KR20230132640A - 티올 반응성 에디티브를 이용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 수율을 높이는 방법 - Google Patents

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오영수
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이선민
이태진
이영근
서진우
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손진영
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Abstract

본 출원은 티올 반응성 에디티브를 이용하는, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

티올 반응성 에디티브를 이용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 수율을 높이는 방법
본 출원은 기능성 그룹을 포함하는 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 출원은 티올 반응성 에디티브를 이용하는, 기능성 그룹을 포함하는 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 수율을 높이는 방법에 관한 것이다.
항체 (antibody)는 특정 분자를 인식하는 기능을 갖는 생체 분자로서 다양한 산업적 용도로 사용되고 있다. 일 예로 항체를 이용하여 특정 물질을 검출 혹은 검색(스크리닝)할 수 있고, 특정 물질이 체내 또는 세포 내에서 이동하는 경로를 확인할 수 있으며, 특정 물질에 대한 면역반응을 유도하여 치료 용도로도 사용될 수 있다.
이러한 항체의 기능을 확장하기 위하여 항체를 개선하기 위한 시도가 있어왔다. 대표적으로, 항체의 기능을 보완하거나 확장하기 위하여 외부 물질들을 표지하기 위한 시도가 이루어졌다. 대표적으로, 형광물질을 항체에 표지하여 형광 어세이에 활용하거나, 특정 병증을 치료하기 위한 제제를 항체에 표지하여 항체의 치료 효능을 극대화할 수 있다. 이러한 시도들 및 기술을 본 출원에서 항체 표지 (antibody labeling)로 통칭한다. 본 출원은 신규한 항체 표지 방법에 관한 것이다.
초기의 항체 표지는 항체에 무작위적으로 외부 물질을 부착하는 방식으로 이루어졌으나, 이러한 방법에는 많은 문제가 있다. 이렇게 제조된 항체는 균질성이 떨어지는 문제가 있다. 이러한 항체들은 각각 부착된 물질의 개수가 다르고 그 결합 위치가 다르기 때문에 효과가 불균질해지는 문제가 있다. 이러한 문제는 높은 안전성 및 재현가능성을 요구하는 항체-약물 콘쥬게이트 (antibody-drug conjugate; ADC) 기술의 발전에 큰 장애가 된다.
또한 항체의 인식 효과가 현저히 저하되는 문제가 있다. 항체는 항원을 인식하는 항원 결합 도메인 (antigen-binding domain)을 포함하는 Fab 도메인과 항체의 결정화에 관여하는 Fc 도메인으로 구성된다. 무작위적인 표지는 외부 물질을 항체의 항원 결합 도메인 또는 이에 인접한 위치에 결합시킴으로써 항체의 인식 효과를 크게 저하시켰다.
이로 인해 해당 기술분야에는 위치특이적으로 균일하게 항체를 표지하는 기술에 대한 수요가 있었다. 일부 기술이 개발되긴 하였으나, 대부분 항체를 유전적으로 조작하거나 변형시키는 등 기술적, 경제적 효과가 부족한 면이 있었다.
이후, 항체의 유전적 변형 없이 위치특이적으로 약물과 같은 기능성 물질을 접합시키는 기술이 개발되었다. 즉, 항체에 대한 추가적인 조작 없이, 화학적 반응을 통해서 항체에 위치특이적으로 약물을 부착시키는 기술이 개발되었다.
특히, 문헌 [PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944]은 티오에스터 그룹 및 Fc 결합성 펩타이드를 포함하는 화합물을 통해, 항체에 위치 특이적으로 약물 또는 생체직교적 작용기와 같은 기능성 그룹을 전달하는 방법을 개시한다.
전술한 바와 같이, 티오에스터 그룹 및 Fc 결합성 펩타이드를 포함하는 화합물을 통해, 항체에 위치 특이적으로 약물 또는 생체직교적 작용기와 같은 기능성 그룹을 전달하는 방법이 개발되었으나, 티오에스터 그룹 및 Fc 결합성 펩타이드를 포함하는 화합물을 사용하는 경우, 목적하는 생성물인 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수득률이 낮은 문제가 본 출원을 통해 확인되었다.
이에, 본 출원은 티오에스터 그룹 및 Fc 결합성 펩타이드를 포함하는 화합물을 이용한 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조에 있어서, 티올 반응성 에디티브를 사용하여 목적하는 생성물인 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율을 높이는 방법을 제공한다.
본 출원의 일부 실시양태는 기능성 그룹을 포함하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 출원의 일부 실시양태는, 티올 반응성 에디티브를 이용한, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 방법을 제공한다.
본 출원의 일부 실시양태는, 다음을 포함하는, 티올 반응성 에디티브를 이용하여, 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 통해 제조되는 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율을 높이는 방법을 제공한다:
(a) 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 반응 조성물 내에서 접촉함,
이때 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 티오에스터 그룹(thioester group), 기능성 그룹(Functional group; FG), 및 Fc 결합성 펩타이드 (Fc-binding peptide; FcBP)를 포함하고,
이때 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 상기 티오에스터 그룹과 상기 항체의 친핵체가 반응하며,
상기 티오에스터 그룹과 상기 항체의 친핵체의 반응의 결과로,
기능성 그룹을 포함하는 항체, 그리고 티올 그룹 및 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물로부터 유래된 Fc 결합성 펩타이드를 포함하는 부산물이 생성되고, 이때 상기 부산물의 상기 티올 그룹은 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 티오에스터 그룹과 상기 항체의 상기 친핵체의 반응에 의해 생성되며,
이때, 상기 부산물은 상기 반응 조성물 내 아직 반응하지 않은 항체와 아직 반응하지 않은 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 방해하는 반응 저해 효과를 가짐; 및
(b) 상기 부산물의 상기 반응 저해 효과를 제거하기 위해, 상기 부산물과 상기 티올 반응성 에디티브를 반응 조성물 내에서 접촉함,
이때 상기 티올 반응성 에디티브는 티올 그룹과 반응성을 갖고,
이때 상기 티올 반응성 에디티브와 상기 부산물의 상기 티올 그룹이 반응하고,
상기 티올 반응성 에디티브와 상기 티올 그룹의 반응의 결과로, 상기 부산물의 티올기가 캡핑됨.
특정한 실시양태에서, 상기 부산물의 티올기가 캡핑됨으로써, 상기 부산물의 상기 반응 저해 효과가 제거될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 항체와 반응성이 적거나 없는 화합물일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 저분자 화합물일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브의 분자량은 50 g/mol 이상 1000 g/mol 이하일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 티올-다이설파이드 교환 반응(thiol-disulfide exchange reaction)을 하는 화합물일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 다이설파이드 그룹을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 다이페닐 다이설파이드 또는 이의 유도체일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 다이페닐 다이설파이드, 다이피리딜다이설파이드 (Dipyridyldisulfide), 5,5′-다이티오비스-(2-니트로벤조익산) (5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid); DTNB), 2,2'-다이티오다이벤조익산 (2,2′-Dithiodibenzoic acid), 4-아미노페닐 다이설파이드(4-Aminophenyl disulfide), 2-아미노페닐 다이설파이드(2-Aminophenyl disulfide), Bis(4-클로로페닐) 다이설파이드 (Bis(4-chlorophenyl disulfide), Bis(2-니트로페닐) 다이설파이드 (Bis(2-nitrophenyl disulfide), p-톨릴 다이설파이드 (p-tolyl disulfide), Bis(4-니트로페닐) 다이설파이드 (Bis(4-nitrophenyl) disulfide), Bis(2-니트로페닐) 다이설파이드 (Bis(2-nitrophenyl) disulfide), Bis(4-메톡시페닐) 다이설파이드 (Bis(4-methoxyphenyl) disulfide), 또는 Bis(2-메톡시페닐) 다이설파이드 (Bis(2-methoxyphenyl) disulfide), 또는 이의 유도체일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 5,5′-다이티오비스-(2-니트로벤조익산) (5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid); DTNB) 또는 2,2'-다이피리딜다이설파이드 (2,2'-Dipyridyldisulfide)일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 화학식 06의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 유도체일 수 있다:
[화학식 06]
Figure pct00001
,
이때,
A는 5-원 또는 6-원 아로마틱 고리이고, 이때 A는, 선택적으로, 하나 이상의 헤테로원자를 고리 상에 포함하고, 이때 헤테로원자는 각각 독립적으로 N, O, 및 S 중에서 선택되며,
p는 0 내지 4의 정수이고,
Ra는, 각각 독립적으로, -R, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택되고,
B는 5-원 또는 6-원 아로마틱 고리이고, 이때 B는, 선택적으로, 하나 이상의 헤테로원자를 고리 상에 포함하고, 이때 헤테로원자는 각각 독립적으로 N, O, 및 S 중에서 선택되며,
q는 0 내지 4의 정수이고,
Rb는, 각각 독립적으로, -R, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택되고,
R은, 각각 독립적으로, H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, 및 -NH2 중에서 선택됨.
이때, 특정한 실시양태에서, Ra 중 적어도 어느 하나는 전자 끄는 그룹(Electron Withdrawing Group) 또는 친수성 그룹(hydrophilic group)일 수 있다.
이때, 특정한 실시양태에서, Rb 중 적어도 어느 하나는 전자 끄는 그룹(Electron Withdrawing Group) 또는 친수성 그룹(hydrophilic group)일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 말레이미드 또는 이의 유도체일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 말레이미드, N-메틸말레이미드 (N-Methylmaleimide), N-에틸말레이미드 (N-Ethylmaleimide), N-페닐말레이미드 (N-Phenylmaleimide), N-벤질말레이미드 (N-Benzylmaleimide), 3-말레이미도프로피오닉산 (3-Maleimidopropionic acid), N-tert-부틸말레이미드 (N-tert-butylmaleimide), 또는 N-시클로헥실말레이미드 (N-Cyclohexylmaleimide), 또는 이의 유도체일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 tert-부틸 말레이미드일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 화학식 09의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 유도체일 수 있다:
[화학식 09]
Figure pct00002
,
이때, Rc는 -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -CH2CR3, -NR2, -OR, -SR, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택되고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, 및 -SH 중에서 선택됨.
특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브는 화학식 10 내지 화학식 31 중 어느 하나의 구조를 갖는 화합물일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 화학식 01의 구조를 가질 수 있다:
[화학식 01]
FU-RU-PU,
이때,
FU는 기능성 그룹(functional group; FG)을 포함하는 기능성 유닛 (Functional Unit)이고,
RU는 티오에스터 그룹을 포함하는 반응성 유닛 (Reactive Unit) 이고,
PU는 Fc 결합성 펩타이드 (Fc-binding peptide; FcBP)를 포함하는 펩티드 유닛(Peptide Unit; PU)임.
특정한 실시양태에서, 상기 Fc 결합성 펩타이드는 8 내지 20 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 Fc 결합성 펩타이드는 서열번호 02 내지 서열번호 80 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 이와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 기능성 그룹은 하나 이상의 생체직교적 작용기를 포함할 수 있다.
이때, 특정한 실시양태에서, 상기 생체직교적 작용기는, 각각 독립적으로, 스타우딩어 라이게이션(Staudinger Ligation), 구리-촉매화 아자이드-알킨 사이클로에디션 (Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition; CuAAC), 구리가 없는 아자이드-알킨 사이클로에디션 (Copper-Free Azide-Alkyne Cycloaddition), 테트라진 라이게이션 (Tetrazine Ligation), 테트라졸 라이게이션 (Tetrazole Ligation), 옥심 라이게이션 (Oxime Ligation), 및 이소시아나이드 클릭 반응 (Isocyanide Click Reaction) 중 선택되는 어느 하나의 생체직교적 반응에 참여하는 그룹일 수 있다.
이때, 특정한 실시양태에서, 상기 생체직교적 작용기는, 각각 독립적으로, 아자이드, 말단 알킨, 사이클로 알킨, 테트라진, 노르보르넨, 사이클로 알켄, 테트라졸, 옥심, 및 이소시아나이드 그룹 중에 선택되는 어느 하나일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 기능성 그룹은 하나 이상의 활성 모이어티를 포함할 수 있다.
이때, 특정한 실시양태에서, 상기 활성 모이어티는, 각각 독립적으로, 약물, 이미징 모이어티, 방사성 동위원소에 대한 리간드, 친화성 물질, 안정화 물질, 비타민, 및 친수성 모이어티 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 부산물의 상기 반응 저해 효과는 상기 부산물에 포함된 Fc 결합성 펩타이드가 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 상기 항체의 반응이 일어나는 상기 항체에 위치한 반응 자리로 상기 부산물을 가이드함과 함께, 상기 부산물에 포함된 티올기가 상기 반응 자리에서 상기 항체와 상호작용하기 때문에 생성되는 것일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 방법의 상기 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율은, 티올 반응성 에디티브를 사용하지 않는 경우와 비교할 때, 1.5배 이상일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율은 2개의 기능성 그룹을 포함하는 항체를 기준으로 측정된 것일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 방법의 (a) 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 접촉, 및 (b) 부산물 및 티올 반응성 에디티브의 접촉은 티올 반응성 에디티브, 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 혼합함으로써 수행되는 것일 수 있다.
이때, 특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브, 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 혼합함에 있어서, 상기 티올 반응성 에디티브와 항체가 먼저 혼합되고, 이후에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 혼합될 수 있다.
이때, 특정한 실시양태에서, 상기 티올 반응성 에디티브, 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 혼합함에 있어서, 상기 티올 반응성 에디티브와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 먼저 혼합되고, 이후에 항체가 혼합될 수 있다.
본 출원의 일부 실시양태는, 티올 반응성 에디티브, 항체, 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 포함하는 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이기 위해 사용되는 키트를 제공한다.
본 출원의 일부 실시양태는, 티올 반응성 에디티브, 항체, 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 포함하는 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이기 위해 사용되는 조성물을 제공한다.
본 출원의 일부 실시양태에 따른 방법에 의하면, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높일 수 있다.
도 01은 IgG 또는 트라스트주맙에서 K246 및 K248 위치가 포함된 Fc 영역의 서열 GPSVFLFPPKPKDTLMI (서열번호 01) 및 EU 넘버링 체계에 의한 아미노산 서열의 번호를 나타낸 것이다.
도 02는 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응의 예시를 도시한 것이다.
도 03은 부산물의 반응 저해 매커니즘을 설명하기 위한 예시에 관한 것이다.
도 04는 부산물의 반응 저해 매커니즘을 설명하기 위한 예시에 관한 것이다.
도 05는 FAR 1 기능성 그룹을 포함하는 항체의 예시 및 FAR 2 기능성 그룹을 포함하는 항체의 예시를 도시한 것이다.
도 06은 FAR 3 기능성 그룹을 포함하는 항체의 예시 및 FAR 4 기능성 그룹을 포함하는 항체의 예시를 도시한 것이다.
도 07은 합성된 FcBP (L6Dap FcBP, L6Dab FcBP, L6Orn FcBP, 및 L6Lys FcBP)의 구조를 도시한 것이다.
도 08은 화합물 7(FcBP-N3)의 구조를 도시한 것이다.
도 09는 화합물 7(FcBP-N3)의 질량 분석 데이터를 나타낸다.
도 10은 화합물 17(FcBP-C6PEG4)의 구조를 도시한 것이다.
도 11은 화합물 17(FcBP-C6PEG4)의 질량 분석 데이터를 나타낸다.
도 12는 화합물 27(FcBP-C6PEG3)의 구조를 도시한 것이다.
도 13은 화합물 27(FcBP-C6PEG3)의 질량 분석 데이터를 나타낸다.
도 14는 화합물 7(FcBP-N3)을 이용하여 제조된, 아자이드를 포함하는 기능성 그룹을 포함하는 항체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 15는 화합물 7(FcBP-N3)을 이용하는 기능성 그룹을 포함하는 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 과정에서, 티올 반응성 에디티브의 유무에 따른 기능성 그룹을 포함하는 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 수율에 대한 분석 결과이다.
도 16은 화합물 17(FcBP-C6PEG4)를 이용하여 제조된, 아자이드를 포함하는 기능성 그룹을 포함하는 항체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 17은 화합물 17(FcBP-C6PEG4)을 이용한 기능성 그룹을 포함하는 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 과정에서, 티올 반응성 에디티브의 유무에 따른 기능성 그룹을 포함하는 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 수율에 대한 분석 결과이다.
도 18은 화합물 27(FcBP-C6PEG3)를 이용하여 제조된, 아자이드를 포함하는 기능성 그룹을 포함하는 항체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 19는 화합물 27(FcBP-C6PEG3)을 이용한 기능성 그룹을 포함하는 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 과정에서, 티올 반응성 에디티브의 유무에 따른 기능성 그룹을 포함하는 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 수율에 대한 분석 결과이다.
도 20은 FcBP(L6Dap)-norbornene의 구조를 나타낸 것이다.
도 21은 FcBP(L6Dap)-norbornene의 HPLC 크로마토그램 데이터를 나타낸 것이다.
도 22은 FcBP(L6Dab)-norbornene의 구조를 나타낸 것이다.
도 23은 FcBP(L6Dab)-norbornene의 HPLC 크로마토그램 데이터를 나타낸 것이다.
도 24은 FcBP(L6Orn)-norbornene의 구조를 나타낸 것이다.
도 25은 FcBP(L6Orn)-norbornene의 HPLC 크로마토그램 데이터를 나타낸 것이다.
도 26은 FcBP(L6Lys)-norbornene의 구조를 나타낸 것이다.
도 27은 FcBP(L6Lys)-norbornene의 HPLC 크로마토그램 데이터를 나타낸 것이다.
도 28은 FcBP-norbornene을 이용한 기능성 그룹을 포함하는 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 과정에서, 티올 반응성 에디티브의 유무에 따른 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율에 대한 분석 결과이다.
도 29은 FcBP-norbornene을 이용한 기능성 그룹을 포함하는 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 과정에서, 티올 반응성 에디티브의 유무에 따른 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율에 대한 분석 결과를 그래프를 통해 나타낸 것이다.
도 30은 트라스트주맙의 LC-MS 분석 결과를 나타낸다.
도 31은 T/2-N (trastuzumab/2-norbornene conjugate)의 LC-MS 분석 결과를 나타낸다.
도 32는 각 인큐베이션 시간에서 분석된, HIC-HPLC 모니터링 결과를 나타낸다.
도 33 내지 도 39는 FcBP-N3 (화합물 7)을 이용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 과정에서, 티올 반응성 에디티브(티올 반응성 에디티브 1 내지 12)의 사용에 따른 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 수율에 대한 분석 결과이다. 도 33은 대조군(티올 반응성 에디티브를 사용하지 않은 경우)에 대한 HIC-HPLC 분석 결과이다.
도 40 내지 도 46은 FcBP-C6PEG4 (화합물 17)을 이용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 과정에서, 티올 반응성 에디티브 (티올 반응성 에디티브 1 내지 12)의 사용에 따른 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 수율에 대한 분석 결과이다.
도 47 내지 도 54는 말레이미드 계열 화합물의 항체와의 반응성을 분석한 결과이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
용어의 정의
다르게 정의되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 출원의 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
"할로겐" 또는 "할로"는 주기율표에서 할로겐 족 원소에 포함된 플루오르, 염소, 브롬 및 요오드를 포함하는 군을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "헤테로"는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 화합물 또는 그룹을 지칭한다. 즉, 용어 헤테로는 분자 자체를 지칭하기 위해 사용되는 용어 또는 분자의 일부를 지칭하기 위해 사용되는 용어와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 헤테로알킬렌은 하나 이상의 헤테로원자를 주사슬에 포함하는 알킬렌 그룹을 지칭한다. 다른 예로, 헤테로아릴은 하나 이상의 헤테로원자를 고리 상에 포함하는 (예를 들어, C6 아릴에서 고리 상의 하나 이상의 탄소가 각각 독립적으로 선택되는 헤테로원자로 치환된 그룹) 아릴 그룹을 지칭한다. 용어 "헤테로원자"는 탄소나 수소가 아닌 원자로서, 예를 들어 B, Si, N, P, O, S, F, Cl, Br, I 및 Se 등을 포함한다. 바람직하게는, N, O, 및 S와 같은 다가 원소를 포함한다. 예를 들어, 어떤 구조가 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 경우, 헤테로원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에서 선택될 수 있다.
그 자체인 분자를 지칭하기 위해 사용되거나 또는 분자의 일부를 지칭하기 위해 사용되는 용어 "알킬" 또는 "알칸"은 사슬 모양 또는 가지 모양의 탄화수소로서 완전히 포화된 그룹을 의미하는 것으로 사용된다. 사슬 모양 및 가지 모양 알킬기는 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, iso-부틸, 펜틸(pentyl), 헥실(hexyl), 헵틸(heptyl), 옥틸(octyl), 노닐(nonyl), 및 데실(decyl) 등일 수 있다. 알킬기는 고리형 구조를 포함할 수 있다. "Cx-y"라는 용어는, 예를 들어, 용어 알킬과 함께 사용되는 경우 사슬 또는 고리에 x 내지 y 개의 탄소를 포함하는 잔기를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, "Cx-y알킬"이라는 용어는 치환된 또는 비치환된, 사슬 모양 알킬기, 가지 모양 알킬 기, 또는 고리형 구조를 포함하는 알킬기로써 x 내지 y 개의 탄소를 포함하는 것을 포함하고, 나아가 디플루오로메틸 및 2,2,2-트리플루오로에틸, 등과 같은 할로알킬 기를 포함하는 것을 의미할 수 있다. C0 알킬은 수소를 의미한다. C1-4 알킬의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, iso-부틸, 디플루오로메틸, 및 2,2,2-트리플루오로에틸 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "헤테로알킬"은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 알킬을 의미한다. 이때 헤테로원자는 각각 독립적으로 선택된다.
그 자체인 분자를 지칭하기 위해 사용되거나 또는 분자의 일부를 지칭하기 위해 사용되는 용어 "알킬렌"은 알킬로부터 유도된 2가 라디칼(divalent radical)을 의미한다. 용어 "알킬렌"은, 필요에 따라, "치환된" 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용될 수 있다. 용어 "알킬렌"이 "치환된" 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용되지 않는 경우에는, 용어 "알킬렌"은 치환된 알킬렌 및 비치환된 알킬렌을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 알킬렌은 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, 및 -CH2CH2CH2CH2- 으로 예시될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 알킬렌은 C2 알킬렌과 같이 사용될 수 있으며, 이는 주사슬에 두개의 탄소 원자를 포함하는 알킬렌 그룹을 의미한다. 예시적으로, 본 명세서에서 "Cx-y 알킬렌" 은 주사슬에 X 내지 Y 수의 탄소 원자를 갖는, 치환된 또는 비치환된 알킬렌을 모두 포함하는 알킬렌을 의미하는 것으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "알킬렌"은 주사슬에 헤테로원자를 포함하지 않는 알킬렌 그룹 및 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 헤테로 알킬렌 그룹을 포괄하는 것으로 사용될 수 있다.
그 자체인 분자를 지칭하기 위해 사용되거나 또는 분자의 일부를 지칭하기 위해 사용되는 용어 "헤테로알킬렌"은 헤테로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 용어 “헤테로알킬렌”은 필요에 따라, “치환된” 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용될 수 있다. 용어 "헤테로알킬렌"이 "치환된" 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용되지 않는 경우에는, 용어 "헤테로알킬렌"은 치환된 헤테로알킬렌 또는 비치환된 헤테로알킬렌을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 예시적으로 헤테로알킬렌 그룹은 ―CH2―CH2―O―CH2―CH2―, 및 ―CH2―O―CH2―CH2―NH―CH2― 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 헤테로알킬렌 그룹은 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 각각의 헤테로원자는 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 헤테로알킬렌 그룹은 사슬 또는 가지의 말단이 아닌 위치에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 각각의 헤테로원자는 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 헤테로알킬렌 그룹은 사슬 또는 가지의 말단 각각, 또는 모든 말단에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 각각의 헤테로원자는 같거나 다를 수 있다. 예시적으로, 본 명세서에서 "Cx-y 헤테로알킬렌" 은 주사슬에 총 x 내지 y 수의 탄소 원자 및 헤테로 원자를 갖는, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌을 모두 포함하는 것으로 사용된다. 예를 들어, C3 헤테로알킬렌은 주사슬에 2개의 탄소 원자 및 하나의 헤테로원자를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌을 의미하는 것으로 사용될 수 있다. 다른 예로, C5 헤테로알킬렌은 주사슬에 3개의 탄소 원자 및 2개의 헤테로원자를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌을 의미하는 것으로 사용될 수 있다.
용어 "시클로알킬"은 완전히 포화된 시클릭 탄화수소 그룹을 지칭하는 것으로 사용된다. "시클로알킬"은 모노시클릭 및 폴리시클릭 그룹을 포함한다. 다르게 정의되지 않는 한, 일반적으로, 모노시클릭 시클로알킬 그룹은 3 내지 약 10개의 탄소 원자를 고리 상에 갖는다. 폴리시클릭 시클로알킬의 첫번째 고리 외의 고리는 포화, 불포화, 및 방향족 고리로부터 선택될 수 있다. 시클로알킬은 바이시클릭 분자로서 1, 2 또는 3, 또는 그 이상의 원자가 2개의 고리 사이에서 공유된 것을 포함한다. "융합된 시클로알킬"이라는 용어는 폴리시클릭 시클로알킬로서 각각의 고리가 다른 고리와 함께 인접한 2개의 원자를 공유하는 그룹을 지칭한다. 융합된 폴리시클릭 시클로알킬의 첫번째 고리 외의 고리는 포화, 불포화 및 방향족 고리로부터 선택될 수 있다. 시클로알킬은 치환된 또는 비치환된의 용어와 함께 사용될 수 있으며, 치환된 시클로알킬은 고리 상의 탄소 원자에 연결된 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 독립적인 치환기로 치환된 경우 제공되는 그룹을 지칭한다. 나아가, 시클로알킬은 용어 헤테로와 함께 사용될 수 있으며, 이때 헤테로시클로알킬은 하나 이상의 헤테로원자를 고리상에 포함하는 시클로알킬 그룹을 지칭한다. 용어 시클로알킬은 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 및 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬을 모두 포괄하는 것으로 사용될 수 있다.
용어 "시클로알킬렌"은 시클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 용어 시클로알킬렌은 치환된 또는 비치환된의 용어와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 용어 시클로알킬렌은 용어 헤테로와 함께 사용될 수 있다. 용어 시클로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 및 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌을 모두 포괄하는 것으로 사용될 수 있다.
그 자체인 분자를 지칭하기 위해 사용되거나 또는 분자의 일부를 지칭하기 위해 사용되는 용어 "알켄" 또는 "알케닐"은 사슬 모양 또는 가지 모양의 비방향족 탄화수소로서 하나 이상의 이중 결합을 포함한다. 예를 들어, 사슬 모양 또는 가지 모양 알케닐 기는, 2 내지 약 50개, 2 내지 20개, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 가질 수 있다.
용어 "헤테로알켄" 또는 "헤테로알케닐"은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 알케닐을 의미한다. 이때 헤테로원자는 각각 독립적으로 선택된다.
그 자체인 분자를 지칭하기 위해 사용되거나 또는 분자의 일부를 지칭하기 위해 사용되는 용어 "알케닐렌"은 알케닐로부터 유도된 2가 라디칼 (divalent radical)을 의미한다. 용어 "알케닐렌"은, 필요에 따라, "치환된" 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용될 수 있다. 용어 알케닐렌이 치환된 또는 비치환된의 용어와 함께 사용되지 않는 경우에는, 용어 알케닐렌은 치환된 알케닐렌 및 비치환된 알케닐렌을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 알케닐렌은 -C=C-, -C-C-C=C-C=C-, 또는 -C-C-C-C=C- 등과 같이 예시될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 "Cx-y 알케닐렌"과 같이 사용되는 경우, Cx-y 알케닐렌은 주사슬에 x 내지 y의 수의 탄소 원자를 갖는, 치환된 또는 비치환된 알케닐렌을 모두 포함하는 알케닐렌을 의미하는 것으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "알케닐렌"은 주사슬에 헤테로원자를 포함하지 않는 알케닐렌 그룹 및 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 헤테로 알케닐렌 그룹을 포괄하는 것으로 사용될 수 있다.
그 자체인 분자를 지칭하기 위해 사용되거나 또는 분자의 일부를 지칭하기 위해 사용되는 용어 "헤테로알케닐렌"은 헤테로알케닐로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 예를 들어, 용어 "헤테로알케닐렌"은 하나 이상의 헤테로원자를 주사슬에 포함하는 알케닐렌 그룹을 지칭하는 것으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 "Cx-y 헤테로알케닐렌"과 같이 사용되는 경우, Cx-y 헤테로알케닐렌은 주사슬에 x 내지 y의 수의 탄소 원자 및 헤테로 원자(예를 들어, 탄소 원자 수 및 헤테로 원자의 수의 합이 x 내지 y임)를 갖는, 치환된 또는 비치환된 헤테로알케닐렌을 모두 포괄하는 헤테로알케닐렌을 의미하는 것으로 사용된다.
용어 "시클로알켄" 또는 "시클로알케닐"은 고리 상에 하나 이상의 이중결합을 포함하는 시클릭 탄화수소이다. "시클로알케닐"은 모노시클릭 및 폴리시클릭 그룹을 포함한다. 다르게 정의되지 않는 한 일반적으로, 모노시클릭 시클로알케닐은 고리 상에 3 내지 약 10 개의 탄소 원자를 갖는다. 폴리시클릭 시클로알케닐의 첫번째 고리 외의 고리는 포화, 불포화 및 방향족 고리로부터 선택될 수 있다. 시클로알케닐은 바이시클릭 분자로서 1, 2 또는 3 또는 그 이상의 원자가 2 개의 고리 사이에서 공유된 것을 포함한다. "융합된 시클로알케닐"이라는 용어는 폴리시클릭 시클로알케닐로서 각각의 고리가 다른 고리와 함께 인접한 2 개의 원자를 공유하는 것을 의미한다. 융합된 폴리시클릭 시클로알케닐의 첫번째 고리 외의 고리는 포화, 불포화 및 방향족 고리로부터 선택될 수 있다. 용어 "시클로알케닐"은 용어 "치환된" 또는 "비치환된"과 함께 사용될 수 있으며, 치환된 시클로알케닐은 고리 상의 탄소 원자에 연결된 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 독립적인 치환기로 치환된 경우 제공되는 그룹을 지칭한다. 나아가, 용어 "시클로알케닐"은 용어 "헤테로"와 함께 사용될 수 있으며, 이때 헤테로시클로알케닐은 하나 이상의 헤테로원자를 고리상에 포함하는 시클로알케닐 그룹을 지칭한다. 용어 시클로알케닐은 치환 또는 비치환된 시클로알케닐, 및 치환 또는 비치환된 헤티로시클로알케닐을 모두 포괄하는 것으로 사용될 수 있다.
용어 "시클로알케닐렌"은 시클로알케닐로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 용어 시클로알케닐렌은 치환된 또는 비치환된의 용어와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 용어 시클로알케닐렌은 용어 헤테로와 함께 사용될 수 있다. 용어 시클로알케닐렌은 치환된 또는 비치환된 시클로알케닐렌, 및 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알케닐렌을 모두 포괄하는 것으로 사용될 수 있다.
그 자체인 분자를 지칭하기 위해 사용되거나 또는 분자의 일부를 지칭하기 위해 사용되는 용어 "알킨" 또는 "알키닐"은 사슬 모양 또는 가지 모양의 비방향족 탄화수소로서 하나 이상의 삼중 결합을 포함한다. 예를 들어, 사슬 모양 또는 가지 모양 알키닐 기는, 2 내지 약 50개, 2 내지 20개, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 가질 수 있다.
용어 "헤테로알키닐" 또는 "헤테로알킨"은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 알키닐을 의미한다. 이때 헤테로원자는 각각 독립적으로 선택된다.
그 자체인 분자를 지칭하기 위해 사용되거나 또는 분자의 일부를 지칭하기 위해 사용되는 용어 "알키닐렌"은 알키닐로부터 유도된 2가 라디칼 (divalent radical)을 의미한다. 용어 "알키닐렌"은, 필요에 따라, "치환된" 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용될 수 있다. 용어 알키닐렌이 치환된 또는 비치환된의 용어와 함께 사용되지 않는 경우에는, 용어 알키닐렌은 치환된 알키닐렌 및 비치환된 알키닐렌을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 "Cx-y 알키닐렌"과 같이 사용되는 경우, Cx-y 알키닐렌은 주사슬에 x 내지 y의 수의 탄소 원자를 갖는, 치환된 또는 비치환된 알키닐렌을 모두 포함하는 알키닐렌을 의미하는 것으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "알키닐렌"은 주사슬에 헤테로원자를 포함하지 않는 알키닐렌 그룹 및 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 헤테로 알키닐렌 그룹을 포괄하는 것으로 사용될 수 있다.
그 자체인 분자를 지칭하기 위해 사용되거나 또는 분자의 일부를 지칭하기 위해 사용되는 용어 "헤테로알키닐렌"은 헤테로알키닐로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 예를 들어, 용어 "헤테로알키닐렌"은 하나 이상의 헤테로원자를 주사슬에 포함하는 알키닐렌 그룹을 지칭하는 것으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 "Cx-y 헤테로알키닐렌"과 같이 사용되는 경우, Cx-y 헤테로알키닐렌은 주사슬에 x 내지 y의 수의 탄소 원자 및 헤테로 원자(예를 들어, 탄소 원자 수 및 헤테로 원자의 수의 합이 x 내지 y임)를 갖는, 치환된 또는 비치환된 헤테로알키닐렌을 모두 포괄하는 헤테로알키닐렌을 의미하는 것으로 사용된다.
용어 "시클로알킨" 또는 "시클로알키닐"은 고리 상에 하나 이상의 삼중결합을 포함하는 시클릭 탄화수소로서, "스트레인된 알킨"으로도 지칭된다. "시클로알키닐"은 모노시클릭 및 폴리시클릭 그룹을 포함한다. 다르게 정의되지 않는 한 일반적으로, 모노시클릭 시클로알키닐은 고리 상에 3 내지 약 10 개의 탄소 원자를 갖는다. 폴리시클릭 시클로알키닐의 첫번째 고리 외의 고리는 포화, 불포화 및 방향족 고리로부터 선택될 수 있다. 시클로알키닐은 바이시클릭 분자로서 1, 2 또는 3 또는 그 이상의 원자가 2 개의 고리 사이에서 공유된 것을 포함한다. "융합된 시클로알키닐"이라는 용어는 폴리시클릭 시클로알키닐로서 각각의 고리가 다른 고리와 함께 인접한 2 개의 원자를 공유하는 것을 의미한다. 융합된 폴리시클릭 시클로알키닐의 첫번째 고리 외의 고리는 포화, 불포화 및 방향족 고리로부터 선택될 수 있다. 용어 "시클로알키닐"은 용어 "치환된" 또는 "비치환된"과 함께 사용될 수 있으며, 치환된 시클로알키닐은 고리 상의 탄소 원자에 연결된 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 독립적인 치환기로 치환된 경우 제공되는 그룹을 지칭한다. 나아가, 용어 "시클로알키닐"은 용어 "헤테로"와 함께 사용될 수 있으며, 이때 헤테로시클로알키닐은 하나 이상의 헤테로원자를 고리상에 포함하는 시클로알키닐 그룹을 지칭한다. 용어 시클로알키닐은 치환 또는 비치환된 시클로알키닐, 및 치환 또는 비치환된 헤티로시클로알키닐을 모두 포괄하는 것으로 사용될 수 있다.
용어 "시클로알키닐렌"은 시클로알키닐로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 용어 시클로알키닐렌은 치환된 또는 비치환된의 용어와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 용어 시클로알키닐렌은 용어 헤테로와 함께 사용될 수 있다. 용어 시클로알키닐렌은 치환된 또는 비치환된 시클로알키닐렌, 및 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알키닐렌을 모두 포괄하는 것으로 사용될 수 있다.
용어 "아릴(aryl)"은 방향족 고리를 포함하는 그룹을 지칭하는 것으로 사용되며, 방향족 화합물인 아렌(arene)으로부터 유도된 그룹을 의미한다. 용어 아릴은 모노시클릭 그룹 및 폴리시클릭 그룹을 포함한다. 용어 "아릴"은 용어 "헤테로"와 함께 사용될 수 있으며, 헤테로아릴은 고리 상에 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 아릴 그룹을 지칭하는 것으로 사용된다. 용어 "아릴"은 용어 "치환된" 또는 "비치환된"과 함께 사용될 수 있으며, 치환된 아릴은 고리 상의 원자에 연결된 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 경우의 아릴 그룹을 지칭하는 것으로 사용된다. 용어 "아릴"은 치환 또는 비치환된 아릴, 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴을 모두 포괄하는 것으로 사용될 수 있다. 아릴의 예는 페닐(phenyl), 피리딜 (pyridyl), 나프틸(naphthyl), 및 바이페닐 (biphenyl) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
용어 "아릴렌(arylene)"은 아릴로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 용어 아릴렌은 치환된 또는 비치환된의 용어와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 용어 아릴렌은 용어 헤테로와 함께 사용될 수 있다. 용어 아릴렌은 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌을 모두 포괄하는 것으로 사용될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "치환된"은 원자의 원자가(valence)가 정상이고 치환된 화합물이 안정적인, 원자상의 하나 이상의 수소 원자가 중수소 및 수소 변이체(variants)를 포함하는 치환기로 치환됨을 의미한다. 치환기가 산소(즉, =O)인 경우, 이는 두개의 수소 원자가 치환되었음을 의미한다. 하나의 치환기가 할로겐(예를 들어, Cl, F, Br, 및 I 등)인 경우, 이는 하나의 수소원자가 할로겐으로 치환되었음을 의미한다. 치환기가 하나의 그룹에 두개 이상 존재할 경우, 상기 그룹에 존재하는 치환기는 같거나 다를 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 치환기의 유형 및 수는 화학적으로 달성 가능한 한, 임의적일 수 있다. 예시적으로, 치환기는 -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은, 각각 독립적으로, H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다 (단, 치환기는 -H가 아님). 치환기의 대표적인 예로는, -C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -OH, -NO2 및 -SH 이 있으나 이에 제한되지 않는다. 용어 치환된 또는 비치환된은 분자 그 자체를 지칭하기 위해 사용되는 용어 또는 분자의 일부를 지칭하기 위해 사용되는 용어와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 치환된 C10-20 알킬렌은 주사슬에 연결된 하나 이상의 수소원자가 치환기로 치환된 것을 의미할 수 있으며, 이때 각각의 치환기는 독립적으로 선택될 수 있다.
본 명세서에 개시되는 구조식 또는 화학식 내에서 사용되는 구조 "
Figure pct00003
"는 Cx 알킬렌 또는 Cx 헤테로알킬렌, Cx 알케닐렌 또는 Cx 헤테로알케닐렌, 또는 Cx 알키닐렌 또는 Cx 헤테로알키닐렌을 의미하는 것으로 사용된다. 바람직하게는, 구조 "
Figure pct00004
"는 Cx 알킬렌 또는 Cx 헤테로알킬렌을 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 구조
Figure pct00005
는 -CH2-CH2-CH2-CH2-와 같은 C4 알킬렌, 및 -CH2-CH2-O-CH2- 및 -O-CH2-CH2-CH2- 등과 같은 C4 헤테로알킬렌 등을 모두 포함하는 구조를 의미하는 것으로 사용될 수 있다. 여기서, x가 0인 경우는 결합 (bond)을 의미한다. 즉, 구조
Figure pct00006
은 구조
Figure pct00007
으로 표현될 수 있다.
본 명세서의 화합물은 특정 기하(geometric) 또는 입체 이성질체 형태를 가질 수 있다. 달리 명시되지 않고 본 출원에 화합물이 개시되는 경우, 상기 화합물의 시스 및 트랜스 이성질체, (-)- 및 (+)- 거울상 이성질체(enantiomers), (R)- 및 (S)- 거울상 이성질체, 부분입체이성질체, (D)- 이성질체, (L)-이성질체, 및 라세미체 등의 이성질체는 본 출원의 범위에 포함된다. 즉, 본 명세서에 개시된 화학식 또는 구조에 이성질체와 관련된 표시(예를 들어,
Figure pct00008
등)가 없는 경우, 개시된 화학식 또는 구조는 가능한 모든 이성질체를 포함함을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 다른 아미노산과 결합되지 않은 아미노산, 및 단백질 또는 펩타이드에 포함된 다른 아미노산과 결합된 아미노산 잔기를 모두 지칭하는 것으로 사용될 수 있으며, 상기 아미노산 용어가 사용된 단락의 내용 또는 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 천연 아미노산(natural amino acid)은 인간의 체내에서 유전자의 전사 및 번역 과정을 통해 합성되는 20종의 아미노산을 통틀어 의미한다. 구체적으로, 상기 천연 아미노산은 알라닌(Alanine; Ala, A), 아르기닌(Arginine; Arg, R), 아스파라긴(Asparagine; Asn, N), 아스파르트산(Aspartic acid; Asp, D), 시스테인(Cysteine; Cys, C), 글루탐산(Glutamic acid; Glu, E), 글루타민(Glutamine; Gln, Q), 글리신(Glycine; Gly, G), 히스티딘(Histidine; His, H), 이소류신(Isoleucine; Ile, I), 류신(Leucine; Leu, L), 리신(Lysine; Lys K), 메티오닌(Methionine; Met, M), 페닐알라닌(Phenylalanine; Phe, F), 프롤린(Proline; Pro, P), 세린(Serine; Ser, S), 트레오닌(Threonine; Thr, T), 트립토판(Tryptophan; Trp, W), 티로신(Tyrosine; Tyr, Y), 및 발린(Valine; Val, V)을 포함한다. 본 명세서에서 비천연 아미노산(unnatural amino acid)은 인간의 체내에서 유전자의 전사 및 번역 과정을 통해 합성되지 않고 전사 및 번역 과정이 아닌 다른 과정을 통해 합성되거나, 인공적으로 합성되거나, 또는 인간이 아닌 다른 유기체에서 합성될 수 있는 아미노산을 의미한다. 상기 비천연 아미노산은 예를 들어, 오르니틴(ornithine; orn), 디아미노프로피오닉산 (diaminopropionic acid; Dap), 디아미노뷰티릭산 (diaminobytyric acid; Dab), 및 나프틸알라닌(naphthylalanine) 등을 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 다른 아미노산과 결합되지 않은 아미노산, 및 단백질 또는 펩타이드에 포함된 다른 아미노산과 결합된 아미노산 잔기를 모두 지칭하는 것으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 알라닌은 알라닌 및/또는 알라닌 잔기를 지칭하는 것으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 아르기닌은 아르기닌 및/또는 아르기닌 잔기를 지칭하는 것으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 L형 아미노산 및 D형 아미노산 모두를 포함하는 것으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, L형 또는 D형에 대한 언급이 없는 경우, L형 아미노산으로 해석될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산 잔기(amino acid residue)"는 화합물, 펩타이드, 및/또는 단백질(예를 들어, 항체 등)에 포함된, 상기 화합물, 펩타이드, 및/또는 단백질의 다른 부분과 공유결합으로 연결되어 있는, 아미노산으로부터 유래된 구조를 의미한다. 예를 들어, 알라닌, 아르기닌 및 글루탐산이 아마이드 결합을 통해 연결되어 ARE 서열을 갖는 펩타이드가 형성된 경우, 상기 펩타이드는 3개의 아미노산 잔기를 포함하며, 이때, A는 알라닌 잔기, R은 아르기닌 잔기, E는 글루탐산 잔기로 지칭될 수 있다. 나아가, 전술한 바와 같이, ARE 서열을 갖는 펩타이드에서, 상기 펩타이드는 3개의 아미노산을 포함할 수 있고, A는 알라닌, R은 아르기닌, E는 글루탐산으로도 지칭될 수 있다. 다른 예로, 아스파르트산, 페닐알라닌, 라이신이 아마이드 결합을 통해 연결되어 DFK 서열을 갖는 펩타이드가 형성된 경우, 상기 펩타이드는 3개의 아미노산 잔기를 포함하며, 이때, D는 아스파르트산 잔기, F는 페닐알라닌 잔기, K는 라이신 잔기로 지칭될 수 있다. 나아가, 전술한 바와 같이, DFK 서열을 갖는 펩타이드에서, 상기 펩타이드는 3개의 아미노산을 포함할 수 있고, D는 아스파르트산, F는 페닐알라닌, K는 라이신으로도 지칭될 수 있다.
달리 서술하지 않는 한, 본 명세서에서는 아미노산 서열을 기재할 때는 아미노산 일문자 표기법, 또는 세문자 표기법을 사용하여, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 기재한다. 예를 들어, RNVP로 표기하는 경우, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 아르기닌(arginine), 아스파라긴(asparagine), 발린(valine), 및 프롤린(proline)이 차례로 연결된 펩타이드를 의미한다. 또 다른 예를 들어, Thr-Leu-Lys로 표기하는 경우, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 트레오닌(Threonine), 류신(Leucine), 및 리신(Lysine)이 차례로 연결된 펩타이드를 의미한다. 상기 일문자 표기법, 또는 세문자 표기법으로 나타낼 수 없는 아미노산의 경우, 다른 문자를 사용하여 표기하며, 추가적으로 보충하여 설명한다. 본 명세서에서 제시하는 서열은, 목적하는 기능이 동일유사하다면, 제시 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “클릭화학(click-chemistry)”은 Scripps Research Institute의 K. Barry Sharpless에 의하여, 두 개의 분자가 빠르고 안정적으로 공유 결합을 형성하도록 설계된 상보적인 화학작용기 및 화학 반응을 설명하기 위해 도입된 화학적 개념이다. 본 명세서의 클릭화학은 특정한 반응을 의미하는 것이 아닌, 빠르고 안정적인 반응의 개념을 의미한다. 일 실시양태로, 클릭화학으로 분자들 사이의 결합을 형성하기 위해서는 몇 가지 조건을 만족해야 한다. 상기 조건은 높은 수득률, 반응 자리에 대한 뛰어난 선택성, 모듈식으로 작동하여 유기적으로 분자가 결합되는 것 및 열역학적으로 안정화된 방향으로 진행되어 빠르고 정확한 생성물을 만드는 것이다. 본 명세서의 클릭화학은 클릭화학작용기(예를 들어, 말단 알킨 (terminal alkyne), 아자이드 (azide), 스트레인된 알킨(strained alkyne), 다이엔 (diene), 친다이엔체 (dienophile), 트랜스 시클로옥틴(trans-cyclooctene), 알켄 (alkene), 티올 (thiol), 테트라진 (tetrazine), 트리아진(triazine), DBCO(dibenzocyclooctyne) 및 비시클로노닌(bicyclononyne, bicyclo[6.1.0]non-4-yne)을 포함)중에서 서로 반응성을 갖는 쌍이 반응하는 것을 포함한다. 클릭화학반응의 예시로는, 휴이스겐 1,3-이극성 고리화첨가 (Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition; Tornoe et al.　Journal of Organic Chemistry (2002) 67: 3075-3064 등 참조); 디엘스-알더 반응 (Diels-Alder reaction); inverse-demand 디엘스-알더(Diels-Alder) 반응; 에폭사이드 (epoxide) 및 아지리딘 (aziridine)과 같은 작은 스트레인된 고리 (strained ring)에 대한 친핵성 첨가 반응 (Nucleophilic addition); 활성화된 카르보닐기 (activated carbonyl group)에 대한 친핵성 첨가 반응; staudinger ligation 및 탄소-탄소 이중결합 또는 삼중결합에 대한 첨가 반응이 있다.
용어 "생체직교적 작용기 (bio-orthogonal functional group)"는 생물학적으로 불활성인 화학 반응 그룹을 지칭하는 것으로 사용된다. 즉, 용어 "생체직교적 작용기"는 생체직교 화학 (bio-orthogonal chemistry) 또는 생체직교 반응에 참여하여, 생체직교 반응을 수행하는 화학적 작용기를 지칭하는 것으로 사용된다. 용어 "생체직교적 작용기"는 생체직교적 화학 작용기 또는 생체직교적 화학 그룹으로 지칭될 수 있다. 생체직교적 작용기는 살아있는 세포 또는 유기체 내의 내인성 분자 또는 기능적 그룹과 반응하지 않는 그룹을 지칭한다. 이들 생체직교적 작용기는 정상적인 세포 과정을 방해하지 않고 복잡한 생물학적 시스템에서 특정 그룹과 반응할 수 있도록 설계된다. "생체직교적 화학"이라는 용어는 2003년 Carolyn R. Bertozzi에 의해 처음 제안되었으며, 생체직교적 화학은 지금까지도 유기화학 및 컨쥬게이션 분야에서 널리 이용되고 있다. 용어 "생체직교적(bio-orthogonal)"는 생체직교적 작용기를 통해 수행되는 화학적 반응이 자연적인 생물학적 과정을 방해하지 않고 수행될 수 있음을 지칭한다. 생체직교적 작용기의 주요 특징 중 하나는 생물학적 환경에서 상응하는 반응 그룹과 구체적이고 효율적으로 반응하는 것이다. 생체직교적 작용기, 생체직교적 화학, 또는 생체직교적 반응은 문헌 [Sletten, Ellen M., and Carolyn R. Bertozzi. "Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality." Angewandte Chemie International Edition 48.38 (2009): 6974-6998.; Mbua, Ngalle Eric, et al. "Strain-promoted alkyne-azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis." ChemBioChem 12.12 (2011): 1912-1921.; Bird, Robert E., et al. "Bioorthogonal chemistry and its applications." Bioconjugate Chemistry 32.12 (2021): 2457-2479.; Devaraj, Neal K. "The future of bioorthogonal chemistry." ACS central science 4.8 (2018): 952-959.; 및 Scinto, Samuel L., et al. "Bioorthogonal chemistry." Nature Reviews Methods Primers 1.1 (2021): 30.]에 상세히 설명되며, 이들 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 생체직교적 화학은 보다 범위가 넓은 클릭 화학의 분야와 상당히 겹칠 수 있다. 전술한 바와 같이, 고수율 및 모듈식 반응을 지칭하는 클릭화학은 엄격하게는 생체직교적이지 않은 반응도 포함한다. 특정한 실시양태에서, 생체직교적 작용기는 항체와 반응성이 없으나, 상기 생체직교적 작용기와 생체직교적 반응이 가능한 그룹에 높은 반응성을 갖는 화학적 그룹을 지칭하는 것으로 사용될 수 있다. 생체직교적 반응 (또는 생체직교적 화학)의 대표적인 종류로는 스타우딩어 라이게이션(Staudinger Ligation), 구리-촉매화 아자이드-알킨 사이클로에디션 (Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition; CuAAC), 변형-촉진된 아자이드-알킨 사이클로에디션 (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition; SPAAC)을 포함하는 구리가 없는 아자이드-알킨 사이클로에디션 (Copper-Free Azide-Alkyne Cycloaddition), 테트라진 라이게이션 (Tetrazine Ligation), 테트라졸 라이게이션 (Tetrazole Ligation), 옥심 라이게이션 (Oxime Ligation), 및 이소시아나이드 클릭 반응 (Isocyanide Click Reaction) 등이 있으나 달리 제한되지 않는다. 생체직교적 작용기는 예를 들어, 아자이드, 말단 알킨, 사이클릭 알킨 (예를 들어, 시클로옥틴), 테트라진, 노르보르넨, 사이클로 알켄 (예를 들어, 시클로옥텐), 테트라졸, 옥심, 또는 이소시아나이드 그룹을 포함하며 달리 제한되지 않는다. 예를 들어, 구리가 없는 아자이드-알킨 사이클로에디션 (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition; SPAAC)에서는 아자이드 그룹과 시클로옥틴 그룹이 생체직교적 반응을 수행한다. SPAAC에 참여하는 시클로옥틴 그룹은 모노시클릭 시클로옥틴 이거나 융합된 폴리시클릭을 포함하는 폴리시클릭 시클로옥틴일 수 있다. SPAAC에 참여하는 시클로옥틴 그룹의 구체적인 예는, BCN (Bicyclononyne), DBCO (Dibenzocyclooctyne), DIBAC (aza-dibenzocyclooctynes), DIBO (dibenzocyclooctynol), DIFO (difluorinated cyclooctynes), BARAC (biarylazacyclooctynone), DIMAC (dimethoxyazacyclooctyne) 및 DIFBO(difluorobenzocyclooctyne) 등을 포함하나 달리 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 항체는 이뮤노글로불린 분자 또는 이의 단편을 의미하는 것으로 사용된다. 이뮤노글로불린은 통상적으로 잘 알려져 있으며, 하나 이상의 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 능력을 갖고 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 항체는 이의 단편 역시 포괄하는 것으로 사용되므로, Fc 단편의 경우와 같이 특정 항원에 대한 결합능이 없어도 무관하다. 항체와 관련된 특별한 한정과 같이 사용되지 않는 한, 용어 항체는 단일특이적 항체 (monospecific antibody), 이중특이적항체(bispecific antibody), 삼중특이적항체 (trispecific antibody), 단일클론항체(monoclonal antibody), 인간 항체, 인간화 항체, 재조합 항체, 및 키메릭 항체 등을 모두 포함하는 것으로 특별한 한정 없이 해석될 것이다. 예를 들어, 항체는 두개의 중쇄 및 두개의 경쇄를 포함할 수 있고, 이때 두개의 중쇄가 하나 이상의 브릿지(예를 들어, 이황화결합)를 통해 연결되고, 하나의 중쇄와 하나의 경쇄가 하나 이상의 브릿지를 통해 연결되고, 하나의 다른 중쇄와 하나의 다른 경쇄가 하나 이상의 브릿지를 통해 연결된 구조를 가질 수 있다. 항체는 Fc 영역 (또는 Fc 도메인)과 Fab 영역으로 나눌 수 있으며, Fab 영역은 항원과 결합 가능한 부위를 포함하고, Fc 영역은 중쇄의 불변 영역을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 컨쥬게이트된 항체 및 컨쥬게이트되지 않은 항체(예를 들어, 자유 항체(free antibody))를 모두 포함하는 것으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "기능성 그룹 (functional group)"은 하나 이상의 기능을 갖는 그룹을 지칭하는 것으로 사용되며, 달리 제한되지 않는다. 결국, 항체-약물 컨쥬게이트와 같은 항체의 컨쥬게이트 분야는, 항체에 특정한 기능을 도입하기 위해 디자인된 기능성 물질을 항체에 연결시키는 것을 목적으로 한다. 기능성 물질을 포함하는 기능성 그룹은, 예를 들어, 다른 화학적 반응기와 반응하도록 디자인된 반응기를 포함하는 그룹과 활성 모이어티를 포함하는 그룹으로 구분될 수 있다. 예를 들어, 기능성 그룹은 하나 이상의 다른 화학적 반응기와 반응하도록 디자인된 반응기를 포함할 수 있다. 여기서, 다른 화학적 반응기와 반응하도록 디자인된 반응기는 예를 들어, 생체직교적 작용기일 수 있다. 즉, 기능성 그룹은 하나 이상의 생체직교적 작용기를 포함하고, 이때 생체직교적 작용기는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 다른 예로, 기능성 그룹은 하나 이상의 활성 모이어티를 포함할 수 있다. 활성 모이어티는 예를 들어, 약물 (예를 들어, 독소), 이미징 모이어티(예를 들어, 형광 모이어티, 루시페린과 같은 발광 물질을 포함하는 발광 모이어티 등), 방사성 모이어티, 특정한 기능을 갖는 단백질, 특정한 기능을 갖는 펩타이드, 친화성 물질 (예를 들어, 비오틴, 스트렙타비딘, 및 압타머 등), 안정화 물질, 비타민, DNA 분자, 또는 PEG (polyethylene glycol) 모이어티를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 하나 이상의 활성 모이어티는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 분야에서, 생체직교적 작용기를 포함하는 항체를 제조한 후 상기 생체직교적 작용기가 참여하는 생체직교적 반응을 통해 활성 모이어티를 항체에 결과적으로 연결할 수 있음은 관련 분야의 기술자에게 자명하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "방사성 모이어티 (radioactive moiety)"는 방사성 동위원소와 결합하도록 디자인된 방사성동위원소에 대한 리간드 및/또는 방사성 동위원소를 포함하는 모이어티를 의미한다. 방사성 동위원소 표지 (radiolabelling)은 진단 이미지 촬영 (diagnostic imaging), 라디오이뮤노테라피(Radioimmunotherapy; RIT), 및 방사성 치료 등에 유용하다. 방사성 모이어티는 예를 들어, 18F, 11C, 67Cu, 90Y, 125I, 123I, 124I, 131I, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 213Bi, 225Ac 또는 99mTc을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형광 모이어티 (fluorescent moiety)"는 형광 용도로 이용하기 위한 염료 (dye), 단백질, 또는 염료 시약 (dye reagent)을 포함하는 모이어티를 지칭한다. 염료 및 염료 시약으로 사용될 수 있는 분자는 당업계에 널리 알려져있다. 형광 모이어티는 예를 들어, GFP(green fluorescent protein), Cy3, Cy5, Texas Red, FITC, Rhodamine, 또는 DAPI을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약물"은 임의의 질병에 대한 치료 효능을 갖는 분자 또는 분자의 일부를 의미하는 것으로 사용된다. 본 출원에 의한 약물은 통상의 기술자에게 임의의 질병에 대하여 효능이 있는 것으로 알려진 것들을 포함한다. 나아가, 본 명세서에서 사용되는 용어 "약물"은 컨쥬게이트된 약물 및 컨쥬게이트되지 않은 약물(예를 들어, 자유 약물 (free drug))을 모두 포함하는 것으로 사용될 수 있다. 약물은, 예를 들어, 아우리스타틴(auristatin), 에리불린(eribulin), 튜불리신(tubulysin), 젤다나마이신(geldanamycin) (Kerr et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8(6):781-784), 메이탄시노이드(maytansinoid) (EP 1391213, ACR 2008, 41, 98-107), 칼리케마이신(calicheamicin) (U.S. Patent Publication No. 2009/0105461, Cancer Res. 1993, 53, 3336-3342), 메르탄신(Mertansine), 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 빈데신(vindesine), SG2285 (Cancer Res. 2010, 70(17), 6849-6858), 돌라스타틴(dolastatin), 돌라스타틴 아날로그 아우리 스타틴(dolastatin analogs auristatin) (U.S. Patent No. 5,635,483), 크립토피신(cryptophycin), 캄토테신(camptothecin), 리족신 유도체(rhizoxin derivative), CC 1065 아날로그 또는 유도체, 듀오카마이신(duocarmycin), 에네디인 항생제(enediyne antibiotic), 에스페라마이신(esperamicin), 에포틸론(epothilone), 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepine, PBD) 유도체, α-아마니틴(a-amanitin), 톡소이드, TLR5 (toll-like receptor 5) agonist TLR7 (toll-like receptor 7) agonist, TLR8 (toll-like receptor 8) agonist, NOTA (1,4,7-Triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), 및 DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid) 중 선택되는 어느 하나이거나, 또는 이의 유사체일 수 있으나 달리 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용되는 용어 "전자 끄는 그룹 (Electron-withdrawing group)"은 분자 내의 다른 원자 또는 그룹 (예를 들어, 인접한 그룹)으로부터 전자를 끌어당기는 능력을 갖는 그룹 또는 치환기를 지칭하는 것으로 사용되며, 관련 분야의 기술자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 해석된다. 전자 끄는 그룹의 대표적인 예로는 할로겐, 카보닐 그룹 (예를 들어, -CHO), 설포닐 그룹(예를 들어, -SO3H), 에스터 그룹 (예를 들어, -COOH), 아마이드 그룹 (예를 들어, -CONH2), -CN, -NO2, 및 할로알킬 그룹 (예를 들어, -CF3) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용되는 용어 "친수성 그룹(hydrophilic group)"은 부가되는 분자의 친수성을 증가시키거나 친수성을 부가하는 그룹을 지칭하는 것으로 사용되며, 관련 분야의 기술자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 해석된다. 친수성 그룹의 대표적인 예로는 -OH, -CHO, -COOH, -CONH2, -NH2, -PO4, -SO3H, PEG 모이어티, 및 슈거 모이어티 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 항체의 Fc 도메인 (또는 Fc 영역)에 대한 아미노산 서열에 대한 언급이 나온다면, 다르게 언급되지 않는 한 서열번호는 EU 넘버링 체계 (EU numbering system)에 따른다. EU 넘버링 체계는 Edelman GM, et al., The covalent structure of an entire gammaG immunoglobulin molecule, Proc Natl Acad Sci U S A., 1969 May;63(1):78-85.에서 IgG의 서열이 연구된 이후 Fc 도메인의 서열 체계로 널리 이용되고 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "연결된" 또는 "연결"은 하나의 개념화 가능한 구조 내에 존재하는 2 이상의 요소가 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 링커와 같은 다른 요소를 통해) 연결되어 있는 것을 의미하며, 상기 2 이상의 요소 사이에 다른 추가적 요소가 존재할 수 없음을 의도하는 것은 아니다. 예를 들어, "요소 A에 연결된 요소 B"와 같은 기재는 요소 A와 요소 B 사이에 하나 이상의 다른 요소가 포함된 경우(즉, 하나 이상의 다른 요소를 통해 요소 A가 요소 B에 연결된 경우) 및 요소 A와 요소 B 사이에 하나 이상의 다른 요소가 존재하지 않는 경우 (즉, 요소 A와 요소 B가 직접적으로 연결된 경우)를 모두 포함하는 것으로 의도되며, 제한되어 해석될 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 동일성 (sequence identity)"은 2개 이상의 서열 사이의 유사성 정도와 관련하여 사용되는 용어이다. 예를 들어, 용어 "서열 동일성"은 기준이 되는 서열을 지칭하는 용어 및 비율(예를 들어, 백분율)을 나타내는 용어와 함께 사용된다. 예를 들어, 용어 "서열 동일성"은 기준이 되는 아미노산 서열과 유사하거나 실질적으로 동일한 서열을 설명하기 위해서 사용될 수 있다. "서열 A와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열"과 같이 기술되는 경우, 여기서 기준이 되는 서열은 서열 A이다. 예를 들어, 서열 동일성의 백분율은 기준 서열과 서열 동일성의 백분율 측정의 대상이 되는 서열을 정렬함을 통해 계산될 수 있다. 서열 동일성의 백분율의 계산 및/또는 결정 방법은 달리 제한되지 않으며, 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이용될 수 있는 합리적인 방법 또는 알고리즘을 통해 계산 및/또는 결정될 수 있다.
종래의 항체에 위치 선택적으로 기능성 그룹을 전달하기 위한 방법
항체에 위치 선택적으로 기능성 그룹을 전달하기 위한 방법의 요구
항체 (antibody)는 특정 분자를 인식하는 기능을 갖는 생체 분자로서 다양한 산업적 용도로 사용되고 있다. 일례로 항체를 이용하여 특정 물질을 검출 혹은 검색(스크리닝)할 수 있고, 특정 물질이 체내 또는 세포 내에서 이동하는 경로를 확인할 수 있으며, 특정 물질에 대한 면역반응을 유도하여 치료 용도로도 사용될 수 있다.
이러한 항체의 기능을 확장하기 위하여 항체를 개선하기 위한 시도가 있어왔다. 대표적으로, 항체의 기능을 보완하거나 확장하기 위하여 외부 물질들을 표지하기 위한 시도가 이루어졌다. 대표적으로, 형광물질을 항체에 표지하여 형광 어세이에 활용하거나, 특정 병증을 치료하기 위한 제제를 항체에 표지하여 항체의 치료 효능을 극대화할 수 있다. 이러한 시도들 및 기술을 본 출원에서 항체 표지 (antibody labeling)로 통칭한다. 본 출원은 신규한 항체 표지 방법에 관한 것이다.
초기의 항체 표지는 항체에 무작위적으로 외부 물질을 부착하는 방식으로 이루어졌으나, 이러한 방법에는 많은 문제가 있다. 이렇게 제조된 항체는 균질성이 떨어지는 문제가 있다. 이러한 항체들은 각각 부착된 물질의 개수가 다르고 그 결합 위치가 다르기 때문에 효과가 불균질해지는 문제가 있다. 이러한 문제는 높은 안전성 및 재현가능성을 요구하는 항체-약물 콘쥬게이트 (antibody-drug conjugate; ADC) 기술의 발전에 큰 장애가 된다.
또한 항체의 인식 효과가 현저히 저하되는 문제가 있다. 항체는 항원을 인식하는 항원 결합 도메인 (antigen-binding domain)을 포함하는 Fab 도메인 (또는 Fab 영역)과 항체의 결정화에 관여하는 Fc 도메인 (또는 Fc 영역)으로 구성된다. 무작위적인 표지는 외부 물질을 항체의 항원 결합 도메인 또는 이에 인접한 위치에 결합시킴으로써 항체의 인식 효과를 크게 저하시켰다.
이로 인해 해당 기술분야에는 위치특이적으로 균일하게 항체를 표지하는 기술에 대한 수요가 있었다. 일부 기술이 개발되긴 하였으나, 대부분 항체를 유전적으로 조작하거나 변형시키는 등 기술적, 경제적 효과가 부족한 면이 있었다.
이후, 항체의 유전적 변형 없이 위치특이적으로 약물과 같은 기능성 물질을 접합시키는 기술이 개발되었다. 즉, 항체에 대한 추가적인 조작 없이, 화학적 반응을 통해서 항체에 위치특이적으로 약물을 부착시키는 기술이 개발되었다. 이러한 위치 특이성의 부여는 위치-특이적 항체 인터렉톰 (예를 들어, Fc-결합성 펩타이드) 및 이를 포함하는 화합물의 사용에 의해 달성된다. 이하에서는 위치-특이적 항체 인터렉톰에 대해 설명하기에 앞서, 항체의 구조 및 기능성 물질이 연결되는 위치인 표지 위치에 대한 예시를 설명한다.
항체의 구조
본 설명은 본 출원의 이해를 돕기 위하여 제공되는 항체의 구조, 학문적 체계, 및 생리적 작용에 대한 설명을 제공하는 것을 목적으로 하며, 본 출원의 권리범위의 대상이 되는 항체는 본 설명에 의하여 한정되어선 안 된다.
항체는 알려진 바와 같이 두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄로 이루어져 있다. 항체를 기능적으로 간단히 나누면 경쇄를 포함하는 항원 결합 단편 가변부위 (Fragment antigen-binding variable region; Fab)와 중쇄의 일부로 구성된 결정화 단편 부위 (Fragment crystallizable region; Fc region)으로 나뉜다. Fab는 항원과 결합하는 파라토프 (paratope)를 포함하며, 알려진 바와 같이 항체가 항원에 대한 특이적 결합 활성을 갖도록 하는 부위이다. Fc 영역 또는 Fc 도메인은 세포의 Fc 수용기 (Fc receptor; FcR)에 대한 리간드로서, 면역반응을 유도하는 데 중요한 역할을 한다. 또한 Fc 도메인은 신생아 Fc 수용체 (neonatal Fc receptor)와 결합하여 항체가 반복적으로 세포에 내재화되도록 함으로써 항체의 반감기를 늘리는 데에도 중요한 역할을 한다.
이로부터 항체 표지의 몇몇 바람직한 방향성을 도출할 수 있다. (1) 먼저, 표지는 항체의 파라토프와 이격된 곳에서 이루어지는 것이 바람직하다. 표지가 파라토프 또는 이와 인접한 곳에서 이루어진다면, 항체의 항원에 대한 결합능이 크게 저하될 수 있다. (2) 두번째로, 표지는 FcRn을 포함하는 FcR의 인식 부위와 이격된 곳에서 이루어지는 것이 바람직하다. 표지가 상기 수용체의 인식부위 또는 이와 인접한 곳에서 이루어진다면 항체의 면역 유도 기능이 저하되거나 또한 항체의 반감기가 크게 떨어질 수 있다. Fc 도메인의 결합 활성 모티프에 대한 정보는 DeLano, W. L. (2000). Convergent Solutions to Binding at a Protein-Protein Interface. Science, 287(5456), 1279-1283., 및 W. Lance Martin et al. (2001), Molecular Cell, Vol. 7, 867-877, April, 2001 등에서 확인 가능하다.
본 출원에서 항체의 Fc 도메인에 대한 아미노산 서열에 대한 언급이 나온다면, 다르게 언급되지 않는 한 서열번호는 EU 넘버링 체계 (EU numbering system)에 따른다. EU 넘버링 체계는 Edelman GM, et al., The covalent structure of an entire gammaG immunoglobulin molecule, Proc Natl Acad Sci U S A., 1969 May;63(1):78-85.에서 IgG의 서열이 연구된 이후 Fc 도메인의 서열 체계로 널리 이용되고 있다.
예시적 표지 위치
상기 표지 위치(또는 표적 위치)의 기준, 즉 (1) 파라토프와 이격된 곳이고 (2) FcRn을 포함한 FcR의 인식 부위와 이격된 곳이어야 할 것을 고려하여 항체의 표지 위치 (예를 들어, 표적 위치)를 설계할 수 있다. 아미노산 중 생체콘쥬게이트 (bioconjugate) 반응에 활용되는 것으로는 대표적으로 라이신, 시스테인, 및 티로신이 있다. 항체의 Fc 도메인에 존재하는 246번 라이신 (Lys246, K246 또는 246번 라이신)과 248번 라이신 (Lys248, K248 또는 248번 라이신)은 상기 조건들을 모두 만족하는 잔기로서 바람직한 표지 위치 중 하나이다. 상기 항체의 Fc 도메인에 존재하는 K246 라이신 및 K248 라이신은 인간 Fc 도메인을 포함하는 항체에서 관찰된다. 예를 들어, 인간 IgG (immunoglobulin G), 트라스트주맙(trastuzumab), 리툭시맙 (rituximab), 베바시주맙 (bevacizumab), 인플릭시맙 (infliximab), 아달리무맙 (adalimumab), 및 오말리주맙 (omalizumab)은 K246 및 K248을 포함한다. 예를 들어, 데노슈맙(denosumab)은 IgG1의 K246 및 K248 각각과 대응되는 K247 및 K249를 포함한다. 다른 예로, 듀플리우맙 (dupilumab)은 IgG1의 K246 및 K248 각각과 대응되는 K251 및 K253을 포함한다 (문헌 [유럽 특허출원 출원번호 19818561.3, 공개번호 EP 3811978; 및 유럽 특허출원 출원번호 18791007.0, 공개번호 EP 3617235] 참조). IgG 또는 트라스트주맙에서 상기 Lys246 및 Lys248의 위치가 포함된 Fc 영역의 서열은 GPSVFLFPPKPKDTLMI (서열번호 01)이며, 서열 및 EU 넘버링 체계에 의한 서열의 번호는 도 01에 도시된다.
예를 들어, 표지 위치는 노출된 라이신 잔기, 노출된 티로신 잔기, 노출된 세린 잔기, 및 노출된 트레오닌 잔기 중 어느 하나 이상으로 선택될 수 있다. 인간 IgG1에서 선택될 수 있는 표지 위치의 예시는 다음과 같다 (문헌 [유럽 특허출원 출원번호 19818561.3, 공개번호 EP 3811978; 및 유럽 특허출원 출원번호 18791007.0, 공개번호 EP 3617235] 참조).
- 노출된 라이신 잔기:
CH2 도메인 (위치 246, 위치 248, 위치 274, 위치 288, 위치 290, 위치 317, 위치 320, 위치 322, 및 위치 338)
CH3 도메인 (위치 360, 위치 414, 및 위치 439)
- 노출된 티로신 잔기:
CH2 도메인 (위치 278, 위치 296, 및 위치 300)
CH3 도메인 (위치 436)
- 노출된 세린 잔기:
CH2 도메인 (위치 254, 위치 267, 위치 298, 및 위치 324)
CH3 도메인 (위치 375, 위치 400, 위치 415, 위치 440, 및 위치 442)
- 노출된 트레오닌 잔기:
CH2 도메인 (위치 256, 위치 289, 및 위치 307)
CH3 도메인 (위치 335, 위치 359, 위치 393, 및 위치 437)
위치-특이적 항체 인터렉톰 (site-specific antibody interactome; SSAI)
항체의 특정한 위치 (예를 들어, 전술한 표지 위치)에 기능성 물질을 도입은, 위치-특이적 항체 인터렉톰을 사용하는 기술을 통해 달성되었다. 위치-특이적 항체 인터렉톰 및 이를 포함하는 화합물을 이용하여 항체의 특정한 위치에 기능성 물질 (예를 들어, 생체직교적 작용기 및 약물 등)을 도입하는 기술은 문헌 [유럽 특허출원 출원번호 19818561.3, 공개번호 EP 3811978; PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944; Lee, TaeJin, et al. "Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody." Journal of Medicinal Chemistry 65.7 (2022): 5751-5759.; 및 Zeng, Yue, et al. "A Traceless Site-Specific Conjugation on Native Antibodies Enables Efficient One-Step Payload Assembly." Angewandte Chemie International Edition 61.36 (2022): e202204132.]에 상세히 설명되며, 이들 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 출원에서 사용된 용어 "인터렉톰 (interactome)"은 단백질 또는 펩타이드 간의 단백질-단백질 상호작용 (protein-protein interaction; PPI)이 있는 경우 상기 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 단백질 또는 펩타이드를 의미한다. 예컨데, 샤페론 단백질과 이의 승객 단백질은 서로의 인터렉톰이다. "단백질-단백질 상호작용"은 둘 이상의 단백질 또는 펩타이드 분자가 상호작용에 의하여 높은 특이성을 가지고 물리적 접촉을 이루는 것을 의미한다. 이때 원인이 되는 상호작용은 전자기력, 수소결합, 및 소수성 상호작용을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 사용된 용어 "항체 인터렉톰 (antibody interactome)"는 이뮤노글로불린을 포함하는 항체에 대한 인터렉톰을 의미한다. 항체에 기능성 그룹의 위치 특이적 전달은 항체 인터렉톰 및 이를 포함하는 화합물을 이용하여 달성될 수 있다. 항체 인터렉톰 중 항체의 Fc 도메인과의 결합 활성을 갖는 것으로 알려져 있는 펩타이드를 Fc 인터렉톰 또는 Fc-결합성 펩타이드 (Fc-binding peptide; FcBP)로 지칭된다. 상기 전술한 네개의 문헌 (문헌 [유럽 특허출원 출원번호 19818561.3, 공개번호 EP 3811978; PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944; Lee, TaeJin, et al. "Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody." Journal of Medicinal Chemistry 65.7 (2022): 5751-5759.; 및 Zeng, Yue, et al. "A Traceless Site-Specific Conjugation on Native Antibodies Enables Efficient One-Step Payload Assembly." Angewandte Chemie International Edition 61.36 (2022): e202204132.])은 FcBP 및 이를 포함하는 화합물을 사용하여, 표지하고자 하는 분자를 항체에 위치 특이적으로 전달시키는 방법에 관한 문헌이다. FcBP는 예를 들어, 하기의 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나의 서열, 또는 이와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다:
RGNCAYHKGQIIWCTYH (서열번호 02); RGNCAYHKGQIVWCTYH (서열번호 03); RGNCAYHKGQVVWCTYH (서열번호 04); RGNCAYHKGQAVWCTYH (서열번호 05); RGNCAYHKGQLLWCTYH (서열번호 06); RGNCAYHKGQLIWCTYH (서열번호 07); DCAYHKGQIVWCT (서열번호 08); DCAYHKGQVVWCT (서열번호 09); DCAYHKGQAVWCT (서열번호 10); RGNCAYHKSQIIWCTYH (서열번호 11); RGNCAYHKNQIIWCTYH (서열번호 12); RGNCAYHKDQIIWCTYH (서열번호 13); RGNCAYHKQQIIWCTYH (서열번호 14); RGNCAYHKEQIIWCTYH (서열번호 15); RGNCAYHKFQIIWCTYH (서열번호 16); RGNCAYHKYQIIWCTYH (서열번호 17); RGNCAYHKWQIIWCTYH (서열번호 18); RGNCAYHKHQIIWCTYH (서열번호 19); RGNCAYHKTQIIWCTYH (서열번호 20); RGNCAYHKLQIIWCTYH (서열번호 21); CAYHKLQIVWC (서열번호 22); CAYHKLQLIWC (서열번호 23); CAYHKSQIVWC (서열번호 24); RGNCAYHKGQLVFCTYH (서열번호 25); RGNCAYHKGQQVWCTYH (서열번호 26); RGNCAYHKGQEVWCTYH (서열번호 27); CAYHKGQLVWC (서열번호 28); RGNCAYHKAQLVWCTYH (서열번호 29); RGNCAYHKVQLVWCTYH (서열번호 30); RGNCAYHKLQLVWCTYH (서열번호 31); RGNCAYHKIQLVWCTYH (서열번호 32); RGNCAYHKSQLVWCTYH (서열번호 33); RGNCAYHKTQLVWCTYH (서열번호 34); RGNCAYHKNQLVWCTYH (서열번호 35); RGNCAYHKDQLVWCTYH (서열번호 36); RGNCAYHKQQLVWCTYH (서열번호 37); RGNCAYHKEQLVWCTYH (서열번호 38); RGNCAYHKFQLVWCTYH (서열번호 39); RGNCAYHKRQLVWCTYH (서열번호 40); RGNCAYHKHQLVWCTYH (서열번호 41); RGNCAYHKWQLVWCTYH (서열번호 42); RGNCAYHKYQLVWCTYH (서열번호 43); RGNCAYFKGQLVWCTYH (서열번호 44); RGNCAYYKGQLVWCTYH (서열번호 45); RGNCAYWKGQLVWCTYH (서열번호 46); RGNCAYRKGQLVWCTYH (서열번호 47); RGNCAYGKGQLVWCTYH (서열번호 48); DCAYHKGQLVWC (서열번호 49); NCAYHKGQLVWC (서열번호 50); CAYHKGQLVWCT (서열번호 51); CAYHKSQLVWC (서열번호 52); GNCAYHKGQIIWCTYH (서열번호 53); RGNCAYHEGQIIWCTYH (서열번호 54); GPDCAYHRGELVWCTFH (서열번호 55) (문헌 [유럽 특허출원 출원번호 19818561.3, 공개번호 EP 3811978] 참조); DCAWHDapGELVWCT (서열번호 56) (Dap: Diaminopropionic acid); DCAWHDabGELVWCT (서열번호 57) (Dab: Diaminobutyric acid); DCAWHOrnGELVWCT (서열번호 58) (Orn: Ornithine); DCAWHKGELVWCT (서열번호 59); DCAWHLGELVWCT (서열번호 60) (문헌 [PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944; 및 Lee, TaeJin, et al. "Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody." Journal of Medicinal Chemistry 65.7 (2022): 5751-5759.] 참조); RGNCAYHRGKLVWCTYH (서열번호 61) (문헌 [Zeng, Yue, et al. "A Traceless Site-Specific Conjugation on Native Antibodies Enables Efficient One-Step Payload Assembly." Angewandte Chemie International Edition 61.36 (2022): e202204132.] 참조); RGNCAYHKGQLVWCTYH (서열번호 62); GPDCAYHDapGELVWCTFH (서열번호 63); GPDCAYHDabGELVWCTFH (서열번호 64); GPDCAYHOrnGELVWCTFH (서열번호 65); GPDCAYHKGELVWCTFH (서열번호 66); GPDCAYHRGDapLVWCTFH (서열번호 67); GPDCAYHRGDabLVWCTFH (서열번호 68); GPDCAYHRGOrnLVWCTFH (서열번호 69); 및 GPDCAYHRGKLVWCTFH (서열번호 70).
나아가, FcBP는 하기의 문헌들에서 또한 상세히 설명되며, 하기의 문헌들에서 공개된 FcBP는 본 출원의 일 실시양태에 의해 제공되는 방법에서 제한 없이 사용 가능함은 관련 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 본 출원의 일 실시양태에 의해 제공되는 방법은 FcBP 및 티오에스터 그룹을 포함하는 화합물(즉, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물)을 이용하여 항체에 기능성 그룹을 전달하는 과정에서, 티올 반응성 에디티브를 첨가함을 통해, 생성물인 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율을 높이기 위한 방법에 관한 것이기 때문이다.
FcBP에 대해 상세히 설명하는 추가의 문헌:
(1) 미국 특허출원 출원번호 10/149835, 등록번호 US 7608681 B2;
(2) 미국 특허출원 출원번호 15/575138, 등록번호 US US 10227383 B2;
(3) DeLano, Warren L., et al. "Convergent solutions to binding at a protein-protein interface." Science 287.5456 (2000): 1279-1283.;
(4) Sockolosky, Jonathan T., Saul Kivimae, and Francis C. Szoka. "Fusion of a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant protein substantially increases its plasma half-life in mice." PLoS One 9.7 (2014): e102566.;
(5) Yue Zeng. et al. “A Traceless Site-Specific Conjugation on Native Antibodies Enables Efficient One-Step Payload Assembly.” Angewandte Chemie (2022): e202204132.;
(6) Viktoriia Postupalenko., et al. “Template directed synthesis of antibody Fc Conjugates with concomitant ligand release.” Chemical Science 13 (2022): 3965-3976.;
(7) Cao, Yu J., et al. “Synthesis of precision antibody conjugates using proximity-induced chemistry” Theraostics 11.18 (2021): 9107-9117.;
(8) Muguruma, Kyohei., et al. “Novel Hybrid Compound of a Plinabulin Prodrug with an IgG Binding Peptide for Generating a Tumor Selective Noncovalent-Type Antibody-Drug Conjugate” Bioconjugate Chemistry 27.7 (2016): 1606-1613.; 및
(9) Park, Jisoo., at al. “Peptide-directed photocrosslinking for site-specific conjugation of IgG” Bioconjugate Chemistry 29.10 (2018): 3240-3244..
FcBP에는 통상적으로 펩타이드나 단백질에 부가되는 변형이 부가될 수 있다. 변형된 FcBP는 관련 기술분야에서 펩타이드 또는 단백질에 대해 통상적으로 수행되는 변형이 부가된 FcBP를 지칭한다. 일부 연구에서는 변형된 FcBP가 사용되었다. 예를 들어, 변형은 지방산 기의 접합, 히드록실 기의 부가, C 말단의 아미데이션, N 말단의 아세틸레이션, 페길레이션 (예를 들어, C 말단 및/또는 N 말단에 PEG 모이어티의 접합), 및/또는 링커 등의 부가를 포함할 수 있다. 예를 들어, PEG 모이어티는 2개 내지 40개의 에틸렌글리콜 유닛을 포함할 수 있다.
종래의 항체에 위치 선택적으로 기능성 그룹을 전달하기 위한 방법의 개괄
Fc-결합성 펩타이드를 이용한 항체에 기능성 그룹의 위치-특이적 전달은 Fc-결합성 펩타이드를 포함하는 화합물을 통해 달성된다. 종래에 연구된, Fc-결합성 펩타이드를 이용한, 항체에 기능성 그룹의 위치-특이적 전달에는 두가지 케이스가 존재하는데, 이들은 다음과 같다:
(Case 1) Fc-결합성 펩타이드를 포함하는 화합물과 항체와의 반응을 통해, Fc-결합성 펩타이드와 함께 기능성 그룹이 항체로 전달됨.
(Case 2) Fc-결합성 펩타이드를 포함하는 화합물과 항체와의 반응을 통해, Fc-결합성 펩타이드 없이 기능성 그룹이 항체로 전달됨.
위 'Case 1'은 문헌 [유럽 특허출원 출원번호 18791007.0, 공개번호 EP 3617235; 및 PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/001145, 공개번호 WO2020/153774]에서 상세히 설명된다. 전술한 'Case 2' 문헌 [유럽 특허출원 출원번호 19818561.3, 공개번호 EP 3811978; 및 PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944]에서 상세히 설명된다. 위 Case 1의 경우와 같이, 항체에 FcBP가 잔류하는 경우에는, 컨쥬게이트로부터 FcBP를 제거하는 과정이 추가적으로 요구될 수 있다. 항체에 접합되어 있는 FcBP는 항체의 반감기에 좋지 않은 영향을 미치기 때문이다.
위 두가지 케이스 중, Case 2는 Fc 결합성 펩타이드가 반응과정에서 이탈되고, 기능성 그룹만이 항체로 전달되는 반응을 기초로 하기 때문에, Case 2의 반응 매커니즘을 통해 제조된 항체-약물 컨쥬게이트는 (Case 1과 달리) 반감기가 감소하지 않거나 또는 FcBP를 제거하는 추가적 공정이 필요하지 않다. Case 2는 항체에 기능성 그룹의 전달을 하나의 단계를 통해 달성 가능하도록 한다. 즉, one-step 반응으로 항체에 생체직교적 작용기와 같은 기능성 그룹을 전달할 수 있도록 한다. FcBP가 반응을 통해 이탈되는 Case 2의 반응 매커니즘을 이용한 컨쥬게이션은 트래이스리스 가교 (Traceless cross-linking), 트래이스리스 반응 (traceless reaction), 또는 트래이스리스 컨쥬게이션 등으로 지칭된다 (문헌 [Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody.; 및 A Traceless Site-Specific Conjugation on Native Antibodies Enables Efficient One-Step Payload Assembly.] 참조).
종래의 항체에 위치 선택적으로 기능성 그룹을 전달하기 위한 방법에 사용되는 요소
전술한 바와 같이, 항체에 위치 선택적으로 기능성 그룹을 전달하기 위해서는 적어도 하기의 두가지 요소가 요구된다:
(1) FcBP 및 전달을 목적으로 하는 기능성 그룹을 포함하는, 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물; 및
(2) 항체.
이때 상기 FcBP를 포함하는 화합물은 항체의 반응성 그룹 (예를 들어, -NH2와 같은 친핵체)과의 반응 자리를 갖는다. 이때, 반응 자리는 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 내에서 FcBP와 전달을 목적으로 하는 기능성 그룹 사이에 위치한다. 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체와의 반응은, 보다 구체적으로, 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 내의 반응 자리와 상기 항체의 친핵체의 반응으로 설명될 수 있으며, 상기 반응과 동시에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 내의 FcBP는 이탈되고 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 내의 기능성 그룹은 항체의 특정 위치로 전달된다. 상기 항체의 특정 위치와 연관되는 항체의 친핵체는 Fc 도메인 내에 위치한다. 예를 들어, 항체의 친핵체는 전술한 표지 위치에 존재할 수 있으며, 예를 들어, 표지 위치는 Fc 도메인 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 표지 위치는 Fc 도메인 내에 위치하는 라이신 잔기일 수 있다. 예를 들어, 표지 위치는 K246, K248, K274, K288, K290, K317, K320, K322, K338, K360, K414, 및 K439 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 항체의 미리 결정된 표지 위치(Fc 도메인 내에 위치함)로 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물에 포함된 FcBP에 의해 유도된다. 이러한 FcBP에 의한 유도는 상기 표지 위치의 친핵체와 상기 친핵체와 반응할 수 있도록 디자인된 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물에 포함된 반응 자리가 반응할 수 있도록 하여, 표지 위치에 기능성 그룹의 전달을 달성 가능하도록 한다.
항체에 위치-특이적으로 기능성 그룹을 전달하기 위한 방법은 전술한 문헌들에서 상세히 설명된다. 이하에서는, 문헌 [PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944; Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody.; 및 A Traceless Site-Specific Conjugation on Native Antibodies Enables Efficient One-Step Payload Assembly. 등]에서 상세히 설명하고 있는, 티오에스터 그룹을 포함하는 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 이용한 위치-특이적 컨쥬게이션 방법에 대하여 상세히 설명한다.
종래의 항체에 위치선택적으로 기능성 그룹을 전달하기 위한 방법의 예시 - 티오에스터 그룹을 포함하는 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 사용
상기 문헌들에서는 항체의 친핵체와의 반응 자리로 디자인된 티오에스터 그룹을 포함하는 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 개시된다. 상기 티오에스터 그룹 또는 이를 포함하는 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 아실 그룹의 도너 (donor)로써 작용하고, 항체의 친핵체 (예를 들어, -NH2)와의 반응을 통해 아실 그룹을 항체의 친핵체로 전달한다. 여기서, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물에 포함된 FcBP는 전술한 바와 같이, 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 항체의 Fc 도메인으로 가이드하는 역할을 한다. 나아가, FcBP는 항체의 특정 위치(예를 들어, K246 및/또는 K248)의 아마이드 그룹과, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물에 포함된 티오에스터 그룹이 반응할 수 있도록 상기 두 요소를 충분히 가까이 위치하도록 한다.
이하에서는, 기능성 그룹을 포함하는 항체를 제조하기 위해 항체와 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 예시한다. 이하의 예시는 문헌 [PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944]에 설명된 내용을 기초로 기재된 것이다.
[Reaction scheme 1]
Figure pct00009
상기 반응 스캠 (Reaction scheme) 1은 항체와 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 도시한 것이다. 여기서, 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 (즉, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물)은 도시된 바와 같이, (1) 기능성 그룹을 포함하는 기능성 유닛 (Functional unit; FU), (2) FcBP를 포함하는 펩타이드 유닛 (Peptide unit; PU), 및 (3) 티오에스터 그룹 (-C(=O)S-)를 포함한다. 항체의 친핵성 그룹인 아마이드 그룹과 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 티오에스터 그룹이 반응하여, 티오에스터그룹의 아실 그룹이 항체의 친핵성 그룹으로 전달된다. 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 통해, 기능성 그룹을 포함하는 항체 및 부산물 (티올-함유 화합물)이 생성된다. 반응에 참여하는 화합물과 항체의 반응은 도 02를 통해 보다 구체적으로 설명된다 (문헌 [Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody.] 참조).
도 02에 도시된 바와 같이, 티오에스터 그룹을 이용한 S에서 N으로의 아실 트랜스퍼(S to N acyl transfer)에 의해 기능성 그룹인 생체직교적 작용기 (노르보르넨)이 항체의 특정한 위치 (K248)로 전달된다. 결과적으로, 항체의 두개의 중쇄에 위치한 각각의 표적 위치 (예를 들어, 각각의 K248)에 생체직교적 화학 그룹이 각각 전달된다.
이처럼, 티오에스터 그룹 및 FcBP를 포함하는 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 이용하는 경우, 위치-선택적으로 기능성 그룹을 항체에 전달할 수 있다. 티오에스터 그룹의 사용은 유사한 기능을 갖는 다른 반응 그룹 (예를 들어, NHS ester)를 사용하는 경우보다 위치 선택성이 높을 뿐만 아니라, 생리적 조건에서 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 (예를 들어, 약 pH 7.4의 조건) 가능하게 한다.
그러나, 높은 위치 선택성을 담보하는 위 반응 매커니즘에서 문제점이 발견되었다. 이하에서, 본 출원의 발명자들이 발견한 문제점과 이를 해결하기 위해 본 출원을 통해 제공되는 발명에 대하여 상세히 설명한다.
티오에스터 그룹을 포함하는, 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 사용하는 경우 발생하는 문제 - 새로이 발견된 문제
문제점의 발견
본 출원의 발명자들은 티오에스터 그룹을 이용하여 항체에 위치-특이적으로 기능성 그룹을 전달하기 위해 사용되는 전술한 반응을 이용하는 경우, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율이 보다 낮다는 문제를 발견하였다. 여기서, 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응의 최종 생성물은 두개의 기능성 그룹을 포함하는 항체 (이때, 상기 항체는 두개의 중쇄를 포함하고 있고, 이에 따라 두개의 표지 위치가 제공되므로, 각각의 모든 표지 위치에 기능성 그룹이 연결되는 경우 두개의 기능성 그룹을 포함하는 항체가 제조된다)이거나 또는 하나의 기능성 그룹을 포함하는 항체 (이때, 상기 항체는 두개의 중쇄를 포함하고 있고, 이 중 하나의 중쇄에 위치한 표지 위치에 기능성 그룹이 연결되는 경우 하나의 기능성 그룹을 포함하는 항체가 제조된다)일 수 있다. 여기서, 항체에 연결된 기능성 그룹의 개수를 나타내기 위해, 항체-약물 컨쥬게이트에서와 유사하게, FAR (Functional group-to-Antibody ratio)의 파라미터가 사용될 수 있다. 항체-약물 컨쥬게이트 분야에서는 항체에 연결된 약물의 개수를 DAR (Drug-to-Antibody ratio)의 파라미터가 사용된다. 예를 들어, DAR2 ADC는, 항체에 2개의 약물이 연결되어있는 ADC를 나타낸다. 이와 유사하게, FAR 2는 2개의 기능성 그룹이 항체에 연결되어 있음을 나타내고, FAR 1은 1개의 기능성 그룹이 항체에 연결되어 있음을 나타낸다. 즉, 두개의 기능성 그룹을 포함하는 항체는 FAR 2 항체로 지칭될 수 있고, 하나의 기능성 그룹을 포함하는 항체는 FAR 1 항체로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 도 02에서는 최종적으로 두개의 기능성 그룹(노르보르넨)을 포함하는 항체가 생성되었음이 도시되는데, 이는 FAR 2 항체가 생성된 것으로 이해될 수 있다. 기능성 그룹에 대해서는 달리 제한되지 않으며, 기능성 그룹은 하나 또는 복수의 생체직교적 화학 그룹 또는 하나 또는 복수의 약물을 포함하도록 디자인될 수 있기 때문에, FAR 2 항체의 예시는 DAR 1, DAR 2, DAR 3, DAR 4, DAR 5, DAR 6, DAR 7, 및 DAR 8 항체-약물 컨쥬게이트 (Antibody-Drug conjugate; ADC) 등의 태양을 포괄한다.
반응 스캠 1과 도 02를 참고하면, 티오에스터 그룹을 포함하는 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체와의 반응에 의해 (1) 기능성 그룹을 포함하는 항체 및 (2) 부산물이 생성됨을 알 수 있다. 상기 생성된 부산물은 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 저해하지 않을 것으로 예측되었다.
그러나, 본 출원의 발명자들은 티오에스터 그룹을 이용한 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 반응의 수율 (여기서, 수율은 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율을 나타냄)이 보다 낮고 반응 속도가 충분하지 않다는 문제점을 새로이 발견하였다.
나아가, 본 출원의 발명자들은 이러한 수율 또는 반응 속도가 낮은 문제가 생성된 부산물에 의한 것임을 발견하였다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 본 출원은 부산물의 티올기를 티올 반응성 에디티브로 캡핑하는 것을 특징으로 하는 발명을 제공한다.
문제의 원인의 탐구
전술한 바와 같이, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율 또는 이를 제조하기 위한 반응의 반응 속도가 보다 낮은 문제가 발견되었다. 제조 수율이 낮은 문제를 유발하는 원인은 다양할 수 있다. 예를 들어, 애초에 반응 속도가 빠르지 못하거나, 반응 조건이 적절하지 않거나, 반응 물질의 농도가 적절하지 않거나, 또는 반응에 의해 생성된 물질이 반응을 방해함 등이 원인이 되어 제조 수율에 영향을 미칠 수 있다.
전술한 바와 같이, 처음에는, 상기 생성된 부산물은 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 저해하지 않을 것으로 예측되었다.
또한, 상기 부산물은 도시된 바와 같이, 말단에 자유 티올 그룹을 포함한다. 일반적인 항체에는 티올과 반응할 수 있는 그룹이 존재하지 않기 때문에, 상기 부산물이 아직 반응하지 않은 항체와 아직 반응하지 않은 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 방해하지 않을 것이라고 예측되었다.
따라서, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율이 낮은 문제의 원인에 대해서 쉽게 예측하기 어려웠다.
결과적으로, 본 출원의 발명자들은 부산물의 티올 그룹을 티올 반응성 에디티브를 통해 캡핑함으로써 (즉, 티올 그룹을 제거함으로써), 상기 반응에서 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율 또는 제조 속도를 높일 수 있었다. 본 출원에 개시된 실험의 결과로부터 역으로 추측한 결과 본 출원의 발명자들은, 부산물이 제조 수율에 부정적인 영향을 미치는 요소임을 알게 되었다. 실험 결과를 통해 역으로 예측된 부산물의 반응 저해 매커니즘을 이하에서 설명한다.
부산물의 반응 저해 매커니즘
하기의 예시를 통해, 부산물의, 항체와 기능성 그룹 항체에 대한 제1 화학작용기 전달용 제제의 반응 저해 매커니즘을 기술한다. 이는 본 출원의 이해를 돕기 위한 것인 바, 본 출원의 권리범위가 하기의 예시들에 의해 제한되는 것은 아니다. 상기 부산물의 반응 저해 매커니즘을 보다 쉽게 이해하기 위하여 반응 저해에 대해 예시적으로 도시한 도 03 및 도 04가 참고될 수 있다. 도 03은 생성된 부산물이 반응하지 않은 항체와 반응하지 않은 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 저해함을 설명하는 도면이다. 도 04는 생성된 부산물이 FAR 1의 기능성 그룹을 포함하는 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 저해함을 설명하는 도면이다.
생성된 부산물은 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응에서, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 경쟁 물질로 작용할 수 있다.
일 예로, 부산물은 상기 부산물에 포함된 FcBP에 의하여, 항체의 Fc 도메인의, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 반응하는 반응 자리에 위치할 수 있다. 나아가, 부산물의 티올기는 항체의 반응 자리의 친핵체와 화학적으로 작용할 수 있고, 이때 상기 부산물은 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체의 반응을 저해할 수 있다.
예를 들어, 부산물은 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체가 반응하는 반응 자리에 위치할 수 있고, 이때 부산물의 티올기가 항체의 친핵체 와 화학적으로 작용할 수 있고, 이때 부산물은 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체의 반응을 저해할 수 있다. 예를 들어, 항체의 친핵체는 아미노그룹일 수 있다. 이때, 부산물의 티올기와 항체의 아미노 그룹 사이의 화학적 작용은 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)일 수 있다. 예를 들어, 상기 정전기적 상호작용은 수소결합일 수 있다. 이때, 상기 항체의 아미노 그룹은 상기 항체의 Fc 도메인에 포함된 라이신의 아미노 그룹일 수 있다. 이때, 상기 항체의 아미노 그룹은 항체의 Fc 도메인에 위치하는 246번 라이신, 248번 라이신, 274번 라이신, 288번 라이신, 290번 라이신, 317번 라이신, 320번 라이신, 322번 라이신, 338번 라이신, 360번 라이신, 414번 라이신, 및 439번 라이신 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노 그룹일 수 있다.
예를 들어, 부산물은 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체가 반응하는 반응 자리에 위치할 수 있고, 이때 부산물의 티올기가 항체의 아미노 그룹과 화학적으로 작용할 수 있고, 이때 부산물은 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체의 반응을 저해할 수 있다. 예를 들어, 부산물의 티올기의 H와 아미노 그룹의 N이 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)을 할 수 있거나, 또는 부산물의 티올기의 S와 아미노 그룹의 H가 정전기적 상호작용할 수 있다. 이때, 상기 정전기적 상호작용은 수소결합일 수 있다.
기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 과정에서 부산물이 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체의 반응을 저해하는 경우, 목적하는 양의 기능성 그룹을 포함하는 항체 (FAR 1 또는 FAR 2)가 수득되지 않거나, 목적하는 양의 기능성 그룹을 포함하는 항체를 수득하기 위해서 보다 많은 시간이 소요될 수 있다.
본 출원의 발명자들은, 부산물의 티올기를 제거하는 방법을 통해, 목적하는 양의 기능성 그룹을 포함하는 항체가 수득되지 않는 문제 또는 목적하는 양의 기능성 그룹을 포함하는 항체를 수득하기 위해 보다 많은 시간이 소요되는 문제를 해결하였다. 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 과정에서, 반응을 저해하는 부산물이 제거되는 경우, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율이 증가되는 것으로 이해될 수 있다.
상기 기술된 문제를 해결하기 위하여, 본 출원은 티올 반응성 에디티브를 추가적으로 사용하는, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 방법을 제공한다. 티올 반응성 에디티브를 통해 티올-함유 부산물을 제거함으로써, 티올-함유 부산물이 원인이 되는 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체의 반응 저해에 대한 문제를 해결할 수 있다. 티올 반응성 에디티브는 티올-함유 부산물의 티올기와 반응하여 티올기를 캡핑한다. 티올기가 캡핑된 부산물은 티올-함유 부산물과의 혼동을 방지하기 위해 제2 부산물로 지칭될 수 있으며, 제2 부산물과 티올-함유 부산물이 함께 기술될 때에는, 티올-함유 부산물은 제1 부산물로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 제1 부산물과 티올 반응성 에디티브가 반응하여 생성된 제2 부산물은 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체의 반응을 저해하지 않을 수 있다. 왜냐하면, 제1 부산물의 반응 저해의 원인이 되는 티올기가 제거되었기 때문이다. 결국, 생성된 제2 부산물은, 기능성 그룹을 포함하는 항체 (FAR 1 또는 FAR 2)의 제조 과정에서, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체의 반응을 저해하지 않고, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율에 영향을 미치지 않을 수 있다. 티올 그룹에 새로운 그룹이 부가되는 것은 (예를 들어, 티올 그룹의 캡핑) 티올 그룹과 항체의 친핵체의 작용을 방지하는 것 뿐만 아니라, FcBP를 포함하는 부산물의 항체의 Fc 도메인과의 결합 친화성 또한 감소시키는 것으로 추측된다.
본 출원에서 제공되는 방법의 주요한 특징은, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체의 반응을 저해하는 티올-함유 부산물을 제거함을 통해, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 것에 있다.
이하에서, 본 출원에서 제공되는 티올 반응성 에디티브를 사용하여 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율을 높이기 위한 방법이 상세히 설명된다.
티올 반응성 에디티브를 사용하여 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 방법 개괄
전술한 바와 같이, 본 출원의 발명자들은 티올 반응성 에디티브를 사용하여 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 방법을 개발하였다. 티올 반응성 에디티브를 사용하여 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 방법에는 하기의 세가지 요소가 필수적으로 관여된다:
(1) 티올 반응성 에디티브;
(2) 항체; 및
(3) 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물.
이들 세가지 요소 중 항체와 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 관여되는, 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 이용하여 항체의 특정한 위치에 기능성 그룹을 전달하는 방법에 대해서는 종래에 상세히 연구되었으며, [유럽 특허출원 출원번호 19818561.3, 공개번호 EP 3811978; PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944; Lee, TaeJin, et al. "Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody." Journal of Medicinal Chemistry 65.7 (2022): 5751-5759.; 및 Zeng, Yue, et al. "A Traceless Site-Specific Conjugation on Native Antibodies Enables Efficient One-Step Payload Assembly." Angewandte Chemie International Edition 61.36 (2022): e202204132.]의 문헌들에서 상세히 설명된다.
티올 반응성 에디티브를 사용하여 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 방법의 사용은 티오에스터 그룹을 포함하는 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 사용에 한정된다. 티오에스터 그룹을 포함하는 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 항체와 반응하여 티올-함유 부산물을 생성하고, 티올-함유 부산물의 반응 저해 효과를 제거하기 위해 티올 반응성 에디티브가 사용되기 때문이다. 티올 반응성 에디티브는 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응 전에 조성물 내에 미리 존재할 수 있다. 티올 반응성 에디티브는 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응 후에 조성물 내로 첨가될 수 있다. 이처럼, 티올 반응성 에디티브가 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응에 관여하는 것이 보다 중요하며, 티올 반응성 에디티브의 첨가 시점 또는 반응 관여 시점은 달리 제한되지 않는다.
이하에서, 티올 반응성 에디티브를 사용하여 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이기 위한 방법에서 사용되는 세가지 요소 중, 종래에 연구된 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 및 항체, 그리고 이를 이용한 기능성 그룹을 포함하는 항체를 제조하기 위한 방법에 대해 상세히 설명한다.
항체에 위치 선택적으로 기능성 그룹을 전달하는 방법에 사용되는 요소 1 - 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물
항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 (Compound for transferring functional group to antibody) 개괄
전술한 바와 같이, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 티오에스터 그룹을 포함한다. 나아가, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 Fc-결합성 펩타이드 (Fc-binding peptide; FcBP)를 포함한다. 나아가, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 항체에 전달될 기능성 그룹을 포함한다. 즉, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 다음 세가지 요소를 필수로 포함한다: 티오에스터 그룹; FcBP; 및 기능성 그룹.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 하기의 화학식 (formula) 01의 구조를 갖는 화합물일 수 있다:
[화학식 01]
FU-RU-PU.
이때, FU는 기능성 그룹(functional group)을 포함하는 기능성 유닛 (Functional Unit; FU)이다. 기능성 그룹은 예를 들어, 하나 이상의 생체직교적 화학 그룹, 및 하나 이상의 활성 모이어티 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 이때 기능성 그룹에 포함되는 각각의 생체직교적 화학 그룹 또는 각각의 활성 모이어티는 독립적으로 선택될 수 있다. 생체직교적 화학 그룹 또는 활성 모이어티는 이하에서 상세하게 설명된다.
이때, RU는 티오에스터 그룹을 포함하는 반응성 유닛 (Reactive Unit)이다. 반응성 유닛은 항체의 친핵체와의 반응을 위해 디자인된 티오에스터 그룹을 포함한다. 전술한 바와 같이, 항체의 친핵체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 티오에스터 그룹의 반응을 통해, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 S 원자에 연결된 아실 그룹이 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물에서 항체로 전달된다.
이때, PU는 FcBP를 포함하는 펩티드 유닛(Peptide Unit; PU)이다. 펩티드 유닛과 FcBP는 이하에서 상세히 설명된다.
반응성 유닛과 티오에스터 그룹
전술한 바와 같이, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 티오에스터 그룹을 포함하는 반응성 유닛(Reactive Unit; RU)을 포함한다. 반응성 유닛은 항체와의 반응을 위한 반응성 유닛일 수 있다.
티오에스터(thioester) 그룹은 -C(=O)S- 또는 -SC(=O)-의 구조로 표현되거나, 또는
Figure pct00010
, 또는
Figure pct00011
의 구조로 표현될 수 있다. 여기서, 물결은 티오에스터 그룹이 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 다른 부분과 연결되어 있음을 나타낸다. 특정한 실시양태에서, 티오에스터 그룹은 구조
Figure pct00012
로 표현될 수 있고, 이때 1'는 기능성 유닛 측에 연결된 부분을, 2'는 펩타이드 유닛 측에 연결된 부분을 나타낼 수 있다. 즉, 티오에스터 그룹의 카르보닐기 (-C(=O)-)는 기능성 유닛에 보다 가깝게 위치하며, 티오에스터 그룹의 -S-는 펩타이드 유닛에 보다 가깝게 위치한다. 이와 같이 디자인되는 이유는, 항체의 친핵체 (예를 들어, -NH2)와 티오에스터 그룹의 반응을 통해 아실 그룹이 항체로 전달되도록 하기 위해서이다. 여기서, 아실 그룹은 티오에스터 그룹의 -C(=O)-와 기능성 유닛을 포함하는 그룹을 지칭하는 것으로 사용되며, 아실 그룹은 상기 티오에스터 그룹의 -S-를 포함하지 않는다. 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 항체의 아미노 그룹과 반응하면, 아실 그룹이 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물로부터 항체의 아미노그룹으로 전달되고, 이는 S에서 N으로의 아실 트랜스퍼(S to N acyl transfer)로 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 반응성 유닛은 티오에스터 그룹 외에도 링커 그룹을 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커 그룹은 FcBP를 포함하는 펩타이드 유닛과 티오에스터 그룹의 거리 조절을 위해 디자인될 수 있다. 다른 예로, 링커 그룹은 기능성 그룹을 포함하는 기능성 유닛과 티오에스터 그룹의 거리 조절을 위해 디자인될 수 있다. 예를 들어, 링커 그룹의 길이는 주사슬의 원자 수를 기준으로 1 내지 50일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 링커 그룹의 길이는 주사슬의 원자 수를 기준으로 1 내지 10일 수 있다. 링커 그룹은 주사슬에 하나 이상의 독립적으로 선택된 헤테로원자 및 하나 이상의 독립적으로 선택된 고리형 그룹 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 달리 제한되지 않는다. 나아가, 링커 그룹은 하나 이상의 독립적으로 선택된 치환기를 포함할 수 있으며, 달리 제한되지 않는다. 이때, 고리형의 그룹이 주사슬에 존재하는 경우 주사슬의 원자의 개수의 카운팅은, 편의상, 고리 상의 고리가 아닌 다른 부분과 결합을 형성하는 두 원자를 기준으로 카운팅될 수 있으며, 이때의 카운팅은 가장 적은수가 달성될 수 있는 방향으로 카운팅된다. 예를 들어,
Figure pct00013
의 고리가 링커 그룹의 주사슬에 존재하는 경우, 상기 고리에 의해 카운팅되는 주사슬의 원자의 수는 3개이다. 예를 들어,
Figure pct00014
의 고리가 링커 그룹의 주사슬에 존재하는 경우, 상기 고리에 의해 카운팅되는 주사슬의 원자의 수는 5개이다.
일부 실시양태에서, 반응성 유닛은 다음의 구조를 가질 수 있다:
-D1-X-D2-.
이때, X는 티오에스터 그룹이다. X는 D1을 통해 기능성 유닛 또는 펩타이드 유닛과 연결될 수 있다. X는 D2를 통해 기능성 유닛 또는 펩타이드 유닛과 연결될 수 있다.
이때, D1은 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-20 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-20 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알키닐렌, 또는 치환된 또는 비치환된 아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 예를 들어, 치환기는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. D1이 결합(bond)인 경우, X는 기능성 유닛 또는 펩타이드 유닛과 직접적으로 연결된다.
여기서, D2는 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-20 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-20 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 예를 들어, 치환기는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. D2가 결합(bond)인 경우, X는 기능성 유닛 또는 펩타이드 유닛과 직접적으로 연결된다.
특정한 실시양태에서, D1은 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-6 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 이때 치환기는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -NO2, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다.
특정한 실시양태에서, D2는 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-6 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 이때 치환기는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -NO2, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 반응성 유닛은 다음의 구조를 가질 수 있다:
-D11-D12-D13-X-D21-D22-D23-.
이때, X는 티오에스터 그룹이다. X는 -D11-D12-D13-을 통해 기능성 유닛 또는 펩타이드 유닛과 연결될 수 있다. X는 -D21-D22-D23-를 통해 기능성 유닛 또는 펩타이드 유닛과 연결될 수 있다.
여기서, D11, D12, 및 D13는, 각각 독립적으로, 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-20 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-20 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알키닐렌, 또는 치환된 또는 비치환된 아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 예를 들어, 치환기는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. D11, D12, 및 D13가 모두 결합(bond)인 경우, X는 기능성 유닛 또는 펩타이드 유닛과 직접적으로 연결된다.
여기서, D21, D22, 및 D23는, 각각 독립적으로, 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-20 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-20 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 예를 들어, 치환기는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. D21, D22, 및 D23 모두가 결합(bond)인 경우, X는 기능성 유닛 또는 펩타이드 유닛과 직접적으로 연결된다.
특정한 실시양태에서, D11, D12, 및 D13는, 각각 독립적으로, 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-6 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 이때 치환기는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다.
특정한 실시양태에서, D21, D22, 및 D23는, 각각 독립적으로, 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-6 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 이때 치환기는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -NO2, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다.
티오에스터 그룹과 항체의 특정 위치의 친핵체의 적절한 반응을 위해서는, 티오에스터 그룹과 FcBP 사이의 거리가 적절히 디자인될 필요가 있다. FcBP가 티오에스터 그룹을 항체의 상기 친핵체의 근처로 유도하기 때문이다. 특정한 실시양태에서, X는 -D11-D12-D13-을 통해 기능성 유닛과 연결되고, -D21-D22-D23-을 통해 펩타이드 유닛과 연결될 수 있다. 이때, D11, D12-, 및 D13 모두는 결합일 수 있다. 이때, D21, D22, 및 D23 은 각각 독립적으로 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-6 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 이때 치환기는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -NO2, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. 이때, -D21-D22-D23-의 길이는 주사슬의 원자 수를 기준으로 0 내지 10일 수 있다. 이때, X는 -C(=O)S-일 수 있으며, S는 -D21-D22-D23-와 연결되고, 카보닐 그룹 (C(=O))는 -D11-D12-D13-와 연결될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 반응성 유닛은 하기의 구조 중 선택되는 어느 하나의 구조를 가질 수 있으나 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00015
Figure pct00016
여기서, a는 0 내지 5의 정수이다.
여기서, b는 0 내지 5의 정수이다.
여기서, 1'은 기능성 유닛과 연결되는 부분을 나타내고, 2'는 펩타이드 유닛과 연결되는 부분을 나타낸다.
기능성 유닛과 기능성 그룹
전술한 바와 같이, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 기능성 그룹을 포함하는 기능성 유닛(Functional Unit; FU)을 포함한다. 기능성 그룹은 하나 이상의 기능을 갖는 그룹을 지칭하는 것으로 사용되며, 달리 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 기능성 그룹은 생체직교적 작용기 또는 클릭화학작용기와 같은 다른 화학적 반응기와 반응하도록 디자인된 반응기 및/또는 활성 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹은 생체직교적 작용기를 포함할 수 있다. 생체직교적 작용기는 생체직교적 화학 반응에 참여하는 화학적 작용기 또는 그룹을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 생체직교적 작용기는 스타우딩어 라이게이션(Staudinger Ligation), 구리-촉매화 아자이드-알킨 사이클로에디션 (Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition; CuAAC), 변형-촉진된 아자이드-알킨 사이클로에디션 (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition; SPAAC)을 포함하는 구리가 없는 아자이드-알킨 사이클로에디션 (Copper-Free Azide-Alkyne Cycloaddition), 테트라진 라이게이션 (Tetrazine Ligation), 테트라졸 라이게이션 (Tetrazole Ligation), 옥심 라이게이션 (Oxime Ligation), 및 이소시아나이드 클릭 반응 (Isocyanide Click Reaction) 중 선택되는 어느 하나의 생체직교적 반응에 참여하는 그룹일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체직교적 작용기는 아자이드, 말단 알킨, 사이클로 알킨 (예를 들어, 시클로옥틴), 테트라진, 노르보르넨, 사이클로 알켄 (예를 들어, 시클로옥텐), 테트라졸, 옥심, 및 이소시아나이드 그룹 중에 선택되는 어느 하나일 수 있다. 기능성 그룹은 하나 이상의 생체직교적 작용기를 포함할 수 있으며, 복수의 생체직교적 작용기가 기능성 그룹에 포함되는 경우, 각각의 생체직교적 작용기는 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹은 활성 모이어티를 포함할 수 있다. 활성 모이어티는 예를 들어, 약물 (예를 들어, 독소), 이미징 모이어티(예를 들어, 형광염료, GFP와 같은 형광 단백질, 루시페린과 같은 발광 물질), 방사성 동위원소와 결합하도록 디자인된 방사성동위원소에 대한 리간드, 방사성 동위원소, 특정한 기능을 갖는 단백질, 특정한 기능을 갖는 펩타이드, 친화성 물질 (예를 들어, 비오틴, 스트렙타비딘, 및 압타머 등), 안정화 물질, 비타민, DNA 분자, 및 PEG (polyethylene glycol) 모이어티 같은 친수성 모이어티 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 기능성 그룹은 하나 이상의 활성 모이어티를 포함할 수 있고, 기능성 그룹이 복수의 활성 모이어티를 포함하는 경우, 각각의 활성 모이어티는 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 활성 모이어티는 약물일 수 있다. 약물은 예를 들어, 아우리스타틴(auristatin), 에리불린(eribulin), 튜불리신(tubulysin), 젤다나마이신(geldanamycin) (Kerr et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8(6):781-784), 메이탄시노이드(maytansinoid) (EP 1391213, ACR 2008, 41, 98-107), 칼리케마이신(calicheamicin) (U.S. Patent Publication No. 2009/0105461, Cancer Res. 1993, 53, 3336-3342), 메르탄신(Mertansine), 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 빈데신(vindesine), SG2285 (Cancer Res. 2010, 70(17), 6849-6858), 돌라스타틴(dolastatin), 돌라스타틴 아날로그 아우리 스타틴(dolastatin analogs auristatin) (U.S. Patent No. 5,635,483), 크립토피신(cryptophycin), 캄토테신(camptothecin), 리족신 유도체(rhizoxin derivative), CC 1065 아날로그 또는 유도체, 듀오카마이신(duocarmycin), 에네디인 항생제(enediyne antibiotic), 에스페라마이신(esperamicin), 에포틸론(epothilone), 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepine, PBD) 유도체, α-아마니틴(a-amanitin), 톡소이드, TLR5 (toll-like receptor 5) agonist TLR7 (toll-like receptor 7) agonist, TLR8 (toll-like receptor 8) agonist, NOTA (1,4,7-Triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), 및 DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid) 중 선택되는 어느 하나이거나, 또는 이의 유사체일 수 있으나 달리 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 기능성 유닛은 기능성 그룹 외에도 하나 이상의 링커 그룹을 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커 그룹은 기능성 그룹과 반응성 유닛 사이의 거리의 조절을 위해 디자인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹은 생체직교적 화학 작용기 및/또는 활성 모이어티 외에도 하나 이상의 링커 그룹을 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커 그룹은 각각의 생체직교적 화학 작용기 및/또는 활성 모이어티의 배치나 거리 조절을 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기능성 유닛은 다음의 구조를 가질 수 있다:
FG-D3-
이때, FG는 기능성 그룹 (functional group; FG)이다. 기능성 그룹은 D3를 통해 티오에스터 그룹을 포함하는 반응성 유닛과 연결될 수 있다.
이때, D3는 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-20 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-20 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알키닐렌, 또는 치환된 또는 비치환된 아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 예를 들어, 치환기는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. D3이 결합(bond)인 경우, FG는 반응성 유닛과 직접적으로 연결된다.
특정한 실시양태에서, D3는 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-10 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-10 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-10 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-10 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-10 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-10 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-10 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 이때 치환기는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -NO2, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기능성 유닛은 다음의 구조를 가질 수 있다:
FG-D31-D32-D33-
이때, FG는 기능성 그룹 (functional group; FG)이다. 기능성 그룹은 -D31-D32-D33-를 통해 티오에스터 그룹을 포함하는 반응성 유닛과 연결될 수 있다.
이때 D31, D32, 및 D33는, 각각 독립적으로, 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-20 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-20 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알키닐렌, 또는 치환된 또는 비치환된 아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 예를 들어, 치환기는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. D31, D32, 및 D33가 모두 결합(bond)인 경우, FG는 반응성 유닛과 직접적으로 연결된다.
특정한 실시양태에서, D31, D32, 및 D33는, 각각 독립적으로, 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-6 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 이때 치환기는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다.
펩타이드 유닛과 FcBP
전술한 바와 같이, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 Fc-결합성 펩타이드(Fc-binding peptide; FcBP)를 포함하는 펩타이드 유닛 (Peptide Unit; PU)을 포함한다.
일부 실시양태에서, FcBP는 5 내지 50 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, FcBP는 5 내지 30 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, FcBP는 8 내지 20 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, FcBP는 11 내지 19 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다.
FcBP와 항체 또는 항체의 Fc 도메인의 결합 친화성은 해리상수 (dissociation constant, Kd)로 표현될 수 있다. 일부 실시양태에서, FcBP의 항체에 대한 Kd (dissociation constant)는 10μM, 1μM (1x10-6M), 900nM, 800nM, 700nM, 600nM, 500nM, 450nM, 400nM, 350nM, 300nM, 250nM, 200nM, 180nM, 160nM, 140nM, 120nM, 100nM, 90nM, 80nM, 70nM, 60nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10nM, 5nM, 1nM (1x10-9M), 0.5nM, 0.1nM, 0.05nM, 또는 0.01nM 이하이거나, 전술한 값 중 선택되는 임의의 두 값에 의해 설정되는 범위 내일 수 있다. 일부 실시양태에서, FcBP의 항체의 Fc 도메인에 대한 Kd (dissociation constant)는 10μM, 1μM (1x10-6M), 900nM, 800nM, 700nM, 600nM, 500nM, 450nM, 400nM, 350nM, 300nM, 250nM, 200nM, 180nM, 160nM, 140nM, 120nM, 100nM, 90nM, 80nM, 70nM, 60nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10nM, 5nM, 1nM (1x10-9M), 0.5nM, 0.1nM, 0.05nM, 또는 0.01nM 이하이거나, 전술한 값 중 선택되는 임의의 두 값에 의해 설정되는 범위 내일 수 있다.
일부 실시양태에서, FcBP에는 변형이 부가될 수 있다. 변형은 예를 들어, 지방산 기의 접합, 히드록실 기의 부가, C 말단의 아미데이션, N 말단의 아세틸레이션, 페길레이션 (예를 들어, C 말단 및/또는 N 말단에 PEG 모이어티의 접합), 및 링커의 부가 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 달리 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, FcBP는 하기의 아미노산 서열을 포함할 수 있다(문헌 [PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944] 참조):
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3 (서열번호 72 내지 서열번호 79),
이때,
각각의 Xaa는 독립적으로 시스테인이 아닌 임의의 아미노산이고,
Xa1은 시스테인, 류신, 디아미노프로피오닉산 (diaminopropionic acid; Dap), 디아미노뷰티릭산 (diaminobytyric acid; Dab), 오르니틴(ornithine; orn), 및 라이신 중에서 선택되고,
Xa2는 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xa3는 트립토판, 나프틸알라닌, 및 페닐알라닌으로부터 선택될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 13 이상 17 이하 개수의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 특정한 실시양태에서, N 말단으로부터 2 내지 4 아미노산만큼 떨어진 시스테인과 C 말단으로부터 2 내지 4 아미노산만큼 떨어진 시스테인은 선택적으로 서로 연결될 수 있다. 특정한 실시양태에서, X3는 NH2일 수 있다. 특정한 실시예에서, (Xaa)2는 AW일 수 있다. 특정한 실시예에서, Xa2는 글루탐산일 수 있다. 특정한 실시예에서, Xa3는 트립토판일 수 있다.
특정한 실시양태에서, FcBP는 하기의 아미노산 서열을 포함할 수 있다(문헌 [PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944] 참조):
D-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-T (서열번호 80).
이때,
각각의 Xaa는 독립적으로 시스테인이 아닌 임의의 아미노산이고,
Xa1은 시스테인, 류신, 디아미노프로피오닉산 (diaminopropionic acid; Dap), 디아미노뷰티릭산 (diaminobytyric acid; Dab), 오르니틴(ornithine; orn), 및 라이신 중에서 선택되고,
Xa2는 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xa3는 트립토판, 나프틸알라닌, 및 페닐알라닌으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, FcBP는 다음의 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나의 서열 또는 이와 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다:
RGNCAYHKGQIIWCTYH (서열번호 02); RGNCAYHKGQIVWCTYH (서열번호 03); RGNCAYHKGQVVWCTYH (서열번호 04); RGNCAYHKGQAVWCTYH (서열번호 05); RGNCAYHKGQLLWCTYH (서열번호 06); RGNCAYHKGQLIWCTYH (서열번호 07); DCAYHKGQIVWCT (서열번호 08); DCAYHKGQVVWCT (서열번호 09); DCAYHKGQAVWCT (서열번호 10); RGNCAYHKSQIIWCTYH (서열번호 11); RGNCAYHKNQIIWCTYH (서열번호 12); RGNCAYHKDQIIWCTYH (서열번호 13); RGNCAYHKQQIIWCTYH (서열번호 14); RGNCAYHKEQIIWCTYH (서열번호 15); RGNCAYHKFQIIWCTYH (서열번호 16); RGNCAYHKYQIIWCTYH (서열번호 17); RGNCAYHKWQIIWCTYH (서열번호 18); RGNCAYHKHQIIWCTYH (서열번호 19); RGNCAYHKTQIIWCTYH (서열번호 20); RGNCAYHKLQIIWCTYH (서열번호 21); CAYHKLQIVWC (서열번호 22); CAYHKLQLIWC (서열번호 23); CAYHKSQIVWC (서열번호 24); RGNCAYHKGQLVFCTYH (서열번호 25); RGNCAYHKGQQVWCTYH (서열번호 26); RGNCAYHKGQEVWCTYH (서열번호 27); CAYHKGQLVWC (서열번호 28); RGNCAYHKAQLVWCTYH (서열번호 29); RGNCAYHKVQLVWCTYH (서열번호 30); RGNCAYHKLQLVWCTYH (서열번호 31); RGNCAYHKIQLVWCTYH (서열번호 32); RGNCAYHKSQLVWCTYH (서열번호 33); RGNCAYHKTQLVWCTYH (서열번호 34); RGNCAYHKNQLVWCTYH (서열번호 35); RGNCAYHKDQLVWCTYH (서열번호 36); RGNCAYHKQQLVWCTYH (서열번호 37); RGNCAYHKEQLVWCTYH (서열번호 38); RGNCAYHKFQLVWCTYH (서열번호 39); RGNCAYHKRQLVWCTYH (서열번호 40); RGNCAYHKHQLVWCTYH (서열번호 41); RGNCAYHKWQLVWCTYH (서열번호 42); RGNCAYHKYQLVWCTYH (서열번호 43); RGNCAYFKGQLVWCTYH (서열번호 44); RGNCAYYKGQLVWCTYH (서열번호 45); RGNCAYWKGQLVWCTYH (서열번호 46); RGNCAYRKGQLVWCTYH (서열번호 47); RGNCAYGKGQLVWCTYH (서열번호 48); DCAYHKGQLVWC (서열번호 49); NCAYHKGQLVWC (서열번호 50); CAYHKGQLVWCT (서열번호 51); CAYHKSQLVWC (서열번호 52); GNCAYHKGQIIWCTYH (서열번호 53); RGNCAYHEGQIIWCTYH (서열번호 54); GPDCAYHRGELVWCTFH (서열번호 55) (문헌 [유럽 특허출원 출원번호 19818561.3, 공개번호 EP 3811978] 참조); DCAWHDapGELVWCT (서열번호 56) (Dap: Diaminopropionic acid); DCAWHDabGELVWCT (서열번호 57) (Dab: Diaminobutyric acid); DCAWHOrnGELVWCT (서열번호 58) (Orn: Ornithine); DCAWHKGELVWCT (서열번호 59); DCAWHLGELVWCT (서열번호 60) (문헌 [PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944; 및 Lee, TaeJin, et al. "Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody." Journal of Medicinal Chemistry 65.7 (2022): 5751-5759.] 참조); RGNCAYHRGKLVWCTYH (서열번호 61) (문헌 [Zeng, Yue, et al. "A Traceless Site-Specific Conjugation on Native Antibodies Enables Efficient One-Step Payload Assembly." Angewandte Chemie International Edition 61.36 (2022): e202204132.] 참조); RGNCAYHKGQLVWCTYH (서열번호 62); GPDCAYHDapGELVWCTFH (서열번호 63); GPDCAYHDabGELVWCTFH (서열번호 64); GPDCAYHOrnGELVWCTFH (서열번호 65); GPDCAYHKGELVWCTFH (서열번호 66); GPDCAYHRGDapLVWCTFH (서열번호 67); GPDCAYHRGDabLVWCTFH (서열번호 68); GPDCAYHRGOrnLVWCTFH (서열번호 69); 및 GPDCAYHRGKLVWCTFH (서열번호 70).
일부 실시양태에서, FcBP의 N 말단에 인접한 시스테인 잔기와 C 말단에 인접한 시스테인 잔기는 공유적으로 (예를 들어, 다이설파이드 본드를 통해) 연결되어 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, FcBP는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20번째 아미노산 잔기를 통해 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 다른 부분과 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩타이드 유닛은 FcBP 외에도 하나 이상의 링커 그룹을 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커 그룹은 FcBP와 반응성 유닛 사이의 거리 조절을 위해 디자인될 수 있다.
항체에 위치 선택적으로 기능성 그룹을 전달하는 방법에 사용되는 요소 2 - 항체
종래의 항체에 위치 선택적으로 기능성 그룹을 전달하는 방법에는 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 및 항체가 관여된다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체(humanized antibody)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 외의 동물 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 전장 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체의 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 야생형 항체 또는 조작된 항체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 IgG일 수 있다. 일부 실시양태에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 아달리무맙 (Adalimumab) (Humira), 리툭시맙 (Rituximab) (Rituxan), 트라스트주맙 (Trastuzumab) (Herceptin), 베바시주맙 (Bevacizumab) (Avastin), 인플리시맙 (Infliximab) (Remicade), 펨브로리주맙 (Pembrolizumab, Keytruda), 니볼루맙 (Nivolumab) (Opdivo), 에쿨리주맙 (Eculizumab) (Soliris), Alemtuzumab (Lemtrada, Campath), 다라투무맙 (Daratumumab) (Darzalex), 이필리무맙 (Ipilimumab) (Yervoy), 골리무맙 (Golimumab) (Simponi), 토실리주맙 (Tocilizumab) (Actemra), 라니비주맙 (Ranibizumab) (Lucentis), 세쿠키누맙 (Secukinumab) (Cosentyx), Ixekizumab (Taltz), 듀플리우맙 (Dupilumab) (Dupixent), Ustekinumab (Stelara), 팔리비주맙 (Palivizumab) (Synagis), 두발리맙 (Durvalumab) (Imfinzi), 아테졸리주맙 (Atezolizumab) (Tecentriq), 오말리주맙 (Omalizumab) (Xolair), 베돌리주맙 (Vedolizumab) (Entyvio), Abciximab (ReoPro), 바실리시맙 (Basiliximab) (Simulect), Alefacept (Amevive), Daclizumab (Zinbryta), 및 엘로투주맙 (Elotuzumab) (Empliciti) 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체의 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체의 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체의 중쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체의 중쇄의 불면 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG (예를 들어, IgG1)의 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG의 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG의 중쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG의 중쇄의 불변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 EpCAM, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD19, CD20, CD22, CD26, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD79, CD105, CD138, EphA receptors, EphB receptors, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, mesothelin, cripto, alphavbeta3, alphavbeta5, CLDN 18.2 및 alpha v beta 6 integrin 중 어느 하나에 결합성을 갖는 항체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 항-CLDN18.2 항체 (문헌 [한국특허출원 출원번호 10-2021-7023724] 참조)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 GPSVFLFPPKPKDTLMI (서열번호 01)의 아미노산 서열, 또는 이와 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응에 의해 생성되는 생성물 1 - 기능성 그룹을 포함하는 항체
항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응, 접촉 또는 혼합에 의해, 기능성 그룹을 포함하는 항체가 생성된다. 즉, 기능성 그룹이 항체로 전달된다. 예를 들어, 기능성 그룹이 생체직교적 작용기를 포함하는 경우, 생체직교적 작용기를 포함하는 기능성 그룹이 항체로 전달되고, 생체직교적 작용기를 포함하는 항체가 제조된다. 생체직교적 작용기를 포함하는 항체는 상기 생체직교적 작용기(예를 들어, 제1 생체직교적 작용기)와 생체직교적 반응을 하도록 설계된 다른 생체직교적 작용기 (예를 들어, 제2 생체직교적 작용기) 및 활성 모이어티를 포함하는 페이로드와 반응할 수 있고, 이를 통해 활성 모이어티가 항체에 연결된 컨쥬게이트가 제조된다. 활성 모이어티가 약물인 경우, 항체-약물 컨쥬게이트가 제조된다. 다른 예로, 기능성 그룹이 활성 모이어티를 포함하는 경우, 활성 모이어티를 포함하는 기능성 그룹이 항체로 전달되고, 활성 모이어티를 포함하는 항체가 제조된다. 활성 모이어티가 약물인 경우, 항체-약물 컨쥬게이트가 제조된다.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체는 1개의 기능성 그룹을 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 하나의 기능성 그룹을 갖는 기능성 그룹을 포함하는 항체는 FAR (functional group-to-antibody ratio) 1의 기능성 그룹을 포함하는 항체로 지칭될 수 있다. FAR 1 기능성 그룹을 포함하는 항체의 예시는 도 05에 도시된다.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체는 2개의 기능성 그룹을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 하나의 기능성 그룹을 포함하는 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 반응하여 2개의 기능성 그룹을 포함하는 항체가 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 기능성 그룹은 항체의 하나의 중쇄의 Fc 영역의 제1 표적 위치 (예를 들어, 제1 아미노산 잔기)에 연결되고, 다른 하나의 기능성 그룹은 항체의 다른 하나의 중쇄의 Fc 영역의 제1 표적 위치 (예를 들어, 제1 아미노산 잔기)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 하나의 기능성 그룹은 하나의 중쇄의 K248에 연결되고, 다른 하나의 기능성 그룹은 항체의 다른 하나의 중쇄의 K248에 연결될 수 있으나 달리 제한되지 않는다. 일부 다른 실시양태에서, 하나의 기능성 그룹은 하나의 중쇄의 Fc 영역의 제1 표적 위치 (예를 들어, 제1 아미노산 잔기)에 연결되고, 다른 하나의 기능성 그룹은 항체의 다른 하나의 중쇄의 Fc 영역의 제2 표적 위치 (제2 아미노산 잔기)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 하나의 기능성 그룹은 하나의 중쇄의 K248에 연결되고, 다른 하나의 기능성 그룹은 항체의 다른 하나의 중쇄의 K246에 연결될 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 하나의 기능성 그룹은 하나의 중쇄의 Fc 영역의 제1 표적 위치 (예를 들어, 제1 아미노산 잔기)에 연결되고, 다른 하나의 기능성 그룹은 상기 동일한 중쇄의 Fc 영역의 제2 표적 위치 (예를 들어, 제2 아미노산 잔기)에 연결될 수 있고, 다른 하나의 중쇄에는 기능성 그룹이 연결되어 있지 않을 수 있다. 이처럼, 기능성 그룹을 포함하는 항체가 복수의 기능성 그룹을 포함하는 경우, 기능성 그룹이 연결되는 위치는 달리 제한되지 않는다. 2개의 기능성 그룹을 갖는 기능성 그룹을 포함하는 항체는 FAR (functional group-to-antibody ratio) 2의 기능성 그룹을 포함하는 항체로 지칭될 수 있다. FAR2 기능성 그룹을 포함하는 항체의 예시는 도 05에 도시된다.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체는 3개의 기능성 그룹을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 2개의 기능성 그룹을 포함하는 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 반응하여 3개의 기능성 그룹을 포함하는 항체가 제조될 수 있다. 3개의 기능성 그룹을 갖는 기능성 그룹을 포함하는 항체는 FAR (functional group-to-antibody ratio) 3의 기능성 그룹을 포함하는 항체로 지칭될 수 있다. FAR 3 기능성 그룹을 포함하는 항체의 예시는 도 06에 도시된다.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체는 4개의 기능성 그룹을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 3개의 기능성 그룹을 포함하는 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 반응하여 4개의 기능성 그룹을 포함하는 항체가 제조될 수 있다. 4개의 기능성 그룹을 갖는 기능성 그룹을 포함하는 항체는 FAR (functional group-to-antibody ratio) 4의 기능성 그룹을 포함하는 항체로 지칭될 수 있다. FAR 4 기능성 그룹을 포함하는 항체의 예시는 도 06에 도시된다.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체는 4개 초과의 기능성 그룹을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체는 하나 또는 두개의 기능성 그룹을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체는 2개의 기능성 그룹을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체는 2개의 기능성 그룹을 포함하고, 이때 2개의 기능성 그룹 중 하나의 기능성 그룹은 항체의 하나의 중쇄의 제1 표적 위치 (예를 들어, 제1 아미노산 잔기)에 연결되어 있고, 다른 하나의 기능성 그룹은 항체의 다른 하나의 중쇄의 제1 표적 위치 (예를 들어, 제1 아미노산 잔기)에 연결되어 있을 수 있다.
항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응에 의해 생성되는 생성물 2 - 티올기를 포함하는 부산물
티올기를 포함하는 부산물 개괄
항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응, 접촉 또는 혼합에 의해 기능성 그룹을 포함하는 항체 외에도 티올-함유 부산물 (즉, 부산물)이 생성된다. 부산물은 티올 그룹과 FcBP를 포함하는 펩타이드 유닛 (반응 스캠 1 참고)를 포함한다. 전술한 바와 같이, 부산물은 FcBP에 의해 항체의 Fc 영역 또는 디자인된 표적 위치로 유도될 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이, 티올 그룹은 표적 위치에서의 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 저해할 수 있다. 이하에서, 부산물의 구조에 대하여 상세히 설명한다.
부산물의 구조
전술한 바와 같이, 부산물은 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응에 의해 생성된다. 이에, 부산물은 티오에스터 그룹으로부터 유래된 티올기 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 FcBP로부터 유래된 FcBP를 포함한다. 즉, 부산물은 티올기 및 FcBP를 포함한다.
일부 실시양태에서, 부산물은 다음의 화학식 02의 구조를 갖는 화합물일 수 있다:
[화학식 02]
TU-PU
이때, TU는 티올-함유 유닛 (Thiol-containing Unit)이다. 여기서, 티올기는 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 티오에스터 그룹으로부터 유래된 것이다. 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 티오에스터 그룹의 S에 연결된 아실 그룹이 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물로부터 항체로 전달되므로, 부산물에서 티올 그룹과 연결된 나머지 부분은 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 대응되는 부분 (즉, 아실 그룹이 아닌 부분)과 동일하다.
이때, FcBP를 포함하는 PU는 펩타이드 유닛이다. 여기서, 펩타이드 유닛의 구조는 항체와의 반응에 사용된 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 펩타이드 유닛의 구조와 동일하다.
티올-함유 유닛은 티올 그룹을 포함한다. 티올 그룹은 구조 -SH 또는
Figure pct00017
로 표현될 수 있다. 여기서, 물결은 티올 그룹이 부산물의 다른 부분과 연결되어 있음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, TU는 티올 그룹 외에도 링커 그룹을 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커 그룹은 FcBP를 포함하는 펩타이드 유닛과 티오에스터 그룹의 거리 조절을 위해 디자인될 수 있다. 예를 들어, 링커 그룹의 길이는 주사슬의 원자 수를 기준으로 1 내지 50일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 링커 그룹의 길이는 주사슬의 원자 수를 기준으로 1 내지 10일 수 있다. 링커 그룹은 주사슬에 하나 이상의 독립적으로 선택된 헤테로원자 및 하나 이상의 독립적으로 선택된 고리형 그룹 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 달리 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 티올-함유 유닛(TU)은 다음의 구조를 가질 수 있다:
X'-D2-
여기서, X'는 티올 그룹이다. X'는 D2를 통해 펩타이드 유닛과 연결된다.
여기서, D2는 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-20 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-20 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 예를 들어, 치환기는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. D2가 결합(bond)인 경우, X'은 펩타이드 유닛과 직접적으로 연결된다.
특정한 실시양태에서, D2는 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-6 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 이때 치환기는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -NO2, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올-함유 유닛은 다음의 구조를 가질 수 있다:
X'-D21-D22-D23-.
이때, X' 티올 그룹이다. X'은 -D21-D22-D23-를 통해 펩타이드 유닛과 연결될 수 있다.
여기서, D21, D22, 및 D23는, 각각 독립적으로, 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-20 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-20 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-20 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-20 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 예를 들어, 치환기는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. D21, D22, 및 D23 모두가 결합(bond)인 경우, X'은 펩타이드 유닛과 직접적으로 연결된다.
특정한 실시양태에서, D21, D22, 및 D23는, 각각 독립적으로, 결합(bond)이거나, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C1-6 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C1-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알킬렌, 치환된(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) C2-6 알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C2-6 헤테로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알케닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 C3-8 헤테로시클로알키닐렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다. 여기서, 치환된(substituted)은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환된 것을 나타낸다. 이때 치환기는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -NO2, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. -D21-D22-D23-의 길이는 주사슬의 원자 수를 기준으로 0 내지 10일 수 있다.
전술한 바와 같이, 펩타이드 유닛의 구조는 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 동일하다. 펩타이드 유닛의 구조는 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 설명하는 단락에서 상세히 설명되었다.
티올 반응성 에디티브를 사용하여 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 방법
티올 반응성 에디티브를 사용하여 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 방법 개괄
전술한 바와 같이, 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응에 의해 생성된 부산물 (즉, 티올-함유 부산물)은 나머지 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응, 또는 하나의 기능성 그룹을 포함하는 기능성 그룹을 포함하는 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 저해한다. 부산물은 FcBP와 티올 그룹을 포함하기 때문이다. 본 출원의 발명자들은 티올 반응성 에디티브를 사용하여 부산물의 티올 그룹을 제거 (즉, 티올-함유 부산물을 제거)함을 통해, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 방법을 개발하였다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브를 사용하는 경우, 티올 반응성 에디티브를 사용하지 않은 경우와 비교할 때, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율은 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.2, 2.4, 2.5, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20, 또는 전술한 값 이상의 배수로 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수율은 반응 이후 생성된 기능성 그룹을 포함하는 항체의 양을 통해 계산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수율은 초기에 반응에 참여한 항체의 양과 반응 이후 생성된 기능성 그룹을 포함하는 항체의 양을 기준으로 계산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수율은 크로마토그래피 분석 결과로 도출되는 피크를 분석 (예를 들어, 피크의 면적)을 분석함을 통해 계산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율은 FAR 1 기능성 그룹을 포함하는 항체를 기준으로 측정된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율은 FAR2 기능성 그룹을 포함하는 항체 (예를 들어, 두개의 생체직교적 화학작용기를 포함하는 항체)를 기준으로 측정된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율은 하나 이상의 기능성 그룹을 포함하는 항체 (FAR 1, 및 FAR 2를 모두 포함함)를 기준으로 측정된 것일 수 있다. 바람직하게는, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율은 목적하는 기능성 그룹을 포함하는 항체 (예를 들어, FAR 2)를 기준으로 측정된 것일 수 있다. 예를 들어, 반응 또는 혼합 조성물에서 확인되는 FAR 2의 항체의 비율이 20% (티올 반응성 에디티브를 사용하지 않은 경우)에서 80% (티올 반응성 에디티브를 사용한 경우)로 증가되었다면, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율은 4배 증가한 것이다.
일부 실시양태에서, 수율은 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응 시작 또는 혼합 시작 후 제1 시간이 지났을 때 측정된 것일 수 있다. 여기서, 제1 시간은 약 30 min, 1 hr, 2 hr, 3 hr, 4 hr, 5 hr, 6 hr, 7 hr, 8 hr, 9 hr, 10 hr, 11 hr, 12 hr, 13 hr, 14 hr, 15 hr, 16 hr, 17 hr, 18 hr, 19 hr, 20 hr, 21 hr, 22 hr, 23 hr, 24 hr, 26 hr, 28 hr, 30 hr, 32 hr, 34 hr, 36 hr, 38 hr, 40 hr, 44 hr, 48 hr, 3days, 4days, 또는 5days, 또는 그 이상일 수 있으나, 달리 제한되지 않는다. 관련 분야의 기술자는 기능성 그룹을 포함하는 항체를 제조하기 위한 적절한 시간을 디자인할 수 있고, 이러한 시간이 너무 짧은 경우 적절한 양의 기능성 그룹을 포함하는 항체를 얻지 못할 수 있다. 또한, 이러한 시간이 너무 긴 경우에는 제조 단가가 올라가거나 목적하는 물질이 변성될 수 있다. 즉, 관련 분야의 기술자는 적절한 시간을 반응 시간으로 디자인할 수 있으며, 수율은 디자인된 반응 시간이 도과한 후(즉, 디자인된 반응 완료 시점)에서 측정될 수 있다.
티올 반응성 에디티브, 항체, 및 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 혼합은 다양한 순서로 수행될 수 있다. 예를 들어, 티올 반응성 에디티브, 항체, 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 동시에 혼합될 수 있다. 다른 예로, 티올 반응성 에디티브와 항체가 먼저 혼합되고, 이후 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 혼합될 수 있다. 또 다른 예로, 티올 반응성 에디티브와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 먼저 혼합되고, 이후 항체가 혼합될 수 있다. 또 다른 예로, 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 먼저 혼합되고, 이후 티올 반응성 에디티브가 혼합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 조성물 내에 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응 전에 먼저 또는 반응 시에 존재할 수 있다. 즉, 티올 반응성 에디티브와 항체가 먼저 혼합되거나, 티올 반응성 에디티브와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 먼저 혼합될 수 있다. 티올 반응성 에디티브가 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응 시에 존재하는 경우, 티올 반응성 에디티브가 부산물을 곧바로 제거할 수 있기 때문에 티올 반응성 에디티브가 조성물 내에 미리 존재하는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율을 높이는 방법은 다음을 포함할 수 있다: 티올 반응성 에디티브, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물, 및 항체를 혼합함.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율을 높이는 방법은 다음을 포함할 수 있다: 티올 반응성 에디티브 및 항체를 혼합함; 및 상기 혼합액에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 첨가함.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율을 높이는 방법은 다음을 포함할 수 있다: 티올 반응성 에디티브 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 혼합함; 및 상기 혼합액에 항체를 첨가함.
일부 실시양태에서, 항체 대비 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 0, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 140, 160, 180, 200, 240, 280, 320, 360, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 100000 당량, 또는 전술한 값 초과의 당량, 또는 전술한 값 중 선택되는 두 값으로 이루어지는 범위 내의 당량의 티올 반응성 에디티브가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브가 관여되는 반응은 약 pH 4, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 8, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 9, 또는 10에서 수행되거나, 또는 전술한 값 중 선택되는 두 값에 의해 설정되는 범위의 pH에서 수행될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브가 참여하는 반응은 약 pH 6.8, 7, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 또는 8 에서 수행되거나, 또는 전술한 값 중 선택되는 두 값에 의해 설정되는 범위의 pH에서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체의 반응 시간은 약 30 min, 1 hr, 2 hr, 3 hr, 4 hr, 5 hr, 6 hr, 7 hr, 8 hr, 9 hr, 10 hr, 11 hr, 12 hr, 13 hr, 14 hr, 15 hr, 16 hr, 17 hr, 18 hr, 19 hr, 20 hr, 21 hr, 22 hr, 23 hr, 24 hr, 26 hr, 28 hr, 30 hr, 32 hr, 34 hr, 36 hr, 38 hr, 40 hr, 44 hr, 48 hr, 3days, 4days, 또는 5days, 또는 그 이상이거나, 전술한 값 중 선택되는 두 값에 의해 생성되는 범위 내일 수 있으나, 달리 제한되지 않는다.
티올 반응성 에디티브는 티올 그룹과 반응성을 갖는 화합물이다. 이하에서, 티올 반응성 에디티브에 대해 상세히 설명한다.
티올 반응성 에디티브 (Thiol reactive additive)
티올 반응성 에디티브(Thiol reactive additive)는 티올 그룹과 반응성을 갖는 화합물이다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 적어도 다음의 조건을 만족하여야 한다: 티올 그룹과 반응성을 가질 것. 즉, 티올 반응성 에디티브는 티올기와 반응성을 갖는 티올 반응성 그룹을 포함한다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 다음의 두 조건을 만족하여야 한다: 티올 그룹과 반응성을 가질 것, 및 항체와 반응성이 적거나 없을 것. 티올 반응성 에디티브가 항체와의 반응성을 갖거나 항체와의 반응성이 높은 경우에는 항체의 구조 및/또는 기능의 변경을 유발하기 때문이다. 이러한 목적하지 않는, 항체의 구조 및/또는 기능의 변경은 항체-기반 약물을 사용함에 있어 예측하기 어려운 부작용을 유발할 가능성이 높다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 다음의 특징 중 하나 이상을 가질 수 있다: 티올 그룹과 반응성을 가짐, 항체와의 반응성이 적거나 없음, 및 티오에스터 그룹과 반응성이 적거나 없음, 및 FcBP와의 반응성이 적거나 없음.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 "Ad"로 표현된다. 티올 반응성 에디티브는 부산물의 티올기와 반응하여 부산물의 티올기를 캡핑한다. 즉, 티올 반응성 에디티브는 티올-함유 부산물과 반응하여 티올-함유 부산물을 제거하는 역할을 한다. 여기서, 티올-함유 부산물은 제1 부산물, 티올 반응성 에디티브와 티올-함유 부산물이 반응하여 생성된 새로운 부산물은 제2 부산물로 지칭될 수 있다. 제2 부산물은 티올 그룹을 더 이상 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
티올 반응성 에디티브와 티올-함유 부산물의 반응에 대한 예시적 반응 스캠은 아래에서 도시된다.
[Reaction scheme 2]
Figure pct00018
반응 스캠 2에서 도시된 바와 같이, 티올 반응성 에디티브와 제1 부산물이 반응하여 제2 부산물이 생성된다. 제2 부산물은 티올 그룹의 H가 티올 반응성 에디티브로부터 유래된 Ad'으로 치환된 형태이다. 반응 스캠 2에서, Ad'은 티올 반응성 에디티브로부터 유래된 구조이며, 티올 반응성 에디티브와 제1 부산물의 티올그룹의 반응에 의해 형성된 그룹이다. 예를들어, 제2 부산물은 티올 그룹이 캡핑된 것을 제외하고 제1 부산물과 동일한 구조를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 부산물은 하기의 화학식 03의 구조를 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 03]
TU'-PU
이때, PU는 펩타이드 유닛이고, 관련 단락에서 상세히 설명되었다.
이때, TU'은 캡핑된 티올을 포함하는 유닛이고, 캡핑된 티올인 Ad'-S-의 구조를 포함한다. Ad'-S- 를 제외한 나머지 구조 (존재하는 경우)는 제1 부산물의 TU에서 티올 그룹을 제외한 부분과 대응되며, TU에서 설명된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 티올 그룹과 반응성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 티올 그룹과 반응성을 갖는 티올 반응성 그룹을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 저분자 화합물(small molecule compound)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브의 분자량(molecular weight)은 30 g/mol, 40 g/mol, 50 g/mol, 60 g/mol, 70 g/mol, 80 g/mol, 90 g/mol, 100 g/mol, 110 g/mol, 120 g/mol, 130 g/mol, 140 g/mol, 150 g/mol, 160 g/mol, 170 g/mol, 180 g/mol, 190 g/mol, 200 g/mol, 220 g/mol, 240 g/mol, 260 g/mol, 280 g/mol, 300 g/mol, 350 g/mol, 400 g/mol, 450 g/mol, 500 g/mol, 600 g/mol, 700 g/mol, 800 g/mol, 900 g/mol, 1000 g/mol, 1100 g/mol, 1200 g/mol, 1300 g/mol, 1400 g/mol, 1500 g/mol, 1600 g/mol, 1700 g/mol, 1800, g/mol 1900 g/mol, 2000 g/mol, 2500 g/mol, 3000 g/mol, 3500 g/mol, 4000 g/mol, 4500 g/mol, 5000 g/mol, 6000 g/mol, 7000 g/mol, 8000 g/mol, 9000 g/mol, 또는 10000 g/mol 이하이거나, 전술한 값 중 선택되는 두 값에 의해 설정되는 범위 내일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브의 분자량은 50 g/mol, 60 g/mol, 70 g/mol, 80 g/mol, 90 g/mol, 100 g/mol, 110 g/mol, 120 g/mol, 130 g/mol, 140 g/mol, 150 g/mol, 160 g/mol, 170 g/mol, 180 g/mol, 190 g/mol, 200 g/mol, 220 g/mol, 240 g/mol, 260 g/mol, 280 g/mol, 300 g/mol, 350 g/mol, 400 g/mol, 450 g/mol, 500 g/mol, 600 g/mol, 700 g/mol, 800 g/mol, 900 g/mol, 또는 1000 g/mol 이하이거나, 전술한 값 중 선택되는 두 값에 의해 설정되는 범위 내일 수 있다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 티올 스캐빈져로 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 친전자성 치환반응(Electrophilic substitution reaction)을 하는 화합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 친전자성 치환반응 분자(Electrophilic substitution reaction molecule)일 수 있다. 예를 들어, 티올 반응성 에디티브는 친전자성 치환 반응을 하는 그룹을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 친핵성 치환 반응(Nucleophilic substitution reaction)을 하는 화합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 친핵성 치환 반응 분자(Nucleophilic substitution reaction molecule)일 수 있다. 예를 들어, 티올 반응성 에디티브는 친핵성 치환 반응을 하는 그룹을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 SN2 반응을 하는 화합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 SN2 반응 분자(SN2 reaction molecule)일 수 있다. 예를 들어, 티올 반응성 에디티브는 SN2 반응을 하는 그룹을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 티올-다이설파이드 교환 반응(thiol-disulfide exchange reaction)을 하는 화합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 티올-다이설파이드 교환 분자(thiol-disulfide exchange molecule) 일 수 있다. 예를 들어, 티올 반응성 에디티브는 다이설파이드 그룹을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 티올레이트-다이설파이드 상호교환 반응(Thiolate disulfide interchange reaction)을 하는 화합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 티올레이트-다이설파이드 상호교환 반응 분자 (Thiolate disulfide interchange reaction molecules)일 수 있다. 예를 들어, 티올 반응성 에디티브는 다이설파이드 그룹을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 티올과의 반응 이후 특정 파장의 빛에 흡광도를 갖는 화합물을 생성하는 화합물일 수 있다. 특정 파장은 예를 들어, 350 내지 500nm, 380 내지 450nm, 또는 400 내지 420nm일 수 있다. 예를 들어, 후술되는 DTNB(5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid))는 티올-함유 화합물과의 반응을 통해 412 nm의 빛에 최대 흡광능을 갖는 TNB2로 이온화되는 TNB(2-nitro-5-thiobenzoate)로 전환된다. TNB2는 노랑색을 띄며, 412nm의 가시광선에서 흡광도를 측정하여 정량화될 수 있다. TNB2-의 Extinction coefficient는 희석된 용액에서 14,150 M-1 cm-1- 이고, 높은 염 농도의 용액에서는 13,700 M-1 cm-1로 알려져 있다. DTNB와 티올-함유 화합물의 반응 스캠은 이하에서 도시된다.
[Reaction scheme 3]
Figure pct00019
이하에서, 티올 반응성 에디티브로 사용될 수 있는 예시적 화합물에 대하여 설명한다.
티올 반응성 에디티브로써의 예시적 화합물 (1)
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 다이페닐 다이설파이드 (diphenyl disulfide) 또는 이의 유도체일 수 있다. 다이페닐 다이설파이드는 하기의 화학식 04의 구조를 갖는 화합물이다:
[화학식 04]
Figure pct00020
.
다이페닐 다이설파이드의 유도체는, 예를 들어, 2,2'-다이피리딜 다이설파이드 (2,2'-Dipyridyldisulfide) 또는 4,4'-다이피리딜 다이설파이드 (4,4′-Dipyridyl disulfide)와 같은 다이피리딜다이설파이드 (Dipyridyldisulfide), Ellman's Reagent 라고도 지칭되는 5,5′-다이티오비스-(2-니트로벤조익산) (5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid); DTNB), 2,2'-다이티오다이벤조익산 (2,2′-Dithiodibenzoic acid), 4-아미노페닐 다이설파이드(4-Aminophenyl disulfide), 2-아미노페닐 다이설파이드(2-Aminophenyl disulfide), Bis(4-클로로페닐) 다이설파이드 (Bis(4-chlorophenyl) disulfide), Bis(2-니트로페닐) 다이설파이드 (Bis(2-nitrophenyl) disulfide), p-톨릴 다이설파이드 (p-tolyl disulfide), Bis(4-니트로페닐) 다이설파이드 (Bis(4-nitrophenyl) disulfide), Bis(2-니트로페닐) 다이설파이드 (Bis(2-nitrophenyl) disulfide), Bis(4-메톡시페닐) 다이설파이드 (Bis(4-methoxyphenyl) disulfide), 및 Bis(2-메톡시페닐) 다이설파이드 (Bis(2-methoxyphenyl) disulfide) 중 어느 하나, 또는 이의 유도체일 수 있으나, 달리 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 하기의 화학식 05의 구조를 갖는 화합물일 수 있다:
[화학식 05]
Figure pct00021
,
이때, Z1은 치환된 또는 비치환된 C5-10 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴이다. 이때 치환된 C5-10 아릴 또는 치환된 C5-10 헤테로아릴은 하나 이상의 치환기를 갖고, 이때 상기 치환기는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 치환기는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -NO2, -SO3H, -OSO3H, -OPO3H2, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴은 하나 또는 두개의 치환기를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, Z1은 치환된 또는 비치환된 페닐, 또는 치환된 또는 비치환된 피리딜일 수 있다.
이때, Z2는 치환된 또는 비치환된 C5-10 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 C5-10 헤테로아릴이다. 이때 치환된 C5-10 아릴 또는 치환된 C5-10 헤테로아릴은 하나 이상의 치환기를 갖고, 이때 상기 치환기는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 치환기는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -NO2, -SO3H, -OSO3H, -OPO3H2, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴은 하나 또는 두개의 치환기를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, Z2는 치환된 또는 비치환된 페닐, 또는 치환된 또는 비치환된 피리딜일 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 화학식 06의 구조를 갖는 화합물일 수 있다:
[화학식 06]
Figure pct00022
.
이때, A는 5-원 아로마틱 고리 또는 6-원 아로마틱 고리이고, 이때 A는 하나 이상의 헤테로원자를 고리 상에 선택적으로 포함할 수 있다. 이때 헤테로원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에서 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, A는 벤젠 고리, 피리딘 고리, 피리미딘 고리, 피롤 고리, 퓨란 고리, 티오펜 고리 (thiophene ring), 또는 이미다졸 고리를 포함할 수 있다.
이때, p는 0 내지 4의 정수일 수 있다. 특정한 실시양태에서, p는 0 내지 2의 정수일 수 있다.
이때 Ra는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, Ra는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -NO2, -SO3H, -OSO3H, -OPO3H2, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 Ra는 친수성 그룹(hydrophilic group)일 수 있다. 친수성(hydrophilic group) 그룹은, 각각 독립적으로, -OH, -CHO, -COOH, -CONH2, -NH2, PEG 모이어티, 및 슈거 모이어티(sugar moiety) 중 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 하나 이상의 Ra는 전자 끄는 그룹 (Electron withdrawing group; EWG)일 수 있다. 전자 끄는 그룹은, 각각 독립적으로, 할로겐, 카보닐 그룹 (예를 들어, -CHO), 설포닐 그룹(예를 들어, -SO3H), -COOH, -CN, -NO2, 및 할로알킬 그룹 (예를 들어, -CF3) 중 선택될 수 있다.
이때, B는 5-원 아로마틱 고리 또는 6-원 아로마틱 고리이고, 이때 B는 하나 이상의 헤테로원자를 고리 상에 선택적으로 포함할 수 있다. 이때 헤테로원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에서 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, B는 벤젠 고리, 피리딘 고리, 피리미딘 고리, 피롤 고리, 퓨란 고리, 티오펜 고리 (thiophene ring), 또는 이미다졸 고리를 포함할 수 있다.
이때, q는 0 내지 4의 정수일 수 있다. 특정한 실시양태에서, p는 0 내지 2의 정수일 수 있다.
이때, Rb는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, Rb는, 각각 독립적으로, C1-4 알킬, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, =O, =S, -NO2, -SO3H, -OSO3H, -OPO3H2, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 Rb는 친수성 그룹(hydrophilic group)일 수 있다. 친수성(hydrophilic group) 그룹은, 각각 독립적으로, -OH, -CHO, -COOH, -CONH2, -NH2, PEG 모이어티, 및 슈거 모이어티 중 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 하나 이상의 Rb는 전자 끄는 그룹 (Electron withdrawing group; EWG)일 수 있다. 전자 끄는 그룹은, 각각 독립적으로, 할로겐, 카보닐 그룹 (예를 들어, -CHO), 설포닐 그룹(예를 들어, -SO3H), -COOH, -CN, -NO2, 및 할로알킬 그룹 (예를 들어, -CF3) 중 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 06의 구조를 갖는 화합물은 다이페닐 다이설파이드 또는 이의 유도체로 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 화학식 07의 구조를 갖는 화합물일 수 있다:
[화학식 07]
Figure pct00023
이때, EWG는 전자 끄는 그룹(Electron Withdrawing Group)을 나타내며, EWG는 각각 독립적으로, 할로겐, 카보닐 그룹 (예를 들어, -CHO), 설포닐 그룹(예를 들어, -SO3H), -COOH, -CN, -NO2, 및 할로알킬 그룹 (예를 들어, -CF3) 중에서 선택될 수 있다.
이때, HG는 친수성 그룹(Hydrophilic Group)을 나타내며, 친수성 그룹은 각각 독립적으로, -OH, -CHO, -COOH, -CONH2, -NH2, PEG 모이어티, 및 슈거 모이어티 중에서 선택될 수 있다.
이때, pa는 0 내지 2의 정수일 수 있다.
이때, qa는 0 내지 2의 정수일 수 있다.
이때, pb는 0 내지 2의 정수일 수 있다.
이때, qb는 0 내지 2의 정수일 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 07의 구조를 갖는 화합물은 다이페닐 다이설파이드 또는 이의 유도체로 지칭될 수 있다.
티올 반응성 에디티브로써의 예시적 화합물 (2)
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 말레이미드 (maleimide) 또는 이의 유도체일 수 있다. 말레이미드는 하기의 화학식 08의 구조를 갖는 화합물이다:
[화학식 08]
Figure pct00024
.
말레이미드의 유도체는, 예를 들어, N-메틸말레이미드 (N-Methylmaleimide), N-에틸말레이미드 (N-Ethylmaleimide), N-페닐말레이미드 (N-Phenylmaleimide), N-벤질말레이미드 (N-Benzylmaleimide), 3-말레이미도프로피오닉산 (3-Maleimidopropionic acid), N-tert-부틸말레이미드 (N-tert-butylmaleimide), 및 N-시클로헥실말레이미드 (N-Cyclohexylmaleimide) 중 어느 하나, 또는 이의 유도체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 하기의 화학식 09의 구조를 갖는 화합물일 수 있다:
[화학식 09]
Figure pct00025
.
이때, Rc는 -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -CH2CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택될 수 있고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, Rc는 C1-4 알킬, C3-8 시클로알킬, C3-8 헤테로시클로알킬, C3-8 시클로알케닐, C3-8 헤테로시클로알케닐, -C(=O)H, -C(=O)CH3, -CH2CH2C(=O)OH, -C(=O)OH, -C(=O)NH2, -NH2, -NO2, -SO3H, -OSO3H, -OPO3H2, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있다.
티올 반응성 에디티브로써의 예시적 화합물 (3)
이하에서는, 티올 반응성 에디티브로 사용 가능한 화합물에 대하여 예시한다. 특정한 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브는 하기의 화학식 중 어느 하나의 구조를 갖는 화합물일 수 있다:
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
티올 반응성 에디티브를 포함하는 키트
본 출원의 일부 실시양태로, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 키트가 제공될 수 있다. 티올 반응성 에디티브를 포함하는 키트는 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이기 위한 용도로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는데 사용하기 위한, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 키트가 제공될 수 있다. 나아가, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 기능성 그룹을 포함하는 항체 제조용 키트가 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 키트는, 티올 반응성 에디티브, 및 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 키트는, 티올 반응성 에디티브, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 전구체, 및 FcBP를 포함할 수 있다. 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 전구체는 문헌 [PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944]에서 상세히 서술되며, FcBP와의 반응을 통해 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 제조하기 위해 사용되는 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 키트는 항체를 더 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 키트는 티올 반응성 에디티브, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물, 및 항체를 포함할 수 있다.
티올 반응성 에디티브를 포함하는 조성물
본 출원의 일부 실시양태로, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 조성물이 제공될 수 있다. 티올 반응성 에디티브를 포함하는 조성물은 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이기 위한 용도로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는데 사용하기 위한, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 조성물이 제공될 수 있다. 나아가, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 기능성 그룹을 포함하는 항체 제조용 조성물이 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 조성물은, 티올 반응성 에디티브, 및 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 조성물은, 티올 반응성 에디티브, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 전구체, 및 FcBP를 포함할 수 있다. 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 전구체는 문헌 [PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282, 공개번호 WO2020/184944]에서 상세히 서술되며, FcBP와의 반응을 통해 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 제조하기 위해 사용되는 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 조성물은 항체를 더 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브를 포함하는 조성물은 티올 반응성 에디티브, 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물, 및 항체를 포함할 수 있다.
티올 반응성 에디티브를 사용하여 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 방법의 예시적 실시양태
이하에서는, 본 출원의 티올 반응성 에디티브를 사용하여 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 방법의 예시적 실시양태가 제공된다. 일부 실시양태에서, 티올 반응성 에디티브를 사용하여 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 방법은 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 방법으로 지칭될 수 있다.
본 명세서의 전체에 걸쳐, 본 명세서에 사용된 용어는 단수의 형태로 기재되더라도 복수의 개념을 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 즉, 단수의 형태로 기재된 용어들은 필요에 따라 복수의 개념을 포함하는 것으로 해석될 수 있는 것으로 인식될 것이다.
A01. 다음을 포함하는, 티올 반응성 에디티브를 사용하는, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이는 방법:
(a) 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 반응 조성물 내에서 접촉함,
이때 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 티오에스터 그룹(thioester group), 기능성 그룹(Functional group; FG), 및 Fc 결합성 펩타이드 (Fc-binding peptide; FcBP)를 포함하고,
이때 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 상기 티오에스터 그룹과 상기 항체의 친핵체가 반응하며,
상기 티오에스터 그룹과 상기 항체의 친핵체의 반응의 결과로,
기능성 그룹을 포함하는 항체, 그리고 티올 그룹 및 FcBP를 포함하는 부산물이 생성되고, 이때 상기 부산물의 상기 티올 그룹은 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 티오에스터 그룹과 상기 항체의 상기 친핵체의 반응에 의해 생성되며,
이때, 상기 부산물은 상기 반응 조성물 내 아직 반응하지 않은 항체와 아직 반응하지 않은 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 방해하는 반응 저해 효과를 가짐; 및
(b) 상기 부산물의 상기 반응 저해 효과를 제거하기 위해, 상기 부산물과 상기 티올 반응성 에디티브를 반응 조성물 내에서 접촉함,
이때 상기 티올 반응성 에디티브는 티올 그룹과 반응성을 갖는 화합물이고,
이때 상기 티올 반응성 에디티브와 상기 부산물의 상기 티올 그룹이 반응하고,
상기 티올 반응성 에디티브와 상기 티올 그룹의 반응의 결과로, 상기 부산물의 티올기가 캡핑됨.
A02. A01에 있어서,
상기 부산물의 티올기가 캡핑됨으로써, 상기 부산물이 제거되는 것을 특징으로 하는, 방법.
A03. A01 내지 A02 중 어느 하나에 있어서,
상기 부산물의 티올기가 캡핑됨으로써, 상기 부산물의 상기 반응 저해 효과가 제거되는 것을 특징으로 하는, 방법.
A04. A01 내지 A03 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 항체와 반응성이 적거나 없는 화합물인, 방법.
A05. A01 내지 A04 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 저분자 화합물인, 방법.
A06. A01 내지 A05 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브의 분자량은 50 g/mol 이상 2000 g/mol 이하인, 방법.
A07. A01 내지 A06 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브의 분자량은 100 g/mol 이상 1000 g/mol 이하인, 방법.
A08. A01 내지 A07 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 티올-다이설파이드 교환 반응(thiol-disulfide exchange reaction)을 하는 화합물인, 방법.
A09. A01 내지 A08 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 티올레이트-다이설파이드 상호교환반응(Thiolate disulfide interchange reaction)을 하는 화합물인, 방법.
A10. A01 내지 A09 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 다이설파이드 그룹을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
A11. A01 내지 A10 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 다이페닐 다이설파이드 또는 이의 유도체인, 방법.
A12. A01 내지 A11 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 다이페닐 다이설파이드, 다이피리딜다이설파이드 (Dipyridyldisulfide), 5,5′-다이티오비스-(2-니트로벤조익산) (5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid); DTNB), 2,2'-다이티오다이벤조익산 (2,2′-Dithiodibenzoic acid), 4-아미노페닐 다이설파이드(4-Aminophenyl disulfide), 2-아미노페닐 다이설파이드(2-Aminophenyl disulfide), Bis(4-클로로페닐) 다이설파이드 (Bis(4-chlorophenyl disulfide), Bis(2-니트로페닐) 다이설파이드 (Bis(2-nitrophenyl disulfide), p-톨릴 다이설파이드 (p-tolyl disulfide), Bis(4-니트로페닐) 다이설파이드 (Bis(4-nitrophenyl) disulfide), Bis(2-니트로페닐) 다이설파이드 (Bis(2-nitrophenyl) disulfide), Bis(4-메톡시페닐) 다이설파이드 (Bis(4-methoxyphenyl) disulfide), 또는 Bis(2-메톡시페닐) 다이설파이드 (Bis(2-methoxyphenyl) disulfide)인, 방법.
A13. A01 내지 A11 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 5,5′-다이티오비스-(2-니트로벤조익산) (5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid); DTNB)인, 방법.
A14. A01 내지 A11 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 화학식 06의 구조를 갖는 화합물인, 방법:
[화학식 06]
Figure pct00034
,
이때,
A는 5-원 또는 6-원 아로마틱 고리이고, 이때 A는, 선택적으로, 하나 이상의 헤테로원자를 고리 상에 포함하고, 이때 헤테로원자는 각각 독립적으로 N, O, 및 S 중에서 선택되며,
p는 0 내지 4의 정수이고,
Ra는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택되고,
B는 5-원 또는 6-원 아로마틱 고리이고, 이때 B는, 선택적으로, 하나 이상의 헤테로원자를 고리 상에 포함하고, 이때 헤테로원자는 각각 독립적으로 N, O, 및 S 중에서 선택되며,
q는 0 내지 4의 정수이고,
Rb는, 각각 독립적으로, -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택되고,
R은, 각각 독립적으로, H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, =O, =S, 및 -SH 중에서 선택됨.
A15. A14에 있어서,
Ra 중 적어도 어느 하나는 전자 끄는 그룹(Electron Withdrawing Group) 또는 친수성 그룹(hydrophilic group)인 것을 특징으로 하는, 방법.
A16. A14 내지 A15 중 어느 하나에 있어서,
Rb 중 적어도 어느 하나는 전자 끄는 그룹(Electron Withdrawing Group) 또는 친수성 그룹(hydrophilic group)인 것을 특징으로 하는, 방법.
A17. A01 내지 A07 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 말레이미드 또는 이의 유도체인, 방법.
A18. A17에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 말레이미드, N-메틸말레이미드 (N-Methylmaleimide), N-에틸말레이미드 (N-Ethylmaleimide), N-페닐말레이미드 (N-Phenylmaleimide), N-벤질말레이미드 (N-Benzylmaleimide), 3-말레이미도프로피오닉산 (3-Maleimidopropionic acid), N-tert-부틸말레이미드 (N-tert-butylmaleimide), 또는 N-시클로헥실말레이미드 (N-Cyclohexylmaleimide)인, 방법.
A19. A17에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 tert-부틸 말레이미드인 것을 특징으로 하는, 방법.
A20. A17에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 화학식 09의 구조를 갖는 화합물인, 방법:
[화학식 09]
Figure pct00035
,
이때, Rc는 -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -CH2CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택되고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, -NH2, 및 -SH 중에서 선택됨.
A21. A01 내지 A07 중 어느 하나에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브는 화학식 10 내지 화학식 31 중 어느 하나의 구조를 갖는 화합물인 것을 특징으로 하는, 방법.
A22. A01 내지 A21 중 어느 하나에 있어서,
상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 화학식 01의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법:
[화학식 01]
FU-RU-PU,
이때,
FU는 기능성 그룹(functional group; FG)을 포함하는 기능성 유닛 (Functional Unit)이고,
RU는 티오에스터 그룹을 포함하는 반응성 유닛 (Reactive Unit) 이고,
PU는 Fc 결합성 펩타이드 (Fc-binding peptide; FcBP)를 포함하는 펩티드 유닛(Peptide Unit; PU)임.
A23. A01 내지 A22 중 어느 하나에 있어서,
상기 Fc 결합성 펩타이드는 8 내지 20 아미노산 잔기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
A24. A01 내지 A23 중 어느 하나에 있어서,
상기 Fc 결합성 펩타이드는 서열번호 02 내지 서열번호 80 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 이와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
A25. A01 내지 A24 중 어느 하나에 있어서,
상기 기능성 그룹은 하나 이상의 생체직교적 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
A26. A25에 있어서,
상기 생체직교적 작용기는, 각각 독립적으로, 스타우딩어 라이게이션(Staudinger Ligation), 구리-촉매화 아자이드-알킨 사이클로에디션 (Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition; CuAAC), 구리가 없는 아자이드-알킨 사이클로에디션 (Copper-Free Azide-Alkyne Cycloaddition), 테트라진 라이게이션 (Tetrazine Ligation), 테트라졸 라이게이션 (Tetrazole Ligation), 옥심 라이게이션 (Oxime Ligation), 및 이소시아나이드 클릭 반응 (Isocyanide Click Reaction) 중 선택되는 어느 하나의 생체직교적 반응에 참여하는 그룹인 것을 특징으로 하는, 방법.
A27. A25에 있어서,
상기 생체직교적 작용기는, 각각 독립적으로, 아자이드, 말단 알킨, 사이클로 알킨, 테트라진, 노르보르넨, 사이클로 알켄, 테트라졸, 옥심, 및 이소시아나이드 그룹 중에 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 방법.
A28. A01 내지 A24 중 어느 하나에 있어서,
상기 기능성 그룹은 하나 이상의 활성 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
A29. A28에 있어서,
상기 활성 모이어티는, 각각 독립적으로, 약물, 이미징 모이어티, 방사성 동위원소에 대한 리간드, 친화성 물질, 안정화 물질, 비타민, 및 친수성 모이어티 중 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
A30. A01 내지 A29 중 어느 하나에 있어서,
상기 부산물의 상기 반응 저해 효과는 상기 부산물에 포함된 Fc 결합성 펩타이드가 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 상기 항체의 반응이 일어나는 상기 항체에 위치한 반응 자리로 상기 부산물을 가이드함과 함께, 상기 부산물에 포함된 티올기가 상기 반응 자리에서 상기 항체와 상호작용하기 때문에 생성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
A31. A01 내지 A29 중 어느 하나에 있어서,
상기 방법의 상기 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율은, 티올 반응성 에디티브를 사용하지 않는 경우와 비교할 때, 1.5배 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
A32. A31에 있어서,
상기 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율은 2개의 기능성 그룹을 포함하는 항체를 기준으로 측정된 것인, 방법.
A33. A01 내지 A32 중 어느 하나에 있어서,
상기 방법의 (a) 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 접촉, 및 (b) 부산물 및 티올 반응성 에디티브의 접촉은 티올 반응성 에디티브, 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 혼합함으로써 수행되는 것인, 방법.
A34. A33에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브, 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 혼합함에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브와 항체가 먼저 혼합되고, 이후에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 혼합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
A35. A33에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브, 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 혼합함에 있어서,
상기 티올 반응성 에디티브와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 먼저 혼합되고, 이후에 항체가 혼합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 실험예 또는 실시예를 통해 본 출원이 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실험예는 오로지 본 출원에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예
재료 및 장비 (materials and instruments)
화합물 및 항체
화합물은 상업적 공급자로부터 구매하여 더 이상 정제하지 않고 사용하였다. 5-엑소-노르보르넨 카복실산 (5-Exo-norbornene carboxylic acid), 암모늄 설페이트 ((NH4)2SO4), N-Boc-에틸렌디아민 (N-Boc-ethylenediamine), 트리이소프로필실란 (triisopropylsilane; TIS), 및 1,2-에탄다이티올 (1,2-ethanedithiol; EDT)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. N-메틸말레이미드 (N-Methylmaleimide), N-에틸말레이미드 (N-ethylmaleimide), N-사이클로헥실말레이미드(N-cyclohexylmaleimide), N-페닐말레이미드 (N-phenylmaleimide), N-벤질말레이미드(N-benzylmaleimide), N-tert-부틸말레이미드(N-tert-butylmaleimide), 및 3-말레이미도프로피오닉산 (3-maleimidopropionic acid)은 Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan)로부터 구매하였다. tert-부틸 티오글리콜레이트(tert-Butyl thioglycolate)는 Angene Chemical (Telangana, India)로부터 구매하였다. 4-메틸테트라진 NHS 에스터(4-methyltetrazine NHS ester) Broadpharm Inc. (San Diego, CA, USA)로부터 구매하였다. Fmoc-PEG8-OH는 Quanta Biodesign (Plain City, OH, USA)으로부터 구매하였다. DM1-SMCC는 eNovation Chemicals LLC (Bridgewater Township, NJ, USA)로부터 구매하였다. DBCO-C6-NHS는 (Lumiprobe, Hong Kong)로부터 구매하였다. 모든 아미노산, rink amide resin, 및 커플링 시약은 Aapptec (Louisville, KY, USA), GL Biochem Ltd. (Shanghai, China), 및 Combi-Blocks (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 용매는 증류 없이 사용하였다. 트리 플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid; TFA), N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine; DIPEA), 암모늄 하이드록사이드 (ammonium hydroxide) (ammonia solution), 디에틸아민 (diethylamine), Na2HPO4, N,N-디메틸포름아마이드 (N,N-dimethylformamide; DMF), 디클로로메탄 (dichloromethane; DCM), 메탄올 (MeOH), 헥산 (hexane; Hex), 에틸 아세테이트 (EA), 및 디에틸에터는 Daejung (Siheung, Korea)으로부터 얻었다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)-등급 아세토니트릴 (acetonitrile) (ACN), 이소프로판올 (isopropanol), 및 물은 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. 트라스트주맙 (trastuzumab)은 Roche (Basel, Switzerland)에서 구입하였다.
스몰 몰레큘 및 펩타이드의 특성화(Characterization) 및 정제
박층 크로마토그래피 (thin-layer chromatography)는 사전 코팅된 실리카겔 F254 플레이트 (Merck, Billerica, MA, USA)에서 수행되었으며 observed 자외선 (254 nm) 또는 KMnO4 또는 ninhydrin solutions으로 염색하여 관찰되었다. 합성된 모든 화합물은 미리 채워진 실리카겔 카트리지를 사용하여 Combi-flash 정제로 정제되었다. 모든 합성 펩타이드는 preparative-HPLC (Waters, Milford, MA, USA; with XBridgeTM prep C18, 5 μm, 4.6 Х 250 mm column)으로 정제하였다.
온전한 질량의 분석을 위한 항체의 탈글리코실화
두개의 마이크로리터의 샘플 (75 mg/mL)을 8 μL 6 M의 우레아 완충액 및 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)과 결합하여 총 반응 부피가 99μL가 되도록 하고, 여기에 500 유닛 (1 μL)의 PNGaseF (glycerol-free)를 첨가하였다. 샘플을 부드럽게 혼합하고 Rapid Enzyme Digestion System (ASTA, HST REDS, Suwon, Korea)을 사용하여 400 W에서 90분동안 37°C에서 배양하였다.
항체-링커 결합 부위의 분석을 위한 용액 내 분해
ADC 샘플 (100 μg)을 용액에서 분해(digestion)하였다. 간략하게, 샘플을 8M 우레아로 변성시키고 10 mM DTT (30 min at 37°C)로 환원시킨 다음, 25 mM 요오도아세트아미드로 알킬화 하였다 (실온에서 20분). 키모트립신 또는 IdeS 효소를 1 μg 키모트립신 또는 IdeS:50μg 단백질 (즉, 1:50 비율)로 첨가하고 샘플을 37°C에서 밤새 배양하였다. 배양 후, 다이제스트는 C18 SPE 카트리지를 사용하여 탈염하였다.
장비
원심분리는 Fleta 4 centrifuge (Hanil, Korea)에서 수행되었다.
모든 펩타이드 및 테트라진-포함 페이로드는 HPLC (Waters, XBridge®, C18, 4.6 Х 250 mm, 5 μm)를 사용하여 특성화되었다.
HPLC는 Waters사의 HPLC Alliance system (2996 PAD detector와 2695 separations module)을 사용하였다.
모든 펩타이드 및 페이로드등 저분자 물질 분석에 사용된 질량분석기는 Waters 사의 Quatro Premier XE 장비와 Acquity Waters LC syetem이 결합된 LC/MS를 사용하였다.
ADC 전구체 및 ADC를 포함하는 모든 항체들은 HIC-HPLC (Thermo Fisher Scientific, MAbPacTM, HIC-butyl, 4.6 Х 100 mm, 5 μm) 및 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)-HPLC (Thermo Fisher Scientific, MAbPacTM, SEC-1, 300 Å 4 Х 300 mm, 5 μm)를 사용하여 특성화되었다.
스몰 몰레큘 및 펩타이드의 질량 스펙트럼은 전기 분무 이온화 (ESI) 및 time-of-flight (TOF) 분석기인 Waters의 Quattro Premier XE mass spectrophotometer와 COSMOSIL COSMOCORE 2.6 C18 column (2.6 μm, 2.1 Х 50 mm, Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)를 사용하여 얻었다.
모든 항체의 질량은 matrix-associated laser desorption ionization 및 시나핀산 (sinapinic acid; SA)를 매트릭스로 하는 TOF 분석기 (MALDI-TOF)를 사용하여 얻었다. MALDI-TOF 질량 스펙트라는 정극성 및 선형 모드에서 작동하는 337-nm pulsed 질소 레이저가 장착된 Ultraflex III mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA)를 사용하여 획득하였다.
Ultra-performance liquid chromatography (UPLC) 및 MS 가 질량 분석에 사용되었다. 항체의 UPLC-MS 분석은 Waters Acquity UPLC 및 Waters BEH300 C4 column (1.7 μm, 2.1 Х 100 mm)에 결합된 Orbitrap Fusion Tribrid (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행되었다.
결합 부위를 분석하기 위해, 추출된 펩타이드를 Easy-nLC 시스템 (Thermo Fisher Scientific)과 결합된 quadrupole Orbitrap 질량 분석기 (Q-Exactive, Thermo Fisher Scientific)로 분석하였다. 펩타이드를 0.1% 포름산으로 재구성하고 분석 컬럼 (C18, 2 μm particle size, 50 μm id Х 15 cm length, Thermo Fisher Scientific)에서 분리하였다.
장비의 파라미터
C18-HPLC를 사용한 펩타이드 및 테트라진 포함 페이로드의 특성화
C18-HPLC는 1mL/min의 유속으로 수행되었다. 모든 화합물은 동일한 일루션 컨디션을 사용하여 분석되었다 [initial 80% mobile phase A (0.1% TFA in H2O) for 1 min followed by a 20-80% gradient of mobile phase B (0.075% TFA in ACN) in A for 15 min]. 모든 펩타이드의 크로마토그램은 280nm에서 획득하였고 페이로드의 크로마토그램은 254nm에서 획득하였다.
HIC-HPLC를 사용한 항체의 특성화
HIC-HPLC는 1mL/min의 유속에서 수행되었다. 모든 항체는 동일한 조건에서 수행되었다 [initial 100% mobile phase A (1.5 M (NH4)2SO4, 50 mM Na2HPO4 at pH 7.0, 5% isopropanol) for 1 min followed by a 0-100% gradient of mobile phase B (50 mM sodium phosphate at pH 7.0, 20% isopropanol) in A for 15 min]. 모든 크로마토그램은 280nm에서 획득되었다.
SEC-HPLC를 사용한 항체의 특성화
SEC-HPLC는 0.2mL/min의 유속에서 수행되었다. 모든 항체는 동일한 조건 하에서 분석되었다 [isocratic mobile phase D (1Х PBS) for 20 min]. 모든 크로마토그램은 280nm에서 획득되었다.
질량 분석
ESI-MS: 컬럼 온도는 25°C로 설정하고, 0.3mL/min의 유속이 사용되었다. 화합물은 5 μL의 부피로 컬럼에 주입되었다. 이동상 A는 0.05% TFA가 포함된 물로 구성된 반면, 이동상 B는 0.05% TFA와 함께 아세토니트릴로 구성되었다. 초기 구배 조건은 20% B에서 20분; 이후, B는 80%까지 점진적으로 3.5분 동안 증가되었고, 이어서 0.1 분동안 구배는 80% B에서 20% B로 감소되었다.
UPLC-MS: 컬럼 온도는 65°C로 설정되었고 0.4mL/min의 유속이 사용되었다. 10 마이크로리터의 각 항체를 컬럼에 주입하였다. 이동상 A는 0.1% 포름산과 물로 구성되었고, 이동상 B는 0.1% 포름산과 아세토니트릴로 구성되었다. 구배는 5% B로 시작하여 0.5분 동안, 그리고 10분동안 점차적으로 80%까지 증가하였다. 이후, 구배는 80% B에서 100% B로 0.1 분동안 증가하였다. 컬럼은 100% B로 2분동안 세척되었으며, 2% B에서 3분동안 평형화하였다.
Orbitrap fusion Tribrid/data analysis: 항체의 온전한 질량은 +3.2 분무 전압을 사용하여 Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer로 조사되었다. MS 시스템은 275°C에서 이온 전달 튜브를 사용하고 및 350°C 에서 기화기를 사용하여 intact protein 모드에서 작동되었다. 15.000의 해상도에서 m/z 600 부터 6000 까지 전체 스캔을 획득하였다. 온전한 매스 스펙트라는 Intact Protein workflow in BioPharma Finder 3.1 integrated software를 사용하여 분석되었고, sliding window integration와 함께 ReSpect algorithm을 조합하여 사용하여 time-resolved deconvolution를 수행하였다. Deconvolution 스펙트라는 총 16개의 이황화결합과 6개의 가능한 글리칸 콤비네이션 (G0/G0F, G0F/G0F, G0F/G1F, G1F/G1F, G1F/G2F, and G2F/G2F)에 해당하는 가변 변형이 있는 아미노산 서열을 입력하여 주석을 달았다.
MALDI-TOF: 항체는 1mg/mL의 농도로 H2O에 용해되었고, ACN:H2O (1:1) 중 0.1% TFA 중 SA의 포화 용액이 매트릭스로서 사용되었다. 항체 (2 μL)를 분쇄된 강철 384 타겟 플레이트에 스팟팅하고, 2 μL의 매트릭스 용액과 혼합하고 진공 건조하였다. FlexControl software (version 3.0)이 다음의 기기 조건에서 스펙트럼 획득에 사용되었다: m/z 2,000-300,000의 질량 범위, 최대 m/z 5,000까지 억제된 편향, 1000회 반복으로 누적된 샷, 100 Hz의 레이저 주파수, 및 이온 소스 I에서 25 kV 전압, 이온 소스 II에서 23 kV 전압, 및 렌즈에서 9 kV.
1. 티올 반응성 에디티브 선정
본 출원의 발명자들은 티올기에 대해 선택적인 반응성을 갖는 화합물을 티올 반응성 에디티브로 선정하였다. 선정된 티올 반응성 에디티브의 예시는 표 01을 통해 개시된다.
표 01. 선정된 티올 반응성 에디티브로 이용가능한 화합물
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
2. Fc 결합성 펩타이드 (Fc binding peptide)의 제조
2.1. L6Dap FcBP, L6Dab FcBP, L6Orn FcBP, L6Lys FcBP의 제조
본 출원의 발명자들은, 기능성 그룹을 포함하는 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 과정에서 티올 반응성 에디티브를 첨가하여, 티올 반응성 에디티브의 효과를 확인하였다. 기능성 그룹을 포함하는 항체를 제조하기 위해서는 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 항체의 반응이 요구된다. 티올 반응성 에디티브는 상기 반응에서 사용된다. 이하에서, 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 제조하는 방법에 대하여 설명한다. 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 Fc 결합성 펩타이드의 부분을 포함한다. Fc 결합성 펩타이드의 제조 방법이 우선적으로 설명된다. Fc 결합성 펩타이드와 이의 합성 방법은 문헌 [출원번호 PCT/KR2020/003282의 PCT 특허 출원 (공개번호 WO2020/184944 A1); 및 Lee, TaeJin, et al. "Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody." Journal of Medicinal Chemistry 65.7 (2022): 5751-5759.] 에서 상세히 설명되며, 상기 각각의 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 출원의 발명자들은 고체 합성법을 이용하여 L6Dap FcBP, L6Dab FcBP, L6Orn FcBP, 및 L6Lys FcBP를 제조하였다. 합성된 FcBP의 구조는 도 07에 도시된다. (Dap: Diaminopropionic acid; Dab: Diaminobutyric acid; Orn: Ornithine; Lys: Lysine) 합성된 L6Dap FcBP, L6Dab FcBP, L6Orn FcBP, 및 L6Lys FcBP에 대한 정보는 다음과 같다:
- Sequence: Ac-PEG8-DCAWH-(Dap, Dab, Orn, or Lys)-GELVWCT-amide (All L-form amino acid)
- N-term: acetylation (= Ac)
- C-term: Amidation (=amide)
- Cys-Cys disulfide oxidation
L6Dap FcBP, L6Dab FcBP, L6Orn FcBP, 및 L6Lys FcBP은 PCT 특허출원 출원번호 PCT/KR2020/003282 (공개번호 WO2020/184944 A1)를 참고하여 합성되었다. 구체적으로, 출원번호 PCT/KR2020/003282의 "실험예"의 "1.2. 위치-특이적 Fc 인터랙톰 (SSFI)의 합성 및 구조 확인"의 섹션이 참고되었다. 관련 분야의 기술자의 이해를 돕기 위해 이하에서 FcBP의 합성 방법을 설명한다.
사용된 Fmoc 아미노산 목록 및 도입순서
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-X(Boc)-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH.
여기서, Fmoc-X(Boc)-OH는 Fmoc-Dap(Boc)-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Orn(Boc)-OH, 또는 Fmoc-Lys(Boc)-OH 이다.
아미노산 도입
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 mmole에 기초하였다. 0.5 g의 Rink amide resin (0.48 mmole/g, PeptideInternational, 미국)를 합성 반응기에 넣고, 각각의 Fmoc-아미노산 블록 1 mmole의 무게를 달아 펩타이드 아미노산 서열 순서대로 C-말단에서부터 N-말단까지 준비하였다.
Fmoc-아미노산을 활성화하여 Clear amide resin에 활성화된 잔기를 부착하는 반응을 C-말단 아미노산부터 순차적으로 진행하였다.
Fmoc의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF에서 수행하였고 잔기의 활성화 및 도입은 서열에 맞추어 준비한 아미노산을 2 mL 0.5 M HOBt 함유 DMF 용액, 2 mL 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액, 그리고 174 μL DIPEA와 5 분간 혼합한 다음 레진이 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 혼합하였다.
도입 반응의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반응으로 확인되면 도입 반응을 1회 더 반복하거나 20% Ac2O함유 DMF용액으로 캡핑을 실시하였다. 각 도입 반응과 Fmoc 제거 과정에서 다음 단계로 넘어가기 전에 DMF와 DCM으로 수지를 충분히 세척하였다. 이러한 과정은 목표한 펩타이드 서열이 완성될 때까지 반복하여 진행하였다.
H-PEG8-OH의 도입
아미노산 도입이 모두 끝난 다음에 N-말단에 H-PEG8-OH를 도입하기 위하여 1 mL 0.5 M Fmoc-N-amido-dPEG8-acid in DMF 용액, 1 mL 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액, 1 mL 0.5 M HOBt 함유 DMF 용액, 그리고 87 μL DIPEA와 5 분간 혼합한 다음 반응 레진이 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 혼합하였다.
반응의 진행은 카이저 시험법으로 확인하였으며, 미반응 아민이 남아있는 것으로 판단되면 반응 시간을 1 ~ 3시간 더 연장하거나 반응액을 비우고 상기의 반응 과정을 다시 반복하였다. N-말단의 Fmoc 보호기의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF를 사용하여 수행한 다음, 펩타이드가 부착된 레진을 건조하고 중량을 측정하였다.
상기 과정에서 준비한 펩타이드가 부착된 수지 250 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT (94:1.0:2.5:2.5)의 혼합액 2 mL과 함께 실온에서 120 분간 교반하여 레진에서 펩타이드를 절단하였다. 절단 혼합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩타이드를 침전시켰다. 침전된 펩타이드를 에테르로 3 회 더 세척하고 질소 가스로 건조하였다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% ACN 함유 물에 녹인 다음 6 시간 동안 교반한 다음 농축하였다.
농축액을 5%-DMSO-20%-ACN 함유 0.01 M ammonium acetate buffer (pH 6.5) 용액에 0.1 mg/mL 농도로 녹인 다음 공기 노출된 상태로 3 일 동안 교반하였다. 이황화 결합 형성 반응의 진행은 HPLC로 관측하였으며, 더 이상 진행하지 않는 것으로 판단되면 반응액을 동결건조하여 펩타이드 침전물을 얻었다.
정제 및 분석
상기 (c) 과정에서 동결건조하여 얻은 펩타이드 침전물을 prep-LC 1차 정제 조건에서 분리한 다음 prep-LC 2차 정제 조건으로 추가 정제하고 동결 건조하였다. Prep-LC의 정제 조건은 다음과 같다:
- Prep-LC 1차 정제 조건
장비명: Water 2525pump, Waters 2487 UV detector; 컬럼: Waters, XBridge Prep C18 5μm OBD 19x250 mm; 이동상 A/B: 0.1% TFA-20% ACN/0.1% TFA in 80% ACN; 구배: 0min -> 30min, B 0% -> B 100%; 유속: 17mL/min; 검출파장 UV 280nm.
- Prep-LC 2차 정제 조건
장비명: Water 2525pump, Waters 2487 UV detector; 컬럼: Waters, XBridge Prep C18 5μm OBD 19x250mm; 이동상 A/B: 0.1% TFA-30% ACN/0.1% TFA in 70% ACN; 구배: 0min -> 30min, B 0% -> B 100%; 유속: 15mL/min; 검출파장 UV 280nm.
얻어진 펩타이드는 각각 90% 이상의 순도임을 분석용 HPLC로 확인하였다. 구체적으로, HPLC는 Waters사의 HPLC Alliance system, 2996 PAD detector와 2695 separations module을 사용하고 분석은 1mL/min의 유속에서 initial 80% mobile phase A (0.1% TFA in H2O) for 1 min followed by a 20-80% gradient of mobile phase B (0.075% TFA in ACN) in A for 15 min 조건으로 수행하였다. 합성한 펩타이드의 분자량을 질량 분석기(Bruker, Ultraflextreme) (측정 매트릭스: CHCA(a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid) & DHB(2,5-Dihydroxybenzoic acid))를 통해 확인하였다.
질량 분석 결과는 다음과 같다:
- L6Dap FcBP: 1968.21 g/mol (Calculated molecular weight); 984.71 g/mol (M+2H)2+ (Measured molecular weight)
- L6Dab FcBP: 1982.24 g/mol (Calculated molecular weight); 992.33 g/mol (M+2H)2+ (Measured molecular weight)
- L6Orn FcBP: 1996.26 g/mol (Calculated molecular weight); 999.13 g/mol (M+2H)2+ (Measured molecular weight)
- L6Lys FcBP: 2010.29 g/mol (Calculated molecular weight); 2011.89 g/mol (M+H)+ (Measured molecular weight)
2.2. L6Dap FcBP, L6Dab FcBP, L6Orn FcBP, L6Lys FcBP의 구조
전술한 과정에 의해 합성된 L6Dap FcBP, L6Dab FcBP, L6Orn FcBP, 및 L6Lys FcBP의 구조가 도 07에 도시된다.
3. 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 (Compound for transferring functional group to antibody) 제조
3.1. 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 제조 (1): FcBP-N3 (화합물 7)
Figure pct00039
화합물 1의 제조
2 mL (18.94 mmol, 1.0 당량)의 2-(Chloroethoxy)ethanol을 12 mL의 물에 녹이고 3.08 g (47.35 mmol, 2.5 당량)의 NaN3를 첨가하여 80 ℃에서 16 시간동안 교반하였다. 20 mL의 5% NaOH를 천천히 적가하여 반응을 종결시킨 후, 다이에틸 에터 (Diethyl ether) 용매를 이용하여 생성물을 유기층으로 추출하였다. 이후 Na2SO4를 이용하여 유기층을 건조하고 감압 농축을 통해 생성물을 수득하였다 (2.47 g, 99%). 획득한 생성물은 추가적인 정제 과정없이 다음 반응에 사용하였다.
화합물 2의 제조
2.47 g (18.84 mmol, 1.0 당량)의 화합물 1을 50 mL의 아세톤 용매에 녹이고 75.36 mL (75.36 mmol, 4.0 당량)의 0 ℃에서 Jone's reagent를 천천히 적가하여 3 시간동안 교반하였다. 이후 상온에서 1 시간동안 교반하고, 0 ℃에서 포화탄산수소나트륨 용액을 천천히 적가하여 반응을 종결하였다. 에틸아세테이트 용매를 이용하여 생성물을 유기층으로 추출하였다. 이후 Na2SO4를 이용하여 유기층을 건조하고 감압 농축을 통해 생성물을 수득하였다 (2.69 g, 98%). 획득한 생성물은 추가적인 정제 과정없이 다음 반응에 사용하였다.
화합물 3의 제조
2.69 g (18.58 mmol, 1.0 당량)의 화합물 2를 50 mL의 다이클로로메탄 용매에 녹이고 2.43 mL (27.86 mmol, 1.5 당량)의 oxalyl chloride와 1 방울의 디메틸포름아미드를 0 ℃에서 천천히 적가하였다. 반응 용액을 18 시간동안 교반한 후, 감압 농축을 통하여 oxalyl chloride를 제거하였다. Oxalyl chloride를 완전히 제거하기 위하여 다이클로로메탄 용매를 넣어 추가로 감압 농축을 3 회 더 진행하였고, 잔류물을 진공 건조하여 수득하였다. 획득한 생성물 (2.42 g, 80%)은 추가적인 정제 과정없이 다음 반응에 사용하였다.
화합물 4의 제조
1.047 g (8.1 mmol, 1.5 당량)의 1,1-Dimethylethyl 2-mercaptoacetate를 30 mL의 다이클로로메탄 용매에 녹이고 DIPEA와 혼합하여 5 분간 교반하였다. 다이클로로메탄 용매에 녹아있는 0.8 g (5.40 mmol, 1.0 당량)의 화합물 3을 상온에서 16 시간동안 교반하였다. 반응 종결 후 10% 구연산 용액과 혼합하여 생성물을 유기층으로 추출하였다. 이후 Na2SO4를 이용하여 유기 층을 건조하여 감압 농축하였고 컬럼 크로마토그래피 정제법을 통해 화합물 4 (0.73 g, 99%)를 성공적으로 정제하였다.
화합물 5의 제조
0.73 g (2.66 mmol, 1.0 당량)의 화합물 4를 10 mL의 다이클로로메탄 용매에 녹이고 10 mL의 TFA를 0 ℃에서 천천히 적가하였다. 반응 용액을 3시간동안 교반한 후, 감압 농축을 통하여 TFA를 제거하였다. TFA를 완전히 제거하기 위하여 다이클로로메탄 용매를 넣어 추가로 감압 농축을 2 회 더 진행하였고, 잔류물을 진공 건조하여 수득하였다. 획득한 생성물은 추가적인 정제 과정없이 다음 반응에 사용하였다.
화합물 6의 제조
0.05 g (0.228 mmol, 1.0 당량)의 화합물 5를 3 mL의 아세톤 용매에 녹이고 0.03 g (0.255 mmol, 1.12 당량)의 NHS와 촉매량의 DMAP를 첨가하여 상온에서 5 분간 교반하였다. 이후 다이클로로메탄 용매에 녹아있는 EDCi 용액을 반응 용액에 0 ℃에서 천천히 적가하여 18 시간동안 교반하였다. 반응 후 감압 농축을 통하여 용매를 제거한 후 컬럼 크로마토그래피 정제법을 통해 화합물 6을 성공적으로 수득하였다.
화합물 7의 제조
화합물 6 (0.09 mmol, 1.2 당량)에 디메틸포름아마이드 용액 5 mL을 넣고, SPPS (Solid phase peptide synthesis) 방법으로 합성된 FcBP (L6Dap FcBP) (0.08 mmol, 1.0 당량) 펩타이드 합성물을 넣고 다이아이소프로필에틸아민 (0.32 mmol, 4.2 당량)을 첨가하여 상온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 Prep-HPLC (C18)으로 정제하고, 동결건조하여 화합물 7 (105 mg, 63.2%)을 수득하였다. 화합물 7 (FcBP-N3)의 상세한 구조는 도 08에 도시된다. 얻어진 화합물 7의 질량을 질량분석기 (Waters, Quatro Premier XE 및 Acquity Waters LC syetem이 결합된 분석 장비 사용)를 통해 분석하였으며, 합성된 화합물 7의 질량 분석 (Mass analysis) 데이터는 도 09에 도시된다. ([M+2H]2+: 1086.9; [M+3H]3+: 725.5)
3.2. 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 제조 (2): FcBP-C6PEG4 (화합물 17)
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
화합물 8의 제조
고체상 합성법을 이용하여 합성하였다. 2-클로로트리틸 클로라이드레진 (2-chlorotrityl chloride resin) (1.4 mmol/g) 2 g에 다이클로로메탄 (Dichloromethane) 50 mL를 첨가하여 30 분간 교반하였다. 교반 후 용매를 제거 하고, 다음 반응을 위해 플루오레닐메톡시카보닐-L-6-아미노헥사노익 에시드 (Fmoc-L-6-aminohexanoic acid) (5.6 mmol, 2.0 당량)와 다이아이소프로필에틸아민 (N,N'-Diisopropylethylamine) (11.2 mmol, 4.0 당량)를 40 mL 의 다이클로로메탄과 섞어 레진 (resin)에 넣었다. 상온에 2 시간 교반 후 반응 용액을 제거하였다. 그 후 남아 있는 레진을 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드 (Dimethylformamide)로 각각 50 mL x 3 회 첨가하여 레진을 씻어 화합물 8을 제조하였다.
화합물 9의 제조
20 % 피페리딘이 함유된 디메틸포름아마이드 (부피 비율) 용액 40 mL 를 레진에 넣고 10 분간 상온에서 교반해주고, 교반 후 반응 용액을 제거하였다 (2 회 반복). 그 후 남아 있는 레진을 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드 (Dimethylformamide)로 20 mL 첨가하여 각각 3 회씩 씻었다. 다음 반응에 사용되는 N-알파-플루오레닐메톡시카보닐-N-입실론-[1(4,4-다이메틸-2,6-다이옥시사이클로헥-1-일리딘)에틸]-L-라이신 (N-alpha-Fmoc-N-epsilon-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxycyclohex-1-ylidine)ethyl]-L-lysine) (5.6 mmol, 2.0 당량)과 하이드록시벤조트라이아졸(Hydroxybenzotriazole) (11.2 mmol, 4.0 당량)과 다이아이소프로필카보다이이마이드(N,N'-Diisopropylcarbodiimide) (5.6 mmol, 2 당량)을 레진에 넣고, 디메틸포름아마이드 50 mL를 용매로 사용하여 2 시간 동안 상온에서 교반 후 반응 용액을 제거하였다. 이후, 상기 과정을 N-알파-플루오레닐메톡시카보닐-N-입실론-[1(4,4-다이메틸-2,6-다이옥시사이클로헥-1-일리딘)에틸]-L-라이신과 2-아지도아세트 산 (2-Azidoacetic acid) 순서대로 넣어 동일하게 반복하여 진행하였다. 2-아지도아세트 산 반응 후, 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드로 각각 50 mL x 3 회 첨가하여 레진을 씻어 화합물 9를 제조하였다.
화합물 10의 제조
5% 하이드라진 함유 디메틸포름아마이드 (부피비율)를 레진에 50 mL 넣어 준 후 상온에서 10 분간 교반 후 반응 용액은 제거하였다. 그 후 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드로 각각 50 mL x 3 회 첨가하여 레진을 씻어 화합물 10을 제조하였다.
화합물 11의 제조
N-알파-플루오레닐메톡시카보닐-N-입실론-플루오레닐메톡시카보닐-L-라이신 (N-alpha-Fmoc-N-epsilon-Fmoc-L-lysine) (11.2 mmol, 4.0 당량)과 하이드록시벤조트라이아졸 (22.4 mmol, 8.0 당량)과 다이아이소프로필카보다이이마이드 (11.2 mmol, 4.0 당량)을 레진에 넣고 디메틸포름아마이드 50 mL를 용매로 사용하여 2 시간 동안 상온에서 교반 후 반응 용액을 제거하였다. 반응 후 20 % 피페리딘이 함유된 디메틸포름아마이드 (부피 비율) 용액 40 mL 를 레진에 넣고 10 분간 상온에서 교반하고, 용액을 제거하였다 (2 회 반복). 그 후 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드로 각 50 mL x 3 회 첨가하여 레진을 씻었다. 다음 과정으로 4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사핵사코사노익 에시드 (4,7,10,13,16,19,22,25-Octaoxahexacosanoic acid) (22.4 mmol, 8.0 당량)를 넣어 준 후 위 과정과 동일하게 하이드록시벤조트라이아졸 (44.8 mmol, 16.0 당량)과 다이아이소프로필카보다이이마이드 (22.4 mmol, 8.0 당량)을 레진에 넣어준 후, 용매로 디메틸포름아마이드 50 mL를 넣어 2 시간 동안 상온에서 교반 후 반응 용액을 제거하였다. 반응 후에 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드로 각 50 mL x 3회 첨가하여 씻어준 후 레진은 건조하여 화합물 11를 제조하였다.
화합물 12의 제조
95:2.5:2.5 (TFA:TIS:DW) 부피 비율로 트라이플루오로아세트 산 (TFA, Trifluoroacetic acid), 트라이아이소프로필실란 (TIS, Triisopropylsilane)과 물 (DW, deionized water)을 50 mL 섞어 화합물 14 제지까지 진행된 레진에 넣고 상온에서 2 시간 교반하였다. 교반 후 용액과 레진을 분리하였다. 분리된 용액에 0 ℃ 다이에틸 에터 (Diethyl ether)를 500 mL 넣고 섞어준 후, 0 ℃에서 2 시간 이상 방치하였다. 석출된 생성물을 필터해 준 후 0 ℃ 다이에틸 에터 50 mL 첨가 후 다시 필터하였다 (2 회 반복). 이후, 생성물을 건조해 화합물 12 (2.13 mmol, 76%)를 제조하였다.
화합물 13의 제조
상기 화합물 12 (1 g, 0.433 mmol)와 테트라메틸-O-(N-석시니미딜)우로니움 테트라플루오로보레이트 (Tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uronium tetrafluoroborate) (1 mmol, 2.0 당량)을 디메틸포름아마이드 5 mL에 섞어준 후 다이아이소프로필에틸아민 (1.3 mmol, 3.0 당량)을 넣고 상온에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후 트라이플루오로아세트 산으로 용액의 pH가 4.0 이 되도록 넣어주었다. 반응 용액을 Prep-HPLC (C18)으로 정제하여 화합물 13 (0.303 mmol, 70%)을 수득하였다.
화합물 14의 제조
상기 화합물 13 (0.303 mmol)과 tert-부틸 2-머캅토아세테이트 (tert-Butyl 2-mercaptoacetate) (0.606 mmol, 2.0 당량)을 디메틸포름아마이드 5 mL에 섞어 준 후 다이아이소프로필에틸아민 (0.909 mmol, 3.0 당량)을 넣고 상온에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후 트라이플루오로아세트 산으로 용액의 pH가 4.0 이 되도록 넣어주었다. 반응 용액을 Prep-HPLC (C18)으로 정제하고, 동결건조하여 화합물 14 (0.242 mmol, 80%)을 수득하였다.
화합물 15의 제조
상기 화합물 14 (0.242 mmol)에 트라이플루오로아세트 산과 다이클로로메탄을 1:1 부피비율로 10 mL 넣어준 후, 상온에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후 감압 농축기로 용액을 제거 한 후 다시 다이클로로메탄 10 mL을 넣고 감압 농축 (3 회 반복)을 수행하여 화합물 18을 제조하였다. 화합물 15은 건조하여 -80 ℃에 보관하였다.
화합물 16의 제조
상기 화합물 15 (0.242 mmol)에 디메틸포름아마이드 용액 10 mL을 넣고 다이아이소프로필에틸아민을 첨가하여 pH를 8~9로 조절하였다. 상온에서 10 분간 교반 후 테트라메틸-O-(N-석시니미딜)우로니움 테트라플루오로보레이트 (0.7 mmol, 2.0 당량)를 넣어준 후 다이아이소프로필에틸아민 (0.375 mmol, 1.0 당량)을 같이 첨가하여 상온에서 2 시간 교반하였다. 반응 종료 후 트라이플루오로아세트 산으로 용액의 pH가 4.0이 되도록 넣어주었다. Prep-HPLC (C18)으로 정제하고, 동결건조하여 화합물 16 (0.124 mmol, 51%)를 수득하였다.
화합물 17의 제조
상기 화합물 16 (0.173 mmol)에 디메틸포름아마이드 용액 5 mL을 넣고, SPPS(Solid phase peptide synthesis) 방법으로 합성된 FcBP (L6Dap FcBP) (0.225 mmol, 1.2 당량) 펩타이드 합성물을 넣고 다이아이소프로필에틸아민 (0.26 mmol, 1.5 당량)을 첨가하여 상온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 Prep-HPLC (C18)으로 정제하고, 동결건조하여 화합물 17 (283 mg, 0.066 mmol, 53%)을 수득하였다. 화합물 17 (FcBP-C6PEG4)의 상세한 구조는 도 10에 도시된다. 얻어진 화합물 17의 질량을 질량분석기(Waters, Quatro Premier XE 및 Acquity Waters LC syetem이 결합된 분석 장비 사용)를 통해 분석하였으며, 화합물 17 (FcBP-C6PEG4)의 질량 분석 데이터는 도 11에 도시된다. ([M+3H]3+: 1440.0)
3.3. 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 제조 (3): FcBP-C6PEG3 (화합물 27)
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
화합물 18의 제조
2-클로로트리틸 클로라이드레진 (2-chlorotrityl chloride resin) (1.4 mmol/g) 5 g에 다이클로로메탄 (Dichloromethane) 50 mL를 첨가하여 30 분간 교반하였다. 교반 후 용매를 제거 하고, 다음 반응을 위해 플루오레닐메톡시카보닐-L-6-아미노헥사노익 에시드 (Fmoc-L-6-aminohexanoic acid) (14 mmol, 2.0 당량)와 다이아이소프로필에틸아민 (N,N’-Diisopropylethylamine) (28 mmol, 4.0 당량)를 40 mL 의 다이클로로메탄과 섞어 레진 (resin)에 넣었다. 이후, 상온에서 2 시간 교반 후, 반응 액을 제거하였다. 그 후 남아 있는 레진을 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드 (Dimethylformamide)로 각각 50 mL x 3 회 첨가하여 레진을 씻어 화합물 18을 제조하였다.
화합물 19의 제조
20 % 피페리딘이 함유된 디메틸포름아마이드 (부피 비율) 용액 40 mL 를 레진에 넣고 10 분간 상온에서 교반해주고, 교반 후 반응 용액을 제거하였다 (2 회 반복). 그 후 남아 있는 레진을 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드 (Dimethylformamide)로 20 mL x 3 회 첨가하여 씻었다. 다음 반응에 사용되는 N-알파-플루오레닐메톡시카보닐-N-입실론-[1(4,4-다이메틸-2,6-다이옥시사이클로헥-1-일리딘)에틸]-L-라이신 (N-alpha-Fmoc-N-epsilon-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxycyclohex-1-ylidine)ethyl]-L-lysine) (14 mmol, 2.0 당량)과 하이드록시벤조트라이아졸 (Hydroxybenzotriazole) (28 mmol, 4.0 당량)과 다이아이소프로필카보다이이마이드 (N,N’-Diisopropylcarbodiimide) (14 mmol, 2.0 당량)을 레진에 넣고 디메틸포름아마이드 50 mL를 용매로 사용하여 2 시간 동안 상온에서 교반 후 반응 용액을 제거하였다. 이후, 상기 과정을 아미노산 N-알파-플루오레닐메톡시카보닐-N-입실론-[1(4,4-다이메틸-2,6-다이옥시사이클로헥-1-일리딘)에틸]-L-라이신과 4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사핵사코사노익 에시드 (4,7,10,13,16,19,22,25-Octaoxahexacosanoic acid) 순서대로 넣어 동일하게 반복하여 진행하였다. 4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사핵사코사노익 에시드 반응 후 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드로 각각 50 mL x 3 회 첨가하여 레진을 씻어 화합물 19를 제조하였다.
화합물 20의 제조
5% 하이드라진 함유 디메틸포름아마이드 (부피비율)를 레진에 50 mL 넣어 준 후 상온에서 10 분간 교반 후 반응 용액은 제거하였다. 그 후 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드로 각각 50 mL x 3 회 첨가하여 레진을 씻어 화합물 20을 제조하였다.
화합물 21의 제조
N-알파-플루오레닐메톡시카보닐-N-입실론-[1(4,4-다이메틸-2,6-다이옥시사이클로헥-1-일리딘)에틸]-L-라이신 (28 mmol, 4.0 당량)과 하이드록시벤조트라이아졸 (56 mmol, 8.0 당량)과 다이아이소프로필카보다이이마이드 (28 mmol, 4.0 eq)을 레진에 넣고 디메틸포름아마이드 50 mL를 용매로 사용하여 2 시간 동안 상온에서 교반 후 반응 용액을 제거하였다. 반응 후 20 % 피페리딘이 함유된 디메틸포름아마이드 (부피 비율) 용액 40 mL 를 레진에 넣고 10 분간 상온에서 교반하고, 반응 용액을 제거하였다 (2회 반복). 그 후 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드로 각 50 mL x 3 회 첨가하여 레진을 씻었다. 다음 반응으로 2-아지도아세트 산 (2-Azidoacetic acid) (28 mmol, 2.0 당량)를 넣어준 후 위 과정과 동일하게 하이드록시벤조트라이아졸 (56 mmol, 4.0 당량)과 다이아이소프로필카보다이이마이드 (28 mmol, 2.0 당량)을 레진에 넣어준 후 용매로 디메틸포름아마이드 50 mL를 넣어 2시간동안 상온에서 교반 후 용액은 제거하였다. 반응 후에 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드로 각 50 mL x 3 회 첨가하여 씻었다. 다음 과정으로 화합물 3 제조 과정을 동일하게 수행하였다. 2,5,8,11,14,17,20,23-옥타옥사핵사코산-26-오익-에시드 (28 mmol, 2.0 당량)와 하이드록시벤조트라이아졸 (56 mmol, 4.0 당량)과 다이아이소프로필카보다이이마이드 (28 mmol, 2.0 당량)를 순서대로 넣고 용매로 디메틸포름아마이드 50 mL를 넣어 2시간 동안 상온에서 교반 후 용액은 제거하였다. 반응이 완료된 후 다이클로로메탄과 디메틸포름아마이드로 각각 50 mL x 3 회 첨가하여 씻어준 후 레진은 건조하여 화합물 21를 제조하였다.
화합물 22의 제조
95:2.5:2.5 (TFA:TIS:DW) 부피 비율로 트라이플루오로아세트 산 (TFA, Trifluoroacetic acid), 트라이아이소프로필실란 (TIS, Triisopropylsilane)과 물 (DW, deionized water)을 50 mL 섞어 화합물 4 제지까지 진행된 레진에 넣고 상온에서 2시간 교반하였다. 교반 후, 용액과 레진을 분리하였다. 분리된 용액에 0 ℃ 다이에틸 에터 (Diethyl ether)를 500 mL 넣고 섞어준 후, 0 ℃에서 2 시간 이상 방치하였다. 석출된 생성물을 필터해 준 후 0℃ 다이에틸 에터 50 mL 첨가 후 다시 필터하였다 (2 회 반복). 이후 생성물을 건조하여 화합물 22 (5.11 mmol, 73%)를 제조하였다.
화합물 23의 제조
상기 화합물 22 (0.996g, 0.5 mmol)와 테트라메틸-O-(N-석시니미딜)우로니움 테트라플루오로보레이트 (Tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uronium tetrafluoroborate) (1 mmol, 2.0 당량)을 디메틸포름아마이드 5 mL에 섞어준 후 다이아이소프로필에틸아민 (1.5 mmol, 3.0 당량)을 넣고 상온에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후 트라이플루오로아세트 산으로 용액의 pH가 4.0 이 되도록 넣어주었다. 반응 용액을 Prep-HPLC (C18)으로 정제하여 화합물 23 (0.375 mmol, 75%)을 수득하였다.
화합물 24의 제조
상기 화합물 23 (0.375 mmol)과 tert-부틸 2-머캅토아세테이트 (tert-Butyl 2-mercaptoacetate) (0.7 mmol, 2.0 당량)을 디메틸포름아마이드 5 mL에 섞어준 후 다이아이소프로필에틸아민 (1.1 mmol, 3.0 당량)을 넣고 상온에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후 트라이플루오로아세트 산으로 용액의 pH가 4.0 이 되도록 넣어주었다. 반응 용액을 Prep-HPLC (C18)으로 정제하고, 동결건조하여 화합물 24 (0.3 mmol, 80%)을 수득하였다.
화합물 25의 제조
상기 화합물 24 (0.375 mmol)에 트라이플루오로아세트 산과 다이클로로메탄을 1:1 부피비율로 10 mL 넣어 준 후 상온에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후 감압 농축기로 용액을 제거한 후 다시 다이클로로메탄 10 mL을 넣고 감압 농축을 수행하여 (3 회 반복) 화합물 8을 수득하였다. 화합물 25은 건조하여 -80 ℃에 보관하였다. (0.297 mmol, 99%)
화합물 26의 제조
상기 화합물 25 (0.375 mmol)에 디메틸포름아마이드 용액 10 mL을 넣고 다이아이소프로필에틸아민을 첨가하여 pH를 8~9로 조절하였다. 상온에서 10 분간 교반 후 테트라메틸-O-(N-석시니미딜)우로니움 테트라플루오로보레이트 (0.7 mmol, 2.0 당량)를 넣어준 후 다이아이소프로필에틸아민 (0.375 mmol, 1.0 당량)을 같이 첨가하여 상온에서 2 시간 교반하였다. 반응 종료 후 트라이플루오로아세트 산으로 용액의 pH가 4.0 이 되도록 넣어주었다. Prep-HPLC (C18)으로 정제하고, 동결건조하여 화합물 26 (0.173 mmol, 46%)를 수득하였다.
화합물 27의 제조
상기 화합물 26 (0.173 mmol)에 디메틸포름아마이드 용액 5 mL을 넣고, SPPS(Solid phase peptide synthesis) 방법으로 합성된 FcBP (L6Dap FcBP) (0.225 mmol, 1.2 당량) 펩타이드 합성물을 넣고 다이아이소프로필에틸아민 (0.26 mmol, 1.5 당량)을 첨가하여 상온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 Prep-HPLC (C18)으로 정제하고, 동결건조하여 화합물 27 (348 mg, 0.087 mmol, 50%)을 수득하였다. 화합물 27 (FcBP-C6PEG3)의 상세한 구조는 도 12에 도시된다. 얻어진 화합물 27의 질량을 질량분석기(Waters, Quatro Premier XE 질량분석 장비와 Acquity Waters LC syetem이 결합된 분석 장비를 사용)를 통해 분석하였으며, 합성된 화합물 27의 질량 분석 (Mass analysis) 데이터는 도 13에 도시된다. ([M+3H]3+: 1340.0)
3.4. 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 제조 (4): FcBP-azidobenzoic acid (화합물 31)
Dichloromethane에 dithiodiglycolic acid를 녹인 후, glycine t-butyl ester (2.2 당량), N,N-diiso-propylamine(4.8 몰당량), 및 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (2.4 몰당량)을 첨가한다. 그리고 혼합물을 한시간동안 교반한다. 반응물을 분리하고 물로 세척하고, 유기층을 수득하고 감압 하에서 농축한다. 수득된 잔류물을 N,N-dimethylformamide/water(1:1)에 녹이고, tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (1.3 몰당량)을 가하고 상온에서 한시간 교반한다. 용액을 에틸 아세테이트로 추출하고 감압 하에서 농축하고 ethyl acetate/hexane 으로 실리카겔 컬럼 처리하여 화합물 28을 수득한다.
Figure pct00048
화합물 28을 dichloromethane에 녹이고, 4-azidobenzoic acid (1 몰당량), 1H-benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (1.2 몰당량), 및 N,N-diisopropylethylamine (1.5 몰당량)을 첨가하고, 혼합물을 상온에서 30분동안 교반한다. 반응물을 실리카겔 컬럼으로 정제한다. 이후 얻어진 백색 결정을 dichloromethane/trifluoroacetic acid (1:1)에 녹이고, 상온에서 한시간 동안 교반한다. 반응액을 동결건조하여 thioglycolate를 이탈기로 갖는 제1 링커(화합물 29)를 얻는다.
Figure pct00049
화합물 29와 화합물 30을 반응시켜 FcBP-azidobenzoic acid(제1 링커-FcBP, 화합물 31)을 제조한다. 구체적인 방법은 아래와 같다.
FcBP (화합물 30), 화합물 29 (40 몰당량), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (32 몰당량), 및 1-hydroxybenzotriazole (32 몰당량)을 혼합하고, 혼합물을 두시간동안 교반한다. 반응 완결 후 HPLC로 정제하여 FcBP-azidobenzoic acid(제1 링커-FcBP, 화합물 31)을 얻는다.
Figure pct00050
4. 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조에서 티올 반응성 에디티브의 효과 확인 1
아래의 실험예를 통해, 기능성 그룹을 포함하는 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 과정에서 티올 반응성 에디티브를 사용하는 경우, 기능성 그룹을 포함하는 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 수율이 증가함을 확인하였다.
4.1. FcBP-N3 (화합물 7)를 사용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조에서 티올 반응성 에디티브의 효과 확인
(1) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조
1) 생체직교적 작용기(azide)를 포함하는 항체의 제조
이하의 방법을 통해 기능성 그룹을 포함하는 항체를 제조하였다. FcBP-N3 (화합물 7)는 DMSO 용매 중 10 mM의 농도로 준비하였다. 티올 반응성 에디티브 (N-tert-butylmaleimide)는 DMSO 용매 중 100 mM 및 1000 mM의 농도로 준비하였다. 1 mg의 항체(trastuzumab)와 항체를 기준으로 0, 10, 100, 1000, 및 6910 당량의 티올 반응성 에디티브(N-tert-butylmaleimide)를 1 x PBS (pH 7.4)하에서 섞어주었다. 항체의 표적 위치를 기준으로 할 때 (예를 들어, 항체에는 2개의 K248이 존재하므로), 각각 0, 5, 50, 500, 및 3455 당량의 티올 반응성 에디티브가 사용되었다. 상온에서 약 10분간 혼합 후, 항체를 기준으로 10 당량의 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물(화합물 7, FcBP-N3-)을 첨가하고, 6-7 시간동안 혼합하였다. 표적 위치를 기준으로 할 때, 5 당량의 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 사용되었다. 반응 후, 과량의 FcBP-N3-와 티올 반응성 에디티브(N-tert-butylmaleimide)는 크기배제 크로마토그래피, 스핀 탈염, 그리고 투석기법을 이용하여 제거하고, 생체직교적 작용기 (azied)를 포함하는 항체를 얻었다. 기능성 그룹(여기서는, 아자이드)을 포함하는 항체의 모식도는 도 14에 도시된다.
2) 페이로드 합성
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
화합물 32의 제조
4-하이드록시-3-나이트로벤잘데하이드(4 g, 29.6 mmol)을 120 mL 아세토니트릴에 녹인 후 분자체(molecular-sieve, 10 g)를 첨가하였다. 그리고 아세토브로모- α -D- 글루쿠로닉 에씨드 메틸 에테르(10.3 g, 32.6 mmol)와 산화은(Ⅰ)(7 g, 30.2 mmol)을 넣고 아르곤 대기 하에서 18 시간 동안 교반하였다. 반응용액을 셀라이트로 여과 후 감압 농축하고 에틸 아세테이트와 증류수 넣어 유기층을 추출하였다. 모인 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조하였다. 여과 후 농축하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 32(12.6 g, 88%)을 수득하였다.
화합물 33의 제조
화합물 32(12.6 g, 26.0 mmol)을 아이소프로필 알코올(50.6 mL)과 클로로포름(185 mL)에 녹인 후 0 ℃, 질소 대기하에서 소듐 보로하이드라이드(1.67 g, 44.1 mmol)를 서서히 첨가하고 2.5시간 동안 교반하였다. 반응용액에 증류수를 넣고 15분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이드와 증류수를 넣어 유기층을 추출하였다. 모인 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하였다. 여과 후 농축하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 33(7.7 g, 61.1 %)을 수득하였다.
화합물 34의 제조
화합물33(6.7 g, 14.2 mmol)를 에틸 아세테이트(90 mL), 에탄올(190 mL), 메탄올(44 mL)에 녹인 후 팔라듐(0.33 g)을 넣고 수소 대기하에서 3시간 동안 교반하였다. 반응용액을 셀라이트로 여과 후 감압 농축하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 34을 (5.3 g, 76.9%) 수득하였다.
화합물 35의 제조
플루오레닐메틸옥시카보닐-베타-알라닌(Fmoc-beta-alanine)(2.46 g, 7.9 mmol)을 디클로로메탄(13 mL), N,N-다이메틸폼아마이드(0.5 mL)에 녹인 후 질소 대기하에서 옥살릴클로라이드(1.36 mL, 15.8 mmol)을 서서히 첨가하고 2시간동안 교반하였다. 반응용액을 감압 농축 후, 디클로로메탄(33 mL)에 용해된 화합물 34에 0 ℃에서 천천히 적가한다. 반응용액을 농축 후 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 35(3.9 g, 79.1%) 수득하였다.
화합물 36의 제조
화합물 35(2.5 g, 3.34 mmol)을 디클로로메탄(30 mL)에 녹인 후 비스(4-나이트로페닐)카보네이트(1.73 g, 5.7 mmol), N,N-디아이소프로필에틸아민(0.99 mL, 5.68 mmol)를 넣고 2시간 동안 교반하였다. 반응용액을 감압 농축하고 컬럼 크로마토그래피 정제하여 화합물 36(2.3 g, 75.4%) 수득하였다.
화합물 37의 제조
화합물 36(1 g, 1.09 mmol)을 N,N-디아이소프로필에틸아민(10.8 mL)에 녹인 후 모노메틸아우리스탄틴 E(MMAE, 0.864 g, 1.2 mmol), N-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBt·H2O, 0.44 g, 3.27 mmol), N,N-디아이소프로필에틸아민(0.28 mL, 1.64 mmol)을 넣고 상온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응용액을 감압농축하고 컬럼 크로마토그래피 정제하여 화합물 37(1.45 g, 89%) 수득하였다.
화합물 38의 제조
화합물 37(1.4 g, 9.37 mmol)을 메탄올(15.2 mL)에 녹인 후 0.4N 리튬하이드록사이드 용액(1.5 mL)를 넣고 6시간 동안 교반하였다. 반응용액을 컬럼 크로마토그래피 정제하여 화합물 38(0.62 g, 59%) 수득하였다.
화합물 39 (페이로드)의 제조
화합물 38 (0.6g, 0.53 mmol)을 N,N-다이메틸폼아마이드(5 mL)에 녹인 후 DBCO-C6-NHS (0.27g, 0.64 mmol), N,N-디아이소프로필에틸아민(185 μL, 1.06 mmol)을 넣고 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응용액을 컬럼 크로마토그래피 정제하여 화합물 39(0.5g, 65%) 수득하였다.
3) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조
아자이드와 클릭화학 반응을 하는 DBCO 작용기 및 약물을 포함하는 페이로드 (화합물 39)는 DMSO 용매 중 10mM의 농도로 준비하였다. 투석기법 이후 얻어진 생체직교적 작용기(azide)가 연결된 항체 1mg (1mg/ml)와 페이로드 (화합물 39)를 1 x PBS 버퍼 (pH 7.4)에서 섞어주고, 1일 동안 반응을 진행하였다. 이때, 반응 위치 당 3 당량의 페이로드가 사용되었다. 반응은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 관찰하였다. 반응 종결 후, 크기배제 크로마토그래피, 스핀 탈염, 그리고 투석 기법을 이용하여 과량의 페이로드를 제거하였다.
(2) 티올 반응성 에디티브의 사용 효과 확인
1) 분석 방법
전술한 방법에 따라 항체-약물 컨쥬게이트를 제조 후, 이를 Hydrophobic-Interaction Chromatography (HIC)-HPLC 를 이용하여 분석하였다. 분석에는 HIC-butyl, 4.6 x 100 mm, 5μm 사양의 컬럼 (MAbPacTM, Thermo Fisher Scientific) 이 사용되었다.
2) 분석 결과
티올 반응성 에디티브의 사용 여부 및 티올 반응성 에디티브의 첨가량에 따른 항체-약물 컨쥬게이트의 수율을 분석하였다. 분석 결과는 도 15에 도시된다. 구체적으로, 도 15의 (a)는 티올 반응성 에디티브가 존재하지 않는 경우에 대한 결과이다. (b)는 5 당량 (5 equiv.)의 티올 반응성 에디티브 샘플에 대한 결과이다. (c)는 50 당량의 티올 반응성 에디티브 샘플에 대한 결과이다. (d)는 500 당량의 티올 반응성 에디티브 샘플에 대한 결과이다. (e)는 3455 당량의 티올 반응성 에디티브 샘플에 대한 결과이다.
기능성 그룹을 포함하는 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 과정에서 티올 반응성 에디티브가 사용되는 경우, 티올 반응성 에디티브가 사용되지 않은 경우보다 항체-약물 컨쥬게이트의 수율이 높게 관찰되었다.
또한, 사용되는 티올 반응성 에디티브의 양이 증가할수록 항체-약물 컨쥬게이트의 수율이 높아졌다. 3455 당량의 티올 반응성 에디티브가 사용된 경우 관찰된 항체-약물 컨쥬게이트의 수율은 500 당량의 티올 반응성 에디티브가 사용된 경우 관찰된 항체-약물 컨쥬게이트의 수율보다 낮았다.
4.2. FcBP-C6PEG4 (화합물 17)을 사용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조에서 티올 반응성 에디티브의 효과 확인
(1) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조
1) 기능성 그룹(aizde)을 포함하는 항체의 제조
FcBP-C6PEG4 (화합물 17)는 DMSO 중 10mM 농도로 준비하였다. 티올 반응성 에디티브(N-tert-butylmaleimide)는 DMSO 중 100mM 및 1000mM의 농도로 준비하였다. 1mg (1mg/mL)의 항체(trastuzumab)와 항체를 기준으로 0, 10, 100, 1000, 및 6910 당량의 티올 반응성 에디티브를 1 x PBS (pH 7.4) 하에서 섞어주었다. 항체의 표적 위치를 기준으로 할 때, 각각 0, 5, 50, 500, 및 3455 당량의 티올 반응성 에디티브가 사용되었다. 상온에서 약 10분간 혼합 후, 항체를 기준으로 10 당량의 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 (화합물 17, FcBP-C6PEG4-)을 첨가하고, 6-7 시간동안 혼합하였다. 표적 위치를 기준으로 할 때, 5 당량의 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 사용되었다. 반응 후, 과량의 FcBP-C6PEG4-와 티올 반응성 에디티브(N-tert-butylmaleimide)는 크기배제 크로마토그래피, 스핀 탈염 그리고 투석기법을 이용하여 제거하였다. 기능성 그룹(azide)을 포함하는 항체의 모식도는 도 16에 도시된다.
2) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조
아자이드와 클릭화학 반응을 하는 DBCO 작용기 및 약물을 포함하는 페이로드 (화합물 39)는 DMSO 용매 중 10mM의 농도로 준비하였다. 투석기법 이후 얻어진 생체직교적 작용기(azide)가 연결된 항체 1mg (1mg/ml)와 페이로드 (화합물 39)를 1 x PBS 버퍼 (pH 7.4)에서 섞어주고, 1일동안 반응을 진행하였다. 이때, 반응 위치 당 3 당량의 페이로드가 사용되었다. 반응은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 관찰하였다. 반응 종결 후, 크기배제 크로마토그래피, 스핀 탈염, 그리고 투석 기법을 이용하여 과량의 페이로드를 제거하였다.
(2) 티올 반응성 에디티브의 사용 효과 확인
1) 분석 방법
전술한 방법에 따라 항체-약물 컨쥬게이트를 제조 후, 이를 Hydrophobic-Interaction Chromatography (HIC)-HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석에는 HIC-butyl, 4.6 x 100 mm, 5μm 사양의 컬럼 (MAbPacTM, Thermo Fisher Scientific) 이 사용되었다.
2) 분석 결과
티올 반응성 에디티브의 사용 여부 및 티올 반응성 에디티브의 첨가량에 따른 항체-약물 컨쥬게이트의 수율을 분석하였다. 분석 결과는 도 17에 도시된다. 도 17의 (a)는 티올 반응성 에디티브가 존재하지 않는 경우에 대한 결과이다. (b)는 5 당량 (5 equiv.)의 티올 반응성 에디티브 샘플에 대한 결과이다. (c)는 50 당량의 티올 반응성 에디티브 샘플에 대한 결과이다. (d)는 500 당량의 티올 반응성 에디티브 샘플에 대한 결과이다. (e)는 3455 당량의 티올 반응성 에디티브 샘플에 대한 결과이다.
기능성 그룹을 포함하는 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 과정에서 티올 반응성 에디티브가 사용되는 경우, 티올 반응성 에디티브가 사용되지 않은 경우보다 항체-약물 컨쥬게이트의 수율이 높게 관찰되었다.
또한, 사용되는 티올 반응성 에디티브의 양이 증가할수록 항체-약물 컨쥬게이트의 수율이 높아졌다. 3455 당량의 티올 반응성 에디티브가 사용된 경우 관찰된 항체-약물 컨쥬게이트의 수율은 500 당량의 티올 반응성 에디티브가 사용된 경우 관찰된 항체-약물 컨쥬게이트의 수율보다 낮았다.
4.3. FcBP-C6PEG3 (화합물27)을 사용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조에서 티올 반응성 에디티브의 효과 확인
(1) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조
1) 기능성 그룹(azide)을 포함하는 항체의 제조
FcBP-C6PEG3 (화합물 27)는 DMSO 중 10mM 농도로 준비하였다. 티올 반응성 에디티브(N-tert-butylmaleimide)는 DMSO 중 100mM 및 1000mM의 농도로 준비하였다. 1mg (1mg/mL)의 항체(trastuzumab)와 항체를 기준으로 0, 10, 100, 1000, 및 6910 당량의 티올 반응성 에디티브를 1 x PBS (pH 7.4) 하에서 섞어주었다. 항체의 표적 위치를 기준으로 할 때, 각각 0, 5, 50, 500, 및 3455 당량의 티올 반응성 에디티브가 사용되었다. 상온에서 약 10분간 혼합 후, 항체를 기준으로 10 당량의 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 (화합물 27, FcBP-C6PEG3)을 첨가하고, 6-7 시간동안 혼합하였다. 표적 위치를 기준으로 할 때, 5 당량의 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 사용되었다. 반응 후, 과량의 FcBP-C6PEG3과 티올 반응성 에디티브(N-tert-butylmaleimide)는 크기배제 크로마토그래피, 스핀 탈염 그리고 투석기법을 이용하여 제거하였다. 기능성 그룹(여기서는, 아자이드)을 포함하는 항체의 모식도는 도 18에 도시된다.
2) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조
아자이드와 클릭화학 반응을 하는 DBCO 작용기 및 약물을 포함하는 페이로드 (화합물 39)는 DMSO 용매 중 10mM의 농도로 준비하였다. 투석기법 이후 얻어진 생체직교적 작용기(azide)가 연결된 항체 1mg (1mg/ml)와 페이로드 (화합물 39)를 1 x PBS 버퍼 (pH 7.4)에서 섞어주고, 1일동안 반응을 진행하였다. 이때, 반응 위치 당 3 당량의 페이로드가 사용되었다. 반응은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 관찰하였다. 반응 종결 후, 크기배제 크로마토그래피, 스핀 탈염, 그리고 투석 기법을 이용하여 과량의 페이로드를 제거하였다.
(2) 티올 반응성 에디티브의 사용 효과 확인
1) 분석 방법
전술한 방법에 따라 항체 약물 컨쥬게이트를 제조 후, 이를 Hydrophobic-Interaction Chromatography (HIC)-HPLC 를 이용하여 분석하였다. 분석에는 HIC-butyl, 4.6 x 100 mm, 5μm 사양의 컬럼 (MAbPacTM, Thermo Fisher Scientific) 이 사용되었다.
2) 분석 결과
티올 반응성 에디티브의 사용 여부 및 티올 반응성 에디티브의 첨가량에 따른 항체-약물 컨쥬게이트의 수율을 분석하였다. 분석 결과는 도 19에 도시된다. 구체적으로, 도 19의 (a)는 티올 반응성 에디티브가 존재하지 않는 경우에 대한 결과이다. (b)는 5 당량 (5 equiv.)의 티올 반응성 에디티브 샘플에 대한 결과이다. (c)는 50 당량의 티올 반응성 에디티브 샘플에 대한 결과이다. (d)는 500 당량의 티올 반응성 에디티브 샘플에 대한 결과이다. (e)는 3455 당량의 티올 반응성 에디티브 샘플에 대한 결과이다.
기능성 그룹을 포함하는 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트(DAR 4, 4개의 약물이 컨쥬게이트 됨)의 제조 과정에서 티올 반응성 에디티브가 사용되는 경우, 티올 반응성 에디티브가 사용되지 않은 경우보다 항체-약물 컨쥬게이트의 수율이 높게 관찰되었다.
또한, 사용되는 티올 반응성 에디티브의 양이 증가할수록 항체-약물 컨쥬게이트의 수율이 높아졌다. 3455 당량의 티올 반응성 에디티브가 사용된 경우 관찰된 항체-약물 컨쥬게이트의 수율은 500 당량의 티올 반응성 에디티브가 사용된 경우 관찰된 항체-약물 컨쥬게이트의 수율보다 낮았다.
4.4. FcBP-azidobenzoic acid (화합물 31)를 사용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조에서 티올 반응성 에디티브의 효과 확인
(1) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조
1) 기능성 그룹(azide)을 포함하는 항체의 제조
4.1. 의 (1) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조에 설명된 방법과 유사한 방법으로, 티올 반응성 에디티브(N-tert-butylmaleimide), FcBP-azidobenzoic acid, 및 항체(트라스트주맙)을 사용하여 생체직교적 작용기(azide)를 포함하는 항체를 제조한다.
2) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조
4.1. 의 (1) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조에 설명된 방법과 유사한 방법으로, 기능성 그룹을 포함하는 항체와 DBCO 및 약물을 포함하는 페이로드를 사용하여 항체-약물 컨쥬게이트를 제조한다.
(2) 티올 반응성 에디티브의 사용 효과 확인
1) 분석 방법
4.1. 의 (2) 티올 반응성 에디티브의 사용 효과 확인에 설명된 방법과 유사한 방법으로, HPLC를 이용하여 제조된 항체 약물 컨쥬게이트를 분석한다.
2) 분석 결과
4.1. 의 (2) 티올 반응성 에디티브의 사용 효과 확인에 설명된 방법과 유사한 방법으로, 티올 반응성 에디티브의 사용 여부 및 티올 반응성 에디티브의 첨가량에 따른 항체-약물 컨쥬게이트의 수율을 분석한다.
5. 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조에서 티올 반응성 에디티브의 효과 확인 2
본 출원의 발명자들은, 이전의 연구에서 합성된 기능성 그룹을 포함하는 항체 (norbornene을 포함하는 항체)의 제조에서, 티올 반응성 에디티브가 미치는 영향을 확인하였다. 이전의 연구에서 합성된 기능성 그룹을 포함하는 항체(즉, norbornene을 포함하는 항체)의 제조 방법 및 상기 기능성 그룹을 포함하는 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트와 관련된 데이터는 본 명세서에 그 내용 전체가 참조로 포함되는 문헌인 출원번호 PCT/KR2020/003282의 PCT 특허 출원 (공개번호 WO2020/184944 A1)의 실험예; 및 문헌 [Lee, TaeJin, et al. "Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody." Journal of Medicinal Chemistry 65.7 (2022): 5751-5759.]에서 상세히 설명된다. 출원번호 PCT/KR2020/003282의 PCT 특허 출원 (공개번호 WO2020/184944 A1)의 문헌에서 설명되는 기능성 그룹을 포함하는 항체는, 상술한 내용과 유사하게, 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 및 항체의 반응에 의해 제조되었다. 항체로는 트라스트주맙(trastuzumab)이 사용되었다.
5.1. 본 실험에 사용된 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 제조
(1) tert-Butyl (5-exo-norbornene carbonylthio)acetate (화합물 40)의 제조
5-엑소-노보넨 카르복실산 (5-Exo-norbornene carboxylic acid) (200 mg, 1.45 mmol, 1.0 equiv.)을 5 mL DMF에 녹였다. 헥사플로오로포스페이트 아자벤조트리아졸 테트라메틸 우로니움(Hexafluorophosphate azabenzotriazole tetramethyl uranium; HATU) (660 mg, 1.74 mmol, 1.2 equiv.) 및 DIPEA (0.66 mL, 3.48 mmol, 2.4 equiv.)을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 대기하에서 교반하였다. 반응 혼합물에 테트라 부틸 α 티오아세테이트 (tert-Butyl α-thioacetate) (0.25 mL, 1.74 mmol, 1.2 equiv.)를 천천히 첨가하였다. 16 시간 후, DMF 를 감압하에서 제거하고, 테트라-부틸 (5-엑소-노르보르넨 카보닐티오)아세테이트 carbonylthio) (tert-Butyl (5-exo-norbornene carbonylthio)acetate) (화합물 32) (350 mg, 90%, white solid)를 헥산(hexane) 중 2% 에틸 아세테이트를 사용한 플래시 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. RF = 0.5 (10% ethyl acetate in hexane); MS (ESI): m/z 269.34 [M+H]+ HRMS: [M+H]+ calcd. for C14H21O3S 269.1206 Found 269.1214
Figure pct00054
(화합물 40)
(2) (5-Exo-norbornene carbonylthio)acetic acid NHS ester (화합물 41)의 제조
얼음물 배스에서, 5mL DCM 내 화합물 40의 용액 (310 mg, 1.16 mmol, 1.0 equiv.)에 5mL TFA를 천천히 첨가하였다. 2시간 후, TFA 를 감압하에서 제거하고, 잔류물을 DCM(5mL)에 재용해시키고 휘발성 물질을 감압 하에서 3회 제거하였다. 잔류물을 고진공 하에 건조시키고 10mL DCM에 재용해시켰다. 얼음물 배스에서 DIPEA (0.6 mL, 3.48 mmol, and 3.0 equiv.)를 천천히 첨가하여 용액의 pH를 9.0으로 조정하고, N,N,N′,N′-tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uronium tetrafluoroborate (1.05 g, 3.48 mmol, 3.0 equiv.)를 첨가하였다. 3시간 후, 반응 혼합물을 10% 시트르산 및 염수로 세척하고 Na2SO4- -상에서 건조시켰다. 이어서 용매를 감압하에 제거하였다. 흰색 고체로서 화합물 41 (310 mg, 87%)을 헥산(hexane) 중 10% 에틸 아세테이트를 사용하여 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. RF = 0.3 (33% ethyl acetate in hexane); MS (ESI): m/z 310.26 [M+H]+ HRMS: [M+H]+ calcd. for C14H16NO5S 310.0744, found 310.0756
Figure pct00055
(화합물 41)
(3) 항체에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 제조
합성된 펩타이드인 L6Dap FcBP, L6Dab FcBP, L6Orn FcBP, 및 L6Lys FcBP (실험예의 섹션 "2. Fc 결합성 펩타이드의 제조" 참고) 각각과 화합물 41을 사용하여 FcBP-norbornene을 제조하였다. DMF 중 화합물 41 1.5 당량 및 6 당량의 DIPEA(N,N-diisopropylethylamine)를 사용(이때, FcBP는 1당량)하여 5-엑소-노르보르넨 티오에스터 (5-exo-norbornene thioester)를 각 펩타이드의 아민 작용기 (펩타이드의 6번째 위치)에 도입하였다. 최종 FcBP-norbornene은 분취용 HPLC (preparative HPLC)으로 정제되었고, 이들의 순도는 분석용 HPLC(analytical HPLC)에 의해 검증되었다.
합성된 FcBP(L6Dap)-norbornene를 분취용 HPLC을 통해 정제하였고 동결건조하여 흰색 고체를 얻었다. 순도는 분석용 HPLC로 확인하였다. MS (ESI): m/z 1082.34 [M+2H]2+. FcBP(L6Dap)-norbornene의 구조는 도 20에 도시된다. FcBP(L6Dap)-norbornene의 HPLC 크로마토그램 데이터(RT=14.7min)는 도 21에 도시된다.
합성된 FcBP(L6Dab)-norbornene을 분취용 HPLC을 통해 정제하였고 동결건조하여 흰색 고체를 얻었다. 순도는 분석용 HPLC로 확인하였다. MS (ESI): m/z 1089.94 [M+2H]2+. FcBP(L6Dab)-norbornene의 구조는 도 22에 도시된다. FcBP(L6Dab)-norbornene의 HPLC 크로마토그램 데이터(RT=14.6min)는 도 23에 도시된다.
합성된 FcBP(L6Orn)-norbornene을 분취용 HPLC을 통해 정제하였고 동결건조하여 흰색 고체를 얻었다. 순도는 분석용 HPLC로 확인하였다. MS (ESI): m/z 1089.94 [M+2H]2+. FcBP(L6Orn)-norbornene의 구조는 도 24에 도시된다. FcBP(L6Orn)-norbornene의 HPLC 크로마토그램 데이터(RT=14.7min)는 도 25에 도시된다.
합성된 FcBP(L6Lys)-norbornene을 분취용 HPLC을 통해 정제하였고 동결건조하여 흰색 고체를 얻었다. 순도는 분석용 HPLC로 확인하였다. MS (ESI): m/z 1089.94 [M+2H]2+. FcBP(L6Lys)-norbornene의 구조는 도 26에 도시된다. FcBP(L6Lys)-norbornene의 HPLC 크로마토그램 데이터(RT=14.9min)는 도 27에 도시된다.
5.2. 티올 반응성 에디티브를 이용한, 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응 가속
(1) 티올 반응성 에디티브 없이 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응
기능성 그룹을 포함하는 항체를 제조하기 위해, 각각의 FcBP-norbornene 3당량을 트라스트주맙 (1mg/mL, 1mL)와 혼합하였다. 혼합물을 1X PBS(pH 7.4)에서 18시간 동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 반응을 HIC-HPLC로 모니터링하였다. 문헌 [PCT 특허 출원 출원번호 PCT/KR2020/003282; 및 Lee, TaeJin, et al. "Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody." Journal of Medicinal Chemistry 65.7 (2022): 5751-5759.]을 참고하면, FcBP-클릭화학작용기 (예를 들어, 아자이드 또는 norbornene)을 통해 클릭화학작용기가 항체의 Fc 도메인의 K248 위치에 전달되었음이 확인된다.
(2) 티올 반응성 에디티브 존재 하에서, 항체와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응
트라스트주맙 (1mg/mL, 1mL) 및 50 당량의 N-tert-부틸 말레이미드의 혼합물을 pH 7.4, 1xPBS에서, 25℃에서 10분동안 인큐베이션하였다. 3 당량의 각 FcBP-norbornene을 혼합물에 첨가하고 18시간동안 인큐베이션하였다. 스핀 탈염을 통해 과량의 펩타이드와 스캐빈져를 제거하였다. FcBP-norbornene과 트라스트주맙의 크로스링킹을 모니터링하고 HIC-HPLC 분석을 진행하였다.
(3) 결과의 비교
티올 반응성 에디티브의 유무에 따른 크로스링킹 비율 (즉, 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 비율)이 조사되었으며, HIC-HPLC 분석을 통해 도출된 결과는 도 28 내지 도 29에서 설명된다. 하기의 표 02 및 표 03은 도 29에 도시된 그래프의 결과를 요약한 것이다. 도 28 및 도 29의 (a)는 티올 반응성 에디티브가 존재하지 않는 경우의 FcBP-norbornene 별 크로스링킹 모니터링 결과이다. 도 28 및 도 29의 (b)는 티올 반응성 에디티브 존재 하의 조건에서, FcBP-norbornene 별 크로스링킹 모니터링 결과이다. 도 28 내지 도 29 및 표 02 내지 표 03에서, T/1-N은 trastuzumab/1-norbornene conjugate, 즉, 트라스트주맙에 하나의 노르보르넨이 크로스링킹된 것을 나타낸다. T/2-N은 trastuzumab/2-norbornene conjugate, 즉, 트라스트주맙에 두개의 노르보르넨이 크로스링킹된 것을 나타낸다 (이때, 노르보르넨은 각각의 중쇄의 Fc 영역의 K248에 연결됨) (문헌 [PCT 특허 출원 출원번호 PCT/KR2020/003282; 및 Lee, TaeJin, et al. "Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody." Journal of Medicinal Chemistry 65.7 (2022): 5751-5759.] 참고).
표 02. 티올 반응성 에디티브 부재 하의 크로스링킹 비율 (HIC-HPLC 분석 결과)
Figure pct00056
표 03. 티올 반응성 에디티브 존재 하의 크로스링킹 비율 (HIC-HPLC 분석 결과)
Figure pct00057
(4) FcBP(L6Dap)-norbornene에 대한 추가 실험: 반응 시간에 따른 반응 정도 확인
트라스트주맙 (5.4 mg/mL, 10 mL)을 50 당량의 N-tert-부틸 말레이미드와 함께 pH 7.4, 1xPBS에서, 25℃에서 10분동안 인큐베이션하였다 (대조군에는 N-tert-부틸 말레이미드가 사용되지 않음). 이후, 5 당량의 FcBP(L6Dap)-norbornene을 첨가하고 6시간동안 인큐베이션하였다. 과량의 FcBP(L6Dap)-norbornene 및 N-tert-부틸 말레이미드를 제거하기 위해, 반응 혼합물을 스핀 탈염 처리한 후, 추가 조사를 수행하였다. 미반응 트라스트주맙의 비오티닐화를 위해, 1 당량의 트라스트주맙의 FcBP-biotin (bFcBP)10을 상기 혼합물과 함께 1xPBS (pH 7.4)에서 인큐베이션 하였다 (6시간, 25°C). 비오티닐화된 항체의 제거를 위해, 스트랩타비딘 비드를 상기 항체 혼합물에 처리하였다. 미반응 또는 부분 반응 트라스트주맙의 비오틴-스트렙타비딘 풀다운 후, 고순도의 T/2-N을 얻었다. 반응하지 않은 접합체의 제거는 HIC-HPLC로 모니터링하였으며, 정제된 T/2-N의 온전한 질량은 LC-MS로 분석되었다 (도 30 내지 도 31 참고) (문헌 [Lee, TaeJin, et al. "Site-Selective Antibody-Drug Conjugation by a Proximity-Driven S to N Acyl Transfer Reaction on a Therapeutic Antibody." Journal of Medicinal Chemistry 65.7 (2022): 5751-5759.] 참고). 도 31에서, T/2-N은 trastuzumab/2-norbornene conjugate, 즉, 트라스트주맙에 두개의 노르보르넨이 크로스링킹된 것을 나타낸다.
반응은 HIC-HPLC로 모니터링되었다. HIC-HPLC 모니터링 결과는 도 31에 도시된다. 구체적으로, 도 32는 인큐베이션 시간에 따른 HIC-HPLC 모니터링 결과를 도시한다. (a)는 트라스트주맙(5.9min)의 피크, (b)는 2h 인큐베이션, (c)는 4h 인큐베이션, (d)는 6h 인큐베이션을 나타낸다.
6. 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조에서 티올 반응성 에디티브의 효과 확인 3
6.1. 본 실험에서 사용된 티올 반응성 에디티브
본 "6. 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조에서 티올 반응성 에디티브의 효과 확인 3"에서는 하기의 티올 반응성 에디티브 1 내지 12을 사용하여 실험을 진행하였다. 하기의 표 04를 통해 본 실험에서 사용된 티올 반응성 에디티브 1 내지 12를 개시한다.
표 04. 본 실험에서 사용된 티올 반응성 에디티브
Figure pct00058
Figure pct00059
다음의 화합물들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다: 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) (Cas No. 69-78-3) (Cat No. D218200); Phenyl disulfide (Cas No. 882-33-7) (Cat No. 169021); 4-Aminophenyl disulfide (Cas No. 722-27-0) (Cat No. 369462); Aldrithiol??-2 (Cas No. 2127-03-9) (Cat No. 143049); Aldrithiol??-4 (Cas No. 2645-22-9) (Cat No. 143057); 및 2,2'-Dithiodibenzoic acid (Cas No. 119-80-2) (Cat No. 43761).
다음의 화합물들은 Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan)로부터 구매하였다: N-Tertbutylmaleimide (Cas No. 4144-22-3) (Cat No. B3638); 2,2'-Dithiodianiline (Cas No. 1141-88-4) (Cat No. D1246); 4,4'-Dichlorodiphenyl Disulfide (Cas No. 1142-19-4) (Cat No. D0360); Bis(2-nitrophenyl) Disulfide (Cas No. 1155-00-6) (Cat No. B0503); Di-p-tolyl Disulfide (Cas No. 103-19-5) (Cat No. T1074); 및 Bis(4-nitrophenyl) Disulfide (Cas No. 100-32-3) (Cat No. B0504).
6.2. FcBP-N3 (화합물 7)을 사용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조에서 티올 반응성 에디티브의 효과 확인
(1) 대조군 준비
1) 기능성 그룹(azide)를 포함하는 항체의 제조
1mg (1mg/mL)의 항체와 항체를 기준으로 10 당량의 FcBP-N3 (화합물 7)을 1 x PBS (pH 7.4) 하에서 섞어주었다. 상온에서 6-7 시간동안 반응 후 과량의 FcBP-N3 (화합물 7)는 크기배제 크로마토그래프, 스핀 탈염 및 투석기법을 이용하여 제거하여 생체직교적 작용기(azide)를 포함하는 항체를 얻었다.
2) 항체-약물(MMAE) 컨쥬게이트의 제조
페이로드 (화합물 39)는 DMSO 중 10mM 농도로 준비하였다. 투석기법 이후 얻어진 생체직교적 작용기 (azide)가 연결된 항체 1mg (1mg/mL)와 페이로드 (화합물 39)를 1 x PBS (pH 7.4) 하에서 섞어주고, 1일 동안 반응을 진행하였다. 이때, 반응 위치 당 3 당량의 페이로드가 사용되었다. 반응은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 관찰하였다. 반응 종결 후, 크기 배제 크로마토그래피, 스핀 탈염, 그리고 투석 기법을 이용하여 과량의 페이로드를 제거하여, 항체-약물(MMAE) 컨쥬게이트를 얻었다.
(2) 티올 반응성 에디티브를 사용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조
1) 기능성 그룹 (aizde)를 포함하는 항체의 제조
FcBP-N3 (화합물 7)은 DMSO 중 10mM의 농도로 준비하였다. 티올 반응성 에디티브 1 내지 12는 DMSO 중 100mM 농도로 준비하였다. 1mg (1mg/mL)의 항체(항-CLDN18.2 항체, 문헌 [한국특허출원 출원번호 10-2021-7023724, 공개번호 10-2021-0110339] 참조)와 항체를 기준으로 100 당량의 각각의 티올 반응성 에디티브 (티올 반응성 에디티브 1 내지 12)를 1 x PBS (pH 7.4) 하에서 섞어주었다. 표적 위치를 기준으로 할 때, 50 당량의 티올 반응성 에디티브가 사용되었다. 상온에서 약 10분간 혼합 후, 항체를 기준으로 10 당량의 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 (화합물 7, FcBP-N3)을 첨가하고, 6-7 시간 동안 섞어주었다. 표적 위치를 기준으로 할 때, 5 당량의 FcBP-N3가 사용되었다. 반응 후, 과량의 FcBP-N3와 티올 반응성 에디티브를 크기배제 크로마토그래피, 스핀 탈염, 그리고 투석기법을 이용하여 제거하였다. 본 실험에서 사용된 항-CLDN18.2 항체는 서열번호 81의 서열을 갖는 두개의 경쇄와 서열번호 82의 서열을 갖는 두개의 중쇄를 포함하는 항체이다. 기능성 그룹(azide)를 포함하는 항체의 모식도는 도 14에 도시된다.
- DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQTLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQSPQLLIYWASTGESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQNAYFYPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 81)
- QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVAVIWAGGSTNYNSALMSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAAYYGNGLDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 82)
2) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조
페이로드 (화합물 39)는 DMSO 중 10mM의 농도로 준비하였다. 투석기법 이후 얻은 생체직교적 작용기(azide)를 포함하는 항체 1mg (1mg/mL)와 페이로드 (화합물 39)를 1 x PBS (pH 7.4) 하에서 섞어주고, 1일 동안 반응하였다. 이때, 페이로드는 반응 위치를 기준으로 3 당량이 사용되었다. 반응은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 관찰하였다. 반응 종결 후, 크기배제 크로마토그래피, 스핀 탈염, 그리고 투석 기법을 이용하여 과량의 페이로드를 제거하여, 항체-약물(MMAE) 컨쥬게이트를 얻었다.
(3) 티올 반응성 에디티브의 사용 효과 확인
1) 분석 방법
전술한 방법에 따라 항체-약물 컨쥬게이트를 제조 후, 이를 Hydrophobic-Interaction Chromatography (HIC)-HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석에는 HIC-butyl, 4.6 x 100 mm, 5μm 사양의 컬럼 (MAbPacTM, Thermo Fisher Scientific) 이 사용되었다.
2) 분석 결과
티올 반응성 에디티브의 사용 여부에 따른 항체-약물 컨쥬게이트의 수율을 분석하였다. 티올 반응성 에디티브 1 내지 12의 사용에 대한 HIC-HPLC 분석 결과는 도 33 내지 도 39에 도시된다. 하기의 표는 도 33 내지 도 39의 결과를 요약한 것이다. 대조군은 티올 반응성 에디티브가 존재하지 않는 경우에 대한 결과이다. 항체 또는 제조되는 항체-약물 컨쥬게이트의 비율은 HIC-HPLC 분석 그래프의 피크의 면적을 통해 도출되었다.
표 05. 티올 반응성 에디티브의 사용 여부에 따른 항체-약물 컨쥬게이트 제조 수율 (FcBP-N3)
Figure pct00060
6.3. FcBP-C6PEG4 (화합물 17)을 사용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조에서 티올 반응성 에디티브의 효과 확인
(1) 대조군 준비
1) 기능성 그룹(aizde)을 포함하는 항체의 제조
1mg (1mg/mL)의 항체와 항체를 기준으로 10 당량의 FcBP-C6PEG4 (화합물 17)을 1xPBS (pH 7.4) 하에서 섞어주었다. 상온에서 6-7시간동안 반응 후 과량의 FcBP-C6PEG4는 크기 배제 크로마토그래피, 스핀 탈염, 및 투석기법을 이용하여 제거하여, 생체직교적 작용기 (azide)를 포함하는 항체를 얻었다.
2) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조
페이로드 (화합물 39)는 DMSO 중 10mM의 농도로 준비되었다. 투석 기법 후 얻어진 생체직교적 작용기(azide)를 포함하는 항체 1mg (1mg/mL)와 페이로드 (화합물 39)를 1xPBS (pH 7.4) 하에서 섞어주고, 1일 동안 반d응하였다. 이때, 반응 위치 당 3.5 당량의 페이로드가 사용되었다. 반응은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 관찰하였다. 반응 종결 후, 크기배제 크로마토그래피, 스핀 탈염 그리고 투석 기법을 이용하여 과량의 페이로드를 제거하여, 항체-약물(MMAE) 컨쥬게이트를 얻었다.
(2) 티올 반응성 에디티브를 사용한 항체-약물 컨쥬게이트 제조
1) 기능성 그룹(aizde)을 포함하는 항체의 제조
FcBP-C6PEG4 (화합물 17)은 DMSO 중 10mM의 농도로 준비하였다. 티올 반응성 에디티브 1 내지 12는 DMSO 중 100mM 농도로 준비하였다. 1mg (1mg/mL)의 항체(항-CLDN18.2 항체, 문헌 [한국특허출원 출원번호 10-2021-7023724, 공개번호 10-2021-0110339] 참조)와 항체를 기준으로 100 당량의 각각의 티올 반응성 에디티브 (티올 반응성 에디티브 1 내지 12)를 1 x PBS (pH 7.4) 하에서 섞어주었다. 표적 위치를 기준으로 할 때, 50 당량의 티올 반응성 에디티브가 사용되었다. 상온에서 약 10분간 혼합 후, 항체를 기준으로 10 당량의 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물 (화합물 7, FcBP-N3)을 첨가하고, 6-7 시간 동안 섞어주었다. 표적 위치를 기준으로 할 때, 5 당량의 FcBP-N3가 사용되었다. 반응 후, 과량의 FcBP-N3와 티올 반응성 에디티브를 크기배제 크로마토그래피, 스핀 탈염, 그리고 투석기법을 이용하여 제거하였다. 본 실험에서 사용된 항-CLDN18.2 항체는 서열번호 81의 서열을 갖는 두개의 경쇄와 서열번호 82의 서열을 갖는 두개의 중쇄를 포함하는 항체이다. 기능성 그룹(azide)를 포함하는 항체의 모식도는 도 16에 도시된다.
2) 항체-약물 컨쥬게이트의 제조
페이로드 (화합물 39)는 DMSO 중 10mM의 농도로 준비하였다. 투석기법 이후 얻은 생체직교적 작용기(azide)를 포함하는 항체 1mg (1mg/mL)와 페이로드 (화합물 39)를 1 x PBS (pH 7.4) 하에서 섞어주고, 1일 동안 반응하였다. 이때, 페이로드는 반응 위치를 기준으로 3.5 당량이 사용되었다. 반응은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 관찰하였다. 반응 종결 후, 크기배제 크로마토그래피, 스핀 탈염, 그리고 투석 기법을 이용하여 과량의 페이로드를 제거하여, 항체-약물(MMAE) 컨쥬게이트를 얻었다.
(3) 티올 반응성 에디티브의 사용 효과 확인
1) 분석 방법
전술한 방법에 따라 항체-약물 컨쥬게이트를 제조 후, 이를 Hydrophobic-Interaction Chromatography (HIC)-HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석에는 HIC-butyl, 4.6 x 100 mm, 5μm 사양의 컬럼 (MAbPacTM, Thermo Fisher Scientific) 이 사용되었다.
2) 분석 결과
티올 반응성 에디티브의 사용에 따른 항체-약물 컨쥬게이트의 수율을 분석하였다. 티올 반응성 에디티브 1 내지 12의 사용에 대한 HIC-HPLC 분석 결과는 도 40 내지 도 46에 도시된다. 하기의 표는 도 40 내지 도 46의 결과를 요약한 것이다. 표 06의 대조군은 티올 반응성 에디티브가 존재하지 않는 경우에 대한 결과이다. 항체 또는 제조되는 항체-약물 컨쥬게이트의 비율은 HIC-HPLC 분석 그래프의 피크의 면적을 통해 도출되었다.
표 06. 티올 반응성 에디티브의 사용 여부에 따른 항체-약물 컨쥬게이트 제조 수율 (FcBP-C6PEG4)
Figure pct00061
7. 티올 반응성 에디티브 중 말레이미드 계열 화합물의 항체와의 반응성 확인
7.1. 실험 방법
본 출원의 발명자들은 말레이미드 계열 화합물의 항체와의 반응성을 확인하였다.
항체(Trastuzumab) 1mg, 및 50당량의 티올 반응성 에디티브를 pH 7.4, 1XPBS에서 혼합하여 반응시켰다. 반응은 상온에서 18시간동안 진행되었다. 반응 후, 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 항체와 반응하지 않은 티올 반응성 에디티브를 제거하였다. 항체와 티올 반응성 에디티브의 반응 여부는 소수성 작용 크로마토그래피(HIC-HPLC) 및 말디토프(MALDI-TOF) 질량분석기를 이용하여 분석하였다.
7.2. 결과
실험 결과는 도 48 내지 도 54 및 아래의 표 07을 통해 개시된다. 질량 분석 결과, 항체와 반응시킨 화합물(티올 반응성 에디티브)의 분자량만큼 반응 후 혼합 샘플(mixed sample)의 분자량이 증가한 경우, 티올 반응성 에디티브가 항체와 반응했음을 알 수 있다. 도 47은 트라스트주맙의 질량 분석 결과이다.
표 07. 티올 반응성 에디티브로 이용가능한 화합물의 항체와의 반응 결과 요약
Figure pct00062
N-methylmaleimide를 항체와 반응시킨 결과, 한 분자의 N-methylmaleimide가 항체와 반응함을 알 수 있었다. 도 48과 같이, 항체와 N-methylmaleimide를 반응시킨 경우, N-methylmaleimide와 항체의 혼합 샘플의 HIC-HPLC 피크가 이동된 것을 확인할 수 있었다. 도 48과 같이, 항체와 N-methylmaleimide를 반응시킨 경우, N-methylmaleimide와 항체의 혼합 샘플의 질량이 증가하였음을 질량분석기를 통해 관찰하였다.
N-ethylmaleimide를 항체와 반응시킨 결과, 한 분자의 N-ethylmaleimide가 항체와 반응함을 알 수 있었다. 도 49와 같이, 항체와 N-ethylmaleimide를 반응시킨 경우, N-ethylmaleimide와 항체의 혼합 샘플의 HIC-HPLC 피크가 이동된 것을 확인할 수 있었다. 도 49와 같이, 항체와 N-ethylmaleimide를 반응시킨 경우, N-ethylmaleimide와 항체의 혼합 샘플의 질량이 증가하였음을 질량분석기를 통해 관찰하였다.
N-cyclohexylmaleimide를 항체와 반응시킨 결과, 한 분자의 N-cyclohexylmaleimide가 항체와 반응함을 알 수 있었다. 도 50과 같이, 항체와 N-cyclohexylmaleimide를 반응시킨 경우, N-cyclohexylmaleimide와 항체의 혼합 샘플의 HIC-HPLC 피크가 이동된 것을 확인할 수 있었다. 도 50과 같이, 항체와 N-cyclohexylmaleimide를 반응시킨 경우, N-cyclohexylmaleimide와 항체의 혼합 샘플의 질량이 증가하였음을 질량분석기를 통해 관찰하였다.
N-phenylmaleimide를 항체와 반응시킨 결과, 한 분자의 N-phenylmaleimide가 항체와 반응함을 알 수 있었다. 도 51와 같이, 항체와 N-phenylmaleimide를 반응시킨 경우, N-phenylmaleimide와 항체의 혼합 샘플의 HIC-HPLC 피크가 이동된 것을 확인할 수 있었다. 도 51과 같이, 항체와 N-phenylmaleimide를 반응시킨 경우, N-phenylmaleimide와 항체의 혼합 샘플의 질량이 증가하였음을 질량분석기를 통해 관찰하였다.
N-benzylmaleimide를 항체와 반응시킨 결과, 한 분자의 N- benzylmaleimide 가 항체와 반응함을 알 수 있었다. 도 52과 같이, 항체와 N- benzylmaleimide를 반응시킨 경우, N-benzylmaleimide와 항체의 혼합 샘플의 HIC-HPLC 피크가 이동된 것을 확인할 수 있었다. 도 52과 같이, 항체와 N- benzylmaleimide를 반응시킨 경우, N-benzylmaleimide와 항체의 혼합 샘플의 질량이 증가하였음을 질량분석기를 통해 관찰하였다.
3-maleimidopropionicacid를 항체와 반응시킨 결과, 한 분자의 3-maleimidopropionicacid가 항체와 반응함을 알 수 있었다. 도 53와 같이, 항체와 3-maleimidopropionicacid를 반응시킨 경우, 3-maleimidopropionicacid와 항체의 혼합 샘플의 HIC-HPLC 피크가 이동된 것을 확인할 수 있었다. 도 53과 같이, 항체와 3-maleimidopropionicacid를 반응시킨 경우, 3-maleimidopropionicacid와 항체의 혼합 샘플의 질량이 증가하였음을 질량분석기를 통해 관찰하였다.
N-tert-butyl-maleimide를 항체와 반응시킨 결과, N-tert-butylmaleimide는 항체와 반응하지 않음을 알 수 있었다. 도 54과 같이, 항체와 N-tert-butylmaleimide를 반응시킨 경우, N-tert-butylmaleimide와 항체의 혼합 샘플의 HIC-HPLC 피크가 이동하지 않은 것을 확인할 수 있었다. 도 54와 같이, 항체와 N-tert-butylmaleimide를 반응시킨 경우, 혼합 샘플의 질량이 증가하지 않음을 질량분석기를 통해 확인하였다.

Claims (34)

  1. 다음을 포함하는, 티올 반응성 에디티브를 이용하여, 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 통해 제조되는 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율을 높이는 방법:
    (a) 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 반응 조성물 내에서 접촉함,
    이때 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 티오에스터 그룹(thioester group), 기능성 그룹(Functional group; FG), 및 Fc 결합성 펩타이드 (Fc-binding peptide; FcBP)를 포함하고,
    이때 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 상기 티오에스터 그룹과 상기 항체의 친핵체가 반응하며,
    상기 티오에스터 그룹과 상기 항체의 친핵체의 반응의 결과로,
    기능성 그룹을 포함하는 항체, 그리고 티올 그룹 및 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물로부터 유래된 Fc 결합성 펩타이드를 포함하는 부산물이 생성되고, 이때 상기 부산물의 상기 티올 그룹은 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 티오에스터 그룹과 상기 항체의 상기 친핵체의 반응에 의해 생성되며,
    이때, 상기 부산물은 상기 반응 조성물 내 아직 반응하지 않은 항체와 아직 반응하지 않은 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 반응을 방해하는 반응 저해 효과를 가짐; 및
    (b) 상기 부산물의 상기 반응 저해 효과를 제거하기 위해, 상기 부산물과 상기 티올 반응성 에디티브를 반응 조성물 내에서 접촉함,
    이때 상기 티올 반응성 에디티브는 티올 그룹과 반응성을 갖고,
    이때 상기 티올 반응성 에디티브와 상기 부산물의 상기 티올 그룹이 반응하고,
    상기 티올 반응성 에디티브와 상기 티올 그룹의 반응의 결과로, 상기 부산물의 티올기가 캡핑됨.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 부산물의 티올기가 캡핑됨으로써, 상기 부산물의 상기 반응 저해 효과가 제거되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 항체와 반응성이 적거나 없는 화합물인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 저분자 화합물인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브의 분자량은 50 g/mol 이상 1000 g/mol 이하인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 티올-다이설파이드 교환 반응(thiol-disulfide exchange reaction)을 하는 화합물인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 다이설파이드 그룹을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 다이페닐 다이설파이드 또는 이의 유도체인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 다이페닐 다이설파이드, 다이피리딜다이설파이드 (Dipyridyldisulfide), 5,5′-다이티오비스-(2-니트로벤조익산) (5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid); DTNB), 2,2'-다이티오다이벤조익산 (2,2′-Dithiodibenzoic acid), 4-아미노페닐 다이설파이드(4-Aminophenyl disulfide), 2-아미노페닐 다이설파이드(2-Aminophenyl disulfide), Bis(4-클로로페닐) 다이설파이드 (Bis(4-chlorophenyl disulfide), Bis(2-니트로페닐) 다이설파이드 (Bis(2-nitrophenyl disulfide), p-톨릴 다이설파이드 (p-tolyl disulfide), Bis(4-니트로페닐) 다이설파이드 (Bis(4-nitrophenyl) disulfide), Bis(2-니트로페닐) 다이설파이드 (Bis(2-nitrophenyl) disulfide), Bis(4-메톡시페닐) 다이설파이드 (Bis(4-methoxyphenyl) disulfide), 또는 Bis(2-메톡시페닐) 다이설파이드 (Bis(2-methoxyphenyl) disulfide), 또는 이의 유도체인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 5,5′-다이티오비스-(2-니트로벤조익산) (5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid); DTNB) 또는 2,2'-다이피리딜다이설파이드 (2,2'-Dipyridyldisulfide)인, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 화학식 06의 구조를 갖는 화합물인, 방법:
    [화학식 06]
    Figure pct00063
    ,
    이때,
    A는 5-원 또는 6-원 아로마틱 고리이고, 이때 A는, 선택적으로, 하나 이상의 헤테로원자를 고리 상에 포함하고, 이때 헤테로원자는 각각 독립적으로 N, O, 및 S 중에서 선택되며,
    p는 0 내지 4의 정수이고,
    Ra는, 각각 독립적으로, -R, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택되고,
    B는 5-원 또는 6-원 아로마틱 고리이고, 이때 B는, 선택적으로, 하나 이상의 헤테로원자를 고리 상에 포함하고, 이때 헤테로원자는 각각 독립적으로 N, O, 및 S 중에서 선택되며,
    q는 0 내지 4의 정수이고,
    Rb는, 각각 독립적으로, -R, -NO2, -CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택되고,
    R은, 각각 독립적으로, H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, =O, =S, 및 -NH2 중에서 선택됨.
  12. 제11항에 있어서,
    Ra 중 적어도 어느 하나는 전자 끄는 그룹(Electron Withdrawing Group) 또는 친수성 그룹(hydrophilic group)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    Rb 중 적어도 어느 하나는 전자 끄는 그룹(Electron Withdrawing Group) 또는 친수성 그룹(hydrophilic group)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 말레이미드 또는 이의 유도체인, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 말레이미드, N-메틸말레이미드 (N-Methylmaleimide), N-에틸말레이미드 (N-Ethylmaleimide), N-페닐말레이미드 (N-Phenylmaleimide), N-벤질말레이미드 (N-Benzylmaleimide), 3-말레이미도프로피오닉산 (3-Maleimidopropionic acid), N-tert-부틸말레이미드 (N-tert-butylmaleimide), 또는 N-시클로헥실말레이미드 (N-Cyclohexylmaleimide), 또는 이의 유도체인, 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 tert-부틸 말레이미드인 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 화학식 09의 구조를 갖는 화합물인, 방법:
    [화학식 09]
    Figure pct00064
    ,
    이때, Rc는 -R, =O, =S, -NO2, -CR3, -CH2CR3, -NR2, -OR, -SR, -SO2R, -OSO2R, -PO2R2, -OPOR2, -C(=O)R, -C(=O)CR3, -C(=O)OR, 및 -C(=O)NR2 중에서 선택되고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -OH, =O, =S, -NH2, 및 -SH 중에서 선택됨.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브는 화학식 10 내지 화학식 31 중 어느 하나의 구조를 갖는 화합물인 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물은 화학식 01의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법:
    [화학식 01]
    FU-RU-PU,
    이때,
    FU는 기능성 그룹(functional group; FG)을 포함하는 기능성 유닛 (Functional Unit)이고,
    RU는 티오에스터 그룹을 포함하는 반응성 유닛 (Reactive Unit) 이고,
    PU는 Fc 결합성 펩타이드 (Fc-binding peptide; FcBP)를 포함하는 펩티드 유닛(Peptide Unit; PU)임.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 결합성 펩타이드는 8 내지 20 아미노산 잔기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 결합성 펩타이드는 서열번호 02 내지 서열번호 80 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 이와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 그룹은 하나 이상의 생체직교적 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 생체직교적 작용기는, 각각 독립적으로, 스타우딩어 라이게이션(Staudinger Ligation), 구리-촉매화 아자이드-알킨 사이클로에디션 (Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition; CuAAC), 구리가 없는 아자이드-알킨 사이클로에디션 (Copper-Free Azide-Alkyne Cycloaddition), 테트라진 라이게이션 (Tetrazine Ligation), 테트라졸 라이게이션 (Tetrazole Ligation), 옥심 라이게이션 (Oxime Ligation), 및 이소시아나이드 클릭 반응 (Isocyanide Click Reaction) 중 선택되는 어느 하나의 생체직교적 반응에 참여하는 그룹인 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 생체직교적 작용기는, 각각 독립적으로, 아자이드, 말단 알킨, 사이클로 알킨, 테트라진, 노르보르넨, 사이클로 알켄, 테트라졸, 옥심, 및 이소시아나이드 그룹 중에 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 방법.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 그룹은 하나 이상의 활성 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 활성 모이어티는, 각각 독립적으로, 약물, 이미징 모이어티, 방사성 동위원소에 대한 리간드, 친화성 물질, 안정화 물질, 비타민, 및 친수성 모이어티 중 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  27. 제1항에 있어서,
    상기 부산물의 상기 반응 저해 효과는 상기 부산물에 포함된 Fc 결합성 펩타이드가 상기 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물과 상기 항체의 반응이 일어나는 상기 항체에 위치한 반응 자리로 상기 부산물을 가이드함과 함께, 상기 부산물에 포함된 티올기가 상기 반응 자리에서 상기 항체와 상호작용하기 때문에 생성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  28. 제1항에 있어서,
    상기 방법의 상기 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율은, 티올 반응성 에디티브를 사용하지 않는 경우와 비교할 때, 1.5배 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 기능성 그룹을 포함하는 항체의 수율은 2개의 기능성 그룹을 포함하는 항체를 기준으로 측정된 것인, 방법.
  30. 제1항에 있어서,
    상기 방법의 (a) 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물의 접촉, 및 (b) 부산물 및 티올 반응성 에디티브의 접촉은 티올 반응성 에디티브, 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 혼합함으로써 수행되는 것인, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브, 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 혼합함에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브와 항체가 먼저 혼합되고, 이후에 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 혼합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브, 항체 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 혼합함에 있어서,
    상기 티올 반응성 에디티브와 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물이 먼저 혼합되고, 이후에 항체가 혼합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  33. 티올 반응성 에디티브, 항체, 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 포함하는 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이기 위해 사용되는 키트.
  34. 티올 반응성 에디티브, 항체, 및 기능성 그룹을 전달하기 위한 화합물을 포함하는 기능성 그룹을 포함하는 항체의 제조 수율을 높이기 위해 사용되는 조성물.
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