WO2023171809A1 - Ｆｃ含有分子修飾試薬の製造方法 - Google Patents

Ｆｃ含有分子修飾試薬の製造方法 Download PDF

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WO2023171809A1
WO2023171809A1 PCT/JP2023/009425 JP2023009425W WO2023171809A1 WO 2023171809 A1 WO2023171809 A1 WO 2023171809A1 JP 2023009425 W JP2023009425 W JP 2023009425W WO 2023171809 A1 WO2023171809 A1 WO 2023171809A1
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WO
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containing molecule
producing
peptide
residue
igg
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PCT/JP2023/009425
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English (en)
French (fr)
Inventor
豪太 殿谷
美貴子 佐藤
拓也 武田
敦史 上野
祐二 伊東
浩 中山
Original Assignee
日本メジフィジックス株式会社
住友ファーマ株式会社
国立大学法人 鹿児島大学
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/13—Labelling of peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an Fc-containing molecule-modifying reagent and a method for producing a complex using the Fc-containing molecule-modifying reagent.
  • Antibodies have been widely used to detect target molecules in various research and development activities, and have become extremely important in industry as detection reagents and diagnostic agents. Antibodies are also attracting attention as drugs for treating diseases because of their high specificity for target molecules. As a site-specific chemical modification to add functionality to antibodies without affecting their specificity for the target molecule, the present inventors have previously developed peptides that specifically or selectively bind to antibodies (hereinafter referred to as IgG binding).
  • an amino acid capable of binding with a cross-linking agent into a peptide (also referred to as a peptide) and modifying the amino acid with a cross-linking agent, an IgG-binding peptide site-specifically modified with a cross-linking agent is prepared, and this is used to bind an antibody.
  • a technique for site-specific modification has been reported (Patent Document 1).
  • An IgG-binding peptide is a peptide that can specifically bind to the Fc region of IgG.
  • the present inventors have so far developed a CCAP (Chemical conjugation by affinity peptide) reagent as an antibody labeling reagent that utilizes Fc-binding peptides such as Z33 peptide and Z34C peptide.
  • CCAP Chemical conjugation by affinity peptide
  • Fc-binding peptides such as Z33 peptide and Z34C peptide.
  • the group is modified with a reactive functional group.
  • the CCAP method which combines a CCAP reagent with an antibody, is currently being considered for application to radiopharmaceuticals and antibody-drug conjugates as a method that can site-specifically modify antibodies with covalent bonds (Patent Documents 1 to 3). ).
  • succinimidyl glutaryl (SG) CCAP reagent by reacting the IgG-binding peptide (IgG-BP) or Z33, Z34C peptide, which has been used in the CCAP method, with the crosslinking reagent discuccinimidyl glutarate (DSG).
  • IgG-BP IgG-binding peptide
  • DSG crosslinking reagent discuccinimidyl glutarate
  • the present inventors have determined that the reaction conditions (type of base and reaction temperature) when reacting an IgG-binding peptide with a cross-linking agent are appropriately adjusted as the first embodiment of the present invention.
  • this method we succeeded in maintaining the yield of antibody-modified linker at the same level as conventional methods while reducing the content of hydrolysis of the antibody-modified linker, which is a by-product, and produced antibodies with higher purity.
  • the second embodiment of the present invention aims to provide a method for producing an antibody labeling reagent that can obtain an antibody labeling reagent in a short time and in high yield.
  • the present inventors improved the reaction method and purification method of IgG-binding peptide or Z33, Z34C peptide with DSG, and as a result, established a method for obtaining CCAP reagent in a short time and in high yield. did.
  • Another improvement in the second embodiment of the present invention is a change in the purification method for the SG-modified CCAP reagent. After reacting a peptide with DSG, it is necessary to remove excess DSG, and this has conventionally been performed using a reversed phase column.
  • reversed-phase columns have problems such as low recovery rates and difficulty in scaling up. Therefore, by switching to size exclusion chromatography using a Sephadex G-10 column, steps were omitted and the recovery rate was improved.
  • an Fc-containing molecule modification reagent in the method for producing an Fc-containing molecule modification reagent according to the present invention, a protein or peptide is reacted with a crosslinking agent in the presence of a base having stronger basicity than pyridine, and an amino group in the protein or peptide is reacted with the crosslinking agent. including combining with.
  • a crosslinking agent in the presence of a base having stronger basicity than pyridine, and an amino group in the protein or peptide is reacted with the crosslinking agent. including combining with.
  • “antibody modification linker” and “antibody labeling reagent” are included in "Fc-containing molecule modification reagent.”
  • Another aspect of the present invention includes a linker modification step of obtaining an Fc-containing molecule-modifying reagent by performing the method for producing an Fc-containing molecule-modifying reagent of the present invention, and combining the Fc-containing molecule-modifying reagent and the Fc-containing molecule. Mix and react the Fc-containing molecule modification reagent with the side chain terminal amino group of the amino acid constituting the Fc-containing molecule to obtain a complex of the Fc-containing molecule modification reagent and the Fc-containing molecule.
  • the present invention provides a method for manufacturing a composite, comprising a composite step.
  • the content of the hydrolyzed antibody-modified linker can be reduced while maintaining the yield of the antibody-modified linker at the same level as conventional methods. That is, an antibody-modified linker can be produced with high purity.
  • an antibody labeling reagent can be obtained in a short time and in high yield.
  • FIG. 2 is a diagram showing a scheme of the SG reaction of IgGBP-N3-RRR peptide.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of reversed phase HPLC analysis before (A) and after (B) the SG reaction of IgGBP-N3-RRR peptide.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of size exclusion chromatography (A) from the SG reaction product of IgGBP-N3-RRR peptide and the results of reversed phase HPLC analysis after purification (B).
  • FIG. 2 is a diagram showing a scheme of the SG reaction of Z33-38azide peptide.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of reversed phase HPLC analysis before (A) and after (B) the SG reaction of Z33-38azide peptide.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of size exclusion chromatography (A) from the SG reaction product of Z33-38azide peptide and the results of reversed phase HPLC analysis after purification (B).
  • the "Fc-containing molecule” only needs to contain the Fc region of an antibody, and includes polypeptides in which the Fc region and another polypeptide are fused, such as antibodies.
  • the Fc-containing molecule may be a full-length antibody, or an antibody fragment or variant.
  • “Fc” generally refers to a region in an antibody molecule containing two polypeptide chains consisting of the hinge region or a part thereof, CH2 domain, and CH3 domain, but is not particularly limited to this. In some cases, the hinge portion or a portion thereof may not be included.
  • Fc can be obtained by partially digesting IgG with a proteolytic enzyme.
  • the present invention will be explained mainly using antibodies as an example of Fc-containing molecules, but the present invention is not limited thereto, and the antibody-modified linker described in the first embodiment can be used as an Fc-containing molecule. It can be used as a linker for modification, and the antibody labeling reagent described in the second embodiment can be used as a labeling reagent for Fc-containing molecules.
  • a first embodiment of the present invention is a method for producing an antibody-modified linker, which comprises reacting an IgG-binding peptide with a cross-linking agent, wherein the cross-linking agent is on the side of an amino acid residue constituting the IgG-binding peptide.
  • a crosslinking agent having a succinimide group capable of binding to a chain terminal amino group and the reaction is carried out at room temperature or below in the presence of a tertiary amine that is more basic than pyridine.
  • a manufacturing method is provided. Hereinafter, it will also be referred to as the method for producing an antibody-modified linker of the first embodiment. 1.
  • the first embodiment of the present invention provides a method for producing an IgG-binding peptide (peptide that specifically or selectively binds to an antibody) that has been site-specifically modified with a cross-linking agent.
  • the IgG-binding peptide site-specifically modified by the cross-linking agent is also referred to as an antibody-modified linker.
  • the "IgG" used in the first embodiment of the present invention includes mammals such as humans and primates such as chimpanzees, laboratory animals such as rats, mice, and rabbits, pigs, cows, horses, sheep, goats, etc.
  • the term refers to IgG of domestic animals such as domestic animals and pets such as dogs and cats, preferably human IgG (IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4).
  • the IgG in the first embodiment of the present invention is more preferably human IgG1, IgG2, or IgG4, or rabbit IgG, particularly preferably human IgG1, IgG2, or IgG4.
  • the IgG binding peptide used in the first embodiment of the invention has the following formula I: (X) 1-3 -C-(X) 2 -H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X) 1-3 (I) (wherein each X is independently any amino acid residue other than cysteine, C is a cysteine residue, H is a histidine residue, Xaa1 is a lysine residue, G is a glycine residue, Xaa2 is a glutamic acid residue, a glutamine residue or an asparagine residue, L is a leucine residue, V is a valine residue and W is a tryptophan residue. ) It contains an amino acid sequence consisting of 13 to 17 amino acid residues, and is capable of binding to human IgG.
  • the notation (X) 1-3 at the N-terminus or C-terminus means that 1 to 3 consecutive arbitrary amino acid residues X other than cysteine (C or Cys) are present. , the amino acid residues constituting it may be the same or different residues, but preferably consist of a sequence in which all three are not the same residues.
  • (X) 2 means two consecutive arbitrary amino acid residues X other than cysteine (C or Cys), and the amino acid residues constituting it may be the same or different residues. group, but preferably consists of a sequence in which the two consecutive amino acid residues are not the same residue.
  • the two cysteine residues of formula I can be disulfide bonded to form a cyclic peptide, and are usually disulfide bonded.
  • the sulfide groups in the two cysteine residues have the following formula:
  • the wavy line part in the above formula means a bonding part with a sulfide group. This group is more stable against reduction reactions and the like than normal disulfide bonds.
  • Such a peptide can be synthesized, for example, according to the method described in WO2016/186206 pamphlet and WO2017/217347 pamphlet.
  • IgG-binding peptide of formula I are listed below in 1) to 18), but it goes without saying that the invention is not limited thereto.
  • IgG binding peptides of formula I include: 1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT (SEQ ID NO: 116), 2) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 117), 13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH (SEQ ID NO: 128), and 14) G(Xaa3)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa3)H (SEQ ID NO: 129), A particularly preferred example is 2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (SEQ ID NO: 117) (wherein, Xaa1 is a lysine residue, Xaa2 is a homocysteine, and preferably two cysteines and/or two homocysteines are (forming disulfide bonds with each other).
  • the IgG-binding peptide used in the first embodiment of the present invention can be produced using a combination of amino acids regardless of natural amino acids and unnatural amino acids, for example, by liquid phase synthesis, solid phase synthesis, automated peptide synthesis, genetic synthesis, etc. It can be produced by subjecting it to a peptide synthesis method such as a recombinant method or a phage display method. When synthesizing a peptide, the functional groups of the amino acids used may be protected as necessary. These can be performed, for example, according to the methods described in WO2016/186206 pamphlet, WO2017/217347 pamphlet, and WO2018/230257 pamphlet.
  • the IgG-binding peptide is modified with a cross-linking agent, and the IgG-binding peptide modified with a cross-linking agent can be used as a linker for modifying an antibody. .
  • Xaa1 is adjacent to a lysine residue in a specific region of IgG Fc.
  • the IgG is trastuzumab, it is close to Lys248 or Lys246 according to EU numbering in human IgG Fc, preferably Lys248. Therefore, by modifying Xaa1 of the IgG-binding peptide with a cross-linking agent, a cross-linking reaction with IgG is carried out, and a cross-linked structure is formed site-specifically between Xaa1 of the IgG-binding peptide and the lysine residue of IgG Fc.
  • the method according to the first embodiment of the present invention has the advantage that the yield of the obtained product is high, and since it does not involve modification of the antibody itself, there is a low possibility of reducing the function of the antibody.
  • a "crosslinking agent” is a chemical substance for covalently linking an IgG binding peptide and IgG Fc.
  • the crosslinking agent of the first embodiment of the present invention can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • crosslinking agents preferably containing two or more succinimidyl groups such as DSG (disuccinimidyl glutarate) and DSS (disuccinimidyl suberate), DMA (dimethyl adipimidate 2HCl, dimethyl adipimidate)
  • a crosslinking agent preferably containing two or more imide acid moieties, such as dihydrochloride), DMP (dimethyl pimelimidate 2HCl, dimethyl suberimidate dihydrochloride), and DMS (dimethyl suberimidate 2HCl, dimethyl suberimidate dihydrochloride), and SS bonds such as DTBP (dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate 2HCl, dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate dihydrochloride) and DSP (dithiobis (succinimidyl propionate), dithiobis succinimidyl propionate), etc.
  • DSG disuccinimidyl glut
  • crosslinking agents that have The crosslinking agent is preferably one having a succinimide group capable of binding to the terminal amino group of the side chain of the amino acid residue constituting the IgG-binding peptide, and DSG and DSS are particularly preferred.
  • the IgG-binding peptide may be modified with other functional substances, such as antibodies such as IgA or VHH, labeling substances, and/or other drugs.
  • the IgG-binding peptide and other functional substances can be linked by methods known to those skilled in the art, such as reaction between an azide group and dibenzocyclooctyne, or a reaction between a maleimide group and a sulfhydryl group.
  • the IgG-binding peptide forms a complex with IgG, making it possible to detect or quantify IgG via the labeling substance.
  • Labeling substances include, but are not limited to, fluorescent dyes, chemiluminescent dyes, fluorescent proteins such as biotin and GFP (green fluorescent protein), photoproteins, and enzymes such as peroxidase.
  • preferable labeling substances include fluorescein and These include fluorescein derivatives such as FITC, rhodamine derivatives such as rhodamine and tetramethylrhodamine, and fluorescent dyes such as Texas Red.
  • the drugs include, but are not limited to, anticancer drugs such as auristatin, maytansine, doxorubicin, bleomycin, or derivatives thereof; and drugs on the blood-brain barrier. Examples include targeting agents such as drugs that bind to the receptors of antibodies and enable their transfer to the central nervous system, and drugs that bind to cancer cells and the like and enable the antibodies to transfer into the cells.
  • the N-terminus of the IgG-binding peptide is modified with a chelating agent capable of chelating a radioactive metal or an atomic group capable of a click reaction.
  • the chelating agent is not particularly limited as long as it has a site to which a radioactive metal is coordinated in its structure, and has a chelate moiety that is a site to which a radioactive metal is coordinated.
  • the chelate moiety is not particularly limited as long as it has a site to which a radioactive metal coordinates in its structure.
  • R 11 , R 13 and R 14 are each independently -(CH 2 ) p COOH, -(CH 2 ) p C 5 H 5 N, -(CH 2 ) p PO 3 A group consisting of H 2 , -(CH 2 ) p CONH 2 or -(CHCOOH) (CH 2 ) p COOH, in which one of R 12 or R 15 is a hydrogen atom, a carboxyl group, or a carbon number of 2 or 3, the other is a substituent for binding to the IgG-binding peptide, p is an integer of 0 to 3, and R 12 is a substituent for binding to the IgG-binding peptide.
  • R 15 is a hydrogen atom
  • R 12 is not a substituent for binding to the IgG binding peptide
  • R 15 is a substituent for binding to the IgG binding peptide.
  • chelating agents to IgG binding peptides are well known to those skilled in the art.
  • N-hydroxysuccinimide ester NHS
  • ITC isothiocyano group
  • sulfonic acid chloride carboxylic acid chloride, ethylene oxide, alkyl chloride, aldehyde group
  • a reactive group such as carboxylic acid anhydride or the like may be added to the chelating agent, and this may be reacted with the N-terminal amino group of the IgG-binding peptide.
  • an IgG-binding peptide containing such a chelating agent may be directly synthesized using well-known synthetic methods.
  • radioactive metal a metal nuclide that emits radiation of ⁇ rays, ⁇ rays, ⁇ rays, or a combination thereof can be used.
  • radioactive metal nuclides include radioactive isotopes of alkali metals, alkaline earth metals, lanthanides, actinides, transition metals, and metals other than these metals.
  • radioactive metal nuclides include 44 Sc, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 60 Co, 59 Fe, 67 Ga, 68 Ga, 64 Cu, 67 Cu, 89 Sr, 89 Zr, 90 Y, 99m Tc, 103 Ru, 111 In, 153 Sm, 165 Dy, 166 Ho, 177 Lu, 186 Re, 188 Re, 198 Au, 201 T l, 197 Hg , 203 Hg, 212 Bi, 213 Bi, 212 Pb, 227 Th or 225 Ac are preferably used.
  • These radioactive metals can be produced according to conventional methods, and are preferably obtained as a solution containing the radioactive metal in an ionized form.
  • a person skilled in the art can appropriately select a preferred combination of a radioactive metal and a chelating agent.
  • An appropriate atomic group that can undergo a click reaction is selected depending on the type of click reaction.
  • the click reaction can be carried out, for example, by a combination of an alkyne and an azide, a combination of a 1,2,4,5-tetrazine and an alkene, and the like.
  • one group can be introduced at the N-terminus of the IgG-binding peptide and the other group can be introduced into the chelating agent.
  • Specific examples of click reactions using such combinations of atomic groups include the Husgen cycloaddition reaction and the reverse electron request type Diels-Alder reaction.
  • a specific example of a combination of atomic groups capable of a click reaction is, as shown in the formula below, an atomic group containing dibenzylcyclooctyne (DBCO) as an alkyne (formula (1a)) and an atom containing an azide group as an azide. (formula (2a)), or a combination of an atomic group containing 1,2,4,5-tetrazine (formula (1b)) and an atomic group containing trans-cyclooctene (TCO) as an alkene (formula ( A combination with 2b)) can be mentioned.
  • DBCO dibenzylcyclooctyne
  • TCO trans-cyclooctene
  • R 1 represents a binding site with an antibody-modified linker or chelating agent
  • R 2 represents a binding site with an antibody-modified linker or chelating agent
  • R 3 and R 4 represents a binding site with an antibody modification linker or a chelating agent, and the other represents a hydrogen atom, methyl group, phenyl group, or pyridyl group, and in formula (2b), , R5 indicates the binding site for the antibody modification linker or chelating agent.
  • an IgG-binding peptide is dissolved in a solution containing a solubilizing agent, a reducing agent, and an acid if necessary, and an azide group or trans-cyclooctene (TCO) is added to the solution as an atomic group capable of a click reaction.
  • TCO trans-cyclooctene
  • the azide group is introduced into the N-terminus of the peptide using a commercially available azide group-introducing reagent according to a conventional method.
  • the azide group-introducing reagent used include silyl azide, phosphoric azide, alkylammonium azide, inorganic azide, sulfonyl azide, and PEG azide.
  • TCO When introducing an atomic group containing TCO as an atomic group capable of a click reaction, TCO is introduced into the N-terminus of the peptide according to a conventional method using a commercially available click chemistry reagent containing TCO.
  • DBCO dibenzylcyclooctyne
  • DBCO-C6-Acid Dibenzylcyclooctyne-Amine, Dibenzylcyclooctyne Maleimide, DBCO-PEG acid, DBCO-PEG-NHS ester, DBCO-PEG-Alcohol, DBCO-PEG-amine, DBCO-PEG-NH- Boc, Carboxyrhodamine-PEG-DBCO, Sulforhodamine-PEG-DBCO, TAMRA-PEG-DBCO, DBCO-PEG-Biotin, DBCO-PEG-DBCO, DBCO-PEG-Maleimide, TCO-PEG-DBCO, DBCO-mPEG, etc. are selected However, Dibenzylcyclooctyne Maleimide is preferably used.
  • the IgG-binding peptide may be modified, for example, by PEGylation (addition of polyethylene glycol) at the N-terminus, amidation at the C-terminus, etc., in order to improve its stability.
  • PEGylation addition of polyethylene glycol
  • the number of PEG molecules in PEGylation is not particularly limited, and for example, 1 to 50 molecules, 1 to 20 molecules, 2 to 10 molecules, 2 to 6 molecules, or 4 molecules of PEG can be added.
  • An IgG-binding peptide modified with a cross-linking agent i.e., an antibody-modified linker
  • a cross-linking agent i.e., an antibody-modified linker
  • This can be done by selecting the type of amino acid at the particular position modified by the crosslinker in the IgG binding peptide and the combination of the crosslinker.
  • a crosslinking agent containing a succinimidyl group such as DSS or DSG reacts with the side chain of a lysine residue and the primary amine present at the N-terminus of a polypeptide. By reacting with DSG, only the side chains of lysine residues can be specifically modified with DSS or DSG.
  • the reaction between the IgG-binding peptide and the cross-linking agent reduces the hydrolysis of the by-product, the antibody-modified linker, while maintaining the yield of the IgG-binding peptide site-specifically modified by the cross-linking agent, i.e., the antibody-modified linker.
  • the IgG-binding peptide is reacted with a crosslinking agent in the presence of a tertiary amine, which is more basic than pyridine, as a base at room temperature or lower.
  • the solvent used in this reaction is not particularly limited as long as it does not adversely affect the reaction, but water, physiological saline, sodium acetate buffer, ammonium acetate buffer, phosphate buffer, phosphate buffered saline, Buffers such as Tris buffer, HEPES buffer, or tetramethylammonium acetate buffer, or alcohols having 1 to 5 carbon atoms, acetonitrile, N,N-dimethylformamide, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, acetone, etc.
  • a water-soluble organic solvent or a mixed solvent thereof can be used.
  • Base in this embodiment can be expressed by the pKa of the conjugate acid when the tertiary amine used in the first embodiment of the present invention is used as a base.
  • the "tertiary amine more basic than pyridine” is preferably a tertiary amine with a pKa of 6.0 or more (the pKa of pyridine is 5.25). If the basicity is weak, the reaction will not proceed sufficiently. When using a strongly basic tertiary amine, it can be expected that the reaction will proceed satisfactorily, but from the viewpoint of increasing versatility, the pKa is preferably 15.0 or less, more preferably 8.0 or less.
  • the "tertiary amine more basic than pyridine" used in the present invention preferably has a pKa of 6.0 or more and 15.0 or less, more preferably a pKa of 6.0 or more and 8.0 or less.
  • tertiary alkylamine is preferred, tertiary alkylamine having 1 to 10 carbon atoms is more preferred, and may be a chain alkylamine or a cyclic alkyneamine.
  • chain alkylamines such as trimethylamine, triethylamine, diethylmethylamine, methyldipropylamine, methyldiisopropylamine, ethyldimethylamine, dimethylpropylamine, ethylmethylpropylamine, ethylmethylisopropylamine, methylpyrrolidine, ethylpyrrolidine, propyl Cyclic alkyl amines such as pyrrolidine, isopropylpyrrolidine, butylpyrrolidine, tert-butylpyrrolidine, methylhomopiperidine, ethylhomopiperidine, methylpiperidine, ethylpiperidine, dimethylpiperazine, diethylpiperazine, methylethylpiperazine, N-methylmorpholine, ethylmorpholine, etc. Can be mentioned. Preferred is N-methylmorpholine (NMM).
  • NMM N-methylmorpholine
  • the dose of the tertiary amine, which is more basic than pyridine, in this reaction is not particularly limited as long as it can promote the reaction, but the upper limit is, for example, 20 equivalents or less, 10 equivalents or less, based on the molar amount of the IgG-binding peptide.
  • , 8 equivalents or less, or 4 equivalents or less and the lower limit can be, for example, 1 equivalent or more, 2 equivalents or more, 3 equivalents or more, or 4 equivalents or more, preferably 2 equivalents or more and 20 equivalents or less, It can be 4 equivalents or more and 20 equivalents or less, 2 equivalents or more and 10 equivalents or less, 4 equivalents or more and 10 equivalents or less, 2 equivalents or more and 8 equivalents or less, 4 equivalents or more and 8 equivalents or less, and 2 equivalents or more and 4 equivalents or less. If the amount is too small, the reaction will not progress sufficiently, and if it is too large, the amount of hydrolysis as a by-product will increase.
  • the dose of the cross-linking agent in this reaction is not particularly limited as long as the IgG-binding peptide can be site-specifically modified with the cross-linking agent, but it is usually an excessive amount, preferably an upper limit based on the molar amount of the IgG-binding peptide. , for example, 100 equivalents or less, 50 equivalents or less, 40 equivalents or less, 30 equivalents or less, 20 equivalents or less, 15 equivalents or less, or 10 equivalents or less, and the lower limit values are, for example, 5 equivalents or more, 10 equivalents or more, 20 equivalents or less. It can be more than equivalent, 25 equivalents or more, or 30 equivalents or more. If it is too small, the reaction will not progress sufficiently.
  • the yield reaches a plateau, so it is preferably used in an amount of 20 equivalents or more and 50 equivalents or less, 20 equivalents or more and 40 equivalents or less, or 20 equivalents or more and 30 equivalents or less.
  • the reaction temperature in this reaction is, for example, room temperature or lower.
  • room temperature refers to the temperature specified by the 16th edition of the Japanese Pharmacopoeia, and is usually 1 to 30°C.
  • the reaction temperature can be, for example, 30°C or lower, 20°C or lower, or 10°C or lower, more preferably 5°C or lower, even more preferably -5°C or lower. By doing so, it is possible to further suppress the generation of the by-product hydrolysis of the antibody-modified linker.
  • the reaction temperature is preferably -40°C or higher, and more preferably -20°C or higher. preferable.
  • the reaction time in this reaction is not particularly limited as long as the reaction proceeds sufficiently, and varies depending on the type and amount of the IgG-binding peptide, crosslinking agent, tertiary amine (base) used, and reaction temperature, and may be adjusted as appropriate depending on these. Set.
  • the reaction time can be up to 250 minutes, up to 200 minutes, up to 180 minutes, up to 150 minutes, up to 120 minutes, up to 60 minutes.
  • the amount of base is lower and the reaction time is shorter.
  • the amount of base will be higher and the reaction time will be longer.
  • the reaction solution may be used as it is in the complexing step described below, or may be concentrated or purified by removing the solvent by freeze-drying or the like.
  • Purification conditions are not particularly limited, but for example, solids may be precipitated using ethyl acetate, isopropyl acetate, acetonitrile, or tetrahydrofuran, ultrafiltration, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, Various chromatography methods such as reverse phase chromatography and high performance liquid chromatography can be used.
  • the mobile phase is preferably a mixture of an organic solvent and an acidic aqueous solution; the organic solvent is acetonitrile, ethanol, methanol, or 2-propanol, and the acidic aqueous solution is formic acid, acetic acid, or trifluoroacetic acid.
  • the acidic aqueous solution is formic acid, acetic acid, or trifluoroacetic acid.
  • a mixture of acetonitrile and an aqueous solution containing trifluoroacetic acid is more preferable.
  • the antibody-modified linker it is preferably stored at room temperature or lower, more preferably at 0°C or lower.
  • the first embodiment of the present invention includes a linker modification step for obtaining an antibody modified linker by the above production method (1.
  • Method for producing an antibody modified linker) and a linker modification step for obtaining an antibody modified linker by the above production method (1.
  • the antibody complex only needs to be one or more molecules of antibody modification linker and one molecule of antibody, for example, an antibody complex in which one molecule of antibody modification linker and one molecule of antibody are connected, or two molecules of antibody modification linker and one molecule of antibody are linked. It contains an antibody complex in which one antibody molecule is linked.
  • the conditions for the conjugation step are not particularly limited as long as a crosslinking reaction can occur between the succinimide group of the crosslinking agent of the antibody modification linker and the terminal amino group of the side chain of the amino acid residue constituting the antibody.
  • a solution containing an antibody-modified linker that has undergone a linker modification step and a solution containing the antibody may be mixed, or the solution containing the antibody-modified linker may be replaced with a desired buffer solution and then the solution containing the antibody is mixed.
  • Known methods can be appropriately employed for solvent substitution.
  • reaction temperature in the conjugation step is not particularly limited as long as the antibody modified linker and the antibody are linked by a cross-linking reaction, and it is preferable to carry out the reaction under conditions where the antibody can exist stably. It is more preferable to carry out the reaction at a temperature at which the modified linker does not degrade and the hydrolysis of the antibody modified linker does not increase excessively. For example, it can be carried out at room temperature (1°C to 30°C) or normal temperature (15°C to 25°C).
  • the conjugation step is preferably performed under conditions that allow the antibody to exist stably, and is preferably performed under weakly acidic conditions at pH 5 to 7.
  • Solvents for the complexing step include acetate buffer, 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol (Tris) buffer, 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1- Buffers such as piperazinyl]-ethanesulfonic acid (HEPES) buffer, phosphate buffer, histidine buffer, etc. can be used.
  • a known catalyst to promote the crosslinking reaction a known stabilizer such as arginine, a sugar such as sucrose, or an isotonic agent such as sodium chloride or potassium chloride may be added. good.
  • the mixing ratio of the antibody-modified linker and the antibody in the conjugation step is not particularly limited, but is, for example, a molar ratio of 1:1 or more and 20:1 or less.
  • the lower limit is preferably 2:1 or more, more preferably 5:1 or more, and the upper limit is more preferably 10:1 or less.
  • the reaction time of the complexing step is not particularly limited, but is, for example, 1 minute or more and 5 hours or less.
  • the lower limit is preferably 10 minutes or more, more preferably 15 minutes or more, and the upper limit is preferably 2 hours or less, more preferably 1 hour or less.
  • the method for producing an antibody conjugate includes performing a step of purifying the obtained antibody conjugate as necessary to remove impurities such as unreacted IgG-binding peptide, antibody modification linker, and antibody. etc., and the antibody complex may be purified.
  • Purification conditions in that case are not particularly limited, but examples include ultrafiltration, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reversed phase chromatography, hydrophobic chromatography, high performance liquid chromatography, etc. Purification methods known in the art can be employed, preferably affinity chromatography.
  • As the mobile phase phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer, glycine buffer, etc. can be used, and salts such as ammonium sulfate, sodium chloride, potassium chloride, etc. may be added as appropriate.
  • the first embodiment of the present invention includes the following technical ideas.
  • a method for producing an antibody-modified linker which comprises reacting an IgG-binding peptide with a cross-linking agent, wherein the cross-linking agent is capable of bonding to the terminal amino group of the side chain of the amino acid residue constituting the IgG-binding peptide.
  • a crosslinking agent having a succinimide group and the reaction is carried out at room temperature or below in the presence of a tertiary amine that is more basic than pyridine.
  • the IgG-binding peptide has the following formula I: (X) 1-3 -C-(X) 2 -H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X) 1-3 (I) (wherein each X is independently any amino acid residue other than cysteine, C is a cysteine residue, H is a histidine residue, Xaa1 is a lysine residue, G is a glycine residue, Xaa2 is a glutamic acid residue, a glutamine residue or an asparagine residue, L is a leucine residue, V is a valine residue and W is a tryptophan residue.
  • a linker modification step of obtaining an antibody-modified linker by carrying out the method for producing an antibody-modified linker described in [1] to [9] above;
  • the antibody modified linker and the antibody are mixed, and the succinimide group of the antibody modified linker is reacted with the side chain terminal amino group of the amino acid constituting the antibody, so that the antibody modified linker and the antibody are reacted.
  • a conjugation step to obtain a composite A method for producing an antibody complex comprising:
  • the method for producing an antibody labeling reagent according to the present embodiment includes reacting a protein or peptide with the crosslinking reagent (crosslinking agent) in the presence of a base having stronger basicity than pyridine. and a crosslinking reagent.
  • Base in this embodiment has the same meaning as “basicity” defined in the first embodiment.
  • the base used in this embodiment is a base with a pKa greater than 5.2 (or 5.19, 5.23, or 5.25).
  • a base having a pKa smaller than 14 (or 14.0) can be used.
  • bases with a pKa of 11 or less can be used. More preferably, the base range is a combination of these maximum and minimum values.
  • pKa is pKa at room temperature (for example, 25° C.).
  • the concentration of the base is not particularly limited as long as it can bond the amino group and the crosslinking reagent, but it depends on the base, protein or peptide used, the type of crosslinking reagent, the protein or peptide, and It can be set appropriately depending on the concentration of the crosslinking reagent, but is preferably 0.1 to 5%, more preferably 0.5 to 3%, 0.8 to 2%, 0.9 to 1.5%. % or 1%.
  • the solvent used is not particularly limited as long as it does not affect the reaction and can dissolve the protein or peptide and the crosslinking reagent, but is preferably an aprotic polar solvent, such as dimethyl
  • an aprotic polar solvent such as dimethyl
  • the protein or peptide is preferably a peptide that can specifically bind to the Fc region of IgG (Fc-binding peptide).
  • IgG refers to mammals, such as primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats, mice, and rabbits, domestic animals such as pigs, cows, horses, sheep, and goats, and pet animals such as dogs and cats. It may be an animal IgG, preferably a human IgG (IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4).
  • the IgG is preferably human IgG1, IgG2, or IgG4, or rabbit IgG, and particularly preferably human IgG1, IgG2, or IgG4.
  • the "IgG Fc region” typically refers to a C-terminal fragment obtained from IgG treated with the proteolytic enzyme papain.
  • the Fc-binding peptide is preferably a site selected from Lys248, Lys246, Lys338, Lys288, Lys290, Lys360, Lys414, and Lys439 according to Eu numbering in Fc and/or its adjacent region, preferably Lys248 and/or its adjacent region. or a peptide that binds to the protein A binding region.
  • the Fc-binding peptide may be a partial peptide of protein A having Fc-binding ability or a variant thereof.
  • peptides examples include the following peptides (i) to (iii).
  • each (Linker) is independently the same or different linker, or is absent, where the linker is RRRGS (SEQ ID NO: 136), EEGGS (SEQ ID NO: 137), ( GSGGS (SEQ ID NO: 138)) 1-3 or (PEG) 1-10 (preferably (PEG) 1-8 or (PEG) 2-10 , more preferably (PEG) 4 ), 1 to 3 X 1 , X 2 , X 3 , X 4 , X 5 , X 6 , X 7 , and 1 to 3 X 8 each independently represent the same or different amino acid residues;
  • Dab, Tle and Cha mean 2,4-diaminobutanoic acid, tert-leucine and ⁇ -cyclohexyl-L-alanine, respectively.
  • Ac and t-Bu mean having an acetyl group and a tert-butyl group, respectively.
  • the amino group at the N-terminus may be acetylated.
  • a Lys residue may be introduced at an appropriate position near the N-terminus in the Linker.
  • X 1 1-3 is (S, G, F, or none) - (D, G, A, S, P, Hcy, or none) - (S, D, T, N, E, or This is the amino acid sequence represented by R).
  • X 1 1-3 is D, GPD, R, GPR, SPD, GDD, GPS, SDD, RGN, G-Hcy-D, RGP, or GPD.
  • X 1 1-3 is D or GPD.
  • X 2 is A, S, or T.
  • X 2 is A or T.
  • X 2 is A.
  • X 3 is Y or W.
  • X 3 is Y.
  • X 4 is H.
  • X 5 is K, R, AcOrn.
  • X 5 is one amino acid residue selected from V, Dab, F, R, L, Nva, Nle, Ala (t-Bu), and Cha.
  • X 5 is one amino acid residue selected from F, R, L, Nva, Nle, Ala (t-Bu), and Cha.
  • X 5 is one amino acid residue selected from L, Ala (t-Bu), and Cha.
  • X 6 is E or N.
  • [16]X 6 is E.
  • [17]X 7 is V.
  • X 8 1-3 is (S, T, or D)-(H, G, Y, T, N, D, F, Hcy, or none)-(Y, F, H, M, or None).
  • X 8 1-3 is T, TFH, S, SFH, THH, TFY, TYH, or T-Hcy-H.
  • X 8 1-3 is T or TFH.
  • X 5 is the same as above; it may have an NH 2 -(Linker)- group at the N-terminus; -NH 2 group at the C-terminus) or -(Linker)-- NH2 group): 1) DCAYHX 5 GELVWCT (SEQ ID NO: 1) 2) GPDCAYHX 5 GELVWCTFH (SEQ ID NO: 2) 3) RCAYHX 5 GELVWCS (SEQ ID NO: 3) 4) GPRCAYHX 5 GELVWCSFH (SEQ ID NO: 4) 5) SPDCAYHX 5 GELVWCTFH (SEQ ID NO: 5) 6) GDDCAYHX 5 GELVWCTFH (SEQ ID NO: 6) 7) GPSCAYHX 5 GELVWCTFH (SEQ ID NO: 7) 8) GPDCAYHX 5 GELVWCSFH (SEQ ID NO: 8) 9) GPDCAYHX 5 GELVWCT (SEQ ID NO: 1) 2)
  • Examples of peptides bound to linkers include peptides having the following structure. 60) GSGGS-GPDCAYHRGELVWCTFH-NH 2 (SEQ ID NO: 60) (PEG) 4 -GPDCAYHRGELVWCTFH-NH 2 ((PEG) 4 -SEQ ID NO: 33-NH 2 ) 61) GSGGS-DCAYHRGELVWCT-NH 2 (SEQ ID NO: 61) (PEG) 4 -DCAYHRGELVWCT-NH 2 ((PEG) 4 -SEQ ID NO: 32-NH 2 )
  • peptide and “peptide capable of specifically binding to the Fc region of IgG” include peptides to which a functional group Z is bound.
  • a functional group Z may be bonded to the end of the (Linker). Examples of such peptides include the following peptides.
  • the following peptides may have a maleimide group, DBCO group, tetrazine group, or TCO group bonded to the N-terminus, and/or a NH 2 group bonded to the C-terminus.
  • RRRGS-GPDCAYHKGELVWCTFH SEQ ID NO: 65
  • EEGGS-GPDCAYHKGELVWCTFH SEQ ID NO: 66
  • PEG 4 -GPDCAYHKGELVWCTFH
  • examples of peptides having a functional group Z bonded to the end of (Linker) include the following peptides. 67) Acetyl-K(Z)RRRGS-DCAYHKGELVWCT-NH 2 (SEQ ID NO: 67) 68) Acetyl-K(Z)EEGGS-DCAYHKGELVWCT-NH 2 (SEQ ID NO: 68) 69) Acetyl-K(Z)-(PEG) 4 -DCAYHKGELVWCT-NH 2 (Acetyl-K(Z)-(PEG) 4 -SEQ ID NO: 69-NH 2 )
  • the following peptides may have a maleimide group, DBCO group, tetrazine group, or TCO group bonded to the N-terminus, and/or a NH 2 group bonded to the C-terminus.
  • RRRGS-DCAYHKGELVWCT SEQ ID NO: 70
  • EEGGS-DCAYHKGELVWCT SEQ ID NO: 71
  • PEG 4 -DCAYHKGELVWCT
  • (ii) In the peptide represented by the following formula (II) or the amino acid sequence of (II), one or several amino acids are added, deleted, and/or substituted at positions other than X 9 to X 14 Peptides containing amino acid sequences: X 9 1-2 NMQX 10 QX 14 RFYEALHDPNLNEEQRNAX 11 IX 12 SIRDDX 13 -(Linker2)-CONH 2 ...(II) [In formula (II), (Linker2) is (GSGGS) 1-3 , (SGGS) 1-3 , or (PEG) 2-10 -Lys (preferably (PEG) 4 -Lys), SGSGSK, SRRCR , SRRK(Z)R, SRRCRRCRRC, SRRK(Z)RRK(Z)RRK(Z), or (PEG) 1-8 -Lys (preferably (PEG) 4 -Lys), or is absent.
  • (Linker2) is (GSGGS) 1-3 ,
  • peptide having the amino acid sequence represented by formula (II) include the following peptides.
  • X 9 is selected from the group consisting of GF, F, K, and Acetyl-K.
  • X 10 is Q.
  • X 11 and X 12 are each independently selected from the group consisting of R, H, and E.
  • [25]X 11 is R.
  • X 12 is R or K(Z) (preferably Z is azide).
  • the peptide having the amino acid sequence represented by the above formula (II) may include the following peptides (however, the lysine residue contained may be bonded with a functional group as necessary). good): 72) FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 72) 73) GFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 73) 74) KNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 74) 75) GFNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 75) 76) KNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 76) 77) FNMQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD (SEQ ID NO: 77) 78) GKNMQCQRRF
  • the peptide may have a reactive functional group (preferably an azide group) bonded to the N-terminus or C-terminus (preferably the N-terminus) via a linker, if necessary.
  • a peptide having 1 to 3 (preferably 2) glutamic acids bonded to the N-terminus and/or C-terminus of the peptide may have a reactive functional group (eg, an azide group) at the terminal end.
  • a peptide having an azide group can be linked to the other functional molecule by click reaction with another functional molecule having Dibenzylcyclooctyne (DBCO), an alkyne, or TCO.
  • DBCO Dibenzylcyclooctyne
  • the peptide and other functional substances can also be bonded by other methods known to those skilled in the art, such as reaction of a maleimide group with a sulfhydryl group.
  • the protein or peptide may be crosslinked within the molecule.
  • one or more proteins or peptides may exist within or between molecules (for example, 1 to 10, 2 to 8, 4 to 6, 1, 2, 3, 4, 5, or 6) crosslinked structures.
  • the crosslinking may be a thiol bond or, for example, a structure in which SH groups are bonded to each other via the following structure.
  • A is a hydrogen atom, a phenyl group, or a C1-6 alkyl group optionally substituted with a halogen atom, a phenyl group, or a C1-6 alkyl group]
  • the protein may be 500 Da or more, 1000 Da or more, 2000 Da or more, and/or 500,000 Da or less, 200,000 Da or less, 100,000 Da or less.
  • proteins include enzymes, glycoproteins (such as erythropoietin), cytokines, toxins, adjuvants, structural proteins, antibodies, Fc fusion proteins, antibody fragments (F(ab') 2 , Fab', Fab, Fab 3 , Single chain Fv (scFv), (tandem) bispecific single chain Fv (sc(Fv) 2 ), single chain triple body, nanobody, divalent VHH, pentavalent VHH, minibody, (double chain) diabody , tandem diabody, bispecific tribody, bispecific bibody, dual affinity retargeting molecule (DART), triabody (or tribody), tetrabody (or [sc(Fv) 2 ] 2 ), or (scFv-SA ) 4 ) Disulfide-bonded Fv
  • the peptide may be a peptide of 5 to 5000 amino acids, 5 to 1000 amino acids, 5 to 500 amino acids, 5 to 100 amino acids, 5 to 50 amino acids, or 10 to 40 amino acids. Further, the peptide may be either cyclic or linear. Such peptides include vaccines, micro antibodies, antibacterial peptides, and the like.
  • X m (m is an integer) represents an amino acid.
  • “X m n ” represents that n amino acids X m are bonded, and “X m ” where n is not described represents that one amino acid X m is present.
  • the plurality of X m may each independently be the same or different amino acids.
  • n is "pq”, it means that p to q amino acids X m are present.
  • A is an alanine residue
  • R is an arginine residue
  • N is an asparagine residue
  • D is an aspartic acid residue
  • C is a cysteine residue.
  • Q is a glutamine residue
  • E is a glutamic acid residue
  • G is a glycine residue
  • H is a histidine residue
  • I is an isoleucine residue
  • L is a leucine residue.
  • K is a lysine residue
  • M is a methionine residue
  • F is a phenylalanine residue
  • P is a proline residue
  • S is a serine residue
  • T is a threonine residue.
  • W is a tryptophan residue
  • Y is a tyrosine residue
  • V is a valine residue.
  • Hcy is homocysteine
  • Dpr is diaminopropionic acid
  • Orn is an ornithine residue
  • ⁇ Ala is a ⁇ -alanine residue
  • Dab is a 2,4-diaminobutyric acid residue
  • Nle is norleucine.
  • Nva is a norvaline residue
  • Tle is a tert-leucine residue
  • Ala (t-Bu) is a tert-butylalanine residue
  • Cha is a cyclohexylalanine residue.
  • the amino group in the residue having an amino group in the side chain may be acetylated as necessary.
  • the acetylated forms of natural and artificial amino acids are sometimes described with the prefix Ac in the amino acid designation described above, unless it is particularly inconsistent to interpret them in this way.
  • Ac is understood to include an acetylated form even if it is not written as Ac.
  • K(Z) means a functional group-bonded lysine residue, preferably K(Z) is K(Azide).
  • K (Azide) represents an azide-bonded lysine residue.
  • the amino group in the protein or peptide that binds to the crosslinking reagent includes lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, diaminopropionic acid, which are present in the protein or peptide.
  • lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, diaminopropionic acid which are present in the protein or peptide.
  • DSG disuccinimidyl glutarate
  • DSS disuccinimidyl suberate
  • DMA dimethyl adipimidate dihydrochloride
  • DMP dimethyl pimelimidate dihydrochloride
  • DTBP dithiobis(succinimidylpropionic acid)
  • a "reactive functional group” or a group represented by “Z” can react and bond with a peptide, protein, nucleic acid, or small molecule drug under relatively mild conditions.
  • Reactive functional groups include maleimides, thiols or protected thiols, alcohols, acrylates, acrylamides, amines or protected amines, carboxylic acids or protected carboxylic acids, azides, alkynes including cycloalkynes, 1,3- including cyclopentadiene and furans.
  • alpha-halocarbonyl N-hydroxysuccinimidyl, N-hydroxysulfosuccinimidyl, nitrophenyl ester, carbonate, dibenzocyclooctyne (DBCO), tetrazine, methyltetrazine (MTZ), transcyclooctene ( TCO), azide, carboxy, tosyl, amino, epoxy, acyl, isothiocyanate, isocyanate, acyl azide, NHS ester, acid chloride, aldehyde, glyoxal, epoxide, oxirane, carbonate, arylating agent, imido ester, carbodiimide, acid anhydride compound, haloacetyl, alkyl halide, maleimide, aziridine, acryloyl derivative, arylating agent, diazoalkane, diazoacetyl compound, carbonyl, ketone, carbodiimide,
  • the method according to this embodiment may include binding an amino group in a protein or peptide with a crosslinking reagent, and then purifying the protein or peptide by size exclusion chromatography.
  • a carrier for size exclusion chromatography organic solvents such as Sephadex, Sepharose, Superdex, Superose, Sephacryl, Biogel, Cellulofine, Toyopearl, and Sephadex LH-20 can be used. Any resin that can be used for graphics can be used.
  • the pore size of the carrier is preferably 30 to 2000 ⁇ , more preferably 100 to 300 ⁇ . Further, the particle size of the carrier is preferably 5 to 500 ⁇ m, more preferably 20 to 120 ⁇ m.
  • the column size is preferably a column with a gel volume of 10 to 1000 mL or more in the case of an open column, and a column with a gel volume of 3 to 100 mL or more in the case of a packed column.
  • the elution conditions for size exclusion chromatography are preferably from 4°C to room temperature, and the eluent is a volatile strong acid such as 0.01 to 1% TFA or HCl, or 1 to 30% formic acid, acetic acid, etc.
  • Aqueous solutions of volatile weak acids can be used.
  • 1 to 100% volatile/hydratable organic solvents CH 3 CN, MetOH, EtOH, propanol, acetone, etc.
  • volatile strong acids such as 0.01 to 1% TFA and HCl/water. It is also possible to use a mixture.
  • the second embodiment of the present invention includes the following technical ideas.
  • [1] In the presence of a base with stronger basicity than pyridine, the protein or peptide is reacted with the crosslinking reagent to bond the amino group in the protein or peptide to the crosslinking reagent.
  • Method for producing antibody labeling reagent [2] The method for producing an antibody labeling reagent according to [1], wherein the base has a pKa of greater than 5.2.
  • [3] The method for producing an antibody labeling reagent according to [2], wherein the base has a pKa of 14 or less.
  • [4] The method for producing an antibody labeling reagent according to [1], wherein the base is triethylamine, N,N-diisopropylethylamine, diethylamine, or monomethylamine.
  • [5] The method for producing an antibody labeling reagent according to [1], wherein the base is triethylamine.
  • [6] The method for producing an antibody labeling reagent according to any one of [1] to [5], wherein the concentration of the base is 0.01 to 5%.
  • [7] The method for producing an antibody labeling reagent according to any one of [1] to [6], wherein the protein or peptide is a peptide that can specifically bind to the Fc region of IgG.
  • the antibody label according to [7], wherein the amino acid sequence of the peptide that can specifically bind to the Fc region of IgG is the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 115. Method for manufacturing reagents.
  • the amino group is an amino group possessed by a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, diaminopropionic acid, or arginine residue present in the protein or peptide.
  • the crosslinking reagent is disuccinimidyl glutarate (DSG), disuccinimidyl suberate (DSS), dimethyl adipimidate dihydrochloride (DMA), dimethyl pimelimidate dihydrochloride (DMP), suberimidic acid selected from the group consisting of dimethyl dihydrochloride (DMS), 3,3'-dithiobispropionimidate dimethyl dihydrochloride (DTBP), and dithiobis(succinimidylpropionic acid) (DSP), [1] The method for producing an antibody labeling reagent according to any one of [9] to [9]. [11] The method for producing an antibody labeling reagent according to any one of [1] to [10], further
  • Example 1 Table 1 shows terms, abbreviations, and definitions used in this example.
  • GPDCAYHKGELVWCTFH SEQ ID NO: 134, two Cys in the molecule form an SS bond, and the C-terminus is amidated
  • MPA002 is manufactured according to the method described in WO2017/217347 pamphlet and has the structure shown below, in which ethyl azide is bonded to the N-terminus of IgGBP via a linker structure having diglycolic acid and eight ethylene glycol groups. be.
  • the 3armDOTA peptide has the structure shown below and was produced according to the method described in the WO2017/217347 pamphlet.
  • Test Example 1-1 Preparation and evaluation of an antibody-modified linker using an IgG-binding peptide whose N-terminus was modified with a chelating agent (Comparative Example 1-1) 3armDOTA peptide (about 1 mg) was dissolved in DMSO (13 ⁇ L) to give a peptide solution of about 30 mmol/L. To this peptide solution, add 13 ⁇ L of approximately 300 mmol/L DSG dissolved in acetonitrile (10 equivalents to 3armDOTA peptide) and 0.2 ⁇ L of pyridine (5 equivalents to 3armDOTA peptide) to give a final concentration of approximately 0.5%. was added and reacted at 50°C for 6 hours. After the reaction, 1 ⁇ L of the solution was diluted with 0.1% formic acid/DMSO solution (99 ⁇ L) and analyzed under the test conditions listed in Table 2.
  • Example 1-1 Production of antibody-modified linker using 3armDOTA peptide 3armDOTA peptide (about 1 mg) was dissolved in DMSO (13 ⁇ L) to make a peptide solution of about 30 mmol/L. To this peptide solution, 13.3 ⁇ L of 300 mmol/L DSG dissolved in acetonitrile (10 equivalents to 3armDOTA peptide) and 0.21 ⁇ L of NMM (5 equivalents to 3armDOTA peptide) were added, and the mixture was heated at -20°C for 1 hour. Made it react. Similarly, samples were prepared that were reacted at 20°C for 1 hour, 20°C for 1.3 hours, 5°C for 3 hours, or -10°C for 3 hours. After completion of the reaction, 1 ⁇ L of each solution was diluted with DMSO (49 ⁇ L) and analyzed under the test conditions listed in Table 2.
  • Test Example 1-2 Production and evaluation of an antibody-modified linker using an IgG-binding peptide modified with azide at the N-terminus
  • MPA002 (about 1 mg) was dissolved in DMSO (20 ⁇ L) to obtain a peptide solution of about 19 mmol/L.
  • DMSO 20 ⁇ L
  • DSG acetonitrile solution 500 mmol/L
  • 0.27 ⁇ L of pyridine 6.5 equivalents to MPA002 was added to give a final concentration of 0.5%, and the mixture was heated at 50°C.
  • the reaction was allowed to proceed for 3 hours. After the reaction, 1 ⁇ L of the solution was diluted with DMSO (49 ⁇ L) and analyzed under the following test conditions.
  • MPA002 (about 1 mg) was dissolved in DMSO (20 ⁇ L) to obtain a peptide solution of about 19 mmol/L. After adding 20 ⁇ L of a DSG acetonitrile solution (500 mmol/L) to this peptide solution, 0.13 ⁇ L of NMM (3 equivalents to MPA002) was added, and the mixture was reacted at 0° C. for 1 or 2 hours. After the reaction was completed, 1 ⁇ L of each solution was diluted with DMSO (49 ⁇ L) and analyzed under the conditions listed in Table 5.
  • Example 1-5 Examination of the type of base As shown in the above example, the present inventors found that using NMM, which is a stronger base than pyridine, and lowering the reaction temperature were excellent conditions. I discovered that. Therefore, TEA (pKa: 10.75), which is a stronger base than NMM, was used and the reaction temperature was further lowered to carry out the reaction. MPA002 (about 1 mg) was dissolved in DMSO (20 ⁇ L) to obtain a peptide solution of about 19 mmol/L.
  • DMSO 20 ⁇ L
  • IgG-BP IgGBP-N3-RRR: Acetyl-(Lys[Azide]) RRRGSGPDCAYHKGELVWCTFH-CONH 2
  • SEQ ID NO: 115 SEQ ID NO: 115
  • Example 2-2 Purification of IgG-binding peptide CCAP reagent
  • size exclusion chromatography was performed using a Sephadex G-10 column equilibrated with 0.1% TFA. That is, a reaction product (approximately 0.8 mL) diluted 5 times with 0.1% TFA was added to a Sephadex G-10 column (25 x 600 mm) connected to an NGC chromatograph (BioRad) at a flow rate of 2.0 mL/min. was injected, and the eluate was fractionated and collected. Elution was monitored by absorbance measurements at 220 and 280 nm.
  • FIG. 3A The results of size exclusion chromatography are shown in Figure 3A.
  • SG-modified IgG-BP was recovered in the flow-through fraction, and DSG was eluted later, indicating that the two can be clearly separated.
  • the purity of the peptide recovered from the flow-through fraction was checked by reverse phase UPLC, and the results are shown in FIG. 3B.
  • hydrolysates of SG-conjugated IgG-BP (oxidized type) and SG-conjugated IgG-BP (reduced type) were found, but the purity was about 78%.
  • Example 2-3 Preparation of Z33 Peptide CCAP Reagent
  • a Z33-based CCAP reagent was also prepared using an improved method.
  • the Z33-38azide peptide was subjected to reverse phase UPLC under the following conditions. That is, the sample was injected into an ACQUITY UPLC BEH C18 column (1.7 ⁇ m, 2.1 x 100 mm) connected to a UPLC (Waters) connected to ACQUITY SQD, and 0.1% was added at a flow rate of 0.2 ml/min. Elution was with a gradient of 10% to 40% acetonitrile containing formic acid. The column temperature was 35° C., and elution was monitored by absorbance measurement at 280 nm.
  • the present invention is useful for modification of Fc-containing molecules, production of modified Fc-containing molecules and Fc-containing molecule modification reagents, and research reagents.

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Abstract

ピリジンよりも強い塩基性を有する塩基の存在下で、タンパク質又はペプチドと架橋剤とを反応させて、前記タンパク質又はペプチド内のアミノ基と前記架橋剤とを結合させることを含む、Ｆｃ含有分子修飾試薬の製造方法。

Description

Ｆｃ含有分子修飾試薬の製造方法
　本発明は、Ｆｃ含有分子修飾試薬の製造方法及び該Ｆｃ含有分子修飾試薬を用いた複合体の製造方法に関する。
　抗体は、従来から種々の研究・開発において、標的分子の検出に多く利用されており、検出試薬や診断薬として産業面でも、極めて重要なものとなっている。また、抗体は、その標的分子に対する特異性の高さから、疾患の治療のための医薬品としても注目されている。
　抗体の標的分子に対する特異性に影響を与えずに機能付加するための部位特異的な化学修飾として、本発明者らはこれまで、抗体に特異的又は選択的に結合するペプチド（以下、ＩｇＧ結合ペプチドとも称する）に架橋剤と結合可能なアミノ酸を導入し、該アミノ酸を架橋剤により修飾することで、架橋剤により部位特異的に修飾されたＩｇＧ結合ペプチドを調製し、それを用いて抗体を部位特異的に修飾する技術について報告してきた（特許文献１）。
　ＩｇＧ結合ペプチドは、ＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合することができるペプチドである。本発明者らは、これまで、Ｚ３３ペプチドやＺ３４Ｃペプチド等のＦｃ結合性ペプチドを利用した抗体標識試薬としてＣＣＡＰ（Chemical conjugation by affinity peptide）試薬を開発してきた。ＣＣＡＰ試薬では、Ｆｃ結合性ペプチド内に存在するリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、２－アミノスベリン酸、ジアミノプロピオン酸、アルギニン残基、又は１位のアミノ酸のアミノ基が反応性官能基で修飾されている。ＣＣＡＰ試薬と抗体とを結合させるＣＣＡＰ法は、部位特異的に共有結合で抗体を修飾できる方法として、現在、放射性医薬品及び抗体薬物複合体などへの応用が検討されている（特許文献１～３）。
国際公開第２０１７／２１７３４７号 国際公開第２０１６／１８６２０６号 国際公開第２０１８／２３０２５７号
　架橋剤により部位特異的に修飾されたＩｇＧ結合ペプチド（以下、抗体修飾リンカーとも称する）を製造するにあたり、特許文献１に記載の方法等、従来の方法では、ＩｇＧ結合ペプチドに架橋剤を反応させた場合に副生成物として抗体修飾リンカーの加水分解体が生成し、さらに、この抗体修飾リンカーの加水分解体は、抗体修飾リンカーと物性が近似しているため、高速液体クロマトグラフィー等の精製方法で両者を分離することが困難であることが、本発明者らにより明らかとなった。
　そのため抗体修飾リンカーの収率を従来と同程度に維持しつつ、分離が困難な加水分解体の生成を低減させる抗体修飾リンカーの製造方法の開発が望まれていた。
　また、これまでＣＣＡＰ法に用いてきたＩｇＧ結合ペプチド（ＩｇＧ－ＢＰ）又はＺ３３、Ｚ３４Ｃペプチドと、架橋試薬ｄｉｓｃｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｇｌｕｔａｒａｔｅ（ＤＳＧ）との反応によるｓｃｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｇｌｕｔａｒｙｌ（ＳＧ）化されたＣＣＡＰ試薬の製造方法には、いくつかの問題があった。一つは、反応には、高温（５０℃）で２時間の反応時間を要すること、もう一つは、精製に、逆相カラムを用いるため、回収率が低く、大量調製に向かないことである。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、本発明の第１の実施形態として、ＩｇＧ結合ペプチドと架橋剤を反応させる際の反応条件（塩基の種類及び反応温度）を適切に選択することで、抗体修飾リンカーの収率を従来と同程度に維持しつつ、副生成物である抗体修飾リンカーの加水分解体の含有量を低減させることに成功し、より純度の高い抗体修飾リンカーが得られる製造方法を見出した。
　また、本発明の第２の実施形態は、短時間かつ高収量で抗体標識試薬を得ることができる抗体標識試薬の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、この問題を解決する為、ＩｇＧ結合ペプチド又はＺ３３、Ｚ３４ＣペプチドとＤＳＧとの反応方法及び精製方法の改良を行った結果、短時間かつ高収量でＣＣＡＰ試薬を得る手法を構築した。
　従来法では、ＩｇＧ結合ペプチド（ＩｇＧ－ＢＰ）又はＺ３３、Ｚ３４ＣペプチドとＤＳＧとの反応は、１％ピリジンを含むＤＭＳＯ中で、５０℃にて２時間という条件で行っていた。このような条件では、ペプチド中のアミノ酸のラセミ化などの副反応の可能性が懸念されるため、よりマイルドな条件で反応を進行させる手法が求められていた。本発明者らは、検討の結果、１％ピリジンの代わりに、別の塩基触媒を用いることで、飛躍的に反応が加速することを見出した。後に述べるように、わずか１５分で、１００％近い収率でのペプチドの修飾が可能である。
　本発明の第２の実施形態におけるもう一つの改良点は、ＳＧ化されたＣＣＡＰ試薬の精製法の変更である。ペプチドとＤＳＧを反応後、過剰なＤＳＧを除去する操作が必要であるが、これを、従来、逆相カラムを用いて行っていた。しかし、逆相カラムでは、回収率が低くなること、スケールアップ化が難しいといった問題があった。そこで、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１０カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーに切り替えることで、ステップの省略と回収率の向上に至った。
　本発明に係るＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法は、ピリジンよりも強い塩基性を有する塩基の存在下で、タンパク質又はペプチドと架橋剤とを反応させて、タンパク質又はペプチド内のアミノ基と架橋剤とを結合させることを含む。なお、本発明において、「抗体修飾リンカー」や「抗体標識試薬」は、「Ｆｃ含有分子修飾試薬」に含まれる。
　本発明の別の一態様は、本発明のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法を実行して、Ｆｃ含有分子修飾試薬を得るリンカー修飾工程と、前記Ｆｃ含有分子修飾試薬と、Ｆｃ含有分子とを混和して、前記Ｆｃ含有分子修飾試薬と、前記Ｆｃ含有分子を構成するアミノ酸の側鎖末端アミノ基と、を反応させて、前記Ｆｃ含有分子修飾試薬と前記Ｆｃ含有分子との複合体を得る複合化工程と、を備える複合体の製造方法を提供するものである。
　本発明の第１の実施形態の製造方法によれば、抗体修飾リンカーの収率を従来と同程度に維持しつつ、抗体修飾リンカーの加水分解体の含有量を低減させることができる。すなわち、高純度で抗体修飾リンカーを製造することができる。
　本発明の第２の実施形態の製造方法によれば、短時間かつ高収量で抗体標識試薬を得ることができる。
ＩｇＧＢＰ－Ｎ３－ＲＲＲペプチドのＳＧ化反応のスキームを示す図である。 ＩｇＧＢＰ－Ｎ３－ＲＲＲペプチドのＳＧ化反応前（Ａ）と後（Ｂ）での逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 ＩｇＧＢＰ－Ｎ３－ＲＲＲペプチドのＳＧ化反応物からのサイズ排除クロマトグラフィー（Ａ）の結果と精製後の逆相ＨＰＬＣ分析（Ｂ）の結果を示す図である。 Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅペプチドのＳＧ化反応のスキームを示す図である。 Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅペプチドのＳＧ化反応前（Ａ）と後（Ｂ）での逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅペプチドのＳＧ化反応物からのサイズ排除クロマトグラフィー（Ａ）の結果と精製後の逆相ＨＰＬＣ分析（Ｂ）の結果を示す図である。
　本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
　本発明において、「Ｆｃ含有分子」は、抗体のＦｃ領域を含んでいればよく、Ｆｃ領域と他のポリペプチドが融合したポリペプチド、例えば、抗体などが含まれる。Ｆｃ含有分子として、完全長抗体を採用してもよいし、抗体断片又は改変体を採用してもよい。
　本発明において、「Ｆｃ」とは、通常、抗体分子中の、ヒンジ部若しくはその一部、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインからなるポリペプチド鎖を二本含む領域のことをいうが、特にこれに限定されず、ヒンジ部若しくはその一部が含まれない場合もある。Ｆｃは、ＩｇＧをタンパク質分解酵素で部分消化して得ることができる。
　以下の実施形態では、Ｆｃ含有分子として主に抗体を例に挙げて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されず、第１の実施形態で説明する抗体修飾リンカーはＦｃ含有分子を修飾するリンカーとして用いることができるし、第２の実施形態で説明する抗体標識試薬は、Ｆｃ含有分子の標識試薬として用いることができる。
（第１の実施形態）
　本発明の第１の実施形態は、ＩｇＧ結合ペプチドと、架橋剤と、を反応させる、抗体修飾リンカーの製造方法であって、前記架橋剤は、前記ＩｇＧ結合ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖末端アミノ基と結合可能なスクシンイミド基を有する架橋剤であり、前記反応が、ピリジンより塩基性の強い三級アミンの存在下、室温以下で実行されることを特徴とする、抗体修飾リンカーの製造方法を提供するものである。以下、第１の実施形態の抗体修飾リンカーの製造方法とも称する。
１．抗体修飾リンカーの製造方法
　本発明の第１の実施形態は、架橋剤により部位特異的に修飾されたＩｇＧ結合ペプチド（抗体に特異的又は選択的に結合するペプチド）を製造する方法を提供する。本発明の第１の実施形態では、該架橋剤により部位特異的に修飾されたＩｇＧ結合ペプチドを抗体修飾リンカーとも称する。
＜ＩｇＧ結合ペプチド＞
　本発明の第１の実施形態で使用する「ＩｇＧ」は、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット、マウス、及びウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物のＩｇＧ、好ましくはヒトのＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）を指すものとする。本発明の第１の実施形態におけるＩｇＧは、さらに好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ４、又はウサギＩｇＧであり、特に好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４である。
　一態様において、本発明の第１の実施形態で使用するＩｇＧ結合ペプチドは、下記の式Ｉ：
（Ｘ）１－３－Ｃ－（Ｘ）２－Ｈ－（Ｘａａ１）－Ｇ－（Ｘａａ２）－Ｌ－Ｖ－Ｗ－Ｃ－（Ｘ）１－３　　　　　　　　（Ｉ）
（式中、Ｘの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Ｃはシステイン残基であり、
Ｈはヒスチジン残基であり、
Ｘａａ１はリシン残基であり、
Ｇはグリシン残基であり、
Ｘａａ２はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Ｌはロイシン残基であり、
Ｖはバリン残基であり、かつ
Ｗはトリプトファン残基である。）
によって表される、１３～１７アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトＩｇＧと結合可能である。
　上記式で、Ｎ末端又はＣ末端の（Ｘ）１－３という表記は、システイン（Ｃ又はＣｙｓ）以外の独立的に任意のアミノ酸残基Ｘが１～３個連続していることを意味し、それを構成するアミノ酸残基は同じか又は異なる残基であるが、好ましくは３個すべてが同じ残基でない配列からなる。同様に、（Ｘ）２もシステイン（Ｃ又はＣｙｓ）以外の独立的に任意のアミノ酸残基Ｘが２個連続していることを意味し、それを構成するアミノ酸残基は同じか又は異なる残基であるが、好ましくは当該２個連続しているアミノ酸残基は同じ残基でない配列からなる。
　式Ｉの２つのシステイン残基はジスルフィド結合して環状ペプチドを形成することができ、通常、ジスルフィド結合している。或いは、式Ｉのペプチドにおいて、２つのシステイン残基中のスルフィド基は、以下の式：
で表される基により連結されていてもよい。上記式中の波線部分は、スルフィド基との結合部分を意味する。当該基は、通常のジスルフィド結合よりも、還元反応等に対して安定である。このようなペプチドは例えば、ＷＯ２０１６／１８６２０６号パンフレット、ＷＯ２０１７／２１７３４７号パンフレットに記載の方法に準じて合成することができる。
　式ＩのＩｇＧ結合ペプチドの具体例のいくつかを以下の１）～１８）に列挙するが、これらに制限されないことはいうまでもない。
１）ＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号１１６）、
２）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１１７）、
３）ＲＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＳ（配列番号１１８）、
４）ＧＰＲＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＳＦＨ（配列番号１１９）、
５）ＳＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１２０）、
６）ＧＤＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１２１）、
７）ＧＰＳＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１２２）、
８）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＳＦＨ（配列番号１２３）、
９）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴＨＨ（配列番号１２４）、
１０）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴＦＹ（配列番号１２５）、
１１）ＳＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴＦＹ（配列番号１２６）、
１２）ＳＤＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴＦＹ（配列番号１２７）、
１３）ＲＧＮＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号１２８）、
１４）Ｇ（Ｘａａ３）ＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴ（Ｘａａ３）Ｈ（配列番号１２９）
１５）ＤＣＴＹＨ（Ｘａａ１）ＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号１３０）、
１６）ＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号１３１）、
１７）ＤＣＴＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号１３２）、及び
１８）ＤＣＡＷＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号１３３）
（式中、Ｘａａ１はリシン残基であり、Ｘａａ３はホモシステインであり、好ましくは、ホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している）。
　式ＩのＩｇＧ結合ペプチドの好ましい具体例として、
１）ＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号１１６）、
２）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１１７）、
１３）ＲＧＮＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号１２８）、及び
１４）Ｇ（Ｘａａ３）ＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴ（Ｘａａ３）Ｈ（配列番号１２９）が挙げられ、
特に好ましい例として、２）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ１）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１１７）が挙げられる（式中、Ｘａａ１はリシン残基であり、Ｘａａ２はホモシステインであり、好ましくはシステイン同士及び／又はホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している）。
　本発明の第１の実施形態で使用されるＩｇＧ結合ペプチドは、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を問わないアミノ酸を組み合わせて用いて、例えば液相合成法、固相合成法、自動ペプチド合成法、遺伝子組み換え法又はファージディスプレイ法等のペプチド合成法に供することよって製造することができる。ペプチドの合成にあたり、必要に応じて、用いられるアミノ酸の官能基の保護を行ってもよい。これらは、例えば、ＷＯ２０１６／１８６２０６号パンフレット、ＷＯ２０１７／２１７３４７号パンフレット及びＷＯ２０１８／２３０２５７号パンフレットに記載の方法に準じて行うことができる。
　本発明の第１の実施形態において、上記ＩｇＧ結合ペプチドは、架橋剤により修飾されていることを特徴とし、架橋剤で修飾されたＩｇＧ結合ペプチドは抗体を修飾する為のリンカーとして用いることができる。
　本発明の第１の実施形態で使用するＩｇＧ結合ペプチドが、例えば式Ｉによって表される場合、Ｘａａ１において、ＩｇＧ　Ｆｃの特定の領域にあるリシン残基を近接する。例えば、ＩｇＧがトラスツズマブの場合、ヒトＩｇＧ　ＦｃにおけるＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従うＬｙｓ２４８又はＬｙｓ２４６、好ましくはＬｙｓ２４８と近接する。従って、上記ＩｇＧ結合ペプチドのＸａａ１が架橋剤で修飾されることで、ＩｇＧとの架橋反応が実行され、ＩｇＧ結合ペプチドのＸａａ１とＩｇＧ　Ｆｃのリシン残基との間で部位特異的に架橋構造を形成させることができる。このようにＩｇＧ結合ペプチドのＸａａ１を架橋剤で修飾し、ＩｇＧと架橋反応させることによって、種々の化合物を、特異的かつ簡便にＩｇＧに導入することができる。また、ＩｇＧ結合ペプチドを介して化合物を導入することができるため、様々な構造の化合物をＩｇＧに導入することができる。さらに本発明の第１の実施形態に係る方法は、得られる産物の収率が高く、また、抗体そのもの改変を伴わないため、抗体の機能を低下させる可能性が低いという利点も有する。
　本発明の第１の実施形態において、「架橋剤」とは、ＩｇＧ結合ペプチドと、ＩｇＧ　Ｆｃを、共有結合により連結させるための化学物質である。本発明の第１の実施形態の架橋剤は、当業者であれば適宜選択することが可能である。例えば、ＤＳＧ（disuccinimidyl glutarate、ジスクシンイミジルグルタレート）、ＤＳＳ（disuccinimidyl suberate、ジスクシンイミジルスベレート）等のスクシンイミジル基を好ましくは２以上含む架橋剤、ＤＭＡ（dimethyl adipimidate・2HCl、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＭＰ（dimethyl pimelimidate・2HCl、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、及びＤＭＳ（dimethyl suberimidate・2HCl、スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）等のイミド酸部分を好ましくは２以上含む架橋剤、並びにＤＴＢＰ（dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate・2HCl、3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）及びＤＳＰ（dithiobis（succinimidyl propionate）、ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）等のＳＳ結合を有する架橋剤が挙げられる。架橋剤として好ましくはＩｇＧ結合ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖末端アミノ基に結合可能なスクシンイミド基を有するものであり、特にＤＳＧ及びＤＳＳが好ましい。
　本発明の第１の実施形態において、上記ＩｇＧ結合ペプチドは、他の機能性物質、例えば、ＩｇＡ又はＶＨＨ等の抗体、標識物質及び／又は他の薬剤により修飾されていてもよい。ＩｇＧ結合ペプチドと他の機能性物質の連結は、当業者に公知の方法、例えばアジド基とdibenzocyclooctyneとの反応、又はマレイミド基とスルフヒドリル基の反応等により行うことができる。標識物質により標識されている場合、ＩｇＧ結合ペプチドがＩｇＧと複合体を形成することで、該標識物質を介してＩｇＧの検出又は定量を行うことが可能となる。標識物質は、限定されないが、例えば蛍光色素、化学発光色素、並びにビオチン及びＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）等の蛍光タンパク質、発光タンパク質、並びにペルオキシダーゼ等の酵素を含み、好ましい標識物質の例は、フルオレセイン及びＦＩＴＣ等のフルオレセイン誘導体、ローダミン及びテトラメチルローダミン等のローダミン誘導体、並びにテキサスレッド等の蛍光色素である。ＩｇＧ結合ペプチドを他の薬剤によって修飾する場合、薬剤として、限定するものではないが、例えば、オーリスタチン、メイタンシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、又はこれらの誘導体等の抗がん剤；並びに、血液脳関門上のレセプターに結合して中枢神経への移行を可能とする薬剤、又はがん細胞等に結合して抗体の細胞内への移行を可能にする薬剤等の標的化剤が挙げられる。
　本発明の第１の実施形態の一態様として、上記ＩｇＧ結合ペプチドは、Ｎ末端が、放射性金属をキレート可能なキレート剤またはクリック反応可能な原子団により修飾されている。本発明の第１の実施形態においてキレート剤は、放射性金属が配位する部位を構造中に有するものであれば特に限定されず、放射性金属が配位する部位であるキレート部を有する。キレート部は、放射性金属が配位する部位を構造中に有するものであれば特に限定されないが、CB-TE2A(1,4,8,11-Tetraazabicyclo[6.6.2]hexadecane-4,11-diacetic acid)、CDTA(Cyclohexane-trans-1,2-diamine tetra-acetic acid)、CDTPA(4-cyano-4-[[(dodecylthio)thioxomethyl]thio]-Pentanoic acid)、DOTA(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)、DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α’,α’’,α’’’-tetramethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)、DOTAM(1,4,7,10-tetrakis(carbamoylmethyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecane)、DOTA-GA(α-(2-Carboxyethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)、DOTP(((1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetrakis(methylene))tetraphosphonicacid)、DOTMP(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrakis(methylenephosphonic acid))、DOTA-4AMP(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrakis(acetamidomethylenephosphonic acid)、D02P(Tetraazacyclododecane dimethanephosphonic acid)、Deferoxamine (DFO)、DTPA(Glycine, N, N-bis[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl]-)、DTPA-BMA(5,8-Bis(carboxymethyl)-11-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]-3-oxo-2,5,8,11-tetraazatridecan-13-oic acid)、EDTA(2、2’,2’’,2’’’-(ethane-1,2-diylbis(azanetriyl))tetraacetic acid)、NOTA(1,4,7-Triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid)、NOTP(1,4,7-Triazacyclononane-1,4,7-triyltris(methylenephosphonic acid)、TETPA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetrapropionic acid)、TETA(1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecane-N,N’,N’’,N’’’-tetraacetic acid)、TTHA(3,6,9,12-Tetrakis(carboxymethyl)- 3,6,9,12-tetraazatetradecanedioic acid)、HEHA(1,2,7,10,13-hexaazacyclooctadecane-1,4,7,10,13,16-hexaacetic acid)、1,2-HOPO(N,N’,N’’,N’’’-tetra(1、2-dihydro-1-hydroxy-2-oxopyridine-6-carbonyl)-1,5,10,14-tetraazatetradecane)、PEPA(1,4,7,10,13-pentaazacyclopentadecane-N,N’,N’’,N’’’,N’’’’-penta-acetic acid)、H4octapa(N,N’-bis(6-carboxy-2-pyridylmethyl)-ethylenediamine-N,N’-diacetic acid)、H2bispa2(6,6’-({9-hydroxy-1,5-bis(methoxycarbonyl)-2,4-di(pyridine-2-yl)-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonane-3,7-diyl}bis(-methylene))dipicolinic acid)、H2dedpa(1,2-[{6-(carboxy)-pyridin-2-yl}-methylamino]ethane)、H2macropa(6-(1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecan-N,N’-methyl)picolinic acid)、H5decapa(N,N’’-bis(6-carboxy-2-pyridylmethyl)-diethylenetriamine-N,N’ ,N’’-triacetic acid)、H6phospa(N,N’-(methylenephosphonate)-N,N’-[6-(methoxycarbonyl)pyridin-2-yl]-methyl-1,2-diaminoethane)、HP-D03A(Hydroxypropyltetraazacyclododecanetriacetic acid)、若しくはporphyrin又は下記式(A)で表される化合物に由来する構造を有することが好ましい。これらの構造は、後述する放射性金属の種類に応じて、適宜選択することができる。
（式（Ａ）中、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、－（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨ、－（ＣＨ２）ｐＣ５Ｈ５Ｎ、－（ＣＨ２）ｐＰＯ３Ｈ２、－（ＣＨ２）ｐＣＯＮＨ２若しくは、－（ＣＨＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨからなる基であり、Ｒ１２又はＲ１５の一方が、水素原子、カルボキシル基、又は、炭素数２若しくは３のカルボキシアルキル基であり、他方が、前記ＩｇＧ結合ペプチドに結合するための置換基であり、ｐが０以上３以下の整数であり、Ｒ１２が前記ＩｇＧ結合ペプチドに結合するための置換基であるときＲ１５は水素原子であり、Ｒ１２が前記ＩｇＧ結合ペプチドに結合するための置換基でないときＲ１５は前記ＩｇＧ結合ペプチドに結合するための置換基である。）
　式（Ａ）で表される具体的な構造としては、以下の式（Ａ－１）～（Ａ－１２）で表される化合物に由来する構造が挙げられる。
　キレート剤をＩｇＧ結合ペプチドに連結させる方法は当業者には周知である。例えば、キレート剤をＩｇＧ結合ぺプチドのＮ末端に連結させる場合には、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）、イソチオシアノ基（ＩＴＣ）、スルホン酸クロリド、カルボン酸クロリド、エチレンオキシド、アルキルクロリド、アルデヒド基、及びカルボン酸無水物等の反応基をキレート剤に付加し、これをＩｇＧ結合ペプチドのＮ末端のアミノ基と反応させればよい。あるいは、このようなキレート剤を含むＩｇＧ結合ペプチドを、周知の合成法等により直接合成してもよい。
　放射性金属としては、α線、β線若しくはγ線又はこれらの組み合わせの放射線を放出する金属核種を用いることができる。このような放射性金属の核種としては、例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属、ランタノイド、アクチノイド、遷移金属若しくはこれらの金属以外の金属の放射性同位体等が挙げられる。これらのうち、商業利用可能であり且つキレート形成性の向上を図る観点から、放射性金属の核種として、４４Ｓｃ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１０３Ｒｕ、１１１Ｉｎ、１５３Ｓｍ、１６５Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、２０１Ｔｌ、１９７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２７Ｔｈ又は２２５Ａｃを用いることが好ましい。これらの放射性金属は、常法に従って製造することができ、放射性金属が電離した態様で含む溶液として得ることが好ましい。
　放射性金属とキレート剤の好ましい組み合わせは、当業者であれば適宜選択することができる。
　クリック反応可能な原子団としては、クリック反応の種類に応じて適切なものが選択される。クリック反応は、例えば、アルキンとアジドとの組み合わせ、１，２，４，５－テトラジンとアルケンとの組み合わせ等によって実行され得る。これらの組み合わせのうち、一方の原子団がIgG結合ペプチドのN末端に導入され、もう一方の原子団はキレート剤に導入され得る。このような原子団の組み合わせによるクリック反応の具体例として、ヒュスゲン環化付加反応、あるいは逆電子要請型ディールスアルダー反応等が挙げられる。
　クリック反応可能な原子団の組み合わせの具体例としては、以下の式に示すように、アルキンとしてジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を含む原子団（式（１ａ））と、アジドとしてアジド基を含む原子団（式（２ａ））との組み合わせ、あるいは、１，２，４，５－テトラジンを含む原子団（式（１ｂ））と、アルケンとしてｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）を含む原子団（式（２ｂ））との組み合わせが挙げられる。
（式（１ａ）中、Ｒ１は、抗体修飾リンカー又はキレート剤との結合部位を示し、式（２ａ）中、Ｒ２は、抗体修飾リンカー又はキレート剤との結合部位を示す。）
（式（１ｂ）中、Ｒ３及びＲ４のうち一方が抗体修飾リンカー又はキレート剤との結合部位を示し、他方が水素原子、メチル基、フェニル基又はピリジル基を示し、式（２ｂ）中、Ｒ５は、抗体修飾リンカー又はキレート剤との結合部位を示す。）
　クリック反応可能な原子団をＩｇＧ結合ペプチドに連結させる方法は当業者には周知である。例えば、ＩｇＧ結合ペプチドを、溶解補助剤及び還元剤、並びに必要に応じて酸を加えた溶液に溶解し、該溶液にクリック反応可能な原子団として、アジド基又はｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）を含む原子団の有機溶媒溶液を添加し、室温で攪拌することにより導入する方法が挙げられる。
　クリック反応可能な原子団としてアジド基を含む原子団を導入する場合には、市販のアジド基導入試薬を用いて、常法に従い、ペプチドのＮ末端にアジド基を導入する。用いられるアジド基導入試薬としては例えば、シリルアジド、リン酸アジド、アルキルアンモニウムアジド、無機アジド、スルホニルアジド、又はＰＥＧアジド等が挙げられる。
　クリック反応可能な原子団としてＴＣＯを含む原子団を導入する場合には、ＴＣＯを含む市販のクリックケミストリー用試薬を用いて、常法に従い、ペプチドのＮ末端にＴＣＯを導入する。
　クリック反応可能な原子団としてアルキンを用い、例えば、上記式（１ａ）で表されるジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を含む原子団を用いる場合は、市販されている種々のＤＢＣＯ試薬が挙げられる。具体的には、例えば、DBCO-C6-Acid、Dibenzylcyclooctyne-Amine、Dibenzylcyclooctyne Maleimide、DBCO-PEG acid、DBCO-PEG-NHS ester、DBCO-PEG-Alcohol、DBCO-PEG-amine、DBCO-PEG-NH-Boc、Carboxyrhodamine-PEG-DBCO、Sulforhodamine-PEG-DBCO、TAMRA-PEG-DBCO、DBCO-PEG-Biotin、DBCO-PEG-DBCO、DBCO-PEG-Maleimide、TCO-PEG-DBCO、DBCO-mPEGなどが選択できるが、好ましくはDibenzylcyclooctyne Maleimideを用いる。
　前記ＩｇＧ結合ペプチドは、その安定性の向上等のため、例えば、Ｎ末端のＰＥＧ化（ポリエチレングリコール付加）、及びＣ末端のアミド化等により修飾されていても良い。ＰＥＧ化を行う場合のＰＥＧの分子数は特に限定されず、例えば、１～５０分子、１～２０分子、２～１０分子、２～６分子、又は４分子のＰＥＧを付加することができる。
　架橋剤により修飾されたＩｇＧ結合ペプチド、すなわち抗体修飾リンカーは、例えば上記＜ＩｇＧ結合ペプチド＞の項目で記載した方法に従って得られたＩｇＧ結合ペプチドを架橋剤と反応させることにより製造することができる。これは、ＩｇＧ結合ペプチドにおける架橋剤によって修飾される特定の位置のアミノ酸の種類と架橋剤の組み合わせを選択することによりなされ得る。例えば、ＤＳＳ又はＤＳＧ等のスクシンイミジル基を含む架橋剤は、リシン残基の側鎖及びポリペプチドのＮ末端に存在する一級アミンと反応するため、ＩｇＧ結合ペプチドのＮ末端をブロッキングした上でＤＳＳ又はＤＳＧと反応させることで、リシン残基の側鎖のみをＤＳＳ又はＤＳＧで特異的に修飾することができる。
　ＩｇＧ結合ペプチドと架橋剤との反応は、架橋剤により部位特異的に修飾されたＩｇＧ結合ペプチド、即ち抗体修飾リンカーの収率を維持しつつ副生成物である抗体修飾リンカーの加水分解体を低減することが可能な範囲で実施される。具体的には、ＩｇＧ結合ペプチドを、溶媒中、塩基として「ピリジンより塩基性の強い三級アミン」を用い、その存在下に架橋剤と室温以下の反応温度で実施される。本反応で使用する溶媒としては、反応に悪影響が出ない限り特に限定されないが、水、生理食塩水、又は酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、若しくはテトラメチルアンモニウム酢酸緩衝液等の緩衝液等、若しくは炭素数１以上５以下のアルコール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルミアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド及びアセトン等の水溶性有機溶媒又はこれらの混合溶媒を用いることができる。
　本実施の形態でいう「塩基性」は、本発明の第１の実施形態で用いられる三級アミンを塩基としたときの共役酸のｐＫａで表わすことができる。
　「ピリジンより塩基性の強い三級アミン」としては、好ましくは、ｐＫａ６．０以上の三級アミンであり（ピリジンのｐＫａは５．２５）である。塩基性が弱いと、反応が十分に進行しない。強い塩基性の三級アミンの使用は反応の十分な進行は期待できるが、汎用性を高める観点からｐＫａは好ましくは１５．０以下、より好ましくは８．０以下である。本発明で使用する「ピリジンより塩基性の強い三級アミン」は、好ましくはｐＫａ６．０以上１５．０以下、より好ましくはｐＫａ６．０以上８．０以下である。具体的には、三級アルキルアミンが好ましく、炭素数１～１０の三級アルキルアミンがより好ましく、鎖状アルキルアミンであってもよいし、環状アルキンアミンであってもよい。例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルメチルアミン、メチルジプロピルアミン、メチルジイソプロピルアミン、エチルジメチルアミン、ジメチルプロピルアミン、エチルメチルプロピルアミン、エチルメチルイソプロピルアミン等の鎖状アルキルアミン、メチルピロリジン、エチルピロリジン、プロピルピロリジン、イソプロピルピロリジン、ブチルピロリジン、ｔｅｒｔ－ブチルピロリジン、メチルホモピペリジン、エチルホモピペリジン、メチルピペリジン、エチルピペリジン、ジメチルピペラジン、ジエチルピペラジン、メチルエチルピペラジン、Ｎ－メチルモルホリン、エチルモルホリン等の環状アルキルアミンが挙げられる。好ましくはＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）である。
　本反応におけるピリジンより塩基性の強い三級アミンの用量は、反応を促進し得る限り特に限定されないが、ＩｇＧ結合ペプチドのモル量を基準として、上限値としては、例えば２０当量以下、１０当量以下、８当量以下又は４当量以下とすることができ、下限値としては、例えば１当量以上、２当量以上、３当量以上又は４当量以上とすることができ、好ましくは２当量以上２０当量以下、４当量以上２０当量以下、２当量以上１０当量以下、４当量以上１０当量以下、２当量以上８当量以下、４当量以上８当量以下、２当量以上４当量以下とすることができる。少なすぎると反応の進行が不十分となり、多すぎると副生成物である加水分解体の量が増える。
　本反応における架橋剤の用量は、ＩｇＧ結合ペプチドを部位特異的に架橋剤で修飾できれば特に限定されないが、通常、過剰量であり、好ましくはＩｇＧ結合ペプチドのモル量を基準として、上限値としては、例えば１００当量以下、５０当量以下、４０当量以下、３０当量以下、２０当量以下、１５当量以下又は１０当量以下とすることができ、下限値としては、例えば５当量以上、１０当量以上、２０当量以上、２５当量以上又は３０当量以上とすることができる。少なすぎると反応の進行が不十分となる。ある一定量以上の架橋剤を使用しても収率はプラトーに達することから、２０当量以上５０当量以下、２０当量以上４０当量以下、２０当量以上３０当量以下での使用が好ましい。
　本反応における反応温度は、例えば、室温以下である。ここで「室温」とは、第十六改正日本薬局方で定める温度をいい、通常１～３０℃である。反応温度は、例えば、３０℃以下、２０℃以下又は１０℃以下とすることができ、より好ましくは、５℃以下、さらにより好ましくは－５℃以下である。こうすることで、副生成物である抗体修飾リンカーの加水分解体の生成をより抑制することができる。また、ピリジンより塩基性の強い三級アミンの必要量の増加を抑える、及び／又は反応時間が長くなりすぎないようにするため、反応温度は－４０℃以上が好ましく、－２０℃以上がより好ましい。
　本反応における反応時間は、反応が十分に進行する限り特に限定されず、使用するＩｇＧ結合ペプチド、架橋剤、三級アミン（塩基）の種類や量、反応温度によっても異なり、それらに応じて適宜設定される。通常、反応時間は２５０分以下、２００分以下、１８０分以下、１５０分以下、１２０分以下、６０分以下であり得る。より高い反応温度では、塩基の量はより少なく反応時間も短い。より低い反応温度では、塩基の量はより多く反応時間も長くなる。
　反応終了後、反応液をそのまま後述する複合化工程に用いてもよいし、凍結乾燥等により溶媒を除去することで濃縮したり、精製をしたりしてもよい。精製条件は特に限定されるものではないが、例えば、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、テトラヒドロフランを用いて固体を析出させたり、限外ろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の種々のクロマトグラフィー法を用いたりすることができる。逆相クロマトグラフィー法を用いる場合、移動相は、有機溶媒と酸性水溶液との混液が好ましく、有機溶媒としてはアセトニトリル、エタノール、メタノール又は２－プロパノール、酸性水溶液としては、ギ酸、酢酸又はトリフルオロ酢酸を含む水溶液との混液が例示されるが、アセトニトリルと、トリフルオロ酢酸を含む水溶液との混液がより好ましい。抗体修飾リンカーを保存する場合は、室温以下で保存することが好ましく、０℃以下で保存することがより好ましい。
２．抗体複合体の製造方法
　別の一態様として、本発明の第１の実施形態は、上記製法（１．抗体修飾リンカーの製造方法）によって抗体修飾リンカーを得るリンカー修飾工程と、上記抗体修飾リンカーと、抗体とを混和して、抗体修飾リンカーのスクシンイミド基と、抗体を構成するアミノ酸残基の側鎖末端アミノ基とを反応させて、抗体修飾リンカーと抗体との複合体を得る複合化工程と、を備える抗体複合体の製造方法を提供する。該抗体複合体は、抗体修飾リンカー１分子以上と抗体１分子が連結していればよく、例えば抗体修飾リンカー１分子と抗体１分子が連結している抗体複合体、又は抗体修飾リンカー２分子と抗体１分子が連結している抗体複合体を含む。
　該複合化工程の条件は抗体修飾リンカーの有する架橋剤のスクシンイミド基と抗体を構成するアミノ酸残基の側鎖末端アミノ基との間で架橋反応が生じうる条件であれば特に限定しない。例えば、リンカー修飾工程を経た抗体修飾リンカーを含む溶液と抗体を含む溶液を混和してもよく、抗体修飾リンカーを含む溶液を所望の緩衝液に溶媒置換してから抗体を含む溶液を混和してもよい。溶媒置換には公知の方法を適宜採用可能である。また、該複合化工程の反応温度は抗体修飾リンカーと抗体とが架橋反応により連結される温度であれば特に限定されるものではなく、抗体が安定に存在できる条件で実施することが好ましく、抗体修飾リンカーが分解せず、抗体修飾リンカーの加水分解体が極端に増加しない温度で行うことがより好ましい。例えば、室温（１℃～３０℃）又は常温（１５℃～２５℃）で行うことができる。該複合化工程は、抗体が安定に存在できる条件で実施することが好ましく、ｐＨ５～７の弱酸性条件下で実行することが好ましい。該複合化工程の溶媒としては、酢酸緩衝液、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール（Ｔｒｉｓ）緩衝液、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液等の緩衝液を用いることができる。また、必要に応じて架橋反応を促進するための公知の触媒、アルギニンなどの公知の安定化剤、又はスクロース等の糖類若しくは塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの等張化剤を適量加えて行ってもよい。
　該複合化工程における抗体修飾リンカーと抗体との混合比率は、特に限定されるものではないが、例えば、モル比率として１：１以上２０：１以下である。下限は好ましくは２：１以上、より好ましくは５：１以上、上限はより好ましくは１０：１以下である。また、該複合化工程の反応時間は特に限定されるものではないが、例えば、１分以上５時間以下である。下限は好ましくは１０分以上、より好ましくは１５分以上であり、上限は好ましくは２時間以下、より好ましくは１時間以下である。
　該抗体複合体の製造方法は、複合化工程の後、得られた抗体複合体を、必要に応じて精製する工程を実行して、不純物、例えば未反応のＩｇＧ結合ペプチド、抗体修飾リンカー、抗体等を分離し、抗体複合体の精製を行ってもよい。その場合の精製条件は特に限定されるものではないが、例えば、限外ろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の当該分野で公知の精製法を採用可能であり、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。移動相は、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液などを使用でき、適宜、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩を添加してもよい。
　本発明の第１の実施形態は、以下の技術思想を包含するものである。
［１］ＩｇＧ結合ペプチドと、架橋剤と、を反応させる、抗体修飾リンカーの製造方法であって、前記架橋剤が、前記ＩｇＧ結合ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖末端アミノ基と結合可能なスクシンイミド基を有する架橋剤であり、前記反応が、ピリジンより塩基性の強い三級アミンの存在下、室温以下で実行されることを特徴とする、抗体修飾リンカーの製造方法。
［２］前記三級アミンが、ｐＫａ６．０以上１５．０以下の三級アミンである、上記［１］記載の抗体修飾リンカーの製造方法。
［３］前記三級アミンが、ｐＫａ６．０以上８．０以下の三級アミンである、上記［２］記載の抗体修飾リンカーの製造方法。
［４］前記反応が、前記ＩｇＧ結合ペプチドのモル量を基準として２当量以上２０当量以下のモル量の前記三級アミンの存在下で実行されることを特徴とする、上記［１］～［３］に記載の抗体修飾リンカーの製造方法。
［５］前記反応が、５℃以下で実行されることを特徴とする、上記［１］～［４］に記載の抗体修飾リンカーの製造方法。
［６］前記反応が、マイナス５℃以下で実行されることを特徴とする、上記［１］～［４］に記載の抗体修飾リンカーの製造方法。
［７］前記架橋剤が、ＤＳＧ（ジスクシンイミジルグルタレート）又はＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）である、上記［１］～［６］に記載の抗体修飾リンカーの製造方法。
［８］前記ＩｇＧ結合ペプチドが、下記の式Ｉ：
（Ｘ）１－３－Ｃ－（Ｘ）２－Ｈ－（Ｘａａ１）－Ｇ－（Ｘａａ２）－Ｌ－Ｖ－Ｗ－Ｃ－（Ｘ）１－３　　　　　　　　（Ｉ）
（式中、Ｘの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Ｃはシステイン残基であり、
Ｈはヒスチジン残基であり、
Ｘａａ１はリシン残基であり、
Ｇはグリシン残基であり、
Ｘａａ２はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Ｌはロイシン残基であり、
Ｖはバリン残基であり、かつ
Ｗはトリプトファン残基である。）によって表される、
１３～１７アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、上記［１］～［７］に記載の抗体修飾リンカーの製造方法。
［９］前記ＩｇＧ結合ペプチドは、Ｎ末端が、放射性金属をキレート可能なキレート剤またはクリック反応可能な原子団により修飾されている、上記［１］～［８］に記載の抗体修飾リンカーの製造方法。
［１０］上記［１］～［９］に記載の抗体修飾リンカーの製造方法を実行して、抗体修飾リンカーを得るリンカー修飾工程と、
前記抗体修飾リンカーと、抗体とを混和して、前記抗体修飾リンカーのスクシンイミド基と、前記抗体を構成するアミノ酸の側鎖末端アミノ基と、を反応させて、前記抗体修飾リンカーと前記抗体との複合体を得る複合化工程と、
を備える抗体複合体の製造方法。
（第２の実施形態）
　本実施の形態に係る抗体標識試薬の製造方法は、ピリジンよりも強い塩基性度を有する塩基の存在下で、タンパク質又はペプチドと前記架橋試薬（架橋剤）とを反応させて、前記タンパク質又はペプチド内のアミノ基と架橋試薬とを結合させることを含む。
　本実施形態の「塩基性度」は、第１の実施形態で定義される「塩基性」と同義である。本実施の形態で使用する塩基としては、ｐＫａが５．２（又は、５．１９、５．２３、若しくは５．２５）より大きい塩基である。好ましくは、ｐＫａが１４（又は、１４．０）よりも小さい塩基を用いることができる。あるいは、ｐＫａが１１以下の塩基を使用することができる。より好ましくは、これらの最大値と最小値を組み合わせた範囲の塩基である。このような塩基としては、トリエチルアミン（ｐＫａ＝１０．７５）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ジエチルアミン、又はモノメチルアミンを挙げることができ、好ましくはトリエチルアミンである。本実施の形態において、ｐＫａは室温（例えば２５℃）におけるｐＫａである。
　塩基の濃度は、アミノ基と架橋試薬とを結合させることができる濃度であれば特に限定されるものではないが、使用する塩基、タンパク質又はペプチド、及び架橋試薬の種類、及びタンパク質又はペプチド、及び架橋試薬の濃度に応じて適宜設定することができるが、好ましくは０.１～５％であり、より好ましくは０.５～３％、０.８～２％、０．９～１．５％、又は１％とすることができる。
　使用する溶媒としては、反応に影響せず、且つタンパク質又はペプチド及び架橋試薬を溶解可能な溶媒であれば特に限定されるものではないが、好ましくは、非プロトン性極性溶媒であり、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、アセトン、及びアセトニトリルを挙げることができ、より好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）である。
　タンパク質又はペプチドとしては、好ましくは、ＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合することができるペプチド（Ｆｃ結合性ペプチド）である。「ＩｇＧ」は、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット、マウス、及びウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物のＩｇＧであってよく、好ましくはヒトのＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）である。ＩｇＧとして好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ４、又はウサギＩｇＧであり、特に好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４である。「ＩｇＧのＦｃ領域」とは、典型的には、ＩｇＧのタンパク分解酵素パパイン処理物として得られるＣ末端側の断片を意味する。
　Ｆｃ結合性ペプチドとして、好ましくは、ＦｃにおけるＥｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従うＬｙｓ２４８、Ｌｙｓ２４６、Ｌｙｓ３３８、Ｌｙｓ２８８、Ｌｙｓ２９０、Ｌｙｓ３６０、Ｌｙｓ４１４、及びＬｙｓ４３９から選択される部位及び／又はその近接領域、好ましくはＬｙｓ２４８及び／又はその近接領域に結合するか、あるいは、プロテインＡの結合領域に結合するペプチドである。例えば、Ｆｃ結合性ペプチドは、Ｆｃ結合能を有するプロテインＡの部分ペプチド又はその変異体であってもよい。このようなペプチドの具体的な例が国際特許公開公報ＷＯ２００８／０５４０３０、ＷＯ２０１３／０２７７９６、ＷＯ２０１６／１８６２０６、ＷＯ２０１８／２３０２５７号、及びＫｙｏｈｅｉ　Ｍｕｇｕｒｕｍａら、ＡＣＳ　Ｏｍｅｇａ（２０１９）；４（１１）：１４３９０－１４３９７．に記載されており、それらはそれぞれの文献に記載の方法に従って適宜調製することができる。
　このようなペプチドとしては、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）のペプチドを挙げることができる。
（ｉ）下記式（Ｉ）で表されるペプチド：
ＮＨ２－（Ｌｉｎｋｅｒ）－（Ｘ１ １－３）－Ｃ－（Ｘ２）－（Ｘ３）－（Ｘ４）－（Ｘ５）－Ｇ－（Ｘ６）－Ｌ－（Ｘ７）－Ｗ－Ｃ－（Ｘ８ １－３）－（Ｌｉｎｋｅｒ）・・・（Ｉ）
［式（Ｉ）において、各（Ｌｉｎｋｅｒ）は独立して、同一又は異なるリンカーであるか、又は存在せず、ここで、リンカーは、ＲＲＲＧＳ（配列番号１３６）、ＥＥＧＧＳ（配列番号１３７）、（ＧＳＧＧＳ（配列番号１３８））１－３若しくは（ＰＥＧ）1－１０（好ましくは、（ＰＥＧ）1－８又は（ＰＥＧ）２－１０であり、より好ましくは（ＰＥＧ）４）であり、
　１～３個のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、及び１～３個のＸ８は、それぞれ互いに独立して、同一又は異なるアミノ酸残基を示し、
　各Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及び各Ｘ８は、互いに独立して、同一又は異なる、Ｃ以外の任意のアミノ酸残基を示し、
　Ｘ４は、Ｈ、Ｒ、Ｓ、又はＤであり、
　Ｘ５はＫ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、２－アミノスベリン酸、Ｄｐｒ、Ｏｒｎ、ＡｃＯｒｎ、ＡｃＤａｂ、Ｄａｂ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｔｌｅ、Ａｌａ（ｔ－Ｂｕ）、及びＣｈａから選択される１個のアミノ酸残基であり、
　Ｘ６は、Ｅ、Ｎ、Ｒ、又はＤであり、
　Ｘ７は、Ｉ又はＶである。
　なお、Ｄａｂ、Ｔｌｅ及びＣｈａは、それぞれ２，４－ジアミノブタン酸、ｔｅｒｔ－ロイシン及びβ－シクロヘキシル－Ｌ－アラニンを意味する。また、Ａｃ及びｔ－Ｂｕは、それぞれアセチル基を有すること及びｔｅｒｔ－ブチル基を意味する。］
　式（Ｉ）において、結合のため、式（Ｉ）のＣ末端アミノ酸の末端（－ＣＯＯＨ）にアミノ基が結合して（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基となっていてもよい。また、式（Ｉ）において、Ｎ末端のアミノ基はアセチル化されていてもよい。この場合、Ｌｉｎｋｅｒ中のＮ末端近傍の適切な位置にＬｙｓ残基が導入されていてもよい。
　前記式（Ｉ）で表されるペプチドとして、好ましくは、以下のペプチドが挙げられる。
［１］Ｘ１ １－３が、（Ｓ、Ｇ、Ｆ、又はなし）－（Ｄ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｈｃｙ、又はなし）－（Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｎ、Ｅ、又はＲ）で表されるアミノ酸配列である。
［２］Ｘ１ １－３が、Ｄ、ＧＰＤ、Ｒ、ＧＰＲ、ＳＰＤ、ＧＤＤ、ＧＰＳ、ＳＤＤ、ＲＧＮ、Ｇ－Ｈｃｙ－Ｄ、ＲＧＰ、又はＧＰＤである。
［３］Ｘ１ １－３が、Ｄ又はＧＰＤである。
［４］Ｘ２が、Ａ、Ｓ、又はＴである。
［５］Ｘ２が、Ａ又はＴである。
［６］Ｘ２が、Ａである。
［７］Ｘ３が、Ｙ又はＷである。
［８］Ｘ３が、Ｙである。
［９］Ｘ４が、Ｈである。
［１０］Ｘ５が、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、２－アミノスベリン酸、Ｄｐｒ、Ｒ、Ｆ、２－アミノスベリン酸、Ｄｐｒ、ＡｃＯｒｎ、ＡｃＤａｂ、Ｄａｂ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ａｌａ（ｔ－Ｂｕ）、及びＣｈａから選択される１個のアミノ酸残基である。
［１１］Ｘ５が、Ｋ、Ｒ、ＡｃＯｒｎ、である。
［１２］Ｘ５が、Ｖ、Ｄａｂ、Ｆ、Ｒ、Ｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ａｌａ（ｔ－Ｂｕ）、及びＣｈａから選択される１個のアミノ酸残基である。
［１３］Ｘ５が、Ｆ、Ｒ、Ｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ａｌａ（ｔ－Ｂｕ）、及びＣｈａから選択される１個のアミノ酸残基である。
［１４］Ｘ５が、Ｌ、Ａｌａ（ｔ－Ｂｕ）、及びＣｈａから選択される１個のアミノ酸残基である。
［１５］Ｘ６が、Ｅ又はＮである。
［１６］Ｘ６が、Ｅである。
［１７］Ｘ７が、Ｖである。
［１８］Ｘ８ １－３が、（Ｓ、Ｔ、又はＤ）－（Ｈ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、Ｆ、Ｈｃｙ、又はなし）－（Ｙ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、又はなし）である。
［１９］Ｘ８ １－３が、Ｔ、ＴＦＨ、Ｓ、ＳＦＨ、ＴＨＨ、ＴＦＹ、ＴＹＨ、又はＴ－Ｈｃｙ－Ｈである。
［２０］Ｘ８ １－３が、Ｔ又はＴＦＨである。
　前記式（Ｉ）で表されるペプチドとしては、以上の条件の任意の１つ又は２以上の組み合わせであってもよく、例えば、以下に記載された条件を満たすペプチドであってもよい：［８］と［９］；［８］と［１７］；［９］と［１７］；［８］と［９］と［１７］；あるいはこれらと［１０］～［１４］のいずれか１つとの組み合わせである。
　より具体的には、以下のペプチドを挙げることができる（Ｘ５は上述と同じであり；Ｎ末端にＮＨ２－（Ｌｉｎｋｅｒ）－基を有していてもよく；Ｃ末端に－ＮＨ２基又は－（Ｌｉｎｋｅｒ）－ＮＨ２基を有していてもよい）：
１）ＤＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号１）
２）ＧＰＤＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号２）
３）ＲＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＳ（配列番号３）
４）ＧＰＲＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＳＦＨ（配列番号４）
５）ＳＰＤＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号５）
６）ＧＤＤＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号６）
７）ＧＰＳＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号７）
８）ＧＰＤＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＳＦＨ（配列番号８）
９）ＧＰＤＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴＨＨ（配列番号９）
１０）ＧＰＤＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴＦＹ（配列番号１０）
１１）ＳＰＤＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴＦＹ（配列番号１１）
１２）ＳＤＤＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴＦＹ（配列番号１２）
１３）ＲＧＮＣＡＹＨＸ５ＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号１３）
１４）Ｇ－Ｈｃｙ－ＤＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴ－Ｈｃｙ－Ｈ（配列番号１４）
１５）ＲＲＧＰＤＣＡＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１５）
１６）ＤＣＴＹＨＸ５ＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号１６）
１７）ＤＣＡＹＨＸ５ＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号１７）
１８）ＤＣＴＹＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号１８）
１９）ＤＣＡＷＨＸ５ＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号１９）
２０）ＤＣＴＹＴＸ５ＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号２０）
２１）ＤＣＡＹＴＸ５ＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号２１）
２２）ＤＣＳＹＴＸ５ＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号２２）
２３）ＤＣＴＷＴＸ５ＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号２３）
２４）ＤＣＴＹＨＸ５ＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号２４）
２５）ＤＣＴＹＲＸ５ＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号２５）
２６）ＤＣＴＹＳＸ５ＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号２６）
２７）ＤＣＴＹＴＸ５ＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号２７）
２８）ＤＣＴＹＴＸ５ＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号２８）
２９）ＤＣＴＹＴＸ５ＧＲＬＶＷＣＴ（配列番号２９）
３０）ＤＣＴＹＴＸ５ＧＤＬＶＷＣＴ（配列番号３０）
３１）ＤＣＴＹＴＸ５ＧＮＬＩＷＣＴ（配列番号３１）
３２）ＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号３２）
３３）ＧＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号３３）
３４）ＲＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＳ（配列番号３４）
３５）ＧＰＲＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＳＦＨ（配列番号３５）
３６）ＳＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号３６）
３７）ＧＤＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号３７）
３８）ＧＰＳＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号３８）
３９）ＧＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＳＦＨ（配列番号３９）
４０）ＧＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＨＨ（配列番号４０）
４１）ＧＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＹ（配列番号４１）
４２）ＳＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＹ（配列番号４２）
４３）ＳＤＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＹ（配列番号４３）
４４）ＤＣＴＹＨＲＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号４４）
４５）ＤＣＡＹＨＲＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号４５）
４６）ＤＣＴＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号４６）
４７）ＤＣＡＷＨＲＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号４７）
４８）ＤＣＴＹＴＮＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号４８）
４９）ＤＣＡＹＴＮＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号４９）
５０）ＤＣＳＹＴＮＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号５０）
５１）ＤＣＴＷＴＮＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号５１）
５２）ＤＣＴＹＨＮＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号５２）
５３）ＤＣＴＹＲＮＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号５３）
５４）ＤＣＴＹＳＮＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号５４）
５５）ＤＣＴＹＴＲＧＮＬＶＷＣＴ（配列番号５５）
５６）ＤＣＴＹＴＮＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号５６）
５７）ＤＣＴＹＴＮＧＲＬＶＷＣＴ（配列番号５７）
５８）ＤＣＴＹＴＮＧＤＬＶＷＣＴ（配列番号５８）
５９）ＤＣＴＹＴＮＧＮＬＩＷＣＴ（配列番号５９）
　リンカーと結合したペプチドの例として、以下の構造を有するペプチドが挙げられる。
６０）ＧＳＧＧＳ－ＧＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＨ－ＮＨ２（配列番号６０）
（ＰＥＧ）４－ＧＰＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴＦＨ－ＮＨ２（（ＰＥＧ）４－配列番号３３－ＮＨ２）
６１）ＧＳＧＧＳ－ＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴ－ＮＨ２（配列番号６１）
（ＰＥＧ）４－ＤＣＡＹＨＲＧＥＬＶＷＣＴ－ＮＨ２（（ＰＥＧ）４－配列番号３２－ＮＨ２）
　また、本実施の形態において「ペプチド」及び「ＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合することができるペプチド」は、官能基Ｚが結合したペプチドを含む。例えば、前記式（Ｉ）で表されるペプチドは、（Ｌｉｎｋｅｒ）の先に官能基Ｚが結合していてもよい。このようなペプチドとしては、以下のペプチドを挙げることができる。
６２）Ａｃｅｔｙｌ－Ｋ（Ｚ）－ＲＲＲＧＳ－ＧＰＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨ－ＮＨ２（配列番号６２）
６３）Ａｃｅｔｙｌ－Ｋ（Ｚ）－ＥＥＧＧＳ－ＧＰＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨ－ＮＨ２（配列番号６３）
６４）Ａｃｅｔｙｌ－Ｋ（Ｚ）－（ＰＥＧ）４－ＧＰＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨＮＨ２（Ａｃｅｔｙｌ－Ｋ（Ｚ）－（ＰＥＧ）４－配列番号６４－ＮＨ２）
　あるいは、以下のペプチドのＮ末端にマレイミド基、ＤＢＣＯ基、テトラジン基、ＴＣＯ基が結合し、かつ／又は、Ｃ末端にＮＨ２基が結合しているペプチドであってもよい。
ＲＲＲＧＳ－ＧＰＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号６５）
ＥＥＧＧＳ－ＧＰＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号６６）
（ＰＥＧ）４－ＧＰＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（（ＰＥＧ）４－配列番号６４）
　また、（Ｌｉｎｋｅｒ）の先に官能基Ｚが結合したペプチドとしては、以下のペプチドを挙げることができる。
６７）Ａｃｅｔｙｌ－Ｋ（Ｚ）ＲＲＲＧＳ－ＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴ－ＮＨ２（配列番号６７）
６８）Ａｃｅｔｙｌ－Ｋ（Ｚ）ＥＥＧＧＳ－ＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴ－ＮＨ２（配列番号６８）
６９）Ａｃｅｔｙｌ－Ｋ（Ｚ）－（ＰＥＧ）４－ＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴ－ＮＨ２（Ａｃｅｔｙｌ－Ｋ（Ｚ）－（ＰＥＧ）４－配列番号６９－ＮＨ２）
　あるいは、以下のペプチドのＮ末端にマレイミド基、ＤＢＣＯ基、テトラジン基、ＴＣＯ基が結合し、かつ／又は、Ｃ末端にＮＨ２基が結合しているペプチドであってもよい。
ＲＲＲＧＳ－ＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号７０）
ＥＥＧＧＳ－ＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号７１）
（ＰＥＧ）４－ＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴ（（ＰＥＧ）４－配列番号６９）
（ｉｉ）下記式（ＩＩ）で表されるペプチド、又は（ＩＩ）のアミノ酸配列において、Ｘ９～Ｘ１４以外の位置で１若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含むペプチド：
Ｘ９ １－２ＮＭＱＸ１０ＱＸ１４ＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＸ１１ＩＸ１２
ＳＩＲＤＤＸ１３－（Ｌｉｎｋｅｒ２）－ＣＯＮＨ２・・・（ＩＩ）
［式（ＩＩ）において、（Ｌｉｎｋｅｒ２）は、（ＧＳＧＧＳ）１－３、（ＳＧＳＧＳ）１－３、若しくは（ＰＥＧ）２－１０－Ｌｙｓ（好ましくは、（ＰＥＧ）４－Ｌｙｓ）、ＳＧＳＧＳＫ、ＳＲＲＣＲ、ＳＲＲＫ（Ｚ）Ｒ、ＳＲＲＣＲＲＣＲＲＣ、ＳＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）、若しくは（ＰＥＧ）１－８－Ｌｙｓ（好ましくは、（ＰＥＧ）４－Ｌｙｓ）であるか、又は存在せず、
　Ｘ９ １－２は、ＧＦ、ＡＦ、ＶＦ、ＬＦ、ＩＦ、ＭＦ、ＰＦ、ＦＦ、ＷＦ、ＫＦ、Ｏｒｎ－Ｆ、ＣＦ、ＤＦ、ＥＦ、ｂｅｔａアラニン－Ｆ、２－アミノスベリン酸－Ｆ、Ｄｐｒ－Ｆ、ＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－ＣＯ（ここで、ｎ＝１－５０）－Ｆ、Ｆ、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、２－アミノスベリン酸、Ｄｐｒ、及びＡｃｅｔｙｌ－Ｋからなる群から選択され、
　Ｘ１０は、Ｃ又はＱであり、
　Ｘ１１及びＸ１２は、それぞれ独立に、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、及びＣからなる群から選択され、
　Ｘ１３は、Ｃ又はＰであるか、存在せず
　Ｘ１４は、Ｒ、Ｃ、Ｋ、又はＫ（Ｚ）である］。
　式（ＩＩ）のＮ末端アミノ酸の末端（－ＮＨ２）はアセチル化されて（ＣＨ３－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）基となっていてもよい。また、リンカーに含まれるＣｙｓ残基（Ｃ）は、必要に応じて、マレイミド基を介して他の機能性分子が結合していてもよい。
　前記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドとして、好ましくは、以下のペプチドが挙げられる。
［２１］Ｘ９が、ＧＦ、ＡＦ、βＡｌａＦ、ＮＨ２－（ＰＥＧ）ｎ－ＣＯ（ｎ＝２－１０）－Ｆ、Ｆ、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｃ、Ｄｐｒ、及びＡｃｅｔｙｌ－Ｋからなる群から選択される。
［２２］Ｘ９が、ＧＦ、Ｆ、Ｋ、及びＡｃｅｔｙｌ－Ｋからなる群から選択される。
［２３］Ｘ１０が、Ｑである。
［２４］Ｘ１１及びＸ１２が、それぞれ独立して、Ｒ、Ｈ、及びＥからなる群から選択される。
［２５］Ｘ１１が、Ｒである。
［２６］Ｘ１２が、Ｒ又はＫ（Ｚ）である（好ましくは、Ｚがアジドである）。
　前記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドとして、より具体的には、以下のペプチドを挙げることができる（ただし、含まれるリシン残基は必要に応じて官能基が結合していてもよい）：
７２）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号７２）
７３）ＧＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号７３）
７４）ＫＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号７４）
７５）ＧＦＮＭＱＣＱＫＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号７５）
７６）ＫＮＭＱＣＱＫＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号７６）
７７）ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤ（配列番号７７）
７８）ＧＫＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号７８）
７９）Ａｃｅｔｙｌ－ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＰ－ＳＧＳＧＳＫ－ＮＨ２（配列番号７９）
８０）Ａｃｅｔｙｌ－ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－ＳＧＳＧＳＫ－ＮＨ２（配列番号８０）
８１）Ａｃｅｔｙｌ－ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＰ－（ＰＥＧ）４－Ｌｙｓ－ＮＨ２（配列番号８１）
７２－２）Ａｃｅｔｙｌ－ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－（ＰＥＧ）４－Ｌｙｓ－ＮＨ２（Ａｃｅｔｙｌ－配列番号７２－（ＰＥＧ）４－Ｌｙｓ－ＮＨ２）
８２）ＦＮＭＱＱＱＣＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤ－ＮＨ２（配列番号８２）
８３）ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－ＮＨ２（配列番号８３）
８４）ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＰ－ＳＲＲＫ（Ｚ）Ｒ－ＮＨ２（配列番号８４）
８５）ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＰ－ＳＲＲＣＲ－ＮＨ２（配列番号８５）
８６）ＦＮＭＱＱＱＣＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＣＳＩＲＤＤＰ－ＳＲＲＣＲＲＣＲＲＣ－ＮＨ２（配列番号８６）、
８７）ＦＮＭＱＱＱＫ（Ｚ）ＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＫ（Ｚ）ＳＩＲＤＤＰ－ＳＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）－ＮＨ２（配列番号８７）
８８）Ａｃｅｔｙｌ－ＫＮＭＱＱＱＣＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤ－ＮＨ２（配列番号８８）
８９）Ａｃｅｔｙｌ－ＫＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－ＮＨ２（配列番号８９）
９０）Ａｃｅｔｙｌ－ＫＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＰ－ＳＲＲＫ（Ｚ）Ｒ－ＮＨ２（配列番号９０）
９１）Ａｃｅｔｙｌ－ＫＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＰ－ＳＲＲＣＲ－ＮＨ２（配列番号９１）
９２）Ａｃｅｔｙｌ－ＫＮＭＱＱＱＣＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＣＳＩＲＤＤＰ－ＳＲＲＣＲＲＣＲＲＣ－ＮＨ２（配列番号９２）
９３）Ａｃｅｔｙｌ－ＫＮＭＱＱＱＫ（Ｚ）ＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＫ（Ｚ）ＳＩＲＤＤＰ－ＳＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）－ＮＨ２（配列番号９３）
９４）ＧＦＮＭＱＱＱＣＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤ－ＮＨ２（配列番号９４）
９５）ＧＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－ＮＨ２（配列番号９５）
９６）ＧＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＰ－ＳＲＲＫ（Ｚ）Ｒ－ＮＨ２（配列番号９６）
９７）ＧＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＰ－ＳＲＲＣＲ－ＮＨ２（配列番号９７）
９８）ＧＦＮＭＱＱＱＣＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＣＳＩＲＤＤＰ－ＳＲＲＣＲＲＣＲＲＣ－ＮＨ２（配列番号９８）
９９）ＧＦＮＭＱＱＱＫ（Ｚ）ＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＫ（Ｚ）ＳＩＲＤＤＰ－ＳＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）－ＮＨ２（配列番号９９）
１００）ＦＮＭＱＣＱＺＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－ＮＨ２（配列番号１００）
１０１）Ａｃｅｔｙｌ－ＫＮＭＱＣＱＺＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－ＮＨ２（配列番号１０１）
１０２）ＧＦＮＭＱＣＱＫ（Ｚ）ＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－ＳＲＲＫ（Ｚ）Ｒ－ＮＨ２（配列番号１０２）
１０３）ＦＮＭＱＣＱＫ（Ｚ）ＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－ＮＨ２（配列番号１０３）
１０４）Ａｃｅｔｙｌ－ＫＮＭＱＣＱＫ（Ｚ）ＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－ＳＲＲＫ（Ｚ）Ｒ－ＮＨ２（配列番号１０４）
１０５）ＧＦＮＭＱＣＱＫ（Ｚ）ＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－ＳＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）－ＮＨ２（配列番号１０５）
１０６）Ａｃｅｔｙｌ－ＫＮＭＱＣＱＫ（Ｚ）ＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－ＳＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）－ＮＨ２（配列番号１０６）
１０７）ＧＦＮＭＱＣＱＫ（Ｚ）ＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ－ＳＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）ＲＲＫ（Ｚ）－ＮＨ２（配列番号１０７）
（ｉｉｉ）以下のペプチド：
１０８）ＣＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ（配列番号１０８）
１０９）ＤＣＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号１０９）
１１０）ＤＣＡＷＨＬＧＥＬＶＦＣＴ（配列番号１１０）
１１１）ＤＣＡＷＨＬＧＥＬＶＸ１５ＣＴ（配列番号１１１）
　Ｘ１５＝１－ｎａｐｈｔｏｙｌ、２－ｎａｐｈｔｏｙｌ、ｂｅｎｚｙｌ、又はｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ
１１２）ＣＤＣＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣＴＣ（配列番号１１２）
１１３）ＣＡＹＨＬＧＥＬＶＷＣ（配列番号１１３）
１１４）ＤＣＡＹＨＬＧＥＬＶＷＣＴＦ（２－Ｐｙａ）（配列番号１１４）
１１５）Ａｃｅｔｙｌ－（Ｌｙｓ［Ａｚｉｄｅ］）ＲＲＲＧＳＧＰＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨ－ＣＯＮＨ２）（配列番号１１５）
　前記ペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端（好ましくは、Ｎ末端）に、必要に応じてリンカーを介して、反応性官能基（好ましくはアジド基）が結合していてもよい。例えば、ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に更にグルタミン酸が１～３個（好ましくは、２個）結合したペプチドの末端に反応性官能基（例えばアジド基）を有してもよい。アジド基を有するペプチドは、Ｄｉｂｅｎｚｙｌｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ（ＤＢＣＯ）、アルキン、ＴＣＯを有する他の機能性分子とクリック反応することによって、当該他の機能性分子をペプチドに連結することができる。また、ペプチドと他の機能性物質の結合は、その他の当業者に公知の方法、例えばマレイミド基とスルフヒドリル基の反応等により行うこともできる。
　タンパク質又はペプチドは、分子内が架橋されていてもよい。タンパク質又はペプチドは、例えば、分子内又は分子間に１個以上（例えば、１～１０個、２～８個、４～６個、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）の架橋構造を有していてもよい。架橋は、チオール結合であってもよいし、例えば、ＳＨ基同士が以下の構造を介して結合した構造であってもよい。
［式中、式中、Ａは水素原子、フェニル基又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１～６アルキル基、フェニル基、Ｃ１～６アルキル基である］
　例えば、該タンパク質は、５００Ｄａ以上、１０００Ｄａ以上、２０００Ｄａ以上、かつ／又は、５００，０００Ｄａ以下、２００，０００Ｄａ以下、１００，０００Ｄａ以下のタンパク質であってもよい。例えば、このようなタンパク質として、酵素、糖タンパク質（エリスロポエチンなど）、サイトカイン、トキシン、アジュバント、構造タンパク質、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、抗体断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ３、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、（タンデム）バイスペシフィック一本鎖Ｆｖ（ｓｃ（Ｆｖ）２）、一本鎖トリプルボディ、ナノボディ、ダイバレントＶＨＨ、ペンタバレントＶＨＨ、ミニボディ、（二本鎖）ダイアボディ、タンデムダイアボディ、バイスペシフィックトリボディ、バイスペシフィックバイボディ、デュアルアフィニティリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、トリアボディ（又はトリボディ）、テトラボディ（又は［ｓｃ（Ｆｖ）２］２）、若しくは（ｓｃＦｖ－ＳＡ）４）ジスルフィド結合Ｆｖ、コンパクトＩｇＧ、重鎖抗体、又はそれらの重合体など）であってもよい。また、例えば、ペプチドは、５～５０００アミノ酸、５～１０００アミノ酸、５～５００アミノ酸、５～１００アミノ酸、５～５０アミノ酸、又は１０～４０アミノ酸のペプチドであってもよい。また、ペプチドは、環状又は線状のいずれであってもよい。このようなペプチドとしては、ワクチン、マイクロ抗体、抗菌性ペプチドなどが挙げられる。
　本実施の形態において、Ｘｍ（ｍは整数）はアミノ酸を表す。「Ｘｍ ｎ」は、ｎ個のアミノ酸Ｘｍが結合していることを表し、ｎが記載されていない「Ｘｍ」はアミノ酸Ｘｍが１個存在することを表す。ここで、ｎが２以上の場合、複数のＸｍはそれぞれ独立して同一又は異なるアミノ酸であってよい。また、ｎが「ｐ－ｑ」である場合、アミノ酸Ｘｍがｐ～ｑ個存在することを表す。また、本実施の形態に記載されたアミノ酸配列において、Ａはアラニン残基であり、Ｒはアルギニン残基であり、Ｎはアスパラギン残基であり、Ｄはアスパラギン酸残基であり、Ｃはシステイン残基であり、Ｑはグルタミン残基であり、Ｅはグルタミン酸残基であり、Ｇはグリシン残基であり、Ｈはヒスチジン残基であり、Ｉはイソロイシン残基であり、Ｌはロイシン残基であり、Ｋはリシン残基であり、Ｍはメチオニン残基であり、Ｆはフェニルアラニン残基であり、Ｐはプロリン残基であり、Ｓはセリン残基であり、Ｔはトレオニン残基であり、Ｗはトリプトファン残基であり、Ｙはチロシン残基であり、Ｖはバリン残基である。また、Ｈｃｙはホモシステインであり、Ｄｐｒはジアミノプロピオン酸であり、Ｏｒｎはオルニチン残基であり、βＡｌａはβアラニン残基であり、Ｄａｂは２、４－ジアミノ酪酸残基であり、Ｎｌｅはノルロイシン残基であり、Ｎｖａはノルバリン残基であり、Ｔｌｅはｔｅｒｔ－ロイシン残基であり、Ａｌａ（ｔ－Ｂｕ）はｔｅｒｔ－ブチルアラニン残基であり、かつ、Ｃｈａはシクロヘキシルアラニン残基である。また、側鎖にアミノ基を有する残基（リシン残基、オルニチン残基、２、４－ジアミノ酪酸残基）中のアミノ基は、必要に応じてアセチル化されていてもよい。本実施の形態において天然及び人工アミノ酸のアセチル化形態は、上述のアミノ酸標記にＡｃの接頭語を伴って記載されることもあるが、特にそのように解することが不整合である場合を除き、Ａｃと記載されていなくてもアセチル化形態を含みうると解される。本実施の形態において、Ｋ（Ｚ）は、官能基結合リシン残基を意味する、好ましくは、Ｋ（Ｚ）はＫ（Ａｚｉｄｅ）である。Ｋ（Ａｚｉｄｅ）はアジド結合リシン残基を表す。
　架橋試薬と結合するタンパク質又はペプチド中のアミノ基としては、前記タンパク質又はペプチド内に存在する、リシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、２－アミノスベリン酸、ジアミノプロピオン酸、若しくはアルギニン残基が有するアミノ基、１位のアミノ酸のアミノ基、又はカルボニル基末端に導入されたアミノ基であってもよく、好ましくは、リシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、２－アミノスベリン酸、ジアミノプロピオン酸、若しくはアルギニン残基が有するアミノ基、又は１位のアミノ酸のアミノ基である。
　架橋試薬としては、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＡ）、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＰ）、スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＳ）、３，３’－ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＴＢＰ）、及びジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）（ＤＳＰ）を挙げることができる。
　本実施の形態全体にわたって、「反応性官能基」又は「Ｚ」で表される基は、比較的穏やかな条件下で、ペプチド、タンパク質、核酸、又は低分子医薬などと反応して結合することができる基を意味する。反応性官能基としては、マレイミド、チオールもしくは保護チオール、アルコール、アクリラート、アクリルアミド、アミンもしくは保護アミン、カルボン酸もしくは保護カルボン酸、アジド、シクロアルキンを含むアルキン、シクロペンタジエン及びフランを含む１、３－ジエン、アルファ－ハロカルボニル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル、ニトロフェニルエステル、カルボナート、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、テトラジン、メチルテトラジン（ＭＴＺ）、トランスシクロオクテン（ＴＣＯ）、アジド、カルボキシ、トシル、アミノ、エポキシ、アシル、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、酸塩化物、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、酸無水物、ハロアセチル、アルキルハロゲン化物、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、カルボニル、ケトン、カルボジイミド、エポキシド、オキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート、クロロギ酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ハロゲン化アルキル、イソシアネート、ヒドラジン、シッフ塩基、還元的アミノ化生成物、マンニッヒ縮合生成物、ジアゾニウム誘導体、マンニッヒ縮合生成物、ヨウ素化反応生成物、アリールアジド、ハロゲン化アリールアジド、ベンゾフォノン、ジアゾ化合物、及びジアジリン誘導体などを挙げることができる。
　本実施の形態に係る方法は、タンパク質又はペプチド内のアミノ基と架橋試薬とを結合させた後に、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製することを含んでいてもよい。サイズ排除クロマトグラフィーの担体としては、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、Ｂｉｏｇｅｌ、セルロファイン、トヨパール、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０等の有機溶剤が使用可能な樹脂であって、オープンカラム、低圧、高圧クロマトグラフィーに使用可能な樹脂を使用することができる。担体のポアサイズとしては、好ましくは、３０～２０００Å、より好ましくは１００～３００Åとすることができる。また、担体の粒子径としては、好ましくは、５～５００μｍ、より好ましくは２０～１２０μｍとすることができる。カラムサイズは、オープンカラムでは、好ましくは、１０～１０００ｍＬ、それ以上のゲル体積を持つカラムであり、パックドカラムでは、好ましくは、３～１００ｍＬ、それ以上のゲル体積を持つカラムである。
　サイズ排除クロマトグラフィーの溶出条件としては、好ましくは、４℃から室温にて、溶出液としては、０．０１～１％ＴＦＡ、ＨＣｌ等の揮発性強酸、もしくは、１～３０％ギ酸、酢酸等の揮発性弱酸の水溶液を用いることができる。また、０．０１～１％ＴＦＡ、ＨＣｌ等の揮発性強酸を含む、１～１００％の揮発性・水和性の有機溶媒（ＣＨ３ＣＮ、ＭｅｔＯＨ、ＥｔＯＨ、プロパノール、アセトン等）／水の混合液を用いることも可能である。
　本発明の第２の実施形態は、以下の技術思想を包含するものである。
［１］ピリジンよりも強い塩基性度を有する塩基の存在下で、タンパク質又はペプチドと前記架橋試薬とを反応させて、前記タンパク質又はペプチド内のアミノ基と架橋試薬とを結合させることを含む、抗体標識試薬の製造方法。
［２］前記塩基のｐＫａが５．２より大きい、［１］に記載の抗体標識試薬の製造方法。
［３］前記塩基のｐＫａが１４以下である、［２］に記載の抗体標識試薬の製造方法。
［４］前記塩基が、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ジエチルアミン、又はモノメチルアミンである、［１］に記載の抗体標識試薬の製造方法。
［５］前記塩基が、トリエチルアミンである、［１］に記載の抗体標識試薬の製造方法。
［６］前記塩基の濃度が、０.０１～５％である、［１］～［５］のいずれかに記載の抗体標識試薬の製造方法。
［７］前記タンパク質又はペプチドが、ＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合することができるペプチドである、［１］～［６］のいずれかに記載の抗体標識試薬の製造方法。
［８］ＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合することができる前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１～１１５のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列である、［７］に記載の抗体標識試薬の製造方法。
［９］アミノ基が、前記タンパク質又はペプチド内に存在する、リシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、２－アミノスベリン酸、ジアミノプロピオン酸、若しくはアルギニン残基が有するアミノ基、１位のアミノ酸のアミノ基、又はカルボニル基末端に導入されたアミノ基である、［１］～［８］のいずれかに記載の抗体標識試薬の製造方法。
［１０］前記架橋試薬が、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＡ）、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＰ）、スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＳ）、３，３’－ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＴＢＰ）、及びジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）（ＤＳＰ）からなる群から選択される、［１］～［９］のいずれかに記載の抗体標識試薬の製造方法。
［１１］サイズ排除クロマトグラフィーにより精製することを更に含む、［１］～［１０］のいずれかに記載の抗体標識試薬の製造方法。
　以下に実施例等を用いて本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
　本実施例で使用する用語及び略号並びに定義を表１に示す。
　ＩｇＧＢＰとしては、ＧＰＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１３４、分子内の２つのＣｙｓはＳＳ結合を形成、Ｃ末端はアミド化）を用いた。
　ＭＰＡ００２は、ＷＯ２０１７／２１７３４７パンフレットに記載の方法に従って製造された以下に示す構造であり、ＩｇＧＢＰのＮ末端にジグリコール酸及び８つのエチレングリコール基を有するリンカー構造を介して、エチルアジドが結合したものである。
　３ａｒｍＤＯＴＡペプチドは、以下に示す構造であり、ＷＯ２０１７／２１７３４７パンフレットに記載の方法に従って製造した。
試験例１－１：Ｎ末端がキレート剤で修飾されたＩｇＧ結合ペプチドを用いた抗体修飾リンカーの作製と評価
（比較例１－１）
　３ａｒｍＤＯＴＡペプチド（約１ｍｇ）をＤＭＳＯ（１３μＬ）に溶解して約３０ｍｍｏｌ／Ｌのペプチド溶液とした。このペプチド溶液に、アセトニトリルに溶解した約３００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＳＧ　１３μＬ（３ａｒｍＤＯＴＡペプチドに対して１０当量）と、最終濃度が約０．５％となるようピリジン０．２μＬ（３ａｒｍＤＯＴＡペプチドに対して５当量）を加え、５０℃で６時間反応させた。
　反応終了後の溶液１μＬを０．１％ギ酸／ＤＭＳＯ溶液（９９μＬ）で希釈し、表２に記載の試験条件にて分析した。
　未反応体の３ａｒｍＤＯＴＡペプチド（ＩｇＧ結合ペプチド）、加水分解体及びスクシンイミジルグルタレート化した３ａｒｍＤＯＴＡペプチド（抗体修飾リンカー）の量を面積百分率（単位：％）として算出した。結果を表３に示す。
　精製では除去しにくい加水分解体が多く生成することがわかった。
（実施例１－１）３ａｒｍＤＯＴＡペプチドを用いた抗体修飾リンカーの製造
　３ａｒｍＤＯＴＡペプチド（約１ｍｇ）をＤＭＳＯ（１３μＬ）に溶解して約３０ｍｍｏｌ／Ｌのペプチド溶液とした。このペプチド溶液に、アセトニトリルに溶解した３００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＳＧ　１３．３μＬ（３ａｒｍＤＯＴＡペプチドに対して１０当量）と、０．２１μＬのＮＭＭ（３ａｒｍＤＯＴＡペプチドに対して５当量）を加え、－２０℃で１時間反応させた。同様に、２０℃で１時間、又は２０℃で１．３時間、５℃で３時間、又は－１０℃で３時間反応させた試料も用意した。
　反応終了後の各溶液１μＬをＤＭＳＯ（４９μＬ）で希釈し、表２に記載の試験条件にて分析した。
　未反応体の３ａｒｍＤＯＴＡペプチド（ＩｇＧ結合ペプチド）、加水分解体及びスクシンイミジルグルタレート化した３ａｒｍＤＯＴＡペプチド（抗体修飾リンカー）の量を面積百分率（単位：％）として算出した。結果を表４に示す。
　いずれも目的とする抗体修飾リンカーの生成量を低減させることなく、加水分解体量を低減した。比較例１－１で塩基として用いたピリジンは、塩基としては弱い化合物（ｐＫａ：５．２５）に分類される。一方、実施例１－１で塩基として使用したＮＭＭはｐＫａが７．３８でピリジンより塩基性が高い。上記結果より、収量を従来と同程度に維持しつつ、加水分解体の含有量を低減させるためには、ピリジンよりも強い塩基性を有する塩基を使用することが考えられ、さらに当該反応は、室温以下の反応温度で十分に進行することがわかった。
試験例１－２：Ｎ末端がアジドで修飾されたＩｇＧ結合ペプチドを用いた抗体修飾リンカーの作製と評価
（比較例１－２）
　ＭＰＡ００２（約１ｍｇ）をＤＭＳＯ（２０μＬ）に溶解して約１９ｍｍｏｌ／Ｌのペプチド溶液とした。このペプチド溶液に、ＤＳＧのアセトニトリル溶液（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）２０μＬを加えた後、最終濃度が０．５％となるようピリジン０．２７μＬ（ＭＰＡ００２に対して６．５当量）を加え、５０℃で３時間反応させた。
　反応終了後の溶液１μＬをＤＭＳＯ（４９μＬ）で希釈し、以下の試験条件にて分析した。
　未反応体のＭＰＡ００２（ＩｇＧ結合ペプチド）、加水分解体及びスクシンイミジルグルタレート化したＭＰＡ００２（ＭＰＡ００３、抗体修飾リンカー）の量を面積百分率（単位：％）として算出した。結果を表６に示す。
（実施例１－２～３）ＭＰＡ００２を用いた反応温度及び／又は塩基当量の検討
　ＭＰＡ００２（約１ｍｇ）をＤＭＳＯ（２０μＬ）に溶解し約１９ｍｍｏｌ／Ｌのペプチド溶液とした。このペプチド溶液に、ＤＳＧのアセトニトリル溶液（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）２０μＬを加えた後、ＮＭＭを０．１３μＬ（ＭＰＡ００２に対して３当量）、０．２１μＬ（ＭＰＡ００２に対して５当量）又は０．４２μＬ（ＭＰＡ００２に対して１０当量）加え、１０℃、０℃、－１０℃、－２０℃又は－３０℃で１、２、３時間反応させた。
　反応終了後の溶液１μＬをＤＭＳＯ（４９μＬ）で希釈し、表５に記載の試験条件にて分析した。
　未反応体のＭＰＡ００２（ＩｇＧ結合ペプチド）、加水分解体及びスクシンイミジルグルタレート化したＭＰＡ００２（ＭＰＡ００３、抗体修飾リンカー）の量を面積百分率（単位：％）として算出した。反応温度を検討した結果を表７に、塩基当量を検討した結果を表８に示す。
　いずれの結果も、表６に記載の比較例１－２に比べて加水分解体の生成量が少なかった。
　また、ＮＭＭ０．２７μＬ（ＭＰＡ００２に対して６．５当量）を加え、３０℃で１、２又は３時間反応させたところ、各成分の面積百分率（％）は、いずれも加水分解体が表７及び表８の結果よりも多く、抗体修飾リンカーは表７及び表８の結果よりも少なかった。
（実施例１－４）スケールアップの検討
　本発明の第１の実施形態に係る方法が、反応スケールを上げても適用できるかを検討した。
　ＭＰＡ００２（約２０ｍｇ）をＤＭＳＯ（４００μＬ）に溶解して、約１９ｍｍｏｌ／Ｌのペプチド溶液とした。このペプチド溶液に、ＤＳＧのアセトニトリル溶液（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）４００μＬ（ＭＰＡ００２に対して２６当量）を加えた後、ＮＭＭ２．５１μＬ（ＭＰＡ００２に対して３当量）を加え、０℃で１又は２時間反応させた。
　一方、ＭＰＡ００２（約１ｍｇ）をＤＭＳＯ（２０μＬ）に溶解し約１９ｍｍｏｌ／Ｌのペプチド溶液とした。このペプチド溶液に、ＤＳＧのアセトニトリル溶液（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）２０μＬを加えた後、ＮＭＭ０．１３μＬ（ＭＰＡ００２に対して３当量）を加え、０℃で１又は２時間反応させた。
　反応終了後の各溶液１μＬをＤＭＳＯ（４９μＬ）で希釈し、表５に記載の条件にて分析した。
　未反応体のＭＰＡ００２（ＩｇＧ結合ペプチド）、加水分解体及びスクシンイミジルグルタレート化したＭＰＡ００２（ＭＰＡ００３、抗体修飾リンカー）の量を面積百分率（単位：％）として算出した。結果を表９に示す。
　いずれも良好な結果を示し、反応スケールをあげても本発明の第１の実施形態に係る方法が適用可能であることが示された。
（実施例１－５）塩基種類の検討
　上記実施例で示されるように、本発明者らは、ピリジンよりも強い塩基であるＮＭＭを使用し、反応温度を下げることが、優良な条件であることを見出した。そこで、ＮＭＭより強い塩基である、ＴＥＡ（ｐＫａ：１０．７５）を使用し、さらに反応温度を下げて反応を実施した。
　ＭＰＡ００２（約１ｍｇ）をＤＭＳＯ（２０μＬ）に溶解して約１９ｍｍｏｌ／Ｌのペプチド溶液とした。このペプチド溶液に、ＤＳＧのアセトニトリル溶液（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）２０μＬ（ＭＰＡ００２に対して２６当量）を加えた後、ＴＥＡ０．１６μＬ（ＭＰＡ００２に対して３当量）を加え、－２０℃で２又は３時間反応させた。
　反応終了後の各溶液１μＬをＤＭＳＯ（４９μＬ）で希釈し、表５に記載の条件にて分析した。
　未反応体のＭＰＡ００２（ＩｇＧ結合ペプチド）、加水分解体及びスクシンイミジルグルタレート化したＭＰＡ００２（ＭＰＡ００３、抗体修飾リンカー）の量を面積百分率（単位：％）として算出した。結果を表１０に示す。塩基としてＮＭＭを使用した場合の結果として、反応温度－２０℃、反応時間１２０分及び１８０分のデータ（実施例１－２の表７）を併記した。
　いずれも加水分解体の量が低減され、且つ、目的物である抗体修飾リンカーが十分な量合成できることが確認された。
　以上の結果より、抗体修飾リンカーを製造するにあたり、ピリジンより塩基性の強い塩基を用い、
（１）より高い反応温度では、より少ない塩基当量とし、より短い反応時間、
（２）より低い反応温度では、より多い塩基当量とし、より長い反応時間
で架橋剤との結合を実施することが好ましいことがわかった。
（実施例２）
（実施例２－１）ＩｇＧ結合ペプチドＣＣＡＰ試薬の調製
　ＩｇＧ－ＢＰのＤＳＧによる改良法での修飾のスキームを、図１に示す。ＩｇＧ－ＢＰ（ＩｇＧＢＰ－Ｎ３－ＲＲＲ：Ａｃｅｔｙｌ－（Ｌｙｓ［Ａｚｉｄｅ］）ＲＲＲＧＳＧＰＤＣＡＹＨＫＧＥＬＶＷＣＴＦＨ－ＣＯＮＨ２）（配列番号１１５）を、その２０倍のモル濃度のＤＳＧと、１％のトリエチルアミンを含有するＤＭＳＯ中、室温で１５分間反応させた。ＤＳＧ添加前と、及び添加１５分後のサンプルを以下の条件でＵＰＬＣ分析行った。
　すなわち、ＡＣＱＵＩＴＹ　ＳＱＤを連結したＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）に接続したＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）に、１ｎｍｏｌのサンプルをインジェクションし、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎにて、０．１％ギ酸を含む１０％から４０％へのアセトニトリルのグラジエントにて溶出した。カラム温度は３５℃とした。また、溶出は２８０ｎｍの吸光度測定にてモニターした。
　反応開始前及び開始１５分後のＵＰＬＣ分析のクロマトグラムを、それぞれ、図２Ａ及び図２Ｂに示す。１５分後のＵＰＬＣパターン（図２Ｂ）では、反応前に存在していたＩｇＧ－ＢＰ（溶出時間１１．１３分）のピークが消失し、新たに溶出時間１２．１０分のピークが得られた。このピークは質量分析の結果、２９７８．３４の質量値が得られ、ＩｇＧ－ＢＰがＳＧ化された目的のＣＣＡＰ試薬（理論値ＭＷ：２９７８．３６）と一致したことから、ＩｇＧ－ＢＰがＳＧ化されていることが分かった。このように、極めて迅速なＳＧ化は、従来のピリジン／ＤＭＳＯを使った系では見られなかった。また、１１．６１分にＳＧ化の加水分解物、１２．６０分にＳＧ化されたＣＣＡＰ試薬のＳＳ還元体が少量見られるものの、他に大きな副反応物のピークも認められないことから、短時間での反応により副反応も避けられたと考えられる。
（実施例２－２）ＩｇＧ結合ペプチドＣＣＡＰ試薬の精製
　過剰なＤＳＧを反応液から除くため、０．１％ＴＦＡで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－１０カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーを行った。すなわち、ＮＧＣクロマトグラフ（ＢｉｏＲａｄ）に接続したＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－１０カラム（２５×６００ｍｍ）に、０．１％ＴＦＡで５倍に希釈した反応物（約０．８ｍＬ）を、流速２．０ｍＬ／ｍｉｎにて、インジェクトし、溶出物を分画回収した。溶出は、２２０と２８０ｎｍの吸光度測定によりモニターした。
　得られた素通り分画から回収されたペプチドの純度を、逆相ＵＰＬＣでチェックした。上述と同様にＡＣＱＵＩＴＹ　ＳＱＤを連結したＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）に接続したＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｃ１８カラムにて分析を行った。
　サイズ排除クロマトグラフィーの結果を図３Ａに示す。ＳＧ化されたＩｇＧ－ＢＰは素通り分画に回収され、ＤＳＧは遅れて溶出されたことから、両者はきれいに分離できることが分かった。素通り分画から回収されたペプチドの純度を、逆相ＵＰＬＣでチェックした結果を図３Ｂに示す。目的のＳＧ化ＩｇＧ－ＢＰ（酸化型）以外に、ＳＧ化ＩｇＧ－ＢＰ（酸化型）の加水分解物とＳＧ化ＩｇＧ－ＢＰ（還元型）が見られたものの、純度としては、７８％程度の試薬が得られ、実際にＩｇＧとの反応を行ったところ反応性もまったく問題がないことが分かった。不純物として特定したＳＧ化ＩｇＧ－ＢＰ（還元型）については、原料の段階から含まれていたものであり（図２Ａの１１．６５分のピーク）、今後は高純度の原料（ＩｇＧ－ＢＰ酸化型）の使用により、高純度でＣＣＡＰ試薬の合成が可能と考えている。また、詳細なデータを示していないが、従来法のＳＧ化反応によるＩｇＧ－ＢＰのＣＣＡＰ試薬の収率は、原料ペプチドから計算すると約５０％程度であったのに対し、改良法では約６５％程度にまで上昇した。
（実施例２－３）Ｚ３３ペプチドＣＣＡＰ試薬の調製
　図４に示したように、Ｚ３３をベースにしたＣＣＡＰ試薬も、改良法で調製した。Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅのペプチドを以下の条件の逆相ＵＰＬＣにかけた。すなわち、ＡＣＱＵＩＴＹ　ＳＱＤを連結したＵＰＬＣ　（Ｗａｔｅｒｓ）に接続したＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）に、サンプルをインジェクションし、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎにて、０．１％ギ酸を含む１０％から４０％へのアセトニトリルのグラジエントにて溶出した。カラム温度は３５℃にて、また、溶出は、２８０ｎｍの吸光度測定にてモニターした。
　図５Ａに示すように、Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅは、１１．４３分に見られるピークであることが、質量分析から判明した。このペプチドを図１のＩｇＧ－ＢＰと同条件（室温、１５分）でＤＳＧと反応後、ＵＰＬＣにかけた。原料は消失し、１２．１９分に新たなピークとして、目的のＳＧ化Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅの生成が確認された（図５Ａ）。この反応物を０．１％ＴＦＡで５倍に希釈した後（約０．４ｍＬ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－１０のカラムにアプライし（図６Ａ）、素通り分画をＣＣＡＰ試薬として回収した。得られたＣＣＡＰ試薬の純度を逆相ＵＰＬＣにて解析した。
　結果を図６Ｂに示す。クロマトグラムから、目的のＳＧ化Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅの純度は８９％であることが分かった。また、従来法のＳＧ化反応によるＺ３３のＣＣＡＰ試薬の収率は、原料のペプチドから計算すると約３０％程度であったのに対し、改良法では約５０％程度にまで上昇した。
（実施例２－４）ＩｇＧＢＰ－Ｎ３－ＲＲＲを用いた反応時間及び塩基当量の検討
　ＩｇＧＢＰ－Ｎ３－ＲＲＲをＤＭＳＯ（２５μｌ）に溶解し約１４ｍＭのペプチド溶液とした。このペプチド溶液に１Ｍ　ＤＳＧのＤＭＳＯ溶液１０μＬ（最終濃度約２８０ｍＭ）を加えた後、ＴＥＡを０．２１μＬ（ペプチドに対して３当量）、０．３５μＬ（ペプチドに対して５当量）、０．４６μＬ（ペプチドに対して６．５当量）又は０．６１μＬ（ペプチドに対して８．７６当量）加え、それぞれ室温で１５分、１時間又は３時間反応させた。
　反応終了後の各溶液２μＬを１０％ギ酸（１８μＬ）で希釈し、実施例２－１と同様にして分析した。
　ペプチドに対して３当量、５当量、６．５当量又は８．７６当量でＴＥＡを１５分間、１時間、又は３時間反応させた場合のいずれも目的のＳＧ化ＩｇＧ－ＢＰ（酸化型）が高収率で得られた。
　反応時間が長くなるのに伴い加水分解物の量が増加する傾向にあったので、本願発明において短時間での反応でより優れた効果を発揮する。
　また、ＴＥＡの当量数の増加に伴い、加水分解物が増加する傾向にあった。
　上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は、日本で２０２２年３月１１日にそれぞれ出願された特願２０２２－０３７７３２および特願２０２２－０３８４５９を基礎としており、これらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
　本発明は、Ｆｃ含有分子の修飾、修飾されたＦｃ含有分子及びＦｃ含有分子修飾試薬の製造、並びに研究用試薬に有用である。

Claims (21)

  1. 　ピリジンよりも強い塩基性を有する塩基の存在下で、タンパク質又はペプチドと架橋剤とを反応させて、前記タンパク質又はペプチド内のアミノ基と前記架橋剤とを結合させることを含む、Ｆｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  2. 　前記タンパク質又はペプチドがＩｇＧ結合ペプチドであり、
    　前記架橋剤が、前記ＩｇＧ結合ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖末端アミノ基と結合可能なスクシンイミド基を有する架橋剤であり、
    　前記塩基が三級アミンであり、
    　前記反応が、室温以下で実行される、請求項１に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  3. 　前記三級アミンが、ｐＫａ６．０以上１５．０以下の三級アミンである、請求項２記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  4. 　前記三級アミンが、ｐＫａ６．０以上８．０以下の三級アミンである、請求項２記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  5. 　前記反応が、前記ＩｇＧ結合ペプチドのモル量を基準として２当量以上２０当量以下のモル量の前記三級アミンの存在下で実行されることを特徴とする、請求項２に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  6. 　前記反応が、５℃以下で実行されることを特徴とする、請求項２に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  7. 　前記反応が、マイナス５℃以下で実行されることを特徴とする、請求項２に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  8. 　前記架橋剤が、ＤＳＧ（ジスクシンイミジルグルタレート）又はＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）である、請求項２に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  9. 　前記ＩｇＧ結合ペプチドが、下記の式Ｉ：
    (X)1-3-C-(X)2-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X)1-3　　　　　　　　(I)
    （式中、Ｘの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    Ｃはシステイン残基であり、
    Ｈはヒスチジン残基であり、
    Ｘａａ１はリシン残基であり、
    Ｇはグリシン残基であり、
    Ｘａａ２はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
    Ｌはロイシン残基であり、
    Ｖはバリン残基であり、かつ
    Ｗはトリプトファン残基である。）によって表される、
    １３～１７アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、
    請求項２に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  10. 　前記ＩｇＧ結合ペプチドは、Ｎ末端が、放射性金属をキレート可能なキレート剤またはクリック反応可能な原子団により修飾されている、請求項２に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  11. 　前記塩基のｐＫａが５．２より大きい、請求項１に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  12. 　前記塩基のｐＫａが１４以下である、請求項１１に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  13. 　前記塩基が、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ジエチルアミン、又はモノメチルアミンである、請求項１に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  14. 　前記塩基が、トリエチルアミンである、請求項１に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  15. 　前記塩基の濃度が、０.０１～５％である、請求項１に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  16. 　前記タンパク質又はペプチドが、ＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合することができるペプチドである、請求項１に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  17. 　ＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合することができる前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１～１１５のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列である、請求項１６に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  18. 　アミノ基が、前記タンパク質又はペプチド内に存在する、リシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、２－アミノスベリン酸、ジアミノプロピオン酸、若しくはアルギニン残基が有するアミノ基、１位のアミノ酸のアミノ基、又はカルボニル基末端に導入されたアミノ基である、請求項１７に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  19. 　前記架橋剤が、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＡ）、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＰ）、スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＳ）、３，３’－ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＴＢＰ）、及びジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）（ＤＳＰ）からなる群から選択される、請求項１に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  20. 　サイズ排除クロマトグラフィーにより精製することを更に含む、請求項１に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法。
  21. 　請求項１乃至２０のいずれか１項に記載のＦｃ含有分子修飾試薬の製造方法を実行して、Ｆｃ含有分子修飾試薬を得るリンカー修飾工程と、
    　前記Ｆｃ含有分子修飾試薬と、Ｆｃ含有分子とを混和して、前記Ｆｃ含有分子修飾試薬と、前記Ｆｃ含有分子を構成するアミノ酸の側鎖末端アミノ基と、を反応させて、前記Ｆｃ含有分子修飾試薬と前記Ｆｃ含有分子との複合体を得る複合化工程と、
    を備える複合体の製造方法。
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