CN106573956A - 澳瑞他汀衍生物及其缀合物 - Google Patents

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J·格鲁内瓦尔德
W·欧
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宇野哲郎
万咏勤
王兴
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Abstract

本文公开了新的本文所述的式(I)化合物，以及所述肽在制备免疫缀合物(即，抗体药物缀合物)中的用途。本文还描述了免疫缀合物(即，抗体药物缀合物)，其包含与抗原结合部分例如抗体连接的所述新化合物；其中所述免疫缀合物可用于治疗细胞增殖性病症。本发明还提供包含这些免疫缀合物的药物组合物、包含所述免疫缀合物以及治疗共活性剂的组合物和使用这些免疫缀合物和组合物治疗细胞增殖病症的方法。

Description

澳瑞他汀衍生物及其缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年6月13日提交的美国临时申请号62/011961的权益，将其全部引入本文作为参考。
发明领域
本发明提供作为抗-有丝分裂的细胞毒性肽并且可用于治疗细胞增殖性病症的化合物。本发明还包括包含与抗原结合部分连接的所述化合物的缀合物，以及含有这些缀合物的药物组合物。还包括使用这些化合物和缀合物治疗细胞增殖病症包括癌症的方法。
背景
用于将细胞增殖抑制剂和/或细胞毒性物质靶向递送至特定细胞的抗体-药物缀合物(ADC)的应用已经成为重要研究的焦点。抗体-药物缀合物(Antibody-DrugConjugate),Methods in Molecular Biology,Vol.1045,编辑L.Ducry,Humana Press(2013)。ADC包含由于其与靶向治疗干预的细胞结合的能力而被选取的抗体，该抗体连接至由于其细胞抑制活性或细胞毒性而被选取的药物。从而，抗体与靶向细胞的结合使药物递送至需要其治疗效果的位置。
已经公开了在ADC中使用的识别并选择性结合至靶细胞如癌症细胞的许多抗体，还已描述了用于将有效载荷(payload)(药物)化合物例如细胞毒素连接至抗体的许多方法。尽管对于ADC已经做了大量工作，但是只有很少类的细胞增殖抑制剂已被广泛用作ADC有效载荷。尽管在美国批准用于人的第一个ADC在2000年上市(并且随后退市)，但是十年后，仅少数化学类别的药物化合物(美登素类(Maytansinoids)、澳瑞他汀(Auristatins)、刺孢霉素(calicheamycins)和多卡米星)已经作为ADC的有效载荷进入临床实验。Antibody-Drug Conjugates:the Next Generation of Moving Parts,A.Lash,Start-Up,2011年12月,1-6。由于ADC作为治疗剂特别是用于治疗癌症的广泛认可的价值，因此仍需要用作ADC中的有效载荷的具有改善的性质的化合物。
发明简述
本文提供的本发明包括化合物和使用此类化合物作为抗体-药物缀合物(ADC)的药物组分的方法。本发明包括新化合物和此类新化合物作为ADC的有效载荷的用途。本发明还包括可用于将此类新化合物引入ADC中的方法和中间体，以及使用所述新化合物和缀合物治疗细胞增殖病症的方法。所述化合物是通过阻断微管蛋白的聚合从而阻断核迁移以及核和细胞分裂而抑制细胞分裂的抗有丝分裂剂。
本发明的一个方面为具有式(I)结构的化合物或其立体异构体以及其互变异构体、水合物及可药用盐，
其中：
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、–N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)2、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20、–NHR8、-NHLR11、-NHR21、–N＝CR5R10、–N＝R22、–N＝CR5R23或-NHC(＝O)R23；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是-(CH2)mN(R12)2、-(CH2)mN(R12)C(＝O)OR12或未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、-OH、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2、-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6和-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)2；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(＝O)2LR11、-NHLR11、-NHS(O)2(CH2)mNH2、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-LR11、-NHS(O)2R18、
R10是LR11或
R11是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR17、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R13、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是–S(CH2)nCHR14NHC(＝O)R12、
R14是R12或–C(＝O)OR12；
R15是四唑基、-CN、-C(＝O)OR12、 -LR11或–X4LR11；
L各自独立地选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR11取代；
R17是2-吡啶基或4-吡啶基；
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R21是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基；
R22是C-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R23是N-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
X3是X4是
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18，
或其互变异构体、水合物或可药用盐。
该上述方面的一项实施方案中，
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、–N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)2、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20、–NHR8、-NHLR11、-NHR21、–N＝CR5R10、–N＝R22、–N＝CR5R23或-NHC(＝O)R23；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是-(CH2)mN(R12)2、-(CH2)mN(R12)C(＝O)OR12或未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、-OH、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2、-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6和-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)2；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-NHS(O)2(CH2)mN3、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-LR11、-NHS(O)2R18、-NHS(＝O)2LR11、
R10是LR11或
R11是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR17、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R13、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是–S(CH2)nCHR14NHC(＝O)R12或
R14是R12或–C(＝O)OR12；
R15是四唑基、-CN、-C(＝O)OR12、 -LR11或–X4LR11；
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR11取代；
R17是2-吡啶基或4-吡啶基；
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R21是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基；
R22是C-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R23是N-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
X3是
X4是
L各自独立地选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在具有式(I)结构的化合物方面的某些实施方案中，
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、–N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)2、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20或–NHR8；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是-(CH2)mN(R12)2、-(CH2)mN(R12)C(＝O)OR12或未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、-OH、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2、-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6和-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)2；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R18或
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R14是R12或–C(＝O)OR12；
R15是四唑基、-CN、-C(＝O)OR12、
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基；
R17是2-吡啶基或4-吡啶基；
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在具有式(I)结构的化合物的该方面的某些实施方案中，是具有式(Ia)结构的化合物:
在具有式(I)或式(Ia)结构的化合物的该方面的其它实施方案中，是具有式(Ib)结构的化合物:
在具有式(I)结构的化合物的该方面的其它实施方案中，是具有式(Ic)结构的化合物:
在具有式(I)或式(Ic)结构的化合物的该方面的其它实施方案中，是具有式(Id)结构的化合物:
在具有式(I)结构的化合物的该方面的其它实施方案中，是具有式(Ie)结构的化合物:
在具有式(I)或式(Ie)结构的化合物的该方面的其它实施方案中，是具有式(If)结构的化合物:
本发明提供免疫缀合物(本文也称为ADC)，其包含与抗原结合部分例如抗体或抗体片段连接的式(I)化合物。包含式(I)化合物的这些缀合物可用于治疗细胞增殖病症，特别是当所述化合物连接至识别癌症细胞的抗体并因此促使该化合物递送至攻击的靶细胞时。所述免疫缀合物尤其是可用于治疗某些本文进一步详述的癌症。本文提供的数据证实这些免疫缀合物是有效的细胞增殖抑制剂；在不受理论约束的情况下，认为它们的活性是由于抑制细胞中微管蛋白的聚合。
本发明免疫缀合物的一个方面包括式(II)的免疫缀合物：
其中：
Ab代表抗原结合部分；
L是选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-,-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
y是1-16的整数；
R101是-NHC(＝O)NR6*-、-NHR121*-、或-NHC(＝O)R123*-，其中*代表与L的连接点；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R18或
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是四唑基、
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR11取代；
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R110是键或
R121是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元亚杂芳基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基；
R122是C-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元亚杂环烷基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R123是N-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元亚杂环烷基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在式(II)的免疫缀合物的一项实施方案中：
Ab代表抗原结合部分；
L是选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
y是1-16的整数；
R101是-NHC(＝O)NR6*-、-NHR121*-、或-NHC(＝O)R123*-，其中*代表与L的连接点；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R18或
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是四唑基、
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR11取代
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R110是键或
R121是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元亚杂芳基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN,NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基；
R122是C-连接的包含1-2个独立地选自N、O和S的杂原子的5-6元亚杂环烷基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R123是N-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元亚杂环烷基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
本发明免疫缀合物的另一个方面是具有式(III)结构的免疫缀合物：
其中：
Ab代表抗原结合部分；
L是选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
y是1-16的整数；
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20或–NHR8；
R2是-C1-C6烷基；
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-OH、-N(R6)2、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6和C1-C6烷氧基；
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-C(＝O)OR12、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R113是
R117是键、-NH-、-NHS(＝O)2-、-NHS(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-、-NHS(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)-、–NHS(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)m-、
R118是键、四唑基、
R26是
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在式(III)的免疫缀合物的一项实施方案中：
Ab代表抗原结合部分；
L是选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
y是1-16的整数；
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20或–NHR8；
R2是-C1-C6烷基；
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-OH、-N(R6)2、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6和C1-C6烷氧基；
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-C(＝O)OR12、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R113是
R117是键、-NH-、-NHS(＝O)2-、
R118是键、四唑基、
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
和
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
本发明提供采用式(I)化合物作为待被递送的有效载荷(药物)制备此类ADC的方法。此类化合物是抗有丝分裂的细胞毒肽类，其中N-端或C-端已经被修饰以具有反应性官能团和任选的一个或多个连接体构件，以便于使所述化合物直接或间接连接至抗体或抗体或抗原结合片段，例如上面描述的式(I)化合物的第二和第三个方面。此外，本发明提供使用这些ADC治疗细胞增殖病症的方法。
在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物，所述免疫缀合物混合有至少一种可药用的载体或赋形剂，任选混合有两种或更多种可药用的载体或赋形剂，并提供使用这些组合物治疗细胞增殖病症的方法。
在另一方面，本发明提供治疗特征在于过度或不希望的细胞增殖的疾患的方法，其包括向需要此治疗的个体施用有效量的式(II)或式(III)的免疫缀合物。治疗的个体可以是哺乳动物，并优选是人。可被本文描述的免疫缀合物和方法治疗的疾患包括各种形式的癌症，例如胃瘤、骨髓瘤、结肠瘤、鼻咽瘤、食道瘤和前列腺瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如髓性白血病、淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多毛细胞白血病)、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、多发性骨髓瘤、膀胱瘤、肾瘤、胃瘤(例如胃肠道间质瘤(GIST))、肝癌、黑色素瘤和胰腺癌以及肉瘤。能够用这些方法和组合物治疗的其它细胞增殖病症包括糖尿病视网膜病变、肝和肺纤维化、舍格伦(Sjogren)综合征和红斑狼疮。
本发明包括本文描述的式(I)-(III)和其子式的组分和所有立体异构体(包括非对映异构体和对映异构体)、互变异构体和其同位素富集形式(包括氘取代)以及这些化合物的可药用盐。本发明还包括式(I)(或其子式)和其盐、特别是可药用盐的多晶型物。
附图简述
图1.抗-Her2 ADC的体外细胞增殖试验：(A)MDA-MB-231克隆40细胞、(B)MDA-MB-231克隆16细胞、(C)HCC1954细胞和(D)JimT-1细胞。
图2.抗体20507 ADC的体外细胞增殖试验：(A)Jurkat细胞、(B)NCI-H526细胞、(C)KU812细胞和(D)CMK11-5细胞。
图3.使用抗-hIgG试验和抗-MMAF试验的抗-Her2和抗体20507ADC和抗体的药代动力学研究：通过工程化Cys残基缀合的抗-Her2 ADC(A和B)和抗体20507 ADC(C和D)、通过酶促缀合(E)和通过天然二硫键部分还原缀合以及通过赖氨酸残基(F)缀合。图(F)中还包含非-缀合的抗-Her2抗体(抗-Her2)作为参照。
图4.抗-Her2 ADC在NCI-N87异种移植模型(A和B)中以及抗体20507 ADC在H526异种移植模型(C、D和E)中的体内效能研究。在第0天施用单次剂量。
详细描述
除非另外明确提供定义，否则应用下面的定义。
术语“氨基酸”指典型的、合成的和非天然的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其以与典型氨基酸类似的方式起作用。典型氨基酸是由遗传密码编码的生成蛋白质的氨基酸并包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸，以及硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸及吡咯啉-羧基-赖氨酸。氨基酸类似物指与典型氨基酸具有相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保持与典型氨基酸相同的基本化学结构。
本文使用的术语“抗原结合部分(antigen binding moiety)”涉及能够特异性与抗原结合的部分，并且包括且不限于抗体和抗原结合片段。
如本文所用的术语“抗体”指能够非共价、可逆地并以特异性方式结合对应的抗原的免疫球蛋白家族的多肽。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每一条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每一条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为称为互补性决定区(CDR)的高变异性的区域，其散布于称为框架区(FR)的更保守的区域间。每一VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端向羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(CIq)的结合。
术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、嵌合抗体，和抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如，本发明抗体的抗-Id抗体)。抗体可以是任何同种型/类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”是功能性使用的。在这方面，应当理解轻(VL)链和重(VH)链部分的可变域都决定抗原识别和特异性。相反，轻链的恒定域(CL)和重链的恒定域(CH1、CH2或CH3)赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。根据惯例，恒定区结构域的编号随着它们从抗体的抗原结合位点或氨基末端变得更远而增加。N-端是可变区并且C-端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端结构域。
如本文所用，术语“抗原结合片段”指抗体的一个或多个部分，其保留与抗原的表位(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)特异性相互作用的能力。结合片段的实例包括但不限于单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单条臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段(Ward等,Nature341:544-546,1989)，其由VH结构域组成；和分离的互补性决定区(CDR)，或抗体的其他表位结合片段。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是可以使用重组方法，通过合成的连接体将它们连接，所述合成连接体使得它们被制备成单条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(“scFv”)；参见例如Bird等,Science 242:423-426,1988；和Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988)。此类单链抗体也旨在包括在术语“抗原结合片段”中。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗原结合片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的有用性。
抗原结合片段也可以掺入到单结构域抗体、大抗体(maxibodies)、微抗体(minibodies)、纳米抗体(nanobodies)、胞内抗体(intrabodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、v-NAR和bis-scFv(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原结合片段可以嫁接到基于多肽的支架，如纤连蛋白III型(Fn3)上(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单抗体)。
抗原结合片段可以掺入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等,Protein Eng.8:1057-1062,1995；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体成分”指这样的多肽，其包括具有基本相同的氨基酸序列或来自相同遗传来源的抗体和抗原结合片段。该术语还包括单一分子成分的抗体分子的制品。单克隆抗体成分对特定表位展示单一的结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”包括具有这样的可变区的抗体，其中两个构架和CDR区来自人起源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么该恒定区也来自此类人序列，例如，人种系序列，或人种系序列的突变形式或含有来自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如如Knappik等,J.Mol.Biol.296:57-86,2000)中所述。
本发明的人抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点定向诱变或通过体内体细胞突变引入的突变，或取代以促进稳定性或制造)。
如本文所用，术语“人源化”抗体指保留非人抗体的反应性同时在人中免疫原性较低的抗体。这例如通过保留非人CDR区并利用其人对应物替换抗体的剩余部分来实现。参见例如，Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994)。
当在描述抗原(例如蛋白质或聚糖)与抗体、抗体片段或衍生自抗体的结合物质的相互作用的情况下使用时，术语“特异性结合”或“选择性结合”是指在蛋白质和其它生物制品的异质群体中例如在生物样品例如血液、血清、血浆或组织样品中确定抗原存在的结合反应。因此，在某些指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合物质以至少两倍于背景与特定抗原结合，并且基本上不与样品中存在的其它抗原以显著量结合。在一个实施方案中，在指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合物质以至少十(10)倍于背景与特定抗原结合，并且基本上不与样品中存在的其它抗原以显著量结合。在这类条件下与抗体或结合物质的特异性结合可能需要所述抗体或结合物质已就其对特定蛋白质的特异性进行选择。在需要或适当时，该选择可以通过扣除与来自其它物种(例如小鼠或大鼠)或其它亚类的分子交叉反应的抗体来实现。或者，在一些实施方案中，选择与某些希望的分子交叉反应的抗体或抗体片段。
许多免疫测定模式可以用于选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定被常规用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(对于能够用于测定特异性的免疫反应性的免疫测定版式和条件的描述，可参见例如Harlow&Lane,UsingAntibodies,A Laboratory Manual(1998))。典型地，特异性或选择性结合反应将产生比背景信号高至少两倍的信号，并且更典型地比背景高至少10-100倍。
如本文所用的术语“亲和力”指单一抗原位点上抗体与抗原的相互作用强度。在每一个抗原位点内，抗体“臂”的可变区在多个位点上通过弱的非共价力与抗原相互作用；相互作用越强，亲和力越强。
术语“分离的抗体”指基本没有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。然而，特异性结合一个抗原的分离的抗体可能与其他抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用到典型氨基酸聚合物以及非典型氨基酸聚合物。除非另有指出，特定的多肽序列也隐含包括其修饰变体。
如本文所用的术语“免疫缀合物”或“抗体-药物-缀合物”涉及抗原结合部分例如抗体或其抗原结合片段与式(I)化合物的连接(linkage)。该连接可以通过共价键，或非共价相互作用，并且可以包括螯合作用。可以使用多种本领域所知的连接体(linker)以形成免疫缀合物。
如本文所用的术语“细胞毒性肽”、“细胞毒素”或“细胞毒性剂”指对细胞的生长和增殖有害并且可减少、抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的任何物质。
如本文所用的术语“抗癌剂”指可以用于治疗细胞增殖性病症，如癌症的任何物质，包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂、放疗和放射治疗剂、靶向抗癌剂和免疫治疗剂。
本文所用的术语“药物部分”或“有效载荷”指缀合或能够缀合抗体或抗原结合片段以形成免疫缀合物的化学部分，并且可以包括用于连接抗体或抗原结合片段的任何部分。例如，“药物部分”或“有效载荷”包括但不限于本文描述的化合物。本发明的免疫缀合物包含一个或多个本文所述的化合物作为有效载荷，但也可以包含一个或多个其它有效载荷。其它有效载荷包括，例如，药物部分或有效载荷可以是抗癌剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或麻醉剂。在某些实施方案中，药物部分选自Eg5抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀(auristatin)、多拉司他汀、美登素类化合物、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂和DHFR抑制剂。合适的实例包括刺孢霉素，如γ-刺孢霉素；和美登素类化合物，如DM1、DM3和DM4。用于将这些中的每一个连接到与本发明的抗体和方法相容的连接体上的方法为本领域所知。参见例如Singh等,(2009)Therapeutic Antibodies:Methods and Protocols,第525卷,445-457。
“肿瘤”涉及赘生细胞生长和增殖，不管是恶性的还是良性的，以及所有前癌和癌细胞和组织。
术语“抗肿瘤活性”意指肿瘤细胞增殖速度、存活力或转移活性的降低。显示抗肿瘤活性的可能方式是显示在治疗过程中发生的异常细胞的生长速度或肿瘤大小稳定性的降低或减少。可以使用公认的体外或体内肿瘤模型，包括但不限于异种移植物模型、同种异体移植物模型、MMTV模型和本领域已知的其他已知模型评估该活性以研究抗肿瘤活性。
术语“恶性肿瘤”指非良性肿瘤或癌症。如本文所用，术语“癌症”包括以失调的或不受控的细胞生长为特征的恶性肿瘤。示例性癌症包括：癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。
术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，其细胞还没有迁移到个体身体的除了原发肿瘤位点之外的位点的那些肿瘤)和继发性恶性肿瘤(例如，起源于转移的那些肿瘤，所述转移是肿瘤细胞迁移到不同于原发肿瘤位点的第二位点上)。
如本文所用，术语“可药用的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等及其组合，其为本领域技术人员所知(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版.MackPrinting Company,1990,第1289-1329页)。除了与活性成分不相容的情况之外，考虑任一常规载体在治疗或药物组合物中的应用。
术语本发明化合物的“治疗有效量”指将引起个体的生物或医学应答，例如酶或蛋白质活性的降低或抑制，或改善症状、缓解状况、减缓或延迟疾病进程、或预防疾病等的本发明化合物的量。在一个非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”指当向个体施用时，有效地至少部分缓解、抑制、预防和/或改善状况或病症或疾病的本发明化合物的量。
如本文所用，术语“个体”是指动物。典型地，动物是哺乳动物。个体也指例如灵长类动物(例如人，男性或女性)、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施方案中，个体是灵长类动物。在一些具体实施方案中，个体是人。
如本文所用，术语“抑制”是指给定状况、症状或病症或疾病的减轻或抑制，或生物活性或过程的基线活性的显著降低。
如本文所用，术语任何疾病或病症的“治疗”在一个实施方案中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或降低疾病的发生或其至少一种临床症状)。在另一实施方案中，“治疗”指缓解或改善至少一个物理参数，包括患者可能不能辨别的那些。在又一实施方案中，“治疗”指从身体上(例如稳定可辨别的症状)、生理上(例如稳定身体参数)或通过两者调节疾病或病症。在又一实施方案中，“治疗”指预防或延迟疾病或病症的进展。
如本文所用，如果个体将在生物学上、医学上或生活质量上从该治疗中受益，那么该个体是“需要”治疗的。
如本文所用，将理解术语“一个”、“一种”、“该”和本发明上下文中(尤其是在权利要求上下文中)使用的类似术语涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明确地相互矛盾。
在某些实施方案中，根据例如1、2、3、4、5、6、7或8或12或16的“药物-抗体”比例描述修饰的本发明的免疫缀合物；该比例对应于式(II)和式(III)中的“y”。当对于具体缀合物分子该比例具有整数值时，应当理解，由于免疫缀合物的样品中的一些不均匀度，典型地，使用平均值描述含有许多分子的样品。免疫缀合物的样品的平均负载在本文称为“药物与抗体比例”或DAR。在一些实施方案中，DAR是约1至约16，并且典型地是约1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，至少50％重量的样品是具有平均DAR加或减2的化合物，并且优选至少50％的样品是具有平均DAR加或减1.5的产品。优选的实施方案包括其中DAR是约2至约8例如约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8的免疫缀合物。在这些实施方案中，“约q”的DAR意指DAR的测量值在q的±20％内或优选在q的±10％内。
如本文所用，术语“光学异构体”或“立体异构体”指对于本发明的给定化合物可能存在的多种立体异构构型中的任何一种，并包括几何异构体。应理解，取代基可以连接在碳原子的手性中心。术语“手性”指这样的分子，其对于其镜像配偶体具有非可重叠性的性质，而术语“非手性”指这样的分子，其对于其镜像配偶体是可重叠的。因而，本发明包括化合物的对映异构体、非对映异构体或外消旋物。“对映异构体”是彼此为非重叠的镜像的一对立体异构体。一对对映异构体的1：1混合物是“外消旋”混合物。适当时，该术语用于指定外消旋混合物。“非对映异构体”是这样的立体异构体，其具有至少两个不对称原子，但其彼此不是镜像。根据Cahn-lngold-Prelog R-S系统指定绝对立体化学。当化合物是纯的对映异构体时，可以通过R或S指定每个手性碳上的立体化学。其绝对构型未知的拆分的化合物可以根据它们在钠D线的波长上旋转平面偏振光的方向(右旋或左旋)被指定为(+)或(-)。本文所述的某些化合物含有一个或多个不对称中心或轴并因此产生对映异构体、非对映异构体，和在绝对立体化学方面可被定义为(R)-或(S)-的其他立体异构形式。
根据起始材料和方法的选择，化合物可以以可能的异构体之一或其混合物的形式存在，例如作为纯的旋光异构体，或作为异构体混合物，如外消旋物和非对映异构体混合物，这取决于不对称碳原子的数量。本发明旨在包括所有此类可能的异构体，包括外消旋混合物、非对映异构体混合物和光学上纯的形式，除非另外说明，例如指明具体异构体时。可以使用手性合成子或手性试剂制备旋光活性的(R)-和(S)-异构体，或可以使用常规技术进行拆分。如果化合物含有双键，那么取代基可以是E或Z构型。如果化合物含有二取代的环烷基，那么所述环烷基取代基可以具有顺式或反式构型。也旨在包括所有的互变异构形式。
如本文所用，术语“盐”指本发明化合物的酸加成盐或碱加成盐。“盐”特别包括“可药用盐”。术语“可药用盐”指这样的盐，其保留本发明化合物的生物有效性和性质并且其通常不是生物学上的或其他方面不希望的。在许多情况下，本发明的化合物由于存在氨基和/或羧基或与其类似的基团能够形成酸盐和/或碱盐。
可以利用无机酸和有机酸形成可药用的酸加成盐，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴化物、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/氢氯化物、氯茶碱盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘化物/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
可以由其衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。
可以由其衍生盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、羟乙酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可以利用无机碱和有机碱形成可药用的碱加成盐。
可以由其衍生盐的无机碱包括例如铵盐和来自周期表第I列至第XII列的金属。在某些实施方案中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别合适的盐包括铵、钾、钠、钙和镁盐。
可以由其衍生盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺，包括天然存在的取代的胺、环胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星(benzathine)、胆碱盐(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨基丁三醇。
可以通过常规的化学方法，从碱部分或酸部分合成本发明的可药用盐。一般地，可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学量的适当碱(如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应，或通过使这些化合物的游离碱形式与化学量的适当酸反应来制备此类盐。此类反应通常在水或有机溶剂，或两者的混合物中进行。一般地，当可应用时，使用非水介质，像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是合乎需要的。例如可以在“Remington'sPharmaceutical Sciences”,第20版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,(1985)；和Stahl和Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,andUse”(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)中发现另外的合适盐的列表。
本文给出的任何式也旨在代表化合物的未标记形式以及同位素标记形式。同位素标记的化合物具有本文给出的式描述的结构，除了一个或多个原子被具有所选原子量或质量数的原子替换。可以掺入到本发明化合物中的同位素的实例分别包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，如2H、3H、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl、125I。本发明包括多种同位素标记的如本文定义的化合物，例如放射性同位素如3H和14C存在的那些化合物，或非放射性同位素如2H和13C存在的那些化合物。此类同位素标记的化合物可用于代谢研究(利用14C)、反应动力学研究(利用例如2H或3H)、检测或成像技术，如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，包括药物或底物组织分布测定，或患者的放射性治疗中。具体而言，18F或标记的化合物对于PET或SPECT研究是特别合乎需要的。一般可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例和制备中描述的那些类似的方法，使用适当同位素标记的试剂代替先前使用的非标记试剂来制备式(I)的同位素标记的化合物。
此外，利用较重同位素，特别是氘(即，2H或D)的取代可以提供由于更高代谢稳定性的某些治疗优势，例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求或治疗指数的改善。可以通过同位素富集因子定义该较重同位素，尤其是氘的浓度。如本文所用的术语“同位素富集因子”表示同位素丰度与指定同位素的天然丰度之间的比例。如果本发明的化合物中的取代基被指示为氘，那么该化合物对每一个指定的氘原子，具有至少3500(在每个指定的氘原子上52.5％氘掺入)、至少4000(60％氘掺入)、至少4500(67.5％氘掺入)、至少5000(75％氘掺入)、至少5500(82.5％氘掺入)、至少6000(90％氘掺入)、至少6333.3(95％氘掺入)、至少6466.7(97％氘掺入)、至少6600(99％氘掺入)或至少6633.3(99.5％氘掺入)的同位素富集因子。
根据本发明的可药用的溶剂合物包括其中结晶溶剂可能被同位素取代的(例如D2O、d6-丙酮、d6-DMSO)的那些以及具有非富集溶剂的溶剂合物。
含有能够充当氢键的供体和/或受体的基团的本发明化合物即式(I)化合物可能能够与适当的共晶形成剂形成共晶。这些共晶可以通过已知的共晶形成方法由式(I)化合物制备。此类方法包括研磨、加热、共升华、共熔或在结晶条件下使式(I)化合物与共晶形成剂在溶液中接触，并分离由此形成的共晶。适当的共晶形成剂包括WO 2004/078163中描述的那些。因此，本发明还提供包含式(I)化合物的共晶。
本发明化合物的任何不对称原子(例如碳等)能够以外消旋物或对映异构体富集形式例如(R)-、(S)-或(R,S)-构型存在。在某些实施方案中，各不对称原子具有(R)-或(S)-构型的至少50％对映异构体过量、至少60％对映异构体过量、至少70％对映异构体过量、至少80％对映异构体过量、至少90％对映异构体过量、至少95％对映异构体过量或至少99％对映异构体过量；即对于光学活性化合物，通常优选使用一种对映异构体，而基本排除另一对映异构体。如果可能的话，在具有不饱和双键的原子处的取代基可以以顺-(Z)-或反-(E)-形式存在。
因此，如本文所用，本发明的化合物能够为可能的异构体、旋转异构体、阻转异构体、互变异构体之一或其混合物形式的，例如基本上纯的几何(顺或反)异构体、非对映异构体、光学异构体(对映异构体)、外消旋物或其混合物。如本文所用，“基本上纯的”或“基本上没有其它异构体”意指产品含有相对于优选异构体的量的少于5％重量、并优选少于2％重量的其它异构体。
可以基于组分的物理化学差异例如通过色谱法和/或分步结晶将任何得到的异构体的混合物分离为纯的或基本上纯的几何或光学异构体、非对映异构体、外消旋物。
任何得到的终产物或中间体的外消旋物可以通过已知方法被拆分为光学异构体，例如通过分离其与光学活性酸或碱获得的非对映异构体盐并释放光学活性酸性或碱性化合物。特别是，碱性部分因此可以用于将本发明的化合物拆分为它们的光学对映异构体，例如通过分步结晶与光学活性酸形成的盐，所述光学活性酸例如是酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二乙酰基酒石酸、二-O,O'-对-甲苯酰酒石酸、扁桃酸、苹果酸或樟脑-10-磺酸。还可通过手性色谱法例如采用手性吸附剂的高压液相色谱(HPLC)拆分外消旋产物。
此外，本发明的化合物包括它们的盐还可以以它们的水合物的形式获得或包含用于它们结晶的其它溶剂。本发明的化合物可固有地或通过设计与可药用的溶剂(包括水)形成溶剂合物；因此，本发明旨在包括溶剂化的和非溶剂化的形式。术语“溶剂合物”是指本发明化合物(包括其可药用盐)与一个或多个溶剂分子的分子复合物。此类溶剂分子是在制药领域中通常使用的那些，已知其对于接受者是无害的，例如水、乙醇等。术语“水合物”是指其中溶剂分子是水的所述复合物。
本发明的式(I)化合物，包括其盐、水合物和溶剂合物，可以固有地或通过设计形成多晶型物。
本文所用的术语“硫醇-马来酰亚胺”是指硫醇与马来酰亚胺反应形成的基团，其具有下面通式
其中Y和Z是通过硫醇-马来酰亚胺连接部分而被连接的基团，并且可以包含连接体构件、抗体或有效载荷。
本文所用的“可裂解的”是指通过共价连接来连接两个部分但在生理相关条件下断裂以分开所述部分间的共价连接的连接体或连接体构件，典型地，可裂解的连接体在细胞内环境比在细胞外时更快速地在体内分开，使优选在靶细胞内发生有效载荷的释放。裂解可以是酶促的或非-酶促的，但是通过在不降解抗体的情况下从抗体释放有效载荷。裂解可能使连接体或连接体构件的一些部分留在有效载荷上，或其可能释放有效载荷，而没有连接体的任何残留部分或构件。
本文所用的“Pcl”是指吡咯啉羧基赖氨酸，例如其中R20是H，当掺入肽中时其具有下式：
其中R20是甲基的相应化合物是吡咯赖氨酸。
本文所用的“非-可裂解的”是指在生理条件下对裂解尤其不敏感的连接体或连接体构件，例如其至少与免疫缀合物的抗体或抗原结合片段部分一样稳定。此类连接体有时称为“稳定的”，意指它们足以抵抗降解以保持有效载荷连接至抗原结合部分Ab，直到Ab本身至少部分降解，即在体内Ab的降解在连接体的裂解之前。具有稳定的或非-可裂解的连接体的ADC的抗体部分的降解可能使连接体的部分或全部和来自抗体的一个或多个氨基酸基团连接至体内递送的有效载荷或药物部分。
如本文所用，术语"C1-C3烷基"、"C2-C3烷基"、"C1-C4烷基"、"C1-C5烷基"、"C1-C6烷基"和"C2-C6烷基"是指分别含有1-3个碳原子、2-3个碳原子、1-4个碳原子、1-5个碳原子、1-6碳原子或2-6个碳原子的完全饱和的支链或直链烃。"C1-C3烷基"基团的非限制实例包括甲基、乙基、正丙基和异丙基。"C2-C3烷基"基团的非限制实例包括乙基、正丙基和异丙基。"C1-C4烷基"基团的非限制实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。"C1-C5烷基"基团的非限制实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和异戊基。"C1-C6烷基"基团的非限制实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和己基。"C2-C6烷基"基团的非限制实例包括乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和己基。
如本文所用，术语“亚烷基”是指具有1-10个碳原子和两个与其它特征连接的开放价键的二价烷基基团。除非另外提供，亚烷基是指具有1-10个碳原子、1-6个碳原子或1-4个碳原子的基团。亚烷基的代表性实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚异丙基、亚正丁基、亚仲丁基、亚异丁基、亚叔丁基、亚正戊基、亚异戊基、亚新戊基、亚正己基、3-甲基亚己基、2,2-二甲基亚戊基、2,3-二甲基亚戊基、亚正庚基、亚正辛基、亚正壬基、亚正癸基等。
如本文所用，术语"C1-C3烷氧基"、"C2-C3烷氧基"、"C1-C4烷氧基"、"C1-C5烷氧基"、"C1-C6烷氧基"和"C2-C6烷氧基"分别是指基团-O-C1-C3烷基、-O-C2-C3烷基、-O-C1-C4烷基、-O-C1-C5烷基、-O-C1-C6烷基和–O-C2-C6烷基，其中所述基团"C1-C3烷基"、"C2-C3烷基"、"C1-C4烷基"、"C1-C5烷基"、"C1-C6烷基"和"C2-C6烷基”如本文所定义。"C1-C3烷氧基"基团的非限制实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基和异丙氧基。"C2-C3烷氧基"基团的非限制实例包括乙氧基、正丙氧基和异丙氧基。"C1-C4烷氧基"基团的非限制实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。"C1-C5烷氧基"基团的非限制实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊基氧基和异戊基氧基。"C1-C6烷氧基"基团的非限制实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊基氧基、异戊基氧基和己基氧基。"C2-C6烷氧基"基团的非限制实例包括乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊基氧基、异戊基氧基和己基氧基。
如本文所用，术语“卤素”(或卤代)是指氟、溴、氯或碘，特别是氟或氯。卤素取代的基团和部分例如被卤素取代的烷基(卤代烷基)可以是单、多或全卤化的。
如本文所用，术语“杂原子”是指氮(N)、氧(O)或硫(S)原子，特别是氮或氧，除非另外提供。
本文所用的术语“4-8元杂环烷基”是指饱和的4-8元单环烃环结构，其中该烃环结构的1-2个环碳被1-2个NR基团替换，其中R是氢、键、本文定义的R5基团或本文定义的R7基团。如本文所用，4-8元杂环烷基基团的非限制实例包括氮杂环丁烷基、氮杂环丁烷-1-基、氮杂环丁烷-2-基、氮杂环丁烷-3-基、吡咯烷基、吡咯烷-1-基、吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、吡咯烷-4-基、吡咯烷-5-基、哌啶基、哌啶-1-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、哌啶-5-基、哌啶-6-基、哌嗪基、哌嗪-1-基、哌嗪-2-基、哌嗪-3-基、哌嗪-4-基、哌嗪-5-基、哌嗪-6-基、氮杂环庚烷基、氮杂环庚烷-1-基、氮杂环庚烷-2-基、氮杂环庚烷-3-基、氮杂环庚烷-4-基、氮杂环庚烷-5-基、氮杂环庚烷-6-基和氮杂环庚烷-7-基。
本文所用的术语“6元杂环烷基”是指饱和的6元单环烃环结构，其中该烃环结构的1-2个环碳被1-2个NR基团替换，其中R是氢、键、本文定义的R5基团或本文定义的R7基团。如本文所用，6元杂环烷基基团的非限制实例包括哌啶基、哌啶-1-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、哌啶-5-基、哌啶-6-基、哌嗪基、哌嗪-1-基、哌嗪-2-基、哌嗪-3-基、哌嗪-4-基、哌嗪-5-基和哌嗪-6-基。
本文所用的术语“4-8元亚杂环烷基”是指源自4-8元杂环烷基基团的二价基团。
本文所用的术语“6元亚杂环烷基”是指源自6元杂环烷基基团的二价基团。
本文所用的术语“杂芳基”是指包含独立地选自氮、氧和硫的1-4个杂原子的5-6元杂芳基单环。如本文所用该杂芳基基团的非限定性实例包括2-或3-呋喃基；1-,2-,4-或5-咪唑基；3-,4-或5-异噻唑基；3-,4-或5-异噁唑基；2-,4-或5-噁唑基；4-或5-1,2,3-噁二唑基；2-或3-吡嗪基；1-,3-,4-,或5-吡唑基；3-,4-,5-或6-哒嗪基；2-,3-或4-吡啶基；2-,4-,5-或6-嘧啶基；1-,2-或3-吡咯基；1-或5-四唑基；2-或5-1,3,4-噻二唑基；2-,4-或5-噻唑基；2-或3-噻吩基；2-,4-或6-1,3,5-三嗪基；1-,3-或5-1,2,4-三唑基；和1-,4-或5-1,2,3-三唑基。本文所用的杂芳基的优选的实施方案是包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基单环。在某些实施方案中，本文所用的杂芳基基团的非限定性实例包括2-或3-吡嗪基；3-,4-,5-或6-哒嗪基；2-,3-或4-吡啶基；和2-,4-,5-或6-嘧啶基。
本文所用的术语“亚杂芳基”是指源自杂芳基基团的二价基团。
本文使用的免疫缀合物命名规则是抗体-化合物编号，其中化合物编号是指用于与特定抗体缀合的式(I)化合物。例如，抗-Her2-LC-S159C-CL-12描述抗体抗-Her2-LC-S159C与化合物CL-12缀合。例如抗-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22描述抗体抗-Her2-HC-ins388用与CoA类似物(CoA-1)偶联的A1肽标记，并随后与化合物CL-22缀合。
连接体
本文提供用作ADC有效载荷的化合物可以连接至连接体L或直接连接至抗原结合部分。用于此类ADC的适当的连接体是本领域众所周知的，并且能够用于本发明的缀合物中。连接体L可以在抗原结合部分的任何适当的可用位置上连接至抗原结合部分：典型地，L连接到可用的氨基氮原子(即伯或仲胺，而不是酰胺)或羟基氧原子或可用的巯基，例如在半胱氨酸上。本文提供了化合物是抗有丝分裂细胞毒性肽，且连接体L与化合物的连接可以在N末端或C末端。用于ADC的各种连接体是已知的(参见例如Lash,Antibody-DrugConjugates:the Next Generation of Moving Parts,Start-Up,Dec.2011,1-6)，并且能够用于本发明的范围内的缀合物中。
式(I)、式(II)和式(III)中的连接体L是包含一个或多个连接体构件L1、L2、L3、L4、L5、L6等的连接部分。在某些实施方案中，连接体构件可以代表将其侧面基团连接在一起的键。在某些实施方案中，L是-*L1L2L3L4L5L6-，其中*表示与本发明的化合物的连接位点。在某些实施方案中，连接体构件可以代表将其侧面基团连接在一起的键。在某些实施方案中，L是-*L1L2L3L4L5-，其中*表示与本发明的化合物的连接位点。在某些实施方案中，连接体构件可以代表将其侧面基团连接在一起的键。在某些实施方案中，L是-*L1L2L3L4-，其中*表示与本发明的化合物的连接位点。在某些实施方案中，连接体构件可以代表将其侧面基团连接在一起的键。在某些实施方案中，L是-*L1L2L3-，其中*表示与本发明的化合物的连接位点。在一优选的实施方案中，L是-*L1L2-，其中*表示与本发明的化合物的连接位点。在某些实施方案中，L是-L1-。一些优选的连接体和连接体构件描述在文中。
式(I)、式(II)和式(III)中的连接体L可以是二价的，意味着其可以用于每一连接体将仅一个有效载荷连接至抗原结合部分；或其可以是三价的，其每一连接体能够将两个有效载荷连接至抗原结合部分；或其可以是多价的。三价、四价和多价连接体可以用于增加抗原结合部分(例如抗体)上的有效载荷(药物)的负载，从而增加药物与抗体比(DAR)，而不需要额外的用于连接多个连接体的抗体上的位点。此类连接体的实例列在BioconjugateChem.,1999Mar-Apr；10(2):279-88；US6638499；Clin Cancer Res October 15,200410；7063；和WO2012/113847A1中。
用于式(I)化合物和式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L可以是可裂解的或非-可裂解的。可裂解的连接体例如含有腙、二硫化物、二肽Val-Cit的那些以及含有葡糖苷酸酶-可裂解的p-氨基苄基氧基羰基部分的那些是众所周知的并且可以使用。参见例如Ducry,等人,Bioconjugate Chem.vol.21,5-13(2010)。对于包含可裂解的连接体的免疫缀合物，连接体在体内是基本稳定的，直到免疫缀合物与细胞结合或进入细胞中，在此时细胞内酶或细胞内化学条件(pH、减少的容量(capacity))裂解连接体以游离该化合物。
或者，非-可裂解的连接体可用于式(I)化合物和式(II)和式(III)的免疫缀合物中。非-可裂解的连接体缺少设计在细胞中降解因此它们的结构能够实质上变化的结构构件。参见例如Ducry,等人,Bioconjugate Chem.,vol.21,5-13(2010)。据信这些免疫缀合物进入靶细胞，并且进行抗体的蛋白水解降解而不是连接体的分解；因此至少连接体的一部分或全部，以及甚至抗体或抗体片段中的一些可以保持与有效载荷连接。
式(I)化合物和式(II)和式(III)的免疫缀合物中的连接体L典型地通常包含两个或更多个连接体构件，可以对其进行选择以方便缀合物的组装，或可以对它们选择以影响缀合物的性质。用于形成连接体L的适当的连接体构件是本领域已知的，构建连接体L的方法也是本领域已知的。连接体构件可包括通常用于将基团与氨基酸连接的基团、间隔体例如亚烷基基团和环氧乙烷低聚体、氨基酸和至多约4个氨基酸长度的短肽；键；和羰基、氨基甲酸酯、碳酸酯、脲、酯和酰胺连接(linkage)等。连接体构件可包括硫醇-马来酰亚胺基团、硫醚、酰胺和酯；在靶细胞之内、之上或周围条件下容易体内裂解的基团，例如二硫化物、腙、二肽如Val-Cit、取代的苄基氧基羰基基团等；在相对于抗原结合部分的适当位置定向有效载荷的间隔体，例如苯基、杂芳基、环烷基或杂环基环和亚烷基链；和/或提高药代动力学性质的基团例如被一个或多个极性基团(羧基、磺酸盐、羟基、胺、氨基酸、糖)取代的亚烷基和含有一个或多个代替亚甲基基团的–NH-或–O-的亚烷基链，例如乙二醇醚(-CH2CH2O-)p，其中p是1-10，其可以提高溶解度或降低分子间聚集，例如。
此外，连接体构件可以包含通过两个反应基团间的反应容易形成的化学部分。此类化学部分的非限制实例列在表1中。
表1
其中：表1中的R32是H、C1-4烷基、苯基、嘧啶或吡啶；表1中的R35是H、C1-6烷基、苯基或被1-3个–OH基团取代的C1-4烷基；表1中的各R36独立地选自H、C1-6烷基、氟、被–C(＝O)OH取代的苄基氧基、被–C(＝O)OH取代的苄基、被–C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被–C(＝O)OH取代的C1-4烷基；表1中的R37独立地选自H、苯基和吡啶。
在一些实施方案中，式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L的连接体构件是反应性官能团与通常用于缀合的氨基酸侧链之一(例如半胱氨酸的硫醇、赖氨酸的游离–NH2、或改造至抗体中的Pcl或Pyl基团)反应形成的基团。参见例如Ou,等人,PNAS 108(26),10437-42(2011)。通过与抗原结合部分的半胱氨酸残基反应形成的连接体构件包括但不限于 通过与抗原结合部分的赖氨酸残基的–NH2反应形成的连接体构件，其中各p是1-10，且各R独立地是H或C1-4烷基(优选甲基)，包括但不限于 通过与Pcl或Pyl基团反应形成的连接体构件包括但不限于其中R20是H或Me，且R30是H、Me或苯基，对于连接，其中显示的酰基基团连接至改造的抗体中Pcl或Pyl的赖氨酸部分。
在一些实施方案中，式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L的连接体构件是其通过和含有羟胺的式(I)化合物反应形成。在某些实施方案中，式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L的连接体构件是其是在与包含羟胺的式(I)化合物的反应后形成。
在一些实施方案中，式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L的连接体构件包括例如亚烷基基团-(CH2)n-(其中n典型地是1-10或1-6)、乙二醇单元(-CH2CH2O-)n(其中n是1-20，典型地是1-10或1-6)、-O-、-S-、羰基(-C(＝O)-)、酰胺–C(＝O)-NH-或–NH-C(＝O)-、酯–C(＝O)-O-或–O-C(＝O)-、具有两个可用的连接点的环系统例如选自以下的二价环：苯基(包括1,2-1,3-和1,4-二-取代的苯基)、C5-6杂芳基、C3-8环烷基包括1,1-二取代的环丙基、环丁基、环戊基或环己基和1,4-二取代的环己基和C4-8杂环基环和下面描述的具体实例；氨基酸–NH-CHR*-C＝O-或–C(＝O)-CHR*-NH-或具有式[N]–CHR*-C(＝O)-的衍生自连接至相邻结构的N(例如马来酰亚胺氮)的氨基酸的基团，其中R*是已知氨基酸(经常是典型氨基酸之一，例如trp、ala、asp、lys、gly等，但也包括例如正缬氨酸、正亮氨酸、高丝氨酸、高半胱氨酸、苯基甘氨酸、瓜氨酸和其它通常提到的α-氨基酸)的侧链、已知氨基酸的多肽(例如二肽、三肽、四肽等)、硫醇-马来酰亚胺连接部分(来自–SH与马来酰亚胺的加成)、-S-CR2-和其它硫醚例如-S-CR2-C(＝O)-或-C(＝O)-CR2-S-其中R在各次出现时独立地是H或C1-4烷基、-CH2-C(＝O)-和二硫化物(-S-S-)，以及这些中任何一个与下面描述的其它连接体构件的组合，所述其它连接体构件例如键、非-酶促可裂解的连接体、非-可裂解的连接体、酶促可裂解的连接体、光-稳定的连接体、光-可裂解的连接体或包含自毁(self-immolative)间隔体的连接体。
在某些实施方案中，式(I)化合物以及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L是-*L1L2L3L4L5L6-，其中*表示与本发明的化合物的连接位点。在某些实施方案中，式(I)化合物以及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L是-＊L1L2L3L4L5-，其中＊表示与本发明的化合物的连接位点。在某些实施方案中，式(I)化合物以及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L是-＊L1L2L3L4-，其中＊表示与本发明的化合物的连接位点。在某些实施方案中，式(I)化合物以及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L是-＊L1L2L3-，其中＊表示与本发明的化合物的连接位点。在一优选的实施方案中，式(I)化合物以及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L是-＊L1L2-，其中＊表示与本发明的化合物的连接位点。在某些实施方案中，式(I)化合物的连接体L是-L1-。
式(I)化合物以及式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体构件L1选自：
-(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mX3-，-X3(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)n-，-((C(R12)2)mOC(＝O)NR12(CH2)mO(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(C(R12)2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mO(CH2)mNR12C(＝O)O((C(R12)2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3-，-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mS(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mNR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3-，-X3(CH2)m-，-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-，-NR12(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)m-，-(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(C(R12)2)m-，-(CH2CH2O)n-，-(OCH2CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-，-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-，-X1C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)X1-，-C(＝O)CHRaaNR12-，-NR12CHRaaC(＝O)-，-C(＝O)NR12-，-C(＝O)O-，-S-，-SCH2(C＝O)NR12-，-NR12C(＝O)CH2S-，-S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2-，-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，-NR12C(＝S)-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-and-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-，NHS(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-NHS(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)-，-S(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)-，-(CH2)mNHC(＝O)-，-NHS(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)m-，-(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)m-，且L1选自下表2中所示的基团：
表2
且其中：
X1是自消化间隔物，选自
X2是二肽，选自
X3是且
X4是
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
式(I)化合物和式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体构件L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键和L1。
细胞毒性肽
本发明化合物是抗有丝分裂细胞毒性肽，且此类化合物或其立体异构体，和互变异构体、水合物及其药学可接受的盐是具有式(I)结构的化合物。
其中：
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、–N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)2、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20、–NHR8、-NHLR11、-NHR21、–N＝CR5R10、–N＝R22、–N＝CR5R23或-NHC(＝O)R23；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是-(CH2)mN(R12)2、-(CH2)mN(R12)C(＝O)OR12或未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、-OH、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2、-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6和-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)2；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(＝O)2LR11、-NHLR11、-NHS(O)2(CH2)mNH2、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-LR11、-NHS(O)2R18、-NHS(＝O)2LR11、
R10是LR11或
R11是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR17、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R13、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是–S(CH2)nCHR14NHC(＝O)R12或
R14是R12或–C(＝O)OR12；
R15是四唑基、-CN、-C(＝O)OR12、 -LR11或–X4LR11；
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR11取代；
R17是2-吡啶基或4-吡啶基；
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R21是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基；
R22是C-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R23是N-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
X3是
X4是
L各自是独立地选自以下的连接体：-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-,-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
本发明的一方面是具有式(I)结构的化合物或其立体异构体，及其药学可接受的盐。
其中：
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、–N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)2、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20、–NHR8、-NHLR11、-NHR21、–N＝CR5R10、–N＝R22、–N＝CR5R23或-NHC(＝O)R23；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是-(CH2)mN(R12)2、-(CH2)mN(R12)C(＝O)OR12或未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、-OH、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2、-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6和-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)2；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(O)2(CH2)mNH2、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-LR11、-NHS(O)2R18、-NHS(＝O)2LR11、
R10是LR11或
R11是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR17、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R13、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是–S(CH2)nCHR14NHC(＝O)R12或
R14是R12或–C(＝O)OR12；
R15是四唑基、-CN、-C(＝O)OR12、 -LR11或–X4LR11；
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR11取代；
R17是2-吡啶基或4-吡啶基；
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R21是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基；
R22是C-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R23是N-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
X3是
X4是
L各自是独立地选自以下的连接体：-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
合成方法
用于合成本发明化合物的所有原料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂是商业可获得的或可以通过本领域技术人员已知的有机合成方法(例如Houben-Weyl第四版1952,Methods of Organic Synthesis,Thieme,第21卷)生产。此外，本发明的化合物可以借鉴下面的实施例通过本领域技术人员已知的有机合成方法生产。
式(I)化合物或其子式的合成方法的说明性示例提供在下面的一般流程1-25中。在下面的流程中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23和L如本文所定义。尽管一般流程显示了用于各种合成步骤的具体试剂，但是应当理解，其它已知的试剂可以用于完成这些合成步骤。
流程1
在流程1中，R3经形成酰胺键与短肽偶联，然后经脱保护步骤，随后经形成亚胺键与RB偶联。
在流程1中，例如，RA可以是叔丁基、芴基或苄基。在流程1中，例如RB可以是-R4、-R20、-NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-NR12(CH2)mN(R12)2、-R10、-R22、-R19或-R23，其各自如本文所定义。
流程2
在流程2中，R3经形成酰胺键与短肽偶联，然后经脱保护步骤，随后经形成亚胺键与RB偶联。
在流程2中，例如，RA可以是叔丁基、芴基或苄基，且RC可以是H或-R6。
流程3
在流程3中，R3经形成酰胺键与短肽偶联，然后经脱保护步骤，随后经形成酰胺键与–N(RD)2偶联。
在流程3中，例如，RA可以是叔丁基、芴基或苄基，且RD可以各自独立地是–R6或-R7。在流程3中，例如，R20可以是其中X是–NC(＝O)OR12、NH、O或S，且p是1或2，R’20可以是未取代的或被独立地选自以下的1-2个取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基。在流程3中，例如，R’23可以是其中X是–NC(＝O)OR12、NH、O或S，且p是1或2，R’23可以是未取代的或被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基。
流程4
在流程4中，R3经形成酰胺键与短肽偶联，然后经脱保护步骤，随后经形成胺键与RE偶联。
在流程1中，例如，RA可以是叔丁基、芴基或苄基，且RE可以是–R8、LR11或–R21。
流程5
流程5图示了某些式(I)化合物的N-末端的进一步修饰。
流程6
流程6图示了某些式(I)化合物的N-末端的进一步修饰，其中RG1和RG2是反应基团，且CM是获自RG1和RG2之间反应的化学部分，例如表1中给出的那些，且L'是一个或多个连接体构件。其它说明性实例如流程7中所示。
流程7
流程8
流程8图示了某些式(I)化合物的N-末端的进一步修饰，其中RG1和RG2是反应基团，且CM是获自RG1和RG2之间反应的化学部分，例如表1中给出的那些，且L'是一个或多个连接体构件。其它说明性实例如流程9中所示。
流程9
流程10
流程10图示了某些式(I)化合物的N-末端的进一步修饰，其中RG1和RG2是反应基团，且CM是获自RG1和RG2之间反应的化学部分，例如表1中给出的那些，且L'是一个或多个连接体构件。其它说明性实例如流程11中所示。
流程11
流程12
流程12图示了某些式(I)化合物的N-末端的进一步修饰，其中RG1和RG2是反应基团，且CM是获自RG1和RG2之间反应的化学部分，例如表1中给出的那些，且L'是一个或多个连接体构件。其它说明性实例如流程13中所示。
流程13
在流程13中，Y1、Y2和Y3各自独立地是C*、N或CRF，其中*是指与–L’NH2基团的连接点，且RF是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2或C1-C6烷氧基。Y1、Y2和Y3中仅有一个可以是N，且Y1、Y2和Y3中仅有一个可以是C*。
式(I)化合物及其子式的另一种合成方法如以下流程14所示。
流程14
式(I)化合物及其子式的另一种合成方法如以下流程15所示。
流程15
在流程15中，例如，RB可以是-R4、-R20、-NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-NR12(CH2)mN(R12)2、-R22或-R19，其各自如本文所定义。
式(I)化合物及其子式的另一种合成方法如以下流程16所示。
流程16
式(I)化合物及其子式的另一种合成方法如以下流程17所示。
流程17
在流程17中，例如，RB可以是-R4、-R20、-NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-NR12(CH2)mN(R12)2、-R22或-R19，其各自如本文所定义。在流程17中，例如，RC可以是H或-R6，且RE可以是–R8。
式(I)化合物及其子式的另一种合成方法如以下流程18所示。
流程18
在流程18中，RA可以是叔丁基、芴基或苄基，且RD可以各自独立地是–R6或-R7。在流程21中，例如，X是–NC(＝O)OR12、NH、O或S，且p是1或2，且可以是未取代的或被独立地选自以下的1-2个取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基。
式(I)化合物及其子式的另一种合成方法如以下流程19所示。
流程19
在流程19中，例如，RB可以是-R4、-R20、-NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-NR12(CH2)mN(R12)2、-R22或-R19，其各自如本文所定义。在流程19中，例如，RC可以是H或-R6，且RE可以是–R8。
式(I)化合物及其子式的另一种合成方法如以下流程20所示。
流程20
在流程20中，例如，X是–NC(＝O)OR12、NH、O或S，且p是1或2，且可以是未取代的或被独立地选自以下的1-2个取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基。
式(I)化合物及其子式的另一种合成方法如以下流程21所示。
流程21
在流程21中，例如，RB可以是-R4、-R20、-NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-NR12(CH2)mN(R12)2、-R22或-R19，其各自如本文所定义。在流程21中，例如，RC可以是H或-R6，且RE可以是–R8。
式(I)化合物及其子式的另一种合成方法如以下流程22所示。
流程22
在流程22中，例如，RB可以是-R4、-R20、-NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-NR12(CH2)mN(R12)2、-R22或-R19，其各自如本文所定义。在流程22中，例如，RC可以是H或-R6，且RE可以是–R8。
式(I)化合物及其子式的另一种合成方法如以下流程23所示。
流程23
在流程23中，例如，X是–NC(＝O)OR12、NH、O或S，且p是1或2，且可以是未取代的或被独立地选自以下的1-2个取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基。
式(I)化合物及其子式的另一种合成方法如以下流程24所示。
流程24
流程24，例如，X是–NC(＝O)OR12、NH、O或S，且p是1或2，且可以是未取代的或被独立地选自以下的1-2个取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基。
本发明还包括本发明方法的任何变体，其中在其任何阶段可获得的中间体产物被用作原料并进行其余步骤，或者其中在反应条件下在原位形成原料，或者其中以它们的盐或光学纯物质的形式使用反应组分。
下面的实施例意欲举例说明本发明，而不应解释为对其进行限制。温度以摄氏度给出。室温(rt)是20-21℃。如果没有另外提到，所有的蒸发在减压通常约15mm Hg至100mmHg(＝20-133mbar)下进行。所用的缩写是本领域常规的那些。所有反应采用商业级无水溶剂而没有进一步蒸馏、在氮气气氛下进行。试剂以没有进一步纯化的商业级使用。薄层色谱法采用TLC硅胶板进行。柱色谱法采用ISCO Combiflash Rf系统采用快速级预制柱进行。
制备型HPLC在Waters Autopurification系统中采用下面的条件进行：柱SunfireC18 30x100mm,5μ,梯度洗脱：在水中的CH3CN+0.05％TFA-CH3CN，30ml/min。
将适合纯度的包含所需产物的流份色谱纯化后合并并浓缩，得到所需产物。
分析方法
除非另外指出，下面的HPLC和HPLC/MS方法用于制备中间体和实施例。
LC/MS分析在Agilent 1200sl/6140系统上进行。
柱:Waters Acquity HSS T3 C18,50x2.0,1.8μm
流动相:A)H2O+0.05％TFA；B:乙腈+0.035％TFA
泵方法:
时间 A％ B％ 流速(mL/min)
0 90 10 0.9
1.35 0 100 0.9
1.36 0 100 0.9
1.95 0 100 0.9
1.96 90 10 0.9
2.0 90 10 0.9
检测器:UV二极管阵列，在190nm–400nm
MS扫描:200–1350amu
ELSD:60℃
MS参数:
极性 正的
干燥气体 12
喷雾器压力 50
干燥气体温度 350
毛细管电压 3000
中间体的合成方法
合成(E)-6-(((1-乙氧基亚乙基)氨基)氧基)己酸锂(I-1)
在500mL烧瓶中将N-羟基乙酰亚氨酸乙酯(6.18g,59.9mmol)、6-溴己酸乙酯(8.9mL,50mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF,100mL)混合。将NaH(60％在矿物油中,2.20g,55mmol)分几部分在搅拌中在20℃下加入该烧瓶中，并将反应物在20℃搅拌18小时。将反应混合物倒入含有150mL冰的200mL饱和NH4Cl水溶液中，并搅拌直至冰融化。
将该混合物用EtOAc(125mLx3)萃取。将合并的有机层连续每次用100mL的10％柠檬酸水溶液、水、饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到12.6g红色油状物，为粗产物。将该粗的油状物用Büchi玻璃烤箱在低于1毫巴下蒸馏。得到6-(((1-乙氧基亚乙基)氨基)氧基)己酸乙酯，为无色油状物。MS(ESI+)计算值246.2,实测值246.1(M+1)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.121(q,2H,J＝4.7Hz),4.004(q,2H,J＝4.7Hz),3.881(t,2H,J＝4.4Hz),2.303(t,2H,J＝5.0Hz),1.920(s,3H),1.686-1.616(m,4H),1.418-1.366(m,2H),1.266(t,3H,J＝4.8Hz),1.249(t,3H,J＝4.8Hz)。将6-(((1-乙氧基亚乙基)氨基)氧基)己酸乙酯(2.457g,10.0mmol)装入100mL圆底烧瓶，并溶于THF(30mL)中。将LiOH水溶液(1.0M,10.0mL)加入反应物中，并将反应物在20℃搅拌16小时。将另外的2.5mL的1M LiOH水溶液加入反应物中，将反应物在50℃搅拌13小时。LCMS分析指示反应完全。经蒸发除去THF，并将剩余混合物冷冻干燥，得到(E)-6-(((1-乙氧基亚乙基)氨基)氧基)己酸锂(I-1)，为白色固体。MS(ESI+)计算值218.1,实测值218.1(M+1,H型)。1H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ3.980(q,2H,J＝7.2Hz),3.861(t,2H,J＝6.6Hz),2.161(t,2H,J＝7.6Hz),1.883(s,3H),1.665-1.588(m,4H),1.431-1.370(m,2H),1.250(t,3H,J＝7.0Hz)。13C NMR(100MHz,MeOH-d4):δ182.976,163.331,74.495,63.180,39.324,29.972,27.737,27.394,14.779,13.646。
合成1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(I-2)
步骤1:将(2-(2-氨基乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(204mg,1mmol)溶于NaHCO3饱和水溶液(10mL)。将该溶液冷却至0℃。然后加入2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯(155mg,1.0mmol)。将反应物在0℃搅拌1.5小时。用2M HCl将pH调至1-2，并将该混合物用EtOAc萃取(3X 20mL)。将合并的有机相用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并浓缩。将残余物经ISCO用0-4％MeOH在DCM中的溶液梯度洗脱纯化，得到(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ6.82(s,2H),3.68(t,J＝5.4Hz,2H),3.59(t,J＝5.4Hz,2H),3.46(t,J＝5.6Hz,2H),3.18-3.14(m,2H),1.43(s,9H)。MSm/z 185.1(M+1-Boc)。保留时间0.918min。
步骤2:将(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(162mg,0.57mmol)溶于甲醇HCl(3M,2mL)。经蒸发缓慢除去溶剂。在高真空下进一步除去剩余溶剂，得到1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(I-2)。MS m/z 185.1(M+1)。保留时间0.307min。
合成Cbz-Val-Dil-OtBu:((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二 甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯)(I-3)
将Cbz-Val-OH(Bachem,3.682g,14.7mmol)和H-Dil-OtBu((3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲基氨基)庚酸叔丁酯)(Small Molecules Inc.,3.006g,9.75mmol)放入200mL烧瓶中，并溶于DMF(60mL)。加入DIEA(8.0mL,46mmol)。20℃下在搅拌中向该烧瓶中历经3分钟逐滴加入1-[二(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU,5.56g,14.6mmol)在DMF(30mL)中的溶液。将反应物在20℃搅拌2天。将反应混合物用EtOAc(200mL)稀释，并分别用100mL 5％柠檬酸水溶液、水和饱和NaCl水溶液连续洗涤。将合并的水相用100mL EtOAC萃取，并于第一次有机相合并。将合并的有机相干燥并浓缩。将残余物经ISCO用220g硅胶柱以10-20％EtOAc在己烷中的溶液梯度洗脱纯化，得到Cbz-Val-Dil-OtBu(I-3)，为粘稠油状物。MS(ESI+)m/z 493.4(M+1)。保留时间1.494min。
合成Val-Dil-OtBu:((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧 基-5-甲基庚酸叔丁酯)(I-4)
将Cbz-Val-Dil-OtBu(I-3)(1.076g,2.16mmol)、Pd在活性炭(5％Pd,98mg)和MeOH(50mL)在装有磁性搅拌棒的200mL烧瓶中混合。将反应气体用H2置换，并将反应物在20℃剧烈搅拌1小时。将反应混合物经硅藻土垫过滤以除去废催化剂。将滤液浓缩，得到H-Val-Dil-OtBu(I-4)，为浅黄色粘稠油状物。MS(ESI+)m/z 359.3(M+1)。保留时间0.979min。
合成(3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨 基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(I-5)
将(3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(360mg,0.994mmol)溶于DMSO(5.0mL)中，并加入HBTU(526mg,1.383mmol)。将反应物在20℃搅拌17小时。将DIEA(0.174mL)加入反应物中，并将反应物在20℃搅拌1小时。将反应混合物经ISCO用50gC18柱以乙腈水溶液梯度洗脱纯化，得到(3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(I-5)，为白色固体。MS(ESI+)计算值457.4,实测值457.4(M+1)。保留时间1.089min。
合成(3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨 基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(I-6)
将(3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯TFA盐(I-5)(292mg,0.511mmol)溶于4M HCl在1,4-二噁烷(10mL)的溶液中，并将所得溶液在室温下放置20小时。将该溶液浓缩。将残余物溶于乙腈和水中，并冻干，得到非常粘稠的黄色油状物。F-NMR提示该物质包含TFA。为除去TFA，将该油状物溶于乙腈(10mL)中，并用6N盐酸(10mL)处理。减压除去溶剂，得到(3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(I-6)。MS m/z计算值401.3,实测值401.3。保留时间0.760min。
合成Cbz-Val-Dil-OH:((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲 基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸)(I-7)
将Cbz-Val-Dil-OtBu(I-3)(0.371g,0.745mmol)溶于乙腈(3.0mL)中，并加入1N盐酸(2.0mL)。将反应物在40℃搅拌1小时，并在室温下搅拌17小时。减压蒸发除去大部分乙腈以除去多余的HCl。形成白色沉淀。将该混合物用15mL乙腈和10mL水稀释。将所得溶液冷冻并冻干，得到Cbz-Val-Dil-OH(I-7)，为白色固体。MS(ESI+)m/z 437.2(M+1)。保留时间1.145min。
合成Boc-Dap-OMe:((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯 烷-1-甲酸叔丁酯)(I-8)
将Boc-Dap-OH(Small Molecules Inc.,3.11g,10.8mmol)、K2CO3(2.99g,21.6mmol)、碘甲烷(2.95g)和丙酮(55mL)混合。将反应物在20℃搅拌2小时。将另外的碘甲烷(2.28g)加入该反应物中，并将该反应物在40℃搅拌3小时。将反应混合物浓缩。将残余物在200mL EtOAc和100mLH2O之间分配。分离有机层，用50mL饱和NaCl水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到Boc-Dap-OMe(I-8)，为黄色油状物。MS(ESI+)m/z计算值324.2,实测值324.2(M+23)。保留时间1.245min。
合成Dap-OMe:((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酸甲酯)(I- 9)
将Boc-Dap-OMe(3.107g,10.3mmol)与HCl在乙醚中的溶液(2M,10mL)混合，并浓缩。重复该操作。在第7次处理后反应完全。得到Dap-OMe(I-9)的HCl盐，浓缩后为白色固体。MS(ESI+)m/z计算值202.1,实测值202.2(M+1)。保留时间0.486min。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.065-4.041(m,1H),3.732(br.s,1H),3.706(s,3H),3.615(s,3H),3.368(br.s,1H),3.314(br.s,1H),2.795(q,1H,J＝6.8Hz),2.085-1.900(m,4H),1.287(d,3H,J＝7.2Hz)。
合成(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二 甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(I- 10)
将Cbz-Val-Dil-OH(I-7)(208mg,0.875mmol)、HATU(281mg,0.739mmol)和DMF(7.5mL)在40mL玻璃瓶中混合。加入DIEA(0.256mL)，并将反应物在21℃振摇50min。将(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酸甲酯(I-9)(208mg,0.875mmol)加入反应物中，然后加入另外的DIEA(0.256mL)。将反应物在21℃振摇3小时。将反应混合物用EtOAc(60mL)稀释，并用5％柠檬酸水溶液、H2O和饱和NaCl水溶液连续洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。残余物经ISCO用150g C18柱以20-80％乙腈的H2O溶液梯度洗脱纯化，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(I-10)，为黄色玻璃状物质。MS(ESI+)m/z计算值620.4,实测值620.5(M+1)。保留时间1.391min。
合成(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨 基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙 酸(i-11)
步骤1:向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(i-10)(200mg,0.32mmol)在MeOH(5ml)的溶液中加入Pd/C(10％湿重,68.7mg)，将该反应混合物在室温下于H2气氛中搅拌2小时，随后过滤并浓缩，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯MS m/z 486.4(M+1)。保留时间0.883min。
步骤2:将DIEA(0.27ml,1.54mmol)和HATU(141mg,0.37mmol)加入(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(150mg,0.31mmol)在DMF(4ml)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2小时，并随后经制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O，含有0.05％TFA)纯化，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯为TFA盐。MS m/z 584.4(M+1)。保留时间1.027min。
步骤3:将(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(133mg,228μmol)在ACN(2.5ml)和水(1.6ml)中的溶液首先用1N NaOH水溶液(0.68ml)在室温下处理2小时，然后在相同温度下用另外的1.02mL的1N NaOH水溶液处理3小时。用1N盐酸将反应物的pH调至5～6，并冻干。将残余物用反相ISCO(20-70％ACN在H2O中的溶液)纯化，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(i-11)。MS m/z 570.4(M+1)。保留时间1.028min。
(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-氧代-3-((2-氧代丙基)氨基)丙基)丁酰胺(i-12)的合成
步骤1:将泛酸(50mg,0.23mmol)溶解在DMF(5mL)中并加入二苯基磷酰基叠氮化物(98μL,0.46mmol)和2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙胺(40mg,0.34mmol)。将反应混合物冷却至0℃并加入三乙胺(79μL,0.57mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌10min，然后在室温下搅拌24h。加入EtOAc(50mL)并用0.1N HCl溶液(20mL)、0.1N NaOH溶液(20mL)、盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4干燥并过滤。将滤液在真空下浓缩并将残留物通过HPLC纯化并冻干，得到(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-(((2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)甲基)氨基)-3-氧代丙基)丁酰胺。MS(m+1)＝319.2,保留时间：0.466min
步骤2:将(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-(((2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)甲基)氨基)-3-氧代丙基)丁酰胺(46mg,0.14mmol)溶解在THF(5mL)和3N HCl溶液(3mL)中并在室温下搅拌4h。冷却至0℃后，将反应混合物用1N NaOH溶液中和并在真空下浓缩一半体积。将反应混合物通过ISCORP-C18纯化并冻干，得到(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-氧代-3-((2-氧代丙基)氨基)丙基)丁酰胺(i-12)。MS(m+1)＝275.2,保留时间：0.337min,1H-NMR(MeOD,400MHz)δ3.99(s,2H),3.84(s,1H),3.42～4.47(m,2H),3.42(d,1H,J＝11.2Hz),3.34(d,1H,J＝11.2Hz),2.45(t,2H,J＝6.8Hz),2.10(s,3H),0.87(s,6H)。
(R)-N-(3-((2-叠氮基乙基)氨基)-3-氧代丙基)-2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酰胺(i-13)的合成
将泛酸(50mg,0.23mmol)溶解在DMF(5mL)中并加入二苯基磷酰基叠氮化物(98μL,0.46mmol)和2-叠氮基乙胺(30mg,0.34mmol)。将反应混合物冷却至0℃并加入三乙胺(79μL,0.57mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌10min，然后在室温下搅拌24h。加入EtOAc(50mL)并用0.1NHCl溶液(20mL)、0.1N NaOH溶液(20mL)、盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空下浓缩并将残留物通过HPLC纯化并冻干得到(R)-N-(3-((2-叠氮基乙基)氨基)-3-氧代丙基)-2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酰胺(i-13)。MS(m+1)＝288.2,保留时间：0.504min,1H-NMR(MeOD,400MHz)δ3.84(s,1H),3.41～4.47(m,3H),3.31～3.35(m,5H),2.40(t,2H,J＝6.8Hz),0.87(s,6H)。
(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-氧代-3-((3-氧代丁基)氨基)丙基)丁酰胺(i-14)的合成
步骤1:将泛酸半钙盐(100mg,0.390mmol)溶解在CH3CN(10mL)中并用硫酸树脂交换成泛酸。将泛酸(10mg,0.046mmol)溶解在DMF(2mL)中，并加入二苯基磷酰基叠氮化物(20μL,0.091mmol)和2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙胺(7mg,0.005mmol)。将反应混合物冷却至0℃并加入三乙胺(16μL,0.114mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌10min，然后在室温下搅拌24h。加入EtOAc(50mL)并用0.1N HCl溶液(20mL)、0.1NNaOH溶液(20mL)、盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空下浓缩并将残留物通过HPLC纯化并冻干，得到(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-((2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)丁酰胺。MS(m+1)＝333.2,保留时间：0.512min
步骤2:将(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-((2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)丁酰胺(6mg,0.02mmol)溶解在THF(2mL)和3N HCl溶液(1mL)中并在室温下搅拌4h。冷却至0℃后，将反应混合物用1N NaOH溶液中和并在真空下浓缩一半体积。将反应混合物通过ISCO RP-C18纯化并冻干，得到(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-氧代-3-((3-氧代丁基)氨基)丙基)丁酰胺(i-14)。MS(m+1)＝289.2,保留时间：0.362min,1H-NMR(MeOD,400MHz)δ3.83(s,1H),3.37～4.45(m,3H),3.34(d,2H,J＝7.2Hz),3.32(d,1H,J＝3.2Hz),2.65(t,2H,J＝6.4Hz),2.34(t,2H,J＝6.8Hz),2.10(s,3H),0.87(s,6H).
2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-氧代丁基)丁酰胺(i-15)的合成
步骤1:将氢化铝锂(583mg,15mmol)溶解在THF(100mL)中并冷却至0℃。在0℃下，加入(±)-泛内酯(1g,8mmol)的THF(50mL)溶液并在室温下搅拌4h。向反应混合物中缓慢地加入无水硫酸钠，然后加入EtOAc(50mL)。将反应混合物通过短硅藻土垫过滤并将滤液浓缩。将残留物通过ISCO(5％至20％的MeOH的CH2Cl2溶液)纯化，得到3,3-二甲基丁烷-1,2,4-三醇。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ3.71～3.74(m,1H),3.65(dd,1H,J＝4.8和7.6Hz),3.57(dd,1H,J＝2.4和4.8Hz),3.54(d,1H,J＝7.2Hz),3.48(d,1H,J＝7.2Hz),0.95(s,3H),0.93(s,3H).
步骤2:将3,3-二甲基丁烷-1,2,4-三醇(570mg,4mmol)和1-(二甲氧基甲基)-4-甲氧基苯(1.16g,6mmol)溶解在CH2Cl2(50mL)中，并加入(7,7-二甲基-2-氧代二环[2.2.1]庚烷-1-基)甲磺酸(99mg,0.4mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h并加入三乙胺(0.29mL,2mmol)。浓缩后，将残留物通过ISCO(0％至30％EtOAc的正己烷溶液)纯化，得到2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-1,3-二烷-4-基)甲醇。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ7.44(d,2H,J＝6.0Hz),6.91(d,2H,J＝6.0Hz),5.47(s,1H),3.90(s,1H),3.81(s,3H),3.59～3.70(m,5H),1.14(s,3H),0.84(s,3H).
步骤3:将DMSO(0.27mL,4mmol)溶解在无水CH2Cl2(20mL)中并在-78℃下加入草酰氯(0.25mL,3mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌15min并缓慢地加入2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-1,3-二烷-4-基)甲醇(485mg,2mmol)的无水CH2Cl2(1mL)溶液。将反应混合物在-78℃下搅拌30min并加入三乙胺(1.34mL,10mmol)。将反应混合物升温至室温并搅拌1h。将反应混合物在水(50mL)和CH2Cl2(100mL)之间分配，并将有机层用饱和NaHCO3(50mL)和盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残留物通过ISCO(20％至50％的EtOAc的正己烷溶液)纯化，得到2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-1,3-二烷-4-甲醛.MS(m+1)＝251.2,保留时间：1.105min.
步骤4:将2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-1,3-二烷-4-甲醛(289mg,1mmol)溶解在丙酮/CH2Cl2(3:1,20mL)中，并在室温下加入新鲜制备的NaH2PO4.H2O(1593mg,12mmol)和NaCl2O(528mg,6mmol)的水(5mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌30min并浓缩。将残留物通过ISCO(C18)纯化，得到2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-1,3-二烷-4-甲酸MS(m+1)＝267.2,保留时间：0.957min.
步骤5:将2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-1,3-二烷-4-甲酸(40mg,0.2mmol)溶解在DMF(3mL)中，并加入HATU(39mg,0.2mmol)和DIEA(0.05mL,0.3mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10min并加入2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙胺(40mg,0.3mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h并通过制备HPLC纯化，得到2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-N-(2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-1,3-二烷-4-甲酰胺.MS(m+1)＝380.2,保留时间：1.102min,1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ7.44(d,2H,J＝5.6Hz),7.33(bs,1H),6.90(d,2H,J＝5.2Hz),5.46(s,1H),4.08(s,1H),3.82～3.88(m,2H),3.81(s,3H),3.75(m,1H),3.68(dd,2H,J＝7.6and 16.0Hz),3.38(m,2H),1.86(m,4H),1.31(s,3H),1.11(s,3H),1.09(s,3H)。
步骤5:将2-(4-甲氧基苯基)-5,5-二甲基-N-(2-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-1,3-二烷-4-甲酰胺(10mg,0.03mmol)溶解在3M HCl的MeOH溶液(1mL)中并加入水(0.1mL)。将反应混合物在真空下浓缩并通过ISCO(C18)纯化，得到2,4-二羟基-3,3-二甲基-N-(3-氧代丁基)丁酰胺(i-15)。MS(m+1)＝218.2,保留时间：0.400min,1H-NMR(MeOD-d4,400MHz)δ3.84(s,1H),3.31～3.44(m,4H),2.70(t,2H,J＝4.0Hz),2.12(s,3H),0.88(s,3H)。
非连接肽类的合成程序
实施例1：合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-1)和(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(FP-22)
步骤1:0℃下向Boc-Val-Dil-Dap-OH(1.00g,1.75mmol)在DMF(20.0mL)的溶液中加入DIEA(0.677g,5.25mmol)和HATU(0.731g,1.93mmol)。将所得溶液搅拌5min，并在0℃下加入L-苯基丙氨酸甲酯HCl盐(0.377g,1.75mmol)和DIEA(0.226g,1.75mmol)在DMF(5.0mL)中的溶液。将反应物加温至室温，并再搅拌30分钟，并将反应混合物浓缩。将残余物经ISCO用C18柱以20-90％乙腈在水中的溶液梯度洗脱纯化，得到BocVal-Dil-Dap-PheOMe,MS m/z733.4(M+1)。保留时间1.47min。
步骤2:将HCl(4N在1,4-二噁烷中的溶液,16mL)加入步骤1中得到的BocVal-Dil-Dap-PheOMe(0.683g,0.932mmol)在甲醇(20mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌7小时并浓缩。将残余物溶于二噁烷中，并冻干，得到Val-Dil-Dap-PheOMe盐酸盐,MS m/z633.4(M+1)。保留时间0.96min。
步骤3:向Val-Dil-Dap-PheOMe(4.2mg,0.0067mmol)的溶液中加入DMF(1mL)和DIEA(4.3mg,0.033mmol)，然后加入HATU(2.6mg,0.0067mmol)。将反应物在室温下搅拌1小时。将该粗物质经制备型HPLC以20-50％梯度洗脱，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-1)，为TFA盐。MS m/z 731.4(M+1)。保留时间1.122min。
步骤4:向(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯TFA盐(FP-1)(10.2mg,0.012mmol)在MeOH-H2O(2:1,3mL)的溶液中加入LiOH(20mg,0.84mmol)。将反应物在室温下搅拌18小时，并将粗物质经制备型HPLC以20-45％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(FP-22)。MS m/z 717.5(M+1)。保留时间1.008min。
实施例2：合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3,3-二甲基胍基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-2)
向25ml圆底烧瓶中加入苯并三唑(1.19g,9.99mmol)和6N HCl在2-丙醇(3mL)中的溶液。5min内得到均质的溶液，但随后产生白色固体沉淀。然后经蒸发除去溶剂，得到苯并三唑盐酸盐(1.55g,9.96mmol)。向该苯并三唑盐酸盐中加入N,N-二甲基氰胺(0.84g,12mmol)。将反应物在80℃加热30min。该反应物首先转为澄清，并随后开始形成固体。收集该晶体，得到N,N-二甲基-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-甲酰亚胺酰胺。向(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(Val-Dil-Dap-PheOMe)(5.0mg,0.0067mmol)在乙腈(1mL)的溶液中加入DIEA(0.023mL,0.13mmol)和N,N-二甲基-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-甲酰亚胺酰胺(0.015g,0.067mmol)。将该混合物超声处理30秒，密封并在60℃加热20小时。LCMS显示转化率为约50％。将粗物质经制备型HPLC以20-70％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3,3-二甲基胍基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-2)，为TFA盐。MS m/z 703.4(M+1)。保留时间1.256min。
实施例3：合成(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(FP-3)
步骤1:向搅拌过的叠氮化钠(3.5g,54mmol)在水(25ml)的溶液中加入1,3-丙烷磺内酯(6.1g,50mmol)在丙酮(25ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌24小时，并浓缩。将所得固体悬浮于乙醚(100ml)中，并回流下搅拌1小时。将该混悬液冷却至室温。经过滤收集固体，用丙酮和乙醚洗涤，并真空干燥，得到3-叠氮基-1-丙磺酸。MS m/z 188.1(M+23)。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ3.47(t,J＝6.8Hz,2H),2.87(t,J＝7.6Hz,2H),2.07-2.00(m,2H)。
步骤2:将3-叠氮基-1-丙磺酸(2.07g,13mmol)悬浮于甲苯中。加入PCl5(2.61g,13mmol)。将该混合物回流下加热3小时。将反应物冷却至室温。经过滤除去不溶物，并用DCM洗涤。将合并的滤液浓缩，得到3-叠氮基丙烷-1-磺酰氯，为黄-褐色油状物，其不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤3:将NH4OH(28％,5mL)冷却至0℃。加入3-叠氮基丙烷-1-磺酰氯(1.75g,9.53mmol)。10min后，将反应物加温至室温，然后在室温下搅拌3小时。两相变为均质。将反应混合物用EtOAc萃取三次。将合并的有机相用盐水洗涤，用MgSO4干燥，并在旋转蒸发仪上随后在高真空下浓缩18小时，得到3-叠氮基丙烷-1-磺酰胺。MS m/z 187.1(M+23)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.83(s,2H),3.51(t,J＝6.4Hz,2H),3.23(t,J＝7.6Hz,2H),2.17-2.10(m,2H)。
步骤4:将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-苯基丙酸(100mg,0.38mmol)溶于DMF(4mL)中。加入DIEA(0.395mL,2.26mmol)和HATU(358mg,0.94mmol)。15min后，加入3-叠氮基丙烷-1-磺酰胺(186mg,1.13mmol)。将反应物搅拌2小时。LCMS指示反应完全。将反应混合物经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到(S)-(1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 312.1(M+1-Boc)。保留时间1.15min。将因此得到的产物(72.4mg.0.176mmol)溶于甲醇HCl(3M,5mL)。蒸发除去溶剂。将残余物从乙腈和H2O中冻干，得到(S)-2-氨基-N-((3-叠氮基丙基)磺酰基)-3-苯基丙酰胺，为粉色黄色固体。MSm/z 312.1(M+1)1HNMR(400MHz,CD3OD):δ7.42-7.31(m,5H),4.16-4.13(m,1H),3.51-3.47(m,4H),3.32-3.26(m,1H),3.13-3.08(m,1H),2.00-1.94(m,2H)。
步骤5:向Boc-Val-Dil-Dap-OH(195mg,0.34mmol)在DMF(4mL)的溶液中加入DIEA(132mg,1.02mmol)和HATU(108mg,0.28mmol)。将其在室温下搅拌15min。加入(S)-2-氨基-N-((3-叠氮基丙基)磺酰基)-3-苯基丙酰胺(59.2mg,0.17mmol)。将反应物在室温下搅拌2小时。将该粗物质经制备型HPLC纯化，得到所需产物(95mg,65％产率,MS m/z 865.4(M+1),保留时间1.43分钟)。将产物溶于3M HCl在MeOH(3mL)的溶液中。蒸发除去溶剂。将残余物从乙腈-水中冻干，得到(S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-2-氨基-3-甲基-1-氧代丁烷，为HCl盐。MS m/z 765.4(M+1),保留时间1.04min。
步骤6:向(S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-2-氨基-3-甲基-1-氧代丁烷HCl盐(20mg,0.025mmol)在DMF(2mL)的溶液中加入DIEA(0.024mL,0.14mmol)和HATU(21.6mg,0.057mmol)。将反应物在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC以10-90％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(FP-3)，为TFA盐。MS m/z 863.5(M+1)。保留时间1.169min。
实施例4：合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3,3-二甲基脲基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-4)
将Val-Dil-Dap-PheOMe(4.2mg,0.0067mmol)溶于THF-DMF(1:1,1.6ml)中，并加入4-硝基苯基氯甲酸酯(20mg,0.099mmol)，然后加入DIEA(20mg,0.17mmol)。室温下搅拌1小时后，将反应混合物浓缩，并经ISCO用C18柱以30％-70％乙腈在H2O中的溶液洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(((4-硝基苯氧基)羰基)氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯。MS m/z 798.5(M+1)。保留时间1.481min。将由此获得的硝基苯基氨基甲酸酯溶于THF-DMF(1:1,1.6mL)，并加入二甲基胺HCl盐(0.010mg,0.12mmol)，然后加入DIEA(0.027mL,0.16mmol)。将反应物在室温下搅拌72小时，然后浓缩。将粗物质经制备型HPLC用0-55％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3,3-二甲基脲基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-4)。MS m/z 704.4(M+1)。保留时间1.251min。
实施例5：合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3,3-二异丙基脲基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-5)
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3,3-二异丙基脲基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-5)使用化合物FP-4所述相同的方法合成，除了用二异丙基胺(10mg,0.099mmol)代替二甲基胺。MS m/z 760.5(M+1)。保留时间1.481min。
实施例6:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-乙基-3-异丙基脲基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-6)
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-乙基-3-异丙基脲基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-6)使用化合物FP-4所述相同的方法合成，除了用乙基异丙基胺(10mg,0.099mmol)代替二甲基胺。MS m/z 746.5(M+1)。保留时间1.412min。
实施例7:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-(1-(羟基甲基)环丁基)脲基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-7)
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-(1-(羟基甲基)环丁基)脲基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-7)使用化合物FP-4所述相同的方法合成，除了用(1-氨基环丁基)甲醇(10mg,0.099mmol)代替二甲基胺。MS m/z 760.5(M+1)。保留时间1.224min。
实施例8:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((4-甲基嘧啶-2-基)氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-8)
在4盎司瓶中向Val-Dil-Dap-PheOMe TFA盐(5.0mg,0.0067mmol)在2-丙醇(2ml)的溶液中加入2-氯-4-甲基嘧啶(2.6mg,0.020mmol)和DIEA(4.3mg,0.033mmol)。将该瓶密封，并在100℃加热4天。将粗物质经制备型HPLC用20-50％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((4-甲基嘧啶-2-基)氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-8)，为TFA盐MS m/z 725.4(M+1)。保留时间1.177min。
实施例9:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((4-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-9)
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((4-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-9)使用化合物FP-8所述相同的方法合成，除了用2-氯-4-(三氟甲基)嘧啶(3.7mg,0.020mmol)代替2-氯-4-甲基嘧啶。将反应混合物在90℃加热18小时。MS m/z 779.3(M+1)。保留时间1.481min。
实施例10:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-10)
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-10)使用化合物FP-8所述相同的方法合成，除了用3-氯-2-氟-5-(三氟甲基)吡啶(1.3mg,0.0067mmol)代替2-氯-4-甲基嘧啶。将反应物在90℃加热18小时。MS m/z 812.3(M+1)。保留时间1.638min。
实施例11:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-溴-3-氟吡啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-11)
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-溴-3-氟吡啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-11)使用化合物FP-8所述相同的方法合成，除了用5-溴-2,3-二氟吡啶(1.3mg,0.0067mmol)代替2-氯-4-甲基嘧啶。将反应物在100℃加热96小时。MS m/z 806.3(M+1)。保留时间1.592min。
实施例12:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-12)
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-12)，该化合物使用化合物FP-8所述相同的方法合成，使用2-氯嘧啶(7.7mg,0.067mmol)代替2-氯-4-甲基嘧啶。将反应物在120℃加热48小时。MS m/z 711.4(M+1)。保留时间1.221min。
实施例13:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-乙基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-13)
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-乙基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-13)使用化合物FP-8所述相同的方法合成，使用2-氯-4-乙基嘧啶(9.6mg,0.067mmol)代替2-氯-4-甲基嘧啶。将反应物在120℃加热48小时。MS m/z 739.4(M+1)。保留时间1.221min。
实施例14:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((6-甲基嘧啶-4-基)氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-14)
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((6-甲基嘧啶-4-基)氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-14)使用化合物FP-8所述相同的方法合成，除了用4-氯-6-甲基嘧啶(8.6mg,0.067mmol)代替2-氯-4-甲基嘧啶。将反应物在160℃加热6小时。MS m/z 725.4(M+1)。保留时间1.068min。
实施例15:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4,6-二甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-15)
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4,6-二甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-15)使用化合物FP-8所述相同的方法合成，除了用2-氯-4,6-二甲基嘧啶(9.6mg,0.067mmol)代替2-氯-4-甲基嘧啶。将反应物在120℃加热48小时。MSm/z 739.3(M+1)。保留时间1.164min。
实施例16:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((6-氟吡啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-16)
将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯TFA盐(5.0mg,0.0067mmol)、2,6-二氟吡啶(7.7mg,0.067mmol)、K2CO3(10mg,0.072mmol)、DIEA(8.7mg,0.067mmol)和DMSO(1mL)混合，并在密封的瓶中在160℃加热24小时。将该粗物质经反相HPLC用20-50％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((6-氟吡啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-16)。MS m/z 728.4(M+1)。保留时间1.457min。
实施例17:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-异丙基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-17)
S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-异丙基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-17)使用化合物FP-8所述相同的方法合成，除了用2-氯-4-异丙基嘧啶(10.5mg,0.067mmol)代替2-氯-4-甲基嘧啶。将反应物在155℃加热10小时。MS m/z 753.4(M+1)。保留时间1.266min。
实施例18:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(吡嗪-2-基氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-18)
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(吡嗪-2-基氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-18)使用化合物FP-16所述相同的方法合成，除了用2-氯吡嗪(7.7mg,0.067mmol)代替2,6-二氟吡啶。将反应物在130℃加热10小时。MS m/z 711.4(M+1)。保留时间1.295min。
实施例19:合成(S)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-4-((S)-2-((4-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-19)
(S)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-4-((S)-2-((4-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(FP-19)使用化合物FP-8所述相同的方法合成，除了用2-氯-4-甲氧基嘧啶(20mg,0.14mmol)代替2-氯-4-甲基嘧啶。将反应物在155℃加热4小时。MS m/z741.5(M+1)。保留时间1.135min。
实施例20:合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸叔丁酯(FP-20)
步骤1:将LiOH(240mg,10.0mmol)加入Cbz-Val-Dil-Dap-OMe(516mg,0.833mmol)在MeOH-H2O(5:1,12ml)的溶液中。将该反应物在40℃搅拌18小时。将反应混合物浓缩，溶于10mL水中，并用1N HCl水溶液酸化。将该混合物用乙酸乙酯(10mL X3)萃取。将有机层合并，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到Cbz-Val-Dil-Dap-OH MS m/z 606.3(M+1)。保留时间1.423min。
步骤2:室温下向Cbz-Val-Dil-Dap-OH(30mg,0.050mmol)在DMF(1.0mL)的溶液中加入DIEA(19mg,0.15mmol)和HATU(18.8mg,0.050mmol)。将所得溶液搅拌5分钟，并加入L-苯基丙氨酸叔丁酯(11mg,0.050mmol)的溶液中。将反应物在室温下搅拌18小时。将反应混合物经制备型HPLC用30-90％梯度洗脱纯化，得到Cbz-Val-Dil-Dap-PheOtBu,MS m/z809.1(M+1)。保留时间1.595min。
步骤3:向步骤2中得到的BocVal-Dil-Dap-PheOtBu(10.2mg,0.013mmol)在甲醇(2mL)的溶液中加入10％Pd碳(10mg)。将反应物在室温下在H2中搅拌1小时。经过滤除去催化剂，并将滤液浓缩，得到Val-Dil-Dap-PheOtBu。MS m/z 675.1(M+1)。保留时间1.247min。
步骤4:向微波反应瓶中加入Val-Dil-Dap-PheOtBu(4.5mg,0.0067mmol)、2-氯嘧啶(8.7mg,0.076mmol)、DIEA(0.0088ml,0.050mmol)和仲BuOH(2.0ml)。将该瓶密封，并在130℃加热18小时。将反应混合物浓缩，并经制备型HPLC用30-60％洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸叔丁酯(FP-20)，为TFA盐。MS m/z 753.4(M+1)。保留时间1.410min。
实施例21:合成(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氰基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰胺(FP-21)
步骤1:室温下向Cbz-Val-Dil-Dap-OH(30mg,0.050mmol)在DMF(1.0mL)的溶液中加入DIEA(6.4mg,0.05mmol)和HATU(18.8mg,0.050mmol)。将所得溶液搅拌5分钟，并加入(S)-2-氨基-3-苯基丙腈(13mg,0.050mmol)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌18小时，并经制备型HPLC用30-75％梯度洗脱纯化，得到((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氰基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸苄基酯，MS m/z 734.1(M+1)。保留时间1.469min。
步骤2:向步骤1中得到产物(28.2mg,0.038mmol)在甲醇(2mL)的溶液中加入10％Pd碳(10mg)。将反应物在室温下在H2中搅拌1小时。经过滤除去催化剂，并将滤液浓缩，得到(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氰基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺。MS m/z 600.1(M+1)。保留时间1.119min。
步骤3:向微波反应瓶中加入从步骤2得到的(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氰基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺(4.5mg,0.0075mmol)、2-氯嘧啶(8.7mg,0.076mmol)、DIEA(0.0022ml,0.013mmol)和仲BuOH(2.0mL)。将反应瓶密封，并在130℃加热18小时。将反应混合物浓缩，并经制备型HPLC用20-60％梯度洗脱纯化，得到(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氰基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰胺(FP-21)，为TFA盐。MSm/z 678.4(M+1)。保留时间1.272min。
实施例22:合成(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-16-氨基-7-苄基-4,9,12-三甲基-5,8,13-三氧代-2-氧杂-6,9,12-三氮杂十六烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(FP-23)
步骤1:向Cbz-Phe-OH(114mg,0.382mmol)在DMF(4ml)的溶液中加入DIEA(278μl,1.59mmol)和HATU(133mg,0.351mmol)。将所得混合物在室温下搅拌15分钟，并随后加入甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(60mg,0.32mmol)。将反应物在室温下搅拌2小时。经制备型HPLC纯化(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)，得到((S)-(2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯)，MS m/z 470.2(M+1)。保留时间1.313min。
步骤2:向(S)-(2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(104.5mg,0.223mmol)在MeOH(5ml)的溶液中加入Pd/C(47.4mg,10％湿重)。将反应瓶用H2填充。将反应物在室温下搅拌2小时。将反应混合物过滤，浓缩，得到((S)-(2-(2-氨基-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯)，为无色油状物。MS m/z 336.2(M+1)。保留时间0.851分钟。
步骤3:将DIEA(65μl)和HATU(31.2mg,0.082mmol)加入(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(i-11)(61.2mg,89μmol)在DMF(2ml)的溶液中。搅拌15分钟后，加入(S)-(2-(2-氨基-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(25mg,75μmol)在DMF(1.5ml)中的溶液。将反应物在室温下搅拌2小时。经制备型HPLC纯化(30-50％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)，得到(2-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯，MS m/z887.6(M+1)。保留时间1.167min。将产物(37.8mg,38μmol)在DCM(2ml)中的溶液用TFA(0.4ml)在0℃下处理30分钟，并随后在室温下处理2小时。经蒸发除去溶剂，得到(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((7S,10R,11R)-7-苄基-5,10-二甲基-6,9-二氧代-12-氧杂-2,5,8-三氮杂十三烷-11-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺,为TFA盐。MS m/z 787.6(M+1)。保留时间0.891min。
步骤4：向4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸(7.9mg,39μmol)在DMF(2ml)的溶液中加入DIEA(25.2mg,195μmol)，并随后加入HATU(14.8mg,39μmol)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，并随后加入(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((7S,10R,11R)-7-苄基-5,10-二甲基-6,9-二氧代-12-氧杂-2,5,8-三氮杂十三烷-11-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺TFA盐(39.6mg,39μmol)在DMF(1ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩，并经制备型HPLC(20-60％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到((3R,4R,7S)-7-苄基-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-4,9,12-三甲基-5,8,13-三氧代-2-氧杂-6,9,12-三氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯为TFA盐。MS m/z 972.7(M+1)。保留时间1.106min。室温下将产物(42.4mg,39μmol)中DCM(3ml)中的溶液用TFA(1ml)处理4小时，并随后浓缩。将粗物质经制备型HPLC(10-40％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-16-氨基-7-苄基-4,9,12-三甲基-5,8,13-三氧代-2-氧杂-6,9,12-三氮杂十六烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(FP-23)，为TFA盐。MS m/z 872.7(M+1)。保留时间0.874min。
实施例23:合成N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-4-甲基哌嗪-1-甲酰胺(FP-24)
步骤1:将4-硝基苯基氯甲酸酯(20mg,10μmol)和DIEA(25mg,190μmol)加入1-甲基哌嗪(10mg,10μmol)在DMF(1ml)和THF(1ml)的溶液中。将所得混合物搅拌10分钟，并随后加入Val-Dil-Dap-OH，即(30mg,64μmol)。将反应混合物在40℃搅拌16小时，然后浓缩，并经制备型HPLC(10-30％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸，为TFA盐。MS m/z 598.4(M+1)。保留时间0.874min。
步骤2：将DIEA(8mg,6μmol)和HATU(3.9mg,10μmol)加入步骤1中得到的产物(7.4mg,10μmol)在DMF(1ml)的溶液中，并在室温下搅拌5分钟。然后加入(S)-2-氨基-3-苯基丙烷-1-醇(1.6mg,10μmol)，并将反应混合物在室温下搅拌1小时，并随后经制备型HPLC(10-40％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到化合物(FP-24)，为TFA盐。MS m/z 731.5(M+1)。保留时间0.925min。
实施例24:合成N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)吗啉-4-甲酰胺(FP-25)
步骤1：将氯甲酸4-硝基苯基酯(8.3mg,41μmol)和DIEA(16mg,120μmol)加入Val-Dil-Dap-OMe(20mg,41μmol)在DMF(1ml)和THF(1ml)的溶液中，并搅拌10分钟。然后加入吗啉(3.6mg,41μmol)，并将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩，并经制备型HPLC(25-60％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(吗啉-4-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯MSm/z 599.4(M+1)。保留时间1.164min。
步骤2:将步骤1中得到的脲(24mg,41μmol)溶于MeOH-H2O(2:13ml)，并用LiOH(20mg,0.84mmol)在室温下处理2天。然后将反应混合物浓缩，并加入HOAc(40μl)。将粗物质经制备型HPLC(20-45％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(吗啉-4-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸,MS m/z 585.4(M+1)。保留时间1.036min。
步骤3:将DIEA(2.8mg,21μmol)和HATU(3.2mg,84μmol)加入步骤2中得到的酸(5.0mg,8.4μmol)中，并随后在室温下搅拌5分钟。然后加入S)-2-氨基-3-苯基丙烷-1-醇(1.3mg,8.4μmol)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。然后将粗物质经制备型HPLC(10-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到化合物(FP-25)。MS m/z 718.5(M+1)。保留时间1.097min。
实施例25:合成(S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-3-甲基吗啉-4-甲酰胺(FP-26)
化合物(FP-26)(MS m/z 732.5(M+1)；保留时间1.136min.)按照如实施例24所述方法制备，除了在步骤1中用(S)-3-甲基吗啉而不是吗啉。
实施例26:
合成(2S,6R)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2,6-二甲基吗啉-4-甲酰胺(FP-27)
化合物(FP-27)(MS m/z 746.5(M+1)；保留时间1.193min.)按照如实施例24所述方法制备，除了在步骤1中用(2R,6S)-2,6-二甲基吗啉而不是吗啉。
实施例27:合成(R)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基吗啉-4-甲酰胺(FP-28)
化合物(FP-28)(MS m/z 732.5(M+1)；保留时间1.143min.)按照如实施例24所述方法制备，除了在步骤1中用(R)-2-甲基吗啉盐酸盐而不是吗啉。
实施例28:合成(S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基吗啉-4-甲酰胺(FP-29)
化合物(FP-29)(MS m/z 732.5(M+1)；保留时间1.144min.)按照如实施例24所述方法制备，除了在步骤1中用(S)-2-甲基吗啉盐酸盐而不是吗啉。
实施例29:合成(R)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-3-甲基吗啉-4-甲酰胺(FP-30)
化合物(FP-30)(MS m/z 732.5(M+1)；保留时间1.145min.)按照如实施例24所述方法制备，除了在步骤1中用(R)-3-甲基吗啉盐酸盐而不是吗啉。
实施例30:
合成(2S,6S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2,6-二甲基吗啉-4-甲酰胺(FP-31)
化合物(FP-31)(MS m/z 746.5(M+1)；保留时间1.179min.)按照如实施例24所述方法制备，除了在步骤1中用(2S,6S)-2,6-二甲基吗啉而不是吗啉。
实施例31:合成N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-3-氧代哌嗪-1-甲酰胺(FP-32)
化合物(FP-32)(MS m/z 731.5(M+1)；保留时间1.129min.)按照如实施例24所述方法制备，除了在步骤1中用哌嗪-2-酮而不是吗啉。
实施例32:合成N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2,2-二甲基-3-氧代哌嗪-1-甲酰胺(FP-33)
化合物(FP-33)(MS m/z 759.5(M+1)；保留时间1.084min.)按照如实施例24所述方法制备，除了在步骤1中用3,3-二甲基哌嗪-2-酮而不是吗啉。
实施例33:合成(S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2,4-二甲基哌嗪-1-甲酰胺(FP-34)
化合物(FP-34)(MS m/z 745.6(M+1)；保留时间0.946min.)按照如实施例24所述方法制备，除了在步骤1中用(S)-1,3-二甲基哌嗪而不是吗啉。
实施例34:
合成(2R,6S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酰胺(FP-35)
化合物(FP-35)(MS m/z 745.6(M+1)；保留时间0.946min.)按照如实施例24所述方法制备，在步骤1中用(3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯而不是吗啉，且通过用5％HCl在1:1乙腈-水混合物(4ml)中的溶液处理，并搅拌48小时，将boc保护基团从最终的中间体上去除，得到标题化合物，为HCl盐。
实施例35:N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2,2-二甲基哌嗪-1-甲酰胺(FP-36)
化合物(FP-36)(MS m/z 745.5(M+1)；保留时间0.976min.)按照如实施例34所述方法制备，除了在步骤1中使用3,3-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯而不是(3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯。
实施例36:(2R,6S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2,4,6-三甲基哌嗪-1-甲酰胺(FP-37)
将多聚甲醛(1.7mg,56μmol)、乙酸(5μl,90μmol)和NaCNBH3(3.5mg,56μmol)加入(2R,6S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酰胺盐酸盐(FP-35)(4.4mg,56μmol)在MeOH(2ml)的溶液中，并随后在室温下搅拌16小时。经制备型HPLC纯化(10-45％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)，然后用HCl处理，得到标题化合物(FP-37)，为HCl盐。MS m/z 759.6(M+1)。保留时间0.950min。
实施例37:N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2,2,4-三甲基哌嗪-1-甲酰胺(FP-38)
化合物(FP-38)(MS m/z 759.6(M+1)；保留时间0.980min.)按照如实施例36所述方法制备，除了用化合物(FP-37)而不是化合物(FP-35)。
实施例38:(S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基哌嗪-1-甲酰胺(FP-39)
化合物(FP-39)(MS m/z 731.6(M+1)；保留时间0.934min.)按照如实施例24所述方法制备，除了在步骤1中用(S)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯而不是吗啉，且通过用5％HCl在1:1乙腈-水混合物(4ml)中的溶液处理，并搅拌2小时，将boc保护基团从最终的中间体上去除，得到标题化合物，为HCl盐。
实施例39:(R)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基哌嗪-1-甲酰胺(FP-40)
化合物(FP-40)(MS m/z 731.5(M+1)；保留时间0.932min.)按照如实施例24所述方法制备，除了在步骤1中用(R)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯而不是吗啉，且通过用5％HCl在1:1乙腈-水混合物(4ml)中的溶液处理，并搅拌2小时，将boc保护基团从最终的中间体上去除，得到标题化合物，为HCl盐。
实施例40:
(S)-4-乙酰基-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基哌嗪-1-甲酰胺(FP-41)
向乙酸(0.9mg,20μmol)在DMF(0.5ml)的溶液中加入DIEA(3.9mg,30μmol)和HATU(3.2mg,8μmol)。将所得混合物在室温下搅拌5分钟，并随后加入化合物(FP-39)盐酸盐(5.8mg,7.6μmol)在DMF(0.5ml)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并随后浓缩，经制备型HPLC(10-60％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到标题化合物(FP-41)。MS m/z773.5(M+1)。保留时间1.061min。
实施例41:(R)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2,4-二甲基哌嗪-1-甲酰胺(FP-42)
化合物(FP-42)(MS m/z 745.5(M+1)；保留时间0.935min.)按照如实施例36所述方法制备，除了用化合物(FP-40)而不是化合物(FP-35)
实施例42:(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰胺(FP-43)
步骤1:将10％Pd碳(60mg)加入Cbz-Val-Dil-Dap-OMe(350mg,565μmol)在MeOH(10ml)的溶液中，并将反应物在室温下在氢气中搅拌1小时，并经过滤除去催化剂。将滤液浓缩，得到Val-Dil-Dap-OMe。MS m/z 486.3(M+1)。保留时间1.070min。
步骤2:向微波反应瓶内装入Val-Dil-Dap-OMe(274mg,565μmol)、2-氯嘧啶(194mg,1.69mmol)、DIEA(292mg,2.26mmol)和仲丁醇(5.0ml)。将其密封，并在130℃加热48小时。将反应混合物浓缩，并经制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯为TFA盐。MS m/z 564.4(M+1)。保留时间1.274min。
步骤3:将氢氧化锂(120mg,5.0mmol)加入步骤2中得到的产物(383mg,565μmol)在MeOH-H2O(1:1,10ml)中的溶液。将反应物在室温下搅拌16小时，然后在60℃加热1小时。然后将反应混合物冷却至室温，并浓缩。将盐酸(1N)加入残余物中，直至形成沉淀(pH～5)。将该混合物浓缩，并经制备型HPLC(20-60％乙腈-水，包含0.05％TFA))纯化，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸,为TFA盐。MS m/z 550.3(M+1)。保留时间1.152min。
步骤4：将DIEA(3.5mg,27μmol)并随后将HATU(6.9mg,18μmol)加入步骤3中得到的产物(6.0mg,9μmol)在DMF(0.5ml)的溶液中。将该混合物在室温下搅拌5分钟，并随后加入(S)-2-氨基-3-苯基丙烷-1-醇(4.1mg,27μmol)在DMF(0.5ml)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌16小时，并随后经制备型HPLC(20-60％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到化合物(FP-43)，为TFA盐。MS m/z 683.4(M+1)。保留时间1.264min。
实施例43:(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-氨基苯基)-3-羟基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰胺(FP-44)
步骤1:向0℃下在N2中搅拌的(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(3-硝基苯基)丙酸(562mg,1.81mmol)在THF(10ml)的溶液中加入BH3在THF(1M,10ml)中的溶液，并将反应物加温至50℃，并搅拌1小时。将反应物冷却至0℃，并用水猝灭。将猝灭的混合物用乙酸乙酯稀释，并用10％K2CO3水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。将粗物质经硅胶柱纯化，用30-70％乙酸乙酯-己烷洗脱，得到(S)-(1-羟基-3-(3-硝基苯基)丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯，为白色固体。MS m/z 319.1(M+Na)。保留时间1.183分钟。1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ8.13-8.04(m,2H),7.57(d,J＝7.7 Hz,1H),7.46(dd,J＝8.9,7.6 Hz,1H),4.76(s,1H),3.87(dq,J＝8.0,4.6,4.1 Hz,1H),3.69(dd,J＝10.9,3.9 Hz,1H),3.58(dd,J＝10.8,4.7 Hz,1H),2.97(td,J＝13.1,12.5,7.3 Hz,2H),1.37(s,9H)。
步骤2:向(S)-(1-羟基-3-(3-硝基苯基)丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.31g,1.046mmol)在乙腈(5ml)的溶液中加入10％HCl(5ml)。将其在室温下搅拌48小时，并随后浓缩，得到(S)-2-氨基-3-(3-硝基苯基)丙烷-1-醇，为HCl盐。MS m/z 197.2(M+H)。保留时间0.775分钟。
步骤3:将步骤2中得到的(S)-2-氨基-3-(3-硝基苯基)丙烷-1-醇HCl盐(0.243g,1.046mmol)溶于MeOH(10ml)中，并加入10％钯碳(50mg,0.047mmol)。连接2L氢气球。将反应物用H2冲扫三次，并随后在室温下搅拌1小时。LCMS指示反应完全。将反应混合物经硅藻土过滤，并随后浓缩，得到(S)-2-氨基-3-(3-氨基苯基)丙烷-1-醇，为HCl盐。MS m/z 167.2(M+H)。保留时间0.373分钟。
步骤4:将步骤3中得到的(S)-2-氨基-3-(3-氨基苯基)丙烷-1-醇HCl盐(0.212g,1.05mmol)溶于二噁烷-水-AcOH(10:9:1,20ml)。加入Boc2O(0.243mL,1.05mmol)。将反应物在室温下搅拌3天。LCMS指示仍剩余1/4起始材料。加入另外的Boc2O(150mg)，并将反应物进一步搅拌6小时。然后将反应混合物浓缩，并经制备型HPLC(10-40％乙腈水溶液，含有0.05％TFA)纯化，得到(S)-(3-(2-氨基-3-羟基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯，为油状物。MSm/z 267.2(M+H)。保留时间1.011分钟。
步骤5:向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸、TFA盐(30mg,0.045mmol)在DMF(1ml)的溶液中加入DIEA(0.029mg,0.226mmol)和HATU(17.2mg,0.045mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后加入(S)-(3-(2-氨基-3-羟基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯HCl盐(17.2mg,0.045mmol)在DMF(1ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并随后浓缩。将粗物质经制备型HPLC纯化(用10-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA洗脱)，得到(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-羟基丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯，为TFA盐。MS m/z 798.5(M+H)。保留时间1.267分钟。
步骤6:将步骤5中得到的化合物(36.1mg,0.045mmol)在乙腈-H2O(1:1,5ml)中的溶液(包含5％HCl)在室温下搅拌24小时。然后将反应混合物浓缩，并经制备型HPLC纯化(用5-35％乙腈-H2O，包含0.05％TFA洗脱)，得到化合物(FP-44)，为TFA盐。MS m/z 698.5(M+H)。保留时间0.894分钟。
实施例44:(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰胺(FP-45)
向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(嘧啶-2-基氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(8mg,0.015mmol)在DMF(1ml)的溶液中加入DIEA(8.6mg,0.012ml)和HATU(5.3mg,0.014mmol)。将反应物搅拌15分钟，并随后加入(1S,2R)-(+)-去甲麻黄碱(2mg,0.013mmol)。将反应物在室温下搅拌1小时。将粗物质经制备型HPLC纯化(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)，得到化合物(FP-45)。MS m/z 683.4(M+1)。保留时间1.241分钟。
式(I)的N-末端连接的化合物实施例的合成程序
实施例45：合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-4)
步骤1:室温下历经5分钟将草酰氯(0.356g,2.80mmol)在DCM(1mL)中的溶液逐滴加入4-(二甲基氨基甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.361g,1.40mmol)在DCM(5mL)的溶液中。将反应物在回流下在搅拌中加热3小时。经LCMS分析测定起始的脲向所需产物的转化率约70％。将反应混合物浓缩，并用乙醚(10mL)处理。将由此形成的固体超声处理，并弃去乙醚层。将固体溶于DCM(10mL)，并用饱和KPF6水溶液处理(0.8g在3.0mL水中的溶液)。将该混合物振摇5分钟。分离DCM层，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到N-((4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)氯亚甲基)-N-甲基甲铵六氟磷酸盐MS m/z 276.1(M+)。保留时间0.771min。该产物不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤2:将步骤1中得到的产物(0.462g,1.09mmol)加入1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇(HOBt)(0.148g,1.09mmol)和三乙胺(0.111g,1.09mmol)在DCM(10mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌3小时，形成沉淀。将反应混合物浓缩，并将残余物用乙醚洗涤，得到异脲1六氟磷酸盐,为固体。MS m/z 375.2(M+)。保留时间0.826min。
步骤3:向(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(118mg,0.186mmol)在DMF(5mL)的溶液中加入DIEA(120mg,0.928mmol)和步骤2中得到的产物(342mg,0.557mmol)。将反应物在40℃加热12小时。将反应混合物浓缩，并经ISCO用C18柱以25-75％乙腈在H2O中的溶液(包含0.035％TFA)梯度洗脱纯化，得到4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-N,N-二甲基甲脒基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(NL-1)，为TFA盐,MS m/z 872.5(M+1)。保留时间1.159min。
步骤4:室温下将4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-N,N-二甲基甲脒基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(NL-1)(0.157g,0.180mmol)在DCM(10.0mL)中的溶液用TFA(3.0mL)处理1小时。将反应混合物浓缩，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-2)，为TFA盐,MS m/z 772.5(M+1)。保留时间0.924min。
步骤5:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-2)(183mg,0.207mmol)溶于MeOH:H2O(2:1,9.0ml)，并加入LiOH(35.6mg,1.49mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，并浓缩。将残余物用乙酸(0.060mL)处理，并经ISCO用C18柱以10-70％乙腈在H2O中的溶液(包含0.05％TFA)梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-3)，为TFA盐,MS m/z 758.5(M+1)。保留时间0.860min。
步骤6:向6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(EMCA,17mg,0.080mmol)在DMF(2.0mL)的溶液中加入DIEA(0.042mL,0.241mmol)和HATU(30.5mg,0.080mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，并加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-3)(70mg,0.080mmol)在DMF(1.0mL)的溶液中。反应立即完成。经蒸发除去DMF。将残余物经ISCO用C18柱以15-70％乙腈水溶液(包含0.05％TFA)梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-4)，为TFA盐。MS m/z 951.5(M+1)。保留时间1.049min。
实施例46：合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,7S,E)-4-((S)-仲丁基)-9-(二甲基氨基)-19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-7-异丙基-3-甲氧基-5,10,13-三甲基-6,14-二氧代-5,8,10,13-四氮杂十八-8-烯-1-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-9)
步骤1:0℃下在搅拌中将二甲基氨基甲酰氯(129mg,1.20mmol)逐滴加入(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(188mg,0.999mmol)和三乙胺(0.139mL,0.999mmol)在DCM(5mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌1小时。将反应混合物用1N NaOH水溶液碱化，并分离所得两相。将水相用DCM萃取。将合并的DCM相连续用水和饱和NaCl水溶液洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到甲基(2-(1,3,3-三甲基脲基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 260.2(M+1)。保留时间1.042min。该产物不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤2:室温下历经5分钟将草酰氯(253mg,2.00mmol)在DCM(1mL)中的溶液逐滴加入步骤1得到的脲(288mg,1.11mmol)在DCM(5mL)的溶液中。将反应混合物回流下在搅拌中加热3小时，并随后浓缩。将残余物溶于乙醚(10mL)中，并超声处理。弃去乙醚层后，将残余物溶于DCM中，并用1.5mL饱和KPF6水溶液(0.38g在1.5mL水中)处理。将该混合物振摇5分钟，并分离DCM层，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到N-(((2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基)氯亚甲基)-N-甲基甲铵六氟磷酸盐。MS m/z 278.2(M+)。保留时间0.710min。该产物不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤3:将步骤2中得到的产物(179mg,0.422mmol)加入HOBt(56.9mg,0.421mmol)和三乙胺(42.6mg,0.421mmol)在DCM(10mL)的溶液中。将反应物搅拌1小时。没有沉淀形成，但LCMS指示产物形成。将反应混合物浓缩，将残余物用乙醚处理。不溶的残余物主要是所需产物，2-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)-1-(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)-1,3,3-三甲基异脲鎓六氟磷酸盐如LCMS分析测定。MS m/z 377.2(M+)。保留时间0.746min。残余物不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤4:将DIEA(15.6mg,0.121mmol)加入步骤3中得到的残余物(63.1mg,0.121mmol)和(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯TFA盐(30mg,0.040mmol)在DMF(2mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌2小时，并随后在50℃搅拌2小时。将该粗物质经制备型HPLC用30-55％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((11S,14S,15R,Z)-14-((S)-仲丁基)-9-(二甲基氨基)-11-异丙基-15-甲氧基-2,2,5,8,13-五甲基-4,12-二氧代-3-氧杂-5,8,10,13-四氮杂十七-9-烯-17-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-5)，为TFA盐。MS m/z 874.5(M+1)。保留时间1.179min。
步骤5:将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((11S,14S,15R,Z)-14-((S)-仲丁基)-9-(二甲基氨基)-11-异丙基-15-甲氧基-2,2,5,8,13-五甲基-4,12-二氧代-3-氧杂-5,8,10,13-四氮杂十七-9-烯-17-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-5)(17mg,0.020mmol)在DCM(2mL)中的溶液用TFA(2mL)处理。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，并浓缩，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((8S,11S,12R,Z)-11-((S)-仲丁基)-6-(二甲基氨基)-8-异丙基-12-甲氧基-5,10-二甲基-9-氧代-2,5,7,10-四氮杂十四-6-烯-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-6)，为TFA盐。MS m/z 774.5(M+1)。保留时间0.899min。
步骤6:将LiOH(10mg,0.42mmol)加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((8S,11S,12R,Z)-11-((S)-仲丁基)-6-(二甲基氨基)-8-异丙基-12-甲氧基-5,10-二甲基-9-氧代-2,5,7,10-四氮杂十四-6-烯-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-6)(24mg,0.027mmol)在MeOH:H2O(2:1,6mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌0.5小时。LCMS指示脲NL-8与NL-7一起形成。将反应混合物浓缩。将该残余物经制备型HPLC用20-55％梯度洗脱纯化。分别收集包含NL-7和NL-8的流份，并浓缩，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((8S,11S,12R,Z)-11-((S)-仲丁基)-6-(二甲基氨基)-8-异丙基-12-甲氧基-5,10-二甲基-9-氧代-2,5,7,10-四氮杂十四-6-烯-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-7)，为TFA盐,MSm/z 760.5(M+1),保留时间0.868min；和(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-8-异丙基-12-甲氧基-5,10-二甲基-6,9-二氧代-2,5,7,10-四氮杂十四烷-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-8)，为TFA盐。MS m/z 733.4(M+1)。保留时间0.954min。
步骤7:向EMCA(2.4mg,0.011mmol)在DMF(2mL)的溶液中加入DIEA(6.0mg,0.046mmol)和HATU(4.0mg,0.010mmol)。将反应混合物搅拌5分钟，并加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((8S,11S,12R,Z)-11-((S)-仲丁基)-6-(二甲基氨基)-8-异丙基-12-甲氧基-5,10-二甲基-9-氧代-2,5,7,10-四氮杂十四-6-烯-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-7)TFA盐(5.5mg,0.0056mmol)。将反应物在室温下搅拌30分钟。将该粗物质经制备型HPLC用30-50％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,7S,E)-4-((S)-仲丁基)-9-(二甲基氨基)-19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-7-异丙基-3-甲氧基-5,10,13-三甲基-6,14-二氧代-5,8,10,13-四氮杂十八-8-烯-1-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-9)。MS m/z 953.5(M+1)。保留时间1.057min。
实施例47：合成(S)-2-((E)-((二甲基氨基)(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(2H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺(NL-12)
步骤1:将(S)-(1-氰基-2-苯基乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.50g,2.03mmol)、叠氮化钠(0.264g,4.06mmol)和ZnBr2(0.229g,1.02mmol)在2-丙醇-水混合物(1:1,60ml)中的溶液在回流下加热16小时。反应完全后，加入5mL的10％柠檬酸和30mL EtOAc，并搅拌直至没有固体剩余。将水层用EtOAc萃取两次。将合并的有机层用水洗涤，用Na2SO4干燥，并过滤。经蒸发除去溶剂，并将残余物经硅胶快速色谱纯化(10％MeOH在DCM中的溶液)。将包含所需产物的流份浓缩，再次溶于EtOAc，用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到(S)-(2-苯基-1-(2H-四唑-5-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 290.2(M+1)。保留时间0.990min。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40–7.24(m,3H),7.22–7.12(m,2H),5.22–5.02(m,2H),3.49–3.24(m,2H),1.40(s,9H)。
步骤2:在15mL圆底烧瓶中将(S)-(2-苯基-1-(2H-四唑-5-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(30mg,0.104mmol)、TFA(2mL)和DCM(4mL)混合，得到澄清溶液。将该溶液在室温下搅拌1小时，并浓缩，得到(S)-2-苯基-1-(2H-四唑-5-基)乙胺为TFA盐(M+1 190.2)。保留时间0.422min。其不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤3:在15ml圆底烧瓶中装入Boc-Val-Dil-Dap-OH(59.3mg,0.104mmol)、DIEA(0.072mL,0.415mmol)和DMF(2ml)，然后加入HATU(43.4mg,0.114mmol)。将反应物搅拌5分钟，并加入在步骤2中得到的(S)-2-苯基-1-(2H-四唑-5-基)乙胺TFA盐(0.104mmol)。将反应物在室温下搅拌72小时。将粗物质经制备型HPLC用10-70％梯度洗脱纯化，得到((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯MSm/z 743.5(M+1)。保留时间1.373min。
步骤4:在15ml圆底烧瓶中将((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(46mg,0.056mmol)、TFA(2mL)和DCM(4mL)混合，得到澄清溶液。将该溶液在室温下搅拌1小时，并浓缩，得到(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺，为TFA盐，MS m/z643.5(M+1)。保留时间0.929min。其不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤5:将DIEA(0.028ml,0.16mmol)加入(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺TFA盐(40mg,0.053mmol)和异脲1(27.6mg,0.053mmol)在DMF(2mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌1小时。将粗物质经制备型HPLC用30-55％梯度洗脱纯化，得到4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(2H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-N,N-二甲基甲脒基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(NL-10)，为TFA盐,MS m/z 882.6(M+1)。保留时间1.174min。
步骤6:将4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(2H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-N,N-二甲基甲脒基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(NL-10)(46.6mg,0.053mmol)在DCM(1mL)中的溶液用TFA(1mL)在室温下处理2小时，并浓缩。将粗物质经制备型HPLC用10-45％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺(NL-11)，为TFA盐,MS m/z 782.5(M+1)。保留时间0.869min。
步骤7:向EMCA(1.9mg,0.0092mmol)在DMF(1mL)的溶液中加入DIEA(4.9mg,0.038mmol)和HATU(3.5mg,0.0092mmol)。将反应混合物搅拌5分钟，并加入(S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺(NL-11)(5.0mg,0.0044mmol)。如LCMS测定，该反应在10分钟内完成。将粗物质经制备型HPLC用30-50％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((E)-((二甲基氨基)(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(2H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺(NL-12)。MS m/z 975.6(M+1)。保留时间1.074min。
实施例48：合成(2R)-2-乙酰氨基-3-((1-(6-(4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-N,N-二甲基甲脒基)哌嗪-1-基)-6-氧代己基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)硫基)丙酸(NL-13)
将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-4)(3.6mg,0.0034mmol)溶于50％乙腈水溶液(3mL)中，并加入L-乙酰半胱氨酸(1.1mg,0.0067mmol)在pH7.5磷酸盐缓冲液中的溶液。LCMS分析指示产物定量形成。将粗物质经制备型HPLC用20-70％梯度洗脱纯化，得到(2R)-2-乙酰氨基-3-((1-(6-(4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-N,N-二甲基甲脒基)哌嗪-1-基)-6-氧代己基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)硫基)丙酸(NL-13)。MS m/z 1114.6(M+1)。保留时间0.973min。
实施例49：合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(4-(4-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-15)
步骤1:向4-叠氮基丁酸(1.9mg,0.015mmol)在DMF(1mL)的溶液中加入DIEA(0.0076ml,0.044mmol)和HATU(5.5mg,0.015mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，并加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸TFA盐(NL-3)(12.7mg,0.015mmol)和DIEA(0.010ml)在DMF(1mL)的溶液中。LCMS指示反应在10分钟内完成。将粗物质经ISCO用C18柱以15-85％乙腈水溶液(包含0.05％TFA)梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((4-(4-叠氮基丁酰基)哌嗪-1-基)(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-14)，为TFA盐,MS m/z 869.5(M+1)。保留时间1.076min。
步骤2:将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((4-(4-叠氮基丁酰基)哌嗪-1-基)(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-14)TFA盐(11.6mg,0.012mmol)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2.0mg,0.015mmol)在水和t-BuOH的1:2混合物中的溶液用Ar脱气。加入脱气的L-抗坏血酸钠(5.9mg,0.030mmol)和CuSO4(0.5mg,0.003mmol)的溶液。将反应物在室温下搅拌30分钟。经蒸发除去溶剂。将残余物经制备型HPLC用20-45％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(4-(4-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-15)，为TFA盐。MS m/z 1004.5(M+1)。保留时间1.031min。
实施例50：合成(2R)-2-乙酰氨基-3-((1-((1-(4-(4-((Z)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-N,N-二甲基甲脒基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)硫基)丙酸(NL-16)
向(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(4-(4-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸TFA盐(NL-15)(2.0mg,0.0018mmol)在乙腈的溶液中加入乙酰半胱氨酸(0.3mg,0.002mmol)在pH 7.5磷酸盐缓冲液中的溶液。反应完成后，将所需产物经制备型HPLC用20-50％梯度洗脱纯化，得到(2R)-2-乙酰氨基-3-((1-((1-(4-(4-((Z)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-N,N-二甲基甲脒基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)硫基)丙酸(NL-16)。MS m/z 1167.5(M+1)。保留时间0.986min。
实施例51：合成((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二 甲基氨基)(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨 基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙 酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(NL-19)
步骤1:将((R)-1-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(如JOrganometallic Chem 646(2002)212和J Chem Soc Perkin Trans I:Organic and Bio-Organic Chemistry(1984),(12),2845中所述流程合成)(100mg,0.313mmol)溶于吡啶(5ml)和正-BuOH(35mg,0.46mmol)，然后加入新戊酰氯(70mg,0.58mmol)。再加入三次等部分的正-BuOH和新戊酰氯，直至经LCMS测定全部次膦酸被消耗。加入碘(160mg,0.630mmol)在2mL吡啶-H2O(10％水)中的溶液。将反应物搅拌20分钟。LCMS指示反应完全。经蒸发除去吡啶。加入硫代硫酸钠水溶液，并将反应混合物用EtOAc萃取。将EtOAc层用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。将残余物经ISCO用C18柱以10％-60％乙腈水溶液(包含0.5％TFA)梯度洗脱纯化，得到((1R)-1-(丁氧基(羟基)膦酰基)-2-苯基乙基)氨基甲酸苄基酯，为白色固体，MS m/z 392.1(M+1)。保留时间1.179min。1H NMR(400MHz,CD3CN)d7.42-7.18(m,8H),7.18-7.00(m,2H),6.10(s,1H),5.07-4.59(m,2H),4.20-4.35(m,1H),4.13-3.93(m,2H),3.15-3.30(m,1H),2.85-2.75(s,1H),1.71-1.47(m,2H),1.47-1.23(m,2H),0.89(t,J＝7.3 Hz,3H)。
步骤2:向((1R)-1-(丁氧基(羟基)膦酰基)-2-苯基乙基)氨基甲酸苄基酯(84.7mg,0.216mmol)在MeOH(5mL)的溶液中加入10％Pd/C(26mg)。将反应物在室温下在H2气氛中搅拌2小时。经硅藻土过滤除去催化剂，将滤液浓缩，得到((R)-1-氨基-2-苯基乙基)磷酸氢丁酯MS m/z 258.1(M+1)。保留时间0.789min。该物质不经进一步纯化直接用于步骤3。
步骤3:在15mL圆底烧瓶中将Boc-Val-Dip-Dap-OH(80mg,0.140mmol)、DIEA(62.9mg,0.487mmol)和DMF(2mL)混合，随后加入HATU(53mg,0.139mmol)。将反应物搅拌5分钟，加入步骤2中得到的产物(41.9mg,0.163mmol)。将所得溶液在室温下搅拌16小时。将粗物质经制备型HPLC用40-60％梯度洗脱纯化，得到((2S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((2S)-2-((1R,2R)-3-((1-(丁氧基(羟基)膦酰基)-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯,MS m/z 811.4(M+1)。保留时间1.376min。
步骤4:将TFA(1mL)加入步骤3中得到的产物(106mg,0.131mmol)在DCM(3mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并浓缩，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸TFA盐，MSm/z 655.3(M+1)。保留时间0.957min。
步骤5:向步骤4中得到的产物(22.6mg,0.029mmol)在DMF(1ml)的溶液中加入异脲1(30.7mg,0.059mmol)和DIEA(19.0mg,0.15mmol)。将反应物在40℃加热2小时，并将反应混合物经制备型HPLC用25-42％梯度洗脱纯化，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(NL-17)，为TFA盐,MS m/z 894.5(M+1)。保留时间1.067min。
步骤6:将((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(NL-17)TFA盐(9mg,0.01mmol)溶于DCM(2ml)，并加入TFA(1ml)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并浓缩，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(NL-18)，为TFA盐,MS m/z 794.5(M+1)。保留时间0.842min。
步骤7:向EMCA(0.7mg,0.003mmol)在DMF(1mL)的溶液中加入DIEA(0.0017mL,0.0099mmol)和HATU(1.4mg,0.0036mmol)。将反应混合物搅拌5分钟，并加入((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(NL-18)(3mg,0.003mmol)在DMF(0.5mL)的溶液中。如LCMS指示，该反应在5分钟内完成。将反应混合物经制备型HPLC用25-34％梯度洗脱纯化，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(NL-19)，为TFA盐。MS m/z 987.5(M+1)。保留时间1.042min。
实施例52:
合成((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(4-(4-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(NL-21)
步骤1:向4-叠氮基丁酸(0.8mg,0.007mmol)在DMF(1mL)的溶液中加入DIEA(2.6mg,0.020mmol)和HATU(2.5mg,0.0066mmol)。将反应混合物搅拌5分钟，并加入((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(NL-18)TFA盐(6.0mg,0.0066mmol)在DMF(0.5mL)的溶液中。如LCMS指示，该反应在5分钟内完成。将粗物质经制备型HPLC用25-32％梯度洗脱纯化，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((4-(4-叠氮基丁酰基)哌嗪-1-基)(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(NL-20)，为TFA盐,MS m/z 905.5(M+1)。保留时间1.048min。
步骤2:将((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((4-(4-叠氮基丁酰基)哌嗪-1-基)(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(NL-20)TFA盐(4.0mg,0.0039mmol)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1.1mg,0.0079mmol)在水-t-BuOH的1:2混合物中的溶液用Ar脱气。向该脱气的溶液中连续加入L-抗坏血酸钠(2.3mg,0.012mmol)在水中和硫酸铜(0.7mg,0.004mmol)在水中的脱气溶液。将反应混合物在室温下搅拌3小时，并浓缩。将残余物经制备型HPLC用20-32％梯度洗脱纯化，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(4-(4-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)膦酸(NL-21)。MS m/z 1040.5(M+1)。保留时间0.996min。
实施例53：合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,7S)-4-((S)-仲丁基)-19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-7-异丙基-3-甲氧基-5,10,13-三甲基-6,9,14-三氧代-5,8,10,13-四氮杂十九烷-1-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-22)
向EMCA(2.1mg,0.0010mmol)在DMF(2mL)的溶液中加入DIEA(0.0081mL,0.046mmol)和HATU(3.7mg,0.0097mmol)。将反应混合物搅拌5分钟，并加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-8-异丙基-12-甲氧基-5,10-二甲基-6,9-二氧代-2,5,7,10-四氮杂十四烷-14-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-8)TFA盐(4.3mg,0.0051mmol)中。将反应物在室温下搅拌30分钟。所需产物经制备型HPLC用30-55％线性梯度洗脱分离，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,7S)-4-((S)-仲丁基)-19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-7-异丙基-3-甲氧基-5,10,13-三甲基-6,9,14-三氧代-5,8,10,13-四氮杂十九烷-1-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-22)。MS m/z 926.4(M+1)。保留时间1.141min。
实施例54：合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-26)
步骤1:将DIEA(0.012ml,0.067mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(4.5mg,0.022mmol)加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯盐酸盐(15mg,0.022mmol)在DMF:THF混合物(1:1,2mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌1小时。LCMS指示4-硝基苯氧基氨基甲酸酯的形成完成。MS m/z 798.4(M+1)。保留时间1.409min。向该反应物中加入哌嗪-1-甲酸叔丁酯(6.3mg,0.034mmol)，并将反应物再搅拌1小时。将反应混合物经制备型HPLC用30-70％梯度洗脱纯化，得到4-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(NL-23),MS m/z 845.5(M+1)。保留时间1.367min。
步骤2:将TFA(1ml)加入4-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(NL-23)(14.9mg,0.018mmol)在DCM(2mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并浓缩，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(哌嗪-1-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-24)，为TFA盐,MSm/z 745.5(M+1)。保留时间1.006min。
步骤3:将LiOH(15mg,0.63mmol)加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(哌嗪-1-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-24)TFA盐(15.5mg,0.018mmol)在MeOH:H2O(1:1,2mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌18小时。将该混合物经制备型HPLC用20-45％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(哌嗪-1-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-25)，为TFA盐,MSm/z 731.4(M+1)。保留时间0.918min。
步骤4:将HATU(6.8mg,0.018mmol)加入EMCA(3.8mg,0.018mmol)和DIEA(0.0094ml,0.054mmol)在DMF(1mL)的溶液中。将反应混合物搅拌5分钟，并加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-(哌嗪-1-甲酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-25)TFA盐(16mg,0.019mmol)中。将反应混合物在室温下搅拌2小时，并经制备型HPLC用20-60％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-甲酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-26)。MS m/z 924.6(M+1)。保留时间1.152min。
实施例55：合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,7S)-4-((S)-仲丁基)-20-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-7,10-二异丙基-3-甲氧基-5-甲基-6,9,15-三氧代-5,8,10,14-四氮杂二十烷-1-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-30)
步骤1:将DIEA(23mg,0.18mmol)和4-硝基苯基碳酰氯(9.0mg,0.045mmol)加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯盐酸盐(30mg,0.045mmol)在DMF:THF(1:1,2mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌1小时。LCMS指示4-硝基苯氧基氨基甲酸酯的形成完成。MS m/z 798.4(M+1)。保留时间1.409min。将反应物中加入(3-(异丙基氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(9.7mg,0.045mmol)，并将反应物在室温下搅拌70小时。将反应混合物经制备型HPLC用20-80％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((12S,15S,16R)-15-((S)-仲丁基)-9,12-二异丙基-16-甲氧基-2,2,14-三甲基-4,10,13-三氧代-3-氧杂-5,9,11,14-四氮杂十八烷-18-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-27),MSm/z 875.6 (M+1)。保留时间1.371min。
步骤2:将TFA(1mL)加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((12S,15S,16R)-15-((S)-仲丁基)-9,12-二异丙基-16-甲氧基-2,2,14-三甲基-4,10,13-三氧代-3-氧杂-5,9,11,14-四氮杂十八烷-18-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-27)(19.1mg,0.022mmol)在DCM(2mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并浓缩，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-(3-氨基丙基)-3-异丙基脲基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-28)，为TFA盐,MS m/z775.6(M+1)。保留时间1.064min。
步骤3:将LiOH(20mg,0.84mmol)加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-(3-氨基丙基)-3-异丙基脲基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-28)TFA盐(19.0mg,0.022mmol)在MeOH:H2O(3:2,2mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并经制备型HPLC用20-80％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-(3-氨基丙基)-3-异丙基脲基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-29)，为TFA盐，MS m/z 761.5(M+1)。保留时间0.993min。
步骤4:向EMCA(3.1mg,0.015mmol)在DMF(1mL)的溶液中加入DIEA(0.0070ml,0.040mmol)和HATU(5.6mg,0.015mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，并加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(3-(3-氨基丙基)-3-异丙基脲基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-29)(12mg,0.013mmol)中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并经制备型HPLC用20-45％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,7S)-4-((S)-仲丁基)-20-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-7,10-二异丙基-3-甲氧基-5-甲基-6,9,15-三氧代-5,8,10,14-四氮杂二十烷-1-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-30)。MS m/z 954.5(M+1)。保留时间1.144min。
实施例56：
合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-34)
步骤1:将草酰氯(0.055ml,0.624mmol)和DMF(0.0024mL,0.031mmol)加入2-氯-4-甲基嘧啶-5-甲酸(59.2mg,0.343mmol)在DCM(6.0mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌20小时。将反应混合物浓缩，并将残余物溶于DCM(6.0ml)。加入(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(50mg,0.312mmol)在DCM(3mL)中的溶液，然后加入三乙胺(0.13mL,0.936mmol)。将反应物在室温下搅拌4小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用20-70％梯度洗脱纯化，得到(2-(2-氯-4-甲基嘧啶-5-甲酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 315.1(M+1)。保留时间0.951min。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.65(s,1H),3.46-3.43(m,2H),3.31-3.26(m,2H),2.61(s,3H),1.43(s,9H)。
步骤2:将Val-Dil-Dap-Phe-OMe(实施例1步骤2)(24mg,0.038mmol)、(2-(2-氯-4-甲基嘧啶-5-甲酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(23.9mg,0.076mmol)和DIEA(0.066ml,0.38mmol)在2-丙醇(2mL)中的溶液在密封瓶中于120℃加热4小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用20-70％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)-4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-31),MS m/z911.6(M+1)。保留时间1.295min。
步骤3:将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)-4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-31)(11.8mg,0.013mmol)溶于甲醇HCl(3M,2mL)。缓慢蒸发溶剂。LCMS分析指示Boc基团去除完全。将残余物溶于乙腈和水中，并冻干，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)-4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-32),MS m/z 811.5(M+1)。保留时间1.009min。
步骤4:将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)-4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-32)(11mg,0.013mmol)溶于THF(0.8mL)、MeOH(0.1mL and H2O(0.1mL)的混合物中。加入LiOH(5.5mg,0.13mmol)。室温下将反应物搅拌4小时。LCMS分析指示反应完全。用盐酸(0.1N)将反应混合物的pH调至7，并将该混合物浓缩。将残余物从乙腈和水中冻干，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)-4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-33),MS m/z 797.6(M+1)。保留时间0.942min。
步骤5:将DIEA(10mg,0.078mmol)和HATU(12.3mg,0.032mmol)加入EMCA(8.2mg,0.039mmol)在DMF(2mL)的溶液中。将反应物搅拌10分钟后，加入(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)-4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-33)(10.3mg,0.013mmol)。将反应物在室温下搅拌1小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用20-70％ACN-H2O梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-34)。MS m/z 990.5(M+1)。保留时间1.115min。
实施例57：
合成(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-38)
步骤1:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-35),是按照如(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)-4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-31)所述方法制备。MS m/z 911.5(M+1)。保留时间1.405min。
步骤2:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-36),是按照(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)-4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(NL-32)所述方法制备。MS m/z 811.5(M+1)。保留时间1.131min.
步骤3:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-37),是按照(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)-4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-33)所述方法制备。MS m/z 797.5(M+1)。保留时间1.038min。
步骤4:(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((4-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-38)是按照(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((5-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(NL-34)所述方法制备。MS m/z 990.5(M+1)。保留时间1.183min。
实施例58：
合成2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(羟基)膦酰基)乙酸(NL-42)
步骤1:向((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸TFA盐，(17mg,0.021mmol)在DMF(2mL)的溶液中加入异脲1(50mg,0.096mmol)和DIEA(0.021mL,0.120mmol)。将反应物在45℃搅拌18小时。将粗物质经制备型HPLC用20-50％梯度洗脱纯化，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸(NL-39)，为TFA盐,MS m/z 950.4(M+1)。保留时间1.252min。
步骤2:将((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸(NL-39)TFA盐(7.6mg,0.0071mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液用TFA(1.0mL)处理。将反应物在室温下搅拌24小时。将反应混合物浓缩，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸(NL-40)，为TFA盐,MS m/z850.5(M+1)。保留时间0.941min。
步骤3:向((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸(NL-40)TFA盐(6.9mg,0.0071mmol)在MeOH:H2O(2:1,3mL)的溶液中加入LiOH(3.4mg,0.14mmol)。将反应物在室温下搅拌18小时，使得该酯全部水解。浓缩后，将残余物用0.01ml HOAc处理，并经制备型HPLC用20-45％梯度洗脱纯化，得到2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(羟基)膦酰基)乙酸(NL-41)，为TFA盐,MS m/z 836.4(M+1)。保留时间0.983min。
步骤4:向EMCA(1.07mg,0.005mmol)在DMF(1mL)的溶液中加入DIEA(0.0037ml,0.021mmol)和HATU(1.9mg,0.005mmol)。将反应混合物搅拌5分钟，并加入2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(羟基)膦酰基)乙酸TFA盐(4mg,0.004mmol)在DMF(0.5mL)与DIEA(0.001mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌1小时。将粗物质经制备型HPLC用20-50％梯度洗脱纯化，得到2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(羟基)膦酰基)乙酸(NL-42)，为TFA盐。MS m/z 1029.5(M+1)。保留时间1.089min。
式(I)的C-末端连接化合物的实施例的合成程序
实施例59：合成N-(4-((R)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(CL-1)
步骤1:将DIEA(388mg,3.0mmol)和HATU(571mg,1.5mmol)加入(4-(氨基甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(111mg,0.50mmol)和EMCA(127mg,0.60mmol)在DMF(5mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌2小时。将反应混合物用EtOAc(30mL)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将水层用EtOAc萃取(2x30mL)。将合并的有机相用H2O洗涤(5x10mL)，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。将残余物经ISCO纯化(EtOAc/己烷0-75％)。得到所需产物，(4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(MS m/z 416.3(M+1))，为黄色油状物。将该油状物溶于DCM(2mL)，并用TFA(2mL)处理。室温下1小时后，将反应混合物浓缩。将残余物溶于乙腈和H2O中，并冻干，得到N-(4-氨基苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺TFA盐，为黄色固体(MS m/z 316.2(M+1))。
步骤2:将DIEA(226mg,1.75mmol)和HATU(265mg,0.698mmol)加入N-(4-氨基苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺TFA盐(110mg,0.349mmol)和(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-苯基丙酸(111mg,0.419mmol)在DMF(2mL)的溶液中。室温下将反应物搅拌2小时。将反应混合物用EtOAc(20mL)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将水层用EtOAc萃取(2x20mL)。将合并的有机相用H2O洗涤(5x10mL)，用MgSO4干燥，过滤，并浓缩。将残余物经ISCO纯化(EtOAc/己烷,0-75％)，得到(S)-(1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(MSm/z 563.3(M+1))。将该产物溶于3M HCl在MeOH(3mL)的溶液中，并浓缩。将残余物溶于乙腈和H2O中，并冻干，得到(S)-N-(4-(2-氨基-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺，为HCl盐，MS m/z 463.3(M+1)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.76(bs,1H),7.36-7.20(m,9H),6.70(s,2H),5.84(s,1H),4.47(bs,1H),4.41(d,J＝5.6Hz,2H),3.52(t,J＝7.2Hz,2H),3.17(d,J＝7.2Hz,2H),2.23(t,J＝7.6Hz,2H),1.64-1.26(m,6H),1.45(s,9H)。
步骤3:将DIEA(60.1mg,0.465mmol)和HATU(70.7mg,0.186mmol)加入(S)-N-(4-(2-氨基-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺HCl盐(46.3mg,0.093mmol)和BocVal-Dil-Dap-OH(53mg,0.093mmol)在DMF(2mL)的溶液中。室温下将反应物搅拌1小时。将反应混合物经制备型HPLC纯化，得到((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 1016.6(M+1)。将该产物溶于3M HCl在MeOH(2mL)的溶液中，并浓缩。将残余物溶于乙腈和H2O中，并冻干，得到N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺，为HCl盐，MS m/z 916.5(M+1)。保留时间1.060min。
步骤4:将DIEA(1.7mg,0.013mmol)和HATU(3.4mg,0.0089mmol)加入N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺HCl盐(4.6mg,0.0045mmol)在DMF的溶液中。将反应物在室温下搅拌10分钟。将粗物质经制备型HPLC用20-50％梯度洗脱纯化，得到N-(4-((R)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(CL-1)。MS m/z1014.5(M+1)。保留时间1.108min。
实施例60：合成N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1,3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(CL-2)
向N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺HCl盐(4.5mg,0.0044mmol)在DMF(1mL)的溶液中加入DIEA(20mg,0.16mmol)和2-氯-1,3-二甲基咪唑啉六氟磷酸盐(4.6mg,0.017mmol)。将反应物在室温下搅拌30分钟。将粗物质经反相HPLC用33-38％梯度洗脱纯化，得到N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1,3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(CL-2)。MS m/z 1012.6(M+1)。保留时间1.122min。
实施例61：合成N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(吗啉基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(CL-3)
步骤1:0℃下将N,N-二甲基氨基甲酰氯(129mg,1.20mmol)逐滴加入搅拌中的吗啉(87mg,0.999mmol)和三乙胺(0.139ml,0.999mmol)在DCM(5mL)的混合物中。加完后，将温度升至室温，并将反应物在室温下搅拌18小时。将反应混合物用10％NaOH水溶液碱化。分离有机层，将水层用DCM萃取。将合并的DCM层连续用水和饱和NaCl水溶液洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到N,N-二甲基吗啉-4-甲酰胺。MS m/z 159.2(M+1)。保留时间0.474分钟。该产物不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤2:室温下历经5分钟将草酰氯(0.079ml,0.90mmol)在DCM(1mL)中的溶液逐滴加入N,N-二甲基吗啉-4-甲酰胺(158mg,0.999mmol)在DCM(2mL)的溶液中。将反应物在回流下加热3小时。干净地形成所需产物N-(氯(吗啉基)亚甲基)-N-甲基甲铵氯化物。蒸发溶剂，并将残余物用乙醚洗涤。将由此获得的白色固体溶于DCM中，并在室温下于剧烈搅拌下加入饱和KPF6水溶液。将该水溶液用DCM萃取三次。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩，得到产物N-(氯(吗啉基)亚甲基)-N-甲基甲铵六氟磷酸盐。MS m/z 177.1(M+1)。保留时间0.244min。
步骤3:将N-(氯(吗啉基)亚甲基)-N-甲基甲铵六氟磷酸盐(140mg,0.433mmol)加入1-羟基-苯并三唑(58.5mg,0.433mmol)和三乙胺(0.060mL,0.43mmol)在DCM(20mL)的溶液中。将反应物搅拌14小时。加入HOBt后立即形成沉淀。经过滤收集该白色固体，得到异脲2,MS m/z 276(M+)。保留时间0.375min。该产物不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤4:向N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺HCl盐(5.0mg,0.0049mmol)在DMF(1mL)的溶液中加入DIEA(1.9mg,0.015mmol)和异脲2(4.1mg,0.0097mmol)。将反应物在室温下搅拌18小时。将粗物质经制备型HPLC用33-40％梯度洗脱纯化，得到N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((Z)-((二甲基氨基)(吗啉基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(CL-3)。MS m/z 1056.6(M+1)。保留时间1.125min。
实施例62：合成4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-N,N-二甲基甲脒基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(CL-4)
向N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺HCl盐(10mg,0.0097mmol)在DMF(1mL)的溶液中加入DIEA(10mg,0.077mmol)和异脲1(20mg,0.038mmol)。将反应物在60℃搅拌30分钟。将粗物质经制备型HPLC用35-46％梯度洗脱纯化，得到4-((E)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-N,N-二甲基甲脒基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(CL-4)，为TFA盐。MS m/z 1155.6(M+1)。保留时间1.226min。
实施例63：合成N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(CL-5)
将TFA(1mL)加入4-((Z)-N'-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-N,N-二甲基甲脒基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯TFA盐(5.1mg,0.004mmol在DCM(2mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并浓缩。将残余物经制备型HPLC用25-35％梯度洗脱纯化，得到N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((E)-((二甲基氨基)(哌嗪-1-基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(CL-5)。MS m/z 1055.6(M+1)。保留时间0.973min。
实施例64：合成N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(CL-6)
步骤1:向EMCA(349mg,1.65mmol)在DMF(10mL)的溶液中加入DIEA(820mg,6.35mmol)和HATU(579mg,1.52mmol)。室温下10分钟后，加入(4-(氨基甲基)苯基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(300mg,1.27mmol)。将反应物在室温下再搅拌1小时。将反应混合物用EtOAc(30mL)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将水层用EtOAc萃取(2x30ml)。将合并的有机相用H2O洗涤(5x10mL)，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。将残余物经ISCO纯化(EtOAc/己烷0-80％)，得到所需产物，为黄色油状物。MS m/z 374.2(M-56.1(异丁烯)+1)。保留时间1.156min。将该产物溶于DCM(3mL)，并用TFA(1mL)处理。室温下1小时后，蒸发溶剂。将残余物溶于乙腈和H2O，并冻干，得到6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-(4-(甲基氨基)苄基)己酰胺TFA盐，为黄色固体。MS m/z 330.2(M+1)。保留时间0.61min。
步骤2:将DIEA(356mg,2.76mmol)和HATU(288mg,0.758mmol)加入Boc-苯基丙氨酸(219mg,0.827mmol)在DMF(5mL)的溶液中。室温下10分钟后，加入6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-(4-(甲基氨基)苄基)己酰胺TFA盐(227mg,0.512mmol)。室温下将反应物搅拌2小时。将反应混合物用EtOAc(20mL)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将水层用EtOAc萃取(2x20mL)。将合并的有机相用H2O洗涤(5x10mL)，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。将残余物经ISCO纯化(EtOAc/己烷,0-75％)，得到(S)-(1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 577.3(M+1)。保留时间1.19min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.00(s,1H),8.24(t,J＝6.0Hz,1h),7.52(d,j＝8.4Hz,2H),7.32-7.09(m,7H),7.01(s,2H),4.31(m,1H),4.19(d,J＝6.0Hz,2H),3.38(t,J＝7.0Hz,2H),3.17(d,J＝7.2Hz,2H),3.00(m,1H),2.85(m,1H),2.10(t,J＝7.4Hz,2H),1.54-1.44(m,4H),1.31(s,9H),1.22-1.15(m,4H)。将该产物溶于甲醇HCl(3M,5mL)并缓慢浓缩。将残余物溶于乙腈和H2O中，并冻干，得到(S)-N-(4-(2-氨基-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺，为HCl盐。MS m/z 477.2(M+1)。保留时间0.83min。
步骤3:向Boc-Val-Dil-Dap-OH(347mg,0.607mmol)在DMF(4mL)的溶液中加入DIEA(261mg,2.02mmol)和HATU(282mg,0.49mmol)。将反应物在室温下搅拌15分钟，然后加入(S)-N-(4-(2-氨基-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺HCl盐(193mg,0.376mmol)。将反应物在室温下再搅拌2小时。将反应混合物经制备型HPLC纯化，得到((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)甲基)苯基)(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 1030.5(M+1)。保留时间1.430min。将该产物溶于甲醇HCl(3M,3mL),并浓缩。将残余物溶于乙腈和H2O中，并冻干，得到N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺,为HCl盐(MS m/z 930.5(M+1),保留时间1.07min。
步骤4:将DIEA(0.019mL,0.11mmol)和HATU(12.3mg,0.032mmol)加入N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺HCl盐(20mg,0.021mmol)在DMF(2mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌2小时。将粗物质经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-N-甲基-3-苯基丙酰氨基)苄基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺为TFA盐(CL-6)。MS m/z 1028.6(M+1)。保留时间1.129min。
实施例65：合成6-(氨基氧基)-N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)己酰胺(CL-7)
步骤1:室温下向Boc-苯基丙氨酸(964mg,3.63mmol)在DMF(10mL)的溶液中加入DIEA(1.27g,9.84mmol)和HATU(1.13g,3.03mmol)。10分钟后，加入4-氨基苄基氨基甲酸苄基酯(388mg,1.51mmol)。室温下将反应物搅拌2小时。将反应混合物用EtOAc(60mL)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将水层用EtOAc萃取(2x30mL)。将合并的有机相用H2O(5x10mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到粗产物。将粗产物溶于DCM(5.0mL)，并在室温下用TFA(5.0mL)处理1小时。将反应混合物浓缩，并经ISCO用0-8％MeOH以2M氨在DCM中的溶液洗脱纯化，得到(S)-4-(2-氨基-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯，为白色固体。MS m/z404.2(M+1)。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.44-7.23(m,14H),5.10(s,2H),4.26(s,2H),4.12(d,J＝7.4Hz,1H),3.28-3.22(m,1H),3.15-3.10(m,1H)。
步骤2:将DIEA(323mg,2.50mmol)和HATU(342mg,0.90mmol)加入(S)-4-(2-氨基-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯(202mg,0.50mmol)和(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(429mg,0.75mmol)在DMF(6mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并经制备型HPLC纯化，得到((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((((苄氧基)羰基)氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 957.5(M+1)。保留时间1.54min。将该产物(393mg,0.41mmol)溶于甲醇HCl(3M,15mL)。缓慢蒸发溶剂。LCMS分析指示Boc基团全部去除。将残余物溶于乙腈和水中，并冻干，得到4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯,为HCl盐，MS m/z 857.5(M+1)。保留时间1.16min。
步骤3:将DIEA(0.031mL,0.18mmol)和HATU(20.0mg,0.053mmol)加入4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯HCl盐(30mg,0.034mmol)在DMF(2mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯,为TFA盐。MS m/z 955.6(M+1)。保留时间1.232min。
步骤4:将4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸苄基酯TFA盐(16mg,0.015mmol)溶于MeOH(1ml)中。加入Pd/C(10％,wet,7.1mg)。将反应物在H2中搅拌1小时。LCMS指示反应完全。将反应混合物过滤并浓缩，得到(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-(氨基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺,MSm/z 821.5(M+1)。保留时间0.907min。
步骤5:将6-(((1-乙氧基亚乙基)氨基)氧基)己酸锂盐(13.2mg,0.059mmol)悬浮于DMF(2mL)中，并加入HATU(18.75,0.049mmol)。将反应物在室温下搅拌15分钟。加入DIEA(0.021mL,0.12mmol)，然后加入(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-(氨基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(16.2mg,0.020mmol)。将反应物搅拌直至LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到N-(6-((4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)氨基)-6-氧代己基)氧基乙酰亚胺酸乙酯,为TFA盐。MS m/z 1020.6(M+1)。保留时间1.243min。
步骤6:室温下将N-(6-((4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)氨基)-6-氧代己基)氧基乙酰亚胺酸乙酯(11.4mg,0.0101mmol)在MeOH(1.5mL)中的溶液用盐酸(1M,0.061ml)处理30分钟。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用33-45％梯度洗脱纯化，得到6-(氨基氧基)-N-(4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基)己酰胺(CL-7)，为TFA盐。MS m/z 950.6(M+1)。保留时间0.967min。
实施例66：合成(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)脲基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-8)
步骤1:将(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-(氨基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(6.4mg)溶于DMF(0.5mL)和THF(0.5mL)中。加入DIEA(0.0068mL 0.039mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(3.14mg,0.016mmol)。将反应物在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸4-硝基苯基酯,为TFA盐。MS m/z986.5(M+1)。保留时间1.206min。
步骤2:向4-4-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)苄基氨基甲酸硝基苯基酯TFA盐(2.4mg,0.0024mmol)在DMF(0.5mL)和THF(0.5mL)的溶液中加入DIEA(0.0085mL,0.049mmol)和1-(6-氨基己基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2.9mg,0.015mmol)。将反应物在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((4-((3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基)脲基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-8)，为TFA盐。MS m/z 1043.6(M+1)。保留时间1.161min。
实施例67：合成(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-9)
将(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(FP-3)TFA盐(87.4mg,0.089mmol)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(24.2mg,0.0179mmol)悬浮于各3.0mL的叔丁醇和水中。将反应瓶经真空填充循环用N2填充五次。连续加入L-抗坏血酸钠(17.7mg,0.089mmol)在H2O(2.4ml)中的脱气溶液和CuSO4(2.86mg,0.018mmol)在H2O(0.6ml)中的溶液，并将反应物在室温下搅拌5小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用20-45％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-9)，为TFA盐。MS m/z 998.5(M+1)。保留时间1.014min。
实施例68：合成(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-苄基-21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-甲基-5,8,19-三氧代-2,12,15-三氧杂-6,9,18-三氮杂二十烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-10)
步骤1:向(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-苯基丙酸(482mg,1.82mmol)在DMF(10mL)的溶液中加入DIEA(705mg,5.46mmol)和HATU(622mg,1.64mmol)。10分钟后，加入(9H-芴-9-基)(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸甲酯(370mg,0.91mmol)。室温下将反应物搅拌2小时。将粗物质经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到(S)-(1-(9H-芴-9-基)-3,14-二氧代-16-苯基-2,7,10-三氧杂-4,13-二氮杂十六烷-15-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 618.3(M+1)。保留时间1.395min。将该产物溶于甲醇HCl(3M,5ml)并缓慢浓缩。LCMS分析指示Boc基团全部去除。将残余物溶于乙腈和H2O，并冻干，得到(S)-(9H-芴-9-基)(2-(2-(2-(2-氨基-3-苯基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸甲酯，为HCl盐。MSm/z 518.2(M+1)。保留时间1.041min。
步骤2:向Boc-Val-Dil-Dap-OH(189mg,0.33mmol)在DMF(6mL)的溶液中加入DIEA(0.144mL,0.83mmol)和HATU(113mg,0.297mmol)。室温下15分钟后，加入(S)-(9H-芴-9-基)(2-(2-(2-(2-氨基-3-苯基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸甲酯HCl盐(91.5mg,0.165mmol)。将反应物在室温下再搅拌2小时。将粗物质经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((15S,18R,19R)-15-苄基-1-(9H-芴-9-基)-18-甲基-3,14,17-三氧代-2,7,10,20-四氧杂-4,13,16-三氮杂二十烷-19-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MSm/z 1071.6(M+1)。保留时间1.577min。将该产物(93mg,0.087mmol)溶于甲醇HCl(3M,3ml)，并缓慢浓缩。LCMS分析指示Boc基团全部去除。将残余物溶于乙腈和水中，并冻干，得到(9H-芴-9-基)((3R,4R,7S)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-7-苄基-4-甲基-5,8-二氧代-2,12,15-三氧杂-6,9-二氮杂十七烷-17-基)氨基甲酸甲酯,为HCl盐。MS m/z 971.6(M+1)。保留时间1.195min。
步骤3:向(9H-芴-9-基)((3R,4R,7S)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-7-苄基-4-甲基-5,8-二氧代-2,12,15-三氧杂-6,9-二氮杂十七烷-17-基)氨基甲酸甲酯HCl盐(30mg,0.030mmol)在DMF(2mL)的溶液中加入DIEA(0.027mL0.15mmol)和HATU(23.5mg,0.062mmol)。将反应物在室温下搅拌2小时。将粗物质经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到(9H-芴-9-基)((3R,4R,7S)-7-苄基-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-4-甲基-5,8-二氧代-2,12,15-三氧杂-6,9-二氮杂十七烷-17-基)氨基甲酸甲酯。MS m/z 1069.6(M+1)。保留时间1.255min。用哌啶(0.2mL)在DMF(2mL)中的溶液在室温下处理30分钟，除去Fmoc基团，形成产物(13.6mg,0.011mmol)。经蒸发除去挥发物，得到(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-17-氨基-7-苄基-4-甲基-5,8-二氧代-2,12,15-三氧杂-6,9-二氮杂十七烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺,MS m/z847.6(M+1)。保留时间0.924min。该物质不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤4:向3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸(5.83mg,0.034mmol)在DMF(2mL)的溶液中加入DIEA(0.012mL,0.069mmol)和HATU(10.9mg,0.029mmol)。室温下15分钟后，加入步骤3中得到的粗产物(9.74mg)。将反应物在室温下搅拌2小时。将粗物质经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-苄基-21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-甲基-5,8,19-三氧代-2,12,15-三氧杂-6,9,18-三氮杂hen二十烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-10)。MS m/z 998.6(M+1)。保留时间1.007min。
实施例69：合成(S)-2-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)丙基(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(CL-11)
步骤1-2:(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(((S)-1-羟基丙烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺,HCl盐是按照实施例68中步骤1和2中所述方法合成，除了用(S)-2-氨基丙烷-1-醇代替(9H-芴-9-基)(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸甲酯,.MS m/z 676.5(M+1)。保留时间0.899min。
步骤3:将DIEA(0.026mL,0.15mmol)和HBTU(14.6mg,0.038mmol)加入(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(((S)-1-羟基丙烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺HCl盐(20mg,0.028mmol)在DMF(2mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(((S)-1-羟基丙烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺,为TFA盐。MS m/z 774.6(M+1)。保留时间0.984min。
步骤4:向1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(I-2)(12.5mg,0.057mmol)和无水吡啶(0.0092mL,0.11mmol)在DCM(2.0mL)的搅拌过的溶液中加入光气(15％在甲苯中的溶液,0.276mL,0.364mmol)。将该混合物在室温下搅拌20分钟，并在回流下加热40分钟。将该反应物冷却至室温，并加入(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(((S)-1-羟基丙烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺TFA盐(8.8mg,0.0099mmol)在DCM(1.0mL)中的溶液。将反应物在回流下加热1小时。将粗产物经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)丙基(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(CL-11)，为TFA盐。MS m/z 984.6(M+1)。保留时间1.065min。
实施例70：合成(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-苄基-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-甲基-5,8-二氧代-2,12-二氧杂-6,9-二氮杂十四烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-12)
步骤1-2:将(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-苄基-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-甲基-5,8-二氧代-2,12-二氧杂-6,9-二氮杂十四烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺,HCl盐按照实施例68中步骤1和2中所述方法合成，除了用1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(I-2)代替(9H-芴-9-基)(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸甲酯。MS m/z 785.4(M+1)。保留时间0.975min。
步骤3:将DIEA(0.019ml,0.11mmol)和HATU(17.4mg,0.046mmol)加入(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-苄基-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-甲基-5,8-二氧代-2,12-二氧杂-6,9-二氮杂十四烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺HCl盐(15mg,0.018mmol)在DMF(2mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-苄基-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-甲基-5,8-二氧代-2,12-二氧杂-6,9-二氮杂十四烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-12)，为TFA盐。MS m/z 883.5(M+1)。保留时间1.061min。
实施例71：合成(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-13)的(R)-Ac-Cys-OH加合物
将(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-9)TFA盐(5mg,0.005mmol)溶于磷酸盐缓冲液(pH 7.5,1mL)(包含1.3mg of(R)-Ac-Cys-OH)中。将反应物搅拌1小时。将粗物质经制备型HPLC用10-90％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-13)的(R)-Ac-Cys-OH加合物，为TFA盐。MS m/z 1161.5(M+1)。保留时间0.976min。
实施例72：合成((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-((3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)丙基)氨基)-2-氧代乙基)次膦酸(CL-15)
步骤1:将((R)-1-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(按照JOrganometallic Chem 646(2002)212和J Chem Soc Perkin Trans I:Organic and Bio-Organic Chemistry(1984),(12),2845中所述流程合成)(300mg,0.940mmol)和六甲基二硅氮烷(1.516g,9.40mmol)在密封瓶中混合，并在115℃加热2小时。将温度降至95℃，并逐滴加入溴乙酸甲酯(719mg,4.70mmol)，得到混悬液。将反应混合物在95℃搅拌1小时，并浓缩。将残余物经ISCO用C18柱(15.5g)纯化，并将所需产物用10-45％乙腈-H2O(包含0.05％TFA)洗脱，得到(2-甲氧基-2-氧代乙基)((R)-2-苯基-1-(2-苯基乙酰氨基)乙基)次膦酸。MS m/z 392.1(M+1)。保留时间1.010min。
步骤2:向(2-甲氧基-2-氧代乙基)((R)-2-苯基-1-(2-苯基乙酰氨基)乙基)次膦酸(0.178g,0.454mmol)在MeOH(10mL)的溶液中加入10％Pd/C(0.048g,0.045mmol)。将反应物在室温下在H2气氛中搅拌1小时。经硅藻土过滤除去催化剂，并蒸发滤液，得到((R)-1-氨基-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸。MS m/z 258.1(M+1)。保留时间0.565min。该物质不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤3:向Boc-Dap-OH(Small Molecules Inc.)(118mg,0.412mmol)在DMF(5mL)的溶液中加入DIEA(160mg,1.236mmol)和HATU(157mg,0.412mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，并加入((R)-1-氨基-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸(106mg,0.412mmol)在DMF的溶液中。反应完成后，将粗物质经制备型HPLC用20-34％梯度洗脱纯化，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸。MS m/z 527.2(M+1)。保留时间1.144min。浓缩过程中，Boc基团部分地从产物中丢失。
步骤4:将TFA(0.676mL,8.77mmol)加入步骤3中得到的产物(155mg,0.294mmol)在DCM(10mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌16小时，并浓缩，得到((R)-1-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸,MS m/z 427.2(M+1)。保留时间0.774min。
步骤5:向Cbz-Val-Dil-OH(I-7)(108mg,0.247mmol)在DMF(5mL)的溶液中加入DIEA(0.131mL,0.752mmol)和HATU(94mg,0.25mmol)。将反应混合物搅拌5分钟，并加入步骤4中得到的胺(133.5mg,0.247mmol)在DMF(2mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌2小时。将粗物质经制备型HPLC用35-44％梯度洗脱纯化，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸,MS m/z 845.4(M+1)。保留时间1.322min。
步骤6:将Pd/C(10％,17.9mg)加入((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸(143mg,0.169mmol)在MeOH(5mL)的溶液中。将反应物在H2中搅拌1小时。LCMS指示Cbz基团全部去除。将反应混合物经硅藻土过滤以除去Pd/C，并浓缩。将残余物经ISCO用C18柱(15.5g)纯化，将所需产物用10-50％乙腈水溶液(包含0.05％TFA)洗脱，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸,为TFA盐。MS m/z 711.4(M+1)。保留时间1.009min。
步骤7:向((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸TFA盐(35mg,0.042mmol)在DMF(1mL)的溶液中加入DIEA(16mg,0.12mmol)和HATU(16mg,0.042mmol)。将反应物在室温下搅拌4小时，并将所需产物经制备型HPLC用20-45％梯度洗脱分离，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸,为TFA盐。MS m/z 809.5(M+1)。保留时间1.044min。
步骤8:将LiOH(20mg,0.84mmol)加入((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-甲氧基-2-氧代乙基)次膦酸TFA盐(27mg,0.029mmol)在MeOH-H2O(2:1,3mL)的溶液中。将反应混合物室温下搅拌18小时，并浓缩。将残余物溶于乙腈-H2O，并用AcOH(0.060mL)处理。将所得溶液应用于C18柱在ISCO上，并将所需产物用5-50％乙腈-H2O(包含0.05％TFA)洗脱纯化，得到2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(羟基)膦酰基)乙酸，为TFA盐。MS m/z 795.4(M+1)。保留时间1.010min。
步骤9:将DIEA(2.1mg,0.017mmol)和HATU(2.1mg,0.0055mmol)加入2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(羟基)膦酰基)乙酸TFA盐(5.0mg,0.0055mmol)在DMF(1mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，并加入(3-氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯(1.0mg,0.0055mmol)在DMF(0.2mL)的溶液中。将反应混合物在室温下放置18小时，并经制备型HPLC用20-55％梯度洗脱纯化，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙基)氨基)-2-氧代乙基)次膦酸为TFA盐。MS m/z 951.0(M+1)。保留时间1.074min。
步骤10:将TFA(1mL)加入((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙基)氨基)-2-氧代乙基)次膦酸TFA盐(3.5mg,0.0033mmol)在DCM(1mL)的溶液中。将所得溶液在室温下搅拌2小时，并浓缩，得到(2-((3-氨基丙基)氨基)-2-氧代乙基)((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(CL-14)为TFA盐MS m/z 851.1(M+1)。保留时间0.971min。
步骤11:向EMCA(1.0mg,0.0049mmol)在DMF(1mL)的溶液中加入DIEA(0.0029mL,0.016mmol)和HATU(1.9mg,0.0049mmol)。将反应混合物在室温下放置5分钟，并加入(2-((3-氨基丙基)氨基)-2-氧代乙基)((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(CL-14)TFA盐(4.2mg,0.0039mmol)中。反应完成后，将粗产物经制备型HPLC用20-50％梯度洗脱纯化，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-((3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)丙基)氨基)-2-氧代乙基)次膦酸(CL-15)，为TFA盐。MS m/z 1044.0(M+1)。保留时间1.094min。
实施例73：合成((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-((3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基)氨基)-2-氧代乙基)次膦酸(CL-17)
步骤1:将DIEA(2.1mg,0.017mmol)和HATU(2.1mg,0.0055mmol)加入2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(羟基)膦酰基)乙酸TFA盐(5.0mg,0.0055mmol)在DMF(1mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，并加入3-叠氮基丙烷-1-胺(0.6mg,0.006mmol)在DMF(0.2mL)的溶液中。将反应混合物在室温下放置18小时，并经制备型HPLC用20-55％梯度洗脱纯化，得到(2-((3-叠氮基丙基)氨基)-2-氧代乙基)((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(CL-16),为TFA盐。MS m/z 877.0(M+1)。保留时间1.141min。
步骤2:将(2-((3-叠氮基丙基)氨基)-2-氧代乙基)((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(CL-16)TFA盐(2.8mg,0.0028mmol)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(0.8mg,0.006mmol)在水-叔丁醇的1:2混合物中的溶液用Ar脱气。向该脱气的溶液中加入L-抗坏血酸钠(1.7mg,0.0085mmol)和硫酸铜(0.7mg,0.005mmol)的脱气的水溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并浓缩。将残余物经制备型HPLC用20-45％梯度洗脱纯化，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-((3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基)氨基)-2-氧代乙基)次膦酸(CL-17)，为TFA盐。MS m/z 1012.0(M+1)。保留时间1.059min。
实施例74：合成((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-((2-(2-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)次膦酸(CL-19)
步骤1:将DIEA(2.1mg,0.017mmol)并随后将HATU(2.1mg,0.0055mmol)加入2-(((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(羟基)膦酰基)乙酸TFA盐(5.0mg,0.0055mmol)在DMF(1mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，并加入2-(2-叠氮基乙氧基)乙胺(0.7mg,0.006mmol)在DMF(0.2mL)的溶液中。将反应混合物在室温下放置18小时，并经制备型HPLC用20-55％梯度洗脱纯化，得到(2-((2-(2-叠氮基乙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(CL-18)为TFA盐。MS m/z 907.0(M+1)。保留时间1.121min。
步骤2:将2-((2-(2-叠氮基乙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)次膦酸(CL-18)TFA盐(4.6mg,0.0045mmol)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1.2mg,0.0090mmol)在水-叔丁醇的1:2混合物中的溶液用Ar脱气。向该脱气的溶液中加入L-抗坏血酸钠(2.7mg,0.014mmol)和硫酸铜(0.7mg,0.005mmol)的脱气的水溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时并浓缩。将残余物经制备型HPLC用20-45％梯度洗脱纯化，得到((R)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-2-苯基乙基)(2-((2-(2-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)次膦酸(CL-19)，为TFA盐。MS m/z 1042.0(M+1)。保留时间1.057min。
实施例75：合成(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-苄基-20-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4-甲基-5,8-二氧代-2,12,15,18-四氧杂-6,9-二氮杂二十烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-21)
步骤1-3:(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-20-叠氮基-7-苄基-4-甲基-5,8-二氧代-2,12,15,18-四氧杂-6,9-二氮杂二十烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-20)是按照实施例70制备(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-苄基-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-甲基-5,8-二氧代-2,12-二氧杂-6,9-二氮杂十四烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-12)中所述方法制备，除了用2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙胺代替1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(I-2)。MS m/z 917.7(M+1)。保留时间1.099min。
步骤4:将(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-20-叠氮基-7-苄基-4-甲基-5,8-二氧代-2,12,15,18-四氧杂-6,9-二氮杂二十烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-20)(8.9mg,0.0097mmol)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2.6mg,0.019mmol)悬浮于叔丁醇(1.0ml)和水(1.0ml)中。将该混合物经真空填充循环用N2脱气五次。加入L-抗坏血酸钠(1.9mg,0.0097mmol)在H2O(0.4mL)中和CuSO4(0.31mg,0.0019mmol)在H2O(0.4mL)中脱气的溶液，并将反应物在室温下搅拌3小时。将粗物质经制备型HPLC用20-70％梯度洗脱纯化，得到(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-7-苄基-20-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4-甲基-5,8-二氧代-2,12,15,18-四氧杂-6,9-二氮杂二十烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-21)，为TFA盐。MS m/z 1052.3(M+1)。保留时间0.998min。
实施例76：合成(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-(氨基氧基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-22)
步骤1:向N-羟基乙酰亚氨酸乙酯(520mg,5.04mmol)在DMF(8.3mL)的溶液中加入3-溴丙-1-炔(500mg,4.2mmol)，然后加入NaOH(185mg,4.62mmol)。将反应物在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完全。将反应混合物倒入含有冰的饱和NH4Cl水溶液(30ml)中。将该混合物搅拌直至冰融化。将该混合物用EtOAc萃取(3X)。将合并的有机相用水和盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到N-丙-2-炔-1-基氧基乙酰亚胺酸乙酯，为黄色油状物。MS m/z142.1(M+1)。保留时间1.177min。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.52(d,J＝2.4Hz,2H),4.06(m,2H),2.42(t,J＝2.4Hz,1H),1.96(s,3H),1.30-1.24(m,3H)。该物质不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤2:将(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(FP-3)(24mg,0.025mmol)和N-丙-2-炔-1-基氧基乙酰亚胺酸乙酯(6.9mg,0.049mmol)悬浮于叔丁醇(0.5mL)和水(1.0mL)中。将反应混合物经真空填充循环用N2脱气五次。加入L-抗坏血酸钠(4.9mg,0.025mmol)在H2O(0.25mL)中和CuSO4(0.8mg,0.005mmol)在H2O(0.25mL)中脱气的溶液，并将反应物在室温下搅拌3小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用20-70％梯度洗脱纯化，得到所需肟产物，MSm/z 1004.0(M+1)。保留时间1.226min。
步骤3:向步骤2的产物(17.5mg,0.017mmol)在MeOH(3.0mL)的溶液中加入盐酸(1M,0.095mL)。室温下30分钟后，LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用20-70％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-(氨基氧基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-22)。MS m/z 934.3(M+1)。保留时间0.882min。
实施例77：合成(S)-2-((4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-24)
步骤1:将(S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-2-氨基-3-甲基-1-氧代丁烷(7mg,0.009mmol)、2-氯-4-甲基嘧啶(5.6mg,0.044mmol)和DIEA(0.031mL,0.18mmol)在2-丙醇(2mL)中的溶液在密封瓶中150℃加热过夜。将粗物质经制备型HPLC用20-70％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-23),MS m/z 857.4(M+1)。保留时间1.241min。
步骤2:将(S)-2-((4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-23)(2.8mg,0.0029mmol)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1.2mg,0.0087mmol)悬浮于各0.5mL的叔丁醇和水中。将该混合物经真空填充循环用N2脱气五次。加入L-抗坏血酸钠(0.7mg,0.004mmol)在水(0.4mL)中和CuSO4(0.1mg,0.0007mmol)在水(0.1mL)中脱气的溶液。将反应物在室温下搅拌4小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经反相HPLC用20-70％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((4-甲基嘧啶-2-基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-24)。MS m/z 992.5(M+1)。保留时间1.077min。
实施例78：合成(S)-2-(3,3-二异丙基脲基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-26)
步骤1:向(S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-2-氨基-3-甲基-1-氧代丁烷HCl盐(7.5mg,0.0095mmol)在THF:DMF(1:1,1mL)的溶液中加入4-硝基苯基氯甲酸酯(3.2mg,0.016mmol)和DIEA(6.0mg,0.047mmol)。室温下10分钟后，LCMS指示所需氨基甲酸酯形成,蒸发除去THF。加入二异丙基胺(5.7mg,0.056mmol)，并将反应物在室温下搅拌1小时。将粗物质经制备型HPLC用40-80％梯度洗脱纯化，得到(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-(3,3-二异丙基脲基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-25),MS m/z 892.5(M+1)。保留时间1.493min。
步骤2:将(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-(3,3-二异丙基脲基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-25)(6.2mg,0.007mmol)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1.7mg,0.013mmol)在水-叔丁醇的1:2混合物(3mL)中的溶液用Ar脱气。向该脱气的溶液中加入硫酸铜(2.0mg,0.013mmol)和抗坏血酸钠(4.1mg,0.021mmol)的脱气的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并浓缩。将残余物经制备型HPLC用40-73％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-(3,3-二异丙基脲基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-26)。MSm/z 1027.5(M+1)。保留时间1.336min。
实施例79：合成N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)吗啉-4-甲酰胺(CL-28)
步骤1:向(S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-2-氨基-3-甲基-1-氧代丁烷HCl盐(7.5mg,0.0095mmol)在THF:DMF(1:1,1mL)的溶液中加入4-硝基苯基氯甲酸酯(3.2mg,0.016mmol)和DIEA(6.0mg,0.047mmol)。室温下10分钟后，LCMS指示所需氨基甲酸酯形成。蒸发THF。加入吗啉(4.9mg,0.056mmol)，并将反应物在室温下搅拌1小时。将粗物质经制备型HPLC用30-70％梯度洗脱纯化，得到N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)吗啉-4-甲酰胺(CL-27),MS m/z 878.4(M+1)。保留时间1.310min。
步骤2:将N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)吗啉-4-甲酰胺(CL-27)(6.3mg,0.007mmol)和1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1.7mg,0.013mmol)在水-叔丁醇的1:2混合物(3mL)中的溶液用Ar脱气。向该脱气的溶液中加入硫酸铜(1.9mg,0.013mmol)和抗坏血酸钠(1.9mg,0.0095mmol)的脱气的水溶液。将反应物在室温下搅拌1小时。将反应混合物浓缩，并经制备型HPLC纯化用30-60％梯度洗脱纯化，得到N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)吗啉-4-甲酰胺(CL-28)。MS m/z 1013.4(M+1)。保留时间1.122min。
实施例80：合成(S)-2-((1,3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-30)
步骤1:将HOBt(27.8mg,0.206mmol)在DCM(2mL)中的溶液加入2-氯-1,3-二甲基-4,5-二氢-1H-咪唑-3-鎓六氟磷酸盐(57.4mg,0.206mmol)和三乙胺(0.029mL,0.21mmol)在DCM(2mL)中的溶液。将反应物在室温下搅拌过夜。将反应混合物过滤，以收集2-((1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)氧基)-1,3-二甲基-4,5-二氢-1H-咪唑-3-鎓六氟磷酸盐为白色固体。MS m/z 232.1(M+)。保留时间0.324min。该物质不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤2:向(S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-2-氨基-3-甲基-1-氧代丁烷盐酸化物(30.6mg,0.038mmol)在DMF(2mL)的溶液中加入DIEA(0.033mL,0.191mmol)和2-((1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)氧基)-1,3-二甲基-4,5-二氢-1H-咪唑-3-鎓六氟磷酸盐(28.8mg,0.076mmol)。将反应物在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用20-70％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((1,3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-29),MSm/z 861.3(M+1)。保留时间1.090min。
步骤3:(S)-2-((1,3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-30)是按照(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-9)所述方法制备，除了用(S)-2-((1,3-二甲基咪唑烷-2-亚基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-29)。MS m/z 996.4(M+1)。保留时间1.118min。
实施例81：合成(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-羧基丁酰基)氨基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-32)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯
步骤1:将Pd/C(10％,wet,6.5mg)加入(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-叠氮基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(FP-3)TFA盐(30mg,0.031mmol)在水/乙醇(2mL/2mL)的溶液中。将反应物在H2中搅拌3小时。经过滤除去催化剂。将滤液浓缩，得到(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-氨基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-31),MS m/z 837.5(M+1)。保留时间0.993min。
步骤2:将(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-氨基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-31)(12mg,0.014mmol)和DIEA(0.0125mL,0.0715mmol)溶于DMF(1mL)。将所得溶液加入二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)戊二酸酯(7.0mg,0.022mmol)和DIEA(0.0125mL,0.0715mmol)在DMF(1mL)的溶液中。将反应物在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完全。将粗物质经制备型HPLC用20-70％梯度洗脱纯化，得到(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(5-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-5-氧代戊酰氨基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-32)。MS m/z 1048.5(M+1)。保留时间1.285min。
实施例82：合成(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基)氨基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-33)
将(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-氨基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-32)(15mg,14μmol)和DIEA(12μl)在DMF(1mL)的溶液中加入(1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(4.1mg,14μmol)和DIEA(12μl)在DMF(1ml)中的溶液。将反应物用铝箔覆盖，并在室温下搅拌1小时。经制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到化合物(CL-33)。MS m/z 1013.5(M+1)。保留时间1.203min。
实施例83：合成(1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)丙基)氨基甲酸酯(CL-34)
步骤1:向Boc-L-Phe-OH(65mg,0.25mmol)在DMF(2ml)的溶液中加入DIEA(142μl,1.02mmol)和HATU(85mg,0.225mmol)。将反应物搅拌15分钟，并随后加入(3-氨基丙基)氨基甲酸苄基酯(50mg,0.20mmol)在DMF(1ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并随后经制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到(S)-(3-(2-(叔丁氧基羰基)氨基-3-苯基丙酰氨基)丙基)氨基甲酸苄基酯。MS m/z 456.3(M+1)。保留时间1.225min。将由此得到的产物(81.2mg,0.18mmol)溶于甲醇HCl(3M,4ml)。在N2流下缓慢除去溶剂，使得Boc基团去除。从乙腈水混合物中冻干，得到(S)-苄基(3-(2-氨基-3-苯基丙酰氨基)丙基)HCl盐。MS m/z 356.2(M+1)。保留时间0.857min。
步骤2：向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(i-11)(14mg)在DMF(2ml)的溶液中加入DIEA(12.4mg,122μmol)和HATU(7.8mg,20μmol)。将反应物搅拌15分钟，并随后加入(S)-(3-(2-氨基-3-苯基丙酰氨基)丙基)氨基甲酸苄基酯(8mg,20μmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后经制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酰氨基)丙基)氨基甲酸苄基酯,为TFA盐。MS m/z 907.6(M+1)。保留时间1.149分钟。
步骤3:向步骤2中得到的产物(16.2mg,16μmol)在MeOH(2ml)的溶液中加入Pd/C(3.4mg,10％湿重)。将反应气体用H2置换。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后过滤并浓缩，得到(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((3-氨基丙基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺,MS m/z 773.6(M+1)。保留时间0.872min。
步骤4:将步骤3中得到的产物(13.3mg,15μmol)溶于DMF(1ml)，并加入DIEA(13μl)。将(1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯,(4.4mg,15μmol)溶于DMF(1ml)，并加入DIEA(13μl)。将两种溶液合并。室温下将反应混合物搅拌1小时，并随后经制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到化合物(CL-34)。MS m/z 949.6(M+1)。保留时间1.190min。
实施例84：合成(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((2-(氨基氧基)乙基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-35)
步骤1:0℃下将偶氮二甲酸二异丙酯(1.26ml,6.51mmol)逐滴加入N-(叔丁氧基羰基)乙醇胺(1.0g,6.2mmol)、N-羟基酞酰亚胺(1.01g,6.2mmol)和三苯基膦(1.71g,6.51mmol)在四氢呋喃(10ml)的混悬液中。将反应物搅拌，并加温至室温历经16小时。将反应混合物浓缩，并经快速色谱纯化(SiO2,乙酸乙酯/己烷,0％-50％)，得到[2-(1,3-二氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基氧基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯，为白色固体。MS m/z 207.1(M+1-Boc)。保留时间1.138min。0℃下将TFA(2ml)加入[2-(1,3-二氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基氧基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(1g,约60％纯度，2mmol)在DCM(10ml)的溶液中。将反应物缓慢加温至室温，并在室温下搅拌2小时。将反应混合物浓缩，得到2-(2-氨基乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮，为TFA盐。MS m/z 207.1(M+1)。保留时间0.780min。
步骤2:向Boc-L-Phe-OH(519mg,1.96mmol)在DMF(5ml)的溶液中加入DIEA(1.37ml,9.79mmol)和HATU(745mg,1.96mmol)。将反应物搅拌15分钟，并随后加入2-(2-氨基乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(627mg,1.96mmol)在DMF(3ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并经制备型HPLC纯化(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)，得到(S)-(1-((2-((1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)氧基)乙基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 454.2(M+1)。保留时间1.215min。将由此得到的产物(0.66g,1.5mmol)溶于DCM(6ml)，并在0℃下加入TFA(1.5ml)。将反应物缓慢加温至室温，并搅拌2小时。将反应混合物浓缩，得到(S)-2-氨基-N-(2-((1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)氧基)乙基)-3-苯基丙酰胺，为TFA盐。MS m/z 354.2(M+1)。保留时间0.698min。
步骤3:将DIEA(36μl,0.20mmol)和HATU(6.5mg,0.017mmol)加入(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(i-11)(11.6mg,17μmol)在DMF(1ml)的溶液中。将反应物搅拌15分钟，并随后(S)-2-氨基-N-(2-((1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)氧基)乙基)-3-苯基丙酰胺(11.7mg,017μmol)在DMF(1ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌2小时，并随后经制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)，纯化，得到(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-((2-((1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)氧基)乙基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺,为TFA盐。MS m/z 905.5(M+1)。保留时间1.110min。
步骤4:将步骤3中得到的产物(86mg,84μmol)在HCl(6M,6ml)中的溶液在室温下搅拌2天，使得反应完全。经制备型HPLC(20-45％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到化合物(CL-35)，为TFA盐。MS m/z 775.5(M+1)。保留时间0.859min。
实施例85：合成(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(氨基氧基乙酰基)氨基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-36)
步骤1:将(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-氨基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-31)(25mg,30μmol)和DIEA(26μl)在DMF(1.5ml)中的溶液与2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸酯(8.6mg,30μmol)和DIEA(26μl)在DMF(1.5ml)中的溶液合并。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并随后经制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(N-(叔丁氧基羰基)氨基氧基乙酰基)氨基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷，为TFA盐。MS m/z 1011.5(M+1)。保留时间1.079min。
步骤2:0℃下将TFA(0.4ml)加入步骤1中得到的产物(15.3mg,14μmol)在DCM(2ml)的溶液中。将反应物在0℃搅拌30分钟，然后加温至室温，并搅拌1小时。经制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到化合物(CL-36)，为TFA盐。MS m/z 910.5(M+1)。保留时间0.919min。
实施例86：合成(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((3R,4R,7S)-14-(氨基氧基)-7-苄基-4-甲基-5,8-二氧代-2,12-二氧杂-6,9-二氮杂十四烷-3-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺(CL-37)
步骤1:将2-(2-苄氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基氨基甲酸叔丁酯(1.5g,4.2mmol)和10％Pd-C(0.45g,0.42mmol)在EtOAc(25ml)中的溶液在室温下在氢气中搅拌5小时。经过滤除去悬浮的催化剂后，经浓缩除去溶剂，得到2-(2-氨基乙氧基)乙氧基氨基甲酸叔丁基酯。MS m/z 221.2(M+1)。保留时间0.451min。
步骤2:向Cbz-Phe(299mg,1.0mmol)在DMF(2ml)的溶液中加入DIEA(0.793ml,4.54mmol)和HATU(363mg,953μmol)。在室温下搅拌15分钟后，加入2-(2-氨基乙氧基)乙氧基氨基甲酸叔丁酯(200mg,0.908mmol)在DMF(2ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌2小时，并随后经制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到(S)-2-(2-(2-苄氧基羰基氨基-3-苯基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 502.3(M+1)。保留时间1.206min。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.58(s,1H),7.35-7.18(m,10H),6.74(s,1H),5.58(d,J＝7.6Hz,1H),5.07(s,2H),4.46-4.44(m,1H),3.94-3.92(m,2H),3.59-3.57(m,2H),3.46-3.34(m,4H),3.10-3.08(m,2H),1.46(s,9H)。
步骤3:经步骤1中所述方法除去Cbz基团，得到(S)-2-(2-(2-氨基-3-苯基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 368.5(M+1)。保留时间0.807min。
步骤4:将DIEA(19μl)和HATU(8.3mg,22μmol)加入(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(i-11)(15mg,22μmol)在DMF(1ml)的溶液中。将反应物搅拌15分钟，然后加入(S)-2-(2-(2-氨基-3-苯基丙酰氨基)乙氧基)乙氧基氨基甲酸叔丁酯(8.1mg,22μmol)在DMF(1ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后经制备型HPLC(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)纯化，得到((3R,4R,7S)-7-苄基-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-4-甲基-5,8-二氧代-2,12-二氧杂-6,9-二氮杂十四烷-14-基)氧基氨基甲酸叔丁酯,为TFA盐。MS m/z 919.6(M+1)。保留时间1.139min。
步骤5:0℃下将TFA(0.4ml)加入步骤4中得到的产物(13.8mg,13μmol)在DCM(2ml)的溶液中。将反应混合物在0℃搅拌30分钟，并随后在室温下搅拌1小时。经制备型HPLC纯化(20-70％乙腈-H2O，包含0.05％TFA)，得到化合物(CL-37)，为TFA盐。MS m/z 819.6(M+1)。保留时间0.868min。
实施例87：合成(3R,4R,7S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基7-苄基-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-4,9,12-三甲基-5,8,13-三氧代-2-氧杂-6,9,12-三氮杂十七烷-17-酸酯(CL-38)
化合物(CL-38)(MS m/z 998.5(M+1)；保留时间1.022min.)是按照实施例81的步骤2所述方法制备，除了用(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((7S,10R,11R)-7-苄基-5,10-二甲基-6,9-二氧代-12-氧杂-2,5,8-三氮杂十三烷-11-基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺,代替化合物(CL-31)。
实施例88：合成(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-羧基丁酰基)氨基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-39)的2,3,5,6-四氟苯基酯
化合物(CL-39)(MS m/z 1099.5(M+1)；保留时间1.197min.)是按照实施例81的步骤2所述方法制备，除了用二(2,3,5,6-四氟苯基)戊二酸酯代替二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)戊二酸酯.
实施例89：合成(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(3-(2-羧基乙氧基)丙酰基)氨基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-40)的全氟苯基酯
化合物(CL-40)(MS m/z 1147.4(M+1)；保留时间1.223min.)是按照实施例81的步骤2所述方法制备，除了用二(全氟苯基)3,3'-氧基二丙酸酯代替二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)戊二酸酯。
实施例90：合成(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-羧基丁酰基)氨基丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-41)的全氟苯基酯
化合物(CL-41)(MS m/z 1117.5(M+1)；保留时间1.220min.)是按照实施例81的步骤2所述方法制备，除了用二(全氟苯基)戊二酸酯代替二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)戊二酸酯。
辅酶A类似物的合成程序
实施例91：辅酶A的3-丁烯-2-酮加合物(CoA-1)
将辅酶A三锂盐(259mg,Sigma,assay>93％)溶于2.0mL磷酸盐缓冲液(包含EDTA)(100mM磷酸盐,5mM EDTA,pH7.5)。向反应混合物中加入3-丁烯-2-酮(29.0μL,Aldrich,99％)，将反应混合物在20℃放置75分钟。将全部反应混合物装载于ISCO C18Aq Gold15.5g柱上，其用100％H2O预平衡。将所需产物用100％H2O洗脱。将包含纯的所需产物的流份合并，并冻干，得到化合物CoA-1，为结晶状固体。MS(ESI+)m/z 838.2(M+1)。H-NMR(400MHz,D2O)δ8.525(s,1H),8.235(s,1H),6.140(d,1H,J＝7.2Hz),4.746(m,1H),4.546(bs,1H),4.195(bs,1H),3.979(s,1H),3.786(dd,1H,J＝4.8,9.6Hz),3.510(dd,1H,J＝4.8,9.6Hz),3.429(t,2H,J＝6.6Hz),3.294S(t,2H,J＝6.6Hz),2.812(t,2H,J＝6.8Hz),2.676(t,2H,J＝6.8Hz),2.604(t,2H,J＝6.8Hz),2.420(t,2H,J＝6.6Hz),2.168(s,3H),0.842(s,3H),0.711(s,3H)(注：部分与D2O重叠的峰未记录)。
实施例92:辅酶A的(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷加合物(CoA-2)
将化合物CL-9(2.0mg,2.0μmol)在100μL的DMSO中的溶液用溶于120μL水中的辅酶A三锂盐(2.4mg,3.0μmol)补充。通过加入750μL的75mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)将该反应混合物缓冲，在室温下将反应物振摇1小时后，将产物经制备型反相C18HPLC柱用10-90％乙腈水溶液(包含0.05％TFA)线性梯度洗脱纯化。将包含纯化产物的流份合并，并冻干，得到化合物CoA-2，为结晶状固体。MS(ESI+)m/z 883.5((M+2)/2)。保留时间0.89分钟。
实施例93：酮-辅酶A类似物CoA-(i-12)
通过将5mM化合物(i-12)与25mM的ATP在10μM金黄色葡萄球菌CoAA、25μM大肠杆菌CoAD和20μM大肠杆菌CoAE存在下在包含20mM MgCl2的50mM HEPES缓冲液(pH 8.0)中于37℃下反应约16小时，将化合物(i-12)转化为酮-官能化的CoA类似物CoA-(i-12)。经离心(20,817xg，2分钟)除去沉淀。用超滤法经截留分子量为10kDa的Amicon超离心过滤器将酶类从反应混合物中分离。该包含CoA-(i-12)的滤液不经进一步纯化而使用。化合物(i-12)向CoA类似物CoA-(i-12)的酶转化通过形成抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-12)-CL-35ADC(见表11、表12和实施例102)证实。
实施例94：叠氮化物-辅酶A类似物CoA-(i-13)
使用实施例93中所述方法将化合物(i-13)转化为酮-官能化的CoA类似物CoA-(i-13)，除了用化合物(i-13)代替化合物(i-12)。使用化合物CL-33的无铜点击化学是在50％(v/v)DMSO/H2O中在23℃下进行3小时，并将反应混合物在反相Acquity UPLC HSS T3柱(2.1mm x 50mm,Waters)用10-100％乙腈水溶液(包含0.05％TFA)以0.9mL/min流速梯度洗脱分离。质谱分析确认了CoA类似物CoA-(i-13)的结构。MS m/z 895.5((M+2)/2)。保留时间0.88分钟。
实施例95：酮-辅酶A类似物CoA-(i-14)
使用实施例93中所述方法将化合物(i-14)转化为酮-官能化的CoA类似物CoA-(i-14)，除了用化合物(i-14)代替化合物(i-12)。化合物(i-14)向CoA类似物CoA-(i-14)的酶转化通过形成抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-14)-CL-35 ADC(见表11、表12和实施例102)证实。
实施例96：酮-辅酶A类似物CoA-(i-15)
使用实施例93中所述方法将化合物(i-15)转化为酮-官能化的CoA类似物CoA-(i-15)，除了用化合物(i-15)代替化合物(i-12)。化合物(i-15)向CoA类似物CoA-(i-15)的酶转化通过形成抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-15)-CL-35 ADC(见表11、表12和实施例102)证实。
可比较的肽的合成程序
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(MC-MMAF)的合成
将MMAF-OMe(135mg,Concortis Biosystems)溶解在CH3CN(10mL)中。向得到的澄清溶液加入5mL水，随后加入0.375mL 1N氢氧化钠水溶液(合乎标准的,FisherScientific)。将反应混合物在21℃磁力搅拌18小时，此时LCMS分析指示反应完全。将反应混合物冷冻并冻干，得到MMAF钠盐。LCMS保留时间0.911分钟。MS(ESI+)m/z 732.5(M+1)。将在前面的反应中获得的整个MMAF钠盐溶解在10mL DMSO中。在另一个反应容器中，将EMCA(95mg)用HATU(165mg)和DIEA(0.126mL)的3.0mL DMSO溶液在21℃处理25min。将该活化的酯的整个反应混合物加入到MMAF钠盐的溶液中，并将反应混合物在21℃下搅拌3小时。将反应混合物在40mL EtOAc和20mL 5％柠檬酸水溶液之间分配。将有机层分离，并将水层用20mL EtOAc萃取。将合并的有机层用10mL饱和NaCl水溶液洗涤，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩。将残留物在ISCO CombiFlash仪器上使用ISCO C18gold 15.5g柱纯化。采用50％CH3CN的H2O溶液洗脱期望的物质，得到所需化合物，为白色固体。LCMS保留时间1.392分钟。MS(ESI+)m/z 925.6(M+1).
抗原结合部分
式(II)或(III)中的抗原结合部分(Ab)可以是与靶细胞类型选择性结合的任何部分。在一些方面，Ab是与主要或优先存在于癌症细胞的表面的抗原(例如肿瘤相关的抗原)特异性结合的抗体或抗体片段(例如抗体的抗原结合片段)。在一些方面，Ab是与细胞表面受体蛋白质或其它细胞表面分子、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、组织发育或分化相关(例如已知或怀疑在功能上促进它们)的分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调节的分子、涉及血管发生的分子或与血管发生相关的(例如已知或怀疑在功能上促进其)的分子特异性结合的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)。肿瘤相关的抗原可以是簇分化因子(即CD蛋白)。在本发明的一些方面，本发明的抗原结合部分与一种抗原特异性结合。在本发明的一些方面，本发明的抗原结合部分与文中描述的两种或更多种抗原特异性结合，例如，本发明的抗原结合部分是双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段。
示例性抗体或抗原结合片段包括但不限于抗-雌激素受体抗体、抗-孕酮受体抗体、抗-p53抗体、抗-HER-2抗体、抗-EGFR抗体、抗-组织蛋白酶D抗体、抗-Bcl-2抗体、抗-E-钙粘蛋白抗体、抗-CA125抗体、抗-CA15-3抗体、抗-CA19-9抗体、抗-c-erbB-2抗体、抗-P-糖蛋白抗体、抗-CEA抗体、抗-视网膜母细胞瘤蛋白抗体、抗-ras癌基因蛋白抗体、抗-Lewis X抗体、抗-Ki-67抗体、抗-PCNA抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD5抗体、抗-CD7抗体、抗-CD8抗体、抗-CD9/p24抗体、抗-CD1-抗体、抗-CD11c抗体、抗-CD13抗体、抗-CD14抗体、抗-CD15抗体、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体、抗-CD22抗体、抗-CD23抗体、抗-CD30抗体、抗-CD31抗体、抗-CD33抗体、抗-CD34抗体、抗-CD35抗体、抗-CD38抗体、抗-CD39抗体、抗-CD41抗体、抗-LCA/CD45抗体、抗-CD45RO抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD71抗体、抗-CD95/Fas抗体、抗-CD99抗体、抗-CD100抗体、抗-S-100抗体、抗-CD106抗体、抗-泛素抗体、抗-c-myc抗体、抗-细胞角蛋白抗体、抗-λ轻链抗体、抗-黑素体抗体、抗-前列腺特异性抗原抗体、抗-tau抗原抗体、抗-纤维蛋白抗体、抗-角蛋白抗体和抗-Tn-抗原抗体。
在一个实施方案中，式(II)或(III)的抗体-药物缀合物(ADC)的抗原结合部分与ErbB基因编码的受体特异性结合。抗原结合部分可以与选自EGFR、HER2、HER3和HER4的ErbB受体特异性结合。抗原结合部分可以是将与HER2受体的胞外域(ECD)特异性结合并抑制过表达HER2受体的肿瘤细胞的生长的抗体。抗体可以是单克隆抗体例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。人源化抗体可以是huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7或huMAb4D5-8(曲妥珠单抗)。抗体可以是抗体片段例如Fab片段。
式(II)或(III)中的抗原-结合部分包括但不限于针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)。此类肿瘤相关抗原是本领域已知的，并且可以使用本领域众所周知的方法和信息制备用于生产抗体。尝试发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶点，研究者已经考虑鉴定与在一种或多种正常非-癌症细胞上表达相比，特异性地在一种或多种特定类型的癌症细胞表面上表达的跨膜或其它肿瘤相关的多肽。通常，与在非癌症细胞的表面上表达相比，此类肿瘤相关的多肽更大量地在癌症细胞的表面上表达。此类肿瘤-相关的细胞表面抗原多肽的鉴定提升特异性靶向用于通过基于抗体治疗来破坏的癌症细胞的能力。
可用于本发明的免疫缀合物的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)包括修饰的或改造的抗体，例如修饰以引入半胱氨酸残基(Junutula JR,Raab小时，Clark S,BhaktaS,Leipold DD,Weir S,Chen Y,Simpson M,Tsai SP,Dennis MS,Lu Y等人:NatBiotechnol 2008,26:925-932)或其它反应性氨基酸包括Pcl、吡咯赖氨酸和非-天然氨基酸代替天然序列的至少一个氨基酸，从而提供用于缀合式(I)或其子式的化合物的抗体或抗原结合片段上的反应位点的抗体。例如抗体或抗体片段可以被修饰以引入Pcl或吡咯赖氨酸(W.Ou等人(2011)PNAS 108(26),10437-10442)或非天然氨基酸(J.Y.Axup,K.M.Bajjuri,M.Ritland,B.M.Hutchins,C.H.Kim,S.A.Kazane,R.Halder,J.S.Forsyth,A.F.Santidrian,K.Stafin,Y.Lu等人Proc Natl Acad Sci U S A,109(2012),16101–16106页；对于综述，参见C.C.Liu和P.G.Schultz(2010)Annu Rev Biochem 79,413-444；C.H.Kim,J.Y.Axup,P.G.Schultz(2013)Curr Opin Chem Biol.17,412-419)作为用于与药物缀合的位点。类似地，用于酶促缀合方法的肽标签可以引入抗体中(Strop P.等人ChemBiol.2013,20(2):161-7；Rabuka D.,Curr Opin Chem Biol.2010Dec；14(6):790-6；Rabuka D等人,Nat Protoc.2012,7(6):1052-67)。一个其它实例是使用4’-磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)，用于将辅酶A类似物缀合到肽标签如S6、A1和ybbR标签上(Grunewald J.等人,SITE-SPECIFIC LABELING METHODS AND MOLECULES PRODUCEDTHEREBY,PCT/US2013/043684)。用于将此类修饰的或改造的抗体与有效载荷或连接体-有效载荷组合进行缀合的方法是本领域已知的。来自大肠杆菌的突变AcpS PPTase(AcpSR26L-C119S)的蛋白序列列于表3(SEQ ID NO:25)。该重组酶包含C-末端的His6标签。
可用于本发明的抗原-结合部分(例如抗体和抗原结合片段)还可以具有其它修饰或被缀合至其它部分，例如但不限于聚乙二醇标签、白蛋白和其它融合多肽。
本文的实施例中所使用的抗体具有表3中所列的重链和轻链序列。这些抗体中的一部分被改造以包含用于与本发明化合物发生位点特异性缀合的半胱氨酸残基或PPTase酶标签。本文的实施例举例说明这些改造的抗体是用于式(II)或(III)的免疫缀合物的适合的抗体。此外，未改造的抗体还可以通过传统方法(Carter PJ,Senter PD,Antibody-drug conjugates for cancer therapy,Cancer J.2008,14(3):154-69；J.E.Stefano,M.Busch,L.Hou,A.Park,和D.A.Gianolio,p.145-171,和M.-P.Brun和L.Gauzy-Lazo,p.173-187in Antibody-Drug Conjugate,Methods in Molecular Biology,Vol.1045,编辑L.Ducry,Humana Press(2013))用于制备式(II)或(III)的免疫缀合物。
表3.抗体和酶实施例的氨基酸序列
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别是野生型抗-Her2抗体重链(HC)和轻链(LC)的全长氨基酸序列。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别是抗体20507和抗-Her2抗体的HC和LC恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:5是抗-Her2 LC-S159C和抗体20507-LC-S159C突变抗体的LC恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7分别是重链HC-E152C突变抗体20507和抗-Her2抗体以及两种抗体的重链HC-S375C突变体的恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:8分别是抗体20507和抗-Her2抗体的轻链LC-K107C突变体的氨基酸序列。SEQ ID NO:9分别是抗体20507和抗-Her2抗体的重链HC-K360C突变体的氨基酸序列。SEQ ID NO:10是抗体20507和抗-Her2的重链双半胱氨酸突变体HC-E152C和HC-S375C的恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:11是抗-Her2和抗体20507HC-ins388-A1抗体(其中A1标签被插在HC残基Glu388后)的突变重链的恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:14是抗-Her2抗体(其中ybbR标签被插在HC残基Glu388后)的突变重链的恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:15是抗-Her2抗体(其中ybbR-S2C标签(SEQ ID NO:21)被插在HC残基Glu388后)的突变重链的恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:16是抗-Her2抗体(其中A1-3aa标签(SEQ ID NO:22)代替残基S119、T120、K121、G122和P123)的突变重链的恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:17是抗-Her2抗体(其中S6-5aa标签(SEQ ID NO:23)经以下突变引入：P189G、S190D、S192L、L193S、G194W和T195L)的突变重链的恒定区的氨基酸序列。ID NO:18是抗-Her2抗体(其中S6-6aa标签(SEQ IDNO:24)经以下突变引入：S190D、S192L、L193S、G194W和T195L)的突变重链的恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:19是抗-Her2抗体(其中单半胱氨酸残基被插在HC残基Glu388后)的突变重链的恒定区的氨基酸序列。SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24分别是A1标签、ybbR标签、ybbR-S2C标签、A1-3aa标签、S6-5aa标签和S6-6aa标签的氨基酸序列。SEQ ID NO:13是使用的信号肽。突变或插入的Cys残基和A1、ybbR、ybbR-S2C、A1-3aa、S6-5aa和S6-6aa序列标签以粗体显示，并在相应突变链的序列中加下划线。在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的CDR序列加下划线。
抗体的产生
本发明的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)可以通过本领域已知的任何方式产生，包括但不限于重组表达、化学合成和抗体四聚体的酶消化，而全长单克隆抗体可通过例如杂交瘤或重组生产来获得。重组表达可以来自本领域中已知的任何适当的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本发明还提供了编码本文描述的抗体的多核苷酸，例如，编码重链或轻链可变区或包含如本文所述的互补决定区的片段的多核苷酸。
多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过编码抗体或其结合片段的现有的序列(例如，如在下面实施例中描述的序列)的PCR诱变来制备。核酸的直接化学合成可通过本领域中已知的方法来完成，所述方法例如Narang等人的磷酸三酯法，Meth.Enzymol.68:90,1979；Brown等人的磷酸二酯法，Meth.Enzymol.68:109,1979；Beaucage等人的二乙基磷酰胺酸法，Tetra.Lett.,22:1859,1981；和美国专利号4,458,066的固相支持法。通过PCR向多核苷酸序列引入突变可如以下文献所述进行，例如PCR Technology:Principles andApplications for DNA Amplification,H.A.Erlich(Ed.),Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等人.(Ed.),AcademicPress,San Diego,CA,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和Eckert等人,PCR Methods and Applications 1:17,1991。
在本发明中还提供了用于生产上述抗体或抗体片段的表达载体和宿主细胞。各种表达载体可被用来表达编码本发明的抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体都可用于在哺乳动物宿主细胞中生产抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体，典型地具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒和人类人工染色体(参见例如Harrington等人，Nat Genet 15:345,1997)。例如，可用于在哺乳动物(如人类)细胞中表达多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B&C(LifeTech.,San Diego,CA)、MPSV载体和本领域已知的用于表达其它蛋白质的大量其它载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP埃巴病毒的载体，痘苗病毒载体和Semliki森林病毒(SFV)。参见Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
表达载体的选择取决于将在其中表达所述载体的预期的宿主细胞。典型地，表达载体含有启动子和可操作地连接到编码本发明的抗体链或片段的多核苷酸的其它调节序列(例如，增强子)。在一些实施方案中，采用诱导型启动子，以防止除了诱导条件下之外的插入序列的表达。诱导型启动子包括，例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。转化的生物的培养物可以在非诱导条件下在不对编码表达产物被宿主细胞更好地耐受的序列的群体施加偏压的情况下进行扩增。除了启动子，其他调节元件也可能需要或期望用于本发明的抗体链或片段的有效表达。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其它序列。另外，表达的效率可以通过包含适合于使用的细胞系统的增强子而提高(参见例如Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于在哺乳动物宿主细胞中增加表达。
所述表达载体也可提供分泌信号序列位置，以形成具有通过插入的抗体序列编码的多肽的融合蛋白。更多的时候，插入的抗体序列在引入载体中之前连接于信号序列。用于接收编码抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。此类载体允许可变区作为与恒定区的融合蛋白一起表达，从而导致产生完整抗体或其片段。通常，此类恒定区是人的。
携带和表达本发明的抗体链的宿主细胞可以是原核或真核细胞。大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本发明的多核苷酸的原核宿主。适合使用的其它微生物宿主包括杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)，和其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和各种假单胞菌(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，还可以制作表达载体，其通常含有与宿主细胞(例如，复制起点)兼容的表达控制序列。此外，任何数量的多种众所周知的启动子可以存在，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自λ噬菌体的启动子系统。启动子通常任选地与操纵基因序列一起控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于起始和完成转录和翻译。其它微生物如酵母也可用于表达本发明的抗体或抗体片段。也可以使用与杆状病毒载体组合的昆虫细胞。
在一个方面中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的抗体和抗体片段。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常必死的或正常或不正常的永生的动物或人类细胞。例如，一些能够分泌完整免疫球蛋白的适当的宿主细胞系已被开发，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。表达多肽的哺乳动物组织细胞培养物的应用一般地讨论于例如Winnacker,From Genes to Clones(从基因到克隆),VCHPublishers,N.Y.,N.Y.,1987中。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(见，例如，Queen等人，Immunol.Rev.89:49-68,1986)，和必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。这些表达载体通常含有来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性和/或可调控的或可调节的。有用的启动子包括但不限于，金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域中已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主(一般参见Sambrook等人，同上)。其它方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹道方法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、融合到疱疹病毒结构蛋白VP22(Elliot和O'Hare,Cell 88:223,1997)、试剂增强的DNA吸收、和离体转导。对于重组蛋白的长期、高产量生产，稳定的表达往往会被期望。例如，稳定表达抗体链或结合片段的细胞系可以使用含有病毒复制起点或内源性表达元件和可选择的标记基因的本发明的表达载体来制备。在引入载体后，细胞可以在富集培养基中生长1-2天，然后将它们切换到选择培养基。可选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在使得成功表达引入序列的细胞在选择培养基中生长。抗性的、稳定转染的细胞可以使用适合于细胞类型的组织培养技术增殖。
实施例97：用于缀合研究的抗-Her2和抗体20507Cys和A1/ybbR标记的突变抗体的克隆
编码抗-Her2抗体的重链和轻链的可变区的DNA寡核苷酸(Carter P,Presta L,Gorman CM,Ridgway JB,Henner D,Wong WL,Rowland AM,Kotts C,Carver ME,Shepard HM.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,4285-4289.Humanization of an anti-p185her2antibody for human Cancer therapy(用于人类癌症治疗的抗-p185her2抗体的人源化))被化学合成并克隆到两种哺乳动物表达载体即包含人IgG1和人κ轻链的恒定区的pOG-HC和pOG-LC中，得到两种野生型构建体，分别是pOG-抗-Her2抗体HC和pOG-抗-Her2抗体LC。在这些载体中，抗体重链和轻链的在哺乳动物细胞中的表达是由CMV启动子驱动。载体在重链和轻链的N-端编码合成的24个氨基酸的信号序列MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA(SEQ ID NO:13)，以引导它们从哺乳动物细胞分泌。该信号序列已经被验证在293FreestyleTM细胞中在数百种哺乳动物蛋白中有效定向蛋白分泌(Gonzalez R,JenningsLL,Knuth M,Orth AP,Klock HE,Ou W,Feuerhelm J,Hull MV,Koesema E,Wang Y,ZhangJ,Wu C,Cho CY,Su AI,Batalov S,Chen小时，Johnson K,Laffitte B,Nguyen DG,SnyderEY,Schultz PG,Harris JL,Lesley SA.(2010)Proc Natl Acad Sci U S A.107:3552-7)。寡核苷酸定向诱变被用于制备抗-Her2抗体的LC-S159C突变体。化学合成对应于人κ轻链的恒定区中的LC-S159C的正义和反义引物(表4)。使用PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶(Stratagene)，以pOG-抗-Her2抗体HC和pOG-抗-Her2抗体LC作为模板进行PCR反应。在琼脂糖凝胶上证实PCR产物，并用DPN I处理，接着在DH5a细胞中转化(Klock等人,(2009)Methods Mol Biol.498:91-103)。
通过DNA测序证实野生型和Cys突变体构建体的序列。野生型抗-Her2抗体重链的全长氨基酸序列示为SEQ ID NO:1，而轻链的显示为SEQ ID NO:2(表3)。LC-S159C突变抗体的氨基酸序列显示于表3中，C159以粗体和下划线表示(SEQ ID NO:5)。在人IgG1重链和人κ轻链中的氨基酸残基根据Eu编号系统(Edelman等人,(1969)Proc Natl Acad Sci USA,63:78-85)编号。抗-Her2-LC-S159C抗体进一步克隆入含有抗生素选择标记物的载体中，所述抗生素选择标记物用于在含有相应抗生素的培养基中选择稳定转染的细胞克隆。使用在表4中列出的DNA引物和上述方法克隆另外的单Cys突变体(HC-E152C、HC-S375C、LC-K107C)和两个双Cys突变体(HC-E152/HC-S375C、HC-K360C/LC-K107C)。此外，使用标准定点诱变将单半胱氨酸残基插入CH3结构域的环区域。各个寡核苷酸的序列列于表4中。
类似地，克隆第二个抗体(抗体20507)的四种单Cys突变体(HC-E152C、HC-S375C、LC-K107C、LC-S159C)和两种双Cys突变体(HC-E152/HC-S375C、HC-K360C/LC-K107C)。抗体20507包含人IgG1重链和人κ轻链。抗体20507的重和轻链的恒定部分与抗-Her2抗体中的相应氨基酸序列相同。全部Cys突变体的恒定区的氨基酸序列如表3中所示，其中突变的Cys以粗体和下划线表示。
使用标准分子生物学技术将用于PPTase-介导缀合的编码A1标签(GDSLDMLEWSLM,SEQ ID NO:12)和ybbR标签(DSLEFIASKLA,SEQ ID NO:20)的DNA序列引入人IgG1重链并经DNA测序证实。表4列出了用于质粒pOG-抗-Her2抗体HC的PCR扩增的寡核苷酸序列(SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41)，获得HC-ins388-A1抗体和HC-ins388-ybbR抗体的重链的表达载体。表3显示HC-ins388-A1(SEQ ID NO:11)和HC-ins388-ybbR(SEQ ID NO:14)的重链恒定区的氨基酸序列。按照Eu编号系统将A1和ybbR肽标签(以粗体和下划线突出显示)插入残基Glu388后(Edelman等人,(1969)Proc Natl Acad Sci US A,63:78-85)。使用表4中列出的寡核苷酸(SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49)将ybbR标签的2位丝氨酸残基进一步突变为半胱氨酸(DCLEFIASKLA,SEQ ID NO:21)。所得HC-ins388-ybbR-S390C抗体(SEQ ID NO:15)的蛋白质序列如表3中所示。类似地，使用表4中列出的寡核苷酸将A1(SEQ ID NO:22)和S6(SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24)标签的截短版本克隆入抗-Her2抗体的CH1结构域。具有以粗体和下划线表示的截短肽标签的突变的重链(SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18)的恒定区的氨基酸序列如表3中所示。
编码A1标记的抗体20507(SEQ ID NO：11)的载体通过用抗体20507的抗体取代抗-Her2可变区来构建。恒定区的各蛋白质序列列于表3中。将编码抗-Her2 HC-ins388-A1和抗-Her2 HC-ins388-ybbR抗体的DNA序列进一步克隆到适合于选择稳定表达这些肽标记的抗体构建体的细胞系的载体中。
表4.用于克隆Cys和肽标记的突变抗体的突变引物的DNA序列。
实施例98:抗-Her2及抗体20507Cys和A1标记的突变抗体的制备
使用先前所述(Meissner,等人,Biotechnol Bioeng.75:197-203(2001))的瞬时转染法通过共转染重链和轻链质粒在293FreestyleTM细胞中表达抗-Her2-LC-S159C、抗-Her2 HC-ins388-C、抗-Her2 HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW、抗-Her2HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L、抗-Her2 HC-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L、抗-Her2 HC-ins388-ybbR-S390C、所有抗体20507Cys突变体和抗体20507HC-ins388-A1。在共转染中所用的DNA质粒按照制造商的方案用Qiagen质粒制备试剂盒制备。293FreestyleTM细胞在37℃、5％CO2下在FreestyleTM表达培养基(Invitrogen)中以混悬液培养。转染前一天，将细胞以0.7x106个细胞/ml分瓶到新鲜培养基中。在转染的当天，细胞密度通常达到1.5x106细胞/ml。使用PEI方法(Meissner等，2001同上)，将细胞用1:1比例的重链和轻链质粒的混合物转染。将转染的细胞进一步培养五天。通过在2000xg离心培养物20分钟收获培养物的培养基，并通过0.2微米的过滤器过滤。使用蛋白A-SepharoseTM(GEHealthcare Life Sciences)从过滤的培养基纯化表达的抗体。采用pH 3.0洗脱缓冲液从蛋白A-SepharoseTM柱洗脱抗体IgG。将洗脱的IgG溶液立即用1M Tris-HCl(pH 8.0)中和，随后缓冲液交换到PBS中。
抗-Her2-LC-S159C、抗-Her2-HC-ins388-A1和抗-Her2-HC-ins388-ybbR抗体的表达构建体也被转染到CHO细胞中。根据标准方案，然后使用抗生素选择稳定表达这些抗体的细胞。通过如上所述的蛋白A-琼脂糖(Sepharose)色谱法纯化在选择的CHO细胞克隆中表达的所有抗-Her2抗体构建体。
免疫缀合物
包含此类式(I)化合物及其子式作为有效载荷(药物)的本发明的免疫缀合物包括式(II)的缀合物:
其中：
Ab代表抗原结合部分；
L是选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-,-L1L2L3-、-L3L2L1-,-L1L2-、-L2L1-和-L1的连接体，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
y是1-16的整数；
R101是-NHC(＝O)NR6*-、-NHR121*-、或-NHC(＝O)R123*-，其中*代表与L的连接点；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R18或
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是四唑基、
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR11取代，
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R110是键或
R121是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元亚杂芳基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基；
R122是C-连接的包含1-2个独立地选自N、O和S的杂原子的5-6元亚杂环烷基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R123是N-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元亚杂环烷基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
包含此类式(I)化合物及其子式作为有效载荷(药物)的本发明的其它免疫缀合物包括式(III)的缀合物:
其中：
Ab代表抗原结合部分；
L是选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
y是1-16的整数；
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20或–NHR8；
R2是-C1-C6烷基；
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-OH、-N(R6)2、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6和C1-C6烷氧基；
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-C(＝O)OR12、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R113是
R117是键、-NH-、-NHS(＝O)2-、
R118是键、四唑基、
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10,
且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
本发明提供免疫缀合物，其包含一个或多个与抗原结合部分(例如抗体或抗体片段)连接的抗-有丝分裂细胞毒性肽。优选的本发明的免疫缀合物是本文描述的式(II)或(III)的那些。制备此类免疫缀合物的方法是本领域众所周知的。优选的免疫缀合物包括但不限于表6-14和实施例100至109中公开的那些，以及其变体，所述变体具有代替抗-Her2抗体的另外的抗原结合部分，特别是其中抗-Her2抗体被选自以下列表的抗体替换的此类缀合物：抗-雌激素受体抗体、抗-孕酮受体抗体、抗-p53抗体、抗-EGFR抗体、抗-组织蛋白酶D抗体、抗-Bcl-2抗体、抗-E-钙粘蛋白抗体、抗-CA125抗体、抗-CA15-3抗体、抗-CA19-9抗体、抗-c-erbB-2抗体、抗-P-糖蛋白抗体、抗-CEA抗体、抗-视网膜母细胞瘤蛋白抗体、抗-ras癌基因蛋白抗体、抗-Lewis X抗体、抗-Ki-67抗体、抗-PCNA抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD5抗体、抗-CD7抗体、抗-CD8抗体、抗-CD9/p24抗体、抗-CD1-抗体、抗-CD11c抗体、抗-CD13抗体、抗-CD14抗体、抗-CD15抗体、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体、抗-CD22抗体、抗-CD23抗体、抗-CD30抗体、抗-CD31抗体、抗-CD33抗体、抗-CD34抗体、抗-CD35抗体、抗-CD38抗体、抗-CD39抗体、抗-CD41抗体、抗-LCA/CD45抗体、抗-CD45RO抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD71抗体、抗-CD95/Fas抗体、抗-CD99抗体、抗-CD100抗体、抗-S-100抗体、抗-CD106抗体、抗-泛素抗体、抗-c-myc抗体、抗-细胞角蛋白抗体、抗-λ轻链抗体、抗-黑素体抗体、抗-前列腺特异性抗原抗体、抗-tau抗原抗体、抗-纤维蛋白抗体、抗-角蛋白抗体和抗-Tn-抗原抗体。
在一些实施方案中，式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物包含具有抗原-结合活性的抗体或抗体片段Ab，其中连接体L在Ab的半胱氨酸硫原子处连接至Ab。用于与半胱氨酸硫基团反应的典型反应基团和得到的形成基团列在表1中。通过与抗原结合部分的半胱氨酸残基反应形成的连接体构件的非限制实例包括但不限于
在某些实施方案中，式(II)或式(III)的免疫缀合物或其子式包含具有抗原结合活性的抗体或抗体片段Ab，其中连接体经与包含羟胺的式(I)化合物反应后形成的桥联的二硫化物与Ab连接。在某些实施方案中，式(II)和式(III)的免疫缀合物的连接体L的连接体构件是其经与包含羟胺的式(I)化合物反应后形成。
在某些实施方案中，式(II)或式(III)的免疫缀合物或其子式包含具有抗原结合活性的抗体或抗体片段Ab，其中连接体L在丝氨酸的游离–NH2位与Ab连接。该连接体构件经与抗原结合部分的丝氨酸残基的–NH2反应形成，其中p各自是1-10，且R各自独立地是H或C1-4烷基(优选甲基)，包括但不限于
在某些实施方案中，式(II)或式(III)的免疫缀合物或其子式包含具有抗原结合活性的抗体或抗体片段Ab，其中连接体L在改造为抗体的Pcl或Pyl基团位置与Ab连接。参见，例如Ou等人,PNAS 108(26),10437-42(2011)。经与Pcl或Pyl基团反应形成的连接体构件包括但不限于其中R20是H或Me，且R30是H、Me或苯基，用于连接，其中所示的酰基连接到工程化抗体中Pcl或Pyl的赖氨酸部分。
在某些实施方案中，式(II)或式(III)的免疫缀合物或其子式包含具有抗原结合活性的抗体或抗体片段Ab，其中连接体L在改造为抗体的S6、ybbR或A1肽中的丝氨酸残基位置与Ab连接。经与该丝氨酸残基反应形成的连接体构件包括但不限于
例如，用于形成式(II)的免疫缀合物的一项一般反应流程如以下流程32中所示：
流程32
其中RG1是表1中的反应基团1，且RG2是表1中的反应基团2，各基团(如表1中所示)的反应产物是连接体L的连接体构件。R101、R2、R3、L和Ab如本文所定义。
用于形成式(II)的免疫缀合物的另一项一般反应流程如以下流程33中所示：
流程33
其中RG1是表1中的反应基团1，且RG2是表1中的反应基团2，各基团(如表1中所示)的反应产物是连接体L的连接体构件。R101、R2、R3、L和Ab如本文所定义。
例如，用于形成式(III)的免疫缀合物的另一项一般反应流程显示在下面的流程34中:
流程34
其中RG1是来自表1的反应基团1，且RG2是来自表1的反应基团1，并且各基团的反应产物(见表1中)是连接体L的连接体构件。R1、R2、R113、L和Ab如本文所定义。
用于形成式(II)的免疫缀合物的另一个一般反应流程显示在下面的流程35中:
流程35
其中RG1是来自表1的反应基团1，且RG2是来自表1的反应基团2，并且各基团的反应产物(见表1中)是连接体L的连接体构件。R1、R2、R113、L和Ab如本文所定义。
在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物以及至少一种可药用的载体。该药物组合物可被配制用于特定的施用途径，例如静脉内施用、肠胃外施用等。
本发明的免疫缀合物一般被在水性缓冲液和/或等渗水溶液中配制成溶液或混悬液。它们典型地通过注射或输注胃肠外施用。它们的配制和施用方法类似于其他基于生物的制药如抗体治疗的那些配制和施用方法，并且是本领域中的技术人员中已知的。
某些注射用组合物是等渗水溶液或混悬液，栓剂可由脂肪性乳剂或混悬剂来制备。所述组合物可以被灭菌和/或含有辅助剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以含有其它治疗上有价值的物质。所述组合物分别按照常规的混合、制粒或包衣方法制备，并且含有约0.1-75％，或含有约1-50％的活性成分。
从某些式(I)的化合物获得的表3中列出的体外细胞杀伤效力表明此类式(I)化合物显示出有价值的药理活性，因此这些化合物可以用作ADC的有效载荷。如本文所证实，包含式(I)化合物的免疫缀合物在体外对靶细胞呈现出实质活性，并在体内对肿瘤呈现出实质活性，这由代表不同的人癌症的异种移植肿瘤的有效的生长抑制所证实。因此，包含与抗原结合部分例如抗体连接的式(I)和其子式的有效载荷的本发明式(II)或(III)的免疫缀合物还可用于治疗癌症例如胃瘤、骨髓瘤、结肠瘤、鼻咽瘤、食道瘤和前列腺瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如髓性白血病、淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多毛细胞白血病)、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、多发性骨髓瘤、膀胱瘤、肾瘤、胃瘤(例如胃肠道间质瘤(GIST))、肝癌、黑色素瘤和胰腺癌以及肉瘤。
本发明的一个实施方案提供式(I)和其子式化合物与抗原结合部分的缀合，从而形成本文所述的式(II)或式(III)的免疫缀合物。
包含式(I)或其子式化合物的本发明的免疫缀合物特别可用于治疗被抗-有丝分裂毒素抑制的本领域已知的癌症以及本文证实的对本发明的化合物和缀合物的抑制易感的那些肿瘤类型。适当的用于治疗的适应症包括但不限于胃瘤、骨髓瘤、结肠瘤、鼻咽瘤、食道瘤和前列腺瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如髓性白血病、淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多毛细胞白血病)、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、多发性骨髓瘤、膀胱瘤、肾瘤、胃瘤(例如胃肠道间质瘤(GIST))、肝癌、黑色素瘤和胰腺癌以及肉瘤。包含式(I)或其子式化合物的本发明的免疫缀合物特别可用于治疗。在进一实施方案中，所述治疗用于可以被抗-有丝分裂毒素治疗的疾病。在另一实施方案中，本发明化合物可用于治疗癌症，包括但不限于胃瘤、骨髓瘤、结肠瘤、鼻咽瘤、食道瘤和前列腺瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如髓性白血病、淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多毛细胞白血病)、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、多发性骨髓瘤、膀胱瘤、肾瘤、胃瘤(例如胃肠道间质瘤(GIST))、肝癌、黑色素瘤和胰腺癌以及肉瘤。
所述的方法典型地包括将有效量的本文所述的本发明的免疫缀合物或包含此类免疫缀合物的药物组合物施用至需要此治疗的个体。免疫缀合物可以通过任何适当的方法例如本文描述的那些施用，施用可以以由治疗医师选择的间隔重复进行。
因此，作为另一实施方案，本发明提供式(II)或(III)的免疫缀合物或本文描述的此类化合物的任何实施方案在制备药物中的用途。在另一实施方案中，所述药物用于治疗可以被抗-有丝分裂毒素治疗的疾病。在另一实施方案中，所述疾病选自胃瘤、骨髓瘤、结肠瘤、鼻咽瘤、食道瘤和前列腺瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、甲状腺癌、白血病(例如髓性白血病、淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T-谱系急性成淋巴细胞性白血病或T-ALL慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多毛细胞白血病)、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、多发性骨髓瘤、膀胱瘤、肾瘤、胃瘤(例如胃肠道间质瘤(GIST))、肝癌、黑色素瘤和胰腺癌以及肉瘤。
对于约50-100kg的个体，本发明的药物组合物或组合可以是约1-1000mg活性成分的单位剂量，或约1-500mg或约1-250mg或约1-150mg或约0.5-100mg或约1-50mg的活性成分。化合物、其药物组合物或组合的治疗有效剂量依赖于个体的物种、体重、年龄和个体状况、所治疗的病症或疾病或其严重程度。普通技术的医师、临床医师或兽医可以容易地确定预防、治疗或抑制病症或疾病的进展所需的各活性成分的有效量。
上面引用的剂量性质可在体外和体内试验使用哺乳动物例如小鼠、大鼠、狗、猴或离体器官、组织及其制品来证实。本发明的化合物可以以溶液例如水溶液的形式体外施用，和经肠、胃肠外、静脉内例如作为混悬液或水溶液体内施用。体外剂量可以在约10-3至10-12摩尔浓度之间。根据施用的途径，体内治疗有效量可以为约0.1-500mg/kg或约1-100mg/kg。
本发明的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物可以与一种或多种治疗共活性剂同时施用或在之前或之后施用。本发明的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物可以通过相同或不同的施用途径被单独施用或作为共活性剂在相同的药物组合物一起施用。
在一个实施方案中，本发明提供一种产品，其包含式(I)或其子式化合物和至少一种其它治疗共活性剂，其作为在治疗中同时、单独或顺序使用的组合制剂。在一个实施方案中，该治疗是用抗有丝分裂毒素进行的疾病或疾患如癌症的治疗。作为组合制剂提供的产品包括组合物，该组合物含有式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物和一起在同一药物组合物中的另外的治疗共活性剂，或分开形式例如药盒形式的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物和另外的治疗共活性剂。
在一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物，以及另外的治疗共活性剂。任选地，该药物组合物可包含可药用的载体，如上所述。
与本发明的化合物和缀合物一起使用的合适的共活性剂包括其它抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐药)、止痛药、抗炎剂、细胞保护剂及其组合。
考虑用于与本文公开的缀合物组合使用的具体共活性剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、柔红霉素盐酸盐柔红霉素柠檬酸盐脂质体注射液地塞米松、多西他赛多柔比星盐酸盐依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞磷胆碱)、羟脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤氨甲喋呤米托蒽醌Mylotarg、紫杉醇Phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生20与卡莫司汀植入物他莫昔芬柠檬酸盐替尼泊苷6-硫鸟嘌呤、塞替派、替拉扎明盐酸拓扑替康注射液长春碱长春新碱和长春瑞滨
在一个实施方案中，本发明提供包含两种或更多种分开的药物组合物的药盒，其中至少一种药物组合物含有式(II)或式(III)或其子式。在一个实施方案中，药盒包括用于分别容纳所述组合物的工具，诸如容器、分开的瓶或分开的箔包。
在本发明的组合治疗中，本发明的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物和其它治疗共活性剂可以由相同或不同的制造商制备和/或配制。此外，本发明的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物和其它治疗剂可以如下被一起引入组合治疗：(i)以将组合产品发放给医生之前(例如，在包括本发明的化合物和其它治疗剂的药盒的情况下)；(ii)施用前不久由医生自己(或在医师的指导下)；(iii)患者自己，例如在本发明的化合物和其它治疗剂的顺序施用期间。
本发明还提供用于用细胞毒性肽治疗疾病或疾患的方法的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物。本发明还提供用于用细胞毒性肽治疗疾病或疾患的方法的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物，其中式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物被制备与另外的治疗剂一起施用。本发明还提供用于用细胞毒性肽治疗疾病或疾患的方法的另外的治疗共活性剂，其中所述另外的治疗共活性剂被制备用于与式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物一起施用。本发明还提供用于用抗-有丝分裂毒素治疗疾病或疾患的方法的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物，其中式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物与另外的治疗共活性剂一起施用。本发明还提供用于用抗-有丝分裂毒素治疗疾病或疾患的方法的另外的治疗共活性剂，其中另外的治疗共活性剂与式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物一起施用。
本发明还提供了式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物用于与细胞毒性肽治疗疾病或疾患的用途，其中所述患者先前(例如24小时内)已用另外的治疗剂治疗。本发明还提供了另外的治疗剂用于与抗有丝分裂毒素治疗疾病或疾患的用途，其中所述患者先前(例如24小时内)已用式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物治疗。
本发明还提供用于用抗-有丝分裂毒素治疗疾病或疾患的方法中的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物。本发明还提供用于用抗-有丝分毒素治疗疾病或疾患的方法中的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物，其中式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物被制备用于与另外的治疗剂一起施用。本发明还提供用于用抗-有丝分毒素治疗疾病或疾患的方法中的另外的治疗共活性剂，其中另外的治疗共活性剂被制备用于与式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物一起施用。本发明还提供用于用抗-有丝分毒素治疗疾病或疾患的方法中的式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物，其中式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物与另外的治疗共活性剂一起施用。本发明还提供用于用抗-有丝分毒素治疗疾病或疾患的方法中的另外的治疗共活性剂，其中另外的治疗共活性剂与式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物一起施用。
本发明还提供了式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物用于用抗-有丝分毒素治疗的疾病或疾患的用途，其中所述患者先前(例如24小时内)已用另外的治疗剂治疗。本发明还提供了另外的治疗剂用于用抗有丝分裂毒素治疗的疾病或疾患的用途，其中所述患者先前(例如24小时内)已用式(II)或式(III)或其子式的免疫缀合物治疗。
连接体-有效载荷(L-P)与抗原结合部分的缀合
实施例99:使用工程化Cys突变抗体制备抗体药物缀合物
连接体-有效载荷与抗原结合部分缀合的许多方法在本领域中是已知的(综述于例如：Antibody-Drug Conjugate,Methods in Molecular Biology,Vol.1045,编辑L.Ducry,Humana Press(2013))。在本实例中，如Junutula JR,Raab H,Clark S,Bhakta S,Leipold DD,Weir S,Chen Y,Simpson M,Tsai SP,Dennis MS,Lu Y,Meng YG,Ng C,YangJ,Lee CC,Duenas E,Gorrell J,Katta V,Kim A,McDorman K,Flagella K,Venook R,RossS,Spencer SD,Lee Wong W,Lowman HB,Vandlen R,Sliwkowski MX,Scheller RH,PolakisP,Mallet W.(2008)Nature Biotechnology 26:925-932中所描述，将包含连接体的本发明化合物缀合到改造进入抗体的半胱氨酸残基上。例如，本文仅通过一小组的Cys抗体突变体举例说明本发明化合物的缀合，但是可以预料的是，该化合物可以缀合到大多数(如果不是所有的话)可能的Cys抗体突变体。
因为在哺乳动物细胞中表达的抗体中的改造的Cys在它们的生物合成过程中被加合物(二硫化物)如谷胱甘肽(GSH)和/或半胱氨酸修饰(Chen等人2009)，最初所表达的产物中的经修饰的Cys对硫醇基反应试剂如马来酰亚氨基或者溴-或碘-乙酰胺基团是非反应性的。为了在表达后缀合改造的半胱氨酸，需要通过还原这些二硫化物除去谷胱甘肽或半胱氨酸加合物，这通常还需要还原在表达抗体中的天然二硫化物。这可以通过首先暴露抗体于还原剂如二硫苏糖醇(DTT)，随后进行允许对抗体的所有天然二硫键的再氧化，以恢复和/或稳定功能性抗体结构的操作来实现。因此，为了还原所有天然二硫键和改造的半胱氨酸残基的半胱氨酸或GSH加合物之间的二硫键，将新鲜制备的DTT加入到纯化的抗-Her2或抗体20507Cys突变构建体中，至10mM的终浓度。用DTT在37℃下孵育1小时后，将混合物在4℃采用PBS透析3天，每天更换缓冲液以除去DTT，并再氧化天然的二硫键。另一种方法是通过脱盐柱例如Sephadex G-25以除去还原剂。一旦蛋白质被完全还原，将1mM的氧化的抗坏血酸盐(脱氢抗坏血酸)加到脱盐样品中，并再氧化孵育20小时。全部方法产生类似的结果。然而，试图效仿以前在文献中描述的使用CuSO4的再氧化方案时，导致蛋白质沉淀(Junutula JR,Raab小时，Clark S,Bhakta S,Leipold DD,Weir S,Chen Y,Simpson M,Tsai SP,Dennis MS,Lu Y,Meng YG,Ng C,Yang J,Lee CC,Duenas E,Gorrell J,Katta V,Kim A,McDorman K,Flagella K,Venook R,Ross S,Spencer SD,Lee Wong W,Lowman HB,Vandlen R,Sliwkowski MX,Scheller RH,Polakis P,Mallet W.(2008)NatureBiotechnology 26:925)。再氧化恢复了链内二硫化物，而透析去除最初连接到抗体的改造的半胱氨酸上的半胱氨酸和谷胱甘肽。
再氧化后，将抗体缀合到包含连接体和反应性部分的式(I)化合物。例如，将具有连接的马来酰亚胺部分的化合物(相对于抗体10摩尔当量)加入到在PBS缓冲液(pH值7.2)中的重新氧化的抗-Her2或抗体20507Cys突变抗体。温育1小时。通过能够从非缀合抗体分离缀合抗体的反相HPLC监测缀合过程。将缀合反应混合物在PLRP-S柱进行分析(50mm x 2.1mm,Agilent)，加热至80℃，柱的洗脱通过30-60％乙腈的水溶液(含有0.1％TFA)的线性梯度进行，流速1.5ml/min。在280nm、254nm和215nm处监测抗体从柱的洗脱。
各种具有连接的马来酰亚胺的化合物与抗-Her2或抗体20507Cys突变抗体的缀合效率取决于使用的化合物的溶解性而不同，但大多数反应导致超过80％缀合物(表5和6)。为了评价聚集状态，将所得到的ADC在尺寸排阻色谱(Agilent Bio SEC3,7.8x150mm)以1mL/min流速在PBS中分析。所有的ADC主要是单体的。大多数ADC含有小于3％的二聚和寡聚物质(表5和6)，这表明该化合物与抗-Her2或抗体20507Cys突变抗体的缀合没有引起显著聚集。
该缀合物的特征还在于在细胞毒性肽与抗体结合部分的平均负载，通常被称为药物与抗体比(DAR)。该DAR值是从反相HPLC检测或从LC-MS分析推知。对于大部分连接体-有效载荷分子，与不同数量连接的药物分子的ADC可以容易地通过HPLC拆分。LC/MS还可以定量连接到ADC中的抗体的有效载荷(药物)的平均分子数目。对于LC-MS分析，ADC通常被还原且去糖基化。LC根据每个链的连接体-有效载荷基团的数量将被还原抗体的重链(HC)和轻链(LC)分离。质谱数据能够鉴定混合物中的组分种类，例如，LC、LC+1、LC+2、HC、HC+1、HC+2等。从LC和HC链上的平均负载，可以计算ADC的平均DAR。给定的缀合物样品的DAR表示连接到含有两条轻链和两条重链的典型抗体的药物(有效载荷)分子的平均数目。进行LC/MS和/或HPLC检测。两种方法所得的DAR值一致。表5和6给出了抗-Her2或抗体20507Cys突变抗体和具有连接的马来酰亚胺的某些式(I)化合物的ADC经HPLC或ESI-MS获得的DAR值。
作为比较，按照上述方案，还将抗-Her2-LC-S159C和抗体20507-HC-E152C突变抗体与马来酰亚氨基己酰基单-甲基澳瑞他汀F(MC-MMAF；Doronina SO,Mendelsohn BA,Bovee TD,Cerveny CG,Alley SC,Meyer DL,Oflazoglu E,Toki BE,Sanderson RJ,Zabinski RF,Wahl AF,Senter PD.Bioconjug.Chem.2006Jan-Feb；17(1):114-24.)缀合。两个比较物ADC的选择的性质也列于表5和6中。
利用我们的抗体中在重链或轻链中经工程改造的单个Cys突变位点，最多两个有效载荷分子可以与各抗体分子缀合以产生DAR 2 ADC。为了增加每个抗体的有效载荷数量，我们还创建了抗体构建体，通过不仅在重链和轻链中引入Cys突变位点、还在重链中引入两个Cys突变位点而包含每个抗体分子四个Cys突变位点。例如，将抗-Her2-HC-E152C-S375C、抗体20507-HC-K360C-LC-K107C和抗体20507-HC-E152C-S375C Cys突变抗体与化合物CL-9缀合。三个ADC的选择的性质如表5和6中所示。化合物CL-9与双Cys抗体突变体有效缀合，生成具有3.9-4的DAR的ADC。DAR 4 ADC的缀合是同样有效的，并且所得到的ADC与DAR 2 ADC一样是单体的。
表5.各种抗-Her2 Cys突变体ADC的性质
a由突变的抗体的描述和化学缀合步骤中使用的化合物的描述构成的名字。
b通过反相HPLC测量缀合效率，其描述抗体转化至ADC的百分比。
c根据反相HPLC的药物-抗体比例。
d通过分析尺寸排阻色谱法测量聚集。寡聚体百分比包括二聚和寡聚种类。
表6.各种抗体20507Cys突变体ADC的性质
a由突变的抗体的描述和化学缀合步骤中使用的化合物的描述构成的名字。
b通过反相HPLC测量缀合效率，其描述抗体转化至ADC的百分比。
c根据反相HPLC的药物-抗体比例。
d通过分析尺寸排阻色谱法测量聚集。寡聚体百分比包括二聚和寡聚种类。B.L.Q，低于定量限。
实施例100：通过酶促缀合进行ybbR-标记的抗-Her突变抗体与化合物CoA-2的肽-标记的抗体-缀合的抗体药物的一步制备
天然导致蛋白质的翻译后修饰的一些酶促过程可以被重新用于有效地将结构不同的小分子缀合到蛋白质(Rabuka D,Rush JS,deHart GW,Wu P,Bertozzi CR.NatProtoc.(2012)7:1052-1067)(Strop P,Liu SH,Dorywalska M,Delaria K,Dushin RG,Tran TT,Ho WH,Farias S,Casas MG,Abdiche Y,Zhou D,Chandrasekaran R,Samain C,Loo C,Rossi A,Rickert M,Krimm S,Wong T,Chin SM,Yu J,Dilley J,Chaparro-RiggersJ,Filzen GF,O'Donnell CJ,Wang F,Myers JS,Pons J,Shelton DL,Rajpal A.ChemBiol.(2013)20:161-167)(Tsukiji S,Nagamune T.Chembiochem (2009)10:787-798)(YinJ,Straight PD,McLoughlin SM,Zhou Z,Lin AJ,Golan DE,Kelleher NL,Kolter R,WalshCT(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:15815-15820),(Zhou Z,Cironi P,Lin AJ,XuY,Hrvatin S,Golan DE,Silver PA,Walsh CT,Yin J.ACS Chem Biol.(2007)2:337-346)。例如，我们先前已证明由4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)催化的翻译后修饰可用于产生化学上确定的同源ADC(Gruenewald等人，WO2013184514)。通过将11-12聚体的A1、S6或ybbR肽插入IgG1抗体的恒定区的表面暴露的环中来实现细胞毒性化合物的位点特异性缀合。这些肽标签用作Sfp和AcpS PPTase的识别元件，其通过磷酸二酯键形成催化辅酶A(CoA)连接的细胞毒性药物与不变的丝氨酸残基的共价连接。PPTase催化的生物正交性进一步使得能够在细胞培养基中用CoA类似物直接标记肽标记的抗体。尽管以下实施例描述了仅一个位点的PPTase介导的ADC形成，但该方法预期可应用于抗体骨架内的许多插入位点，并且预期可应用于其它抗体。
PPTase作为多种酶，其接受多种CoA报道分子类似物作为底物(La Clair JJ,Foley TL,Schegg TR,Regan CM,Burkart MD(2004)Chem.Biol.11:195-201)。细胞毒性CoA-肽类似物(CoA-2,与CoA共价连接的CL-9，见实施例92)经酶促缀合至抗-Her2抗体的插入的ybbR序列上。具体而言，将2.5μM抗-Her2-HC-ins388-ybbR抗体与50μM CoA-2(相对于抗体20摩尔当量)在2μM来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的Sfp PPTase的存在下缀合。将该反应在添加了20mM NaCl和12.5mM MgCl2的75mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中于室温下进行约16小时。缀合后，通过蛋白A亲和色谱使用rmp蛋白A Sepharose Fast Flow树脂(GE Healthcare Life Sciences)除去Sfp PPTase和过量试剂。用约6床体积的0.1M乙酸钠缓冲液(pH 2.8)进行亲和树脂的洗脱，然后用25％(v/v)的1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)立即中和。使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)将ADC最终缓冲液交换到PBS中。
在加热至80℃的PLRP-S柱(50mm x 2.1mm,Agilent Technologies)上，通过反相分析HPLC，使用30-60％乙腈水溶液线性梯度(包含0.1％TFA，流速为1.5mL/min)测定有效载荷缀合的程度。在280nm、254nm和215nm监测缀合和非缀合抗体的反相分离。通过获得还原和去糖基化样品的解卷积的ESI-MS谱进一步确认酶促标记的ADC的特性。如表8中所示，观察的质量与药物标记的抗-Her2-HC-ins388-ybbR抗体重链的计算分子量一致。最后，通过分析型尺寸排阻色谱(AnSEC)在Bio SEC-3柱(Agilent Technologies)上检测酶促标记的ADC。该ADC的缀合效率、DAR和聚集(％)如表7中所示。
表7.ybbR-标记的抗-Her2 ADC的性质
a HC-ins388是指在重链的残基Glu388后插入ybbR肽标签。最后的数字对应于化学缀合步骤中使用的化合物。
b通过反相HPLC测量缀合效率，其描述抗体转化至ADC的百分比。
c根据反相HPLC的药物-抗体比例。
d通过AnSEC测量聚集，并包括二聚和寡聚种类。
表8.ybbR-标记的抗-Her2 ADC的质谱分析
a HC-ins388是指在重链的残基Glu388后插入ybbR肽标签。最后的数字对应于化学缀合步骤中使用的化合物。
b在Agilent 6520Q-TOF仪器(Agilent Technologies)上检测的以道尔顿为单位的质量。
c对于缀合的重链预测的以道尔顿为单位的质量。
d对于未偶联的重链预测的以道尔顿为单位的质量。
实施例101：通过酶促缀合进行肽-标记的抗-Her和抗体20507突变抗体与式(I)化合物的肽标记的抗体-缀合的抗体药物缀合物的两步制备
ADC制备可以使用一步法(参见实施例100)进行，其中以CoA部分为特征的细胞毒性化合物直接并酶促缀合，或ADC制备可以使用两步法，其中抗体首先与CoA或CoA类似物酶促缀合，随后在第二步中用细胞毒性化合物进行化学修饰。
两步骤方法的一种方法使用稳定的细胞系，将标记有A1、S6或ybbR肽的抗体或截短的标签(参见表3)和PPTase共同分泌到培养基中。在该两步骤方法的第一步骤中，在培养基中添加包含表1中所列的任何一种反应性基团的CoA类似物。随后的PPTase催化提供用来自表1的反应性基团官能化的相应抗体。在第二步骤中，将纯化的官能化抗体与用互补反应性基团活化的细胞毒性药物反应。这种两步骤方法的优点是不需要分别表达和纯化PPTase，并可以使用无毒的生物正交CoA类似物，从而允许在细胞毒性有效载荷偶联之前纯化无毒的官能化抗体。这可以促进PPTase标记的ADC按比例放大到生产水平。
或者，两步骤方法可以涉及产生用A1、S6或ybbR肽或截短标签(参见表3)标记的抗体，其在暴露于CoA类似物和PPTase混合物前纯化。该混合物含有PPTase，其共价连接含有表1中所列的任何一种反应性基团的生物正交CoA类似物，从而产生用表1的反应性基团官能化的相应抗体。随后将该官能化抗体纯化。在第二步中，通过使纯化的官能化抗体与用与来自步骤1的官能化抗体的反应性基团反应的反应性基团官能化的细胞毒性化合物(有效载荷)反应来实现细胞毒性化合物的共价缀合/连接。随后将所得ADC纯化。
为了证明两步骤方法，将后一种方法用于位点特异性地标记通过将酮-CoA类似物(实施例91：化合物CoA-1)酶促缀合至A1标记的抗体而制备的ADC，从而形成酮官能化的抗体，随后将其纯化并与具有烷氧基胺部分的式(I)的化合物(化合物CL-22)反应。
具体而言，制备在重链残基Glu388之后(根据Eu编号系统)插入A1肽的两个IgG1抗体(抗-Her2-HC-ins388-A1和抗体20507-HC-ins388-A1)(实施例98)。然后在2μM枯草芽孢杆菌Sfp存在下，使30μM酮官能化的CoA(化合物CoA-1)(相对于抗体12摩尔当量)与2.5μM抗体20507-HC-ins388-A1反应。相同的底物和酶浓度用于与抗-Her2-HC-ins388-A1抗体的相应缀合反应。两种酶反应在含有12.5mM MgCl2和20mM NaCl的75mM Tris缓冲液(pH 8.0)中在23℃下进行约16小时。缀合后，通过蛋白A亲和色谱(Protein A-SepharoseTM,GEHealthcare Life Sciences)纯化两种抗体构建体，以除去过量的试剂和酶。用75mM乙酸钠缓冲液(pH 3.0)进行抗体洗脱。立即用1M Tris缓冲液(pH 8.0)中和酸性溶液，随后使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)将缓冲液更换成PBS。对于ESI-MS分析，将缓冲液交换的抗体构建体去糖基化并还原。ESI-MS分析证实酮官能化的抗体(抗-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1和抗体20507-HC-ins388-A1-CoA-1)的形成(表9)。
向包含2.5％(v/v)DMSO的酮官能化抗体(25μM抗-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1或抗体20507-HC-ins388-A1-CoA-1)在100mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)的溶液中，加入500μM氨基氧基-官能化化合物(化合物CL-22)(相对于抗体20倍摩尔过量)，并在23℃孵育2天。通过尺寸排阻色谱纯化除去过量的试剂。去糖基化和还原样品的ESI-MS分析证实了肟连接的ADC，即抗-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22和抗体20507-HC-ins388-A1-CoA-CL-22(表9)的形成。与化学缀合至Cys突变体抗体(实施例99)类似，通过插入的A1肽的酶促缀合也以约95％(表11)的高效率进行，并获得具有小于1％的可检测的聚集体的单体缀合物(表10)。
该两步骤方法也用于将式(I)化合物连接到在CH1结构域和CH3结构域的位点包含ybbR和S6-5aa标签的抗-Her2抗体。PPTase催化用于将生物正交酮基团(CoA-1)位点特异性地酶促缀合到抗-Her2抗体的嵌入的ybbR和S6-5aa标签上。抗-Her2-HC-ins388-ybbR抗体在与上述用于与A1标签酶促缀合完全相同的条件下与CoA-1缀合，不同之处在于使用降低浓度的1.5μM Sfp PPTase。如上所述用于与A1标签酶促缀合的相同条件也用于缀合抗-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L(含有S6-5aa标签)，除了使用升高浓度的CoA-1(100μM)和Sfp PPTase(3μM)。通过蛋白A亲和色谱(MabSelect SuRe TM树脂，GEHealthcare Life Sciences)除去Sfp PPTase和过量的酮-CoA类似物(CoA-1)后，将酮激活的抗体，即抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-1和抗-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L-CoA-1用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific)洗脱。使用PD-10脱盐柱(GEHealthcare)将中和的抗体溶液缓冲液交换为PBS。
然后，两步骤方法的第二步骤包括将细胞毒性有效载荷通过随后的肟连接位点特异性地连接于酮激活的抗体；抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-1和抗-Her2-HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L-CoA-1。具体而言，在包含6.7％(v/v)DMSO的100mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)中将67μM的抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-1与二十倍过量的化合物CL-22或化合物CL-35(1.33mM)在37℃下缀合约16-24小时。除了较低的DMSO浓度(5.0％(v/v))外，使用相同的缀合条件将1.0mM化合物CL-35缀合至67μM的酮官能化的抗体，即抗-Her2HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L-CoA-1。缀合后，通过在HiLoad 26/600Superdex 200制备级柱(GE Healthcare)上或在HiLoad 16/600Superdex 200制备级柱(GEHealthcare)上的制备型尺寸排阻色谱除去过量的氨基氧基试剂。通过在PLRP-S柱(5μm，50×4.6mm，Agilent Technologies，在30-60％乙腈水溶液(包含0.1％三氟乙酸)中的5分钟线性梯度，流速为1.5mL/min，柱温为80℃)中的分析性反相HPLC测定药物与抗体的比率。在280nm的波长下监测HPLC迹线，随后对缀合的和非缀合的抗体的峰积分。对于使用这种两步骤方法获得的ADC，表9比较了预期质量与观察质量，表10示出了缀合效率、DAR和聚集。
表9.酶促缀合的ADC的表征
a HC-ins388-A1和HC-ins388-ybbR分别是指按照Eu编号系统在重链的Glu388后插入A1肽或ybbR肽。剩余的数字描述了在缀合步骤中使用的CoA类似物和化合物。抗-Her2-HC-ins388-A1、抗-Her2-HC-ins388-ybbR、抗-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L和抗体20507-HC-ins388-A1首先与化合物CoA-1酶促缀合，然后与化合物CL-22或CL-35进行肟连接。
b在Agilent 6520Q-TOF仪器(Agilent Technologies)上检测的以道尔顿为单位的质量。
c对缀合的重链预测的以道尔顿为单位的质量。
d对未偶联的重链预测的以道尔顿为单位的质量。
e预测的质量基于N-末端谷氨酰胺残基的焦谷氨酸形成。
表10.酶促缀合的ADC的性质
a HC-ins388-A1和HC-ins388-ybbR分别是指按照Eu编号系统在重链的Glu388后插入A1肽或ybbR肽。剩余的数字描述了在缀合步骤中使用的CoA类似物和式(1)化合物。抗-Her2-HC-ins388-A1、抗-Her2-HC-ins388-ybbR、抗-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L和抗体20507-HC-ins388-A1首先与化合物CoA-1酶促缀合，然后与化合物CL-22或CL-35进行肟连接。
b通过反相HPLC测量缀合效率，其描述抗体转化至ADC的百分比。
c根据分析型反相HPLC的药物-抗体比例。
d通过分析尺寸排阻色谱法测量聚集，并包括二聚和寡聚种类。
e DAR和缀合效率是基于HPLC峰高估算。
*ND：未测定，NA：不适用
实施例102：使用化学酶促合成的CoA类似物的抗体-药物缀合物的两步制备
在两步骤标记方法的另一方面，使用CoA生物合成酶CoAA、CoAD和CoAE在化学酶促作用下制备修饰的CoA类似物(Worthington AS,Burkart MD(2006)Org.Biomol.Chem.4:44-46)(Kosa NM,Haushalter RW,Smith AR,Burkart MD(2012)Nat Methods 9:981-984)。采用该方法，分别从相应的泛酸盐前体分子i-12、i-14和i-14制备了酮官能化的CoA类似物CoA-(i-12)、CoA-(i-14)和CoA-(i-15)(实施例93、95和96)。同样，从相应的泛酸盐衍生物i-13(实施例94)化学酶促合成叠氮化物官能化的CoA类似物CoA-(i-13)。
使用CoA类似物CoA-(i-12)、CoA-(i-13)和CoA-(i-14)(参见实施例93-95)的粗制剂与终浓度为约30μM的抗-Her2-HC-ins388-ybbR抗体(2.5μM)缀合。在1.5μM枯草芽孢杆菌Sfp PPTase的存在下，在添加有12.5mM MgCl2和20mM NaCl的75mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，在23℃下进行标记约16小时。类似地，在其它相同条件下，在2μM Sfp酶的存在下，将约25μM的CoA-(i-15)(在实施例96中制备)与2.5μM的抗-Her2-HC-ins388-ybbR抗体缀合。化学酶促合成的CoA类似物的缀合进一步证实了不同的标记位点。与上述缀合反应类似，在3μM Sfp酶存在下，将2.5μM抗-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L抗体与约100μMCoA-(i-12)在添加有12.5mM MgCl2和20mM NaCl的75mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中偶联。将反应混合物在23℃孵育约16小时。与上述标记反应相反，来自大肠杆菌的突变AcpS PPTase AcpS R26L-C119S用于将CoA-(i-12)或CoA-(i-14)(各400μM)缀合至抗-Her2 HCS190D-S192L-L193S-G194W-T195L抗体(10μM)。使用40μM的该突变酶的最终浓度，在含有10mM MgCl2的76mM HEPES缓冲液(pH 7)存在下，在37℃下进行偶联反应16小时。同样的反应条件还用于将抗-Her2 HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW抗体(10μM)与CoA-(I-13)(333μM)在40μM AcpS R26L-C119S突变体存在下缀合。使用MabSelectSuRe TM树脂(GE Healthcare Life Sciences)或rProtein A Sepharose Fast Flow树脂(GE Healthcare Life Sciences)对所有生物正交标记的抗体进行亲和纯化。纯化后，将中和的抗体溶液缓冲交换到PBS中。通过用PNGase F和TCEP处理样品后的质谱分析证实酮和叠氮部分与工程化抗体的共价连接(表11)。
具有酮和叠氮部分的位点特异性抗体标记分别实现通过肟连接和无铜点击化学的随后的有效负载缀合，作为双步骤方法的第二步骤。将酮激活的抗体，即抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-12)和抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-14)(各自67μM)在37℃下，在包含7至13％(v/v)DMSO的100mM乙酸钠缓冲液(pH 4)中与20倍过量的氨基氧基-官能化的有效载荷CL-22和CL-35(各1.33mM)反应约16小时。抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-14)与化合物CL-36和CL-37的肟连接在相同条件下进行，除了pH值较高为5。类似地，在37℃下使67μM的抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-15)在包含5％(v/v)DMSO的100mM乙酸钠缓冲液(pH4)中与15倍过量的CL-22和CL-36(各1.0mM)反应约16小时。将孵育时间延长至2天，以便用CL-37(1.0mM)和CL-35(0.5mM)标记相同的抗体构建体。该缀合策略扩展到不同的标记位点，将抗-Her2 HC-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L-CoA-(i-14)和抗-Her2 HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW-CoA-(i-14)(各60μM)在含有5％(v/v)DMSO的190mM乙酸钠缓冲液(pH 5)中与15倍过量的CL-22有效载荷(0.9mM)缀合。两次肟连接都在23℃孵育4天。还在37℃和pH5下，将抗-Her2 HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW-CoA-(i-14)(30μM)与CL-35(0.89mM)缀合约24小时。此外，在23℃下在含有2.5％(v/v)DMSO的200mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)中将抗-Her2 HC-S119G-T120D-K121S-G122L-P123D-ins123-MLEW-CoA-(i-15)(33μM)与CL-22有效载荷(500μM)缀合2天。最后，在37℃下将抗-Her2 HC-P189G-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L-CoA-(i-12)和抗-Her2HC-S190D-S192L-L193S-G194W-T195L-CoA-(i-12)(各67μM)与15当量的CL-35(1mM)在含有5％(v/v)DMSO的100mM乙酸钠缓冲液(pH 4)中缀合约16-24小时。
抗体标记后，通过制备型尺寸排阻色谱法在HiLoad 26/600Superdex 200制备级柱(GE Healthcare)上或在HiLoad 16/600 Superdex 200制备级柱(GE Healthcare)上除去过量的试剂。通过在PLRP-S柱(5μm，50×4.6mm，Agilent Technologies，在30-60％乙腈水溶液(包含0.1％三氟乙酸)中的5分钟线性梯度，流速为1.5mL/min，柱温为80℃)中的分析型反相HPLC测定药物与抗体的比率(DAR)。在280nm的波长下监测HPLC迹线，随后对缀合的和非缀合的抗体的峰积分。表11显示了用氨基氧基-肽类似物CL-22、CL-35、CL-36和CL-37标记的酮活化的抗-Her2抗体的质量，且表12显示这些标记抗体所观察的缀合效率、DAR和聚集。
叠氮部分与工程化抗体的位点特异性的连接允许通过无铜点击化学随后实现有效载荷缀合。这通过使用在二环[6.1.0]壬炔(BCN)官能化的有效载荷CL-33存在下用叠氮化物活化的抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-13)抗体进行的应变促进的炔-叠氮化物环加成来证明，其中将127μM抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-13)加入在添加有1M NaCl和6％(v/v)DMSO的100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中的10倍摩尔过量的BCN官能化的有效载荷CL-33(1.27mM)。在23℃孵育约16小时后，用MabSelect SuReTM树脂(GE Healthcare LifeSciences)经蛋白质A亲和色谱除去过量的BCN试剂。用IgG洗脱缓冲液(ThermoScientific)进行洗脱，随后用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8)中和，并缓冲交换至PBS中。表11显示了用BCN-官能化的有效载荷CL-33标记的叠氮化物-活化的抗-Her2抗体所获得的质量，且表12显示该ADC所观察的缀合效率、DAR和聚集。使用在10μL 50％的IgG Sepharose6Fast Flow(GE Healthcare)浆液中的10μg的用BCN官能化的有效载荷CL-33标记的该叠氮化物活化的抗-Her2抗体获得DAR值。树脂结合在23℃下和温和搅拌中进行1小时。在用PBS洗涤树脂后，亲和结合的ADC通过加入5μg PNGase F进行去糖基化，随后在37℃下孵育3小时。用PBS洗涤该亲和树脂除去PNGase F。接下来，使用1％甲酸洗脱去糖基化样品，然后立即用10M乙酸铵(pH 5)中和。为了有效地将抗体构建体还原为重链和轻链，向20μL洗脱液中添加包含6M胍盐酸盐和5μL的0.66M TCEP在10M乙酸铵中的溶液(pH 5)的10μL100mM甲酸钠缓冲液(pH 4.0)。在23℃孵育至少30分钟，将还原和去糖基化的样品注射到6550iFunnelQ-TOF LC/MS系统(Agilent Technologies)上。MassHunter定性分析软件(AgilentTechnologies)用于光谱记录和光谱去卷积的处理。
表11.包含生物正交CoA类似物的抗体和ADC的质谱分析
a HC-ins388-ybbR是指按照Eu编号系统在重链的Glu388后插入ybbR肽。剩余的数字描述了在缀合步骤中使用的CoA类似物和化合物。例如，抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-12)-CL-22首先与化合物CoA-(i-12)酶促缀合，然后与化合物CL-22进行肟连接。
b在Agilent 6520 Q-TOF仪器(Agilent Technologies)上检测的以道尔顿为单位的质量。
c对缀合的重链预测的以道尔顿为单位的质量。
d对未偶联的重链预测的以道尔顿为单位的质量。
e观察到的质量最可能对应于预期质量为50655.1Da的CoA类似物的伯胺(源自叠氮部分的还原)。
表12.包含生物正交CoA类似物的抗体和ADC的性质
a HC-ins388-ybbR是指按照Eu编号系统在重链的Glu388后插入ybbR肽。剩余的数字描述了在缀合步骤中使用的CoA类似物和化合物。例如，抗-Her2-HC-ins388-ybbR-CoA-(i-12)-CL-22首先与化合物CoA-(i-12)酶促缀合，然后与化合物CL-22进行肟连接。
b通过分析型反相HPLC测量缀合效率，并描述抗体转化至ADC的百分比。
c根据分析型反相HPLC的药物-抗体比例(DAR)。
d通过分析尺寸排阻色谱法测量聚集，并包括二聚和寡聚种类。
e通过ESI-MS测量结合效率并描述抗体转化为ADC的百分比。
f根据ESI-MS的药物-抗体比例。
g DAR和缀合效率是基于HPLC峰高估算。
*ND：未测定，NA：不适用
实施例103：通过部分还原非工程化抗体的天然二硫键来制备抗体药物缀合物
本发明的细胞毒性药物还可以使用涉及抗体部分还原的方法与非工程抗体的天然半胱氨酸残基缀合(Doronina,S.O.,Toki,B.E.,Torgov,M.Y.,Mendelsohn,B.A.,Cerveny,C.G.,Chace,D.F.,DeBlanc,R.L.,Gearing,R.P.,Bovee,T.D.,Siegall,C.B.,Francisco,J.A.,Wahl,A.F.,Meyer,D.L.,and Senter,P.D.(2003)Development ofpotent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancertherapy.Nat.Biotechnol.21,778-84)。在该实施例中，通过加入固体巯基乙基胺至终浓度为50mM并在37℃下将混合物孵育1小时，将浓度为5-10mg/ml的抗-Her2和抗体20507抗体的链间二硫键和链内二硫键首先在PBS(包含2mM EDTA)中部分还原。脱盐并加入1％w/v PS-20去污剂后，将该部分还原的抗体(1-2mg/ml)与0.5-1mg CL-9/10mg抗体在4℃下反应过夜。将所得ADC经蛋白质A色谱纯化。用PBS进行基线洗涤后，用50mM柠檬酸盐、pH 2.7,140mMNaCl洗脱该缀合物，中和并无菌过滤。所得ADC，即抗-Her2-CL-9和抗体20507-CL-9的平均DAR测定分别为4.1和3.9。抗-Her2-CL-9和抗体20507-CL9 ADC的选择的性质总结在表13中。
实施例104：使用1,3-二氯丙烷-2-酮重新连接非工程化抗体的天然二硫键来制备抗体药物缀合物
使用实施例103中的方法与非工程化抗体的天然半胱氨酸残基的缀合具有缺点，即天然稳定抗体的一些天然二硫键被破坏并在药物缀合后保持。在克服该缺点的替代方法中，抗体的链间和链内二硫键首先被还原，然后通过与1,3-二氯丙烷-2-酮的反应化学重新连接。在该方法中，抗体中的四个天然链间二硫键被三碳“酮桥”取代(流程36)。然后酮基可以在第二步中特异性地与细胞毒性药物偶联。所得ADC具有多达四个药物，其特异性连接在抗体的四个天然链间二硫键的位置。与传统缀合至部分还原的天然二硫化物(实施例103)不同，该实施例中制备的ADC更稳定。
在一个实施例中，通过标准方法并如上所述制备非工程化的重组抗体20507。纯化后，抗体20507按照流程36的两个步骤与细胞毒性药物缀合：
流程36
步骤1–还原天然二硫键桥和使用1,3-二氯丙烷-2-酮重新桥连：4℃下将TCEP·HCl(41.4μg,0.144μmol)加入抗体20507(1770μg,0.012μmol,147μL在0.25M Tris中，pH7.4)和1,3-二氯丙烷-2-酮(193μg,1.443μmol)的溶液中。将所得混合物在4℃保持4小时。然后将反应混合物用Zeba spin柱7K MWCO(0.5mL)用PBS(pH 7.4)作为洗脱缓冲液脱盐4次，得到修饰的抗体20507:144483Da(经PNGase F(New England Biolabs)去糖基化后)。ESI(洗脱剂A:水+0.1％甲酸,洗脱剂B：乙腈+0.04％甲酸。梯度:从3-80％B，在2min内–流速1.0mL/min。柱：Proswift Monolith 4.6*50mm 40℃)。
步骤2–细胞毒药物的缀合：将(S)-2-((二(二甲基氨基)亚甲基)氨基)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-N-1-(3-(4-(氨基氧基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基磺酰氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷(CL-22)(304μg,0.326μmol,3.04μL,在DMSO中)和3,5-二氨基苯甲酸(681μg,4.48μmol,2.27μL,在DMSO中)的溶液加入来自步骤1的修饰抗体的溶液(1200μg,0.0081μmol,118μL在PBS中的溶液，pH 7.4)中。将所得混合物在23℃保持15小时。然后将该反应混合物用Zeba spin柱7KMWCO(2mL)使用PBS(pH 7.4)作为洗脱缓冲液脱盐(3x)。所得ADC抗体20507-CL-22经MS测定具有平均DAR3.8。ADC的某些性质如表13中所示。
实施例105：使用式(I)的赖氨酸反应性化合物制备抗体药物缀合物
本发明的细胞毒性药物还可以与非工程抗体的天然赖氨酸残基缀合。这可以例如通过在中性pH值下在PBS缓冲液(不含游离胺)中将与NHS酯或五氟苯基(PFP)酯基连接的细胞毒性药物与非工程化抗体反应来实现。药物中的NHS或PFP酯基团容易与抗体中的赖氨酸残基反应(Hermanson,G.T.Bioconjugate Techniques；Academic Press:New York,1996；BasléE,Joubert N,Pucheault M.Chem Biol.2010,17:213-227.Protein chemicalmodification on endogenous amino acids)。在一个实施例中，非工程抗-Her2和抗体20507抗体分别以10:1和4:1的化合物与抗体摩尔比与化合物CL-32或CL-41反应。所得ADC，即抗-Her2-CL-32、抗-Her2-CL-41和抗体20507-CL-32分别具有平均DAR 4.7、DAR1.3和DAR2.7(表13)。抗-Her2-CL-32和抗体20507-CL-32的部分性质列于表13中。
表13.用非工程抗体制备的各种ADC的性质
ADC的名称a DARc 寡聚物(％)d
抗-Her2-CL-9 4.1 2.3
抗体20507-CL-9 3.9 2.7
抗-Her2-CL-32 4.7 1.0
抗体20507-CL-32 2.7 1.0
抗体20507-CL-22 3.8 3.0
抗-Her2-CL-41 1.3 1.0
尽管表5和6中公开的式(II)和式(III)的免疫缀合物是通过将抗-Her2和抗体20507Cys突变抗体与具有连接马来酰亚胺部分的式(I)的某些化合物缀合而获得，但本发明的其它连接体-有效载荷组合也已使用，如表8-13中公开的免疫缀合物所示例。此外，使用本领域已知的和如实施例103、实施例104和实施例105中所示的方法，并通过表13中的免疫缀合物示例，缀合至非工程化抗体也是可能的，特别是在半胱氨酸或赖氨酸残基上。
如实施例107所述测试所有实施例ADC的体外细胞杀伤效力。对所选择的本发明的免疫缀合物进行药代动力学研究(实施例108)和体内功效研究(实施例109)。
实施例106：式(I)化合物的体外细胞杀伤试验
为了评价式(I)化合物的体外细胞杀伤效力，用8种细胞系平行进行细胞增殖试验：MDA-MB231克隆16、克隆40、JimT1、HCC1954、NCI-H526、KU812、CMK11-5细胞和Jurkat细胞。细胞系在实施例107中更详细地描述，并且也用于评估本发明的免疫缀合物的体外效力。在细胞用不同浓度的化合物孵育五天后，细胞增殖试验用Cell-Titer-Glo TM(Promega)进行(Riss等人,(2004)Assay Drug Dev Technol.2:51-62)。在一些研究中，基于细胞的试验是高通量的并在自动化系统上进行(Melnick等人,(2006)Proc Natl AcadSci U S A.103:3153-3158)。对于式(I)化合物的某些实施例获得的体外细胞杀伤效力在表14中给出。
表14.某些式(I)化合物的体外细胞杀伤(IC50[nM])
实施例107：测量ADC的体外细胞杀伤效力的细胞增殖试验
天然表达靶抗原的细胞或经改造以表达靶抗原的细胞系经常用于测定ADC的活性和效力。为了评价抗-Her2抗体ADC在体外的细胞杀伤效力，使用两种工程化细胞系，MDA-MB-231克隆16和克隆40，以及两种内源性细胞系JimT-1和HCC1954细胞(Clinchy B,Gazdar A,Rabinovsky R,Yefenof E,Gordon B,Vitetta ES.Breast Cancer Res Treat.(2000)61:217-228)。MDA-MB-231克隆16细胞在细胞表面上稳定表达高拷贝数(～5x105拷贝/细胞)的重组人Her2，而克隆40以低水平(～5x103拷贝/细胞)表达人Her2。HCC1954细胞在表面中内源性表达重组人Her2的高水平(～5x105拷贝/细胞)，而JimT-1细胞以中等水平(～8x104拷贝/细胞)表达人Her2。NCI-N87细胞表达高水平的Her2，而A375细胞表达低水平的Her2。ADC应以抗原依赖性方式杀死细胞，这意味着只有在细胞表面表达足够抗原的细胞而非缺乏抗原的细胞将被杀死。因此，在MDA-MB-231克隆40细胞中不会观察到细胞杀死。
为了检测抗原依赖性细胞杀伤，在不同细胞类型用不同浓度的ADC孵育5天后，用Cell-Titer-GloTM(Promega)进行细胞增殖试验。(Riss等人,(2004)Assay Drug Dev Technol.2:51-62)。在一些研究中，基于细胞的试验是高通量的并在自动化系统上进行(Melnick等人,(2006)Proc Natl Acad Sci U S A.103:3153-3158)。
在上述四种细胞系中测定用本发明化合物制备并与抗-Her2 Cys突变抗体(参见表5)位点特异性结合的抗-Her2 ADC，以评价其细胞毒性。除了两个(抗-Her2-LC-S159C-NL-34和-CL-6)之外的所有ADC特异性杀死具有高水平Her2表达的两个细胞系；MDA-MB231克隆16和HCC1954，但没有杀死MDA-MB-231克隆40细胞，其表达低水平的Her2(图1，表15)。抗-Her2 ADC在MDA-MB-231克隆16和HCC1954细胞试验中的IC50值范围为20pM至300pM(表15)。用两种有效载荷(抗-Her2-LC-S159C-NL-34和-CL-6)制备的ADC在试验中没有显示对任何细胞系的细胞毒性。在JimT-1细胞中，具有中等水平Her2表达的细胞系，ADC的细胞杀伤活性广泛变化。具有一些有效载荷(化合物：CL-5、NL-38、NL-30、NL-19、NL-21、CL-24)的ADC在HCC1954和MDAMB231-16细胞中有活性，但在JimT-1细胞中不具有活性。许多ADC与HCC1954和MDAMB231-16细胞一样有效地杀死JimT-1细胞(图1，表15)。在JimT-1细胞增殖试验(表15)中，具有本发明的许多有效载荷的抗-Her2 ADC显示比抗-Her2-MMAF更高的细胞毒性，所述ADC包含良好表征的参照有效载荷(Svetlana O.Doronina,BrianA.Mendelsohn,Tim D.Bovee,Charles G.Cerveny,步骤hen C.Alley,Damon L.Meyer,Ezogelin Oflazoglu,Brian E.Toki,Russell J.Sanderson,Roger F.Zabinski,AlanF.Wahl,and Peter D.Senter,Bioconjugate Chem.2006,17,114-124)。多个抗-Her2-LC-S159C ADC在JimT-1细胞中观察到的细胞毒性效力的显著差异使得可以对有效载荷的效力进行排序。结果表明，具有本发明的多种化合物的抗-Her2 ADC以Her2依赖性方式杀死Her2+细胞，并且ADC对多种细胞类型具有高度活性。这与通过游离的未缀合的本发明化合物的体外细胞杀死高和低表达Her2的细胞系(参见实施例106，表14)不同。
为了验证式(I)化合物与其它抗体缀合时是否也具有活性，将几种化合物(CL-1、CL-6、CL-9、NL-4)与抗体20507Cys突变抗体(表6)缀合，其靶抗原在H526、KU812和CMK11-5细胞中表达，但不在Jurkat细胞中表达，因此对于Jurkat细胞系不会观察到细胞杀伤。如图2和表16所示，在Her2+细胞中显示细胞杀伤活性的有效载荷连接体组合(CL-1、CL9、NL-4)当与抗体20507缀合时也是有活性的，杀死表达靶抗原的细胞。与抗-Her2-CL-6 ADC在Her2+细胞中没有细胞毒性的观察一致，抗体20507-CL-6 ADC在用抗原表达细胞的细胞杀伤测定中也不具有活性(表16)。结果表明本文所述的化合物显示出对宽范围的细胞类型的细胞毒性。
由于ADC中的细胞毒性药物有效载荷是细胞毒性的主要原因，增加药物与抗体比(DAR)应该增强ADC的细胞毒性效力。我们在细胞增殖试验中检测了两种DAR 4 ADC(抗体20507-HC-K360C-LC-K107C-CL-9和抗体20507-HC-E152C-S375C-CL-9)的细胞毒活性。如表16所示，两种DAR4 ADC以抗原依赖性方式抑制细胞增殖，IC50值低于相应的DAR 2 ADC，表明如所预期的，四个CL-9有效载荷分子与每个抗体的缀合增加ADC的细胞毒性效力，而不牺牲抗体的特异性。
本发明的化合物可以结合广泛的缀合方法有效地用作ADC有效载荷。除了用Cys工程化抗体制备的高效ADC(上文讨论；实施例99)之外，用四种其它缀合方法制备本发明的免疫缀合物：使用标记抗体的酶促法进行缀合(实施例101-103)和通过天然二硫键部分还原的非工程化抗体的缀合(实施例103)，通过还原的天然二硫键的“酮桥接”(实施例104)，以及通过天然赖氨酸残基缀合(实施例105)。
除了Cys工程化的ADC，用后四种方法制备的ADC也被证明是高度细胞毒性的并以抗原依赖性方式杀死细胞。具体而言，有效载荷CL-22具有与CL-9相似的核心结构并且包含羟基胺部分以替代马来酰亚胺部分。通过如实施例101-103中所述的酶介导的缀合方法和如实施例104中所述的基于酮桥的方法将CL-22缀合至抗体20507。得到的两个ADC是抗体20507-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22和抗体20507-CL-22。在如上所述的细胞增殖试验中测试两个ADC。虽然具有相同的缀合比(DAR 2)，酶促缀合的ADC，抗体20507-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22与相应的CL-9-缀合的DAR 2 Cys ADC相比显示出2-3倍更高的IC50值(表16)。另一方面，具有DAR为4的酮桥连ADC(抗体20507-CL-22)在对比DAR2CL-9Cys ADC的IC50方面显示出相似的效力，并且比DAR4CL-9Cys ADC低(表16)。当CL-9位点特异性结合于抗-Her2和抗体20507时，其是有效的有效载荷。CL-9也通过如实施例103中所述的部分还原方法与抗-Her2和抗体20507的天然Cys残基缀合。两个得到的ADC：抗-Her2-CL-9和抗体20507-CL-9的平均DAR比分别为DAR 4.1和DAR 3.9(表13)。基于体外细胞试验，两种ADC都是有效的，具有与位点特异性的Cys工程化CL-9 ADC类似的IC50(表15和16)。与具有NHS酯和PFP酯的包含药物有效载荷的抗体中的赖氨酸残基缀合是ADC制备中的常见方法。通过将CL-32或CL-41缀合至抗-Her2和抗体20507来制备ADC。所得ADC，即抗-Her2-CL-32、抗-Her2-CL-41和抗体20507-CL-32(表13)在基于细胞的试验中显示高的、抗原依赖性的细胞毒性(表15和表16)。
我们的结果证明，本发明中描述的有效载荷种类适合于使用上述各种缀合方法制备活性ADC。可以从将有效载荷缀合到抗体中的大量不同缀合位点而制备强效ADC，所述缀合位点包括工程改造的半胱氨酸残基、天然半胱氨酸残基、赖氨酸残基和某些丝氨酸残基。
表15.体外细胞杀伤试验中的ADC效力：在MDA-MB231克隆40、MDA-MB231克隆16、HCC1954、JimT-1NCI-N87和A375细胞增殖试验中的抗-Her2 ADC的IC50。
对于所有Cys ADC，在试验中使用的最高浓度为67nM，对于抗-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22为61nM。IC50值为67nM表明试验中的ADC无活性。ND:未测定
表16：体外细胞杀伤试验中的ADC效力：抗体20507 ADC在Jurkat、H526、KU812和CMK11-5细胞增殖试验中的IC50。
在试验中使用的最高浓度为67nM。因此，IC50值为67nM表示试验中的ADC无活性。
实施例108：ADC药代动力学研究
已经证明，长的血清半衰期对于ADC的高体内效力是至关重要的(Hamblett,等人,“Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibodydrug conjugate,”Clin Cancer Res.,10:7063-7070(2004)；Alley等人,BioconjugChem.19:759-765(2008))。疏水性药物的有效载荷与抗体的连接可能影响抗体的性质，而这可能导致ADC在体内快速清除(Hamblett等人,2004)和差的体内效力。为了评价本发明的各种式(I)化合物的缀合对体内ADC清除的效果，进行非携瘤小鼠的药物动力学研究。为了在小鼠血浆中检测本发明的免疫缀合物，产生识别本发明所述的各种化合物的抗-MMAF抗体。使用用于捕获来自血浆的人IgG分子的抗-hIgG抗体和第二种抗-人IgG抗体和抗-MMAF抗体(在两个独立试验中用于信号检测)在GyrosTM平台上开发用于检测免疫缀合物的ELISA试验。抗-MMAF抗体识别本发明的化合物，因此可用于检测具有连接的化合物的ADC(“完整”ADC)。因此，所述两种ELISA分别测量人抗体和“完整”ADC的血清浓度。
PK研究的实例显示在图3中。向每组三只小鼠施用单剂量的指定的ADC。八个抗-Her2 DAR 2 ADC，即抗-Her2-LC-S159C-CL-9、抗-Her2-LC-S159C-NL-4、抗-Her2-LC-S159C-CL-1、抗-Her2-LC-S159C-CL-6、抗-Her2-LC-S159C-CL-10、抗-Her2-LC-S159C-CL-11、抗-Her2-LC-S159C-CL-12和抗-Her2-LC-S159C-NL-38(图3A、B)，两个抗体20507 DAR 2ADC，即抗体20507-HC-E152C-CL-9和抗体20507-HC-E152C-NL-4(图3C)，两个抗体20507DAR 4 ADC，即抗体20507-HC-E152C-S375C-CL-9和抗体20507-HC-K360C-LC-K107C-CL-9(图3D)，两个酶促缀合的ADC，即抗-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22和抗体20507-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22(图3E)，通过天然二硫键部分还原来制备的抗-Her2-CL-9 ADC(图3F)，通过天然赖氨酸残基缀合的抗-Her2-CL-32 ADC(图3F)，以及未缀合的野生型抗-Her2抗体，以1mg/kg向小鼠施用。在三个星期中收集血浆样品，并通过使用抗-hIgG抗体捕获IgG分子，包括ADC和裸的抗-Her2抗体和抗体20507的ELISA试验进行测试。随后将抗-MMAF和抗-hIgG抗体用于在两个独立的试验中检测。抗-MMAF抗体试验仅检测该缀合物的浓度，抗-hIgG定量缀合物和缺乏有效载荷的抗体两者。采用相同的注入小鼠中的材料，对于各ADC分别产生标准曲线。因此，如果注射到小鼠体内后ADC的药物载荷没有发生变化，用抗-MMAF和抗-hIgG的测定应当产生相同的浓度读数。对于损失一些有效载荷的ADC，用抗-MMAF抗体的试验将比抗-hIgG试验测得更低的浓度。因此这两个浓度读数的比较能够测量在小鼠体内培养期间从ADC的药物释放。为了比较，还进行了未缀合的野生型抗-Her2的PK研究(图3F)。
本发明的大多数抗-Her2 ADC显示出与野生型非缀合抗体相似的药代动力学(参见图3F)。如图3A和B所示，对于六个ADC(抗-Her2-LC-S159C-CL-9、抗-Her2-LC-S159C-NL-4、抗-Her2-LC-S159C-CL-10、抗-Her2-LC-S159C-CL-11、抗-Her2-LC-S159C-CL-12和抗-Her2-LC-S159C-NL-38)，通过抗-hIgG试验和抗-MMAF试验两者获得的血浆浓度非常匹配，表明在测试期间这六个ADC中存在最小的药物损失，并且表明六种有效载荷(CL-9、CL10、CL-11、CL-12和NL-4，NL-38)以及有效载荷的连接体在小鼠血循环期间是稳定的。然而，对于一个ADC(抗-Her2-LC-S159C-CL-1)，抗-MMAF试验和抗-hIgG试验的结果彼此显著不同，表明CL-1有效载荷从抗体中丢失(图3B)。在施用ADC后3周，从小鼠血浆分离的抗-Her2-LC-S159C-CL-1 ADC的MS分析表明CL-1连接体中的酰胺键被切割，证实了抗-MMAF试验的结果。
抗-MMAF和抗-hIgG试验数据(图3B)显示抗-Her2-LC-S159C-CL-6在小鼠中比未缀合的抗-Her2抗体更快速地从血循环中清除(正方形，图3F)。PK研究清楚地确定了用于六种有效载荷(CL-9、CL10、CL-11、CL-12和NL-4、NL-38)的稳定的有效载荷-连接体组合。这些有效载荷中的两种(CL-9和NL-4)与第二抗体(抗体20507)以DAR 2和DAR 4形式缀合。四个抗体20507 ADC(抗体20507-HC-E152C-CL-9、抗体20507-HC-E152C-NL-4、抗体20507-HC-E152C-S375C-CL-9和抗体20507-HC-K360C-LC-K107C-CL-9)的PK研究在第二抗体的背景中(图3C、D)证实了四种连接体-有效载荷组合的优异的连接体稳定性。与DAR2抗体20507ADC(图3C)、DAR4抗体20507ADC(图3D)、特别是抗体20507-HC-K360C-LC-K107C-CL-9相比，显示出稍微更快地从小鼠的循环中清除。但是，结果表明两个或四个CL-9或NL-4有效载荷在所述位点中与每个抗体分子的缀合不改变生化特性，也不显著改变抗体的药代动力学。
在另一个实施例中，有效载荷化合物CL-22通过如实施例101-103中所述的酶介导的缀合方法与抗-Her2和抗体20507抗体缀合。将两个ADC(抗-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22和抗体20507-ins388-A1-CoA-1-CL-22)进行小鼠PK研究。如图3E所示，虽然抗-hIgG测定数据显示在三周的时间段内与未缀合的野生型抗-Her2抗体(图3F)相似的PK谱图，但抗-MMAF试验显示，小鼠血浆中的两个ADC在24小时内都下降到检测水平以下，表明CL-22有效载荷从两种抗体中释放。MS分析表明CL-22中的连接体在磺酰胺和肟连接基团处裂解。这一发现是出乎意料的，因为当与工程化的Cys残基(图3A、C和D)或天然Cys残基(图3F)缀合时，密切相关的化合物CL-9未出现裂解。在后一个实施例中，有效载荷化合物CL-9与部分还原的抗-Her2抗体的天然半胱氨酸残基缀合(实施例103)。用所得ADC，抗-Her2-CL-9进行的PK研究显示抗-IgG和抗-MMAF试验的图谱与未缀合的野生型抗-Her2的图谱相似(图3F)，表明尽管天然二硫键被部分还原，ADC仍具有良好的PK性质。
与CL-9 ADC相比，两个CL-22 ADC(抗-Her2-HC-ins388-A1-CoA-1-CL-22和抗体20507-ins388-A1-CoA-1-CL-22)在化合物和抗体的缀合位点之间包含更长的连接体(实施例91,流程49)。通过酶促方法(实施例101-103)制备的两个CL-22 ADC中的长且柔性的连接体可能使得连接体对于可以促进连接体裂解的酶更易接近。另一方面，与酶促制备的CL-22ADC相比，用实施例104中描述的缀合方法制备的抗-Her2-CL-22，即CL-22 ADC在化合物和抗体上的缀合位点之间包含较短的连接体。当将抗-Her2-CL-22进行PK研究时，抗-hIgG试验和抗-MMAF试验两者证明了与野生型抗-Her2类似的良好PK曲线(图3F)，表明在抗-Her2-CL-22中的CL-22有效载荷在整个PK研究过程中不从ADC释放。因此，连接体的长度和化学组成可能是ADC稳定性的重要因素。
我们还使用抗-Her2-CL-32(具有与抗-Her2抗体的赖氨酸残基缀合的有效载荷CL-32的ADC)进行PK研究(实施例105)。抗-IgG和抗-MMAF试验的图谱(图3F)彼此重叠，表明有效载荷CL-32稳定地与抗体缀合，并且证实了该ADC在小鼠血循环中优异的PK性质。
总之，我们的PK研究中的发现清楚地表明，在本发明中描述的有效载荷中，在小鼠循环中ADC的稳定性方面存在显著差异。发现有效载荷CL-1和CL-22中的连接体在小鼠血循环中被裂解。有效载荷CL-6使得ADC比来自循环的非缀合抗体更快地被清除。然而，使用不同缀合方法的用有效载荷CL-9、CL10、CL-11、CL-12、CL-32、NL-4和NL-38制备的ADC在小鼠的血循环中是稳定的，并且表现出优异的PK性质。用有效载荷CL-9、CL10、CL-11、CL-12、NL-4和NL-38制备的ADC在小鼠中是稳定的。
实施例109:体内效能研究
体内异种移植肿瘤模型通过将相关且充分表征的人原发性肿瘤或肿瘤细胞系移植到免疫缺陷的裸鼠中来模拟在人类中观察到的生物活性。用抗癌剂治疗肿瘤异种移植小鼠的研究提供了关于所测试试剂的体内功效的有价值的信息(Sausville和Burger,CancerRes.2006,66:3351-3354)。NCI-N87细胞在细胞表面上过表达Her2抗原，并已用作抗-Her2抗体的体外和体内功效研究的模型(Kasprzyk,P.,Song,S.V.,DiFiore,P.P.&King,C.R.,Cancer Res.1992,52:2771-2776)。NCI-N87细胞系用作在体内测试用抗-Her2抗体制备的ADC的模型。H526细胞在其表面表达抗体20507的抗原，并被抗体20507ADC选择性杀死(图2，表16)。该细胞系用作第二异种移植模型以评价用抗体20507制备的ADC的体内活性。所有动物研究根据实验动物的护理和使用指南进行(NIH出版；National Academy Press,第八版,2001)。将NCI-N87或H526细胞皮下植入到nu/nu小鼠中(Morton和Houghton,Nat.Protoc.2007；2:247-250)。在肿瘤大小达到～200mm3后，通过IV注射以每项研究中所示的剂量以单剂量向小鼠施用ADC。然后在ADC施用后定期测量肿瘤生长。在NCI-N87异种移植模型中使用抗-Her2ADC的体内功效研究的实例显示在图4A和4B中，在H526异种移植模型中的抗体20507 ADC的体内功效研究的实例如图4C、4D和4E中所示。
NCI-N87异种移植研究显示用抗-Her2-LC-S159C-CL-9和抗-Her2-LC-S159C-NL-4处理的小鼠在NCI-N87肿瘤中引起剂量依赖性的肿瘤抑制和消退(图4A和4B)。施用2.5mg/kg抗-Her2-LC-S159C-CL-9时观察到NCI-N87肿瘤的抑制，而用5mg/kg的相同ADC治疗诱导肿瘤停滞(图4A)。在10mg/kg抗-Her2-LC-S159C-CL-9中观察到持续的肿瘤消退50天。作为比较，当用10mg/kg含有文献参照化合物MMAF的抗-Her2-LC-S159C-MMAF处理小鼠时，NCI-N87肿瘤最初消退，但在30天后复原(图4A)。因此，由抗-Her2-LC-S159C-CL-9引起的肿瘤消退持续时间显著长于当以相同剂量施用抗-Her2-LC-S159C-MMAF ADC时的肿瘤消退。用包含另一种有效载荷NL-4的ADC处理小鼠也引起NCI-N87肿瘤的剂量依赖性抑制(抗-Her2-LC-S159C-NL-4，图4B)。在单剂量2.5mg/kg后观察到NCI-N87肿瘤生长的弱抑制，而对于5mg/kg和10mg/kg抗-Her2-LC-S159C-NL-4的剂量观察到肿瘤停滞。由抗-Her2-LC-S159C-NL-4引起的肿瘤抑制程度与由抗-Her2-LC-S159C-MMAF引起的肿瘤抑制程度相似(图4B)。
为了研究包含上述两种有效载荷的ADC在体内另一种肿瘤模型中是否有效，使用与抗体20507缀合的有效载荷CL-9和NL-4制备ADC，其抗原在H526细胞上高度表达(实施例107)中。制备具有两种不同抗体-药物比例的ADC(即DAR 2和DAR 4)，并在H526肿瘤模型中进行测试。如图4C所示，类似于在NCI-N87模型中使用抗-Her2 ADC的上述研究的结果，抗体20507-LC-S159C-NL-4 ADC(DAR2)以剂量依赖性方式抑制H526肿瘤生长。抗体20507-LC-S159C-NL-4在3mg/kg的单次给药后抑制H526肿瘤生长，并在10mg/kg导致肿瘤消退。由3mg/kg抗体20507-LC-S159C-NL-4 ADC引起的H526肿瘤的抑制与由相同剂量的参照ADC(抗体20507-LC-S159C-MMAF)引起的H526肿瘤的抑制相似。
DAR 4ADC具有比DAR 2 ADC连接至抗体两倍的细胞毒性药物，因此应当递送每抗体两倍的药物剂量。为了说明这一特征，在H526异种移植模型中体内比较DAR 2和DAR 4ADC的功效(图4D)。在该研究中，用DAR 4 ADC(抗体20507-HC-E152C-S375C-CL-9)以5mg/kg处理小鼠引起与用DAR 2 ADC(抗体20507-HC-S375C-CL-9)以10mg/kg处理相比相当的肿瘤消退。结果表明，制备为DAR 2或DAR 4 ADC的有效载荷CL-9在体内是有效的。由CL-9 ADC引起的肿瘤抑制和消退取决于由实验动物中的ADC递送的CL-9的量。
在实施例107中，我们已经显示，通过各种缀合方法用本发明的有效载荷制备的ADC在基于体外细胞试验中是有效的。在另一个实施例中，通过两种不同的缀合方法制备的在抗体20507中具有有效载荷CL-9的ADC在H526肿瘤模型中评价其在抑制肿瘤生长中的体内功效(图4E)：如实施例99所述通过将CL-9缀合到抗体20507中的4个工程化的Cys残基来制备抗体20507-HC-E152C-S375C-CL-9，将CL-9与天然Cys残基通过如实施例103中所述的部分还原方法缀合来制备抗体20507-CL-9 ADC。因为H526肿瘤细胞在表面不表达Her2抗原，所以以与抗体20507-HC-E152C-S375C-CL-9相同的方式制备抗-Her2-HC-E152C-S375C-CL-9，并在研究中用作阴性对照ADC。三个ADC含有相同的CL-9药物与抗体比(DAR 3.9)。如所预期的，当以5mg/kg给药时，抗-Her2-HC-E152C-S375C-CL-9不影响肿瘤生长，而抗体20507-HC-E152C-S375C-CL-9和抗体20507-CL-9 ADC以剂量依赖性方式引起肿瘤消退(图4E)。在2.5mg/kg剂量下，两种抗体20507 ADC显示对H526肿瘤生长的抑制。两种抗体20507ADC都在5mg/kg观察到的完全的肿瘤消退。
从具有用两种不同抗体制备的ADC的NCI-N87和H526肿瘤中的体内异种移植物模型的结果可见，与参照的MMAF ADC相比，用CL-9制备的ADC显示出在肿瘤抑制和消退方面更高的功效。CL-9 ADC能够导致比MMAF ADC更可持续的肿瘤消退。用有效载荷NL-4制备的ADC显示与参照的MMAF ADC类似的体内效力。我们还表明，使用两种不同的方法用有效载荷CL-9制备的ADC能够在体内引起肿瘤消退，证实了来自体外研究的观察结果(实施例107)。实施例107和实施例109中的结果表明，用本发明公开的化合物有效载荷制备的ADC对于不同的抗体和多种肿瘤细胞系在体外和体内都是有效的。预期本发明的化合物将广泛适用于许多不同的肿瘤环境和适应症。使用许多已建立的缀合方法，包括位点特异性工程化Cys方法(实施例99)、部分还原方法(实施例103)、酶介导的缀合方法(实施例101-103)、半胱氨酸酮桥法(实施例104)和NHS-赖氨酸缀合法(实施例105)，这些化合物可用于制备有效的ADC。预期本发明的化合物可以与许多不同的抗体或者抗原靶向部分组合。
本发明的某些方面和实施例在列举的实施方案的以下列表中提供。应当认识到，每个实施方案中描述的特征可以与其他描述的特征组合以提供本发明的另外的实施方案。
1.具有式(I)结构的化合物或其立体异构体以及互变异构体，
其中：
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、–N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)2、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20或–NHR8；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是-(CH2)mN(R12)2、-(CH2)mN(R12)C(＝O)OR12或未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、-OH、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2、-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6和-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)2；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R18或
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是–S(CH2)nCHR14NHC(＝O)R12或
R14是R12或–C(＝O)OR12；
R15是四唑基、-CN、-C(＝O)OR12、
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基；
R17是2-吡啶基或4-吡啶基；
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
2.如实施方案1中所述的化合物，其中
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)2或–N＝CR5R20。
3.如实施方案1中所述的化合物，其中：
R1是-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4或-NHC(＝O)R20。
4.如实施方案1中所述的化合物，其中：
R1是–N＝CR4R5；
R4是-N(R6)2；
R5是N(R6)2；
且
R6各自独立地选自-C1-C6烷基。
5.如实施方案1中所述的化合物，其中R1是
6.如实施方案1中所述的化合物，其中R1是–NHR8。
7.如实施方案1-6中任一项所述的化合物，其中
R3是
8.如实施方案1-3中任一项所述的化合物，其中R7是-(CH2)mN(R12)2、-(CH2)mN(R12)C(＝O)OR12。
9.如实施方案1-3中任一项所述的化合物，其中R7是被-(CH2)mOH取代的C3-C8环烷基。
10.如实施方案1、3或6中任一项所述的化合物，其中R8是未取代的C-连接的吡啶基、未取代的C-连接的嘧啶基或未取代的C-连接的吡嗪基。
11.如实施方案1、3或6中任一项所述的化合物，其中R8是C-连接的吡啶基、C-连接的嘧啶基或C-连接的吡嗪基，其各自被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6和-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)2。
12.如实施方案1、2或7中任一项所述的化合物，其中R19是C-连接的咪唑烷基或C-连接的哌嗪基，其各自被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基.
13.如实施方案1、2、3或7中任一项所述的化合物，其中R20是未取代的哌嗪基。
14.如实施方案1、2、3或7中任一项所述的化合物，其中R20是N-连接的哌嗪基，其被独立地选自以下的1-2个取代基取代：-C(＝O)OR12和-C(＝O)(CH2)mN3。
15.如实施方案1-14中任一项所述的化合物，其中R9是-OH、C1-C6烷氧基、-NHS(O)2(CH2)mN3或-NHS(O)2(CH2)mNH2。
16.如实施方案1-14中任一项所述的化合物，其中R15是四唑基或
17.具有式(I)结构的化合物或其立体异构体，
其中：
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、–N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)2、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20、–NHR8、-NHLR11、-NHR21、–N＝CR5R10、–N＝R22、–N＝CR5R23或-NHC(＝O)R23；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是-(CH2)mN(R12)2、-(CH2)mN(R12)C(＝O)OR12或未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、-OH、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2、-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6和-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)2；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(＝O)2LR11、-NHLR11、-NHS(O)2(CH2)mNH2、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-LR11、-NHS(O)2R18、
R10是LR11或
R11是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR17、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R13、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是–S(CH2)nCHR14NHC(＝O)R12、
R14是R12或–C(＝O)OR12；
R15是四唑基、-CN、-C(＝O)OR12、 -LR11或–X4LR11；
L各自独立地选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR11取代；
R17是2-吡啶基或4-吡啶基；
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R21是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基；
R22是C-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R23是N-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
X3是X4是
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18，
或其互变异构体、水合物或可药用盐。
18.具有式(I)结构的化合物或其立体异构体，
其中，
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、–N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)2、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20、–NHR8、-NHLR11、-NHR21、–N＝CR5R10、–N＝R22、–N＝CR5R23或-NHC(＝O)R23；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是-(CH2)mN(R12)2、-(CH2)mN(R12)C(＝O)OR12或未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、-OH、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2、-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6和-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)2；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-NHS(O)2(CH2)mN3、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-LR11、-NHS(O)2R18、-NHS(＝O)2LR11、
R10是LR11或
R11是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR17、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R13、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是–S(CH2)nCHR14NHC(＝O)R12或
R14是R12或–C(＝O)OR12；
R15是四唑基、-CN、-C(＝O)OR12、 -LR11或–X4LR11；
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR11取代；
R17是2-吡啶基或4-吡啶基；
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R21是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基；
R22是C-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R23是N-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
L各自独立地选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
X3是且
X4是
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
或其互变异构体、水合物或可药用盐。
19.如实施方案1-17中任一项所述的化合物，其中该化合物具有式(Ia)的结构：
20.如实施方案1-18中任一项所述的化合物，其中该化合物是具有式(Ib)结构的化合物：
21.如实施方案1-6中任一项所述的化合物，其中该化合物是具有式(Ic)结构的化合物：
22.如实施方案1-6和20中任一项所述的化合物，其中该化合物是具有式(Id)结构的化合物：
23.如实施方案1-17中任一项所述的化合物，其中该化合物是具有式(Ie)结构的化合物：
24.如实施方案1-17和22中任一项所述的化合物，其中该化合物是具有式(If)结构的化合物：
25.如实施方案17-23中任一项所述的化合物，其中L各自独立地选自-L1L2L3L4L5L6-和-L6L5L4L3L2L1-，且其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义。
26.如实施方案17-23中任一项所述的化合物，其中L各自独立地选自-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-和-L3L2L1-，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义。
27.如实施方案17-23中任一项所述的化合物，其中L各自独立地选自-L1L2-和-L2L1-，且其中-L1和L2如本文所定义。
28.如实施方案17-23中任一项所述的化合物，其中L是-L1-，其中-L1如本文所定义。
29.如实施方案17-27中任一项所述的化合物，其中：
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、–N＝CR5R10、–N＝R22或–N＝CR5R23。
30.如实施方案17-27中任一项所述的化合物，其中：
R1是–N＝CR5R10、–N＝R22或–N＝CR5R23。
31.如实施方案17-27中任一项所述的化合物，其中：
R1是–N＝CR5R10、–N＝R22、-NHLR11、-NHR21、–N＝CR5R23或-NHC(＝O)R23。
32.如实施方案17-27中任一项所述的化合物，其中：
R1是-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20或-NHC(＝O)R23。
33.如实施方案17-27中任一项所述的化合物，其中：
R1是-NHC(＝O)R23。
34.如实施方案17-27中任一项所述的化合物，其中：
R1是–NHR8、-NHLR11或-NHR21。
35.如实施方案17-27中任一项所述的化合物，其中：
R1是–NHR8。
36.如实施方案17-27中任一项所述的化合物，其中：
R1是-NHLR11或-NHR21。
37.如实施方案17-27中任一项所述的化合物，其中：
R1是–N＝CR4R5；R4是-N(R6)2；R5是N(R6)2；且R6各自独立地选自-C1-C6烷基。
38.如实施方案17-27中任一项所述的化合物，其中：
R1是
39.如实施方案17-27中任一项所述的化合物，其中R7是-(CH2)mN(R12)2、-(CH2)mN(R12)C(＝O)OR12。
40.如实施方案17-27中任一项所述的化合物，其中R7是被-(CH2)mOH取代的C3-C8环烷基。
41.如实施方案17-27、33或34中任一项所述的化合物，其中R8是未取代的C-连接的吡啶基、未取代的C-连接的嘧啶基或未取代的C-连接的吡嗪基。
42.如实施方案17-27、33或34中任一项所述的化合物，其中R8是C-连接的吡啶基、C-连接的嘧啶基或C-连接的吡嗪基，其各自被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、-OH、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2、-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6和-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)2。
43.如实施方案17-28中任一项所述的化合物，其中R19是C-连接的咪唑烷基或C-连接的哌嗪基，其各自被1-3个独立地选自C1-C6烷基的取代基取代。
44.如实施方案17-28或31中任一项所述的化合物，其中R20是未取代的哌嗪基。
45.如实施方案17-28或31中任一项所述的化合物，其中R20是N-连接的哌嗪基，其独立地被选自以下的1-2个取代基取代：-C(＝O)OR12和-C(＝O)(CH2)mN3。
46.如实施方案17-27、30或33中任一项所述的化合物，其中R21是C-连接的吡啶基、C-连接的嘧啶基或C-连接的吡嗪基，其各自被-LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、-OH、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基。
47.如实施方案17-30中任一项所述的化合物，其中R22是C-连接的咪唑烷基或C-连接的哌嗪基，其各自被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基。
48.如实施方案17-32中任一项所述的化合物，其中R23是N-连接的哌嗪基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基。
49.如实施方案17-30中任一项所述的化合物，其中R10是LR11。
50.如实施方案17-49中任一项所述的化合物，其中：
R3是
51.如实施方案17-50中任一项所述的化合物，其中R9是-OH、C1-C6烷氧基、-NHS(O)2(CH2)mN3或-NHS(O)2(CH2)mNH2。
52.如实施方案17-50中任一项所述的化合物，其中R9是-LR11、-NHS(＝O)2LR11、
53.如实施方案17-50中任一项所述的化合物，其中R15是四唑基或
54.如实施方案17-50中任一项所述的化合物，其中R15是 -LR11或–X4LR11。
55.如实施方案17-50中任一项所述的化合物，其中R15是四唑基、-CN、-C(＝O)OR12、
56.如实施方案17-55中任一项所述的化合物，其中R11是 -N3、-ONH2、-NH2或
57.式(II)的免疫缀合物：
其中：
Ab代表抗原结合部分；
L是选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
R101是-NHC(＝O)NR6*-、-NHR121*-、或-NHC(＝O)R123*-，其中*代表与L的连接点；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R18或
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是四唑基、
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR11取代；
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R110是键或
R121是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元亚杂芳基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基；
R122是C-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元亚杂环烷基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R123是N-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元亚杂环烷基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
y是1-16的整数；
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
58.如实施方案57中所述的免疫缀合物，其中L是-L1L2L3L4L5L6-或-L6L5L4L3L2L1-，且其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义。
59.如实施方案57中所述的免疫缀合物，其中L是选自-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-和-L3L2L1-，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义。
60.如实施方案57-59中任一项所述的免疫缀合物，其中式(II)的免疫缀合物是式(IIa)的免疫缀合物：
61.如实施方案57-60中任一项所述的免疫缀合物，其中L是-L1L2-或–L2L1-，且其中-L1和L2如本文所定义。
62.如实施方案57-61中任一项所述的免疫缀合物，其中式(II)的免疫缀合物是式(IIb)的免疫缀合物：
63.如实施方案57-62中任一项所述的免疫缀合物，其中式(II)、式(IIa)或式(IIb)的免疫缀合物是具有式(IIc)结构的免疫缀合物：
64.如实施方案57-63中任一项所述的免疫缀合物，其中R101是且R110是键。
65.如实施方案57-63中任一项所述的免疫缀合物，其中R101是且R110是
66.如实施方案57-63中任一项所述的免疫缀合物，其中R101是-NHR121*-且R121是C-连接的亚嘧啶基、C-连接的亚吡嗪基或C-连接的亚吡啶基，其各自被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基。
67.如实施方案57-63中任一项所述的免疫缀合物，其中R101是-NHC(＝O)R123*-且R123是N-连接的亚哌嗪基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基。
68.如实施方案57-63中任一项所述的免疫缀合物，其中R101是-NHC(＝O)NR6*-。
69.如实施方案57-68中任一项所述的免疫缀合物，其中
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NHS(O)2R18或-NR12(CH2)mR16；
且
R15是四唑基、
70.如实施方案57-69中任一项所述的免疫缀合物，其中R3是
71.如实施方案57-70中任一项所述的免疫缀合物，其中R9是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2或-NR12(CH2)mR16。
72.如实施方案57-71中任一项所述的免疫缀合物，其中R9是–OH或–OCH3。
73.如实施方案57-70中任一项所述的免疫缀合物，其中R15是
74.式(III)的免疫缀合物：
其中：
Ab代表抗原结合部分；
L是选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
y是1-16的整数；
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20或–NHR8；
R2是-C1-C6烷基；
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-OH、-N(R6)2、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6和C1-C6烷氧基；
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-C(＝O)OR12、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R113是
R117是键、-NH-、-NHS(＝O)2-、-NHS(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-、-NHS(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)-、–NHS(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)m-、
R118是键、四唑基、
R26是
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
75.式(III)的免疫缀合物：
其中：
Ab代表抗原结合部分；
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20或–NHR8；
R2是-C1-C6烷基；
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-OH、-N(R6)2、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6和C1-C6烷氧基；
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-C(＝O)OR12、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R113是
R117是键、-NH-、-NHS(＝O)2-、
R118是键、四唑基、
L是选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义；
y是1-16的整数；
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
和
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
76.如实施方案74中所述的免疫缀合物，其中L是-L1L2L3L4L5L6-或-L6L5L4L3L2L1-，且其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义。
77.如实施方案74-75中任一项所述的免疫缀合物，其中L是选自-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-和-L3L2L1-，其中-L1、L2、L3、L4、L5和L6如本文所定义。
78.如实施方案74-76中任一项所述的免疫缀合物，其中式(III)的免疫缀合物是式(IIIa)的免疫缀合物：
79.如实施方案74-76中任一项所述的免疫缀合物，其中L是-L1L2-或–L2L1-，且其中-L1和L2如本文所定义。
80.如实施方案74-76或78中任一项所述的免疫缀合物，其中式(III)或式(IIIa)的免疫缀合物是式(IIIb)的免疫缀合物：
81.如实施方案74-79中任一项所述的免疫缀合物，其中式(III)、式(IIIa)或式(IIIb)的免疫缀合物是式(IIIc)的免疫缀合物：
82.如实施方案74-80中任一项所述的免疫缀合物，其中R1是–N＝CR4R5、–N＝R19或–N＝CR5R20。
83.如实施方案74-80中任一项所述的免疫缀合物，其中R1是-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4或-NHC(＝O)R20。
84.如实施方案74-80中任一项所述的免疫缀合物，其中R1是–NHR8。
85.如实施方案74-80中任一项所述的免疫缀合物，其中R1是–N＝CR4R5；R4是-N(R6)2；R5是N(R6)2；且R6各自独立地选自-C1-C6烷基。
86.如实施方案74-80中任一项所述的免疫缀合物，其中R1是
87.如实施方案74-85中任一项所述的免疫缀合物，其中R113是且R117是-NH-、-NHS(＝O)2-或
88.如实施方案74-85中任一项所述的免疫缀合物，其中R113是且R118是
89.实施方案17-56中任一项所述的化合物和实施方案57-87中任一项所述的免疫缀合物，其中L1是选自-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mX3-、-X3(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)n-、-((C(R12)2)mOC(＝O)NR12(CH2)mO(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(C(R12)2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-、-(CH2)mO(CH2)mNR12C(＝O)O((C(R12)2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mS(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12-、-(CH2)mNR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3-、-X3(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NR12(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)m-、-(CH2)mC(R12)2NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)mNR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(C(R12)2)m-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-、-(CH2)mO(CH2)m-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)m X3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-、-(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-、-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-、-X1C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)X1-、-C(＝O)CHRaaNR12-、-NR12CHRaaC(＝O)-、-C(＝O)NR12-、-C(＝O)O-、-S-、-SCH2(C＝O)NR12-、-NR12C(＝O)CH2S-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-、-NR12C(＝S)-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-、-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-和-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-，且L1是选自表2中所示的基团，
其中：
X1是自消化间隔物，选自
X2是二肽，选自
X3是且
X4是
且
L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键和L1。
90.如实施方案17-56中任一项所述的化合物，以及实施方案57-87中任一项所述的免疫缀合物，其中L1是选自表2中所示的基团，-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-NHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3-、-X3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)mO(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)O(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)-、-(CH2)mO(CH2)mNHC(＝O)O((CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)X1-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mS(CH2)m-、-NHC(＝O)(CH2)m-、-NHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH-、-(CH2)mC(＝O)NH-、-(CH2)mNH(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3-、-X3(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NH(CH2)m-、-NHCH2(CH2)m-、-(CH2)mCH2NH-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNH-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)NH-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-NHCH2(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mCH2NH-、-NH(CH2)mX3(CH2)m-、-NHCH2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mCH2NH-、-NHCH2(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)mCH2NH-、-NHCH2(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)mCH2NH-、-NHCH2(CH2)mOC(＝O)NH((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)O(CH2)mCH2NH-、-NHCH2(CH2)mOC(＝O)NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)O(CH2)mCH2NH-、-(CH2)mX3(CH2)mNH-、-NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNH-、-(CH2)mNH-、-NH((CH2)mO)n(CH2)m-、-NH((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nNH-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNH-、-(CH2)m-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-、-(CH2)mO(CH2)m-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)m X3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-、-(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NH(CH2)m-、-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-、-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-、-C(＝O)CHRaaNH-、-NHCHRaaC(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、-S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-、-NHC(＝S)-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-NHS(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-和-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NH-；其中，
X1是自消化间隔物，选自 ；
X2是二肽，选自
X3是且
X4是
且
L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键和L1。
91.如实施方案17-56中任一项所述的化合物和实施方案57-87中任一项所述的免疫缀合物，其中L1是选自-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mX3-、-X3(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)n-、-((C(R12)2)mOC(＝O)NR12(CH2)mO(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(C(R12)2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-、-(CH2)mO(CH2)mNR12C(＝O)O((C(R12)2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mS(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12-、-(CH2)mNR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3-、-X3(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NR12(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)m-、-(CH2)mC(R12)2NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)mNR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(C(R12)2)m-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-、-(CH2)mO(CH2)m-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)m X3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-、-(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-、-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-、-X1C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)X1-、-C(＝O)CHRaaNR12-、-NR12CHRaaC(＝O)-、-C(＝O)NR12-、-C(＝O)O-、-S-、-SCH2(C＝O)NR12-、-NR12C(＝O)CH2S-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-、-NR12C(＝S)-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-、-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-和-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-；其中，
X1是自消化间隔物，选自
X2是二肽，选自
X3是
X4是
L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键和表2中所示的基团。
92.如实施方案17-56中任一项所述的化合物和实施方案57-87中任一项所述的免疫缀合物，其中L1是选自-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-NHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3-、-X3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)mO(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)O(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)-、-(CH2)mO(CH2)mNHC(＝O)O((CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)X1-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mS(CH2)m-、-NHC(＝O)(CH2)m-、-NHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH-、-(CH2)mC(＝O)NH-、-(CH2)mNH(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3-、-X3(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NH(CH2)m-、-NHCH2(CH2)m-、-(CH2)mCH2NH-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNH-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)NH-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-NHCH2(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mCH2NH-、-NH(CH2)mX3(CH2)m-、-NHCH2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mCH2NH-、-NHCH2(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)mCH2NH-、-NHCH2(CH2)mOC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)O(CH2)mCH2NH-、-NHCH2(CH2)mOC(＝O)NH((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)O(CH2)mCH2NH-、-NHCH2(CH2)mOC(＝O)NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)O(CH2)mCH2NH-、-(CH2)mX3(CH2)mNH-、-NH((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNH-、-(CH2)mNH-、-NH((CH2)mO)n(CH2)m-、-NH((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nNH-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNH-、-(CH2)m-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-、-(CH2)mO(CH2)m-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)m X3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-、-(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NH(CH2)m-、-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-、-X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)X1-、-C(＝O)CHRaaNH-、-NHCHRaaC(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、-S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-、-NHC(＝S)-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-NHS(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-和-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NH-；
X1是自消化间隔物，选自
X2是二肽，选自
X3是
X4是
L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键和表2中所示的基团。
93.如实施方案17-56中任一项所述的化合物，其中L是–L1-和–L1-，是选自-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、 -(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-和-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-。
94.如实施方案17-56中任一项所述的化合物，其中L是–L1-和–L1-，是选自-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、 -(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-和-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-。
95.如实施方案17-56中任一项所述的化合物，其中L是–L1-，且–L1-是选自-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-和-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-。
96.如实施方案17-56中任一项所述的化合物和实施方案57-73中任一项所述的免疫缀合物，其中L1是-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-、-X3(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH*-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)*-、-((CH2)mO)n(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NH*-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)*-、-(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-X3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)m(O(CH2)m)n*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n*-、-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mO(CH2)mNHC(＝O)O((C(R12)2)m*-、-(CH2)mS(＝O)2*-或-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2*-，其中在免疫缀合物实施方案中*是指与R101的连接点；
L2是 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、-NH(＝O)CH2CH2S-、-SCH2CH2C(＝O)NH-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中L2的*是指与L1的连接点；
且L3、L4、L5和L6是键。
97.如实施方案17-56中任一项所述的化合物和实施方案57-73中任一项所述的免疫缀合物，其中L1是选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NH*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-、-X3(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-X3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)m(O(CH2)m)n*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n*-、-(CH2)mO(CH2)mNHC(＝O)O((C(R12)2)m*-、-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m*-和-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m*-，其中免疫缀合物的实施方案中*是指与R101中的连接点；
L2是 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、-NH(＝O)CH2CH2S-、-SCH2CH2C(＝O)NH-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中L2的*是指与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
98.如实施方案17-56中任一项所述的化合物和实施方案57-73中任一项所述的免疫缀合物，其中L1是选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NH*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-、-X3(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-X3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)m(O(CH2)m)n*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n*-、-(CH2)mO(CH2)mNHC(＝O)O((C(R12)2)m*-、-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m*-和-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m*-，其中免疫缀合物的实施方案中*是指与R101中的连接点；
L2是其中L2的*是指与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
99.如实施方案17-56中任一项所述的化合物和实施方案57-73中任一项所述的免疫缀合物，L1是选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NH*-和-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-，其中免疫缀合物的实施方案中*是指与R101中的连接点；
L2是其中L2的*是指与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
100.如实施方案17-56中任一项所述的化合物和实施方案74-87中任一项所述的免疫缀合物，其中L1是选自-*(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mX3-、-*C(＝O)(CH2)m-、-*NHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3-、-*(CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*((C(R12)2)mOC(＝O)NH(CH2)mO(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-、-*C(＝O)NH(CH2)m)-、-*C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-*C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-*C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-、-*(CH2)m(O(CH2)m)n-、-*C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)NH(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-和-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，其中免疫缀合物的实施方案中*是指与R3中的连接点；
L2是键、 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、 -S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中L2的*是指与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
101.如实施方案17-56中任一项所述的化合物和实施方案74-87中任一项所述的免疫缀合物，其中L1是选自-*(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mX3-、-*C(＝O)(CH2)m-、-*NHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3-、-*(CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*((C(R12)2)mOC(＝O)NH(CH2)mO(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-和-*C(＝O)NH(CH2)m)-，其中免疫缀合物的实施方案中*是指与R3中的连接点；
L2是 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、 -S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中L2的*是指与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
102.如实施方案17-56中任一项所述的化合物和实施方案74-87中任一项所述的免疫缀合物，其中L1是选自-*(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mX3-、-*C(＝O)(CH2)m-、-*NHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3-、-*(CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*((C(R12)2)mOC(＝O)NH(CH2)mO(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-和-*C(＝O)NH(CH2)m)-，其中免疫缀合物的实施方案中*是指与R3中的连接点；
L2是 其中L2的*是指与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
103.如实施方案17-56中任一项所述的化合物和实施方案74-87中任一项所述的免疫缀合物，其中L1是选自-*(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mX3-、-*C(＝O)(CH2)m-、-*NHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3-、-*(CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*((C(R12)2)mOC(＝O)NH(CH2)mO(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-and-*C(＝O)NH(CH2)m)-，其中免疫缀合物的实施方案中*是指与R3中的连接点；
L2是其中L2的*是指与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
104.如实施方案17-56中任一项所述的化合物和实施方案74-87中任一项所述的免疫缀合物，其中L1是选自-*(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mX3-、-*C(＝O)(CH2)m-、-*NHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3-、-*(CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*((C(R12)2)mOC(＝O)NH(CH2)mO(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-和-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，其中免疫缀合物的实施方案中*是指与R3的连接点；
L2是其中L2的*是指与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
105.如实施方案1-56或88-106中任一项所述的化合物或实施方案57-87或88-106中任一项所述的免疫缀合物，其中R6是H、甲基、乙基、异丙基或仲丁基。
106.如实施方案1-56或88-107、或88中任一项所述的化合物或实施方案57-88或88-107中任一项所述的免疫缀合物，其中R12是H、甲基、乙基、异丙基或仲丁基。
107.如实施方案1-56或88-108、88或89中任一项所述的化合物或实施方案57-89或88-108中任一项所述的免疫缀合物，其中R2是甲基、乙基、异丙基或仲丁基。
108.如实施方案1-56和88-109中任一项所述的化合物，其中该化合物是选自
109.包含如实施方案57-87中任一项所述的免疫缀合物和一种或多种可药用载体的药物组合物。
110.包含治疗有效量的如实施方案57-87中任一项所述的免疫缀合物和一种或多种治疗活性助剂的组合。
111.治疗细胞增殖病症的方法，包括向需要此治疗的个体施用治疗有效量的如实施方案57-87中任一项所述的免疫缀合物。
112.用作药物的如实施方案57-87中任一项所述的免疫缀合物。
113.如实施方案114中所述的免疫缀合物，其中该药物是用于治疗癌症。
114.用于治疗癌症的如实施方案57-87中任一项所述的免疫缀合物。
115.如实施方案57-87中所述的免疫缀合物，具有选自以下的式：
116.在实施方案117中，X是其中R101、R2和R3如实施方案57-73中所定义。
117.在实施方案117中，X是其中R1、R2和R3如实施方案74-87中所定义。
118.具有式(I)结构的化合物或其立体异构体
其中：
R1是–N＝CR4R5；R2是-C1-C6烷基；R3是R4is-N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R9是-NHS(＝O)2LR11；R11是L是–(CH2)mX3(CH2)m-；X3是且
m各自独立地选自1、2和3。
119.式(III)的免疫缀合物
其中：
Ab代表抗原结合部分；
L是y是1-16的整数；R1是–N＝CR4R5；R2是-C1-C6烷基；
R113是R4是-N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R117是-NHS(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-；
m各自独立地选自1、2和3。
120.式(III)的免疫缀合物
其中：
Ab代表抗原结合部分；
L是-L1L2-；L1是-NHS(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-；L2是y是1-16的整数；
R1是–N＝CR4R5；R2是-C1-C6烷基；
R113是R4是-N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R117是键；
m各自独立地选自1、2和3。
121.在实施方案57-87和117-119的任一项中，除非另外描述，Ab可以是任何抗原结合部分，且优选地是识别细胞表面标志物的抗原或抗原片段，例如本文所述的那些是靶细胞例如癌细胞的特征的细胞表面标志物。
122.在实施方案57-87和117-119的任一项中，除非另外描述，Ab可以是任何抗原结合部分，通常是识别待靶向用于药物干预的细胞的抗原特征的抗原结合部分，例如癌细胞。许多合适的抗原是本领域公知的；本文描述了特别感兴趣的特异性抗原。通常，Ab是抗体，其可以是分离的或构建的，并且可以是天然的或修饰的(工程的)，或保留与抗体类似的抗原结合活性的抗体片段。
123.在上述实施方案的任一项中，m各自独立地选自1、2、3、4、5和6。在上述实施方案的任一项中，m各自独立地选自1、2、3、4和5。在上述实施方案的任一项中，m各自独立地选自1、2、3和4。在上述实施方案的任一项中，m各自独立地选自1、2和3。在上述实施方案的任一项中，m各自独立地选自1和2。
124.在上述实施方案的任一项中，n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在上述实施方案的任一项中，n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。在上述实施方案的任一项中，n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在上述实施方案的任一项中，n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在上述实施方案的任一项中，n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7和8。在上述实施方案的任一项中，n各自独立地选自1、2、3、4、5、6和7。在上述实施方案的任一项中，n各自独立地选自1、2、3、4、5和6。在上述实施方案的任一项中，n各自独立地选自1、2、3、4和5。在上述实施方案的任一项中，n各自独立地选自1、2、3和4。在上述实施方案的任一项中，n各自独立地选自1、2和3。在上述实施方案的任一项中，n各自独立地选自1和2。
125.在实施方案38-95的任一项中，y各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在上述实施方案的任一项中，y各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。在上述实施方案的任一项中，y各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在上述实施方案的任一项中，y各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。在上述实施方案的任一项中，y各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7和8。在上述实施方案的任一项中，y各自独立地选自1、2、3、4、5、6和7。在上述实施方案的任一项中，y各自独立地选自1、2、3、4、5和6。在上述实施方案的任一项中，y各自独立地选自1、2、3、4和5。在上述实施方案的任一项中，y各自独立地选自1、2、3和4。在上述实施方案的任一项中，y各自独立地选自1、2和3。在上述实施方案的任一项中，y各自独立地选自1和2。

Claims (64)

1.具有式(I)结构的化合物或其立体异构体，
其中，
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、–N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)C(O)OR12、-N＝CR5NR12(CH2)mN(R12)2、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20、–NHR8、-NHLR11、-NHR21、–N＝CR5R10、–N＝R22、–N＝CR5R23或-NHC(＝O)R23；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是-(CH2)mN(R12)2、-(CH2)mN(R12)C(＝O)OR12或未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、-OH、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2、-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)C(O)OR6和-C(＝O)NR6(CH2)mN(R6)2；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(O)2(CH2)mNH2、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-LR11、-NHS(O)2R18、-NHS(＝O)2LR11、
R10是LR11或
R11是-NR12C(＝O)CH＝CH2、-N3、SH、-SSR17、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR12C(＝O)CH2R13、-NR12C(＝O)CH2Br、-NR12C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、-C(O)NHNH2、-CO2H、-NH2、-NCO、-NCS、
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R13是–S(CH2)nCHR14NHC(＝O)R12或
R14是R12或–C(＝O)OR12；
R15是四唑基、-CN、-C(＝O)OR12、 -LR11或–X4LR11；
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR11取代；
R17是2-吡啶基或4-吡啶基；
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、-C(＝O)OR12、-C(＝O)(CH2)mN3、C1-C6卤代烷基、卤素、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R21是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基；
R22是C-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R23是N-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被LR11和0-2个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
L各自独立地选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，
其中L1是选自：
-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mX3-、-X3(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)n-、-((C(R12)2)mOC(＝O)NR12(CH2)mO(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(C(R12)2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-、-(CH2)mO(CH2)mNR12C(＝O)O((C(R12)2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mS(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12-、-(CH2)mNR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3-、-X3(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NR12(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)m-、-(CH2)mC(R12)2NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)mNR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(C(R12)2)m-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-、-(CH2)mO(CH2)m-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-、-(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-、-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-、-X1C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)X1-、-C(＝O)CHRaaNR12-、-NR12CHRaaC(＝O)-、-C(＝O)NR12-、-C(＝O)O-、-S-、-SCH2(C＝O)NR12-、-NR12C(＝O)CH2S-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-、-NR12C(＝S)-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-、-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-、
R24是H或Me；
R25各自独立地选自H或C1-4烷基；
R26是
Raa是H或选自以下的氨基酸的侧链：丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、苯基甘氨酸和叔丁基甘氨酸；
R30是H、-CH3或苯基；
R32各自独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R33独立地选自
R34独立地选自H、C1-4烷基和C1-6卤代烷基。
X1是自消化间隔物，选自
X2是二肽，选自
X3是且
X4是
L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键和L1；
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18，
或其互变异构体、水合物或可药用盐。
2.如权利要求1中所述的化合物，其中该化合物是具有式(Ia)结构的化合物：
3.如权利要求1或权利要求2中所述的化合物，其中该化合物是具有式(Ib)结构的化合物：
4.如权利要求1中所述的化合物，其中该化合物是具有式(Ic)结构的化合物：
5.如权利要求1或权利要求4中所述的化合物，其中该化合物是具有式(Id)结构的化合物：
6.如权利要求1中所述的化合物，其中该化合物是具有式(Ie)结构的化合物：
7.如权利要求1或权利要求6中所述的化合物，其中该化合物是具有式(If)结构的化合物：
8.如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中L各自独立地选自L1L2-和-L2L1-，或L是-L1-。
9.如权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、–N＝CR5R10、–N＝R22或–N＝CR5R23。
10.如权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中
R1是–N＝CR5R10、–N＝R22、-NHLR11、-NHR21、–N＝CR5R23或-NHC(＝O)R23。
11.如权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中
R1是-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20或-NHC(＝O)R23。
12.如权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中
R1是–NHR8、-NHLR11或-NHR21。
13.如权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中
R1是–N＝CR5R10、–N＝R22、-NHLR11、-NHR21、–N＝CR5R23或-NHC(＝O)R23。
14.如权利要求1-10中任一项所述的化合物，其中：
R1是–N＝CR4R5；
R4是-N(R6)2；
R5是N(R6)2；
且
R6各自独立地选自-C1-C6烷基。
15.如权利要求1-10或14中任一项所述的化合物，其中：
R1是
16.如权利要求1-15中任一项所述的化合物，其中R9是-OH、C1-C6烷氧基、-NHS(O)2(CH2)mN3、-NHS(O)2(CH2)mNH2、-NHS(＝O)2LR11或
17.如权利要求1-16中任一项所述的化合物，其中-R15是
18.如权利要求1-17中任一项所述的化合物，其中R11是
-S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-ONH2、N3、
19.如权利要求1-18中任一项所述的化合物，其中-R11是或-ONH2。
20.如权利要求1-19中任一项所述的化合物，其中L是–L1-，且–L1-选自：
-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、 -(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-和-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-。
21.如权利要求1-20中任一项所述的化合物，其中L是–L1-，且–L1-选自：
-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、 -(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-和-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-。
22.如权利要求1-21中任一项所述的化合物，其中L是–L1-，且–L1-选自：
-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)m-、、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-和-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-。
23.如权利要求1-22中任一项所述的化合物，其中R12是H、-CH3或–CH2CH3。
24.如权利要求1-23中任一项所述的化合物，其中R2是甲基、乙基、异丙基或仲丁基。
25.权利要求1的化合物，选自：
26.式(II)的免疫缀合物：
其中：
Ab代表抗原结合部分；
R101是-NHC(＝O)NR6*-、-NHR121*-、或-NHC(＝O)R123*-，其中*代表与L的连接点；
R2是-C1-C6烷基；
R3是
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R12)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NR12(CH2)mR16、-NHS(O)2R18或
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R15是四唑基、
R16是N-连接的包含独立地选自N、O、S、S(＝O)和S(＝O)2的1-2个杂原子的4-8元杂环烷基，其是未取代的或被-LR11取代；
R18各自独立地选自C1-C6烷基、被叠氮基取代的C1-C6烷基和被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R110是键或
R121是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元亚杂芳基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-CN、NO2、-C(＝O)OR6、-C(＝O)N(R6)2和C1-C6烷氧基；
R122是C-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元亚杂环烷基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R123是N-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元亚杂环烷基，其被独立地选自以下的0-2个取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
L是选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，
其中
L1选自：
-(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mX3-、-X3(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)n-、-((C(R12)2)mOC(＝O)NR12(CH2)mO(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(C(R12)2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-、-(CH2)mO(CH2)mNR12C(＝O)O((C(R12)2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)n-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mS(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12-、-(CH2)mNR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3-、-X3(CH2)m-、-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-、-NR12(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)m-、-(CH2)mC(R12)2NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NR12-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-、-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)mNR12-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-、-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-、-(C(R12)2)m-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-、-(CH2)mO(CH2)m-、-S(＝O)2(CH2)m-、-(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-、-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-、-(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-、-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-、-X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1X4-、-X1C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)X1-、-C(＝O)CHRaaNR12-、-NR12CHRaaC(＝O)-、-C(＝O)NR12-、-C(＝O)O-、-S-、-SCH2(C＝O)NR12-、-NR12C(＝O)CH2S-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-、-NR12C(＝S)-、-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-、-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-、-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-、-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-、
R24是H或Me；
R25独立地选自H或C1-4烷基；
R26是
Raa是H或选自以下的氨基酸的侧链：丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、苯基甘氨酸和叔丁基甘氨酸；
R30是H、-CH3或苯基；
R32独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R33独立地选自
R34独立地选自H、C1-4烷基和C1-6卤代烷基。
X1是自消化间隔物，选自
X2是二肽，选自
X3是且
X4是
y是1-16的整数；
L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键和L1；
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
27.如权利要求26所述的免疫缀合物，其中式(II)的免疫缀合物是式(IIa)的免疫缀合物：
28.如权利要求26或27所述的免疫缀合物，其中L是-L1L2-或–L2L1-。
29.如权利要求26-28中任一项所述的免疫缀合物，其中式(II)的免疫缀合物是式(IIb)的免疫缀合物：
30.如权利要求26-29中任一项所述的免疫缀合物，其中式(II)、式(IIa)或式(IIb)的免疫缀合物是具有式(IIc)结构的免疫缀合物：
31.如权利要求26-30中任一项所述的免疫缀合物，其中：
R101是且R110是键。
32.如权利要求26-31中任一项所述的免疫缀合物，其中：
R101是且R110是
33.如权利要求26-32中任一项所述的免疫缀合物，其中
R9是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R12)2、-NHS(O)2R18或-NR12(CH2)mR16；
且
R15是四唑基、
34.如权利要求26-33中任一项所述的免疫缀合物，其中R9是-OH、C1-C6烷氧基、-N(R14)2、-R16、-NR12(CH2)mN(R14)2或-NR12(CH2)mR16。
35.如权利要求26-34中任一项所述的免疫缀合物，其中R15是
36.如权利要求26-35中任一项所述的免疫缀合物，其中
R9是–OH或–OCH3。
37.如权利要求26-36中任一项所述的免疫缀合物，其中R12是H、-CH3或–CH2CH3。
38.如权利要求26-37中任一项所述的免疫缀合物，其中R2是甲基、乙基、异丙基或仲丁基。
39.如权利要求26-38中任一项所述的免疫缀合物，其中：
L1是-(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mX3(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-、-X3(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH*-、-(CH2)mNH(CH2)mC(＝O)*-、-((CH2)mO)n(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NH*-、-(CH2)mX3(CH2)m-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)*-、-(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-X3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)m(O(CH2)m)n*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n*-、-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m*-、-(CH2)mO(CH2)mNHC(＝O)O((C(R12)2)m*-、-(CH2)mS(＝O)2*-和-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2*-，其中L1的*是指与R101的连接点，
L2是 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、-NH(＝O)CH2CH2S-、-SCH2CH2C(＝O)NH-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中L2的*是指与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
40.如权利要求26-39中任一项所述的免疫缀合物，其中：
L1选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NH*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-、-X3(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-X3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)m(O(CH2)m)n*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n*-、-(CH2)mO(CH2)mNHC(＝O)O((C(R12)2)m*-、-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m*-和-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m*-，其中L1的*是指与R101的连接点；
L2是 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、-NH(＝O)CH2CH2S-、-SCH2CH2C(＝O)NH-、-S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中L2的*是指与L1的连接点，
且L3、L4、L5和L6是键。
41.如权利要求26-40中任一项所述的免疫缀合物，其中：
L1选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NH*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-、-(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)*-、-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m*-、-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)*-、-X3(CH2)m*-、-(CH2)mC(＝O)NH*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)mX3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-X3(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m*-、-(CH2)m(O(CH2)m)n*-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m(O(CH2)m)n*-、-(CH2)mO(CH2)mNHC(＝O)O((C(R12)2)m*-、-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m*-和-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNHC(＝O)(CH2)m*-，其中L1的*是指与R101的连接点；
L2是其中L2的*是指与L1的连接点，
且
L3、L4、L5和L6是键。
42.如权利要求26-41中任一项所述的免疫缀合物，其中：
L1选自-(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12*-、-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NH*-和-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)*-，其中L1的*是指与R101的连接点；
且
L2是其中L2的*是指与L1的连接点，
且
L3、L4、L5和L6是键。
43.式(III)的免疫缀合物：
其中：
Ab代表抗原结合部分；
R1是–N＝CR4R5、–N＝R19、–N＝CR5R20、-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4、-NHC(＝O)R20或–NHR8；
R2是-C1-C6烷基；
R4是-N(R6)2或-NR6R7；
R5是N(R6)2；
R6各自独立地选自H和-C1-C6烷基；
R7是未取代的C3-C8环烷基；
或R7是C3-C8环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、氧代、-C(＝O)R18、-(CH2)mOH、-C(＝O)(CH2)mOH、-C(＝O)((CH2)mO)nR12、-((CH2)mO)nR12或任选被1-5个羟基取代的C1-C6烷基；
R8是未取代的C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基；
或R8是C-连接的包含1-2个N杂原子的5-6元杂芳基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-OH、-N(R6)2、-CN、-NO2、-C(＝O)OR6和C1-C6烷氧基；
R12各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R19是未取代的C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R19是C-连接的包含独立地选自N和O的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素和C1-C6烷氧基；
R20是未取代的N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基；
或R20是N-连接的包含独立地选自N、O和S的1-2个杂原子的5-6元杂环烷基，其被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、-C(＝O)OR12、氧代、-OH和C1-C6烷氧基；
R113是
R117是键、-NH-、-NHS(＝O)2-、
R118是键、四唑基、
L是选自-L1L2L3L4L5L6-、-L6L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4L5-、-L5L4L3L2L1-、-L1L2L3L4-、-L4L3L2L1-、-L1L2L3-、-L3L2L1-、-L1L2-、-L2L1-和-L1，
其中
L1选自：
-(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)X1X2(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)mNR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-，-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)X1C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mX3-，-X3(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)n-，-((C(R12)2)mOC(＝O)NR12(CH2)mO(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(C(R12)2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-(CH2)m(O(CH2)m)nS(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mNR12(CH2)mC(＝O)-，-(CH2)mO(CH2)mNR12C(＝O)O((C(R12)2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)X1-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)n-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-，-(CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3-，-X3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-C(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mS(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12-，-(CH2)mNR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3-，-X3(CH2)m-，-((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-，-NR12(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)m-，-(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)NR12-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)-，-NR12(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12C(R12)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-NR12C(R12)2(CH2)mOC(＝O)NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12C(＝O)O(CH2)mC(R12)2NR12-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)mNR12-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)m-，-NR12((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(CH2)m(O(CH2)m)nNR12-，-(C(R12)2)m-，-(CH2CH2O)n-，-(OCH2CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)m-，-S(＝O)2(CH2)m-，-(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mS(＝O)2-，-S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2-，-(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)X2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mX2X1C(＝O)-，-C(＝O)X1X2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mNR12C(＝O)-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)-，-C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1C(＝O)NR12(CH2)m-，-×4X1X2C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)X2X1×4-，-X1C(＝O)(CH2)mNR12C(＝O)(CH2)m-，-(CH2)mC(＝O)NR12(CH2)mC(＝O)X1-，-C(＝O)CHRaaNR12-，-NR12CHRaaC(＝O)-，-C(＝O)NR12-，-C(＝O)O-，-S-，-SCH2(C＝O)NR12-，-NR12C(＝O)CH2S-，-S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2-，-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-，-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，-NR12C(＝S)-，-(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(＝O)-，-C(＝O)((CH2)mO)nX3(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-，-(CH2)m(O(CH2)m)nC(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mNR12C(＝O)NR12(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mNR12C(＝O)-，-C(＝O)NR12(CH2)mX3(CH2)m-，-NR12S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-，-(CH2)mX3(CH2)mS(＝O)2NR12-，
R24是H或Me；
R25各自独立地选自H或C1-4烷基；
R26是
Raa是H或选自以下的氨基酸的侧链：丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、苯基甘氨酸和叔丁基甘氨酸；
R30是H、-CH3或苯基；
R32各自独立地选自H、C1-4烷基、苯基、嘧啶和吡啶；
R33各自独立地选自
R34各自独立地选自H、C1-4烷基和C1-6卤代烷基。
X1是自消化间隔物，选自
X2是二肽，选自
X3是且
X4是
y是1-16的整数；
L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自键和L1，
m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，
且
n各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
44.如权利要求43-45中任一项所述的免疫缀合物，其中式(III)的免疫缀合物是式(IIIa)的免疫缀合物：
45.如权利要求43-44中任一项所述的免疫缀合物，其中L是-L1L2-或–L2L1-。
46.如权利要求43-45中任一项所述的免疫缀合物，其中式(III)的免疫缀合物是式(IIIb)的免疫缀合物：
47.如权利要求43-46中任一项所述的免疫缀合物，其中式(III)、式(IIIa)或式(IIIb)的免疫缀合物是式(IIIc)的免疫缀合物：
48.如权利要求43-47中任一项所述的免疫缀合物，其中R1是–N＝CR4R5、–N＝R19或–N＝CR5R20。
49.如权利要求43-47中任一项所述的免疫缀合物，其中R1是-NHC(＝NR6)R4、-NHC(＝O)R4或-NHC(＝O)R20。
50.如权利要求43-47中任一项所述的免疫缀合物，其中R1是–NHR8。
51.如权利要求43-48中任一项所述的免疫缀合物，其中：
R1是–N＝CR4R5；
R4是-N(R6)2；
R5是N(R6)2；
且
R6各自独立地选自-C1-C6烷基。
52.如权利要求43-48或51中任一项所述的免疫缀合物，其中R1是
53.如权利要求43-52中任一项所述的免疫缀合物，其中R12是H、-CH3或–CH2CH3。
54.如权利要求43-53中任一项所述的免疫缀合物，其中R2是甲基、乙基、异丙基或仲丁基。
55.如权利要求43-54中任一项所述的免疫缀合物，其中：
L1选自-*(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mX3-、-*C(＝O)(CH2)m-、-*NHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3-、-*(CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*((C(R12)2)mOC(＝O)NH(CH2)mO(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-、-*C(＝O)NH(CH2)m)-、-*C(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mS(＝O)2((CH2)mO)n(CH2)m-、-*C(＝O)(CH2)mNR12(CH2)m-、-*C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-、-*(CH2)m(O(CH2)m)n-、-*C(＝O)(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)NH(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-和-C(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)-，其中L1的*是指与R3的连接点；
L2是键、 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、 -S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中L2的*是指与L1的连接点；
且L3、L4、L5和L6是键。
56.如权利要求43-54中任一项所述的免疫缀合物，其中：
L1选自-*(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mX3-、-*C(＝O)(CH2)m-、-*NHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3-、-*(CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*((C(R12)2)mOC(＝O)NH(CH2)mO(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-和-*C(＝O)NH(CH2)m)-，其中L1的*是指与R3的连接点；
L2是 -S-、-SCH2(C＝O)NH-、-NHC(＝O)CH2S-、 -S(＝O)2CH2CH2S-、-SCH2CH2S(＝O)2-、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2S-或-SCH2CH2S(＝O)2CH2CH2-，其中L2的*是指与L1的连接点；
且L3、L4、L5和L6是键。
57.如权利要求43-56中任一项所述的免疫缀合物，其中：
L1选自-*(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mX3-、-*C(＝O)(CH2)m-、-*NHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3-、-*(CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*((C(R12)2)mOC(＝O)NH(CH2)mO(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-和-*C(＝O)NH(CH2)m)-，其中L1的*是指与R3的连接点；
L2是 其中L2的*是指与L1的连接点；
且L3、L4、L5和L6是键。
58.如权利要求43-57中任一项所述的免疫缀合物，其中：
L1选自-*(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mX3-、-*C(＝O)(CH2)m-、-*NHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3-、-*(CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*((C(R12)2)mOC(＝O)NH(CH2)mO(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mNHC(＝O)X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X4X1X2C(＝O)(CH2)m-、-*X1C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*NH2S(＝O)2(CH2)mX3(CH2)m-、-*C(＝O)((CH2)mO)n(CH2)m)-和-*C(＝O)NH(CH2)m)-，其中L1的*是指与R3的连接点；
L2是其中L2的*是指与L1的连接点；
且L3、L4、L5和L6是键。
59.如权利要求43-58中任一项所述的免疫缀合物，其中：
L1选自-*(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mX3-、-*C(＝O)(CH2)m-、-*NHC(＝O)(CH2)m-、-(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mX3-、-*(CH2)mO)n(CH2)m-、-*(CH2)mO)n(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-、-*((C(R12)2)mOC(＝O)NH(CH2)mO(CH2)m-、-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3-和-*(CH2)mC(＝O)NH(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-，其中L1的*是指与R3的连接点；
L2是其中L2的*是指与L1的连接点；
且L3、L4、L5和L6是键。
60.包含如权利要求26-59中任一项所述的免疫缀合物和一种或多种可药用载体的药物组合物。
61.包含治疗有效量的如权利要求26-59中任一项所述的免疫缀合物和一种或多种治疗活性的共活性剂的组合。
62.治疗细胞增殖病症的方法，包括向需要此治疗的个体施用治疗有效量的如权利要求26-59中任一项所述的免疫缀合物。
63.用作药物的如权利要求26-59中任一项所述的免疫缀合物。
64.用于治疗癌症的如权利要求26-59中任一项所述的免疫缀合物。
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