JP7252333B2 - 酸法による抗体薬物複合体中間体の調製方法及びその応用 - Google Patents

酸法による抗体薬物複合体中間体の調製方法及びその応用 Download PDF

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Description

本発明は、抗体薬物複合体の分野に関し、具体的には、抗体薬物複合体中間体の調製方法及び抗体薬物複合体の調製におけるその応用に関する。
抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、新規な生物学的ミサイルとして、モノクローナル抗体標的化と小分子薬物細胞毒性の強力な組み合わせを実現し、腫瘍標的療法の分野で最も急速に成長している分野の１つである。ＡＤＣの３つの要件（抗体、細胞毒素及びリンカー）は、一緒になって標的化薬物送達システムを形成し、中でも、抗体は、標的化を達成し、リンカーは、ＡＤＣの血液輸送中の安定性を保証し、標的点に到達した後、毒素は、癌細胞に殺傷効果を発揮する。
現在、ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ又はｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓは、ＡＤＣ開発で最も広く使用されている２つの有糸分裂阻害剤であり、ビンブラスチン結合部位の近くのチューブリンに結合して、引起Ｇ２／Ｍ細胞周期停止とそれに続くアポトーシスを引き起こすことができる。この細胞殺傷メカニズムは急速に増殖する細胞に非常に効果的であるが、非分裂及び静止細胞は薬剤の影響に対する感受性が低く、薬剤耐性につながる可能性があり、腫瘍細胞はほとんどの正常細胞よりも速く分裂するため、抗有糸分裂薬は癌細胞に特に効果的である。この固有の選択性のために、効率よい微小管阻害剤、例えば、メイタンシン及びａｕｒｉｓｔａｔｉｎは、臨床的に承認されたＡＤＣ医薬品（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂｖｅｄｏｔｉｎ及びｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂｅｍｔａｎｓｉｎｅなど）として首尾よく使用されている。
ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）は、インド洋産のアメフラシ類であるタツナミガイ（Ｄｏｌａｂｅｌｌａ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）に見られる高い細胞毒性を持つ線状ペプチド化合物であり、このような細胞毒性薬は、チューブリンの形成及び重合を大幅に阻害することができる。しかしながら、ドラスタチン １０は、単独で使用した場合、毒性と副作用が大きく、薬物動態特性が低く、治療域が狭いため、その開発が制限されている。Ｍｉｙａｚａｋｉらは、Ｎ末端に２級アミンを有するモノメチルアウリスタチン Ｄ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｄ、ＭＭＡＤ）の毒性がドラスタチン １０と同等であることを発見し、このようなＮ－モノメチル置換ドラスタチン誘導体をアウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）と名付け、それらは、リンカーとの効果的な接続を実現でき、新世代の高効率ＡＤＣも生み出される。現在、ＡＤＣの開発で一般的に使用される弾頭分子は、アウリスタチン類化合物ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦである（胡馨月、李艶萍、李卓栄． 抗体薬物複合体の弾頭分子の研究進展［Ｊ］．中国医薬生物技術、２０１７（６）：５４９－５５５．）。
ＭＭＡＦ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）は、ドラスタチン１０（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ１０、Ｄ１０）の誘導体であり、細胞の有糸分裂を阻害することができ、強力な抗腫瘍活性を持つ。現在、臨床試験を行っている複数のＡＤＣ製品にカップリングされる細胞傷害性分子には、ＭＭＡＦがあり、現在のＡＤＣにおいて最も多く選択されているモノメチルアウリスタチン誘導体の１つでもある。但し、これらの小分子薬は高価である。
ＭＭＡＦの市場価格は、１０ｍｇあたり５０００元に近く、抗体にカップリングするための中間体Ｍｃ－ＭＭＡＦの市場価格は、１ｍｇあたり６０００元に近く、ＭＭＡＦからＭｃ－ＭＭＡＦ中間体への価格は、１０倍以上上昇する（ＭＭＡＦ、Ｍｃ－ＭＭＡＦの価格は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ．ｃｎ／ｍｍａｆ－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ．ｈｔｍｌ？ｓｒｃ＝３６０－ｐｒｏｄｕｃｔ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ．ｃｎ／ＭｃＭＭＡＦ．ｈｔｍｌを参照する）。ＡＤＣ中間体の高価格は、関連するＡＤＣの高い製造コストの重要な要因になる。
対応する細胞毒性分子よりも、関連するＡＤＣ中間体（共有結合的リンカー－薬物複合体）の価格が急激に上昇する重要な理由は、抗体薬物複合体の中間体、即ち調製プロセスの収率が低いことである。従って、関連するＡＤＣ中間体の収率を向上させることにより、ＡＤＣ薬の大規模生産コストを効果的に制御することができる。
Ｍｃ－ＭＭＡＦの構造は、以下の通りである。
Figure 0007252333000001
Ｍｃ－ＭＭＡＥの構造は、以下の通りである。
Figure 0007252333000002
Ｍｃ－ＭＭＡＤの構造は、以下の通りである。
Figure 0007252333000003
特許公開番号ＣＮ１９３８０４６Ａの中国特許は、Ｍｃ－ＭＭＡＦを調製するための２つの方法（明細書第２０６～２０７頁及び明細書第２０７～２０８頁）を開示しており、そのうちの１つは、ｔｅｒｔ－ブチルエステルによるＭｃ－ＭＭＡＦの合成であり、もう１つは、ジメトキシベンジルエステルによるＭｃ－ＭＭＡＦの合成であり、これらの２つの方法の合成経路は、それぞれ、以下の通りである。
（１）ｔｅｒｔ－ブチルエステルによるＭｃ－ＭＭＡＦの合成
Figure 0007252333000004
（２）ジメトキシベンジルエステルによるＭｃ－ＭＭＡＦの合成
Figure 0007252333000005
これらの２つの経路は、いずれも二段階合成法を使用し、ｔｅｒｔ－ブチルエステルによるＭｃ－ＭＭＡＦの合成経路は、まず、Ｍｃ－ＭＭＡＦ－ＯｔＢｕ（即ち、Ｍｃ－ＭｅＶａｌ－Ｖａｌ－Ｄｉｌ－Ｄａｐ－Ｐｈｅ－ＯｔＢｕ）を合成し、次に、トリフルオロ酢酸で脱エステル化し、Ｍｃ－ＭＭＡＦ（総収率は、６０％未満である。）を得る。ジメトキシベンジルエステルによるＭｃ－ＭＭＡＦの合成経路は、まず、Ｍｃ－ＭＭＡＦ－ＯＤＭＢ（即ち、Ｍｃ－ＭｅＶａｌ－Ｖａｌ－Ｄｉｌ－Ｄａｐ－Ｐｈｅ－ＯＤＭＢ）を合成し、次いで、トリフルオロ酢酸で脱エステル化し、Ｍｃ－ＭＭＡＦを得る。欠点は、二段階合成において、第１の階段の収率が５７％であり、第２の階段の収率が７３％であり、総収率が４２％だけであり、また、ＭＭＡＦ－ＯＤＭＢが得られにくい。
特許公開番号ＣＮ１０９８２４７５９Ａの中国特許は、ＭｃとＭＭＡＦの直接反応によるＭｃ－ＭＭＡＦの調製方法（明細書の第２頁第［０００９］行）も開示しており、そのプロセス経路は、以下の通りである。
Figure 0007252333000006
その経路は、ＭＭＡＦのＮ末端バリンのＮには１つのメチル基があり、立体障害が大きく、この場合には、マレイミドｎ－ヘキサン酸（Ｍｃ－ｈｅｘ－Ａｃｉｄ）をＭＭＡＦに連結すると、反応速度が遅くなる。その経路は、１ｇ未満のＭＣ－ＭＭＡＦの合成に使用され、最後に、逆相キラル分離用分取ＨＰＬＣを使用して異性体不純物を除去し、収率は、５０％未満である。
本発明は、酸法による抗体薬物複合体の中間体の調製方法を提供する。
本発明に係る実施形態は、酸法による抗体薬物複合体中間体の調製方法であって、その反応経路は、以下の通りであり、
Figure 0007252333000007
（式中、
Ｌは、アシル基を含む任意の連結基であり、
Ｌ’は、モノメチルアウリスタチン誘導体を共有結合させた後の連結基の残基であり、
溶媒Ａ及び溶媒Ｂは、任意の極性又は非極性溶媒である。）
１）連結基Ｌ、縮合剤及び有機塩基を溶媒Ａに溶解させ、溶液１を形成するステップと、
２）モノメチルアウリスタチン誘導体及び酸を溶媒Ｂに溶解させ、溶液２を形成するステップと、
３）溶液１を溶液２に加え、Ｌとモノメチルアウリスタチン誘導体の縮合反応によりＬ’－モノメチルアウリスタチン誘導体を得るステップと、を含み、
ここで、ステップ１）で加えられた有機塩基のモル量は、ステップ３）の反応系におけるすべての遊離カルボキシル基のモル量よりも多い、方法である。
さらに、前記酸は、トリフルオロ酢酸、スルホン酸から選ばれる１つ又は複数の組み合わせである。
さらに、前記モノメチルアウリスタチン誘導体は、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＤを含む。
さらに、前記方法の反応経路は、次のとおりである。
Figure 0007252333000008
さらに、前記縮合剤は、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＨＢＰＩＰＵ、ＨＢＰｙＵ、ＨＣＴＵ、ＨＤＭＡ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＣＴＵ、ＴＣＦＨ、ＴＤＢＴＵ、ＴＦＦＨ、ＢＴＦＦＨ 、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＣｌＯＰ、ＰｙＡＯＰ、ＰｙＣＩＵ、ＤＥＰＢＴ、ＥＥＤＱの１つ又は複数であり、好ましくは、前記縮合剤は、ＨＡＴＵである。
さらに、前記有機塩基は、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、トリエチレンジアミン、Ｎ－メチルモルホリン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン、Ｎ－メチルイミダゾール、キヌクリジン、トリメチルピリジンの１つ又は複数であり、好ましくは、前記有機塩基は、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンである。
さらに、前記溶媒Ａ及び溶媒Ｂは、それぞれ独立して、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＮＭＰ、ジクロロメタン、四塩化炭素、ＤＭＳＯ、クロロホルム、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、ヘキサメチルリン酸トリアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピレン尿素、エチレングリコールジメチルエーテルから選ばれる１つ又は複数であり、溶媒Ａ及び溶媒Ｂは、同一でも異なっていてもよく、好ましくは、溶媒Ａ及び溶媒Ｂは、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭＳＯである。
また、前記スルホン酸は、ｐ－トルエンスルホン酸、ベンゼンスルフィン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、（－）－１０－カンファースルホン酸、（＋）－１０－カンファースルホン酸、メタンスルホン酸の１つ又は複数を含み、前記ｐ－トルエンスルホン酸は、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物であることが好ましい。
好ましくは、前記Ｌは、アシル基を含む任意の連結基であり、その構造が式（Ｉ）で示される。
Figure 0007252333000009
より好ましくは、前記Ｌは、
Figure 0007252333000010
から選ばれる。
より好ましくは、前記Ｌ’－ＭＭＡＦは、
Figure 0007252333000011
から選ばれる。
さらに、対応するモノメチルアウリスタチン誘導体に対する前記酸用量のモル比は、１以上、又は２以上であることが好ましい。
さらに、前記溶液１への溶液２の添加方法は、いずれも均一に添加する又は滴下することである。
本発明は、さらに、抗体薬物複合体の調製における上記のいずれか１項に記載の方法の応用を提供する。
本発明で提供される酸法による抗体薬物複合体中間体（具体的には、共有結合的な連結基－ＭＭＡＦ複合体）の調製方法は、従来の調製方法（特許公開番号ＣＮ１９３８０４６Ａの中国特許の明細書の第２頁第［０００９］行に開示されている調製方法）に基づいて酸性添加剤を加え、ＭＭＡＦが塩になった後、反応に関与させ、一連の反応を経った後、酸性添加剤の添加により最終生成物の収率を有意に向上させることができることを予想外に発見し、しかも、酸の価格は低く（ＭＭＡＦと比較して無視できる。）、最終的なＡＤＣ製品の製造コストを大幅に削減する。さらに、特許公開番号ＣＮ１９３８０４６Ａに開示されている２つの方法よりも、本発明で提供される調製方法は、ワンステップ調製法を使用し、最終生成物のより高い収率の以外は、生産中に、消耗品、手間、設備、場所、原材料などのコストを節約するだけでなく、生産廃液を大幅に削減し、生産コストを低減させ、生産効率を向上させ、工業的大規模生産に適している。
図１は、本発明の実施例２で各種のスルホン酸系添加剤を加えた生成物の液体クロマトグラムを示す。 図２は、本発明の実施例３で異なるモル量のｐ－トルエンスルホン酸一水合物を加えた場合の反応生成物の面積比（面積比とは、クロマトグラムにおいて生成物のピーク面積と基準面積の比であり、基準面積は、酸性添加剤とＭＭＡＦ用量のモル比が１：１になる時のピーク面積である。）の折れ線グラフを示す。 図３は、本発明の実施例４で異なるモル量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを加えた反応生成物の液体クロマトグラムを示す。
［略語］
特に断りのない限り、本発明で使用されるすべての略語は、当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本発明で使用されるように、一般的に使用される略語およびそれらの定義は以下の通りである。
Figure 0007252333000012
Figure 0007252333000013
［定義］
明細書の様々な側面に関連する様々な用語は、明細書および特許請求の範囲全体で使用されている。特に明記しない限り、そのような用語は、当技術分野においてそれらの通常の意味を有する。その他の具体的に定義された用語は、本明細書で提供されている定義と一致する方法で理解する必要がある。
本明細書で使用される「１つ」、「１種」及び「前記」という用語は、標準的な慣習に従って使用され、文脈上別段の指示がない限り、１つまたは複数を意味する。従って、例えば、「抗体薬物複合体」への言及は、２つ又はそれ以上の抗体薬物複合体の組み合わせなどを含む。
本明細書において「含む」という言葉を使用して説明する場合の以外は、さらに「．．．からなる」及び／又は「基本に．．．からなる」という言葉で説明する類似の場合があることを理解すべきである。
発明の広い範囲に示されている数値範囲およびパラメータの近似値であるが、具体的な実施例に示されている数値は、可能な限り正確に記録されている。しかしながら、いずれの値にもそれぞれの測定値に存在する標準偏差によって引き起こされる一定のエラーが本質的に含まれている。また、本明細書に開示されるすべての範囲は、そこに含まれるすべてのサブ範囲をカバーすると理解されるべきである。例えば、記載されている「１～１０」という範囲は、最小値１から最大値１０まで（エンドポイントを含む）のすべてのサブ範囲、つまり、最小値１又はそれ以上から始まるすべてのサブ範囲、例えば、１～６．１、及び最大値１０又はそれ以下まで終わるすべてのサブ範囲、例えば、５．５～１０を含むことを理解すべきである。また、「本明細書に組み込まれる」と呼ばれる参照は、その全体が組み込まれるものとして理解されるべきである。
本発明で使用される
Figure 0007252333000014
とは、
Figure 0007252333000015
を含む基がここで化学結合を介して他の基と結合していることを意味する。
本発明に係る「連結基」という用語とは、タンパク質／抗体分子およびＭＭＡＦとそれぞれ反応することができる二官能性または多機能基を有する分子を指し、したがって、「ブリッジ」としてタンパク質／抗体とＭＭＡＦとを連結される。本発明に係る連結基は、特に、構造にアシル基を含む基を指す。
本発明に係る「抗体薬物複合体中間体」という用語とは、共有結合的な連結基－ＭＭＡＦ複合体を意味する。
以下、具体的な実施形態により本発明をさらに説明する。これらの実施形態は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。以下の実施形態で特定の条件を指定しない実験方法は、通常、従来の条件又は製造元が推奨する条件に従って実施され、具体的な供給源が記載されていない試薬は、市場で購入されている通常の試薬である。特に明記されていない限り、すべての百分率、比率、割合、又は部は、重量とするものである。
本発明に係る重量体積パーセントの単位は、当業者に周知であり、例えば、１００ｍｌの溶液中の溶質の重量を指す。
特に定義されていない限り、本明細書で使用されているすべての本分野および科学的用語は、当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。さらに、本明細書に記載されたものと類似又は同等である任意の方法及び材料は、本発明の方法に適用することができる。本明細書に記載されている好ましい実施形態及び材料は、例示されたものだけである。
実施例１ Ｍｃ－ＭＭＡＦ調製方法の酸性試薬の添加効果の対照
Ｍｃ－ＭＭＡＦ調製方法１（酸なし）
Figure 0007252333000016
Ｍｃ－ＯＨ ８４．６ｍｇ及びＨＡＴＵ １４４．６ｍｇを秤量し、５０ｍＬの丸底フラスコに加え、５ｍＬシリンジを使用してＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド ５ｍＬを丸底フラスコに入れ、次いで、２００μＬのピペットマンを使用してＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン １６５．４μＬを吸い取ってサンプルボトルに入れ、マグネチックスターラー上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ １４６．４ｍｇを秤量して２５ｍＬ丸底フラスコに投入し、１０ｍＬのシリンジでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド １０ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、マグネチックスターラー上の氷浴を取り外し、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
反応終了後、ロータリーエバポレーターで溶媒をよく蒸発させ、アセトニトリル ５ｍＬを加え、５ｍＬのシリンジで吸い取った後、シリンジフィルター(有機溶媒用)で１０ｍＬのオートサンプラーバイアルにろ過し、分取ＨＰＬＣにより精製した。調製方法は、移動相Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＨＣＯＯＨ、移動相Ｂ：ＭｅＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨ、流速４０ｍＬ／ｍｉｎ、グラジエント：２５％ Ｂ－７０％ Ｂ、３０ｍｉｎ、２５．１ｍｉｎの時点にピークが現れた。１回目の注入で５ｍＬロードし、分取液４５ｍＬを得、サンプルボトルにアセトニトリル ５ｍＬを加え、２回目の注入で５ｍＬロードし、分取液４５ｍＬを得た。得られた分取液を２５０ｍＬの丸底フラスコに合わせ、－８０℃の冷蔵庫に入れて３ｈ冷凍し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥した後、Ｍｃ－ＭＭＡＦの純粋な製品１０２．７ｍｇ（収率５２％）を得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ） ＋：９２４．４；（Ｍ－Ｈ） －：９２２．９。
Ｍｃ－ＭＭＡＦの調製方法２（トリフルオロ酢酸の添加）
Figure 0007252333000017
Ｍｃ－ＯＨ ８４．８ｍｇ及びＨＡＴＵ １４４．７ｍｇを秤量し、５０ｍＬの丸底フラスコに入れ、５ｍＬのシリンジでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド ５ｍＬを採取して丸底フラスコに入れ、次いで２００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１６５．４μＬを採取してサンプルボトルに入れ、マグネチックスターラー上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ １４６．４ｍｇ及びトリフルオロ酢酸２２．８ｍｇを秤量し、２５ｍＬの丸底フラスコに加え、１０ｍＬのシリンジでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド １０ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、マグネチックスターラー上の氷浴を取り外し、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
反応終了後、ロータリーエバポレーターで溶媒をよく蒸発させ、アセトニトリル ５ｍＬを加え、５ｍＬのシリンジで吸い取った後、シリンジフィルター(有機溶媒用)で１０ｍＬのオートサンプラーバイアルにろ過し、分取ＨＰＬＣにより精製した。調製方法は、移動相Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＨＣＯＯＨ、移動相Ｂ：ＭｅＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨ、流速４０ｍＬ／ｍｉｎ、グラジエント：２５％ Ｂ－７０％ Ｂ、３０ｍｉｎ、２５．１ｍｉｎの時点にピークが現れた。１回目の注入で５ｍＬロードし、分取液４５ｍＬを得、サンプルボトルにアセトニトリル ５ｍＬを加え、２回目の注入で５ｍＬロードし、分取液４５ｍＬを得た。得られた分取液を２５０ｍＬの丸底フラスコに合わせ、－８０℃の冷蔵庫に入れて３ｈ冷凍し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥した後、Ｍｃ－ＭＭＡＦの純粋な製品１１４．１ｍｇ（収率６２％）を得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ） ＋：９２４．４；（Ｍ－Ｈ） －：９２２．９。
Ｍｃ－ＭＭＡＦの調製方法３（ｐ－トルエンスルホン酸一水合物の添加）
Figure 0007252333000018
Ｍｃ－ＯＨ ８４．６ｍｇ及びＨＡＴＵ １４４．２ｍｇを秤量し、５０ｍＬの丸底フラスコに入れ、５ｍＬのシリンジでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド ５ｍＬを採取して丸底フラスコに入れ、次いで２００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１６５．４μＬを採取してサンプルボトルに入れ、マグネチックスターラー上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ １４６．４ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物３４．８ｍｇを秤量し、２５ｍＬの丸底フラスコに加え、１０ｍＬのシリンジでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド １０ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、マグネチックスターラー上の氷浴を取り外し、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
反応終了後、ロータリーエバポレーターで溶媒をよく蒸発させ、アセトニトリル ５ｍＬを加え、５ｍＬのシリンジで吸い取った後、シリンジフィルター(有機溶媒用)で１０ｍＬのオートサンプラーバイアルにろ過し、分取ＨＰＬＣにより精製した。調製方法は、移動相Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＨＣＯＯＨ、移動相Ｂ：ＭｅＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨ、流速４０ｍＬ／ｍｉｎ、グラジエント： ２５％ Ｂ－７０％ Ｂ、３０ｍｉｎ、２５．１ｍｉｎの時点にピークが現れた。１回目の注入で５ｍＬロードし 、分取液４５ｍＬを得、サンプルボトルにアセトニトリル ５ｍＬを加え、２回目の注入で５ｍＬロードし 、分取液４５ｍＬを得た。得られた分取液を２５０ｍＬの丸底フラスコに合わせ、－８０℃の冷蔵庫に入れて３ｈ冷凍し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥した後、Ｍｃ－ＭＭＡＦの純粋な製品１２５．９ｍｇ（収率６８％）を得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ） ＋：９２４．４；（Ｍ－Ｈ） －：９２２．９。
Ｍｃ－ＭＭＡＦの調製方法４（（－）－１０－カンファースルホン酸の添加）
Figure 0007252333000019
Ｍｃ－ＯＨ ８４．２ｍｇ及びＨＡＴＵ １４４．４ｍｇを秤量し、５０ｍＬの丸底フラスコに入れ、５ｍＬのシリンジでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド ５ｍＬを採取して丸底フラスコに入れ、次いで２００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１６５．４μＬを採取してサンプルボトルに入れ、マグネチックスターラー上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ １４７．０ｍｇ及び（－）－１０－カンファースルホン酸４６．８ｍｇを秤量し、２５ｍＬの丸底フラスコに加え、１０ｍＬのシリンジでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド １０ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、マグネチックスターラー上の氷浴を取り外し、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
反応終了後、ロータリーエバポレーターで溶媒をよく蒸発させ、アセトニトリル ５ｍＬを加え、５ｍＬのシリンジで吸い取った後、シリンジフィルター(有機溶媒用)で１０ｍＬのオートサンプラーバイアルにろ過し、分取ＨＰＬＣにより精製した。調製方法は、移動相Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＨＣＯＯＨ、移動相Ｂ：ＭｅＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨ、流速４０ｍＬ／ｍｉｎ、グラジエント： ２５％ Ｂ－７０％ Ｂ、３０ｍｉｎ、２５．１ｍｉｎの時点にピークが現れた。１回目の注入で５ｍＬロードし 、分取液４５ｍＬを得、サンプルボトルにアセトニトリル ５ｍＬを加え、２回目の注入で５ｍＬロードし 、分取液４５ｍＬを得た。得られた分取液を２５０ｍＬの丸底フラスコに合わせ、－８０℃の冷蔵庫に入れて３ｈ冷凍し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥した後、Ｍｃ－ＭＭＡＦの純粋な製品１１７．４ｍｇ（収率６４％）を得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ） ＋：９２４．４；（Ｍ－Ｈ） －：９２２．９。
Ｍｃ－ＭＭＡＦの調製方法５（トリフルオロメタンスルホン酸の添加）
Figure 0007252333000020
Ｍｃ－ＯＨ ８４．６ｍｇ及びＨＡＴＵ １４４．７ｍｇを秤量し、５０ｍＬの丸底フラスコに入れ、５ｍＬのシリンジでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド ５ｍＬを採取して丸底フラスコに入れ、次いで２００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１６５．４μＬを採取してサンプルボトルに入れ、マグネチックスターラー上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ １４６．５ｍｇ及びトリフルオロメタンスルホン酸３０．０ｍｇを秤量し、２５ｍＬの丸底フラスコに加え、１０ｍＬのシリンジでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド １０ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、マグネチックスターラー上の氷浴を取り外し、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
反応終了後、ロータリーエバポレーターで溶媒をよく蒸発させ、アセトニトリル ５ｍＬを加え、５ｍＬのシリンジで吸い取った後、シリンジフィルター(有機溶媒用)で１０ｍＬのオートサンプラーバイアルにろ過し、分取ＨＰＬＣにより精製した。調製方法は、移動相Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＨＣＯＯＨ、移動相Ｂ：ＭｅＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨ、流速４０ｍＬ／ｍｉｎ、グラジエント： ２５％ Ｂ－７０％ Ｂ、３０ｍｉｎ、２５．１ｍｉｎの時点にピークが現れた。１回目の注入で５ｍＬロードし、分取液４５ｍＬを得、サンプルボトルにアセトニトリル ５ｍＬを加え、２回目の注入で５ｍＬロードし 、分取液４５ｍＬを得た。得られた分取液を２５０ｍＬの丸底フラスコに合わせ、－８０℃の冷蔵庫に入れて３ｈ冷凍し、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥した後、Ｍｃ－ＭＭＡＦの純粋な製品１２１．２ｍｇ（収率６６％）を得た。ＬＣ－ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ） ＋：９２４．４；（Ｍ－Ｈ） －：９２２．９。
前記の試験では、上記Ｍｃ－ＭＭＡＦの調製方法１に基づいてさらに検討を行い、ＭＭＡＦ反応溶液を調製する際、酸又はアルカリ試薬を加えることによりＭＭＡＦをまず塩に変換させ、その後、反応を行った。予備試験においてトリフルオロ酢酸、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシドなどの試薬を添加することにより、ＭＭＡＦ反応試薬を調製する際、トリフルオロ酢酸を加えた後（Ｍｃ－ＭＭＡＦの調製方法２）、Ｍｃ－ＭＭＡＦの製品収率が大幅に向上したことを発見した。
そして、他の酸を添加する効果を検討した。中でも、さまざまな酸の添加は、いずれも製品収率に驚くべき影響を及ぼした。例えば、比較対照試験のために、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物を添加すると（Ｍｃ－ＭＭＡＦの調製方法３）、Ｍｃ－ＭＭＡＦの製品収率も驚くほど向上した。Ｍｃ－ＭＭＡＦの製品収率は、５２％から６８％に向上し、収率の絶対値は、１６％向上し、酸を添加しない調製方法１よりも、酸を添加した後の収率の相対値は、３０．７％（（６８％－５２％）／５２％）向上した。さらに、（－）－１０－カンファースルホン酸及びトリフルオロメタンスルホン酸を加える試験群におけるＭｃ－ＭＭＡＦの製品収率は、それぞれ６４％及び６６％に達した。
試験結果は、反応系に酸性試薬を加えることによりＭｃ－ＭＭＡＦの製品収率を効果的に向上させることができることを示した。
実施例２ 各種のスルホン酸系添加剤の添加による試験結果
Figure 0007252333000021
試験例１）（－）－１０－カンファースルホン酸の添加：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２２．３μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及び（－）－１０－カンファースルホン酸６．３ｍｇを秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例２）（＋）－１０－カンファースルホン酸の添加：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２２．３μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及び（＋）－１０－カンファースルホン酸６．３ｍｇを秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例３）１０－カンファースルホン酸の添加：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２２．３μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及び１０－カンファースルホン酸６．３ｍｇを秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例４）メタンスルホン酸の添加：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２２．３μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びメタンスルホン酸２．６ｍｇを秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例５）トリフルオロメタンスルホン酸の添加：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２２．３μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びトリフルオロメタンスルホン酸 ４．１ｍｇを秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例６）ｐ－トルエンスルホン酸一水合物の添加：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２２．３μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物４．７ｍｇを秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
検出結果は、図１に示し、各種のスルホン酸、例えば、（－）－１０－カンファースルホン酸、（＋）－１０－カンファースルホン酸、１０－カンファースルホン酸、メタンスルホン酸及びトリフルオロメタンスルホン酸といった添加剤を反応系に加えることにより、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物の添加剤の添加と同等の反応促進効果が得られ、いずれもＭｃ－ＭＭＡＦの製品収率を効果的に向上させることができた。
実施例３ 酸性添加剤の添加量による試験への影響
試験例１）酸性添加剤なし：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇ（０．０５４ｍｍｏｌ）を秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン ３５．７μＬ（０．２１６ｍｍｏｌ）を採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。秤量ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ（０．０２７ｍｍｏｌ）、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例２）酸性添加剤とＭＭＡＦ用量のモル比１：
１００： Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．７μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物４６μｇ（２．７＊１０-4ｍｍｏｌ）を秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例３）酸性添加剤とＭＭＡＦ用量のモル比１：２０：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．７μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物０．２３ｍｇ（１３．５＊１０-4ｍｍｏｌ）を秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例４）酸性添加剤とＭＭＡＦ用量のモル比１：１０：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．７μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物０．４６ｍｇ（２．７＊１０-3ｍｍｏｌ）を秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例５）酸性添加剤とＭＭＡＦ用量のモル比１：５：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．７μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物０．９２ｍｇ（５．４＊１０-3ｍｍｏｌ）を秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例６）酸性添加剤とＭＭＡＦ用量のモル比２：５：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．７μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物１．８４ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）を秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例７）酸性添加剤とＭＭＡＦ用量のモル比１：２：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．７μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物２．３ｍｇ（０．０１４ｍｍｏｌ）を秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例８）酸性添加剤とＭＭＡＦ用量のモル比１：１：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．７μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物４．６ｍｇ（０．０２７ｍｍｏｌ）を秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例９）酸性添加剤とＭＭＡＦ用量のモル比２：１：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．７μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物９．３ｍｇ（０．０５４ｍｍｏｌ）を秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例１０）酸性添加剤とＭＭＡＦ用量のモル比３：１：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．７μＬを採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物１３．９ｍｇ（０．０８１ｍｍｏｌ）を秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例１１）酸性添加剤とＭＭＡＦ用量のモル比４：１：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５．７μＬ を採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物１８．６ｍｇ（０．１０８ｍｍｏｌ）を秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
検出結果は、図２に示し、酸性添加剤とＭＭＡＦ用量のモル比が１を超える場合には、反応に有意な促進効果を発揮することを示した。
実施例４ 溶液１における有機塩基の添加量による反応系への影響
溶液１（連結基を含む溶液）で使用される有機塩基の用量が反応の結果に影響を与えるかどうかを検証するために、本実施例では、ＤＩＰＥＡを例として関連する実験をさらに実行した。
試験例１）塩基性添加剤（ＤＩＰＥＡ）と酸性添加剤用量のモル比２：１：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇ（０．０５４ｍｍｏｌ）を秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン８．９μＬ（０．０５５ｍｍｏｌ）を採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ（０．０２７ｍｍｏｌ）及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物４．６ｍｇ（０．０２７ｍｍｏｌ）を秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例２）塩基性添加剤（ＤＩＰＥＡ）と酸性添加剤用量のモル比３：１：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１３．４μＬ（０．０８１ｍｍｏｌ）を採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。秤量ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ和ｐ－トルエンスルホン酸一水合物４．６ｍｇ、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例３）塩基性添加剤（ＤＩＰＥＡ）と酸性添加剤用量のモル比４：１：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１７．９μＬ（０．１０８ｍｍｏｌ）を採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物４．６ｍｇを秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例４）塩基性添加剤（ＤＩＰＥＡ）と酸性添加剤用量のモル比５：１：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２２．３μＬ（０．１３５ｍｍｏｌ）を採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物４．６ｍｇを秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例５）塩基性添加剤（ＤＩＰＥＡ）と酸性添加剤用量のモル比６：１：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン２６．８μＬ（０．１６２ｍｍｏｌ）を採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物４．６ｍｇを秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
試験例６）塩基性添加剤（ＤＩＰＥＡ）と酸性添加剤用量のモル比７：１：
Ｍｃ－ＯＨ １１．５ｍｇ及びＨＡＴＵ ２０．５ｍｇを秤量し、５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを採取してサンプルボトルに入れ、次いで１００μＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３１．３μＬ（０．１８９ｍｍｏｌ）を採取してサンプルボトルに入れ、並行反応撹拌機上に置き、回転子を入れ、室温で０．５ｈ撹拌した。ＭＭＡＦ ２０．０ｍｇ及びｐ－トルエンスルホン酸一水合物４．６ｍｇを秤量し、別の５ｍＬのサンプルボトルに入れ、１ｍＬのピペットマンでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１ｍＬを２回採取してサンプルボトルに入れ、回転子を入れ、マグネチックスターラー上に置き、氷浴中で撹拌した。氷浴条件下で、５ｍＬのプラスチックスポイトを使用してＭｃ－ＯＨ系をＭＭＡＦの溶液に移し、反応フラスコを並行反応器上にセットし、１ｈ撹拌し続けた。反応を停止し、１０μＬのピペットマンで１０μＬ採取して１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、次に１ｍＬのピペットマンでアセトニトリル１ｍＬを採取して遠心分離管に入れ、さらに、１ｍＬのシリンジで吸い取った後にシリンジフィルター(有機溶媒用)を使用してろ過した後、サンプルを注入し、ＬＣ－ＭＳにより反応の状況を検出した。
反応系全体において、ＭＭＡＦの投入量が０．０２７ｍｍｏｌである場合には、投入されるＭｃ－ＯＨは０．０５５ｍｍｏｌモルであり、酸試薬は０．０２７ｍｍｏｌモルであり、反応系に存在する遊離カルボキシル基の合計は０．１０９ｍｍｏｌである。図３の検出結果より、ＤＩＰＥＡが投入されるモル量が０．１０８ｍｍｏｌ以下である場合には、反応しないか、反応速度が遅く、ＤＩＰＥＡモル量が０．１０８ｍｍｏｌを超えた後、つまり、系中に存在する有機塩基のモル量が反応系中に存在する遊離カルボキシル基の合計のモル量を超えた後、反応促進効果が有意になることを示した。
上記の実施例から、酸性添加剤を添加しない場合（実施例１中調製方法１）よりも、本発明で提供される調製方法（即ち、酸法による抗体薬物複合体の中間体の調製法）によって調製されるＭｃ－ＭＭＡＦの収率が有意に向上し、予期しない技術的効果を持つことを理解することが困難ではない。
以上より、上記のＭｃ－ＭＭＡＦの合成を試験例として検証された試験原理によれば、酸試薬を添加してモノメチルアウリスタチン誘導体を塩に変換した後、その後の反応を行うことにより、反応の進行を促進し、収率を大幅に向上させることができることを推定できる。また、生産においては、生産消耗品、手間、設備、場所、原材料などのコストを節約するだけでなく、生産廃液を大幅に削減し、生産コストを削減し、生産効率を向上させ、工業用大規模生産に適している。
本発明は、それぞれの具体的な実施形態によって例示されて説明された。しかしながら、当業者は、本発明がそれぞれの具体的な実施形態に限定されず、本発明の範囲内で様々な変更または修正を行うことができ、かつ本明細書の様々な場所で言及される様々な技術的特徴を互いに組み合わせることができ、本発明の精神および範囲から逸脱しないことを理解すべきである。これらの変更および修正は、いずれも本発明の範囲内である。

Claims (6)

  1. 酸法による抗体薬物複合体中間体の調製方法であって、反応経路は、以下の通りであり、
    Figure 0007252333000022
    であり、
    前記モノメチルアウリスタチン誘導体はＭＭＡＦであり、
    前記縮合剤はＨＡＴＵであり、
    前記有機塩基はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン及びトリエチルアミンから選ばれる１つまたは複数であり、
    前記溶媒Ａ及び溶媒Ｂはそれぞれ独立して、ＤＭＦ、ＤＭＡ及びＤＭＳＯから選ばれる１つまたは複数であり、
    前記酸はトリフルオロ酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、（－）－１０－カンファースルホン酸、（＋）－１０－カンファースルホン酸、およびメタンスルホン酸から選ばれる１つまたは複数であり、
    対応するモノメチルアウリスタチン誘導体に対する前記酸用量のモル比は１以上であり、
    Ｌ’は、モノメチルアウリスタチン誘導体を共有結合させた後の連結基の残基である。）
    前記方法は、
    １）連結基Ｌ、縮合剤、及び有機塩基を溶媒Ａに溶解させ、溶液１を形成するステップと、
    ２）モノメチルアウリスタチン誘導体及び酸を溶媒Ｂに溶解させ、溶液２を形成するステップと、
    ３）溶液１を溶液２に加え、Ｌとモノメチルアウリスタチン誘導体の縮合反応によりＬ’－モノメチルアウリスタチン誘導体を得るステップと、を含み、
    ここで、ステップ１）で加えられる有機塩基のモル量は、ステップ３）の反応系におけるすべての遊離カルボキシル基のモル量よりも多い、方法。
  2. 前記方法の反応経路は、
    Figure 0007252333000023
     である請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｌ’－ＭＭＡＦは、
    Figure 0007252333000024
     から選ばれることを特徴とする請求項２に記載の方法。
  4. 前記溶液１の溶液２への添加方法は、均一に添加することを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記溶液１を溶液２に滴下で添加することを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 抗体薬物複合体の調製における、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法の使用。
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