WO2018230257A1 - ＩｇＧ結合ペプチド、及び該ペプチドによる抗体の特異的修飾 - Google Patents

ＩｇＧ結合ペプチド、及び該ペプチドによる抗体の特異的修飾 Download PDF

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WO2018230257A1
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祐二 伊東
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present invention relates to an IgG-binding peptide, an IgG-binding peptide modified with a crosslinking agent, an IgG-binding peptide-IgG complex modified with the crosslinking agent, a method for producing the complex, and the like.
  • Antibodies have been widely used for the detection of target molecules in various researches and developments in the past, and are extremely important industrially as detection reagents and diagnostic agents. Antibodies are also attracting attention as pharmaceuticals for the treatment of diseases because of their specificity for target molecules.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Chemical modifications for functional addition of antibodies include enzymes such as alkaline phosphatase (AP) and peroxidase (HRP) (Non-Patent Documents 1 and 2), iodination for radioisotopes and addition of chelate compounds ( Non-patent document 3) and modification with low molecular weight compounds such as biotin have been made (non-patent document 4). These modifications are mainly performed through the amino group of lysine, the thiol group of cysteine, the activated carboxyl group, etc., which are specific for the functional group, but not site-specific. There is a problem that the activity of the antibody is reduced by modification of the antigen binding site.
  • AP alkaline phosphatase
  • HRP peroxidase
  • the number of ligands to be introduced is increased in order to increase the detection sensitivity or therapeutic effect
  • the physical properties and structure of the antibody change with an increase in the number of amino acid residues to be modified, resulting in decreased antibody activity or nonspecificity. causes binding, leading to reduced therapeutic efficacy, detection sensitivity and specificity.
  • an antibody is modified by using an antibody having a specific functional group introduced site-specifically. For example, modification at a specific site by introducing an unnatural amino acid (Non-patent documents 5 to 7) or free cysteine (Non-patent documents 8 to 9) and introducing it into a specific site by genetic engineering modification Became possible. Moreover, it has been reported that transglutaminase (TG) is used to modify natural or artificially introduced specific glutamine in an antibody (Non-patent Documents 10 to 11). It is known that the reaction yield is greatly influenced by the structure of the target compound and the spatial environment of the target glutamine residue. In this way, site-specific antibody modification technology is being developed, but in many cases, it is necessary to modify the antibody itself in terms of antibody engineering. It is not necessarily an advantageous method.
  • TG transglutaminase
  • the present inventor has prepared an IgG-binding peptide, found that the IgG antibody can be modified by this peptide without reducing the activity of the IgG antibody, and completed the present invention.
  • the present invention includes the following aspects. (1) (Xaa1) NMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNA (Xaa2) I (Xaa3) SIRDDC (SEQ ID NO: 1), (Xaa4) FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNA (Xaa2) I (Xaa3) SIRDDC (SEQ ID NO: 2), or one or several amino acids added, deleted, and / or deleted at positions other than Xaa1 to Xaa4 in SEQ ID NO: 1 or 2 Or a substituted amino acid sequence, Xaa1 is selected from the group consisting of lysine residues, ornithine residues, cysteine residues, aspartic acid residues, glutamic acid residues, 2-aminosuberic acid residues, and diaminopropionic acid residues; Xaa2 and Xaa3 are each independently an arginine residue, a histidine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue
  • Xaa2 and Xaa3 are each independently selected from the group consisting of an arginine residue, a histidine residue, and a glutamic acid residue.
  • Xaa2 and Xaa3 are arginine residues.
  • a cysteine residue at position 5 and a cysteine residue at position 34 of SEQ ID NO: 1, and a cysteine residue at position 6 and SEQ ID NO: 2 are linked via a disulfide bond or a linker.
  • FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 9), GFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 7), KNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 4), GFNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 5), KNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 6),
  • the peptide according to any one of (1) to (8), comprising the amino acid sequence of FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD (SEQ ID NO: 10) or GKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 11).
  • Xaa1 and Xaa4 are modified with a crosslinking agent, or when Xaa4 is not present, phenylalanine at position 1 of SEQ ID NO: 2 is modified with a crosslinking agent, The peptide according to any one.
  • the cross-linking agent is DSG (disuccinimidyl glutarate), DSS (disuccinimidyl suberate), DMA (dimethyl adipimidate dihydrochloride), DMP (dimethyl pimelic acid dihydrochloride), DMS ( (15) selected from the group consisting of dimethyl suberimidate dihydrochloride), DTBP (3,3′-dithiobispropionimidate dimethyl dihydrochloride), and DSP (dithiobissuccinimidylpropionic acid)
  • DSG disuccinimidyl glutarate
  • DSS disuccinimidyl suberate
  • DMA dimethyl adipimidate dihydrochloride
  • DMP dimethyl pimelic acid dihydrochloride
  • DMS (15) selected from the group consisting of dimethyl suberimidate dihydrochloride
  • DTBP 3,3′-dithiobispropionimidate dimethyl dihydrochloride
  • DSP di
  • IgG-binding peptide modified with the cross-linking agent of the present invention can be added to IgG in a short time and with almost no side reaction, various compounds can be bound by binding various compounds to the IgG-binding peptide.
  • IgG can be modified specifically and conveniently.
  • FIG. 1A shows a schematic diagram of random labeling such as amine coupling method, which is a conventional method for labeling antibodies.
  • a functional ligand such as a labeling substance or a drug binds to a random site of an antibody.
  • FIG. 1B shows site-specific labeling according to the method of one embodiment of the invention.
  • a functional ligand such as a labeling substance or a drug is site-specifically bound to an antibody via an IgG-binding peptide.
  • FIG. 1A shows a schematic diagram of random labeling such as amine coupling method, which is a conventional method for labeling antibodies.
  • a functional ligand such as a labeling substance or a drug binds to a random site of an antibody.
  • FIG. 1B shows site-specific labeling according to the method of one embodiment of the invention.
  • a functional ligand such as a labeling substance or a drug is site-specifically bound to an antibody via an IgG-binding peptide.
  • FIG. 2 shows a model structure (A) of the binding between the Z34C peptide and human IgG, and a model structure (B) of the binding between the Z34C-derived peptide ( ⁇ z34C) and human IgG.
  • FIG. 3 shows the results of SDS-PAGE of the reaction product of the SGated ⁇ Z34C peptide and human IgG.
  • Lane 1 is human IgG1 (Trastuzumab)
  • Lane 2 is a reaction product of human IgG1 and ⁇ Z34C
  • Lane 3 is a reaction product of human IgG2
  • Lane 4 is a reaction product of human IgG2 and ⁇ Z34C
  • Lane 5 is a reaction product of human IgG3
  • Lane 6 Shows the results of SDS-PAGE of the reaction product of human IgG3 and ⁇ Z34C
  • lane 7 shows the result of human IgG4
  • lane 8 shows the reaction product of human IgG4 and ⁇ Z34C.
  • FIG. 4 shows the results of SDS-PAGE (A, C, D) of the reaction product of SG-modified ⁇ Z34C 7K peptide and human IgG, mouse IgG, and rabbit and rat IgG, respectively, and SG-ized ⁇ Z34C 7K peptide and human IgG.
  • the result of Western blotting (B) of the reaction product is shown.
  • FIG. 4 shows the results of SDS-PAGE (A, C, D) of the reaction product of SG-modified ⁇ Z34C 7K peptide and human IgG, mouse IgG, and rabbit and rat IgG, respectively, and SG-ized ⁇ Z34C 7K peptide and human IgG.
  • B Western blotting
  • lane 1 is human IgG1 (Trastuzumab)
  • lane 2 is a reaction product of human IgG1 and ⁇ Z34C 7K
  • lane 3 is a reaction product of human IgG2
  • lane 4 is a reaction product of human IgG2 and ⁇ Z34C 7K
  • lane 5 is Lane 6 shows the result of SDS-PAGE of the reaction product of human IgG3 and ⁇ Z34C ⁇ 7K
  • lane 7 shows the reaction result of human IgG4
  • lane 8 shows the reaction product of human IgG4 and ⁇ Z34C 7K.
  • Lanes 1-8 in FIG. 4B correspond to lanes 1-8 in FIG. 4A.
  • lane 1 is mouse IgG1
  • lane 2 is a reaction product of mouse IgG1 and ⁇ Z34CZ7K
  • lane 3 is a mouse IgG2b
  • lane 4 is a reaction product of mouse IgG2b and ⁇ Z34C 7K
  • lane 5 is a mouse IgG3 reaction.
  • Lane 6 shows the result of SDS-PAGE of the reaction product of mouse IgG3 and ⁇ Z34C 7K.
  • lane 1 is a rabbit IgG
  • lane 2 is a reaction product of rabbit IgG and ⁇ Z34C 7K
  • lane 3 is a rat IgG1
  • lane 4 is a reaction product of rat IgG1 and ⁇ Z34C 7K
  • lane 5 is a rat IgG2b reaction.
  • Lane 6 shows the result of SDS-PAGE of the reaction product of rat IgG2b and ⁇ Z34C 7K
  • Lane 7 shows the result of rat IgG2c
  • Lane 8 shows the result of SDS-PAGE of the reaction product of rat IgG2c and ⁇ Z34C 7K.
  • lane 5 shows the results of SDS-PAGE (A, B, and C, respectively) of the reaction product of SG-modified ⁇ Z34C 7K peptide with human IgG, mouse IgG, and rabbit and rat IgG.
  • lane 1 is human IgG1 (Trastuzumab)
  • lane 2 is a reaction product of human IgG1 and ⁇ Z34C 7K
  • lane 3 is a human IgG2
  • lane 4 is a reaction product of human IgG2 and ⁇ Z34C 7K
  • lane 5 is Lane 6 shows the results of SDS-PAGE of human IgG3, the reaction product of human IgG3 and ⁇ Z34C 7K
  • lane 1 is mouse IgG1
  • lane 2 is mouse IgG1 and ⁇ Z34C ⁇ 7K reaction
  • lane 3 is mouse IgG2b
  • lane 4 is mouse IgG2b and ⁇ Z34C 7K reaction
  • lane 5 is mouse IgG3
  • Lane 6 shows the result of SDS-PAGE of the reaction product of mouse IgG3 and ⁇ Z34C 7K.
  • lane 1 is a rabbit IgG
  • lane 2 is a reaction product of rabbit IgG and ⁇ Z34C 7K
  • lane 3 is a rat IgG1
  • lane 4 is a reaction product of rat IgG1 and ⁇ Z34C 7K
  • lane 5 is a rat IgG2b reaction.
  • Lane 6 shows the result of SDS-PAGE of the reaction product of rat IgG2b and ⁇ Z34C 7K
  • Lane 7 shows the result of rat IgG2c
  • Lane 8 shows the result of SDS-PAGE of the reaction product of rat IgG2c and ⁇ Z34C 7K.
  • FIG. 6 shows binding activity of mouse IgG1, 2b and human IgG3 modified with ⁇ Z34C 7K and ⁇ Z34C 7K (all antigens are chicken egg white lysozyme) and Trastuzumab (anti-HER2 human IgG1 antibody) to chicken egg white lysozyme by ELISA The evaluation is shown.
  • Figure 7 shows the results of SDS-PAGE of samples after 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, and 3 hours of reaction with various SG-modified polypeptides with IgG1, and the modification efficiency of IgG1 estimated from the results. Show.
  • Figure 8 shows the results of SDS-PAGE of samples after reaction with various antibodies at pH 7.4 of SG peptide peptide reagents (three peptide reagents Z34C 26 28R, ⁇ Z34C, and ⁇ Z34C) and estimated from the results. The modification efficiency of various antibodies is shown.
  • IgG refers to mammals, eg, primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats, mice, and rabbits, domestic animals such as pigs, cows, horses, sheep, and goats, And IgG of pet animals such as dogs and cats, preferably human, mouse, rat, or rabbit, more preferably rat or mouse IgG.
  • the IgG subclass is not limited.
  • human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 preferably human IgG1, IgG2, or IgG4
  • mouse IgG1, mouse IgG2a, mouse IgG2b, mouse IgG3 preferably mouse IgG2a, mouse IgG2b, mouse IgG3
  • rat IgG1, rat IgG2a, rat IgG2b, rat IgG3 preferably rat IgG1 or rat IgG2c
  • rabbit IgG rabbit IgG.
  • the present invention provides an amino acid sequence of (Xaa1) NMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNA (Xaa2) I (Xaa3) SIRDDC (SEQ ID NO: 1), or (Xaa4) FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNA (Xaa2) I (Xaa3) SIRDDC (SEQ ID NO: 2)
  • the present invention relates to a peptide comprising the amino acid sequence of No. 1 or 2, wherein one or several amino acids are added, deleted and / or substituted at positions other than Xaa1 to Xaa4.
  • the peptide of the present invention is preferably an IgG-binding peptide or an IgG-binding peptide.
  • SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is a Z34C peptide (Braisted AC. And Wells JA., Whose affinity is optimized by minimizing the IgG binding domain (B-domain) of protein A and performing mutation etc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, pp. 5688-5692, 6881996) may be mutated with respect to Xaa1 to Xaa4.
  • Xaa1 is a lysine residue, ornithine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid residue, and diaminopropionic acid residue, preferably a lysine residue, It is selected from the group consisting of ornithine residue, cysteine residue, and diaminopropionic acid residue, more preferably lysine residue.
  • Xaa2 and Xaa3 are each independently arginine residue, histidine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, serine residue, threonine residue, asparagine residue, glutamine residue, tyrosine.
  • Residues and cysteine residues preferably selected from the group consisting of arginine residues, histidine residues, and glutamic acid residues, more preferably arginine residues.
  • Xaa2 and Xaa3 are not reactive with the crosslinkers described below.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of KNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 4), and a specific example of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of GFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 7).
  • an arginine residue at position 7 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is a lysine residue.
  • the range of “one or several” that can be added, deleted, and / or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is, for example, 1 to 5, 1 to 4, preferably 1 To 3, 1 to 2, more preferably 1.
  • the amino acid inserted by addition or substitution is not a cysteine residue.
  • the amino acid inserted by addition or substitution is a lysine residue, it is preferable that the epsilon amino group of a lysine residue is modified and it does not have reactivity with the crosslinking agent described below.
  • deletion or substitution is performed on the amino acid of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, it is preferable that the amino acid to be deleted or substituted is not a cysteine residue.
  • Addition, deletion, and / or substitution to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 can be performed for amino acids that do not significantly affect the binding of the peptide to IgG.
  • Examples of additions, deletions and / or substitutions to such amino acids include deletion of the arginine residue at position 7 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the arginine residue at position 8 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or Substitution and addition of a lysine residue to the C-terminus of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • An amino acid suitable for substitution can be determined as appropriate based on, for example, conservative amino acid substitution in consideration of the properties of the side chain.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 examples include EfuenuemukyushikyuaruaruefuYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 9), GFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 7), KNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 4), GFNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 5), KNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ No. 6), FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD (SEQ ID NO: 10), or GKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 11).
  • Two cysteine residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 namely, cysteine residues at positions 5 and 34 of SEQ ID NO: 1, and cysteine residues at position 6 and 35 of SEQ ID NO: 2.
  • Residues can be linked via a disulfide bond or a linker to form a cyclic peptide.
  • the two cysteine residues are disulfide bonded.
  • the type of the linker is not particularly limited. The following formula:
  • linker represented by the formula selected from the group consisting of:
  • the linker is preferably
  • R in the linker in the IgG-binding peptide is a substituted or unsubstituted alkyl, preferably a substituted or unsubstituted C1-C6 alkyl, that is, methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group, pentyl Group or hexyl group.
  • the substituent of R is not particularly limited, and examples thereof include a hydroxy group, a (mono or poly) ethylene oxide group, a carboxyl group, an alkoxy group, an acyl group, an alkyl group, an amide group, an ester group, a halogen group (F, Cl, Br, Or I), or a combination thereof.
  • the wavy line part in a formula means the coupling
  • the linker is more excellent in stability, for example, resistance to alkali or reduction reaction, preferably alkali resistance than a normal disulfide bond.
  • the method for preparing the peptide having the linker is not particularly limited.
  • the peptide having a linker represented by the following method: A step of mixing a peptide containing two cysteine residues and a compound having a reactive functional group (for example, a halogen group, an imidazole group, etc.) involved in a crosslinking reaction in the wavy portion of the linker, for example, under acidic conditions It can be obtained by the method of including.
  • a reactive functional group for example, a halogen group, an imidazole group, etc.
  • the halogen group is preferably selected from the group consisting of F, Cl, Br, and I, more preferably Cl, Br, and I.
  • the halogen groups are preferably the same, more preferably all halogen groups are Cl.
  • Xaa1 is a protein-constituting amino acid such as a lysine residue, ornithine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, and diaminopropionic acid residue And non-protein constituent amino acids such as 2-aminosuberic acid residue, preferably lysine residue, ornithine residue, cysteine residue, or diaminopropionic acid residue, more preferably lysine residue. is there.
  • Xaa1 is preferably modifiable by a crosslinking agent described later.
  • non-proteinogenic amino acid refers to an amino acid that is not used to constitute a protein in a living body.
  • the ⁇ -amino group of Xaa1 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is an acyl group such as an acetyl group or a propynyl group (in this specification, “acyl group”).
  • the “group” is represented by the general formula: R—CO—, wherein R is a hydrocarbon, preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an amino group or the like.
  • the peptide of the present invention has no or almost no amino acid residue as Xaa1 in the sequence (for example, it preferably has only one or two), and when it has the same amino acid residue as Xaa1, it is preferable that the amino acid residue is modified so that the crosslinking agent does not react.
  • the modification of the same amino acid residue as Xaa1 is not limited, but may be, for example, a linkage of a labeling substance or a drug described in detail below.
  • the peptide of the present invention preferably has no or almost no lysine residue at a position other than Xaa1 in the sequence.
  • Xaa4 is a glycine residue, alanine residue, valine residue, leucine residue, isoleucine residue, methionine residue, proline residue, phenylalanine residue.
  • the N-terminal amino acid such as phenylalanine at the 1-position is preferably modifiable by a crosslinking agent described later.
  • ⁇ -amino of Xaa4 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (or N-terminal amino acid such as phenylalanine at position 1 in the absence of Xaa4)
  • the group is unmodified, and it is preferred that this ⁇ -amino group is modified with a crosslinking agent.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has no or almost no amino acid that can be modified with the crosslinking agent (for example, 1 or 2), and in the case of having an amino acid that can be modified by a crosslinking agent, the amino acid residue is preferably modified so that the crosslinking agent does not react.
  • the modification of the amino acid is not limited, but may be, for example, a linkage of a labeling substance or drug described in detail below.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has no or almost no lysine residue (for example, only one or two). It is preferred that the ⁇ -amino group of the residue is modified.
  • the IgG-binding peptide described in the present specification may have, for example, N-terminal acylation (for example, acetylation), amination, and / or PEGylation (polyethylene glycol addition) in order to improve its stability and the like. It may be modified by C-terminal amidation or the like.
  • the number of PEG molecules for PEGylation is not particularly limited, and for example, 1 to 50 molecules, 1 to 20 molecules, 2 to 10 molecules, 2 to 6 molecules, or 4 molecules of PEG can be added.
  • the peptide of the present invention has a binding affinity for IgG of, for example, about 10 times or more, preferably about 50 times or more, more preferably about 200 times compared to other immunoglobulins (eg, IgA, IgE, IgM). More expensive.
  • the dissociation constant (Kd) relating to the binding between the peptide of the present invention and human IgG can be determined by surface plasmon resonance spectrum analysis (for example, using the BIACORE system), for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 1 M to less than 1 ⁇ 10 ⁇ 3 M , Preferably less than 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M, more preferably less than 1 ⁇ 10 ⁇ 5 M.
  • the IgG-binding peptide of the present invention binds to the Fc domain of IgG.
  • the IgG-binding peptide of the present invention has a specific region of IgG Fc in Xaa1 or Xaa4, that is, Lys248 according to Eu numbering in human IgG Fc (hereinafter simply referred to as “Lys248” in this specification). It can also be described as human IgG CH2 (corresponding to the 18th amino acid residue of SEQ ID NO: 8)).
  • Peptides of the present invention include conventional liquid phase synthesis methods, peptide synthesis methods such as solid phase synthesis methods, peptide synthesis using an automatic peptide synthesizer, etc.
  • peptide synthesis methods such as solid phase synthesis methods, peptide synthesis using an automatic peptide synthesizer, etc.
  • the peptide may be produced by a gene recombination method using a nucleic acid encoding the peptide of the present invention, a phage display method, or the like.
  • the target peptide can be produced by incorporating a DNA encoding the amino acid sequence of the peptide of the present invention into an expression vector, introducing it into a host cell and culturing.
  • the produced peptide can be obtained by conventional methods, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, HPLC chromatography, ammonium sulfate fractionation, ultrafiltration, and immunoadsorption. It can be recovered or purified by a method or the like.
  • amino acids prepared by protecting functional groups other than the ⁇ -amino group and ⁇ -carboxyl group to be bound of each amino acid are prepared.
  • a peptide bond forming reaction is carried out between the ⁇ -amino group and ⁇ -carboxyl group of each amino acid.
  • the carboxyl group of the amino acid residue located at the C-terminus of the peptide is bound to the solid phase via an appropriate spacer or linker.
  • the amino-terminal protecting group of the dipeptide thus obtained is selectively removed, and a peptide bond is formed with the ⁇ -carboxyl group of the next amino acid.
  • the production by gene recombination method is performed, for example, by inserting a DNA encoding the peptide of the present invention into an appropriate expression vector, introducing the vector into an appropriate host cell, culturing the cell, and from inside the cell or extracellular fluid.
  • Can be achieved by a method comprising recovering the peptide of interest from The vector is not limited, and is, for example, a vector such as a plasmid, phage, cosmid, phagemid, and virus.
  • Plasmid vectors include, but are not limited to, E. coli-derived plasmids (eg, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, etc.) ) And yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YCp50, etc.).
  • E. coli-derived plasmids eg, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, etc.
  • yeast-derived plasmids eg, YEp13, YCp50, etc.
  • Phage vectors include, but are not limited to, T7 phage display vectors (T7Select10-3b, T7Select1-1b, T7Select1-2a, T7Select1-2b, T7Select1-2c, etc. (Novagen)), and ⁇ phage vectors (Charon4A, Charon21A , EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP, ⁇ ZAPII, etc.).
  • viral vectors include, but are not limited to, animal viruses such as retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses, and Sendai viruses, and insect viruses such as baculoviruses.
  • cosmid vectors include, but are not limited to, Lorist 6, Charomid 9-20, and Charomid 9-42.
  • phagemid vectors include, but are not limited to, pSKAN, pBluescript, pBK, and pComb3H.
  • the vector may include a regulatory sequence so that the target DNA can be expressed, a selection marker for selecting a vector containing the target DNA, a multicloning site for inserting the target DNA, and the like.
  • regulatory sequences include promoters, enhancers, terminators, S-D sequences or ribosome binding sites, replication origins, poly A sites, and the like.
  • an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a dihydrofolate reductase gene, and the like can be used as the selection marker.
  • Host cells for introducing the vector include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeast cells, insect cells, animal cells (for example, mammalian cells), plant cells, and the like, and transformation or transfer into these cells.
  • the effects include, for example, a calcium phosphate method, an electroporation method, a lipofection method, a particle gun method, and a PEG method.
  • the transformed cells are cultured according to a usual method used for culturing host organisms. For example, a culture solution of microorganisms such as Escherichia coli and yeast cells contains a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts that can be assimilated by the host microorganism.
  • the peptide produced by expression out of the cell is preferable to secrete the peptide produced by expression out of the cell.
  • This can be performed by binding DNA encoding a peptide sequence that allows secretion of the peptide from the cell to the 5 ′ end of the DNA encoding the target peptide.
  • the fusion peptide transferred to the cell membrane is cleaved by signal peptidase, and the target peptide is secreted and released into the medium.
  • the target peptide accumulated in the cells can be recovered. In this case, the cells are physically or chemically destroyed, and the target peptide is recovered using protein purification techniques.
  • the IgG-binding peptide of the present invention and another protein are fused, after preparing the IgG-binding peptide and the other protein separately, the IgG-binding peptide and the protein may be fused using a linker as necessary.
  • An appropriate linker may be added as necessary by gene recombination to produce a fusion protein. In this case, it is preferable to prepare a fusion protein so that the IgG-binding peptide of the present invention does not impair the binding property with IgG.
  • the IgG-binding peptide in the present invention is preferably modified with a cross-linking agent.
  • the IgG-binding peptide of the present invention can be close to Lys248 according to a specific region of IgGLFc, that is, Eu numbering in human IgG Fc, in Xaa1 or Xaa4, as shown in Examples described later.
  • a cross-linked structure can be formed in a site-specific manner between Xaa1 or Xaa4 (or N-terminal amino acid when Xaa4 is not present) and Lys248 of IgG Fc.
  • the IgG-binding peptide of the present invention is modified with various compounds, Xaa1 or Xaa4 (or the N-terminal amino acid in the absence of Xaa4) is modified with a cross-linking agent, and this is cross-linked with IgG.
  • These compounds can be specifically and easily introduced into IgG.
  • a compound can be introduced through an IgG-binding peptide, compounds having various structures can be introduced into IgG without side reactions.
  • the method of the present invention has an advantage that the yield of the obtained product is high and the antibody itself is not modified, so that the possibility of reducing the function of the antibody is low.
  • the IgG-binding peptide of the present invention can also be used for non-human animals, preferably mammals such as rat, mouse, and rabbit IgG.
  • the site in IgG to which the IgG-binding peptide of the present invention binds can be easily determined by those skilled in the art who have read this specification by, for example, aligning the sequence of human IgG with the sequence of IgG from other animals. Can be specified.
  • the “crosslinking agent” is a chemical substance for linking the IgG-binding peptide of the present invention and IgG Fc by a covalent bond.
  • the cross-linking agent of the present invention can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • crosslinkers preferably containing two or more succinimidyl groups such as DSG (disuccinimidyl glutarate) and DSS (disuccinimidyl suberate), DMA Imido acid moieties such as (dimethyl adipimidate ⁇ 2HCl, adipimidic acid dimethyl dihydrochloride), DMP (dimethyl pimelimidate ⁇ 2HCl, dimethyl suberimidate ⁇ 2HCl, dimethyl suberimidate ⁇ 2HCl, dimethyl suberimidate ⁇ 2HCl)
  • a crosslinking agent containing 2 or more, and DTBP (dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate ⁇ 2HCl, 3,3'-dithiobispropionimidic acid dimethyl dihydrochloride) and DSP (dithiobis (succinimidyl propionate), dithiobissuccinimine)
  • a crosslinking agent preferably containing two or more succinimidy
  • the IgG-binding peptide of the present invention may be modified with another functional ligand, for example, a labeling substance and / or another agent (for example, an antibody such as IgA or VHH).
  • the IgG-binding peptide of the present invention has the arginine residue at position 7 of SEQ ID NO: 1 or the arginine residue at position 8 of SEQ ID NO: 2 substituted with a lysine residue, or SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: A lysine residue is further included at the C-terminus of the two, and a functional ligand such as a labeling substance and / or other agent is linked to the substituted lysine residue or the C-terminal lysine residue.
  • the labeling substance and / or other drug may be directly linked to the IgG-binding peptide, or may be linked with a molecule such as PEG (polyethylene glycol).
  • PEG polyethylene glycol
  • the number of PEG molecules in the case of attaching PEG is not particularly limited. For example, 1 to 50 molecules, 1 to 20 molecules, 2 to 10 molecules, 2 to 6 molecules, or 4 molecules of PEG can be added.
  • the IgG-binding peptide and other functional substance can be linked by methods known to those skilled in the art, for example, a reaction between an azide group and dibenzocyclooctyne or a reaction between a maleimide group and a sulfhydryl group.
  • the IgG-binding peptide of the present invention forms a complex with IgG, whereby IgG can be detected or quantified via the labeling substance.
  • Labeling substances include, but are not limited to, fluorescent dyes, chemiluminescent dyes, radioisotopes (eg, chelate complexes of radioiodine or radioisotope metal ions, eg, chelate complexes of DOTA or desferrioxamine), and biotin and GFP
  • preferable labeling substances include fluorescent proteins such as (green fluorescent protein), luminescent proteins, and enzymes such as peroxidase
  • examples of preferred labeling substances include fluorescein derivatives such as fluorescein and FITC, rhodamine derivatives such as rhodamine and tetramethylrhodamine, and Texas Red The fluorescent dye.
  • the drug is not limited to, for example, auristatin such as auristatin E, maytansine, emtansine, doxorubicin, bleomycin, or an anti-cancer such as these derivatives Agents; and targeting agents that bind to receptors on the blood-brain barrier and allow them to enter the central nervous system, or agents that bind to cancer cells and enable antibodies to enter cells Agents.
  • auristatin such as auristatin E
  • maytansine emtansine
  • doxorubicin bleomycin
  • an anti-cancer such as these derivatives Agents
  • the IgG-binding peptide modified with the crosslinking agent of the present invention can be produced, for example, by reacting an IgG-binding peptide obtained according to the method described in the above item ⁇ IgG-binding peptide> with a crosslinking agent.
  • a crosslinking agent it is necessary to specifically modify the side chain of the amino acid residue of Xaa1 or Xaa4 in the IgG-binding peptide.
  • the combination of the type of Xaa1 or Xaa4 and a crosslinking agent should be selected. Can be made.
  • a crosslinker containing a succinimidyl group such as DSS or DSG reacts with a side chain amine ( ⁇ amino group) of a lysine residue and a primary amine ( ⁇ amino group) present at the N-terminus of a polypeptide, so that IgG Only the side chain of the lysine residue can be specifically modified with DSS or DSG by reacting with the DSS or DSG after blocking the N-terminus of the binding peptide.
  • a combination of an amino acid residue and a crosslinking agent can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the primary amine ( ⁇ -amino group) present at the N-terminus of the polypeptide is unmodified, thereby making the ⁇ -amino group specific. Can also be modified.
  • the IgG-binding peptide modified with the crosslinking agent of the present invention can also be produced, for example, by performing peptide synthesis using an amino acid residue modified with the crosslinking agent.
  • an IgG-binding peptide is modified with a labeling substance and / or other drug, it is modified with the labeling substance and / or other drug by synthesizing the peptide using amino acid residues with these modifications.
  • IgG-binding peptides may be prepared.
  • the present invention relates to a method for producing a complex of an IgG binding peptide and IgG comprising the step of mixing IgG with an IgG binding peptide modified with a cross-linking agent of the present invention.
  • a cross-linking reaction can occur between IgG-binding peptide modified with a cross-linking agent and IgG.
  • the cross-linking reaction may occur in a site-specific manner, particularly between the above-mentioned Xaa1 or Xaa4 amino acid residue of IgG-binding peptide and IgG Fc Lys248.
  • the conditions for the mixing step are not particularly limited as long as the mixing step is performed under conditions that cause a cross-linking reaction between the IgG-binding peptide of the present invention and IgG.
  • the reaction can be performed by mixing the IgG-binding peptide of the present invention and IgG in a suitable buffer at room temperature (eg, about 15 ° C. to 30 ° C.).
  • the mixing step may be performed by adding an appropriate amount of a catalyst that promotes the crosslinking reaction, if necessary.
  • the reaction conditions may be adjusted in order to increase the binding property between IgG-binding peptide and IgG.
  • protein A which is derived from the Z34C peptide, is known to have increased binding to human IgG3 at pH 8 or higher, and binding to mouse IgG1 by increasing the salt concentration such as NaCl. Is known to increase.
  • the conditions for the crosslinking reaction of the present invention can be set.
  • the reaction conditions between IgG-binding peptide and IgG can be appropriately determined in consideration of the types of IgG-binding peptide and IgG, and are not limited, but are not limited to pH 4.5 to 6.5 (for example, pH 5.0 to 6.0, pH 5.2 to 5.8). , PH 5.4 to 5.6, or pH about 5.5), or pH 6.5 to 8.5 (eg, pH 6.9 to 7.9, pH 7.2 to 7.7, pH 7.3 to 7.5, or pH about 7.4).
  • pH 4.5 to 6.5 for example, pH 5.0 to 6.0, pH 5.2 to 5.8). , PH 5.4 to 5.6, or pH about 5.5
  • pH 6.5 to 8.5 eg, pH 6.9 to 7.9, pH 7.2 to 7.7, pH 7.3 to 7.5, or pH about 7.4
  • the mixing ratio of the IgG-binding peptide of the present invention and IgG in the mixing step is not particularly limited.
  • the molar ratio of the IgG-binding peptide of the present invention to IgG can be, for example, 1: 1 to 20: 1, preferably 2: 1 to 20: 1 or 5: 1 to 10: 1.
  • the mixing time (reaction time) in the mixing step is not limited as long as a cross-linking reaction occurs between the IgG-binding peptide of the present invention and IgG, but for example, 1 minute to 5 hours, preferably 10 minutes to 2 hours. Or it may be 15 minutes to 1 hour.
  • the method for producing the IgG-binding peptide-IgG complex of the present invention separates impurities, for example, unreacted IgG-binding peptide, IgG, and reagents, from the mixture after the above-described steps, if necessary. And a step of purifying the complex.
  • This step can be performed by a method known in the art, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, chromatography such as HPLC, and the like.
  • the invention relates to a cross-linked complex of an IgG binding peptide of the invention and IgG.
  • the complex can be formed by the crosslinking reaction. Therefore, the present invention is preferably a complex of an IgG-binding peptide and IgG in which the amino acid residue of Xaa1 or Xaa4 of the IgG-binding peptide and Lys248 of IgG Fc are bound via a crosslinking agent in a site-specific manner.
  • a crosslinking agent in a site-specific manner.
  • the complex of the present invention is formed by a site-specific cross-linking reaction, there is little possibility that the cross-linking reaction has a negative effect on the activity of IgG.
  • new functionality can be added to IgG by linking the modified IgG-binding peptide to IgG.
  • IgG-binding peptide modified with a labeling substance when an IgG-binding peptide modified with a labeling substance is bound to IgG, it is possible to detect or quantify IgG via the labeling substance. Since examples of the labeling substance are as described above, the description is omitted here.
  • IgG-binding peptide modified with a drug is bound to IgG, which is a pharmaceutical antibody, the therapeutic effect of IgG disease can be enhanced. Since the example of the medicine is as described above, the description is omitted here.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition or diagnostic agent comprising the IgG-binding peptide, an IgG-binding peptide modified with the cross-linking agent, or a complex of an IgG-binding peptide and IgG modified with the cross-linking agent.
  • the IgG-binding peptide is preferably modified with, for example, the above-mentioned drug.
  • the IgG-binding peptide is preferably modified with, for example, the above-described labeling substance. preferable.
  • the disease or disorder which can be targeted by an antibody Preferably, cancer, an inflammatory disease, an infectious disease, and a nerve Examples include degenerative diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally (for example, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, rectal administration, or transmucosal administration).
  • the pharmaceutical composition of this invention can be made into a suitable dosage form according to an administration route. Specifically, granules, tablets, pills, capsules, syrups, emulsions, suspensions, intravenous injections, arterial injections, injections for intramuscular injections, drops, external preparations, suppositories, etc. It can be prepared in a dosage form.
  • the administration method and dosage form can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the sex, age, weight, symptoms, etc. of the patient.
  • composition of the present invention can be formulated according to a conventional method (see, for example, Remington's Pharmaceutical, Science, Latest Edition, Mark Publishing, Company, Easton, USA) and pharmaceutically acceptable carriers and additives. May be included.
  • Examples of carriers and pharmaceutical additives that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, polyacrylic acid Sodium, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, Examples include human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • HSA human serum albumin
  • mannitol mannitol
  • sorbitol lactose
  • surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • the IgG binding protein of the present invention or a complex of IgG binding protein and IgG is dissolved in a solution such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • a solution such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin and the like can be used.
  • it may be freeze-dried to obtain a dosage form that is dissolved and reconstituted before use.
  • the stabilizer for freeze-drying include sugar alcohols such as mannitol and glucose and / or sugars. Can be used.
  • the effective dose and administration interval of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected according to the sex, age, weight, symptom, etc. of the patient.
  • the timing of administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be prophylactic or therapeutic administration regardless of before or after the clinical symptoms of the disease occur.
  • the antibody Trasutumab (Human IgG1) is available from Chugai, Human IgG2 kappa Isotype Control, Human IgG3 kappa Isotype Control, Human IgG4 kappa Isotype Control, Mouse IgG1 kappa Isotype Control, Mouse IgG2b kappa Isotype Control, Mouse IgG3 kappa Isotype Control, Crown Bioscience Purchased from the company.
  • Rabbit IgG Isotype Control was obtained from Thermo fisher, Rat IgG1 Isotype Control and Rat IgG2b Isotype Control were obtained from R & D Systems, and Rat IgG2c Isotype Control Antibody was obtained from LifeSpan BioSciences. For each antibody, the powder was diluted to 2.0 mg / mL with 0.5 M NaCl and stored frozen until use.
  • Z34C Peptide Variant Z34C peptide variant was prepared by solid phase synthesis by F-moc method. After synthesis, 5.5 mg (1.29 ⁇ mol) of the Z34C-derived peptide was dissolved in 10 ⁇ L of dimethyl sulfoxide (DMSO) (Wako), 190 ⁇ L of 0.1 M NaHCO 3 aqueous solution was added thereto, and the mixture was allowed to stand overnight at room temperature to give intramolecular SS. A bond was formed. Thereafter, the sample was diluted with 3 mL of 1% acetonitrile containing 0.1% TFA, and the whole amount was applied to a preparative chromatograph LC-forte / R (YMC). Elution was performed with a gradient of 10-60% acetonitrile / water containing 0.1% TFA, and then the organic solvent was removed under reduced pressure, followed by lyophilization.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • YMC preparative chromatograph
  • the reaction product was diluted in 3 mL of 1% acetonitrile containing 0.1% TFA, and the whole amount was applied to a preparative chromatograph LC-forte / R (YMC). Elution was performed with a gradient of 10-60% acetonitrile / water containing 0.1% TFA, and then the organic solvent was removed under reduced pressure, followed by lyophilization to obtain a succinimidyl glutarized (SG) Z34C peptide variant. .
  • Peptide affinity analysis Z34C peptide variant affinity analysis was performed on BIAcore T-200 (GE-Healthcare) at 25 ° C. That is, approximately 2000 RU values were immobilized on Trastuzumab (human IgG1 antibody) or other antibodies on the CM5 sensor chip according to the protocol for amine coupling. Sensorgrams (association time: 180 sec, dissociation time: 600 sec) by injecting a total of 7 different concentrations of peptides from 1 ⁇ M to 0.015 ⁇ M as analytes in HBS-EP buffer at a flow rate of 50 ⁇ L / min The dissociation constant (Kd) was calculated from the equilibrium value analysis using the attached BIA evaluation software.
  • Kd dissociation constant
  • ELISA Mouse IgG1, IgG2b, and human IgG3 (all recognize chicken egg white lysozyme as an antigen) and anti-HER2 antibody Trastuzumab (human IgG1) are dissolved in 10 mM acetate buffer (pH 5.5) (final concentration 2.5 ⁇ M) ), 10 times the same amount of peptide reagents ⁇ Z34C 7K and ⁇ Z34C 7K dissolved in DMSO were added and reacted at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 1/10 volume of 1M Tris-HCl (pH 8.0), diluted 5000 times with PBS containing 0.5% BSA, and used for ELISA.
  • 1M Tris-HCl pH 8.0
  • Lysozyme as an antigen was diluted with PBS to 200 ⁇ g / L, 100 ⁇ g / L, and 50 ⁇ g / L, and each well was coated (2 hours). Next, after blocking with a PBS solution containing 0.5% BSA and washing, 50 ⁇ L of the diluted antibody solution was added to each well and allowed to react for 1 hour. After washing, SA-HRP (Vector) diluted 5000 times with a PBS solution containing 0.5% BSA was added to the well. After the reaction, the well was washed, and TMB reagent was added to cause color development.
  • SA-HRP Vector
  • Example 1 Preparation of substituted peptide based on Z34C peptide> Based on the X-ray crystal structure of human IgG1-Fc and Z34C peptide (PDB ID: 1OQO, 10), we searched for amino acid residues on Lys248 and the proximal Z34C peptide in human IgG1-Fc. The side chain of phenylalanine was found to be closest to Lys248 in IgG1-Fc (FIG. 2A).
  • Z34C peptide in order to remove an amino group that can be modified by reaction with DSG, lysine at positions 26 and 28 of Z34C peptide was substituted with arginine, and further, ⁇ Z34C (with phenylalanine at position 1 substituted with lysine for SG formation) Z34C (F1K, K26R, K28R)) peptide was prepared.
  • the amino acid sequences of the Z34C peptide and ⁇ Z34C peptide are shown in Table 1 below (however, the N-terminus and C-terminus of each peptide were acetylated and amidated, respectively).
  • the affinity with human IgG1 was evaluated by BIAcore® T-200 (GE-Healthcare), and the Kd value was 17 ( ⁇ 1.9) nM. Since the Kd value of the original Z34C peptide was reported to be 20 nM, it was found that there was almost no effect of mutation.
  • this peptide is reacted with DSG (disuccinimidyl glutarate) to convert the side chain of lysine at position 1 to SG (succinimidyl glutarate), and the resulting S-glycated ⁇ Z34C peptide and human Reactivity with each IgG subclass was evaluated.
  • DSG disuccinimidyl glutarate
  • succinimidyl glutarate succinimidyl glutarate
  • the ⁇ amino group was modified with PEG4-biotin ( ⁇ Z34C 7K and ⁇ Z34C 7K, respectively).
  • the structures of the two types of biotinylated labeled peptides are shown in Table 2 below (however, the N-terminus and C-terminus of Z34C and ⁇ Z34C 7K were acetylated and amidated, respectively, and ⁇ Z34C 7K peptide was modified at the N-terminus. No, only C-terminal amidation was performed).
  • peptides were converted to SG by the same method as in Example 1, and the reactivity with the antibody was evaluated. That is, the SG group was introduced into the ⁇ -amino group at the N-terminal in the ⁇ Z34C 7K peptide, and the SG group was introduced into the ⁇ -amino group of Lys1 in the ⁇ Z34C 7K peptide, and the labeling ability for human, mouse, and rat antibodies was examined by SDS-PAGE.
  • Example 3 Affinity evaluation of biotinylated peptide-labeled antibody to various antibodies> Next, the affinity between the used biotinylated peptide (no DSG) and the antibody was evaluated.
  • Table 4 shows the results of affinity analysis of the used peptides and various IgG antibodies using BIAcore T200. The relationship between the labeling efficiencies of the various peptides in Table 3 and the affinity in Table 4 was plotted, but it seemed that there was no clear correlation between the affinity between the antibody and peptide and the labeling efficiency (data not shown). ).
  • Example 4 ELISA with biotinylated peptide-labeled antibody>
  • Mouse IgG1, IgG2b, human IgG3 (all recognize chicken egg white lysozyme as an antigen), and anti-HER2 antibody Trastuzumab (human IgG1) were reacted with ⁇ Z34C 7K and ⁇ Z34C 7K and subjected to ELISA.
  • the results are shown in FIG.
  • mouse IgG1 and IgG2b had high binding reactivity, and binding activity was also observed for human IgG3.
  • no binding activity was observed with human IgG1 (antigen is HER2) with different target antigens.
  • the labeling reaction can be completed simply by mixing the labeled antibody with the antibody solution and the peptide solution, and the reaction solution can be used as it is for an assay such as ELISA without any extra purification and isolation. It was shown that it can be done.
  • Example 5 Reactivity of various peptides to IgG1> The following peptides were synthesized by the F-moc method, and the reactivity with IgG1 at pH 5.5 was evaluated (however, the C-terminus was amidated, the N-terminus was only ⁇ Z34C, and the others were aminated. ).
  • Example 6 Examination of influence of pH> To each IgG (99 ⁇ L) dissolved in 10 mM PBS (pH 7.4), 1 ⁇ L of 0.5 mM SG peptide reagent (three peptide reagents Z34C 26 28R, ⁇ Z34C, and ⁇ Z34C) dissolved in DMSO was added, The reaction was performed at room temperature (however, the final concentrations of antibody and peptide reagent were 1 ⁇ M and 5 ⁇ M). After reacting for 3 hours, the same method as in Example 5 was followed by SDS-PAGE followed by CBB staining.
  • 0.5 mM SG peptide reagent three peptide reagents Z34C 26 28R, ⁇ Z34C, and ⁇ Z34C
  • IgG-binding peptide modified with the cross-linking agent of the present invention can be added to IgG in a short time and with almost no side reaction, various compounds can be bound by binding various compounds to the IgG-binding peptide.
  • IgG can be modified specifically and conveniently. Since IgG provided with various compounds can be used as a therapeutic agent or a diagnostic agent, the industrial applicability of the present invention is great.

Abstract

本発明は、特異的かつ簡便に抗体を修飾することができる方法を提供すること等を課題とする。　本発明は、IgG結合ペプチド、架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチド、該架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチドとIgGの複合体、及び該複合体を生産する方法等に関する。

Description

ＩｇＧ結合ペプチド、及び該ペプチドによる抗体の特異的修飾
　本発明は、IgG結合ペプチド、架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチド、該架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチドとIgGの複合体、及び該複合体を生産する方法等に関する。
　抗体は、従来から種々の研究・開発において、標的分子の検出に多く利用されており、検出試薬や診断薬として産業面でも、極めて重要なものとなっている。また、抗体は、その標的分子に対する特異性から、疾患の治療のための医薬品としても注目されている。
　抗体の機能付加のための化学修飾として、アルカリフォスファターゼ（AP）やパーオキシダーゼ（HRP）等の酵素（非特許文献1～2）、さらには放射性同位体のためのヨウ素化やキレート化合物の付加（非特許文献3）、ビオチン等といった低分子化合物による修飾がなされてきた（非特許文献4）。これらの修飾は、主にリシンのアミノ基やシステインのチオール基、及び活性化されたカルボキシル基等を介して行われており、これらは官能基について特異的だが、部位特異的ではないため、抗体の抗原結合部位への修飾等により抗体の活性を低下させるといった問題があった。また、検出の感度又は治療効果を高めるため、導入するリガンドの数を上げると、修飾されるアミノ酸残基数の増加とともに抗体の物性や構造が変化し、抗体の活性の低下又は非特異的な結合を引き起こして、治療効果や検出感度及び特異性の低下につながる。
　このような問題を克服するため、特定の官能基を部位特異的に導入した抗体を使って、抗体を修飾することが行われている。例えば、非天然アミノ酸（非特許文献5～7）又はフリーのシステイン（非特許文献8～9）を導入して、特定の部位に遺伝子工学的改変により導入することで、特定の部位での修飾が可能になった。またトランスグルタミナーゼ（TG）を利用して、抗体中の天然のもしくは人工的に導入された特定のグルタミンを標的にして修飾を行うことが報告されているが（非特許文献10～11）、導入する化合物の構造や、標的とするグルタミン残基の空間的な環境によってその反応収率が大きく影響を受けることが知られている。このように部位特異的な抗体修飾技術は開発されつつあるが、多くの場合、抗体そのものを抗体工学的に改変する必要があり、その改変に伴う抗体の機能低下や開発のコスト高を考えると必ずしも有利な方法とはいえない。
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　したがって、特異的かつ簡便に抗体を修飾することができる方法が必要とされている。
　本発明者は、IgG結合ペプチドを作製し、本ペプチドによってIgG抗体の活性を低下させることなく、IgG抗体を修飾できることを見出し、本願発明を完成させた。
　したがって、本発明は以下の態様を包含する。
（１）（Xaa1）NMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNA（Xaa2）I（Xaa3）SIRDDC（配列番号1）、
　（Xaa4）FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNA（Xaa2）I（Xaa3）SIRDDC（配列番号2）、又は配列番号1若しくは2のアミノ酸配列において、Xaa1～Xaa4以外の位置で1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
　Xaa1は、リシン残基、オルニチン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸残基、及びジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択され、
　Xaa2及びXaa3は、それぞれ独立に、アルギニン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、チロシン残基、及びシステイン残基からなる群から選択され、
　Xaa4は、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、リシン残基、オルニチン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、βアラニン残基、2-アミノスベリン酸残基、ジアミノプロピオン酸残基、及びNH2-(PEG)n-CO(n=1～50)からなる群から選択されるか、又は存在しない、
ペプチド、ＩｇＧ結合ペプチド、又はＩｇＧ結合用ペプチド。
（２）Xaa1がリシン残基、オルニチン残基、システイン残基、及びジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される、（１）に記載のペプチド。
（３）Xaa1がリシン残基である、（２）に記載のペプチド。
（４）Xaa4がグリシン残基、アラニン残基、βアラニン残基、及びNH2-(PEG)n-CO(n=1～50)からなる群から選択されるか、又は存在しない、（１）～（３）のいずれかに記載のペプチド。
（５）Xaa4がグリシン残基であるか、又は存在しない、（４）に記載のペプチド。
（６）Xaa2及びXaa3が、それぞれ独立に、アルギニン残基、ヒスチジン残基、及びグルタミン酸残基からなる群から選択される、（１）～（５）のいずれかに記載のペプチド。
（７）Xaa2及びXaa3がアルギニン残基である、（６）に記載のペプチド。
（８）配列番号1の5位のシステイン残基と34位のシステイン残基、及び配列番号2の6位のシステイン残基と35位のシステイン残基がジスルフィド結合又はリンカーを介して連結されている、（１）～（７）のいずれかに記載のペプチド。
（９）FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号9）、
　GFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号7）、
　KNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号4）、
　GFNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号5）、
　KNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号6）、
　FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD（配列番号10）、又は
　GKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号11）のアミノ酸配列を含む、（１）～（８）のいずれかに記載のペプチド。
（１０）標識物質又は薬剤が結合している、（１）～（９）のいずれかに記載のペプチド。
（１１）配列番号1の7位のR若しくは配列番号2の8位のRがリシン残基に置換されているか、配列番号1若しくは配列番号2のC末端にリシン残基をさらに含む、（１）～（１０）のいずれかに記載のペプチド。
（１２）標識物質又は薬剤が、置換リシン残基又はC末端のリシン残基に結合している、（１１）に記載のペプチド。
（１３）N末端のアミノ酸がアセチル化又はアミノ化されている、（１）～（１１）のいずれかに記載のペプチド。
（１４）Ｃ末端のアミノ酸がアミド化されている、（１）～（１３）のいずれかに記載のペプチド。
（１５）Xaa1及びXaa4が、架橋剤で修飾されているか、又はXaa4が存在しない場合には、配列番号2の1位のフェニルアラニンが架橋剤で修飾されている、（１）～（１４）のいずれかに記載のペプチド。
（１６）前記架橋剤が、DSG（ジスクシンイミジルグルタレート）、DSS（ジスクシンイミジルスベレート）、DMA（アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMP（ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMS（スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DTBP（3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）、及びDSP（ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）からなる群より選択される、（１５）に記載のペプチド。
（１７）前記架橋剤がDSG（ジスクシンイミジルグルタレート）又はDSS（ジスクシンイミジルスベレート）である、（１６）に記載のペプチド。
（１８）（１５）～（１７）のいずれかに記載のペプチドとIgGとの架橋複合体。
（１９）（１５）～（１７）のいずれかに記載のペプチドとIgGを混合し、架橋剤で修飾されているペプチドとIgGを架橋反応させる工程を含む、ペプチドとIgGの複合体を生産する方法。
（２０）（１）～（１７）のいずれかに記載のペプチド、又は（１８）に記載の複合体を含む、医薬組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-118735号の開示内容を包含する。
　本発明の架橋剤により修飾されたIgG結合ペプチドは、短時間で、しかもほとんど副反応なくIgGに付加することができるため、該IgG結合ペプチドに種々の化合物を結合させることで、種々の化合物によってIgGを特異的かつ簡便に修飾することができる。
図1Aは、抗体の標識の従来法であるアミンカップリング法等のランダム標識の模式図を示す。図1Aに示す通り、従来法では標識物質又は薬剤等の機能性リガンドが、抗体のランダムな部位に結合する。図1Bは、本発明の一実施形態の方法による部位特異的標識を示す。図1Bに示す通り、本発明の一実施形態の方法では、標識物質又は薬剤等の機能性リガンドが、IgG結合ペプチドを介して抗体に部位特異的に結合する。 図2は、Z34CペプチドとヒトIgGの結合のモデル構造（A）、並びにZ34C誘導ペプチド（εz34C）とヒトIgGの結合のモデル構造（B）を示す。 図3は、SG化εZ34CペプチドとヒトIgGの反応物のSDS-PAGEの結果を示す。レーン1はヒトIgG1（Trastuzumab）の、レーン2はヒトIgG1とεZ34Cの反応物の、レーン3はヒトIgG2の、レーン4はヒトIgG2とεZ34Cの反応物の、レーン5はヒトIgG3の、レーン6はヒトIgG3とεZ34Cの反応物の、レーン7はヒトIgG4の、レーン8はヒトIgG4とεZ34Cの反応物のSDS-PAGEの結果を示す。 図4は、SG化αZ34C 7Kペプチドと、ヒトIgG、マウスIgG、並びにウサギ及びラットIgGとの反応物のSDS-PAGEの結果（それぞれA、C、D）、及びSG化αZ34C 7KペプチドとヒトIgGの反応物のウエスタンブロッティング（B）の結果を示す。図4Aにおいて、レーン1はヒトIgG1（Trastuzumab）の、レーン2はヒトIgG1とαZ34C 7Kの反応物の、レーン3はヒトIgG2の、レーン4はヒトIgG2とαZ34C 7Kの反応物の、レーン5はヒトIgG3の、レーン6はヒトIgG3とαZ34C 7Kの反応物の、レーン7はヒトIgG4の、レーン8はヒトIgG4とαZ34C 7Kの反応物のSDS-PAGEの結果を示す。図4Bにおけるレーン1～8は図4Aのレーン1～8に対応する。図4Cにおいて、レーン1はマウスIgG1の、レーン2はマウスIgG1とαZ34C 7Kの反応物の、レーン3はマウスIgG2bの、レーン4はマウスIgG2bとαZ34C 7Kの反応物の、レーン5はマウスIgG3の、レーン6はマウスIgG3とαZ34C 7Kの反応物のSDS-PAGEの結果を示す。図4Dにおいて、レーン1はウサギIgGの、レーン2はウサギIgGとαZ34C 7Kの反応物の、レーン3はラットIgG1の、レーン4はラットIgG1とαZ34C 7Kの反応物の、レーン5はラットIgG2bの、レーン6はラットIgG2bとαZ34C 7Kの反応物の、レーン7はラットIgG2cの、レーン8はラットIgG2cとαZ34C 7Kの反応物のSDS-PAGEの結果を示す。 図5は、SG化εZ34C 7Kペプチドと、ヒトIgG、マウスIgG、並びにウサギ及びラットIgGとの反応物のSDS-PAGEの結果（それぞれA、B、C）を示す。図5Aにおいて、レーン1はヒトIgG1（Trastuzumab）の、レーン2はヒトIgG1とεZ34C 7Kの反応物の、レーン3はヒトIgG2の、レーン4はヒトIgG2とεZ34C 7Kの反応物の、レーン5はヒトIgG3の、レーン6はヒトIgG3とεZ34C 7Kの反応物の、レーン7はヒトIgG4の、レーン8はヒトIgG4とεZ34C 7Kの反応物のSDS-PAGEの結果を示す。図5Bにおいて、レーン1はマウスIgG1の、レーン2はマウスIgG1とεZ34C 7Kの反応物の、レーン3はマウスIgG2bの、レーン4はマウスIgG2bとεZ34C 7Kの反応物の、レーン5はマウスIgG3の、レーン6はマウスIgG3とεZ34C 7Kの反応物のSDS-PAGEの結果を示す。図5Cにおいて、レーン1はウサギIgGの、レーン2はウサギIgGとεZ34C 7Kの反応物の、レーン3はラットIgG1の、レーン4はラットIgG1とεZ34C 7Kの反応物の、レーン5はラットIgG2bの、レーン6はラットIgG2bとεZ34C 7Kの反応物の、レーン7はラットIgG2cの、レーン8はラットIgG2cとεZ34C 7Kの反応物のSDS-PAGEの結果を示す。 図6は、αZ34C 7K、εZ34C 7Kを用いて修飾したマウスIgG1、2b、及びヒトIgG3（いずれも抗原はニワトリ卵白リゾチーム）、並びにTrastuzumab（抗HER2ヒトIgG1抗体）のニワトリ卵白リゾチームに対するELISAによる結合活性評価を示す。 図7は、各種SG化ポリペプチドの、IgG1との反応の10分、30分、1時間、及び3時間後のサンプルのSDS-PAGEの結果、及びその結果から推定されるIgG1の修飾効率を示す。 図8は、SG化ペプチド試薬（Z34C 26 28R、αZ34C、及びεZ34Cの3種のペプチド試薬）の、pH7.4における各種抗体との反応後のサンプルのSDS-PAGEの結果、及びその結果から推定される各種抗体の修飾効率を示す。
＜IgG結合ペプチド＞
　本明細書中で使用する「IgG」は、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット、マウス、及びウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物のIgG、好ましくはヒト、マウス、ラット、又はウサギ、さらに好ましくはラット又はマウスのIgGを指すものとする。IgGのサブクラスは限定しないが、例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4（好ましくはヒトIgG1、IgG2、又はIgG4）、マウスIgG1、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3（好ましくはマウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3）、ラットIgG1、ラットIgG2a、ラットIgG2b、ラットIgG3（好ましくはラットIgG1又はラットIgG2c）、及びウサギIgGが挙げられる。
　一態様において、本発明は、（Xaa1）NMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNA（Xaa2）I（Xaa3）SIRDDC（配列番号1）、若しくは（Xaa4）FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNA（Xaa2）I（Xaa3）SIRDDC（配列番号2）のアミノ酸配列、又は配列番号1若しくは2のアミノ酸配列において、Xaa1～Xaa4以外の位置で1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含む、ペプチドに関する。本発明のペプチドは好ましくはＩｇＧ結合ペプチド、又はＩｇＧ結合用ペプチドである。配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列は、プロテインAのIgG結合ドメイン（B-ドメイン）を最小化し、変異等を行うことによって親和性を最適化したZ34Cペプチド（Braisted AC. and Wells JA., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, pp. 5688-5692, 1996）をXaa1～Xaa4について変異させたものであり得る。
　上記アミノ酸配列において、Xaa1は、リシン残基、オルニチン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸残基、及びジアミノプロピオン酸残基、好ましくはリシン残基、オルニチン残基、システイン残基、及びジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択され、さらに好ましくはリシン残基である。また、上記アミノ酸配列において、Xaa2及びXaa3は、それぞれ独立に、アルギニン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、チロシン残基、及びシステイン残基、好ましくはアルギニン残基、ヒスチジン残基、及びグルタミン酸残基からなる群から選択され、さらに好ましくはアルギニン残基である。一実施形態において、Xaa2及びXaa3は、以下で記載する架橋剤に対して反応性を有さない。また、上記アミノ酸配列において、Xaa4は、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、リシン残基、オルニチン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、βアラニン残基、2-アミノスベリン酸残基、ジアミノプロピオン酸残基、及びNH2-(PEG)n-CO(n=1～50、1～20、1～10、好ましくはn=1～7)からなる群から選択されるか、又は存在しない。Xaa4は、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、βアラニン残基、及びNH2-(PEG)n-CO(n=1～50)からなる群から選択されるか、又は存在せず、さらに好ましくはグリシン残基であるか、又は存在しない。
　配列番号1のアミノ酸配列の具体例として、KNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号4）のアミノ酸配列が挙げられ、配列番号2のアミノ酸配列の具体例として、GFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号7）のアミノ酸配列が挙げられる。また、配列番号1のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列の具体例として、配列番号4のアミノ酸配列の7位のアルギニン残基がリシン残基に置換されたKNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号6）のアミノ酸配列が挙げられ、配列番号2のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列の具体例として、配列番号7のアミノ酸配列の8位のアルギニン残基がリシン残基に置換されたGFNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号5）のアミノ酸配列が挙げられる。
　本明細書において、配列番号1若しくは2のアミノ酸配列において付加、欠失、及び／又は置換がなされ得る「１若しくは数個」の範囲は、例えば1から5個、1から4個、好ましくは1から3個、1から2個、さらに好ましくは1個である。
　配列番号1又は配列番号2のアミノ酸に対して付加又は置換がなされる場合、付加又は置換により挿入されるアミノ酸はシステイン残基でないことが好ましい。また、付加又は置換により挿入されるアミノ酸がリシン残基である場合、リシン残基のεアミノ基は修飾され、以下で記載する架橋剤に対して反応性を有さないことが好ましい。また、配列番号1又は配列番号2のアミノ酸に対して欠失又は置換がなされる場合、欠失又は置換されるアミノ酸はシステイン残基でないことが好ましい。
　配列番号1又は2のアミノ酸配列に対する付加、欠失、及び／又は置換は、ペプチドのIgGとの結合に大きな影響を与えないようなアミノ酸について行うことができる。そのようなアミノ酸に対する付加、欠失、及び／又は置換の例として、配列番号1のアミノ酸配列の7位のアルギニン残基、及び配列番号2のアミノ酸配列の8位のアルギニン残基の欠失又は置換、及び配列番号1又は配列番号2のC末端へのリシン残基の付加が挙げられる。置換に適したアミノ酸は、側鎖の性質を考慮して、例えば保存的アミノ酸置換に基づいて、適宜定めることができる。
　配列番号1又は2のアミノ酸配列の例として、限定するものではないが、FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号9）、GFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号7）、KNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号4）、GFNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号5）、KNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号6）、FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD（配列番号10）、又はGKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号11）のアミノ酸配列が挙げられる。
　配列番号1又は2のアミノ酸配列の2つのシステイン残基、すなわち配列番号1の5位のシステイン残基と34位のシステイン残基、及び配列番号2の6位のシステイン残基と35位のシステイン残基は、ジスルフィド結合又はリンカーを介して連結されて、環状ペプチドを形成することができる。好ましくは、配列番号1又は2のアミノ酸配列において、2つのシステイン残基はジスルフィド結合している。配列番号1又は2のアミノ酸配列の2つのシステイン残基が、リンカーにより連結される場合、リンカーの種類は特に限定しないが、例えば、
以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 からなる群から選択される式で表されるリンカーが挙げられる。リンカーは、好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 で表されるリンカー、さらに好ましくは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 で表されるリンカーである。
　上記IgG結合ペプチドにおけるリンカー中のRは、置換された又は置換されていないアルキル、好ましくは置換された又は置換されていないC1～C6アルキル、即ちメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、又はヘキシル基である。Rの置換基は特に限定しないが、例えば、ヒドロキシ基、（モノ若しくはポリ）エチレンオキシド基、カルボキシル基、アルコキシ基、アシル基、アルキル基、アミド基、エステル基、ハロゲン基（F、Cl、Br、又はI）、又はこれらの組み合わせであってよい。また、式中の波線部分は、スルフィド基との結合部分を意味する。当該リンカーは、通常のジスルフィド結合よりも、安定性、例えばアルカリ耐性又は還元反応等耐性、好ましくはアルカリ耐性に優れる。
　上記リンカーを有するペプチドを調製する方法は特に限定しない。例えば、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で表されるリンカーを有するペプチドは、例えば以下の方法：
　システイン残基を2つ含むペプチドと、上記リンカーの波線部分に架橋反応に関与する反応性の官能基（例えば、ハロゲン基、イミダゾール基等）を有する化合物を、例えば酸性条件下で混合する工程を含む方法により得ることができる。
　さらに、上記カルボニル基を有するペプチドを、一級アミン（RNH2）と反応させることにより、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 で表されるリンカーにより連結されたペプチドを得ることができる（Rは上記と同じ意味である）。
　前記化合物において、ハロゲン基は、好ましくはF、Cl、Br、及びI、さらに好ましくはCl、Br、及びIからなる群から選択される。ハロゲン基は好ましくは同一であり、さらに好ましくは、ハロゲン基はいずれもClである。
　上記の通り、配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドにおいて、Xaa1は、リシン残基、オルニチン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基等のタンパク質構成アミノ酸、並びにジアミノプロピオン酸残基及び2-アミノスベリン酸残基等の非タンパク質構成アミノ酸のいずれであってもよく、好ましくはリシン残基、オルニチン残基、システイン残基、又はジアミノプロピオン酸残基、さらに好ましくはリシン残基である。Xaa1は、後述する架橋剤によって修飾可能であることが好ましい。本明細書において「非タンパク質構成アミノ酸」とは、生体においてタンパク質を構成するのに用いられないアミノ酸を指す。本発明のペプチドを架橋剤によって修飾する際の部位特異性を高めるため、配列番号1のアミノ酸配列中のXaa1のαアミノ基はアセチル基又はプロピニル基等のアシル基（本明細書において、「アシル基」は、一般式：R-CO-で表され、式中、Rは炭化水素、好ましくは炭素数1～6のアルキル基である）、又はアミノ基等で修飾されていることが好ましい。また、本発明のペプチドを架橋剤によって修飾する際の部位特異性を高めるため、本発明のペプチドは、その配列中にXaa1と同じアミノ酸残基を、全く有さないか、ほとんど有さない（例えば、1個又は2個しか有さない）ことが好ましく、Xaa1と同じアミノ酸残基を有する場合にはそのアミノ酸残基が架橋剤が反応しないように修飾されていることが好ましい。この場合、Xaa1と同じアミノ酸残基の修飾は、限定するものではないが、例えば以下で詳細に記載する標識物質又は薬剤の連結であってよい。例えば、Xaa1がリシン残基である場合には、本発明のペプチドは、その配列中にXaa1以外の場所にリシン残基を全く有さないか、ほとんど有さないことが好ましく、リシン残基を有する場合にはリシン残基のεアミノ基が修飾されていることが好ましい。
　また、上記の通り、配列番号2のアミノ酸配列を有するペプチドにおいて、Xaa4は、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、リシン残基、オルニチン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、及びグルタミン酸残基等のタンパク質構成アミノ酸、βアラニン残基、2-アミノスベリン酸残基、ジアミノプロピオン酸残基、及びNH2-(PEG)n-CO(n=1～50、1～20、1～10、好ましくはn=1～7)等の非タンパク質構成アミノ酸のいずれであってもよく、又は存在しなくてもよい。Xaa4は、好ましくはグリシン残基、アラニン残基、βアラニン残基、又はNH2-(PEG)n-CO(n=1～50、1～20、1～10、好ましくはn=1～7)さらに好ましくはグリシン残基であるか、存在しない。Xaa4、又はXaa4が存在しない場合には1位のフェニルアラニン等のN末端アミノ酸は、後述する架橋剤によって修飾可能であることが好ましい。本発明のペプチドを架橋剤によって修飾する際の部位特異性を高めるため、配列番号2のアミノ酸配列中のXaa4（又はXaa4が存在しない場合には1位のフェニルアラニン等のN末端アミノ酸）のαアミノ基は非修飾であり、このαアミノ基が架橋剤によって修飾されることが好ましい。また、本発明のペプチドを架橋剤によって修飾する際の部位特異性を高めるため、配列番号2のアミノ酸配列は、架橋剤によって修飾され得るアミノ酸を、全く有さないか、ほとんど有さない（例えば、1個又は2個しか有さない）ことが好ましく、架橋剤によって修飾され得るアミノ酸を有する場合にはそのアミノ酸残基が架橋剤が反応しないように修飾されていることが好ましい。この場合、アミノ酸の修飾は、限定するものではないが、例えば以下で詳細に記載する標識物質又は薬剤の連結であってよい。例えば、配列番号2のアミノ酸配列は、リシン残基を全く有さないか、ほとんど有さない（例えば、1個又は2個しか有さない）ことが好ましく、リシン残基を有する場合にはリシン残基のεアミノ基が修飾されていることが好ましい。
　また、本明細書に記載のIgG結合ペプチドは、その安定性の向上等のため、例えば、N末端のアシル化（例えばアセチル化）、アミノ化、及び／又はPEG化（ポリエチレングリコール付加）、及びC末端のアミド化等により修飾されていても良い。PEG化を行う場合のPEGの分子数は特に限定されず、例えば、1～50分子、1～20分子、2～10分子、2～6分子、又は4分子のPEGを付加することができる。
　本発明のペプチドは、IgGとの結合親和性が、他の免疫グロブリン（例えば、IgA、IgE、IgM）と比較して例えば約10倍以上、好ましくは約50倍以上、より好ましくは約200倍以上高い。本発明のペプチドとヒトIgGとの結合に関する解離定数(Kd)は、表面プラズモン共鳴スペクトル解析（例えばBIACOREシステム使用）により決定可能であり、例えば1×10-1M～1×10-3M未満、好ましくは1×10-4M未満、より好ましくは1×10-5M未満である。
　本発明のIgG結合ペプチドは、IgGのFcドメインに結合する。本発明のIgG結合ペプチドは、後述する実施例において示す通り、上記Xaa1又はXaa4において、IgG Fcの特定の領域、すなわち、ヒトIgG FcにおけるEu numberingに従うLys248（以下、本明細書では単に「Lys248」とも表記し、ヒトIgG CH2（配列番号8）の18番目のアミノ酸残基に相当する）と近接し得る。
　本発明のペプチドは、慣用の液相合成法、固相合成法等のペプチド合成法、自動ペプチド合成機によるペプチド合成等（Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. eds., Plenum Press NY. (1990) Vol.12, p.1-19;Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) W.H. Freeman Co.; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: p.5132、「新生化学実験講座１ タンパク質IV」（1992）日本生化学会編，東京化学同人）によって製造することができる。あるいは、本発明のペプチドをコードする核酸を用いた遺伝子組換え法やファージディスプレイ法等によって、ペプチドを製造してもよい。例えば本発明のペプチドのアミノ酸配列をコードするDNAを発現ベクター中に組み込み、宿主細胞中に導入し培養することにより、目的のペプチドを製造することができる。製造されたペプチドは、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、及び免疫吸着法等により、回収又は精製することができる。
　ペプチド合成では、例えば、各アミノ酸（天然であるか非天然であるかを問わない）の、結合しようとするα－アミノ基とα－カルボキシル基以外の官能基を保護したアミノ酸類を用意し、それぞれのアミノ酸のα－アミノ基とα－カルボキシル基との間でペプチド結合形成反応を行う。通常、ペプチドのC末端に位置するアミノ酸残基のカルボキシル基を適当なスペーサー又はリンカーを介して固相に結合しておく。このようにして得られたジペプチドのアミノ末端の保護基を選択的に除去し、次のアミノ酸のα－カルボキシル基との間でペプチド結合を形成する。このような操作を連続して行い側基が保護されたペプチドを製造し、最後に、すべての保護基を除去し、固相から分離する。保護基の種類や保護方法、ペプチド結合法の詳細は、上記の文献に詳しく記載されている。
　遺伝子組換え法による製造は、例えば、本発明のペプチドをコードするDNAを適当な発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞にベクターを導入し、細胞を培養し、細胞内から又は細胞外液から目的のペプチドを回収することを含む方法によりなされ得る。ベクターは、限定されないが、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、及びウイルス等のベクターである。
　プラスミドベクターとしては、限定するものではないが、大腸菌由来のプラスミド（例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等）、及び酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YCp50等）等が挙げられる。
　ファージベクターとしては、限定するものではないが、T7ファージディスプレイベクター（T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen））、及びλファージベクター（Charon4A、 Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等）が挙げられる。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、及びセンダイウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルス等が挙げられる。コスミドベクターとしては、限定するものではないが、Lorist 6、Charomid9-20、及びCharomid9-42等が挙げられる。
　ファージミドベクターとしては、限定するものではないが、例えばpSKAN、pBluescript、pBK、及びpComb3H等が知られている。ベクターには、目的のDNAが発現可能なように調節配列や、目的DNAを含むベクターを選別するための選択マーカー、目的DNAを挿入するためのマルチクローニングサイト等が含まれ得る。そのような調節配列には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、S-D配列又はリボソーム結合部位、複製開始点、及びポリAサイト等が含まれる。また、選択マーカーには、例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、等が用いられ得る。ベクターを導入するための宿主細胞は、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、及び植物細胞等であり、これらの細胞への形質転換又はトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、及びPEG法等を含む。形質転換細胞の培養は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物の培養液は、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する。
　本発明のペプチドの回収を容易にするために、発現によって生成したペプチドを細胞外に分泌させることが好ましい。これは、その細胞からのペプチドの分泌を可能にするペプチド配列をコードするDNAを、目的ペプチドをコードするDNAの5'末端側に結合することにより行うことができる。細胞膜に移行した融合ペプチドがシグナルペプチダーゼによって切断されて、目的のペプチドが培地に分泌放出される。あるいは、細胞内に蓄積された目的ペプチドを回収することもできる。この場合、細胞を物理的又は化学的に破壊し、タンパク質精製技術を使用して目的ペプチドを回収する。
　本発明のIgG結合ペプチドと他のタンパク質を融合させる場合、IgG結合ペプチドと他のタンパク質を別々に調製した後に、必要に応じてリンカーを用いてIgG結合ペプチドとタンパク質を融合させても良いし、遺伝子組換え法によって、必要に応じて適当なリンカーを加えて融合タンパク質として作製してもよい。この場合、本発明のIgG結合ペプチドがIgGとの結合性を損なわないように融合タンパク質を作製することが好ましい。
＜修飾されたIgG結合ペプチド＞
　一態様において、本発明における上記IgG結合ペプチドは、架橋剤により修飾されていることが好ましい。
　上記の通り、本発明のIgG結合ペプチドは、後述する実施例において示す通り、上記Xaa1又はXaa4において、IgG Fcの特定の領域、すなわち、ヒトIgG FcにおけるEu numberingに従うLys248と近接し得る。したがって、本発明のIgG結合ペプチドのXaa1又はXaa4（又はXaa4が存在しない場合には1位のフェニルアラニン等のN末端アミノ酸）を架橋剤で修飾し、IgGと架橋反応させることによって、IgG結合ペプチドのXaa1又はXaa4（又はXaa4が存在しない場合にはN末端アミノ酸）とIgG FcのLys248の間で部位特異的に架橋構造を形成させ得る。したがって、本発明のIgG結合ペプチドを種々の化合物で修飾し、Xaa1又はXaa4（又はXaa4が存在しない場合にはN末端アミノ酸）を架橋剤で修飾し、これをIgGと架橋反応させることによって、種々の化合物を特異的かつ簡便にIgGに導入することができる。また、本発明によれば、IgG結合ペプチドを介して化合物を導入することができるため、様々な構造の化合物を副反応なくIgGに導入し得る。さらに本発明の方法は、得られる産物の収率が高く、また、抗体そのもの改変を伴わないため、抗体の機能を低下させる可能性が低いという利点も有する。
　本発明のIgG結合ペプチドは、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物、例えばラット、マウス、及びウサギのIgGに対して用いることもできる。この場合、本発明のIgG結合ペプチドが結合するIgG中の部位は、本明細書を読んだ当業者であれば、例えばヒトIgGの配列と他の動物のIgGの配列をアライメントすることにより、容易に特定することができる。
　本発明において、「架橋剤」とは、本発明のIgG結合ペプチドと、IgG Fcを、共有結合により連結させるための化学物質である。本発明の架橋剤は、当業者であれば適宜選択することが可能であり、所望のアミノ酸、例えば、Xaa1であれば、リシン残基、オルニチン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸残基、又はジアミノプロピオン酸残基等、Xaa4であればグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、リシン残基、オルニチン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、βアラニン残基、2-アミノスベリン酸残基、ジアミノプロピオン酸残基、及びNH2-(PEG)n-CO(n=1～50、1～20、1～10、好ましくはn=1-7)と結合可能な部位を少なくとも2箇有する化合物とすることができる。その例として、限定するものではないが、DSG（disuccinimidyl glutarate、ジスクシンイミジルグルタレート）、DSS（disuccinimidyl suberate、ジスクシンイミジルスベレート）等のスクシンイミジル基を好ましくは2以上含む架橋剤、DMA（dimethyl adipimidate・2HCl、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMP（dimethyl pimelimidate・2HCl、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、及びDMS（dimethyl suberimidate・2HCl、スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）等のイミド酸部分を好ましくは2以上含む架橋剤、並びにDTBP（dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate・2HCl、3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）及びDSP（dithiobis（succinimidyl propionate）、ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）等のSS結合を有する架橋剤が挙げられる。
　本発明のIgG結合ペプチドは、他の機能性リガンド、例えば、標識物質及び／又は他の薬剤（例えばIgA又はVHH等の抗体）により修飾されていてもよい。一実施形態において、本発明のIgG結合ペプチドは、配列番号1の7位のアルギニン残基若しくは配列番号2の8位のアルギニン残基がリシン残基に置換されているか、配列番号1若しくは配列番号2のC末端にリシン残基をさらに含み、この置換リシン残基又はC末端のリシン残基に機能性リガンド、例えば、標識物質及び／又は他の薬剤が連結している。標識物質及び／又は他の薬剤は、直接IgG結合ペプチドに連結してもよいし、PEG（ポリエチレングリコール）等の分子を付して連結してもよい。PEGを付す場合のPEGの分子数は特に限定されず、例えば、1～50分子、1～20分子、2～10分子、2～6分子、又は4分子のPEGを付加することができる。
　IgG結合ペプチドと他の機能性物質の連結は、当業者に公知の方法、例えばアジド基とdibenzocyclooctyneとの反応、又はマレイミド基とスルフヒドリル基の反応等により行うことができる。標識物質により標識されている場合、本発明のIgG結合ペプチドがIgGと複合体を形成することで、該標識物質を介してIgGの検出又は定量を行うことが可能となる。標識物質は、限定されないが、例えば蛍光色素、化学発光色素、放射性同位元素（例えば、放射性ヨウ素又は放射性同位体金属イオンのキレート錯体、例えばDOTA又はデスフェリオキサミンのキレート錯体）、並びにビオチン及びGFP（緑色蛍光タンパク質）等の蛍光タンパク質、発光タンパク質、並びにペルオキシダーゼ等の酵素を含み、好ましい標識物質の例は、フルオレセイン及びFITC等のフルオレセイン誘導体、ローダミン及びテトラメチルローダミン等のローダミン誘導体、並びにテキサスレッド等の蛍光色素である。本発明のペプチドを他の薬剤によって修飾する場合、薬剤として、限定するものではないが、例えば、オーリスタチンE等のオーリスタチン、メイタンシン、エムタンシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、又はこれらの誘導体等の抗がん剤；並びに、血液脳関門上のレセプターに結合して中枢神経への移行を可能とする薬剤、又はがん細胞等に結合して抗体の細胞内への移行を可能にする薬剤等の標的化剤が挙げられる。薬剤を連結している場合、本発明のIgG結合ペプチドは、例えば医薬抗体として用いられるIgGと複合体を形成することで、疾患の治療効果を高めることができる。
　本発明の架橋剤により修飾されたIgG結合ペプチドは、例えば上記＜IgG結合ペプチド＞の項目で記載した方法に従って得られたIgG結合ペプチドを架橋剤と反応させることにより製造することができる。この場合、IgG結合ペプチド中の上記Xaa1又はXaa4のアミノ酸残基の側鎖を特異的に修飾することが必要であり、これは、例えば、Xaa1又はXaa4の種類と架橋剤の組み合わせを選択することによりなされ得る。例えば、DSS又はDSG等のスクシンイミジル基を含む架橋剤は、リシン残基の側鎖のアミン（εアミノ基）及びポリペプチドのN末端に存在する一級アミン（αアミノ基）と反応するため、IgG結合ペプチドのN末端をブロッキングした上でDSS又はDSGと反応させることで、リシン残基の側鎖のみをDSS又はDSGで特異的に修飾することができる。このようなアミノ酸残基と架橋剤の組み合わせは、当業者であれば適宜選択することができる。また、DSS又はDSGを用いる場合は、リシン残基を含まないようなペプチドにおいて、ポリペプチドのN末端に存在する一級アミン（αアミノ基）を非修飾とすることで、αアミノ基を特異的に修飾することもできる。
　本発明の架橋剤により修飾されたIgG結合ペプチドは、例えば、架橋剤により修飾されたアミノ酸残基を用いてペプチド合成を行うことによって製造することもできる。同様に、IgG結合ペプチドを標識物質及び／又は他の薬剤で修飾する場合には、これらの修飾を加えたアミノ酸残基を用いてペプチド合成することにより標識物質及び／又は他の薬剤で修飾されたIgG結合ペプチドを調製してもよい。
＜架橋反応＞
　一態様において、本発明は、本発明の架橋剤で修飾されているIgG結合ペプチドとIgGを混合する工程を含む、IgG結合ペプチドとIgGの複合体を生産する方法に関する。本工程により、架橋剤で修飾されているIgG結合ペプチドとIgGの間で架橋反応が生じ得る。架橋反応は、特にIgG結合ペプチドの上記Xaa1又はXaa4のアミノ酸残基とIgG FcのLys248の間で部位特異的に生じ得る。
　該混合工程の条件は、本発明のIgG結合ペプチドとIgGの間で架橋反応が生じる条件で行うものであれば特に限定しない。例えば、本発明のIgG結合ペプチドとIgGを、適当なバッファー中において、室温（例えば約15℃～30℃）で混合することにより反応を行うことができる。該混合工程は、必要に応じて架橋反応を促進する触媒を適量加えて行ってもよい。
　IgG結合ペプチドとIgGの結合性を高めるため、反応条件を調整してもよい。例えば、Z34Cペプチドの由来となるプロテインAは、pHが8以上の条件でヒトIgG3との結合性が増すことが知られており、またNaCl等の塩濃度を高めることによってマウスIgG1との結合性が増すことが知られている。このような知見を参照して、本発明の架橋反応の条件を設定することができる。
　IgG結合ペプチドとIgGの反応条件は、IgG結合ペプチド及びIgGの種類などを考慮して適宜定めることができ、限定しないが、pH4.5～6.5（例えばpH5.0～6.0、pH5.2～5.8、pH5.4～5.6、又はpH約5.5）、又はpH6.5～8.5（例えばpH6.9～7.9、pH7.2～7.7、pH7.3～7.5、又はpH約7.4）であってよい。
　該混合工程における本発明のIgG結合ペプチドとIgGの混合比率は、特に限定しない。本発明のIgG結合ペプチドとIgGのモル比率は、例えば1：1～20：1、好ましくは2：1～20：1又は5：1～10：1とすることができる。
　該混合工程における混合時間（反応時間）は、本発明のIgG結合ペプチドとIgGの間で架橋反応が生じる限り限定するものではないが、例えば、1分～5時間、好ましくは10分～2時間又は15分～1時間とすることができる。
　本発明のIgG結合ペプチドとIgGの複合体を生産する方法は、必要に応じて、上記工程を行った後の混合物から、不純物、例えば、未反応のIgG結合ペプチド、IgG、及び試薬等を分離し、該複合体を精製する工程をさらに含んでよい。該工程は、本分野で公知の方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、及びHPLC等のクロマトグラフィー等により行うことができる。
＜複合体＞
　一態様において、本発明は、本発明のIgG結合ペプチドとIgGとの架橋複合体に関する。該複合体は、上記架橋反応によって形成され得る。よって、本発明は、好ましくは、IgG結合ペプチドの上記Xaa1又はXaa4のアミノ酸残基とIgG FcのLys248との間が部位特異的に架橋剤を介して結合したIgG結合ペプチドとIgGとの複合体に関する。
　本発明の複合体は、部位特異的な架橋反応によって形成されることから、該架橋反応が、IgGの活性に負の影響を与える可能性が少ない。また、修飾したIgG結合ペプチドをIgGに連結することによって、IgGに新たな機能性を付加することができる。例えば、標識物質により修飾したIgG結合ペプチドをIgGに結合させれば、該標識物質を介してIgGの検出又は定量を行うことが可能となる。標識物質の例は、上記の通りであるからここでは記載を省略する。また、例えば、薬剤により修飾したIgG結合ペプチドを、医薬抗体であるIgGに結合させれば、IgGの疾患の治療効果を高めることができる。薬剤の例は、上記の通りであるからここでは記載を省略する。
＜医薬組成物又は診断剤＞
　一態様において、本発明は上記IgG結合ペプチド、上記架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチド、又は上記架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチドとIgGの複合体を含む医薬組成物又は診断剤に関する。医薬組成物に含まれる場合、IgG結合ペプチドは、例えば上記の薬剤により修飾されていることが好ましく、診断剤に含まれる場合、IgG結合ペプチドは、例えば上記の標識物質により修飾されていることが好ましい。
　本発明の医薬組成物及び診断剤の対象となる疾患として、限定するものではないが、例えば、抗体により標的化可能な疾患又は障害、好ましくは、がん、炎症性疾患、感染症、及び神経変性疾患が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、腹腔内投与、直腸投与、又は経粘膜投与等）で、投与することができる。また、本発明の医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とすることができる。具体的には顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、静脈注射、動脈注射、若しくは筋肉注射用の注射剤、点滴剤、外用剤、又は坐剤等の各種製剤形態に調製することができる。投与方法及び剤型は、患者の性別、年齢、体重、症状等により、当業者であれば適宜選択することができる。
　本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,米国を参照されたい）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
　本発明の医薬組成物に含まれ得る担体及び医薬添加物の例としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、及び医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
　実際の添加物は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明のIgG結合タンパク質又はIgG結合タンパク質とIgGの複合体を溶液、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに容器吸着防止剤、例えばTween 80、Tween 20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解して再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のため安定化剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコール及び／又は糖類を使用することができる。
　本発明の医薬組成物の有効投与量及び投与間隔は、患者の性別、年齢、体重、及び症状等に応じて適宜選択することができる。
　本発明の医薬組成物を投与する時期は、上記疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず、予防的投与であっても治療的投与であってもよい。
（材料と方法）
抗体
　Trasutumab（Human IgG1）は中外製薬より、Human IgG2 kappa Isotype Control、Human IgG3 kappa Isotype Control、Human IgG4 kappa Isotype Control、Mouse IgG1 kappa Isotype Control、Mouse IgG2b kappa Isotype Control、Mouse IgG3 kappa Isotype Controlは、Crown Bioscience社より購入した。また、Rabbit IgG Isotype ControlはThermo fisherより、Rat IgG1 Isotype Control, Rat IgG2b Isotype Controlは、R&D Systems社より、Rat IgG2c Isotype Control Antibodyは、LifeSpan BioSciencesより、それぞれ入手した。各抗体は、パウダーを、0.5M NaClで2.0mg/mLに希釈し、使用まで、凍結して保存した。
Z34Cペプチド変異体の調製
　Z34Cペプチド変異体は、F-moc法による固相合成により調製した。合成後のZ34C誘導ペプチド5.5mg(1.29μmol)を、10μLのジメチルスルホキシド(DMSO)(Wako)に溶解させ、これに190μLの0.1M NaHCO3水溶液を加え、室温で一晩放置し、分子内SS結合を形成させた。その後、サンプルを0.1%TFAを含む１％アセトニトリル3mLに希釈し、全量を分取用クロマトグラフLC-forte/R(YMC)にアプライした。0.1%TFAを含む10－60%アセトニトリル／水のグラジエントで溶出を行い、その後、有機溶媒を減圧下で除去後、凍結乾燥した。
生成物同定のためのLC-MSによる分子量解析
　反応生成物の構造確認は、反応液0.1μLを4000倍に0.1%ギ酸水溶液で希釈し、そのうち18μLを、kinetex（登録商標）LCカラム（1.7μm、EVO C18 100オングストローム、Phenomenex）を接続したLCMS-8030（Shimadzu）上にアプライした。流速は0.2mL/minにて0.1%ギ酸を含む10－50%アセトニトリル／水のグラジエント溶出を行い、得られたピークの質量を解析することにより確認した。
分子構造モデリング
　Z34C変異体のモデリング並びに修飾部位のデザインは、分子構造計算ソフトウェアMOE(The Molecular Operating Environment、CCG)を用いて行った。ヒトIgG1-FcとZ34Cペプチドの結晶構造（PDB ID :1OQO）をベースに、ペプチド上の変異部位の探索を行い、モデリングはProtein Builderのツールを用いて行った。
Z34Cペプチド変異体のDSGによる修飾
　Z34Cペプチド変異体のN末αアミノ基もしくはLysのεアミノ基のDSG（N,N’-Disuccimidyl glutarate）による修飾は、以下の方法で行った。1-2mgのペプチドを40μLのDMSOに溶解後、0.1％ピリジンを加え、アセトニトリルに溶解した500mMのDSGを20μL加え、50℃にて4.5時間反応した。反応物は、0.1%TFAを含む１％アセトニトリル3mLに希釈し、全量を分取用クロマトグラフLC-forte/R(YMC)にアプライした。0.1%TFAを含む10－60%アセトニトリル/水のグラジエントで溶出を行い、その後、有機溶媒を減圧下で除去後、凍結乾燥し、サクシイミジルグルタル（SG）化したZ34Cペプチド変異体を得た。
ペプチドの親和性解析
　Z34Cペプチド変異体親和性解析は、25℃にてBIAcore T-200（GE-Healthcare）上にて行った。すなわち、CM5センサーチップ上に、Trastuzumab（ヒトIgG1抗体）又はその他の抗体を、アミンカップリングのプロトコールに従い、RU値で約2000程度固定化した。HBS-EP緩衝液中、流速50μL/minの条件で、アナライトとして1μMから0.015μMまで計7点の異なる濃度のペプチドをインジェクトすることでセンサーグラム（会合時間: 180 sec、解離時間: 600sec）を得、付属のBIA evaluation softwareを用いて、平衡値解析から解離定数（Kd）を算出した。
SG化Z34C変異体ペプチド試薬による抗体の標識とSDS-PAGEによる標識の確認
　10mM酢酸緩衝液（pH.5.5）14μLに溶解した各種抗体3.0μg(0.2nmol)に、DMSOに1.5mMになるように溶解したSG化Z34Cペプチド変異体ペプチドを1.33μL（10倍モル等量、2nmol）加え、室温で30分静置した。このサンプル14.4μLに2-メルカプトエタノール0.6μL(Wako)およびSDS-PAGEサンプルバッファー（4×）5μLを加え、全量で20μL（3% 2-メルカプトエタノール）とした。95℃にて10分間加熱して還元後、Super Sep TM Ace（5-20%、13well、Wako 197-15011)にて、200V,20mAで約90分間電気泳動を行った。得られたゲルの蛋白質は、CBB(Coomassie Brilliant Blue)染色を行い、検出した。
ELISA
　マウスIgG1、IgG2b、及びヒトIgG3（いずれもニワトリ卵白リゾチームを抗原として認識）、並びに抗HER2抗体であるTrastuzumab（ヒトIgG1）を10mM酢酸緩衝液（pH5.5）中に溶解し（最終濃度2.5μM）、DMSOに溶解したペプチド試薬αZ34C 7K、εZ34C 7Kを10倍等量加え、室温にて30分反応させた。1/10体積の1M Tris-HCl(pH8.0)を加え反応を停止させ、0.5％BSAを含むPBSにて5000倍に希釈後、ELISAに使用した。抗原であるリゾチームをPBSにて200μg/L、100μg/L、50μg/Lとなるように希釈し、各ウェルをコートした（2時間）。次に、0.5％BSAを含むPBS溶液でブロックし、洗浄後、各ウェルに、希釈した抗体溶液50μLを加え、１時間反応させた。洗浄後、ウェルに0.5％BSAを含むPBS溶液で5000倍に希釈したSA-HRP（Vector）を加え、反応後、洗浄し、TMB試薬を加え発色させた。
（結果）
＜実施例１：Z34Cペプチドをベースにした置換ペプチドの調製＞
　ヒトIgG1-FcとZ34CペプチドのX線結晶構造（PDB ID:1OQO、10）をベースに、ヒトIgG1-Fc中のLys248と近位のZ34Cペプチド上のアミノ酸残基を探したところ、N末端のフェニルアラニンの側鎖が、IgG1-Fc中のLys248と最も接近していることが分かった（図2A）。次に、Z34CペプチドのN末端のフェニルアラニンをリシンに置換し、FcのLys248と置換したZ34CペプチドのLys1のεアミノ基の距離を測定したところ、最も近い距離で6.57Åまで接近できることが分かった（図2B）ため、実際にこの2つのアミノ基間の架橋が可能であるかどうか、変異ペプチドを合成し確認を試みた。
　まず、DSGとの反応にて修飾され得るアミノ基を除くため、Z34Cペプチドの26位及び28位のリシンをアルギニンに置換し、さらにSG化するために1位のフェニルアラニンをリシンに置換したεZ34C（Z34C（F1K,K26R,K28R））ペプチドを調製した。Z34Cペプチド、及びεZ34Cペプチドのアミノ酸配列を以下の表1に示す（ただし、各ペプチドのN末端とC末端はそれぞれ、アセチル化とアミド化を行った）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　εZ34Cペプチドの分子内ジスルフィド結合を形成後、BIAcore T-200（GE-Healthcare）によりヒトIgG1との親和性を評価したところ、Kd値は17（±1.9）nMであった。元のZ34CのペプチドのKd値は、20nMであるとの報告があるため、変異の影響はほとんどないことがわかった。
　次に、このペプチドをDSG（ジスクシンイミジルグルタレート）と反応させて、1位のリシンの側鎖のSG（スクシンイミジルグルタレート）化を行い、得られたSG化εZ34CペプチドとヒトIgGの各サブクラスとの反応性を評価した。具体的には、pH5.5にて約14μMに調製したIgG溶液に、10倍量のモル比で、SG化εZ34Cペプチドを反応させた後、還元状態で、SDS-PAGEを行った結果を図3に示す。
　図3に示したように、SG化εZ34CペプチドとヒトIgGの反応では、IgG1-4の軽鎖のバンドの位置は、全く変化していないのに対し、IgG1（Trastuzumab）、IgG2、及びIgG4の重鎖のバンド（約50kDa）の約半分程度に約3000程度の分子量の増加が見られた。これは、SG化εZ34Cペプチドが、少なくとも、IgG3を除くIgGの重鎖に特異的に共有結合にて付加していることを示している。
＜実施例2：Z34Cペプチドをベースにした置換ペプチドの調製2＞
　Phe1Lysの置換を行わずに、Z34CのN末端にグリシンを１つ付加した置換ペプチドαZ34Cペプチド（Z34C（-1G,K26R,K28R））を設計した。αZ34Cのモデル構造では、N末端のグリシンのαアミノ基とIgGのFc中のLys248のεアミノ基の距離は、8.0オングストロームとなり、十分に、DSG等の架橋剤で架橋できることが示唆された。
　また、αZ34C、及び実施例1で調製したεZ34Cペプチドのビオチン標識部位として、溶媒に露出し、抗体との結合部位とは反対側に側鎖が伸びている7位のアルギニンをリシンに変換し、そのεアミノ基をPEG4-biotin修飾した（それぞれ、εZ34C 7K及びαZ34C 7Kとする）。ビオチン化した2種類の標識ペプチドの構造を以下の表2に示す（ただし、Z34C及びεZ34C 7KのN末端とC末端はそれぞれ、アセチル化とアミド化を行い、αZ34C 7KペプチドはN末端の修飾は行わず、C末端のアミド化のみ行った）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　これらのペプチドを実施例1と同様の方法でSG化を行い、抗体との反応性を評価した。すなわち、αZ34C 7KペプチドはN末端のαアミノ基に、εZ34C 7KペプチドではLys1のεアミノ基にSG基を導入し、ヒト、マウス、及びラットの抗体に対する標識能をSDS-PAGEで検討した。
　図4Aに示したように、SG化αZ34C 7Kペプチドでは、図3で見た際と同様に、ヒトIgG1、2、及び4では、明らかに重鎖（約50kDaのバンド）の約半分程度に、3000程度の分子量の増加が見られた。一方で、IgG1～4の軽鎖及びIgG3の重鎖では、分子量の変化は見られなかった。この点をさらに確認するため、泳動後のゲルからタンパク質をPVDF膜に転写し、SA-HRPを使って染色したところ、ヒトIgG1,2,4において分子量が増加した重鎖のバンドのみが強く染色されたことから（図4B）、シフトしたバンドは、ビオチン化ペプチド試薬が含まれていることがわかった。一方、マウスのIgG1、2b、及び3の重鎖にも、同様なシフトが見られ（図4B）、またウサギIgGとラットIgG1とIgG2cにもシフトが見られた（図4C）ため、反応が起こっていることが分かった。一方、ラットIgG2bの重鎖にはバンドの変化は見られなかった（図4C）。
　同様に、SG化εZ34C 7Kペプチドについて、ヒト、マウス、ウサギ、及びラットIgGとの反応性を検討した。図5Aに示したように、ペプチドとの反応後、ヒトIgG1、2、及び4の重鎖は、分子量が3000ほどシフトしたバンドが得られ、IgG3は変化しなかった。この結果は、図3のSG化εZ34Cの結果とほぼ同様であることから、ビオチン化に伴う大きな影響はないと考えられた。一方、このペプチドとマウスIgGとの反応では、IgG2b、IgG3に、分子量が増大した重鎖のバンドが見られ（図5B）、ウサギならびにラットIgGとの反応では、ウサギIgG、ラットIgG2cに、分子量が増加した重鎖のバンドが見られた（図5C）。
　これらの2種類のビオチン化ペプチドの各種IgG抗体に対する反応性の違いを詳しく調べるため、反応後のSDS-PAGEの重鎖のバンド（X）とペプチドが結合した重鎖のバンド（Y）の染色ヒストグラムの面積から、修飾効率（Y/（X＋Y）×100％）を算出した結果を、表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　このようなペプチドのアミノ酸配列の違いによる各IgGとの反応性の違いは、ペプチドとIgG抗体の親和性並びに、修飾標的部位であるIgG FcのLys248近傍の構造の違いに由来すると考えられる。
＜実施例3：ビオチン化ペプチド標識抗体の各種抗体に対する親和性評価＞
　次に、使用したビオチン化ペプチド（DSG化無）と抗体との親和性を評価した。表4に、使用したペプチドと各種IgG抗体との、BIAcore T200を使った親和性解析の結果を示す。この表3の各種ペプチドによる標識効率と表4の親和性の関係をプロットしたが、抗体とペプチドの親和性と標識効率には、明確な相関は見られないように見受けられた（データ示さず）。
　これは、標識反応には、ある程度の抗体のFcとの親和性が必要だが、共有結合による架橋反応の形成のためには、おそらくLysの側鎖から伸びる架橋剤の構造、特にペプチドとFcが結合した際の末端に存在するNHS基と反応を受けるLys248のεアミノ基との位置関係といった構造的要因が重要であることが推測された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
＜実施例4：ビオチン化ペプチド標識抗体によるELISA＞
　マウスIgG1、IgG2b、及びヒトIgG3（いずれもニワトリ卵白リゾチームを抗原として認識）、並びに抗HER2抗体であるTrastuzumab（ヒトIgG1）について、αZ34C 7K、εZ34C 7Kを反応させ、ELISAを行った。結果を図6に示す。予想されたように、マウスIgG1、IgG2bは、結合反応性が高く、ヒトIgG3についても、結合活性が見られた。一方、標的抗原が異なるヒトIgG1（抗原はHER2）では、結合活性は全く見られなかった。
　このように、本ペプチドを使うと、標識抗体を抗体溶液とペプチド溶液を混合するだけで標識反応が終了し、余分な精製単離操作なしで、そのまま反応溶液をELISA等のアッセイに用いることができることが示された。
＜実施例5：各種ペプチドのIgG1に対する反応性＞
　以下のペプチドをF-moc法により合成し、pH5.5でのIgG1との反応性を評価した（ただしC末端はいずれもアミド化を行い、N末端はεZ34Cのみメトキシ化し、その他はアミノ化した）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　10mMの酢酸緩衝液（pH5.5）に溶解したTrastuzumab（ヒトIgG1抗体）99μLに、DMSOに溶解した5mMの各SG化ペプチドを1μL加え、室温で反応させた（ただし、Trastuzumabとペプチド試薬の最終濃度は、10μMと200μM）。反応後、10分、30分、1時間、及び3時間後に、17μL（25μg）を取り、5%の2-mercaptoethanol（2-ME）を含む4×SDSサンプル溶液50μLを加え、蒸留水を163μLを加え、全量を200μLにした後、95℃にて10分インキュベートを行うことにより還元した。反応液のうち20μLを、5～20％ゲルにてSDS-PAGEを行い、CBB染色を行った。
　結果を図7に示す。Z34C 26 28Rが最も反応性が優れており、30分で100％のIgG1が修飾されていた。一方、αZ34C及びεZ34Cの30分後の収率は、49%と55％で、Z34C 26 28Rに比べ、約半分程度の修飾効率であった。さらに、Z33においても、Z34Cよりも効率は低いものの、αZ34C及びεZ34Cとほぼ同程度の効率で修飾されていた。
＜実施例6：pHの影響の検討＞
　10mMのPBS（pH7.4）に溶解した各種のIgG（99μL）に、DMSOに溶解した0.5mMのSG化ペプチド試薬（Z34C 26 28R、αZ34C、及びεZ34Cの3種のペプチド試薬）を1μL加え、室温で反応させた（ただし、抗体とペプチド試薬の最終濃度は、1μMと5μM）。3時間反応後、実施例5と同様の方法で、SDS-PAGE後、CBB染色を行った。
　結果を図8に示し、表5に値をまとめた（αZ34C及びεZ34Cのカッコ内の値は、表3におけるαZ34C 7K及びεZ34C 7Kペプチドを使ったpH5.5での抗体に対するペプチドの修飾効率（ただし、ペプチド試薬は、抗体の10倍モル比を加えた）を示す）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　αZ34CでのpH5.5とpH7.4では、pH7.4でpH5.5に対し反応性向上が確認された（特に、マウスIgG1（30→56％）、マウスIgG2b（60→100％）、及びラットIgG1（5→59％））。一方で、ヒトIgG4（100→50％）及びラットIgG2c（100→43％）では、pH5.5のときに比べ、pH7.4では半分にまで反応収率が低下した。εZ34Cでは、比較したヒトIgG1-4の反応性は、pH5.5と7.4では大きな違いは見られなかった。Z34Cについては、pH5.5との比較データは示していないが、マウスIgG1、IgG2b、及びIgG 3並びにラットIgG1及びIgG 2cにおいて、100％の修飾効率を達成した。さらに、ラットZ34C（pH7.4）では、IgG2bに対して54％の修飾体が得られた。
　本発明の架橋剤により修飾されたIgG結合ペプチドは、短時間で、しかもほとんど副反応なくIgGに付加することができるため、該IgG結合ペプチドに種々の化合物を結合させることで、種々の化合物によってIgGを特異的かつ簡便に修飾することができる。種々の化合物を付与したIgGは治療薬又は診断剤として用い得るため、本発明の産業上の利用可能性は大きい。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (20)

  1. 　（Xaa1）NMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNA（Xaa2）I（Xaa3）SIRDDC（配列番号1）、
    　（Xaa4）FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNA（Xaa2）I（Xaa3）SIRDDC（配列番号2）、又は配列番号1若しくは2のアミノ酸配列において、Xaa1～Xaa4以外の位置で1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
    　Xaa1は、リシン残基、オルニチン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸残基、及びジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択され、
    　Xaa2及びXaa3は、それぞれ独立に、アルギニン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、チロシン残基、及びシステイン残基からなる群から選択され、
    　Xaa4は、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、リシン残基、オルニチン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、βアラニン残基、2-アミノスベリン酸残基、ジアミノプロピオン酸残基、及びNH2-(PEG)n-CO(n=1～50)からなる群から選択されるか、又は存在しない、
    ペプチド。
  2. 　Xaa1がリシン残基、オルニチン残基、システイン残基、及びジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
  3. 　Xaa1がリシン残基である、請求項２に記載のペプチド。
  4. 　Xaa4がグリシン残基、アラニン残基、βアラニン残基、及びNH2-(PEG)n-CO(n=1～50)からなる群から選択されるか、又は存在しない、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド。
  5. 　Xaa4がグリシン残基であるか、又は存在しない、請求項４に記載のペプチド。
  6. 　Xaa2及びXaa3が、それぞれ独立に、アルギニン残基、ヒスチジン残基、及びグルタミン酸残基からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のペプチド。
  7. 　Xaa2及びXaa3がアルギニン残基である、請求項６に記載のペプチド。
  8. 　配列番号1の5位のシステイン残基と34位のシステイン残基、及び配列番号2の6位のシステイン残基と35位のシステイン残基がジスルフィド結合又はリンカーを介して連結されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のペプチド。
  9. 　FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号9）、
    　GFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号7）、
    　KNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号4）、
    　GFNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号5）、
    　KNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号6）、
    　FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD（配列番号10）、又は
    　GKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC（配列番号11）のアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のペプチド。
  10. 　標識物質又は薬剤が結合している、請求項１～９のいずれか一項に記載のペプチド。
  11. 　配列番号1の7位のR若しくは配列番号2の8位のRがリシン残基に置換されているか、配列番号1若しくは配列番号2のC末端にリシン残基をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド。
  12. 　標識物質又は薬剤が、置換リシン残基又はC末端のリシン残基に結合している、請求項１１に記載のペプチド。
  13. 　N末端のアミノ酸がアセチル化又はアミノ化されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載のペプチド。
  14. 　Ｃ末端のアミノ酸がアミド化されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載のペプチド。
  15. 　Xaa1及びXaa4が、架橋剤で修飾されているか、又はXaa4が存在しない場合には、配列番号2の1位のフェニルアラニンが架橋剤で修飾されている、請求項１～１４のいずれか一項に記載の結合ペプチド。
  16. 　前記架橋剤が、DSG（ジスクシンイミジルグルタレート）、DSS（ジスクシンイミジルスベレート）、DMA（アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMP（ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMS（スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DTBP（3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）、及びDSP（ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）からなる群より選択される、請求項１５に記載のペプチド。
  17. 　前記架橋剤がDSG（ジスクシンイミジルグルタレート）又はDSS（ジスクシンイミジルスベレート）である、請求項１６に記載のペプチド。
  18. 　請求項１５～１７のいずれか一項に記載のペプチドとIgGとの架橋複合体。
  19. 　請求項１５～１７のいずれか一項に記載のペプチドとIgGを混合し、架橋剤で修飾されているペプチドとIgGを架橋反応させる工程を含む、ペプチドとIgGの複合体を生産する方法。
  20. 　請求項１～１７のいずれか一項に記載のペプチド、又は請求項１８に記載の複合体を含む、医薬組成物。
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