JP5718638B2 - 新規な組成物、方法および使用 - Google Patents
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Description
血清アルブミンは哺乳動物の血清に最も豊富に含まれているタンパク質であり(ヒトで40g/l;約0.7mM)、その機能の1つは脂質およびビリルビンのような分子に結合することである(非特許文献1)。血清アルブミンの半減期は動物の大きさに正比例し、例えばヒト血清アルブミン(HSA)は19日の半減期を有し、ウサギ血清アルブミンは約5日の半減期を有する(非特許文献2)。ヒト血清アルブミンは全身、特に腸および血液コンパートメントに広く分布しており、主として浸透圧の維持に関与する。構造的に、アルブミンは3つの相同ドメインを含み、全部で584または585個のアミノ酸からなる単鎖タンパク質である(非特許文献3)。アルブミンは17個のジスルフィド架橋および1個の反応性チオール、C34を含有するが、N−結合およびO−結合糖質部分を含まない(非特許文献1、4)。グリコシル化の欠如はアルブミンの組換え発現を簡単にしている。この特性はその三次元構造が知られているという事実(非特許文献5)と共に、アルブミンを組換え融合タンパク質に使用するための魅力的な候補にしている。そのような融合タンパク質は、一般に、単一のポリペプチド鎖に(タンパク質がそれ自体で投与されると迅速に体から排除される)治療用タンパク質および血漿タンパク質(自然な遅いクリアランスを示す)を結合させる(非特許文献6)。そのような融合タンパク質は必要な注射の回数を減らし、生体内で治療用タンパク質濃度が高いという臨床上の利点をもたらすことができる。
血清アルブミンは何れかの酵素的または免疫学的機能を欠いており、そのため生物活性ポリペプチドとカップリングすると望ましくない副作用を示さなくなる。さらに、HSAは多数の天然分子および治療的分子の内因性輸送および送達にかかわる天然のキャリアーである(非特許文献7)。タンパク質を直接血清アルブミンに共有結合させるか、または生体内で血清アルブミンと結合することができるペプチドもしくはタンパク質に共有結合させるかのいずれかの戦略が幾つか報告されている。後者のアプローチの例は例えば特許文献1、2および非特許文献8に記載されている。最初の文献はとりわけ他のタンパク質の半減期を長くするための連鎖球菌プロテインG(SpG)から誘導されるアルブミン結合ペプチドまたはタンパク質の使用を開示している。この考えは細菌由来のアルブミン結合ペプチド/タンパク質を血液中で迅速なクリアランスを有することがわかっている治療上関心あるペプチド/タンパク質に融合させることである。このように生成した融合タンパク質は生体内で血清アルブミンに結合し、その長い半減期から恩恵を受け、融合した治療上関心あるペプチド/タンパク質の最終半減期が長くなる。特許文献2および非特許文献8は同じコンセプトに関するが、ここでは著者らは比較的短いペプチドを使用して血清アルブミンと結合させている。ペプチドはファージ提示ペプチドライブラリーから選択されている。非特許文献8において、初期の研究で連鎖球菌プロテインGのアルブミン結合性ドメインとヒト1型補体受容体との組換え融合に対する免疫応答の増強を見い出したことを述べている。特許文献3もまた、血清アルブミンに結合し、腫瘍標的化のための生物活性化合物と複合する、ファージ提示法でも同定されるペプチドリガンドを含む構築物の使用を開示している。
生物学的に活性なタンパク質の生体内半減期に対する効果の他に、生物学的に活性なタンパク質およびアルブミン結合性タンパク質間の融合体とアルブミンとの非共有結合が作用して、生物学的に活性なタンパク質に対する免疫応答を低下させることが提唱されている。すなわち、特許文献4において、生物学的に活性なタンパク質に対する免疫応答を低下させる、または排除するためのこの原理の使用が開示されている。
連鎖球菌プロテインG(SpG)は連鎖球菌の特定の菌株の表面に存在する二官能性受容体であり、IgGおよび血清アルブミンの両方と結合することができる(非特許文献9)。その構造は幾つかの構造的かつ機能的に異なるドメインの高度な繰り返し(非特許文献10)であり、より正確には3個のIg結合モチーフおよび3個の血清アルブミン結合性ドメイン(非特許文献11)である。3個の血清アルブミン結合性ドメインのうち1個の構造が決定されており、3−へリックスバンドルドメインを示す(非特許文献12)。このモチーフはABD(アルブミン結合性ドメイン)と名付けられ、46個のアミノ酸残基の大きさである。文献では、その後G148−GA3とも記号表示されている。
MHCクラスI関連新生児Fc受容体(FcRn)はアルブミンおよびIgGの細胞輸送および再利用にかかわる(非特許文献17、18)。Brambell受容体としても知られているFcRnは低いエンドソームpHでアルブミンおよびIgGと特異的に結合し、そのため飲作用により取り込まれたタンパク質を細胞表面への輸送によりリソソーム分解から保護し、中性のpHで放出する。FcRnはpH5〜6でアルブミンおよびIgGの両方に対して良好な親和性を有するが、中性のpHでは低い親和性しか示さないか全く示さない。このようにして、アルブミンおよびIgGの濃度および半減期は調節される。さらに、FcRnはアルブミンおよびIgGを細胞壁全体、例えば気道の上皮や腸および胎盤の内皮に活発に輸送するのにかかわる。
GVSDX5YKX8X9I X11X12AX14TVEGVX20 ALX23X24X25I
(ここで、互いに独立して
X5はYおよびFから選択され;
X8はN、RおよびSから選択され;
X9はV、I、L、M、FおよびYから選択され;
X11はN、S、EおよびDから選択され;
X12はR、KおよびNから選択され;
X14はKおよびRから選択され;
X20はD、N、Q、E、H、S、RおよびKから選択され;
X23はK、IおよびTから選択され;
X24はA、S、T、G、H、LおよびDから選択され;そして
X25はH、EおよびDから選択される;が、但しアミノ酸配列はGVSDYYKNLI NNAKTVEGVK ALIDEIではない)からなり、相互作用のKD値が最大で1×10-9Mであるようにアルブミンと結合するアルブミン結合性ポリペプチドの提供を通して、比較的高いアルブミン親和性を有する新規ポリペプチドのニーズを満たす。
aureus)由来プロテインAの5個のうち1個またはそれ以上の3−へリックスドメインの一部を形成する;すなわち3−へリックスバンドルタンパク質ドメインはプロテインAのドメインA、B、C、DおよびEからなる群より選択される。他の同様の実施態様において、ABMは黄色ブドウ球菌由来プロテインAのドメインBから誘導されるタンパク質Zの一部を形成する。
LAEAKXaXbAXcXd ELXeKY−[ABM]−LAALP
(ここで[ABM]は上記で定義されたようなアルブミン結合モチーフであり、さらに互いに独立して
XaはVおよびEから選択され;
XbはL、EおよびDから選択され;
XcはN、LおよびIから選択され;
XdはRおよびKから選択され;そして
XeはDおよびKから選択される)からなるアルブミン結合性ポリペプチドを提供する。
インを構成することができる。そのような本発明のポリペプチドおいて結合したポリペプチド“単位”は、知られている有機化学方法を使用して共有結合により結合することができ、またはポリペプチドの組換え発現システムにおいて1個もしくはそれ以上の融合ポリペプチドとして発現でき、または任意の他のやり方で、直接もしくは幾つかのアミノ酸を含むリンカーが介在して結合できる。
ソルビシン、マイタンシノイド、タキソール、エクチナサイジン、ゲルダナマイシンおよびそれらの誘導体、並びにそれらの組合せから選択されるものである。別法として、細胞毒性薬は天然に存在する化合物から誘導されない合成ケモトキシンである。
該化合物を相互作用のKDが1×10-6M以下であるようなアルブミンに対する親和性を有するアルブミン結合性ポリペプチドと共有結合させて、化合物およびアルブミン結合性ポリペプチドの共有結合複合体を形成する工程を含む。
該化合物を相互作用のKDが1×10-6M以下であるようなアルブミンに対する親和性を有するアルブミン結合性ポリペプチドと共有結合させて化合物とアルブミン結合性ポリペプチドとの共有結合複合体を形成する工程;そして
化合物とアルブミン結合性ポリペプチドとの該複合体をアルブミン結合性ポリペプチドとアルブミンの非共有結合を促進する条件下でアルブミンと混合する工程;を含み
それにより上記複合体における化合物の水に対する溶解度が、化合物それ自体の水に対する溶解度よりも高い、化合物の水溶解度を高める方法を提供する。
要約
本実施例において、連鎖球菌株G148のアルブミン結合性ドメインGA3(以後“ABD”と呼ぶ)のへリックス2および3の16位の変更を通してポリペプチド変異体のファージ提示ライブラリーを作成した。ABD野生型配列(“ABDwt”)は図1および添付した配列表でSEQ ID NO:491として表示される。前記pAffi1ベクターに基づいた新規なファージ提示型ベクター(pAY1075)(GronwallらのJ Biotechnol., 128, 162〜183(2007年)をこの新規なライブラリーのために構成した。変更されたABDフラグメント(へリックス2−3)を制限酵素SacIおよびNheIでpAY1075にクローン化した。ライゲーションを精製し、大腸菌(大腸菌)RR1ΔM15細胞にエレクトロポレーションした(RutherのNucleic Acids Res., 10, 5765〜5772(1982年))。新しく構成されたライブラリーはLibABDmat2005と記号表示され、どのオリゴヌクレオチドがへリックス2および3の変更された配列の作成に使用されたかに応じて2つのサブライブラリーからなる。一方はABD分子に基づいて構築され、他方はABDの17位および18位の間に挿入された追加のアミノ酸を有し、それはABDと相同なタンパク質の幾つかが有する(例えばRozakらのBiochemistry, 45, 3263〜3271(2006年))。LibABDmat2005の大きさは1×109のメンバー(それぞれのサブライブラリーについて5×108)である。新規なライブラリーの品質はDNA配列が約87%のクローンが機能的であると示し、アミノ酸の相対度数の測定値が理論値とよく一致するという点で満足いくものであった。
新規なファージ提示ベクター(pAY1075)を新規なライブラリーのために構成した。pAY1075はファージミドベクターpAffi1(Groenwallらの上記文献)に基づいている。pAY1075を作出するために、pAffi1をXhoIおよびXmaI(10単位/μl;New England Biolabs)で消化し、新しいインサートまたはクローニングカセットを作成し、ベクターにライゲーションした。新しいインサートはABDwtのヘリックス1をコードするDNA、ダミー配列、トロンビン部位、Zwt(ブドウ球菌プロテインAのドメインBに基づいている遺伝子操作IgG結合ドメイン;NilssonらのProt Eng., 1, 107〜113(1987年)を参照)、トランケートされたGIII(残基249〜406)、末端ドメインTTおよび幾つかの他の制限酵素部位を含んだ。このインサートによりコードされる要素の略図については図2Aを参照。図2Bはダミー配列が残りのABD変異体ポリペプチドをコードする配列(下記を参照)により置換されたときの発現ベクターのインサートを示す。クローニング実験でプライマーおよびテンプレートとして使用される様々なDNAオリゴヌクレオチドの配列およびライブラリー構成を下記の表1に示す。
ABD分子のへリックス2および3についてランダム化した配列を有する一連のオリゴヌクレオチドを下記のようにして調製した。これらのオリゴヌクレオチドを続いてpAY1075のダミー配列の置換に使用してpAY1075−ABDを作出した(図2Bおよび5)。次に、pAY1075−ABDベクターをファージの表面上でABD変異体のライブラリーの発現に使用した。
次の手順を使ってABD 変異体をコードする遺伝子ライブラリーLibABDmat2005を作出した。アセンブリー反応において、オリゴヌクレオチドAFFI−791およびオリゴヌクレオチド混合物AFFI−793またはAFFI−794をアニールし、Taq DNAポリメラーゼで延長した。外
部プライマーAFFI−791およびAFFI−792を使用するPCR反応を行なってフラグメントを増幅した。PCR産物をメーカーの使用説明書に従ってQIAquick PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製した。
要約
実施例1で構築されたライブラリーを使用するファージ提示法による選択においてビオチン化ヒト血清アルブミン(HSA)を標的として使用した。選択はアルブミンに対して高い親和性を有するABD変異体を得る可能性を最大にする様々な条件を使用して行なった。選択されたファージの溶離後、発現した相当するタンパク質をELISA法でアルブミンに対する親和性について試験した。陽性クローンを同定し、配列決定し、相当するポリペプチドおよびそれらのアルブミン結合モチーフの予想されるアミノ酸配列を差し引き、それにより多数の本発明のアルブミン結合性ポリペプチドの配列を得た。差し引かれたアルブミン結合モチーフのアミノ酸配列は図1および配列表でSEQ ID NO:1〜257として記載され、相当する全長ABD変異体のアミノ酸配列はSEQ ID NO:258〜514として記載される。
凍結乾燥したヒト血清アルブミン(Sigma、カタログ番号A3782−5G)をPBS(2.68mMのKCl、1.47mMのKH2PO4、137mMのNaCl、8.1mMのNa2HPO4、pH7.4)に溶解して最終濃度を10mg/mlにした。EZ−リンク スルホ−NHS−LC−ビオチン(Pierce、カタログ番号21335)を水に溶解して最終濃度を1mg/mlにし、5および10倍モル過剰を0.5mlの全容量で500mgのアルブミンに加えた。混合物を室温で30分間インキュベートした。透析カセット(Slide−A−Lyser、10kDa;Pierce)を使用してPBSを透析することにより非結合ビオチンを除去した。
全部で、5ラウンドの選択を次第に厳しくなる条件を使用して行なった。初期の3ラウンドを主に適した選択プロトコルを確立する目的で行なった後、得られるファージストックを実施例1のようにして調製したグリセリンストックから調製した。次に、表4に記載の選択緩衝液、標的濃度および固体支持体を組合せて選択をさらに2サイクル行なった。
プレートからの細胞をTSB培地(30g/lのトリプチックソイブロス)中で再懸濁し、OD600=1が5×108細胞/mlに相当すると仮定して光学密度を600nmで測定することにより細胞濃度を決定した。細胞を2%グルコースおよび100mg/mlのアンピシリンを補足した100mlのTSB+YE培地に接種(溶出ファージより約100倍過剰の細胞)し、37℃でOD600=約0.5〜0.7になるまで増殖させた。その後、10mlを新しいフラスコに移し、25倍過剰のM13K07ヘルパーファージ(1×1012cfu/ml;New England Biolabs、カタログ番号NO315S)により感染させ、ゆっくりと撹拌しながら30分間インキュベートした。細胞を2000gで10分間遠心し、100mMのイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)、50mg/mlのカナマイシンおよび100mg/mlのアンピシリンを補足した100mlのTSB+YE培地中で再懸濁し、100rpmおよび25℃で一晩培養した。再懸濁した細胞の一部をグリセリンストックとして−80℃で保存した。
各選択+ABDwtからクローンを発現させ、10nMから低いpMまでのKD値を有する結合剤の検出が可能なELISA法を使用して血清アルブミンに対するHSA結合活性についてスクリーニングした。ランダムに採取したコロニーは96ディープウェルプレートにおいて各コロニーを100mg/mlのアンピシリンおよび1mMのIPTGを補足した1mlのTSB+YE培地に接種することにより発現させ、37℃で一晩培養した。細胞を3000gで15分間遠心してペレット化し、400μlのPBS−T(PBS中の0.5%ツィーン20)中で再懸濁し、−80℃で凍結した。凍結試料を水浴で解凍し、細胞残屑を3700gで40分間ペレット化した。ABD変異体−Zwt融合タンパク質を含有する上澄みを集め、下記のようにELISAで使用するまで4℃で保存した。
オリゴヌクレオチドAFFI−69(5'−gtgagcggataacaattcccctc−3')およびAFFI−70(5'−cagcaaaaaacccctcaagaccc−3')を使用して選択されたコロニーからのPCRフラグメントを増幅した。増幅フラグメントの配列決定はメーカーの使用説明書に従ってABI PRISM(登録商標)dGTP、BigDye(商標)Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencingキット(Applied Biosystems)でビオチン化オリゴヌクレオチドAFFI−202(5'−ビオチン−gtgagcggataacaattcccctc−3')を使用して行なった。シークエンシング反応をMagnatrix 8000装置(Magnetic Biosolutions)を使用してストレプトアビジン被覆電磁ビーズに結合させることにより精製し、最後にABI PRISM(登録商標)3100遺伝子解析装置(Applied Biosystems)で分析した。
ABDwtをコードするDNA(SEQ ID NO:515)および選択からの12個のクローンを発現ベクターpAY442へのサブクローニングのために選択した(Gronwallら、上記文献)。図1に関して、選択されたABD変異体クローンはABD00002、ABD00003、ABD00009、ABD00015、ABD00025、ABD00027、ABD00046、ABD00049、ABD00053、ABD00054、ABD00055およびABD00245である。これらのABD変異体分子をコードするインサートを含有するプラスミドを2mlの大腸菌RR1ΔM15細胞(Rutherの上記文献(1982年))の一晩培養物(2%グルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを補足したトリプチックソイブロス培地(30g/l))からメーカーの使用説明書に従ってQiagen Miniキット(Qiagen)を使用して精製した。
すべて上記のようにしてpAY442でサブクローニングされたABDwtおよび12個のABD変異体を大腸菌BL21(DE3)でN−末端His6−タグとの融合体として発現させ、IMACにより精製した。各ABD変異体のコロニーを使用して50μg/mlのカナマイシンを補足した5mlのTSB培地に接種した。培養物を37℃で一晩増殖させた。翌日、50μlの各培養物を別々に1リットルのフラスコ中で50μg/mlのカナマイシンを補足した100mlのTSB+YE培地に接種した。培養物を37℃において100rpmで0.7〜1のOD600まで増殖させ、その後IPTGを最終濃度が0.5mMになるまで加え、細胞を室温において100rpmで一晩インキュベートした。培養物を8000gで5分間遠心することにより収穫し、ペレットをタンパク質の調製まで冷凍庫で保存した。
バイオセンサー分析はBiacore2000装置(Biacore)においてCM−5チップ(リサーチグレード;Biacore)の表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより固定化されたMSA、HASおよびRSAを使用してメーカーの使用説明書に従って行なった。チップ上の表面1は活性化および不活性化され、注入中の参照細胞として使用され、表面2は350RU(共鳴単位)で固定化されたMSAを含み、表面3は360RUで固定化されたHSAを含み、そして表面4は340RUで固定化されたRSAを含む。上記のように発現させて精製したABD変異体およびABDwtをHBS−EP(Biacore)で25nMまで希釈し、25μl/分の一定流速で10分間注入し、次にHBS−EPを30分間注入した。20μlの15mM HCl、次に0.05%SDSを2回注入し、さらに20μlのHClを注入して表面を再生した。
要約
本実施例において、選択されたABD変異体ABD00003、ABD00053およびABD00239とABDwtをすべて上記実施例2に記載のようにしてpAY442でサブクローニングし、より大きな規模で発現させ、His Gravitrap(商標)キットで精製した。発現した分子をBiacore装置を使用してHASに対する親和性について特性決定した。
ABD00003、ABD00053、ABD00239およびABDwtを大腸菌BL21(DE3)細胞で実施例2に記載のようなコンストラクトを使用してN−末端His6−タグとの融合体として発現させ、IMACにより精製した。各ABD変異体のコロニーを使用して50μg/mlのカナマイシンを補足した10mlのTSB培地に接種した。培養物を37℃で一晩増殖させた。翌日、500μlの各培養物を別々に5リットルのフラスコ中で50μg/mlのカナマイシンを補足した500mlのTSB+YE培地に接種した。培養物を37℃において100rpmで0.7〜1のOD600まで増殖させ、その後IPTGを最終濃度が0.5mMになるまで加え、室温で一晩インキュベートした。培養物を8000gで5分間遠心することにより収穫し、ペレットをタンパク質の製造まで−20℃で保存した。
バイオセンサー分析はBiacore2000装置(Biacore)においてCM−5チップ(リサーチグレード;Biacore)の表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより固定化されたHSA(SIGMA、カタログ番号A3782−5G)を使用してメーカーの使用説明書に従って行なった。HSAの固定化は450共鳴単位のシグナルを与えた。1個のチップ表面を活性化および不活性化し、注入中の参照細胞として使用した。精製したHis6−ABD試料をHBS−EP(Biacore)でABDwtについては4、10、40、100および400nM、選択されたABD変異体については0.2、0.8、2、5および20nMに希釈した。試料を25μl/分の一定流速で10分間注入し、次にHBS−EPを3時間注入した。5および10mMのHCl(20μl)を2回注入して表面を再生した。KD、kaおよびkd値を推定し、表7に示す。これらはHSAに対して非常に高い親和性を示す分子が得られた実施例2の結果を裏付けている。
要約
マウスおよびラットにおける前記試験はABDwtと融合した様々なZ変異体分子がZ変異体単独の場合と比べてより低い抗体反応しか生じさせないことを示している。本試験の目的は、1) これらの結果を霊長類で裏付け、それをアルブミンに対してABDwtと比べて103倍高い結合親和性を示すABDの突然変異した変異体にまで拡大すること、および2) ABD−融合のおよび裸のZ変異体の血清中半減期を比較することであった。HER2受容体に対する親和性を有するZ変異体を場合により融合パートナーとしてのABD変異体と共に霊長類に投与した。免疫付与および採血を45日期間にわたって繰り返し行なった。Z変異体分子に対する特異的抗体反応および血清中半減期をELISAアッセイにより分析した。
Z00342:ブドウ球菌プロテインAのBドメインから誘導され、HER2受容体に対して親和性を有するタンパク質Zの変異体。この変異体は組換えDNA技術により生産した。精製はアニオン交換および逆相クロマトグラフィー法を使用して行ない、メーカーの使用説明書に従ってDetoxi−Gel(商標) Affinity Pak(商標)プレパックカラム(Pierce、カタログ番号2034)でエンドトキシンを除去した。Z00342分子についての詳細な説明はOrlovaらのCancer Res., 66, 8,4339〜48(2006年)に記載されており、それはZHer2:342として表示されている。
投与および試料採取のスキーム:動物試験をスウェーデン・ソルナのSMI(Smittskyddsinsitutet)で地元の動物実験倫理委員会の許可(N196/06)を得て行なった。霊長類を試験分子の投与および血液試料採取の前にケタミン(Ketalar(登録商標))の筋肉内投与により鎮静状態にした。10匹の霊長類カニクイザル(Macaca fascicularis)を2つのグループに分け、試験分子を表8のスキームに従って静脈注射した。
Z00342を注射した霊長類のZに特異的なIgG:各採血からの血清をZ変異体に特異的なIgGの存在についてELISAにより分析した(図9A−9C)。第0日に、中濃度の予め形成された抗体を持つ1匹の霊長類(9039)を除けば低濃度のIgGが検出された。第14日後、抗体力価は徐々に増加し、第28〜35日に3匹の動物(9039、10025、11019)が最大になり、2匹(9023および10105)が全45日期間低い抗体反応しか示さなかった。
本試験の結果からABD−融合Z変異体分子はアルブミン結合性融合パートナーなしでZ変異体分子と比べてより低い免疫応答しか引き起こさず、延長された排出半減期を示すことがわかる。
試験分子
実施例4の延長として、アルブミンに対して高い親和性(KD=10-13M)を有するABDの第2変異体を二量体のZ変異体と融合させ、霊長類の免疫原性試験に使用した。
(Z01154)2:ブドウ球菌プロテインAのBドメインから誘導されるタンパク質Zの二量体変異体。 この二量体変異体は組換えDNA技術により生産した。精製はアニオン交換、逆相クロマトグラフィーおよびカチオン交換法を使用して行ない、Detoxi−Gel(商標) Affinity Pak(商標)プレパックカラム(Pierce、カタログ番号2034)においてエンドトキシンを除去した。単量体のZ01154分子についての詳細な説明はGunneriusson EらのProtein Eng 12, 10, 873〜878(1999年)に記載されており、それはZTaq4:1として表示される。
(Z01154)2−ABD00239:二量体の(Z01154)2と実施例2で選択された変異体ABD分子ABD00239の融合タンパク質。この融合タンパク質は組換えDNA技術により生産した。精製はHSA−セファロースによる親和性捕捉および逆相クロマトグラフィーを使用して行ない、上記のようにしてエンドトキシンを除去した。
投与および試料採取のスキーム:動物試験をスウェーデン・ソルナのSMI(Smittskyddsinsitutet)で地元の動物実験倫理委員会の許可(N196/06)を得て行なった。霊長類を試験分子の投与および血液試料採取の前にケタミン(Ketalar(登録商標))の筋肉内投与により鎮静状態にした。7匹の霊長類カニクイザル(Macaca fascicularis)をそれぞれ3匹および4匹からなる2つのグループに分け、試験分子を表10に記載のように静脈注射した。
(Z01154)2および(Z01154)2−ABD00239による免疫:裸のまたはABD00239−融合した(Z01154)2で免疫付与した霊長類由来の血清をそれぞれ(Z01154)2および(Z01154)2−ABD00239被覆プレートにおいて滴定し、その滴定曲線を図13A−13Bおよび図14A−14Bに示す。過免疫したサル由来の血清を陽性対照として滴定に含めた。1600倍希釈での陽性対照の吸光度を100%と設定し、正規化に使用した。図15は個々の反応の正規化値を示す。その結果はすべての3匹の動物は(Z01154)2に対して反応したが、1匹の霊長類(E89)の反応はより低かった。対照的に、4匹の動物のうち1匹だけが(Z01154)2−ABD00239に対して反応した。
要約
融合プロテインABDwt−(Z00342)2−Cys(野生型ABDドメインおよび二量体のZ変異体、Z00342からなる組換え技術により生産した融合タンパク質;HER2受容体に対して親和性を有する)と非極性分子マレイミド−スペースリンカー−ドキソルビシンの複合体を生産した。その構造式は下記に示される。
マレイミド−スペースリンカー−ドキソルビシン(Syntarga B.V.:オランダ)をN,N−ジメチルホルムアミド(Sigma、カタログ番号D−4551)に溶解して4μモル/mlの最終濃度とし、使用するまで−80℃で保存した。4mlの融合プロテインABDwt−(Z00342)2−Cys(1.9mg/ml、PBS中)を40℃において20mMのDTT(Acros Organics、カタログ番号165680250)で30分間還元した。過剰のDTTをPD−10カラムにおける緩衝液をPBS(2.68mMのKCl、1.47mMのKH2PO4、137mMのNaCl、8.1mMのNa2HPO4、pH7.4)に交換することにより除去した。3mlのアセトニトリル(AcN、Merck、カタログ番号1.14291.2500)を加えてタンパク質試料を30%(v/v)有機溶媒に調整した。198μl、すなわち2倍モル過剰のマレイミド−スペースリンカー−ドキソルビシンをタンパク質溶液に加えた。30分間混合した後、溶液を4℃で一晩インキュベートした。反応混合物を最後に脱イオン水/AcN(70:30、v/v)で平衡化させたHiPrep 26/10脱塩カラム(GE、カタログ番号17−5087−01)において精製した。タンパク質濃度は280nmでUV吸収を測定して0.44mg/mlであると定量された。
3つの溶液を溶解度試験に使用した:
1. DMEM、ダルベッコ改変イーグル培地(Cambrex Bio Science、カタログ番号BE12−917F)、
2. 6mg/mlのヒト血清アルブミン(HSA)(Sigma、カタログ番号A1887−5G)を補足したことを除けば1と同じDMEM、および
3. 10%ウシ胎仔血清(FCS)を補足したことを除けば1と同じDMEM。
各バイアル(溶液1〜3)から30μlをエッペンドルフ遠心分離機において13000rpmで10分間遠心した。20μlの得られる上澄みをオンラインで質量分析検出が可能な液体クロマトグラフィー(Agilent 1100、LC−MS)により分析した。カラムZorbax 300SB−C18(4.6x150mm、3.5u)を65%溶媒A(0.1%TFA、脱イオン水中)および35%溶媒B(0.1%TFA、AcN中)により0.5ml/分の流量で平衡化させた。UV 吸収を220、280、254および495nmで測定した。試料成分を緩やかな直線グラジエントの50〜60%溶媒Bで35分間溶離した。溶液中の複合体分子の量に相当するピーク面積を試料間で比較した。
Claims (20)
- アルブミン結合モチーフを含み、該モチーフはアミノ酸配列:
GVSDX5YKX8X9I NX12AX14TVEGVX20 ALX23X24X25I
(ここで、互いに独立して
X5はYおよびFから選択され;
X8はN、RおよびSから選択され;
X9はV、I、LおよびYから選択され;
X12はRおよびKから選択され;
X14はKおよびRから選択され;
X20はD、N、Q、E、HおよびRから選択され;
X23はK、IおよびTから選択され;
X24はA、S、G、H、LおよびDから選択され;そして
X25はHおよびDから選択される;)からなり、当該アルブミン結合モチーフは3−へリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成し、そして、アルブミンとの相互作用のKD値が最大で1×10-9Mであるようにアルブミンと結合するアルブミン結合性ポリペプチド。 - アルブミン結合モチーフはSEQ ID NO:1〜3、15、37、41、46、49、50、53〜58、68、87、89、93、97、100、103〜107、118、139、143、148、151、152、155〜160、170、190、192、196、201、204、205、208〜210、221、228、230、234、236、239〜246および248から選択されるアミノ酸配列
からなる請求項1記載のアルブミン結合性ポリペプチド。 - アルブミン結合モチーフはSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:155およびSEQ ID NO:239〜245から選択されるアミノ酸配列
からなる請求項2記載のアルブミン結合性ポリペプチド。 - アルブミン結合モチーフはSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:239およびSEQ ID NO
:245から選択されるアミノ酸配列
からなる請求項3記載のアルブミン結合性ポリペプチド。 - アルブミン結合モチーフはSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:53およびSEQ ID NO:239から選択されるアミノ酸配列からなる請求項4記載のアルブミン結合性ポリペプチド。
- 3−へリックスバンドルタンパク質ドメインは連鎖球菌株G148由来のプロテインGのドメインGA3である請求項1〜5の何れかの項記載のアルブミン結合性ポリペプチド。
- アミノ酸配列:LAEAKXaXbAXcXd ELXeKY−[ABM]−LAALP
(ここで[ABM]は請求項1〜5の何れかの項で定義されたようなアルブミン結合モチーフであり、
および互いに独立してXaはVおよびEから選択され;
XbはL、EおよびDから選択され;
XcはN、LおよびIから選択され;
XdはRおよびKから選択され;そして
XeはDおよびKから選択される)
を含む請求項1〜6の何れかの項記載のアルブミン結合性ポリペプチド。 - アミノ酸配列が次から選択される定義:
i) SEQ ID NO:258〜514から選択される;
ii) SEQ ID NO:258〜514から選択される配列と89%以上の同一性を有するアミノ酸配列である;
の一つを満たす配列を含むアルブミン結合性ポリペプチドであって、
ここで当該アルブミン結合性ポリペプチドは相互作用のKD値が最大で1×10-9Mであるようにアルブミンと結合する、ポリペプチド。 - アミノ酸配列が次から選択される定義:
iii)SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:310およびSEQ ID NO:496から選択される;
iv)iii)の配列と89%以上の同一性を有するアミノ酸配列である;
の一つを満たす配列を含む請求項8記載のアルブミン結合性ポリペプチド。 - フラグメントが実質的にアルブミン結合性を保持する請求項1〜9の何れかの項記載のアルブミン結合性ポリペプチドのフラグメント。
- モノマー単位として少なくとも2個のアルブミン結合性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む請求項1〜10の何れかの項記載のアルブミン結合性ポリペプチドまたはそのフラグメントのマルチマー。
- i) 請求項1〜11の何れかの項記載のアルブミン結合性ポリペプチド、フラグメントまたはマルチマーからなる第1部分;および
ii) 所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第2部分
を含有する融合タンパク質または複合体。 - さらに標識を含む請求項1〜12の何れかの項記載のポリペプチド。
- 請求項1〜12の何れかの項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- それ自体での所望の生物活性を有するポリペプチドの生体内半減期よりも長い生体内半減期を示す薬剤の調製のための請求項12記載の融合タンパク質または複合体の使用。
- それ自体での所望の生物活性を有するポリペプチドを哺乳動物に投与した際に引き起こされる免疫応答と比較して、哺乳動物に投与した際に免疫応答がないか、または低い薬剤の調製のための請求項12記載の融合タンパク質または複合体の使用。
- 請求項1〜13の何れかの項記載の、アルブミン結合性ポリペプチド、融合タンパク質または複合体;これと結合した、それ自体で水に対する溶解度が100μg/ml以下を有する化合物、ここで化合物およびアルブミン結合性ポリペプチド、融合タンパク質または複合体は共有結合する;を含む組成物。
- それ自体で水に対する溶解度が100μg/ml以下である化合物を備え;そして
該化合物を、請求項1〜13の何れかの項記載の、アルブミン結合性ポリペプチド、融合タンパク質または複合体と共有結合させて、化合物およびアルブミン結合性ポリペプチド、融合タンパク質または複合体の共有結合複合体を含む組成物を形成することを含む請求項17記載の組成物を調製する方法。 - それ自体で水に対する溶解度が100μg/ml以下である化合物を備える工程;
該化合物を、請求項1〜13の何れかの項記載の、アルブミン結合性ポリペプチド、融合タンパク質または複合体と共有結合させて、化合物およびアルブミン結合性ポリペプチド、融合タンパク質または複合体の共有結合複合体を含む組成物を形成する工程;そして
化合物とアルブミン結合性ポリペプチド、融合タンパク質または複合体との該複合体をアルブミン結合性ポリペプチド、融合タンパク質または複合体とアルブミンの非共有結合を促進する条件下でアルブミンと混合する工程;を含み、
それにより上記複合体における化合物の水に対する溶解度が、化合物それ自体の水に対する溶解度よりも高い、化合物の水溶解度を高める方法。 - 薬剤として使用するための請求項17記載の組成物。
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