KR102604763B1 - 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도 - Google Patents

항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102604763B1
KR102604763B1 KR1020220016118A KR20220016118A KR102604763B1 KR 102604763 B1 KR102604763 B1 KR 102604763B1 KR 1020220016118 A KR1020220016118 A KR 1020220016118A KR 20220016118 A KR20220016118 A KR 20220016118A KR 102604763 B1 KR102604763 B1 KR 102604763B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
binding peptide
antibody
unsubstituted
norbornene
Prior art date
Application number
KR1020220016118A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220024297A (ko
Inventor
정상전
김주환
이영근
이태진
서진우
Original Assignee
앱티스 주식회사
성균관대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 앱티스 주식회사, 성균관대학교산학협력단 filed Critical 앱티스 주식회사
Publication of KR20220024297A publication Critical patent/KR20220024297A/ko
Priority to KR1020230159445A priority Critical patent/KR20230168994A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102604763B1 publication Critical patent/KR102604763B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/537—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

본 출원은 두 개 이상의 카보닐기의 친전자성 탄소 및 클릭 화학 작용기을 하나 이상 포함하는 바이오 컨쥬게이션에 이용되는 신규한 링커로, 보다 구체적으로, 치환반응에 의해 원하는 타겟분자, 즉 타겟분자에 화합물, 펩타이드 및/또는 단백질을 직접적 및/또는 간접적으로 연결시킬 수 있는 링커에 관한 것이다.

Description

항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도 {compounds for producing antibody-payload conjugate, and its use}
본 발명은 바이오 컨쥬게이션(bioconjugation)분야에 관한 것이다. 본 발명은 위치특이적으로 결합된 항체-페이로드 컨쥬게이트를 제조하기 위한 링커, 이를 이용하여 제조된 항체-페이로드 컨쥬게이트 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 상기 링커는 두 개 이상의 상이한 부분 양전하를 가진 카보닐기 탄소 및 양 말단에 작용기를 포함하고 있으며, 치환반응에 의해 생체(타겟) 분자에 화합물, 펩타이드 및/또는 단백질을 연결시킬 수 있는, 링커에 관한 것이다.
바이오 컨쥬게이션은 적어도 두 개 이상의 분자를 연결하는 과정으로서 이때 적어도 한 개 이상의 분자가 생체활성 분자 (bioactive molecule)인 것을 말한다. 생체활성 분자는 “타겟분자” 또는 “관심 분자”로 지칭될 수 있으며, 예를 들어 단백질(또는 펩타이드), 글리칸, 핵산(또는 올리고 뉴클레오티드), 지질, 호르몬 또는 천연 약물(또는 그의 단편 또는 이들의 조합) 등일 수 있다. 이러한 두 개 이상의 분자를 연결하는 링커는 항체와 같은 표적 특이적 단백질과 형광물질 등을 결합하여 검출, 진단 및 바이오마커 등에 광범위하게 사용될 수 있다.
현재, 바이오 컨쥬게이션으로서 검출, 진단 및 치료 등에 이용되는 링커, 예를 들어, PEG(폴리에틸렌글리콜)는 수용성이 높고, 비독성이고, 비항원성이며 응집되지 않아 상업적으로 널리 이용되고 있다. 최근에는 항체에 세포독성 약물(항암제)를 연결하여 특정 질환을 치료하는 치료제에 관한 관심이 증가하면서, 항체 등 타겟분자에 세포독성 약물을 결합시킬 수 있는 링커에 대한 연구도 활발해지고 있다. 이러한 두 개 이상의 분자를 연결시킬 수 있는 링커는 생체 내에서 혈중 안정성, 적합성. 용해도 및 타겟 특이성 등이 모두 고려되어야 한다.
한편, 현재 항체-페이로드 콘쥬게이트 분야에서 연구되고 있는 링커는 길이 및 크기에 의해 항체의 생물학적 활성, 예를 들어, FcRn 수용체 결합을 막음으로써 반감기가 감소하는 등의 문제점이 있고, 위치-특이적 결합하는데 어려움이 있어 균질한 항체-약물 결합체를 생산하는데 어려움이 있다. 따라서, 이러한 단점을 극복하기 위하여, 타겟분자의 활성을 유지하면서도 생체 내에서 혈중 안정성, 적합성. 용해도 및 위치 특이성이 모두 뛰어난 링커의 개발이 절실히 요구된다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 두 개 이상의 상이한 부분 양전하(δ+)를 가진 카보닐기를 포함하고, 양 말단에 이탈기 및/또는 클릭화합물을 포함하여, 타겟분자의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않으면서, 타겟분자에 페이로드를 연결시킬 수 있는 링커를 발명하였다. 해당 링커는 길이 조절을 통해 타겟분자에 대한 위치-특이성 뿐만 아니라 수용성을 증가시킴으로써 반응성을 높일 수 있다. 이러한 링커는 반응 조건이 까다롭지 않고, 바이오 컨쥬게이션으로써 타겟분자를 포함한 분자에 대한 접합 수율이 높아, 보다 안정적이고 경제적으로 효용성이 높은 링커를 제공하고자 한다.
본 출원은 두 개 이상의 카보닐기의 친전자성 탄소 및 하나 이상의 클릭 화학 잔기를 포함하는 신규한 trans 구조를 가진 링커 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 출원은 두 개 이상의 카보닐기의 친전자성 탄소 및 하나 이상의 클릭 화학 잔기를 포함하는 신규한 cis 구조를 가진 링커 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
전술한 본 출원의 과제를 해결하고자, 본 명세서에서는 타겟분자에 페이로드를 직접적 및/또는 간접적으로 연결시키기 위해 운반 및 결합반응을 돕는 링커 (linker)를 제공하고자 한다.
일 양태에서, 본 출원은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 2]
상기 식에서, R'은 에스터 그룹 활성화 잔기 (ester group activating group)이며, R''은 아세틸렌(Acetylene), 트랜스사이클로옥텐(transcyclooctene), 사이클로옥타인(cyclooctyne), 다이아릴사이클로옥타인(dyarylcyclooctyne), 메틸 에스터 포스핀(methyl ester phosphine), 노르보레인(norbornene), 메틸사이클로프로펜(methylcyclopropene), 아제틴(azetine) 및 사이아나이드(cyanide) 중 어느 하나이며, R'''은 치환 또는 비치환된 C1-20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 폴리메틸렌, 치환 또는 비치환된 C5-12 아릴, 치환 또는 비치환된 C5-14 아릴 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C8-16 아릴 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C3-10 사이클로알킬렌, 치환 또는 비치환된 C3-10 헤테로사이클로알킬렌, 또는 치환 또는 비치환된 C5-12 헤테로아릴이며, 상기 헤테로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌 또는 헤테로아릴은 N, O 또는 S가 적어도 하나 이상 포함되고, 상기 치환은 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 -Ra, -O-, =O, -ORa, -SRa, -S-, -N(Ra)2, =NRa, -C(Rb)3, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N-OH, =N2, -N3, -NHC(=O)Ra, -C(=O)Ra, -C(=O)NRaRa -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2Ra, -OS(=O)2ORa, -S(=O)2NRa, -S(=O)Ra, -C(=O)Ra, 알킬렌-C(=O)Ra, -C(=S)Ra, -C(=O)ORa, 알킬렌-C(=O)ORa, -C(=O)O-, 알킬렌-C(=O)O-, -C(=S)ORa, -C(=O)SRa, -C(=S)SRa, -C(=O)NRaRa, 알킬렌-C(=O)NRaRa, -C(=S)NRaRa, -C(-NRa)NRaRa 및 Rb로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있고, 상기 Ra는 H, C1-6 알킬, C5-12 아릴, C7-12 아릴알킬 또는 헤테로사이클이고, 상기 Rb은 F, Cl, Br, 또는 I이고, X는 O, N 및 S 중 어느 하나이다. 나아가, 본 출원은 상기 R''은 노르보레인(norbornene), 트랜스사이클로옥텐(transcyclooctene), 사이클로옥타인(cyclooctyne) 및 메틸사이클로프로펜(methylcyclopropene) 중 어느 하나인 화합물을 제공한다. 더 나아가, 본 출원은 상기 R''은 노르보레인(norbornene)인 화합물을 제공한다.
또는 나아가, 본 출원은 R'''은 치환 또는 비치화된 C1-10알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 헤테로 알킬렌 및 C1-10폴리메틸렌 중 어느 하나이며, 상기 헤테로 알킬렌은 N, O 또는 S가 적어도 하나 이상 포함되고, 상기 치환은 비수소 치환기로 치환된 것으로, 비수소 치환기는 -O-, =O, -ORa, -SRa, -S-, -N(Ra)2, =NRa, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N-OH, =N2, -N3, -NHC(=O)Ra, -C(=O)Ra, -C(=O)NRaRa -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2Ra, -OS(=O)2ORa, -S(=O)2NRa, -S(=O)Ra, -C(=O)Ra, 알킬렌-C(=O)Ra, -C(=S)Ra, -C(=O)ORa, 알킬렌-C(=O)ORa, -C(=O)O-, 알킬렌-C(=O)O-, -C(=S)ORa, -C(=O)SRa, -C(=S)SRa, -C(=O)NRaRa, 알킬렌-C(=O)NRaRa, -C(=S)NRaRa 및 -C(-NRa)NRaRa로 이루어진 군으로부터 하나 이상이며, 상기 Ra는 C1-6 알킬, C5-12 아릴, C7-12 아릴알킬 또는 헤테로사이클이고, 상기 Rb는 F, Cl, Br, 또는 I이고, X는 O, N 및 S 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물을 제공한다. 더 나아가, 본 출원은 상기 R'''은 비치환된 C1-5 알킬렌 또는 비치환된 C1-5 폴리메틸렌인 것을 특징으로 하는, 화합물을 제공한다.
또는 나아가, 본 출원은 상기 X는 O인 것을 특징으로 하는, 화합물을 제공한다.
또는 나아가, 상기 화학식 2의 화합물은 하기 화학식 2-1-2로 표시되는 것인 화합물을 제공한다:
[화학식 2-1-2]
.
다른 양태에서, 본 출원은 화학식 2의 구조를 갖는 링커를 Fc 결합성 펩타이드와 반응시켜 링커-Fc 결합성 펩타이드 콘쥬게이트를 제조함; 상기 링커-Fc 결합성 펩타이드 콘쥬게이트와 항체를 반응시켜 상기 항체에 제1 클릭 화학 작용기를 포함시킴; 및 상기 제1 클릭 화학작용기를 포함하는 항체에 상기 제1 클릭 화학작용기와 상보적인 제2 클릭 화학작용기를 포함하는 페이로드를 반응시켜 하기 화학식 8의 구조를 갖는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제조함을 포함하는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제조하기 위한 방법을 제공한다:
[화학식 8]
이때, Ab는 항체이고, R'''은 비치환된 C1-5 알킬렌 또는 비치환된 C1-5 폴리메틸렌이며, Y4는 N이고, Fp는 Fc 결합성 펩타이드이며, B는 상기 제1 클릭 화학작용기와 상기 제2 클릭 화학작용기의 클릭화학 반응 (click-chemistry)에 의하여 형성되는 구조들 중 어느 하나이며, Am은 활성 모이어티 또는 이를 포함하는 구조로서, 상기 활성 모이어티는 약물 분자, 이미징 모이어티, 광학 작용제, 비타민 및 독소로부터 선택된 어느 하나이고, n은 1 이상 4 이하의 정수이다.
나아가, 본 출원은 상기 Fc 결합성 펩타이드는 화학식 13 또는 14 중 선택된 어느 하나의 펩타이드이고,
이때
[화학식 13]
D-C-A-W-H-Xa-G-E-L-V-W-C-T
[화학식 14]
D-C-A-W-H-K-G-E-L-V-W-C-T
이때, D는 아스파르트산이고, C는 시스테인이며, A는 알라닌이고, W는 트립토판이며, H는 히스티딘이고, Xa는 이며, G는 글리신이고, E는 글루탐산이며, L은 류신이고, V는 발린이며, T는 트레오닌이고, K는 라이신이며, 이때, m은 1 이상 4 이하의 정수이고, N 말단의 시스테인와 C 말단의 시스테인은 서로 연결되어 있으며, 이로써 n=2이고, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 양 Fc의 246번 라이신 또는 248번 라이신 잔기에 포함된 것을 특징으로 하는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제조하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 화학식 8의 구조를 갖는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제공한다:
[화학식 8]
이때, Ab는 항체이고, R'''은 비치환된 C1-5 알킬렌 또는 비치환된 C1-5 폴리메틸렌이며, Y4는 N이고, Fp는 Fc 결합성 펩타이드이며, B는 상기 제1 클릭 화학작용기와 상기 제2 클릭 화학작용기의 클릭화학 반응 (click-chemistry)에 의하여 형성되는 구조들 중 하나이며, Am은 활성 모이어티 또는 이를 포함하는 구조로서, 상기 활성 모이어티는 약물 분자, 이미징 모이어티, 광학 작용제, 비타민 및 독소로부터 선택된 어느 하나이고, n은 1 이상 4 이하의 정수이다.
나아가, 본 출원은 상기 Fp가 화학식 13 또는 14 중 선택된 어느 하나의 펩타이드이고,
이때
[화학식 13]
D-C-A-W-H-Xa-G-E-L-V-W-C-T
[화학식 14]
D-C-A-W-H-K-G-E-L-V-W-C-T
이때, D는 아스파르트산이고, C는 시스테인이며, A는 알라닌이고, W는 트립토판이며, H는 히스티딘이고, Xa는 이며, G는 글리신이고, E는 글루탐산이며, L은 류신이고, V는 발린이며, T는 트레오닌이고, K는 라이신이며, 이때, m은 1 이상 4 이하의 정수이고, N 말단의 시스테인와 C 말단의 시스테인은 서로 연결되어 있으며, 상기 Fp는 6번 아미노산 잔기에서 Y4를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제공한다.
또는 나아가, 본 출원은 B는 또는 이고, 이때 A1은 항체와 연결되어있고 A2는 Am과 연결되어있거나 또는 A1은 Am과 연결되어있고 A2는 항체와 연결되어있는 것을 특징으로 하는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제공한다. 더 나아가, 본 출원은 B는 인 것을 특징으로 하는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제공한다.
또는, 본 출원은 상기 Am은 항암제를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제공한다. 더 나아가, 본 출원은 상기 항암제는 메르탄신 (mertansine; DM1)인 것을 특징으로 하는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제공한다. 또는 더 나아가, 본 출원은 상기 Am은 2개 이상의 항암제를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제공한다.
또는, 본 출원은 Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 Fc의 246번 라이신 또는 248번 라이신 잔기에 포함된 것을 특징으로 하는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제공한다.
또는, 본 출원은 n=2이고, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 양 Fc의 246번 라이신 또는 248번 라이신에 포함된 것을 특징으로 하는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 항암제를 포함하는 항체-페이로드 콘쥬게이트를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
나아가, 본 출원은 상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에 의해 개시되는 기술에 따르면, 다음과 같은 효과가 발생한다.
본 명세서에 개시된 화합물 1은 항체에 위치 특이적으로 페이로드(payload)를 연결시킬 수 있는 링커를 제공한다. 이러한 상기 링커는 항체의 반감기 등의 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 효과를 가지며, 검출, 진단, 바이오마커 및 항암치료제의 바이오컨쥬게이션으로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에 개시된 화합물 2는 항체에 위치 특이적으로 페이로드(payload)를 연결시킬 수 있는 링커를 제공한다. 상기 링커는 타겟분자의 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있으며 예를 들어 타겟분자 및/또는 페이로드의 반감기를 감소시키거나 배출을 촉진시킬 수 있는 효과를 가진다. 이러한 상기 링커는 검출, 진단, 바이오마커에 활용되는 바이오컨쥬게이션으로서 유용하게 사용될 수 있다.
나아가, 화합물 1 및 화합물 2에 의하여 제공되는 항체-페이로드 콘쥬게이트는 그 결합 위치가 균일하여 높은 균일성 (uniformity)을 갖는 장점이 있다.
도 1은 화합물 I(trans)의 전체 합성 공정을 나타낸다.
도 2는 화합물 II(cis)의 전체 합성 공정을 나타낸다.
도 3은 화합물 6 이성질체 구조의 HPLC 분석 스펙트럼 분석 결과를 보여준다.
도 4는 화합물 6(cis)의 분자량 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 화합물 6(trans)의 분자량 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 화합물II의 이성질체 구조를 HPLC를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 HPLC 통해 화합물 II의 수득 결과를 보여준다.
도 8은 FcBP(6Lys)-Norbornene의 HPLC 결과이다.
도 9는 FcBP(6Lys)-Norbornene의 LC mass 결과이다.
도 10은 화합물Ⅰ-FcBP(6Lys)-norborene의 HPLC 결과이다.
도 11은 화합물Ⅰ-FcBP(6Lys)-norborene의 LC mass 결과이다.
도 12는 화합물Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene의 HPLC 결과이다.
도 13은 화합물Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene의 mass spectometer 결과이다.
도 14는 화합물Ⅰ-FcBP(6Lys)-norbornene과 항체의 반응을 도시한 것이다.
도 15는 화합물Ⅰ-FcBP(6Lys)-norbornene과 항체의 반응에 의해 생성된 Ab (246/248 Lys)-Norbornene의 구조를 나타낸 것이다.
도 16은 화합물Ⅰ-FcBP(6Lys)-norbornene과 항체의 반응을 HIC-HPLC를 통해 반응 모니터링한 결과이다.
도 17은 화합물Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene과 항체의 반응을 도시한 것이다.
도 18은 화합물Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene과 항체의 반응에 의해 생성된 Ab (246/248 Lys)-Norbornene의 구조를 나타낸 것이다.
도 19는 화합물Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene과 항체의 반응을 HIC-HPLC를 통해 반응 모니터링한 결과이다.
도 20은 Herceptin-Norbornene의 질량 분석 결과이다.
도 21은 도 18의 제1 클릭화학 작용기를 포함하는 항체를 이용하여 생성된 항체-페이로드 콘쥬게이트의 구조를 나타낸 것이다. 확대된 구조는 페이로드의 구조이고, 확대되지 않은 부분은 도 18의 구조와 동일하다.
도 22는 도 18의 Ab (246/248 Lys)-Norbornene과 테트라진-PEG8-DM1 (Tetrazine-PEG8-DM1)의 반응을 HIC-HPLC를 통해 반응 모니터링한 결과이다.
도 23은 항체-페이로드 콘쥬게이트의 질량 분석 결과이다.
도 24 내지 도 27은 각각 NCI-N87, BT474, MDA-MB-468에 대한 세포 독성 실험 결과 및 이를 정리한 표이다.
도 28 및 도 29는 허셉틴과 본 출원에 의한 항체-페이로드 콘쥬게이트의 종양 성장 억제 실험 결과이다.
도 30은 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dap)-norbornene의 HPLC 결과이다.
도 31은 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dap)-norbornene의 mass spectrometer 결과이다.
도 32는 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dab)-norbornene의 HPLC 결과이다.
도 33은 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dab)-norbornene의 mass spectrometer 결과이다.
도 34는 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Orn)-norbornene의 HPLC 결과이다.
도 35는 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Orn)-norbornene의 mass spectrometer 결과이다.
도 36은 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Lys)-norbornene의 HPLC 결과이다.
도 37은 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Lys)-norbornene의 mass spectrometer 결과이다.
도 38은 화합물Ⅱ-FcBP(L6Dap)-norbornene 기반 항체와의 결합 반응 모니터링을 위한 HIC-HPLC 결과이다.
도 39는 화합물Ⅱ-FcBP(L6Dab)-norbornene 기반 항체와의 결합 반응 모니터링을 위한 HIC-HPLC 결과이다.
도 40은 화합물Ⅱ-FcBP(L6Orn)-norbornene 기반 항체와의 결합 반응 모니터링을 위한 HIC-HPLC 결과이다.
도 41은 화합물Ⅱ-FcBP(L6Lys)-norbornene 기반 항체와의 결합 반응 모니터링을 위한 HIC-HPLC 결과이다.
용어 "헤테로알킬"은 하나 이상의 탄소원자가 O, N 또는 S와 같은 헤테로 원자로 치환되어 있는 알킬기를 지칭한다. 예를 들면, 모 분자에 부착되어 있는 알킬기의 탄소원자가 헤테로 원자(예를 들면, O, N 또는 S)로 치환되는 경우, 결과물인 헤테로알킬기는 각각 알콕시 기(예를 들면, -OCH3 등), 아민(예를 들면, -NHCH3, -N(CH3)2 등), 또는 티오알킬기(예를 들면, -SCH3)이다. 모 분자에 부착되지 않은 알킬기의 비(非)-말단 탄소원자가 헤테로 원자(예를 들면, O, N 또는 S)로 치환되는 경우, 결과물인 헤테로알킬기는 각각 알킬 에터(예를 들면, -CH2CH2-O-CH3 등), 알킬 아민(예를 들면, -CH2NHCH3, -CH2N(CH3)2 등), 또는 티오알킬 에터(예를 들면, -CH2-S-CH3)이다. 알킬기의 말단 탄소원자가 헤테로 원자(예를 들면, O, N 또는 S)로 치환되는 경우, 결과물인 헤테로알킬기는 각각 하이드록시알킬기(예를 들면, -CH2CH2-OH), 아미노알킬기(예를 들면, -CH2NH2), 또는 알킬 티올 기(예를 들면, -CH2CH2-SH)이다. 헤테로알킬기는 예를 들면, 1 내지 20개의 탄소원자, 1 내지 10개의 탄소원자, 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 가질 수 있다. C1-C6 헤테로알킬기는 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 헤테로알킬기를 의미한다.
용어 "알킬렌"은, 모(parent) 알칸의 동일하거나 상이한 2개의 탄소원자로부터 2개의 수소 원자가 제거되어 유도되는 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는, 분지쇄 또는 직쇄 또는 고리형인 포화 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 예를 들면, 알킬렌 기는 1 내지 20개의 탄소원자, 1 내지 10개의 탄소원자, 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 가질 수 있다. 전형적인 알킬렌 라디칼은, 메틸렌(-CH2-), 1,1-에틸(-CH(CH3)-), 1,2-에틸(-CH2CH2-), 1,1-프로필(-CH(CH2CHV)-), 1,2-프로필(-CH2CH(CH3)-), 1,3-프로필(-CH2CH2CH2-), 1,4-부틸(-CH2CH2CH2CH2-) 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "알케닐렌"은 모 알켄의 동일하거나 상이한 2개의 탄소원자로부터 2개의 수소 원자가 제거되어 유도되는 2개의1가 라디칼 중심을 갖는, 분지쇄 또는 직쇄 또는 고리형인 불포화 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 예를 들면, 알케닐렌 기는 1 내지 20개의 탄소원자, 1 내지 10개의 탄소원자, 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 가질 수 있다. 전형적인 알케닐렌 기는 1,2-에틸렌(-CH=CH-)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "알키닐렌"은 모 알킨의 동일하거나 상이한 2개의 탄소원자로부터 2개의 수소 원자가 제거되어 유도되는 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는, 분지쇄 또는 직쇄 또는 고리형인 불포화 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 예를 들면, 알키닐렌 기는 1 내지 20개의 탄소원자, 1 내지 10개의 탄소원자, 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 가질 수 있다. 전형적인 알키닐렌 라디칼은 아세틸렌(-C≡C-), 프로파길(-CH2C≡C-), 및 4-펜티닐(-CH2CH2CH2C≡C-)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
용어 “폴리메틸렌”은 하나 이상의 탄소원자를 갖는 알킬렌을 의미하고, 메틸렌, 에틸렌, 트리메틸렌, 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌 및 헵타메틸렌을 포함한다.
당업계의 숙련자라면, "알킬", "아릴", "헤테로사이클릴" 등의 잔기가 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 경우, 이들은 선택적으로, "알킬렌", "아릴렌", "헤테로사이클릴렌" 등의 잔기로서 지칭될 수 있음(즉, 모체인 "알킬", "아릴", "헤테로사이클릴" 잔기의 하나 이상의 수소 원자가 언급한 치환기로 치환됨을 의미한다)을 인식할 것이다. "알킬", "아릴", "헤테로사이클릴" 등와 같은 잔기가 본원에서 "치환된" 것으로 지칭되거나, 도면상 치환된 것(또는 임의로 치환된 것, 예를 들어 치환기의 개수가 0 내지 양수인 경우)으로 도시한 경우, "알킬", "아릴", "헤테로사이클릴" 등의 용어는 "알킬렌", "아릴렌", "헤테로사이클릴렌" 등과 상호교환적인 것으로 이해되어야만 한다.
용어 "아실"은 -C(=O)-알킬, -C(=O)-카보사이클(치환되거나 비치환됨), -C(=O)- 헤테로사이클(치환되거나 비치환됨)을 지칭하되, 여기서 그의 알킬, 카보사이클, 또는 헤테로사이클 부분은 본원에서 정의한 바와 같다. "아실"의 비-제한적인 예로는 -C(=O)CH3, -C(=O)CH2CH3, -C(=O)CH(CH3)2, -C(=O)C(CH3)3, -C(=O)-페닐(치환되거나 비치환됨), -C(=O)-사이클로프로필(치환되거나 비치환됨), -C(=O)-사이클로부틸(치환되거나 비치환됨), -C(=O)-사이클로펜틸(치환되거나 비치환됨), -C(=O)-사이클로헥실(치환되거나 비치환됨), -C(=O)-피리딜(치환되거나 비치환됨) 등을 포함한다.
용어 "치환된", 예를들면, "치환된 알킬", "치환된 알킬렌", "치환된 아릴", "치환된 아릴알킬", "치환된 헤테로사이클릴" 및 "치환된 카보사이클릴(예를 들어, 치환된 사이클로알킬)"은 각각 하나 이상의 수소 원자가 각각 독립적으로 비(非)수소 치환기로 치환된 알킬, 알킬렌, 아릴, 아릴알킬, 헤테로사이클릴, 카보사이클릴(예를 들어, 사이클로알킬)을 의미한다. 전형적인 치환기는 -X, -R, -O-, =O, -OR, -SR, -S-, -NR2, -N+R3, =NR, -C(X)3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N-OH, =N2, -N3, -NHC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NRR -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -C(=O)R, 알킬렌-C(=O)R, -C(S)R, -C(=O)OR, 알킬렌-C(=O)OR, -C(=O)O-, 알킬렌-C(=O)O-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NRR, 알킬렌-C(=O)NRR, -C(=S)NRR, -C(-NR)NRR(여기서, 각 X는 독립적으로 할로겐: F, Cl, Br, 또는 I이고, R은 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 아릴알킬 또는 헤테로사이클)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 알킬렌, 알케닐렌, 및 알키닐렌 기는 또한 유사하게 치환될 수도 있다.
"임의로 치환된"은 1개, 2개, 또는 그 이상의 치환기를 갖는 화학식 1의 화합물의 특정 부분(예를 들면, 임의로치환된 아릴 기)을 지칭한다.
“이탈기(leaving group)”은 다른 화학적 작용기로 제거되거나 또는 대체될 수 있는 화학적 모이어티(moiety)를 나타낸다. 본 발명의 명세서 전반에서, 용어 이탈기는 클릭 화학 작용기 (click chemistry functional group), NHS(N-Hydroxysuccinimide) 또는 말레이미드(maleimide)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "타겟분자 (target molecule)" 또는 "관심분자 (molecule of interest)"는 페이로드를 이에 연결시키고자 하는 분자를 의미한다. 예시적으로 타겟분자는 생체활성 분자일 수 있으며, 예를 들어 단백질(또는 펩타이드), 글리칸, 핵산(또는 올리고 뉴클레오티드), 지질, 호르몬 또는 천연 약물(또는 그의 단편 또는 이들의 조합) 등일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "페이로드 (payload)"는 타겟분자에 연결시키고자 하는 분자를 의미한다. 예시적으로 페이로드는 화합물, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 및/또는 약물 분자일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "클릭 화학 작용기 (click chemistry functional group)"는 클릭 화학 반응 (click chemistry reaction)에 관여하는 작용기를 통칭한다. 클릭 화학의 종류 및 이에 관여하는 작용기는 통상적으로 잘 알려져 있다. 예컨데, 클릭 화학 반응은 [3+2] 고리화 첨가 반응 ([3+2] cycloadditions), 티올-엔 반응 (thiol-ene reaction), 디엘스-알더 반응 (Diels-Alder reaction), inverse electron demand Diels-Alder reaction, [4+1] 고리화 첨가 반응 ([4+1] cycloadditions) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 클릭 화학 반응은 구리(I)-촉매 고리화 첨가 반응 (Copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition; CuAAC), Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC), Strain-promoted alkyne-nitrone cycloaddition (SPANC), 알켄과 아자이드의 [3+2] 고리화 첨가반응, 알켄과 테트라진의 inverse-demand Diels-Alder, 알켄과 테트라졸의 포토클릭 반응 (photoclick reaction), 및 아지드와 알킨의 Huisgen cycloaddition을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 클릭 화학 작용기는 알킨, 시클로알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne)), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene), 친다이엔체(dienophile), 및 사이클로옥틴(cyclooctyne), 사이클로노닌(cyclononyne), dibenzocyclooctyne(DIBO), BARAC(biarylazacyclooctynone), ALO(aryl-less octyne), DIFO(difluorinated cyclooctyne), MOFO(monofluorinated), DIBAC(dibenzo-aza-cyclooctyne) 및 DIMAC(dimethoxyazacylooctyne) 등의 시클로알킨을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "에스터 그룹 활성화 잔기 (ester group activating group)"는 에스터 그룹의 산소에 연결되어 상기 에스터 그룹을 활성 에스터로 만들 수 있는 잔기를 통칭한다. 예컨데, 의 구조를 갖는 에스터 기가 활성 에스터라면 Z는 에스터 그룹 활성화 잔기이다. 예시적으로, 에스터 그룹 활성화 잔기는 N-히드록시석시니미드 기 (N-Hydroxysuccinimide group; NHS), 파라-니트로페닐 기 (p-nitrophenyl group), 및 펜타플루오로페닐 기 (pentafluorophenyl group)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 에스터 그룹 활성화 잔기는 wo/2015/122478에서 언급된 내용을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용어 "활성화 에스터 (active ester)"는 친핵성 치환반응에 민감한 상태에 있는 에스터를 의미한다.
본 명세서에서, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용되며, 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 예시적인 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 명세서에서 “포함한다”, “구비하다” 또는 “가지다” 등의 용어는 실시된 특징, 숫자, 단계, 구성 요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 구성 요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이하에서, 상세하게 설명한다.
본 출원은 원하는 타겟분자에 페이로드를 연결시킬 수 있도록 운반 및 결합 반응을 돕는, 링커(linker)를 제공할 수 있다.
상기 링커는 페이로드 및/또는 타겟분자와 반응할 수 있는 2 이상의 작용기(functional group)를 포함할 수 있다.
상기 반응은 두 개 이상의 동일하거나 상이한 분자 또는 분자 중 일부 작용기가 서로 연결되거나, 이탈반응, 즉, E1, E2, SN1, SN2 및 친핵성 치환반응 등이 일어나는 것을 의미한다. 상기 연결은 직접적 또는 간접적 공유결합 및/또는 비공유 결합을 모두 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 2 이상의 작용기 중 제 1작용기는 이탈기일 수 있다.
일 예에서, 상기 2 이상의 작용기 중 제 2작용기는 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)일 수 있다.
상기 링커는 두 개 이상의 카보닐기의 친전자성 탄소 원자를 포함할 수 있다.
상기 카보닐기의 친전자성 탄소원자는 작용기(functional group)와 연결될 수 있다.
일 예로, 카보닐기의 친전자성 탄소원자와 작용기는 공유결합을 할 수 있다.
다른 예로, 카보닐기의 친전자성 탄소원자와 작용기 사이에는 하나 이상의 원자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 카보닐기 친전자성 탄소원자와 작용기 사이에는 친핵체 원자가 포함될 수 있다. 이때, 친핵체 원자는 O(산소), N(질소) 또는 S(황)일 수 있다.
상기 링커는 두 개 이상의 부분 양전하(δ+)가 상이한 카보닐기의 친전자성 탄소 원자를 포함할 수 있다.
상기 2개 이상의 카보닐기의 친전자성 탄소원자 중에서 가장 큰 부분 양전하(δ+)를 가진 카보닐기는 제 1카보닐기 탄소원자일 수 있다.
상기 2개 이상의 카보닐기의 친전자성 탄소원자 중에서 두번째로 큰 부분 양전하(δ+)를 가진 카보닐기는 제 2카보닐기 탄소원자일 수 있다.
일 예로, 상기 제 1카보닐기의 친전자성 탄소원자는 제 1작용기와 연결될 수 있다. 이때, 제 1카보닐기의 친전자성 탄소원자와 제 1작용기 사이에는 친핵체 원자가 포함될 수 있다.
다른 예로, 상기 제 2카보닐기의 친전자성 탄소원자는 제 2작용기와 연결될 수 있다. 이때, 제 2카보닐기의 친전자성 탄소원자는 제 1작용기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 링커는 타겟분자에 공유 결합시키고자 하는 페이로드가 결합되는 위치를 조절할 수 있다.
예를 들어, 상기 페이로드는 제 1카보닐기의 친전자성 탄소원자에 연결될 수 있다.
상기 링커는 길이 조절을 통해 수용성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 수용성을 높일 수 있는 치환기를 포함한 알킬기의 수를 증가시킴으로써, 링커의 수용성을 증가시킬 수 있다.
이하 링커 구조에 대하여 상세하게 설명한다.
본 명세서에 개시된 일 양태에 의하면, 하기 화학식 1 및/또는 화학식 2로 표시되는 링커 화합물이 제공될 수 있다.
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 화학식 1에서,
R'은 에스터 그룹 활성화 잔기 (ester group activating group)이다. 상기 에스터 그룹 활성화 잔기는 N-히드록시석시니미드 기 (N-Hydroxysuccinimide group; NHS), 파라-니트로페닐 기 (p-nitrophenyl group), 및 펜타플루오로페닐 기 (pentafluorophenyl group)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 나아가, R'은 또는 중에 어느 하나일 수 있다.
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)은 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 친다이엔체(dienophile) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)이 사이클로알킨(cycloalkyne)인 경우, 사이클로알킨은 사이클로옥틴(cyclooctyne), 사이클로노닌(cyclononyne), dibenzocyclooctyne(DIBO), BARAC(biarylazacyclooctynone), ALO(aryl-less octyne), DIFO(difluorinated cyclooctyne), MOFO(monofluorinated), DIBAC(dibenzo-aza-cyclooctyne) 및 DIMAC(dimethoxyazacylooctyne) 중 어느 하나일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)이 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene)인 경우, 컨쥬게이티드 다이엔은 알켄(alkene) 및 사이클로 알켄(cycloalkane)일 수 있다. 일 예로, 컨쥬게이티드 다이엔은 테트라진(tetrazine)(예로, 1,2,3,4-tetrazine 및/또는 1,2,4,5-tetrazine)일 수 있다.
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)이 친다이엔체(dienophile)인 경우, 친다에엔체는 알켄(alkene) 및 사이클로 알켄(cycloalkane)일 수 있으며, 사이클로 알켄은 바이사이클릭 또는 접합된(fused) 사이클릭 구조를 포함한다. 일 예로, 상기 친다이엔체는 노르보레인(norbornene)일 수 있다.
R'''은 치환 또는 비치환된 C1-20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 폴리메틸렌, 치환 또는 비치환된 C5-12 아릴, 치환 또는 비치환된 C5-14 아릴 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C8-16 아릴 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C3-10 사이클로알킬렌, 치환 또는 비치환된 C3-10 헤테로사이클로알킬렌, 또는 치환 또는 비치환된 C5-12 헤테로아릴이며, 상기 헤테로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌 또는 헤테로아릴은 N, O 또는 S가 적어도 하나 이상 포함되고,
상기 치환은 비수소 치환기로 치환된 것으로, 비수소 치환기는 -Ra, -O-, =O, -ORa, -SRa, -S-, -N(Ra)2, =NRa, -C(Rb)3, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N-OH, =N2, -NV, -NHC(=O)Ra, -C(=O)Ra, -C(=O)NRaRa -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2Ra, -OS(=O)2ORa, -S(=O)2NRa, -S(=O)Ra, -C(=O)Ra, 알킬렌-C(=O)Ra, -C(=S)Ra, -C(=O)ORa, 알킬렌-C(=O)ORa, -C(=O)O-, 알킬렌-C(=O)O-, -C(=S)ORa, -C(=O)SRa, -C(=S)SRa, -C(=O)NRaRa, 알킬렌-C(=O)NRaRa, -C(=S)NRaRa, -C(-NRa)NRaRa 및 Rb로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있고,
상기 Ra는 H, C1-6 알킬, C5-12 아릴, C7-12 아릴알킬 또는 헤테로사이클이고,
상기 Rb은 F, Cl, Br, 또는 I이고,
X는 O, N 및 S 중 어느 하나일 수 있다.
상기 화학식 2에서,
R'은 에스터 그룹 활성화 잔기 (ester group activating group)이다. 상기 에스터 그룹 활성화 잔기는 N-히드록시석시니미드 기 (N-Hydroxysuccinimide group; NHS), 파라-니트로페닐 기 (p-nitrophenyl group), 및 펜타플루오로페닐 기 (pentafluorophenyl group)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 나아가, R'은 또는 중에 어느 하나일 수 있다.
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)은 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol)과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne)), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 친다이엔체(dienophile) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)이 사이클로알킨(cycloalkyne)인 경우, 사이클로알킨은 사이클로옥틴(cyclooctyne), 사이클로노닌(cyclononyne), dibenzocyclooctyne(DIBO), BARAC(biarylazacyclooctynone), ALO(aryl-less octyne), DIFO(difluorinated cyclooctyne), MOFO(monofluorinated), DIBAC(dibenzo-aza-cyclooctyne) 및 DIMAC(dimethoxyazacylooctyne) 중 어느 하나일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)이 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene)인 경우, 컨쥬게이티드 다이엔은 알켄(alkene) 및 사이클로 알켄(cycloalkane)일 수 있다. 일 예로, 컨쥬게이티드 다이엔은 테트라진(tetrazine)(예로, 1,2,3,4-tetrazine 및/또는 1,2,4,5-tetrazine)일 수 있다.
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)이 친다이엔체(dienophile)인 경우, 친다에엔체는 알켄(alkene) 및 사이클로 알켄(cycloalkane)일 수 있으며, 사이클로 알켄은 바이사이클릭 또는 접합된(fused) 사이클릭 구조를 포함한다. 일 예로, 상기 친다이엔체는 TCO(Transcyclooctene), 노르보레인(norbornene)일 수 있다.
R'''은 치환 또는 비치환된 C1-20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 폴리메틸렌, 치환 또는 비치환된 C5-12 아릴, 치환 또는 비치환된 C5-14 아릴 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C8-16 아릴 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C3-10 사이클로알킬렌, 치환 또는 비치환된 C3-10 헤테로사이클로알킬렌, 또는 치환 또는 비치환된 C5-12 헤테로아릴이며, 상기 헤테로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌 또는 헤테로아릴은 N, O 또는 S가 적어도 하나 이상 포함되고,
상기 치환은 비수소 치환기로 치환된 것으로, 비수소 치환기는 -Ra, -O-, =O, -ORa, -SRa, -S-, -N(Ra)2, =NRa, -C(Rb)3, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N-OH, =N2, -N3, -NHC(=O)Ra, -C(=O)Ra, -C(=O)NRaRa -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2Ra, -OS(=O)2ORa, -S(=O)2NRa, -S(=O)Ra, -C(=O)Ra, 알킬렌-C(=O)Ra, -C(=S)Ra, -C(=O)ORa, 알킬렌-C(=O)ORa, -C(=O)O-, 알킬렌-C(=O)O-, -C(=S)ORa, -C(=O)SRa, -C(=S)SRa, -C(=O)NRaRa, 알킬렌-C(=O)NRaRa, -C(=S)NRaRa, -C(-NRa)NRaRa 및 Rb로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있고,
상기 Ra는 H, C1-6 알킬, C5-12 아릴, C7-12 아릴알킬 또는 헤테로사이클이고,
상기 Rb은 F, Cl, Br, 또는 I이고,
X는 O, N 및 S 중 어느 하나일 수 있다.
본원의 화학식에서 은 핵 또는 골격 구조에 대한 잔기 또는 치환기의 부착 지점인 결합을 나타내기 위해 사용된다.
본 명세서에 개시된 일 실시예에 따르면, 상기 화학식1로 표시되는 화합물은 trans형 화합물일 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물에서,
R'은 이며,
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)은 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 알켄(alkene) 등의 친다이엔체(dienophile) 중 어느 하나 이상이며, 이때, 상기 사이클로 알킨, 컨쥬게이티드 다이엔 및 다이엔은 전술한 바와 같다.
R'''은 치환 또는 비치화된 C1-20알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-20 헤테로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-20 할로알킬, 또는 C1-10폴리메틸렌이며, 상기 헤테로알킬렌은 N, O 또는 S가 적어도 하나 이상 포함되고,
상기 치환은 비수소 치환기로 치환된 것으로, 비수소 치환기는 -Ra, -O-, =O, -ORa, -SRa, -S-, -N(Ra)2, =NRa, -C(Rb)3, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N-OH, =N2, -N3, -NHC(=O)Ra, -C(=O)Ra, -C(=O)NRaRa -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2Ra, -OS(=O)2ORa, -S(=O)2NRa, -S(=O)Ra, -C(=O)Ra, 알킬렌-C(=O)Ra, -C(=S)Ra, -C(=O)ORa, 알킬렌-C(=O)ORa, -C(=O)O-, 알킬렌-C(=O)O-, -C(=S)ORa, -C(=O)SRa, -C(=S)SRa, -C(=O)NRaRa, 알킬렌-C(=O)NRaRa, -C(=S)NRaRa, -C(-NRa)NRaRa 및 Rb로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있고,
상기 Ra는 H, C1-6 알킬, C5-12 아릴, C7-12 아릴알킬 또는 헤테로사이클이고,
상기 Rb은 F, Cl, Br, 또는 I이고,
X는 O, N 및 S 중 어느 하나인 경우,
하기 화학식 1-1로 표시될 수 있다.
[화학식 1-1]
구체적으로, 상기 R'''은 , 및 중 하나이며,
상기 R1은 H 이고,
상기 R2는 H 또는 C(=O)이고,
상기 R3는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R4는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R5는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R6은 H 또는 C(=O)이며,
상기 Y1은 C, N, O 및 S 중 어느 하나일 수 있고,
상기 n은 1 내지 20의 정수 중 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
이때, 상기 R5 및 R6은 동시에 C(=O)일 수 없으며,
상기 Y1이 N, O 및 S 중 어느 하나일 때는, R4, R5, R6은 C(=O)일 수 없다.
보다 구체적으로, 상기 R'''은 이며,
상기 R4는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R5는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R6은 H 또는 C(=O)이며,
상기 Y1은 C, N, O 및 S 중 어느 하나일 수 있고,
상기 n은 1 내지 10의 정수 중 어느 하나일 수 있다.
일 실시 예에서, 상기 화학식 1-1로 표시되는 화합물에서,
R'은 이며,
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며
상기 R'''은 이며,
n은 1이고,
상기 R4는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R5는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R6은 H 또는 C(=O)이며,
상기 Y1은 C이고,
상기 X는 N, O 및 S 중 어느 하나인 경우,
하기 화학식 1-1-1로 표시될 수 있다.
[화학식1-1-1]
다른 실시예에서, 상기 화학식 1-1로 표시되는 화합물에서,
R'은 이고,
R''은 노르보레인(norbornene)이며,
R'''은 이고,
상기 R4는 H이며,
상기 R5는 H이며,
상기 R6은 H이며,
상기 n은 1이며,
상기 Y1은 C이고,
상기 X는 O인 경우,
하기 화학식 1-1-2로 표시될 수 있다.
[화학식 1-1-2]
다른 실시예로, 상기 화학식 1에 의해 표시될 수 있는 화합물은 하기 표 1에 기재된 화합물일 수 있다.
화학식 1-1-3
화학식 1-1-4
화학식 1-1-5
화학식 1-1-6
화학식 1-1-7
화학식 1-1-8
화학식 1-1-9
화학식 1-1-10
화학식 1-1-11
화학식 1-1-12
화학식 1-1-13
상기 화학식1로 표시되는 화합물에서,
R'은 이며,
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)은 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 알켄(alkene) 등의 친다이엔체(dienophile) 중 어느 하나 이상이며, 이때, 상기 사이클로 알킨, 컨쥬게이티드 다이엔 및 다이엔은 전술한 바와 같다.
R'''은 치환 또는 비치화된 C1-20알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-20 헤테로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-20 할로알킬, 또는 C1-10폴리메틸렌이며, 상기 헤테로알킬렌은 N, O 또는 S가 적어도 하나 이상 포함되고,
상기 치환은 비수소 치환기로 치환된 것으로, 비수소 치환기는 -Ra, -O-, =O, -ORa, -SRa, -S-, -N(Ra)2, =NRa, -C(Rb)3, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N-OH, =N2, -N3, -NHC(=O)Ra, -C(=O)Ra, -C(=O)NRaRa -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2Ra, -OS(=O)2ORa, -S(=O)2NRa, -S(=O)Ra, -C(=O)Ra, 알킬렌-C(=O)Ra, -C(=S)Ra, -C(=O)ORa, 알킬렌-C(=O)ORa, -C(=O)O-, 알킬렌-C(=O)O-, -C(=S)ORa, -C(=O)SRa, -C(=S)SRa, -C(=O)NRaRa, 알킬렌-C(=O)NRaRa, -C(=S)NRaRa, -C(-NRa)NRaRa 및 Rb로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있고,
상기 Ra는 H, C1-6 알킬, C5-12 아릴, C7-12 아릴알킬 또는 헤테로사이클이고,
상기 Rb은 F, Cl, Br, 또는 I이고,
X는 O, N 및 S 중 어느 하나인 경우,
하기 화학식 1-2로 표시될 수 있다.
[화학식 1-2]
구체적으로, 상기 R'''은 , 및 중 하나이며,
상기 R1은 H 이고,
상기 R2는 H 또는 C(=O)이고,
상기 R3는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R4는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R5는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R6은 H 또는 C(=O)이며,
상기 Y1은 C, N, O 및 S 중 어느 하나일 수 있고,
상기 n은 1 내지 20의 정수 중 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
이때, 상기 R5 및 R6은 동시에 C(=O)일 수 없으며,
상기 Y1이 N, O 및 S 중 어느 하나일 때는, R4, R5, R6은 C(=O)일 수 없다.
보다 구체적으로, 상기 R'''은 이며,
상기 R4는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R5는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R6은 H 또는 C(=O)이며,
상기 Y1은 C, N, O 및 S 중 어느 하나일 수 있고,
상기 n은 1 내지 10의 정수 중 어느 하나일 수 있다.
일 실시예에서, 일 실시 예에서, 상기 화학식1-2로 표시되는 화합물에서,
상기 R'''은 이며,
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며
상기 n은 1이고,
상기 R4는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R5는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R6은 H 또는 C(=O)이며,
상기 Y1은 C이고,
상기 X는 N, O 및 S 중 어느 하나인 경우,
하기 화학식 1-2-1로 표시될 수 있다.
[화학식 1-2-1]
다른 실시예에서, 상기 화학식1-2로 표시되는 화합물에서.
R'은 이고,
R''은 노르보레인(norbornene)이며,
R'''은 이고,
상기 R4는 H이며,
상기 R5는 H이며,
상기 R6은 H이며,
상기 n은 1이며,
상기 Y1은 C이고,
상기 X는 O인 경우,
하기 화학식 1-2-2로 표시될 수 있다.
[화학식 1-2-2]
일 예로, 상기 화학식 1에 의해 표시될 수 있는 화합물은 하기 표 2에 기재된 화합물일 수 있다.
화학식 1-2-3
화학식 1-2-4
화학식 1-2-5
화힉식 1-2-6
화학식 1-2-7
화학식 1-2-8
화학식 1-2-9
화학식 1-2-10
화학식 1-2-11
화학식 1-2-12
화학식 1-2-13
본 명세서에 개시된 일 실시예에 따르면, 상기 화학식2로 표시되는 화합물은 cis형 화합물일 수 있다.
상기 화학식 2로 표시되는 화합물에서,
R'은 이며,
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)은 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 알켄(alkene) 등의 친다이엔체(dienophile) 중 어느 하나 이상이며, 이때, 상기 사이클로 알킨, 컨쥬게이티드 다이엔 및 다이엔은 전술한 바와 같다.
R'''은 치환 또는 비치화된 C1-20알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-20 헤테로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-20 할로알킬, 또는 C1-10폴리메틸렌이며, 상기 헤테로알킬렌은 N, O 또는 S가 적어도 하나 이상 포함되고,
상기 치환은 비수소 치환기로 치환된 것으로, 비수소 치환기는 -Ra, -O-, =O, -ORa, -SRa, -S-, -N(Ra)2, =NRa, -C(Rb)3, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N-OH, =N2, -N3, -NHC(=O)Ra, -C(=O)Ra, -C(=O)NRaRa -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2Ra, -OS(=O)2ORa, -S(=O)2NRa, -S(=O)Ra, -C(=O)Ra, 알킬렌-C(=O)Ra, -C(=S)Ra, -C(=O)ORa, 알킬렌-C(=O)ORa, -C(=O)O-, 알킬렌-C(=O)O-, -C(=S)ORa, -C(=O)SRa, -C(=S)SRa, -C(=O)NRaRa, 알킬렌-C(=O)NRaRa, -C(=S)NRaRa, -C(-NRa)NRaRa 및 Rb로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있고,
상기 Ra는 H, C1-6 알킬, C5-12 아릴, C7-12 아릴알킬 또는 헤테로사이클이고,
상기 Rb은 F, Cl, Br, 또는 I이고,
X는 O, N 및 S 중 어느 하나인 경우,
화학식 2-1로 표시될 수 있다.
[화학식 2-1]
구체적으로, 상기 R'''은 , 및 중 하나이며,
상기 R7은 H 이고,
상기 R8은 H 또는 C(=O)이고,
상기 R9는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R10은 H 또는 C(=O)이며,
상기 R11은 H 또는 C(=O)이며,
상기 R12는 H 또는 C(=O)이며,
상기 Y2는 C, N, O 및 S 중 어느 하나일 수 있고,
상기 n은 1 내지 20의 정수 중 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
이때, 상기 R11 및 R12는 동시에 C(=O)일 수 없으며,
상기 Y2가 N, O 및 S 중 어느 하나일 때는, R10, R11, R12는 C(=O)일 수 없다.
보다 구체적으로, 상기 R'''은 이며,
상기 R10은 H 또는 C(=O)이며,
상기 R11은 H 또는 C(=O)이며,
상기 R12는 H 또는 C(=O)이며,
상기 Y2는 C, N, O 및 S 중 어느 하나일 수 있고,
상기 n은 1 내지 10의 정수 중 어느 하나일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 화학식 2-1로 표시되는 화합물에서,
R'은 이며,
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며
상기 R'''은 이며,
n은 1이고,
상기 R10은 H 또는 C(=O)이며,
상기 R11은 H 또는 C(=O)이며,
상기 R12는 H 또는 C(=O)이며,
상기 Y2는 C이고,
상기 X는 N, O 및 S 중 어느 하나인 경우,
하기 화학식 2-1-1로 표시될 수 있다.
[화학식2-1-1]
다른 실시예에서, 상기 화학식2-1로 표시되는 화합물에서,
상기 화합물은
R'은 이고,
R''은 노르보레인(norbornene)이며,
R'''은 이고,
n은 1이고,
상기 R10은 H이며,
상기 R11은 H이며,
상기 R12는 H이며,
상기 Y2는 C이고,
n은 1이며,
X는 O인 경우,
하기 화학식 2-1-2로 표시될 수 있다.
[화학식 2-1-2]
일 예로, 상기 화학식 2에 의해 표시될 수 있는 화합물은 하기 표 3에 기재된 화합물일 수 있다.
화학식 2-1-3
화학식 2-1-4
화학식 2-1-5
화학식 2-1-6
화학식 2-1-7
화학식 2-1-8
화학식 2-1-9
화학식 2-1-10
화학식 2-1-11
화학식 2-1-12
화학식 2-1-13
상기 화학식2로 표시되는 화합물에서,
R'은 이며,
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)은 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 알켄(alkene) 등의 친다이엔체(dienophile) 중 어느 하나 이상이며, 이때, 상기 사이클로 알킨, 컨쥬게이티드 다이엔 및 다이엔은 전술한 바와 같다.
R'''은 치환 또는 비치화된 C1-20알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-20 헤테로 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-20 할로알킬 또는 C1-10폴리메틸렌이며, 상기 헤테로알킬렌은 N, O 또는 S가 적어도 하나 이상 포함되고,
상기 치환은 비수소 치환기로 치환된 것으로, 비수소 치환기는 -Ra, -O-, =O, -ORa, -SRa, -S-, -N(Ra)2, =NRa, -C(Rb)3, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N-OH, =N2, -N3, -NHC(=O)Ra, -C(=O)Ra, -C(=O)NRaRa -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2Ra, -OS(=O)2ORa, -S(=O)2NRa, -S(=O)Ra, -C(=O)Ra, 알킬렌-C(=O)Ra, -C(=S)Ra, -C(=O)ORa, 알킬렌-C(=O)ORa, -C(=O)O-, 알킬렌-C(=O)O-, -C(=S)ORa, -C(=O)SRa, -C(=S)SRa, -C(=O)NRaRa, 알킬렌-C(=O)NRaRa, -C(=S)NRaRa, -C(-NRa)NRaRa 및 Rb로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있고,
상기 Ra는 H, C1-6 알킬, C5-12 아릴, C7-12 아릴알킬 또는 헤테로사이클이고,
상기 Rb은 F, Cl, Br, 또는 I이고,
X는 O, N 및 S 중 어느 하나인 경우,
하기 화학식 2-2로 표시될 수 있다.
[화학식 2-2]
구체적으로, 상기 R''' 은 , 및 중 하나이며,
상기 R7은 H 이고,
상기 R8은 H 또는 C(=O)이고,
상기 R9는 H 또는 C(=O)이며,
상기 R10은 H 또는 C(=O)이며,
상기 R11은 H 또는 C(=O)이며,
상기 R12는 H 또는 C(=O)이며,
상기 Y2는 C, N, O 및 S 중 어느 하나일 수 있고,
상기 n은 1 내지 20의 정수 중 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
이때, 상기 R11 및 R12는 동시에 C(=O)일 수 없으며,
상기 Y2가 N, O 및 S 중 어느 하나일 때는, R10, R11, R12는 C(=O)일 수 없다.
보다 구체적으로, 상기 R'''은 이며,
상기 R10은 H 또는 C(=O)이며,
상기 R11은 H 또는 C(=O)이며,
상기 R12는 H 또는 C(=O)이며,
상기 Y2는 C, N, O 및 S 중 어느 하나일 수 있고,
상기 n은 1 내지 10의 정수 중 어느 하나일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 화학식 2-2로 표시되는 화합물에서,
R'은 이며,
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며,
상기 R'''은 이며,
n은 1이고,
상기 R10은 H 또는 C(=O)이며,
상기 R11은 H 또는 C(=O)이며,
상기 R12는 H 또는 C(=O)이며,
상기 Y2는 C이고,
상기 X는 N, O 및 S 중 어느 하나인 경우,
하기 화학식 2-2-1로 표시될 수 있다.
[화학식 2-2-1]
다른 실시예에서, 상기 화학식2-1로 표시되는 화합물에서,
상기 화합물은
R'은 이고,
R''은 노르보레인(norbornene)이며,
R'''은 이고,
n은 1이고,
상기 R10은 H이며,
상기 R11은 H이며,
상기 R12는 H이며,
상기 Y2는 C이고,
X는 O인 경우,
하기 화학식 2-2-2로 표시될 수 있다.
[화학식2-2-2]
일 예로, 상기 화학식 2에 의해 표시될 수 있는 화합물은 하기 표 4에 기재된 화합물일 수 있다.
화학식 2-2-3
화학식 2-2-4
화학식 2-2-5
화학식 2-2-6
화학식 2-2-7
화학식 2-2-8
화학식 2-2-9
화학식 2-2-10
화학식 2-2-11
화학식 2-2-12
화학식 2-2-13
이하에서는 타겟 분자가 항체일 때 상기 설명된 링커를 이용하여 항체-페이로드 콘쥬게이트를 준비하는 방법을 설명한다. 항체-페이로드 콘쥬게이트를 준비하는 방법은 (1) 링커를 Fc 결합성 펩타이드와 반응시켜 링커-Fc 결합성 펩타이드 콘쥬게이트를 제조함; (2) 링커-Fc 결합성 펩타이드와 항체를 반응시켜 상기 항체에 제1 클릭 화학 작용기를 포함시킴; 및 (3) 제1 클릭 화학 작용기를 포함하는 항체에 제1 클릭 화학 작용기와 상보적인 제2 클릭 화학 작용기를 포함하는 페이로드를 반응시켜 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제조함을 포함한다. 이하 각 과정을 분설한다.
항체-페이로드 콘쥬게이트를 준비하는 방법은 (1) 링커를 Fc 결합성 펩타이드와 반응시켜 링커-Fc 결합성 펩타이드 콘쥬게이트 (linker-Fc binding peptide conjugate)를 제조함을 포함할 수 있다.
Fc 결합성 펩타이드 (Fc binding peptide)는 항체의 Fc 도메인에 대한 결합성을 갖는 펩타이드를 통칭한다. Fc 결합성 펩타이드의 대표적인 예시로는 FcRn 도메인에 대한 결합성을 갖는 것으로 알려진 DeLano 등이 발견한 13-mer의 펩타이드가 잘 알려져 있다. 본 발명의 발명자는 상기 13-mer의 펩타이드의 특정 잔기를 치환한 서열번호 1 내지 5의 Fc 결합성 펩타이드를 발명함으로써 링커와 반응할 수 있도록 하였다. 이하 구조에서 보듯, 서열번호 1 내지 5의 Fc 결합성 펩타이드는 6번 잔기에서 자유 아민기를 포함하는 잔기로서, 자유 아민기를 통하여 링커와 반응할 수 있다.
서열번호 1에 의한 Fc 결합성 펩타이드는 화학식 13로 표시되는 펩타이드로서:
[화학식 13]
D-C-A-W-H-Xa-G-E-L-V-W-C-T (서열번호 1)
이때, D는 아스파르트산이고, C는 시스테인이며, A는 알라닌이고, W는 트립토판이며, H는 히스티딘이고, Xa는 이며, G는 글리신이고, E는 글루탐산이며, L은 류신이고, V는 발린이며, T는 트레오닌이다. 이때, m은 1 이상 4 이하의 정수이고, N 말단의 시스테인과 C 말단의 시스테인은 선택적으로 서로 연결되어 있을 수 있다. m=1인 경우 Xa는 2,3-디아미노프로피온산 (2,3-Diaminopropionic Acid; Dap)이고 (서열번호 3), m=2인 경우 Xa는 2,4-디아미노뷰티릭산 (2,4-diaminobutyric acid; Dab)이며 (서열번호 4), m=3인 경우 Xa는 오르티닌 (orthinie)이고 (서열번호 5), m=4인 경우 Xa는 라이신 (lysine)이다 (서열번호 2).
서열번호 2에 의한 Fc 결합성 펩타이드는 화학식 14로 표시되는 펩타이드로서:
[화학식 14]
D-C-A-W-H-K-G-E-L-V-W-C-T (서열번호 2)
이때, D는 아스파르트산이고, C는 시스테인이며, A는 알라닌이고, W는 트립토판이며, H는 히스티딘이고, K는 라이신이며, G는 글리신이고, E는 글루탐산이며, L은 류신이고, V는 발린이며, T는 트레오닌이며, N 말단의 시스테인과 C 말단의 시스테인은 선택적으로 서로 연결되어 있을 수 있다.
상기 링커는 이상의 화학식 1 또는 화학식 2에 의한 화합물 및 이의 구체예들을 포함한다.
링커와 Fc 결합성 펩타이드의 결합은 친핵성 치환 반응에 의한 것일 수 있다. 이때, 친핵성 치환 반응은 Fc 결합성 펩타이드에 존재하는 친핵성 원자 (nucleophilic atom)가 링커의 양전하를 띄거나 부분적으로 양전하를 띄는 원자를 공격함으로서 발생할 수 있다. 이때, 상기 친핵성 원자는 라이신의 질소 원자일 수 있다. 또한, 상기 양전하를 띄거나 부분적으로 양전하를 띄는 원자는 카르보닐기의 친전자성 탄소일 수 있다.
이하에서는 예시적으로 본 명세서에 의해 개시되는 화학식 1 및/또는 2로 표시되는 화합물, 즉 링커가 Fc 결합성 펩타이드와 결합하여 링커-Fc 결합성 펩타이드 콘쥬게이트를 형성하는 것을 보여준다.
예시적으로 상기 링커-Fc 결합성 펩타이드 콘쥬게이트는 화학식 3의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 3]
상기 화학식 3에서,
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)은 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 친다이엔체(dienophile) 중 어느 하나 이상이며, 이때, 상기 사이클로 알킨, 컨쥬게이티드 다이엔 및 다이엔은 전술한 바와 같다.
R'''은 치환 또는 비치환된 C1-20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 폴리메틸렌, 치환 또는 비치환된 C5-12 아릴, 치환 또는 비치환된 C5-14 아릴 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C8-16 아릴 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C3-10 사이클로알킬렌, 치환 또는 비치환된 C3-10 헤테로사이클로알킬렌, 또는 치환 또는 비치환된 C5-12 헤테로아릴이며, 상기 헤테로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌 또는 헤테로아릴은 N, O 또는 S가 적어도 하나 이상 포함되고,
상기 치환은 비수소 치환기로 치환된 것으로, 비수소 치환기는 -Ra, -O-, =O, -ORa, -SRa, -S-, -N(Ra)2, =NRa, -C(Rb)3, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N-OH, =N2, -N3, -NHC(=O)Ra, -C(=O)Ra, -C(=O)NRaRa -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2Ra, -OS(=O)2ORa, -S(=O)2NRa, -S(=O)Ra, -C(=O)Ra, 알킬렌-C(=O)Ra, -C(=S)Ra, -C(=O)ORa, 알킬렌-C(=O)ORa, -C(=O)O-, 알킬렌-C(=O)O-, -C(=S)ORa, -C(=O)SRa, -C(=S)SRa, -C(=O)NRaRa, 알킬렌-C(=O)NRaRa, a-C(=S)NRaRa, -C(-NRa)NRaRa 및 Rb로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있고,
상기 Ra는 H, C1-6 알킬, C5-12 아릴, C7-12 아릴알킬 또는 헤테로사이클이고,
상기 Rb은 F, Cl, Br, 또는 I이고,
X는 O, N 및 S 중 어느 하나일 수 있다.
Y3은 O, N 및 S 중 어느 하나일 수 있다.
Fp는 Fc 결합성 펩타이드이다. 나아가, Fp는 화학식 13 또는 14 중 선택된 어느 하나의 펩타이드일 수 있다. 화학식 13 및 14에 관한 것은 이미 설명된 바와 같다.
Fp는 6번 아미노산 잔기에서 Y3를 통해 연결될 수 있다. 이때, 상기 6번 아미노산 잔기는 라이신 (lysine), 오르티닌 (ornithine), 2,3-디아미노프로피온산, 또는 2,4-디아미노뷰티릭산 일 수 있다.
상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 일례로 반응식 1에 의해 제조될 수 있다.
[반응식 1]
상기 반응식 1은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 Fc 결합성 펩타이드와 반응시켜 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 반응이다.
상기 Fc 결합성 펩타이드와 화학식1의 결합반응은 치환반응에 의해 수행될 수 있다.
상기 치환반응은 친핵성 아실 치환반응일 수 있다.
상기 치환반응은 화학식 1의 화합물과 Fc 결합성 펩타이드의 아민기(-NH2), 티올기(-SH) 및 하이드록시기(-OH)중 어느 하나의 반응에 의해 수행될 수 있다.
일 예로, 상기 화학식 1의 화합물과 Fc 결합성 펩타이드의 아민기(-NH2)와 반응할 경우, 상기 Y3는 N(H)일 수 있다. 서열번호 1 내지 5의 펩타이드는 6번 잔기에 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노뷰리틱산, 오르티닌, 또는 라이신이 포함된 것으로서, 해당 잔기들은 모두 자유 아민기를 포함하고 있어 치환반응을 수행할 수 있다.
다른 예로, 상기 화학식 1의 화합물과 Fc 결합성 펩타이드의 티올기(-SH)와 반응할 경우, 상기 Y3는 S일 수 있다.
일 예로, 상기 화학식 1의 화합물과 Fc 결합성 펩타이드의 하이드록시기(-OH)중 어느 하나와 반응할 경우, 상기 Y3는 O일 수 있다.
예시적으로 상기 링커-Fc 결합성 펩타이드 콘쥬게이트는 화학식 4의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 4]
상기 화학식 4에서,
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)은 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 친다이엔체(dienophile) 중 어느 하나 이상이며, 이때, 상기 사이클로 알킨, 컨쥬게이티드 다이엔 및 다이엔은 전술한 바와 같다.
R'''은 치환 또는 비치환된 C1-20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 폴리메틸렌, 치환 또는 비치환된 C5-12 아릴, 치환 또는 비치환된 C5-14 아릴 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C8-16 아릴 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C3-10 사이클로알킬렌, 치환 또는 비치환된 C3-10 헤테로사이클로알킬렌, 또는 치환 또는 비치환된 C5-12 헤테로아릴이며, 상기 헤테로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌 또는 헤테로아릴은 N, O 또는 S가 적어도 하나 이상 포함되고,
상기 치환은 비수소 치환기로 치환된 것으로, 비수소 치환기는 -Ra, -O-, =O, -ORa, -SRa, -S-, -N(Ra)2, =NRa, -C(Rb)3, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N-OH, =N2, -N3, -NHC(=O)Ra, -C(=O)Ra, -C(=O)NRaRa -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2Ra, -OS(=O)2ORa, -S(=O)2NRa, -S(=O)Ra, -C(=O)Ra, 알킬렌-C(=O)Ra, -C(=S)Ra, -C(=O)ORa, 알킬렌-C(=O)ORa, -C(=O)O-, 알킬렌-C(=O)O-, -C(=S)ORa, -C(=O)SRa, -C(=S)SRa, -C(=O)NRaRa, 알킬렌-C(=O)NRaRa, -C(=S)NRaRa, -C(-NRa)NRaRa 및 Rb로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있고,
상기 Ra는 H, C1-6 알킬, C5-12 아릴, C7-12 아릴알킬 또는 헤테로사이클이고,
상기 Rb은 F, Cl, Br, 또는 I이고,
X는 O, N 및 S 중 어느 하나일 수 있다.
Y4는 O, N 및 S 중 어느 하나일 수 있다.
Fp는 Fc 결합성 펩타이드이다. 나아가, Fp는 화학식 13 또는 14 중 선택된 어느 하나의 펩타이드일 수 있다. 화학식 13 및 14에 관한 것은 이미 설명된 바와 같다.
Fp는 6번 아미노산 잔기에서 Y4를 통해 연결될 수 있다. 이때, 상기 6번 아미노산 잔기는 라이신 (lysine), 오르티닌 (ornithine), 2,3-디아미노프로피온산, 또는 2,4-디아미노뷰티릭산 일 수 있다.
상기 화학식 4로 표시되는 화합물은 일례로 반응식 2에 의해 제조될 수 있다.
[반응식 2]
상기 반응식 2는, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물을 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 Fc 결합성 펩타이드와 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 반응이다.
상기 Fc 결합성 펩타이드는 화학식2와 치환반응에 의해 수행될 수 있다.
상기 치환반응은 친핵성 아실 치환반응일 수 있다.
상기 치환반응은 화학식 2의 화합물과 Fc 결합성 펩타이드의 아민기(-NH2) 티올기(-SH) 및 하이드록시기(-OH)중 어느 하나의 반응에 의해 수행될 수 있다.
일 예로, 상기 화학식 2의 화합물과 Fc 결합성 펩타이드의 아민기(-NH2)와 반응할 경우, 상기 Y4는 N일 수 있다. 서열번호 1 내지 5의 펩타이드는 6번 잔기에 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노뷰리틱산, 오르티닌, 또는 라이신이 포함된 것으로서, 해당 잔기들은 모두 자유 아민기를 포함하고 있어 치환반응을 수행할 수 있다.
다른 예로, 상기 화학식 2의 화합물과 Fc 결합성 펩타이드의 티올기(-SH)와 반응할 경우, 상기 Y4는 S일 수 있다.
일 예로, 상기 화학식 2의 화합물과 Fc 결합성 펩타이드의 하이드록시기(-OH)중 어느 하나와 반응할 경우, 상기 Y4는 O일 수 있다.
상기 반응식 1 및 반응식 2에서, Fc 결합성 펩타이드의 아민기(-NH2) 티올기(-SH) 및 하이드록시기(-OH) 잔기는 제 1 카보닐기의 탄소원자와 반응하여, 화학식 3 및/또는 화학식 4로 표시되는 화합물이 제조될 수 있다.
이때, 상기 R'과 가장 근접하게 연결된 카보닐기의 탄소, 즉 제 1 카보닐기의 친전자성 탄소 원자는 가장 큰 부분 양전하(δ+)를 가지고 있을 수 있다.
항체-페이로드 콘쥬게이트를 준비하는 방법은 (2) 링커-Fc 결합성 펩타이드와 항체를 반응시켜 상기 항체에 제1 클릭 화학 작용기를 포함시킴을 포함할 수 있다.
또한 이때 Fc 결합성 펩타이드가 Fc 도메인의 특정 부위와 친화성을 갖는 경우 링커-Fc 결합성 펩타이드 콘쥬게이트가 항체의 특정 위치에 반응하도록 유도할 수 있다. 본 발명의 발명자는 항체의 FcRn 도메인에 대해 친화성을 갖는 서열번호 1 내지 5의 Fc 결합 펩타이드를 사용함으로써, 항체의 특정한 위치, 특히 Fc의 246번 라이신 (Fc-Lys246) 또는 248번 라이신 (Fc-Lys248) 위치에 제1 클릭 화학 작용기를 전달할 수 있는 기술을 개발하였다.
링커-Fc 결합성 펩타이드 콘쥬게이트와 항체의 반응은 친핵성 치환 반응일 수 있다. 이때, 친핵성 치환 반응은 항체에 존재하는 친핵성 원자 (nucleophilic atom)가 링커-Fc 결합성 펩타이드 콘쥬게이트의 양전하를 띄거나 부분적으로 양전하를 띄는 원자를 공격함으로서 발생할 수 있다. 이때, 상기 친핵성 원자는 라이신의 질소 원자일 수 있다. 또한, 상기 양전하를 띄거나 부분적으로 양전하를 띄는 원자는 링커 구조에 포함된 카르보닐기의 친전자성 탄소일 수 있다.
일 예시에서, 제1 클릭 화학작용기를 포함하는 항체는 화학식 5으로 표시될 수 있다.
[화학식 5]
상기 화학식 5에서,
Ab는 항체이다. 나아가, Ab는 트라스투주맙 (Trastuzumab)일 수 있다.
R''은 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group) 중 어느 하나이며
상기 클릭 화학 작용기(click chemistry functional group)은 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 친다이엔체(dienophile) 중 어느 하나 이상이며, 이때, 상기 사이클로 알킨, 컨쥬게이티드 다이엔 및 다이엔은 전술한 바와 같다.
또한, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 Fc의 246번 라이신 또는 248번 라이신 잔기에 포함된 것일 수 있다. 나아가, Ab와 연결된 질소 원자는 항체의 Fc의 246번 라이신 잔기에 포함된 것일 수 있다. 또는 나아가, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 Fc의 248번 라이신 잔기에 포함된 것일 수 있다.
n은 1 이상 4 이하의 정수이다. 예시적으로, n=2일 수 있다. 이 경우 R''이 1 개 항체 내의 2 개의 Fc에 각각 포함된 246번 라이신 또는 248번 라이신에 연결되어 이러한 구조가 생성될 수 있다. 다른 예시에서, n=4일 수 있다. 이 경우 1 개 항체 내의 2 개의 Fc에 각각 포함된 246번 라이신 및 248번 라이신에 연결되어 이러한 구조가 생성될 수 있다.
n=2이고, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 양 Fc의 246번 라이신에 포함된 것일 수 있다. 또는, n=2이고, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 양 Fc의 248번 라이신에 포함된 것일 수 있다.
화학식 5의 항체는 하기 반응식 3으로 표시되는 반응에 의하여 제조될 수 있다.
[반응식 3]
이때, 화학식 3과 화학식 5에 대한 것은 이미 설명된 바와 같다.
이때 서열번호 1 내지 5의 펩타이드는 6번 잔기에 각각 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노뷰티릭산라이신, 오르티닌, 또는 라이신이 포함된 것으로서, 해당 잔기들은 모두 자유 아민기를 포함하는 탄소 뼈대의 길이에 차이가 있을 뿐 유사한 구조를 가지고 있다. 이로 인해 서열번호 1 내지 5의 펩타이드는 모두 항체의 Fc 도메인에 대한 결합성을 보인다.
다른 예시에서, 제1 클릭 화학작용기를 포함하는 항체는 화학식 6으로 표시될 수 있다.
[화학식 6]
상기 화학식 6에서,
Ab는 항체이다. 나아가, Ab는 트라스투주맙 (Trastuzumab)일 수 있다.
R'''은 치환 또는 비치환된 C1-20 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C1-10 폴리메틸렌, 치환 또는 비치환된 C5-12 아릴, 치환 또는 비치환된 C5-14 아릴 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C8-16 아릴 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C3-10 사이클로알킬렌, 치환 또는 비치환된 C3-10 헤테로사이클로알킬렌, 또는 치환 또는 비치환된 C5-12 헤테로아릴이며, 상기 헤테로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌 또는 헤테로아릴은 N, O 또는 S가 적어도 하나 이상 포함되고,
상기 치환은 비수소 치환기로 치환된 것으로, 비수소 치환기는 -Ra, -O-, =O, -ORa, -SRa, -S-, -N(Ra)2, =NRa, -C(Rb)3, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N-OH, =N2, -N3, -NHC(=O)Ra, -C(=O)Ra, -C(=O)NRaRa -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2Ra, -OS(=O)2ORa, -S(=O)2NRa, -S(=O)Ra, -C(=O)Ra, 알킬렌-C(=O)Ra, -C(=S)Ra, -C(=O)ORa, 알킬렌-C(=O)ORa, -C(=O)O-, 알킬렌-C(=O)O-, -C(=S)ORa, -C(=O)SRa, -C(=S)SRa, -C(=O)NRaRa, 알킬렌-C(=O)NRaRa, -C(=S)NRaRa, -C(-NRa)NRaRa 및 Rb로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있다.
또한, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 Fc의 246번 라이신 또는 248번 라이신 잔기에 포함된 것일 수 있다. 나아가, Ab와 연결된 질소 원자는 항체의 Fc의 246번 라이신 잔기에 포함된 것일 수 있다. 또는 나아가, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 Fc의 248번 라이신 잔기에 포함된 것일 수 있다.
또한, 이때 Fc 결합성 펩타이드는 제1 클릭 화학작용기를 포함할 수 있다. 상기 제1 클릭 화학 작용기는 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 친다이엔체(dienophile) 중 어느 하나 이상이며, 이때, 상기 사이클로 알킨, 컨쥬게이티드 다이엔 및 다이엔은 전술한 바와 같다. 나아가, Fc 결합성 펩타이드는 그 서열의 N 말단에 인접한 아미노산 잔기에서 제1 클릭 화학작용기를 포함할 수 있다. 더 나아가, Fc 결합성 펩타이드는 그 서열의 N 말단에서 제1 클릭 화학작용기를 포함할 수 있다. 또는 나아가, Fc 결합성 펩타이드는 그 서열의 C 말단에 인접한 아미노산 잔기에서 제1 클릭 화학작용기를 포함할 수 있다. 더 나아가, Fc 결합성 펩타이드는 그 서열의 C 말단에서 제1 클릭 화학작용기를 포함할 수 있다.
Fp는 Fc 결합성 펩타이드이다. 나아가, Fp는 화학식 13 또는 14 중 선택된 어느 하나의 펩타이드일 수 있다. 화학식 13 및 14에 관한 것은 이미 설명된 바와 같다.
Fp는 6번 아미노산 잔기에서 Y3를 통해 연결될 수 있다. 이때, 상기 6번 아미노산 잔기는 라이신 (lysine), 오르티닌 (ornithine), 2,3-디아미노프로피온산, 또는 2,4-디아미노뷰티릭산 일 수 있다.
n은 1 이상 4 이하의 정수이다. 예시적으로, n=2일 수 있다. 이 경우 Fp가 1 개 항체 내의 2 개의 Fc에 각각 포함된 246번 라이신 또는 248번 라이신에 연결되어 이러한 구조가 생성될 수 있다. 다른 예시에서, n=4일 수 있다. 이 경우 1 개 항체 내의 2 개의 Fc에 각각 포함된 246번 라이신 및 248번 라이신에 연결되어 이러한 구조가 생성될 수 있다.
n=2이고, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 양 Fc의 246번 라이신에 포함된 것일 수 있다. 또는, n=2이고, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 양 Fc의 248번 라이신에 포함된 것일 수 있다.
화학식 6의 항체는 하기 반응식 4로 표시되는 반응에 의하여 제조될 수 있다.
[반응식 4]
이때, 화학식 4과 화학식 6에 대한 것은 이미 설명된 바와 같다.
이때 서열번호 1 내지 5의 펩타이드는 6번 잔기에 각각 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노뷰티릭산라이신, 오르티닌, 또는 라이신이 포함된 것으로서, 해당 잔기들은 모두 자유 아민기를 포함하는 탄소 뼈대의 길이에 차이가 있을 뿐 유사한 구조를 가지고 있다. 이로 인해 서열번호 1 내지 5의 펩타이드는 모두 항체의 Fc 도메인에 대한 결합성을 보인다.
항체-페이로드 콘쥬게이트를 준비하는 방법은 (3) 제1 클릭 화학 작용기를 포함하는 항체에 제1 클릭 화학 작용기와 상보적인 제2 클릭 화학 작용기를 포함하는 페이로드를 반응시켜 항체-페이로드 콘쥬게이트를 제조함을 포함할 수 있다.
상기 페이로드는 활성 모이어티 (active moiety)를 포함할 수 있다. 상기 활성 모이어티는 핵산, 펩타이드 및 화합물 중 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 활성 모이어티는 약물 분자, 이미징 모이어티, 광학 작용제, 비타민 및 독소로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 나아가, 상기 활성 모이어티는 약물 분자일 수 있다. 상기 약물 분자는 프로드러그(Prodrug), 약물전구체(prousor drug) 또는 약물(drug)일 수 있다. 상기 약물 분자는 항암제, 항염증제, 기타 항질환제, 항미생물제(항생제, 항진균제, 항바이러스제)일 수 있다. 더 나아가, 상기 약물 분자는 메르탄신 (mertansine; DM1)일 수 있다. 또는 나아가, 상기 페이로드는 2개 이상의 약물 분자를 포함할 수 있다. 또는, 상기 활성 모이어티는 이미징 모이어티(imaging moiety)일 수 있다. 상기 이미징 모이어티(imaging moiety)는 조영제, 방사성 동위원자, 형광물질일 수 있다. 또는 상기 활성 모이어티는 이외에도 광학 작용제, 비타민, 독소 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 페이로드는 제2 클릭 화학 작용기를 포함한다. 이때, 상기 제2 클릭 화학 작용기는 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 친다이엔체(dienophile) 중 어느 하나 이상이며, 이때, 상기 사이클로 알킨, 컨쥬게이티드 다이엔 및 다이엔은 전술한 바와 같다.
일 예시에서, 항체-페이로드 콘쥬게이트는 화학식 7로 표시될 수 있다.
[화학식 7]
상기 화학식 7에서,
Ab는 항체이다. 나아가, Ab는 트라스투주맙 (Trastuzumab)일 수 있다.
Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 Fc의 246번 라이신 또는 248번 라이신 잔기에 포함된 것일 수 있다. 나아가, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 Fc의 246번 라이신 잔기에 포함된 것일 수 있다. 또는 나아가, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 Fc의 248번 라이신 잔기에 포함된 것일 수 있다.
B는 제1 클릭 화학작용기와 제2 클릭 화학작용기의 클릭화학 반응 (click-chemistry)에 의하여 형성되는 구조들 중 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, B는 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 친다이엔체(dienophile) 중에서 선택된 2개의 반응에 의하여 생성될 수 있는 구조들 중 하나일 수 있다. 나아가, B는 또는 일 수 있다. 이때, A1은 항체와 연결되어있고, A2는 Am과 연결되어있을 수 있다. 또는, A1은 Am과 연결되어있고, A2는 항체와 연결되어있을 수 있다.
Am은 활성 모이어티 또는 이를 포함하는 구조이다. 이때, Am는 2개 이상의 활성 모이어티를 포함할 수 있다. 활성 모이어티에 관한 내용은 상기 페이로드의 설명에서 설명한 바와 같다.
n은 1 이상 4 이하의 정수이다. 예시적으로, n=2일 수 있다. 이 경우 페이로드가 1 개 항체 내의 2 개의 Fc에 각각 포함된 246번 라이신 또는 248번 라이신에 연결되어 이러한 구조가 생성될 수 있다. 다른 예시에서, n=4일 수 있다. 이 경우 1 개 항체 내의 2 개의 Fc에 각각 포함된 246번 라이신 및 248번 라이신에 연결되어 이러한 구조가 생성될 수 있다.
n=2이고, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 양 Fc의 246번 라이신에 포함된 것일 수 있다. 또는, n=2이고, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 양 Fc의 248번 라이신에 포함된 것일 수 있다.
상기 화학식 7로 표시되는 화합물은 일례로 반응식 5에 의해 제조될 수 있다.
[반응식 5]
이때, R''은 제1 클릭 화학작용기이며 위에서 화학식 5를 설명할 때 설명한 바와 같다.
또한, R''''은 제2 클릭 화학작용기이며 상기 페이로드를 설명할 때 설명한 바와 같다.
일 예시에서, 항체-페이로드 콘쥬게이트는 화학식 8로 표시될 수 있다.
[화학식 8]
상기 화학식 8에서,
Ab는 항체이다. 나아가, Ab는 트라스투주맙 (Trastuzumab)일 수 있다.
Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 246번 라이신 또는 248번 라이신 잔기에 포함된 것일 수 있다. 나아가, Ab와 연결된 질소 원자는 항체의 246번 라이신 잔기에 포함된 것일 수 있다. 또는 나아가, Ab와 연결된 질소 원자는 항체의 248번 라이신 잔기에 포함된 것일 수 있다.
B는 제1 클릭 화학작용기와 제2 클릭 화학작용기의 클릭화학 반응 (click-chemistry)에 의하여 형성되는 구조들 중 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, B는 알킨(alkyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne) 및 사이클로노닌(cyclononyne) (예로, 바이사이클로[6.1.0]-논-4-인-9-일 메탄올(bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol) 과 같은 사이클로알킨(cycloalkyne), 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 니트론(nitrone), 니트릴 옥사이드(nitrile oxide), 아자이드(azide), 컨쥬게이티드 다이엔(Conjugated Diene) 및 친다이엔체(dienophile) 중에서 선택된 2개의 반응에 의하여 생성될 수 있는 구조들 중 하나일 수 있다. 나아가, B는 또는 일 수 있다. 이때, A1은 항체와 연결되어있고, A2는 Am과 연결되어있을 수 있다. 또는, A1은 Am과 연결되어있고, A2는 항체와 연결되어있을 수 있다.
Fp는 Fc 결합성 펩타이드이다. 나아가, Fp는 화학식 13 또는 14 중 선택된 어느 하나의 펩타이드일 수 있다. 화학식 13 및 14에 관한 것은 이미 설명된 바와 같다.
Fp는 6번 아미노산 잔기에서 Y4를 통해 연결될 수 있다. 이때, 상기 6번 아미노산 잔기는 라이신 (lysine), 오르티닌 (ornithine), 2,3-디아미노프로피온산, 또는 2,4-디아미노뷰티릭산 일 수 있다.
Am은 활성 모이어티 또는 이를 포함하는 구조이다. 이때, Am는 2개 이상의 활성 모이어티를 포함할 수 있다. 활성 모이어티에 관한 내용은 상기 페이로드의 설명에서 설명한 바와 같다.
B는 Fc 결합성 펩타이드 서열의 N 말단에 인접한 아미노산 잔기와 결합될 수 있다. 더 나아가, B는 Fc 결합성 펩타이드의 N 말단과 결합될 수 있다. 또는 나아가, B는 Fc 결합성 펩타이드 서열의 C 말단에 인접한 아미노산 잔기와 결합될 수 있다. 더 나아가, B는 Fc 결합성 펩타이드의 C 말단과 결합될 수 있다.
n은 1 이상 4 이하의 정수이다. 예시적으로, n=2일 수 있다. 이 경우 페이로드가 1 개 항체 내의 2 개의 Fc에 각각 포함된 246번 라이신 또는 248번 라이신에 연결되어 이러한 구조가 생성될 수 있다. 다른 예시에서, n=4일 수 있다. 이 경우 1 개 항체 내의 2 개의 Fc에 각각 포함된 246번 라이신 및 248번 라이신에 연결되어 이러한 구조가 생성될 수 있다.
n=2이고, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 양 Fc의 246번 라이신에 포함된 것일 수 있다. 또는, n=2이고, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 항체의 양 Fc의 248번 라이신에 포함된 것일 수 있다.
화학식 8로 표시되는 화합물은 일례로 반응식 6에 의해 제조될 수 있다.
이때, R'''''은 제1 클릭 화학작용기이며 위에서 화학식 6을 설명할 때 설명한 바와 같다. Fc 결합성 펩타이드를 합성하는 과정에서 아미노산 잔기에 제1 클릭 화학작용기를 관여시킬 수 있다. 제1 클릭 화학작용기가 관여되는 아미노산 잔기는 어떠한 곳도 무방하나, 6번 잔기는 아닌 것이 바람직하다. 6번 잔기는 링커와의 치환 반응을 위하여 설계된 잔기이기 때문이다. 펩타이드의 인공 합성 과정에 따라, Fc 결합성 펩타이드는 그 서열의 N 말단에 인접한 아미노산 잔기에서 제1 클릭 화학작용기를 포함할 수 있다. 나아가, Fc 결합성 펩타이드는 그 서열의 N 말단에서 제1 클릭 화학작용기를 포함할 수 있다. 또는, Fc 결합성 펩타이드는 그 서열의 C 말단에 인접한 아미노산 잔기에서 제1 클릭 화학작용기를 포함할 수 있다. 나아가, Fc 결합성 펩타이드는 그 서열의 C 말단에서 제1 클릭 화학작용기를 포함할 수 있다.
또한, R''''은 제2 클릭 화학작용기이며 위에서 페이로드를 설명할 때 설명한 바와 같다.
본 출원은 원하는 타겟분자에 페이로드를 연결시킬 수 있도록 운반 및 결합 반응을 돕는 링커(linker)를 제공할 수 있다.
상기 링커 또는 링커의 모이어티(moiety)는 타겟분자에 직접적으로 연결될 수 있다. 상기 타겟분자에 직접적으로 연결된 링커 모이어티는 페이로드와 연결될 수 있다.
상기 링커 모이어티는 링커의 일부 잔기 또는 일부 작용기일 수 있다.
예를 들어, 상기 링커 모이어티는 R'' 또는 R''을 포함한 일부 잔기일 수 있다.
예를 들어, 상기 링커 모이어티는 R''을 제외한 링커의 일부 잔기일 수 있다.
상기 링커 모이어티가 연결된 타겟분자는 클릭 반응(click reaction) 즉, 클릭 화학 작용기간 반응에 의해 페이로드와 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 링커가 화학식1의 구조를 가지는 경우,
상기 타겟분자에 연결된 링커 모이어티는 클릭 화학 작용기을 포함할 수 있다.
이때, 상기 타겟분자에 연결된 링커 모이어티는 페이로드와 클릭반응에 참여할 수 있다.
이러한 링커는 타겟분자의 생물학적 활성에 영향을 주지 않을 수 있다. 즉, 타겟분자의 반감기, 배출 및 혈중 안정성 등에 영향을 거의 주지 않을 수 있다.
상기 타겟분자의 반감기는 상기 타겟분자의 FcRn 결합 친화성에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 타겟분자는 FcRn과 결합함으로써 생체 내에서 recycling이 일어날 수 있고, 생체 내에서 반감기가 증가할 수 있다.
상기 타겟분자의 배출은 상기 단백질체의 응집(aggregation) 결과 신장에 의해 배출되는 정도에 의해 결정될 수 있다.
일 예로, 상기 링커는 세포 내 반감기가 짧은 단백질, 화합물 예를 들어 약물을 세포 내 반감기가 긴 타겟분자에 연결시킴으로써, 혈중에서 약물의 반감기를 증가시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 링커가 화학식2의 구조를 가지는 경우,
상기 타겟분자에 연결된 링커 모이어티는 클릭 화학 작용기을 포함하지 않을 수 있다.
상기 타겟분자에 연결된 링커 모이어티는 클릭 화학 작용기을 포함하고 있는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및/또는 화합물과 연결될 수 있다.
상기 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및/또는 화합물은 페이로드와 클릭반응에 의해 연결될 수 있다.
이러한 링커는 타겟분자의 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있다. 상기 타겟분자의 생물학적 활성에 영향을 주는 경우는 타겟분자의 반감기, 배출 또는 혈중 안정성에 영향을 미치는 경우이다. 예를 들어, 타겟분자에 간접적으로 링커를 연결시킬 경우, 상기 링커는 타겟분자의 반감기를 감소시킴으로써 페이로드를 생체 내에서 빠르게 배출시킬 수 있다.
상기 링커는 특정 타겟분자와 결합친화력(binding affinity)를 가지는 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 연결될 수 있다. 이러한 링커는 타겟분자에 페이로드를 위치-특이적으로 연결시킬 수 있다.
일 예로, 상기 타겟분자는 항체일 수 있다.
예를 들어, 항체는 IgG 항체 또는 IgG항체의 일부 단편일 수 있다. 상기 IgG 항체는 인간 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 및/또는 토끼의 IgG일 수 있다. 상기 IgG 항체는 인간 유래 CH2-CH3 도메인 일 수 있다. 상기 타겟분자는 항체, 또는 항체 일부 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예로, 상기 Fc 결합성 펩타이드는 항체와 결합친화력(binding affinity)을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 Fc 결합성 펩타이드는 IgG 항체와 결합친화력(binding affinity)을 가질 수 있다. 상기 Fc 결합성 펩타이드는 IgG 항체의 특정 도메인과 특이적으로 결합친화력을 가질 수 있다.
예를 들어, Fc 결합성 펩타이드는 IgG 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변부에 대한 특이성을 가질 수 있다.
예를 들어, Fc 결합성 펩타이드는 IgG 항체의 중쇄의 불변 도메인과 특이성을 가질 수 있다. 이때 중쇄 불변 도메인은 CH2 도메인 및/또는 CH3도메인일 수 있다.
상기 Fc 결합성 펩타이드는 화합물이 연결된 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
예를 들어, 상기 Fc 결합성 펩타이드는 클릭 화학 작용기을 포함할 수 있다.
본 발명은 항체-페이로드 콘쥬게이트를 투여함을 포함하는 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이때, 상기 암은 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 심장암, 자궁경부암, 대장암, 직장암, 식도암, 섬유육종, 위암, 위장암, 두경부암, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 골수종, 난소암, 췌장암, 음경암, 전립선암, 고환 생식세포 암, 흉선종 및 흉선암으로부터 선택될 수 있다. 나아가, 상기 암은 유방암일 수 있다.
본 발명은 항체-페이로드 콘쥬게이트를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 이때, 상기 암은 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 심장암, 자궁경부암, 대장암, 직장암, 식도암, 섬유육종, 위암, 위장암, 두경부암, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 골수종, 난소암, 췌장암, 음경암, 전립선암, 고환 생식세포 암, 흉선종 및 흉선암으로부터 선택될 수 있다. 나아가, 상기 암은 유방암일 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다. 이하의 실시예에서 화합물들의 명칭에 붙여진 숫자들은 도면을 기준으로 작성된 것들이다.
[실시예 1] 화합물 I (Trans Linker: NHS & Norbornene, 화학식 1-1-2) 합성 방법 및 구조 확인
실시예 1-1. 화합물 1의 합성 및 구조확인
Monomethylglutarate 10 g (68.4 mmol, 1.0 eq)을 Dichloromethane (DCM) 250 mL에 녹여 교반시킨다. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDCi) 17.7 g (92.3 mmol, 1.34 eq)와 N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) 24 mL (138 mmol, 2.0 eq)를 천천히 적가하여 20 분 동안 교반시킨 후 O-benzylhydroxyamine 8 mL (68.7 mmol, 1.0 eq)를 천천히 적가하였다. 18 시간 뒤 반응 용액을 감압농축하여 제거하였고, Ethylacetate (EA)에 다시 녹여주었다. 유기 층을 10% 시트르산 용액을 사용하여 3번 씻어주었고, 포화소금용액과 황산 나트륨을 사용하여 건조하였다. 목적 화합물을 정제없이 다음 반응에 사용하였다 (crude yield : 12.9 g, 88%). TLC (EA:Hex = 2:1); Rf = 0.5
1H NMR (300 MHz, dmso) δ 7.35 (d, J = 3.5 Hz, 5H), 4.75 (d, J = 3.5 Hz, 2H), 3.56 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 2.26 (td, J = 7.3, 3.8 Hz, 2H), 1.96 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 1.78 - 1.61 (m, 2H).
실시예 1-2 화합물 2의 합성 및 구조확인
화합물 1 12.9 g을 N,N-Dimethylformamide (DMF) 200 mL에 녹인 후 0 ℃에서 교반시켰다. 1,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-ene (DBU) 24 mL (160 mmol, 3.08 eq)와 Methyliodide (MeI) 10 mL (160 mmol, 3.08 eq)를 천천히 적가하였다. Diethylamine 0.2 mL을 천천히 적가하였다. 20 시간 동안 교반시킨 후 반응 용매를 Celite와 섞어 감압농축하여 제거하였고, 컬럼크로마토그래피 (EA:Hex = 1:1)를 통하여 목적 화합물을 정제하였으며, 7.6 g을 획득하였다 (yield : 56%). TLC (EA:Hex = 1:1); Rf = 0.5
1H NMR (300 MHz, cdcl3) δ 7.44 - 7.33 (m, 5H), 4.82 (s, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 2.43 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.98 - 1.85 (m, 2H).
실시예 1-3 화합물 3의 합성 및 구조확인
화합물 2 4.18 g (15.8 mmol, 1.0 eq)을 Tetrahydrofuran (THF) 100 mL에 녹인 후 교반시킨다. 2 N Lithium hydroxide (LiOH) 5 mL를 0 ℃에서 천천히 적가한 뒤 3 시간 동안 교반하였다. H2O 60 mL을 첨가하여 반응을 종결하였고, EA 150 mL을 사용하여 수층으로부터 2 회 씻어주었다. 이후 수 층에 2 N HCl 용액을 사용하여 pH 3.0까지 적정하였고, EA 50 mL을 이용하여 목적화합물을 3 회 추출하였다. 유기 층을 포화소금용액과 황산 나트륨을 사용하여 건조하였고, 2.46 g 획득하였다 (yield : 62%). TLC (EA:Hex = 1:1); Rf = 0.1
1H NMR (300 MHz, dmso) δ12.06 (s, 1H), 7.51 - 7.29 (m, 5H), 4.86 (s, 2H), 3.13 (s, 3H), 2.38 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.22 (dt, J = 11.7, 7.4 Hz, 4H).
실시예 1-4 화합물 4의 합성 및 구조확인
화합물 3 2.46 g을 Methanol (MeOH) 40 mL에 녹인 후 Palladium on carbon (Pd/C) 존재 하에 수소화반응을 18 시간에 걸쳐 진행하였고, 반응 종결 후 short-path column을 통하여 Pd/C 제거 후 목적 화합물을 정제, 농축하여 1.2 g을 획득하였다 (yield : 76%).
1H NMR (300 MHz, dmso) δ 12.06 (s, 1H), 7.51 - 7.29 (m, 5H), 4.86 (s, 2H), 3.13 (s, 3H), 2.38 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.22 (dt, J = 11.7, 7.4 Hz, 4H).
실시예 1-5 화합물 5의 합성 및 구조확인
화합물 4 0.17 g (1.06 mmol, 1.0 eq)를 DCM 10 mL에 녹여 교반시킨다. Exo-5-norbornene acid chloride 0.22 g (1.73 mmol, 1.63 eq)와 DIPEA 0.2 mL (1.1 mmol, 1.0 eq)를 0 ℃에서 천천히 적가하였다. 2 시간 동안 교반시킨 후 유기 층을 10% 시트르산 용액을 사용하여 3 번 씻어주었고, 포화소금용액과 황산 나트륨을 사용하여 건조하였다. 목적 화합물을 정제없이 다음 반응에 사용하였다 (crude yield : 0.24 g, 68%). TLC (DCM:MeOH = 10:1); Rf = 0.3
Expected M.W. (M+H)+: 282.13 g/mol
Measured M.W. (M+H)+: 282.1 g/mol
실시예 1-6 화합물 I의 합성 및 구조확인
화합물 5 0.24 g (0.72 mmol, 1.0 eq)을 DCM 3 mL에 녹여 교반시킨다. N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uroniumtetrafluorborat (TSTU) 0.26 g (0.87 mmol, 1.2 eq)와 DIPEA 0.15 mL (0.87 mmol, 1.2 eq)를 천천히 적가하였다. 1 시간 동안 교반시킨 후 유기 층을 10% 시트르산 용액을 사용하여 3 번 씻어주었고, 포화소금용액과 황산 나트륨을 사용하여 건조하였다. 컬럼크로마토그래피 (EA:Hex = 1:1)를 통하여 목적 화합물을 정제하였으며, 0.04 g을 획득하였다 (yield : 15%). TLC (EA:Hex = 1:1); Rf = 0.3 (도 1 참고)
1H NMR (300 MHz, dmso) δ6.18 (ddd, J = 16.9, 5.5, 3.0 Hz, 2H), 2.94 (s, 1H), 2.80 (s, 4H), 2.71 (s, 1H), 2.67 (q, J = 1.0 Hz, 3H), 2.25 (dd, J = 25.9, 18.6 Hz, 4H), 1.86 (ddd, J = 18.9, 11.5, 5.8 Hz, 4H), 1.45 - 1.26 (m, 4H).
[실시예 2] 화합물 II(Cis Linker: NHS & Norbornene, 화학식 2-1-2) 합성 방법 및 구조 확인
실시예 2-1 화합물 6의 합성 및 구조확인
N-methylhydroxyamine hydrochloride 0.1 g (0.88 mmol, 1.0 eq)를 -25 oC의 Tetrahydrofurane (THF) 2 mL에 녹여 교반시킨다. Glutaric anhydride 0.07 g (0.88 mmol, 1.0 eq)를 첨가하고 10 분간 교반시킨 후 Triethylamine 0.25 mL (1.76 mmol, 2.0 eq)를 천천히 적가하였다. 1 시간 후 (1S,2R,4S)-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2-carbonyl chloride 0.14 g (0.88 mmol, 1.0 eq)와 Triethylamine 0.12 mL (0.88 mmol, 1.0 eq)를 천천히 적가한 후 상온에서 1 시간 동안 반응을 진행하였다. 반응 용액을 감압 농축을 통하여 제거한 후, Ethyl acetate (EA)에 다시 녹이고 10% 시트르산 용액을 사용하여 3번 씻어주었고, 포화소금용액과 황산 나트륨을 사용하여 건조하였다. 목적 화합물을 정제없이 다음 반응에 사용하였다. TLC (DCM:MeOH = 3:1, acetic acid 1 drop); Rf = 0.4
계산된 질량 (M+H)+: 282.13 g/mol
측정된 질량 (M+H)+: 282.1 g/mol
실시예 2-2 화합물 II의 합성
화합물 6을 Dichloromethane (DCM) 2 mL에 녹이고 TSTU 0.22 g (0.73 mmol, 0.8 eq)와 N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) 0.15 mL (0.88 mmol, 1.0 eq)를 천천히 적가하였다. 1 시간동안 반응 후, 반응 용액을 10% 시트르산 용액을 사용하여 3번 씻어주었고, 포화 탄산수소나트륨 용액, 포화소금용액과 황산 나트륨을 사용하여 건조하였다. 컬럼크로마토그래피 (EA:Hex = 1:1)를 통하여 목적 화합물을 정제하였다 TLC (EA:Hex = 2:1); Rf = 0.4 (도 3참고)
실시예 2-3 화합물 Ⅱ 의 구조 확인
최종 화합물 II의 합성은 실시예 2-1 내지 2-2에서 명시한 방법으로 진행하였으며, 도 6에 나타난 바와 같이 HPLC 분석을 통해 이성질체의 존재를 확인하였다. 도 6의 분석 조건을 토대로 HPLC 정제를 수행하였으며, HPLC 분석을 통해 도 7과 같은 순도의 화합물 II(cis)를 수득하였다. 정제된 화합물II의 구조 분석은 질량 분석법을 통해 확인함으로써 최종 화합물II의 분석을 완료하였다.
계산된 질량 (M+H)+: 379.14 g/mol
측정된 질량 (M+H)+: 379.0 g/mol
[실시예 3] 이성질체 화합물 6(Cis Linker or Trans Linker: NHS & Norbornene) 구조 확인
이성질체인 화합물 6을 고속액체크로마토그래피(HPLC, High speed liquid chromatograph) 장비를 이용하여 화합물 6의 Cis와 trans 구조를 확인하였다. HPLC 분석은 Waters사의 Waters 2695 HPLC 모델을 사용하였으며, 분석 칼럼은 Xbridge C18 (4.6 x 250 mm, 5 μm ; Waters), 이동상 용매의 경우 A 용매는 0.1%의 삼불화아세트산이 포함된 물과 B 용매는 0.075% 삼불화아세트산이 포함된 아세토니트릴을 사용하였다. 상기에 따라, 220 nm 파장의 흡광도를 통해 각 구조체의 특성을 분석하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 화합물 6의 Cis 형태의 구조는 14.89 분, Trans 형태의 구조는 15.32 분에 피크가 관찰됨을 확인하였다. 각 구조에 대한 분석은 질량분석기법(Shimadzu, LCMS-8050)을 통해 확인하였으며, 도 4및 도 5는 화합물 6의 Cis 및 Trans 구조에 대한 질량 분석 결과를 나타낸 것이다. 분자량을 확인한 결과, 각 피크에 해당하는 물질은 수소 한 분자가 결합된 282의 분자량이 관찰됨을 확인하였다.
계산된 질량 (M+H)+: 282.13 g/mol
측정된 질량 (M+H)+: 282.1 g/mol
[실시예 4] Fc 결합성 펩타이드 합성 및 구조 확인
실시예 4-1. FcBP(6Lys)-Norbornene 합성 및 구조 확인
[화학식 10]
실시예 4-1-1: FcBP(6Lys)-Norbornene의 합성
사용된 Fmoc 아미노산 목록 및 도입순서
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH.
제조 방법
(a) 아미노산 도입
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 mmole에 기초하였다. 0.5 g의 Clear amide resin (0.48 mmole/g, PeptideInternational, 미국)를 합성 반응기에 넣고, 각각의 Fmoc-아미노산 블록 1 mmole의 무게를 달아 펩타이드 아미노산 서열 순서대로 C-말단에서부터 N-말단까지 준비하였다.
Fmoc-아미노산을 활성화하여 Clear amide resin에 활성화된 잔기를 부착하는 반응을 C-말단 아미노산부터 순차적으로 진행하였다.
Fmoc의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF에서 수행하였고 잔기의 활성화 및 도입은 서열에 맞추어 준비한 아미노산을 2 mL 0.5 M HOBt 함유 DMF 용액, 2 mL 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액, 그리고 174 μL DIPEA와 5 분간 혼합한 다음 레진이 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 혼합하였다.
도입 반응의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반응으로 확인되면 도입 반응을 1회 더 반복하거나 20% Ac2O함유 DMF용액으로 캡핑을 실시하였다. 각 도입 반응과 Fmoc 제거 과정에서 다음 단계로 넘어가기 전에 DMF와 DCM으로 수지를 충분히 세척하였다. 이러한 과정은 목표한 펩타이드 서열이 완성될 때까지 반복하여 진행하였다.
(b) H-PEG8-OH의 도입
아미노산 도입이 모두 끝난 다음에 N-말단에 H-PEG8-OH를 도입하기 위하여 1 mL 0.5 M Fmoc-N-amido-dPEG8-acid in DMF 용액, 1 mL 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액, 1 mL 0.5 M HOBt 함유 DMF 용액, 그리고 87 μL DIPEA와 5 분간 혼합한 다음 반응 레진이 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 혼합하였다.
반응의 진행은 카이저 시험법으로 확인하였으며, 미반응 아민이 남아있는 것으로 판단되면 반응 시간을 1 ~ 3시간 더 연장하거나 반응액을 비우고 상기의 반응 과정을 다시 반복하였다. N-말단의 Fmoc 보호기의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF를 사용하여 수행한 다음, 펩타이드가 부착된 레진을 건조하고 중량을 측정하였다.
(c) 노르보레인(norbornene)의 도입
N-말단의 Fmoc 보호기의 제거는 레진에 노르보레인 카르복실산 4당량, 2 mL 0.5 M HOBt 함유 DMF 용액, 2 mL 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액, 그리고 174 μL DIPEA와 5 분간 혼합한 다음 레진이 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 혼합하였다. 도입 반응의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반응으로 확인되면 도입 반응을 1회 더 반복하였다.
(d) 상기 (c) 과정에서 준비한 펩타이드가 부착된 수지 250 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT (94:1.0:2.5:2.5)의 혼합액 2 mL과 함께 실온에서 120 분간 교반하여 레진에서 펩타이드를 절단하였다. 절단 혼합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩타이드를 침전시켰다. 침전된 펩타이드를 에테르로 3 회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% ACN 함유 물에 녹인 다음 6 시간 동안 교반한 다음 농축하였다.
농축액을 5%-DMSO-20%-ACN 함유 0.01 M ammonium acetate buffer (pH 6.5) 용액에 0.1 mg/mL 농도로 녹인 다음 공기 노출된 상태로 3 일 동안 교반하였다. 이황화 결합 형성 반응의 진행은 HPLC로 관측하였으며, 더 이상 진행하지 않는 것으로 판단되면 반응액을 동결건조하여 펩타이드 침전물을 얻었다.
(e) 정제
상기 (d) 과정에서 동결건조하여 얻은 펩타이드 침전물을 하기 표 5에 기재된 prep-LC 조건에서 정제하고 동결 건조하였다. 얻어진 펩타이드는 각각 90% 이상의 순도임을 분석용 HPLC로 확인하였으며, 도 8에 나타내었다.
norbornene-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Lys-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2 (Cys*: 이황화 결합 위치)
Prep-LC 정제조건
장비명 Waters 2525 pump, Waters 2487 UV detector
컬럼 Waters, XBridge Prep C18 5 μm OBD 19 x 250 mm
이동상 A/B 0.1% TFA in H2O / 0.1% TFA in Acetonitrile
구배 0 min → 30 min : B 20% → B 100%
유속 10 mL/min 검출파장 UV 280 nm
실시예 4-1-2: : FcBP(6Lys)-norbornene (oxidized form)의 구조 확인LC mass 기반 분자량 측정을 통해 FcBP(6Lys)의 합성을 확인하였다.
측정 장비 : Waters quattro premier xe
Calculated molecular weight : 2088.40 g/mol
Measured molecular weight (M/2+H)2+ : 1044.84 g/mol
그 결과를 도 9에 도시하였다.
실시예 4-2. 화합물 Ⅰ-FcBP(6Lys)-Norbornene 합성 및 구조 확인
[화학식 11]
실시예 4-2-1: 화합물 Ⅰ-FcBP(6Lys)-Norbornene의 합성
화합물 Ⅰ (trans-norbornene weinreb amide)-FcBP의 합성은 DMF에서 수행하였고 FcBP(6Lys)-norbornene에 화합물 Ⅰ를 도입하기 위해 DMF에 녹인 2.5 μmol의 FcBP(6Lys)-norbornene에 3 당량의 DIPEA와 3 μmol의 화합물 Ⅰ을 녹여 교반하였다.
도입 반응의 확인은 HPLC를 통한 분석을 시행하였으며 반응이 종결되지 않았으면 DIPEA를 1 eq씩 추가하여 반응의 종결을 관찰하였다
반응의 종결을 확인한 후 반응 용액을 농축하였으며, Preparative-HPLC를 통하여 Ⅰ-FcBP(6Lys)-norbornene의 정제를 시도하였다. 정제 후 동결 건조를 통하여 2.07 μmol을 확보하였으며, 순도 또한 HPLC를 이용하여 확인하였다 (Purity; >95% (HPLC), yield: 83%).
상기 결과를 도 10에 도시하였다.
실시예 4-2-2: 화합물 Ⅰ-FcBP(6Lys)-norbornene 의 구조 확인
LC mass 기반 분자량 측정을 통해 화합물 Ⅰ-FcBP(6Lys)-norbornene의 합성을 확인하였다.
측정 장비 : Waters quattro premier xe
Calculated molecular weight : 2351.69 g/mol
Measured molecular weight (M/2+H)2+ : 1176.42 g/mol
상기 결과를 도 11에 도시하였다.
실시예 4-3. 화합물 Ⅱ-FcBP(6Lys)-Norbornene 합성 및 구조 확인
[화학식 12]
실시예 4-3-1: 화합물 Ⅱ-FcBP(6Lys)-Norbornene의 합성
화합물 Ⅱ(Cis-norbornene weinreb amide)-FcBP의 합성은 DMF에서 수행하였고 FcBP(6Lys)-norbornene에 화합물 Ⅱ를 도입하기 위해 위해 DMF에 녹인 2.5 μmol의 FcBP(6Lys)-norbornene에 3 당량의 DIPEA와 3 μmol의 화합물 Ⅱ를 녹여 교반하였다.
도입 반응의 확인은 HPLC를 통한 분석을 시행하였으며 반응이 종결되지 않았으면 DIPEA를 1 eq씩 추가하여 반응의 종결을 관찰하였다
반응의 종결을 확인한 후 반응 용액을 농축하였으며, Preparative-HPLC를 통하여 Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene의 정제를 시도하였다. 정제 후 동결 건조를 통하여 2.02 μmol을 확보하였으며, 순도 또한 HPLC를 이용하여 확인하였다 (Purity; >95% (HPLC), yield: 81%).
상기 결과를 도 12에 도시하였다.
실시예 4-3-2: 화합물 Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene 의 구조 확인
측정 장비 : Waters quattro premier xe
Calculated molecular weight : 2351.69 g/mol
Measured molecular weight (M/2+H)2+ : 1176.42 g/mol
상기 결과를 도 13에 도시하였다.
[실시예 5] Antibody-Click Chemistry Chemical 합성 방법 및 구조 확인
실시예 5-1: Antibody-Norbornene
실시예 5-1-1: 트라스투주맙(trastuzumab)-Norbornene 합성 방법 (1)
화합물 Ⅰ-FcBP(6Lys)-norbornene를 이용한 도입 반응
Ab (246/248 Lys)-Norbornene의 합성은 pH 7.4 PBS(phosphate buffered saline) buffer 상에서 화합물 Ⅰ-FcBP(6Lys)-norbornene을 이용하여 진행하였다. 항체의 특정 2 곳의 위치에 norbornene 도입을 위해 항체 당 6 당량의 화합물Ⅰ-FcBP(6Lys)-norbornene을 반응액에 넣은 후 반응을 진행하였다. 반응 상온에서 1 주일 이상 소요되었으며, 반응 모니터링 및 종결은 HIC-HPLC를 통해 확인하였다. 정제는 투석(Dialysis, pH 5.5 20 mM Histidine acetate buffer) 3회 및 크기배제크로마토그래피 기법(분자량 Cut-off 40 kDa)을 이용하여 정제를 진행하였다.
화합물 Ⅰ-FcBP(6Lys)-norbornene과 항체의 반응을 도 14에 도시하고 최종 결과물인 Ab (246/248 Lys)-Norbornene의 구조를 도 15에 도시하였으며, HIC-HPLC를 통한 반응 모니터링은 도 16에 도시하였다.
실시예 5-1-2: 트라스투주맙(Trastuzumab)-Norbornene 합성 방법 (2)
화합물 Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene를 이용한 도입 반응
Ab (246/248 Lys)-Norbornene의 합성은 pH 7.4 PBS(phosphate buffered saline) buffer 상에서 화합물 Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene을 이용하여 진행하였다. 항체의 특정 2 곳의 위치에 norbornene 도입을 위해 항체 당 6 당량의 화합물Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene을 반응액에 넣은 후 반응을 진행하였다. 반응 온도 및 시간은 상온에서 12 시간 소요되었으며, 반응 모니터링 및 종결은 HIC-HPLC를 통해 확인하였다. 정제는 투석(Dialysis, pH 5.5 20 mM Histidine acetate buffer) 3회 및 크기배제크로마토그래피 기법(분자량 Cut-off 40 kDa)을 이용하여 정제를 진행하여 150 mg의 트라스투주맙(trastuzumab) 중 135 mg을 확보하였다. (yield = 90%)
화합물Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene과 항체의 반응을 도 17에 도시하였으며, 생성물인 Ab (246/248 Lys)-Norbornene의 구조를 도 18에 도시하였다. HIC-HPLC를 통한 반응 모니터링은 도 19에 도시하였다.
실시예 5-2-1: Herceptin-Norbornene 결합 확인
항체에 FcBP 노보넨 링커가 포함된 항체 중간체 (도 18)의 확인은 질량 분석법을 기반으로 검증되었다.
측정 장비: Ultraflex III (TOF/TOF)
Analysis mode: Linear mode
Polarity: Positive
Detection: m/z 2,000~300,000
Laser repetition rate: 100 Hz
Number of shot: 1,000 shot
Deflection: On, 5,000 Da
Voltage: Ion Source Ⅰ25.00 kV, Ion Source Ⅱ 23.00 kV, Lens 9.00 kV
Calculated molecular weight : 152,385 g/mol
Measured molecular weight : 152,407 g/mol (M+Na)
상기 분석결과를 도 20에 도시하였다.
[실시예 6] Antibody Drug Conjugate 합성 및 확인
실시예 6-1: Antibody-Drug Conjugation
실시예 6-1-1: 트라스투주맙(Trastuzumab)-DM1 합성 방법
화합물Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene에 의해 Norbornene 두 분자가 도입된 트라스투주맙(trastuzumab) (도 18)을 이용하여 항체-페이로드 콘쥬게이트 제작을 수행하였다. 4.5 mg/mL 농도로 25 mL의 양을 이용하여 반응을 수행하였으며, 항체에 접합되어 있는 norbornene과의 생물직교반응(biorthogonal chemistry)을 위해 테트라진-PEG8-DM1 (Tetrazine-PEG8-DM1) 약물의 접합을 시도하였다. 항체 대비 4 당량의 약물을 사용하였으며, 접합 반응은 상온에서 24 시간 동안 pH 5.5 20 mM Histidine aceatate 용액하에서 진행하였다. 접합 반응의 관찰은 HIC-HPLC를 통해 확인하였으며, 트라스투주맙에 FcBP 링커만 결합되어 나타나는 9.4분 대의 피크가 항체-FcBP 링커와 약물이 반응함에 따라 11.2분 대로 변화하는 것을 관찰함으로써 항체-페이로드 콘쥬게이트 생성을 관찰하였다.
생성물인 항체-페이로드 콘쥬게이트의 구조를 도 21에 도시하였으며, HIC-HPLC를 통한 반응 모니터링은 도 22에 도시하였다. 도 21에서, 확대된 구조는 페이로드의 구조이고, 확대되지 않은 부분은 도 18의 구조와 동일하다.
실시예 6-1-2: 트라스투주맙(Trastuzumab)-DM1 정제 방법
고순도의 항체-페이로드 콘쥬게이트를 수득하기 위해 pH 5.5 20 mM histidine acetate 용액을 이용한 투석 및 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography)를 이용한 HIC 정제를 수행하였다.
HIC 정제 조건은 다음과 같다.
FPLC Model : AKTA pure
Flow rate : 1 mL/min
Column : HiPrep butyl FF16/10 칼럼
Elution solvent : (A) 1.5 M Ammonium sulfate + 50 mM phosphate pH 7.0
(B) 50 mM Phosphate pH 7.0
Elution condition
0:00-10:00 A:40%, B:60%
10:00-20:00 A:65%, B:35%
20:00-102.5:00 A:75%, B:25%
102:5-115:00 A:100%, B:0%
115:00-135:00 A:100%, B:0%
정제된 항체-페이로드 콘쥬게이트의 HIC 크로마토그램은 도 19에 도시하였다.
상기 방법을 통해, 2 곳에 약물이 접합된 (Drug Antibody Ratio = 2) 트라스투주맙(trastuzumab)-DM1을 67 mg 수득하였다. (yield = 60%)
실시예 6-1-3: 트라스투주맙(Trastuzumab)-DM1 결합 확인
FcBP 링커와 약물이 포함된 항체-페이로드 콘쥬게이트의 확인은 질량 분석법을 기반으로 검증되었다.
측정 장비 : Ultraflex III (TOF/TOF)
Analysis mode: Linear mode
Polarity: Positive
Detection: m/z 2,000~300,000
Laser repetition rate: 100 Hz
Number of shot: 1,000 shot
Deflection: On, 5,000 Da
Voltage: Ion Source Ⅰ25.00 kV, Ion Source Ⅱ 23.00 kV, Lens 9.00 kV
Calculated molecular weight : 155,493 g/mol
Measured molecular weight : 155,523 g/mol (approx. M+Na)
상기 분석결과를 도 23에 도시하였다.
[실시예 7] 신규 항체 약물 복합체 (ADC, trastzumab-DM1 conjugate)에 의한 세포수준에서의 약효평가 (In vitro cytotoxicity test)
암세포의 마커 표적마커 수준에 따라서 항체-페이로드 콘쥬게이트 (ADC, Trastuzumab-DM1 conjugate)의 효력 평가를 수행하였으며, 표적 항원인 Her2의 양성 발현 세포주는 NCI-N87, BT474를 음성세포주는 MDA-MB-468를 이용하여 세포 독성 실험을 진행하였다. Her2 과발현세포인 NCI-N87과 BT474에서는 제작된 항체 약물 복합체를 농도별로 처리하여 관찰한 결과, IC50 값이 82.1 ng/mL과 29.6 ng/mL을 나타내는 우수한 항암 효과를 확인하였다. 상용화된 허셉틴 ADC인 캐싸일라 (Kadcyla)와 비교할 때 효과가 동등한 수준으로 확인되어 신규한 ADC로서의 효용을 확인할 수 있었다.
상기 실험에 대한 결과는 도 24 내지 27에 도시하였다.
[실시예 8] 신규 항체-페이로드 콘쥬게이트 (ADC, trastzumab-DM1 conjugate)에 의한 동물 수준에서의 약효평가 (In vivo cytotoxicity test)
표적 항원이 과발현 되어있는 NCI-N87 위암 세포주를 피하 이식하여 xenograft 모델을 제작하였으며, 4개의 그룹으로 분류하여 투여 물질에 대한 항암 효력 시험을 수행하였다. 본 실험에서 사용되는 BALB/c nude 마우스는 T 세포가 결핍되어 있어 암세포 이식이 용이하여 설치류를 이용한 항암 효력시험에 적절한 모델로 사용하였다.
(a) 세포주의 준비
인체종양 세포주 (NCI-N87 cell line) 1 vial을 heat inactivation 된 10 % FBS (fetal bovine serum, Gibco, 10082-742)가 들어있는 RPMI1640 medium (Gibco, 22400-089)을 세포배양용 플라스크에 넣고 37 ℃, 5 % CO2 incubator에서 배양한다. PBS를 이용하여 washing하고, 2.5 % Trypsin-EDTA (Gibco, 15090)를 10 배 희석한 다음, 이를 첨가하여 세포를 분리한 후, 원심분리 (1,000 rpm, 5 분)하여 상층액을 버린 뒤, 새로운 배지로 세포 부유액을 얻는다. 현미경을 이용하여 viability를 확인한 다음, 1.25 x 107 cells/mL의 농도로 배지와 matrigel을 1:1로 섞은 용액에 희석하여 세포주를 준비한다.
(b) 세포주의 이식
세포주는 '4. 3) (4) 세포주의 준비'에 기술된 방법에 따라 준비한다. 세포주 준비 시 재현탁 (resuspension)시켜 균질화하며, 준비된 세포주는 즉시 동물에 투여하도록 한다. 세포주 이식 시, 동물의 등쪽 부위를 70 % 알코올로 소독하고, 엄지와 검지로 경배부의 피부를 잡아당겨 피부와 근육 사이에 공간을 만든 후 동물의 전방으로부터 엄지와 검지사이의 피하공간에 26 gauge needle이 장착된 주사침을 찔러 넣고 2.5 X 106 cells/0.2 mL/head의 투여액량으로 피하 투여한다. 순화기간 중 건강한 동물을 선발하여 세포주 접종을 실시한 뒤, 세포주를 이식한 부위의 종양 크기가 약 100-150 mm3에 도달하였을 때, 순위화한 종양의 크기에 따라 각 군의 종양 크기가 최대한 균일하게 분포하도록 분배한다.
(c) 시험군 구성, 투여량 및 투여방법 결정
Cell line = NCI-N87
Mouse type = BALB/c nude (CAnN.Cg-Foxn1nu/CrljOri)
Number of group = 5
투여 방법 = 정맥주사 (Intravenous injection, 26gauge needle syringe) 이용
투여량 = 5 mg/kg
투여 횟수 = 1 회/ 2 일, 3회 투여
관찰 기간 = 5주
그룹 1: PBS, 그룹 2: 허셉틴 (Herceptin, Trastuzumab), 그룹 3: 신규 제작 ADC (허셉틴-DM1 Conjugate, 1.5st ADC)
(d) 관찰 및 검사 항목
일반증상
투여 및 관찰기간 동안 사망을 포함한 일반증상의 종류, 발현일 및 증상의 정도를 1 일 1 회 관찰하고, 개체별로 기록한다. 일반증상이 악화된 개체는 격리한다.
체중
군분리일 또는 시험물질 투여개시일, 그 이후에는 2 회/주 측정한다.
종양 크기 측정
시험물질 투여개시일부터 2 회/주, 5 주간 측정한다. 캘리퍼스 (calipers)를 이용하여 종양의 장축 및 단축을 측정하고 다음의 계산식을 이용하여 종양 크기를 산출한다.
종양 크기 = ab2/2 (a: 장축 길이, b: 단축 길이)
(e) 결과
인산완충용액 (PBS)와 허셉틴 (Herceptin, trastuzumab)를 주사한 그룹은 5 주간의 관찰 기간동안 종양의 성장을 억제하는 경향을 나타내지 않았다. 본 출원에 의하여 제작한 항체-페이로드 콘쥬게이트 (Herceptin-DM1)는 허셉틴에 비하여 종양 성장 억제 능력이 뛰어난 것으로 확인되어 ADC로서 성공적으로 기능하는 것을 확인하였다.
상기 관련 결과는 도 28 및 29에 도시하였다.
[실시예 9] 탄소 길이에 따른 위치 특이적 인터랙톰 합성 및 구조 확인
실시예 9-1. 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dap, L6Dab, L6Orn, L6Lys)-Norbornene 합성 및 구조 확인
실시예 9-1-1: FcBP(L6Dap, L6Dab, L6Orn, L6Lys)-Norbornene의 합성
FcBP(L6Dap) : 사용된 Fmoc 아미노산 목록 및 도입순서 (n =1)
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Dap(Boc)-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH.
FcBP(L6Dab) : 사용된 Fmoc 아미노산 목록 및 도입순서 (n =2)
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH.
FcBP(L6Orn) : 사용된 Fmoc 아미노산 목록 및 도입순서 (n =3)
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Orn(Boc)-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH.
FcBP(L6Lys) : 사용된 Fmoc 아미노산 목록 및 도입순서 (n =4)
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH.
제조 방법
(a) 아미노산 도입
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 mmole에 기초하였다. 0.5 g의 Clear amide resin (0.48 mmole/g, PeptideInternational, 미국)를 합성 반응기에 넣고, 각각의 Fmoc-아미노산 블록 1 mmole의 무게를 달아 펩타이드 아미노산 서열 순서대로 C-말단에서부터 N-말단까지 준비하였다.
Fmoc-아미노산을 활성화하여 Clear amide resin에 활성화된 잔기를 부착하는 반응을 C-말단 아미노산부터 순차적으로 진행하였다.
Fmoc의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF에서 수행하였고 잔기의 활성화 및 도입은 서열에 맞추어 준비한 아미노산을 2 mL 0.5 M HOBt 함유 DMF 용액, 2 mL 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액, 그리고 174 μL DIPEA와 5 분간 혼합한 다음 레진이 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 혼합하였다.
도입 반응의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반응으로 확인되면 도입 반응을 1회 더 반복하거나 20% Ac2O함유 DMF용액으로 캡핑을 실시하였다. 각 도입 반응과 Fmoc 제거 과정에서 다음 단계로 넘어가기 전에 DMF와 DCM으로 수지를 충분히 세척하였다. 이러한 과정은 목표한 펩타이드 서열이 완성될 때까지 반복하여 진행하였다.
(b) H-PEG8-OH의 도입
아미노산 도입이 모두 끝난 다음에 N-말단에 H-PEG8-OH를 도입하기 위하여 1 mL 0.5 M Fmoc-N-amido-dPEG8-acid in DMF 용액, 1 mL 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액, 1 mL 0.5 M HOBt 함유 DMF 용액, 그리고 87 μL DIPEA와 5 분간 혼합한 다음 반응 레진이 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 혼합하였다.
반응의 진행은 카이저 시험법으로 확인하였으며, 미반응 아민이 남아있는 것으로 판단되면 반응 시간을 1 ~ 3시간 더 연장하거나 반응액을 비우고 상기의 반응 과정을 다시 반복하였다. N-말단의 Fmoc 보호기의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF를 사용하여 수행한 다음, 펩타이드가 부착된 레진을 건조하고 중량을 측정하였다.
(c) 노르보레인(Norbornene)의 도입
N-말단의 Fmoc 보호기의 제거는 레진에 노르보레인 카르복실산 4당량, 2 mL 0.5 M HOBt 함유 DMF 용액, 2 mL 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액, 그리고 174 μL DIPEA와 5 분간 혼합한 다음 레진이 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 혼합하였다. 도입 반응의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반응으로 확인되면 도입 반응을 1회 더 반복하였다.
(d) 상기 (c) 과정에서 준비한 펩타이드가 부착된 수지 250 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT (94:1.0:2.5:2.5)의 혼합액 2 mL과 함께 실온에서 120 분간 교반하여 레진에서 펩타이드를 절단하였다. 절단 혼합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩타이드를 침전시켰다. 침전된 펩타이드를 에테르로 3 회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% ACN 함유 물에 녹인 다음 6 시간 동안 교반한 다음 농축하였다.
농축액을 5%-DMSO-20%-ACN 함유 0.01 M ammonium acetate buffer (pH 6.5) 용액에 0.1 mg/mL 농도로 녹인 다음 공기 노출된 상태로 3 일 동안 교반하였다. 이황화 결합 형성 반응의 진행은 HPLC로 관측하였으며, 더 이상 진행하지 않는 것으로 판단되면 반응액을 동결건조하여 펩타이드 침전물을 얻었다.
(e) 정제
상기 (d) 과정에서 동결건조하여 얻은 펩타이드 침전물을 하기 표 6에 기재된 prep-LC 조건에서 정제하고 동결 건조하였다. 얻어진 펩타이드는 각각 90% 이상의 순도임을 확인하였다.
(f) 서열
FcBP(L6Dap)-Norbornene : Norbornene-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Dap-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2 (Cys*: 이황화 결합 위치)
FcBP(L6Dab)-Norbornene : Norbornene-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Dab-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2 (Cys*: 이황화 결합 위치)
FcBP(L6Orn)-Norbornene : Norbornene-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Orn-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2 (Cys*: 이황화 결합 위치)
FcBP(L6Lys)-Norbornene : Norbornene-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Lys-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2 (Cys*: 이황화 결합 위치)
Prep-LC 정제조건
장비명 Waters 2525 pump, Waters 2487 UV detector
컬럼 Waters, XBridge Prep C18 5 μm OBD 19 x 250 mm
이동상 A/B 0.1% TFA in H2O / 0.1% TFA in Acetonitrile
구배 0 min → 30 min : B 20% → B 100%
유속 10 mL/min 검출파장 UV 280 nm
실시예 9-1-2: 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dap)-Norbornene의 합성화합물 Ⅱ(Cis-norbornene weinreb amide)-FcBP의 합성은 DMF에서 수행하였고 FcBP(L6Dap)-norbornene에 화합물 Ⅱ를 도입하기 위해 위해 DMF에 녹인 7.3 μmol의 FcBP(6Dap)-norbornene에 3 당량의 DIPEA와 8.4 μmol의 화합물 Ⅱ를 녹여 교반하였다.
반응의 종결을 확인한 후 반응 용액을 농축하였으며, Preparative-HPLC를 통하여 화합물 Ⅱ-FcBP(6Dap)-norbornene의 정제를 시도하였다. 정제 후 동결 건조를 통하여 14.1 mg을 확보하였으며, 순도 또한 HPLC를 이용하여 확인하였다 (Purity; >99% (HPLC), yield: 83%).
상기 결과를 도 30에 도시하였다.
실시예 9-1-3: 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dap)-Norbornene의 구조 확인
측정 장비 : Waters quattro premier xe
Calculated molecular weight : 2309.61 g/mol
Measured molecular weight (M/2+H)2+ : 1155.08 g/mol
상기 결과를 도 31에 도시하였다.
실시예 9-1-4: 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dab)-Norbornene의 합성
화합물 Ⅱ(Cis-norbornene weinreb amide)-FcBP의 합성은 DMF에서 수행하였고 FcBP(L6Dab)-norbornene에 화합물 Ⅱ를 도입하기 위해 위해 DMF에 녹인 7.3 μmol의 FcBP(6Dab)-norbornene에 3 당량의 DIPEA와 8.4 μmol의 화합물 Ⅱ를 녹여 교반하였다.
반응의 종결을 확인한 후 반응 용액을 농축하였으며, Preparative-HPLC를 통하여 화합물 Ⅱ-FcBP(6Dab)-norbornene의 정제를 시도하였다. 정제 후 동결 건조를 통하여 13.8 mg을 확보하였으며, 순도 또한 HPLC를 이용하여 확인하였다 (Purity; >99% (HPLC), yield: 82%).
상기 결과를 도 32에 도시하였다.
실시예 9-1-5: 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dab)-Norbornene의 구조 확인
측정 장비 : Waters quattro premier xe
Calculated molecular weight : 2323.64 g/mol
Measured molecular weight (M/2+H)2+ : 1162.02 g/mol
상기 결과를 도 33에 도시하였다.
실시예 9-1-6: 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Orn)-Norbornene의 합성
화합물 Ⅱ(Cis-norbornene weinreb amide)-FcBP의 합성은 DMF에서 수행하였고 FcBP(L6Orn)-norbornene에 화합물 Ⅱ를 도입하기 위해 위해 DMF에 녹인 7.2 μmol의 FcBP(L6Orn)-norbornene에 3 당량의 DIPEA와 8.3 μmol의 화합물 Ⅱ를 녹여 교반하였다.
반응의 종결을 확인한 후 반응 용액을 농축하였으며, Preparative-HPLC를 통하여 화합물 Ⅱ-FcBP(L 6Orn)-norbornene의 정제를 시도하였다. 정제 후 동결 건조를 통하여 14.8 mg을 확보하였으며, 순도 또한 HPLC를 이용하여 확인하였다 (Purity; >99% (HPLC), yield: 88%).
상기 결과를 도 34에 도시하였다.
실시예 9-1-7: 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Orn)-Norbornene의 구조 확인
측정 장비 : Waters quattro premier xe
Calculated molecular weight : 2337.66 g/mol
Measured molecular weight (M/2+H)2+ : 1169.03 g/mol
상기 결과를 도 35에 도시하였다.
실시예 9-1-8: 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Lys)-Norbornene의 합성
화합물 Ⅱ(Cis-norbornene weinreb amide)-FcBP의 합성은 DMF에서 수행하였고 FcBP(L6Lys)-norbornene에 화합물 Ⅱ를 도입하기 위해 위해 DMF에 녹인 7.2 μmol의 FcBP(L6Lys)-norbornene에 3 당량의 DIPEA와 8.3 μmol의 화합물 Ⅱ를 녹여 교반하였다.
반응의 종결을 확인한 후 반응 용액을 농축하였으며, Preparative-HPLC를 통하여 화합물 Ⅱ-FcBP(6Lys)-norbornene의 정제를 시도하였다. 정제 후 동결 건조를 통하여 15.4 mg을 확보하였으며, 순도 또한 HPLC를 이용하여 확인하였다 (Purity; >99% (HPLC), yield: 91%).
상기 결과를 도 36에 도시하였다.
실시예 9-1-9: 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Lys)-Norbornene의 구조 확인
측정 장비 : Waters quattro premier xe
Calculated molecular weight : 2351.69 g/mol
Measured molecular weight (M/2+H)2+ : 1176.04 g/mol
상기 결과를 도 37에 도시하였다.
[실시예 10] 탄소 길이에 따른 위치 특이적 인터랙톰의 항체 결합 효율 검증
실시예 10-1. 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dap, L6Dab, L6Orn, L6Lys)-Norbornene에 의한 Site-specific Antibody-Norbornene conjugate 제작
실시예 10-1-1: 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dap)-Norbornene 기반 트라스투주맙(Trastuzumab)-Norbornene 합성
Ab (246/248 Lys)-Norbornene의 합성은 pH 7.4 PBS (phosphate buffered saline) buffer 상에서 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dap)-norbornene을 이용하여 진행하였다. 항체(Trastuzumab 4mg/mL, 1mL)의 특정 2 곳의 위치에 norbornene 도입을 위해 항체 당 6 당량의 화합물Ⅱ-FcBP(L6Dap)-norbornene을 반응액에 넣은 후 반응을 진행하였다. 반응 온도 및 시간은 상온에서 12 시간 소요되었으며, 반응 모니터링 및 종결은 HIC-HPLC를 통해 확인하였다. 트라스투주맙은 HIC-HPLC 상에서 6.3 ~ 6.4 분에 피크를 나타내며, 트라스투주맙의 두 결합 위치 중 한 부분만 결합 했을 때는 8 분, 두 위치 모두 FcBP(L6Dap)-norbornene 분자가 결합했을 때는 9 분의 HIC-HPLC 크로마토그램을 확인할 수 있다. 화합물Ⅱ-FcBP(L6Dap)-norbornene 기반 항체와의 결합 반응 모니터링은 도 38에 도시하였다. 9.074분에서 피크가 관측되는 것을 통해 DAR=2인 항체-페이로드 콘쥬게이트가 합성되는 것을 확인하였다.
실시예 10-1-2: 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dab)-Norbornene 기반 트라스투주맙(Trastuzumab)-Norbornene 합성
Ab (246/248 Lys)-Norbornene의 합성은 pH 7.4 PBS (phosphate buffered saline) buffer 상에서 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Dab)-norbornene을 이용하여 진행하였다. 항체(Trastuzumab 4mg/mL, 1mL)의 특정 2 곳의 위치에 norbornene 도입을 위해 항체 당 6 당량의 화합물Ⅱ-FcBP(L6Dab)-norbornene을 반응액에 넣은 후 반응을 진행하였다. 반응 온도 및 시간은 상온에서 12 시간 소요되었으며, 반응 모니터링 및 종결은 HIC-HPLC를 통해 확인하였다. 트라스투주맙은 HIC-HPLC 상에서 6.3 ~ 6.4 분에 피크를 나타내며, 트라스투주맙의 두 결합 위치 중 한 부분만 결합 했을 때는 8 분, 두 위치 모두 FcBP(L6Dab)-norbornene 분자가 결합했을 때는 9 분의 HIC-HPLC 크로마토그램을 확인 할 수 있다. 화합물Ⅱ-FcBP(L6Dab)-norbornene 기반 항체와의 결합 반응 모니터링은 도 39에 도시하였다. 9.231분에서 피크가 관측되는 것을 통해 DAR=2인 항체-페이로드 콘쥬게이트가 합성되는 것을 확인하였다.
실시예 10-1-3: 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Orn)-Norbornene 기반 트라스투주맙(Trastuzumab)-Norbornene 합성
Ab (246/248 Lys)-Norbornene의 합성은 pH 7.4 PBS (phosphate buffered saline) buffer 상에서 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Orn)-norbornene을 이용하여 진행하였다. 항체(Trastuzumab 4mg/mL, 1mL)의 특정 2 곳의 위치에 norbornene 도입을 위해 항체 당 6 당량의 화합물Ⅱ-FcBP(L6Orn)-norbornene을 반응액에 넣은 후 반응을 진행하였다. 반응 온도 및 시간은 상온에서 12 시간 소요되었으며, 반응 모니터링 및 종결은 HIC-HPLC를 통해 확인하였다. 트라스투주맙은 HIC-HPLC 상에서 6.3 ~ 6.4 분에 피크를 나타내며, 트라스투주맙의 두 결합 위치 중 한 부분만 결합 했을 때는 8 분, 두 위치 모두 FcBP(L6Orn)-norbornene 분자가 결합했을 때는 9 분의 HIC-HPLC 크로마토그램을 확인 할 수 있다. 화합물Ⅱ-FcBP(L6Orn)-norbornene 기반 항체와의 결합 반응 모니터링은 도 40에 도시하였다. 8.975분에서 피크가 관측되는 것을 통해 DAR=2인 항체-페이로드 콘쥬게이트가 합성되는 것을 확인하였다.
실시예 10-1-4: 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Lys)-Norbornene 기반 트라스투주맙(Trastuzumab)-Norbornene 합성
Ab (246/248 Lys)-Norbornene의 합성은 pH 7.4 PBS (phosphate buffered saline) buffer 상에서 화합물 Ⅱ-FcBP(L6Lys)-norbornene을 이용하여 진행하였다. 항체(Trastuzumab 4mg/mL, 1mL)의 특정 2 곳의 위치에 norbornene 도입을 위해 항체 당 6 당량의 화합물Ⅱ-FcBP(L6Lys)-norbornene을 반응액에 넣은 후 반응을 진행하였다. 반응 온도 및 시간은 상온에서 12 시간 소요되었으며, 반응 모니터링 및 종결은 HIC-HPLC를 통해 확인하였다. 트라스투주맙은 HIC-HPLC 상에서 6.3 ~ 6.4 분에 피크를 나타내며, 트라스투주맙의 두 결합 위치 중 한 부분만 결합 했을 때는 8 분, 두 위치 모두 FcBP(L6Lys)-norbornene 분자가 결합했을 때는 9 분의 HIC-HPLC 크로마토그램을 확인 할 수 있다. 화합물Ⅱ-FcBP(L6Lys)-norbornene 기반 항체와의 결합 반응 모니터링은 도 41에 도시하였다. 9.120분에서 피크가 관측되는 것을 통해 DAR=2인 항체-페이로드 콘쥬게이트가 합성되는 것을 확인하였다.
<110> Abtis <120> compounds for producing antibody-payload conjugate, and its use <130> CP19-014 <150> KR 10-2019-0008943 <151> 2019-01-23 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding peptide <400> 1 Asp Cys Ala Trp His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding peptide (L6K) <400> 2 Asp Cys Ala Trp His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10

Claims (42)

  1. 하기 화학식 6의 구조를 갖는 화합물:
    [화학식 6]

    이때,
    Ab는 항체 유닛이고, 이때 상기 항체 유닛은 IgG 항체 또는 IgG 항체의 일부 단편으로부터 유래된 것이며,
    n은 1 이상 4 이하의 정수이고,
    R''' 은 비치환된 C1-6알킬렌, 비치환된 C2-6 알케닐렌, 비치환된 C2-6 알키닐렌, 또는 비치환된 C1-6 헤테로알킬렌이며, 상기 헤테로알킬렌은 N, O, 또는 S를 적어도 하나 이상 포함하고,
    Fp는 Fc 결합성 펩타이드 유닛 및 화학작용기를 포함하고,
    이때 상기 Fc 결합성 펩타이드 유닛은 DCAWHXGELVWCT (서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 결합성 펩타이드로부터 유래된 것이고,
    이때 X는 이며, m은 1이상 4 이하의 정수이고,
    상기 화학작용기는 아세틸렌(Acetylene), 트랜스사이클로옥텐(transcyclooctene), 사이클로옥타인(cyclooctyne), 다이아릴사이클로옥타인(dyarylcyclooctyne), 메틸 에스터 포스핀(methyl ester phosphine), 노르보르넨(norbornene), 테트라진(tetrazine), 메틸사이클로프로펜(methylcyclopropene), 아제틴(azetine), 사이아나이드(cyanide), 아자이드(azide), 및 다이벤조사이클로옥틴(dibenzocyclooctyne) 중 어느 하나이며,
    Y4는 NH이고, 이때 Y4는 상기 Fc 결합성 펩타이드의 6번 아미노산 잔기로부터 유래되고,
    이때 Ab와 연결된 질소 원자는 상기 IgG 항체 또는 IgG 항체의 일부 단편의 적어도 하나의 중쇄의 246번 라이신 및 248번 라이신 중 선택되는 어느 하나 이상으로부터 유래된 것임.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 결합성 펩타이드는 DCAWHKGELVWCT (서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    R'''은 비치환된 C1-5 알킬렌 또는 비치환된 C1-5 헤테로알킬렌인 것을 특징으로 하는, 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    R'''은 비치환된 C3 알킬렌인것을 특징으로 하는, 화합물.
  5. 제1항에 있어서,
    n은 2인 것을 특징으로 하는, 화합물.
  6. 제1항에 있어서,
    n은 2이고, 이때 Ab와 연결된 상기 질소 원자는 상기 IgG 항체 또는 IgG 항체의 일부 단편의 두개의 중쇄의 상기 248번 라이신으로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 화합물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 화학작용기는 상기 Fc 결합성 펩타이드 유닛에 연결된 것을 특징으로 하는, 화합물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 화학작용기는 PEG 유닛을 통해 상기 Fc 결합성 펩타이드 유닛에 연결된 것을 특징으로 하는, 화합물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 화학작용기는 PEG 유닛을 통해 상기 Fc 결합성 펩타이드 유닛의 상기 Fc 결합성 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단의 아미노산 잔기와 대응되는 아미노산 잔기에 연결된 것을 특징으로 하는, 화합물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 화학작용기는 PEG 유닛을 통해 상기 Fc 결합성 펩타이드 유닛의 상기 Fc 결합성 펩타이드의 N 말단의 아미노산 잔기와 대응되는 아미노산 잔기에 연결된 것을 특징으로 하는, 화합물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 PEG 유닛은 8개의 에틸렌글리콜 단위체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 화합물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 결합성 펩타이드의 C 말단은 아미드화 된 것을 특징으로 하는, 화합물.
  13. 하기 화학식 8의 구조를 갖는 화합물:
    [화학식 8]

    이때,
    Ab는 항체 유닛이고, 이때 상기 항체 유닛은 IgG 항체 또는 IgG 항체의 일부 단편으로부터 유래된 것이며,
    n은 1 이상 4 이하의 정수이고,
    R''' 은 비치환된 C1-6알킬렌, 비치환된 C2-6 알케닐렌, 비치환된 C2-6 알키닐렌, 또는 비치환된 C1-6 헤테로알킬렌이며, 상기 헤테로알킬렌은 N, O, 또는 S를 적어도 하나 이상 포함하고,
    Fp는 Fc 결합성 펩타이드 유닛을 포함하고, 이때 상기 Fc 결합성 펩타이드 유닛은 DCAWHXGELVWCT (서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 결합성 펩타이드로부터 유래된 것이고,
    이때 X는 이며, m은 1이상 4 이하의 정수이고,
    Y4는 NH이고, 이때 Y4는 상기 Fc 결합성 펩타이드의 6번 아미노산 잔기로부터 유래되고,
    Am은 활성제(active agent)를 포함하고,
    이때, 상기 활성제는 약물, 방사성 동위원소, 광학 작용제, 비타민 및 독소 중 선택된 어느 하나이며,
    B는 제1 화학작용기 및 제2 화학작용기의 반응에 의하여 형성되는 구조들 중 하나이며,
    이때 B는 상기 Fc 결합성 펩타이드 유닛과 연결되고,
    이때 상기 제1 화학작용기는 아세틸렌(Acetylene), 트랜스사이클로옥텐(transcyclooctene), 사이클로옥타인(cyclooctyne), 다이아릴사이클로옥타인(dyarylcyclooctyne), 메틸 에스터 포스핀(methyl ester phosphine), 노르보르넨(norbornene), 테트라진(tetrazine), 메틸사이클로프로펜(methylcyclopropene), 아제틴(azetine), 사이아나이드(cyanide), 아자이드(azide), 및 다이벤조사이클로옥틴(dibenzocyclooctyne) 중 어느 하나이고,
    이때 상기 제2 화학작용기는 상기 제1 화학작용기와 상기 반응을 하는 상기 제1 화학작용기에 상보적인 작용기이며, 이때 상기 제2 화학작용기는 아세틸렌(Acetylene), 트랜스사이클로옥텐(transcyclooctene), 사이클로옥타인(cyclooctyne), 다이아릴사이클로옥타인(dyarylcyclooctyne), 메틸 에스터 포스핀(methyl ester phosphine), 노르보르넨(norbornene), 테트라진(tetrazine), 메틸사이클로프로펜(methylcyclopropene), 아제틴(azetine), 사이아나이드(cyanide), 아자이드(azide), 및 다이벤조사이클로옥틴(dibenzocyclooctyne) 중 어느 하나이고,
    이때, Ab와 연결된 질소 원자는 상기 IgG 항체 또는 IgG 항체의 일부 단편의 적어도 하나의 중쇄의 246번 라이신 및 248번 라이신 중 선택되는 어느 하나 이상으로부터 유래된 것임.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 Fc 결합성 펩타이드는 DCAWHKGELVWCT (서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 화합물.
  15. 제13항에 있어서,
    R'''은 비치환된 C1-5 알킬렌 또는 비치환된 C1-5 헤테로알킬렌인 것을 특징으로 하는, 화합물.
  16. 제13항에 있어서,
    R'''은 비치환된 C3 알킬렌인것을 특징으로 하는, 화합물.
  17. 제13항에 있어서,
    이때 B는 또는 이고,
    이때 A1은 Fp와 연결되어 있고 A2는 Am과 연결되어 있거나, 또는 A1은 Am과 연결되어 있고 A2는 Fp와 연결된 것을 특징으로 하는, 화합물.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 제1 화학작용기는 노르보르넨(norbornene), 테트라진(tetrazine), 다이벤조사이클로옥틴(dibenzocyclooctyne) 또는 아자이드(azide)인, 화합물.
  19. 제13항에 있어서,
    이때 n은 2인 것을 특징으로 하는, 화합물.
  20. 제13항에 있어서,
    n은 2이고, 이때 Ab와 연결된 상기 질소 원자는 상기 IgG 항체 또는 IgG 항체의 일부 단편의 두개의 중쇄의 상기 248번 라이신으로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 화합물.
  21. 제13항에 있어서,
    이때 B는 상기 Fc 결합성 펩타이드 유닛의 상기 Fc 결합성 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단의 아미노산 잔기와 대응되는 아미노산 잔기에 연결된 것을 특징으로 하는, 화합물.
  22. 제13항에 있어서,
    B는 PEG 유닛을 통해 상기 Fc 결합성 펩타이드 유닛과 연결되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
  23. 제13항에 있어서,
    B는 PEG 유닛을 통해 상기 Fc 결합성 펩타이드 유닛의 상기 Fc 결합성 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단의 아미노산 잔기와 대응되는 아미노산 잔기에 연결된 것을 특징으로 하는, 화합물.
  24. 제13항에 있어서,
    B는 PEG 유닛을 통해 상기 Fc 결합성 펩타이드 유닛의 상기 Fc 결합성 펩타이드의 N 말단 아미노산 잔기와 대응되는 아미노산 잔기에 연결된 것을 특징으로 하는, 화합물.
  25. 제22항에 있어서,
    이때 상기 PEG 유닛은 8개의 에틸렌글리콜 단위체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 화합물.
  26. 제13항에 있어서,
    상기 Fc 결합성 펩타이드의 C 말단은 아미드화 된 것을 특징으로 하는, 화합물.
  27. 제13항에 있어서,
    Am은 2 이상의 활성제(active agent)를 포함하며,
    이때, 각각의 상기 활성제는 독립적으로 약물, 방사성 동위원소, 광학 작용제, 비타민 및 독소 중 선택되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
  28. 제13항에 있어서,
    상기 약물은 항암제, 항염증제, 항생제, 항진균제, 및 항바이러스제 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 화합물.

  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
KR1020220016118A 2019-01-23 2022-02-08 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도 KR102604763B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020230159445A KR20230168994A (ko) 2019-01-23 2023-11-16 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20190008943 2019-01-23
KR1020190008943 2019-01-23
KR1020200009162A KR102362284B1 (ko) 2019-01-23 2020-01-23 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200009162A Division KR102362284B1 (ko) 2019-01-23 2020-01-23 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020230159445A Division KR20230168994A (ko) 2019-01-23 2023-11-16 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220024297A KR20220024297A (ko) 2022-03-03
KR102604763B1 true KR102604763B1 (ko) 2023-11-22

Family

ID=71736456

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200009162A KR102362284B1 (ko) 2019-01-23 2020-01-23 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도
KR1020220016118A KR102604763B1 (ko) 2019-01-23 2022-02-08 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도
KR1020230159445A KR20230168994A (ko) 2019-01-23 2023-11-16 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200009162A KR102362284B1 (ko) 2019-01-23 2020-01-23 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020230159445A KR20230168994A (ko) 2019-01-23 2023-11-16 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220072147A1 (ko)
EP (1) EP3915973A4 (ko)
JP (2) JP7252582B2 (ko)
KR (3) KR102362284B1 (ko)
CN (1) CN113631539A (ko)
AU (1) AU2020210506A1 (ko)
CA (1) CA3127586A1 (ko)
WO (1) WO2020153774A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022078566A1 (en) * 2020-10-12 2022-04-21 Debiopharm Research & Manufacturing S.A. Reactive conjugates
KR20230132640A (ko) 2022-03-04 2023-09-15 앱티스 주식회사 티올 반응성 에디티브를 이용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 수율을 높이는 방법
CN116836235A (zh) * 2022-03-25 2023-10-03 中国科学院上海药物研究所 亲和片段导向的可裂解片段，其设计、合成及在制备定点药物偶联物中的应用
KR20240125071A (ko) * 2022-11-01 2024-08-19 앱티스 주식회사 Fc 결합성 유닛을 포함하는 화합물 및 이를 이용하여 제조된 컨쥬게이트
CN118615456A (zh) * 2023-03-10 2024-09-10 中国科学院上海药物研究所 一种双位点定点抗体功能分子偶联物，其制备方法及用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018199337A1 (ja) 2017-04-28 2018-11-01 味の素株式会社 可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ608748A (en) * 2010-09-02 2015-05-29 Scripps Research Inst Nanoparticle-based tumor-targeted drug delivery
JP6192233B2 (ja) * 2011-11-17 2017-09-06 ファイザー・インク 細胞毒性ペプチドおよびその抗体薬物コンジュゲート
RU2014128467A (ru) * 2011-12-14 2016-02-10 Сиэтл Дженетикс, Инк. Новые коньюгаты связывающее соединение-активное соединение (adc) и их применение
US20140363454A1 (en) * 2013-06-06 2014-12-11 Igenica Biotherapeutics, Inc. Antibody-Drug Conjugates, Compositions and Methods of Use
CA2931798C (en) * 2013-12-16 2023-06-27 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
JP6504508B2 (ja) 2014-02-14 2019-04-24 日産化学株式会社 活性エステル基を含む繊維製造用組成物及びその繊維を用いた細胞培養足場材料
US20170021033A1 (en) * 2014-03-12 2017-01-26 Novartis Ag Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
KR102651537B1 (ko) * 2015-05-20 2024-03-25 가고시마 유니버시티 IgG 결합 펩타이드에 의한 항체의 특이적 변형
US11634448B2 (en) * 2016-06-15 2023-04-25 The General Hospital Corporation Metabolic labeling and molecular enhancement of biological materials using bioorthogonal reactions
CA3036768A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Fujifilm Corporation Cyclic peptide, affinity chromatography support, labeled antibody, antibody drug conjugate, and pharmaceutical preparation
EP3554550A1 (en) * 2016-12-13 2019-10-23 Bolt Biotherapeutics, Inc. Antibody adjuvant conjugates
AU2018270784B2 (en) * 2017-05-18 2024-05-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cyclodextrin protein drug conjugates
CA3132959A1 (en) * 2019-03-08 2020-09-17 AbTis Co., Ltd. Site-specific antibody conjugation and antibody-drug conjugate as specific embodiment thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018199337A1 (ja) 2017-04-28 2018-11-01 味の素株式会社 可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022523684A (ja) 2022-04-26
JP2023063446A (ja) 2023-05-09
US20220072147A1 (en) 2022-03-10
KR102362284B1 (ko) 2022-02-11
AU2020210506A1 (en) 2021-09-16
AU2020210506A2 (en) 2021-10-07
EP3915973A1 (en) 2021-12-01
WO2020153774A1 (ko) 2020-07-30
CN113631539A (zh) 2021-11-09
EP3915973A4 (en) 2023-02-01
KR20200091826A (ko) 2020-07-31
CA3127586A1 (en) 2020-07-30
KR20220024297A (ko) 2022-03-03
JP7252582B2 (ja) 2023-04-05
KR20230168994A (ko) 2023-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102604763B1 (ko) 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도
KR20210006362A (ko) 캄토테신 펩타이드 접합체들
JP7553504B2 (ja) 操作された抗体化合物およびこれらの抱合体
JP7241811B2 (ja) 四級化チューブリシン化合物の複合体
JP2024096335A (ja) 親水性抗体－薬物コンジュゲート
US6291671B1 (en) Process for producing drug complexes
KR102498607B1 (ko) 방사성표지 ｈｅｒ２ 결합 펩티드
US20030171262A1 (en) Drug complex
JP2018512376A (ja) 抗体薬物コンジュゲート
KR102563319B1 (ko) 위치특이적 항체 콘쥬게이션 및 이의 구체예로서의 항체-약물 콘쥬게이트
CN110790829B (zh) pHLIP胞外段作为抗原制备的抗体在制备抗肿瘤药物中的应用
TWI838358B (zh) 疏水性奧瑞他汀(auristatin)f化合物及其結合物
JP2022548306A (ja) 内部移行した生物学的に活性な化合物の結合体からの選択的な薬物放出
CN115990269A (zh) 依沙替康衍生物及其连接子-负载物和缀合物
CN109069581B (zh) 锁环螺旋肽及合成方法
JP7356677B2 (ja) 複合体
WO2023027125A1 (ja) ヒトトランスフェリンレセプター結合抗体－ペプチドコンジュゲート
WO2024212817A1 (zh) 一种氯毒素类似物的多肽偶联物及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right