JP7138411B2

JP7138411B2 - 変異した骨格を有する結合ポリペプチド

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Publication number: JP7138411B2
Application number: JP2016537294A
Authority: JP
Inventors: エーリク・ノルドリング; ヨアキム・ニルソン; パトリック・ストレームバリ
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Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2022-09-16
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Description

本発明は、新規なポリペプチド、その産生方法および共通の骨格に基づくポリペプチド変異体の新規な集団に関する。この集団は、例えば新規な結合タンパク質およびポリペプチドを提供するために用いることができる。

新規な結合タンパク質を作製するための種々の方法が記載されている（非特許文献１）。１つの戦略は、ライブラリー生成およびスクリーニングを所望の性質の選択と組み合わせることである。

共通の第一世代の骨格に基づく第一世代のＺ変異体ポリペプチド、このような分子の集団およびそれらを含む方法は、特許文献１に記載されている。さらに、第二世代の骨格に基づくＺ変異体ポリペプチド、このような分子の集団およびそれらを含む方法は、特許文献２に記載されている。これらの２つの開示の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの適用に関して、改善された性質、例えばより高いアルカリ安定性、低い抗原性、構造安定性、化学合成の容易さおよび親水性を有するＺ変異体ポリペプチドまたはその集団が望まれている。特許文献２は、改善された性質を有する共通の骨格を有するＺ変異体を開示しているが、しかし、その中に記載されたＺ変異体ポリペプチドによってすべての所望の性質を得ることができるわけではない。

ポリペプチド医薬の成功の鍵となる因子の１つは、それらの安定性である。高い構造安定性を示すポリペプチドは、おそらく産生中および人体内の両方で、化学的修飾、物理的条件の変化およびタンパク質分解に機能的に耐えるであろう。さらに、安定性は、ポリペプチド医薬の活性有効期間だけでなく人体内のポリペプチド医薬の活性期間に影響を及ぼすであろう。

したがって、Ｚ変異体ポリペプチドの安定性の改善が継続的に必要とされている。

ＷＯ９５／１９３７４ＷＯ２００９／０８０８１１

Nygren PA and Uhlen M (1997) Curr Opin Struct Biol 7:463-469

新規な骨格を有するポリペプチドを提供することが本発明の目的であり、このポリペプチドは、現在入手可能なＺ変異体ポリペプチドの上記および他の欠点を軽減する。

本発明の別の目的は、新規な骨格に基づくポリペプチドの産生方法を提供することである。また、本発明の目的は、このような改善されたポリペプチド変異体の集団を提供することであり、すべて新規な骨格に基づいている。

本発明の別の目的は、ポリヌクレオチドの集団を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、ポリペプチド集団とポリヌクレオチド集団との組合せを提供することである。

本発明のさらなる目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを、ポリペプチドの集団から選択する方法を提供することである。

別の目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する方法を提供することである。

別の目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを特定する方法を提供することである。

さらなる目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択および特定する方法を提供することである。

関連した目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生する方法を提供することである。

これらのおよび他の目的は、本明細書に開示された種々の態様によって達成してもよい。

本開示の第１の態様において、
ｉ）ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７Ｑ
（配列中、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ６、Ｘ_７、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２５およびＸ_２８のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ_３５は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_３６は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ_３９は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ_４５は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_４６は、Ｄ、ＥおよびＳから選択されるが、但し、Ｘ_４５がＮであるとき、Ｘ_４６はＤでなく；
Ｘ_４７は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ_４５がＮであるとき、Ｘ_４６はＤでない、
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。

上のポリペプチド配列ｉ）の中で、「独立して任意のアミノ酸に相当する」として定義された各アミノ酸Ｘは、それぞれ、すべての可能なアミノ酸から選択されるアミノ酸残基に相当する。明確にするため、これは、上の配列ｉ）中の位置Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２５およびＸ_２８に相当するアミノ酸位置に当てはまる。これは、それぞれのこのようなＸが、配列中のＸと表された他の任意の残基の同一性と独立した任意のアミノ酸残基であってもよいことを意味する。アミノ酸配列中、これらのアミノ酸Ｘは、全２０個の天然のアミノ酸残基のいずれかが、任意の所定の変異体中の対応するＸ位置に存在しうるようなやり方で、これらの２０個の天然のアミノ酸残基から選択してもよい。各位置におけるアミノ酸残基の選択は、多少ランダム化してもよい。また、種々の多様なアミノ酸残基が選択される群を、２０個の天然のアミノ酸残基のうち１９、１８、１７、１６またはそれ未満に限定することも可能である。種々の位置における変動性は、ランダム化を意味しない１個から最大で全２０個のアミノ酸までの間で個々に調整してもよい。アミノ酸のより小さなサブセットのランダム導入は、導入されたデオキシリボヌクレオチド塩基の注意深い選択によって行ってもよく、例えば、コドンＴ（Ａ／Ｃ）Ｃは、ポリペプチド鎖中の所定の位置でセリンまたはチロシンのランダム導入を行うことによって導入してもよい。同様に、コドン（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＣＣを導入してポリペプチド鎖の所定の位置でフェニルアラニン、ロイシン、アラニンおよびバリンのランダム導入を行ってもよい。当業者は、ポリペプチド鎖中の所定の位置でアミノ酸の種々の組合せを得るために用いてもよいデオキシリボヌクレオチド塩基の組合せの多くの選択肢を知っている。また、ポリペプチド鎖中の所定の位置に現れてもよいアミノ酸のセットは、一度に１つのデオキシリボヌクレオチド塩基の代わりに、オリゴヌクレオチド合成中のトリヌクレオチドの導入によって決定してもよい。アミノ酸の確定セットは、合成において望ましい位置で確定コドンの組込みを可能にするスプリット－プール（split-pool）合成を用いて得てもよい。ランダム化二本鎖リンカーを得るためのさらに別の選択肢は、その後に構築された二本鎖ＤＮＡの連結および制限を用いるトリヌクレオチド構成単位のランダム化セットの組込みによるものである。

本開示の一実施態様において、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドが提供される。このような一実施態様において、標的結合特異性をもたらすアミノ酸残基は、上の配列ｉ）中の位置２、３、４、６、７、１０、１１、１７、１８、２０、２１、２５および２８に相当する位置のものである。同様に、このようなポリペプチドにおいて、標的結合特異性もたらすアミノ酸残基は、「骨格アミノ酸」または単に「骨格」と呼ばれる。したがって、一実施態様において、本明細書に定義された骨格アミノ酸残基は、上の配列ｉ）中の位置１、５、８、９、１２～１５、１９、２２～２４、２７、３１、３３～３４、３７～３８、４０～４４および４８に相当する位置のものである。本明細書に定義されたポリペプチドの骨格アミノ酸によってもたらされる好都合な性質が、上記ポリペプチドの標的結合特異性と無関係であることは当業者に明らかであろう。

当業者に知られているように、任意のポリペプチド、例えば本開示のポリペプチドの機能は、ポリペプチドの三次構造に依存する。したがって、その機能に影響を及ぼすことなく、ポリペプチドのアミノ酸の配列に小さな変化を加えることが可能である。したがって、本開示は、ポリペプチドの機能的性質、例えばその改善された安定性および／または所定の標的に対するその結合親和性を変えることのない、上記ポリペプチドの修飾された変異体を包含する。

このように、また、ｉ）に定義された配列に対して９１％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが本開示によって包含される。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９３％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％同一である配列を含んでもよい。

いくつかの実施態様において、配列定義ｉ）とｉｉ）との間のこのような違いは、本明細書に開示されたポリペプチドの配列の任意の位置において見いだされることがある。別の実施態様において、このような変化は、骨格アミノ酸残基にのみ見いだされてもよい。別の実施態様において、上記の変化は、標的結合特異性をもたらすアミノ酸残基中にのみ見いだされてもよい。例えば、アミノ酸残基の特定の機能的分類（例えば疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基を同じ機能的分類からの別のアミノ酸残基と交換することができる可能性がある。

「％同一性」という用語は、本明細書中で用いる場合、例えば、以下のように算出してもよい。ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズム（Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)）を用いてクエリー配列を標的配列に対して整列させる。整列させた配列の１つ、例えば最も短いものに相当するウィンドウ上で比較を行う。ウィンドウは、いくつかの場合、標的配列によって定義してもよい。他の場合、クエリー配列によってウィンドウを定義してもよい。各位置のアミノ酸残基を比較し、標的配列中で同一の対応関係を有するクエリー配列の位置のパーセンテージを％同一性として報告する。

ポリペプチドを結合するための骨格として用いるとき、本明細書に開示された配列は、知られている類似の骨格と比較して利点を提供し、そして高い構造安定性を示し、かつそれによって改善された貯蔵有効期間を示すように設計されている。これらの利点は、本開示の第３の態様（さらに下を参照）にもあてはまり、それらはこの第１の態様のポリペプチド変異体の集団に関連がある。

本開示の一実施態様において、Ｘ_１６はＴである。

一実施態様において、Ｘ_２６はＫである。

一実施態様において、Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２はＤＤＰＳである。

一実施態様において、Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２はＲＱＰＥである。

一実施態様において、Ｘ_３５はＳである。

一実施態様において、Ｘ_３６はＥである。

一実施態様において、Ｘ_３９はＳである。

一実施態様において、Ｘ_４５はＥおよびＳから選択される。

一実施態様において、Ｘ_４５はＥである。

一実施態様において、Ｘ_４５はＳである。

一実施態様において、Ｘ_４６はＥおよびＳから選択される。

一実施態様において、Ｘ_４６はＥである。

一実施態様において、Ｘ_４６はＳである。

一実施態様において、Ｘ_４６はＤである。

一実施態様において、Ｘ_４５がＮであるとき、Ｘ_４６はＤまたはＥではない。

一実施態様において、Ｘ_４５Ｘ_４６は、ＥＥ、ＥＳ、ＳＥおよびＳＳから、例えばＥＳおよびＳＥから選択される。

一実施態様において、Ｘ_４５Ｘ_４６はＥＳである。

一実施態様において、Ｘ_４５Ｘ_４６はＳＥである。

一実施態様において、Ｘ_４５Ｘ_４６はＳＤである。

一実施態様において、Ｘ_４７はＳである。

本明細書に用いる「所定の標的に対する結合親和性」という用語は、例えば表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて試験されうるポリペプチドの性質のことをいう。例えば、上記結合親和性は、所定の標的またはそのフラグメントを機器のセンサチップ上に固定し、被検ポリペプチドを含有するサンプルをチップ上に通過させる実験において試験してもよい。別法として、被検ポリペプチドを機器のセンサチップ上に固定し、所定の標的を含有するサンプルまたはそのフラグメントをチップ上に通過させる。次いで、当業者は、このような実験によって得られた結果を解釈して所定の標的に対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的尺度（qualitative measure）を確立してもよい。定量的尺度（quantitative measure）が望ましい場合、例えば相互作用のＫ_Ｄ値を決定するため、表面プラスモン共鳴法を用いてもよい。結合値は、例えば、ビアコア（Biacore）（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））またはプロテオンＸＰＲ３６（ProteOn XPR 36）（バイオ・ラッド）Bio-Rad）機器において確定してもよい。所定の標的を機器のセンサチップ上に適切に固定し、親和性を決定すべきポリペプチドのサンプルを系列希釈によって調製し、そして順不同で注射する。次いで、例えばBIAevaluation 4.1ソフトウェアの１：１ラングミュア結合モデル、または機器の製造元によって提供される、他の適したソフトウェアを用いて、結果からＫ_Ｄ値を算出してもよい。

また、本明細書に用いる「所定の標的に対する結合親和性」という用語は、例えばＥＬＩＳＡによって試験されうるポリペプチドの性質のことであってもよい。例えば、結合親和性は、抗体コーティングされたＥＬＩＳＡプレート上でポリペプチドのサンプルを捕捉し、ビオチン化された所定の標的またはそのフラグメント、続いてストレプトアビジンコンジュゲート化ＨＲＰを加える実験において試験してもよい。ＴＭＢ基質を加え、そしてマルチウェルプレートリーダー、例えばビクター^３（Victor³）（パーキンエルマー（Perkin Elmer））を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定する。次いで、当業者は、このような実験によって得られた結果を解釈して所定の標的に関して少なくとも複合体の結合親和性の定性的尺度を確立してもよい。また、定量的尺度が望ましい場合、例えば相互作用に関するＥＣ５０値（最大半減有効濃度）を決定するため、ＥＬＩＳＡを用いてもよい。上記のようにＥＬＩＳＡを用いて、所定の標的またはそのフラグメントの希釈系列に対するポリペプチドの反応を測定する。次いで、当業者は、このような実験によって得られた結果を解釈してもよく、例えばグラフパッドプリズム５（GraphPad Prism 5）および非線形回帰を用いて結果からＥＣ５０値を算出してもよい。

前述のとおり、Ｚ変異体ポリペプチドは、３－ヘリックスバンドルタンパク質ドメインを構成するか、またはその一部を形成すると考えられ、そのモチーフは、上記３－ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で、相互接続ループと共に２本のアルファヘリックスの部分を本質的に形成する所定の標的に対する親和性を有する。

本発明の範囲を逸脱することなく、意図する特定の使用に合わせてポリペプチドを作るために、上に定義されたようなポリペプチドの種々の修飾、および／またはそれへの付加を実施してもよい。このような修飾および付加は、以下により詳細に記載されており、同じポリペプチド鎖に含まれるさらなるアミノ酸、または化学的にコンジュゲートされた、もしくは別の方法でポリペプチドに結合された標識および／もしくは治療剤を含んでもよい。

したがって、一実施態様において、さらなるアミノ酸残基を含む上記のようなポリペプチドが提供される。

いくつかの実施態様において、さらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドのＣ末端にあってもよい。

いくつかの実施態様において、さらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドのＮ末端にあってもよい。

一実施態様において、Ｃ末端の上記さらなるアミノ酸残基は、ＡＰを含む。

一実施態様において、Ｎ末端の上記さらなるアミノ酸残基は、ＡＥＡＫＹＡＫを含む。

さらに別の実施態様において、上記のようなポリペプチドを提供し、それは、Ｎ末端で０から７個までのさらなるアミノ酸残基Ｃ末端でおよび０から３個までのさらなるアミノ酸残基を有する配列ｉ）またはｉｉ）からなる。

さらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドの結合において役割を果たしうるが、しかし、例えばポリペプチドの産生、精製、安定化、カップリングまたは検出の１つまたはそれ以上に関連した他の目的に同様に十分役立つこともありうる。

いくつかの実施態様において、上記さらなるアミノ酸残基は、１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを構成する。

このようなさらなるアミノ酸残基は、化学的カップリングのために付加された１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。この一例は、ポリペプチド鎖中のいちばん最初のまたはいちばん最後の位置での、すなわちＮ末端またはＣ末端でのシステイン残基の付加である。また、化学的カップリングに用いるシステイン残基は、タンパク質ドメインの表面における、好ましくは標的結合に関与しない表面の一部における別のアミノ酸の置換によって導入してもよい。このようなさらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」、例えばヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ_６）タグ、またはそのタグに特異的な抗体と相互作用するための「ｍｙｃ」タグもしくは「ＦＬＡＧ」タグを含んでもよい。他の代替物は当業者に知られている。

また、上で議論した「さらなるアミノ酸残基」は、任意の所望の機能、例えば別の結合機能、または半減期延長機能、または酵素的機能、または金属イオンキレート化機能、または蛍光機能、またはそれらの任意の組合せを有する１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを構成してもよい。

実施態様の一例において、所定の標的に対する親和性を有する化合物が提供され、上記化合物は、
Ａ．上に定義された少なくとも１つのポリペプチド；
Ｂ．連鎖球菌Ｇタンパク質の少なくとも１つのアルブミン結合ドメイン、またはその誘導体；および
Ｃ．場合により、上記少なくとも１つのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体を、上記少なくとも１つのポリペプチドのＣまたはＮ末端に連結するための少なくとも１つの連結部分
を含む。

連鎖球菌Ｇタンパク質のアルブミン結合ドメインの誘導体の非限定的な例は、ＷＯ２００９／０１６０４３およびＷＯ２０１２／００４３８４に開示される。

また、さらなる実施態様において、上に定義されたポリペプチドが提供され、それは、
ＹＡＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰ；および
ＦＮＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰ
［配列中、各Ｘｙは、上に定義されたとおりである（そしてｙは、上のｉ）によって定義されたポリペプチド配列内の残基Ｘのアミノ酸位置を表す）］
から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施態様において、ポリペプチドが提供され、それは、
ＡＤＮＮＦＮＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰＫ；
［配列中、Ｘｙは、上に定義されたとおりである（そして、ｙは、上のｉ）によって定義されたポリペプチド配列内の残基Ｘのアミノ酸位置を表す）］
から選択されるアミノ酸配列を含む。

本明細書に開示されたポリペプチド変異体は、例えば知られている骨格に基づき、かつ所定の標的に対する親和性を有するＺ変異体ポリペプチドを取り上げ、そして選択された位置で部位特異的突然変異誘発を実施して、本開示による骨格を有し、標的親和性を保持しているポリペプチドを得ることによって生成してもよい。別法として、本開示によるポリペプチドは、分子全体の化学合成によって、またはＺ変異体ポリペプチドの結合モチーフを本明細書に開示された骨格上へ移植するための、当業者に知られている、他の分子生物学的方法を用いることによって作製してもよい。

一般的な実例として、以下の共通の骨格配列を含み、かつ結合モチーフ［ＢＭ］：
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ
内のアミノ酸配列によって定義された結合特異性を有する元の（original）Ｚ変異体ポリペプチドを修飾して本明細書に開示されたポリペプチドを提供してもよい。

本開示のこの態様のさまざまな具体的実施態様において、以下のポリペプチド：
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＳＳＱＡＰＫ
が提供される。

本明細書に開示されたポリペプチドは、多くの用途、例えば疾患に関する治療上の、診断上のまたは予後の有意性の用途を有する。上記ポリペプチドについて、治療上の、診断上のまたは予後の使用を見いだしうる疾患の非限定的なリストには、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、神経系疾患、神経変性疾患、眼疾患、腎疾患、肺疾患、消化管の疾患、心血管疾患、血液疾患、皮膚疾患、アレルギーおよびその他が含まれる。

したがって、一実施態様において、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドが提供される。より具体的な実施態様において、上記標的は、ＨＥＲ２、ＴＮＦα、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｇＧ、ＰＤＧＦＲβ、ＨＥＲ３、Ｃ５、ＦｃＲｎ、ＣＡＩＸ、アミロイドβ、ＣＤ４、ＩＬ８、ＩＬ６およびインスリンからなる群から選択される。別の実施態様において、上記ポリペプチドは、バイオテクノロジー、産業および医薬用途において、例えば分離技術、精製用途における親和性リガンドとして、または検出剤として有用でありうる。より具体的なこのような実施態様において、所定の標的は、連鎖球菌Ｇタンパク質からのアルブミン結合ドメイン（「ＡＢＤ」または「ＧＡモジュール」）またはその誘導体であってもよい。

所定の標的のリストが非限定的なものとみなされ、かつ他の所定の標的に対する親和性を有する本明細書に定義されたポリペプチドが本開示の範囲内にあることは、当業者にとって明らかであろう。

知られている骨格に基づき、かつ異なる標的に対する親和性を有する知られているＺ変異体ポリペプチドの非限定的な例は、ＥＧＦ受容体（ＷＯ２００７／０６５６３５に開示された）に対する、ＨＥＲ２受容体（ＷＯ２００９／０８０８１０に開示された）に対する、ＨＥＲ３受容体（ＷＯ２０１０／０５６１２４に開示された）に対する、ＩＧＦ１受容体（ＷＯ２００９／０１９１１７に開示された）に対する、ＰＤＧＦ受容体β（ＷＯ２００９／０７７１７５に開示された）に対する、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）（ＷＯ２０１４／０６４２３７に開示された）に対する、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５５２９９に開示された）に対する、そして炭酸脱水酵素ＩＸ（ＷＯ２０１４／０９６１６３に開示された）に対する親和性を有するＺ変異体である。明確にするため、本開示において、Ｚ変異体の結合モチーフ［ＢＭ］は上に記載された文献に開示されたそれらの結合モチーフの最初の２８個のアミノ酸残基に相当し、その際、結合モチーフの定義は２９個のアミノ酸残基であり、そして上の配列ｉ）の位置１～２９に相当する位置のアミノ酸残基に相当することに留意すること。

一実施態様において、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドが提供され、それは、標識、例えば、蛍光色素および金属、発色団色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および粒子からなる群から選択される標識をさらに含む。このような標識は、例えばポリペプチドの検出に用いてもよい。

いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、所望の生物活性を有する第２の部分も含んでいる融合ポリペプチドまたはコンジュゲートの一部として存在する。このような所望の生物活性の非限定的な例としては、治療活性、結合活性および酵素活性が含まれる。

いくつかの実施態様において、上記部分は、標識をさらに含む。標識は、場合によっては、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドにのみ結合していてもよく、場合によっては、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドと、コンジュゲートまたは融合ポリペプチドの第２の部分との両方に結合していてもよい。さらにまた、標識が第２の部分のみ結合しており、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドに結合していなくてもよいことも可能である。したがって、さらに別の実施態様において、第２の部分を含む所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドが提供され、ここで、上記標識は、第２の部分のみに結合されている。

本明細書に開示されたポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、検出試薬、捕捉試薬として、分離試薬として、インビボもしくはインビトロでの診断用の診断剤として、または治療剤として用いることができる。本開示によるポリペプチドまたは融合ポリペプチドをインビトロで用いる方法は、種々のフォーマット、例えばマイクロタイタープレート、タンパク質アレイ、バイオセンサー表面、組織切片などにおいて実施してもよい。

また、本開示によるポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、例えば上記標的において直接的または間接的な効果を有する、治療剤、診断剤もしくは予後剤としてそれ自体で、または他の治療剤、診断剤もしくは予後剤を標的化するための手段として有用でありうることを理解すべきである。直接的な治療効果は、例えば上記標的によってシグナル伝達を阻害することによって実施してもよい。上記標的は、特定の疾患（例えば上記の疾患）の予後を予測するための有益なマーカーとして役立つこともありうる。

したがって、一実施態様において、治療に使用するための、または診断剤として使用するための、本明細書に記載されたようなポリペプチドまたは融合ポリペプチドが提供される。別の実施態様において、上記ポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、治療剤をさらに含む。このような治療剤の非限定的な例としては、上記ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの効果を増強する治療剤、上記ポリペプチドまたは融合ポリペプチドとの相乗効果で作用する治療剤および処置すべき疾患の種々の態様に作用する治療剤である。また、本明細書に開示されたポリペプチドを含む医薬組成物は、単独でまたはさらなる治療剤と一緒に想定されている。

本開示の第２の態様において、本明細書に記載されたポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。また、このようなポリヌクレオチドを発現することを含む、上記のようなポリペプチドまたは融合ポリペプチドを産生する方法；ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；および上記発現ベクターを含む宿主細胞も本開示によって包含される。

本開示の第３の態様において、共通の骨格に基づくポリペプチド変異体の集団が提供され、その集団中のそれぞれのポリペプチドは、
ｉ）ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７Ｑ、
（配列中、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２５およびＸ_２８のそれぞれは、独立していずれかのアミノ酸残基に相当し；そして配列中、互いに独立して、
Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ_３５は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_３６は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ_３９は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ_４５は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_４６は、Ｄ、ＥおよびＳから選択されるが、但し、Ｘ_４５がＮであるとき、Ｘ_４６はＤではなく；
Ｘ^４７は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ_４５がＮであるとき、Ｘ_４６はＤではない、
から選択されるアミノ酸配列を含む。

上の配列ｉ）において、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２５およびＸ_２８のそれぞれは、集団中で変更されたアミノ酸残基に個々に相当する。したがって、それぞれのこのようなアミノ酸残基は、本開示の第１の（ポリペプチド）態様に関連して、上で説明したように、配列中にＸｙと表された他のいずれの残基の同一性とも無関係の任意のアミノ酸残基であってもよい。ポリペプチドの集団中の特定のアミノ酸残基Ｘｙに関する、および配列ｉ）またはｉｉ）のいずれかの末端での任意のさらなるアミノ酸残基に関する非限定的な選択肢は、本開示の第１の態様の実施態様として上に記載されたものと同じである。

上に議論したように、ほとんど三次構造およびその機能に影響を及ぼすことなく、上のアミノ酸配列と比較してより少ない変化を含むポリペプチドも、本開示の範囲内にある。したがって、また、共通の骨格に基づくポリペプチド変異体の集団であって、集団中のそれぞれのポリペプチドがｉ）に定義されたような配列に対して９１％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む集団が本開示よって包含される。いくつかの実施態様において、それぞれのポリペプチドは、ｉ）に定義されたような配列に対して少なくとも９３％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％同一である配列を含んでもよい。

本明細書に定義された集団は、定義されたポリペプチド分子の多数の独特な（unique）および種々の変異体からなる。この文脈において、多数とは、例えば、その集団が少なくとも１×１０^４個の独特なポリペプチド分子、または少なくとも１×１０^６、少なくとも１×１０^８、少なくとも１×１０^１０、少なくとも１×１０^１２、もしくは少なくとも１×１０^１４個の独特なポリペプチド分子を含むことを意味しうる。当業者に認められるように、それは、集団の望ましいサイズを提供するのに十分大きな群を用いることが必要である。また、本明細書に記載された「集団」は、「ライブラリー」と表してもよい。

本明細書に開示された集団が、ｉ）に定義されたポリペプチドに基づく新たな結合分子の選択のためのライブラリーとして有用でありうることは、当業者に明らかであろう。ランダム化されたポリペプチドの集団（またはライブラリー）から結合分子を単離しうることは、当分野でよく知られている。この技術は、ＰＣＴ公報ＷＯ９５／１９３７４、Nord
et al (1997) Nature Biotechnology 15:772-777、およびＷＯ２００９／０８０８１１に一般的な用語で記載されており、そして１３箇所の異なる標的結合位置をランダムに変え、その後、ファージディスプレイまたは遺伝子型－表現型カップリングに基づく他の選択システムにおいて興味の結合剤を選択することにより、さまざまな標的分子に対して共通のＺドメイン骨格に基づく結合分子を選択するために適用することに成功している。本明細書に開示された集団は、先行技術の集団と比較して、特に安定性に関して改善された性質を示すポリペプチド変異体の集団である。ランダム化されたポリペプチドの集団（または、ライブラリー）から単離されたＺ変異体の例としては、ＥＧＦレセプター（ＷＯ２００７／０６５６３５に開示された）に対する、ＨＥＲ２受容体（ＷＯ２００９／０８０８１０に開示された）に対する、ＨＥＲ３受容体（ＷＯ２０１０／０５６１２４に開示された）に対する、ＩＧＦ１受容体（ＷＯ２００９／０１９１１７に開示された）に対する、ＰＤＧＦ受容体β（ＷＯ２００９／０７７１７５に開示された）に対する、ＡＢＤ（ＷＯ２０１４／０６４２３７に開示された）に対する、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５５２９９に開示された）に対する、そして炭酸脱水酵素ＩＸ（ＷＯ２０１４／０９６１６３に開示された）に対する親和性を有するＺ変異体が含まれる。

本開示の第４の態様において、ポリヌクレオチドの集団が提供される。この集団中のそれぞれのポリヌクレオチドは、第３の態様に関連して上に定義されたようなポリペプチドの集団のメンバーをコードしている。

本開示の第５の態様において、第３の態様によるポリペプチド集団と、第４によるポリヌクレオチド集団との組合せが提供され、この組合せにおいて、ポリペプチド集団のそれぞれのメンバーは、遺伝子型－表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコードしている対応するポリヌクレオチドと物理的にまたは空間的に関連している。この物理的または空間的関連は、使用するシステムに応じて、多かれ少なかれ厳密になるであろう。遺伝子型－表現型カップリング（genotype-phenotype coupling）手段は、ファージディスプレイシステムを含んでもよい。ファージディスプレイシステムは、当業者によく知られており、例えば、Smith GP (1985) Science 228:1315-1317およびBarbas CF et al (1991) Proc Natl Acad Sci U S A 88:7978-7982に記載されている。

さらにまた、遺伝子型－表現型カップリング手段は、細胞表面ディスプレイシステムを含んでもよい。細胞表面ディスプレイシステムは、原核細胞、例えばグラム陽性細胞または真核細胞、例えば酵母細胞を含んでもよい。細胞表面ディスプレイシステムは、当業者によく知られている。原核細胞システムは、例えば、Francisco JA et al (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90:10444-10448およびLee SY et al (2003) Trends Biotechnol 21:45-52に記載されている。真核細胞システムは、例えば、Boder ET et al (1997) Nat Biotechnol 15:553-557およびGai SA et al (2007) Curr Opin Struct Biol 17:467-473に記載されている。一実施態様において、上記遺伝子型－表現型カップリングは、ファージディスプレイシステムを含んでもよい。

さらにまた、遺伝子型－表現型カップリング手段は、無細胞ディスプレイシステムを含んでもよい。無細胞ディスプレイシステムは、リボソームディスプレイシステム、またはインビトロ区画化ディスプレイシステム（in vitro compartmentalization display system）、またはシスディスプレイ用のシステム（system for cis display）、またはミクロビーズディスプレイシステムを含んでもよい。リボソームディスプレイシステムは、当業者によく知られており、例えば、Mattheakis LC et al (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91:9022-9026およびZahnd C et al (2007) Nat Methods 4:269-279に記載されている。インビトロ区画化システムは、当業者によく知られており、例えば、Sepp A et al (2002) FEBS Lett 532:455-458に記載されている。シスディスプレイシステムは、当業者によく知られており、例えば、Odegrip R et al (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101:2806-2810に記載されている。ミクロビーズディスプレイシステムは、当業者によく知られており、例えば、Nord O et al (2003) J Biotechnol 106:1-13に記載されている。

さらにまた、遺伝子型－表現型カップリング手段は、非ディスプレイシステム、例えばタンパク質－フラグメント相補性アッセイ（ＰＣＡ）を含んでもよい。ＰＣＡシステムは、当業者によく知られており、例えば、Koch H et al (2006) J Mol Biol 357:427-441に記載されている。

本開示の第６の態様において、ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択する方法であって、
（ａ）第３の態様によるポリペプチドの集団を準備するステップと；
（ｂ）標的と、その標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用が可能となる条件下でポリペプチドの集団を所定の標的と接触させるステップと；
（ｃ）上記特異的相互作用に基づいて、ポリペプチドの残りの集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択するステップと
を含む方法が提供される。

以下において、この方法は、本開示による「選択方法」と称する。

ステップ（ａ）は、ポリヌクレオチドの集団を準備し、そしてポリヌクレオチドの上記集団を発現させてポリペプチドの上記集団を得る準備ステップを含んでもよい。ポリペプチドの集団を得るための手段は、使用するディスプレイシステムに応じて変わり、このような手段の例は、上の遺伝子型－表現型の文献に見いだすことができる。選択方法で用いるポリペプチドの上記集団のそれぞれのメンバーを、遺伝子型－表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコードするポリヌクレオチドと物理的に関連付けてもよい。遺伝子型－表現型カップリング手段は、上に議論されたものの１つであってもよい。

ステップ（ｂ）は、標的と、標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの特異的相互作用が可能となる条件下でポリペプチドの集団を所定の標的と接触させるステップを含む。適用できる条件の範囲は、標的のロバストネス（robustness）、ディスプレイシステムのロバストネス、および標的との相互作用の所望の性質によって決定される。例えば、所定のｐＨへの酸性化といったような相互作用を分離する具体的方法が望ましいこともありうる。当業者は、適した条件を決定するにはどんな実験が必要か知っている。

ステップ（ｃ）は、少なくとも１つのポリペプチドの選択を含む。所定の標的と、標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用に基づいて残りの集団から所望のポリペプチドを選択する手段は、使用するディスプレイシステムに応じて変わり、上の遺伝子型－表現型の文献に見いだすことができる。例えば、インビトロディスプレイ選択システムは、ファージディスプレイおよびタンパク質フラグメント区画化アッセイのようなシステムと対照的に無細胞である。

本開示の第７の態様において、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する方法であって、
・第６の態様による選択方法を用いて、ポリペプチドの集団から、上記所望のポリペプチドおよびそれをコードしているポリヌクレオチドを選択するステップと；
・こうして分離された所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと
を含む方法が提供される。

以下において、この方法は、本開示による「単離方法」と称する。

ポリペプチドからのポリヌクレオチドの分離は、選択に用いるディスプレイシステムに応じて異なるやり方で行ってもよい。例えば、シスディスプレイおよびリボソームディスプレイのような無細胞ディスプレイシステムでは、ポリヌクレオチドまたは対応するｍＲＮＡは、上の遺伝子型－表現型の文献で記載された手段を用いてポリペプチドからの効率的溶離により回収される。ポリヌクレオチドの単離は、選択に用いるディスプレイシステムに応じて異なる方法によって行ってもよい。上記の選択システムのほとんど、例えば、タンパク質フラグメント相補性アッセイにおいて、ポリヌクレオチドは、適当なオリゴヌクレオチドを用いる特異的ＰＣＲ増幅によって直接単離することができる。また、リボソームディスプレイにおけるように、ポリヌクレオチドは、逆転写を用いて対応するｍＲＮＡから単離することができる。ポリヌクレオチドを単離するためのさまざまな手段は、上の遺伝子型－表現型の文献に見いだすことができる。

本開示の第８の態様において、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを特定する方法であって、
・第７の態様による単離方法を用いて、上記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；
・ポリヌクレオチドを配列決定して、上記所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推論することによって確定するステップと
を含む方法が提供される。ポリヌクレオチドの配列決定は、当業者によく知られた標準的な方法に従って行ってもよい。

本開示の第９の態様において、ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択および特定する方法であって、
（ａ）第３の態様によるポリペプチドの集団のそれぞれのメンバーを個々の担体またはビーズ上で合成するステップと；
（ｂ）ポリペプチドと所定の標的との相互作用に基づいて担体またはビーズを選択または富化するステップと；
（ｃ）タンパク質特性評価方法論によってポリペプチドを特定するステップと
を含む方法が提供される。

ステップ（ｃ）では、例えば質量分光分析を用いることが可能である。

以下において、この方法は、本開示による「選択および同定方法」と称する。

本開示の第１０の態様おいて、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生する方法であって、
・第６の態様による選択方法または第９の態様による選択および特定方法を用いて所望のポリペプチドを選択および特定するステップと；
・上記所望のポリペプチドを産生するステップと
を含む方法が提供される。

以下において、この方法は、本開示による「産生方法」と称する。

産生方法において、産生は、所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの組換え発現を用いて実施してもよい。産生は、新たに所望のポリペプチドの化学合成を用いて実施してもよい。

本開示の第１１の態様において、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ１）第７の態様による単離方法を用いて、上記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；または
（ａ２）第９の態様による選択および特定方法を用いて、特定されたポリペプチドを逆翻訳するステップと；
（ｂ）こうして単離されたポリヌクレオチドを発現させて上記所望のポリペプチドを産生するステップと
を含み、その際、ステップ（ｂ）をステップ（ａ１）またはステップ（ａ２）の後に実施する方法が提供される。

本開示によるポリペプチド、集団および方法は、所定の標的に対する特異的結合を特徴とするポリペプチドの供給により、所定の標的に対する親和性を有する物質の供給を可能にする。

非特異的結合を少ししかまたは全く示さない所定の標的に結合するポリペプチドを提供することも可能である。

融合ポリペプチドの一部として容易に用いることができる所定の標的に結合するポリペプチドを提供することも可能である。

さらにまた、既存の抗体試薬で遭遇する知られている問題の１つまたはそれ以上を解決する、所定の標的に結合するポリペプチドを提供することが可能である。

さらに、治療および／または診断用途における使用に適した、所定の標的に結合するポリペプチドを提供することが可能である。

化学的ペプチド合成によって容易に作られた、所定の標的に結合するポリペプチドを提供することも可能である。

さらにまた、本発明は、同じ標的に結合する知られている物質と比べて改善された安定性を示す、所定の標的と結合するポリペプチドの特定を可能にする。

哺乳動物中にインビボで用いたときに低い抗原性を示す、かつ／または哺乳動物に投与すると改善された体内分布を示す、所定の標的に結合するポリペプチドを提供することも可能である。

本開示による集団を構成しているポリペプチドに関する上で議論された修飾は、上記の方法のいずれかによって得られたポリペプチドにもあてはまる。

本開示によるポリペプチドは、化学合成、または細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、全植物およびトランスジェニック動物を含む、種々の原核細胞もしくは真核細胞宿主中での発現を含む、任意の知られている手段で産生してもよい。

ポリペプチド、ポリペプチドの集団および本明細書に開示された特定、選択、単離および産生の方法を、さまざまな例示的な態様および実施態様に関して記載してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、さまざまな変更を行うことができ、その要素を同等のもので置換できることは、当業者に理解されるであろう。さらに、本発明の必須の範囲を逸脱することなく、特定の状況または分子を本発明の教示に適合させるために多くの改変を行ってもよい。したがって、本開示は、企図された任意の特定の実施態様に限定されることなく、添付の特許請求の範囲内にあるすべての実施態様を含むものとする。

本明細書に開示されたポリペプチドの例のアミノ酸配列のリストである。実施例２～３で改善された安定性を有することが示されたＣ５結合Ｚ変異体ポリペプチド配列が、図１に配列番号：１２、１７、１８および２２として記載されており、本明細書に定義された最も短い配列に相当するその配列は、配列番号：１９～２１として記載されている。アルブミン結合ドメインに融合したＣ５結合ポリペプチドのアミノ酸配列は、図１において、配列識別子配列番号：４～１１、１３～１６および２３～２５を有する。改善された安定性を有することが実施例１２で示された、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦ－Ｒβ、ＦｃＲｎおよびＣＡＩＸに対する親和性を有するＺ変異体ポリペプチドの配列は、それぞれ配列番号：２８～２９、配列番号：３１～３２、配列番号：３４～３５および配列番号：３７～４２として、対応する対照ポリペプチド配列番号：２７、３０、３３および３６と共に記載されている。本明細書に定義された最も短い配列に相当する、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦ－Ｒβ、ＦｃＲｎおよびＣＡＩＸに対する親和性を有する上記Ｚ変異体ポリペプチドの配列は、配列番号：４３～５４として記載されている。さらに、対照Ｃ５結合ポリペプチド、アルブミンに融合する対照Ｃ５結合ポリペプチド、アルブミン結合ドメインおよびヒトＣ５のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号：２６、１、２および３として記載されている。図１Ａの続き。図１Ｂの続き。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像であり、図中、第１のレーンは、SeeBlue 2Pサイズマーカーを含有し、バンドは、（０）安定性試験前；および（２ｗ）２週間の安定性試験後のＣ５結合ポリペプチドＰＳＩ０２４２（配列番号：１）を表す。安定性試験前（実線）および２週間の安定性試験後（点線）のＰＳＩ０２４２（配列番号：１）の逆相ＨＰＬＣからのクロマトグラムである。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像であり、図中、第１のレーンはSeeBlue 2Pサイズマーカーを含有し、バンドは、（０）初期サンプル；および（２ｗ）２週間安定性試験後のサンプルを表す。Ａ．配列番号：１；Ｂ．配列番号：１３；Ｃ．配列番号：１４；Ｄ：配列番号：１６。安定性試験前（実線）および２週間の安定性試験後（点線）の修飾されたＣ５阻害薬（配列番号：５）の逆相ＨＰＬＣからのクロマトグラムである。安定性試験前（実線）および２週間の安定性試験後（点線）の修飾されたＣ５阻害薬（配列番号：１６）の逆相ＨＰＬＣからのクロマトグラムである。Ａ．Ｚ１７３５１（配列番号：３７）；Ｂ．Ｚ１７３５２（配列番号：３８）に関して集めたスペクトルである。Ｃ．Ｚ１７３５５（配列番号：３９）；Ｄ．Ｚ１７３５７（配列番号：４０）に関して集めたスペクトルである。Ｅ．Ｚ１７３５９（配列番号：４１）；Ｆ．Ｚ１７３６０（配列番号：４２）に関して集めたスペクトルである。Ｇ：Ｚ０９７８２（配列番号：３６）に関して集めたスペクトルである。２週間の安定性試験の前（０）および後（２ｗ）の元のおよび発明のポリペプチドを示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像である。Ａ：ＨＥＲ２を標的とするポリペプチド：レーン１：Ｍｗ、レーン２：Ｚ０２８９１（０）、レーン３：Ｚ０２８９１（２ｗ）、レーン４：Ｍｗ、レーン５：Ｚ１７３４１（０）、レーン６：Ｚ１７３４１（２ｗ）、レーン７：Ｚ１７３４２（０）、レーン８：Ｚ１７３４２（２ｗ）；Ｂ．ＰＤＧＦ－Ｒβを標的とするポリペプチド：レーン１：Ｍｗ、レーン２：Ｚ１５８０５（０）、レーン３：Ｚ１５８０５（２ｗ）、レーン４：Ｍｗ、レーン５：Ｚ１７３４３（０）、レーン６：Ｚ１７３４３（２ｗ）、レーン７：Ｚ１７３４４（０）、レーン８：Ｚ１７３４４（２ｗ）；Ｃ．ＦｃＲｎを標的とするポリペプチド：レーン１：Ｚ１０１０３（０）、レーン２：Ｚ１０１０３（２ｗ）、レーン３：Ｍｗ、レーン４：Ｚ１７３４７（０）、レーン５：Ｚ１７３４７（２ｗ）、レーン６：Ｚ１７３４８（０）、レーン７：Ｚ１７３４８（２ｗ）；およびＤ．ＣＡＩＸを標的とするポリペプチド：レーン１：Ｍｗ、レーン２：Ｚ０９７８２（０）、レーン３：Ｚ０９７８２（２ｗ）、レーン４：Ｍｗ、レーン５：Ｚ１７３５１（０）、レーン６：Ｚ１７３５１（２ｗ）、レーン７：Ｚ１７３５２（０）、レーン８：Ｚ１７３５２（２ｗ）；レーン９：Ｚ１７３５５（０）、レーン１０：Ｚ１７３５５（２ｗ）、レーン１１：Ｚ１７３５７（０）、レーン１２：Ｚ１７３５７（２ｗ）、レーン１３：Ｚ１７３５９（０）、レーン１４：Ｚ１７３５９（２ｗ）、レーン１５：Ｚ１７３６０（０）、レーン１６：Ｚ１７３６０（２ｗ）。分子サイズマーカー（Ｍｗ）は、Novex^（R）Sharp Pre-stained Protein Standard（２１６、１６０、１１０、８０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、３．５ｋＤａ）であった。（図８Ｃに見られる斜めのバンドは、同じ容器中で染色された第２のゲルの痕跡から生じる人為的な結果である）。図８－１の続き。図８－２の続き。図８－３の続き。位置５２～５３（黒色）にＮＤからＳＥのアミノ酸置換を含むＺ変異体および２週間の安定性試験後に同じ標的に対する親和性を有する元のＺ変異体（灰色）の結合のセンサーグラムを示す。Ａ：ＨＥＲ２に対するＺ０１７３４１（配列番号：２８）およびＺ０２８９１（配列番号：２７）の結合；Ｂ：ＰＤＧＦ－Ｒβに対するＺ０１７３４３（配列番号：３１）およびＺ１５８０５（配列番号：３０）の結合；Ｃ：ＦｃＲｎに対するＺ０１７３４７（配列番号：３４）およびＺ１０１３０（配列番号：３３）の結合およびＤ：ＣＡＩＸに対するＺ０１７３５１（配列番号：３７）およびＺ０９７８２（配列番号：３６）の結合。それぞれのＺ変異体の注射濃度は、実施例１３に記載した。図９－１の続き。図９－２の続き。図９－３の続き。

以下の実施例は、改善された安定性を示す新規なＺ変異体ポリペプチドを開示している。本明細書では、以前の骨格生成に基づくＺ変異体ポリペプチドの性質を、本明細書に開示された骨格に基づくＺ変異体ポリペプチドと比較した。

〔比較実施例１〕知られているＣ５結合Ｚ変異体の安定性試験
ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）で表したＣ５結合Ｚ変異体を、２５ｍＭＮａＰ／１２５ｍＭＮａＣｌｐＨ７．０中で調製し、３７℃で２週間の加速安定性研究にかけた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＣ）によって、安定性試験後の新たな変異体の出現により安定性を測定した。両分析では、初期サンプルおよび安定性研究にかけたものを並行して実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、タンパク質７．５μｇを各ウェルに装填した。ＲＰＣは、Agilent 1100 HPLCにおいて、水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなる移動相Ａ、および０．１％ＴＦＡ／４５％ＭｅＯＨ／４５％イソプロピルアミン（ＩＰＡ）／１０％水からなる移動相Ｂを用いて実施した。

結果は、タンパク質の新たな形態がインキュベーション中に形成され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図２）中にバンドとして、そして逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＣ）クロマトグラム（図３）中に新たなピークとして視覚化されたことを示している。図３において、２週間のインキュベーション後の主要ピークは、元のタンパク質サンプルの５７％に相当する。

配列番号：１の位置１～６０は、配列番号：７５３としてＷＯ２０１３／１２６００６に以前に開示されたポリペプチドＺ０６１７５ａに相当する。

〔実施例２〕修飾されたＣ５結合ポリペプチドおよび化合物の安定性試験
修飾されたＣ５結合ポリペプチドおよび化合物を本質的にＷＯ２０１３／１２６００６に記載されたとおり合成し、そして精製した。

簡潔に言えば、Ｃ５結合Ｚ変異体をコードしているＤＮＡは、GeneArt, GmbHによって最適化され、そして合成されたE. coliコドンであった。新たなＣ５結合Ｚ変異体を表す合成遺伝子をサブクローニングし、そしてE. coli中で発現させた。

細胞内に発現されたＺ変異体を、慣用のクロマトグラフ法を用いて精製した。ホモジナイズおよび清澄化は、超音波処理、続いて遠心分離および濾過よって実施した。陰イオン交換クロマトグラフィーを捕捉ステップとして用いた。さらなる精製を疎水的相互作用クロマトグラフィーによって行った。精製は、酸性条件（ｐＨ５．５）で実行した。研磨（polishing）および緩衝液交換は、サイズ排除クロマトグラフィーによって実施した。

精製されたタンパク質を２５ｍＭＮａＰ／１２５ｍＭＮａＣｌｐＨ７．０中で調製し、そして３７℃で２週間の加速安定性研究にかけた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＣ）によって、安定性試験後の新たな変異体の出現により安定性を測定した。両分析では、初期サンプルおよび安定性研究にかけたものを並行して実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、タンパク質７．５μｇを各ウェルに装填した。生成したゲルの例を図４に示す。

ＲＰＣは、Agilent 1100 HPLCにおいて、水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなる移動相Ａ、および０．１％ＴＦＡ／４５％ＭｅＯＨ／４５％のイソプロピルアミン（ＩＰＡ）／１０％水からなる移動相Ｂを用いて実施した。配列番号：５に関して生成したクロマトグラムの例を図５に示す。

安定性試験の結果を、表１にまとめる。

表１から、特定の修飾されたＣ５結合ポリペプチドまたは化合物は、ＰＳＩ０２４２と比較したときに、増加した安定性のような改善された性質を有することが結論付けられた。このような改善されたＣ５結合ポリペプチドまたは化合物としては、ＰＳＩ０３３４（配列番号：５）、ＰＳＩ０３４０（配列番号：１０）、ＰＳＩ０３６９（配列番号：１１）、ＰＳＩ０３７７（配列番号：１２）、ＰＳＩ０３７８（配列番号：１３）、ＰＳＩ０３７９（配列番号：１４）、ＰＳＩ０３８１（配列番号：１５）、ＰＳＩ０３８３（配列番号：１６）、ＰＳＩ０４００（配列番号：２２）、ＰＳＩ０４１０（配列番号：２３）、ＰＳＩ０４０３（配列番号：２４）およびＰＳＩ０４０４（配列番号：２５）が含まれる。前述の変異体の６つ（配列番号：５、１２、１３、１４、１６および２２）は、位置５２～５３のアミノ酸残基が、ＮＤ（参照ＰＳＩ０２４２）からＳＥに置換されていることで共通している。配列番号：１５では、置換がＮＤからＥＳに相当する。配列番号：２４では、位置５３のアミノ酸残基のみがＤからＥに置換されているのに対して、配列番号：２５では、位置５２のアミノ酸残基がＮからＳに置換されている。

〔実施例３〕修飾された化合物のヒトＣ５に対する結合
ヒト血清アルブミンを、アミンカップリングによってアミン反応性第二世代（Amine Reactive 2nd generation）（ＡＲ２Ｇ）ディップアンドリードバイオセンサ（Dip and Read Biosensors）（ポールライフサイエンシズ（Pall Life sciences）（ForteBio）Cat # 18-5092）に固定した。リードバッファー（read buffer）（ＨＢＳ－ＥＰバッファー［１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０］、ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）、カタログ番号ＢＲ１００１８８）中のＰＳＩ０２４２（配列番号：１；１μＭ）および修飾されたＣ５結合化合物（１μＭ）を、それぞれＨＳＡと共に別々のセンサ上に１２０秒間装填し、続いてリードバッファー中で６０秒間のベースライン記録後、リードバッファー中０．７９ｎＭから２５ｎＭの範囲の濃度でヒトＣ５（クイデル（Quidel）、カタログ番号Ａ４０３））にかけ、各濃度の間に再生サイクルおよびベースライン記録した。センサの再生条件は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ２（３０秒で３回のパルスおよび６０秒間のランニングバッファー（running buffer））であった。それぞれのスペクトログラムは、アルブミン結合ドメイン（配列番号：２）を含有するがＣ５結合能力のない類似の構築物のそれに対して基準値を減算した。ForteBio Analysis 7.1（Pall Life sciences（ForteBio）動態ソフトウェア）を用いて、ラングミュア１：１モデルに従ってデータを分析した。

ＰＳＩ０２４２（配列番号；１）とＣ５との相互作用の相対Ｋ_Ｄを表２に示す。ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）のＫ_Ｄは、種々の実行において１～３ｎＭ変動する。

表２の結果は、本開示によるＣ５結合化合物が、ＷＯ２０１３／１２６００６に開示されたポリペプチドＰＳＩ０２４２（配列番号：１）のものと類似したヒトＣ５に対する結合能力を有することを示している。

〔実施例４〕化学合成されたＣ５結合ポリペプチドの安定性
化学合成されたＰＳＩ０４００（配列番号：２２）をバッヘムＡＧ（BACHEM AG）に注文した。ポリペプチドの安定性を実施例２と同じ方法論に従って試験した。安定性試験の結果を表３に示す。

ＰＳＩ０４００の安定性は、実施例２のE. coli中で産生された同じポリペプチドに匹敵した。

ＵＶ円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを用いて、ＰＳＩ０４００（配列番号：２２）の折り畳みの完全性を、実施例２の方法に従って産生された組換えＣ５結合ポリペプチド（ＰＳＩ０２５７、配列番号：２６）と比較した。

ＣＤスペクトルは、Ｊ－７２０ＣＤ分光偏光計（ジャスコ（Jasco）、日本）によって記録した。Ｐｉバッファー（５ｍＭＮａ－Ｋ－ＰＯ４、ｐＨ７．０）を用いてサンプルを０．１７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した。ＰｉバッファーのＣＤスペクトルを最初に記録し、次いで、サンプルのそれぞれついて、最後に再びＰｉバッファーについてスペクトルを記録した。２つのバッファースペクトルが一致するように、最初に記録されたスペクトルを、バッファースペクトルとして用いた。畳み込み幅（convolution width）２５でSavitzky-Golay法を用いてバッファースペクトルを滑らかにした。他のスペクトルは、同じ方法に従って畳み込み幅１５で滑らかにした。次いで、他の滑らかにしたスペクトルのそれぞれから、滑らかにしたバッファースペクトルを減算した。ＣＤＮＮプログラムを用いてタンパク質の二次含量を推定し、得られた推定値を表４に示す。結果は、位置５２および５３の２つのアミノ酸置換も、化学合成によるポリペプチド産生も、化学合成されたポリペプチドの二次構造含量に影響を与えないことを示した。二次構造含量の完全性を、組換えにより産生されたＰＳＩ０２５７（配列番号：２６）と比較した。

〔実施例５〕修飾されたＺ変異体およびポリペプチドのヒトＣ５に対する結合
ビアコアＴ２００（Biacore T200）機器（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））を用いて、Ｃ５結合化合物ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）、ＰＳＩ０３４０（配列番号：１０）、ＰＳＩ０３７８（配列番号：１３）およびＰＳＩ０４１０（配列番号：２３）ならびにヒトＣ５に関するＣ５結合ポリペプチドＰＳＩ０４００（配列番号：２２）の結合親和性を分析した。ヒトＣ５（クイデル（Quidel）、カタログ番号Ａ４０３）を、製造元のプロトコールに従ってアミンカップリング化学を用いてＣＭ５センサチップ（９００ＲＵ）に結合させた。ｈＣ５を１０ｍＭ酢酸ＮａバッファーｐＨ５（ＧＥヘルスケア）中７．５μｇ／ｍｌの濃度で注射することによってカップリングを実施した。参照細胞は、同じ試薬で処理したが、ヒトＣ５を注射しなかった。固定されたｈＣ５に対するＣ５ポリペプチドおよび化合物の結合を単一のサイクル動態方法で研究し、ここでは、５つの濃度、典型的にＨＢＳ－ＥＰバッファー中２５、１２．５、６．２５、３．１２および１．５６ｎＭのサンプルを、注射間で再生することなく同じサイクルで、２５℃で３０μｌ／分の流速で順々に注射した。バルク屈折率（bulk refractive index）変化を補正するため参照セルからのデータを減算した。ほとんどの場合、センサーグラムがダブルブランクとなるように、対照としてＨＢＳ－ＥＰの注射も含んだ。表面をＨＢＳ－ＥＰバッファーで再生した。速度定数は、ビアコアＴ２００（Biacore T200）評価ソフトウェアバージョン１．０のラングミュア１：１検体モデルを用いてセンサーグラムから算出した。得られた相互作用のＫ_Ｄ値を表５に示す。

本データは、安定性強化アミノ酸置換が、Ｃ５に結合する分子の能力においてなんら有意な悪影響がなく、そのため、それらの生物活性に影響を及ぼさないことを示している。

〔実施例６〕溶血の阻害
古典的補体経路機能ならびにＣ５結合化合物ＰＳＩ０３７８（配列番号：１３）およびＰＳＩ０４１０（配列番号：２３）、およびＣ５結合ポリペプチドＰＳＩ０４００（配列番号：２２）によるその阻害の研究のため、アルセバー液中の新たなヒツジ全血（スウェーデン国立獣医研究所（Swedish National Veterinary Institute））からヒツジ赤血球を調製した。その後、赤血球をウサギ抗ヒツジ赤血球抗血清（シグマ）で処理して抗体感作ヒツジ赤血球（ＥＡ）とした。過程全体を無菌条件下で実施した。他のすべての試薬は、商業的供給源のものであった。

インビトロ試験は、９６ウェルＵ型マイクロタイタープレート中で、試験タンパク質、補体血清およびＥＡ懸濁液の逐次添加によって行った。すべての試薬の最終濃度は、ウェル当たり５０μｌの全反応体積中かつｐＨ７．３～７．４で、０．１５ｍＭＣａＣｌ_２；０．５ｍＭＭｇＣｌ_２；３ｍＭＮａＮ_３；１３８ｍＭＮａＣｌ；０．１％ゼラチン；１．８ｍＭナトリウムバルビタール；３．１ｍＭバルビツール酸；５，０００，０００ＥＡ；適した希釈度の補体タンパク質Ｃ５血清、および所望の濃度のＣ５結合化合物またはポリペプチドであった。

Ｃ５結合化合物およびポリペプチドを、上記の補体血清と共に氷上で２０分間プレインキュベートした後、ＥＡ懸濁液の添加によって反応を開始した。溶血反応を撹拌条件下、３７℃で４５分間進行させ、次いで、場合により０．０２％ツイーン２０（Tween 20）を含有する氷冷生理食塩水１００μｌの添加によって終了させた。細胞をバイアルの底に遠心分離し、上清１００μｌに相当する上方部分をハーフエリアおよび平底のウェルを有する透明なマイクロプレートに移した。４１５ｎｍの波長でマイクロタイタープレートリーダーを用いて反応結果を光学濃度として分析した。

非阻害および完全阻害の反応値を確定するため、それぞれ、各プレートには対照試料（ＰＳＩ０２４２、配列番号：１）およびビヒクルが含まれている。これらの値を用いて任意の所定のサンプル濃度での補体溶血の％阻害を算出した。試験されたＣ５結合化合物およびポリペプチドの阻害能力（ＩＣ５０値）は、Ｃ５減損血清（C5 depleted serum）に添加されたヒトＣ５の制御濃度の存在下で、同じ試験を適用することによって確定した。高度に強力な阻害薬（低ナノモルからナノモル以下）に関して、反応混合物の最終的なＣ５濃度は、０．１ｎＭで制御されており、これは場合によりＣ５減損または欠損血清を用いて確立した。結果を下の表６に示す。

溶血試験からの結果は、改善されたＣ５結合化合物ＰＳＩ０３７８（配列番号：１３）およびＰＳＩ０４１０（配列番号：２３）が、機能に関して参照化合物ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）と大きく異ならないことを示している。Ｃ５結合ポリペプチドＰＳＩ０４００（配列番号：２２）は本試験において機能的であるが、それはアルブミン結合ドメインを含まないので、結果を参照化合物のものと直接比較することはできない。

〔実施例７〕ヒトアルブミンに対する結合
アルブミンに対するＣ５結合化合物の親和性の評価のため、コーティング（ノボザイム（Novozymes））として組換えヒトアルブミンならびにアフィボディＡＢ（一次）およびダコサイトメーション（DakoCytomation）（検出）から商業的に入手可能な抗体を使用してヒトアルブミンＥＬＩＳＡを用いた。ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）から調製され、かつＣ５結合ポリペプチドおよび連鎖球菌Ｇタンパク質のアルブミン結合ドメインを含む方法標準をサンプルの定量に用いた。

９６ウェルマイクロプレートを組換えヒトアルブミンでコーティングした。次いで、プレートを、０．０５％ツイーン２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、ＰＢＳ中の１％カゼインで１～２時間ブロックした。プレート洗浄後、標準、方法対照、対照サンプルおよび試験サンプルをプレートに加える。２時間インキュベーション後、非結合物質を洗浄によって除去した。ヤギ抗アフィボディ（anti-Affibody）^（R）ＩｇＧ（アフィボディＡＢ（Affibody AB）、カタログ番号２０．１０００．０１．０００５）をウェルに加え、プレートを１．５時間インキュベートして、結合されたＣ５結合化合物に結合させた。洗浄後、ウサギ抗ヤギＩｇＧＨＲＰ（ダコサイトメーション（DakoCytomation））を、ヤギ抗体に１時間結合させた。最終洗浄後、結合したＨＲＰの量を、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン）の添加によって検出したところ、それは酵素によって青色の生成物に変換された。３０分後、１Ｍ塩酸の添加により反応を停止し、ウェル内容物の色は青色から黄色に変わった。参照波長として６５０ｎｍの吸光度を用いて４５０ｎｍの吸光度を測光的に測定した。色の強さはＰＳＩ０２４２（配列番号：１）の量に比例しており、サンプル濃度は検量線から決定した。

連鎖球菌Ｇタンパク質からのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の誘導体を含むＣ５結合化合物は、ヒトアルブミンに結合できることが示された。データを表７に示す。

試験の解釈では、調査した改善された安定性を有するＣ５結合ポリペプチドはいずれも、ヒト血清アルブミンを結合するそれらの能力を維持している。

〔実施例８〕Ｃ５結合Ｚ変異体およびポリペプチドの３ヵ月の安定性試験
３７℃で２週間の安定性試験においてＰＳＩ０２４２と比較して改善された安定性を示したＣ５結合変異体およびポリペプチド（実施例２）を、３７℃でより長い３ヵ月の安定性試験にかけた。安定性試験およびＲＰＣによる分析の設定は実施例２に記載されたとおりであった。クロマトグラムの主要ピークを測定し、対応する総タンパク質含量のパーセンテージを算出することによって安定性の評価を行った。実施例２のデータは、解釈をより容易にするため下の表８に含まれる。

ＰＳＩ０２４２と比較して位置５２～５３においてＳＥからＮＤのアミノ酸置換を含むＣ５結合化合物（配列番号：１３、１４および１６）は、同じ条件下で２週間後のＰＳＩ０２４２（配列番号：１）（表１参照）よりも、３７℃で３ヵ月後における元の形態のタンパク質の割合がより高いことを示した。また、他の試験化合物もＰＳＩ０２４２と比較して増加した安定性を示す。

〔実施例９〕種々の標的に対する特異性を有する骨格修飾されたポリペプチドの生成、安定性研究および結合評価
種々の標的に対して特異性を有する骨格修飾されたポリペプチドの生成：本明細書に記載された新たな骨格を含むポリペプチド変異体は、種々の標的に対する特異性を有するＺ変異体ポリペプチドを取り上げ、骨格内の選択された位置で部位特異的突然変異誘発を実施することによって生成される。別法として、分子全体の化学合成によって、またはＺ変異体ポリペプチドの結合モチーフを新たな骨格に移植するための、当業者に知られている他の分子生物学的方法を用いることによって新たな分子を作ってもよい。

種々の標的に対する特異性を有する骨格修飾されたポリペプチドの比較安定性研究：上記のように生成されたそれぞれの新たなポリペプチドに関して、元のポリペプチドまたは別の類似のポリペプチドの安定性と安定性を比較する。ポリペプチドを異なる条件、例えば［２５ｍＭＮａＰ、１２５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０］中の調製物ならびに実施例２に記載された２週間および／または実施例８に記載された３ヵ月の３７℃でのインキュベーションにかける。安定性は、実施例２に記載したようなＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＲＰＣ分析を実施して新たな変異体の出現を分析することによって評価する。

骨格位置に導入された修飾を有するポリペプチドは、実施例２および実施例１２に示した結果と同様に改善された安定性を示すことが期待される。

骨格修飾されたポリペプチドの結合評価：改善された安定性を示しているポリペプチドを、骨格における改変の導入後にその標的に対する結合能力の保存に関してさらに評価する。結合研究は、バイオセンサー機器、または当業者に知られている他のいずれかの機器において２つまたはそれ以上の分子間の相互作用を測定して実施する。例えば、標的分子またはそのフラグメントを機器のセンサチップ上に固定し、被検ポリペプチドを含有するサンプルをチップ上に通過させる。別法として、被検ポリペプチドを機器のセンサチップ上に固定し、所定の標的を含有するサンプルまたはそのフラグメントをチップ上に通過させる。結合親和性は、抗体コーティングされたＥＬＩＳＡプレート上でポリペプチドのサンプルを捕捉し、ビオチン化された所定の標的またはそのフラグメント、ストレプトアビジン結合ＨＲＰを加える実験において試験してもよい。ＴＭＢ基質を加え、マルチウェルプレートリーダー、例えばビクター^３（Victor³）（パーキンエルマー（Perkin Elmer））を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定する。また、例えば相互作用のＥＣ５０値（最大半減有効濃度）を決定するため、定量的尺度が望ましい場合、ＥＬＩＳＡを用いてもよい。上記のようにＥＬＩＳＡを用いて、所定の標的またはそのフラグメントの希釈系列に対するポリペプチドの反応を測定する。このような実験およびＥＣ５０値によって得られた結果は、例えばグラフパッドプリズム５（GraphPad Prism 5）および非線形回帰を用いて結果から算出してもよい。ポリペプチドがアルブミン結合ドメインを含有する場合、アルブミン結合における効果を、実施例３に記載したように、または実施例７に記載したように同様に評価する。

本明細書に記載された骨格変異、およびさらにその標的に対する類似のまたは改善された結合能力を有するポリペプチドは、例えば生物医薬品へとさらに開発するためのより良好な候補であると考えられる。

〔実施例１０〕４つの異なる標的に対する特異性を有する骨格修飾されたポリペプチドの生成
本明細書に記載された新たな骨格を含むポリペプチド変異体は、種々の標的に対する特異性を有するＺ変異体ポリペプチドを取り上げ、骨格内の選択された位置で部位特異的突然変異誘発を実施することによって生成した。ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的とするポリペプチド変異体Ｚ０２８９１（配列番号：２７）；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦ－Ｒβ）を標的とするポリペプチド変異体Ｚ１５８０５（配列番号：３０）；新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を標的とするポリペプチド変異体Ｚ１０１０３（配列番号：３３）；および炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）を標的とするポリペプチド変異体Ｚ０９７８２（配列番号：３６）中の骨格位置のアミノ酸置換は、表９に明記されている。

すべての変異体は、Ｎ末端６×ヒスチジン－タグ（Ｈｉｓ_６）付きでクローニングされ、そして得られた構築物は、フォーマットＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ［Ｚ＃＃＃＃＃］のポリペプチドをコードした。所望のアミノ酸置換をコードしているオーバーラップオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、確立された分子生物学的手法を適用することによって本発明のポリペプチドのプラスミドに変異を導入した。正確なプラスミド配列は、ＤＮＡシークエンシングによって検証した。

元のおよび本発明のポリペプチドをコードする遺伝子フラグメントを含有するプラスミドを用いてE coli（菌株Ｔ７Ｅ２）細胞（ジーンブリッジ（GeneBridge））を形質転換した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＴＳＢ－ＹＥ培地中３７℃で細胞を培養し、その後、ＩＰＴＧの添加によりタンパク質発現を誘導した。沈殿した細胞を、ファストプレップ（FastPrep）^（R）２４ホモジナイザー（Nordic Biolabs）を用いて破壊し、細胞残屑を遠心分離によって除去した。Ｈｉｓ_６タグ付けされたタンパク質としてＺ変異体を含有するそれぞれの上清を、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によってHis GraviTrap^TMカラム（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））を用いて製造元の説明書に従って精製した。精製したＺ変異体を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））を用いてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１．４７ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、８．１ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、１３７ｍＭＮａＣｌ、２．６８ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．４）にバッファー交換した。それぞれのポリペプチドの正確な同一性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ－ＭＳによって検証した。

〔実施例１１〕骨格修飾されたポリペプチドの円偏光二色性分光分析
融解温度（Ｔｍ）を決定し、かつアミノ酸置換の結果として本発明のポリペプチドの二次構造における潜在的変化を評価するために円偏光二色性（ＣＤ）分析を実施した。精製されたＨｉｓ_６タグ付けされたＺ変異体をＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。希釈された各Ｚ変異体に関して、２５０～１９５ｎｍのＣＤスペクトルを２０℃で記録した。Ｔｍを決定するために可変温度測定（ＶＴＭ）を実施した。ＶＴＭでは、５℃／分の温度勾配で温度を２０℃から９０℃まで上昇させながら、吸光度を２２１ｎｍで測定した。ＶＴＭ後、２５０～１９５ｎｍでの第２のＣＤスペクトルを２０℃で記録した。ＣＤ測定は、１ｍｍの光路長を有するセルを用いてジャスコ（Jasco）Ｊ－８１０分光偏光計（ジャスコスカンジナビアＡＢ（Jasco Scandinavia AB））において実施した。

ＣＤシグナル対温度プロットで遷移の中点から決定されたそれぞれ個々のポリペプチドのＴｍを表１０に示す。すべての変異ポリペプチドは、保存されたアルファヘリックス構造を示し、かつ可逆的にまたはほぼ可逆的にリフォールディングされた。ＣＤスペクトルの選択されたセットを図７に示す。

〔実施例１２〕４つの異なる標的に対する特異性を有する骨格修飾されたポリペプチドの比較安定性研究
実施例１０に記載したように作製されたそれぞれの新たなポリペプチドについて、その安定性を、元のポリペプチドの安定性と比較した。ＰＢＳｐＨ７．４中で調製されたポリペプチドを１ｍｇ／ｍｌに希釈し、２００μｌのアリコートを３７℃で２週間インキュベートした。安定性試験の前および後に採取されたサンプルは、１０％Bis-Tris NuPAGEゲル（インビトロゲン）を用いて、タンパク質５μｇを各ウェルに装填してＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。得られたクーマシーブルー染色ゲルを図８に示す。高められた温度でインキュベーション後、新たな変異体の出現によって安定性を評価し、変異した変異体を、それぞれの元のポリペプチドと比較した。

表９に記載した骨格位置に導入された修飾を有するすべてのポリペプチドは、それぞれの元のポリペプチドと比較して改善された安定性を示した。元のポリペプチドのサンプルでは、ゲル上で第２のバンドが主要バンドのすぐ上に認めることができた。置換Ｄ５３Ｅおよび／またはＮ５２Ｓを有する本発明のポリペプチドのサンプルでは、対応する第２のバンドを認めることができなかった。これは、実施例２および４に示した結果と類似している。したがって、本発明の骨格変異に関して観察された安定化効果は、Ｚ変異体または上記Ｚ変異体を含むポリペプチドの標的特異性に関係なく共通の効果であると考えられる。置換Ｄ５３Ｅおよび／またはＮ５２Ｓを単独でまたは置換Ｄ３６Ｒ、Ｄ３７ＱおよびＳ３９Ｅと組み合わせて有するポリペプチドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で類似のプロファイルを示した。単独の、または置換Ｄ３６Ｒ、Ｄ３７ＱおよびＳ３９Ｅと組み合わせた置換Ｄ５３Ｅは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で第２のバンドとして観察された別の確証を有する種の量を低減すると考えられるが、しかし、この種の形成を完全に防ぐことができなかった。

〔実施例１３〕骨格修飾されたポリペプチドの結合評価
実施例１２で改善された安定性を示す一組のポリペプチドを、骨格における改変の導入後だけでなく安定性試験にかけた後、すなわち３７℃で２週間インキュベートした後のそれらの標的に対する結合能力の保存に関してさらに評価した。比較速度定数（ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆ）および親和性（Ｋ_Ｄ）は、ビアコア２０００（Biacore 2000）機器を用いて決定した。標的タンパク質ヒトＨＥＲ２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）、カタログ番号１１２９－ＥＲ－０５０）、ヒトＰＤＧＦ－Ｒβ（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）、カタログ番号３８５－ＰＲ－１００／ＣＦ）、ヒトＦｃＲｎ（Biorbyt、カタログ番号ｏｒｂ８４３８８）およびヒトＣＡＩＸ（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）、カタログ番号２１８８－ＣＡ）を、それぞれＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））のカルボキシル化デキストラン層表面上に固定した。固定化は、製造元のプロトコールに従ってアミンカップリング化学を用い、かつランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰを用いて実施した。チップ上の１つのフローセル表面を活性化し、そして検体注射におけるブランクとして使用するため不活性化した。それぞれの表面上の標的タンパク質の固定化レベルは、ＨＥＲ２に関して約８５０ＲＵ、ＰＤＧＦ－Ｒβに関して２２００ＲＵ、ＦｃＲｎに関して７５０、そしてＣＡＩＸに関して５８０ＲＵであった。

ＨＢＳ－ＥＰ（ＨＥＲ２、ＰＤＧＦ－Ｒβ、ＣＡＩＸ）またはｐＨ６．０のＮａ_２ＨＰＯ_４／クエン酸バッファー（１２６ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、３７ｍＭクエン酸）（ＦｃＲｎ）をランニングバッファーとして用い、さらに後述するように、２５℃で実施した結合実験では、流速は３０μｌ／分であった。

ＨＥＲ２を標的とするＺ変異体Ｚ０２８９１（配列番号：２７）、Ｚ１７３４１（配列番号：２８）およびＺ１７３４２（配列番号：２９）をランニングバッファー中で３．３３、１０、３０および９０ｎＭの最終濃度に希釈し、５分間注射し、続いてランニングバッファー中で３０分解離させた。１０ｍＭＨＣｌと１０ｍＭＮａＯＨとを交互に繰り返す４回の適用、続いてランニングバッファー中の５分の平衡化による再生を、各検体注射後に適用した。

ＰＤＧＦ－Ｒβを標的とするＺ変異体Ｚ１５８０５（配列番号：３０）、Ｚ１７３４３（配列番号：３１）およびＺ１７３４４（配列番号：３２）をランニングバッファー中で６．６７、２０、６０および１８０ｎＭの最終濃度に希釈し、５分間注射し、続いてランニングバッファー中で２０分間解離させた。１０ｍＭＮａＯＨの３回の適用、続いてランニングバッファー中の５分の平衡化による再生を、各検体注射後に適用した。

ＦｃＲｎを標的設定とするＺ変異体Ｚ１０１０３（配列番号：３３）、Ｚ１７３４７（配列番号：３４）およびＺ１７３４８（配列番号：３５）をランニングバッファー中で３．３３、１０および３０ｎＭの最終濃度に希釈し、３分間注射し、続いてランニングバッファー中で１５分間解離させた。ＨＢＳ－ＥＰの３回の適用、続いてランニングバッファー中の１０分の平衡化による再生を、各検体注射後に適用した。

ＣＡＩＸを標的とするＺ変異体Ｚ０９７８２（配列番号：３６）、Ｚ１７３５１（配列番号：３７）、Ｚ１７３５５（配列番号：３９）およびＺ１７３５９（配列番号：４１）をランニングバッファー中で３０、９０および２７０ｎＭの最終濃度に希釈し、５分間注射し、続いてランニングバッファー中で１５分解離させた。１０ｍＭグリシン－ＨＣｌｐＨ３．０の３回の適用、による再生、続いてランニングバッファー中の５分の平衡化による再生を、各検体注射後に適用した。

速度定数は、ラングミュア１：１モデル（ＨＥＲ２、ＦｃＲｎ、ＣＡＩＸ）またはBiaEvaluationソフトウェア４．１（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））の物質移動モデルによる１：１の結合（ＰＤＧＦ－Ｒβ）を用いてセンサーグラムから算出した。リガンド表面の曲線からブランク表面の曲線を減算し、試験サンプルサイクルのデータからバッファーサイクルのデータを減算してシグナル中の任意の変動を補正した。

標的分子に結合するＺ変異体に関する比較速度定数を表１１に示し、分析された相互作用のサブセットに関するセンサーグラムを図９に示す。そのデータは、位置５２～５３におけるＮＤからＳＥの置換によってごくわずかしか親和性がもたらされず、一組の変異体、Ｚ１７３４１（配列番号：２８）およびＺ１７３４３（配列番号：３１）では、親和性がごくわずかに改善されることを示している。Ｚ１７３４２（配列番号：２９）、Ｚ１７３４４（配列番号：３２）およびＺ１７３４８（配列番号：３５）中のような、位置５２～５３におけるＳＥからＮＤの置換と、置換Ｄ３６Ｒ、Ｄ３７ＱおよびＳ３９Ｅとの組合せは、より速い解離速度のため、主に親和性においてよりマイナスの効果を有したが、しかし、１０^－９Ｍの範囲のＫ_Ｄを有する機能的な結合剤が得られた。また、評価された変異体は、３７℃で２週間のインキュベーション後、結合能力も保存していた。

実施態様の項目化されたリスト
１．ポリペプチドであって、
ｉ）ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７Ｑ
（配列中、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ６、Ｘ_７、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２５およびＸ_２８のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ_３５は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_３６は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ_３９は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ_４５は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_４６は、Ｄ、ＥおよびＳから選択されるが、但し、Ｘ_４５がＮであるとき、Ｘ_４６はＤでなく；
Ｘ_４７は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ_４５がＮであるとき、Ｘ_４６はＤでない、
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
２．Ｘ_１６がＴである、項目１に記載のポリペプチド。
３．Ｘ_２６がＫである、項目１または２に記載のポリペプチド。
４．Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２がＤＤＰＳである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
５．Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２がＲＱＰＥである、項目１～３のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
６．Ｘ_３５がＳである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
７．Ｘ_３６がＥである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
８．Ｘ_３９がＳである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
９．Ｘ_４５がＥおよびＳから選択される、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
１０．Ｘ_４５がＥである、項目９に記載のポリペプチド。
１１．Ｘ_４５がＳである、項目９に記載のポリペプチド。
１２．Ｘ_４６がＥおよびＳから選択される、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
１３．Ｘ_４６がＥである、項目１２に記載のポリペプチド。
１４．Ｘ_４６がＳである、項目１２に記載のポリペプチド。
１５．Ｘ_４６がＤである、項目１２に記載のポリペプチド。
１６．Ｘ_４５がＮであるとき、Ｘ_４６はＤまたはＥではない、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
１７．Ｘ_４５Ｘ_４６がＥＥ、ＥＳ、ＳＥおよびＳＳから選択される、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
１８．Ｘ_４５Ｘ_４６がＥＳおよびＳＥから選択される、項目１７に記載のポリペプチド。１９．Ｘ_４５Ｘ_４６がＥＳである、項目１８に記載のポリペプチド。
２０．Ｘ_４５Ｘ_４６がＳＥである、項目１８に記載のポリペプチド。
２１．Ｘ_４５Ｘ_４６がＳＤである、項目１８に記載のポリペプチド。
２２．Ｘ_４７がＳである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
２３．さらなるアミノ酸残基を含む、項目１～２２のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
２４．上記ポリペプチドのＣ末端でさらなるアミノ酸残基を含む、項目２３に記載のポリペプチド。
２５．上記ポリペプチドのＣ末端のさらなるアミノ酸残基がＡＰを含む、項目２４に記載のポリペプチド。
２６．上記ポリペプチドのＮ末端でさらなるアミノ酸残基を含む、項目２３に記載のポリペプチド。
２７．上記ポリペプチドのＮ末端でさらなるアミノ酸残基は、ＡＥＡＫＹＡＫを含む、項目２６に記載のポリペプチド。
２８．ポリペプチドの結合、産生、精製、安定化、カップリングまたは検出の目的で、上記さらなるアミノ酸残基が付加される、項目２３～２７のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
２９．上記さらなるアミノ酸残基が１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを構成する、項目２３～２８のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
３０．上記１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインが、結合機能、酵素機能、金属イオンキレート化機能および蛍光機能またはそれらの混合の群から選択された機能を有する、項目２９に記載のポリペプチド。
３１．項目１～２８のいずれか１項目に記載のポリペプチドであって、
ＹＡＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰ；および
ＦＮＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰ
（配列中、各Ｘｙは、項目１～２２のいずれか１項目に定義されたとおりである）
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
３２．項目３１に記載のポリペプチドであって、
ＡＤＮＮＦＮＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＱＡＰＫ；
（配列中、各Ｘｙは、項目１～２２のいずれか１項目に定義されたとおりである）
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
３３．上記標的が、ＡＢＤ、ＨＥＲ２、ＴＮＦα、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｇＧ、ＰＤＧＦＲβ、ＨＥＲ３、Ｃ５、ＦｃＲｎ、ＣＡＩＸ、アミロイドβ、ＣＤ４、ＩＬ８、ＩＬ６およびインスリンからなる群から場合により選択される、所定の標的に対する親和性を有する、項目１～３２のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
３４．項目１～３３のいずれか１項目に記載のポリペプチドを一部分として含む融合ポリペプチド。
３５．標識をさらに含む、項目１～３４のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド。
３６．治療剤をさらに含む、項目１～３５のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド。
３７．検出試薬、補足試薬または分離試薬としての、項目１～３６のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチドの使用。
３８．治療に使用するための、項目１から３６のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド。
３９．診断剤として使用するための、項目１～３６のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド。
４０．項目１～３４のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
４１．共通の骨格に基づくポリペプチド変異体の集団であって、集団中のそれぞれのポリペプチドが、
ｉ）ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２ＱＳＸ_３５Ｘ_３６ＬＬＸ_３９ＥＡＫＫＬＸ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７Ｑ
（配列中、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ６、Ｘ_７、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２５およびＸ_２８のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_２９Ｘ_３０ＰＸ_３２は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ_３５は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_３６は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ_３９は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ_４５は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_４６は、Ｄ、ＥおよびＳから選択されるが、但し、Ｘ_４５がＮであるとき、Ｘ_４６はＤでなく；
Ｘ_４７は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ_４５がＮであるとき、Ｘ_４６はＤでない、
から選択されるアミノ酸配列を含む集団。
４２．少なくとも１×１０^４個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４１に記載の集団。
４３．少なくとも１×１０^６個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４２に記載の集団。
４４．少なくとも１×１０^８個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４３に記載の集団。
４５．少なくとも１×１０^１０個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４４に記載の集団。
４６．少なくとも１×１０^１２個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４５に記載の集団。
４７．少なくとも１×１０^１４個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４６に記載の集団。
４８．ポリヌクレオチドの集団であって、そのそれぞれのメンバーが、項目４１～４７のいずれか１項目に記載のポリペプチドの集団のメンバーをコードすることを特徴とする集団。
４９．項目４１～４７のいずれか１項目に記載のポリペプチド集団と、項目４８に記載のポリヌクレオチド集団との組合せであって、ポリペプチドの上記集団のそれぞれのメンバーが、遺伝子型－表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコードしているポリヌクレオチドと物理的にまたは空間的に関連している組合せ。
５０．上記遺伝子型－表現型カップリング手段がファージディスプレイシステムを含む、項目４９に記載の組合せ。
５１．上記遺伝子型－表現型カップリング手段が細胞表面選択ディスプレイシステムを含む、項目４９に記載の組合せ。
５２．上記細胞表面ディスプレイシステムが原核細胞を含む、項目５１に記載の組合せ。５３．上記原核細胞がグラム陽性細胞である、項目５２に記載の組合せ。
５４．上記細胞表面ディスプレイシステムが真核細胞を含む、項目５１に記載の組合せ。５５．上記真核生物細胞が酵母細胞である、項目５４に記載の組合せ。
５６．上記遺伝子型－表現型カップリング手段が無細胞ディスプレイシステムを含む、項目４９に記載の組合せ。
５７．上記無細胞ディスプレイシステムがリボソームディスプレイシステムを含む、項目５６に記載の組合せ。
５８．上記無細胞ディスプレイシステムがインビトロ区画化ディスプレイシステムを含む、項目５６に記載の組合せ。
５９．上記無細胞ディスプレイシステムがシスディスプレイ用のシステムを含む、項目５６に記載の組合せ。
６０．無細胞ディスプレイシステムがミクロビーズディスプレイシステムを含む、項目５６に記載の組合せ。
６１．上記遺伝子型－表現型カップリング手段が非ディスプレイシステムを含む、項目４９に記載の組合せ。
６２．上記非ディスプレイシステムがタンパク質－フラグメント相補性アッセイである、項目６１に記載の組合せ。
６３．ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択する方法であって、
（ａ）項目４１～４７のいずれか１項目に記載のポリペプチドの集団を準備するステップと；
（ｂ）標的と、その標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用が可能となる条件下でポリペプチドの集団を所定の標的と接触させるステップと；
（ｃ）上記特異的相互作用に基づいて、ポリペプチドの残りの集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択するステップと
を含む方法。
６４．ステップ（ａ）が、項目４８に記載のポリヌクレオチドの集団を準備し、上記ポリヌクレオチドの集団を発現させて上記ポリペプチドの集団を得る準備ステップを含む、項目６３に記載の方法。
６５．上記ポリペプチドの集団のそれぞれのメンバーが、遺伝子型－表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコードしているポリヌクレオチドと物理的にまたは空間的に関連している、項目６４に記載の方法。
６６．上記遺伝子型－表現型カップリング手段が項目５０～６２のいずれか１項目に定義されたとおりである、項目６５に記載の方法。
６７．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する方法であって、
・項目６３に記載の方法を用いて、ポリペプチドの集団から、上記所望のポリペプチドおよびそれをコードしているポリヌクレオチドを選択するステップと；
・こうして分離された所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと
を含む方法。
６８．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを特定する方法であって、
・項目６７に記載の方法を用いて、上記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；
・ポリヌクレオチドを配列決定して、上記所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推論することによって確定するステップと
を含む方法。
６９．ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択および特定する方法であって、
（ａ）項目４１～４７のいずれか１項目に記載のポリペプチドの集団のそれぞれのメンバーを個々の担体またはビーズ上で合成するステップと；
（ｂ）ポリペプチドと所定の標的との相互作用に基づいて担体またはビーズを選択または富化するステップと；
（ｃ）タンパク質特性評価方法論によってポリペプチドを特定するステップと
を含む方法。
７０．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生する方法であって、
・項目６８に記載の方法を用いて所望のポリペプチドを選択および特定するか、
または項目６９および７０のいずれか１項目に記載の方法を用いて所望のポリペプチドを選択および特定するステップと；
・上記所望のポリペプチドを産生するステップと
を含む方法。
７２．上記産生が、所望のポリペプチドのデノボ化学合成を用いて実施される、項目７１に記載の方法。
７３．上記産生が、所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの組換え発現を用いて実施される、項目７１に記載の方法。
７４．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ１）項目６８に記載の方法を用いて、上記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；または
（ａ２）項目６９および７０のいずれか１項目に記載の第９の態様による選択および特定方法を用いて、特定されたポリペプチドを逆翻訳するステップと；
（ｂ）こうして単離されたポリヌクレオチドを発現させて上記所望のポリペプチドを産生するステップと
を含む方法。

Claims

ｉ）ＥＸ₂Ｘ₃Ｘ₄ＡＸ₆Ｘ₇ＥＩＸ₁₀ Ｘ₁₁ＬＰＮＬＸ₁₆Ｘ₁₇Ｘ₁₈ＱＸ₂₀ Ｘ₂₁ＡＦＩＸ₂₅Ｘ₂₆ＬＸ₂₈Ｘ₂₉Ｘ₃₀ ＰＸ₃₂ＱＳＸ₃₅Ｘ₃₆ＬＬＸ₃₉ＥＡＫＫＬＸ₄₅Ｘ₄₆Ｘ₄₇Ｑ
（配列中、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄、Ｘ₆、Ｘ₇、Ｘ₁₀、Ｘ₁₁、Ｘ₁₇、Ｘ₁₈、Ｘ₂₀、Ｘ₂₁、Ｘ₂₅およびＸ₂₈のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ₁₆は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ₂₆は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ₂₉Ｘ₃₀ＰＸ₃₂は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ₃₅は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ₃₆は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ₃₉は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ₄₅Ｘ₄₆は、ＳＥ、ＥＳまたはＳＤであり；
Ｘ₄₇は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ₄₅Ｘ₄₆はＳＥ、ＥＳまたはＳＤである、
から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、
当該選択されたアミノ酸配列とＸ ₄₅ Ｘ ₄₆ がＮＤである点でのみ相異するアミノ酸配列を含むポリペプチドよりも安定であるポリペプチドであって、
但し、ヒト補体成分５に結合することができ、かつＸ₁₀がＤでＸ₂₀がＷであるポリペプチドは除外される、ポリペプチド。
Ｘ₄₅Ｘ₄₆がＳＥまたはＳＤである、請求項１に記載のポリペプチド。
Ｘ₄₅Ｘ₄₆がＥＳである、請求項１に記載のポリペプチド。
Ｘ₄₅Ｘ₄₆がＳＥである、請求項２に記載のポリペプチド。
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、
ＹＡＫＥＸ₂Ｘ₃Ｘ₄ＡＸ₆Ｘ₇ＥＩＸ₁₀ Ｘ₁₁ＬＰＮＬＸ₁₆Ｘ₁₇Ｘ₁₈ＱＸ₂₀ Ｘ₂₁ＡＦ
ＩＸ₂₅Ｘ₂₆ＬＸ₂₈Ｘ₂₉Ｘ₃₀ ＰＸ₃₂ＱＳＸ₃₅Ｘ₃₆ＬＬＸ₃₉ＥＡＫＫＬＸ₄₅Ｘ₄₆Ｘ₄₇ＱＡＰ；および
ＦＮＫＥＸ₂Ｘ₃Ｘ₄ＡＸ₆Ｘ₇ＥＩＸ₁₀ Ｘ₁₁ＬＰＮＬＸ₁₆Ｘ₁₇Ｘ₁₈ＱＸ₂₀ Ｘ₂₁ＡＦ
ＩＸ₂₅Ｘ₂₆ＬＸ₂₈Ｘ₂₉Ｘ₃₀ ＰＸ₃₂ＱＳＸ₃₅Ｘ₃₆ＬＬＸ₃₉ＥＡＫＫＬＸ₄₅Ｘ₄₆Ｘ₄₇ＱＡＰ
（配列中、各Ｘｙは、請求項１～４のいずれか１項に定義されたとおりである）
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
但し、ヒト補体成分５に結合することができ、かつＸ₁₀がＤでＸ₂₀がＷであるポリペプチドは除外される、ポリペプチド。
請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドを一部分として含む融合ポリペプチド。
請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
共通の骨格に基づくポリペプチド変異体の集団であって、集団中のそれぞれのポリペプチドが、
ｉ）ＥＸ₂Ｘ₃Ｘ₄ＡＸ₆Ｘ₇ＥＩＸ₁₀ Ｘ₁₁ＬＰＮＬＸ₁₆Ｘ₁₇Ｘ₁₈ＱＸ₂₀ Ｘ₂₁ＡＦＩＸ₂₅Ｘ₂₆ＬＸ₂₈Ｘ₂₉Ｘ₃₀ ＰＸ₃₂ＱＳＸ₃₅Ｘ₃₆ＬＬＸ₃₉ＥＡＫＫＬＸ₄₅Ｘ₄₆Ｘ₄₇Ｑ
（配列中、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄、Ｘ₆、Ｘ₇、Ｘ₁₀、Ｘ₁₁、Ｘ₁₇、Ｘ₁₈、Ｘ₂₀、Ｘ₂₁、Ｘ₂₅およびＸ₂₈のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ₁₆は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ₂₆は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ₂₉Ｘ₃₀ＰＸ₃₂は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ₃₅は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ₃₆は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ₃₉は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ₄₅Ｘ₄₆は、ＳＥ、ＥＳまたはＳＤであり；
Ｘ₄₇は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ₄₅Ｘ₄₆はＳＥ、ＥＳまたはＳＤである、
から選択されるアミノ酸配列を含む集団。
少なくとも１×１０⁴個の独特なポリペプチド分子を含む、請求項８に記載の集団。
ポリヌクレオチドの集団であって、そのそれぞれのメンバーが、請求項８～９のいずれか１項に記載のポリペプチドの集団のメンバーをコードすることを特徴とする集団。
請求項８～９のいずれか１項に記載のポリペプチド集団と、請求項１０に記載のポリヌクレオチド集団との組合せであって、ポリペプチドの前記集団のそれぞれのメンバーが、遺伝子型－表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコードしているポリヌクレオチドと物理的にまたは空間的に関連している組合せ。
前記遺伝子型－表現型カップリング手段がファージディスプレイシステムを含む、請求項１１に記載の組合せ。
ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択
する方法であって、
（ａ）請求項８～９のいずれか１項に記載のポリペプチドの集団を準備するステップと；
（ｂ）標的と、該標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用が可能となる条件下でポリペプチドの集団を該所定の標的と接触させるステップと；
（ｃ）前記特異的相互作用に基づいて、ポリペプチドの残りの集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択するステップと
を含む方法。
所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する方法であって、
・請求項１３に記載の方法を用いて、ポリペプチドの集団から、前記所望のポリペプチドおよびそれをコードしているポリヌクレオチドを選択するステップと；
・こうして分離された所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと
を含む方法。
所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを特定する方法であって、
・請求項１４に記載の方法を用いて、前記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；
・ポリヌクレオチドを配列決定して、前記所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推論することによって確定するステップと
を含む方法。
ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択および特定する方法であって、
（ａ）請求項８～９のいずれか１項に記載のポリペプチドの集団のそれぞれのメンバーを個々の担体またはビーズ上で合成するステップと；
（ｂ）ポリペプチドと所定の標的との相互作用に基づいて担体またはビーズを選択または富化するステップと；
（ｃ）タンパク質特性評価方法論によってポリペプチドを特定するステップと
を含む方法。