2或1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R7是LR9；
R8是H或LR9；
各L独立地选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
R9是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR15、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R10、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R10是
各R11独立地选自C1-C6烷基和任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、被苯基取代的咪唑基、被苯基取代的二唑基、吡唑基、咪啶基、
-CH2S(＝O)2NH2、-CH2S(＝O)2NHLR9、-LR9或–X4LR9；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是2-吡啶基或4-吡啶基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR9取代；
各R19是H或C1-C6烷基；
X3是X4是
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
本发明的一个方面为具有式(I)结构的细胞毒性肽或其立体异构体以及其药学上可接受的盐，
其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的，或各自被R7和0-3个独立选自R5和R6的取代基取代，或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NR12(CH2)mR16、-LR9、-NHS(O)2R11、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(＝O)2LR9、
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R7是LR9；
R8是H或LR9；
各L是独立地选自以下的连接体：-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
R9是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR15、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R10、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R10是
各R11独立地选自C1-C6烷基和任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、
-LR9或–X4LR9；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是2-吡啶基或4-吡啶基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR9取代；
X3是X4是
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
合成方法
用于合成本发明化合物的所有原料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂是商业可获得的或可以通过本领域技术人员已知的有机合成方法(例如Houben-Weyl4th Ed.1952,Methods of Organic Synthesis,Thieme,第21卷)生产。此外，本发明的化合物可以借鉴下面的实施例通过本领域技术人员已知的有机合成方法生产。
式(I)化合物或其子式的合成方法的说明性示例提供在下面的一般流程中。在下面的流程中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和L如文中所定义。尽管一般流程显示了用于各种合成步骤的具体试剂，但是应当理解，其它已知的试剂可以用于完成这些合成步骤。
其中R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代的式(I)和其子式化合物的合成方法，显示在下面的流程1-3中。
流程1
在流程1中，R3通过酰胺键形成与短肽偶联，随后是脱保护步骤，然后是通过酰胺键形成的R1的偶联。
在流程1中，例如，可以是其在偶联后随后脱保护。在流程1中，例如，还可以是
流程2
流程2举例说明式(I)和其子式化合物的示例性合成方法，其中R3是且R4是–OH或–OCH3。在流程2中，R3通过酰胺键形成与短肽偶联，随后是脱保护步骤，然后是通过酰胺键形成的R1的偶联。在流程2中，例如，可以是其在偶联后随后脱保护。在流程1中，例如，还可以是
流程3
流程3举例说明式(I)和其子式化合物的一个示例性合成方法，其中R3是在流程3中，R3通过酰胺键形成与短肽偶联，随后是脱保护步骤，然后是通过酰胺键形成的R1的偶联。在流程3中，例如，可以是其在偶联后随后脱保护。在流程1中，例如，还可以是
N-端连接的式(I)和其子式化合物的合成方法显示在下面的流程4至6中，其中R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
流程4
在流程4中，R3通过酰胺键形成与短肽偶联，随后是脱保护步骤，然后是通过酰胺键形成的R1的偶联。在流程3中，例如，可以是
流程5
在流程5中，R1最初是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代(参见流程1-3)，然后连接R7以得到C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。示例性实例显示在下面的流程中：
或者，通过如流程6中所示的两步方法获得式(I)和其子式化合物，其中R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代(参见流程1-3)，然后连接R7以得到C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
流程6
其中RG1和RG2是反应基团，例如表1中列出的那些且L'是一个或多个连接体构件。
示例性实例显示在下面的流程中：
C-端连接的式(I)和其子式化合物的一种合成方法显示在下面的流程7中，其中R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
流程7
流程8
C-端连接的式(I)和其子式化合物的备选合成方法显示在下面的流程8中，其中R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
C-端连接的式(I)和其子式化合物的备选合成方法显示在下面的流程9中，其中R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
流程9
C-端连接的式(I)和其子式化合物的备选合成方法显示在下面的流程10中，其中R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
流程10
C-端连接的式(I)和其子式化合物的备选合成方法显示在下面的流程11中，其中R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
流程11
C-端连接的式(I)和其子式化合物的备选合成方法显示在下面的流程12中，其中R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
流程12
在流程7至12中，例如，可以是其在偶联后随后脱保护。在流程1中，例如，还可以是 或者，在流程7至12中，在未取代的C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基或未取代的R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基脱保护后，随后与 反应，可以连接R5。
本发明还包括本发明方法的任何变体，其中在其任何阶段可获得的中间体产物被用作原料并进行其余步骤，或者其中在反应条件下在原位形成原料，或者其中以它们的盐或光学纯物质的形式使用反应组分。
下面的实施例意欲举例说明本发明，而不应解释为对其进行限制。温度以摄氏度给出。如果没有另外提到，所有的蒸发在减压通常约15mm Hg至100mm Hg(＝20-133mbar)下进行。所用的缩写是本领域常规的那些。所有反应采用商业级溶剂而没有进一步蒸馏、在氮气气氛下进行。试剂以没有进一步纯化的商业级使用。薄层色谱法采用TLC硅胶板进行。柱色谱法采用ISCO Combiflash Companion系统采用快速级预制柱进行。
制备型HPLC在Waters Autopurification系统中采用下面的条件进行：柱SunfireC18 30x 100mm,5μm,梯度洗脱：在水中的CH3CN+0.05％TFA-CH3CN，30ml/min。
分析方法
除非另外指出，下面的HPLC和HPLC/MS方法用于制备中间体和实施例。
LC/MS分析在Agilent 1200sl/6140系统上进行。
柱:Waters Acquity HSS T3C18,50x2.0,1.8μm
流动相:A)H2O+0.05％TFA；B:乙腈+0.035％TFA泵方法:
| 时间 | A％ | B％ | 流速(mL/min) |
| 0 | 90 | 10 | 0.9 |
| 1.35 | 0 | 100 | 0.9 |
| 1.36 | 0 | 100 | 0.9 |
| 1.95 | 0 | 100 | 0.9 |
| 1.96 | 90 | 10 | 0.9 |
| 2.0 | 90 | 10 | 0.9 |
检测器:UV二极管阵列，在190nm–400nm
MS扫描:200–1350amu
ELSD:60℃
MS参数:
| 极性 | 正的 |
| 干燥气体 | 12 |
| 喷雾器压力 | 50 |
| 干燥气体温度 | 350 |
| 毛细管电压 | 3000 |
中间体的合成程序
(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1,3,4-二唑-2-基)乙胺(i-1)的合成
步骤1:在0℃下，将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-苯基丙酸(200mg,0.754mmol)加入到二氯甲烷(5.5ml)中，然后加入羰基二咪唑(128mg,0.792mmol)。在0℃下搅拌30min后，加入苯甲酰肼(103mg,0.754mmol)。在0℃下另外搅拌45min后，加入四溴化碳(497mg,1.5mmol)和三苯基膦(198mg,0.754mmol)。将混合物在0℃下搅拌2h，然后在rt下搅拌16h。将水加入到混合物中并用DCM萃取(5ml X3)。将有机层合并，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过硅胶柱(20-40％乙酸乙酯的己烷溶液)纯化，得到[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1,3,4-二唑-2-基)乙基]氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 366(M+H).保留时间1.351min.1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.03-7.85(m,2H),7.62-7.38(m,3H),7.33-7.16(m,3H),7.18-7.04(m,2H),5.35(d,J＝7.9Hz,1H),5.15(d,J＝9.1Hz,1H),3.28(d,J＝6.6Hz,2H),1.54(s,9H).
步骤2:向在步骤1中得到的化合物(548mg,1.5mmol)的DCM(5ml)溶液中加入TFA(1.5ml)。将得到的溶液在室温下搅拌18h，然后浓缩，得到(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1,3,4-二唑-2-基)乙胺(i-1)TFA盐。其不需要进一步纯化即使用。MS m/z 266(M+H).保留时间0.858min.
2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙胺(i-2)的合成。
在0℃下，将苄基氯化镁(1.2ml,2.4mmol)(2M的THF溶液)滴加到2-氰基嘧啶(210mg,2.00mmol)的甲苯(10ml)溶液中。将反应在该温度下搅拌1h。然后加入2-丁醇(10ml)，然后加入硼氢化钠(106mg,2.80mmol)。将反应在rt下搅拌1h，然后用MeOH(3ml)和水淬灭。将混合物用EtOAc(2X30ml)萃取。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过制备HPLC(10-30％乙腈的水(含有0.05％TFA)溶液)纯化，得到2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙胺(i-2)。MS m/z 200.2(M+H).保留时间0.637min.1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δ8.75(d,J＝5.0Hz,2H),7.41(t,J＝4.9Hz,1H),7.27(m,3H),7.14-7.05(m,2H),4.84(t,J＝6.7Hz,1H),3.45(dd,J＝14.1,6.3Hz,1H),3.33(dd,J＝14.1,7.1Hz,1H).
(S)-2-苯基-1-(1H-吡唑-3-基)乙胺(i-3)的合成
步骤1:将肼一水合物(0.034ml,0.69mmol)加入到(S,E)-(5-(二乙基氨基)-3-氧代-1-苯基戊-4-烯-2-基)氨基甲酸叔丁酯(60mg,0.17mmol)的MeOH(5ml)溶液中。将反应在70℃下加热2h，然后在50℃下加热3天。将反应混合物浓缩，溶取在水中，并用DCM(5ml X 2)萃取，合并DCM层，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残留物通过硅胶制备TLC(4％MeOH的DCM溶液)纯化，得到(S)-(2-苯基-1-(1H-吡唑-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 288.2(M+H).保留时间1.310min.1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.53-7.35(m,1H),7.28-6.90(m,5H),6.01(s,1H),5.47-5.25(m,0.3H),5.15-4.84(m,0.7H),3.40(s,1H),3.09(d,J＝8.0Hz,2H),1.34(d,J＝31.2Hz,9H).
步骤2:将步骤1得到的化合物(38mg,0.13mmol)的DCM(2ml)溶液用TFA(0.5ml)在rt下处理2h，然后浓缩得到(S)-2-苯基-1-(1H-吡唑-3-基)乙胺TFA盐(i-3)。该产物不需要进一步纯化即用于下一步骤。MS m/z 188.2(M+H).保留时间0.616min.
(S)-(3-(2-氨基-3-羟基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-4)的合成
步骤1:在0℃下、搅拌下，将BH3的THF溶液(1M,10ml)加入到(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(3-硝基苯基)丙酸(562mg,1.81mmol)的THF(10ml)溶液中，然后将反应在50℃下搅拌1h。将反应混合物在0℃下冷却，用水淬灭，用EtOAc稀释并用10％K2CO3水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。将粗品通过硅胶柱纯化(30-70％EtOAc-己烷)纯化，获得(S)-(1-羟基-3-(3-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯，为白色固体。MS m/z 319.1(M+Na).保留时间1.183分钟.1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ8.13-8.04(m,2H),7.57(d,J＝7.7Hz,1H),7.46(dd,J＝8.9,7.6Hz,1H),4.76(s,1H),3.87(dq,J＝8.0,4.6,4.1Hz,1H),3.69(dd,J＝10.9,3.9Hz,1H),3.58(dd,J＝10.8,4.7Hz,1H),2.97(td,J＝13.1,12.5,7.3Hz,2H),1.37(s,9H).
步骤2:向(S)-(1-羟基-3-(3-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.31g,1.0mmol)的乙腈(5ml)溶液中加入10％盐酸(5ml)。将反应混合物在rt下搅拌48h，然后浓缩得到(S)-2-氨基-3-(3-硝基苯基)丙-1-醇，为HCl盐。MS m/z197.2(M+H).保留时间0.775min.
步骤3:将(S)-2-氨基-3-(3-硝基苯基)丙-1-醇的HCl盐(0.243g,1.046mmol)溶解在MeOH(10ml)中并加入10％钯碳(50mg,0.047mmol)。连接2L氢气球。将反应用H2冲洗三次，然后在rt下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将反应通过硅藻土垫过滤并浓缩，得到(S)-2-氨基-3-(3-氨基苯基)丙-1-醇，为HCl盐。MS m/z 167.2(M+H).保留时间0.373min.
步骤4:将(S)-2-氨基-3-(3-氨基苯基)丙-1-醇HCl盐(0.212g,1.046mmol)和Boc2O(228mg,1.05mmol)以及二氧六环-水-AcOH(10:9:1,20ml)合并，并在rt下搅拌3天。LCMS指示反应完成75％。加入另外的Boc2O(150mg)并将反应进一步搅拌6h。然后将反应混合物浓缩并用制备型HPLC(10-40％乙腈的水(含有0.05％TFA)溶液)纯化，得到(S)-(3-(2-氨基-3-羟基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-4)，为油状物。MS m/z 267.2(M+H).保留时间1.011min.
(S)-(4-(2-氨基-3-羟基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-5)的合成
步骤1:在0℃下，向(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸(0.80g,2.58mmol)的THF(10ml)溶液中加入硼烷二甲硫醚络合物(1.00ml,10.5mmol)。将反应在0℃下搅拌10min，然后在rt下搅拌5h。然后在0℃下将反应用水淬灭。将淬灭的混合物在DCM和1M Na2CO3水溶液之间分配。分离DCM层，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到(S)-(1-羟基-3-(4-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯，为白色固体。MS m/z 319.1(M+Na).保留时间1.031min.1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.10(d,J＝8.8Hz,2H),7.33(d,J＝8.7Hz,2H),4.73(s,1H),3.83(s,1H),3.70-3.56(m,1H),3.50(d,J＝4.6Hz,1H),2.91(d,J＝7.1Hz,2H),1.32(s,9H).
步骤2:将(S)-(1-羟基-3-(4-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(300mg,1.01mmol)的乙腈(5ml)和10％盐酸(5ml)溶液在rt下搅拌4h，然后浓缩。将残留物用饱和的Na2CO3水溶液处理，并用DCM-iPrOH(10:1,10mlX3)萃取。将有机层合并，干燥并浓缩得到(S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)丙-1-醇。MS m/z 197.2(M+H).保留时间0.512min.1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.32-7.92(m,2H),7.41-7.21(m,2H),4.18-4.00(m,1H),3.66-3.49(m,2H),3.49-3.36(m,1H),3.25-3.00(m,1H),3.01-2.74(m,2H),2.70-2.65(m,1H).
步骤3:将(S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)丙-1-醇(200mg,1.019mmol)溶解在中MeOH(10ml)中，并加入10％Pd/C(50mg)。连接2L氢气球。将反应用H2冲洗三次，然后在rt下搅拌3h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，然后浓缩得到(S)-2-氨基-3-(4-氨基苯基)丙-1-醇。MS m/z 167.2(M+H).保留时间0.240min.
步骤4:将溶解在二氧六环(10ml)-水(9ml)-AcOH(1ml)中的(S)-2-氨基-3-(4-氨基苯基)丙-1-醇(168mg,1.012mmol)和碳酸叔丁酯(t-butyl dicarbonate)(0.28g,1.28mmol)合并，并在rt下搅拌16h。然后将反应混合物浓缩并通过采用C18柱的ISCO，用10-40％乙腈的水(含有0.05％TFA)溶液洗脱，纯化得到(S)-(4-(2-氨基-3-羟基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯TFA(i-5).MS m/z 267.2(M+H).保留时间0.764min.1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δ7.59(s,1H),7.36(d,J＝8.5Hz,2H),7.16(d,J＝8.5Hz,2H),6.14(s,3H),3.69(dd,J＝11.7,3.2Hz,1H),3.57-3.36(m,2H),2.86(d,J＝7.1Hz,2H),1.47(s,9H).
(S)-(3-(2-氨基-3-甲氧基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-6)的合成
步骤1:在0℃下，将硼烷二甲硫醚络合物(3.00ml,31.6mmol)加入到(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(3-硝基苯基)丙酸(1.5g,4.83mmol)的THF(10ml)溶液中。将反应在0℃下搅拌10min，然后在rt下搅拌6h。然后将反应在0℃下用水淬灭。将淬灭的反应混合物在DCM和1M Na2CO3水溶液之间分配。分离DCM层，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到(S)-(1-羟基-3-(3-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯，为白色固体。MS m/z 319.1(M+Na).保留时间1.031min.1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.14-7.97(m,2H),7.57(dt,J＝7.7,1.4Hz,1H),7.46(dd,J＝8.8,7.6Hz,1H),4.77(d,J＝14.5Hz,1H),3.87(s,1H),3.69(dd,J＝10.9,3.8Hz,1H),3.58(dd,J＝10.9,4.7Hz,1H),2.95(t,J＝6.8Hz,2H),1.37(s,9H).
步骤2:在0℃下，向(S)-(1-羟基-3-(3-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.200g,0.675mmol)的THF/DMF 4:1(10ml)溶液中缓慢地加入NaH(60％在矿物油中,0.048g,1.2mmol)，然后加入碘甲烷(0.19g,1.3mmol)。将得到的混合物在rt下搅拌1h。将反应通过缓慢加入水小心地淬灭直到观察到没有鼓泡(H2)。将粗产物用EtOAc(10ml X3)萃取。将合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残留物通过采用C18柱的ISCO纯化，以及用30-67％ACN的水(含有0.05％TFA)溶液洗脱，得到(S)-(1-甲氧基-3-(3-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯，为白色固体。MS m/z 333.1(M+Na).保留时间1.205min.1H NMR(400MHz,氯仿-d)d 8.10(dd,J＝4.5,2.5Hz,2H),7.59(d,J＝7.5Hz,1H),7.48(dd,J＝8.8,7.6Hz,1H),4.96(d,J＝8.7Hz,1H),4.07-3.88(m,1H),3.43-3.28(m,5H),2.98(d,J＝7.2Hz,2H),1.40(s,9H).
步骤3:将(S)-(1-甲氧基-3-(3-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(124mg,0.400mmol)的乙腈(3ml)和10％盐酸(3ml)溶液在rt下搅拌4h，然后浓缩。将饱和的Na2CO3水溶液加入到残留物中并将得到的混合物用DCM-iPrOH(10:1,10ml X3)萃取。将有机层合并，干燥并浓缩得到(S)-1-甲氧基-3-(3-硝基苯基)丙-2-胺。MS m/z 211.2(M+H).保留时间0.622min.
步骤4:将(S)-1-甲氧基-3-(3-硝基苯基)丙-2-胺溶解在MeOH(10ml)中并加入10％Pd/C(50mg)。连接2L氢气球。将反应用H2冲洗三次，然后在rt下搅拌3h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，然后浓缩得到(S)-3-(2-氨基-3-甲氧基丙基)苯胺。MS m/z 181.2(M+H).保留时间0.282min.
步骤5:将(S)-3-(2-氨基-3-甲氧基丙基)苯胺(62.6mg,0.347mmol)的二氧六环(3ml)-水(3ml)-AcOH(0.6ml)和碳酸叔丁酯(0.093ml,0.4mmol)合并，并在rt下搅拌16h。然后将反应混合物浓缩，通过ISCO，采用C18柱，用10-40％乙腈的水(含有0.05％TFA)溶液洗脱，纯化得到(S)-(3-(2-氨基-3-甲氧基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯TFA盐(i-6)。MS m/z281.2(M+H).保留时间0.856min.1H NMR(400MHz,乙腈-d3)d 7.61(s,1H),7.40-7.12(m,3H),6.89(dt,J＝7.4,1.5Hz,1H),6.78(s,3H),3.59(m,1H),3.50(dd,J＝10.6,3.4Hz,1H),3.38(dd,J＝10.6,6.9Hz,1H),3.33(s,3H),2.90(d,J＝7.5Hz,3H),1.48(s,9H).
(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(i-7)的合成
步骤1:将Dil-OtBu HCl盐(388mg,0.982mmol)、(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(287mg,1.19mmol)、HATU(411mg,1.08mmol)和DIEA(0.42ml,2.38mmol)以及DMF(5ml)合并，并在rt下搅拌30min。将反应混合物用水(10ml)稀释并通过RP-C18ISCO纯化，得到(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯。MS(m+1)＝582.5,HPLC峰RT＝1.542min
步骤2:将步骤1得到的产物(540mg,0.93mmol)的4M HCl的1.4-二氧六环(10ml)溶液在rt下搅拌过夜。将反应混合物浓缩得到(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸。MS(m+1)＝426.2,HPLC峰RT＝0.736min
步骤3:将步骤2得到的产物(430mg,0.93mmol)、37％甲醛溶液(0.38ml,4.7mmol)、乙酸(0.27ml,4.65mmol)、NaBH3CN(585mg,9.31mmol)和MeOH(10ml)合并，并在rt下搅拌30min，然后浓缩。将残留物通过RP-C18ISCO纯化，得到450mg的(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸，为TFA盐。将该TFA盐用10ml的12N HCl溶液处理并浓缩两次，得到(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸HCl盐(i-7).MS(m+1)＝440.2,HPLC峰RT＝0.754min
Boc-Dap-OMe:((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-
甲酸叔丁酯)(i-8)的合成
将Boc-Dap-OH(Small Molecules Inc.,3.11g,10.8mmol)、K2CO3(2.99g,21.6mmol)、碘甲烷(2.95g)和丙酮(55mL)合并。将反应在20℃下搅拌2h。将另外的碘甲烷(2.28g)加入到反应中，并将反应在40℃下搅拌3h。将反应混合物浓缩。将残留物在200mLEtOAc和100mL H2O之间分配。分离有机层，用50mL饱和的NaCl水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，获得Boc-Dap-OMe(i-8)，为黄色油状物。MS(ESI+)m/z计算值324.2,实测值324.2(M+23).保留时间1.245min.
Dap-OMe:((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酸甲酯)(i-9)的合成
将Boc-Dap-OMe(3.107g,10.3mmol)与HCl的乙醚溶液(2M,10mL)合并，并浓缩。重复该操作。第7次处理后反应完全。浓缩后得到为白色固体的Dap-OMe(i-9)HCl盐。MS(ESI+)m/z计算值202.1,实测值202.2(M+1).保留时间0.486min.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.065-4.041(m,1H),3.732(br.s,1H),3.706(s,3H),3.615(s,3H),3.368(br.s,1H),3.314(br.s,1H),2.795(q,1H,J＝6.8Hz),2.085-1.900(m,4H),1.287(d,3H,J＝7.2Hz).
(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-氧代-3-((2-氧代丙基)氨基)丙基)丁酰胺(i-10)的合成
步骤1:将泛酸(50mg,0.23mmol)溶解在DMF(5mL)中并加入二苯基磷酰基叠氮化物(98μL,0.46mmol)和2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙胺(40mg,0.34mmol)。将反应混合物冷却至0℃并加入三乙胺(79μL,0.57mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌10min，然后在rt下搅拌24h。加入EtOAc(50mL)并用0.1N HCl溶液(20mL)、0.1N NaOH溶液(20mL)、盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4干燥，并过滤。将将滤液在真空下浓缩并将残留物通过HPLC纯化并冻干，得到(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-(((2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)甲基)氨基)-3-氧代丙基)丁酰胺。MS(m+1)＝319.2,HPLC峰RT＝0.466min
步骤2:将(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-(((2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)甲基)氨基)-3-氧代丙基)丁酰胺(46mg,0.14mmol)溶解在THF(5mL)和3N HCl溶液(3mL)中并在rt下搅拌4h。冷却至0℃后，将反应混合物用1N NaOH溶液中和并在真空下浓缩一半体积。将反应混合物通过ISCO RP-C18纯化并冻干，得到(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-氧代-3-((2-氧代丙基)氨基)丙基)丁酰胺(i-10).MS(m+1)＝275.2,HPLC峰RT＝0.337min,1H-NMR(MeOD,400MHz)δ3.99(s,2H),3.84(s,1H),3.42～4.47(m,2H),3.42(d,1H,J＝11.2Hz),3.34(d,1H,J＝11.2Hz),2.45(t,2H,J＝6.8Hz),2.10(s,3H),0.87(s,6H).
(R)-N-(3-((2-叠氮基乙基)氨基)-3-氧代丙基)-2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酰胺(i-11)的合成
将泛酸(50mg,0.23mmol)溶解在DMF(5mL)中并加入二苯基磷酰基叠氮化物(98μL,0.46mmol)和2-叠氮基乙胺(30mg,0.34mmol)。将反应混合物冷却至0℃并加入三乙胺(79μL,0.57mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌10min，然后在rt下搅拌24h。加入EtOAc(50mL)并用0.1N HCl溶液(20mL)、0.1N NaOH溶液(20mL)、盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空下浓缩并将残留物通过HPLC纯化并冻干得到(R)-N-(3-((2-叠氮基乙基)氨基)-3-氧代丙基)-2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酰胺(i-11).MS(m+1)＝288.2,HPLC峰RT＝0.504min,1H-NMR(MeOD,400MHz)δ3.84(s,1H),3.41～4.47(m,3H),3.31～3.35(m,5H),2.40(t,2H,J＝6.8Hz),0.87(s,6H).
(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-氧代-3-((3-氧代丁基)氨基)丙基)丁酰胺(i-12)的合成
步骤1:将泛酸半钙盐(100mg,0.390mmol)溶解在CH3CN(10mL)中并用硫酸树脂交换成泛酸。将泛酸(10mg,0.046mmol)溶解在DMF(2mL)中，并加入二苯基磷酰基叠氮化物(20μL,0.091mmol)和2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙胺(7mg,0.005mmol)。将反应混合物冷却至0℃并加入三乙胺(16μL,0.114mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌10min，然后在rt下搅拌24h。加入EtOAc(50mL)并用0.1N HCl溶液(20mL)、0.1N NaOH溶液(20mL)、盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空下浓缩并将残留物通过HPLC纯化并冻干，得到(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-((2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)丁酰胺。MS(m+1)＝333.2,HPLC峰RT＝0.512min
步骤2:将(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-((2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)丁酰胺(6mg,0.018mmol)溶解在THF(2mL)和3N HCl溶液(1mL)中并在rt下搅拌4h。冷却至0℃后，将反应混合物用1N NaOH溶液中和并在真空下浓缩一半体积。将反应混合物通过ISCO RP-C18纯化并冻干，得到(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-氧代-3-((3-氧代丁基)氨基)丙基)丁酰胺(i-12)。MS(m+1)＝289.2,HPLC峰RT＝0.362min,1H-NMR(MeOD,400MHz)δ3.83(s,1H),3.37～4.45(m,3H),3.34(d,2H,J＝7.2Hz),3.32(d,1H,J＝3.2Hz),2.65(t,2H,J＝6.4Hz),2.34(t,2H,J＝6.8Hz),2.10(s,3H),0.87(s,6H).
2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-氧代丁基)丁酰胺(i-13)的合成
步骤1:将氢化铝锂(583mg,15mmol)溶解在THF(100mL)中并冷却至0℃。在0℃下，加入(±)-泛内酯(1g,8mmol)的THF(50mL)溶液并在rt下搅拌4h。向反应混合物中缓慢地加入无水硫酸钠，然后加入EtOAc(50mL)。将反应混合物通过短硅藻土垫过滤并将滤液浓缩。将残留物通过ISCO(5％至20％的MeOH的CH2Cl2溶液)纯化，得到3,3-二甲基丁烷-1,2,4-三醇。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ3.71～3.74(m,1H),3.65(dd,1H,J＝4.8和7.6Hz),3.57(dd,1H,J＝2.4和4.8Hz),3.54(d,1H,J＝7.2Hz),3.48(d,1H,J＝7.2Hz),0.95(s,3H),0.93(s,3H).
步骤2:将3,3-二甲基丁烷-1,2,4-三醇(570mg,4mmol)和1-(二甲氧基甲基)-4-甲氧基苯(1.16g,6mmol)溶解在CH2Cl2(50mL)中，并加入(7,7-二甲基-2-氧代二环[2.2.1]庚烷-1-基)甲磺酸(99mg,0.4mmol)。将反应混合物在rt下搅拌2h并加入三乙胺(0.29mL,2mmol)。浓缩后，将残留物通过ISCO(0％至30％EtOAc的正己烷溶液)纯化，得到2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-1,3-二烷-4-基)甲醇。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ7.44(d,2H,J＝6.0Hz),6.91(d,2H,J＝6.0Hz),5.47(s,1H),3.90(s,1H),3.81(s,3H),3.59～3.70(m,5H),1.14(s,3H),0.84(s,3H).
步骤3:将DMSO(0.27mL,4mmol)溶解在无水CH2Cl2(20mL)中并在-78℃下加入草酰氯(0.25mL,3mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌15min并缓慢地加入2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-1,3-二烷-4-基)甲醇(485mg,2mmol)的无水CH2Cl2(1mL)溶液。将反应混合物在-78℃下搅拌30min并加入三乙胺(1.34mL,10mmol)。将反应混合物升温至rt并搅拌1h。将反应混合物在水(50mL)和CH2Cl2(100mL)之间分配，并将有机层用饱和NaHCO3(50mL)和盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残留物通过ISCO(20％至50％的EtOAc的正己烷溶液)纯化，得到2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-1,3-二烷-4-甲醛.MS(m+1)＝251.2,HPLC峰RT＝1.105min.
步骤4:将2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-1,3-二烷-4-甲醛(289mg,1mmol)溶解在丙酮/CH2Cl2(3:1,20mL)中，并在rt下加入新鲜制备的NaH2PO4.H2O(1593mg,12mmol)和NaCl2O(528mg,6mmol)的水(5mL)溶液。将反应混合物在rt下搅拌30min并浓缩。将残留物通过ISCO(C18)纯化，得到2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-1,3-二烷-4-甲酸MS(m+1)＝267.2,HPLC峰RT＝0.957min.
步骤5:将2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-1,3-二烷-4-甲酸(40mg,0.2mmol)溶解在DMF(3mL)中，并加入HATU(39mg,0.2mmol)和DIEA(0.05mL,0.3mmol)。将反应混合物在rt下搅拌10min并加入2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙胺(40mg,0.3mmol)。将反应混合物在rt下搅拌1h并通过制备HPLC纯化，得到2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-N-(2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-1,3-二烷-4-甲酰胺.MS(m+1)＝380.2,HPLC峰RT＝1.102min,1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ7.44(d,2H,J＝5.6Hz),7.33(bs,1H),6.90(d,2H,J＝5.2Hz),5.46(s,1H),4.08(s,1H),3.82～3.88(m,2H),3.81(s,3H),3.75(m,1H),3.68(dd,2H,J＝7.6and 16.0Hz),3.38(m,2H),1.86(m,4H),1.31(s,3H),1.11(s,3H),1.09(s,3H).
步骤5:将2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-N-(2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-1,3-二烷-4-甲酰胺(10mg,0.03mmol)溶解在3M HCl的MeOH溶液(1mL)中并加入水(0.1mL)。将反应混合物在真空下浓缩并通过ISCO(C18)纯化，得到2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-氧代丁基)丁酰胺(i-13).MS(m+1)＝218.2,HPLC峰RT＝0.400min,1H-NMR(MeOD-d4,400MHz)δ3.84(s,1H),3.31～3.44(m,4H),2.70(t,2H,J＝4.0Hz),2.12(s,3H),0.88(s,3H).
非连接的肽的合成程序
实施例1:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(1)
步骤1:在0℃下，向BocVal-Dil-Dap-OH(1.00g,1.75mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF,20.0mL)溶液中加入N,N-二异丙基乙基胺(DIEA,0.677g,5.25mmol)和1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)(0.731g,1.93mmol)。然后将获得的溶液搅拌5分钟，并在0℃下加入到L-苯基丙氨酸甲酯HCl盐(0.377g,1.75mmol)和DIEA(0.226g,1.75mmol)的DMF(5.0mL)溶液中。将反应混合物升温至室温，另外搅拌30分钟，然后浓缩。将残留物通过反相HPLC采用ISCO系统，C18柱，用20-90％乙腈-水洗脱，纯化获得BocVal-Dil-Dap-PheOMe:MS m/z 733.4(M+1)；保留时间1.47分钟。
步骤2:向步骤1获得的BocVal-Dil-Dap-PheOMe(0.683g,0.932mmol)的甲醇(20mL)溶液中加入HCl(4N在1,4-二氧六环中,16mL)。将反应混合物在室温下搅拌7小时并浓缩。将残留物溶解在二氧六环中并冻干获得Val-Dil-Dap-PheOMe HCl盐:MS m/z 633.4(M+1)；保留时间0.96分钟。
步骤3:在15ml圆底烧瓶中将(1R,3S,4S)-N-Boc-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(12.6mg,0.052mmol)溶解在DMF(1mL)中。加入DIEA(12.3mg,0.095mmol)和HATU(19mg,0.050mmol)。将反应混合物搅拌10分钟并加入Val-Dil-Dap-PheOMe HCl盐(30mg,0.090mmol)的DMF(1.0mL)溶液。将反应混合物搅拌1小时。LCMS分析指示反应完成。将粗品通过反相HPLC采用C18柱，用20-90％乙腈-H2O(含有0.05％三氟乙酸(TFA))洗脱纯化。将含有预期产物的级分集合并浓缩获得(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯:MS m/z 856.6(M+1)；保留时间1.67分钟。
步骤4:将步骤3得到的产物溶解在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中并用TFA(0.5mL)处理。将反应混合物在室温下搅拌1小时。LCMS分析显示反应完全。将反应混合物通过旋转蒸发器浓缩得到为TFA盐的化合物1:MS m/z 756.6(M+1)；保留时间1.22分钟。
实施例2:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(2)
在25mL圆底烧瓶中加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯TFA盐(1)(38.4mg,0.044mmol)、LiOH一水合物(50.0mg,1.19mmol)和MeOH-H2O溶剂混合物(2:1,4.0mL)。将该混合物在室温下搅拌60小时。LC-MS分析指示反应完成。将反应混合物浓缩并通过反相HPLC(C18柱)，用乙腈-H2O(10-70％)(含有0.05％TFA)洗脱纯化。将含有预期产物的级分合并并浓缩得到为TFA盐的化合物2，MS m/z 742.5(M+1).保留时间1.15分钟。
实施例3:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(3)
步骤1:在15ml圆底烧瓶中向Boc-Val-Dil-Dap-OH(20.0mg,0.035mmol)的DMF(1.0mL)溶液中加入DIEA(9.0mg,0.070mmol)，然后加入N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(HBTU)(13.3mg,0.035mmol)。将反应混合物搅拌10分钟后将(1S,2R)-2-氨基-1-苯基丙-1-醇(6.4mg,0.042mmol)的DMF(1.0mL)溶液加入到反应混合物中。将反应搅拌1小时。LCMS分析指示反应完成。将粗品通过反相HPLC(C18柱)，用20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱纯化。将含有预期产物的级分集合并浓缩获得((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯,MS m/z 705.4(M+1).保留时间1.39分钟。
步骤2:向((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(24.7mg,0.035mmol)的DCM(2.0mL)溶液中加入TFA(1.0mL)。将反应混合物在室温下搅拌2小时并浓缩获得(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺(MS m/z 605.4(M+1)保留时间0.96分钟和其TFA酯(MS m/z 701.4(M+1))保留时间1.17分钟的混合物。该混合物不需要进一步纯化即用于下一步骤。
步骤3:向(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(8.4mg,0.035mmol)的DMF(1.0mL)溶液中加入DIEA(0.024ml,0.14mmol)和HBTU(13.3mg,0.035mmol)。将反应混合物搅拌10分钟并加入到步骤2得到的产物混合物(25.2mg,0.035mmol)(含有TFA酯)的DMF(0.5mL)溶液中。将反应混合物在室温下保持18小时，然后将粗品通过反相HPLC(C18柱)，用30-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱纯化。将含有预期产物的级分浓缩获得(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(MS m/z 828.5(M+1))保留时间1.42分钟和其TFA酯(MS m/z924.4(M+1))保留时间1.61分钟的混合物。
步骤4:向步骤3得到的混合物的DCM(1.5mL)溶液中加入TFA(1.0mL)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩获得(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(MS m/z 728.4(M+1)),保留时间0.99分钟和2,2,2-三氟乙酸(1S,2R)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-1-苯基丙基酯(MS m/z 824.5(M+1)),保留时间1.31分钟的混合物。该混合物不需要进一步纯化即用于下一步骤。
步骤5:向步骤4得到的混合物的MeOH-H2O(1:1,3.0mL)溶液中加入LiOH(10.0mg,0.418mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时，然后浓缩至总体积约1mL。将粗混合物通过反相HPLC(C18柱)，用20-35％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱纯化。将含有预期产物的级分集合并浓缩获得化合物3,MS m/z 728.4(M+1).保留时间0.99分钟。
实施例4:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(甲基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(4)
步骤1:将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-苯基丙酸(132.5mg,0.50mmol)溶解在DMF(4mL)中。加入DIEA(0.523mL,3.0mmol)和HATU(475mg,1.25mmol)。15分钟后，加入甲磺酰胺(143mg)，并将反应混合物搅拌2小时。LC/MS分析指示反应完成。产物通过Prep-HPLC(C18柱)，用20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱纯化。将含有预期产物的级分集合并冻干获得白色固体。MS m/z 243.1(M+1).保留时间1.023分钟。将产物溶解在DCM(2mL)中。加入TFA(2mL)并在室温搅拌1小时。LC/MS分析指示反应完成。将脱保护的产物也通过Prep-HPLC纯化，采用10-40％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干获得白色固体。MS m/z 243.1(M+1).保留时间0.403分钟。NMR(400MHz,CD3OD):δ7.41-7.30(m,5H),4.10-4.06(m,1H),3.32-3.25(m,1H),3.19(s,3H),3.12-3.07(m,1H).
步骤2:将Boc-Val-Dil-Dap(65.5mg,0.115mmol)溶解在DMF(2mL)中。加入DIEA(59.2mg,80uL)和HATU(27.7mg,0.099mmol)。10分钟后，加入(S)-2-氨基-N-(甲基磺酰基)-3-苯基丙酰胺(18.5mg,0.076mmol)，并将反应混合物在室温搅拌1小时。LC/MS分析指示反应完成。将产物通过Prep-HPLC(C18柱)纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干获得白色固体。MS m/z 796.4(M+1).保留时间1.388分钟。将产物溶解在HCl的MeOH溶液(3M,3mL)中。缓慢地除去溶剂。LC/MS分析指示反应完成。MS m/z 696.3(M+1).保留时间1.046分钟。
步骤3:将(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(14.23mg,0.059mmol)溶解在DMF(2mL)中。加入DIEA(22.9mg,0.177mmol)和HATU(20.19mg,0.053mmol)。10分钟后，加入来自前面步骤的产物(21.6mg,0.029mmol)，并将反应混合物在室温搅拌2小时。LC/MS分析指示反应完成。将产物通过Prep-HPLC(C18柱)纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干获得白色固体。MSm/z 919.5(M+1).保留时间1.370分钟。将产物溶解在HCl的MeOH溶液(3M,3mL)中。缓慢地除去溶剂。LC/MS分析指示反应完成。MS m/z819.5(M+1).保留时间1.096分钟。
实施例5:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(甲基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(5)
将化合物4(5mg,0.00584mmol)溶解在MeOH(2.0mL)中。加入多聚甲醛(5.97mg,0.199mmol)和乙酸(6.0uL)。加入氰基硼氢化钠(12.5mg,0.199mmol)，并将反应混合物加热至50℃并搅拌1小时。LC/MS分析指示反应完成。将产物通过Prep-HPLC(C18柱)纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干获得白色固体。MS m/z 833.5(M+1).保留时间0.983分钟。
实施例6:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(6)
步骤1:将N-Boc-氨基腈(0.5g,2.03mmol)、叠氮化钠(0.264g,4.06mmol)和溴化锌(0.229g,1.02mmol)溶解在2-丙醇-水溶剂混合物(1:1,60ml)中，并将反应混合物在回流下搅拌16小时。反应完成后，加入5ml 10％柠檬酸和30ml乙酸乙酯，并继续搅拌直到没有固体留下。将水层用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机层用水洗涤，并用无水Na2SO4干燥。除去溶剂，并将残留物通过硅胶柱纯化，采用10％甲醇的DCM溶液洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，再溶解在乙酸乙酯中，用盐水洗涤，干燥并浓缩得到(S)-(2-苯基-1-(2H-四唑-5-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯MS m/z 290.2(M+1).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40–7.24(m,3H),7.22–7.12(m,2H),5.22–5.02(m,2H),3.49–3.24(m,2H),1.40(s,9H).
步骤2:在15ml圆底烧瓶中加入(S)-(2-苯基-1-(2H-四唑-5-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(30mg,0.104mmol)、TFA(2ml)和DCM(4ml)，得到澄清溶液，将其在室温下搅拌1小时。LCMS显示Boc基团被裂解。将溶液浓缩获得粗的为TFA盐的(S)-2-苯基-1-(2H-四唑-5-基)乙胺(M+1 190.2),其没有进一步纯化即用过下一步骤。
步骤3:在15ml圆底烧瓶中加入在DMF(2ml)中的Boc-Val-Dil-Dap-OH(59.3mg,0.104mmol)和DIEA(0.072ml,0.415mmol)，得到澄清溶液。加入HATU(43.4mg,0.114mmol)，然后将反应混合物搅拌5分钟，然后加入在步骤2中获得的(S)-2-苯基-1-(2H-四唑-5-基)乙胺TFA盐(0.104mmol)。将溶液在室温下搅拌72小时。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用10-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯MS m/z 743.5(M+1).保留时间1.325分钟。
步骤4:在15ml圆底烧瓶中加入((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(46mg,0.056mmol)、TFA(2ml)和DCM(4ml)，得到澄清溶液，将其在室温下搅拌1小时。LCMS显示Boc基团被裂解。将溶液浓缩得到粗(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺TFA盐。MS m/z 643.5(M+1).保留时间0.947分钟，其没有进一步纯化即用于下面的步骤。
步骤5:向(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(7.6mg,0.032mmol)的DMF(1ml)溶液中加入DIEA(0.014ml,0.079mmol)和HATU(12mg,0.032mmol)，然后将其加至(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺TFA盐(20mg,0.026mmol)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用30-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到为TFA盐的(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯MS m/z866.6(M+1).保留时间1.407分钟。
步骤6:向(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯TFA盐(10.2mg,0.012mmol)的DCM(2ml)溶液中加入TFA(1ml)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩得到(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(6)，其为TFA盐.MS m/z766.6(M+1).保留时间0.985分钟。
实施例7:((R)-1-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(7)
步骤1:将((R)-1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(100mg,0.313mmol)(按照J.Chem.Soc.Perkin Trans.I 1984,2845中描述的方法合成的)溶解在吡啶(5ml)中，并加入n-BuOH(35mg,0.46mmol)，随后加入新戊酰氯(70mg,0.58mmol)。LCMS指示反应不完全，因此，再加入三份n-BuOH和新戊酰氯，直到所有的所述次膦酸消耗完。然后加入碘(160mg,0.630mmol)在2ml吡啶-H2O(10％水)中的溶液，并将反应混合物搅拌20分钟。LCMS指示反应完全。真空除去吡啶。加入硫代硫酸盐水溶液，并将反应混合物用EtOAc萃取。然后干燥EtOAc层，浓缩并用ISCO(5.5g C18柱)纯化，采用10％-60％乙腈的水(含有0.5％TFA)溶液洗脱，得到((1R)-1-(丁氧基(羟基)磷酰基)-2-苯基乙基)氨基甲酸苄酯，为白色固体。MS m/z 392.1(M+1).保留时间1.179分钟。1H NMR(400MHz,CD3CN)d7.42-7.18(m,8H),7.18-7.00(m,2H),6.10(s,1H),5.07-4.59(m,2H),4.20-4.35(m,1H),4.13-3.93(m,2H),3.15-3.30(m,1H),2.85-2.75(s,1H),1.71-1.47(m,2H),1.47-1.23(m,2H),0.89(t,J＝7.3Hz,3H).
步骤2:向((1R)-1-(丁氧基(羟基)磷酰基)-2-苯基乙基)氨基甲酸苄基酯(84.7mg,0.216mmol)的MeOH(5ml)溶液中加入10％Pd/C(26mg)。连接氢气球，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。通过硅藻土过滤除去催化剂，并将滤液蒸发至干，得到((R)-1-氨基-2-苯基乙基)膦酸丁酯。MS m/z258.1(M+1).保留时间0.789分钟，没有纯化即将其用于下面的步骤。
步骤3:在15mL圆底烧瓶中，加入在DMF(2ml)中的Boc-Val-Dip-Dap-OH(80mg,0.140mmol)和DIEA(62.9mg,0.487mmol)，得到澄清溶液。加入HATU(53mg,0.139mmol)，并将反应混合物搅拌5分钟，然后加入((R)-1-氨基-2-苯基乙基)膦酸丁酯(41.9mg,0.163mmol)。将溶液在室温下搅拌18小时。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用40-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到((2S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((2S)-2-((1R,2R)-3-(((1R)-1-(丁氧基(羟基)磷酰基)-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 811.4(M+1).保留时间1.376分钟。
步骤4:向((2S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((2S)-2-((1R,2R)-3-(((1R)-1-(丁氧基(羟基)磷酰基)-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(106mg,0.131mmol)的DCM(3ml)溶液中加入TFA(1ml)，并将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩。约2/3转化为膦酸(1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸.MS m/z 655.3(M+1).保留时间0.957分钟。另外1/3是(1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸丁酯.MS m/z 711.4(M+1).保留时间1.038分钟。混合物没有分离即用于下面的步骤。
步骤5:向(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(3.8mg,0.016mmol)的DMF(1ml)溶液中加入DIEA(6.1mg,0.047mmol)，然后加入HATU(5.9mg,0.016mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后加至来自步骤4的胺的混合物(12mg,0.016mmol)(主要含有所述膦酸)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将粗品通过采用C18柱,4.5g的ISCO纯化，采用10-70％乙腈的水(含0.05％TFA)溶液洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸MS m/z878.5(M+1).保留时间1.307分钟,和(1R,3S,4S)-3-(((2S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((2S)-2-((1R,2R)-3-(((1R)-1-(丁氧基(羟基)磷酰基)-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯MS m/z 934.5(M+1).保留时间1.447分钟。
步骤6:向((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(11.0mg,0.012mmol)的DCM(2ml)溶液中加入TFA(1ml)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(7).MS m/z 778.4(M+1).保留时间0.973分钟。
实施例8:((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(8)
步骤1:在15mL圆底烧瓶中，加入在DMF(2mL)中的Boc-Val-Dip-Dap-OH(50mg,0.087mmol)和DIEA(33.9mg,0.262mmol)，得到澄清溶液。加入HATU(33.3mg,0.087mmol)，并将反应混合物搅拌5分钟，然后加至((R)-1-氨基-2-苯基乙基)次膦酸(41mg,0.154mmol)(按照J.Chem.Soc.Perkin Trans.I 1984,2845中描述的方法合成的)。将溶液在室温下搅拌18小时。LCMS指示形成希望的产物。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用30-50％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸。MS m/z 739.4(M+1).保留时间1.248分钟。
步骤2:向((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(69.1mg,0.094mmol)的DCM(2ml)溶液中加入TFA(1ml)，并将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(MS m/z 639.3(M+1)；保留时间0.851分钟)其没有进一步纯化即用过下一步骤。
步骤3:向(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(11.3mg,0.047mmol)的DMF(1ml)溶液中加入DIEA(0.033ml,0.188mmol)，然后加入HATU(17.9mg,0.047mmol)。将反应混合物搅拌10分钟，然后加至((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(35.4mg,0.047mmol)的DMF(1ml)溶液中。LCMS指示在10分钟反应完成。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用30-55％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸.MS m/z 862.5(M+1).保留时间1.372分钟。
步骤4:向((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(60mg,0.070mmol)的DCM(2ml)溶液中加入TFA(1ml)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(8).MS m/z 762.5(M+1).保留时间1.220分钟。
实施例9:((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(9)
向((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(8)(20mg,0.023mmol)的MeOH(2ml)溶液中加入多聚甲醛(10mg,0.33mmol)和乙酸(0.019ml,0.333mmol)，随后加入氰基硼氢化钠(20mg,0.32mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1小时，然后在室温搅拌2天。LCMS指示反应完全。将反应混合物通过硅藻土过滤以除去不溶的残留物，并将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用10-50％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(9).MS m/z776.4(M+1).保留时间0.944分钟。
实施例10:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(50)
步骤1:将DIEA(0.013ml,0.075mmol)和HATU(18.5mg,0.049mmol)加到(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(9.8mg,0.040mmol)的DMF(1ml)溶液中。将反应混合物搅拌5min，然后加至Val-Dil-Dap-OH(17.7mg,0.038mmol)的DMF溶液中。将反应在rt下搅拌16h。然后将粗品通过制备型HPLC(30-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸。MS m/z 695.4(M+H).保留时间1.376min.
步骤2:向步骤1得到的产物(5.9mg,0.008mmol)的DMF(1ml)溶液中，加入DIEA(1.1mg,0.008mmol)和HATU(3.8mg,0.010mmol)。将反应搅拌5min后，加入(S)-2-(S)-2-氨基-3-苯基丙-1-醇(1.9mg,0.013mmol)的DMF溶液。将反应在rt下搅拌1h。将粗品通过制备型HPLC(20-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯。MS m/z 828.5(M+H).保留时间1.388min.
步骤3:将步骤2得到的产物(4mg,0.005mmol)的DCM(3ml)溶液在rt下用TFA(1ml)处理1h，然后浓缩得到为TFA盐的化合物(50)。MS m/z728.5(M+H).保留时间1.008min.
实施例11:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(51)
在rt下将(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(50)(6.1mg,0.008mmol)、MeOH(2ml)、乙酸(0.005ml,0.09mmol)、多聚甲醛(3mg,0.1mmol)和氰基硼氢化钠(5mg,0.08mmol)合并，然后在50℃搅拌1h。然后将反应混合物冷却到rt，过滤，并通过制备型HPLC(20-40％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到为TFA盐的化合物(51)。MS m/z 742.5(M+H).保留时间1.008min.
实施例12:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-氨基苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(52)
步骤1:将DIEA(0.105ml,0.60mmol)和HATU(45.5mg,0.12mmol)加到(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(i-7)(57mg,0.12mmol)的DMF(2ml)中。将反应混合物在rt下搅拌5min，然后加入DapOMe(i-9)(28.5mg,0.12mmol)的DMF(1ml)溶液中。将反应混合物在rt下搅拌1h，然后通过制备型HPLC(10-50％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯.MS m/z 623.5(M+H).保留时间1.225min.
步骤2:将LiOH(30mg,1.25mmol)加入到步骤1得到的产物(43.2mg,0.059mmol)的MeOH-H2O(1:1,4ml)溶液中。将反应混合物在rt下搅拌18h，浓缩并用HCl(1N,1ml)酸化。将粗品通过制备型HPLC(10-38％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，获得为TFA盐的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸。MS m/z 609.5(M+H).保留时间0.962min.
步骤3:向步骤2得到的产物(45.7mg,0.063mmol)的DMF(1ml)溶液中加入DIEA(0.055ml,0.32mmol)和HATU(24.0mg,0.063mmol)。将反应混合物在rt下搅拌10min，然后加至(S)-(3-(2-氨基-3-羟基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯TFA盐(i-4)(24.1mg,0.063mmol)的DMF(1ml)溶液中。将反应混合物在rt下搅拌1h，然后浓缩。将粗品通过制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到为TFA盐的(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-羟基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 857.5(M+H).保留时间1.145min.
步骤4:将步骤3得到的产物(61.4mg,0.063mmol)的乙腈-水(1:1,4ml)(含有5％HCl)溶液在rt下搅拌24h。然后将反应混合物浓缩，并通过制备型HPLC(10-30％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到为TFA盐的化合物(52)。MS m/z 757.5(M+H).保留时间0.744min.
实施例13:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(53)
向(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯TFA盐(1)(55.4mg,0.064mmol)的MeOH(5ml)溶液中，加入乙酸(0.009ml,0.2mmol)、多聚甲醛(24mg,0.79mmol)，然后加入氰基硼氢化钠(25mg,0.40mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌16h，过滤，浓缩并通过制备型HPLC(10-45％乙腈-水，含有0.05％TFA)纯化，得到为TFA盐的化合物(53)。MS m/z 770.3(M+H).保留时间1.100min.
实施例14:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(9d)
将化合物(53)TFA盐(50.8mg,0.057mmol)溶解在MeOH-H2O(1:1,5ml)中，并加入LiOH(20mg,0.835mmol)。将反应在40℃下搅拌1h。通过蒸发除去MeOH。将水加入到残留物中，并用AcOH(0.040ml)酸化。将粗品通过制备型HPLC(27-33％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到为TFA盐的化合物(54)。MS m/z 756.5(M+H).保留时间0.985min.
实施例15:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(55)
将DIEA(10.2mg,0.014ml)和HATU(7.7mg,0.020mmol)加到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸TFA盐(步骤2,实施例12)(12.3mg,0.017mmol)的DMF(1ml)溶液中。将反应搅拌15min，然后加入(S)-2-氨基-3-苯基丙烷-1-磺酰胺(4.3mg,0.020mmol)的DMF(0.5ml)溶液中。将反应在rt下再搅拌1h。将粗品通过制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)纯化，得到化合物(55)。MS m/z 805.5(M+1).保留时间0.965min.
实施例16:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(56)
步骤1:向Boc-Dap-OH(21.6mg,0.075mmol)的DMF(2ml)溶液中加入DIEA(48.5mg,0.066ml)和HATU(26.2mg,0.069mmol)。将反应搅拌15min，然后加入(S)-2-氨基-3-苯基丙烷-1-磺酰胺(13.4mg,0.063mmol)。将反应混合物在rt下搅拌2h，然后通过制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到(S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。MS m/z 484.2(M+1).保留时间1.130min.
步骤2:(S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(28.5mg,0.059mmol)溶解在HCl甲醇溶液(3M,3ml)中。在N2气流下缓慢除去溶剂，随后在减压下过夜，得到(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰胺，为HCl盐。MS m/z 384.2(M+1).保留时间0.630min.
步骤3:向Cbz-Val-Dil-OH(28.7mg,0.066mmol)的DMF(1ml)溶液中加入DIEA(0.048ml)和HATU(22.9mg,0.060mmol)。将反应搅拌15min，然后加入(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰胺(23mg,0.055mmol)的DMF(1ml)溶液。将反应混合物在rt下搅拌2h，并通过制备型HPLC纯化(20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))，得到((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸苄基酯。MSm/z 802.4(M+1).保留时间1.298min.
步骤4:将步骤3得到的产物(24.6mg,0.031mmol)、10％Pd-C(32.7mg)和EtOAc(3ml)合并，并在氢气下在rt搅拌8h。将反应混合物过滤并浓缩，得到(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺.MS m/z 668.4(M+1).保留时间0.888min.
步骤5:(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(7.0mg,0.029mmol)、DMF(1ml),DIEA(0.021ml)和HATU(10.1mg,0.027mmol)合并，并在rt下搅拌15min，然后加入步骤4得到的产物(16.2mg,0.024mmol)的DMF(1ml)溶液。将反应混合物在rt下搅拌2h，并通过制备型HPLC纯化(30-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))，得到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯.MS m/z 891.5(M+1).保留时间1.319min.
步骤6:将步骤5得到的产物(13.2mg,0.015mmol)溶解在HCl甲醇溶液(3M,3ml)中。在N2流下缓慢除去溶剂，随后在减压下过夜，得到(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(56)，为HCl盐。MS m/z 791.5(M+1).保留时间0.923min.
实施例17:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(57)
将DIEA(33mg,0.26mmol)和HATU(19mg,0.051mmol)加入到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(40mg,0.043mmol)的DMF(2ml)溶液中。将反应在rt下搅拌15min，然后加入(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙胺(22.4mg,0.085mmol)。将反应在rt下搅拌1h。将粗品通过制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯。MS m/z 940.5(M+1).保留时间1.333min.将该产物(13.9mg,0.015mmol)溶解在HCl甲醇溶液(3M,3ml)中。在N2流缓慢除去溶剂，然后在减压下过夜，得到化合物(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(57)，为HCl盐。MS m/z 840.5(M+1).保留时间0.936min.
实施例18:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-3-苯基丙-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(58)
通过对化合物(57)所述的方法，使用(S)-1-甲氧基-3-苯基丙-2-胺HCl盐代替(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙胺，制备化合物(58)。MS m/z742.5(M+1).保留时间0.997min.
实施例19:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-吡唑-3-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(59)
通过对化合物(57)所述的方法，使用(S)-2-苯基-1-(1H-吡唑-3-基)乙胺HCl盐代替(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙胺，制备化合物(59)。MS m/z 764.5(M+1).保留时间0.959min.
实施例20:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(60)，和(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((R)-2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(61)
通过对化合物(57)所述的方法，使用2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙胺代替(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙胺，制备化合物(60)和(61)。在制备型HPLC(30-65％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))上分离Boc保护的(60)和(61)。从Boc保护的(60)和(61)除去Boc基团，得到((1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(60)和(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((R)-2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(61)，其各自为HCl盐。MS m/z776.5(M+1).保留时间1.001min(60)和1.016min(61).
实施例21:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(5-苯基-1,3,4-二唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(62)
以对化合物(57)描述的方法，在步骤1中使用(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1,3,4-二唑-2-基)乙胺代替(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙胺，制备化合物(62)。除去Boc基团后，获得化合物(62)，其为HCl盐。MS m/z842.5(M+1).保留时间1.112min.
实施例22:(1R,3S,4S)-2-(氰基甲基)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(63)
步骤1:将DIEA(104mg,0.80mmol)和HATU(122mg,0.32mmol)加至(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(78mg,0.32mmol)的DMF(3ml)溶液中。将反应混合物在rt下搅拌5min，然后加至Val-Dil-Dap-OMe(130mg,0.27mmol)的DMF(2ml)溶液中。然后将反应混合物在rt下搅拌1h并浓缩。将饱和碳酸氢钠溶液(5ml)加入到残留物中，并将产物用DCM萃取(10ml X 3)。将有机层合并，干燥并浓缩得到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯。该产物不需要进一步纯化即用于下一步骤MS m/z710.5(M+H)。保留时间1.440min.
步骤2:将步骤1得到的产物(190mg,0.27mmol)的DCM(10ml)溶液用TFA(2ml)在rt下处理3h，然后浓缩得到为TFA盐的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯。MS m/z 610.5(M+H).保留时间1.003min.该产物不需要进一步纯化即用于下一步骤。
步骤3:向步骤2得到的产物(193mg,0.27mmol)的MeOH(10ml)溶液中加入乙酸(0.015ml,0.27mmol)、多聚甲醛(40mg,1.3mmol)和氰基硼氢化钠(84mg,1.4mmol)。将反应在50℃下搅拌16h。LCMS指示大约90％转化为氰甲基化的化合物，且约10％转化为甲基化的化合物。将反应混合物过滤，并通过制备型HPLC纯化(20-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))。收集含有氰基加合物的级分并浓缩得到为TFA盐的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(氰基甲基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯。MS m/z648.5(M+H).保留时间1.261min.
步骤4:向步骤3中获得的产物(0.12g,0.16mmol)的MeOH-H2O(1:1 5ml)溶液中加入LiOH(50mg,2.09mmol)。将反应混合物在rt下搅拌16h，然后用0.2ml 10％HCl酸化。将氰基基团部分水解，以除了氰基甲基产物外，形成氨基甲酰基甲基化的产物。将反应浓缩并通过制备型HPLC(20-50％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))将两种产物分离，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(氰基甲基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸,MS m/z 634.4(M+H),保留时间1.138min,和(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(2-氨基-2-氧代乙基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸，其为TFA盐。MS m/z652.4(M+H).保留时间0.888min.
步骤5:向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(氰基甲基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸TFA盐(6mg,0.008mmol)的DMF溶液中加入DIEA(3.1mg,0.024mmol)和HATU(3.7mg,0.0096mmol)。将反应在rt下搅拌5min，然后加入(S)-2-氨基-3-苯基丙-1-醇(2.4mg,0.016mmol)。将反应在rt下搅拌1h。将粗品通过制备型HPLC(10-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到为TFA盐的化合物(63)。MS m/z767.5(M+H).保留时间1.189min.
实施例23:(1R,3S,4S)-2-(2-氨基-2-氧代乙基)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(64)
向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(2-氨基-2-氧代乙基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸TFA盐(步骤4,实施例22)(6.1mg,0.008mmol)的DMF溶液中加入DIEA(3.1mg,0.024mmol)和HATU(3.7mg,0.0096mmol)。将反应在rt下搅拌5min，然后加入(S)-2-氨基-3-苯基丙-1-醇(2.4mg,0.016mmol)。将反应在rt下搅拌1h。将粗品通过制备型HPLC(10-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到为TFA盐的化合物(64)。MS m/z 785.5(M+H).保留时间0.951min.
实施例24:(1R,3S,4S)-2-乙酰基-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(65)
步骤1:向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(步骤2,实施例63)(13mg,0.021mmol)TFA盐的DCM(2ml)溶液中加入DIEA(0.014ml,0.082mmol)和乙酸酐(0.0039ml,0.041mmol)。将反应在rt下搅拌1h。加入Na2CO3水溶液(2M)，并将反应混合物用DCM萃取(5ml X 3)。将有机层合并，用Na2SO4干燥，过滤，然后浓缩，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-乙酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯。该产物不需要进一步纯化即用于下一步骤MS m/z 651.5(M+H).保留时间1.188min.
步骤2:向步骤1得到的产物的MeOH:H2O(1:1 2ml)溶液中加入LiOH(10mg,0.42mmol)。将反应在rt下搅拌16h。将反应混合物浓缩，并加入0.040ml HOAc。将粗品通过制备型HPLC(10-50％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-乙酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸。MS m/z637.4(M+H).保留时间1.158min.
步骤3:向步骤2得到的产物(5mg,0.008mmol)的DMF(1ml)溶液中加入DIEA(2.7mg,0.021mmol)和HATU(3.9mg,0.010mmol)。将反应在rt下搅拌5min，然后加入(S)-2-氨基-3-苯基丙-1-醇(1.6mg,0.010mmol)。将反应在rt下搅拌1h，然后将粗品通过制备型HPLC(10-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到化合物(65).MS m/z 770.5(M+H).保留时间1.121min.
实施例25:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(66)
将DIEA(0.0097ml)和HATU(3.2mg,0.0083mmol)加到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸TFA盐(步骤2,实施例12)、4.0mg,0.0055mmol)的DMF(0.5ml)溶液中。将反应在rt搅拌15min，并加入(S)-2-苯基-1-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)乙胺(2.9mg,0.011mmol)的DMF(0.5ml)溶液。将反应混合物在rt下搅拌2h，然后通过制备型HPLC纯化(20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))，得到(66).MS m/z 854.5(M+1).保留时间0.980min.
实施例26:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-3-苯基丙-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(67)
通过对化合物(66)描述的方法，使用(S)-1-甲氧基-3-苯基丙-2-胺HCl盐代替(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙胺，获得化合物(67)。MS m/z756.5(M+1).保留时间1.046min.
实施例27:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-吡唑-3-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[221]庚烷-3-甲酰胺(68)
通过对化合物(66)描述的方法，使用(S)-2-苯基-1-(1H-吡唑-3-基)乙胺HCl盐代替(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙胺，获得化合物(68)。MS m/z 778.5(M+1).保留时间0.998min.
实施例28:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(69)和(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((R)-2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(70)
通过对化合物(66)描述的方法，使用2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙胺代替(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙胺，在用制备型HPLC分离(30-55％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))两种非对映异构体后，获得化合物(69)和(70)。MS m/z 790.5(M+1).对于(69)和(70)保留时间分别是1.016min和1.043min。
实施例29:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(5-苯基-1,3,4-二唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(71)
通过对化合物(66)描述的方法，使用(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1,3,4-二唑-2-基)乙胺代替(S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙胺，获得化合物(71)。MS m/z 856.5(M+1).保留时间1.120min.
实施例30:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-氨基苯基)-3-甲氧基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(72)
将DIEA(0.012ml,0.069mmol)和HATU(7.89mg,0.021mmol)加到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(步骤2,实施例12)(10mg,0.014mmol)的DMF(2ml)溶液中。将反应在rt下搅拌5min，然后加入(S)-(3-(2-氨基-3-甲氧基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯TFA盐(10.9mg,0.028mmol)。将反应在rt下搅拌1h，然后将粗品通过制备型HPLC(20-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到为TFA盐的(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-甲氧基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯。MSm/z 871.5(M+H).保留时间1.157min.向该产物(13.6mg,0.014mmol)的乙腈(2ml)溶液中加入10％盐酸(2ml)。将反应混合物在rt下搅拌2h，然后浓缩得到(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-氨基苯基)-3-甲氧基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(72)，其为HCl盐。MS m/z 771.5(M+H).保留时间0.883min.
实施例31:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(4-氨基苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(73)
通过对化合物(72)所述的方法，使用(S)-(4-(2-氨基-3-羟基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯TFA盐代替(S)-(3-(2-氨基-3-甲氧基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯TFA盐，制备化合物(73)。MS m/z 757.5(M+H).保留时间0.787min.
实施例32:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(74)
将DIEA(0.006ml,0.035mmol)和HATU(4.0mg,0.010mmol)加到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(5mg,0.007mmol)的DMF(1ml)溶液中。将反应在rt下搅拌5min，然后加入(1S,2R)-(+)-去甲麻黄碱(3mg,0.02mmol)。将反应混合物在rt下搅拌1h，然后通过制备型HPLC纯化(20-50％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))。合并含有预期产物的级分，并加入10％盐酸。浓缩得到化合物(74)，为HCl盐。MS m/z 742.5(M+H).保留时间1.005min.
N-端连接的式(I)化合物实施例的合成程序
实施例33:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(10)
在15ml圆底烧瓶中，向6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(EMCA)(1.2mg,0.0058mmol)的DMF(1.0mL)溶液中加入DIEA(3.0mg,0.023mmol)，随后加入HATU(2.7mg,0.0070mmol)。将反应混合物搅拌10分钟，然后将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸TFA盐(2)(5.0mg,0.0058mmol)的DMF(1.0mL)溶液加入到反应混合物中。将反应混合物搅拌1小时。LCMS分析指示反应完成。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用20-80％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。浓缩含有产物的级分，得到化合物10,MS m/z 935.6(M+1).保留时间1.17分钟。
实施例34:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(11)
步骤1:向100mL圆底烧瓶中加入在饱和NaHCO3水溶液(12.0mL)中的6-氨基-1-己醇(1.00g,6.44mmol)。将混合物在0℃下冷却，并加入N-甲氧基羰基马来酰亚胺(0.750g,6.44mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1.5小时。然后将反应混合物在0℃下用2M HCl酸化至pH1。将酸化的反应混合物用乙酸乙酯(AcOEt)萃取。将有机层浓缩。将残留物溶解在DCM中，上载到硅胶柱上，并采用MeOH/DCM(0-4％)洗脱，得到1-(6-羟基己基)-1H-吡咯-2,5-二酮，为白色固体,MS m/z 198.2(M+1).1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.68(s,2H),3.63(t,d＝6.4Hz,2H),3.52(t,d＝7.2Hz,2H),1.63-1.52(m,4H),1.43-1.28(m,4H).
步骤2:向1-(6-羟基己基)-1H-吡咯-2,5-二酮(237mg,1.20mmol)的DCM(10.0mL)溶液中加入Dess-Martin试剂(618mg,1.44mmol)。在室温1小时后，将反应混合物用DCM(10mL)稀释并过滤。将滤液浓缩并通过ISCO(硅胶,EtOAc/己烷0-20％)纯化，得到6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己醛，为无色油状物,MS m/z 196.2(M+1).1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.76(t,J＝1.6Hz,1H),6.69(s,2H),3.52(t,J＝7.2Hz,2H),2.43(td,J＝7.2Hz,1.6Hz,2H),1.70-1.56(m,4H),1.36-1.28(m,2H).
步骤3:将化合物2(5.0mg,0.0067mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己醛(6.6mg,0.034mmol)溶解在MeOH(1.0mL)中。加入氰基硼氢化钠(4.2mg,0.067mmol)。将反应混合物在室温搅拌3小时。LCMS分析指示反应完成。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分收集并冻干得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸11,MS m/z 921.6(M+1).保留时间1.07分钟。
实施例35:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(12)
在15mL圆底烧瓶中，在室温加入MC-Val-Cit-PABC-PNP(5.2mg,0.0070mmol)、(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸TFA盐(2)(5.0mg,0.0058mmol)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAT)(0.6mg,0.005mmol)，然后加入吡啶-DMF(1:4,1.25mL)。向得到的溶液中加入DIEA(2.3mg,0.018mmol)。将反应混合物搅拌72小时，此时化合物2消耗掉。将反应混合物混合物浓缩，并将残留物通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用20-80％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到化合物12,MS m/z 1340.7(M+1).保留时间1.15分钟。
实施例36:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(13)
步骤1:向3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酸(6.6mg,0.033mmol)的DMF(2ml)溶液中加入DIEA(0.011mL,0.065mmol)和HATU(10.3mg,0.027mmol)。15分钟后，加入化合物1(8.2mg,0.010mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。LCMS分析指示反应完成。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯,(MS m/z 941.3(M+1).保留时间1.30分钟。
步骤2:将步骤1的酯产物溶解在乙腈(0.3mL)和H2O(0.2mL)中。加入NaOH水溶液(1.0N,0.15mL)。将反应混合物搅拌30分钟。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分收集并冻干得到化合物13(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸,MS m/z927.5(M+1).保留时间1.21分钟。
实施例37:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(2-(2-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(14)
将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(13)(5.4mg,0.058mmol)、1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1.6mg,0.012mmol)和CuSO4(0.7mg,0.005mmol)的DMF(1.2mL)和H2O(0.3mL)溶液用L-抗坏血酸钠盐(2.6mg,0.015mmol)处理，并在室温搅拌2小时。LCMS分析显示反应完全。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(2-(2-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸14,MS m/z 1062.5(M+1).保留时间1.15分钟。
实施例38:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-(((2-(2-(2-(乙烯基磺酰基)乙氧基)乙氧基)乙基)磺酰基)乙基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(15)
步骤1:将t-BuOK(119mg,1.10mmol)加入到二乙烯基砜(1.60g,13.5mmol)和乙二醇(330mg,5.32mmol)的THF(100mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌18小时。在减压下除去溶剂，得到粗品，将其通过硅胶柱色谱法(EtOAc-己烷2:1-3:1)纯化，得到((2-(2-(2-乙烯基磺酰基乙氧基)乙氧基)乙基)磺酰基)乙烯，为无色浆状物。1H NMR(400MHz,CDCl3)d6.75(dd,J＝9.9Hz,16.6Hz,2H),6.39(d,J＝16.6Hz,2H),6.09(d,J＝9.9Hz,2H),3.88(t,J＝5.7Hz,4H),3.61(s,4H),3.24(t,J＝5.7Hz,4H).
步骤2:向((2-(2-(2-乙烯基磺酰基乙氧基)乙氧基)乙基)磺酰基)乙烯(13.3mg,0.045mmol)的DCM-i-PrOH(2:1)溶液中加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸TFA盐(2)(10.0mg,0.012mmol)和DIEA(0.0020mL,0.012mmol)。将反应混合物加热至80℃反应18小时，此时LCMS分析指示反应完成70-80％。将反应混合物浓缩，并将残留物通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用10-50％乙腈-H2O,(含有0.05％TFA)洗脱。收集含有预期产物的级分，并浓缩得到化合物15，为TFA盐,MS m/z 1040.4(M+1).保留时间1.03分钟。
实施例39:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(甲基(2-(乙烯基磺酰基)乙基)氨基)丙酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(16)
步骤1:向3-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酸(5.4mg,0.027mmol)的DMF(1.0mL)溶液中加入DIEA(0.0070mL,0.040mmol)和HATU(9.1mg,0.024mmol)。将反应混合物搅拌5分钟，加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸TFA盐(2)(11.4mg,0.013mmol)。通过LCMS分析判断，反应在1小时内完成。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用10-70％乙腈-H2O,(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并浓缩得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(3-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸,MS m/z 927.5(M+1).保留时间1.28分钟。
步骤2:向步骤1得到的产物(6.4mg,0.0069mmol)的DCM(2.0mL)溶液中加入TFA(1.0mL)。将反应混合物在室温下搅拌1小时并浓缩得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(甲基氨基)丙酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸TFA盐。MS m/z 827.4(M+1).保留时间0.99分钟。该产物没有进一步纯化即用于下面的步骤。
步骤3:向步骤2中获得的产物TFA盐(6.5mg,0.0069mmol)的i-PrOH(2.0mL)溶液中加入二乙烯基砜(20.0mg,0.169mmol)和DIEA(0.010mL,0.057mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌1小时，此时通过LCMS分析判断，反应完全，并将反应混合物浓缩。将残留物通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用10-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并浓缩得到化合物16,MS m/z 945.4(M+1).保留时间0.99分钟。
实施例40:(1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(17)
使用对化合物(4)(在实施例4中)所述相同的方法，由EMCA(5.5mg,0.026mmol)、DIEA(10.0mg,0.078mmol)、HBTU(9.8mg,0.026mmol)和(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺TFA盐(3)(21.8mg,0.026mmol)合成该化合物。通过反相HPLC纯化后获得化合物17,MS m/z 921.5(M+1).保留时间1.25分钟。
实施例41:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-巯基己基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(18)
步骤1:向硫代乙酸S-(6-氧代己基)酯(4.28mg,0.025mmol)和(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸TFA盐(2)(7.0mg,0.0082mmol)的MeOH(2.0ml)溶液中加入乙酸(0.0050mL,0.083mmol)和氰基硼氢化钠(2.57mg,0.041mmol)。将反应混合物在50℃下加热2小时，并将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分合并，并浓缩，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(乙酰硫基)己基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸,MS m/z900.5(M+1),保留时间1.17分钟。
步骤2:将步骤1得到的产物溶解在MeOH-H2O(2:1,3.0mL)中。向该溶液中加入氢氧化锂(5.0mg,0.21mmol)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，然后浓缩至大约1.5mL。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用20-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分收集并浓缩得到化合物18,MS m/z 858.5(M+1).保留时间1.16分钟。
实施例42:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(3-氨基-4-甲酰基苯氧基)己基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(19)
步骤1:向2-硝基-4-((6-氧代己基)氧基)苯甲醛(20.1mg,0.076mmol)和(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(1)(16.5mg,0.019mmol)的DMF(2.0mL)溶液中加入乙酸(0.0076mL,0.13mmol)和氰基硼氢化钠(11.9mg,0.190mmol)。将反应混合物在50℃下加热2小时，并将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有期望的醛(MS m/z 1005.5(M+1),保留时间1.27分钟)和期望的醇(MS m/z 1007.5(M+1),保留时间1.21分钟)中间体的级分合并并浓缩，用于下一步骤。
步骤2:将获自步骤1的含有所述醛和醇的混合物溶解在中DCM(2.0mL)中，并加入Dess-Martin氧化剂(Dess-Martin periodinane)(4.0mg,0.0095mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。然后将反应混合物用Na2S2O3水溶液洗涤并用DCM萃取。将DCM层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合，并浓缩得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(4-甲酰基-3-硝基苯氧基)己基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯TFA盐,MS m/z 1005.5(M+1).保留时间1.27分钟。产物还含有一些水解的酸，MS m/z 991.5(M+1).保留时间1.22分钟。
步骤3:向步骤2得到的产物(16.9mg,0.015mmol)在70％EtOH水溶液中的溶液中加入铁粉(0.8mg,0.02mmol)和HCl(0.1N,0.15mL,0.015mmol)。将反应混合物在室温剧烈搅拌18小时。形成棕色沉淀。将混合物通过硅藻土塞过滤，并将滤液浓缩。将粗品通过ISCO(C18柱)纯化，采用30-100％乙腈-H2O洗脱。将含有预期产物的级分集合并浓缩得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(3-氨基-4-甲酰基苯氧基)己基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯,MS m/z 975.5(M+1).保留时间1.23分钟。
步骤4:向步骤3得到的产物(4.6mg,0.0047mmol)的MeOH-H2O(1.5:1,2.5mL)溶液中加入氢氧化锂(10.0mg,0.435mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物浓缩到约50％体积，并用1N HCl酸化至pH 5。将粗品通过ISCO(C18柱)纯化，采用30-75％乙腈-H2O洗脱。将含有预期产物的级分集合，用0.3mg LiOH中和，并冻干，得到化合物19,MSm/z961.5(M+1).保留时间1.15分钟。
实施例43:
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸的辅酶A加合物(20)
向辅酶A(CoA)三锂盐(7.6mg,0.0096mmol)在100mM含有5mM EDTA的磷酸盐缓冲液(pH7.5)中的溶液中加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(17)(9.0mg,0.0096mmol)的DMSO(0.048mL)溶液。将反应混合物在室温放置1小时，此时通过LCMS分析判断，反应完全。将样品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用20-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并浓缩得到CoA加合物20,MS m/z 852(M/2+1))。保留时间0.98分钟。
实施例44:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2-溴乙酰氨基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(21)
步骤1:向6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸(12mg,0.051mmol)的DMF(2.0mL)溶液中加入DIEA(18mg,0.14mmol)和HATU(18mg,0.047mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(2)(40mg,0.047mmol)。在半小时内反应完全。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分收集并浓缩得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸,MS m/z 955.5(M+1).保留时间1.32分钟。
步骤2:向步骤1得到的化合物(15.6mg,0.016mmol)的DCM(2.0mL)溶液中加入TFA(1.0mL)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟并浓缩得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-氨基己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸TFA盐,MS m/z 855.5(M+1).保留时间1.01分钟。
步骤3:将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-氨基己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸TFA盐(20mg,0.021mmol)溶解在DCM中，并用DIEA(12mg,0.093mmol)处理。将反应混合物冷却至0℃。然后在搅拌下向反应混合物中加入2-溴乙酰溴(9.0mg,0.045mmol)的DCM(0.2mL)溶液。将反应混合物在0℃下搅拌10min，LCMS分析显示所述胺原料被消耗。加入饱和NaHCO3水溶液猝灭反应。将反应混合物用DCM萃取(5mL X 3)。将有机层合并并浓缩。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用30-45％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。收集级分并浓缩得到化合物21,MSm/z 975.3(M+1).保留时间1.19分钟。
实施例45:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(氨基氧基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(22)
步骤1:向6-(((1-乙氧基亚乙基)氨基)氧基)己酸锂(6.3mg,0.028mmol)的DMF(1.0mL)溶液中加入HATU(8.9mg,0.023mmol)。将反应混合物在室温下搅拌20分钟，然后将整个反应混合物加入到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯TFA盐(1)(20mg,0.021mmol)和DIEA(6.0mg,0.047mmol)的DMF(1.0mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，将反应混合物通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用40-80％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并浓缩。LCMS分析显示在烷氧基胺部分上的保护基团被除去，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(氨基氧基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯的TFA盐,MS m/z 885.5(M+1).保留时间1.10分钟。
步骤2:向步骤1得到的化合物(24.3mg,0.023mmol)的MeOH-H2O(1:1,2.0mL)溶液中加入氢氧化锂(20mg,0.84mmol)。通过LCMS监测反应。一旦完成，将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用20-40％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到化合物22TFA盐,MS m/z 871.5(M+1).保留时间1.03分钟。
实施例46:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-((S)-氮丙啶-2-甲酰氨基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(23)
步骤1:在7mL小瓶中，将6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸(16mg,0.069mmol)溶解在无水DMF(2mL)中。加入DIEA(0.036mL,0.21mmol)和HATU(24mg,0.062mmol)。将反应混合物搅拌10分钟，然后加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(1,HCl盐,30mg,0.034mmol)。将反应混合物在室温再搅拌2小时。LCMS指示反应完成。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％ACN-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯。MS m/z969.6(M+1).保留时间1.42分钟。将如此获得的产物(21mg,0.022mmol)溶解在HCl的MeOH溶液(3M,2mL)中。在减压下缓慢除去溶剂。残留物的LCMS分析指示Boc基团完全除去。将残留物溶取在乙腈和水中，并冻干得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-氨基己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯，为HCl盐。MS m/z 869.5(M+1).保留时间1.01分钟。
步骤2:将来自前面步骤的产物(10mg,0.012mmol)溶解在THF(0.8mL)、MeOH(0.1mL)和H2O(0.1mL)中。加入氢氧化锂一水合物(4.83mg,0.115mmol)。将反应混合物在室温搅拌4小时。LCMS指示反应完成。在减压下移除溶剂。将残留物使用0.1N盐酸中和，溶取在乙腈和H2O中，并冻干得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-氨基己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸，其含有一些LiCl。MS m/z 855.6(M+1).保留时间0.98分钟。
步骤3:在7mL小瓶中，将(S)-1-三苯甲基氮丙啶-2-甲酸(7.6mg,0.023mmol)溶解在无水DMF(2mL)中。加入DIEA(0.010mL,0.021mmol)和HATU(7.9mg,0.021mmol)。将反应混合物搅拌10分钟，然后加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-氨基己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(10mg,0.012mmol)。将反应混合物在室温下再搅拌2小时。LCMS指示反应完成。在减压下除去溶剂。将粗品通过使用C18aq柱(5.5g)的反相ISCO纯化，采用10-100％乙腈-H2O洗脱。将含有预期产物的级分集合，并冻干得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-(6-((S)-1-三苯甲基氮丙啶-2-甲酰氨基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸。MS m/z 1166.5(M+1).保留时间1.49分钟。
步骤4:将来自步骤3的产物(4.0mg,0.0034mmol)溶解在MeOH/CHCl3(1:1,1mL)中并冷却至0℃。滴加加入TFA(0.0040mL,0.051mmol)。将反应混合物升温至室温并搅拌1小时。LCMS指示反应完成大约60％。再加入TFA(0.0040mL,0.051mmol)。再在室温1小时后，LCMS指示反应完成。在减压下蒸发溶剂。将残留物溶解在MeOH中，并通过使用C18aq柱(5.5g)的反相ISCO纯化，采用10-100％乙腈-H2O洗脱。将含有预期产物的级分集合，并冻干得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-((S)-氮丙啶-2-甲酰氨基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(23).MSm/z 924.6(M+1).保留时间1.012分钟。
实施例47:S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(4-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(24)
步骤1:向4-溴丁酸乙酯(3.4g,0.0174mol)的DMF(100mL)溶液中加入叠氮化钠(1.7g,0.0262mol)。将混合物加热至80℃并搅拌过夜。将反应混合物用水稀释并用乙醚提取3次。将有机相用水洗涤3次，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到粗产物，其没有进一步纯化直接用于下一步骤中。
步骤2:将4-叠氮基丁酸乙酯(157mg,1.0mmol)溶解在THF(4mL)、MeOH(0.5mL)和水(0.5mL)中。然后加入LiOH.H2O(168mg,4.0mmol)，并将反应混合物在室温搅拌2小时。LCMS指示反应完成。将反应停止，使用1N HCl将pH调节至2-3，并将反应混合物用EtOAc萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥，浓缩，得到粗产物，其没有进一步纯化直接用于下一步骤。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ3.36(t,J＝6.8Hz,2H),2.39(t,J＝7.2Hz,2H),1.89-1.82(m,2H).
步骤3:将4-叠氮基丁酸(19mg,0.147mmol)、1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(39.8mg,0.294mmol)和CuSO4(17.62mg,0.11mmol)的DMF(3.0mL)和H2O(0.75mL)溶液用L-抗坏血酸钠盐(72.9mg,0.368mmol)处理并在室温搅拌2小时。将反应混合物通过Prep-HPLC(C18柱)纯化，采用20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到白色固体。MS m/z 265.1(M+1).保留时间0.642分钟。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.94(s,1H),6.86(s,2H),4.77(s,2H),4.43(t,J＝7.0Hz,2H),2.31(t,J＝7.2Hz,2H),2.17-2.13(m,2H).
步骤4:将4-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酸(4.5mg,0.017mmol)溶解在DMF(1mL)中。加入DIEA(9.9uL,0.057mmol)和HATU(5.61mg,0.015mmol)，并将混合物搅拌10分钟，然后加入2(9.72mg,0.011mmol)。然后将反应混合物在室温搅拌1小时。LC/MS分析指示反应完成。将产物通过Prep-HPLC(C18柱)纯化，采用20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物24的级分收集并冻干得到白色固体。MS m/z 988.5.1(M+1).保留时间1.074分钟。
实施例48:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(甲基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(25)
将EMCA(4.1mg,0.019mmol)溶解在DMF(2mL)中。加入DIEA(8.31mg,0.064mmol)和HATU(5.87mg,0.015mmol)，并在10分钟后，加入化合物4(11mg,0.013mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。LC/MS分析指示反应完成。将产物通过Prep-HPLC(C18柱)纯化，采用30-50％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干，得到预期产物25，为白色固体.MS m/z 1012.5(M+1).保留时间1.222分钟。
实施例49:(1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(26)
向EMCA(2.5mg,0.012mmol)的DMF(1ml)溶液中加入DIEA(6.2ul,0.035mmol)，然后加入HATU(4.5mg,0.012mmol)。将反应混合物搅拌5分钟，然后加至(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺TFA盐(6.7mg,0.0076mmol)中。将反应混合物在室温下保持1小时，并将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用20-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到化合物26MS m/z 959.5(M+1).保留时间1.220分钟。
实施例50:
((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(27)
向EMCA(3.3mg,0.016mmol)的DMF(1ml)溶液中加入DIEA(2.7ul,0.016mmol)，然后加入HATU(5.93mg,0.016mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后加至((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸7(10mg,0.011mmol)的DMF溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用30-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸27.MS m/z 971.5(M+1).保留时间1.181分钟。
实施例51:
((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(28)
向EMCA(2.4mg,0.011mmol)的DMF(1ml)溶液中加入DIEA(6.6ul,0.038mmol)和HATU(4.0mg,10.42μmol)。将反应混合物搅拌5分钟，然后加至((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸8(8.3mg,0.0095mmol)的DMF(1mL)溶液中。反应混合物在10分钟完成。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用30-55％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸28.MS m/z 955.5(M+1).保留时间1.151分钟。
实施例52:
((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸丁基酯(29)
向((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸8(4.2mg,0.0044mmol)的吡啶(1ml)溶液中加入n-BuOH(3.3mg,0.044mmol)，然后加入新戊酰氯(5.3mg,0.044mmol)。通过LCMS监测反应，直到所有的膦酸转化为酯。然后加入新制备的碘(11mg,0.044mmol)在湿吡啶-水(10:1 1ml)中的溶液。通过LCMS监测反应，直到反应完全。真空除去吡啶，并将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用30-55％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸丁基酯29.MS m/z 1027.5(M+1).保留时间1.300分钟。该酯在酸性条件下倾向于水解。
实施例53:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-((((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基)羰基)氨基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(75)
向(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-氨基己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(步骤2,实施例44)(5mg,0.005mmol)的DMF-THF(1:1,2ml)溶液中加入碳酸(1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(1.5mg,0.005mmol)和DIEA(0.0025ml,0.014mmol)。将反应混合物在rt下搅拌30min，然后通过制备型HPLC纯化(40-65％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))得到化合物(75).MS m/z 1031.6(M+H).保留时间1.337min.
实施例54:
(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基酯(76)
向MC-Val-Cit-PAB-PNP(1.9mg,0.0026mmol)、化合物(50)TFA盐(1.8mg,0.002mmol)的DMF(1ml)溶液中加入吡啶(0.25ml)、HOAT(0.29mg,0.002mmol)和DIEA(0.0054ml,0.031mmol)。将反应在40℃下搅拌2h，然后在30℃搅拌18h。将反应混合物浓缩，并通过制备型HPLC(20-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到化合物(76).MS m/z664.0(M/2+H).保留时间1.165min.
实施例55:
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(77)
向3-(2-(马来酰亚氨基)乙氧基)丙酸(2.2mg,0.010mmol)的DMF(1ml)溶液中加入HATU(3.7mg,0.0098mmol)和DIEA(3.6mg,0.028mmol)。将反应搅拌5min，然后加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(8mg,0.0093mmol)的DMF(0.5ml)溶液。将反应混合物在rt下搅拌1h，然后浓缩。将粗品通过制备型HPLC(10-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到化合物(77).MS m/z 937.5(M+H).保留时间1.138min.
实施例56:
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(78)
通过对化合物(77)所述的方法，使用3-(2-(2-(马来酰亚氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸(2.6mg,0.010mmol)代替3-(2-(马来酰亚氨基)乙氧基)丙酸，制备化合物(78)。MS m/z981.5(M+H).保留时间1.140min.
实施例57:
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(3-(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(79)
通过对化合物(77)所述的方法，使用3-(2-(2-(2-(马来酰亚氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(3.1mg,0.010mmol)代替3-(2-(马来酰亚氨基)乙氧基)丙酸，制备化合物(79)。MS m/z 1025.5(M+H).保留时间1.143min.
实施例58:
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五-15-酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(80)
通过对化合物(77)所述的方法，使用1-(马来酰亚氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五-15-酸(3.6mg,0.010mmol)代替3-(2-(马来酰亚氨基)乙氧基)丙酸，制备化合物(80)。MS m/z 1069.5(M+H).保留时间1.144min.
实施例59:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-(4-(1-(2-(2-(2-(2-(4-(5-(甲基磺酰基)-1,3,4-二唑-2-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)丁酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(81)
步骤1:将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(1)(63mg,0.080mmol)溶解在ACN(0.75ml)和水(0.5mL)中。加入NaOH(1M,0.35ml)。将反应在rt搅拌2h。用1N HCl中和至大约pH 5，将反应混合物用水稀释并冻干，得到粗(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸。MS m/z742.4(M+1).保留时间1.010min.该产物不需要进一步纯化即用于下一步骤。
步骤2:向己-5-炔酸(5.4mg,0.049mmol)的DMF(2ml)溶液中加入DIEA(26.1mg,0.35mmol)和HATU(16.9mg,0.044mmol)。将反应在rt下搅拌15min。然后加入步骤1得到的产物(30mg,0.040mmol)。将反应在rt下搅拌2h。将粗品通过制备型HPLC(10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(己-5-炔酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸。MS m/z836.5(M+1).保留时间1.224min.
步骤3:将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(己-5-炔酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(7mg,0.0084mmol)和2-(4-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)-5-(甲基磺酰基)-1,3,4-二唑(3.7mg,0.0084mmol)混悬在t-BuOH(1ml)和水(1mL)中。使用注射器依次加入L-抗坏血酸钠(1.7mg,0.0084mmol)的0.3ml H2O溶液和CuSO4(0.3mg,0.0017mmol)的0.3mlH2O溶液，并将反应在rt下搅拌3h。将反应混合物通过制备型(10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到化合物(81)，为白色固体。MS m/z 639.4(M/2+1).保留时间1.196min.
实施例60:(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基酯(82)
将(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺((56),8.7mg,0.011mmol)、MC-Val-Cit-PABC-PNP(9.7mg,0.013mmol)、HOAT(1.7mg,0.011mmol)和DIEA(0.013ml,0.077mmol)合并在吡啶(0.5ml)和DMF(2mL)中。将反应在rt搅拌4h。将反应混合物通过制备型HPLC(10-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到为白色固体的化合物(82)。MS m/z 695.5(M/2+1).保留时间1.139min.
实施例61:(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基酯(83)
通过对化合物(82)所述的方法，使用(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(5-苯基-1H-咪唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(57)代替化合物(56)，制备化合物(83).MS m/z 720.0(M/2+1).保留时间1.169min.
实施例62:(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-3-苯基丙-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基酯(84)
通过对化合物(82)所述的方法，使用(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-3-苯基丙-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(58)代替化合物(56)，制备化合物(84)。MS m/z671.0(M/2+1).保留时间1.236min.
实施例63:(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-吡唑-3-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基酯(85)
通过对化合物(82)所述的方法，使用(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-吡唑-3-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(59)代替化合物(56)，制备化合物(85)。MS m/z682.1(M/2+1).保留时间1.172min.
实施例64:(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(5-苯基-1,3,4-二唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基酯(86)
通过对化合物(83)所述的方法，使用(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(5-苯基-1,3,4-二唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(62)代替化合物(56)，制备化合物(86)。MS m/z 721.1(M/2+1).保留时间1.280min.
实施例65:(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基酯(87)
通过对化合物(82)所述的方法，使用(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(60)代替化合物(56)，制备化合物(87)。保留时间1.204min.
实施例66:(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((R)-2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基酯(88)
通过对化合物(82)所述的方法，使用(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((R)-2-苯基-1-(嘧啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(61)代替化合物(56)，制备化合物(88)。MS m/z688.0(M/2+1).保留时间1.221min.
实施例67:
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(5-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-5-氧代戊酰氨基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(89)
将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-氨基己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸((步骤2,实施例44)20mg,0.021mmol)和DIEA(0.018ml,0.10mmol)的DMF(1ml)溶液加入到戊二酸双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(10.1mg,0.031mmol)和DIEA(0.018ml)的DMF(1mL)溶液中。将反应在rt搅拌2h。将粗品通过制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(5-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-5-氧代戊酰氨基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(89).MS m/z 1066.5(M+1).保留时间1.103min.
C-端连接的式(I)化合物的实施例的合成程序
实施例68:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(30)
步骤1:在15ml圆底烧瓶中，加入(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(12mg,0.050mmol)和DIEA(0.032mL,0.18mmol)的DMF(2.0ml)溶液，随后加入HATU(19mg,0.050mmol)。将得到的溶液搅拌5分钟。然后加入N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺TFA盐(48.5mg,0.047mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用10-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并浓缩得到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯,MS m/z 1139.6(M+1).保留时间1.39分钟。
步骤2:在15ml圆底烧瓶中，加入步骤1得到的产物(42.6mg,0.037mmol)、TFA(2.0mL)和DCM(4.0mL)，得到澄清溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，此时LCMS分析显示Boc完全除去。将反应混合物浓缩得到为TFA盐的化合物30,MS m/z 1039.6(M+1).保留时间1.06分钟。
实施例69:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(31)
在15mL圆底烧瓶中，加入(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺TFA盐(30)(20mg,0.017mmol)、多聚甲醛(5.9mg,0.21mmol)和乙酸(0.0029mL,0.050mmol)的MeOH(2.0ml)溶液。向得到的混悬液中加入NaCNBH3(6.6mg,0.11mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。再加入甲醛和NaCNBH3，并将反应混合物加热至50℃反应1小时，以完成反应。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用10-50％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并浓缩，得到为TFA盐的化合物31,MS m/z 1053.7(M+1))。保留时间1.07分钟。
实施例70:(1R,3S,4S)-2-乙酰基-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(32)
在15mL圆底烧瓶中，加入乙酸(0.79mg,0.013mmol)、DIEA(1.7mg,0.013mmol)和DMF(1.0mL)，随后加入HBTU(2.2mg,0.0058mmol)。将反应混合物搅拌5分钟，然后加入(2S,3S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-3-甲基吡咯烷-2-甲酰胺TFA盐(30)(5.5mg,0.0048mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用20-50％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并浓缩得到化合物32,MS m/z 1081.3(M+1).保留时间1.22分钟。
实施例71:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-(6-羟基己基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(33)
向化合物30(3.0mg,0.0029mmol)的MeOH(1.0ml)溶液中加入6-羟基己醛(6.7mg,0.058mmol)，随后加入NaBH3CN(9.1mg,0.14mmol)。30分钟后，再加入NaBH3CN(9.1mg,0.14mmol)。再30分钟后，LCMS分析指示反应完成。将反应混合物混合物通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-(6-羟基己基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺33,MS m/z 1139.6(M+1).保留时间1.10分钟。
实施例72:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-(6-羟基己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(34)
向6-羟基己酸(3.8mg,0.029mmol)的DMF(1ml)溶液中加入DIEA(7.5mg,0.058mmol)和HBTU(9.1mg,0.024mmol)。10分钟后，加入化合物30(10mg,0.0096mmol)。将反应混合物搅拌1小时，此时LCMS分析指示反应完成。将反应混合物通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干，得到化合物34,MS m/z 1153.5(M+1).保留时间1.20分钟。
实施例73:
(2S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-3-氮杂二环[3.1.0]己烷-2-甲酰胺(35)
该化合物使用对化合物30所述相同的方法，使用3-(叔丁氧基羰基)-3-氮杂二环[3.1.0]己烷-2-甲酸(12.5mg,0.055mmol)、DIEA(28.5mg,0.22mmol)、HATU(21mg,0.055mmol)和N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺TFA盐(11mg,0.011mmol)合成。纯化后，获得Boc-保护的中间体，MS m/z 1125.5(M+1).保留时间1.34分钟。将因此获得产物(10mg,0.0089mmol)用TFA(2.0mL)的DCM(4.0mL)溶液处理。将反应混合物在室温下搅拌1小时，LCMS分析显示Boc完全除去。将溶液浓缩得到为TFA盐的化合物35,MS m/z 1025.5(M+1).保留时间1.06分钟。
实施例74:
(2S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-3-甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己烷-2-甲酰胺(36)
向(2S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-3-氮杂二环[3.1.0]己烷-2-甲酰胺TFA盐(35)(7.9mg,0.0062mmol)和多聚甲醛(2.7mg,0.089mmol)的MeOH(2.0mL)溶液中加入NaCNBH3(11mg,0.018mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌2小时。将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用20-50％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并浓缩得到为TFA盐的化合物36,MS m/z 1039.5(M+1).保留时间1.07分钟。
实施例75:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十八烷-38-酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(37)
向2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十八烷-38-酸(17.0mg,0.029mmol)的DMF(1.5mL)溶液中加入DIEA(7.5mg,0.058mmol)和HATU(9.2mg,0.024mmol)。10分钟后，加入化合物30(10.0mg,0.0096mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。将反应混合物通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分收集并冻干得到化合物37,MS m/z 805.6((M+2)/2).保留时间1.25分钟。
实施例76:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(38)
通过对化合物37所述的相同方法，使用化合物30(10mg,0.0096mmol)和2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酸(11.91mg,0.029mmol)合成化合物38，MS m/z 717.5((M+2)/2).保留时间1.25分钟。
实施例77:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-(1-羟基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(39)
通过对化合物37所述的相同方法，使用30(10mg,0.0096mmol)、1-羟基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸(7.7mg,0.029mmol)、DIEA(7.46mg,0.058mmol)和HBTU(9.12mg,0.024mmol)的DMF(1.5mL)溶液合成化合物39,MS m/z 1287.6(M+1))。保留时间1.18分钟。
实施例78:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷甲酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(40)
步骤1:将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-苯基丙酸(964mg,3.63mmol)溶解在DMF(10mL)中。加入DIEA(1.27g,9.84mmol)和HATU(1.13g,3.03mmol)。10分钟后，加入4-氨基苄基氨基甲酸苄基酯(388mg,1.51mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，此时LCMS分析指示反应完成。将EtOAc(60mL)加入到反应中。然后将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将水层用EtOAc(2x 30mL)萃取。将合并的有机相用H2O(5x 10mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到粗产物。将粗产物溶解在DCM(5.0mL)中，并用TFA(5.0mL)处理。在室温1小时后，LCMS分析指示反应完成。在减压下除去溶剂。将残留物通过使用0-8％MeOH(含有2M氨)的DCM溶液的ISCO纯化，获得(S)-4-(2-氨基-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯，其为白色固体,MS m/z 404.2(M+1))。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.44-7.23(m,14H),5.10(s,2H),4.26(s,2H),4.12(d,J＝7.4Hz,1H),3.28-3.22(m,1H),3.15-3.10(m,1H).
步骤2:将(S)-4-(2-氨基-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯(201.7mg,0.50mmol)和(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(429mg,0.75mmol)溶解在DMF(6mL)中。然后加入DIEA(323mg,2.50mmol)和HATU(342mg,0.90mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时。将反应混合物通过反相HPLC纯化，得到4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯，MS m/z 957.5(M+1),保留时间1.54分钟。将Boc保护的产物(393mg,0.41mmol)溶解在HCl甲醇溶液中(3M,15mL)。在减压下缓慢蒸发溶剂。LCMS分析指示脱保护反应完成。加入乙腈和水，并将得到的溶液冻干，得到为HCl盐的4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯，MS m/z 857.5(M+1).保留时间1.16分钟。
步骤3:将(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(190mg,0.788mmol)溶解在DMF(5.0mL)中。加入DIEA(254mg,1.97mmol)和HATU(270mg,1.71mmol)。将反应混合物搅拌15分钟，加入4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯(336mg,0.394mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，此时LCMS分析显示反应完全。将反应混合物通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((((苄基氧基)羰基)氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯，MS m/z1080.5(M+1),保留时间1.56分钟。
将Boc保护的产物(88mg,0.081mmol)溶解在HCl甲醇溶液(3M,6.0mL)中。在减压下缓慢蒸发溶剂。LCMS分析指示脱保护反应完成。加入乙腈和水，并将得到的溶液冻干，得到4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯，其为HCl盐,MS m/z 980.5(M+1).
步骤4:将4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯(65.8mg,0.067mmol)溶解在MeOH(4mL)中。加入多聚甲醛(22.8mg,0.76mmol)和乙酸(0.023mL,0.40mmol)，随后加入氰基硼氢化钠(47.7mg,0.76mmol)。将反应混合物在搅拌下加热至50℃反应1小时。LCMS分析指示反应完成。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯，MS m/z 994.5(M+1).保留时间1.21分钟。
步骤5:将4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯(48mg,0.048mmol)溶解在MeOH(5.0mL)中，在N2下闪蒸。加入Pd/C(20.5mg,10％Pd)。将反应容器抽真空并用H2回填。重复该操作五次，以用H2替换反应气氛。将反应混合物在H2下在室温搅拌2小时。LCMS分析指示反应完成。将反应混合物过滤，并浓缩，获得(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-(氨基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺,MS m/z 860.5(M+1).保留时间0.86分钟。如此获得的产物没有进一步纯化即用于下面的步骤.
步骤6:将(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-(氨基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(12mg,0.014mmol)和4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷甲酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(5.6mg,0.017mmol)溶解在DMF(1mL)中，并加入DIEA(10.8mg,0.084mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时。LCMS分析指示反应完成。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到化合物40,MS m/z 1079.5(M+1).保留时间1.12分钟。
实施例79:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((3-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(41)
向3-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酸(7.2mg,0.028mmol)的DMF(1.5ml)溶液中加入DIEA(10.8mg,0.084mmol)和HATU(8.0mg,0.021mmol)。10分钟后，加入(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-(氨基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(12mg,0.014mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到化合物41,MS m/z 1099.5(M+1).保留时间1.07分钟。
实施例80:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(42)
向饱和NaHCO3水溶液(3.0mL)中加入(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-(氨基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(20.0mg,0.023mmol)。将得到的混悬液冷却至0℃，并加入2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯(14.4mg,0.093mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1.5小时。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到化合物42,MS m/z 940.5(M+1).保留时间1.13分钟。
实施例81:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)脲基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(43)
步骤1:将(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((((苄基氧基)羰基)氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(211mg,0.195mmol)溶解在MeOH(10mL)中。加入Pd/C(41.6mg,10％Pd)。将反应容器抽真空并用H2回填。重复该操作五次以用H2替换反应气氛。将反应混合物在H2下在室温搅拌2小时。LCMS分析显示反应完全。将反应混合物过滤并浓缩，得到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-(氨基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯，MS m/z 946.6(M+1))，没有纯化即将其用于下面的步骤。
步骤2:将(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-(氨基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(30mg,0.032mmol)溶解在DMF(3ml)和THF(3mL)中。然后加入DIEA(20.5mg,0.16mmol)和氯甲酸4-硝基苯基酯(12.8mg,0.063mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。LC/MS分析指示反应完成。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯，MS m/z 1111.5(M+1).保留时间1.54分钟。
步骤3:向溶解在DMF(1.0mL)和THF(1.0mL)中的(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(13.7mg,0.012mmol)中加入1-(6-氨基己基)-1H-吡咯-2,5-二酮(14.5mg,0.074mmol)和DIEA(31.9mg,0.25mmol)。将反应混合物在室温搅拌4小时。LCMS分析显示反应完全。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)脲基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯，MS m/z 1168.6(M+1)。将如此获得的Boc保护的产物溶解在HCl甲醇溶液(3M,2.0mL)中。在减压下缓慢除去溶剂。LCMS分析显示反应完全。将残留物溶解在乙腈和水中，并冻干得到(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)脲基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺，为HCl盐,MS m/z 1068.6(M+1).保留时间1.09分钟
步骤4:将(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)脲基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(8.4mg,0.0079mmol)溶解在MeOH(1.5mL)中。加入多聚甲醛(2.7mg,0.089mmol)和乙酸(0.0027mL,0.046mmol)，随后加入氰基硼氢化钠(5.6mg,0.089mmol)。将反应混合物在搅拌下加热至50℃反应1小时。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到化合物43,MS m/z 1082.6(M+1).保留时间1.11分钟。
实施例82:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(44)
步骤1:将6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(349mg,1.65mmol)溶解在DMF(10mL)中。然后加入DIEA(820mg,6.35mmol)和HATU(579mg,1.52mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌10分钟。然后加入(4-(氨基甲基)苯基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(300mg,1.27mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时。将EtOAc(30mL)加入到反应中。然后将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将水层用EtOAc(2x 30mL)萃取。将合并的有机相用H2O(5x10mL)洗涤，用MgSO4干燥，浓缩并通过ISCO(EtOAc/己烷0-80％)纯化。获得预期产物,MS m/z 374.2(M+1-tBu),保留时间1.156分钟，为黄色油状物。将产物溶解在DCM(3mL)中，并用TFA(1mL)处理。在室温1小时后，在减压下除去溶剂。将残留物溶取在乙腈和H2O中并冻干，得到6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-(4-(甲基氨基)苄基)己酰胺，为黄色固体(MS m/z 330.2(M+1),保留时间0.61分钟).
步骤2:向溶解在DMF(5mL)中的(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-苯基丙酸(219mg,0.827mmol)中加入DIEA(356mg,2.76mmol)和HATU(288mg,0.758mmol)。在室温搅拌10分钟后，加入6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-(4-(甲基氨基)苄基)己酰胺(227mg,0.689mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。将EtOAc(20mL)加入到反应中。然后将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将水层用EtOAc(2x 20mL)萃取。将合并的有机相用H2O(5x 10mL)洗涤，用无水MgSO4干燥，浓缩并通过ISCO(EtOAc/己烷,0-75％)纯化，得到预期产物。MS m/z 577.3(M+1).保留时间1.19分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.00(s,1H),8.24(t,J＝6.0Hz,1h),7.52(d,j＝8.4Hz,2H),7.32-7.09(m,7H),7.01(s,2H),4.31(m,1H),4.19(d,J＝6.0Hz,2H),3.38(t,J＝7.0Hz,2H),3.17(d,J＝7.2Hz,2H),3.00(m,1H),2.85(m,1H),2.10(t,J＝7.4Hz,2H),1.54-1.44(m,4H),1.31(s,9H),1.22-1.15(m,4H).将产物溶解在3M HCl的MeOH溶液(5mL)中。在减压下缓慢地除去溶剂。将残留物溶取在乙腈和H2O中并冻干，获得(S)-N-(4-(2-氨基-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺，为HCl盐。MS m/z 477.2(M+1).保留时间0.83分钟。
步骤3:向溶解在DMF(4mL)中的Boc-Val-Dil-Dap-OH(347mg,0.607mmol)加入DIEA(261mg,2.02mmol)和HATU(282mg,0.49mmol)。在室温搅拌15分钟后，加入(S)-N-(4-(2-氨基-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(193mg,0.404mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。将反应混合物通过反相HPLC纯化，得到预期产物N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺。MS m/z 1030.5(M+1).保留时间1.430分钟。将产物溶解在3M HCl甲醇溶液(3mL)中。在减压下除去溶剂。将残留物溶取在乙腈和H2O中并冻干，获得预期产物N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺，为HCl盐。MS m/z 930.5(M+1).保留时间1.07分钟。
步骤4-5:按照对制备化合物30和化合物31所述的相同的方法，获得化合物44。MSm/z 1067.6(M+1).保留时间1.10分钟。
实施例83:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(45)
步骤1:向搅拌的叠氮化钠(3.50g,53.8mmol)的水(25mL)溶液中加入1,3-丙烷砜(6.10g,50.0mmol)的丙酮(25mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌24小时，并浓缩至干。将得到的固体混悬在乙醚(100mL)中，并在回流下搅拌1小时。将混悬液冷却至室温，并通过过滤收集固体，用丙酮和乙醚洗涤，并在真空下干燥，得到3-叠氮基-1-丙烷磺酸。MS m/z188.1(M+1).1H NMR(400MHz,CD3OD):δ3.47(t,J＝6.8Hz,2H),2.87(t,J＝7.6Hz,2H),2.07-2.00(m,2H).
步骤2:将3-叠氮基-1-丙烷磺酸(2.07g,13.0mmol)混悬在甲苯中。加入PCl5(2.61g,13.0mmol)。将混合物在回流下加热3小时。将反应混合物冷却至室温，并过滤以除去不溶物。将滤饼用DCM洗涤。将合并的滤液浓缩，得到3-叠氮基丙烷-1-磺酰氯，为暗黄色油状物，其没有进一步纯化即用于下面的步骤。
步骤3:向在0℃下冷却的NH4OH(5mlL)中加入3-叠氮基丙烷-1-磺酰氯(1.75g,9.53mmol)。10分钟后，将反应混合物升温至室温并在同样温度下搅拌3小时。该油性混合物变得澄清。将反应混合物用EtOAc萃取三次。将有机相用盐水洗涤，用无水MgSO4干燥，并浓缩。在高真空下进一步除去溶剂，持续18小时，得到3-叠氮基丙烷-1-磺酰胺。MS m/z 187.1(M+1).1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.83(s,2H),3.51(t,J＝6.4Hz,2H),3.23(t,J＝7.6Hz,2H),2.17-2.10(m,2H).
步骤4:将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-苯基丙酸(100mg,0.38mmol)溶解在DMF(4mL)中，随后加入DIEA(0.395mL,2.26mmol)和HATU(358mg,0.940mmol)。15分钟后，加入3-叠氮基丙烷-1-磺酰胺(186mg,1.13mmol)。将反应混合物搅拌2小时，此时LCMS分析显示反应完全。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分收集并冻干，得到(S)-(1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 312.1(M+1-Boc).保留时间1.15分钟。将如此获得的产物(72.4mg.0.176mmol)溶解在3M HCl甲醇溶液(5mL)中。在减压下除去溶剂。将残留物溶取在乙腈和H2O中并冻干，得到(S)-2-氨基-N-((3-叠氮基丙基)磺酰基)-3-苯基丙酰胺，为粉红色微黄色固体。MS m/z 312.1(M+1).1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.42-7.31(m,5H),4.16-4.13(m,1H),3.51-3.47(m,4H),3.32-3.26(m,1H),3.13-3.08(m,1H),2.00-1.94(m,2H).
步骤5:向溶解在DMF(4mL)中的Boc-Val-Dil-Dap-OH(195mg,0.34mmol)中加入DIEA(132mg,1.02mmol)和HATU(108mg,0.28mmol)。将反应混合物在室温搅拌15分钟，然后加入(S)-2-氨基-N-((3-叠氮基丙基)磺酰基)-3-苯基丙酰胺(59.2mg,0.17mmol)。将反应混合物在室温再搅拌2小时。将粗品通过反相HPLC纯化，得到预期产物(95mg,65％产率,MSm/z865.4(M+1),保留时间1.43分钟)。将产物溶解在3M HCl的MeOH溶液(3mL)中。在真空下除去溶剂。然后将乙腈和H2O加到残留物中，并将溶液冻干，获得预期产物(S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-2-氨基-3-甲基-1-氧代丁烷.MS m/z 765.4(M+1).保留时间1.04分钟。
步骤6:向(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(16.5mg,0.068mmol)的DMF(2.0mL)溶液中加入DIEA(17.6mg,0.137mmol)和HATU(21.6mg,0.057mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后加入(S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-2-氨基-3-甲基-1-氧代丁烷(20mg,TFA盐,0.023mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，此时LCMS分析指示反应完成。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％ACN-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺。MS m/z 988.5(M+1).保留时间1.51分钟。将如此获得的产物(9.4mg.0.0095mmol)溶解在HCl甲醇溶液(3M,2.0mL)中。在减压下缓慢除去溶剂。将残留物溶解在中乙腈和H2O中并冻干得到化合物45，为HCl盐。MS m/z888.5(M+1).保留时间1.10分钟。
实施例84:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(46)
将(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(45)(8.8mg,0.0099mmol)溶解在MeOH(2.0mL)中。加入多聚甲醛(10.1mg,0.337mmol)和乙酸(0.0102mL)，随后加入氰基硼氢化钠(21.2mg,0.337mmol)。将反应混合物在搅拌下在50℃下加热1小时。再加入多聚甲醛(10.1mg,0.337mmol)、乙酸(0.0102mL)和氰基硼氢化钠(21.2mg,0.337mmol)。在50℃1小时后，LCMS分析指示反应完成。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％ACN-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到化合物46.MS m/z 902.5(M+1).保留时间1.12分钟。
实施例85:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(47)
将(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(46)(5.2mg,0.0058mmol)、1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1.56mg,0.012mmol)和CuSO4(0.7mg,0.004mmol)的DMF(2.0mL)和H2O(0.5mL)溶液用L-抗坏血酸钠(2.5mg,0.014mmol)处理并在室温搅拌2小时。加入另外的CuSO4(0.7mg,0.004mmol)和L-抗坏血酸钠盐(2.5mg,0.014mmol)。在室温再2小时后，LCMS分析指示反应完成。将粗品通过使用C18柱的反相HPLC纯化，采用10-90％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分集合并冻干得到化合物47。MS m/z 1037.4(M+1).保留时间1.00分钟。
实施例86:((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基酯(48)
向((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸9(10.2mg,0.011mmol)的吡啶(2ml)溶液中加入1-(6-羟基己基)-1H-吡咯-2,5-二酮(13.5mg,0.068mmol)，然后加入新戊酰氯(40mg,0.332mmol)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，并通过LCMS监测反应，直到90％所述次膦酸消失。然后加入新制备的在5％H2O的吡啶溶液中的I2溶液。一旦氧化步骤完成，通过高真空除去吡啶。将粗品溶解在乙腈中，并将粗品通过反相HPLC(C18柱)纯化，采用10-60％乙腈-H2O(含有0.05％TFA)洗脱。将含有预期产物的级分浓缩，得到化合物48。MS m/z971.5(M+1).保留时间1.038分钟。
实施例87:
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(90)
将EMCA(1.3mg,0.006mmol)的DMF(0.5ml)溶液用DIEA(0.006ml,0.03mmol)和HATU(2.3mg,0.006mmol)在rt下处理10min，然后加入化合物(52)TFA盐(6mg,0.006mmol)的DMF(0.5ml)溶液。将反应在rt下搅拌16h。将粗品通过制备型HPLC(10-45％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到为TFA盐的化合物(90)。MS m/z 950.6(M+H).保留时间0.934min.
实施例88:(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-羟基丙基)苯基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基酯(91)
将吡啶(0.25ml)加入到(52)TFA盐(6mg,0.006mmol)、MC-Val-Cit-PAB-PNP(13mg,0.018mmol)的DMF(1ml)溶液中，随后加入HOAT(0.8mg,0.006mmol)和DIEA(13mg,0.098mmol)。将反应在40℃下搅拌48h。将粗品通过制备型HPLC(25-40％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到为TFA盐的化合物(91)。MS m/z 678.6(M/2+H).保留时间0.959min.
实施例89:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-(N-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-氨磺酰基丙烷)-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(92)
将EMCA(12.1mg,0.057mmol)溶解在DMF(1mL)中。加入DIEA(0.0024ml)和HATU(19.7mg,0.052mmol)。然后加入(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-氨磺酰基丙-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺((55),26.4mg,0.029mmol)的DMF(2ml)溶液。将反应在rt下搅拌2h。然后加入另外的EMCA(12.1mg,0.057mmol)、DIEA(0.0024ml)和HATU(19.7mg,0.052mmol)。2h后，再加入EMCA(12.1mg,0.057mmol)、DIEA(0.0024ml)和HATU(19.7mg,0.052mmol)。然后将反应在50℃下加热2h。将反应冷却，加入另外的EMCA(12.1mg,0.057mmol)、DIEA(0.0024ml)和HATU(19.7mg,0.052mmol)。将反应在rt搅拌16h。LCMS指示大约20％(55)转化为产物。将反应混合物通过制备型HPLC纯化(30-50％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))，得到(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-1-苯基-3-(N-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-氨磺酰基丙烷)-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(92).MSm/z 998.5(M+1).保留时间1.041min.
实施例90:(1R,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-苄基-20-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4-甲基-5,8-二氧代-2,12,15,18-四氧杂-6,9-二氮杂二十烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(93)
步骤1:将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-苯基丙酸(175mg,0.66mmol)的DMF(4ml)溶液用DIEA(0.48ml,2.75mmol)和HATU(230mg,0.605mmol)处理15min，随后加入2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙胺(120mg,0.55mmol)。将反应搅拌过夜。将粗品通过制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到(S)-(1-叠氮基-13-氧代-15-苯基-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十五-14-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 466.3(M+1).保留时间1.170min.
步骤2:将(S)-(1-叠氮基-13-氧代-15-苯基-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十五-14-基)氨基甲酸叔丁酯(117mg,0.251mmol)溶解在HCl甲醇溶液(3M,5mL)中。通过蒸发缓慢除去溶剂，完全除去Boc基团。在减压下过夜进一步除去溶剂，得到(S)-2-氨基-N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-苯基丙酰胺，为HCl盐。MS m/z 366.1(M+1).保留时间0.858min.
步骤3:将(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(步骤2,实施例12,8mg,0.01mmol)的DMF(1ml)溶液用DIEA(0.011ml,0.066mmol)和HATU(4.63mg,0.012mmol)处理15min，随后加入(S)-2-氨基-N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-苯基丙酰胺(5.3mg,0.013mmol)的DMF(1mL)。将反应在rt搅拌2h。将粗品通过制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))纯化，得到(1R,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-20-叠氮基-7-苄基-4-甲基-5,8-二氧代-2,12,15,18-四氧杂-6,9-二氮杂二十烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺。MS m/z 956.5(M+1).保留时间1.051min.
步骤4:向步骤3得到的产物(6.2mg,0.0058mmol)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1.6mg,0.012mmol)的t-BuOH(1ml)和水(1ml)溶液中加入L-抗坏血酸钠(1.1mg,0.0058mmol)的0.2ml H2O溶液和CuSO4(0.2mg,0.001mmol)的0.1ml水溶液。将反应混合物在rt下搅拌4h，然后通过制备型HPLC纯化(20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))，得到化合物(93).。MS m/z 1091.6(M+1).保留时间0.980min.
实施例91:(1R,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-苄基-17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-甲基-5,8-二氧代-2,12,15-三氧杂-6,9-二氮杂十七烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(94)
步骤1:将(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(250mg,1.0mmol)和2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯(156mg,1.0mmol)合并在饱和NaHCO3水溶液(10ml)中，并在0℃搅拌1.5h。将反应混合物用盐酸(2M)酸化至pH 2，并用EtOAc萃取。将有机相用盐水洗涤，用MgSO4干燥，并浓缩。将粗品通过使用0-4％MeOH/DCM的ISCO纯化，得到(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯，为无色油状物。MS m/z 229.2(M+1-Boc).保留时间0.963min.1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.71(s,2H),5.04(bs,1H),3.74(t,J＝5.4Hz,2H),3.64(t,J＝5.4Hz,2H),3.61-3.59(m,2H),3.56-3.54(m,2H),3.50(t,J＝5.2Hz,2H),3.31-3.26(m,2H),1.44(s,9H).
步骤2:将(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(184mg,0.56mmol)的DCM(2ml)溶液用TFA(0.4ml)在0℃下处理30min，然后在rt处理2h。将反应混合物浓缩，得到为TFA盐的1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-。MS m/z 229.2(M+1).保留时间0.353min.
步骤3:将Boc-L-Phe-OH(30mg,0.113mmol)的DMF(1ml)溶液用DIEA(88mg)和HATU(43mg,0.113mmol)活化15min，加入1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮TFA盐(46.4mg)的DMF(1ml)溶液。将反应混合物在rt下搅拌2h，然后通过制备型HPLC纯化(20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))，得到(S)-(1-((2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MSm/z 476.2(M+1).保留时间1.091min.将该产物(31mg,0.065mmol)的DCM(2ml)溶液用TFA(0.2ml)在0℃下处理30min，然后在rt处理2h。将反应混合物浓缩，得到为TFA盐的(S)-2-氨基-N-(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-苯基丙酰胺。MS m/z 376.2(M+1).保留时间0.649min.
步骤4:向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸TFA盐(步骤2,实施例12)(7.2mg,0.010mmol)的DMF(1ml)溶液中，加入DIEA(7.7mg)和HATU(4.18mg,0.011mmol)。将反应搅拌15min，并加入(S)-2-氨基-N-(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-苯基丙酰胺TFA盐(6.3mg,0.013mmol)的DMF(1ml)溶液。将反应混合物在rt下搅拌2h，并通过制备型HPLC纯化(20-70％乙腈-H2O(含有0.05％TFA))，得到为TFA盐的化合物(93)。MS m/z966.5(M+1).保留时间1.016min.
实施例92:(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-苄基-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-甲基-5,8-二氧代-2,12-二氧杂-6,9-二氮杂十四烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(95)
通过对化合物(94)所述的方法，使用(2-(2-氨基乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯代替(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯，制备化合物(95)。MS m/z 922.5(M+1).保留时间1.044min.
辅酶A类似物的合成程序
实施例93:辅酶A的3-丁烯-2-酮加合物(49)
将辅酶A三锂盐(259mg,Sigma,含量>93％)溶解在2.0mL含有EDTA的磷酸缓冲液(100mM磷酸盐,5mM EDTA,pH7.5)中。向反应混合物中加入3-丁烯-2-酮(29.0μL,Aldrich,99％)，并将反应混合物在20℃放置75分钟。将整个反应混合物上载到ISCO C18Aq Gold15.5g柱(其被用100％H2O预平衡)上。用100％H2O洗脱预期产物。将含有纯的预期产物的级分合并，并冻干，得到为结晶固体的化合物49。MS(ESI+)m/z 838.2(M+1).H-NMR(400MHz,D2O)δ8.525(s,1H),8.235(s,1H),6.140(d,1H,J＝7.2Hz),4.746(m,1H),4.546(bs,1H),4.195(bs,1H),3.979(s,1H),3.786(dd,1H,J＝4.8,9.6Hz),3.510(dd,1H,J＝4.8,9.6Hz),3.429(t,2H,J＝6.6Hz),3.294S(t,2H,J＝6.6Hz),2.812(t,2H,J＝6.8Hz),2.676(t,2H,J＝6.8Hz),2.604(t,2H,J＝6.8Hz),2.420(t,2H,J＝6.6Hz),2.168(s,3H),0.842(s,3H),0.711(s,3H)(注释：与D2O重叠的一些峰没有被报告)。
实施例94:酮-辅酶A类似物(CoA-(i-10))
如下将化合物(i-10)转化为酮-官能化的CoA类似物CoA-(i-10)：使5mM化合物(i-10)与25mM ATP在10μM金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CoAA、25μM大肠杆菌(Escherichia coli)CoAD和20μM大肠杆菌(Escherichia coli)CoAE存在下在含有20MgCl2的50mM HEPES缓冲液(pH8.0)中在37℃反应约14h。经通过具有10kDa截断值的AmiconUltra离心过滤器超滤来分离可溶酶。通过抗-Her2-HC-ins388-ybbR-(i-10)-22ADC的形成证实化合物(i-10)被酶促转化为CoA类似物CoA-(i-10)(参见表9和表10)。
实施例95:叠氮化物-辅酶A类似物(CoA-(i-11))
如下将化合物(i-11)转化为叠氮化物-官能化的CoA类似物CoA-(i-11)：使5mM化合物(i-11)与25mM ATP在10μM金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CoAA、25μM大肠杆菌(Escherichia coli)CoAD和20μM大肠杆菌(Escherichia coli)CoAE存在下在含有20MgCl2的50mM HEPES缓冲液(pH 8.0)中在37℃反应约14h。经通过具有10kDa截断值的Amicon Ultra离心过滤器超滤来分离可溶酶。在使小部分的超滤液与5倍摩尔过量的化合物(75)反应后，通过LC-MS分析证实化合物(i-11)被酶促转化为CoA类似物CoA-(i-11)。将该无铜点击化学反应在50％(v/v)DMSO/H2O中在23℃进行3h，并在反相Acquity UPLC HSST3柱(2.1mm x 50mm,Waters)上以流速0.9mL/min采用10至100％乙腈的水(含有0.05％TFA)溶液的1.35min-梯度洗脱分离反应混合物。质谱分析揭示存在预期加合物，从而证实化合物(i-11)被所有的三种CoA生物合成酶转化为CoA类似物CoA-(i-11).MS m/z904.6((M+2)/2).保留时间0.94分钟。
实施例96:酮-辅酶A类似物(CoA-(i-12))
如下使化合物(i-12)转化为酮-官能化的CoA类似物CoA-(i-12)：使5mM化合物(i-12)与25mM ATP在10μM金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CoAA、25μM大肠杆菌(Escherichia coli)CoAD和20μM大肠杆菌(Escherichia coli)CoAE存在下在含有20MgCl2的50mM HEPES缓冲液(pH8.0)中在37℃反应约16h。将反应混合物在20817x g离心2min后，经通过具有10kDa截断值的Amicon Ultra离心过滤器超滤(15min；14000x g)来分离可溶酶。通过抗-Her2-HC-ins388-ybbR-(i-12)-22ADC的形成证实化合物(i-12)被酶促转化为CoA类似物CoA-(i-12)(参见表10)。
实施例97:酮-辅酶A类似物(CoA-(i-13))
如下将化合物(i-13)转化为酮-官能化的CoA类似物CoA-(i-13)：使10mM化合物(i-13)与25mM ATP在10μM金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CoAA、25μM大肠杆菌(Escherichia coli)CoAD和20μM大肠杆菌(Escherichia coli)CoAE存在下在含有20mMMgCl2的50mM HEPES缓冲液(pH 8.0)中在37℃反应约48h。将反应混合物在20817x g离心2min后，经通过具有10kDa截断值的Amicon Ultra离心过滤器超滤来分离可溶酶(15min；14000x g).
可比较的肽的合成程序
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(MC-MMAF)的合成
将MMAF-OMe(135mg,Concortis Biosystems)溶解在CH3CN(10mL)中。向得到的澄清溶液加入5mL水，随后加入0.375mL 1N氢氧化钠水溶液(合乎标准的,FisherScientific)。将反应混合物在21℃磁力搅拌18小时，此时LCMS分析指示反应完全。将反应混合物混合物冷冻并冻干，得到MMAF钠盐。LCMS保留时间0.911分钟。MS(ESI+)m/z 732.5(M+1)。将在前面的反应中获得的整个MMAF钠盐溶解在10mL DMSO中。在一分别的反应容器中，将6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(95mg)用HATU(165mg)和DIEA(0.126mL)的3.0mL DMSO溶液在21℃处理25min。将该活化的酯的整个反应混合物加入到MMAF钠盐的溶液中，并将反应混合物在同一温度下搅拌3小时。将反应混合物在40mL EtOAc和20mL 5％柠檬酸水溶液之间分配。将有机层分离，并将水层用20mL EtOAc萃取。将合并的有机层用10mL饱和NaCl水溶液洗涤，用无水MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将残留物在ISCOCombiFlash仪器上使用ISCO C18gold 15.5g柱纯化。采用50％CH3CN的H2O溶液洗脱期望的物质。将含有预期产物的级分合并并冻干，得到为白色固体的化合物。LCMS保留时间1.392分钟。MS(ESI+)m/z 925.6(M+1).
实施例98:有效载荷的体外细胞杀伤测定
为了评价式(I)的细胞毒性肽的体外细胞杀伤效力，用8种细胞系：MDA-MB231克隆16、克隆40、JimT1、HCC1954、H526、KU812、CMK11-5细胞和Jurkat细胞平行进行细胞增殖测定。此外，使用3种其它细胞系：A375、SKBR3和NCI-N87进行体外细胞增殖测定。所有这些细胞系更详细地描述在实施例106中，并且还用于评价本发明的免疫缀合物的体外效力。在用各种浓度的ADC培育细胞后5天，使用细胞-Titer-GloTM(Promega)进行细胞增殖测定(Riss等人,(2004)Assay Drug Dev Technol.2:51-62)。在一些研究中，基于细胞的测定是高通量的并且在自动化系统中进行(Melnick等人,(2006)Proc Natl Acad Sci U S A.103:3153-3158)。对式(I)的细胞毒性肽的某些实施例获得的体外细胞杀伤效力列在表2a和表2b中。
表2a.某些式(I)的细胞毒性肽的体外细胞杀伤(IC50(nM))
表2b.某些式(I)的细胞毒性肽的体外细胞杀伤(IC50(nM))
n.d.,未测定
抗原-结合部分
式(II)或(III)中的抗原结合部分可以是与靶细胞类型上的细胞-表面标志选择性结合的任何部分。在一些方面，Ab是与主要或优先存在于癌症细胞的表面的抗原(例如肿瘤相关的抗原)特异性结合的抗体或抗体片段(例如抗体的抗原结合片段)。在一些方面，Ab是与细胞表面受体蛋白质或其它细胞表面分子、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、组织发育或分化相关(例如已知或怀疑在功能上促进它们)的分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调节的分子、涉及血管发生的分子或与血管发生相关的(例如已知或怀疑在功能上促进其)的分子特异性结合的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)。肿瘤相关的抗原可以是簇分化因子(即CD蛋白)。在本发明的一些方面，本发明的抗原结合部分与一种抗原特异性结合。在本发明的一些方面，本发明的抗原结合部分与文中描述的两种或更多种抗原特异性结合，例如，本发明的抗原结合部分是双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段。
示例性抗体或抗原结合片段包括但不限于抗-雌激素受体抗体、抗-孕酮受体抗体、抗-p53抗体、抗-HER-2抗体、抗-EGFR抗体、抗-组织蛋白酶D抗体、抗-Bcl-2抗体、抗-E-钙粘蛋白抗体、抗-CA125抗体、抗-CA15-3抗体、抗-CA19-9抗体、抗-c-erbB-2抗体、抗-P-糖蛋白抗体、抗-CEA抗体、抗-视网膜母细胞瘤蛋白抗体、抗-ras癌基因蛋白抗体、抗-Lewis X抗体、抗-Ki-67抗体、抗-PCNA抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD5抗体、抗-CD7抗体、抗-CD8抗体、抗-CD9/p24抗体、抗-CD1-抗体、抗-CD11c抗体、抗-CD13抗体、抗-CD14抗体、抗-CD15抗体、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体、抗-CD22抗体、抗-CD23抗体、抗-CD30抗体、抗-CD31抗体、抗-CD33抗体、抗-CD34抗体、抗-CD35抗体、抗-CD38抗体、抗-CD39抗体、抗-CD41抗体、抗-LCA/CD45抗体、抗-CD45RO抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD71抗体、抗-CD95/Fas抗体、抗-CD99抗体、抗-CD100抗体、抗-S-100抗体、抗-CD106抗体、抗-泛素抗体、抗-c-myc抗体、抗-细胞角蛋白抗体、抗-λ轻链抗体、抗-黑素体抗体、抗-前列腺特异性抗原抗体、抗-tau抗原抗体、抗-纤维蛋白抗体、抗-角蛋白抗体和抗-Tn-抗原抗体。
在一个实施方案中，式(II)或(III)的抗体-药物缀合物(ADC)的抗原结合部分与ErbB基因编码的受体特异性结合。抗原结合部分可以与选自EGFR、HER2、HER3和HER4的ErbB受体特异性结合。抗原结合部分可以是将与HER2受体的胞外域(ECD)特异性结合并抑制过表达HER2受体的肿瘤细胞的生长的抗体。抗体可以是单克隆抗体例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。人源化抗体可以是huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7或huMAb4D5-8(曲妥珠单抗)。抗体可以是抗体片段例如Fab片段。
式(II)或(III)中的抗原-结合部分包括但不限于针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)。此类肿瘤相关抗原是本领域已知的，并且可以使用本领域众所周知的方法和信息制备用于生产抗体。尝试发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶点，研究者已经考虑鉴定与在一种或多种正常非-癌症细胞上表达相比，特异性地在一种或多种特定类型的癌症细胞表面上表达的跨膜或其它肿瘤相关的多肽。通常，与在非癌症细胞的表面上表达相比，此类肿瘤相关的多肽更大量地在癌症细胞的表面上表达。此类肿瘤-相关的细胞表面抗原多肽的鉴定提升特异性靶向用于通过基于抗体治疗来破坏的癌症细胞的能力。
可用于本发明的免疫缀合物的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)包括修饰的或改造的(engineered)抗体，例如修饰以引入半胱氨酸残基(Junutula JR,Raab H,ClarkS,Bhakta S,Leipold DD,Weir S,Chen Y,Simpson M,Tsai SP,Dennis MS,Lu Y等人:NatBiotechnol 2008,26:925-932)或其它反应性氨基酸包括Pcl、吡咯赖氨酸、肽标签(例如S6、A1和ybbR标签)和非-天然氨基酸代替天然序列的至少一个氨基酸，从而提供用于缀合式(I)或其子式的细胞毒性肽的抗体或抗原结合片段上的反应位点的抗体。例如抗体或抗体片段可以被修饰以引入Pcl或吡咯赖氨酸(W.Ou等人(2011)PNAS 108(26),10437-10442)或非天然氨基酸(J.Y.Axup,K.M.Bajjuri,M.Ritland,B.M.Hutchins,C.H.Kim,S.A.Kazane,R.Halder,J.S.Forsyth,A.F.Santidrian,K.Stafin,Y.Lu等人Proc NatlAcad Sci U S A,109(2012),16101–16106页；对于综述，参见C.C.Liu和P.G.Schultz(2010)Annu Rev Biochem 79,413-444；C.H.Kim,J.Y.Axup,P.G.Schultz(2013)Curr OpinChem Biol.17,412-419)作为用于与药物缀合的位点。类似地，用于酶促缀合方法的肽标签可以引入抗体中(Strop P.等人Chem Biol.2013,20(2):161-7；Rabuka D.,Curr OpinChem Biol.2010Dec；14(6):790-6；Rabuka D等人,Nat Protoc.2012,7(6):1052-67)。一个其它实例是4’-磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)缀合辅酶A类似物的应用(WO2013184514)。用于将此类修饰的或改造的抗体与有效载荷或连接体-有效载荷组合进行缀合的方法是本领域已知的。
可用于本发明的抗原-结合部分(例如抗体和抗原结合片段)还可以具有其它修饰或被缀合至其它部分例如但不限于聚乙二醇标签、白蛋白和其它融合多肽。
文中的实施例中所使用的抗体具有表3中所列的重链和轻链序列。这些抗体被改造以包含用于与本发明的细胞毒性肽位点特异性缀合的半胱氨酸残基或PPTase酶标签。文中的实施例举例说明这些改造的抗体是用于式(II)或(III)的免疫缀合物的适合的抗体。此外，非-改造的抗体还可以通过传统方法(Carter PJ,Senter PD,Antibody-drugconjugates for cancer therapy,Cancer J.2008,14(3):154-69；J.E.Stefano,M.Busch,L.Hou,A.Park,和D.A.Gianolio,p.145-171,和M.-P.Brun和L.Gauzy-Lazo,p.173-187inAntibody-Drug Conjugate,Methods in Molecular Biology,Vol.1045,编辑L.Ducry,Humana Press(2013)用于制备式(II)或(III)的免疫缀合物。
表3.实例抗体的氨基酸序列
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别是野生型抗-Her2抗体重链(HC)和轻链(LC)的全长氨基酸序列。CDR区被加下划线。SEQ ID NO:3是抗-Her2LC-S159C和抗体20507-LC-S159C突变抗体的LC恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6分别是重链HC-E152C和HC-S375C和HC-E152C-S375C突变抗体的恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:7是抗体20507的轻链LC-K107C突变体。SEQ ID NO:8是抗-Her2HC-ins388-ybbR(其中ybbR标签被插在HC残基Glu388后)的突变重链的恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:9是抗-Her2和抗体20507HC-ins388-A1抗体(其中A1标签被插在HC残基Glu388后)的突变重链的恒定区的氨基酸序列。突变的Cys残基和插入的ybbR和A1序列标签以粗体显示，并在相应突变链的序列中加下划线。SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11分别是野生型抗体20507重链和轻链的恒定区的氨基酸序列。
抗体的产生
本发明的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)可以通过本领域已知的任何方式产生，包括但不限于重组表达、化学合成和抗体四聚体的酶消化，而全长单克隆抗体可通过例如杂交瘤或重组生产来获得。重组表达可以来自本领域中已知的任何适当的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本发明还提供了编码本文描述的抗体的多核苷酸，例如，编码重链或轻链可变区或包含如本文所述的互补决定区的片段的多核苷酸。
多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过编码抗体或其结合片段的现有的序列(例如，如在下面实施例中描述的序列)的PCR诱变来制备。核酸的直接化学合成可通过本领域中已知的方法来完成，所述方法例如Narang等人的磷酸三酯法，Meth.Enzymol.68:90,1979；Brown等人的磷酸二酯法，Meth.Enzymol.68:109,1979；Beaucage等人的二乙基磷酰胺酸(diethylphosphoramidite)法,Tetra.Lett.,22:1859,1981；和美国专利号4,458,066的固相支持法。通过PCR向多核苷酸序列引入突变可如以下文献所述进行，例如PCRTechnology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(Ed.),Freeman Press,NY,NY,1992；PCR PROTOCOLS:A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS,Innis等人.(Ed.),Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和Eckert等人,PCR Methods and Applications 1:17,1991。
在本发明中还提供了用于生产上述抗体或抗体片段的表达载体和宿主细胞。各种表达载体可被用来表达编码本发明的抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体都可用于在哺乳动物宿主细胞中生产抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体，典型地具有用于表达蛋白质或RNA和人类人工染色体的表达盒(见，例如，Harrington等人，Nat Genet 15:345,1997)。例如，可用于在哺乳动物(如人类)细胞中表达多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B&C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV载体和本领域已知的用于表达其它蛋白质的大量其它载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP埃巴病毒的载体，痘苗病毒载体和Semliki森林病毒(SFV)。参见Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
表达载体的选择取决于所述载体待被在其中表达的预期的宿主细胞。典型地，表达载体含有启动子和可操作地连接到编码本发明的抗体链或片段的多核苷酸的其它调节序列(例如，增强子)。在一些实施方案中，采用诱导型启动子，以防止除了诱导条件下之外的插入序列的表达。诱导型启动子包括，例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。转化的生物的培养物可以在非诱导条件下在不对编码表达产物被宿主细胞更好地耐受的序列的群体施加偏压的情况下进行扩增。除了启动子，其他调节元件也可能需要或期望用于本发明的抗体链或片段的有效表达。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其它序列。另外，表达的效率可以通过包含适合于使用的细胞系统的增强子而提高(参见例如Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于在哺乳动物宿主细胞中增加表达。
所述表达载体也可提供分泌信号序列位置，以形成具有通过插入的抗体序列编码的多肽的融合蛋白。更多的时候，插入的抗体序列在引入载体中之前连接于信号序列。用于接收编码抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。此类载体允许可变区作为融合蛋白与恒定区一起表达，从而导致产生完整抗体或其片段。通常，此类恒定区是人的。
携带和表达本发明的抗体链的宿主细胞可以是原核或真核细胞。大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本发明的多核苷酸的原核宿主。适合使用的其它微生物宿主包括杆菌，如枯草杆菌(Bacillus subtili)，和其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和各种假单胞菌(Pseudomonas)种。在这些原核宿主中，还可以制作表达载体，其通常含有与宿主细胞(例如，复制起点)兼容的表达控制序列。此外，任何数量的多种众所周知的启动子可以存在，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自λ噬菌体的启动子系统。启动子通常任选地与操纵基因序列一起控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于起始和完成转录和翻译。其它微生物如酵母也可用于表达本发明的抗体或抗体片段。也可以使用与杆状病毒载体组合的昆虫细胞。
在一个方面中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的抗体和抗体片段。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常必死的或正常或不正常的不朽的动物或人类细胞。例如，一些能够分泌完整免疫球蛋白的适当的宿主细胞系已被开发，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。表达多肽的哺乳动物组织细胞培养物的应用一般地讨论于例如，Winnacker,From Genes to Clones(从基因到克隆),VCHPublishers,N.Y.,N.Y.,1987中。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(见，例如，Queen等人，Immunol.Rev.89:49-68,1986)，和必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。这些表达载体通常含有来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性和/或可调制的或可调节的。有用的启动子包括，但不限于，金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域中已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主(一般参见Sambrook等人，同上)。其它方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹道方法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、融合到疱疹病毒结构蛋白VP22(Elliot和O'Hare,Cell 88:223,1997)、物质-增强的DNA吸收和离体转导。对于重组蛋白的长期、高产量生产，稳定的表达往往会被期望。例如，稳定表达抗体链或结合片段的细胞系可以使用含有病毒复制起点或内源表达元件和可选择的标记基因的本发明的表达载体来制备。在引入载体后，细胞可以在富集培养基中生长1-2天，然后将它们切换到选择培养基。可选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞在选择培养基中生长。抗性的、稳定转染的细胞可以使用适合于细胞类型的组织培养技术增殖。
实施例99：用于缀合研究的抗-Her2和抗体20507Cys和A1/ybbR标签突变抗体的克隆
编码抗-Her2抗体的重链和轻链的可变区的DNA寡核苷酸(Carter P,Presta L,Gorman CM,Ridgway JB,Henner D,Wong WL,Rowland AM,Kotts C,Carver ME,ShepardHM.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,4285-4289.Humanization of an anti-p185her2antibody for human Cancer therapy(用于人类癌症治疗的抗-p185her2抗体的人源化))被化学合成并克隆到两种哺乳动物表达载体即包含人IgG1和人κ轻链的恒定区的pOG-HC和pOG-LC中，得到两种野生型构建体，分别是pOG-抗-Her2抗体HC和pOG-抗-Her2抗体LC。在这些载体中，抗体重链和轻链的在哺乳动物细胞中的表达是由CMV启动子驱动。载体在重链和轻链的N-端编码合成的24个氨基酸的信号序列MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA(SEQ ID NO：12)，以引导它们从哺乳动物细胞分泌。该信号序列已经被验证在293FreestyleTM细胞中在数百种哺乳动物蛋白中有效定向蛋白分泌(Gonzalez R,JenningsLL,Knuth M,Orth AP,Klock HE,Ou W,Feuerhelm J,Hull MV,Koesema E,Wang Y,ZhangJ,Wu C,Cho CY,Su AI,Batalov S,Chen H,Johnson K,Laffitte B,Nguyen DG,SnyderEY,Schultz PG,Harris JL,Lesley SA.(2010)Proc Natl Acad Sci U S A.107:3552-7)。寡核苷酸定向诱变被用于制备抗-Her2抗体的LC-S159C突变体。化学合成对应于人κ轻链的恒定区中的LC-S159C突变位点的有义和反义引物(表4)。使用PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶(Stratagene)，以pOG-抗-Her2抗体HC和pOG-抗-Her2抗体LC作为模板进行PCR反应。在琼脂糖凝胶上证实PCR产物，并用DPN I处理，接着在DH5a细胞中转化(Klock等人,(2009)Methods Mol Biol.498:91-103)。
通过DNA测序证实LC-S159C突变体构建体的序列。野生型抗-Her2抗体重链的全长氨基酸序列示为SEQ ID NO:1，而轻链的显示为SEQ ID NO:2。LC-S159C突变抗体的氨基酸序列显示于表3中，C159以粗体和下划线表示。在人IgG1重链和人κ轻链中的氨基酸残基根据Eu编号系统(Edelman等人,(1969)Proc Natl Acad Sci USA,63:78-85)编号。抗-Her2-LC-S159C抗体进一步克隆入含有抗生素选择标记物的载体中，所述抗生素选择标记物用于在含有相应抗生素的培养基中选择稳定转染的细胞克隆。
类似地，采用表4中所列的DNA引物和上述方法克隆抗-Her2抗体的双Cys突变体即HC-E152C-S375C和另一抗体即抗体20507的四种Cys突变体(HC-E152C、HC-S375C、LC-K107C、LC-S159C、HC-E152C-S375C)。抗体20507含有人IgG1重链和人κ轻链。抗体20507的重链和轻链的恒定部分与抗-Her2抗的那些在氨基酸序列上是相同的。所述抗-Her2抗体和抗体20507的Cys突变体的恒定区的氨基酸序列显示表3中，突变的Cys用粗体和下划线表示。
ybbR和A1肽序列向抗-Her2抗体重链的恒定区的插入是用标准的分子生物学方法完成的。载体pOG-抗-Her2抗体HC担任PCR模板，以获得相应的HC-ins388-ybbR和HC-ins388-A1插入突变体。表4列出了用于这些构建体的克隆的有义和反义引物。通过扩增抗体20507重链的可变区制备编码抗体20507-HC-ins388-A1插入突变体的载体。扩增的DNA片段然后转移到编码抗-Her2-HC-ins388-A1插入突变体的现有载体中。编码肽标记的重链的所有所得的表达载体通过DNA测序证实。具有HC-ins388-ybbR和HC-ins388-A1插入的抗-Her2抗体进一步克隆到具有抗生素选择标记物的载体中，从而允许稳定表达各肽标记的构建物的克隆的随后分离。抗-Her2抗体和抗体20507的A1/ybbR插入突变体的恒定区的氨基酸序列显示在表3中。插入的肽标签以粗体显示并加下划线。
如实施例100中所述制备抗-Her2和抗体20507Cys和A1标签突变抗体，并如在实施例101、102、103、104和105中所述与示例性式(I)细胞毒性肽缀合。
表4.用于克隆突变抗体的突变引物的DNA序列。
实施例100:抗-Her2及抗体20507Cys和A1/ybbR标签突变抗体的制备
使用先前所述的瞬时转染法通过共转染重链和轻链质粒在293FreestyleTM细胞中表达抗-Her2和抗体20507Cys、A1标签和由ybbR标签突变体(Meissner,等人,BiotechnolBioeng.75:197-203(2001))。在共转染中所用的DNA质粒按照制造商的方案用Qiagen质粒制备试剂盒制备。293FreestyleTM细胞在37℃、5％CO2下在FreestyleTM表达培养基(Invitrogen)中以混悬液培养。转染前一天，将细胞以0.7x 106个细胞/ml分配到新鲜培养基中。在转染的当天，细胞密度通常达到1.5x 106细胞/ml。使用PEI方法(Meissner等，2001同上)，将细胞用1:1比例的重链和轻链质粒的混合物转染。将转染的细胞进一步培养五天。通过在2000x g离心培养物20分钟收获培养物的培养基，并通过0.2微米的过滤器过滤。使用蛋白A-SepharoseTM(GE Healthcare Life Sciences)从过滤的培养基纯化表达的抗体。采用pH 3.0洗脱缓冲液从蛋白A-SepharoseTM柱洗脱抗体IgG。将洗脱的IgG溶液立即用1MTris-HCl(pH 8.0)中和，随后缓冲液交换到PBS中。
抗-Her2-LC-S159C、抗-Her2-HC-ins388-ybbR和抗-Her2-HC-ins388-A1抗体的表达构建体也被转染到CHO细胞中。根据标准方案，然后使用抗生素选择稳定表达这些抗体的细胞。通过如上所述的蛋白A-琼脂糖(Sepharose)色谱法纯化在选择的CHO细胞克隆中表达的所有抗-Her2抗体构建体。
在另一项研究中，抗-Her2-LC-S159C抗体稳定表达在CHO细胞中，随后通过抗生素选择进行选择。通过如上所述的蛋白A-琼脂糖柱方法纯化在建立的CHO细胞克隆中表达的抗-Her2-LC-S159C抗体。
免疫缀合物
包含此类细胞毒性肽作为有效载荷(药物)的本发明的免疫缀合物包括式(II)的缀合物:
其中:
Ab表示抗原结合部分；
L是连接体，其选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
y是1至16的整数；
R101是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基二价基团，其中所述6元杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1或C-连接至L1的，且所述6元杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或R101是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团，其中5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1或C-连接至L1的，且5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、或-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R11或
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R11是C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
包含此类细胞毒性肽作为有效载荷(药物)的本发明的其它免疫缀合物包括式(III)的缀合物:
其中:
Ab表示抗原结合部分；
L选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
y是1至16的整数；
R1是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述6元杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或R1是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中5-8元稠合的二环杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R11是C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
R17是键、-NH-、-NHS(＝O)2-、
R18是键、
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
本发明的其它式(II)和式(III)的免疫缀合物提供在下面列举的实施方案中。
本发明提供免疫缀合物，其包含一个或多个与抗原结合部分(例如抗体或抗体片段)连接的抗-有丝分裂细胞毒性肽。优选的本发明的免疫缀合物是文中描述的式(II)或(III)的那些。制备此类免疫缀合物的方法是本领域众所周知的。优选的免疫缀合物包括但不限于表5中公开的那些，以及其变体，所述变体具有代替抗-Her2抗体的另外的抗原结合部分，特别是其中抗-Her2抗体被选自以下列表的抗体替换的此类缀合物：抗-雌激素受体抗体、抗-孕酮受体抗体、抗-p53抗体、抗-EGFR抗体、抗-组织蛋白酶D抗体、抗-Bcl-2抗体、抗-E-钙粘蛋白抗体、抗-CA125抗体、抗-CA15-3抗体、抗-CA19-9抗体、抗-c-erbB-2抗体、抗-P-糖蛋白抗体、抗-CEA抗体、抗-视网膜母细胞瘤蛋白抗体、抗-ras癌基因蛋白抗体、抗-Lewis X抗体、抗-Ki-67抗体、抗-PCNA抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD5抗体、抗-CD7抗体、抗-CD8抗体、抗-CD9/p24抗体、抗-CD1-抗体、抗-CD11c抗体、抗-CD13抗体、抗-CD14抗体、抗-CD15抗体、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体、抗-CD22抗体、抗-CD23抗体、抗-CD30抗体、抗-CD31抗体、抗-CD33抗体、抗-CD34抗体、抗-CD35抗体、抗-CD38抗体、抗-CD39抗体、抗-CD41抗体、抗-LCA/CD45抗体、抗-CD45RO抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD71抗体、抗-CD95/Fas抗体、抗-CD99抗体、抗-CD100抗体、抗-S-100抗体、抗-CD106抗体、抗-泛素抗体、抗-c-myc抗体、抗-细胞角蛋白抗体、抗-λ轻链抗体、抗-黑素体抗体、抗-前列腺特异性抗原抗体、抗-tau抗原抗体、抗-纤维蛋白抗体、抗-角蛋白抗体和抗-Tn-抗原抗体。
在一些实施方案中，式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物包含具有抗原-结合活性的抗体或抗体片段Ab，其中连接体L在Ab的半胱氨酸硫原子处连接至Ab。用于与半胱氨酸硫基团反应的典型反应基团和得到的形成基团列在表1中。通过与抗原结合部分的半胱氨酸残基反应形成的连接体构件的非限制实例包括但不限于
在其它实施方案中，式(II)或式(III)的免疫缀合物包含具有抗原-结合活性的抗体或抗体片段Ab，其中连接体通过Ab中的桥连二硫键连接至Ab。在此类实施方案中，经和含有羟胺的式(I)化合物反应形成部分。
在一些实施方案中，式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物包含具有抗原-结合活性的抗体或抗体片段Ab，其中连接体L在赖氨酸的游离–NH2处与Ab连接。通过与抗原结合部分的赖氨酸残基的–NH2反应形成的连接体构件，其中各p是1-10，且各R独立地是H或C1-4烷基(优选甲基)，包括但不限于
在一些实施方案中，式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物包含具有抗原-结合活性的抗体或抗体片段Ab，其中连接体L在改造进抗体中的Pcl或Pyl基团处与Ab连接。参见例如Ou,等人,PNAS 108(26),10437-42(2011)。与Pcl或Pyl基团反应形成的连接体构件包括但不限于其中R20是H或Me，且R30是H、Me或苯基，对于连接，其中显示的酰基基团连接至改造的抗体中的Pcl或Pyl的赖氨酸部分。
在一些实施方案中，式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物包含具有抗原-结合活性的抗体或抗体片段Ab，其中连接体L在改造进抗体的S6、ybbR或A1肽中的丝氨酸残基处与Ab连接。与此类丝氨酸残基反应形成的连接体构件包括但不限于
例如，用于形成式(II)的免疫缀合物的一个一般反应流程显示在下面的流程13中：
流程13
其中RG1是来自表1的反应基团1，且RG2是来自表1的反应基团1，并且各基团的反应产物(见表1中)是连接体L的连接体构件。R101、R2、R3、L和Ab如文中所定义。
用于形成式(II)的免疫缀合物的另一一般反应流程显示在下面的流程14中:
流程14
其中RG1是来自表1的反应基团1，且RG2是来自表1的反应基团1，并且各基团的反应产物(见表1中)是连接体L的连接体构件。R101、R2、R3、L和Ab如文中所定义。
例如，用于形成式(III)的免疫缀合物的一个一般反应流程显示在下面的流程15中：
流程15
其中RG1是来自表1的反应基团1，且RG2是来自表1的反应基团1，并且各基团的反应产物(见表1中)是连接体L的连接体构件。R1、R2、R3、L和Ab如文中所定义。
用于形成式(II)的免疫缀合物的另一一般反应流程显示在下面的流程16中:
流程16
其中RG1是来自表1的反应基团1，且RG2是来自表1的反应基团1，并且各基团的反应产物(见表1中)是连接体L的连接体构件。R1、R2、R3、L和Ab如文中所定义。
在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物以及至少一种药学上可接受的载体。该药物组合物可被配制用于特定的施用途径，例如静脉内施用、肠胃外施用等。
本发明的免疫缀合物一般被在水性缓冲液和/或等渗水溶液中配制成溶液或混悬液。它们典型地通过注射或输注胃肠外施用。它们的配制和施用方法类似于其他基于生物的制药如抗体治疗的那些配制和施用方法，并且是本领域中的技术人员中已知的。
某些注射用组合物是等渗水溶液或混悬液，栓剂可有利地由脂肪性乳剂或混悬剂来制备。所述组合物可以被灭菌和/或含有辅助剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以含有其它治疗上有价值的物质。所述组合物分别按照常规的混合、制粒或包衣方法制备，并且含有约0.1-75％，或含有约1-50％的活性成分。
从某些式(I)的细胞毒性肽获得的表2中列出的体外细胞杀伤效力表明此类式(I)化合物显示出有价值的药理活性，因此这些化合物可以用作ADC的有效载荷。如文中所证实，包含式(I)化合物的免疫缀合物在体外对靶细胞呈现出实质活性，并在体内对肿瘤呈现出实质活性，这由代表不同的人癌症的异种移植肿瘤的有效的生长抑制所证实。因此，包含与抗原结合部分例如抗体连接的式(I)和其子式的有效载荷的本发明式(II)或(III)的免疫缀合物还可用于治疗癌症例如胃瘤、骨髓瘤、结肠瘤、鼻咽瘤、食道瘤和前列腺瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如髓性白血病、淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多毛细胞白血病)、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、多发性骨髓瘤、膀胱瘤、肾瘤、胃瘤(例如胃肠道间质瘤(GIST))、肝癌、黑色素瘤和胰腺癌以及肉瘤。
本发明的一个实施方案提供式(I)和其子式化合物与抗原结合部分的缀合，从而形成文中所述的式(II)或式(III)的免疫缀合物。
包含式(I)或其子式化合物的本发明的免疫缀合物特别可用于治疗被抗-有丝分裂毒素抑制的本领域已知的癌症以及文中证实的对本发明的化合物和缀合物的抑制易感的那些肿瘤类型。适当的用于治疗的适应症包括但不限于胃瘤、骨髓瘤、结肠瘤、鼻咽瘤、食道瘤和前列腺瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如髓性白血病、淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多毛细胞白血病)、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、多发性骨髓瘤、膀胱瘤、肾瘤、胃瘤(例如胃肠道间质瘤(GIST))、肝癌、黑色素瘤和胰腺癌以及肉瘤。包含式(I)或其子式化合物的本发明的免疫缀合物特别可用于治疗。在进一实施方案中，所述治疗用于可以被抗-有丝分裂毒素治疗的疾病。在另一实施方案中，本发明化合物可用于治疗癌症，包括但不限于胃瘤、骨髓瘤、结肠瘤、鼻咽瘤、食道瘤和前列腺瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如髓性白血病、淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多毛细胞白血病)、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、多发性骨髓瘤、膀胱瘤、肾瘤、胃瘤(例如胃肠道间质瘤(GIST))、肝癌、黑色素瘤和胰腺癌以及肉瘤。
所述的方法典型地包括将有效量的文中所述的本发明的免疫缀合物或包含此类免疫缀合物的药物组合物施用至需要此治疗的个体。免疫缀合物可以通过任何适当的方法例如文中描述的那些施用，施用可以以由治疗医师选择的间隔重复进行。
因此，作为另一实施方案，本发明提供式(II)或(III)的免疫缀合物或文中描述的此类化合物的任何实施方案在制备药物中的用途。在另一实施方案中，所述药物用于治疗可以被抗-有丝分裂毒素治疗的疾病。在另一实施方案中，所述疾病选自胃瘤、骨髓瘤、结肠瘤、鼻咽瘤、食道瘤和前列腺瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如髓性白血病、淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多毛细胞白血病)、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、多发性骨髓瘤、膀胱瘤、肾瘤、胃瘤(例如胃肠道间质瘤(GIST))、肝癌、黑色素瘤和胰腺癌以及肉瘤。
对于约50-100kg的个体，本发明的药物组合物或组合可以是约1-1000mg活性成分的单位剂量，或约1-500mg或约1-250mg或约1-150mg或约0.5-100mg或约1-50mg的活性成分。化合物、其药物组合物或组合的治疗有效剂量依赖于个体的物种、体重、年龄和个体状况、所治疗的病症或疾病或其严重程度。普通技术的医师、临床医师或兽医可以容易地确定预防、治疗或抑制病症或疾病的进展所需的各活性成分的有效量。
上面引用的剂量性质可在体外和体内试验有利地使用哺乳动物例如小鼠、大鼠、狗、猴或离体器官、组织及其制品来证实。本发明的化合物可以以溶液例如水溶液的形式体外施用，和经肠、胃肠外、有利地静脉内例如作为混悬液或水溶液体内施用。体外剂量可以在约10-3至10-12摩尔浓度之间。根据施用的途径，体内治疗有效量可以为约0.1-500mg/kg或约1-100mg/kg。
本发明的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物可以与一种或多种治疗共活性剂同时施用或在之前或之后施用。本发明的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物可以通过相同或不同的施用途径被单独施用或作为共活性剂在相同的药物组合物一起施用。
在一个实施方案中，本发明提供一种产品，其包含式(I)或其子式化合物和至少一种其它治疗共活性剂，其作为在治疗中同时、单独或顺序使用的组合制剂。在一个实施方案中，该治疗是用抗有丝分裂毒素的疾病或疾患如癌症的治疗。作为组合制剂提供的产品包括组合物，该组合物含有式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物和一起在同一药物组合物中的另外的治疗共活性剂，或分开形式例如药盒形式的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物和另外的治疗共活性剂。
在一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物，以及另外的治疗共活性剂。任选地，该药物组合物可包含药学上可接受的载体，如上所述。
与本发明的化合物和缀合物一起使用的合适的共活性剂包括其它抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐药)、止痛药、抗炎剂、细胞保护剂及其组合。
考虑用于与本文公开的化合物和缀合物组合使用的具体共活性剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、柔红霉素盐酸盐柔红霉素柠檬酸盐脂质体注射液地塞米松、多西他赛多柔比星盐酸盐依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞磷胆碱)、羟脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤氨甲喋呤米托蒽醌Mylotarg、紫杉醇Phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生20与卡莫司汀植入物他莫昔芬柠檬酸盐替尼泊苷6-硫鸟嘌呤、塞替派、替拉扎明盐酸拓扑替康注射液长春碱长春新碱和长春瑞滨
在一个实施方案中，本发明提供包含两种或更多种分开的药物组合物的药盒，其中至少一种药物组合物含有式(II)或式(III)或其子式。在一个实施方案中，药盒包括用于分别容纳所述组合物的工具，诸如容器、分开的瓶或分开的箔包。
在本发明的组合治疗中，本发明的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物和其它治疗共活性剂可以由相同或不同的制造商制备和/或配制。此外，本发明的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物和其它治疗剂可以如下被一起引入组合治疗：(i)以将组合产品发放给医生之前(例如，在包括在本发明的化合物和其它治疗剂的药盒的情况下)；(ii)施用前不久由医生自己(或在医师的指导下)；(iii)患者自己，例如在本发明的化合物和其它治疗剂的顺序施用期间。
本发明还提供用于用细胞毒性肽治疗疾病或疾患的方法的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物。本发明还提供用于用细胞毒性肽治疗疾病或疾患的方法的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物，其中式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物被制备与另外的治疗剂一起施用。本发明还提供用于用细胞毒性肽治疗疾病或疾患的方法的另外的治疗共活性剂，其中所述另外的治疗共活性剂被制备用于与式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物一起施用。本发明还提供用于用抗-有丝分裂毒素治疗疾病或疾患的方法的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物，其中式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物与另外的治疗共活性剂一起施用。本发明还提供用于用抗-有丝分裂毒素治疗疾病或疾患的方法的另外的治疗共活性剂，其中另外的治疗共活性剂与式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物一起施用。
本发明还提供了式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物用于与细胞毒性肽治疗疾病或疾患的用途，其中所述患者先前(例如24小时内)已用另外的治疗剂治疗。本发明还提供了另外的治疗剂用于与抗有丝分裂毒素治疗疾病或疾患的用途，其中所述患者先前(例如24小时内)已用式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物处理。
本发明还提供用于用抗-有丝分裂毒素治疗疾病或疾患的方法中的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物。本发明还提供用于用抗-有丝分毒素治疗疾病或疾患的方法中的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物，其中式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物被制备用于与另外的治疗剂一起施用。本发明还提供用于用抗-有丝分毒素治疗疾病或疾患的方法中的另外的治疗共活性剂，其中另外的治疗共活性剂被制备用于与式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物一起施用。本发明还提供用于用抗-有丝分毒素治疗疾病或疾患的方法中的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物，其中式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物与另外的治疗共活性剂一起施用。本发明还提供用于用抗-有丝分毒素治疗疾病或疾患的方法中的另外的治疗共活性剂，其中另外的治疗共活性剂与式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物一起施用。
本发明还提供了式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物用于与抗-有丝分毒素治疗疾病或疾患的用途，其中所述患者先前(例如24小时内)已用另外的治疗剂治疗。本发明还提供了另外的治疗剂用于与抗有丝分裂毒素治疗疾病或疾患的用途，其中所述患者先前(例如24小时内)已用式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物处理。
连接体-有效载荷(L-P)与抗原结合部分的缀合
实施例101:通过抗-Her2和抗体20507Cys突变抗体与式(I)的细胞毒性肽缀合形成的抗体药物缀合物(ADC)
缀合连接体-有效载荷与抗原结合部分的许多方法在本领域中是已知的(综述于例如：Antibody-Drug Conjugate,Methods in Molecular Biology,Vol.1045,编辑L.Ducry,Humana Press(2013))。在本实施例中，采用Junutula JR,Raab H,Clark S,Bhakta S,Leipold DD,Weir S,Chen Y,Simpson M,Tsai SP,Dennis MS,Lu Y,Meng YG,NgC,Yang J,Lee CC,Duenas E,Gorrell J,Katta V,Kim A,McDorman K,Flagella K,VenookR,Ross S,Spencer SD,Lee Wong W,Lowman HB,Vandlen R,Sliwkowski MX,Scheller RH,Polakis P,Mallet W.(2008)Nature Biotechnology 26:925-932描述的方法，将包含连接体的本发明的式(I)化合物缀合到改造进抗体的半胱氨酸残基。文中使用一小组的Cys抗体突变体举例说明本发明的式(I)的细胞毒性肽的缀合，但是可以预料的是，细胞毒性肽可以缀合到大多数(如果不是所有的话)Cys抗体突变体。此外，预期细胞毒性肽可以与众多(如果不是所有的话)抗体的Cys突变体缀合。
因为在哺乳动物细胞中表达的抗体中的改造的Cys在它们的生物合成过程中被加合物(二硫化物)如谷胱甘肽(GSH)和/或半胱氨酸修饰(Chen等人2009)，最初所表达的产物中的经修饰的Cys对硫醇基反应试剂如马来酰亚氨基或者溴-或碘-乙酰胺基团是非反应性的。为了在表达后缀合改造的半胱氨酸，需要通过还原这些二硫化物除去谷胱甘肽或半胱氨酸加合物，这通常需要还原在表达的蛋白质中的所有二硫化物。这可以通过首先暴露抗体于还原剂如二硫苏糖醇(DTT)，随后进行允许对抗体的所有天然二硫键的再氧化，以恢复和/或稳定功能性抗体结构的操作来实现。因此，为了还原所有天然二硫键和改造的半胱氨酸残基的半胱氨酸或GSH加合物之间的二硫键，将新鲜制备的DTT加入到纯化的抗-Her2或抗体20507Cys突变体构建体中，至20mM的终浓度。用DTT在37℃下孵育1小时后，将混合物在4℃采用PBS透析3天，每天更换缓冲液以除去DTT，并再氧化天然的二硫键。另一种方法是通过脱盐柱例如Sephadex G-25以除去还原剂。一旦蛋白质被完全还原，将1mM的氧化的抗坏血酸盐(脱氢抗坏血酸)加到脱盐样品中，并再氧化孵育20小时。这两种方法产生类似的结果。然而，试图效仿以前在文献中描述的使用CuSO4的再氧化方案时，导致蛋白质沉淀(Junutula JR,Raab H,Clark S,Bhakta S,Leipold DD,Weir S,Chen Y,Simpson M,TsaiSP,Dennis MS,Lu Y,Meng YG,Ng C,Yang J,Lee CC,Duenas E,Gorrell J,Katta V,KimA,McDorman K,Flagella K,Venook R,Ross S,Spencer SD,Lee Wong W,Lowman HB,Vandlen R,Sliwkowski MX,Scheller RH,Polakis P,Mallet W.(2008)NatureBiotechnology 26:925)。本文中所有的实施例都使用上述透析方案。再氧化恢复链内二硫化物，而透析去除最初连接到抗体的改造的半胱氨酸的半胱氨酸和谷胱甘肽。
再氧化后，将抗体缀合到式(I)的细胞毒性肽，其中式(I)的细胞毒性肽包含连接体和反应性部分。例如，将具有连接的马来酰亚胺部分的式(I)的细胞毒性肽(相对于抗体10摩尔当量)加入到在PBS缓冲液(pH值7.2)中的重新氧化的抗-Her2或抗体20507Cys突变抗体。温育1小时。通过能够从非缀合抗体分离缀合抗体的反相HPLC监测缀合过程。将缀合反应混合物在PRLP-S柱进行分析(50mm x 2.1mm,Agilent)，加热至80℃，柱的洗脱通过30-60％乙腈的水(含有0.1％TFA)溶液的线性梯度进行，流速1.5ml/min。在280nm、254nm和215nm处监测从柱的蛋白质的洗脱。
各种具有连接的马来酰亚胺的细胞毒性肽与抗-Her2或抗体20507Cys突变抗体的缀合效率取决于使用的细胞毒性肽的溶解性而不同，但大多数反应导致超过90％缀合物(表5和6)。为了评价聚集状态，将所得到的缀合物在尺寸排阻层析柱(GE,Superdex200,3.2/30)以0.1ml/min流速在PBS中分析。所有的缀合物主要是单体的。大多数缀合物含有小于3％的二聚和低聚物质(表5和6)，这表明具有连接的马来酰亚胺的此类细胞毒性肽与抗-Her2或抗体20507Cys突变抗体的缀合没有引起聚集。同样地，通过A1或ybbR标签(实施例104和105)的酶缀合也以大于90％(表7和9)缀合效率进行，并导致是单体的缀合物，具有小于3％的可检测的聚集体(表7和9)。
该缀合物的特征还在于在细胞毒性肽与抗体结合部分的平均负载，通常被称为药物与抗体比(DAR)。该DAR值从还原和去糖基化样品的LC-MS的数据推知。LC/MS使得能够定量连接到ADC中的抗体的有效载荷(药物)的平均分子数目。HPLC将抗体分离为轻链和重链，并根据每条链连接体-有效载荷基团的数量分离重链(HC)和轻链(LC)。质谱数据能够鉴定混合物中的组分种类，例如，LC、LC+1、LC+2、HC、HC+1、HC+2等。从LC和HC链上的平均负载，可以计算ADC的平均DAR。给定的缀合物样品的DAR表示连接到含有两条轻链和两条重链的四聚体抗体的药物(有效载荷)分子的平均数目。表5和6给出了采用抗-Her2或抗体20507抗体和具有连接的马来酰亚胺的某些细胞毒性肽获得的缀合物获得的DAR值。
作为比较，按照相同的方案，将抗体20507-LC-S159C突变抗体与马来酰亚氨基己酰基单-甲基澳瑞他汀(auristatin)F(MC-MMAF；Doronina SO,Mendelsohn BA,Bovee TD,Cerveny CG,Alley SC,Meyer DL,Oflazoglu E,Toki BE,Sanderson RJ,Zabinski RF,Wahl AF,Senter PD.Bioconjug.Chem.2006Jan-Feb；17(1):114-24.)缀合。比较抗体20507-LC-S159C-MMAF ADC的性质列于表6中。
实施例102：通过非-改造的抗体的天然二硫键的部分还原的抗体药物缀合物的制备
本发明的细胞毒药物还能够采用涉及抗体的部分还原的方法缀合至非-改造的抗体的天然半胱氨酸残基(Doronina,S.O.,Toki,B.E.,Torgov,M.Y.,Mendelsohn,B.A.,Cerveny,C.G.,Chace,D.F.,DeBlanc,R.L.,Gearing,R.P.,Bovee,T.D.,Siegall,C.B.,Francisco,J.A.,Wahl,A.F.,Meyer,D.L.,和Senter,P.D.(2003)Development of potentmonoclonal antibody auristatin conjugates for cancertherapy.Nat.Biotechnol.21,778-784)。在该实施例中，通过加入固体巯基乙胺到50mM的终浓度，并在37℃温育混合物1小时，将5至10mg/ml浓度的抗-Her2和抗体20507抗体的链间和链内二硫键在含有2mM EDTA的PBS中部分还原。脱盐和加入1％w/v PS-20洗涤剂后，将部分还原的抗体(1-2mg/ml)在4℃与每10mg抗体0.5至1mg的有效载荷化合物10过夜反应。经蛋白A色谱法纯化由此得到的ADC、抗-Her2-10和抗体20507-10。用PBS基线洗涤后，用50mM柠檬酸盐(pH值2.7)、140mM NaCl洗脱缀合物，中和并无菌过滤。通过疏水相互作用色谱法和MS，所得的两种ADC即抗-Her2-10和抗体20507-10的平均DAR确定分别为4.1和4.6。两种ADC的选取的生化性质显示在表5和6中。除抗-Her2抗体和抗体20507，预期采用上述方法(实施例102)，本发明的细胞毒性肽可以缀合众多(如果不是全部)抗体的天然半胱氨酸残基。
表5.各种抗-Her2Cys突变体ADC的性质
a由突变的抗体的描述和对应于化学缀合步骤中使用的化合物的最后的数字构成的名字。
b通过反相HPLC测量缀合效率，其描述抗体转化至ADC的百分比。
c根据反相HPLC的药物-与-抗体比。
d通过分析尺寸排阻色谱法测量聚集，包括二聚和低聚种类。
表6.各种抗体20507Cys突变体ADC的性质
a由突变的抗体的描述和对应于化学缀合步骤中使用的化合物的最后的数字构成的名字。
b通过反相HPLC测量缀合效率，其描述抗体转化至ADC的百分比。
c根据反相HPLC的药物-与-抗体比。
d通过分析尺寸排阻色谱法测量聚集，包括二聚和低聚种类。
实施例103:使用1,3-二氯丙-2-酮以重新连接非-改造的抗体的天然二硫键的抗体药物缀合物的制备
使用实施例102中的方法，与非-改造抗体的天然半胱氨酸残基的缀合具有如下缺点：一些天然稳定抗体的天然二硫键被断裂，并在药物缀合之后仍然如此。在一种克服这个缺点的备选方法中，首先还原抗体的链间和链内二硫键，然后通过与1,3-二氯丙-2-酮反应重新化学连接。在这个方法中，在抗体的四个天然链间二硫键被三碳“酮桥”(流程17)替换。酮基然后能够在第二步骤中特异性地与细胞毒性药物缀合。由此产生的ADC具有在抗体的四个天然链间二硫键的位置特异性连接的最多四个药物。与部分还原的天然二硫化物的传统缀合(实施例102)相比，在该实施例中制备的ADC更稳定。在一个实施例中，通过标准方法和如上所述制备非-改造的、重组抗-Her2。纯化后，按照流程17以两个步骤，将修饰的抗-Her2缀合至细胞毒性药物。
流程17
步骤1:还原天然二硫化物桥，并使用1,3-二氯丙-2-酮再桥连：在4℃，将TCEP·HCl(47.2μg,0.165μmol)加入到抗-Her2IgG(2036μg,0.014μmol)和1,3-二氯丙-2-酮(220μg,1.648μmol)的在Tris缓冲液(pH7.4,0.25M,177μL)中的溶液中。将得到的混合物在4℃保持4h。然后使用Zeba旋转柱7K MWCO，用PBS(pH 7.4)作为洗脱缓冲液，将反应混合物脱盐。通过10K Amicon滤器，将得到的溶液浓缩得到修饰的抗-Her2)。ESI(洗脱剂A:水+0.1％甲酸,洗脱剂B:乙腈+0.04％甲酸。梯度:在2min从3％至80％B–流速1.0ml/min。柱:ProswiftMonolith 4.6*50mm 40℃)；145399Da(通过PNGase F(New England biolab)去糖基化后)。
步骤2:细胞毒药物的缀合:在23℃，将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(6-(氨基氧基)己酰基)-2-氮杂二环[2.2.1]庚烷-3-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(22)(77μg,0.078μmol,0.77μL在DMSO中)和3,5-二氨基苯甲酸(355μg,2.334μmol,1.42μL在DMSO中)溶液加至修饰的抗-Her2(577.5μg,0.0039μmol,35μL在PBS,pH7.4中)溶液中。将得到的混合物在23℃保持21h。然后使用Zeba旋转柱7K MWCO，用PBS(pH 7.4)作为洗脱缓冲液，将反应混合物脱盐两次，得到与化合物(22)缀合的修饰的抗-Her2。ESI-MS(洗脱剂A:水+0.1％甲酸,洗脱剂B:乙腈+0.04％甲酸.梯度:在2min，从3％至80％B–流速1.0ml/min.柱:Proswift Monolith 4.6*50mm 40℃)；147955Da(DAR 3),148807Da(DAR 4)(通过用PNGase F(New England biolab)处理去糖基化后)。整体DAR计算为DAR 3.7。
尽管此处仅对用于抗-Her2抗体进行了显示，但是预期该实施例中的缀合方法适用于众多(如果不是全部)其它抗体。
实施例104:抗-Her2和抗体20507A1/ybbR标签突变抗体与式(I)的细胞毒性肽的缀合
翻译后-4'-磷酸泛酰巯基乙胺基化是用结构不同的小分子位点特异性标记重组蛋白的一种通用的方法(Yin J,Straight PD,McLoughlin SM,Zhou Z,Lin AJ,Golan DE,Kelleher NL,Kolter R,Walsh CT(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:15815-15820)(Zhou Z,Cironi P,Lin AJ,Xu Y,Hrvatin S,Golan DE,Silver PA,Walsh CT,Yin J(2007)ACS Chem.Biol.2:337-346)。这种基于混杂4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTases)的催化作用的酶方法被采用用于制备高度同质化的ADC(WO2013184514)。酶标记是通过在IgG1抗体的恒定区的不同位点引入11或12-mer S6、ybbR和A1肽序列来完成的。虽然下面的实施例描述了用于仅一个位点的PPTase介导的ADC的形成，但是预期该方法适用于抗体骨架内的许多插入位点，并预期可应用于众多的抗体。
Burkart和同事以前的工作表明PPTases作为接受多种CoA-报道分子类似物作为底物的多功能酶(La Clair JJ,Foley TL,Schegg TR,Regan CM,Burkart MD(2004)Chem.Biol.11:195-201)。因此，为了将药物有效载荷转变为适合用于PPTase催化的底物，通过迈克尔(Michael)加成将含有式(I)的细胞毒性肽的马来酰亚胺缀合到CoA的末端硫醇基(见实施例43)。使细胞毒性肽共价连接至酶识别元件，将所得的细胞毒性CoA-肽类似物(化合物20)酶促地缀合到各抗体的嵌入式肽序列。例如，2.5μM的抗-Her2-HC-ins388-ybbR抗体或抗体20507-HC-ins388-A1在1μM的来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的SfpPPTase的存在下与30μM细胞毒性CoA-肽类似物(化合物20)(相对于抗体，12摩尔当量的)缀合。酶促缀合反应在室温下在补充有20mM NaCl和12.5mM MgCl2的75mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中进行约16小时。为了保证抗体20507-HC-ins388-A1被细胞毒性有效载荷近乎完全标记，孵育时间被延长另外三天，CoA-肽类似物(化合物20)和Sfp PPTase的浓度分别增加至35μM(相对于抗体14摩尔当量)和2μM。缀合后，Sfp PPTase和过量的试剂被蛋白A亲和色谱法(蛋白A-SepharoseTM，GE Healthcare Life Sciences)去除。柱的洗脱用0.1M的醋酸钠缓冲液(pH为3.0)进行，接着立即用1M的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中和。肽-标记的ADC最终用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)缓冲交换到PBS中。
用6-min线性梯度的25-50％乙腈的水(含有0.1％三氟乙酸)溶液，通过分析HPLC在PLRP-S柱(5μM,50x 4.6mm,Agilent Technologies)上测定有效载荷缀合的程度。在280nm波长监测缀合的和非缀合的抗体的反相分离。对于该目的，HPLC峰积分指示抗-Her2-HC-ins388-ybbR和20507-HC-ins388-A1抗体用CoA-肽类似物(化合物20)几乎完全标记。酶促标记的ADC的鉴定被相应的还原和去糖基化的样品的去卷积(deconvoluted)ESI-MS谱进一步确证。如表8所示，观察到的质量与抗-Her2-HC-ins388-ybbR和20507-HC-ins388-A1抗体的药物标记的重链的计算分子量一致。最后，通过分析尺寸排阻色谱法(AnSEC)在Shodex PROTEIN KW-803柱上分析酶促标记的ADC。在对应于单体ADC的表观分子量的保留时间处洗脱出两种抗体缀合物(见表7)。没有检测到其他种类，表明亲水CoA-肽类似物的缀合没有促进抗体聚集。
表7.抗-Her2和抗体20507A1/ybbR标签ADC的性质
aHC-ins388是指在重链的残基Glu388后插入A1或ybbR肽标签。最后的数字对应于化学缀合步骤中使用的化合物。
b通过反相HPLC测量缀合效率，其描述抗体转化至ADC的百分比。
c根据反相HPLC的药物-与-抗体比。
d通过分析尺寸排阻色谱法测量聚集，并包括二聚和低聚种类。
表8.抗-Her2和抗体20507A1/ybbR标签ADC的性质
aHC-ins388是指在重链的残基Glu388后插入A1或ybbR肽标签。最后的数字对应于化学缀合步骤中使用的化合物。
b在Agilent 6520Q-TOF仪器(Agilent Technologies)上检测的以道尔顿为单位的质量。
c对于缀合的重链预测的以道尔顿为单位的质量。
d对于未偶联的重链预测的以道尔顿为单位的质量。
实施例105：A1/ybbR-标记的抗-Her2和抗体20507突变抗体与式(I)的细胞毒性肽的两步缀合
该两步方法是通过翻译后-4'-磷酸泛酰巯基乙胺基化(WO2013184514)来制备位点特异性的ADC的替代策略。这种方法的第一个步骤是基于使用含有生物正交基团诸如叠氮基、烯烃、炔烃、酮、或醛部分的CoA类似物的肽标记的抗体的PPTase催化的标记。在生物正交标记的抗体亲和纯化后，所述两步法的第二步骤涉及包含与所述生物正交基团反应的部分的细胞毒性有效载荷的缀合。作为举例，下面的部分描述了含有在重链的恒定区中的特定位点的A1或ybbR标记插入的抗体20507和抗-Her2突变抗体的两步法。此外，下面的部分描述了包含在重链的恒定区中的特定位点的A1或ybbR标记插入的抗体20507和抗Her2突变抗体的两步法。然而，可以预料，这种策略广泛地适用于各种各样的抗体的恒定区内的众多插入位点。此外，虽然所述两步法以肟连接(ligation)和无铜点击化学为例进行，可以设想，这种策略可以扩展到其他生物正交化学，如Staudinger连接、基于异腈的点击化学和四嗪连接。
肟连接和无铜点击化学已经被几个研究小组作为制备位点特异性的蛋白质缀合物的高效、生物正交方法使用(Axup JY,Bajjuri KM,Ritland M,Hutchins BM,Kim CH,Kazane SA,Halder R,Forsyth JS,Santidrian AF,Stafin K,Lu Y,Tran H,Seller AJ,Biroc SL,Szydlik A,Pinkstaff JK,Tian F,Sinha SC,Felding-Habermann B,SmiderVV,Schultz PG(2012)Proc Natl Acad Sci U S A.109:16101-16106)(Rabuka D,RushJS,deHart GW,Wu P,Bertozzi CR(2012)Nat Protoc.7:1052-1067)(Plass T,Milles S,Koehler C,Schultz C,Lemke EA(2011)Angew Chem Int Ed Engl.50:3878-3881)(KayaE,Vrabel M,Deiml C,Prill S,Fluxa VS,Carell T(2012)Angew Chem Int Ed Engl.51:4466-4469)。为了将翻译后-4'-磷酸泛酰巯基乙胺基化与肟连接组合，通过使CoA与甲基乙烯基酮反应，将酮基团共价连接到CoA(见实施例93)。接着，PPTase催化用于位点特异性地酶促缀合生物正交酮基团到抗-Her2抗体的嵌入的A1标签。具体地，使2.5μM的抗-Her2-HC-ins388-A1抗体与30μM的所得的酮-CoA类似物(化合物49)(相对于抗体12摩尔当量)在1μM来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的Sfp PPTase存在下缀合。该两步法的第一步在室温下在补充有12.5mM MgCl2和20mM NaCl的75mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中进行约16小时。通过获得还原和去糖基化样品的去卷积ESI-MS谱证实抗-Her2-HC-ins388-A1抗体被酮-CoA类似物(化合物49；参见实施例93)几乎完全标记。类似的反应条件也导致抗体20507-HC-ins388-A1的接近定量的酮官能化。如表10所示，观测质量是与相应的酮官能化的重链的计算分子量一致。通过蛋白质A亲和色谱法(蛋白A-SepharoseTM，GE HealthcareLife Sciences)除去Sfp PPTase和过量的酮-CoA类似物后，酮活化的抗体、抗-Her2-HC-ins388-A1-49和抗体20507-HC-ins388-A1-49用0.1M乙酸钠缓冲液(pH 3)洗脱，接着立即用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8)中和。将中和的抗体溶液缓冲交换入水中，并通过具有0.22μm孔径的过滤器。
在这个两步骤的标记方法的另一个方面，使用CoA生物合成酶CoAA、CoAD和CoAE化学酶促制备修饰的CoA类似物(Worthington AS,Burkart MD(2006)Org Biomol Chem.4:44-46)(Kosa NM,Haushalter RW,Smith AR,Burkart MD(2012)Nat方法9:981-984)。采用这种方法，从相应的泛酸盐前体分子(i-10)、(i-12)和(i-13)制备酮官能化的CoA类似物(见实施例94，96和97)。同样地，从各自的泛酸盐衍生物(i-11)化学酶促合成叠氮化物官能化的CoA类似物(参见实施例95)。在这种方法中，不经进一步纯化而使用来自实施例94-97的超滤液，在大约30μM的终浓度，将CoA类似物CoA-(i-10)、CoA-(i-11)、CoA-(i-12)和CoA-(i-13)用于缀合到抗-Her2-HC-ins388-ybbR(2.5μM)。在1.5μM的枯草杆菌(B.subtilis)Sfp PPTase存在下、在23℃、在补充有12.5mM MgCl2和20mM NaCl的75mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，将抗体标记进行16-72小时。类似地，在2μM Sfp酶存在下在大约25μM的最终浓度缀合CoA-(i-13)。
以与上面对于酮-CoA类似物49所述完全相同的方式进行生物正交标记的抗体的亲和色谱法(MabSelect SuReTM,GE Healthcare Life Sciences)。纯化后，将中和的抗体溶液缓冲交换到PBS中。在采用PNGase F和TCEP处理样品后，通过质谱分析确认酮和叠氮化物部分与ybbR-标记的抗体的共价连接(表10)。
酮基团的位点特异性连接使得能够进行随后的作为两步法的第二步骤的细胞毒性有效载荷与酮-活化的抗-Her2-HC-ins388-A1-49、抗体20507-HC-ins388-A1-49、抗-Her2-HC-ins388-ybbR-(i-10)和抗-Her2-HC-ins388-ybbR-(i-12)的肟连接。在含有2.5至5％(v/v)DMSO的50或100mM乙酸钠缓冲液(pH 4-5)中，使25-67μM酮-官能化的抗体与7.5至40倍摩尔过量的(0.5–1mM)氨基氧基肽类似物(化合物22)反应。在23或37℃培育16-36小时后，通过制备型尺寸排阻色谱在HiLoad 26/600Superdex 200制备级柱(GE Healthcare)上除去过量的氨基氧基试剂。通过在PLRP-S柱(5μM,50x 4.6mm,AgilentTechnologies)上、采用5-min线性梯度的30-60％乙腈的水(含有0.1％三氟乙酸)溶液的分析HPLC测定药物-与-抗体比(DAR)。在280nm波长监控HPLC跟踪，随后对缀合抗体和非缀合抗体进行峰积分。如表9所示，两步法得到酮活化的抗-Her2-HC-ins388-A1-49和抗体20507-HC-ins388-A1-49与氨基氧基肽类似物(化合物22)的近乎定量的标记。与此相反，化合物22与酮-活化的抗-Her2-HC-ins388-ybbR-(i-10)抗体的位点特异性缀合是更低效率的，导致具有1.3的DAR的ADC。在免疫缀合物的还原和去糖基化后通过ESI-MS进一步确认通过肟连接的ADC形成(表10)。最后，在Superdex 200 10/300GL(GE Healthcare)和蛋白质KW-803 5μm 300x 8mm(Shodex)柱上的分析尺寸排阻色谱法(AnSEC)显示只有少量的聚集的ADC，这表明在该两步偶联方法期间几乎没有诱导聚集。
叠氮化物部分与改造的抗体的位点特异性连接允许随后的通过无铜点击化学的有效载荷缀合。在该实施例中，通过共价连接至药物-连接体的二环[6.1.0]壬炔(BCN)基团的环链促进生物正交反应。在BCN-官能化的有效载荷化合物75存在下，采用叠氮化物-活化的抗-Her2-HC-ins388-ybbR-(i-11)抗体进行链促进的炔-叠氮化物环加成。采用127μM抗-Her2-HC-ins388-ybbR-(i-11)抗体和1270μM BCN-连接的肽类似物(化合物75)在补充有1MNaCl和6％(v/v)DMSO的100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中进行该两步骤方法的第二步骤。在23℃培育大约16小时后，通过标准蛋白质A亲和色谱法使用MabSelect SuReTM(GEHealthcare Life Sciences)除去过量的BCN试剂。采用IgG洗脱缓冲液(ThermoScientific)洗脱，随后用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8)中和，并缓冲交换至PBS中。如表10中所示，在ADC样品的还原和去糖基化后通过ESI-MS确认通过无铜点击化学的有效载荷缀合。使用相同的方法计算免疫缀合物的平均DAR。在该方法中，将10μg ADC补充10μL IgGSepharose 6Fast Flow的50％浆体(GE Healthcare)。在23℃在温和搅拌下使树脂结合进行1小时。用PBS冲洗树脂后，通过加入5μg PNGase F，随后在37℃温育3小时，使亲和结合的ADC去糖基化。用PBS洗涤亲和树脂除去PNGase F酶。接着，将去糖基化样品用1％甲酸洗脱，接着立即用10M乙酸铵(pH 5)中和。为了有效地还原重链和轻链的抗体构建体，向20μL洗脱液补充10μL 100mM甲酸钠缓冲液(pH 4.0)(含有6M盐酸胍)和5μL在10M乙酸铵中的0.66MTCEP(pH 5)。在23℃培育至少30min后，将还原和去糖基化的样品进样至6550iFunnel Q-TOF LC/MS系统(Agilent Technologies)。使用MassHunter定性分析软件(AgilentTechnologies)用于光谱记录和光谱去卷积的处理。平均DAR计算为横跨分布的相对峰高度的DAR状态加权平均。如表9所示，抗-Her2-HC-ins388-ybbR-(i-11)-75ADC具有2.0的平均DAR，这表明这两个缀合步骤都是几乎定量的。最后，通过分析尺寸排阻色谱法(AnSEC)在Bio SEC-3柱(Agilent Technologies)上检查ADC，发现95％为单体的，表明在该缀合方法中几乎不诱导聚集。
表9.
通过两-步骤缀合方法标记的A1-和ybbR-标记的抗体/ADC的性质
aHC-ins388是指在重链的残基Glu388后插入A1或ybbR肽标签。最后的数字对应于化学缀合步骤中使用的化合物。例如，抗-Her2-HC-ins388-A1-49-22和抗体20507-HC-ins388-A1-49-22首先与化合物49酶促缀合，随后与化合物22化学缀合。
b通过反相HPLC测量缀合效率，其描述抗体转化至ADC的百分比。
c通过质谱测量缀合效率，其描述抗体转化至ADC的百分比。
d根据反相HPLC的药物-与-抗体比。
e根据质谱法的药物-与-抗体比。
f通过分析尺寸排阻色谱法测量聚集，并包括二聚和低聚种类。
表10.
通过两步骤缀合方法标记的A1-和ybbR-标记的抗体/ADC的性质
aHC-ins388是指在重链的残基Glu388后插入A1或ybbR肽标签。最后的数字对应于化学缀合步骤中使用的化合物。例如，抗-Her2-HC-ins388-A1-49-22和抗体20507-HC-ins388-A1-49-22首先与化合物49酶促缀合，随后与化合物22化学缀合。
b在Agilent 6520Q-TOF仪器(Agilent Technologies)上检测的以道尔顿为单位的质量。
c对缀合的重链预测的以道尔顿为单位的质量。
d对未偶联的重链预测的以道尔顿为单位的质量。
e未知身份的较小峰。
f未修饰的重链是指未-磷酸泛酰巯基乙胺基化且未酮/叠氮化物-官能化的种类。
虽然表5和6中公开的式(II)和式(III)的免疫缀合物通过缀合抗-Her2和抗体20507Cys抗体和具有连接的马来酰亚胺部分的某些式(I)的细胞毒性肽获得，但是还已使用本发明的其它连接体-有效载荷组合。在表7至10所公开的免疫缀合物是此类实例。与非-改造的抗体缀合是另一实例。这可以通过如实施例102和103中所述与部分还原的二硫键缀合来实现。采用例如化合物89，或多种本领域已知的其他方法，还可以将非-改造的抗体缀合到赖氨酸。
实施例106：测量抗-Her2和抗体20507Cys和A1/ybbR标签ADC的体外细胞杀伤效力的细胞增殖测定
天然表达靶抗原的细胞或改造以表达靶抗原的细胞系经常用于测定ADC的活性和效力。为了体外评价抗-Her2抗体ADC的细胞杀伤效力，应用两种改造的细胞系MDA-MB231克隆16和克隆40以及4种内源性细胞系JimT1、HCC1954、NCI-N87和SKBR3细胞(Clinchy B,Gazdar A,Rabinovsky R,Yefenof E,Gordon B,Vitetta ES.Breast Cancer Res Treat.(2000)61:217-228).MDA-MB231克隆16细胞稳定表达高拷贝数(～5x105拷贝/细胞)的重组人Her2，而克隆40表达低拷贝数(～5x103拷贝/细胞)的人Her2。高水平的Her2被内源性表达在HCC1954(～5x105拷贝/细胞)、SKBR-3(5.4x105拷贝/细胞)和NCI-N87(2.7x105拷贝/细胞)细胞系中，而JimT-1细胞以中等水平(～8x104拷贝/细胞)表达人Her2。作为阴性对照，使用了Her2阴性A375细胞系。抗原依赖性的细胞毒性作用应该只杀死在细胞表面表达足够抗原的细胞，而不杀死缺乏抗原的细胞。在将细胞用不同浓度的ADC孵育五天后，用Cell-Titer-GloTM(Promega)进行细胞增殖测定(Riss等人,(2004)Assay Drug Dev Technol.2:51-62)。在一些研究中，基于细胞的测定法是高通量的和在自动化系统上进行(Melnick等人,(2006)Proc Natl Acad Sci U S A.103:3153-3158)。
除了一种(抗-Her2-LC-S159C-44)之外，所有抗-Her2ADC特异性地杀伤具有高水平Her2表达的细胞系即MDA-MB231克隆16、HCC1954、NCI-N87、SKBR3，但是对表达低水平的Her2的MDA-MB231克隆40细胞不显示细胞毒效力，且对Her2阴性A375细胞也不显示细胞毒效力(图1；表11,表13)。在表达高水平的Her2的四种细胞系中抗-Her2ADC的IC50是20pM至700pM(表11、表13)。在表达中等水平Her2的JimT-1细胞中，抗-Her2-ADC的细胞杀伤活性宽范围变化。一些ADC在表达高水平的Her2的细胞中是活性的，但是在JimT-1细胞中不是。许多ADC与对表达高水平的Her2的细胞系一样有效地杀伤JimT-1细胞(表11、表13)。结果表明抗-Her2ADC以Her2-依赖性方式杀伤Her2+细胞，且ADC对多种细胞类型是有活性的。类似地，通过野生型抗体的部分还原方法(实施例102)和通过A1或ybbR标签的酶促方法(实施例104和105)和通过酮桥方法(实施例103)制备的抗-Her2ADC也以Her2-依赖性方式杀伤Her2+细胞(表11)，表明当通过不同的缀合方法和化学缀合到抗体时，本发明中公开的细胞毒性肽保留它们的效力。
为了验证当缀合到其它抗体时式(I)的细胞毒性肽是否也是活性的，将数种式(I)的细胞毒性肽缀合至抗体20507，其靶抗原在H526、KU812和CMK11-5细胞中表达但不在Jurkat细胞中表达。如在图2和表12中所示，当与抗体20507缀合时，在Her2+细胞中显示细胞杀伤活性的有效载荷连接体组合也是活性的，杀伤表达靶抗原的细胞。结果显示文中描述的式(I)的细胞毒性肽对宽范围的细胞类型显示细胞毒性。
表11.
体外细胞杀伤测定中的ADC效力:抗-Her2ADC在MDA-MB231克隆40、MDA-MB231克隆16、HCC1954和JimT-1细胞增殖测定中的IC50。
a名称由突变的抗体的描述和对应于化学缀合步骤使用的化合物的最后数字构成。HC-ins388是指在重链的残基Glu388后插入A1或ybbR肽标签。
b测定中使用的最高浓度是6.67E-02μM。因此，6.67E-02μM的IC50值是指ADC在测定中的无活性。
c该值等于测定中使用的最高浓度，因此指示ADC的无活性。
表12
体外细胞杀伤测定中的ADC效力:抗体20507ADC在Jurkat、H526、KU812和CMK11-5细胞增殖测定中的IC50。
a名称由突变的抗体的描述和对应于化学缀合步骤使用的化合物的最后数字构成。HC-ins388是指在重链的残基Glu388后插入A1肽标签。
b测定中使用的最高浓度是6.67E-02μM。因此，6.67E-02μM的IC50值是指ADC在测定中无活性。
表13
体外细胞杀伤测定中的ADC效力:抗-Her2ADC在A375、HCC1954、JimT-1NCI-N87和SKBR3细胞增殖测定中的IC50。
a名称由突变的抗体的描述和对应于化学缀合步骤使用的化合物的最后数字构成。
b测定中使用的最高浓度是6.67E-02μM。因此，6.67E-02μM的IC50值是指ADC在测定中无活性。
cN.D.:未测定
实施例107：抗-Her2和抗体20507ADC的药代动力学研究
已证明，长的血清半衰期对于ADC的高体内效力是至关重要的(Hamblett,等人,“Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibodydrug conjugate,”Clin Cancer Res.,10:7063-7070(2004)；Alley等人,BioconjugChem.19:759-765(2008))。疏水性药物有效载荷与抗体的连接可能影响抗体的性质，而这可能导致ADC的体内快速清除(Hamblett等人,2004)和差的体内效力。为了评价本发明的各种细胞毒性肽的缀合对体内ADC的清除的效果，进行非携瘤小鼠的药物动力学研究。为了在小鼠血浆中检测本发明的免疫缀合物的细胞毒性肽(即药物部分)，产生还识别本发明的各种细胞毒性肽的抗-MMAF抗体。使用用于捕获来自血浆的人IgG分子的抗-hIgG抗体和另一种抗-人IgG抗体和抗-MMAF抗体(在两个独立试验中用于信号检测)在GyrosTM平台上开发用于检测免疫缀合物的ELISA试验。抗-MMAF抗体识别本发明的细胞毒性肽，因此可用于检测具有连接的细胞毒肽的ADC(“完整”ADC)。因此，所述两种ELISA分别测量人抗体和“完整”ADC的血清浓度。
PK研究的实例显示在图3和图4中。每组三只小鼠分别以1mg/kg施用单一剂量的下面ADC：抗-Her2-LC-S159C-10(图3A)、抗-Her2-LC-S159C-47(图3B)、抗-Her2-LC-S159C-77(图3C)、抗-Her2-LC-S159C-80(图3D)、抗-Her2-LC-S159C-79(图3E)、抗-Her2-LC-S159C-78(图3F)、抗-Her2-LC-S159C-14(图3G)、抗-Her2-HC-E152C-S375C-10(图3H)、抗-Her2-10(图3I)、抗体20507-HC-E152C-10(图4A)、抗体20507-LC-K107C-47(图4B)、抗体20507-HC-ins388-A1-20(图4C)抗体20507-HC-E152C-S375C-10(图4D)、抗体20507-10(图4E)、抗-Her2-HC-ins388-ybbR-20(图4G)、抗体20507-HC-ins388-A1-49-22(图4H)、抗-Her2-HC-ins388-A1-49-22(图4I)、和抗-Her2-HC-ins388-ybbR-(i-11)-75(图4J)ADC。以10mg/kg的单一剂量施用抗体20507-HC-ins388-A1-20(图4F)。在三个星期中收集血浆样品，并通过使用捕获IgG分子的抗-hIgG抗体包括抗体20507和抗-Her2ADC以及各自的裸抗体的ELISA测定。然后将抗-MMAF和抗-hIgG抗体在两个独立的测定中用于检测。抗-MMAF抗体测定仅测量抗体缀合物的浓度，抗-hIgG定量抗体缀合物和缺乏有效载荷的抗体两者。采用相同的注入小鼠中的材料，对于各ADC分别产生标准曲线。因此，用抗-MMAF和抗-hIgG的测定应当产生相同的浓度读数，如果注射到小鼠体内后抗体20507或抗-Her2ADC的药物载荷没有发生变化。对于损失一些有效载荷的ADC，用抗-MMAF抗体的测定将比抗-hIgG测定测得更低的浓度。因此这两个浓度读数的比较允许测量在小鼠体内培养期间从抗体20507和抗-Her2ADC的药物释放。
如在图3和图4所示，由抗-hIgG和抗-MMAF测定获得的血浆浓度与大部分具有缀合至抗-Her2和抗体20507抗体中改造的Cys的马来酰亚胺有效载荷的ADC匹配良好(图3A-I,图4D)，这表明在这些ADC的测试期间在这些ADC中有最小的药物损失。由野生型抗体抗-Her2-10(图3I)和抗体20507-10(图4E)的部分还原制备的两种ADC在通过抗-hIgG和抗-MMAF测定测量的浓度间显示强的分离，前者高于后者，这表明对于这两种ADC在测试期间有显著的药物损失。通过酶介导的方法制备的ADC，即抗体20507-HC-ins388-A1-20、抗-Her2-HC-ins388-ybbR-20、抗体20507-HC-ins388-A1-49-22和抗-Her2-HC-ins388-A1-49-22ADC，在通过抗-IgG和抗-MMAF测定测量的浓度间显示良好匹配(图4F、G、H和I)。与此相反，抗-Her2-HC-ins388-ybbR-(i-11)-75ADC(图4J)在抗-hIgG和抗-MMAF测定之间显示大的分离，这表明ADC在PK研究期间经历显著的药物去缀合。
如在图4中所示，通过抗-hIgG测定和抗-MMAF测定获得的血浆浓度与抗体20507-HC-E153C-10ADC、抗体20507-LC-K107C-47ADC和抗体20507-HC-ins388-A1-20ADC良好匹配，这表明在测试期间在这些ADC中有最小的药物损失。
为了更详细地测定在小鼠循环三周后ADC的药物有效载荷的保留，从通过终端出血收集的小鼠血清亲和纯化ADC，通过MS分析法分析连接至ADC的药物有效载荷。在一个典型的方法中，将200μl血浆用等量的含有10mM EDTA的PBS稀释。向稀释液中，加入10μl亲和树脂(IgG Select Sepharose 6Fast flow；GE Healthcare 17-0969-01；50％浆体)。在室温下用该稀释的血浆样品孵育树脂1小时，期间轻微搅拌以避免树脂沉降。然后过滤树脂，用200μl PBS洗涤2次。为了使抗体去糖基化，将用10μl PBS稀释的10μl PNGase F(1mg/mL,1/2x TBS pH 7.4,2.5mM EDTA,50％甘油)加入到树脂中，并在37℃将混合物孵育2-3小时。通过用200μl PBS洗涤亲和树脂两次除去PNGase F后，通过加入20μl 1％甲酸将样品从亲和树脂洗脱两次，并滤去树脂。将合并的洗脱物用20μl 6M盐酸胍和5μl还原缓冲液(0.66MTCEP,3.3M乙酸铵,pH 5)稀释。为了有效地还原抗体，在分析前，将样品在室温孵育至少30min。采用Agilent Technologies6550-iFunnel QTOF MS/Agilent 1260HPLC系统进行LCMS。采用PLRS柱(8μm,2.1x 50mm,Agilent)在80℃以0.5ml/min的流速，使用标准反相色谱法用于样品脱盐。使用在6min内的线性梯度的20％-60％-乙腈(含有0.1％甲酸)进行洗脱。Agilent定性分析被用于光谱记录和光谱去卷积的处理。对于分析，在涵盖所有相关种类的洗脱的时间区间，将谱记录求和。将求和的谱以电荷态去卷积，并记录去卷积的谱的图像。对于可指定的种类，提取峰值强度的值。DAR态(state)和片段种类的归属是基于来自所分析的抗体的序列的计算质量值和具有药物分子的缀合物的预期质量偏移进行。使用跨分布的所有DAR态的相对峰高计算平均DAR。平均抗体DAR被计算为来自2个平均轻链和2个平均重链的DAR的总和。
将在小鼠循环三周后纯化的ADC的平均DAR(由MS测量)与原始ADC制品中的DAR比较。“有效载荷保留”由来自两个DAR的比率(从小鼠血浆分离的ADC的DAR除以原始的ADC制品的DAR)来计算，并表示在小鼠循环中三周后在ADC上保留的有效载荷的百分比。通过MS测量的各种ADC的有效载荷保留与通过上述使用抗-MMAF抗体的ELISA测定获得的结果在很大程度上保持一致(图3和4)。
如表14所示，取决于化合物、缀合位点和缀合方法，有效载荷保留广泛地为5％至96％。对于通过PPTase酶促方法制备的ADC，化合物20和22的有效载荷保留(通过MS)大于50％，而对于化合物75，有效载荷保留仅是5％(表14)。在后一情况中，从末端出血血清纯化的ADC的质谱评估揭示了药物-连接体的氨基甲酸酯部分几乎定量裂解，而抗体和细胞毒性有效载荷之间的点击化学联接(linkage)在循环中保持稳定。
对于用具有马来酰亚胺基团的Cys反应性细胞毒肽制备的ADC，根据化合物的结构和缀合位点，有效载荷保留是18％至96％(表14)。从血浆样品分离的ADC的MS的结果确认在马来酰亚胺有效载荷和缀合的Cys残基的硫醇基团间发生从ADC的有效载荷的去缀合。没有观察到连接体结构中的断裂。因此，马来酰亚胺连接的有效载荷的有效载荷保留可以与经由逆Michael加成的去缀合相反地相关，因为回收的未缀合抗体的观测质量是未修饰的抗体的质量。
众所周知，在马来酰亚胺和游离硫醇基团之间形成硫醚的反应是可逆的(Bioconjugate Chem.2011,22,1946–1953)。逆反应被认为是负责在体内和体外从ADC去缀合马来酰亚胺药物有效载荷。随后，去缀合的有效载荷的马来酰亚胺可以与氨基酸、肽或蛋白质形式的游离硫醇反应(Bioconjugate Chem.2008,19,759–765；Nat.Biotechnol.2012,30,184-189)。
对于本发明的某些细胞毒性肽，在小鼠血液循环中从ADC的有效载荷去缀合被发现是可忽略的(表14)。在小鼠循环中三周后，对于用化合物47、14、77、80、79和78缀合到抗体的改造Cys制备的ADC，发现90％的有效载荷被保留。从血浆样品中分离的这些ADC的MS分析揭示了对于各缀合的药物有效载荷，ADC的质量增加18道尔顿，表明发生了水解反应。从马来酰亚胺基团与半胱氨酸反应得到的琥珀酰亚胺环已知进行自发水解(Gregory,J.Am.Chem.Soc.1955,77,3922；Knight,P.Biochem.J.1979,179,191–197；Khan M.N.JPharm Sci.1984,73:1767-1771)。实际上，通过将缀合物暴露于碱性pH可以有意地水解该基团(例如,Biochem.J.1979 179,191-197；Biochemistry 1976,15,2863-8；ChemCommun.2011；47:5452–5454)。琥珀酰亚胺基团的水解开环将产生不会进行上述马来酰亚胺逆反应的稳定硫醚键(Bioconjugate Chem.2011,22,1946–1953；Nat.Biotechnol.2012,30,184-189；Nat.Biotechnol.2014,32,1059)。由化合物47、14、77、80、79和78例示的某些本发明化合物当缀合至抗体的Cys残基时具有较大的琥珀酰亚胺环水解，从而产生更稳定的抗体药物缀合物。
表14
如IP-MS测定的，在幼稚小鼠中3周后，选取的ADC的有效载荷保留
实施例108:ADC的体外稳定性
在体外进一步研究琥珀酰亚胺环水解对用本发明细胞毒性肽制备的ADC稳定性的影响。通过LC-MS监测由有效载荷去缀合和缀合到抗体的马来酰亚胺有效载荷的琥珀酰亚胺环的水解导致的质量变化。已经报道琥珀酰亚胺环的水解被某些条件如高pH、高温或高盐刺激(J.Am.Chem.Soc.1955,77,3922；Biochemistry,1976,1 5,2836；Biochem.J.1979,179,191–197；J Pharm Sci.1984,73:1767-1771,Bioorg.Med.Chem.Lett.17(2007)6286–6289)。为了探测ADC的作为pH函数的体外稳定性，在37℃在从pH7.0至pH 9.0的缓冲液中温育抗-Her2-LC-S159C-10和抗-Her2-LC-S159C-47，通过MS在各时间点分析ADC，以确定有效载荷去缀合和琥珀酰亚胺水解的程度。从相应的ADC种类的相对的MS强度计算去缀合的ADC、具有连接的带有水解的琥珀酰亚胺环的有效载荷的ADC和具有连接的带有完整的琥珀酰亚胺环的有效载荷的ADC的相对群体(populatoins)。如在图5A中所示，增加孵育缓冲液的pH提高了抗-Her2-LC-S159C-10的去缀合。在pH 7.0的缓冲液中，抗-Her2-LC-S159C-10是稳定的，在10小时后，大约10％有效载荷损失。但是，在pH8.0和pH9.0缓冲液中孵育10小时，有效载荷去缀合的程度分别增加至大约30％和60％(图5A)。与此相反，抗-Her2-LC-S159C-47在pH 7.0至pH 9.0的缓冲液中在37℃孵育25小时导致不超过15％的去缀合(图5C)。
并行地，还在不同的时间点测定两种ADC的琥珀酰亚胺环水解程度(图5B和图5D)。对于两种ADC，孵育缓冲液的pH的增加刺激琥珀酰亚胺环的水解。对于抗-Her2-LC-S159C-47，琥珀酰亚胺环水解显著比抗-Her2-LC-S159C-10更迅速地发生。在pH 7.5的缓冲液中将抗-Her2-LC-S159C-10孵育25小时导致30％的有效载荷去缀合，和20％的仍与抗体连接的有效载荷被水解(图5A和图5B)。在相同的孵育条件下，抗-Her2-LC-S159C-47仅损失大约10％有效载荷，而大约90％的连接的有效载荷被水解(图5C和图5D)。如图5E和F所示，对于在37℃在pH 8.5缓冲液孵育24小时的抗-Her2-LC-S159C-10、抗-Her2-LC-S159C-77、抗-Her2-LC-S159C-80、抗-Her2-LC-S159C-79、抗-Her2-LC-S159C-78和抗-Her2-LC-S159C-14ADC，体外分析有效载荷缀合和琥珀酰亚胺环水解。对于抗-Her2-LC-S159C-77、抗-Her2-LC-S159C-80、抗-Her2-LC-S159C-79、抗-Her2-LC-S159C-78和抗-Her2-LC-S159C-14ADC而言有效载荷的去缀合是不可检测的(图5E)，对于所有ADC观察到高度的琥珀酰亚胺环水解(图5F)。因此，化合物47、14、77、80、79和78例示的某些本发明化合物显示提高的ADC稳定性，这是由于对通过逆马来酰亚胺反应去缀合更低的敏感性，和通过琥珀酰亚胺环水解更稳定。
实施例109:用抗体20507ADC的体内效力研究
体内异种移植肿瘤模型模拟在人类中观察的生物活性，并且由将相关的和充分表征的人原发性肿瘤或肿瘤细胞系移植到免疫缺陷裸鼠中构成。用抗癌试剂治疗肿瘤异种移植物小鼠的研究就测试试剂的体内效力提供有价值的信息(Sausville and Burger,(2006)Cancer Res.66:3351-3354)。因为H526细胞在其表面上表达抗体20507的抗原，并选择性地被抗体20507ADC杀伤(图2，表12)，所述细胞系用于产生评估抗体20507ADC的体内活性的异体移植模型。所有的动物研究按照Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals(实验动物的护理和使用指南)进行(NIH publication；National Academy Press,第8版,2001)。在nu/nu小鼠皮下植入H526细胞(Morton和Houghton,Nat Protoc.2007；2:247-250)。达到～200mm3肿瘤大小后，将三种抗体20507ADCs由静脉注射以3mg/kg或10mg/kg的单剂量施用到小鼠中。在ADC注射后定期测定肿瘤生长。各治疗组包括7只小鼠。这样的体内效力研究的一个例子示于图6A中。用3mg/kg抗体20507-HC-E152C-10ADC治疗小鼠引起肿瘤生长抑制，而用10mg/kg抗体20507-HC-E152C-10ADC治疗导致肿瘤消退(图6A)。抗体20507-HC-E152C-10ADC的效力等同于阳性对照ADC(与参照化合物MC-MMAF缀合的抗体20507-HC-E152C-MMAF)的效力。没有观察到与ADC治疗相关的重量减轻，表明低的全身毒性。结果证实，采用以10mg/kg的单剂量治疗，抗体20507-HC-E152C-10ADC有效引起H526肿瘤消退而不引起显著体重减轻。在第二项研究中，以3mg/kg和10mg/kg的剂量在H526荷瘤小鼠中施用抗体20507-HC-E152C-10和抗体20507-HC-ins388-A1-20ADCs(图6B)。两种ADC在3mg/kg显示类似的肿瘤抑制活性，在10mg/kg显示类似的肿瘤消退活性。抗体20507-HC-E152C-10ADC比20507-HC-ins388-A1-20ADC稍微更有效。
在另一个实例中，我们比较了两种抗体20507ADCs抗体20507-HC-E152C-S375C-10和抗体20507-10在H526异种移植模型中的体内效力(图6C)。采用两种不同的方法，利用缀合到不同Cys位点的相同有效载荷化合物10来制备该两种ADC。如实施例101所述，将化合物10缀合到改造的Cys残基HC-E152C和HC-S375C，使用Cys突变抗体制备抗体20507-HC-E152C-S375C-10。如实施例102中所述，使化合物10缀合至天然Cys残基，通过使用野生型抗体20507的部分还原方法制备抗体20507-10。抗体20507-10具有比抗体20507-HC-E152C-S375C-10(DAR 3.9)稍高的DAR(DAR 4.6)(表6)。药代动力学研究显示在3周小鼠循环期间，该两种ADC以非常不同的程度保留所述相同有效载荷(图4D、图4E、表14)：相比抗体20507-10(20％)，抗体20507-HC-E152C-S375C-10显示好得多的有效载荷保留(56％)。
在H526异种移植物模型中，相同剂量的抗体20507-HC-E152C-S375C-10在抑制肿瘤方面比抗体20507-10更有效(图6C)。其抗原在H526细胞中不表达的抗-Her2-HC-E152C-S375C-10没有表现出任何的肿瘤抑制活性。
在第三项研究中，将抗体20507-HC-E152C-10和抗体20507-HC-ins388-A1-49-22ADCs以7mg/kg的单剂量静脉内注射入H526荷瘤小鼠中(图6D)。抗体20507-HC-ins388-A1-49-22ADC显示肿瘤抑制，在相同剂量水平抗体20507-HC-E152C-10ADC表现出肿瘤消退，指示后者ADC的效力更高。对于同种型对照ADC，抗-Her2-HC-ins388-A1-49-22，没有观察到显著肿瘤抑制活性，表明抗体20507ADCs的抗原特异性肿瘤杀伤。所有三个研究一起证实通过各种方法与抗体连接的本发明的细胞毒性肽可以在小鼠异种移植模型引起抗原-表达癌症的消退。
实施例110：Sfp 4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)的生产
使用PIPE方法将枯草杆菌(Bacillus subtilis)Sfp PPTase克隆到pET22b表达载体中(参见Klock等人,Proteins 71:982-994(2008))。为了允许C-末端His6标签的裂解，将TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶识别位点插入在Sfp编码序列的下游。用于克隆的所有的引物和Sfp蛋白质序列列于表15中。
表15.
用于克隆的引物和Sfp蛋白质序列
根据Yin等人(参见Nat.Protoc.1:280-285(2006))进行蛋白表达和纯化，并进行了一些修改。简言之，将1L的TB培养基用携有pET22b/sfp表达质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞的饱和过夜培养物接种。将培养物在37℃在250rpm振摇，达到0.7的光密度(600nm处)后通过加入1mM的IPTG诱导。将温度降低到30℃，并将培养物以250rpm振摇约16小时，然后通过离心(3400rpm，20分钟)收获细菌细胞。在使用前，将细胞沉淀贮存于-20℃。为了开始蛋白质纯化，将冷冻的沉淀在冰上解冻约15分钟，再悬浮于含有20mM Tris/HCl(pH 8)、0.5M NaCl、5mM咪唑和2U/mL DNase I的缓冲液中(3mL缓冲液/g湿重细胞)。通过总时间2min的超声(使用1秒超声脉冲，具有间歇的1秒延迟)诱导细胞裂解。为了除去不溶性细胞碎片，将所得裂解物在40000x g在4℃离心25分钟。然后通过加入4mL 50％Ni-NTA琼脂糖浆体(Qiagen)至清澈的裂解物中捕获His6-标记的Sfp酶。在4℃振摇1小时后，将树脂-裂解物混合物倒入一次性柱中。将沉降的树脂用50柱体积的50mMTris/HCl(pH 8)、300mM NaCl和20mM咪唑洗涤。用6柱体积的50mM Tris/HCl(pH 8)、300mMNaCl和250mM咪唑洗脱。将Sfp酶交换到含有50mM Tris/HCl(pH 8)和50mM NaCl的TEV裂解缓冲液中。通过用7％(w/w)TEV蛋白酶在23℃消化1小时，然后在4℃消化大约16小时，进行His6标签的去除。然后将TEV-消化的Sfp酶重新加载到用PBS预平衡的新鲜的Ni-NTA柱。从柱流通液和涉及5柱体积的50mM Tris/HCl(pH 8)、300mM NaCl和20mM咪唑的洗涤步骤收集裂解的酶。然后，使用具有3.5kDa截断值的Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes(Pierce)，将纯化的Sfp酶针对10mM Tris/HCl(pH 7.4)、1mM EDTA和10％甘油透析。在使透析液通过0.22μm过滤器后，通过紫外光谱在280nm定量Sfp酶的产量(ND-1000紫外可见分光光度计，NanoDrop Technologies,Wilmington,DE)，使用28620M-1cm-1的摩尔消光系数。每升培养物获得19mg的TEV-裂解的Sfp酶。接着，使用具有10kDa截断值的Amicon Ultra CentrifugalFilter Units(Millipore)，将Sfp PPTase浓缩至151μM。通过SDS-PAGE评估酶的纯度，通过LC-MS确认His6标签的去除。根据分析型尺寸排阻色谱，TEV-裂解的Sfp PPTase为90％单体的。将浓缩的酶等分，在液氮中快速冷冻，并储存于-80℃。
在列举的实施方案的以下清单中提供了本发明的其它方面和实施例。应当认识到，在各实施方案中指明的特征可以与其他特定的特征组合，以提供本发明的进一步的实施方案。
实施方案1.具有式(I)结构的化合物或其立体异构体
其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的，或各自是被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R11、
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12,或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R8是H；
各R11独立地选自C1-C6烷基和任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是2-吡啶基或4-吡啶基；
R16是未取代的N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
实施方案2.根据实施方案1的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述C-连接的6元杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
实施方案3.具有式(I)结构的化合物或其立体异构体
其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的，或各自被R7和0-3个独立选自R5和R6的取代基取代，或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NR12(CH2)mR16、-LR9、-NHS(O)2R11、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(＝O)2LR9、
R5是C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被–CN、-C(＝O)NH2或1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R7是LR9；
R8是H或LR9；
各L独立地选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
R9是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR15、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R10、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R10是
各R11独立地选自C1-C6烷基和任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、被苯基取代的咪唑基、被苯基取代的二唑基、吡唑基、咪啶基、 -CH2S(＝O)2NH2、-CH2S(＝O)2NHLR9、-LR9或–X4LR9；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是2-吡啶基或4-吡啶基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR9取代；
X3是
X4是
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18,
或其药学上可接受的盐。
实施方案4.具有式(I)结构的化合物或其立体异构体
其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的，或各自被R7和0-3个独立选自R5和R6的取代基取代，或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NR12(CH2)mR16、-LR9、-NHS(O)2R11、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(＝O)2LR9、
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R7是LR9；
R8是H或LR9；
各L独立地选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
R9是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR15、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R10、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R10是
各R11独立地选自C1-C6烷基和任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、 -LR9或–X4LR9；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是2-吡啶基或4-吡啶基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR9取代；
X3是
X4是
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18，
或其药学上可接受的盐。
实施方案5.根据实施方案1-4中任何一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(Ia)结构的化合物:
实施方案6.根据实施方案1-5中任何一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(Ib)结构的化合物:
实施方案7.根据实施方案1-4中任何一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(Ic)结构的化合物:
实施方案8.根据实施方案1-4和7中任何一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(Id)结构的化合物:
实施方案9.根据实施方案1-4中任何一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(Ie)结构的化合物:
实施方案10.根据实施方案1-4和9中任何一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(If)结构的化合物:
实施方案11.根据实施方案1-4中任何一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(Ig)结构的化合物:
实施方案12.根据实施方案1-4或11中任何一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(Ih)结构的化合物:
实施方案13.根据实施方案1-4中任何一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(Ii)或式(Ij)结构的化合物:
实施方案14.根据实施方案1-4或13中任何一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(Ik)或式(Im)结构的化合物:
实施方案15.根据实施方案1-4中任何一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(In)或式(Io)结构的化合物:
实施方案16.根据实施方案1-4或15中任何一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(Ip)或式(Iq)结构的化合物:
实施方案17.根据实施方案11-16中任何一项所述的化合物，其中R19是H。实施方案18.根据实施方案3至17中任何一项所述的化合物，其中各L独立地选自-L1L2L3L4L5L6-和-L6L5L4L3L2L1-，且其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义。
实施方案19.根据实施方案3至18中任何一项所述的化合物，其中各L独立地选自-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-和-L3L2L1-，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义。
实施方案20.根据实施方案3至19中任何一项所述的化合物，其中各L独立地选自-L1L2-和-L2L1-，且其中-L1和L2如文中所定义。
实施方案21.根据实施方案3至19中任何一项所述的化合物，其中L是-L1-，其中-L1如文中所定义。
实施方案22.根据实施方案3至21中任何一项所述的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
实施方案23.根据实施方案3至21中任何一项所述的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述C-连接的6元杂环烷基被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
实施方案24.根据实施方案3至6和18至21中任何一项所述的化合物，其中:R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代,
且R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R11、实施方案25.根据实施方案3至6、18至21和24中任何一项所述的化合物，其中:R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述C-连接的6元杂环烷基被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代，
且R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R11、
实施方案26.根据实施方案3至25中任何一项所述的化合物，其中:
R2是-C1-C6烷基；
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R7是L1R9；
R8是H；
R9是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR15、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R10是
各R11独立地选自C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是2-吡啶基或4-吡啶基、
且
R16是未取代的N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基。
实施方案27.根据实施方案1-21中任何一项所述的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基、其中各自是未取代的或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代。
实施方案28.根据实施方案1-21和27中任何一项所述的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述C-连接的6元杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
实施方案29.根据实施方案3至27中任何一项所述的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代；
R3是
且
R4是-L1R9、-NHS(＝O)2L1R9、
实施方案30.根据实施方案3至20和29中任何一项所述的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述C-连接的6元杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和
R6的取代基取代；
R3是
且
R4是-L1R9、-NHS(＝O)2L1R9、
实施方案31.根据实施方案3至21和27至30中任何一项所述的化合物，其中:
R2是-C1-C6烷基；
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2和–NR12C(＝O)R11；
R8是L1R9；
R9是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R10、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R10是
各R11独立地选自C1-C6烷基和任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是
-LR9或–X4LR9；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基，其被-LR9取代；
X3是
X4是
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
实施方案32.根据实施方案1-6和18至28中任何一项所述的化合物，其中R4是–OH、–OCH3、-NHS(O)2R11或
实施方案33.根据实施方案3至6和18至28中任何一项所述的化合物，其中R4是–OH、–OCH3、-NHS(O)2R11、-NHS(O)2(CH2)mN3或
实施方案34.根据实施方案3至6、18至23和27至31中任何一项所述的化合物，其中R4是-L1R9、-NHS(＝O)2L1R9、
实施方案35.根据实施方案1-4、9、10和18至30中任何一项所述的化合物，其中R13是
实施方案36.根据实施方案1-4、9、10和18至30和35中任何一项所述的化合物，其中R13是 -LR9或–X4LR9。
实施方案37.根据实施方案1-21和26至36中任何一项所述的化合物，其中R1是
实施方案38.根据实施方案1-21和26至37中任何一项所述的化合物，其中R1是
实施方案39.根据实施方案1、3至21、26、27、29和31-36中任何一项所述的化合物，其中R1是
实施方案40.根据实施方案1、3至21、26、27、29、31-36和39中任何一项所述的化合物，其中R1是
实施方案41.根据实施方案3至26和32至36中任何一项所述的化合物，其中R1是
实施方案42.根据实施方案3至26、32至36和41中任何一项所述的化合物，其中R1是
实施方案43.根据实施方案3至22、24和31-36中任何一项所述的化合物，其中R1是
实施方案44.根据实施方案3至22、24、31-36和43中任何一项所述的化合物，其中R1是
实施方案44.根据实施方案3至22、24、31-36和43中任何一项所述的化合物，其中R9是 -S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、N3、
实施方案45.根据实施方案3至44中任何一项所述的化合物，其中R9是-S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、N3、
实施方案46.式(II)的免疫缀合物:
其中:
Ab表示抗原结合部分；
L选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
y是1至16的整数；
R101是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基二价基团，其中所述6元杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1或C-连接至L1的，且所述6元杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或R101是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团，其中5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1或C-连接至L1的，且5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2,或-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R11或
R5是C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基，
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R11是C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、被苯基取代的咪唑基、被苯基取代的二唑基、吡唑基、咪啶基、 -CH2S(＝O)2NH2；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
R19是H或C1-C6烷基；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
实施方案47.式(II)的免疫缀合物:
其中:
Ab表示抗原结合部分；
L选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
y是1至16的整数；
R101是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基二价基团，其中所述6元杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1或C-连接至L1的，且所述6元杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或R101是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团，其中5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1或C-连接至L1的，且5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2或-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R11或
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R11是C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
实施方案48.根据实施方案46和47所述的免疫缀合物，其中L是-L1L2L3L4L5L6-或-L6L5L4L3L2L1-，且其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义。
实施方案49.根据实施方案46和47所述的免疫缀合物，其中L选自-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-和-L3L2L1-，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义。
实施方案50.根据实施方案47和49中任何一项所述的免疫缀合物，其中式(II)的免疫缀合物是式(IIa)的免疫缀合物:
实施方案51.根据实施方案46和47所述的免疫缀合物，其中L是-L1L2-或–L2L1-，且其中-L1和L2如文中所定义。
实施方案52.根据实施方案46、47和51中任何一项所述的免疫缀合物，其中式(II)的免疫缀合物是式(IIb)的免疫缀合物:
实施方案53.根据实施方案46、47、51和52中任何一项所述的免疫缀合物，其中式(II)、式(IIa)或式(IIb)的免疫缀合物是具有式(IIc)结构的免疫缀合物:
实施方案54.根据实施方案46至53中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
R101是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基二价基团，其中所述6元杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1的，且所述6元杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或
R101是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团，其中5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1的，且5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
实施方案55.根据实施方案46至54中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
R101是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基二价基团，
其中所述6元杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1的，且所述6元杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
实施方案56.根据实施方案46至55中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
R101是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基二价基团，其中所述6元杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1的，且所述6元杂环烷基二价基团是未取代的。
实施方案57.根据实施方案46-56中任何一项所述的免疫缀合物，其中R101是
实施方案58.根据实施方案46-57中任何一项所述的免疫缀合物，其中R101是
实施方案59.根据实施方案46-58中任何一项所述的免疫缀合物，其中R3是且R19是H。
实施方案60.根据实施方案46至59中任何一项所述的免疫缀合物，其中
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NHS(O)2R11或-NR12(CH2)mR16；
且
R13是四唑基、
实施方案61.根据实施方案46至60中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2或-NR12(CH2)mR16。
实施方案62.根据实施方案46至61中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
R13是四唑基、
实施方案63.根据实施方案46至62中任何一项所述的免疫缀合物，其中
R4是-OH或C1-C6烷氧基。
实施方案64.式(III)的免疫缀合物:
其中:
Ab表示抗原结合部分；
L选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
y是1至16的整数；
R1是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述6元杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或R1是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中5-8元稠合的二环杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R11是C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
R17是键、-NH-、-NHS(＝O)2-、
R18是键、或-CH2S(＝O)2NH-；
R19是H或C1-C6烷基；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
实施方案65.式(III)的免疫缀合物，
其中:
Ab表示抗原结合部分；
L选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义；
y是1至16的整数；
R1是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述6元杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或R1是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中5-8元稠合的二环杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R11是C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
R17是键、-NH-、-NHS(＝O)2-、
R18是键、
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
实施方案66.根据实施方案64和65中任何一项所述的免疫缀合物，其中L是-L1L2L3L4L5L6-或-L6L5L4L3L2L1-，且其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义。
实施方案67.根据实施方案64和65中任何一项所述的免疫缀合物，其中L选自-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-和-L3L2L1-，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如文中所定义。
实施方案68.根据实施方案64、65-66中任何一项所述的免疫缀合物，其中式(III)的免疫缀合物是式(IIIa)的免疫缀合物:
实施方案69.根据实施方案64和65中任何一项所述的免疫缀合物，其中L是-L1L2-或–L2L1-，且其中-L1和L2如文中所定义。
实施方案70.根据实施方案64、65和69中任何一项所述的免疫缀合物，其中式(III)的免疫缀合物是式(IIIb)的免疫缀合物:
实施方案71.根据实施方案64、65、69和70中任何一项所述的免疫缀合物，其中式(III)、式(IIIa)或式(IIIb)的免疫缀合物是式(IIIc)的免疫缀合物:
实施方案72.根据实施方案64至71中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
R1是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述6元杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
实施方案73.根据实施方案64至72中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
R1是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述6元杂环烷基是未取代的或被1-3独立地选自R5的取代基取代。
实施方案74.根据实施方案64至73中任何一项所述的免疫缀合物，其中
R1是
实施方案75.根据实施方案64至74中任何一项所述的免疫缀合物，其中
R1是
实施方案76.根据实施方案64至71中任何一项所述的免疫缀合物，其中
R1是
实施方案77.根据实施方案64至71中任何一项所述的免疫缀合物，其中
R1是
实施方案78.根据实施方案1-45中任何一项所述的化合物，或根据实施方案46至77中任何一项所述的免疫缀合物，其中R5是–CH3或–C(＝O)CH3。
实施方案79.根据实施方案1-45和78中任何一项所述的化合物，或根据实施方案46至78中任何一项所述的免疫缀合物，其中R12是H、-CH3或–CH2CH3。
实施方案80.根据实施方案1-45、78和79中任何一项所述的化合物，或根据实施方案46至79中任何一项所述的免疫缀合物，其中R2是甲基、乙基、异丙基或仲丁基。
实施方案81.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中
L1选自-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mX3((CH2)mO)n-，C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)m-，-(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)m-，-(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mS(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mNR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-，-NR12(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)m-，-(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-，-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-NR12(CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(C(R12)2)m-，-(CH2CH2O)n-，-(OCH2CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mX2X1 C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-，-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-，-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-，-C(＝O)CHRaaNR12-，-CHRaaC(＝O)-，-C(＝O)NR12-，-C(＝O)O-，-S-，-SCH2(C＝O)NR12-，-NR12C(＝O)CH2S-，-S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2-，-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，-NR12C(＝S)-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-，
L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键、-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mX3((CH2)mO)n-，C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH 2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)m-，(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)m-，-(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mS(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mNR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-，-NR12(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)m-，-(CH2)mC(R12)2NR12，(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-，-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-NR12(CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH 2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m，(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(C(R12)2)m-，-(CH2CH2O)n-，-(OCH2CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-，-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-，-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-，-C(＝O)CHRaaNR12-，-CHRaaC(＝O)-，-C(＝O)NR12，C(＝O)O-，-S-，-SCH2(C＝O)NR12-，-NR12C(＝O)CH2S-，-S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2-，-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，-NR12C(＝S)-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-，
其中:
R20是H或Me，且R30是H、-CH3或苯基；
R21是
各R25独立地选自H或C1-4烷基；
Raa是氨基酸的侧链，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯基甘氨酸和叔丁基甘氨酸；
R32独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R33独立地选自
且
R34独立地选自H、C1-4烷基和C1-6卤代烷基；
X1是自毁间隔体，其选自
X2是选自以下的二肽：
X3是且X4是
实施方案82.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中
L1选自-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-,-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-,-C(＝O)NR12(CH2)m-,-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)NH(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mS(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mNR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-，-NR12(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)m-，-(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-，-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12，NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(C(R12)2)m-，-(CH2CH2O)n-，-(OCH2CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-，-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-，-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-，-C(＝O)CHRaaNR12-，-CHRaaC(＝O)-，-C(＝O)NR12-，-C(＝O)O-，-S-，-SCH2(C＝O)NR12-，-NR12C(＝O)CH2S-，-S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2-，-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，-NR12C(＝S)-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m，(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-，
L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键、-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)3NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)3-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)3-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mS(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mNR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-，-NR12(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)m-，-(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-，-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，12-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR-，-(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(C(R12)2)m-，-(CH2CH2O)n-，-(OCH2CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，12-(CH2)mC(＝O)X2X1 C(＝O)NR(CH2)m-，-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-，-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-，-C(＝O)CHRaaNR12-，-CHRaaC(＝O)-，-C(＝O)NR12-，-C(＝O)O-，-S-，-SCH2(C＝O)NR12-，-NR12C(＝O)CH2S-，-S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2-，-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，-NR12C(＝S)-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-，
其中:
R20是H或Me，且R30是H、-CH3或苯基；
R21是
各R25独立地选自H或C1-4烷基；
Raa是氨基酸的侧链，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯基甘氨酸和叔丁基甘氨酸；
R32独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R33独立地选自
且
R34独立地选自H、C1-4烷基和C1-6卤代烷基；
X1是自毁间隔体，其选自
X2是选自以下的二肽：
X3是且X4是
实施方案83.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中
L1选自-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，C(＝O)X1C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-，C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mS(CH2)m-，-NHC(＝O)(CH2)m-，-NHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH-，-(CH2)mC(＝O)NH-，-(CH2)mNH(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-，-NH(CH2)m-，-NHC(R12)2(CH2)m-，-(CH2)mC(R12)2NH-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNH-，-NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-NHC(R12)2(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(R12)2NH-，-NH(CH2)mX3(CH2)m-，-NHC(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NH-，-NHC(R12)2(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)mC(R12)2NH-，-NHC(R12)2(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)mC(R12)2NH-，-NHC(R12)2(CH2)mOC(＝O)NH((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)O(CH2)mC(R12)2NH-，-NHC(R12)2(CH2)mOC(＝O)NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)O(CH2)mC(R12)2NH-，-(CH2)mX3(CH2)mNH-，-NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNH-，-(CH2)mNH-，-NH((CH2)mO)n(CH2)m-，-NH((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nNH-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNH-，-(CH2CH2O)n-，-(OCH2CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NH(CH2)m-，-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-，-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-，-C(＝O)CHRaaNH-，-CHRaaC(＝O)-，-C(＝O)NH-，-C(＝O)O-，-S-，-SCH2(C＝O)NH-，-NHC(＝O)CH2S-，-S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2-，-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，-NHC(＝S)-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)-，-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-，-NHS(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NH-，
L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键、-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-,-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-,-C(＝O)NH(CH2)m-,-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-,C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mS(CH2)m-，-NHC(＝O)(CH2)m-，-NHC(＝O)(CH2)mX2(CH2)m-，-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH-，-(CH2)mC(＝O)NH-，(CH2)mNH(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-，-NH(CH2)m-，-NHC(R12)2(CH2)m-，-(CH2)mC(R12)2NH-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNH-，-NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-NHC(R12)2(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(R12)2NH，NH(CH2)mX3(CH2)m-，-NHC(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NH-，-NHC(R12)2(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)mC(R12)2NH-，-NHC(R12)2(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)mC(R12)2NH-，-NHC(R12)2(CH2)mOC(＝O)NH((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)O(CH2)mC(R12)2NH-，-NHC(R12)2(CH2)mOC(＝O)NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)O(CH2)mC(R12)2NH-，-(CH2)mX3(CH2)mNH-，-NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNH-，-(CH2)mNH-，-NH((CH2)mO)n(CH2)m-，-NH((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nNH-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNH-，-(CH2CH2O)n-，-(OCH2CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NH(CH2)m-，-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-，-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-，-C(＝O)CHRaaNH-，-CHRaaC(＝O)-，-C(＝O)NH-，-C(＝O)O-，-S-，-SCH2(C＝O)NH-，-NHC(＝O)CH2S-，-S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2-，-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，-NHC(＝S)-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)-，-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-，-NHS(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NH-，
其中:
R20是H或Me，且R30是H、-CH3或苯基；
R21是
各R25独立地选自H或C1-4烷基；
Raa是氨基酸的侧链，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯基甘氨酸和叔丁基甘氨酸；
R32独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R33独立地选自
且
R34独立地选自H、C1-4烷基和C1-6卤代烷基；
X1是自毁间隔体，其选自
X2是选自以下的二肽：
X3是且X4是
实施方案84.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L2、L3、L4、L5和L6是键，且
L1选自-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mS(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mNR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-((CH2)mO)n(CH2)mX 3(CH2)m-，-(CH2)mX 3(CH2)m(O(CH2)m)n-，-NR12(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)m-，-(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-，-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(C(R12)2)m-，-(CH2CH2O)n-，-(OCH2CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-，-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-，-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-，-C(＝O)CHRaaNR12-，-CHRaaC(＝O)-，-C(＝O)NR12-，-C(＝O)O-，-S-，-SCH2(C＝O)NR12-，-NR12C(＝O)CH2S-，-S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2-，-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)-，-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，和-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-；
X1是自毁间隔体，其选自
X2是选自以下的二肽：
X3是且X4是
实施方案85.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中：
L2、L3、L4、L5和L6是键，且
L1选自-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1 X2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，C(＝O)X1C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)-，(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-((CH2)mO)n(CH2)m-，(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mS(CH2)m-，-NHC(＝O)(CH2)m-，-NHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH-，-(CH2)mC(＝O)NH-，-(CH2)mNH(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-，-NH(CH2)m-，-NHC(R12)2(CH2)m-，-(CH2)mC(R12)2NH-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNH-，-NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-NHC(R12)2(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(R12)2NH-，-NH(CH2)mX3(CH2)m-，-NHC(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NH-，-NHC(R12)2(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)mC(R12)2NH-，-NHC(R12)2(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)mC(R12)2NH-，-NHC(R12)2(CH2)mOC(＝O)NH((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)O(CH2)mC(R12)2NH-，-NHC(R12)2(CH2)mOC(＝O)NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)O(CH2)mC(R12)2NH-，-(CH2)mX3(CH2)mNH-，-NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNH-，-(CH2)mNH-，-NH((CH2)mO)n(CH2)m-，-NH((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nNH-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNH-，-(CH2CH2O)n-，-(OCH2CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NH(CH2)m-，-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-，-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-，-C(＝O)CHRaaNH-，-CHRaaC(＝O)-，-C(＝O)NH-，-C(＝O)O-，-S-，-SCH2(C＝O)NH-，-NHC(＝O)CH2S-，-S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2-，-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-and-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)-，-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m--NHS(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，和-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NH-；
X1是自毁间隔体，其选自
X2是选自以下的二肽：
X3是且X4是
实施方案86.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案45至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L2、L3、L4、L5和L6是键，且
L1选自-(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-,-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-,-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-,-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-,-C(＝O)NH(CH2)m-,-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-,-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-,-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-,(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-,(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-,-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-,-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-,-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-,-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-,-NHC(R12)2(CH2)m-,-NH(CH2)mX3(CH2)m-，-NHCH2(CH2)mOC(＝O)NH((CH2)mO)n(CH2)m-，(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)-，-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-，-NHS(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-和-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NH-，；
X1是自毁间隔体，其选自
X2是选自以下的二肽：
X3是且X4是
实施方案87.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中：
L2、L3、L4、L5和L6是键，且
L1选自-(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-NHC(R12)2(CH2)m-、-NH(CH2)mX3(CH2)m-、-NHCH2(CH2)mOC(＝O)NH((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-和-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-NHS(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-和-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NH-；
X1是自毁间隔体，其选自
X2是选自以下的二肽：
X3是且X4是
实施方案88.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至63和78至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1是-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m*-、-*C(＝O)(CH2)mX3((CH2)mO)n-、-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-、-((CH2)mO)n(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)*-、-(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mS(＝O)2*-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2*-、-(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)*-和-(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)mS(＝O)2*-，其中在免疫缀合物实施方案中，*指示与R101的连接点，而在化合物实施方案中*指示与R1的连接点；
L2是键、 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、-SCH2CH2C(＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2NH-或-NHS(＝O)2CH2CH2S-，其中*指示与L1的连接点；
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案89.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至63和78至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1是-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-、-((CH2)mO)n(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)*-、-(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mS(＝O)2*-和-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2*-，其中在免疫缀合物实施方案中*指示与R101的连接点，而在化合物实施方案中*指示与R1的连接点；
L2是键、 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、-SCH2CH2C(＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2NH-或-NHS(＝O)2CH2CH2S-，其中*指示与L1的连接点；
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案90.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至63和78至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-和-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-，其中在免疫缀合物实施方案中*指示与R101的连接点，而在化合物实施方案中*指示与R1的连接点；
L2是 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、-SCH2CH2C(＝O)NH-、-NHC(＝O)CH CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2NH-或-NHS(＝O)2CH2CH2S-，其中*指示与L1的连接点,
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案91.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至63和78至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-和-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-，其中在免疫缀合物实施方案中*指示与R101的连接点，而在化合物实施方案中*指示与R1的连接点；
L2是 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、-NH(＝O)CH2CH2S-、-SCH2CH2C(＝O)NH-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中*指示与L1的连接点,
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案92.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至63和78至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-和-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-，其中在免疫缀合物实施方案中*指示与R101的连接点，而在化合物实施方案中*指示与R1的连接点；
L2是其中*指示与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案93.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至63和78至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-和-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-，其中在免疫缀合物实施方案中*指示与R101的连接点，而在化合物实施方案中*指示与R1的连接点；
L2是其中*指示与L1的连接点,
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案94.根据实施方案3至45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案46至63和78至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-和-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-，其中在免疫缀合物实施方案中*指示与R101的连接点，而在化合物实施方案中*指示与R1的连接点；
L2是其中*指示与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案95.根据实施方案3至21、27至31、34、36至40、45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案64至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-*C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-、-*C(＝O)NH(CH2)m)-、-*C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-*((CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-*C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-*C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-、-*(CH2)m(O(CH2)m)n-、-*C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)NH(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-和-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，其中*指示与R3的连接点；
L2是键、 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、 -S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中*指示与L1的连接点,
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案96.根据实施方案3至21、27至31、34、36至40、45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案64至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-*C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-、-*C(＝O)NH(CH2)m)-、-*C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-*C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-*C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-、-*(CH2)m(O(CH2)m)n-、-*C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)NH(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-和-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，其中*指示与R3的连接点；
L2是键、 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、 -S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中*指示与L1的连接点,
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案97.根据实施方案3至21、27至31、34、36至40、45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案64至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-*C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-和-*C(＝O)NH(CH2)m)-，其中*指示与R3的连接点；
L2是-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、 -S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中*指示与L1的连接点,
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案98.根据实施方案3至21、27至31、34、36至40、45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案64至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-*C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-和-*C(＝O)NH(CH2)m)-，其中*指示与R3的连接点；
L2是-S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、 -S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中*指示与L1的连接点,
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案99.根据实施方案3至21、27至31、34、36至40、45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案64至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-*C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-和-*C(＝O)NH(CH2)m)-，其中*指示与R3的连接点；
L2是其中*指示与L1的连接点,
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案100.根据实施方案3至21、27至31、34、36至40、45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案64至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-*C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-和-*C(＝O)NH(CH2)m)-，其中*指示与R3的连接点；
L2是-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、 -S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中*指示与L1的连接点,
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案101.根据实施方案3至21、27至31、34、36至40、45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案64至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-*C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-和-*C(＝O)NH(CH2)m)-，其中*指示与R3的连接点；
L2是其中*指示与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案102.根据实施方案3至21、27至31、34、36至40、45和78至80中任何一项所述的化合物，和根据实施方案64至80中任何一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-*C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-和-*C(＝O)NH(CH2)m)-，其中*指示与R3的连接点；
L2是其中*指示与L1的连接点,
且L3、L4、L5和L6是键。
实施方案103.根据实施方案1-45和78至102中任何一项所述的化合物，其中所述化合物选自
实施方案104.药物组合物，其包含实施方案46至102中任何一项所述的免疫缀合物和一种或多种药学上可接受的载体。
实施方案105.组合产品，其包含治疗有效量的实施方案46至102中任何一项所述的免疫缀合物和一种或多种治疗活性的共活性剂。
实施方案106.治疗细胞增殖病症的方法，其包括向有其需要的个体施用治疗有效量的实施方案46至102中任何一项所述的免疫缀合物。
实施方案107.实施方案46至102中任何一项所述的免疫缀合物，其用作药物。
实施方案108.根据实施方案107所述的免疫缀合物，其中所述药物用于治疗癌症。
实施方案109.实施方案46至102中任何一项所述的免疫缀合物，其用于治疗癌症。
实施方案110.根据实施方案46至102的免疫缀合物，其具有选自以下的式:
实施方案111.在实施方案110中，X是
其中R101、R2和R3如在实施方案46、47、54至59和80中所定义。
实施方案112.在实施方案中111，X是其中R1、R2和R3如在实施方案65、66、73至78和81中所定义。
实施方案113.在实施方案112中，X是实施方案1或2中的种类(species)中的任何一种。
实施方案114.在实施方案46至113中的任何一项中，除非另外说明，Ab可以是任何抗原结合部分，并且优选是识别为靶细胞例如癌症细胞的特征的细胞表面标志(例如文中描述的那些)的抗原或抗原片段。
实施方案115.在实施方案46至113中任何一项中，除非另外描述，Ab可以是任何抗原结合部分，典型地是识别药物干预所靶向的细胞例如癌症细胞的抗原特征的抗原结合部分。许多适当的抗原是本领域众所周知的；特别关注的具体种类描述在文中。典型地，Ab是抗体，其可以是分离的或构建的,并且可以是天然的或修饰的(改造的),或保留与抗体类似的抗原结合活性的抗体片段。
实施方案116.在上述实施方案中的任一项中，各m独立地选自1、2、3、4、5和6。在上述实施方案中的任一项中，各m独立地选自1、2、3、4和5。在上述实施方案中的任一项中，各m独立地选自1、2、3和4。在上述实施方案中的任一项中，各m独立地选自1、2和3。在上述实施方案中的任一项中，各m独立地选自1和2。
实施方案117.在上述实施方案中的任一项中，各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在上述实施方案中的任一项中，各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。在上述实施方案中的任一项中，各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在上述实施方案中的任一项中，各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在上述实施方案中的任一项中，各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7和8。在上述实施方案中的任一项中，各n独立地选自1、2、3、4、5、6和7。在上述实施方案中的任一项中，各n独立地选自1、2、3、4、5和6。在上述实施方案中的任一项中，各n独立地选自1、2、3、4和5。在上述实施方案中的任一项中，各n独立地选自1、2、3和4。在上述实施方案中的任一项中，各n独立地选自1、2和3。在上述实施方案中的任一项中，各n独立地选自1和2。
实施方案118.在实施方案46至114中任何一项中，各y独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在上述实施方案中的任一项中，各y独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。在上述实施方案中的任一项中，各y独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在上述实施方案中的任一项中，各y独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在上述实施方案中的任一项中，各y独立地选自1、2、3、4、5、6、7和8。在上述实施方案中的任一项中，各y独立地选自1、2、3、4、5、6和7。在上述实施方案中的任一项中，各y独立地选自1、2、3、4、5和6。在上述实施方案中的任一项中，各y独立地选自1、2、3、4和5。在上述实施方案中的任一项中，各y独立地选自1、2、3和4。在上述实施方案中的任一项中，各y独立地选自1、2和3。在上述实施方案中的任一项中，各y独立地选自1和2。
实施方案119.根据实施方案3的化合物，其中R3是 且R19是H。
实施方案120.根据实施方案3至6、18-26、32、33、45和81-87中任何一项所述的化合物，其中:
R1是R2是甲基、乙基、异丙基或仲丁基；R3是
R4是–OH；R9是
L是L1，其中L1选自-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-和-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
实施方案121.根据实施方案3至6、18-26、32、33、45和81-87中任何一项所述的化合物，其中:
R1是R2是甲基、乙基、异丙基或仲丁基；
L是L1，其中L1选自-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-和-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-；
R3是R4是–OH；R9是X3是
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
Claims (56)
1.具有式(I)结构的化合物或其立体异构体
其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的，或各自被R7和0-3个独立选自R5和R6的取代基取代，或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NR12(CH2)mR16、-LR9、-NHS(O)2R11、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(＝O)2LR9、
R5是C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被–CN、-C(＝O)NH2或1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R7是LR9；
R8是H或LR9；
各L独立地选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1、
其中
L1选自:
-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mX3((CH2)mO)n-、-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-、-(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)m-、-(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)m-、-(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mS(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12-、-(CH2)mNR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NR12(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)m-、-(CH2)mC(R12)2NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-、-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-NR12(CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)mNR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(C(R12)2)m-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-、-(CH2)mO(CH2)m-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)m X3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-、-(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-、-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-、-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-、-C(＝O)CHRaaNR12-、-CHRaaC(＝O)-、-C(＝O)NR12-、-C(＝O)O-、-S-、-SCH2(C＝O)NR12-、-NR12C(＝O)CH2S-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-、-NR12C(＝S)-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-、-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-、
R20是H或Me，且R30是H、-CH3或苯基；
R21是
各R25独立地选自H或C1-4烷基；
Raa是氨基酸的侧链，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯基甘氨酸和叔丁基甘氨酸；
R32独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R33独立地选自
R34独立地选自H、C1-4烷基和C1-6卤代烷基；
X1是自毁间隔体，其选自
X2是选自以下的二肽：
X3是且
X4是
且L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键和L1；
R9是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR15、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R10、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R10是
各R11独立地选自C1-C6烷基和任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、被苯基取代的咪唑基、被苯基取代的二唑基、吡唑基、咪啶基、 -CH2S(＝O)2NH2、-CH2S(＝O)2NHLR9、-LR9或–X4LR9；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是2-吡啶基或4-吡啶基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR9取代；
各R19是H或C1-C6烷基；
X3是
X4是
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18，
或其药学上可接受的盐。
2.权利要求1的化合物，其中R3是且R19是H。
3.权利要求1或权利要求2的化合物，其中所述化合物是具有式(Ia)结构的化合物:
4.权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述化合物是具有式(Ib)结构的化合物:
5.权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中各L独立地选自L1L2-和-L2L1-，或L是-L1-。
6.权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述C-连接的6元杂环烷基被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
7.权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述C-连接的6元杂环烷基被R7和0-3个独立地选自R5和R6的取代基取代,
且
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R11、
8.权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中:
R2是-C1-C6烷基；
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R7是L1R9；
R8是H；
R9是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR15、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R10是
各R11独立地选自C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是2-吡啶基或4-吡啶基，
且
R16是未取代的N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基。
9.权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中R1是
10.权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中R1是
11.权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中R1是
12.权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中R1是
13.权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代。
14.权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述C-连接的6元杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
15.权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述C-连接的6元杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R3是
且
R4是-L1R9、-NHS(＝O)2L1R9、
16.权利要求1-5或15中任一项所述的化合物，其中:
R2是-C1-C6烷基；
R5是C1-C6烷基、任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12或-((CH2)mO)nR12；
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2和–NR12C(＝O)R11；
R8是L1R9；
R9是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R10、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R10是
各R11独立地选自C1-C6烷基和任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是 -LR9或–X4LR9；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基，其被-LR9取代；
X3是
X4是
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
17.权利要求1-5或15至16中任一项所述的化合物，其中R4是-L1R9、-NHS(＝O)2L1R9、
18.权利要求1-5或15至17中任一项所述的化合物，其中R13是 -LR9或–X4LR9。
19.权利要求1-18中任一项所述的化合物，其中R9是 -S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、N3、
20.权利要求1-19中任一项所述的化合物，其中R9是 -S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、N3、
21.权利要求1-20中任一项所述的化合物，其中L是–L1-，且–L1-选自:-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、 -(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-和-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-。
22.权利要求1-21中任一项所述的化合物，其中L是–L1-，且–L1-选自:-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、 -(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-和-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-。
23.权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，或R1是C-连接的含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基，其中各自是未取代的或各自被1-3个独立选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R11、
R5是C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被–CN、-C(＝O)NH2或1-5个羟基取代的C1-C6烷基，
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R8是H；
各R11独立地选自C1-C6烷基和任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、被苯基取代的咪唑基、被苯基取代的二唑基、吡唑基、咪啶基、 -CH2S(＝O)2NH2；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是2-吡啶基或4-吡啶基；
R16是未取代的N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
R19是H或C1-C6烷基；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
24.权利要求23的化合物，其中:
R1是C-连接的含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基，其中所述C-连接的6元杂环烷基是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
25.权利要求1-14或23至24中任一项所述的化合物，其中R4是–OH、–OCH3、-NHS(O)2R11、-NHS(O)2(CH2)mN3或
26.权利要求1、5至16或19至25中任一项所述的化合物，其中R13是
27.权利要求1-5或权利要求13至26中任一项所述的化合物，其中R1是
28.权利要求1-5或权利要求13至26中任一项所述的化合物，其中R1是
29.权利要求1-5、13、23或25至26中任一项所述的化合物，其中R1是
30.权利要求1-5、13、23或25至26中任一项所述的化合物，其中R1是
31.权利要求1-30中任一项所述的化合物，其中R5是–CH3或–C(＝O)CH3。
32.权利要求1-31中任一项所述的化合物，其中R12是H、-CH3或–CH2CH3。
33.权利要求1-32中任一项所述的化合物，其中R2是甲基、乙基、异丙基或仲丁基。
34.权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中:
R1是
R2是甲基、乙基、异丙基或仲丁基；R3是
R4是–OH；R9是且
L是L1，其中L1选自-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-和-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
35.权利要求1的化合物，其选自：
36.式(II)的免疫缀合物:
其中:
Ab表示抗原结合部分；
L选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1、
其中
L1选自-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-、-(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)m-、-(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)m-、-(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mS(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12-、-(CH2)mNR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NR12(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)m-、-(CH2)mC(R12)2NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-、-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-NR12(CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-NR12(CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)mNR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(C(R12)2)m-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-、-(CH2)mO(CH2)m-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-、-(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-、-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-、-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-、-C(＝O)CHRaaNR12-、-CHRaaC(＝O)-、-C(＝O)NR12-、-C(＝O)O-、-S-、-SCH2(C＝O)NR12-、-NR12C(＝O)CH2S-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-、-NR12C(＝S)-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-、-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-、
R20是H或Me，且R30是H、-CH3或苯基；
R21是
各R25独立地选自H或C1-4烷基；
Raa是氨基酸的侧链，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯基甘氨酸和叔丁基甘氨酸；
R32独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R33独立地选自
R34独立地选自H、C1-4烷基和C1-6卤代烷基；
X1是自毁间隔体，其选自
X2是选自以下的二肽：
X3是且
X4是
且L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键和L1；
y是1至16的整数；
R101是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基二价基团，其中所述6元杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1或C-连接至L1的，且所述6元杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或R101是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团，其中5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1或C-连接至L1的，且5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2或-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R11或
R5是C1-C6烷基、-C(＝O)R11、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基，
R6是卤素、氧代、OH、C1-C6烷基、-N(R14)2、-R16和–NR12C(＝O)R11；
R11是C1-C6烷基或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
各R12独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是四唑基、被苯基取代的咪唑基、被苯基取代的二唑基、吡唑基、咪啶基、 或-CH2S(＝O)2NH2；
各R14独立地选自H和C1-C6烷基；
R16是N-连接的含有1-2个独立地选自N和O的杂原子的4-8元杂环烷基；
R19是H或C1-C6烷基；
各m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
各n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
37.权利要求36的免疫缀合物，其中式(II)的免疫缀合物是式(IIb)的免疫缀合物:
38.权利要求36至37中任一项所述的免疫缀合物，其中式(II)、式(IIa)或式(IIb)的免疫缀合物是具有式(IIc)结构的免疫缀合物:
39.权利要求36至38中任一项所述的免疫缀合物，其中:
R101是含有1-2个N杂原子和C1-C2亚烷基桥的6元杂环烷基二价基团，其中所述6元杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1的，且所述6元杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代；
或
R101是含有1-2个N杂原子的5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团，其中5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是C–连接至基团的并且是N-连接至L1的，且5-8元稠合的二环杂环烷基二价基团是未取代的或被1-3个独立地选自R5和R6的取代基取代。
40.权利要求36至39中任一项所述的免疫缀合物，其中R101是
41.权利要求36至40中任一项所述的免疫缀合物，其中R101是
42.权利要求36至41中任一项所述的免疫缀合物，其中R3是 且R19是H。
43.权利要求36至42中任一项所述的免疫缀合物，其中:
R4是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2或-NR12(CH2)mR16。
44.权利要求36至42中任一项所述的免疫缀合物，其中:
R13是四唑基、
45.权利要求36至43中任一项所述的免疫缀合物，其中
R4是-OH或C1-C6烷氧基。
46.权利要求36至45中任一项所述的免疫缀合物，其中R5是–CH3或–C(＝O)CH3。
47.权利要求36至46中任一项所述的免疫缀合物，其中R12是H、-CH3或–CH2CH3。
48.权利要求36至47中任一项所述的免疫缀合物，其中R2是甲基、乙基、异丙基或仲丁基。
49.权利要求36至48中任一项所述的免疫缀合物，其中:
L1是-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)*-、-((CH2)mO)n(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)*-、-(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mS(＝O)2*-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2*-、-(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)*-和-(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)mS(＝O)2*-，且其中*指示与R101的连接点；
L2是键、 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、-SCH2CH2C(＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2NH-或-NHS(＝O)2CH2CH2S-，其中*指示与L1的连接点，且
L3、L4、L5和L6是键。
50.权利要求36至49中任一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-和-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-，
其中*指示与R101的连接点；
L2是 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、-SCH2CH2C(＝O)NH-、-NHC(＝O)CH CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2NH-或-NHS(＝O)2CH2CH2S-，其中*指示与L1的连接点，且
L3、L4、L5和L6是键。
51.权利要求36至50中任一项所述的免疫缀合物，其中:
L1选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-和
-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-，其中*指示与R101的连接点；且
L2是其中*指示与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
52.药物组合物，其包含权利要求36至51中任一项所述的免疫缀合物和一种或多种药学上可接受的载体。
53.组合产品，其包含治疗有效量的权利要求36至51中任一项所述的免疫缀合物和一种或多种治疗活性的共活性剂。
54.治疗细胞增殖病症的方法，其包括向有其需要的个体施用治疗有效量的权利要求36至51中任一项所述的免疫缀合物。
55.权利要求36至51中任一项所述的免疫缀合物，其用作药物。
56.权利要求36至51中任一项所述的免疫缀合物，其用于治疗癌症。
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