TR201911279T4 - Mutasyona uğramış bir yapı iskelesine sahip polipeptidlerin bağlanması. - Google Patents
Mutasyona uğramış bir yapı iskelesine sahip polipeptidlerin bağlanması. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201911279T4 TR201911279T4 TR2019/11279T TR201911279T TR201911279T4 TR 201911279 T4 TR201911279 T4 TR 201911279T4 TR 2019/11279 T TR2019/11279 T TR 2019/11279T TR 201911279 T TR201911279 T TR 201911279T TR 201911279 T4 TR201911279 T4 TR 201911279T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- polypeptide
- polypeptides
- population
- amino acid
- seq
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 392
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 389
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 389
- 230000027455 binding Effects 0.000 title description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 64
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 49
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 49
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 49
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 40
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 37
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 16
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 16
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 238000002823 phage display Methods 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 claims description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 101710136524 X polypeptide Proteins 0.000 claims 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 17
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 description 28
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 28
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 18
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 17
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 17
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 17
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 17
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 17
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 17
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 16
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 13
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 102220097833 rs876660426 Human genes 0.000 description 13
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 102220470986 Histone deacetylase 8_S39E_mutation Human genes 0.000 description 9
- 102220597878 Ketimine reductase mu-crystallin_D36R_mutation Human genes 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 101100440311 Homo sapiens C5 gene Proteins 0.000 description 7
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 7
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 6
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000011805 ball Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 4
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 4
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 4
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 3
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- -1 PDGF-Rß Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 108700011201 Streptococcus IgG Fc-binding Proteins 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 102200016465 rs104894275 Human genes 0.000 description 3
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101150050927 Fcgrt gene Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 2
- 102000038455 IGF Type 1 Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 108091058560 IL8 Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011806 microball Substances 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 2
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N Calcium oxide Chemical compound [Ca]=O ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- JZUFKLXOESDKRF-UHFFFAOYSA-N Chlorothiazide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC2=C1NCNS2(=O)=O JZUFKLXOESDKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 101000910338 Homo sapiens Carbonic anhydrase 9 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 1
- 101710132633 Protein C5 Proteins 0.000 description 1
- 101710089766 Ribonuclease P protein component Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N barbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=O)N1 HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000000978 circular dichroism spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 210000005255 gram-positive cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- RGHFKWPGWBFQLN-UHFFFAOYSA-M sodium;5,5-diethylpyrimidin-3-ide-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCC1(CC)C([O-])=NC(=O)NC1=O RGHFKWPGWBFQLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000005315 stained glass Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
- C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1044—Preparation or screening of libraries displayed on scaffold proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Mevcut buluş, yeni polipeptidlere, bunların üretim usullerine ve bir ortak yapı iskelesini baz alan polipeptid varyantların yeni popülasyonlarına ilişkindir. Popülasyonlar, örneğin yeni bağlayıcı proteinleri ve polipeptidleri sunmak için kullanılabilir.
Description
TARIFNAME
MUTASYONA UGRAMIS BIR YAPI ISKELESINE SAHIP POLIPEPTIDLERIN
BAGLANMASI
Bulusun alani
Mevcut bulus, yeni polipeptidlere, bunlarin üretim usullerine ve bir ortak yapi iskelesini baz
alan polipeptid varyantlarin yeni popülasyonlarina iliskindir. Popülasyonlar, örnegin yeni
baglayici proteinleri ve polipeptidleri sunmak için kullanilabilir.
Bulusla ilgili bilinen hususlar
Yeni baglayici proteinlerin yapimi için farkli usuller açiklanmistir (Nygren PA ve Uhlén M
(1997) Curr Opin Struct Biol 7:463-469). Bir strateji, arzu edilen özellikler için kütüphane
olusumu ve seçimli taramayi birlestirmek olmustur.
Bir ortak, birinci jenerasyon yapi iskelesini baz alan birinci jenerasyon Z varyant
polipeptidleri, bu tür moleküllerin popülasyonlari ve bunlari içeren usuller WO95/ 193 74lte
açiklanmistir. Ilaveten, bir ikinci jenerasyon yapi iskelesini baz alan Z varyant polipeptidleri,
bu tür moleküllerin popülasyonlari ve bunlari içeren usuller W02009/080811lde
açiklanmistir. Bu iki açiklamanin ögretileri buraya referansla dahil edilmektedir.
Bazi basvurular için, Z varyant polipeptidleri veya bunlarin daha yüksek alkali stabilite,
düsük antijenisite, yapisal stabilite, kimyasal sentez ve hidrofilisiteye amenabilite gibi
gelistirilmis Özelliklere sahip popülasyonlari arzu edilmektedir. WO2009/080811°de
gelistirilmis Özellikleri olan bir ortak yapi iskelesine sahip Z varyantlari açiklaninaktadir,
fakat her bir arzu edilen özellik, burada açiklandigi gibi Z varyant polipeptidleriyle elde
edilemez.
Polipeptid farmasötiklerine yönelik basari için ana faktörlerinden biri bunlarin stabilitesidir.
Yüksek yapisal bir stabiliteyi gösteren polipeptidler, hem üretim sirasinda hem de insan
vücudunda büyük olasilikla islevsel olarak kimyasal modifikasyonlara, fiziksel kosullara ve
proteolizde degisikliklere dayanacaktir. Bunda baska, stabilite, polipeptid farmasötiklerin
aktif raf ömrünü, ayni zamanda insan vücudu içerisinde polipeptid farmasötiginin aktif
ömrünü etkileyecektir.
Dolayisiyla, Z varyant polipeptidlerinin stabilitesinin gelistirilmesi için sürekli bir ihtiyaç söz
konusudur.
Bulusun açiklamasi
Mevcut bulusun bir amaci yeni bir yapi iskelesine sahip bir polipeptid sunmaktir, bu
polipeptid, halihazirdaki mevcut Z varyant polipeptidlerin yukarida belirtilen ve baska
dezavantajlarmi azaltir.
Mevcut bulusun baska bir amaci, yeni bir yapi iskelesini baz alan bir polipeptidin üretimine
yönelik bir usul sunmaktadir.
Ayrica mevcut bulusun bir amaci, bu tür gelistirilmis polipeptid varyantlarin bir popülasyonu
sunmaktir, hepsi yeni bir yapi iskelesini baz almaktadir.
Mevcut bulusun baska bir amaci, polinükleotidlerin bir popülasyonunu sunmaktir.
Mevcut bulusun yine baska bir amaci, bir polipeptid popülasyon ve bir polinükleotid
popülasyonun bir kombinasyonunu sunmaktir.
Mevcut bulusun baska bir amaci, polipeptidlerin bir popülasyonundan önceden belirlenmis
bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin seçilmesine yönelik bir usul
sunmaktir.
Baska bir amaç, önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir
polipeptidi kodlayan bir polinükleotidi izole etmek için bir usul sunmaktir.
Baska bir amaç önceden belirlenmis bir hedef için bir afmiteye sahip arzu edilen bir
polipeptidi tanimlamak için bir usul sunmaktir.
Baska bir amaç, önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir
polipeptidi seçmek ve tanimlamak için bir usul sunmaktir.
Ilgili bir amaç, önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir
polipeptidin üretimine yönelik bir usul sunmaktir.
Bu ve baska amaçlar, mevcut basvuruda açiklanan farkli yönlerle elde edilebilir.
Mevcut tarifnamenin bir birinci yönünde, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini
içeren bir polipeptid sunulmaktadir:
I) EX2X3X4AX6X7EIXIO X1 ILPNLX16XI7X18QX20 XziAFIX25X20LX28X29X30
PX32QSX35X35LLX39E AKKLX45X46X47Q,
burada X2, X3, X4, X6, X7, Xio, X”, X17, X113, X20, X21, X25 ve X28,ln her bir] bagimsiz
olarak herhangi bir amino asit kalintisina karsilik gelir; ve
burada, birbirinden bagimsiz olarak,
Xis, N ve "l”den seçilir;
X26 K ve S7den seçilir;
X29X30PX32 DDPS ve RQPE°den seçilir;
X35 A ve S7den seçilir;
X36 E ve Niden seçilir;
X39 A, C ve S”den seçilir;
X45 E ve Slden seçilir;
X46 D, E ve S”den seçilir;
X47 A ve S”den seçilir; ve
ii) X45 N oldugunda, X46”nin D veya N olmamasi kaydiyla; i),de tanimlanan diziye en az %91
özdeslige sahip olan bir amino asit dizisi.
Yukaridaki polipeptid dizisi i) içerisinde, "bagimsiz olarak herhangi bir amino aside karsilik
gelen" olarak tanimlandigi gibi her bir amino asit X, tüm muhtemel amino asitlerden seçilen
bir amino asit kalintisina tek tek karsilik gelir. Anlasilir olmasi için, bu, yukaridaki dizi i)`de
pozisyonlar X2, X3, X4, X6, X7, Xm, X1 1, X”, Xig, X20, Xzi, X25 ve X287e karsilik gelen amino
asit pozisyonlari için geçerlidir. Bu, her bir bu tür Xlin, dizide X olarak ifade edilen herhangi
bir baska kalintinin tanimindan bagimsiz olarak herhangi bir amino asit kalintisi olabilecegi
anlamina gelir. Ainino asit dizisinde, bu amino asitler X, bu 20 dogal olusumlu amino asit
kalintilarinin herhangi birinin, herhangi bir belirtilen varyantta karsilik gelen X pozisyonunda
mevcut olabilecegi sekilde, tüm 20 dogal olusumlu amino asit kalintilardan seçilebilir. Her
bir pozisyonda amino asit kalintisinin seçimi az çok randomize edilebilir. Ayrica farkli
degiskenlik gösteren amino asit kalintilardan, 20 dogal olusumlu amino asit kalintilarin 19,
18, 17, 16 veya daha azinin seçildigi grubu sinirlamak mümkündür. Farkli pozisyonlarda
degiskenlik, bir, randomizasyon yok anlamindadir, ila en fazla tüm 20 ainino asitler arasinda
tek tek ayarlanabilir. Amino asitlerin daha küçük bir alt-kümesinin rastgele katilimi, katilan
deoksiribonükleotid bazlarin dikkatli seçimiyle elde edilebilir, örnegin kodonlar T(A/C)C,
polipeptid zincirde belirtilen bir pozisyonda serin ya da tirozinin bir rastgele katilimini elde
etmek için katilabilir. Benzer sekilde, kodonlar (T/C/A/G)CC, polipeptid zincirde belirtilen
bir pozisyonda fenilalanin, lösin, alanin ve valinin bir rastgele katilimini elde etmek için
katilabilir. Uzman kisi, polipeptid zincirde belirtilen bir pozisyonda amino asitlerin farkli
kombinasyonlarini elde etmek için kullanilabilen deoksiribonükleotid baz
kombinasyonlarinin birçok alternatifinden haberdardir. Polipeptid zincirde belirtilen bir
pozisyonda ortaya çikabilen amino asitler kümesi ayrica bir seferde bir deoksiribonükleotid
baz yerine oligonükleotid sentez sirasinda trinükleotidlerin katilimiyla belirlenebilir. Amino
asitlerin bir tanimlanmis kümesi ayrica sentezde arzu edilebilen pozisyonlarda tanimlanmis
kodonlarin katilimini saglayabilen bölünmüs havuz sentezi kullanilarak elde edilebilir.
Randomize edilmis çift sarinal baglayicilari elde etmek için yine baska bir alternatif,
ligasyonlar kullanilarak trinükleotid yapi bloklarinin randoinize edilmis kümelerinin
katilimiyla ve müteakip olarak yapilandirilmis çift sarmal DNA”nin kisitlamalariyladir.
Bu tarifnamenin bir düzenlemesinde, önceden belirlenmis bir hedef için afiniteye sahip bir
polipeptid sunulmaktadir. Bu tür bir düzenlemede, hedef baglanma spesifitesi sunan amino
asit kalintilar, yukarida dizi i),de pozisyonlar 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 17, 18, 20, 21, 25 ve 283e
karsilik gelen pozisyonlardakilerdir. Benzer sekilde, bu tür bir polipeptidde, hedef baglanma
spesifitesi sunmayan amino asit kalintilarina, "yapi iskelesi amino asitleri" veya basitçe "yapi
iskelesi" olarak atifta bulunulur. Uygun olarak, bir düzenlemede, burada tanimlandigi gibi
yapi iskelesi amino asit kalintilar, yukarida dizi i)°de pozisyonlar 1, 5, 8, 9, 12-15, 19, 22-24,
27, 31, 33-34, 37-38, 40-44 ve 48,e karsilik gelen pozisyonlardakilerdir. Uzman kisi burada
tanimlandigi gibi polipeptidlerin yapi iskelesi amino asitleriyle sunulan avantajli özelliklerin
söz konusu polipeptidin hedef baglanma spesifitesinden bagimsiz oldugunu takdir edecektir.
Uzman kisinin farkina varacagi gibi, herhangi bir polipeptidin islevi, örnegin mevcut
tarifnainenin polipeptidi, polipeptidin tersiyer yapisina baglidir. Dolayisiyla bunun islevini
etkilemeden bir polipeptidde amino asitlerin dizisine küçük degisiklikler yapmak
mümkündür. Bu nedenle, tarifname, önceden belirlenmis bir hedef için bunun gelistirilmis
stabilitesi ve/veya bunun baglama afinitesi gibi polipeptidin islevsel özelliklerini
degistirmeyen söz konusu polipeptidin modifiye edilmis varyantlarini kapsamaktadir.
Bu sekilde ayrica mevcut tarifname, i),de tanimlanan bir diziye %91 veya daha fazla tanimla
bir amino asit dizisi içeren bir polipeptidi kapsamaktadir. Bazi düzenlemelerde, polipeptid,
dizi i),de tanimlanana en az %93, örnegin en az %95, örnegin en az %97 özdes olan bir dizi
içerebilir.
Bazi düzenlemelerde, dizi tanimlari i) ve ii) arasinda bu tür farklar, burada açiklandigi gibi
polipeptid dizisinin herhangi bir pozisyonunda bulunabilir. Diger düzenlemelerde, bu tür
degisiklikler sadece yapi iskelesi amino asit kalintilarinda bulunabilir. Diger düzenlemelerde,
söz konusu degisiklikler sadece hedef baglanma Spesititesi sunan amino asit kalintilarda
bulunabilir. Örnegin, amino asit kalintilarin belirli bir islevsel gruplamasina ait bir amino asit
kalintisinin (örnegin hidrofobik, hidrofilik, polar vs) ayni islevsel gruptan baska bir amino
asit kalintisi için degistirilebilmesi mümkündür.
Tarifname boyunca kullanildigi gibi "% tanim", örnegin asagidaki gibi hesaplanabilir. Araina
dizisi, CLUSTAL W algoritmai (Thompson ve digerleri, Nucleic acids Research, 22: 4673-
4680 (1994)) kullanilarak hedef dizisine hizalanir. Bir kiyaslama, hizalanmis dizilerin birine
karsilik gelen pencere, örnegin en kisasi üzerinden yapilir. Pencere bazi örneklerde hedef
diziyle tanimlanabilir. Baska örneklerde, pencere, arama dizisiyle tanimlanabilir. Her bir
pozisyonda amino asit kalintilari kiyaslanir, ve hedef dizisinde özdes karsiliklara sahip olan
arama dizisinde pozisyonlarin yüzdesi, % tanim olarak bildirilir.
Baglayici polipeptidler için yapi iskeleleri olarak kullanildiginda, burada açiklanan diziler,
bilinen, benzer yapi iskelelerine kiyasla avantajlar saglar, ve bunlarin, yüksek yapisal bir
stabilite ve dolayisiyla gelistirilmis bir depolama raf ömrü göstermesi için genetigiyle
oynanmistir. Bu avantajlar ayrica bu birinci yönün polipeptid varyantlarinin
popülasyonlariyla ilgili olan tarifnamenin üçüncü yönü için geçerlidir (ayrica asagi bakiniz).
Bu tarifnamenin bir düzenlemesinde, X16 T,dir.
Bir düzenlemede, X26 Ksdir.
BH` düzenlemede, X29X30PX32 DDPS,dII'.
Bir düzenlemede, X29X30PX32 RQPE/dll'.
Bir düzenlemede, X35 Sidir.
Bir düzenlemede, X36 E3dir.
Bir düzenlemede, X39 Ssdir.
Bir düzenlemede, X45 E ve S7den seçilir.
Bir düzenlemede, X45 Eadir.
Bir düzenlemede, X45 S7dir.
Bir düzenlemede, X46 E ve Siden seçilir.
Bir düzenlemede, X46 E°dir.
Bir düzenlemede, X46 S°dir.
Bir düzenlemede, X4., D`dir.
X45 N oldugunda X46 D veya E degildir.
Bir düzenlemede, X45X4(i EE, ES, SE ve SS“den, örnegin ES ve SE`den seçilir.
Bir düzenlemede, X45X46 ESidir.
Bir düzenlemede, X45X46 SEldir.
Bir düzenlemede, X45X46 SD'dir.
Bir düzenlemede, X47 Sidir.
Bu tarifnamede kullanildigi gibi "önceden belirlenmis bir hedef için baglama afinitesi"
terimiyle, örnegin yüzey plazmon rezonans (SPR) teknolojisinin kullanimiyla test edilebilen
bir polipeptidin bir özelligine atifta bulunulmaktadir. Örnegin, söz konusu baglama afinitesi,
bir deneyde test edilebilir, burada önceden belirlenmis hedef, veya bunun bir fragmani,
cihazin bir sensör çipi üzerinde immobilize edilir, ve test edilecek polipeptidi içeren numune
çip üzerinden geçirilir. Atematif olarak, test edilecek polipeptid, cihazin bir sensör çipi
üzerinde immobilize edilir, ve önceden belirlenmis hedefi içeren bir numune, veya bunun bir
fragmani, çip üzerinden geçirilir. Uzman kisi daha sonra önceden belirlenmis hedef için
polipeptidin baglama afinitesinin en az bir kalitatif ölçümünü yapmak için bu tür deneyle elde
edilen sonuçlari yorumlayabilir. Bir kantitatif ölçüm, örnegin etkilesim için bir KD degerini
belirlemek arzu edilirse, yüzey plazmon rezonans usulleri ayrica kullanilabilir. Baglama
degerleri örnegin bir Biacore (GE Healthcare) veya ProteOn XPR 36 (Bio-Rad) cihazinda
tanimlanabilir. Önceden belirlenmis hedef cihazin bir sensör çipi üzerinde uygun olarak
immobilize edilir, ve afinitesi belirlenecek olan polipeptid numuneler, seri seyreltmeyle
hazirlanir ve rastgele sirayla enjekte edilir. KD degerleri daha sonra örnegin cihaz imalatçisi
tarafindan tedarik edilen BIA evaluation 4.1 yazilimi, veya baska uygun yazilimin lzl
Langmuir baglama modelinin kullanildigi sonuçlardan hesaplanabilir.
Burada kullanildigi haliyle "önceden belirlenmis bir hedef için baglama afinitesi" terimiyle
ayrica, örnegin ELISA ile test edilebilen bir polipeptidin bir özelligine atifta bulunabilir.
Örnegin, baglama afinitesi, polipeptid numunelerinin, antikor kapli ELISA plakalari ve
biyotinlenmis önceden belirlenmis hedef üzerinde yakalandigi, veya bunun bir fragmaninin,
ardindan streptavidinle konjuge edilmis HRP'nin ilave edildigi bir deneyde test edilebilir.
TMB substrati ilave edilir ve bir çok kuyucuklu plaka okuyucu, örnegin Victor3 (Perkin
Elmer) kullanilarak 450 nm”de absorbans ölçülür. Uzman kisi daha sonra önceden
belirlenmis hedef için kompleksin baglama afinitesinin en az bir kalitatif ölçümünü yapmak
için bu tür deneyle elde edilen sonuçlari yorumlayabilir. Bir kantitatif ölçüm arzu edilirse,
örnegin etkilesim için EC50 degerini belirlemek için (yari azami atkili konsantrasyon),
ELISA ayrica kullanilabilir. Polipeptidin, önceden belirlenmis hedefin veya bunun bir
fragmaninin bir seyreltme serilerine karsi yaniti, yukarida açiklandigi gibi ELISA
kullanilarak ölçülür. Uzman kisi daha sonra bu tür deneyle elde edilen sonuçlari
yorumlayabilir, ve EC50 degerleri, örnegin GraphPad Prism 5 ve dogrusal olmayan
regresyonun kullanildigi sonuçlardan hesaplanabilir.
Önceden açiklandigi gibi, Z varyant polipeptidlerinin, bir üç sarmalli demet protein bölgesini
veya bunun bir parçasini, söz konusu üç sarmalli demet protein bölgesi içerisinde esas
itibariyle bir birbirine baglanan döngüyle iki alfa sarmalinin parçasini olusturan önceden
belirlenmis bir hedef için afiniteye sahip motifi olusturdugu düsünülmektedir.
Yukarida tanimlandigi gibi polipeptidin farkli modifikasyonlari ve/veya buna ilaveleri,
mevcut bulusun kapsamindan ayrilmadan, polipeptidi amaçlanan spesifik kullanima
uydurmak amaciyla gerçeklestirilebilir.
Bu tür modifikasyonlar ve ilaveler asagida daha detayli açiklanmaktadir, ve ayni polipeptid
zincirde olusan ilave amino asitler, veya etiketler ve/veya kimyasal olarak konjuge edilen
veya baska türlü polypeptide baglanan terapötik maddeler içerebilir.
Dolayisiyla, bir düzenlemede, ilave amino asit kalintilar içeren yukarida açiklandigi gibi bir
polipeptid sunulmaktadir. Bazi düzenlemelerde ilave amino asit kalintilar, polipeptidin C-
ucunda yer alabilir. Bazi düzenlemelerde ilave amino asit kalintilar, polipeptidin N-ucunda
yer alabilir.
Bir düzenlemede, C-ucunda söz konusu ilave amino asit kalintilar, AP içerir.
Bir düzenlemede, N-ucunda söz konusu ilave amino asit kalintilar, AEAKYAK içerir.
Yine baska bir düzenlemede, N-ucunda 0 ila 7 ilave amino asit kalintisina ve C-ucunda 0 ila
3 ilave amino asit kalintisina sahip dizi i) veya ii)°den olusan yukarida açiklandigi gibi bir
polipeptid sunulmaktadir.
Ilave amino asit kalintilar, polipeptidin baglanmasinda bir rol oynayabilir, fakat, örnegin
polipeptid üretimi, saflastirmalari, stabilizasyonu, kenetlenmesi veya saptanmasiyla ilgili bir
veya daha fazla baska amaçlara da esit olarak iyi hizmet edebilir. Bazi düzenlemelerde, söz
konusu ilave amino asit kalintilar, bir veya daha fazla polipeptid bölge olusturur.
Bu tür ilave amino asit kalintilar kimyasal kenetlenme amaçlari için ilave edilen bir veya
daha fazla amino asit kalintisi içerebilir. Bunun bir örnegi, polipeptid zincirde en bastaki veya
en sondaki pozisyonda, yani N- veya C-ucunda bir sistein kalintisinin ilavesidir. Kimyasal
kenetlenme için kullanilacak bir sistein kalintisi ayrica baska bir amino asidin, protein bölgesi
yüzeyi üzerinde, tercihen hedef baglanmayla ilgisi olmayan yüzeyin bir kismi üzerinde
ikamesiyle katilabilir. Bu tür ilave amino asit kalintilari ayrica polipeptidin saflastirilmasi
veya saptanmasi için bir "etiket", etikete özgü antikorlarla etkilesim için, örnegin bir
heksahistidil (HiSö) etiketi, veya bir "myc" etiketi veya bir "FLAG" etiketi içerebilir. Uzman
kisi baska alternatiflerin farkindadir.
Yukarida tartisilan "ilave amino asit kalintilar" ayrica baska bir baglama islevi, veya bir yari
ömrü uzatma islevi, veya bir enzimatik islev, veya bir inetal iyon selatlama islevi, veya bir
tloresan islevi, veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu gibi herhangi bir arzu edilen islevle
bir veya daha fazla polipeptid bölgesi olusturabilir.
Bir örnek düzenlemede, önceden belirlenmis bir hedef için afiniteye sahip bir bilesik
sunulmaktadir, söz konusu bilesik asagidakileri içerir:
A. yukarida tanimlandigi gibi en az bir polipeptid;
B. Streptokoksal protein G'nin en az bir albumin baglama bölgesi, veya bunun bir
türevi; ve
C. istege bagli olarak, söz konusu en az bir albumin baglama bölgesi veya bunun bir
türevinin, söz konusu en az bir polipeptidin C veya N ucuna baglanmasi için en az bir
baglayici parça.
Streptokoksal protein G'nin albumin baglama bölgesinin türevlerinin sinirlayici olmayan
örnekleri, W02009/016043 ve W02012/0043843te açiklanmaktadir.
Ayrica, baska bir düzenlemede, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içeren yukarida
tanimlandigi gibi bir polipeptid sunulmaktadir:
YÂK LX;-X;5X.:AX:;X7LIXi'i X1lLPNLxWXHXILIJXH' x;!Ai-IX;'HX;HLX;~|!X;ûx.-i'i
pX-J_OSX!GX:›}LLX±«E AKKLX:5X4›5X47O Ap; ve
l-NK tx;›x;i.>(.iAXaX±|X~v X~LPNLX1aX ~XmCJXm XyiAl-IX;vrx.›;LX.ipX_.s.Xu~
PXI~._.OSX'IU_.X_irjLLngE AKKLXJ-.X-C-,XJO AP.
burada her bir Xy yukaridaki gibi tanimlanmaktadir (ve y, yukarida i) ile tanimlanan
polipeptid dizi içerisinde kalinti X'in amino asit pozisyonunu belirtir).
Bazi düzenlemelerde, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içeren bir polipeptid
sunulmaktadir:
AUNNH'JK LX_›X1X.iAXaXrLIX1it XwLPNLXnÄan-(JXA-
X;-AFIX_-:X_›_.LX_.›.:.X~_-i_.X_i;g PX;.;OSX3:.XJ:_«LLX_i›_.E AKKLX4:.X9_.X;+O APK
AUNKF NK LXJK ;XLAXOJXTL [X lv'_i X' 'L PN LX 43)( - #X l ElOXpii
X; 'AFIX_'(X;›,L xaixgix 3.3. PX;.;OSX,.±.)(,.:;LLX-,i.,E AKKLXACihQXa'O APKV
"IÜNKFNK LXÂX'xiAXr-,XTLIXM X"LPNLX i-.X 7Xi!iQX;\i
X;'AFIX;«_)(~_,_.LX&›._.)(;-i,X_i.-_. PX;.;OSX_.5.X_.::LLXJ._.E AKKLX4:.X4›-_.Xr0 APK
VUAKYAK LXJXIXJAXLXILIX'I: X'iLPNLXi-.X'TXWUXI
X_.-AFIX_-±X.,_.LX;›...X;›i,X_i;_-. PX;.;OSX,.:.X_i:gLLX_i.,«E t`KKLX4çX4›'_.Xa?O APK
ve
ÂEAKYFNK EX;X›X.:AX;XTE|XV. XHLPNLX'QXwXisQXn'
Xg-Al-IXxXgLXg-.gX'gaoij PX;.;OSX;SXJÇLLXJTE AKKLX4:.X4›'JX.-.r0 APK
burada Xy yukarida açiklandigi gibi tanimlanmaktadir (ve y yukarida i) ile tanimlanan
polipeptid dizisi içerisinde kalinti X,in amino asit pozisyonunu belirtir).
Burada açiklanan polipeptid varyantlar, örnegin bilinen bir yapi iskelesini baz alan ve belirli
bir hedef için atiniteye sahip olan bir Z varyant polipeptidi alinarak, ve mevcut tarifnameye
göre bir yapi iskelesine sahip bir polipeptidi elde etmek için seçilen pozisyonlarda alana
yönelik mutagenez gerçeklestirilerek, hedef afinite korunarak olusturulabilir. Bir Z varyant
polipeptidinin baglayici motifini, burada açiklanan yapi iskelesi üzerine asilamak için mevcut
tarifnameye göre bir polipeptid alternatif olarak tüm molekülün kimyasal senteziyle veya bu
sahada uzman biri tarafindan bilinen baska moleküler biyoloji usulleri kullanilarak
hazirlanabilir.
Genel bir açiklama olarak, asagidaki ortak yapi iskelesi dizisini içeren ve bir baglayici motif
[BM] içerisinde amino asit dizisiyle tanimlanan bir baglanma spesifitesine sahip olan orjinal
Z varyant polipeptidleri,
AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLNDSQ APK
burada açiklandigi gibi bir polipeptid sunmak için modifiye edilebilir.
Tarifnamenin bu yönünün çesitli spesifik düzenlemelerinde, asagidaki polipeptidler
sunulmaktadir:
AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLNDSQ APK
AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLSESQ APK
AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLESSQ APK
AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLSDSQ APK
AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLNESQ APK
AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLSESQ APK
AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLESSQ APK
AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLSDSQ APK
AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLNSSQ APK
Burada açiklanan polipeptidler, birçok uygulamaya, örnegin bir hastalik için terapötik, tanisal
veya pro gnostik anlainlilik uygulamalarina sahiptir. Söz konusu polipeptidlerin, terapötik,
tanisal veya pro gnostik kullanimi olabilen hastaliklarin bir sinirlayici olmayan listesi içinde
kanser, enflamatuar hastaliklar, otoimmün hastalik, bulasici hastaliklar, nörolojik hastaliklar,
nörodejeneratif hastaliklar, göz hastaliklari, böbrek hastaliklari, pulmoner hastaliklar, mide-
bagirsak yolu hastaliklari, kardiyovasküler hastaliklar, hematolojik hastaliklar, dermatolojik
hastaliklar, alerjiler ve digerleri yer alir.
Bu nedenle, bir düzenlemede, önceden belirlenmis bir hedef için afiniteyle bir polipeptid
sunulmaktadir. Daha spesifik düzenlemelerde, söz konusu hedef, HERZ, TNFa, EGFR,
IGFlR, IgG, PDGFRß, HER3, C5, FcRn, CAIX, amiloid ß, CD4, IL8, IL6 ve insülinden
olusan gruptan seçilir. Diger düzenlemelerde, söz konusu polipeptidin, biyoteknolojik, sinai
ve farmasötik uygulamalarda kullanimi, örnegin ayirma teknolojisi, saIlastirma
uygulamalarinda bir afinite ligandi olarak veya bir saptama maddesi olarak kullanimi olabilir.
Bu tür daha spesifik bir düzenleinede, önceden belirlenmis hedef, streptokoksal Protein
Giden bir albumin baglama bölgesi ("ABD" veya "GA modülü"), veya bunun bir türevi
olabilir.
Uzman kisi, önceden belirlenmis hedeflerin listesinin, sinirlayici olmayacak sekilde
görülecegini, ve burada tanimlandigi gibi baska önceden belirlenmis hedefler için afiniteyle
polipeptidlerin, mevcut tarifnamenin kapsami içerisinde yer aldigini takdir edecektir.
Bilinen bir yapi iskelesini baz alan ve farkli hedefler için afiniteye sahip olan bilinen Z
varyant polipeptidlerin sinirlayici olmayan örnekleri, EGF reseptörü için
(WO2007/065635°te açiklanmaktadir), HER2 reseptörü için (W02009/080810”da
açiklanmaktadir), HER3 reseptörü için (WO20lO/056124,te açiklanmaktadir), IGF l
reseptörü için (W02009/Ol9l l7,de açiklanmaktadir), PDGF reseptör [3 için
(W02009/077l75”te açiklanmaktadir), albumin baglama bölgesi (ABD) için
(W02014/064237`de açiklanmaktadir), neonatal F c reseptörü (FcRn) için
(PCT/EP2014/055299°da açiklanmaktadir) ve karbonik anhidraz IX için
(W02014/096163'de açiklanmaktadir) aIiniteyle Z varyantlardir. Anlasilir olmasi için,
mevcut tarifnamede, bir Z varyant'in baglayici motifinin [BM], yukarida belirtilen
dokümanlarda açiklanan söz konusu baglayici motiflerin birinci 28 amino asit kalintisina
karsilik geldigini dikkate aliniz, burada baglayici motiflerin tanimlari, 29 amino asit
kalintisidir ve yukarida dizi i)”nin pozisyon 1-293una karsilik gelen pozisyonlarda ainino asit
kalintilarina karsilik gelir.
Bir düzenlemede, önceden belirlenmis bir hedef için bir atiniteyle bir polipeptid
sunulmaktadir, bu ayrica floresan boyalar ve metaller, kromoforik boyalar, kemiluminesan
bilesikler ve biyoluminesan proteinler, enzimler, radionüklidler ve parçaciklardan olusan
gruptan seçilen bir etiket gibi bir etiket içerir. Bu tür etiketler Örnegin polipeptid saptainasi
için kullanilabilir.
Bazi düzenlemelerde, polipeptid, bir tüzyon polipeptidde bir parça olarak mevcuttur veya
konjugat ayrica arzu edilen bir biyolojik aktiviteye sahip bir ikinci parça içerir. Bu tür arzu
edilen bir biyolojik aktivitenin sinirlayici olmayan örnekleri bir terapötik aktivite, bir
baglayici aktivite, ve bir enzimatik aktivite içerir.
Bazi düzenlemelerde, söz konusu parça ayrica bir etiket içerir.
Etiket, bazi örneklerde sadece önceden belirlenmis bir hedef için afiniteyle polipeptide, ve
bazi örneklerde hem önceden belirlenmis bir hedef için afiniteyle polipeptide, hem de
konjugat veya füzyon polipeptidin ikinci parçasina kenetlenebilir. Bundan baska, ayrica
etiketin sadece bir ikinci parçaya kenetlenebilmesi ve önceden belirlenmis bir hedef için
afiniteyle polipeptide kenetlenmemesi mümkündür. Dolayisiyla, yine baska bir düzenlemede
bir ikinci parça içeren önceden belirlenmis bir hedef için afiniteyle bir polipeptid
sunulmaktadir, burada söz konusu etiket, sadece ikinci parçaya kenetlenir.
Burada açiklanan polipeptidler veya füzyon polipeptidler, saptayici reaktif maddeler olarak,
yakalayici reaktif maddeler olarak, ayirici reaktif maddeler olarak, in vivo veya in vitro teshis
için tanisal maddeler, veya terapötik maddeler olarak kullanilabilir. Mevcut tarifnameye göre
polipeptidler veya füzyon polipeptidleri kullanan usuller, mikrotitre plakalarinda, protein
dizilislerinde, biyosensör yüzeyler üzerinde, doku kesitleri üzerinde, ve benzerleri gibi farkli
formatlarda in vitro gerçeklestirilebilir.
Ayrica mevcut tarifnameye göre polipeptid veya füzyon polipeptidlerinin, örnegin söz
konusu hedef üzerinde dogrudan veya dolayli etkilerle, kendi içinde bir terapötik, tanisal veya
prognostik madde olarak veya baska terapötik, tanisal veya pro gno stik maddeleri hedeflemek
için bir araç olarak yararli olabilecegi anlasilmalidir. Bir dogrudan terapötik etki, örnegin, söz
konusu hedefle sinyal vermeyi inhibe ederek gerçeklestirilebilir. Söz konusu hedef ayrica
birtakim hastaliklarin (örnegin yukarida belirtilen hastaliklar) prognozunu tahmin etmek için
degerli bir markör olarak hizmet edebilir.
Dolayisiyla, bir düzenlemede, terapide kullanim için veya bir tanisal madde olarak kullanim
için burada açiklandigi gibi bir polipeptid veya füzyon polipeptid sunulmaktadir. Baska bir
düzenlemede, söz konusu polipeptid veya füzyon polipeptidi ayrica bir terapötik madde
içerir. Bu tür terapötik maddelerin sinirlayici olmayan örnekleri, söz konusu polipeptid veya
füzyon polipeptidinin etkisini arttiran bir terapötik madde, söz konusu polipeptid veya füzyon
polipeptidiyle Sinerji halinde etki eden bir terapötik madde ve tedavi edilecek hastaligin farkli
bir yönünü etkileyen bir terapötik maddedir. Ayrica öngörülenler, tek basina veya daha fazla
terapötik maddelerle birlikte burada açiklandigi gibi polipeptidler içeren farmasötik
bilesimlerdir.
Mevcut tarifiiamenin bir ikinci yönünde, burada açiklandigi gibi bir polipeptid veya bir
füzyon polipeptidini kodlayan bir polinükleotid sunulmaktadir. Ayrica bu tarifnameyle
kapsananlar, bu tür bir polinükleotidin; polinükleotid içeren bir ekspresyon vektörün; ve söz
konusu ekspresyon vektörü içeren bir konakçi hücrenin eksprese edilmesini içeren yukarida
açiklandigi gibi bir polipeptid veya ûizyon polipeptidinin üretimine yönelik bir usuldür.
Mevcut tarifnamenin bir üçüncü yönünde, bir ortak yapi iskelesini baz alan polipeptid
varyantlarin bir popülasyonu sunulmaktadir, popülasyonda her bir polipeptid, asagidakilerden
seçilen bir amino asit dizisini içerir:
I) EX2X3X4AX6X7EIXIO XllLPNLX16X17X18QX20 XZIAFIX25X26LX28X29X30
PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Qs
burada X2, X3, X4, X6, X7, Xio, X] [, Xi7, Xig, X20, X21, X25 VC X28”in her biri bagimsiz
olarak herhangi bir amino asit kalintisina karsilik gelir; ve
burada, birbirinden bagimsiz olarak,
Xm N ve T7den seçilir;
X26 K ve Siden seçilir;
X29X30PX32 DDPS ve RQPE”den seçilir;
X35 A ve Siden seçilir;
X36 E ve N7den seçilir;
X39 A, C ve S”den seçilir;
X45 E ve S“den seçilir;
X46 D, E ve S'den seçilir;
X47 A ve S,den seçilir; ve
ii) X45 N oldugunda X46'nin D veya E olmamasi kaydiyla, i)'de tanimlanan diziye en az %91
Özdeslige sahip olan bir amino asit dizisi.
Yukarida dizi i),de, X2, X3, X4, X6, X7, Xio, X”, X17, Xig, X20, X21, X25 ve Xzg”in her biri tek
tek popülasyonda degisiklik gösteren bir amino asit kalintisina karsilik gelir. Dolayisiyla, her
bir bu tür amino asit kalintisi, tarifnamenin birinci (polipeptid) yönüyle baglantili olarak
yukarida açiklandigi gibi, dizide Xy olarak belirtilen herhangi bir baska kalintinin tanimindan
bagimsiz olarak herhangi bir amino asit kalintisi olabilir. Polipeptidlerin popülasyonunda
spesifik amino asit kalintilari Xy için, ve dizi i) ya da ii),nin ucunda herhangi bir ilave amino
asit kalintisi için sinirlayici olmayan seçenekler, tarifnamenin birinci yönünün düzenlemeleri
olarak yukarida belirtilenlerle aynidir.
Yukarida tartisildigi gibi, yukaridaki amino asit dizilerine kiyasla, tersiyer yapi ve bunun
islevini büyük ölçüde etkilemeden küçük degisiklikleri içeren polipeptidler ayrica mevcut
tarifriamenin kapsami içerisindedir. Bu nedenle, ayrica mevcut tarifnamede bir ortak yapi
iskelesini baz alan polipeptid varyantlarin bir popülasyonu kapsanmaktadir, burada
popülasyonda her bir polipeptid i),de tanimlanan bir dizide %91 veya daha fazla tanimla bir
amino asit dizisi içerir. Bazi düzenlemelerde, her bir polipeptid, i),de tanimlandigi gibi diziye
en az %93, örnegin en az %95, örnegin en az %97 özdes olan bir dizi içerebilir.
Burada tanimlanan popülasyon, tanimlanan polipeptid moleküllerin büyük bir sayida
benzersiz ve farkli varyantlarindan olusur. Bu baglamda, büyük bir sayi, örnegin,
popülasyonun, en az 1 x 104 benzersiz polipeptid moleküller, veya en az 1 x 106, en az 1 X
108, en az 1 x 1010, en az 1 x 1012, veya en az 1 x 1014 benzersiz polipeptid moleküller
içerdigi anlamina gelebilir. Uzman kisinin takdir edecegi gibi, popülasyonun arzu edilen
boyutunu sunmak için yeterince büyük olan bir grubu kullanmak gereklidir. Burada açiklanan
"popülasyon" ayrica "kütüphane" olarak belirtilebilir.
Uzman kisi burada açiklandigi gibi popülasyonun i),de tanimlanan polipeptidi baz alan yeni
baglayici moleküllerin seçimi için bir kütüphane olarak yararli olabilecegini takdir edecektir.
Baglayici moleküllerin, randomize edilmis polipeptidlerin bir popülasyonundan (veya
kütüphane) izole edilebilecegi bu sahada iyi bilinmektedir. Bu teknoloji, PCT yayini
WO95/19374°te, Nord ve digerleri (1997) Nature Biotechnology 152772-777,de ve
W02009/080811”de genel hatlariyla açiklanmaktadir, ve on üç farkli hedef baglanma
pozisyonlar üzerinde rastgele varyasyonla ve bir faj göstergesi veya genotip-fenotip
kenetlenmesini baz alan baska seçim sisteminde ilgili baglayicilarin müteakip seçimiyle
çesitli hedef moleküllere karsi, bir ortak Z bölge yapi iskelesini baz alan baglayici
molekülleri seçmek amaciyla basarili sekilde uygulanmistir. Burada açiklandigi gibi
popülasyon, önceki teknikteki popülasyonlara kiyasla, özellikle stabilite bakimindan
gelistirilmis özellikler sergileyen polipeptid varyantlarin bir popülasyonudur. Randoinize
edilmis polipeptidlerin bir popülasyonundan (veya kütüphane) izole edilen Z varyantlarinin
örnekleri arasinda EGF reseptörü için (W02007/065635,te açiklanmaktadir), HER2
reseptörü için (WO2009/080810”da açiklanmaktadir), HER3 reseptörü için
(WO2010/056124'te açiklanmaktadir), IGFl reseptörü için (W02009/0191177de
açiklanmaktadir), PDGF reseptörü [3 için (W02009/0771757te açiklanmaktadir), ABD için
(W02014/064237,de açiklanmaktadir), neonatal F c reseptörü (FcRn) için
(PCT/EP2014/055299`da açiklanmaktadir) ve karbonik anhidraz lX için (WO2014/0961631te
açiklanmaktadir) afiniteyle Z varyantlar yer alir.
Mevcut tarifnamenin bir dördüncü yönünde, polinükleotidlerin bir popülasyonu
sunulmaktadir. Bu popülasyonda her bir polinükleotid, üçüncü yönle baglantili olarak
yukarida tanimlandigi gibi polipeptidlerin bir popülasyonunun bir üyesini kodlamaktadir.
Mevcut tarifnamenin bir besinci yönünde, üçüncü yöne göre bir polipeptid popülasyon ve
dördüncüye göre bir polinükleotid popülasyonun bir kombinasyonu sunulmaktadir, bu
kombinasyonda polipeptid popülasyonun her bir üyesi, genotip-fenotip kenetlenmesi için
araçlarla bu üyeyi kodlayan bir karsilik gelen polinükleotidle fiziksel olarak veya mekansal
olarak iliskilidir. Bu fiziksel veya mekansal iliski, kullanilan sisteme bagli olarak asagi yukari
tam olacaktir.
Genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, bir faj gösterge sistemini içerebilir. Faj gösterge
sistemleri uzman kisi tarafindan iyi bilinmektedir, ve örnegin, Smith GP (1985) Science
22821315-1317 ve Barbas CF ve digerleri (1991) Proc Natl Acad Sci U S A 88:7978-7982”de
açiklanmaktadir.
Bundan baska, genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, bir hücre yüzey gösterge sistemini
içerebilir. Hücre yüzey gösterge sistemi, prokaryotik hücreler, örnegin Gram-pozitif hücreler,
veya ökaryotik hücreler, örnegin maya hücreleri içerebilir. Hücre yüzey gösterge sistemleri
uzman kisi tarafindan iyi bilinmektedir. Prokaryotik sistemler, örnegin, Francisco JA ve
digerleri (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90:10444-10448 ve Lee SY ve digerleri (2003)
Trends Biotechnol 21:45-52,de açiklanmaktadir. Ökaryotik sistemler, örnegin, Boder ET ve
digerleri (1997) Nat Biotechnol 15:553-557 ve Gai SA ve digerleri (2007) Curr Opin Struct
Biol 17:467-473°te açiklanmaktadir. Bir düzenlemede, söz konusu genotip-fenotip
kenetlenmesi, bir faj gösterge sistemini içerebilir.
Bundan baska, genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, bir hücre içermeyen gösterge
sistemini içerebilir. Hücre içermeyen gösterge sistemi, bir ribozom gösterge sistemi, veya bir
in vitro bölümlesme gösterge sistemi, veya cis göstergesi için bir sistem, veya bir mikro-
bilyeli gösterge sistemi içerebilir. Ribozom gösterge sistemleri uzman kisi tarafindan iyi
bilinmektedir, ve örnegin, Mattheakis LC ve digerleri (1994) Proc Natl Acad Sci U S A
91 :9022-9026 ve Zahnd C ve digerleri (2007) Nat Usulleri 4:269-279”da açiklanmaktadir. In
vitro bölümlesme sistemleri uzman kisi tarafindan iyi bilinmektedir, ve örnegin, Sepp A ve
digerleri (2002) FEBS Lett 5322455-4581de açiklanmaktadir. Cis gösterge sistemleri uzman
kisi tarafindan iyi bilinmektedir, ve örnegin, Odegrip R ve digerleri (2004) Proc Natl Acad
Sci U S A 101 :2806-28101da açiklanmaktadir. Mikro-bilye gösterge sistemleri uzman kisi
tarafindan iyi bilinmektedir, ve örnegin, Nord O ve digerleri (2003) .1 Biotechnol 106: 1-13”te
açiklanmaktadir.
Bundan baska, genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, protein-fragmani bölümlesme
analizi (PCA) gibi bir göstergesi olmayan sistem içerebilir. PCA sistemleri uzman kisi
tarafindan iyi bilinmektedir, ve örnegin, Koch H ve digerleri (2006) J Mol Biol 357z427-
441 ,de açiklanmaktadir.
Mevcut tarifnamenin bir altinci yönünde, polipeptidlerin bir popülasyonundan önceden
belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin seçilmesine yönelik
bir usul sunulmakta olup, asagidaki asamalari içerir:
(a) üçüncü yöne göre polipeptidlerin bir popülasyonunun sunulmasi;
(b) polipeptidlerin popülasyonunun, hedef ve hedef için bir afiniteye sahip en az bir
arzu edilen polipeptid arasinda spesifik etkilesimi saglayabilen kosullar altinda,
önceden belirlenmis hedefle temas haline getirilmesi; ve
(c) söz konusu spesifik etkilesim bazinda, polipeptidlerin geri kalan popülasyonundan
en az bir arzu edilen polipeptidin seçilmesi.
Asagida, bu usul, bu tarifnameye uygun olarak "seçme usulü" olarak adlandirilir.
Asama (a), polinükleotidlerin bir popülasyonu sunma ve polipeptidlerin söz konusu
popülasyonunu elde etmek için polinükleotidlerin söz konusu popülasyonunu eksprese
etmeye yönelik hazirlayici asamalar içerebilir. Polipeptidlerin bir popülasyonunun elde
edilmesi için araçlar, kullanilan gösterge sistemine bagli olarak degisir ve bu tür araçlarin
örnekleri yukaridaki genotip-fenotip referanslarinda bulunabilir. Seçme usulünde kullanilan
polipeptidlerin söz konusu popülasyonunun her bir üyesi, genotip-fenotip kenetlenmesi için
araçlarla bu üyeyi kodlayan polinükleotidle fiziksel olarak iliskili olabilir. Genotip-fenotip
kenetlenmesi için araçlar, yukarida tartisilanlardan biri olabilir.
Asama (b), polipeptidlerin popülasyonunu, hedef ve hedef için bir afiniteye sahip en az bir
arzu edilen polipeptid arasinda spesifik etkilesimi saglayabilen kosullar altinda önceden
belirlenmis hedefle temas haline getirmeye yönelik asamalar içerir. Uygulanabilir kosullar
araligi, hedefin saglamligiyla, gösterge sisteminin saglamligi, ve hedefle etkilesimin arzu
edilen özellikleriyle belirlenir. Örnegin ayirma etkilesiinine yönelik spesifik bir usul, örnegin
önceden belirlenmis bir pH`a asitlestirme arzu edilebilir. Uzman kisi uygun kosullari
belirlemek için hangi deneylerin gerekecegini bilir.
Asama (0), en az bir polipeptidin seçimini içerir. Önceden belirlenmis hedef ve hedef için
afiniteye sahip en az bir arzu edilen polipeptid arasinda spesifik etkilesim baz alinarak Geri
kalan popülasyondan arzu edilen polipeptidin seçimi için araçlar, kullanilan gösterge
Sistemine bagli olarak degisiklik gösterir ve yukarida genotip-fenotip referanslarinda
bulunabilir. Örnegin, in vitro gösterge seçim sistemleri, faj göstergesi ve protein fragman
bölümlesme analizi gibi sistemlerine kiyasla hücre içermez.
Mevcut tarifnamenin bir yedinci yönünde, önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye
sahip arzu edilen bir polipeptidi kodlayan bir polinükleotidi izole etmek için bir usul
sunulmaktadir, asagidaki asamalari içerir:
0 söz konusu arzu edilen polipeptid ve bunu, altinci yöne göre seçme usulü kullanilarak
polipeptidlerin bir popülasyonundan kodlayan polinükleotidin seçilmesi; ve
o arzu edilen polipeptidi kodlayan bu sekilde ayrilan polinükleotidin izole edilmesi.
Asagida, bu usul, bu tarifnameye göre "izolasyon usulü" olarak adlandirilir.
Polinükleotidin polipeptidden ayrilmasi, seçim için kullanilan gösterge sistemine bagli olarak
farkli sekilde yapilabilir. Örnegin, cis göstergesi ve ribozom göstergesi gibi hücre içermeyen
gösterge sistemlerinde polinükleotid veya karsilik gelen mRNA, yukarida genotip-fenotip
referanslarinda açiklanan araçlar kullanilarak polip eptidden etkili elusyonla düzeltilir.
Polinükleotidin izolasyonu, seçim için kullanilan gösterge sistemine bagli olarak farkli
usullerle yapilabilir.
Yukarida açiklanan seçim sistemlerinin çogunda, örnegin protein fragman bölümlesme
analizinde, uygun oligonükleotidler kullanilarak polinükleotid spesifik PCR amplifikasyonla
dogrudan izole edilebilir. Ayrica, ribozom göstergesinde oldugu gibi, polinükleotid, ters
transkripsiyon kullanilarak karsilik gelen mRNA'dan izole edilebilir. Polinükleotidin
izolasyonu için çesitli araçlar, yukarida genotip-fenotip referanslarinda bulunabilir.
Mevcut tarifnamenin bir sekizinci yönünde, önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye
sahip arzu edilen bir polipeptidi tanimlamaya yönelik bir usul sunulmaktadir, asagidaki
asamalari içerir:
0 yedinci yöne göre izolasyon usulüne göre kullanilarak söz konusu arzu edilen
polipeptidin kodlandigi bir polinükleotid; ve
0 Söz konusu arzu edilen polipeptidi amino asit dizisinin çikarilmasiyla olusturmak için
polinükleotidin siralanmasi.
Polinükleotidin siralanmasi, uzman kisi tarafindan iyi bilinen standart prosedürlere göre
gerçeklestirilebilir.
Mevcut tarifnamenin bir dokuzuncu yönü, polipeptidlerin bir popülasyonundan önceden
belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin seçilmesi ve
tanimlanmasina yönelik bir usul sunulmakta olup, asagidaki asamalari içerir:
(a) bir ayri tasiyici veya bilye üzerinde üçüncü yöne göre polipeptidlerin bir
popülasyonunun her bir üyesinin sentezlenmesi;
(b) önceden belirlenmis hedefle polipeptidin etkilesimini baz alan tasiyicilar veya
bilyelerin seçilmesi veya zenginlestirilmesi; ve
(c) polipeptidin, protein karakterizasyon metodolojisiyle tanimlanmasi.
Asama (c)°de, örnegin kütle spektrometrik analizi kullanmak mümkündür.
Asagida, bu usul, tarifnameye göre "seçme ve tanima usulü" olarak adlandirilir.
Ayrica önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin
üretimine yönelik bir usul açiklanmakta olup, asagidaki asamalari içerir:
. altinci yöne göre seçme usulü veya dokuzuncu yöne göre seçme ve tanima usulü
kullanilarak arzu edilen bir polipeptidin seçilmesi ve tanimlanmasi; ve
. söz konusu arzu edilen polipeptidin üretilmesi.
Asagida, bu usul, tarifnameye göre "üretim usulü" olarak adlandirilir.
Üretim usulünde, üretim, arzu edilen polipeptidi kodlayan bir polinükleotidin rekombinant
ekspresyonu kullanilarak gerçeklestirilebilir. Üretim ayrica arzu edilen polipeptidin kimyasal
sentezi de novo kullanilarak gerçeklestirilebilir.
Ayrica önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin
üretimine yönelik bir usul açiklanmakta olup, asagidaki asamalari içerir:
(al) yedinci yöne göre izolasyon usulü kullanilarak söz konusu arzu edilen polipeptidi
kodlayan bir polinükleotidin izole edilmesi; veya
(aZ) dokuzuncu yöne göre seçme ve tanima usulünü kullanarak tanimlanan bir polipeptidin
yeniden translasyona tabi tutulmasi; ve
(b) söz konusu arzu edilen polipeptidi üretmek için bu sekilde izole edilen polinükleotidin
eksprese edilmesi,
burada asama (b), asama (al) veya asama (a2),den sonra gerçeklestirilir.
Tarifnameye göre polipeptidler, popülasyonlar ve usuller, önceden belirlenmis hedefe
spesifik baglanmayla karakterize edilen bir polipeptidin tedarigiyle önceden belirlenmis bir
hedef için bir atiniteyle maddelerin tedarigini saglar.
Ayrica az spesifik olmayan baglanma sergileyen veya bunu hiç sergilemeyen önceden
belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidler sunmak mümkündür.
Ayrica bir füzyon polipeptidinde bir parça olarak kolaylikla kullanilabilen önceden
belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidler sunmak mümkündür.
Bundan baska, mevcut antikor reaktif maddeleriyle deneyimlenen bir veya daha fazla bilinen
usulü çözen önceden belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidleri sunmak mümkündür.
Bunda baska, terapötik ve/veya tanisal uygulamalarda kullanmak için uygun olan önceden
belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidleri sunmak mümkündür.
Ayrica kimyasal peptid senteziyle kolaylikla hazirlanan önceden belirlenmis bir hedefe
baglanan polipeptidler sunmak mümkündür.
Bundan baska, bulus, ayni hedefe baglanan bilinen maddeler karsisinda gelistirilmis bir
stabilite sergileyen önceden belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidlerin tanimlanmasini
saglar.
Ayrica bir memelide in vivo kullanildiginda düsük antijenisite sergileyen ve/veya bir
memeliye uygulamadan sonra gelistirilmis bir biyolojik dagilim sergileyen önceden
belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidleri sunmak mümkündür.
Mevcut tarifnameye göre popülasyonu olusturan polipeptidler için yukarida tartisilan
modifikasyonlar ayrica yukarida belirtilen usullerin herhangi biriyle elde edilen
polipeptidlere uygulanabilirdir.
Mevcut tarifnameye göre polipeptidler, bakteriyel hücreler, maya hücreleri, bitki hücreleri,
böcek hücreleri, tüm bitkiler ve transjenik hayvanlar dahil olmak üzere farkli prokaryotik
veya ökaryotik konakçilarda kimyasal sentez veya ekspresyon dahil olmak üzere herhangi
bilinen bir yolla üretilebilir.
Polipeptidler, polipeptidlerin popülasyonlari ve burada açiklanan tanimlama, seçme,
izolasyon ve üretim için usuller çesitli örnek teskil edici yönlere ve düzenlemelere atifta
bulunularak, çesitli degisikliklerin yapilabilecegi ve esdegerlerin bulusun kapsamindan
ayrilmadan bunun elementleri için sübstitüe edilebilecegi bu sahada uzman kisilerce takdir
edilecektir. Ilaveten, birçok modifikasyonun, bulusun esas kapsamindan ayrilmadan bulusun
ögretilerine özel bir durum veya molekülü adapte etmesi saglanabilir. Dolayisiyla,
tarifnamenin, üzerine düsünülen herhangi bir özel düzenlemeyle sinirli olmamasi
amaçlanmaktadir, fakat ekteki istemlerin kapsami içerisinde yer alan tüm düzenlemeleri
içermesi amaçlamaktadir.
Sekillerin kisa açiklamasi
Sekil 1 burada açiklandigi gibi bir polipeptidin örneklerinin amino asit dizilerinin bir
listesidir. Örnekler 2-3°te gelistirilmis stabiliteye sahip oldugu gösterilen Z varyant
polipeptidleri baglayan C5 dizileri, DIZI TANI NO:12, 17, 18 ve 22 olarak Sekil l°de
belirtilir, ve bunun burada tanimlanan en kisa diziye karsilik gelen dizileri, DIZI TANI
NO: 19-21 olarak belirtilir. Albumin baglama bölgelerine kaynasik C5 baglayici
polipeptidlerin amino asit dizileri, dizi tanimlayicilar DlZl TANI NO:4-l 1, 13-16 ve 23-25,le
Sekil 1°dedir. Örnek 127de gelistirilmis stabiliteye sahip oldugu gösterilen HER2, PDGF-Rß,
FCRn ve CAIX için afiniteyle Z varyant polipeptidlerin dizileri, karsilik gelen kontrol
polipeptidleri DIZI TANI NO:27, 30, 33 ve 36,yla birlikte, sirasiyla, DIZI TANI NO:28-29,
DIZI TANI NO:31-32, DIZI TANI NO:34-35 ve DIZI TANI NO:37-42 olarak belirtilir.
Burada tanimlanan en kisa diziye karsilik gelen HER2, PDGF-Rß, FcRn ve CAlX için
afîniteyle söz konusu Z varyant polipeptidlerin dizileri, DIZI TANI NO:43-54 olarak
belirtilir. ilaveten, bir kontrol C5 baglayici polipeptidin, albumin kaynasik kontrol C5
baglayici polipeptidin, albumin baglama bölgesinin ve insan C5lin amino asit dizileri
sirasiyla DIZI TANI NO:26, 1, 2 ve 3 olarak belirtilir.
Sekil 2, bir SDS-PAGE jelinin bir görüntüsüdür, burada birinci serit, SeeBlue 2P boyutu
markörünü içerir ve bantlar, stabilite testinden önce; ve (2W) bir 2 haftalik stabilite testinden
sonra C5 baglayici polipeptidi PSIOZ42lyi (DIZI TANI No:1) (0) temsil etmektedir.
Sekil 3, stabilite testinden (kesintisiz çizgi) önce ve bir 2 haitalik stabilite testinden (noktali
çizgi) sonra PSIOZ42'nin ters faz HPLC°sinden bir kromatogramdir (DIZI TANI NO: 1) .
Sekil 4 bir SDS-PAGE jelinin bir görüntüsüdür, burada birinci serit, SeeBlue 2P boyutu
markörü içerir ve bantlar, (0) baslangiç numunelerini; ve (2w) bir 2 haftalik stabilite testinden
sonraki numuneleri temsil eder. A: DIZI TANI No:1; B: DIZI TANI NO:13; C: DIZI TANI
NO:14; D: DIZI TANI NO:16.
Sekil 5 stabilite testinden önce (kesintisiz çizgi) ve bir 2 haftalik stabilite testinden (noktali
çizgi) sonra bir modifiye edilmis C5 inhibitörünün (D121 TANI No:5) ters faz HPLC,sinden
bir kromatogramdir.
Sekil 6 stabilite testinden önce (kesintisiz çizgi) ve bir 2 haftalik stabilite testinden (noktali
çizgi) sonra bir modifiye edilmis C5 inhibitörünün (DIZI TANI NO: 16) ters faz
HPLCsinden bir kromatogramdir.
Sekil 7 A: 217351 (DIZI TANI NO:37); B: Z17352 (DIZI TANI NO:38), C: 217355 (DIZI
TANI NO:39); D: Z17357 (DIZI TANI NO:40), E: 217359 (DIZI TANI NO:40; F: 217360
(DIZI TANI NO:42); ve G: 209782 (DIZI TANI NO:36) için toplanan CD spektradir.
Sekil 8 (0),dan önce ve bir 2 haftalik (2W) stabilite testinden sonra orjinal ve bulus özelligi
olan polipeptidleri gösteren SDS-PAGE jellerin görüntüleridir. A: HERZ: serit l: MW, serit 2:
202891 (0), serit 3:202891 (2w), serit 4: MW, serit 5: 217341 (0), serit 6: 217341 (2w), serit
7: 217342 (0), serit 8: 217342 (2W)”yi hedefleyen polipeptidler; B: PDGF-Rß: serit 1: MW,
serit 2: 215805 (0), serit 3:215805 (2w), serit 4: Mw, serit 5: 217343 (0), serit 6: 217343
(2W), serit 7: 217344 (0), serit 8: 217344 (2w)°yi hedefleyen polipeptidler; C: FcRn: serit 1:
210103 (0), serit 22210103 (2W), serit 3: MW, serit 4: 217347 (0), serit 5: 217347 (2W), serit
6: 217348 (0), serit 7: 217348 (2W),yi hedefleyen polipeptidler; ve D: CAIX: serit lzMw,
serit 2: 209782 (0), serit 31209782 (2W), serit 4: MW, serit 5: 217351 (0), serit 6: 217351
(2“O,seüt7:217352(0),$3ü:8:217352(2“0;seût9:217355(OLseüt10:217355(2n0,
serit 11: 217357 (0), serit 12: 217357 (2W), serit 13: 217359 (0), serit 14: 217359 (2W), serit
: 217360 (0), serit 16: 217360 (2W)”yi hedefleyen polipeptidler. Moleküler boyut markörü
(MW), Novex® Sharp Önceden boyanmis Protein Standardiydi (216, 160, 110, 80, 60, 50, 40,
, 20, 15, 10, 3.5 kDa). (Sekil 8C,de görülen çapraz baglantilar, ayni kapta boyanan bir
ikinci jelden bir etkiden kaynaklanan bir artifakttir).
Sekil 9 bir 2 haftalik stabilite testinden sonra ayni hedef için afiniteyle pozisyon 52-53 (siyah)
ve orjinal 2 varyantlarda (gri) amino asit sübstitüsyonlari ND ila SE*yi içeren 2 varyantlarin
baglanmasina yönelik sensörgramlari gösterir. A: 2017341 (DIZI TANI NO:28) ve
202891 ,in (DIZI TANI NO:27), HER21ye baglanmasi; B: 2017343 (DIZI TANI NO:31) ve
2158053in (DIZI TANI NO:30), PDGF-Rߔye baglanmasi; C: 2017347 (DIZI TANI NO:34)
ve 2101303un (DIZI TANI NO:33) FcRnlye baglanmasi ve D: 2017351 (DIZI TANI NO:37)
ve ZO9782inin (DIZI TANI NO:36), CAIXie baglanmasi. Her bir Z varyantin enjekte edilen
konsantrasyonlari, Örnek l3ite açiklandigi gibidir.
Örnekler
Asagidaki Örnekler, gelistirilinis stabilite sergileyen, yeni Z varyant polipeptidlerini gösterir.
Burada, yapi iskelelerinin önceki jenerasyonlarini baz alan Z varyant polipeptidlerinin
özellikleri, burada açiklanan yapi iskelesini baz alan Z varyant polipeptidleriyle kiyaslandi.
Karsilastirmali örnek 1
Bilinen C5 baglayici Z varyantmin stabilite testi
PSIOZ42 (DIZI TANI NO: 1) olarak belirlenen bir C5 baglayici Z varyanti, 25 mM NaP / 125
mM NaCl pH 7.0°de formüle edildi ve 2 hafta 37°C°de bir hizlandirilmis stabilite çalismasina
tabi tutuldu. Stabilite, SDS-PAGE ve Ters faz HPLC (RPC) ile test edilen stabiliteden sonra
yeni varyantlarin görünümüyle ölçüldü. Her iki analizde, baslangiç numunesi ve stabilite
çalismasina tabi tutulan numune paralel olarak yürütüldü. SDS-PAGE için, 7.5 ug protein her
bir kuyucuga yüklendi. RPC, su içinde %01 trifloroasetik asitten (TFA) olusan bir Mobil Faz
A, ve %0.] TFA / %45 MeOH / %45 izopropilamin (IPA) / %10 sudan olusan bir Mobil Faz
B kullanilarak bir Agilent 1100 HPLC üzerinde yürütüldü.
Sonuçlar, proteinin yeni formlarinin, inkübasyon sirasinda olusturuldugunu gösterir, SDS-
PAGESda (Sekil 2) bantlar olarak ve Ters faz HPLC (RPC) kromatogramlarinda (Sekil 3)
yeni tepe noktalari olarak görülür. Sekil 37te, 2 haftalik inkübasyondan sonra %57 oraninda
orjinal protein numunesine karsilik gelir.
DIZI TANI NO:1*de Pozisyonlar 1-60, DIZI TANI No:753 olarak W02013/126006,da
önceden açiklandigi gibi polipeptid Z06175a,ya karsilik gelir.
Örnek 2
Modifiye edilmis C5 baglavici polipeptidler ve bilesiklerin stabilite testi
Modifiye edilmis C5 baglayici polipeptidler ve bilesikler sentezlendi ve W02013/126006'da
açiklandigi gibi esas itibariyle sailastirildi.
Kisaca, C5 baglayici Z varyantlarini kodlayan DNA, GeneArt, GmbH tarafindan optimize
edilen ve sentezlenen E. coli' kodonuydu. Yeni C5 baglayici Z varyantlari temsil eden sentetik
genler alt-klonlandi ve E. coli olarak eksprese edildi.
Hücre içi eksprese edilen Z varyantlar, geleneksel kromatografi usuller kullanilarak
satlastirildi. Homojenizasyon ve klarifikasyon, sonikasyonla, ardindan santrifügasyon ve
filtrasyonla gerçeklestirildi. Anyon degisim kromatografisi, yakalama asamasi olarak
kullanildi. Ayrica saflastirma, hidrofobik etkilesim kromatografisiyle elde edildi.
Saflastirmalar, asidik kosullarda (pH 5.5) yapildi. Parlatma ve tampon degisimi, boyut
eksklüzyon kromatografisiyle gerçeklestirildi.
Satlastirilan proteinler, 25 inM NaP / 125 mM NaCl pH 7.0,da formüle edildi ve 2 hafta 37
°C°de bir hizlandirilmis stabilite çalismasina tabi tutuldu. Stabilite, SDS-PAGE ve Ters faz
HPLC (RPC) ile stabilite testinden sonra yeni varyantlarin görünümüyle ölçüldü. Her iki
analizde, baslangiç numunesi ve stabilite çalismasina tabi tutulan numune paralel olarak
yürütüldü. SDS-PAGE için, 7.5 ug protein her bir kuyucuga yüklendi. Elde edilen bir jelin
bir örnegi, Sekil 4°te gösterilmektedir.
RPC, su içinde %0.] trifloroasetik asitten (TFA) olusan bir Mobil Faz A, ve %0.] TFA / %45
MeOl-l / %45 izopropilamin (IPA) / %10 sudan olusan bir Mobil Faz B kullanilarak bir
Agilent 1100 HPLC üzerinde yürütüldü. DIZI TANI No:5 için elde edilen bir
kromatogramin bir örnegi, Sekil Site gösterilmektedir.
Stabilite testinin sonuçlari Tablo 1'de Özetlenmektedir.
Tablo 1. 3 7 °C ,de 2 hafta inkübasyondarz sonra Z varyant polipeptidlerin Stabi'litesi'. SDS-
PA GE ve HPLC ,den sonuçlar kiyaslanmakladir.
DIZI Ana tepe noktasi
SDS-PAGE RPC ön-tepe RPC son-tepe
TANI Tanimlama (toplam protein
bantlari noktalari _ noktalari
NO: yüzdesi)
1 ?810242 2 2 57 l
4 PSIO332 2 1 57 l
PSIO334 1 l 73 0
DIZI Ana tepe noktasi
TANI Tanimlama SDS-PAGE RPC ön-tepe (toplam protein RPC son-tepe
NO: bantlari noktalari yüzdesi) noktalari
6 PSIO335 2 2 57 1
7 PS[0336 2 2 57 l
8 ?810337 2 2 57 1
9 PSIO339 2 2 57 1
PSIO340 2 2 67 1
11 PSI0369 2 1 90 1
12 PSIO377 1 0 77 0
13 PSIO378 1 0 89 0
14 PSIO379 1 0 88 0
PSIO381 1 0 87 0
16 PSIO383 1 0 9] 0
22 PSIO400 1 0 91 0
23 PS 10410 1 1 72 1
24 PSIO403 1 1 77 1
PSIO404 1 1 88 0
Tablo 1°de birtakim modifiye edilmis C5 baglayici polipeptidler veya bilesiklerin, PSIO242
ile kiyaslandiginda arttirilmis stabilite gibi gelistirilmis özelliklere sahip oldugu sonucuna
varilabilir. Bu tür gelistirilmis C5 baglayici polipeptidler veya bilesikler arasinda PSIO334
(DIZI TANI No:5), PSIO340 (DIZI TANI NO:10), PSIO369 (DIZI TANI No:1 1), PSIO377
(DIZI TANI NO:12), PSIO378 (DIZI TANI NO:13), PSIO379 (DIZI TANI NO:14), PSIO381
(DIZI TANI NO:15), PSIO383 (DIZI TANI NO:16), PSIO400 (DIZI TANI NO:22), PSIO410
(DIZI TANI NO:23), PSIO403 (DIZI TANI NO:24) ve PSIO404 (DIZI TANI NO:25) yer alir.
Belirtilen varyantlarin altisi (DIZI TANI NO:5, 12, 13, 14, 16 ve 22), pozisyonlar 52-53”te
amino asit kalintilarinin, NDsden (cf. P810242) SE°ye sübstitüe edilmis olmasi bakimindan
ortaktir. DIZI TANI NO:15,te, karsilik gelen sübstitüsyon, ND ila ES”dir. DIZI TANI
NO:249te sadece pozisyon 537teki amino asit kalintisi, DIZI TANI NO:25°te pozisyon 525de
amino asit kalintisi, N ila Saden sübstitüe edilirken D ila E”den sübstitüe edilmistir.
Örnek 3
Modifiye edilmis bilesiklerin insan C5”e baglanmasi
Insan serum albumin, amin kenetlenmesiyle Amin Reaktif 2. jenerasyon (AR2G) Dip and
Read Biyosensörlerine (Pall Life sciences (ForteBio) Kat # 18-5092) immobilize edildi.
PSIOZ42 (DIZI TANI NO: 1; 1 nM) ve okuma tamponunda (HBS-EP Tamponu [10 mM
HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, %0.005 Yüzey aktif madde P20], GE
Healthcare, kat. no. BR100188) modifiye edilmis C5 baglayici bilesikleri (1 uM), her biri
HSA ile ayri bir sensöre, 120 saniye, ardindan bir yeniden olusum döngüsüyle 0.79 nM ila 25
nM arasinda degisen konsantrasyonlarda ve her bir konsantrasyon arasinda bir baz hatti
kaydiyla okuma tamponunda insan C5 ”e (Quidel, kat. no. A403) tabii tutulmadan önce
okuma tamponunda bir baz hatti kaydiyla, 60 saniye yüklendi. Sensörler için yeniden olusum
kosullari, 10 mM Glisin, pH 2°ydi (30 saniye üç darbe ve 60 saniye çalistirma tamponu). Her
bir spektrogram, fakat C5 baglama kapasitesi olmadan, bir albumin baglama bölgesini (DIZI
TANI No:2) içeren benzer bir yapininkine karsi referansla çikarildi. Veriler, ForteBio
Analysis 7.1 (Pall Life sciences (ForteBio) kinetics yazilimi) kullanilarak Langmuir 1:1
modeline göre analiz edildi.
C5 ile PSlO242`in (DIZI TANI NO;1) etkilesimin nispi KD'si, Tablo 2°de gösterilmektedir.
P810242anin Kplsi (DIZI TANI NO: 1) farkli çalistirmalarda 1-3 nM”den degiskenlik gösterir.
Tablo 27de sonuçlar, mevcut tarifnameye göre C5 baglayici bilesiklerinin,
W02013/126006'da açiklanan polipeptid PSIO242°ninkine (DIZI TANI NO: 1) benzeyen
insan C5,e bir baglama kapasitesi sahip oldugunu gösterir.
Tablo 2. DIZI TANI NO:1,in C5 etki'lesiminin KD degerine kiyasla DIZI TANI N0.'5, 13, 15
ve 16 'nm etkilesi'mi'm'n KD degeri
DIZI TANI NO: Tanimlama Rel. KD
l PSIOZ42 1.0
PSIO334 1.1
DIZI TANI NO: Tanimlama Rel. KD
13 PSIO378 1.3
PSIO381 23
16 PSIO383 2.1
Örnek 4
Kimyasal olarak sentezlenen C5 baglayici polipeptidin stabilitesi
Kimyasal olarak sentezlenen bir PSIO400 (DIZI TANI NO:22), BACHEM AG,den siparis
edildi. Polipeptidin stabilitesi, Örnek ?deki gibi ayni metodolojiye göre test edildi. Stabilite
testinin sonuçlari, Tablo 3”te gösterilmektedir.
Tablo 3. 2 haftalik inkübasyondan sonra kimyasal olarak üretilen C5 baglayici poli'pepti'd
PSIO400ün stabi'li'tesi (DIZI TANI NO:22)
DIZI Tanimlama SDS- RPC ön-tepe Ana tepe noktasi RPC son-tepe
TANI NO PAGE noktalari (toplam protein noktalari
bands yüzdesi)
22 PSIO400 1 0 91 0
PSIO400 stabilitesi, Örnek 2'de E. coli' `de üretilen ayni polipeptidle kiyaslanabilirdir.
PSIO400 kat bütünlügü (DIZI TANI NO:22), uzak UV dairesel dikroizm (CD) spektrasi
kullanilarak Örnek 2 usullerine uygun olarak üretilen bir rekombinant C5 baglayici
polipeptidle (PSIO257, DIZI TANI NO:26) kiyaslandi.
CD spektrasi bir J-720 CD spektropolariinetre (Jasco, Japonya) ile kiyaslandi. Numuneler, Pi
tampon (5 mM Na-K-PO4, pH 7.0) kullanilarak 0.17 mg/ml protein konsantrasyonuna
seyreltildi. Pi tamponunun bir CD spektiumu ilk olara kaydedildi, daha sonra spektra
numunelerin her biri için ve son olarak Pi tamponu için tekrar kiyaslandi. Iki tampon
spektrasi çakistigindan, ilk olarak kaydedilen spektrum, tampon spektrumu olarak kullanildi.
Tampon spektrumu, 25`lik kivrimli genislikle Savitzky-Golay prosedürü kullanilarak
yumusatildi pürüzsüzlestirildi. Baska spektra, '15”lik bir kivrimli genislikle ayni prosedüre
göre pürüzsüzlestirildi. Pürüzsüzlestirilen tampon spektruinu daha sonra diger
pürüzsüzlestirilen spektranin her birinden çikarildi. CDNN programi, proteinlerin sekonder
içerigini tahmin etmek için kullanildi ve elde edilen tahminler, Tablo 4”te sunulmaktadir.
Sonuçlar ne pozisyon 52 ve 53ste iki amino asit sübstitüsyonu ne de kimyasal sentezle
polipeptid üretiminin, kimyasal olarak sentezlenen polipeptidin sekonder yapi içerigini
etkiledigini gösterdi. Sekonder yapi içeriginin bütünlügü rekombinant olarak üretilen
PSIO257 (DIZI TANI NO:26) ile kiyaslandi.
Tablo 4. CD ile belirlendigi gibi iki C5 baglayici polipeptid için sekonder yapi içeriginin
kiyaslamasi
DIZI TANI NO:26 Dizi TANI NO:22
Sarmal %63 %69
Anti-paralel %3 %2
Paralel %3 %3
Beta-Turn %13 %12
Düzensiz sargi %13 %1 1
Örnek 5
Modifiye edilmis Z varvantlar ve polipeptidlerin insan C5,ve baglanmasi
Insan C5 için C5 baglayici bilesikleri P810242 (DIZI TANI NO:1), PSIO340 (DIZI TANI
NO:10), PSIO378 (DIZI TANI NO:13), ve PSIO410 (DIZI TANI NO:23) ve C5 baglayici
polipeptid PSIO400'ün (DIZI TANI NO:22) baglama afînitesi, bir Biacore T200 cihazi (GE
Healthcare) kullanilarak analiz edildi. Insan C5 (Quidel, kat. no. A403), imalatçi protokolüne
göre amin kenetlenme kimyasi kullanilarak bir CMS sensör çipine (900 RU) kenetlendi.
Kenetlenme, 10 mM Na-asetat tamponu pH 5°te (GE Healthcare) 7.5 ug/ml'lik bir
konsantrasyonda hC5”in enjekte edilmesiyle gerçeklestirildi. Referans hücresi, fakat insan
C5,i enjekte etmeden ayni reaktif maddeleriyle muamele edildi. C5 polipeptid ve bilesiklerin,
immobilize edilmis hC57e baglanmasi, tekli döngü kinetik usulüyle çalisildi, burada
numunenin bes konsantrasyonu, tipik olarak HBS-EP tamponunda 25, 12.5, 6.25, 3.12 ve
1.56 nM enjeksiyonlar arasinda yeniden olusum olmadan ayni döngüde 25 °C,de 30
pil/dakikalik bir akis hizinda birbiri ardindan enjekte edildi. Referans hücresinden veriler,
hacim refraktif indis degisiklikleri karsilamak için çikarildi. Birçok durumda, HBS-EP”nin bir
enjeksiyonu ayrica kontrol olarak dahil edildi, böylece sensörgramlar çift bosaltildi.
Yüzeyler, HBS-EP tamponunda yeniden olusturuldu. Kinetik sabitler, Biacore T200
Evaluation Yazilim versiyonu 1.071n Langmuir 1:1 analit modeli kullanilarak
sensörgramlardan hesaplandi. Etkilesimlerin elde edilen KD degerleri, Tablo 5°te
sunulmaktadir.
Tablo 5. DIZI TANI NO.'1 ile C5 etkilesimin KD degerine kiyasla C5 ile DIZI TANI NO:10,
13, 22 ve 23 'ün etkilesimi'nin KD degeri
DIZI TANI NO: Tanimlama KD (nM)
1 PSIOZ42 1.3
PSIO340 2.5
13 PSIO378 2.1
22 PSIO400 0.53
23 PSIO410 1.3
Mevcut veriler, stabilite-arttirici amino asit sübstitüsyonlarinin, C5,e baglanabilme özelligi
üzerinde herhangi bir anlamli negatif etkiye sahip olmadigini gösterir, ve bu nedenle bunlarin
biyolojik aktivitelerini etkilemez.
Örnek 6
Hemoliz inhibisyonu
Klasik tamamlayici yol islevi ve bunun C5 baglayici bilesikler PSIO3 78 (DIZI TANI NO:13)
ve PSIO410 (DIZI TANI NO:23), ve C5 baglayici polipeptid PSIO400 (DIZI TANI NO:22)
ile inhibisyonuna yönelik çalisinalar için, koyun eritrositler, Alsever çözeltisinde (Isveç
Ulusal Veteriner Enstitüsü) taze koyun tam kandan hazirlandi. Eritrositler bundan sonra
antikorla duyarlastirilan koyun eritrositleri (EA) haline gelmesi için tavsan anti-koyun
eritrosit antiserumla (Sigma) muamele edildi. Tam islem, aseptik kosullar altinda yürütüldü.
Tüm baska reaktif maddeler ticari kaynaklardandi.
In vitro analizde, bir test proteini, bir tamamlayici serum ve EA süspansiyonun art arda
ilaveleriyle 96-kuyucuklu U-form mikrotitre plakasinda yürütüldü. Beher kuyucuk için 50 ul
bir toplam reaksiyon hacminde ve pH 7 .3-7.4”te tüm reaktif maddelerin nihai
konsantrasyonlari, 0.15 mM CaCI 2; 0.5 mM MgCI 2; 3 mM NaN 3; 138 mM NaCl; %0.]
jelatin; 1.8 mM sodyum barbital; 3.1 mM barbiturik asit; 5 milyon EA; arzu edilen
konsantrasyonlarda uygun seyreltmede tamamlayici protein C5 serumu, ve C5 baglayici
bilesik veya polipeptiddi.
C5 baglayici bilesikler ve polipeptid, reaksiyonun EA süspansiyon ilavesiyle
baslatilmasindan önce 20 dakika buz üzerinde yukarida açiklanan tamamlayici serumla
önceden inkübe edildi. Hemolitik reaksiyonun, 37 °C'de çalkalama kosullari altinda 45
dakika devam etmesine izin verildi ve daha sonra %002 Tween 20 içeren 100 ul buz
soguklugunda salin ilavesiyle istege bagli olarak durduruldu. Hücreler, flakonun altina
santrifüjlendi ve 100 ul üst faza karsilik gelen üst porsiyon, yari alanli ve düz tabanli
kuyucuklara sahip bir saydam mikroplakaya aktarildi. Reaksiyon sonuçlari, 415 nmilik bir
dalga boyunda bir mikrotitre plaka okuyucusu kullanilarak optik yogunluk olarak analiz
edildi.
Bir kontrol nuinunesi (PSlO242, DIZI `TANI NO: 1) ve vehikül, sirasiyla inhibe edilmemis ve
tamamen inhibe edilmis reaksiyonlar için degerleri tanimlamak amaciyla her bir plakaya
dahil edildi. Bu degerler, herhangi bir belirtilen numune konsantrasyonunda tamamlayici
hemolizin % inhibisyonunu hesaplamak için kullanildi. Test edilen C5 baglayici bilesikleri ve
polipeptidin inhibitör etkileri (IC 50-degerler), C5 ”i tükenmis seruma ilave edilen insan
C5°ün bir kontrollü konsantrasyonu varliginda ayni analize uygulanarak tanimlandi. Oldukça
etkili inhibitörler (düsük nanomolar ila alt-nanomolar) için, reaksiyon karisiminin bir nihai
C5 konsantrasyonu, 0.1 nM”de kontrol altina alindi, bu, istege bagli olarak C5°i tükenmis
veya bundan yoksun sera kullanilarak olusturuldu. Sonuçlar asagi Tablo 6”da sunulmaktadir.
Tablo 6. C5-baglayici bilesikler ve polipeptidin inhibitör kapasitesi
DIZI TANI NO: Tanimlama Etki (%) IC 50 (nM)
1 PSI0242 100 0.47
13 PSIO378 83 0.58
DIZI TANI NO: Tanimlama Etki (%) IC 50 (nM)
22 PSIO400 - 4
23 PSIO410 107 0.49
Hemoliz analizinden sonuçlar gelistirilmis C5 baglayici bilesikler PSI0378 (DIZI TANI
NO:13) ve PSIO4101un (DIZI TANI NO:23), islev bakimindan referans bilesigi PSIO242°den
(DIZI TANI NO:1) anlamli sekilde degismedigini gösterir. C5 baglayici polipeptid PSIO4OO
(DIZI TANI NO:22) analizde islevseldir ve bir albumin baglama bölgesi içermediginden,
sonuçlar, referans bilesigininkilerle dogrudan kiyaslanamaz.
Örnek 7
Insan albumin baglama
Albumin için C5 baglayici bilesiklerin afinitesinin degerlendirilmesi için, kaplama olarak
rekombinant insan albumin (Novozyines) ve Affibody AB (primer) ve DakoCytomation'dan
(saptama) piyasada satilan antikorlar kullanilarak bir insan albumin ELISA kullanildi.
PSIOZ42”den (DIZI TANI NO: 1) hazirlanan ve bir C5 baglayici polipeptid ve streptokoksal
protein Gsnin bir albuinin baglama bölgesini içeren standart bir usul, numunelerin ölçülmesi
için kullanildi.
Bir 96-kuyucuklu mikroplaka, rekombinant insan albuminle kaplandi. Plaka daha sonra
%005 Tween 20 (PBST) içeren fosfat tamponlu salinle yikandi ve PBS°de %1 kazeinle 1-2
saat bloke edildi. Bir plaka yikamasindan sonra, standart, usul kontrolleri, kontrol numunesi
ve test numuneleri plakaya ilave edilir. 2 saat inkübasyondan sonra, bagli olmayan malzeme
bir çözeltiyle giderildi. bir keçi anti-Affibody® IgG (Aftibody AB, Kat no. 20.1000.01.0005)
kuyucuklara ilave edildi ve plaka, bagli C5 baglayici bilesiklerine baglanmasina izin vermek
için 1.5 saat inkübe edildi. Bir yikamadan sonra, tavsan anti-keçi IgG HRP7nin
(DakoCytomation) keçi antikorlarina 1 saat baglanmasina izin verildi. Bir nihai yikamadan
sonra, bagli HRP miktari, enzimle mavi bir ürüne dönüstürülen TMB substrati (3,3',5,5'-
tetrametibenzidin) ilavesiyle saptandi. 30 dakika sonra 1 M hidroklorik asit ilavesi,
reaksiyonu durdu ve kuyucuk içeriklerinin rengi maviden sariya degisti. 450 nm°de
absorbanlar, bir referans dalga boyu olarak 650 nm,de absorbans kullanilarak fotometrik
olarak ölçüldü. Renk yogunlugu, PSIOZ42 (DIZI TANI NO:1) miktariyla orantiliydi ve
numune konsantrasyonlari, standart egriden belirlendi.
Streptokoksal protein G'den (ABD) albumin baglama bölgesinin bir türevini içeren C5
baglayici bilesiklerin, insan albumin baglanabildigi gösterilmistir. Veriler, Tablo 7°de
sunulmaktadir.
Tablo 7. ELISA ,dan sonuçlarin Özeti
DIZI TANI NO: Tanimlama toplam protein içeriginin yüzdesi
l PSIOZ42 103
13 PSI0378 85
23 PSIO410 150
Analizin yorumlamasi, gelistirilmis stabiliteyle arastirilan C5 baglayici polipeptidlerin her
ikisinin bunlarin insan serum albumini baglayabilme özelligini korumasidir.
Örnek 8
C5 baglayici Z varvantlari ve polipeptidlerin üc avlik stabilite testi
37 °Clde (Örnek 2) 2 haftalik stabilite testinde P810242'ye kiyasla gelistirilmis bir stabilite
gösteren C5 baglayici varyantlari ve polipeptidleri, 37 °Clde daha uzun 3 aylik bir stabilite
testine tabi tutuldu. Stabilite testi ve RPC analizinin kurulumu, Örnek Zide açiklandigi
gibiydi. Stabiliteiiin degerlendirilmesi, kromatogramin ana tepe noktasinin ölçülmesiyle ve
toplam protein içeriginin karsilik gelen yüzdesinin hesaplanmasiyla yapildi. Örnek 2°den
veriler, yorumlamayi daha kolay hale getirmek için asagida Tablo 8”de yer almaktadir.
Tablo 8. 37 °C 'de 3 ay inkübasyondan sonra C5 baglayici polipeptidleri'n ve bilesiklerin
stabilitesi
DIZI TANI Tanimlama 2 hatta, 37 °C Ana tepe noktasi 3 ay, 37 °C Ana tepe noktasi
NO: (toplam protein yüzdesi) (toplam protein yüzdesi)
PSIO334 73 16
DIZI TANI Tanimlama 2 hafta, 37 °C Ana tepe noktasi 3 ay, 37 °C Ana tepe noktasi
NO: (toplam protein yüzdesi) (toplam protein yüzdesi)
13 PSIO378 89 59
14 PSI0379 88 58
PSIO381 87 46
16 PSIO383 91 59
23 PSIO410 72 16
24 PSIO403 77 35
PSI0404 88 46
PS10242,ye kiyasla pozisyonlar 52-53,te amino asit sübstitüsyonlari ND ila SESyi içeren
(DIZI TANI NO:13, 14, ve 16) C5 baglayici bilesikler, ayni kosullar altinda 2 haftadan sonra
(bakiniz Tablo 1) P3102427den (DIZI TANI NO: 1), 37 °Cide 3 ay sonra orjinal formda
proteinin daha yüksek bir oranini gösterdi. Diger test edilen bilesikler ayrica PSIO242lye
kiyasla artmis bir stabilite gösterir.
Örnek 9
Jenerasvon, stabilite çalismasi ve farkli hedefler için spesifitevle vapi iskelesi-modifiye
edilmis polipeptidlerin baglama degerlendirilmesi
Farkli hedefler için spesititevle yapi iskelesi-modifiye edilmis polipeptidlerin ienerasyonu:
Burada açiklanan yeni yapi iskelesini içeren polipeptid varyantlar, farkli hedefler için
spesifiteyle Z varyant polipeptidler alinarak, ve yapi iskelesi içerisinde seçilen pozisyonlarda
alana yönelik mutagenezin gerçeklestirilmesiyle olusturulur. Yeni moleküller, bir Z varyant
polipeptidinin bir baglayici motitinin, yeni yapi iskelesine asilanmasi için, alternatif olarak
tüm molekülün kimyasal senteziyle veya bu sahada uzman biri tarafindan bilinen baska
moleküler biyoloji usulleri kullanilarak hazirlanabilir.
Farkli hedefler için spesifiteyle yapi iskelesi-modifiye edilmis polipeptidlerin karsilastirmali
stabilite çalismasi: Yukarida açiklandigi gibi olusturulan her bir yeni polipeptid için, stabilite,
orjinal polipeptid veya baska bir kiyaslanabilir polipeptidin stabilitesiyle kiyaslanir.
Polipeptidler, [25 mM NaP, 125 mM NaCl, pH 7.0],deki formülasyon gibi farkli kosullara ve
Örnek 2°de açiklandigi gibi 2 hafta ve/veya Örnek 8”de açiklandigi gibi 3 ay 37 °C9de
inkübasyona tabi tutulur. Stabilite, Örnek 2,de açiklandigi gibi SDS-PAGE ve RPC
analizlerinin gerçeklestirilmesiyle yeni varyantlarin görünümünün analiz edilmesiyle
degerlendirilir.
Yapi iskelesi pozisyonlarinda katilan modifikasyonlarla polipeptidlerin, Örnek 2 ve Örnek
12”de sunulan sonuçlara benzer gelistirilmis stabilite göstermesi beklenmektedir.
Yapi iskelesi-modifiye edilmis polipeptidlerin baglama degerlendirilmesi: Gelistirilmis
stabilite özellikleri gösterilmis polipeptidler ayrica yapi iskelesinde degisiklikler basladiktan
sonra bunun korunan hedefine baglama kapasiteleri bakimindan degerlendirilir. Baglama
çalisinalari, bir biyosensör cihazi, veya bu sahada uzman kisi tarafindan bilinen herhangi bir
baska cihaz üzerinde ve iki veya daha fazla molekül arasinda etkilesimin ölçülmesiyle
gerçeklestirilir. Örnegin, hedef molekül, veya bunun bir fragmani, cihazin bir sensör çipi
üzerinde immobilize edilir, ve test edilecek polipeptidi içeren numune, çip üzerinden geçirilir.
Alternatif olarak, test edilecek polipeptid, cihazin bir sensör çipi üzerinde immobilize edilir,
ve önceden belirlenmis hedefi içeren bir numune, veya bunun bir fragmani, çip üzerinden
geçirilir. Baglama afinitesi, bir deneyde test edilebilir, burada polipeptid numuneleri, antikor
kapli ELISA plakalari üzerinde yakalanir ve biyotinlenmis önceden belirlenmis hedef, veya
bunun bir fragmani ilave edilir, bunu streptavidinle konjuge edilmis HRP takip eder. TMB
substrati ilave edilir ve 450 nm,de absorbans, bir çok kuyucuklu plaka okuyucu, örnegin
Victor3 (Perkin Elmer) kullanilarak ölçülür. Örnegin etkilesim için EC50 degerini (yari azami
atkili konsantrasyon) belirlemek için bir kantitatif ölçüm arzu edildiginde, ELISA ayrica
kullanilabilir. Önceden belirlenmis hedef, veya bunun bir fragmaninin bir seyreltme serilerine
karsi polipeptid yaniti, yukarida açiklandigi gibi ELISA kullanilarak ölçülür. Bu tür deneyle
elde edilen sonuçlar ve ECSO degerleri, örnegin GraphPad Prism 5 ve dogrusal olmayan
regresyonun kullanildigi sonuçlardan hesaplanabilir. Polipeptid, bir albumin baglama
bölgesini içerdiginde, albumin baglama etkisi, Örnek 3”te açiklandigi gibi veya Örnek 73de
açiklandigi gibi benzer sekilde degerlendirilecektir.
Burada açiklanan yapi iskelesi mutasyonlarina sahip polipeptidler ve, ilaveten, bunun hedefi
için benzer veya gelistirilmis baglama kapasiteleri, örnegin biyo-farmasötik ürünlere daha
fazla gelistirme için daha iyi adaylar olarak kabul edilir.
Örnek 10
Dört farkli hedef için spesifitevle yapi iskelesi-modifiye edilmis nolipeptidleriii
ienerasyonu
Burada açiklanan yeni yapi iskelesini içeren polipeptid varyantlar, farkli hedefler için
spesifiteyle Z varyant polipeptidlerini alarak, ve yapi iskelesi içerisinde seçilen pozisyonlarda
alana yönelik mutagenez gerçeklestirilerek olusturuldu. Polipeptid varyantlar, insan
epidermal büyüme faktörü reseptör 2,yi (HER2) hedefleyen 202891 ,de yapi iskelesi
pozisyonlarinda amino asit sübstitüsyonlari (DIZI TANI NO:27); trombosit kaynakli büyüme
faktörü reseptörü beta (PDGF-RßYyi hedefleyen 215805 (DIZI TANI NO:30); neonatal Fe
reseptörünü (FcRn) hedefleyen 210103 (DIZI TANI NO:33); ve karbonik anhidraz IX,u
(CAIX) hedeneyen 209782 (DIZI TANI NO:36), Tablo 9'da belirtilmektedir.
Tablo 9. Orjinal ve asagida açiklanan Örneklerde stabilite ve islev bakimindan üretilen ve
analiz edilen bulus özelligi olan polipeptidler
DIZI TANI Tanimlama Hedef Amino asit Bulus özelligi olana
NO sübstitüsyonlar karsi orjinal
27 202891 HER2 - Orjinal
28 217341 HER2 NSZS, D53E Bulus özelligi olan
29 217342 HER2 D36R, D37Q, S39E, NSZS, Bulus özelligi olan
D53E
215805 PDGF- - Orjinal
Rß
31 217343 PDGF- N52S, D53E Bulus özelligi olan
Rß
32 217344 PDGF- D36R, D37Q, S39E, N52S, Bulus özelligi olan
Rß D53E
33 210103 FcRn - Orjinal
34 217347 FcRn N528, D53E Bulus özelligi olan
217348 FcRn D36R, D37Q, S39E, NSZS, Bulus özelligi olan
D53E
DIZI TANI Tanimlama Hedef Amino asit Bulus özelligi olana
NO sübstitüsyonlar karsi orjinal
36 Z09782 CAIX - Orjinal
37 Z17351 CAIX NSZS, D53E Bulus özelligi olan
38 Z17352 CAIX D36R, D37Q, S39E, N52S, Bulus özelligi olan
D53E
39 217355 CAIX D53E Bulus özelligi olan
40 Z17357 CAIX D36R, D37Q, S39E, D53E Bulus özelligi olan
41 Z17359 CAIX NSZS Bulus özelligi olan
42 Z17360 CAIX D36R, D37Q, S39E, N52S Bulus özelligi olan
Tüm varyantlar, bir N-terrnina16 x Histidin-etiketiyle (HiSö) klonlandi ve format
MGSSHHHHHHLQ-[Z#####],de kodlanan polipeptid yapilari elde edildi. Mutasyonlar, üst
üste binen arzu edilen amino asit sübstitüsyonlari kodlayan oligonükleotid primer çiftler
kullanilarak ve yerlesik moleküler biyoloji teknikleri kullanilarak bulus özelligi olan
polipeptidlerin plazmidlerine katildi. Dogru plazmid dizileri, DNA diziliiniyle onaylandi.
E coli' (sus T7E2) hücreleri (GeneBridge), orjinali ve bulus özelligi olan polipeptidleri
kodlayan gen fragmanlarini içeren plazmidlerle dönüstürüldü. Hücreler, 50 tig/ml
kanamisinle takviye edilmis TSB-YE ortaminda 37 oCide yetistirildi ve protein ekspresyonu,
IPTG ilavesiyle art arda katildi. Pelletlenen hücreler, bir FastPrep®-24 homojenlestirici
(Nordic Biolabs) kullanilarak ayrildi ve hücre debrisi santriiîigasyonla giderildi. Bir Hisö-
etiketli protein olarak Z varyantini içeren her bir üst faz, imalatçilarin talimatlarina göre His
GraviTrapTM kolonlari (GE Healthcare) kullanilarak immobilize edilmis metal iyon afinite
kromatografisiyle (IMAC) saflastirildi. Sailastirilan Z varyantlar, PD-lO tuz giderici kolonlar
(GE Healthcare) kullanilarak tamponla degistirilmis ila fosfatla degistirilmis salindi (PBS;
1.47 mM KH2P04, 8.1 mM NaZHPO4, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, pH 7.4). Her bir
polipeptidin dogru tanimi, SDS-PAGE ve HPLC-MS ile onaylandi.
Örnek 11
Yapi iskelesi-modifiye edilmis polipeptidlerin dairesel dikroizm spektroskopi analizi
Dairesel dikroizm (CD) analizi, erime sicakliklarini (Tin) ve amino asit sübstitüsyonlarinin
bir sonucu olarak bulus özelligi olan polipeptidlerin sekonder yapisinda potansiyel
degisiklikleri degerlendirmek için gerçeklestirildi.
Saflastirilmis Hisö-etiketli Z varyantlar, PBS'de0.5 mg/mliye seyreltildi. Her bir seyreltilmis
Z varyanti için, 250-195 nmide bir CD spektrumu 20 °Cide kaydedildi. Bir degisken sicaklik
ölçümü (VTM), Tmiyi belirlemek için gerçeklestirildi. VTM,de, sicaklik, 5 °C/dakikalik bir
sicaklik egimiyle, 20 ila 90 °C,ye arttirilirken, absorbans, 221 nmide ölçüldü. VTM”den
sonra, 250-195 nm,de bir ikinci CD spektrumu 20 °Cide kaydedildi. CD ölçümleri, l mm”lik
bir optik yol uzunluguyla bir hücre kullanilarak bir Jasco J-810 spektropolarimetresi (J asco
Scandinavia AB) üzerinde gerçeklestirildi.
Sicaklik çizgisine karsi CD sinyalinde geçisin orta noktasindan belirlendigi gibi her bir ilgili
polipeptidin Tmssi Tablo 10,da gösterilmektedir. Tüm mutasyona ugramis polipeptidler
korunmus alfahelik yapi gösterdi ve 90 °C°ye isitildiktan sonra dahi tersinir sekilde veya
neredeyse tersinir sekilde tekrar katlandi. CD spektrasinin seçilen bir grubu, Sekil 7,de
gösterilmektedir.
Tablo 10. Orjinal ve CD ile belirlenen bulus Özelligi olan Z varyanîlar için erime sicakliklari
DIZI TANI NO Tanimlama Hedef Tm (°C) Bulus özelligi olana karsi orjinal
27 202891 HER2 70 Orjinal
28 Zl734l HER2 66 Bulus özelligi olan
29 Z17342 HER2 62 Bulus özelligi olan
Z15805 PDGF-Rß 48 Orjinal
31 Z17343 PDGF-Rß 46 Bulus özelligi olan
32 Z17344 PDGF-Rß 42 Bulus özelligi olan
33 Z] 0 l 03 FcRn 48 Orjinal
34 217347 FcRn 50 Bulus özelligi olan
217348 FcRn 44 Bulus özelligi olan
36 Z09782 CAIX 43 Orjinal
DIZI TANI NO Tanimlama Hedef Tm (°C) Bulus özelligi olana karsi orjinal
37 217351 CAIX 40 Bulus özelligi olan
38 217352 CAIX 45 Bulus özelligi olan
39 217355 CAIX 43 Bulus özelligi olan
40 217357 CAIX 47 Bulus özelligi olan
41 217359 CAIX 41 Bulus özelligi olan
42 217360 CAIX 46 Bulus özelligi olan
Örnek 12
Dört farkli hedef icin spesifîtevle vapi iskelesi-modifiye edilmis golipeptidlerin
karsilastirmali stabilite çalismasi
Örnek 10°da açiklandigi gibi olusturulan her bir yeni polipeptid için, stabilite, orjinal
polipeptidin stabilitesiyle kiyaslandi. PBS pH 7.4,te formüle edilen polipeptidler, 1 mg/mPye
seyreltildi ve 200 pl sivi bölüntüler, 37 °C3de 2 hafta inkübe edildi. Stabilite testinden önce
ve sonra toplanan numuneler, %10 Bis-Tris NuPAGE jelleri (Invitrogen) kullanilarak ve 5 ug
protein her bir kuyucuga yüklenerek SDS-PAGE ile analiz edildi. Elde edilen Cookütleie
mavi boyali jeller, Sekil 8,de gösterilmektedir. Stabilite, yükseltilmis sicaklikta
inkübasyondan sonra yeni varyantlarin görünümüyle degerlendirildi ve mutasyona ugramis
varyantlar ilgili orjinal polipeptidle kiyaslandi.
Tablo 9°da belirtildigi gibi yapi iskelesi pozisyonlarinda katilan modifikasyonlarla tüm
polipeptidler, ilgili orjinal polipeptide kiyasla gelistirilmis stabilite gösterdi. Orjinal
polipeptidlerin numunelerinde, bir ikinci bant, hemen ana bant üzerinde jel üzerinde
görünüdür. Bir karsilik gelen ikinci bant, sübstitüsyon D53E ve/veya NSZS ile bulus özelligi
olan polipeptidlerin numunelerinde görünür degildi. Bu, Örnek 2 ve 4”te sunulan sonuçlara
benzer sekildedir. Bu nedenle, bulus özelligi olan yapi iskelesi mutasyonlari için gözlemlenen
stabilize edici etkinin, 2 varyantinin hedef spesifitesi veya söz konusu 2 varyanti içeren
polypeptide bakmaksizin genel bir etki oldugu gözlemlenmektedir. Tek basina veya
sübstitüsyonlar D36R, D37Q ve S39E ile birlesik, sübstitüsyonlar D53E ve/veya NSZS ile
polipeptidler, SDS-PAGE jel üzerinde benzer profiler gösterdi. Tek basina veya
sübstitüsyonlar D36R, D37Q ve S39E ile kombinasyon halinde D53E sübstitüsyonu, SDS-
PAGE jeli üzerinde bir ikinci bant olarak gözlemlenen bir alternatif dogrulamayla türlerin
miktarini azalttigi, fakat bu türlerin olusumunu tamamen önleyemeyecegi göründü.
Örnek 13
Yapi iskelesi-modifiye edilmis polipeptidlerin baglama degerlendirilmesi
Örnek 12°de gelistirilmis stabilite özellikleri gösteren polipeptidlerin bir grubu ayrica yapi
iskelesinde degisikliklerin baslamasindan sonra, ayni zamanda stabilite testine tabi tutuluktan
sonra, bunlarin korunan hedeflerine baglama kapasiteleri bakimindan degerlendirildi, yani 37
°Cide 2 hafta inkübe edildi. Karsilastirmali kinetik sabitler (kon ve koff) ve afiniteler (KD), bir
Biacore 2000 cihazi kullanilarak belirlendi. Hedef proteinler sirasiyla, insan HER2-Fc (R&D
Sistemler, kat. no. 1 129-ER-050), insan PDGF-Rß (R&D Sistemler, kat. no. 385-PR-
100/CF), insan FcRn (Biorbyt, kat. no. orb 84388) ve insan CAIX (R&D Sistemleri, kat. no.
2188-CA), CMS çiplerinin (GE Healthcare)karb0ksilatlanmis dekstran tabaka yüzeyi
üzerinde immobilize edildi. Immobilizasyon imalatçi'nin protokolüne göre amin kenetlenme
kimyasi kullanilarak ve yürütme tamponu olarak HBS-EP kullanilarak gerçeklestirildi. Çip
üzerinde bir akis hücre yüzeyi aktive edildi ve analit enjeksiyonlar sirasinda bos olarak
kullanim için de-aktive edildi. Ilgili yüzey üzerinde hedef proteinin immobilizasyon seviyesi
HER2 için yaklasik olarak 850 RU, PDGF-Rß için 2200 RU, FcRn için 750 ve CAIX için
580 RU7ydu.
HBS-EP (HER2, PDGF-Rß, CAIX) veya bir pH 6.0 NagHPO4/sitrik asit tamponu (126 mM
NazHPO4, 37 mM sitrik asit) (FCRn) yürütme tamponu olarak kullanildi ve akis hizi, asagida
daha detayli açiklandigi 25 °Cade gerçeklestirilen baglanma deneyinde 30 ül/dakikaydi.
HER2iyi hedefleyen Z varyantlar1Z0289l (DIZI TANI NO:27), Z17341 (DIZI TANI
NO:28), ve Zl7342 (DIZI TANI NO:29), yürütme tamponunda 3.33, 10, 30 ve 90 nM,lik
nihai konsantrasyonlara seyreltildi ve 5 dakika enjekte edildi, bunu yürütme tamponunda 30
dakika ayrilma takip etti. 10 mM HCI ve 10 mM NaOH arasinda degisen dört darbeyle
yeniden olusum, ardindan yürütme tamponunda 5 dakika dengeleme, her bir analit
enjeksiyonundan sonra uygulandi.
PDGF-Rß,yi hedefleyen z varyantlari Z15805 (DIZI TANI NO:30), 217343 (DIZI TANI
NO:31), ve Z17344 (DIZI TANI NO:32) yürütme tamponunda 6.67, 20, 60 ve 180 nM°lik
nihai konsantrasyonlara seyreltildi ve 5 dakika enjekte edildi, bunu yürütme tamponunda 20
dakika ayrilma takip etti. 10 1nM NaOHinin üç darbesiyle yeniden olusum, ardindan yürütme
tamponunda 5 dakika dengeleine, her bir analit enjeksiyonundan sonra uygulandi.
FcRn” yi hedefleyen Z varyantlari, Z10103 (DIZI TANI NO:33), 217347 (DIZI TANI
NO:34), ve Z17348 (DIZI TANI NO:35) yürütme tamponunda 3.33, 10 ve 30 nM°lik nihai
konsantrasyonlara seyreltildi ve 3 dakika enjekte edildi, bunu yürütme tamponumda 15 dakika
ayrilma takip etti. HBS-EPnin üç darbesiyle yeniden olusum, ardindan yürütme tamponunda
dakika dengeleme her bir analit enjeksiyonundan sonra uygulandi.
CAIXsi hedefleyen Z varyantlar Z09782 (DIZI TANI NO:36), Z17351 (DIZI TANI NO:37),
Z17355 (DIZI TANI NO:39), ve Zl7359 (DIZI TANI NO:41) yürütme tamponumda 30, 90
ve 270 nMilik nihai konsantrasyonlara seyreltildi ve 5 dakika enjekte edildi, bunu yürütme
tamponumda 15 dakika ayrilma takip etti. 10 mM glisin-HClinin, pH 3.0, üç darbesiyle
yeniden olusum, ardindan yürütme tamponumda 5 dakika dengeleme her bir analit
enjeksiyonundan sonra uygulandi.
Kinetik sabitler, Langmuir lzl modeli (HER2, FcRn, CAIX) veya BiaEvaluation yazilimi
4.1*in (GE Healthcare) kütle transfer modeliyle (PDGF-Rß) 1:] baglanma kullanilarak
sensörgramlardan hesaplandi. Bos yüzey egrileri, ligand yüzeylerin egrilerinden çikarildi ve
tampon döngülerinden veriler, sinyalde herhangi bir sapmayi düzeltmek için test-numune
döngülerinin verilerinden çikarildi.
Hedef molekülüne baglanan Z varyantlar için karsilastirmali kinetik sabitler Tablo 115de
gösterilmektedir ve analiz edilen etkilesimlerin bir alt-kümesi için sensörgramlar Sekil 9”da
gösterilmektedir. Veriler, afinitenin, pozisyon 52-53,te sübstitüsyonlar ND ila SE ile sadece
marjinal olarak gerçeklestirildigini ve birkaç varyant, Z17341 (DIZI TANI NO:28) ve
Z17343 (DIZI TANI NO:31) için, afinitenin hatta hafifçe gelistirildigini gösterir. örnegin
Z17342 (DIZI TANI NO:29), Z17344 (DIZI TANI NO:32) ve Z17348sde (DIZI TANI
NO:35) sübstitüsyonlar D36R, D37Q ve S39E ile pozisyon 52-537te sübstitüsyonlar ND ila
SE,nin bir kombinasyonu, öncelikli olarak daha hizli ayrilma hizlari nedeniyle afinite
üzerinde daha olumsuz bir etkiye sahipti, fakat yine de islevsel baglayicilar, 109 M araliginda
KD ile elde edildi. Dergerlendirilen varyantlar ayrica 37 °Csde 2 hafta inkübasyondan sonra
baglanma özelliklerini korumustur.
Tablo 11. Orjinal ve bulus özelligi olan polipeptidlerin karsilastirmali kinetik analiz
Z varyantlari baglayan HER2
DIZI Bulus özelligi
Test kzi (Ms'
TANI olana karsi 1
numunesi
NO: orjinal
27 Z02891 (0) Orjinal 1.33x106
Z0289l 6
27 Orjinal 1 . 15x10
(ZW)
Bulus özelligi 6
28 Z17341 (0) 1.88x10
olan
Zl7341 Bulus özelligi 6
28 2.06x10
(2W) olan
Bulus özelligi 5
29 Z17342 (0) 8.94x10
olan
Z17342 Bulus özelligi 5
29 6.49x10
(2W) olan
Z varyantlari baglayan PDGF-Rß
DIZI Bulus özelligi
Test kz,i (Ms'
TANI olana karsi 1
numunesi )
N 0: orjinal
Z15805 (0) Orjinal 7.15x106
215805 6
Orjinal 5.81x10
(ZW)
Bulus özelligi 6
31 217343 (0) 4.80x10
olan
31 217343 Bulus özelligi 6.45x106
42
kd (8")
7.10x10`
7.19x10'
8.35x10`
8.91x10'
1.57x10'
3
1.50xlO`
kd (S")
1.39x10'
J
1.66X10_
3
1.77x10'
3
1.71x10'
KD
(MV
.4x10`
6.2x10'
ll
4.5x10'
4.3x10`
l 1
1.8x10`
2.3x10'
KDlnv/
KDOrig**
1.0
1.0
0.83
0.69
33
37
KDlnv/
KDOrig**
1.0
1.0
1.90
0.93
KD(2w)/
KD(0) ***
0.97
1.31
KD(2w) /
Külü***
1.47
0.72
Z varyantlari baglayan HER2
DIZI
TANI
NO:
32
Test
numunesi
(ZW)
217344 (0)
217344
(ZW)
Bulus özelligi
olana karsi
orjinal
olan
Bulus özelligi
olan
Bulus özelligi
olan
Z varyantlari baglayan FcRn
DIZI
TANI
NO:
33
33
34
34
Test
numunesi
210103 (0)
210103
(2W)
217347 (0)
217347
(2W)
Z17348 (0)
Z17348
(2W)
Bulus
özelligi
olana karsi
orj inal
Orjinal
Orjinal
Bulus
özelligi olan
Bulus
Özelligi olan
Bulus
özelligi olan
Bulus
özelligi olan
Z varyantlari baglayan CAIX
k.. (Ms' kd _i KD
') (s ) (M)*
3 10
7 6.16X10- 1.2x10'
15x10 2 9
7 6.23x10' 1.1x10-
62x10 2 9
KD
k.. (M ") kd( ")
S S (M)*
1.60x106 4.56x10'3 2.9x10`9
.75 xlO'
3.15x106 3 1.8x10`9
7.99 x10'
1.18x106 6.7›110'9
3
2 2731106 879 XIO- 3 9xi09
. 3 .
1.82x106 1.00›410'2 5.5›110*9
8.09 xlO'
12591106 3 6.3x10'°
43
KDlnv/
KDOrig*
6.19
3.88
Kmm/
9:
KDOrig**
1.0
1.0
2.36
2.13
1.93
3 .46
EP-19147
KD(2w)/
KD(0) **:12
0.93
KD(2w) /
KD(0)***
0.64
0.57
1.14
DIZI
TANI
NO:
36
36
37
37
39
39
41
41
Test
numunesi
209782 (0)
Z09782
(2W)
217351 (0)
217351
(2W)
217355 (0)
217355
(2W)
217359 (0)
217359
(2W)
Bulus
özelligi
olana karsi
orjinal
Orjinal
Orjinal
Bulus
özelligi olan
Bulus
özelligi olan
Bulus
özelligi olan
Bulus
özelligi olan
Bulus
özelligi olan
Bulus
özelligi olan
KD
kan kd -1
(s) (s) (M)*
2.08x105 1.46x10`3 7.0›410'9
14051105 1.38x10`3 9.9x10`9
1.51x105 2.63x10`3 1.8x10's
1.91xio5 2.86x10'3 1.5x10's
1.57x105 1.23x10`3 7.9x10'9
1.16xio5 1.23x10'3 1.1x10`8
1.68x105 2.15x10'3 1.3x10'8
1.78x105 2.33xiO'3 1.3›410'8
I(Dlnv/
KDOrig**
1.0
1.0
2.49
1.52
1.12
1.07
1.82
1.32
EP-19147
KD(2w)
KD (0)/* ›i= ›i=
1.41
0.86
1.35
1.02
* KD degerleri, karsilastirma amaçlari için beli'rlendiginden ve sadece sinirli bir sayida
numune konsantrasyonlari içerdiginden mutlak olarak kabul edilmemelidi'r.
** Oijinalpolipeptidinin KD 'siyle (1.0'a ayarli) bulus Özelligi olan ilgili polipeptidi'n
KD -sinin kiyaslandigi (0) ,dan önce ya da Örnek 12 ,de açiklanan stabilite testinden (2w)
sonra Göreceli K D.
*** (2w) 'den KD ,nin, dizide özdes her bir poli'pepti'd çift için (0) 'dan KD ile kiyaslandigi
Göreceli Kg.
44
EP-19147
DÜZENLEMELERIN MADDE MADDE SIRALANMIS LISTESI
1. Asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içeren polipeptid:
I) EX2X3X4AX6X7EIX10 XIILPNLX16X17X18QX20 XziAFIX25X26LX28X29X30
PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q,
burada X2, X3, X4, X6, X7, XIO, X] 1, Xi7, X187 X20, Xzi, X25 ve X28SIn her biri bagimsiz
olarak herhangi bir amino asit kalintisina karsilik gelir; ve
burada, birbirinden bagimsiz olarak,
Xia N ve T7den seçilir;
X26 K ve Siden seçilir;
X29X30PX32 DDPS ve RQPE”den seçilir;
X35 A ve S,den seçilir;
X36 E ve N7den seçilir;
X39 A, C ve S”den seçilir;
X45 E ve S`den seçilir;
X46 D, E ve S,den seçilir;
X47 A ve S”den seçilir; ve
ii) X45 N oldugunda, X463nin D veya N olmainasi kaydiyla, i),de tanimlanan diziye en az %91
özdeslige sahip bir amino asit dizisi.
2. Madde 1°e göre polipeptid, burada Xiö T”dir.
3. Madde 1 veya 2,ye göre polipeptid, burada X26 lCdir.
4. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X29X30PX32 DDPS”dir.
45
EP-19147
. Madde 1-3°e göre polipeptid, burada X29X30PX32 RQPEldir.
6. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X35 Sldir.
7. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X36 E“dir.
8. Herhangi bir Önceki maddeye göre polipeptid, burada X39 S“dir.
9. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X45 E ve S°den seçilir.
. Madde 9,a göre polipeptid, burada X45 Eldir.
11. Madde 9”a göre polipeptid, burada X45 Sldir.
12. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X46 E ve Slden seçilir.
13. Madde 12”ye göre polipeptid, burada X46 E,dir.
14. Madde 12lye göre polipeptid, burada X46 Sldir.
. Madde 12”ye göre polipeptid, burada X46 Dldir.
16. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X45X46 EE, ES, SE ve SS”den
seçilir.
17. Madde 167ya göre polipeptid, burada X45X46 ES ve SE,den seçilir.
18. Madde 17”ye göre polipeptid, burada X45X46 ES,dir.
19. Madde 173ye göre polipeptid, burada X45X46 SE°dir.
. Madde 17”ye göre polipeptid, burada X45X46 SD,dir.
21. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X47 Sldir.
22. Madde 1-211in herhangi birine göre polipeptid olup, ilave amino asit kalintilar içerir.
23. Madde 22'ye göre polipeptid olup, söz konusu polipeptidin C-ucunda ilave amino asit
kalintilar içerir.
46
EP-19147
24. Madde 23,e göre polipeptid olup, burada söz konusu polipeptidin C-ucunda ilave amino
asit kalintilar, AP içerir.
. Madde 22'ye göre polipeptid olup, söz konusu polipeptidin N-ucunda ilave amino asit
kalintilar içerir.
26. Madde 25”e göre polipeptid olup, burada söz konusu polipeptidin N-ucunda ilave amino
asit kalintilar AEAKYAK içerir.
27. Madde 22-26”in herhangi birine göre polipeptid olup, burada söz konusu ilave amino asit
kalintilar, polipeptidin baglanma, üretim, satlastirma, stabilizasyon, kenetlenme veya
saptanma amaci için ilave edilir.
28. Madde 22-277nin herhangi birine göre polipeptid olup, burada söz konusu ilave amino
asit kalintilar, bir veya daha fazla polipeptid bölge olusturur.
29. Madde 28,e göre polipeptid olup, burada söz konusu bir veya daha fazla polipeptid bölge,
bir baglama islevi, bir enzimatik islev, bir metal iyon selatlania islevi ve bir floresan islevi,
veya bunlarin karisimlarinin grubundan seçilen bir isleve sahiptir.
. Madde l-27°nin herhangi birine göre polipeptid olup, asagidakilerden seçilen bir amino
asit dizisini içerir:
YAK LX;-X,!X4AX5X7L|X1. X1vLPNLX-›~^X17Xi.^-.ÜX.4 XsiAl'IX;P.X›.LX,-iiX.uX›i.
pX'!.OSXmX;r~LLXJ;.E AKKLX45X4›3)(::O ÄPÇ Ve
l'NK LXL'X'!X.1AX.~,X7L|X~ XwLPNLXiHX 7XI›I,(JXJV XL'IAI*IX;'r-x;'êiLX;s-X;'«.Xu
pXjÄOSXJGXJtLLXgiE AKKLXJSXihx4'O ÂP,
burada her bir Xy madde l-2l *in herhangi birinde taniinlandigi gibidir.
31. Madde 30`a göre polipeptid olup, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisi içerir:
ADNNFNK LX:X'.X4AXanLIXA.;X iLPNLX'hXrX1.=.QX.›1'
XgiAFIX;çX;.;LX,.i.:.X_.~._.X_i:_- PX;.;›OSX_.:.X3::LLX3.,E AKKinçxano APK
ÂDNKFNK LX,AX;X4AX.,X7LIXiv;i XHLPNLXMXivXwÜXn;
XgiAFIX;5X;›;LX;-:.X;~;.X3:; pX;.;OSX_-.:.X3;5LLX-_i.,E AKKLX43X45Xr0 APK
47
EP-19147
VUNKFNK inxxiAxnxiLixi.. XisLPNLXi›-.Xi7Xisi(JX.\
XgiAFIX;çX;.;LX,.›.:.)(;~;.X_i;; PX;.;›OSX,`-_`X3:_«LLX±_.E AKKLX4:X;5X;+O APK
"J'UAKYAK LX;X;X;AX»;X,YLIX13 X LPNLXiaXiTX'HQX'::
XEIAFIXJEX;0;LXS:.X{:~XJJS pX;.;~OSX,çX-3:5LLX1,E AKKLXxXsrxs-O APK
VC
ÂEAKYAK EX;IX1X.-.AXr.X›EIX~.i XiiLPNLX-;XuXHOXm
XgiAFIX_:ç)(_..7LX_-...)(_-._.X_i;; pX;.;›OSX_;:.X3:5LLX4›_.E AKKLX4:MX;O APK
burada her bir Xy madde 1-21 ,in herhangi birinde tanimlandigi gibidir.
32. Önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip madde 1-31'in herhangi birine göre
polipeptid olup, burada söz konusu hedef istege bagli olarak ABD, HER2, TNFu, EGFR,
IGFlR, IgG, PDGFRß, HER3, C5, FcRn, CAIX, amiloid ß, CD4, IL8, IL6 ve insülinden
olusan gruptan seçilir.
33. Bir parça olarak madde 1-32,nin herhangi birine göre bir polipeptid içeren Iîizyon
polipeptid.
34. Madde l-33”ün herhangi birine göre polipeptid veya lüzyon polipeptid olup ayrica bir
etiket içerir.
. Madde 1-343ün herhangi birine göre polipeptid veya iüzyon polipeptid olup ayrica bir
terapötik madde içerir.
36. Madde 1-33,ün herhangi birine göre bir polipeptid veya füzyon polipeptidi kodlayan
polinükleotid.
37. Bir ortak yapi iskelesini baz alan polipeptid varyantlarin popülasyonu, popülasyonda her
bir polipeptid, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içerir:
I) EX2X3X4AX6X7EIXIO Xi iLPNLXiÖXwXisQXzo XziAFIX25X26LX28X29X30
PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q,
burada X2, X3, X4, X6, X7, Xio, X”, X”, Xlg, Xgo, X21, X25 VC X28,Il'l her biri bagimsiz
olarak herhangi bir amino asit kalintisina karsilik gelir; ve
48
EP-19147
burada, birbirinden bagimsiz olarak,
XI(i N ve T7den seçilir;
X26 K ve S7den seçilir;
X29X30PX32 DDPS ve RQPE”den seçilir;
X35 A ve S7den seçilir;
X36 E ve N,den seçilir;
X39 A, C ve S”den seçilir;
X45 E ve Slden seçilir;
X46 D, E ve S`den seçilir;
X47 A ve S,den seçilir; ve
ii) X45 N oldugunda X46,nin D veya E olmamasi kaydiyla, i),de tanimlanan diziye en
az %91 özdeslige sahip bir amino asit dizisi.
38. Madde 37'ye göre popülasyon olup, en az lxlO4 benzersiz polipeptid molekül içerir.
39. Madde 38'e göre popülasyon olup, en az 1x`106 benzersiz polipeptid molekül içerir.
40. Madde 39'a göre popülasyon olup, en az lxlO8 benzersiz polipeptid molekül içerir.
41. Madde 40'a göre popülasyon olup, en az 1xlO10 benzersiz polipeptid molekül içerir.
42. Madde 41 'e göre popülasyon olup, en az 1x1012 benzersiz polipeptid molekül içerir.
43. Madde 42`ye göre popülasyon olup, en az lxlO'4 benzersiz polipeptid molekül içerir.
44. Polinükleotidlerin popülasyonu olup, özelligi, bunun her bir üyesinin, madde 37-43,ün
herhangi birine göre polipeptidlerin bir popülasyonunun bir üyesini kodlamasidir.
49
EP-19147
45. Madde 37-43°ün herhangi birine göre polipeptidlerin bir popülasyonunun, madde 44,e
göre bir polinükleotid popülasyonuyla kombinasyonu, burada polipeptidlerin söz konusu
popülasyonunun her bir üyesi, genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlarla üyeyi kodlayan
polinükleotidle fiziksel olarak veya mekansal olarak iliskilidir.
46. Madde 45'e göre kombinasyon olup, burada söz konusu genotip-fenotip kenetlenmesi
için araçlar, bir faj gösterge sistemi içerir.
47. Madde 45”e göre kombinasyon olup, burada söz konusu genotip-fenotip kenetlenmesi
için araçlar, bir hücre yüzeyi seçim gösterge sistemini içerir.
48. Madde 47'ye göre kombinasyon olup, burada söz konusu hücre yüzey gösterge sistemi,
prokaryotik hücreler içerir.
49. Madde 48,e göre kombinasyon olup, burada söz konusu prokaryotik hücreler, Gram-
pozitif hücrelerdi.
50. Madde 47'ye göre kombinasyon olup, burada söz konusu hücre yüzey gösterge sistemi,
ökaryotik hücreler içerir.
51. Madde 50aye göre kombinasyon olup, burada söz konusu ökaryotik hücreler, maya
hücreleridir.
52. Madde 45” göre kombinasyon olup, burada söz konusu genotip-fenotip kenetlenmesi için
araçlar, bir hücre içermeyen gösterge sistemi içerir.
53. Madde 52,ye göre kombinasyon olup, burada SÖZ konusu hücre içermeyen gösterge
sistemi, bir ribozom gösterge sistemi içerir.
54. Madde 52,ye göre kombinasyon olup, burada söz konusu hücre içermeyen gösterge
sistemi, bir in vitro bölümlesme gösterge sistemi içerir.
55. Madde 52'ye göre kombinasyon olup, burada söz konusu hücre içermeyen gösterge
sistemi, ci's göstergesi için bir sistem içerir.
56. Madde 52,ye göre kombinasyon olup, burada hücre içermeyen gösterge sistemi, bir
mikro-bilye gösterge sistemi içerir.
50
EP-19147
57. Madde 45,e göre koinbinasyon olup, burada söz konusu genotip-fenotip kenetlenmesi
için araçlar, bir göstergesi olmayan sistem içerir.
58. Madde 57'ye göre kombinasyon olup, burada söz konusu göstergesi olmayan sistem,
protein-fragmani bölümlesme analizidir.
59. Polipeptidlerin bir popülasyonundan önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip
arzu edilen bir polipeptidin seçilmesine yönelik usul olup, asagidaki asamalari içerir:
(a) madde 37-43”ün herhangi birine polipeptidlerin bir popülasyonunun sunulmasi;
(b) polipeptidlerin popülasyonunun, hedef ve hedef için bir afiniteye sahip en az bir
arzu edilen polipeptid arasinda spesifik etkilesimi saglayabilen kosullar altinda
önceden belirlenmis hedefle temas haline getirilmesi; ve
(c) söz konusu spesifik etkilesim baz alinarak, polipeptidlerin geri kalan
popülasyonundan en az bir arzu edilen polipeptidin seçilmesi.
60. Madde 59'a göre usul olup, burada asama (a), madde 44,e göre polinükleotidlerin bir
popülasyonunun sunulmasina ve polipeptidlerin söz konusu popülasyonunu elde etmek için
söz konusu polinükleotidlerin popülasyonunun eksprese edilmesine yönelik hazirlayici
asamalar içerir.
61. Madde 60“a göre usul olup, burada polipeptidlerin söz konusu popülasyonunun her bir
üyesi, genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar araciligiyla söz konusu üyeyi kodlayan
polinükleotidle fiziksel olarak veya mekansal olarak iliskilidir.
62. Madde 61 ,e göre usul olup, burada söz konusu genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar,
madde 46-585in herhangi birinde tanimlandigi gibidir.
63. Önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidi kodlayan
bir polinükleotidin izole edilmesine yönelik usul olup, asagidaki asainalari içerir:
0 söz konusu arzu edilen polipeptid ve madde 5 9”a göre usul kullanilarak
polipeptidlerin bir popülasyonunun kodlayan polinükleotidin seçilmesi; ve
- arzu edilen polipeptidi kodlayan bu sekilde ayrilan polinükleotidin izole edilmesi.
64. Usul for identifying önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir
polipeptid, asagidaki asamalari içerir:
0 madde 63`e göre usulün kullanildigi söz konusu arzu edilen polipeptidi kodlayan bir
polinükleotidin izole edilmesi; ve
0 Söz konusu arzu edilen polipeptidi amino asit dizisinin çikarilmasiyla olusturinak için
polinükleotidin siralanmasi.
65. Polipeptidlerin bir popülasyonundan önceden belirlenmis bir hedef için bir aIiniteye sahip
arzu edilen bir polipeptidin seçilmesi ve tanimlamasi için usul olup, asagidaki asamalari
içerir:
(a) ayri bir tasiyici veya bilye üzerinde madde 37-43 ,ün herhangi birine göre
polipeptidlerin bir popülasyonunun her bir üyesinin sentezlenmesi;
(b) önceden belirlenmis hedefle polipeptidin etkilesimini baz alan tasiyicilarin veya
bilyelerin seçilmesi veya zenginlestirilmesi; ve
(c) polipeptidin, protein karakterizasyon metodolojisiyle tanimlanmasi.
69. Madde 65,e göre usul olup, burada asama (c),de kullanilan protein karakterizasyon
metodolojisi, kütle spektrometrik analizdir.
Claims (15)
1. Asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içeren polipeptid olup, herhangi bir amino asit kalintisidir; ve burada, birbirinden bagimsiz olarak, Xig N ve T°den seçilir; Xzö K ve Siden seçilir; X29X30PX32 DDPS ve RQPE”den seçilir; X35 A ve S,den seçilir; X36 E ve N7den seçilir; X39 A, C ve Saden seçilir; X45 E ve S'den seçilir; X46 D, E ve S”den seçilir; X47 A ve S”den seçilir; ve ii) X45 N oldugunda X46'nin D veya E olmamasi kaydiyla, i),de tanimlanan diziye en az %91 özdeslige sahip bir amino asit dizisi.
2. Istem 1”e göre polipeptid olup, burada X45 S9dir.
3. Istem 1 veya 27ye göre polipeptid olup, burada X45X46 ES ve SE”den seçilir.
4. Istem l-3°ün herhangi birine göre polipeptid olup, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisi içerir: YÂK LX;-X1X.xAXiiXrL|Xii XHLPNLX'eIXVXHan XLIAI*lX;-nX;›:1LX.vi!XiQX.-i'i PX';_OSX35X;5LLXJ._.E AKKLXuXmgXiro AP; Ve FNK EX;›X3X4AX,,XTE:|X~; X~LPNLXieX TXiaiOXnJ XmAI*IXAXMLXRXHXM pXJ;OSXJSX'JL-LLX19E AKKLXuGüeXJ-'O Ap, burada her bir Xy istein 1-4`ün herhangi birinde tanimlandigi gibidir, burada y, i) ile tanimlanan polipeptid dizisi içerisinde kalinti X°in amino asit pozisyonunu belirtir.
5. Füzyon polipeptidi olup, bir parça olarak istem l-4”ün herhangi birine göre bir polipeptid
6. Istem 1-5°in herhangi birine göre bir polipeptid veya Eizyon polipeptidi kodlayan polinükleotid.
7. Bir ortak yapi iskelesini baz alan polipeptid varyantlarm popülasyonu olup, popülasyonda her bir polipeptid, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içerir: herhangi bir amino asit kalintisina karsilik gelir; ve burada, birbirinden bagimsiz olarak, Xiö N ve T7den seçilir; X26 K ve S°den seçilir; X29X30PX37_ DDPS ve RQPE”den seçilir; X35 A ve S'den seçilir; X36 E ve N,den seçilir; X39 A, C ve Siden seçilir; X45 E ve S°den seçilir; X46 D, E ve S”den seçilir; X47 A ve S,den seçilir; ve ii) X45 N oldugunda X46'nin D veya E olmamasi kaydiyla, i)7de tanimlanan diziye en az %91 özdeslige sahip bir amino asit dizisi.
8. Istem 7`ye göre popülasyon olup, en az 1 x 104 benzersiz polipeptid moleküller içerir.
9. Polinükleotidlerin popülasyonu olup, özelligi, bunun her bir üyesinin, istem 7-87in herhangi birine göre polipeptidlerin bir popülasyonunun bir üyesini kodlamasidir.
10. Istem 9°a göre bir polinükleotid p0pülasy0nla istem 7-8'in herhangi birine göre bir polipeptid popülasyonun kombinasyonu olup, burada polipeptidlerin söz konusu popülasyonunun her bir üyesi genotip-fenotip kenetleninesi için araçlarla söz konusu üyeyi kodlayan polinükleotidle fiziksel olarak veya mekansal olarak iliskilidir.
11. Istem lO”a göre kombinasyon olup, burada genotip-fenotip kenetlenmesi için söz konusu araçlar, bir faj gösterge sistemini içerir.
12. Önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin, polipeptidlerin bir popülasyonundan seçilmesine yönelik usul olup, asagidaki asamalari (a) istem 7-8”in herhangi birine göre polipeptidlerin bir popülasyonunun sunulmasi; (b) polipeptidlerin popülasyonunun, hedef ve hedef için bir afiniteye sahip en az bir arzu edilen polipeptid arasinda spesifik etkilesimi saglayabilen kosullar altinda önceden belirlenmis hedefle temas haline getirilmesi; ve (c) söz konusu spesifik etkilesimi baz alarak, polipeptidlerin geri kalan popülasyonundan en az bir arzu edilen polipeptidin seçilmesi.
13. Önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidi kodlayan bir polinükleotidin izole edilmesine yönelik usul olup, asagidaki asamalari içerir: - istem 12,ye göre usul kullanilarak söz konusu arzu edilen polipeptidin ve bunu polipeptidlerin bir popülasyonundan kodlayan polinükleotidin seçilmesi; ve - arzu edilen polipeptidi kodlayan bu sekilde ayrilan polinükleotidin izole edilmesi.
14. Önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin tanimlanmasina yönelik usul olup, asagidaki asamalari içerir: - istem 137e göre usul kullanilarak söz konusu arzu edilen polipeptidi kodlayan bir polinükleotidin izole edilmesi; ve - söz konusu arzu edilen polipeptidin amino asit dizisinin çikarilmasiyla olusturulmasi için polinükleotidin siralanmasi.
15. Polipeptidlerin bir popülasyonundan önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip olan, arzu edilen bir polipeptidin seçilmesi ve tanimlanmasina yönelik usul olup, asagidaki asamalari içerir: (a) bir ayri tasiyici veya bilye üzerinde istem 7-8,in herhangi birine göre polipeptidlerin bir popülasyonunun her bir üyesinin sentezlenmesi; (b) polipeptidin önceden belirlenmis hedefle etkilesimini baz alarak tasiyicilarin veya bilyelerin seçilmesi veya zenginlestirilmesi; ve (c) polipeptidin protein karakterizasyon metodolo j isiyle tanimlanmasi.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13182022 | 2013-08-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TR201911279T4 true TR201911279T4 (tr) | 2019-08-21 |
Family
ID=49034001
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TR2019/11279T TR201911279T4 (tr) | 2013-08-28 | 2014-08-28 | Mutasyona uğramış bir yapı iskelesine sahip polipeptidlerin bağlanması. |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (2) | USRE49495E1 (tr) |
EP (1) | EP3039033B1 (tr) |
JP (2) | JP7138411B2 (tr) |
KR (2) | KR102497083B1 (tr) |
CN (3) | CN105473606A (tr) |
AU (1) | AU2014314214C1 (tr) |
BR (1) | BR112016003336A2 (tr) |
CA (1) | CA2920005C (tr) |
DK (1) | DK3039033T3 (tr) |
ES (1) | ES2742505T3 (tr) |
IL (1) | IL243849A0 (tr) |
LT (1) | LT3039033T (tr) |
MX (1) | MX367423B (tr) |
MY (1) | MY176200A (tr) |
PL (1) | PL3039033T3 (tr) |
PT (1) | PT3039033T (tr) |
RU (1) | RU2714156C2 (tr) |
TR (1) | TR201911279T4 (tr) |
WO (1) | WO2015028550A1 (tr) |
ZA (1) | ZA201600721B (tr) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
LT2817329T (lt) | 2012-02-20 | 2019-04-10 | Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) | Polipeptidai, prisijungiantys prie žmogaus komplemento c5 |
CN105209482B (zh) | 2013-03-15 | 2022-04-29 | 阿菲博迪公司 | 新的多肽 |
SG11201602679VA (en) * | 2013-08-28 | 2016-05-30 | Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ | Stable polypeptides binding to human complement c5 |
RU2725442C2 (ru) * | 2014-09-17 | 2020-07-02 | Аффибоди Аб | Новые полипептиды |
CA3067247A1 (en) | 2017-07-11 | 2019-01-17 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptides that bind complement component c5 or serum albumin and fusion proteins thereof |
CN114144433A (zh) | 2019-03-22 | 2022-03-04 | 反射制药有限公司 | 用于目标蛋白的多价d-肽化合物 |
EP3941580A1 (en) | 2019-03-22 | 2022-01-26 | Reflexion Pharmaceuticals, Inc. | D-peptidic compounds for vegf |
US20220389066A1 (en) * | 2019-11-05 | 2022-12-08 | Affibody Ab | Polypeptides |
EP4291251A1 (en) | 2021-02-15 | 2023-12-20 | Affibody AB | New her2-binding polypeptide |
AU2022377077A1 (en) * | 2021-11-01 | 2024-05-16 | Ipc Research, Llc | Administration of c5-binding proteins |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE509359C2 (sv) | 1989-08-01 | 1999-01-18 | Cemu Bioteknik Ab | Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel |
EP0560807A1 (en) | 1990-11-26 | 1993-09-22 | The Public Health Laboratory Service Board | Immunoglobulin-binding proteins and recombinant dna molecules coding therefor |
US6074642A (en) | 1994-05-02 | 2000-06-13 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis |
SE9901379D0 (sv) * | 1999-04-19 | 1999-04-19 | Pharmacia & Upjohn Ab | Receptor structures |
PT1325033E (pt) | 2000-10-10 | 2010-04-15 | Genentech Inc | Inibição da activação do complemento c5 para o tratamento e a prevenção da rejeição diferida de um xenoenxertos ou de uma rejeição vascular aguda |
AT410798B (de) | 2001-01-26 | 2003-07-25 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Verfahren zur identifizierung, isolierung und herstellung von antigenen gegen ein spezifisches pathogen |
BRPI0211953B8 (pt) | 2001-08-17 | 2021-05-25 | Genentech Inc | anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno que se liga a c5 e c5a sem a prevenção da formação de c5b, linhagem celular, composição farmacêutica, bem como método in vitro para inibir a atividade de c5a e método de diagnóstico in vitro |
ITMI20021527A1 (it) | 2002-07-11 | 2004-01-12 | Consiglio Nazionale Ricerche | Anticorpi anti componente c5 del complemento e loro uso |
EP1667702A2 (en) | 2003-09-10 | 2006-06-14 | Baxter International Inc., Baxter Healthcare Corp. | Peptides that inhibit complement activation |
SE0400274D0 (sv) | 2004-02-09 | 2004-02-09 | Affibody Ab | New polypeptide |
GB0518443D0 (en) | 2005-09-09 | 2005-10-19 | Evolutec Ltd | Method of treating myasthenia gravis |
KR20140057635A (ko) | 2006-03-15 | 2014-05-13 | 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 | 보체의 저해물질로 발작성 야간혈색뇨증 환자의 치료 |
ES2346178T3 (es) | 2007-07-31 | 2015-11-02 | Affibody Ab | Nuevas composiciones, procedimientos y usos de unión de la albúmina |
DK2231860T3 (da) | 2007-12-19 | 2011-12-05 | Affibody Ab | Polypeptid afledt protein A og i stand til at binde PDGF |
US9187535B2 (en) | 2007-12-19 | 2015-11-17 | Affibody Ab | Polypeptide derived from protein A and able to bind PDGF |
EP2077272A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-07-08 | Affibody AB | Polypeptide libraries with a predetermined scaffold |
EP2072525A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Affibody AB | New polypeptides having affinity for HER2 |
MY159396A (en) | 2008-08-05 | 2016-12-30 | Novartis Ag | Compositions and methods for antibodies targeting complement protein c5 |
EP2496598B1 (en) | 2009-11-04 | 2017-08-02 | Affibody AB | Her3 binding polypeptides |
EP2327725A1 (en) | 2009-11-26 | 2011-06-01 | InflaRx GmbH | Anti-C5a binding moieties with high blocking activity |
NZ604805A (en) | 2010-07-09 | 2014-09-26 | Affibody Ab | Polypeptides |
JP2014502272A (ja) | 2010-11-29 | 2014-01-30 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | アフィニティークロマトグラフィーマトリックス |
CN102127554B (zh) * | 2010-12-22 | 2012-07-25 | 南京农业大学 | 一种日本脑炎颗粒疫苗及其制备方法和应用 |
US9005992B2 (en) | 2011-03-18 | 2015-04-14 | Postech Academy-Industry Foundation | Immobilizing fusion protein for effective and oriented immobilization of antibody on surfaces |
LT2817329T (lt) | 2012-02-20 | 2019-04-10 | Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) | Polipeptidai, prisijungiantys prie žmogaus komplemento c5 |
JP5980104B2 (ja) | 2012-11-22 | 2016-08-31 | 三菱電機株式会社 | 液晶表示装置の製造方法および液晶表示装置の製造システム |
EP2935335B1 (en) | 2012-12-19 | 2020-10-28 | Affibody AB | New polypeptides |
SG11201602679VA (en) | 2013-08-28 | 2016-05-30 | Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ | Stable polypeptides binding to human complement c5 |
-
2014
- 2014-08-28 PT PT14755841T patent/PT3039033T/pt unknown
- 2014-08-28 BR BR112016003336A patent/BR112016003336A2/pt active Search and Examination
- 2014-08-28 KR KR1020227003426A patent/KR102497083B1/ko active IP Right Grant
- 2014-08-28 CA CA2920005A patent/CA2920005C/en active Active
- 2014-08-28 EP EP14755841.5A patent/EP3039033B1/en active Active
- 2014-08-28 DK DK14755841.5T patent/DK3039033T3/da active
- 2014-08-28 JP JP2016537294A patent/JP7138411B2/ja active Active
- 2014-08-28 CN CN201480046781.6A patent/CN105473606A/zh active Pending
- 2014-08-28 CN CN202410280105.0A patent/CN117964710A/zh active Pending
- 2014-08-28 PL PL14755841T patent/PL3039033T3/pl unknown
- 2014-08-28 MY MYPI2016700292A patent/MY176200A/en unknown
- 2014-08-28 US US16/840,882 patent/USRE49495E1/en active Active
- 2014-08-28 WO PCT/EP2014/068259 patent/WO2015028550A1/en active Application Filing
- 2014-08-28 CN CN202310964771.1A patent/CN116987154A/zh active Pending
- 2014-08-28 ES ES14755841T patent/ES2742505T3/es active Active
- 2014-08-28 RU RU2016108976A patent/RU2714156C2/ru not_active Application Discontinuation
- 2014-08-28 US US14/911,319 patent/US9982022B2/en not_active Ceased
- 2014-08-28 KR KR1020167007561A patent/KR20160068744A/ko not_active IP Right Cessation
- 2014-08-28 MX MX2016002208A patent/MX367423B/es active IP Right Grant
- 2014-08-28 AU AU2014314214A patent/AU2014314214C1/en active Active
- 2014-08-28 TR TR2019/11279T patent/TR201911279T4/tr unknown
- 2014-08-28 LT LT14755841T patent/LT3039033T/lt unknown
-
2016
- 2016-01-28 IL IL243849A patent/IL243849A0/en active IP Right Grant
- 2016-02-02 ZA ZA2016/00721A patent/ZA201600721B/en unknown
-
2020
- 2020-07-01 JP JP2020113704A patent/JP2020180133A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TR201911279T4 (tr) | Mutasyona uğramış bir yapı iskelesine sahip polipeptidlerin bağlanması. | |
Jonsson et al. | Engineering of a femtomolar affinity binding protein to human serum albumin | |
CA2710140C (en) | Polypeptide libraries with a predetermined scaffold | |
CA2468583C (en) | Self-assembling multimeric binding complexes derived from ab5 toxin family members | |
KR101782790B1 (ko) | 혈청 알부민에 결합하는 설계된 반복 단백질 | |
CN105073770A (zh) | 链霉亲和素突变蛋白及其使用方法 | |
CA2881431C (en) | Peptide library and use thereof | |
WO2009077175A1 (en) | Polypeptide derived from protein a and able to bind pdgf | |
DK2544785T3 (en) | Immunoglobulin G Fc region binding polypeptide | |
JP2011521653A (ja) | ポリペプチド | |
EP3807311A1 (en) | Serum albumin binding antibodies for tuneable half-life extension of biologics | |
US9187535B2 (en) | Polypeptide derived from protein A and able to bind PDGF | |
CN105658228B (zh) | 结合人类补体c5的稳定多肽 | |
NZ716426B2 (en) | Binding polypeptides having a mutated scaffold | |
WO2021176075A1 (en) | Novel immunoglobulin binding polypeptides | |
CN117897397A (zh) | 修饰的κ轻链-结合多肽 |