TR201911279T4 - Mutasyona uğramış bir yapı iskelesine sahip polipeptidlerin bağlanması. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, yeni polipeptidlere, bunların üretim usullerine ve bir ortak yapı iskelesini baz alan polipeptid varyantların yeni popülasyonlarına ilişkindir. Popülasyonlar, örneğin yeni bağlayıcı proteinleri ve polipeptidleri sunmak için kullanılabilir.

Description

TARIFNAME MUTASYONA UGRAMIS BIR YAPI ISKELESINE SAHIP POLIPEPTIDLERIN BAGLANMASI Bulusun alani Mevcut bulus, yeni polipeptidlere, bunlarin üretim usullerine ve bir ortak yapi iskelesini baz alan polipeptid varyantlarin yeni popülasyonlarina iliskindir. Popülasyonlar, örnegin yeni baglayici proteinleri ve polipeptidleri sunmak için kullanilabilir.

Bulusla ilgili bilinen hususlar Yeni baglayici proteinlerin yapimi için farkli usuller açiklanmistir (Nygren PA ve Uhlén M (1997) Curr Opin Struct Biol 7:463-469). Bir strateji, arzu edilen özellikler için kütüphane olusumu ve seçimli taramayi birlestirmek olmustur.

Bir ortak, birinci jenerasyon yapi iskelesini baz alan birinci jenerasyon Z varyant polipeptidleri, bu tür moleküllerin popülasyonlari ve bunlari içeren usuller WO95/ 193 74lte açiklanmistir. Ilaveten, bir ikinci jenerasyon yapi iskelesini baz alan Z varyant polipeptidleri, bu tür moleküllerin popülasyonlari ve bunlari içeren usuller W02009/080811lde açiklanmistir. Bu iki açiklamanin ögretileri buraya referansla dahil edilmektedir.

Bazi basvurular için, Z varyant polipeptidleri veya bunlarin daha yüksek alkali stabilite, düsük antijenisite, yapisal stabilite, kimyasal sentez ve hidrofilisiteye amenabilite gibi gelistirilmis Özelliklere sahip popülasyonlari arzu edilmektedir. WO2009/080811°de gelistirilmis Özellikleri olan bir ortak yapi iskelesine sahip Z varyantlari açiklaninaktadir, fakat her bir arzu edilen özellik, burada açiklandigi gibi Z varyant polipeptidleriyle elde edilemez.

Polipeptid farmasötiklerine yönelik basari için ana faktörlerinden biri bunlarin stabilitesidir.

Yüksek yapisal bir stabiliteyi gösteren polipeptidler, hem üretim sirasinda hem de insan vücudunda büyük olasilikla islevsel olarak kimyasal modifikasyonlara, fiziksel kosullara ve proteolizde degisikliklere dayanacaktir. Bunda baska, stabilite, polipeptid farmasötiklerin aktif raf ömrünü, ayni zamanda insan vücudu içerisinde polipeptid farmasötiginin aktif ömrünü etkileyecektir.

Dolayisiyla, Z varyant polipeptidlerinin stabilitesinin gelistirilmesi için sürekli bir ihtiyaç söz konusudur.

Bulusun açiklamasi Mevcut bulusun bir amaci yeni bir yapi iskelesine sahip bir polipeptid sunmaktir, bu polipeptid, halihazirdaki mevcut Z varyant polipeptidlerin yukarida belirtilen ve baska dezavantajlarmi azaltir.

Mevcut bulusun baska bir amaci, yeni bir yapi iskelesini baz alan bir polipeptidin üretimine yönelik bir usul sunmaktadir.

Ayrica mevcut bulusun bir amaci, bu tür gelistirilmis polipeptid varyantlarin bir popülasyonu sunmaktir, hepsi yeni bir yapi iskelesini baz almaktadir.

Mevcut bulusun baska bir amaci, polinükleotidlerin bir popülasyonunu sunmaktir.

Mevcut bulusun yine baska bir amaci, bir polipeptid popülasyon ve bir polinükleotid popülasyonun bir kombinasyonunu sunmaktir.

Mevcut bulusun baska bir amaci, polipeptidlerin bir popülasyonundan önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin seçilmesine yönelik bir usul sunmaktir.

Baska bir amaç, önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidi kodlayan bir polinükleotidi izole etmek için bir usul sunmaktir.

Baska bir amaç önceden belirlenmis bir hedef için bir afmiteye sahip arzu edilen bir polipeptidi tanimlamak için bir usul sunmaktir.

Baska bir amaç, önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidi seçmek ve tanimlamak için bir usul sunmaktir.

Ilgili bir amaç, önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin üretimine yönelik bir usul sunmaktir.

Bu ve baska amaçlar, mevcut basvuruda açiklanan farkli yönlerle elde edilebilir.

Mevcut tarifnamenin bir birinci yönünde, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içeren bir polipeptid sunulmaktadir: I) EX2X3X4AX6X7EIXIO X1 ILPNLX16XI7X18QX20 XziAFIX25X20LX28X29X30 PX32QSX35X35LLX39E AKKLX45X46X47Q, burada X2, X3, X4, X6, X7, Xio, X”, X17, X113, X20, X21, X25 ve X28,ln her bir] bagimsiz olarak herhangi bir amino asit kalintisina karsilik gelir; ve burada, birbirinden bagimsiz olarak, Xis, N ve "l”den seçilir; X26 K ve S7den seçilir; X29X30PX32 DDPS ve RQPE°den seçilir; X35 A ve S7den seçilir; X36 E ve Niden seçilir; X39 A, C ve S”den seçilir; X45 E ve Slden seçilir; X46 D, E ve S”den seçilir; X47 A ve S”den seçilir; ve ii) X45 N oldugunda, X46”nin D veya N olmamasi kaydiyla; i),de tanimlanan diziye en az %91 özdeslige sahip olan bir amino asit dizisi.

Yukaridaki polipeptid dizisi i) içerisinde, "bagimsiz olarak herhangi bir amino aside karsilik gelen" olarak tanimlandigi gibi her bir amino asit X, tüm muhtemel amino asitlerden seçilen bir amino asit kalintisina tek tek karsilik gelir. Anlasilir olmasi için, bu, yukaridaki dizi i)`de pozisyonlar X2, X3, X4, X6, X7, Xm, X1 1, X”, Xig, X20, Xzi, X25 ve X287e karsilik gelen amino asit pozisyonlari için geçerlidir. Bu, her bir bu tür Xlin, dizide X olarak ifade edilen herhangi bir baska kalintinin tanimindan bagimsiz olarak herhangi bir amino asit kalintisi olabilecegi anlamina gelir. Ainino asit dizisinde, bu amino asitler X, bu 20 dogal olusumlu amino asit kalintilarinin herhangi birinin, herhangi bir belirtilen varyantta karsilik gelen X pozisyonunda mevcut olabilecegi sekilde, tüm 20 dogal olusumlu amino asit kalintilardan seçilebilir. Her bir pozisyonda amino asit kalintisinin seçimi az çok randomize edilebilir. Ayrica farkli degiskenlik gösteren amino asit kalintilardan, 20 dogal olusumlu amino asit kalintilarin 19, 18, 17, 16 veya daha azinin seçildigi grubu sinirlamak mümkündür. Farkli pozisyonlarda degiskenlik, bir, randomizasyon yok anlamindadir, ila en fazla tüm 20 ainino asitler arasinda tek tek ayarlanabilir. Amino asitlerin daha küçük bir alt-kümesinin rastgele katilimi, katilan deoksiribonükleotid bazlarin dikkatli seçimiyle elde edilebilir, örnegin kodonlar T(A/C)C, polipeptid zincirde belirtilen bir pozisyonda serin ya da tirozinin bir rastgele katilimini elde etmek için katilabilir. Benzer sekilde, kodonlar (T/C/A/G)CC, polipeptid zincirde belirtilen bir pozisyonda fenilalanin, lösin, alanin ve valinin bir rastgele katilimini elde etmek için katilabilir. Uzman kisi, polipeptid zincirde belirtilen bir pozisyonda amino asitlerin farkli kombinasyonlarini elde etmek için kullanilabilen deoksiribonükleotid baz kombinasyonlarinin birçok alternatifinden haberdardir. Polipeptid zincirde belirtilen bir pozisyonda ortaya çikabilen amino asitler kümesi ayrica bir seferde bir deoksiribonükleotid baz yerine oligonükleotid sentez sirasinda trinükleotidlerin katilimiyla belirlenebilir. Amino asitlerin bir tanimlanmis kümesi ayrica sentezde arzu edilebilen pozisyonlarda tanimlanmis kodonlarin katilimini saglayabilen bölünmüs havuz sentezi kullanilarak elde edilebilir.

Randomize edilmis çift sarinal baglayicilari elde etmek için yine baska bir alternatif, ligasyonlar kullanilarak trinükleotid yapi bloklarinin randoinize edilmis kümelerinin katilimiyla ve müteakip olarak yapilandirilmis çift sarmal DNA”nin kisitlamalariyladir.

Bu tarifnamenin bir düzenlemesinde, önceden belirlenmis bir hedef için afiniteye sahip bir polipeptid sunulmaktadir. Bu tür bir düzenlemede, hedef baglanma spesifitesi sunan amino asit kalintilar, yukarida dizi i),de pozisyonlar 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 17, 18, 20, 21, 25 ve 283e karsilik gelen pozisyonlardakilerdir. Benzer sekilde, bu tür bir polipeptidde, hedef baglanma spesifitesi sunmayan amino asit kalintilarina, "yapi iskelesi amino asitleri" veya basitçe "yapi iskelesi" olarak atifta bulunulur. Uygun olarak, bir düzenlemede, burada tanimlandigi gibi yapi iskelesi amino asit kalintilar, yukarida dizi i)°de pozisyonlar 1, 5, 8, 9, 12-15, 19, 22-24, 27, 31, 33-34, 37-38, 40-44 ve 48,e karsilik gelen pozisyonlardakilerdir. Uzman kisi burada tanimlandigi gibi polipeptidlerin yapi iskelesi amino asitleriyle sunulan avantajli özelliklerin söz konusu polipeptidin hedef baglanma spesifitesinden bagimsiz oldugunu takdir edecektir.

Uzman kisinin farkina varacagi gibi, herhangi bir polipeptidin islevi, örnegin mevcut tarifnainenin polipeptidi, polipeptidin tersiyer yapisina baglidir. Dolayisiyla bunun islevini etkilemeden bir polipeptidde amino asitlerin dizisine küçük degisiklikler yapmak mümkündür. Bu nedenle, tarifname, önceden belirlenmis bir hedef için bunun gelistirilmis stabilitesi ve/veya bunun baglama afinitesi gibi polipeptidin islevsel özelliklerini degistirmeyen söz konusu polipeptidin modifiye edilmis varyantlarini kapsamaktadir.

Bu sekilde ayrica mevcut tarifname, i),de tanimlanan bir diziye %91 veya daha fazla tanimla bir amino asit dizisi içeren bir polipeptidi kapsamaktadir. Bazi düzenlemelerde, polipeptid, dizi i),de tanimlanana en az %93, örnegin en az %95, örnegin en az %97 özdes olan bir dizi içerebilir.

Bazi düzenlemelerde, dizi tanimlari i) ve ii) arasinda bu tür farklar, burada açiklandigi gibi polipeptid dizisinin herhangi bir pozisyonunda bulunabilir. Diger düzenlemelerde, bu tür degisiklikler sadece yapi iskelesi amino asit kalintilarinda bulunabilir. Diger düzenlemelerde, söz konusu degisiklikler sadece hedef baglanma Spesititesi sunan amino asit kalintilarda bulunabilir. Örnegin, amino asit kalintilarin belirli bir islevsel gruplamasina ait bir amino asit kalintisinin (örnegin hidrofobik, hidrofilik, polar vs) ayni islevsel gruptan baska bir amino asit kalintisi için degistirilebilmesi mümkündür.

Tarifname boyunca kullanildigi gibi "% tanim", örnegin asagidaki gibi hesaplanabilir. Araina dizisi, CLUSTAL W algoritmai (Thompson ve digerleri, Nucleic acids Research, 22: 4673- 4680 (1994)) kullanilarak hedef dizisine hizalanir. Bir kiyaslama, hizalanmis dizilerin birine karsilik gelen pencere, örnegin en kisasi üzerinden yapilir. Pencere bazi örneklerde hedef diziyle tanimlanabilir. Baska örneklerde, pencere, arama dizisiyle tanimlanabilir. Her bir pozisyonda amino asit kalintilari kiyaslanir, ve hedef dizisinde özdes karsiliklara sahip olan arama dizisinde pozisyonlarin yüzdesi, % tanim olarak bildirilir.

Baglayici polipeptidler için yapi iskeleleri olarak kullanildiginda, burada açiklanan diziler, bilinen, benzer yapi iskelelerine kiyasla avantajlar saglar, ve bunlarin, yüksek yapisal bir stabilite ve dolayisiyla gelistirilmis bir depolama raf ömrü göstermesi için genetigiyle oynanmistir. Bu avantajlar ayrica bu birinci yönün polipeptid varyantlarinin popülasyonlariyla ilgili olan tarifnamenin üçüncü yönü için geçerlidir (ayrica asagi bakiniz).

Bu tarifnamenin bir düzenlemesinde, X16 T,dir.

Bir düzenlemede, X26 Ksdir.

BH` düzenlemede, X29X30PX32 DDPS,dII'.

Bir düzenlemede, X29X30PX32 RQPE/dll'.

Bir düzenlemede, X35 Sidir.

Bir düzenlemede, X36 E3dir.

Bir düzenlemede, X39 Ssdir.

Bir düzenlemede, X45 E ve S7den seçilir.

Bir düzenlemede, X45 Eadir.

Bir düzenlemede, X45 S7dir.

Bir düzenlemede, X46 E ve Siden seçilir.

Bir düzenlemede, X46 E°dir.

Bir düzenlemede, X46 S°dir.

Bir düzenlemede, X4., D`dir.

X45 N oldugunda X46 D veya E degildir.

Bir düzenlemede, X45X4(i EE, ES, SE ve SS“den, örnegin ES ve SE`den seçilir.

Bir düzenlemede, X45X46 ESidir.

Bir düzenlemede, X45X46 SEldir.

Bir düzenlemede, X45X46 SD'dir.

Bir düzenlemede, X47 Sidir.

Bu tarifnamede kullanildigi gibi "önceden belirlenmis bir hedef için baglama afinitesi" terimiyle, örnegin yüzey plazmon rezonans (SPR) teknolojisinin kullanimiyla test edilebilen bir polipeptidin bir özelligine atifta bulunulmaktadir. Örnegin, söz konusu baglama afinitesi, bir deneyde test edilebilir, burada önceden belirlenmis hedef, veya bunun bir fragmani, cihazin bir sensör çipi üzerinde immobilize edilir, ve test edilecek polipeptidi içeren numune çip üzerinden geçirilir. Atematif olarak, test edilecek polipeptid, cihazin bir sensör çipi üzerinde immobilize edilir, ve önceden belirlenmis hedefi içeren bir numune, veya bunun bir fragmani, çip üzerinden geçirilir. Uzman kisi daha sonra önceden belirlenmis hedef için polipeptidin baglama afinitesinin en az bir kalitatif ölçümünü yapmak için bu tür deneyle elde edilen sonuçlari yorumlayabilir. Bir kantitatif ölçüm, örnegin etkilesim için bir KD degerini belirlemek arzu edilirse, yüzey plazmon rezonans usulleri ayrica kullanilabilir. Baglama degerleri örnegin bir Biacore (GE Healthcare) veya ProteOn XPR 36 (Bio-Rad) cihazinda tanimlanabilir. Önceden belirlenmis hedef cihazin bir sensör çipi üzerinde uygun olarak immobilize edilir, ve afinitesi belirlenecek olan polipeptid numuneler, seri seyreltmeyle hazirlanir ve rastgele sirayla enjekte edilir. KD degerleri daha sonra örnegin cihaz imalatçisi tarafindan tedarik edilen BIA evaluation 4.1 yazilimi, veya baska uygun yazilimin lzl Langmuir baglama modelinin kullanildigi sonuçlardan hesaplanabilir.

Burada kullanildigi haliyle "önceden belirlenmis bir hedef için baglama afinitesi" terimiyle ayrica, örnegin ELISA ile test edilebilen bir polipeptidin bir özelligine atifta bulunabilir. Örnegin, baglama afinitesi, polipeptid numunelerinin, antikor kapli ELISA plakalari ve biyotinlenmis önceden belirlenmis hedef üzerinde yakalandigi, veya bunun bir fragmaninin, ardindan streptavidinle konjuge edilmis HRP'nin ilave edildigi bir deneyde test edilebilir.

TMB substrati ilave edilir ve bir çok kuyucuklu plaka okuyucu, örnegin Victor3 (Perkin Elmer) kullanilarak 450 nm”de absorbans ölçülür. Uzman kisi daha sonra önceden belirlenmis hedef için kompleksin baglama afinitesinin en az bir kalitatif ölçümünü yapmak için bu tür deneyle elde edilen sonuçlari yorumlayabilir. Bir kantitatif ölçüm arzu edilirse, örnegin etkilesim için EC50 degerini belirlemek için (yari azami atkili konsantrasyon), ELISA ayrica kullanilabilir. Polipeptidin, önceden belirlenmis hedefin veya bunun bir fragmaninin bir seyreltme serilerine karsi yaniti, yukarida açiklandigi gibi ELISA kullanilarak ölçülür. Uzman kisi daha sonra bu tür deneyle elde edilen sonuçlari yorumlayabilir, ve EC50 degerleri, örnegin GraphPad Prism 5 ve dogrusal olmayan regresyonun kullanildigi sonuçlardan hesaplanabilir. Önceden açiklandigi gibi, Z varyant polipeptidlerinin, bir üç sarmalli demet protein bölgesini veya bunun bir parçasini, söz konusu üç sarmalli demet protein bölgesi içerisinde esas itibariyle bir birbirine baglanan döngüyle iki alfa sarmalinin parçasini olusturan önceden belirlenmis bir hedef için afiniteye sahip motifi olusturdugu düsünülmektedir.

Yukarida tanimlandigi gibi polipeptidin farkli modifikasyonlari ve/veya buna ilaveleri, mevcut bulusun kapsamindan ayrilmadan, polipeptidi amaçlanan spesifik kullanima uydurmak amaciyla gerçeklestirilebilir.

Bu tür modifikasyonlar ve ilaveler asagida daha detayli açiklanmaktadir, ve ayni polipeptid zincirde olusan ilave amino asitler, veya etiketler ve/veya kimyasal olarak konjuge edilen veya baska türlü polypeptide baglanan terapötik maddeler içerebilir.

Dolayisiyla, bir düzenlemede, ilave amino asit kalintilar içeren yukarida açiklandigi gibi bir polipeptid sunulmaktadir. Bazi düzenlemelerde ilave amino asit kalintilar, polipeptidin C- ucunda yer alabilir. Bazi düzenlemelerde ilave amino asit kalintilar, polipeptidin N-ucunda yer alabilir.

Bir düzenlemede, C-ucunda söz konusu ilave amino asit kalintilar, AP içerir.

Bir düzenlemede, N-ucunda söz konusu ilave amino asit kalintilar, AEAKYAK içerir.

Yine baska bir düzenlemede, N-ucunda 0 ila 7 ilave amino asit kalintisina ve C-ucunda 0 ila 3 ilave amino asit kalintisina sahip dizi i) veya ii)°den olusan yukarida açiklandigi gibi bir polipeptid sunulmaktadir.

Ilave amino asit kalintilar, polipeptidin baglanmasinda bir rol oynayabilir, fakat, örnegin polipeptid üretimi, saflastirmalari, stabilizasyonu, kenetlenmesi veya saptanmasiyla ilgili bir veya daha fazla baska amaçlara da esit olarak iyi hizmet edebilir. Bazi düzenlemelerde, söz konusu ilave amino asit kalintilar, bir veya daha fazla polipeptid bölge olusturur.

Bu tür ilave amino asit kalintilar kimyasal kenetlenme amaçlari için ilave edilen bir veya daha fazla amino asit kalintisi içerebilir. Bunun bir örnegi, polipeptid zincirde en bastaki veya en sondaki pozisyonda, yani N- veya C-ucunda bir sistein kalintisinin ilavesidir. Kimyasal kenetlenme için kullanilacak bir sistein kalintisi ayrica baska bir amino asidin, protein bölgesi yüzeyi üzerinde, tercihen hedef baglanmayla ilgisi olmayan yüzeyin bir kismi üzerinde ikamesiyle katilabilir. Bu tür ilave amino asit kalintilari ayrica polipeptidin saflastirilmasi veya saptanmasi için bir "etiket", etikete özgü antikorlarla etkilesim için, örnegin bir heksahistidil (HiSö) etiketi, veya bir "myc" etiketi veya bir "FLAG" etiketi içerebilir. Uzman kisi baska alternatiflerin farkindadir.

Yukarida tartisilan "ilave amino asit kalintilar" ayrica baska bir baglama islevi, veya bir yari ömrü uzatma islevi, veya bir enzimatik islev, veya bir inetal iyon selatlama islevi, veya bir tloresan islevi, veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu gibi herhangi bir arzu edilen islevle bir veya daha fazla polipeptid bölgesi olusturabilir.

Bir örnek düzenlemede, önceden belirlenmis bir hedef için afiniteye sahip bir bilesik sunulmaktadir, söz konusu bilesik asagidakileri içerir: A. yukarida tanimlandigi gibi en az bir polipeptid; B. Streptokoksal protein G'nin en az bir albumin baglama bölgesi, veya bunun bir türevi; ve C. istege bagli olarak, söz konusu en az bir albumin baglama bölgesi veya bunun bir türevinin, söz konusu en az bir polipeptidin C veya N ucuna baglanmasi için en az bir baglayici parça.

Streptokoksal protein G'nin albumin baglama bölgesinin türevlerinin sinirlayici olmayan örnekleri, W02009/016043 ve W02012/0043843te açiklanmaktadir.

Ayrica, baska bir düzenlemede, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içeren yukarida tanimlandigi gibi bir polipeptid sunulmaktadir: YÂK LX;-X;5X.:AX:;X7LIXi'i X1lLPNLxWXHXILIJXH' x;!Ai-IX;'HX;HLX;~|!X;ûx.-i'i pX-J_OSX!GX:›}LLX±«E AKKLX:5X4›5X47O Ap; ve l-NK tx;›x;i.>(.iAXaX±|X~v X~LPNLX1aX ~XmCJXm XyiAl-IX;vrx.›;LX.ipX_.s.Xu~ PXI~._.OSX'IU_.X_irjLLngE AKKLXJ-.X-C-,XJO AP. burada her bir Xy yukaridaki gibi tanimlanmaktadir (ve y, yukarida i) ile tanimlanan polipeptid dizi içerisinde kalinti X'in amino asit pozisyonunu belirtir).

Bazi düzenlemelerde, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içeren bir polipeptid sunulmaktadir: AUNNH'JK LX_›X1X.iAXaXrLIX1it XwLPNLXnÄan-(JXA- X;-AFIX_-:X_›_.LX_.›.:.X~_-i_.X_i;g PX;.;OSX3:.XJ:_«LLX_i›_.E AKKLX4:.X9_.X;+O APK AUNKF NK LXJK ;XLAXOJXTL [X lv'_i X' 'L PN LX 43)( - #X l ElOXpii X; 'AFIX_'(X;›,L xaixgix 3.3. PX;.;OSX,.±.)(,.:;LLX-,i.,E AKKLXACihQXa'O APKV "IÜNKFNK LXÂX'xiAXr-,XTLIXM X"LPNLX i-.X 7Xi!iQX;\i X;'AFIX;«_)(~_,_.LX&›._.)(;-i,X_i.-_. PX;.;OSX_.5.X_.::LLXJ._.E AKKLX4:.X4›-_.Xr0 APK VUAKYAK LXJXIXJAXLXILIX'I: X'iLPNLXi-.X'TXWUXI X_.-AFIX_-±X.,_.LX;›...X;›i,X_i;_-. PX;.;OSX,.:.X_i:gLLX_i.,«E t`KKLX4çX4›'_.Xa?O APK ve ÂEAKYFNK EX;X›X.:AX;XTE|XV. XHLPNLX'QXwXisQXn' Xg-Al-IXxXgLXg-.gX'gaoij PX;.;OSX;SXJÇLLXJTE AKKLX4:.X4›'JX.-.r0 APK burada Xy yukarida açiklandigi gibi tanimlanmaktadir (ve y yukarida i) ile tanimlanan polipeptid dizisi içerisinde kalinti X,in amino asit pozisyonunu belirtir).

Burada açiklanan polipeptid varyantlar, örnegin bilinen bir yapi iskelesini baz alan ve belirli bir hedef için atiniteye sahip olan bir Z varyant polipeptidi alinarak, ve mevcut tarifnameye göre bir yapi iskelesine sahip bir polipeptidi elde etmek için seçilen pozisyonlarda alana yönelik mutagenez gerçeklestirilerek, hedef afinite korunarak olusturulabilir. Bir Z varyant polipeptidinin baglayici motifini, burada açiklanan yapi iskelesi üzerine asilamak için mevcut tarifnameye göre bir polipeptid alternatif olarak tüm molekülün kimyasal senteziyle veya bu sahada uzman biri tarafindan bilinen baska moleküler biyoloji usulleri kullanilarak hazirlanabilir.

Genel bir açiklama olarak, asagidaki ortak yapi iskelesi dizisini içeren ve bir baglayici motif [BM] içerisinde amino asit dizisiyle tanimlanan bir baglanma spesifitesine sahip olan orjinal Z varyant polipeptidleri, AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLNDSQ APK burada açiklandigi gibi bir polipeptid sunmak için modifiye edilebilir.

Tarifnamenin bu yönünün çesitli spesifik düzenlemelerinde, asagidaki polipeptidler sunulmaktadir: AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLNDSQ APK AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLSESQ APK AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLESSQ APK AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLSDSQ APK AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLNESQ APK AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLSESQ APK AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLESSQ APK AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLSDSQ APK AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLNSSQ APK Burada açiklanan polipeptidler, birçok uygulamaya, örnegin bir hastalik için terapötik, tanisal veya pro gnostik anlainlilik uygulamalarina sahiptir. Söz konusu polipeptidlerin, terapötik, tanisal veya pro gnostik kullanimi olabilen hastaliklarin bir sinirlayici olmayan listesi içinde kanser, enflamatuar hastaliklar, otoimmün hastalik, bulasici hastaliklar, nörolojik hastaliklar, nörodejeneratif hastaliklar, göz hastaliklari, böbrek hastaliklari, pulmoner hastaliklar, mide- bagirsak yolu hastaliklari, kardiyovasküler hastaliklar, hematolojik hastaliklar, dermatolojik hastaliklar, alerjiler ve digerleri yer alir.

Bu nedenle, bir düzenlemede, önceden belirlenmis bir hedef için afiniteyle bir polipeptid sunulmaktadir. Daha spesifik düzenlemelerde, söz konusu hedef, HERZ, TNFa, EGFR, IGFlR, IgG, PDGFRß, HER3, C5, FcRn, CAIX, amiloid ß, CD4, IL8, IL6 ve insülinden olusan gruptan seçilir. Diger düzenlemelerde, söz konusu polipeptidin, biyoteknolojik, sinai ve farmasötik uygulamalarda kullanimi, örnegin ayirma teknolojisi, saIlastirma uygulamalarinda bir afinite ligandi olarak veya bir saptama maddesi olarak kullanimi olabilir.

Bu tür daha spesifik bir düzenleinede, önceden belirlenmis hedef, streptokoksal Protein Giden bir albumin baglama bölgesi ("ABD" veya "GA modülü"), veya bunun bir türevi olabilir.

Uzman kisi, önceden belirlenmis hedeflerin listesinin, sinirlayici olmayacak sekilde görülecegini, ve burada tanimlandigi gibi baska önceden belirlenmis hedefler için afiniteyle polipeptidlerin, mevcut tarifnamenin kapsami içerisinde yer aldigini takdir edecektir.

Bilinen bir yapi iskelesini baz alan ve farkli hedefler için afiniteye sahip olan bilinen Z varyant polipeptidlerin sinirlayici olmayan örnekleri, EGF reseptörü için (WO2007/065635°te açiklanmaktadir), HER2 reseptörü için (W02009/080810”da açiklanmaktadir), HER3 reseptörü için (WO20lO/056124,te açiklanmaktadir), IGF l reseptörü için (W02009/Ol9l l7,de açiklanmaktadir), PDGF reseptör [3 için (W02009/077l75”te açiklanmaktadir), albumin baglama bölgesi (ABD) için (W02014/064237`de açiklanmaktadir), neonatal F c reseptörü (FcRn) için (PCT/EP2014/055299°da açiklanmaktadir) ve karbonik anhidraz IX için (W02014/096163'de açiklanmaktadir) aIiniteyle Z varyantlardir. Anlasilir olmasi için, mevcut tarifnamede, bir Z varyant'in baglayici motifinin [BM], yukarida belirtilen dokümanlarda açiklanan söz konusu baglayici motiflerin birinci 28 amino asit kalintisina karsilik geldigini dikkate aliniz, burada baglayici motiflerin tanimlari, 29 amino asit kalintisidir ve yukarida dizi i)”nin pozisyon 1-293una karsilik gelen pozisyonlarda ainino asit kalintilarina karsilik gelir.

Bir düzenlemede, önceden belirlenmis bir hedef için bir atiniteyle bir polipeptid sunulmaktadir, bu ayrica floresan boyalar ve metaller, kromoforik boyalar, kemiluminesan bilesikler ve biyoluminesan proteinler, enzimler, radionüklidler ve parçaciklardan olusan gruptan seçilen bir etiket gibi bir etiket içerir. Bu tür etiketler Örnegin polipeptid saptainasi için kullanilabilir.

Bazi düzenlemelerde, polipeptid, bir tüzyon polipeptidde bir parça olarak mevcuttur veya konjugat ayrica arzu edilen bir biyolojik aktiviteye sahip bir ikinci parça içerir. Bu tür arzu edilen bir biyolojik aktivitenin sinirlayici olmayan örnekleri bir terapötik aktivite, bir baglayici aktivite, ve bir enzimatik aktivite içerir.

Bazi düzenlemelerde, söz konusu parça ayrica bir etiket içerir.

Etiket, bazi örneklerde sadece önceden belirlenmis bir hedef için afiniteyle polipeptide, ve bazi örneklerde hem önceden belirlenmis bir hedef için afiniteyle polipeptide, hem de konjugat veya füzyon polipeptidin ikinci parçasina kenetlenebilir. Bundan baska, ayrica etiketin sadece bir ikinci parçaya kenetlenebilmesi ve önceden belirlenmis bir hedef için afiniteyle polipeptide kenetlenmemesi mümkündür. Dolayisiyla, yine baska bir düzenlemede bir ikinci parça içeren önceden belirlenmis bir hedef için afiniteyle bir polipeptid sunulmaktadir, burada söz konusu etiket, sadece ikinci parçaya kenetlenir.

Burada açiklanan polipeptidler veya füzyon polipeptidler, saptayici reaktif maddeler olarak, yakalayici reaktif maddeler olarak, ayirici reaktif maddeler olarak, in vivo veya in vitro teshis için tanisal maddeler, veya terapötik maddeler olarak kullanilabilir. Mevcut tarifnameye göre polipeptidler veya füzyon polipeptidleri kullanan usuller, mikrotitre plakalarinda, protein dizilislerinde, biyosensör yüzeyler üzerinde, doku kesitleri üzerinde, ve benzerleri gibi farkli formatlarda in vitro gerçeklestirilebilir.

Ayrica mevcut tarifnameye göre polipeptid veya füzyon polipeptidlerinin, örnegin söz konusu hedef üzerinde dogrudan veya dolayli etkilerle, kendi içinde bir terapötik, tanisal veya prognostik madde olarak veya baska terapötik, tanisal veya pro gno stik maddeleri hedeflemek için bir araç olarak yararli olabilecegi anlasilmalidir. Bir dogrudan terapötik etki, örnegin, söz konusu hedefle sinyal vermeyi inhibe ederek gerçeklestirilebilir. Söz konusu hedef ayrica birtakim hastaliklarin (örnegin yukarida belirtilen hastaliklar) prognozunu tahmin etmek için degerli bir markör olarak hizmet edebilir.

Dolayisiyla, bir düzenlemede, terapide kullanim için veya bir tanisal madde olarak kullanim için burada açiklandigi gibi bir polipeptid veya füzyon polipeptid sunulmaktadir. Baska bir düzenlemede, söz konusu polipeptid veya füzyon polipeptidi ayrica bir terapötik madde içerir. Bu tür terapötik maddelerin sinirlayici olmayan örnekleri, söz konusu polipeptid veya füzyon polipeptidinin etkisini arttiran bir terapötik madde, söz konusu polipeptid veya füzyon polipeptidiyle Sinerji halinde etki eden bir terapötik madde ve tedavi edilecek hastaligin farkli bir yönünü etkileyen bir terapötik maddedir. Ayrica öngörülenler, tek basina veya daha fazla terapötik maddelerle birlikte burada açiklandigi gibi polipeptidler içeren farmasötik bilesimlerdir.

Mevcut tarifiiamenin bir ikinci yönünde, burada açiklandigi gibi bir polipeptid veya bir füzyon polipeptidini kodlayan bir polinükleotid sunulmaktadir. Ayrica bu tarifnameyle kapsananlar, bu tür bir polinükleotidin; polinükleotid içeren bir ekspresyon vektörün; ve söz konusu ekspresyon vektörü içeren bir konakçi hücrenin eksprese edilmesini içeren yukarida açiklandigi gibi bir polipeptid veya ûizyon polipeptidinin üretimine yönelik bir usuldür.

Mevcut tarifnamenin bir üçüncü yönünde, bir ortak yapi iskelesini baz alan polipeptid varyantlarin bir popülasyonu sunulmaktadir, popülasyonda her bir polipeptid, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içerir: I) EX2X3X4AX6X7EIXIO XllLPNLX16X17X18QX20 XZIAFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Qs burada X2, X3, X4, X6, X7, Xio, X] [, Xi7, Xig, X20, X21, X25 VC X28”in her biri bagimsiz olarak herhangi bir amino asit kalintisina karsilik gelir; ve burada, birbirinden bagimsiz olarak, Xm N ve T7den seçilir; X26 K ve Siden seçilir; X29X30PX32 DDPS ve RQPE”den seçilir; X35 A ve Siden seçilir; X36 E ve N7den seçilir; X39 A, C ve S”den seçilir; X45 E ve S“den seçilir; X46 D, E ve S'den seçilir; X47 A ve S,den seçilir; ve ii) X45 N oldugunda X46'nin D veya E olmamasi kaydiyla, i)'de tanimlanan diziye en az %91 Özdeslige sahip olan bir amino asit dizisi.

Yukarida dizi i),de, X2, X3, X4, X6, X7, Xio, X”, X17, Xig, X20, X21, X25 ve Xzg”in her biri tek tek popülasyonda degisiklik gösteren bir amino asit kalintisina karsilik gelir. Dolayisiyla, her bir bu tür amino asit kalintisi, tarifnamenin birinci (polipeptid) yönüyle baglantili olarak yukarida açiklandigi gibi, dizide Xy olarak belirtilen herhangi bir baska kalintinin tanimindan bagimsiz olarak herhangi bir amino asit kalintisi olabilir. Polipeptidlerin popülasyonunda spesifik amino asit kalintilari Xy için, ve dizi i) ya da ii),nin ucunda herhangi bir ilave amino asit kalintisi için sinirlayici olmayan seçenekler, tarifnamenin birinci yönünün düzenlemeleri olarak yukarida belirtilenlerle aynidir.

Yukarida tartisildigi gibi, yukaridaki amino asit dizilerine kiyasla, tersiyer yapi ve bunun islevini büyük ölçüde etkilemeden küçük degisiklikleri içeren polipeptidler ayrica mevcut tarifriamenin kapsami içerisindedir. Bu nedenle, ayrica mevcut tarifnamede bir ortak yapi iskelesini baz alan polipeptid varyantlarin bir popülasyonu kapsanmaktadir, burada popülasyonda her bir polipeptid i),de tanimlanan bir dizide %91 veya daha fazla tanimla bir amino asit dizisi içerir. Bazi düzenlemelerde, her bir polipeptid, i),de tanimlandigi gibi diziye en az %93, örnegin en az %95, örnegin en az %97 özdes olan bir dizi içerebilir.

Burada tanimlanan popülasyon, tanimlanan polipeptid moleküllerin büyük bir sayida benzersiz ve farkli varyantlarindan olusur. Bu baglamda, büyük bir sayi, örnegin, popülasyonun, en az 1 x 104 benzersiz polipeptid moleküller, veya en az 1 x 106, en az 1 X 108, en az 1 x 1010, en az 1 x 1012, veya en az 1 x 1014 benzersiz polipeptid moleküller içerdigi anlamina gelebilir. Uzman kisinin takdir edecegi gibi, popülasyonun arzu edilen boyutunu sunmak için yeterince büyük olan bir grubu kullanmak gereklidir. Burada açiklanan "popülasyon" ayrica "kütüphane" olarak belirtilebilir.

Uzman kisi burada açiklandigi gibi popülasyonun i),de tanimlanan polipeptidi baz alan yeni baglayici moleküllerin seçimi için bir kütüphane olarak yararli olabilecegini takdir edecektir.

Baglayici moleküllerin, randomize edilmis polipeptidlerin bir popülasyonundan (veya kütüphane) izole edilebilecegi bu sahada iyi bilinmektedir. Bu teknoloji, PCT yayini WO95/19374°te, Nord ve digerleri (1997) Nature Biotechnology 152772-777,de ve W02009/080811”de genel hatlariyla açiklanmaktadir, ve on üç farkli hedef baglanma pozisyonlar üzerinde rastgele varyasyonla ve bir faj göstergesi veya genotip-fenotip kenetlenmesini baz alan baska seçim sisteminde ilgili baglayicilarin müteakip seçimiyle çesitli hedef moleküllere karsi, bir ortak Z bölge yapi iskelesini baz alan baglayici molekülleri seçmek amaciyla basarili sekilde uygulanmistir. Burada açiklandigi gibi popülasyon, önceki teknikteki popülasyonlara kiyasla, özellikle stabilite bakimindan gelistirilmis özellikler sergileyen polipeptid varyantlarin bir popülasyonudur. Randoinize edilmis polipeptidlerin bir popülasyonundan (veya kütüphane) izole edilen Z varyantlarinin örnekleri arasinda EGF reseptörü için (W02007/065635,te açiklanmaktadir), HER2 reseptörü için (WO2009/080810”da açiklanmaktadir), HER3 reseptörü için (WO2010/056124'te açiklanmaktadir), IGFl reseptörü için (W02009/0191177de açiklanmaktadir), PDGF reseptörü [3 için (W02009/0771757te açiklanmaktadir), ABD için (W02014/064237,de açiklanmaktadir), neonatal F c reseptörü (FcRn) için (PCT/EP2014/055299`da açiklanmaktadir) ve karbonik anhidraz lX için (WO2014/0961631te açiklanmaktadir) afiniteyle Z varyantlar yer alir.

Mevcut tarifnamenin bir dördüncü yönünde, polinükleotidlerin bir popülasyonu sunulmaktadir. Bu popülasyonda her bir polinükleotid, üçüncü yönle baglantili olarak yukarida tanimlandigi gibi polipeptidlerin bir popülasyonunun bir üyesini kodlamaktadir.

Mevcut tarifnamenin bir besinci yönünde, üçüncü yöne göre bir polipeptid popülasyon ve dördüncüye göre bir polinükleotid popülasyonun bir kombinasyonu sunulmaktadir, bu kombinasyonda polipeptid popülasyonun her bir üyesi, genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlarla bu üyeyi kodlayan bir karsilik gelen polinükleotidle fiziksel olarak veya mekansal olarak iliskilidir. Bu fiziksel veya mekansal iliski, kullanilan sisteme bagli olarak asagi yukari tam olacaktir.

Genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, bir faj gösterge sistemini içerebilir. Faj gösterge sistemleri uzman kisi tarafindan iyi bilinmektedir, ve örnegin, Smith GP (1985) Science 22821315-1317 ve Barbas CF ve digerleri (1991) Proc Natl Acad Sci U S A 88:7978-7982”de açiklanmaktadir.

Bundan baska, genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, bir hücre yüzey gösterge sistemini içerebilir. Hücre yüzey gösterge sistemi, prokaryotik hücreler, örnegin Gram-pozitif hücreler, veya ökaryotik hücreler, örnegin maya hücreleri içerebilir. Hücre yüzey gösterge sistemleri uzman kisi tarafindan iyi bilinmektedir. Prokaryotik sistemler, örnegin, Francisco JA ve digerleri (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90:10444-10448 ve Lee SY ve digerleri (2003) Trends Biotechnol 21:45-52,de açiklanmaktadir. Ökaryotik sistemler, örnegin, Boder ET ve digerleri (1997) Nat Biotechnol 15:553-557 ve Gai SA ve digerleri (2007) Curr Opin Struct Biol 17:467-473°te açiklanmaktadir. Bir düzenlemede, söz konusu genotip-fenotip kenetlenmesi, bir faj gösterge sistemini içerebilir.

Bundan baska, genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, bir hücre içermeyen gösterge sistemini içerebilir. Hücre içermeyen gösterge sistemi, bir ribozom gösterge sistemi, veya bir in vitro bölümlesme gösterge sistemi, veya cis göstergesi için bir sistem, veya bir mikro- bilyeli gösterge sistemi içerebilir. Ribozom gösterge sistemleri uzman kisi tarafindan iyi bilinmektedir, ve örnegin, Mattheakis LC ve digerleri (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91 :9022-9026 ve Zahnd C ve digerleri (2007) Nat Usulleri 4:269-279”da açiklanmaktadir. In vitro bölümlesme sistemleri uzman kisi tarafindan iyi bilinmektedir, ve örnegin, Sepp A ve digerleri (2002) FEBS Lett 5322455-4581de açiklanmaktadir. Cis gösterge sistemleri uzman kisi tarafindan iyi bilinmektedir, ve örnegin, Odegrip R ve digerleri (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101 :2806-28101da açiklanmaktadir. Mikro-bilye gösterge sistemleri uzman kisi tarafindan iyi bilinmektedir, ve örnegin, Nord O ve digerleri (2003) .1 Biotechnol 106: 1-13”te açiklanmaktadir.

Bundan baska, genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, protein-fragmani bölümlesme analizi (PCA) gibi bir göstergesi olmayan sistem içerebilir. PCA sistemleri uzman kisi tarafindan iyi bilinmektedir, ve örnegin, Koch H ve digerleri (2006) J Mol Biol 357z427- 441 ,de açiklanmaktadir.

Mevcut tarifnamenin bir altinci yönünde, polipeptidlerin bir popülasyonundan önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin seçilmesine yönelik bir usul sunulmakta olup, asagidaki asamalari içerir: (a) üçüncü yöne göre polipeptidlerin bir popülasyonunun sunulmasi; (b) polipeptidlerin popülasyonunun, hedef ve hedef için bir afiniteye sahip en az bir arzu edilen polipeptid arasinda spesifik etkilesimi saglayabilen kosullar altinda, önceden belirlenmis hedefle temas haline getirilmesi; ve (c) söz konusu spesifik etkilesim bazinda, polipeptidlerin geri kalan popülasyonundan en az bir arzu edilen polipeptidin seçilmesi.

Asagida, bu usul, bu tarifnameye uygun olarak "seçme usulü" olarak adlandirilir.

Asama (a), polinükleotidlerin bir popülasyonu sunma ve polipeptidlerin söz konusu popülasyonunu elde etmek için polinükleotidlerin söz konusu popülasyonunu eksprese etmeye yönelik hazirlayici asamalar içerebilir. Polipeptidlerin bir popülasyonunun elde edilmesi için araçlar, kullanilan gösterge sistemine bagli olarak degisir ve bu tür araçlarin örnekleri yukaridaki genotip-fenotip referanslarinda bulunabilir. Seçme usulünde kullanilan polipeptidlerin söz konusu popülasyonunun her bir üyesi, genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlarla bu üyeyi kodlayan polinükleotidle fiziksel olarak iliskili olabilir. Genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, yukarida tartisilanlardan biri olabilir.

Asama (b), polipeptidlerin popülasyonunu, hedef ve hedef için bir afiniteye sahip en az bir arzu edilen polipeptid arasinda spesifik etkilesimi saglayabilen kosullar altinda önceden belirlenmis hedefle temas haline getirmeye yönelik asamalar içerir. Uygulanabilir kosullar araligi, hedefin saglamligiyla, gösterge sisteminin saglamligi, ve hedefle etkilesimin arzu edilen özellikleriyle belirlenir. Örnegin ayirma etkilesiinine yönelik spesifik bir usul, örnegin önceden belirlenmis bir pH`a asitlestirme arzu edilebilir. Uzman kisi uygun kosullari belirlemek için hangi deneylerin gerekecegini bilir.

Asama (0), en az bir polipeptidin seçimini içerir. Önceden belirlenmis hedef ve hedef için afiniteye sahip en az bir arzu edilen polipeptid arasinda spesifik etkilesim baz alinarak Geri kalan popülasyondan arzu edilen polipeptidin seçimi için araçlar, kullanilan gösterge Sistemine bagli olarak degisiklik gösterir ve yukarida genotip-fenotip referanslarinda bulunabilir. Örnegin, in vitro gösterge seçim sistemleri, faj göstergesi ve protein fragman bölümlesme analizi gibi sistemlerine kiyasla hücre içermez.

Mevcut tarifnamenin bir yedinci yönünde, önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidi kodlayan bir polinükleotidi izole etmek için bir usul sunulmaktadir, asagidaki asamalari içerir: 0 söz konusu arzu edilen polipeptid ve bunu, altinci yöne göre seçme usulü kullanilarak polipeptidlerin bir popülasyonundan kodlayan polinükleotidin seçilmesi; ve o arzu edilen polipeptidi kodlayan bu sekilde ayrilan polinükleotidin izole edilmesi.

Asagida, bu usul, bu tarifnameye göre "izolasyon usulü" olarak adlandirilir.

Polinükleotidin polipeptidden ayrilmasi, seçim için kullanilan gösterge sistemine bagli olarak farkli sekilde yapilabilir. Örnegin, cis göstergesi ve ribozom göstergesi gibi hücre içermeyen gösterge sistemlerinde polinükleotid veya karsilik gelen mRNA, yukarida genotip-fenotip referanslarinda açiklanan araçlar kullanilarak polip eptidden etkili elusyonla düzeltilir.

Polinükleotidin izolasyonu, seçim için kullanilan gösterge sistemine bagli olarak farkli usullerle yapilabilir.

Yukarida açiklanan seçim sistemlerinin çogunda, örnegin protein fragman bölümlesme analizinde, uygun oligonükleotidler kullanilarak polinükleotid spesifik PCR amplifikasyonla dogrudan izole edilebilir. Ayrica, ribozom göstergesinde oldugu gibi, polinükleotid, ters transkripsiyon kullanilarak karsilik gelen mRNA'dan izole edilebilir. Polinükleotidin izolasyonu için çesitli araçlar, yukarida genotip-fenotip referanslarinda bulunabilir.

Mevcut tarifnamenin bir sekizinci yönünde, önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidi tanimlamaya yönelik bir usul sunulmaktadir, asagidaki asamalari içerir: 0 yedinci yöne göre izolasyon usulüne göre kullanilarak söz konusu arzu edilen polipeptidin kodlandigi bir polinükleotid; ve 0 Söz konusu arzu edilen polipeptidi amino asit dizisinin çikarilmasiyla olusturmak için polinükleotidin siralanmasi.

Polinükleotidin siralanmasi, uzman kisi tarafindan iyi bilinen standart prosedürlere göre gerçeklestirilebilir.

Mevcut tarifnamenin bir dokuzuncu yönü, polipeptidlerin bir popülasyonundan önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin seçilmesi ve tanimlanmasina yönelik bir usul sunulmakta olup, asagidaki asamalari içerir: (a) bir ayri tasiyici veya bilye üzerinde üçüncü yöne göre polipeptidlerin bir popülasyonunun her bir üyesinin sentezlenmesi; (b) önceden belirlenmis hedefle polipeptidin etkilesimini baz alan tasiyicilar veya bilyelerin seçilmesi veya zenginlestirilmesi; ve (c) polipeptidin, protein karakterizasyon metodolojisiyle tanimlanmasi.

Asama (c)°de, örnegin kütle spektrometrik analizi kullanmak mümkündür.

Asagida, bu usul, tarifnameye göre "seçme ve tanima usulü" olarak adlandirilir.

Ayrica önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin üretimine yönelik bir usul açiklanmakta olup, asagidaki asamalari içerir: . altinci yöne göre seçme usulü veya dokuzuncu yöne göre seçme ve tanima usulü kullanilarak arzu edilen bir polipeptidin seçilmesi ve tanimlanmasi; ve . söz konusu arzu edilen polipeptidin üretilmesi.

Asagida, bu usul, tarifnameye göre "üretim usulü" olarak adlandirilir. Üretim usulünde, üretim, arzu edilen polipeptidi kodlayan bir polinükleotidin rekombinant ekspresyonu kullanilarak gerçeklestirilebilir. Üretim ayrica arzu edilen polipeptidin kimyasal sentezi de novo kullanilarak gerçeklestirilebilir.

Ayrica önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin üretimine yönelik bir usul açiklanmakta olup, asagidaki asamalari içerir: (al) yedinci yöne göre izolasyon usulü kullanilarak söz konusu arzu edilen polipeptidi kodlayan bir polinükleotidin izole edilmesi; veya (aZ) dokuzuncu yöne göre seçme ve tanima usulünü kullanarak tanimlanan bir polipeptidin yeniden translasyona tabi tutulmasi; ve (b) söz konusu arzu edilen polipeptidi üretmek için bu sekilde izole edilen polinükleotidin eksprese edilmesi, burada asama (b), asama (al) veya asama (a2),den sonra gerçeklestirilir.

Tarifnameye göre polipeptidler, popülasyonlar ve usuller, önceden belirlenmis hedefe spesifik baglanmayla karakterize edilen bir polipeptidin tedarigiyle önceden belirlenmis bir hedef için bir atiniteyle maddelerin tedarigini saglar.

Ayrica az spesifik olmayan baglanma sergileyen veya bunu hiç sergilemeyen önceden belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidler sunmak mümkündür.

Ayrica bir füzyon polipeptidinde bir parça olarak kolaylikla kullanilabilen önceden belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidler sunmak mümkündür.

Bundan baska, mevcut antikor reaktif maddeleriyle deneyimlenen bir veya daha fazla bilinen usulü çözen önceden belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidleri sunmak mümkündür.

Bunda baska, terapötik ve/veya tanisal uygulamalarda kullanmak için uygun olan önceden belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidleri sunmak mümkündür.

Ayrica kimyasal peptid senteziyle kolaylikla hazirlanan önceden belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidler sunmak mümkündür.

Bundan baska, bulus, ayni hedefe baglanan bilinen maddeler karsisinda gelistirilmis bir stabilite sergileyen önceden belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidlerin tanimlanmasini saglar.

Ayrica bir memelide in vivo kullanildiginda düsük antijenisite sergileyen ve/veya bir memeliye uygulamadan sonra gelistirilmis bir biyolojik dagilim sergileyen önceden belirlenmis bir hedefe baglanan polipeptidleri sunmak mümkündür.

Mevcut tarifnameye göre popülasyonu olusturan polipeptidler için yukarida tartisilan modifikasyonlar ayrica yukarida belirtilen usullerin herhangi biriyle elde edilen polipeptidlere uygulanabilirdir.

Mevcut tarifnameye göre polipeptidler, bakteriyel hücreler, maya hücreleri, bitki hücreleri, böcek hücreleri, tüm bitkiler ve transjenik hayvanlar dahil olmak üzere farkli prokaryotik veya ökaryotik konakçilarda kimyasal sentez veya ekspresyon dahil olmak üzere herhangi bilinen bir yolla üretilebilir.

Polipeptidler, polipeptidlerin popülasyonlari ve burada açiklanan tanimlama, seçme, izolasyon ve üretim için usuller çesitli örnek teskil edici yönlere ve düzenlemelere atifta bulunularak, çesitli degisikliklerin yapilabilecegi ve esdegerlerin bulusun kapsamindan ayrilmadan bunun elementleri için sübstitüe edilebilecegi bu sahada uzman kisilerce takdir edilecektir. Ilaveten, birçok modifikasyonun, bulusun esas kapsamindan ayrilmadan bulusun ögretilerine özel bir durum veya molekülü adapte etmesi saglanabilir. Dolayisiyla, tarifnamenin, üzerine düsünülen herhangi bir özel düzenlemeyle sinirli olmamasi amaçlanmaktadir, fakat ekteki istemlerin kapsami içerisinde yer alan tüm düzenlemeleri içermesi amaçlamaktadir.

Sekillerin kisa açiklamasi Sekil 1 burada açiklandigi gibi bir polipeptidin örneklerinin amino asit dizilerinin bir listesidir. Örnekler 2-3°te gelistirilmis stabiliteye sahip oldugu gösterilen Z varyant polipeptidleri baglayan C5 dizileri, DIZI TANI NO:12, 17, 18 ve 22 olarak Sekil l°de belirtilir, ve bunun burada tanimlanan en kisa diziye karsilik gelen dizileri, DIZI TANI NO: 19-21 olarak belirtilir. Albumin baglama bölgelerine kaynasik C5 baglayici polipeptidlerin amino asit dizileri, dizi tanimlayicilar DlZl TANI NO:4-l 1, 13-16 ve 23-25,le Sekil 1°dedir. Örnek 127de gelistirilmis stabiliteye sahip oldugu gösterilen HER2, PDGF-Rß, FCRn ve CAIX için afiniteyle Z varyant polipeptidlerin dizileri, karsilik gelen kontrol polipeptidleri DIZI TANI NO:27, 30, 33 ve 36,yla birlikte, sirasiyla, DIZI TANI NO:28-29, DIZI TANI NO:31-32, DIZI TANI NO:34-35 ve DIZI TANI NO:37-42 olarak belirtilir.

Burada tanimlanan en kisa diziye karsilik gelen HER2, PDGF-Rß, FcRn ve CAlX için afîniteyle söz konusu Z varyant polipeptidlerin dizileri, DIZI TANI NO:43-54 olarak belirtilir. ilaveten, bir kontrol C5 baglayici polipeptidin, albumin kaynasik kontrol C5 baglayici polipeptidin, albumin baglama bölgesinin ve insan C5lin amino asit dizileri sirasiyla DIZI TANI NO:26, 1, 2 ve 3 olarak belirtilir.

Sekil 2, bir SDS-PAGE jelinin bir görüntüsüdür, burada birinci serit, SeeBlue 2P boyutu markörünü içerir ve bantlar, stabilite testinden önce; ve (2W) bir 2 haftalik stabilite testinden sonra C5 baglayici polipeptidi PSIOZ42lyi (DIZI TANI No:1) (0) temsil etmektedir.

Sekil 3, stabilite testinden (kesintisiz çizgi) önce ve bir 2 haitalik stabilite testinden (noktali çizgi) sonra PSIOZ42'nin ters faz HPLC°sinden bir kromatogramdir (DIZI TANI NO: 1) .

Sekil 4 bir SDS-PAGE jelinin bir görüntüsüdür, burada birinci serit, SeeBlue 2P boyutu markörü içerir ve bantlar, (0) baslangiç numunelerini; ve (2w) bir 2 haftalik stabilite testinden sonraki numuneleri temsil eder. A: DIZI TANI No:1; B: DIZI TANI NO:13; C: DIZI TANI NO:14; D: DIZI TANI NO:16.

Sekil 5 stabilite testinden önce (kesintisiz çizgi) ve bir 2 haftalik stabilite testinden (noktali çizgi) sonra bir modifiye edilmis C5 inhibitörünün (D121 TANI No:5) ters faz HPLC,sinden bir kromatogramdir.

Sekil 6 stabilite testinden önce (kesintisiz çizgi) ve bir 2 haftalik stabilite testinden (noktali çizgi) sonra bir modifiye edilmis C5 inhibitörünün (DIZI TANI NO: 16) ters faz HPLCsinden bir kromatogramdir.

Sekil 7 A: 217351 (DIZI TANI NO:37); B: Z17352 (DIZI TANI NO:38), C: 217355 (DIZI TANI NO:39); D: Z17357 (DIZI TANI NO:40), E: 217359 (DIZI TANI NO:40; F: 217360 (DIZI TANI NO:42); ve G: 209782 (DIZI TANI NO:36) için toplanan CD spektradir.

Sekil 8 (0),dan önce ve bir 2 haftalik (2W) stabilite testinden sonra orjinal ve bulus özelligi olan polipeptidleri gösteren SDS-PAGE jellerin görüntüleridir. A: HERZ: serit l: MW, serit 2: 202891 (0), serit 3:202891 (2w), serit 4: MW, serit 5: 217341 (0), serit 6: 217341 (2w), serit 7: 217342 (0), serit 8: 217342 (2W)”yi hedefleyen polipeptidler; B: PDGF-Rß: serit 1: MW, serit 2: 215805 (0), serit 3:215805 (2w), serit 4: Mw, serit 5: 217343 (0), serit 6: 217343 (2W), serit 7: 217344 (0), serit 8: 217344 (2w)°yi hedefleyen polipeptidler; C: FcRn: serit 1: 210103 (0), serit 22210103 (2W), serit 3: MW, serit 4: 217347 (0), serit 5: 217347 (2W), serit 6: 217348 (0), serit 7: 217348 (2W),yi hedefleyen polipeptidler; ve D: CAIX: serit lzMw, serit 2: 209782 (0), serit 31209782 (2W), serit 4: MW, serit 5: 217351 (0), serit 6: 217351 (2“O,seüt7:217352(0),$3ü:8:217352(2“0;seût9:217355(OLseüt10:217355(2n0, serit 11: 217357 (0), serit 12: 217357 (2W), serit 13: 217359 (0), serit 14: 217359 (2W), serit : 217360 (0), serit 16: 217360 (2W)”yi hedefleyen polipeptidler. Moleküler boyut markörü (MW), Novex® Sharp Önceden boyanmis Protein Standardiydi (216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, , 20, 15, 10, 3.5 kDa). (Sekil 8C,de görülen çapraz baglantilar, ayni kapta boyanan bir ikinci jelden bir etkiden kaynaklanan bir artifakttir).

Sekil 9 bir 2 haftalik stabilite testinden sonra ayni hedef için afiniteyle pozisyon 52-53 (siyah) ve orjinal 2 varyantlarda (gri) amino asit sübstitüsyonlari ND ila SE*yi içeren 2 varyantlarin baglanmasina yönelik sensörgramlari gösterir. A: 2017341 (DIZI TANI NO:28) ve 202891 ,in (DIZI TANI NO:27), HER21ye baglanmasi; B: 2017343 (DIZI TANI NO:31) ve 2158053in (DIZI TANI NO:30), PDGF-Rß”ye baglanmasi; C: 2017347 (DIZI TANI NO:34) ve 2101303un (DIZI TANI NO:33) FcRnlye baglanmasi ve D: 2017351 (DIZI TANI NO:37) ve ZO9782inin (DIZI TANI NO:36), CAIXie baglanmasi. Her bir Z varyantin enjekte edilen konsantrasyonlari, Örnek l3ite açiklandigi gibidir. Örnekler Asagidaki Örnekler, gelistirilinis stabilite sergileyen, yeni Z varyant polipeptidlerini gösterir.

Burada, yapi iskelelerinin önceki jenerasyonlarini baz alan Z varyant polipeptidlerinin özellikleri, burada açiklanan yapi iskelesini baz alan Z varyant polipeptidleriyle kiyaslandi.

Karsilastirmali örnek 1 Bilinen C5 baglayici Z varyantmin stabilite testi PSIOZ42 (DIZI TANI NO: 1) olarak belirlenen bir C5 baglayici Z varyanti, 25 mM NaP / 125 mM NaCl pH 7.0°de formüle edildi ve 2 hafta 37°C°de bir hizlandirilmis stabilite çalismasina tabi tutuldu. Stabilite, SDS-PAGE ve Ters faz HPLC (RPC) ile test edilen stabiliteden sonra yeni varyantlarin görünümüyle ölçüldü. Her iki analizde, baslangiç numunesi ve stabilite çalismasina tabi tutulan numune paralel olarak yürütüldü. SDS-PAGE için, 7.5 ug protein her bir kuyucuga yüklendi. RPC, su içinde %01 trifloroasetik asitten (TFA) olusan bir Mobil Faz A, ve %0.] TFA / %45 MeOH / %45 izopropilamin (IPA) / %10 sudan olusan bir Mobil Faz B kullanilarak bir Agilent 1100 HPLC üzerinde yürütüldü.

Sonuçlar, proteinin yeni formlarinin, inkübasyon sirasinda olusturuldugunu gösterir, SDS- PAGESda (Sekil 2) bantlar olarak ve Ters faz HPLC (RPC) kromatogramlarinda (Sekil 3) yeni tepe noktalari olarak görülür. Sekil 37te, 2 haftalik inkübasyondan sonra %57 oraninda orjinal protein numunesine karsilik gelir.

DIZI TANI NO:1*de Pozisyonlar 1-60, DIZI TANI No:753 olarak W02013/126006,da önceden açiklandigi gibi polipeptid Z06175a,ya karsilik gelir. Örnek 2 Modifiye edilmis C5 baglavici polipeptidler ve bilesiklerin stabilite testi Modifiye edilmis C5 baglayici polipeptidler ve bilesikler sentezlendi ve W02013/126006'da açiklandigi gibi esas itibariyle sailastirildi.

Kisaca, C5 baglayici Z varyantlarini kodlayan DNA, GeneArt, GmbH tarafindan optimize edilen ve sentezlenen E. coli' kodonuydu. Yeni C5 baglayici Z varyantlari temsil eden sentetik genler alt-klonlandi ve E. coli olarak eksprese edildi.

Hücre içi eksprese edilen Z varyantlar, geleneksel kromatografi usuller kullanilarak satlastirildi. Homojenizasyon ve klarifikasyon, sonikasyonla, ardindan santrifügasyon ve filtrasyonla gerçeklestirildi. Anyon degisim kromatografisi, yakalama asamasi olarak kullanildi. Ayrica saflastirma, hidrofobik etkilesim kromatografisiyle elde edildi.

Saflastirmalar, asidik kosullarda (pH 5.5) yapildi. Parlatma ve tampon degisimi, boyut eksklüzyon kromatografisiyle gerçeklestirildi.

Satlastirilan proteinler, 25 inM NaP / 125 mM NaCl pH 7.0,da formüle edildi ve 2 hafta 37 °C°de bir hizlandirilmis stabilite çalismasina tabi tutuldu. Stabilite, SDS-PAGE ve Ters faz HPLC (RPC) ile stabilite testinden sonra yeni varyantlarin görünümüyle ölçüldü. Her iki analizde, baslangiç numunesi ve stabilite çalismasina tabi tutulan numune paralel olarak yürütüldü. SDS-PAGE için, 7.5 ug protein her bir kuyucuga yüklendi. Elde edilen bir jelin bir örnegi, Sekil 4°te gösterilmektedir.

RPC, su içinde %0.] trifloroasetik asitten (TFA) olusan bir Mobil Faz A, ve %0.] TFA / %45 MeOl-l / %45 izopropilamin (IPA) / %10 sudan olusan bir Mobil Faz B kullanilarak bir Agilent 1100 HPLC üzerinde yürütüldü. DIZI TANI No:5 için elde edilen bir kromatogramin bir örnegi, Sekil Site gösterilmektedir.

Stabilite testinin sonuçlari Tablo 1'de Özetlenmektedir.

Tablo 1. 3 7 °C ,de 2 hafta inkübasyondarz sonra Z varyant polipeptidlerin Stabi'litesi'. SDS- PA GE ve HPLC ,den sonuçlar kiyaslanmakladir.

DIZI Ana tepe noktasi SDS-PAGE RPC ön-tepe RPC son-tepe TANI Tanimlama (toplam protein bantlari noktalari _ noktalari NO: yüzdesi) 1 ?810242 2 2 57 l 4 PSIO332 2 1 57 l PSIO334 1 l 73 0 DIZI Ana tepe noktasi TANI Tanimlama SDS-PAGE RPC ön-tepe (toplam protein RPC son-tepe NO: bantlari noktalari yüzdesi) noktalari 6 PSIO335 2 2 57 1 7 PS[0336 2 2 57 l 8 ?810337 2 2 57 1 9 PSIO339 2 2 57 1 PSIO340 2 2 67 1 11 PSI0369 2 1 90 1 12 PSIO377 1 0 77 0 13 PSIO378 1 0 89 0 14 PSIO379 1 0 88 0 PSIO381 1 0 87 0 16 PSIO383 1 0 9] 0 22 PSIO400 1 0 91 0 23 PS 10410 1 1 72 1 24 PSIO403 1 1 77 1 PSIO404 1 1 88 0 Tablo 1°de birtakim modifiye edilmis C5 baglayici polipeptidler veya bilesiklerin, PSIO242 ile kiyaslandiginda arttirilmis stabilite gibi gelistirilmis özelliklere sahip oldugu sonucuna varilabilir. Bu tür gelistirilmis C5 baglayici polipeptidler veya bilesikler arasinda PSIO334 (DIZI TANI No:5), PSIO340 (DIZI TANI NO:10), PSIO369 (DIZI TANI No:1 1), PSIO377 (DIZI TANI NO:12), PSIO378 (DIZI TANI NO:13), PSIO379 (DIZI TANI NO:14), PSIO381 (DIZI TANI NO:15), PSIO383 (DIZI TANI NO:16), PSIO400 (DIZI TANI NO:22), PSIO410 (DIZI TANI NO:23), PSIO403 (DIZI TANI NO:24) ve PSIO404 (DIZI TANI NO:25) yer alir.

Belirtilen varyantlarin altisi (DIZI TANI NO:5, 12, 13, 14, 16 ve 22), pozisyonlar 52-53”te amino asit kalintilarinin, NDsden (cf. P810242) SE°ye sübstitüe edilmis olmasi bakimindan ortaktir. DIZI TANI NO:15,te, karsilik gelen sübstitüsyon, ND ila ES”dir. DIZI TANI NO:249te sadece pozisyon 537teki amino asit kalintisi, DIZI TANI NO:25°te pozisyon 525de amino asit kalintisi, N ila Saden sübstitüe edilirken D ila E”den sübstitüe edilmistir. Örnek 3 Modifiye edilmis bilesiklerin insan C5”e baglanmasi Insan serum albumin, amin kenetlenmesiyle Amin Reaktif 2. jenerasyon (AR2G) Dip and Read Biyosensörlerine (Pall Life sciences (ForteBio) Kat # 18-5092) immobilize edildi.

PSIOZ42 (DIZI TANI NO: 1; 1 nM) ve okuma tamponunda (HBS-EP Tamponu [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, %0.005 Yüzey aktif madde P20], GE Healthcare, kat. no. BR100188) modifiye edilmis C5 baglayici bilesikleri (1 uM), her biri HSA ile ayri bir sensöre, 120 saniye, ardindan bir yeniden olusum döngüsüyle 0.79 nM ila 25 nM arasinda degisen konsantrasyonlarda ve her bir konsantrasyon arasinda bir baz hatti kaydiyla okuma tamponunda insan C5 ”e (Quidel, kat. no. A403) tabii tutulmadan önce okuma tamponunda bir baz hatti kaydiyla, 60 saniye yüklendi. Sensörler için yeniden olusum kosullari, 10 mM Glisin, pH 2°ydi (30 saniye üç darbe ve 60 saniye çalistirma tamponu). Her bir spektrogram, fakat C5 baglama kapasitesi olmadan, bir albumin baglama bölgesini (DIZI TANI No:2) içeren benzer bir yapininkine karsi referansla çikarildi. Veriler, ForteBio Analysis 7.1 (Pall Life sciences (ForteBio) kinetics yazilimi) kullanilarak Langmuir 1:1 modeline göre analiz edildi.

C5 ile PSlO242`in (DIZI TANI NO;1) etkilesimin nispi KD'si, Tablo 2°de gösterilmektedir.

P810242anin Kplsi (DIZI TANI NO: 1) farkli çalistirmalarda 1-3 nM”den degiskenlik gösterir.

Tablo 27de sonuçlar, mevcut tarifnameye göre C5 baglayici bilesiklerinin, W02013/126006'da açiklanan polipeptid PSIO242°ninkine (DIZI TANI NO: 1) benzeyen insan C5,e bir baglama kapasitesi sahip oldugunu gösterir.

Tablo 2. DIZI TANI NO:1,in C5 etki'lesiminin KD degerine kiyasla DIZI TANI N0.'5, 13, 15 ve 16 'nm etkilesi'mi'm'n KD degeri DIZI TANI NO: Tanimlama Rel. KD l PSIOZ42 1.0 PSIO334 1.1 DIZI TANI NO: Tanimlama Rel. KD 13 PSIO378 1.3 PSIO381 23 16 PSIO383 2.1 Örnek 4 Kimyasal olarak sentezlenen C5 baglayici polipeptidin stabilitesi Kimyasal olarak sentezlenen bir PSIO400 (DIZI TANI NO:22), BACHEM AG,den siparis edildi. Polipeptidin stabilitesi, Örnek ?deki gibi ayni metodolojiye göre test edildi. Stabilite testinin sonuçlari, Tablo 3”te gösterilmektedir.

Tablo 3. 2 haftalik inkübasyondan sonra kimyasal olarak üretilen C5 baglayici poli'pepti'd PSIO400ün stabi'li'tesi (DIZI TANI NO:22) DIZI Tanimlama SDS- RPC ön-tepe Ana tepe noktasi RPC son-tepe TANI NO PAGE noktalari (toplam protein noktalari bands yüzdesi) 22 PSIO400 1 0 91 0 PSIO400 stabilitesi, Örnek 2'de E. coli' `de üretilen ayni polipeptidle kiyaslanabilirdir.

PSIO400 kat bütünlügü (DIZI TANI NO:22), uzak UV dairesel dikroizm (CD) spektrasi kullanilarak Örnek 2 usullerine uygun olarak üretilen bir rekombinant C5 baglayici polipeptidle (PSIO257, DIZI TANI NO:26) kiyaslandi.

CD spektrasi bir J-720 CD spektropolariinetre (Jasco, Japonya) ile kiyaslandi. Numuneler, Pi tampon (5 mM Na-K-PO4, pH 7.0) kullanilarak 0.17 mg/ml protein konsantrasyonuna seyreltildi. Pi tamponunun bir CD spektiumu ilk olara kaydedildi, daha sonra spektra numunelerin her biri için ve son olarak Pi tamponu için tekrar kiyaslandi. Iki tampon spektrasi çakistigindan, ilk olarak kaydedilen spektrum, tampon spektrumu olarak kullanildi.

Tampon spektrumu, 25`lik kivrimli genislikle Savitzky-Golay prosedürü kullanilarak yumusatildi pürüzsüzlestirildi. Baska spektra, '15”lik bir kivrimli genislikle ayni prosedüre göre pürüzsüzlestirildi. Pürüzsüzlestirilen tampon spektruinu daha sonra diger pürüzsüzlestirilen spektranin her birinden çikarildi. CDNN programi, proteinlerin sekonder içerigini tahmin etmek için kullanildi ve elde edilen tahminler, Tablo 4”te sunulmaktadir.

Sonuçlar ne pozisyon 52 ve 53ste iki amino asit sübstitüsyonu ne de kimyasal sentezle polipeptid üretiminin, kimyasal olarak sentezlenen polipeptidin sekonder yapi içerigini etkiledigini gösterdi. Sekonder yapi içeriginin bütünlügü rekombinant olarak üretilen PSIO257 (DIZI TANI NO:26) ile kiyaslandi.

Tablo 4. CD ile belirlendigi gibi iki C5 baglayici polipeptid için sekonder yapi içeriginin kiyaslamasi DIZI TANI NO:26 Dizi TANI NO:22 Sarmal %63 %69 Anti-paralel %3 %2 Paralel %3 %3 Beta-Turn %13 %12 Düzensiz sargi %13 %1 1 Örnek 5 Modifiye edilmis Z varvantlar ve polipeptidlerin insan C5,ve baglanmasi Insan C5 için C5 baglayici bilesikleri P810242 (DIZI TANI NO:1), PSIO340 (DIZI TANI NO:10), PSIO378 (DIZI TANI NO:13), ve PSIO410 (DIZI TANI NO:23) ve C5 baglayici polipeptid PSIO400'ün (DIZI TANI NO:22) baglama afînitesi, bir Biacore T200 cihazi (GE Healthcare) kullanilarak analiz edildi. Insan C5 (Quidel, kat. no. A403), imalatçi protokolüne göre amin kenetlenme kimyasi kullanilarak bir CMS sensör çipine (900 RU) kenetlendi.

Kenetlenme, 10 mM Na-asetat tamponu pH 5°te (GE Healthcare) 7.5 ug/ml'lik bir konsantrasyonda hC5”in enjekte edilmesiyle gerçeklestirildi. Referans hücresi, fakat insan C5,i enjekte etmeden ayni reaktif maddeleriyle muamele edildi. C5 polipeptid ve bilesiklerin, immobilize edilmis hC57e baglanmasi, tekli döngü kinetik usulüyle çalisildi, burada numunenin bes konsantrasyonu, tipik olarak HBS-EP tamponunda 25, 12.5, 6.25, 3.12 ve 1.56 nM enjeksiyonlar arasinda yeniden olusum olmadan ayni döngüde 25 °C,de 30 pil/dakikalik bir akis hizinda birbiri ardindan enjekte edildi. Referans hücresinden veriler, hacim refraktif indis degisiklikleri karsilamak için çikarildi. Birçok durumda, HBS-EP”nin bir enjeksiyonu ayrica kontrol olarak dahil edildi, böylece sensörgramlar çift bosaltildi.

Yüzeyler, HBS-EP tamponunda yeniden olusturuldu. Kinetik sabitler, Biacore T200 Evaluation Yazilim versiyonu 1.071n Langmuir 1:1 analit modeli kullanilarak sensörgramlardan hesaplandi. Etkilesimlerin elde edilen KD degerleri, Tablo 5°te sunulmaktadir.

Tablo 5. DIZI TANI NO.'1 ile C5 etkilesimin KD degerine kiyasla C5 ile DIZI TANI NO:10, 13, 22 ve 23 'ün etkilesimi'nin KD degeri DIZI TANI NO: Tanimlama KD (nM) 1 PSIOZ42 1.3 PSIO340 2.5 13 PSIO378 2.1 22 PSIO400 0.53 23 PSIO410 1.3 Mevcut veriler, stabilite-arttirici amino asit sübstitüsyonlarinin, C5,e baglanabilme özelligi üzerinde herhangi bir anlamli negatif etkiye sahip olmadigini gösterir, ve bu nedenle bunlarin biyolojik aktivitelerini etkilemez. Örnek 6 Hemoliz inhibisyonu Klasik tamamlayici yol islevi ve bunun C5 baglayici bilesikler PSIO3 78 (DIZI TANI NO:13) ve PSIO410 (DIZI TANI NO:23), ve C5 baglayici polipeptid PSIO400 (DIZI TANI NO:22) ile inhibisyonuna yönelik çalisinalar için, koyun eritrositler, Alsever çözeltisinde (Isveç Ulusal Veteriner Enstitüsü) taze koyun tam kandan hazirlandi. Eritrositler bundan sonra antikorla duyarlastirilan koyun eritrositleri (EA) haline gelmesi için tavsan anti-koyun eritrosit antiserumla (Sigma) muamele edildi. Tam islem, aseptik kosullar altinda yürütüldü.

Tüm baska reaktif maddeler ticari kaynaklardandi.

In vitro analizde, bir test proteini, bir tamamlayici serum ve EA süspansiyonun art arda ilaveleriyle 96-kuyucuklu U-form mikrotitre plakasinda yürütüldü. Beher kuyucuk için 50 ul bir toplam reaksiyon hacminde ve pH 7 .3-7.4”te tüm reaktif maddelerin nihai konsantrasyonlari, 0.15 mM CaCI 2; 0.5 mM MgCI 2; 3 mM NaN 3; 138 mM NaCl; %0.] jelatin; 1.8 mM sodyum barbital; 3.1 mM barbiturik asit; 5 milyon EA; arzu edilen konsantrasyonlarda uygun seyreltmede tamamlayici protein C5 serumu, ve C5 baglayici bilesik veya polipeptiddi.

C5 baglayici bilesikler ve polipeptid, reaksiyonun EA süspansiyon ilavesiyle baslatilmasindan önce 20 dakika buz üzerinde yukarida açiklanan tamamlayici serumla önceden inkübe edildi. Hemolitik reaksiyonun, 37 °C'de çalkalama kosullari altinda 45 dakika devam etmesine izin verildi ve daha sonra %002 Tween 20 içeren 100 ul buz soguklugunda salin ilavesiyle istege bagli olarak durduruldu. Hücreler, flakonun altina santrifüjlendi ve 100 ul üst faza karsilik gelen üst porsiyon, yari alanli ve düz tabanli kuyucuklara sahip bir saydam mikroplakaya aktarildi. Reaksiyon sonuçlari, 415 nmilik bir dalga boyunda bir mikrotitre plaka okuyucusu kullanilarak optik yogunluk olarak analiz edildi.

Bir kontrol nuinunesi (PSlO242, DIZI `TANI NO: 1) ve vehikül, sirasiyla inhibe edilmemis ve tamamen inhibe edilmis reaksiyonlar için degerleri tanimlamak amaciyla her bir plakaya dahil edildi. Bu degerler, herhangi bir belirtilen numune konsantrasyonunda tamamlayici hemolizin % inhibisyonunu hesaplamak için kullanildi. Test edilen C5 baglayici bilesikleri ve polipeptidin inhibitör etkileri (IC 50-degerler), C5 ”i tükenmis seruma ilave edilen insan C5°ün bir kontrollü konsantrasyonu varliginda ayni analize uygulanarak tanimlandi. Oldukça etkili inhibitörler (düsük nanomolar ila alt-nanomolar) için, reaksiyon karisiminin bir nihai C5 konsantrasyonu, 0.1 nM”de kontrol altina alindi, bu, istege bagli olarak C5°i tükenmis veya bundan yoksun sera kullanilarak olusturuldu. Sonuçlar asagi Tablo 6”da sunulmaktadir.

Tablo 6. C5-baglayici bilesikler ve polipeptidin inhibitör kapasitesi DIZI TANI NO: Tanimlama Etki (%) IC 50 (nM) 1 PSI0242 100 0.47 13 PSIO378 83 0.58 DIZI TANI NO: Tanimlama Etki (%) IC 50 (nM) 22 PSIO400 - 4 23 PSIO410 107 0.49 Hemoliz analizinden sonuçlar gelistirilmis C5 baglayici bilesikler PSI0378 (DIZI TANI NO:13) ve PSIO4101un (DIZI TANI NO:23), islev bakimindan referans bilesigi PSIO242°den (DIZI TANI NO:1) anlamli sekilde degismedigini gösterir. C5 baglayici polipeptid PSIO4OO (DIZI TANI NO:22) analizde islevseldir ve bir albumin baglama bölgesi içermediginden, sonuçlar, referans bilesigininkilerle dogrudan kiyaslanamaz. Örnek 7 Insan albumin baglama Albumin için C5 baglayici bilesiklerin afinitesinin degerlendirilmesi için, kaplama olarak rekombinant insan albumin (Novozyines) ve Affibody AB (primer) ve DakoCytomation'dan (saptama) piyasada satilan antikorlar kullanilarak bir insan albumin ELISA kullanildi.

PSIOZ42”den (DIZI TANI NO: 1) hazirlanan ve bir C5 baglayici polipeptid ve streptokoksal protein Gsnin bir albuinin baglama bölgesini içeren standart bir usul, numunelerin ölçülmesi için kullanildi.

Bir 96-kuyucuklu mikroplaka, rekombinant insan albuminle kaplandi. Plaka daha sonra %005 Tween 20 (PBST) içeren fosfat tamponlu salinle yikandi ve PBS°de %1 kazeinle 1-2 saat bloke edildi. Bir plaka yikamasindan sonra, standart, usul kontrolleri, kontrol numunesi ve test numuneleri plakaya ilave edilir. 2 saat inkübasyondan sonra, bagli olmayan malzeme bir çözeltiyle giderildi. bir keçi anti-Affibody® IgG (Aftibody AB, Kat no. 20.1000.01.0005) kuyucuklara ilave edildi ve plaka, bagli C5 baglayici bilesiklerine baglanmasina izin vermek için 1.5 saat inkübe edildi. Bir yikamadan sonra, tavsan anti-keçi IgG HRP7nin (DakoCytomation) keçi antikorlarina 1 saat baglanmasina izin verildi. Bir nihai yikamadan sonra, bagli HRP miktari, enzimle mavi bir ürüne dönüstürülen TMB substrati (3,3',5,5'- tetrametibenzidin) ilavesiyle saptandi. 30 dakika sonra 1 M hidroklorik asit ilavesi, reaksiyonu durdu ve kuyucuk içeriklerinin rengi maviden sariya degisti. 450 nm°de absorbanlar, bir referans dalga boyu olarak 650 nm,de absorbans kullanilarak fotometrik olarak ölçüldü. Renk yogunlugu, PSIOZ42 (DIZI TANI NO:1) miktariyla orantiliydi ve numune konsantrasyonlari, standart egriden belirlendi.

Streptokoksal protein G'den (ABD) albumin baglama bölgesinin bir türevini içeren C5 baglayici bilesiklerin, insan albumin baglanabildigi gösterilmistir. Veriler, Tablo 7°de sunulmaktadir.

Tablo 7. ELISA ,dan sonuçlarin Özeti DIZI TANI NO: Tanimlama toplam protein içeriginin yüzdesi l PSIOZ42 103 13 PSI0378 85 23 PSIO410 150 Analizin yorumlamasi, gelistirilmis stabiliteyle arastirilan C5 baglayici polipeptidlerin her ikisinin bunlarin insan serum albumini baglayabilme özelligini korumasidir. Örnek 8 C5 baglayici Z varvantlari ve polipeptidlerin üc avlik stabilite testi 37 °Clde (Örnek 2) 2 haftalik stabilite testinde P810242'ye kiyasla gelistirilmis bir stabilite gösteren C5 baglayici varyantlari ve polipeptidleri, 37 °Clde daha uzun 3 aylik bir stabilite testine tabi tutuldu. Stabilite testi ve RPC analizinin kurulumu, Örnek Zide açiklandigi gibiydi. Stabiliteiiin degerlendirilmesi, kromatogramin ana tepe noktasinin ölçülmesiyle ve toplam protein içeriginin karsilik gelen yüzdesinin hesaplanmasiyla yapildi. Örnek 2°den veriler, yorumlamayi daha kolay hale getirmek için asagida Tablo 8”de yer almaktadir.

Tablo 8. 37 °C 'de 3 ay inkübasyondan sonra C5 baglayici polipeptidleri'n ve bilesiklerin stabilitesi DIZI TANI Tanimlama 2 hatta, 37 °C Ana tepe noktasi 3 ay, 37 °C Ana tepe noktasi NO: (toplam protein yüzdesi) (toplam protein yüzdesi) PSIO334 73 16 DIZI TANI Tanimlama 2 hafta, 37 °C Ana tepe noktasi 3 ay, 37 °C Ana tepe noktasi NO: (toplam protein yüzdesi) (toplam protein yüzdesi) 13 PSIO378 89 59 14 PSI0379 88 58 PSIO381 87 46 16 PSIO383 91 59 23 PSIO410 72 16 24 PSIO403 77 35 PSI0404 88 46 PS10242,ye kiyasla pozisyonlar 52-53,te amino asit sübstitüsyonlari ND ila SESyi içeren (DIZI TANI NO:13, 14, ve 16) C5 baglayici bilesikler, ayni kosullar altinda 2 haftadan sonra (bakiniz Tablo 1) P3102427den (DIZI TANI NO: 1), 37 °Cide 3 ay sonra orjinal formda proteinin daha yüksek bir oranini gösterdi. Diger test edilen bilesikler ayrica PSIO242lye kiyasla artmis bir stabilite gösterir. Örnek 9 Jenerasvon, stabilite çalismasi ve farkli hedefler için spesifitevle vapi iskelesi-modifiye edilmis polipeptidlerin baglama degerlendirilmesi Farkli hedefler için spesititevle yapi iskelesi-modifiye edilmis polipeptidlerin ienerasyonu: Burada açiklanan yeni yapi iskelesini içeren polipeptid varyantlar, farkli hedefler için spesifiteyle Z varyant polipeptidler alinarak, ve yapi iskelesi içerisinde seçilen pozisyonlarda alana yönelik mutagenezin gerçeklestirilmesiyle olusturulur. Yeni moleküller, bir Z varyant polipeptidinin bir baglayici motitinin, yeni yapi iskelesine asilanmasi için, alternatif olarak tüm molekülün kimyasal senteziyle veya bu sahada uzman biri tarafindan bilinen baska moleküler biyoloji usulleri kullanilarak hazirlanabilir.

Farkli hedefler için spesifiteyle yapi iskelesi-modifiye edilmis polipeptidlerin karsilastirmali stabilite çalismasi: Yukarida açiklandigi gibi olusturulan her bir yeni polipeptid için, stabilite, orjinal polipeptid veya baska bir kiyaslanabilir polipeptidin stabilitesiyle kiyaslanir.

Polipeptidler, [25 mM NaP, 125 mM NaCl, pH 7.0],deki formülasyon gibi farkli kosullara ve Örnek 2°de açiklandigi gibi 2 hafta ve/veya Örnek 8”de açiklandigi gibi 3 ay 37 °C9de inkübasyona tabi tutulur. Stabilite, Örnek 2,de açiklandigi gibi SDS-PAGE ve RPC analizlerinin gerçeklestirilmesiyle yeni varyantlarin görünümünün analiz edilmesiyle degerlendirilir.

Yapi iskelesi pozisyonlarinda katilan modifikasyonlarla polipeptidlerin, Örnek 2 ve Örnek 12”de sunulan sonuçlara benzer gelistirilmis stabilite göstermesi beklenmektedir.

Yapi iskelesi-modifiye edilmis polipeptidlerin baglama degerlendirilmesi: Gelistirilmis stabilite özellikleri gösterilmis polipeptidler ayrica yapi iskelesinde degisiklikler basladiktan sonra bunun korunan hedefine baglama kapasiteleri bakimindan degerlendirilir. Baglama çalisinalari, bir biyosensör cihazi, veya bu sahada uzman kisi tarafindan bilinen herhangi bir baska cihaz üzerinde ve iki veya daha fazla molekül arasinda etkilesimin ölçülmesiyle gerçeklestirilir. Örnegin, hedef molekül, veya bunun bir fragmani, cihazin bir sensör çipi üzerinde immobilize edilir, ve test edilecek polipeptidi içeren numune, çip üzerinden geçirilir.

Alternatif olarak, test edilecek polipeptid, cihazin bir sensör çipi üzerinde immobilize edilir, ve önceden belirlenmis hedefi içeren bir numune, veya bunun bir fragmani, çip üzerinden geçirilir. Baglama afinitesi, bir deneyde test edilebilir, burada polipeptid numuneleri, antikor kapli ELISA plakalari üzerinde yakalanir ve biyotinlenmis önceden belirlenmis hedef, veya bunun bir fragmani ilave edilir, bunu streptavidinle konjuge edilmis HRP takip eder. TMB substrati ilave edilir ve 450 nm,de absorbans, bir çok kuyucuklu plaka okuyucu, örnegin Victor3 (Perkin Elmer) kullanilarak ölçülür. Örnegin etkilesim için EC50 degerini (yari azami atkili konsantrasyon) belirlemek için bir kantitatif ölçüm arzu edildiginde, ELISA ayrica kullanilabilir. Önceden belirlenmis hedef, veya bunun bir fragmaninin bir seyreltme serilerine karsi polipeptid yaniti, yukarida açiklandigi gibi ELISA kullanilarak ölçülür. Bu tür deneyle elde edilen sonuçlar ve ECSO degerleri, örnegin GraphPad Prism 5 ve dogrusal olmayan regresyonun kullanildigi sonuçlardan hesaplanabilir. Polipeptid, bir albumin baglama bölgesini içerdiginde, albumin baglama etkisi, Örnek 3”te açiklandigi gibi veya Örnek 73de açiklandigi gibi benzer sekilde degerlendirilecektir.

Burada açiklanan yapi iskelesi mutasyonlarina sahip polipeptidler ve, ilaveten, bunun hedefi için benzer veya gelistirilmis baglama kapasiteleri, örnegin biyo-farmasötik ürünlere daha fazla gelistirme için daha iyi adaylar olarak kabul edilir. Örnek 10 Dört farkli hedef için spesifitevle yapi iskelesi-modifiye edilmis nolipeptidleriii ienerasyonu Burada açiklanan yeni yapi iskelesini içeren polipeptid varyantlar, farkli hedefler için spesifiteyle Z varyant polipeptidlerini alarak, ve yapi iskelesi içerisinde seçilen pozisyonlarda alana yönelik mutagenez gerçeklestirilerek olusturuldu. Polipeptid varyantlar, insan epidermal büyüme faktörü reseptör 2,yi (HER2) hedefleyen 202891 ,de yapi iskelesi pozisyonlarinda amino asit sübstitüsyonlari (DIZI TANI NO:27); trombosit kaynakli büyüme faktörü reseptörü beta (PDGF-RßYyi hedefleyen 215805 (DIZI TANI NO:30); neonatal Fe reseptörünü (FcRn) hedefleyen 210103 (DIZI TANI NO:33); ve karbonik anhidraz IX,u (CAIX) hedeneyen 209782 (DIZI TANI NO:36), Tablo 9'da belirtilmektedir.

Tablo 9. Orjinal ve asagida açiklanan Örneklerde stabilite ve islev bakimindan üretilen ve analiz edilen bulus özelligi olan polipeptidler DIZI TANI Tanimlama Hedef Amino asit Bulus özelligi olana NO sübstitüsyonlar karsi orjinal 27 202891 HER2 - Orjinal 28 217341 HER2 NSZS, D53E Bulus özelligi olan 29 217342 HER2 D36R, D37Q, S39E, NSZS, Bulus özelligi olan D53E 215805 PDGF- - Orjinal Rß 31 217343 PDGF- N52S, D53E Bulus özelligi olan Rß 32 217344 PDGF- D36R, D37Q, S39E, N52S, Bulus özelligi olan Rß D53E 33 210103 FcRn - Orjinal 34 217347 FcRn N528, D53E Bulus özelligi olan 217348 FcRn D36R, D37Q, S39E, NSZS, Bulus özelligi olan D53E DIZI TANI Tanimlama Hedef Amino asit Bulus özelligi olana NO sübstitüsyonlar karsi orjinal 36 Z09782 CAIX - Orjinal 37 Z17351 CAIX NSZS, D53E Bulus özelligi olan 38 Z17352 CAIX D36R, D37Q, S39E, N52S, Bulus özelligi olan D53E 39 217355 CAIX D53E Bulus özelligi olan 40 Z17357 CAIX D36R, D37Q, S39E, D53E Bulus özelligi olan 41 Z17359 CAIX NSZS Bulus özelligi olan 42 Z17360 CAIX D36R, D37Q, S39E, N52S Bulus özelligi olan Tüm varyantlar, bir N-terrnina16 x Histidin-etiketiyle (HiSö) klonlandi ve format MGSSHHHHHHLQ-[Z#####],de kodlanan polipeptid yapilari elde edildi. Mutasyonlar, üst üste binen arzu edilen amino asit sübstitüsyonlari kodlayan oligonükleotid primer çiftler kullanilarak ve yerlesik moleküler biyoloji teknikleri kullanilarak bulus özelligi olan polipeptidlerin plazmidlerine katildi. Dogru plazmid dizileri, DNA diziliiniyle onaylandi.

E coli' (sus T7E2) hücreleri (GeneBridge), orjinali ve bulus özelligi olan polipeptidleri kodlayan gen fragmanlarini içeren plazmidlerle dönüstürüldü. Hücreler, 50 tig/ml kanamisinle takviye edilmis TSB-YE ortaminda 37 oCide yetistirildi ve protein ekspresyonu, IPTG ilavesiyle art arda katildi. Pelletlenen hücreler, bir FastPrep®-24 homojenlestirici (Nordic Biolabs) kullanilarak ayrildi ve hücre debrisi santriiîigasyonla giderildi. Bir Hisö- etiketli protein olarak Z varyantini içeren her bir üst faz, imalatçilarin talimatlarina göre His GraviTrapTM kolonlari (GE Healthcare) kullanilarak immobilize edilmis metal iyon afinite kromatografisiyle (IMAC) saflastirildi. Sailastirilan Z varyantlar, PD-lO tuz giderici kolonlar (GE Healthcare) kullanilarak tamponla degistirilmis ila fosfatla degistirilmis salindi (PBS; 1.47 mM KH2P04, 8.1 mM NaZHPO4, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, pH 7.4). Her bir polipeptidin dogru tanimi, SDS-PAGE ve HPLC-MS ile onaylandi. Örnek 11 Yapi iskelesi-modifiye edilmis polipeptidlerin dairesel dikroizm spektroskopi analizi Dairesel dikroizm (CD) analizi, erime sicakliklarini (Tin) ve amino asit sübstitüsyonlarinin bir sonucu olarak bulus özelligi olan polipeptidlerin sekonder yapisinda potansiyel degisiklikleri degerlendirmek için gerçeklestirildi.

Saflastirilmis Hisö-etiketli Z varyantlar, PBS'de0.5 mg/mliye seyreltildi. Her bir seyreltilmis Z varyanti için, 250-195 nmide bir CD spektrumu 20 °Cide kaydedildi. Bir degisken sicaklik ölçümü (VTM), Tmiyi belirlemek için gerçeklestirildi. VTM,de, sicaklik, 5 °C/dakikalik bir sicaklik egimiyle, 20 ila 90 °C,ye arttirilirken, absorbans, 221 nmide ölçüldü. VTM”den sonra, 250-195 nm,de bir ikinci CD spektrumu 20 °Cide kaydedildi. CD ölçümleri, l mm”lik bir optik yol uzunluguyla bir hücre kullanilarak bir Jasco J-810 spektropolarimetresi (J asco Scandinavia AB) üzerinde gerçeklestirildi.

Sicaklik çizgisine karsi CD sinyalinde geçisin orta noktasindan belirlendigi gibi her bir ilgili polipeptidin Tmssi Tablo 10,da gösterilmektedir. Tüm mutasyona ugramis polipeptidler korunmus alfahelik yapi gösterdi ve 90 °C°ye isitildiktan sonra dahi tersinir sekilde veya neredeyse tersinir sekilde tekrar katlandi. CD spektrasinin seçilen bir grubu, Sekil 7,de gösterilmektedir.

Tablo 10. Orjinal ve CD ile belirlenen bulus Özelligi olan Z varyanîlar için erime sicakliklari DIZI TANI NO Tanimlama Hedef Tm (°C) Bulus özelligi olana karsi orjinal 27 202891 HER2 70 Orjinal 28 Zl734l HER2 66 Bulus özelligi olan 29 Z17342 HER2 62 Bulus özelligi olan Z15805 PDGF-Rß 48 Orjinal 31 Z17343 PDGF-Rß 46 Bulus özelligi olan 32 Z17344 PDGF-Rß 42 Bulus özelligi olan 33 Z] 0 l 03 FcRn 48 Orjinal 34 217347 FcRn 50 Bulus özelligi olan 217348 FcRn 44 Bulus özelligi olan 36 Z09782 CAIX 43 Orjinal DIZI TANI NO Tanimlama Hedef Tm (°C) Bulus özelligi olana karsi orjinal 37 217351 CAIX 40 Bulus özelligi olan 38 217352 CAIX 45 Bulus özelligi olan 39 217355 CAIX 43 Bulus özelligi olan 40 217357 CAIX 47 Bulus özelligi olan 41 217359 CAIX 41 Bulus özelligi olan 42 217360 CAIX 46 Bulus özelligi olan Örnek 12 Dört farkli hedef icin spesifîtevle vapi iskelesi-modifiye edilmis golipeptidlerin karsilastirmali stabilite çalismasi Örnek 10°da açiklandigi gibi olusturulan her bir yeni polipeptid için, stabilite, orjinal polipeptidin stabilitesiyle kiyaslandi. PBS pH 7.4,te formüle edilen polipeptidler, 1 mg/mPye seyreltildi ve 200 pl sivi bölüntüler, 37 °C3de 2 hafta inkübe edildi. Stabilite testinden önce ve sonra toplanan numuneler, %10 Bis-Tris NuPAGE jelleri (Invitrogen) kullanilarak ve 5 ug protein her bir kuyucuga yüklenerek SDS-PAGE ile analiz edildi. Elde edilen Cookütleie mavi boyali jeller, Sekil 8,de gösterilmektedir. Stabilite, yükseltilmis sicaklikta inkübasyondan sonra yeni varyantlarin görünümüyle degerlendirildi ve mutasyona ugramis varyantlar ilgili orjinal polipeptidle kiyaslandi.

Tablo 9°da belirtildigi gibi yapi iskelesi pozisyonlarinda katilan modifikasyonlarla tüm polipeptidler, ilgili orjinal polipeptide kiyasla gelistirilmis stabilite gösterdi. Orjinal polipeptidlerin numunelerinde, bir ikinci bant, hemen ana bant üzerinde jel üzerinde görünüdür. Bir karsilik gelen ikinci bant, sübstitüsyon D53E ve/veya NSZS ile bulus özelligi olan polipeptidlerin numunelerinde görünür degildi. Bu, Örnek 2 ve 4”te sunulan sonuçlara benzer sekildedir. Bu nedenle, bulus özelligi olan yapi iskelesi mutasyonlari için gözlemlenen stabilize edici etkinin, 2 varyantinin hedef spesifitesi veya söz konusu 2 varyanti içeren polypeptide bakmaksizin genel bir etki oldugu gözlemlenmektedir. Tek basina veya sübstitüsyonlar D36R, D37Q ve S39E ile birlesik, sübstitüsyonlar D53E ve/veya NSZS ile polipeptidler, SDS-PAGE jel üzerinde benzer profiler gösterdi. Tek basina veya sübstitüsyonlar D36R, D37Q ve S39E ile kombinasyon halinde D53E sübstitüsyonu, SDS- PAGE jeli üzerinde bir ikinci bant olarak gözlemlenen bir alternatif dogrulamayla türlerin miktarini azalttigi, fakat bu türlerin olusumunu tamamen önleyemeyecegi göründü. Örnek 13 Yapi iskelesi-modifiye edilmis polipeptidlerin baglama degerlendirilmesi Örnek 12°de gelistirilmis stabilite özellikleri gösteren polipeptidlerin bir grubu ayrica yapi iskelesinde degisikliklerin baslamasindan sonra, ayni zamanda stabilite testine tabi tutuluktan sonra, bunlarin korunan hedeflerine baglama kapasiteleri bakimindan degerlendirildi, yani 37 °Cide 2 hafta inkübe edildi. Karsilastirmali kinetik sabitler (kon ve koff) ve afiniteler (KD), bir Biacore 2000 cihazi kullanilarak belirlendi. Hedef proteinler sirasiyla, insan HER2-Fc (R&D Sistemler, kat. no. 1 129-ER-050), insan PDGF-Rß (R&D Sistemler, kat. no. 385-PR- 100/CF), insan FcRn (Biorbyt, kat. no. orb 84388) ve insan CAIX (R&D Sistemleri, kat. no. 2188-CA), CMS çiplerinin (GE Healthcare)karb0ksilatlanmis dekstran tabaka yüzeyi üzerinde immobilize edildi. Immobilizasyon imalatçi'nin protokolüne göre amin kenetlenme kimyasi kullanilarak ve yürütme tamponu olarak HBS-EP kullanilarak gerçeklestirildi. Çip üzerinde bir akis hücre yüzeyi aktive edildi ve analit enjeksiyonlar sirasinda bos olarak kullanim için de-aktive edildi. Ilgili yüzey üzerinde hedef proteinin immobilizasyon seviyesi HER2 için yaklasik olarak 850 RU, PDGF-Rß için 2200 RU, FcRn için 750 ve CAIX için 580 RU7ydu.

HBS-EP (HER2, PDGF-Rß, CAIX) veya bir pH 6.0 NagHPO4/sitrik asit tamponu (126 mM NazHPO4, 37 mM sitrik asit) (FCRn) yürütme tamponu olarak kullanildi ve akis hizi, asagida daha detayli açiklandigi 25 °Cade gerçeklestirilen baglanma deneyinde 30 ül/dakikaydi.

HER2iyi hedefleyen Z varyantlar1Z0289l (DIZI TANI NO:27), Z17341 (DIZI TANI NO:28), ve Zl7342 (DIZI TANI NO:29), yürütme tamponunda 3.33, 10, 30 ve 90 nM,lik nihai konsantrasyonlara seyreltildi ve 5 dakika enjekte edildi, bunu yürütme tamponunda 30 dakika ayrilma takip etti. 10 mM HCI ve 10 mM NaOH arasinda degisen dört darbeyle yeniden olusum, ardindan yürütme tamponunda 5 dakika dengeleme, her bir analit enjeksiyonundan sonra uygulandi.

PDGF-Rß,yi hedefleyen z varyantlari Z15805 (DIZI TANI NO:30), 217343 (DIZI TANI NO:31), ve Z17344 (DIZI TANI NO:32) yürütme tamponunda 6.67, 20, 60 ve 180 nM°lik nihai konsantrasyonlara seyreltildi ve 5 dakika enjekte edildi, bunu yürütme tamponunda 20 dakika ayrilma takip etti. 10 1nM NaOHinin üç darbesiyle yeniden olusum, ardindan yürütme tamponunda 5 dakika dengeleine, her bir analit enjeksiyonundan sonra uygulandi.

FcRn” yi hedefleyen Z varyantlari, Z10103 (DIZI TANI NO:33), 217347 (DIZI TANI NO:34), ve Z17348 (DIZI TANI NO:35) yürütme tamponunda 3.33, 10 ve 30 nM°lik nihai konsantrasyonlara seyreltildi ve 3 dakika enjekte edildi, bunu yürütme tamponumda 15 dakika ayrilma takip etti. HBS-EPnin üç darbesiyle yeniden olusum, ardindan yürütme tamponunda dakika dengeleme her bir analit enjeksiyonundan sonra uygulandi.

CAIXsi hedefleyen Z varyantlar Z09782 (DIZI TANI NO:36), Z17351 (DIZI TANI NO:37), Z17355 (DIZI TANI NO:39), ve Zl7359 (DIZI TANI NO:41) yürütme tamponumda 30, 90 ve 270 nMilik nihai konsantrasyonlara seyreltildi ve 5 dakika enjekte edildi, bunu yürütme tamponumda 15 dakika ayrilma takip etti. 10 mM glisin-HClinin, pH 3.0, üç darbesiyle yeniden olusum, ardindan yürütme tamponumda 5 dakika dengeleme her bir analit enjeksiyonundan sonra uygulandi.

Kinetik sabitler, Langmuir lzl modeli (HER2, FcRn, CAIX) veya BiaEvaluation yazilimi 4.1*in (GE Healthcare) kütle transfer modeliyle (PDGF-Rß) 1:] baglanma kullanilarak sensörgramlardan hesaplandi. Bos yüzey egrileri, ligand yüzeylerin egrilerinden çikarildi ve tampon döngülerinden veriler, sinyalde herhangi bir sapmayi düzeltmek için test-numune döngülerinin verilerinden çikarildi.

Hedef molekülüne baglanan Z varyantlar için karsilastirmali kinetik sabitler Tablo 115de gösterilmektedir ve analiz edilen etkilesimlerin bir alt-kümesi için sensörgramlar Sekil 9”da gösterilmektedir. Veriler, afinitenin, pozisyon 52-53,te sübstitüsyonlar ND ila SE ile sadece marjinal olarak gerçeklestirildigini ve birkaç varyant, Z17341 (DIZI TANI NO:28) ve Z17343 (DIZI TANI NO:31) için, afinitenin hatta hafifçe gelistirildigini gösterir. örnegin Z17342 (DIZI TANI NO:29), Z17344 (DIZI TANI NO:32) ve Z17348sde (DIZI TANI NO:35) sübstitüsyonlar D36R, D37Q ve S39E ile pozisyon 52-537te sübstitüsyonlar ND ila SE,nin bir kombinasyonu, öncelikli olarak daha hizli ayrilma hizlari nedeniyle afinite üzerinde daha olumsuz bir etkiye sahipti, fakat yine de islevsel baglayicilar, 109 M araliginda KD ile elde edildi. Dergerlendirilen varyantlar ayrica 37 °Csde 2 hafta inkübasyondan sonra baglanma özelliklerini korumustur.

Tablo 11. Orjinal ve bulus özelligi olan polipeptidlerin karsilastirmali kinetik analiz Z varyantlari baglayan HER2 DIZI Bulus özelligi Test kzi (Ms' TANI olana karsi 1 numunesi NO: orjinal 27 Z02891 (0) Orjinal 1.33x106 Z0289l 6 27 Orjinal 1 . 15x10 (ZW) Bulus özelligi 6 28 Z17341 (0) 1.88x10 olan Zl7341 Bulus özelligi 6 28 2.06x10 (2W) olan Bulus özelligi 5 29 Z17342 (0) 8.94x10 olan Z17342 Bulus özelligi 5 29 6.49x10 (2W) olan Z varyantlari baglayan PDGF-Rß DIZI Bulus özelligi Test kz,i (Ms' TANI olana karsi 1 numunesi ) N 0: orjinal Z15805 (0) Orjinal 7.15x106 215805 6 Orjinal 5.81x10 (ZW) Bulus özelligi 6 31 217343 (0) 4.80x10 olan 31 217343 Bulus özelligi 6.45x106 42 kd (8") 7.10x10` 7.19x10' 8.35x10` 8.91x10' 1.57x10' 3 1.50xlO` kd (S") 1.39x10' J 1.66X10_ 3 1.77x10' 3 1.71x10' KD (MV .4x10` 6.2x10' ll 4.5x10' 4.3x10` l 1 1.8x10` 2.3x10' KDlnv/ KDOrig** 1.0 1.0 0.83 0.69 33 37 KDlnv/ KDOrig** 1.0 1.0 1.90 0.93 KD(2w)/ KD(0) *** 0.97 1.31 KD(2w) / Külü*** 1.47 0.72 Z varyantlari baglayan HER2 DIZI TANI NO: 32 Test numunesi (ZW) 217344 (0) 217344 (ZW) Bulus özelligi olana karsi orjinal olan Bulus özelligi olan Bulus özelligi olan Z varyantlari baglayan FcRn DIZI TANI NO: 33 33 34 34 Test numunesi 210103 (0) 210103 (2W) 217347 (0) 217347 (2W) Z17348 (0) Z17348 (2W) Bulus özelligi olana karsi orj inal Orjinal Orjinal Bulus özelligi olan Bulus Özelligi olan Bulus özelligi olan Bulus özelligi olan Z varyantlari baglayan CAIX k.. (Ms' kd _i KD ') (s ) (M)* 3 10 7 6.16X10- 1.2x10' 15x10 2 9 7 6.23x10' 1.1x10- 62x10 2 9 KD k.. (M ") kd( ") S S (M)* 1.60x106 4.56x10'3 2.9x10`9 .75 xlO' 3.15x106 3 1.8x10`9 7.99 x10' 1.18x106 6.7›110'9 3 2 2731106 879 XIO- 3 9xi09 . 3 . 1.82x106 1.00›410'2 5.5›110*9 8.09 xlO' 12591106 3 6.3x10'° 43 KDlnv/ KDOrig* 6.19 3.88 Kmm/ 9: KDOrig** 1.0 1.0 2.36 2.13 1.93 3 .46 EP-19147 KD(2w)/ KD(0) **:12 0.93 KD(2w) / KD(0)*** 0.64 0.57 1.14 DIZI TANI NO: 36 36 37 37 39 39 41 41 Test numunesi 209782 (0) Z09782 (2W) 217351 (0) 217351 (2W) 217355 (0) 217355 (2W) 217359 (0) 217359 (2W) Bulus özelligi olana karsi orjinal Orjinal Orjinal Bulus özelligi olan Bulus özelligi olan Bulus özelligi olan Bulus özelligi olan Bulus özelligi olan Bulus özelligi olan KD kan kd -1 (s) (s) (M)* 2.08x105 1.46x10`3 7.0›410'9 14051105 1.38x10`3 9.9x10`9 1.51x105 2.63x10`3 1.8x10's 1.91xio5 2.86x10'3 1.5x10's 1.57x105 1.23x10`3 7.9x10'9 1.16xio5 1.23x10'3 1.1x10`8 1.68x105 2.15x10'3 1.3x10'8 1.78x105 2.33xiO'3 1.3›410'8 I(Dlnv/ KDOrig** 1.0 1.0 2.49 1.52 1.12 1.07 1.82 1.32 EP-19147 KD(2w) KD (0)/* ›i= ›i= 1.41 0.86 1.35 1.02 * KD degerleri, karsilastirma amaçlari için beli'rlendiginden ve sadece sinirli bir sayida numune konsantrasyonlari içerdiginden mutlak olarak kabul edilmemelidi'r.

** Oijinalpolipeptidinin KD 'siyle (1.0'a ayarli) bulus Özelligi olan ilgili polipeptidi'n KD -sinin kiyaslandigi (0) ,dan önce ya da Örnek 12 ,de açiklanan stabilite testinden (2w) sonra Göreceli K D. *** (2w) 'den KD ,nin, dizide özdes her bir poli'pepti'd çift için (0) 'dan KD ile kiyaslandigi Göreceli Kg. 44 EP-19147 DÜZENLEMELERIN MADDE MADDE SIRALANMIS LISTESI 1. Asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içeren polipeptid: I) EX2X3X4AX6X7EIX10 XIILPNLX16X17X18QX20 XziAFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q, burada X2, X3, X4, X6, X7, XIO, X] 1, Xi7, X187 X20, Xzi, X25 ve X28SIn her biri bagimsiz olarak herhangi bir amino asit kalintisina karsilik gelir; ve burada, birbirinden bagimsiz olarak, Xia N ve T7den seçilir; X26 K ve Siden seçilir; X29X30PX32 DDPS ve RQPE”den seçilir; X35 A ve S,den seçilir; X36 E ve N7den seçilir; X39 A, C ve S”den seçilir; X45 E ve S`den seçilir; X46 D, E ve S,den seçilir; X47 A ve S”den seçilir; ve ii) X45 N oldugunda, X463nin D veya N olmainasi kaydiyla, i),de tanimlanan diziye en az %91 özdeslige sahip bir amino asit dizisi. 2. Madde 1°e göre polipeptid, burada Xiö T”dir. 3. Madde 1 veya 2,ye göre polipeptid, burada X26 lCdir. 4. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X29X30PX32 DDPS”dir. 45 EP-19147 . Madde 1-3°e göre polipeptid, burada X29X30PX32 RQPEldir. 6. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X35 Sldir. 7. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X36 E“dir. 8. Herhangi bir Önceki maddeye göre polipeptid, burada X39 S“dir. 9. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X45 E ve S°den seçilir.

. Madde 9,a göre polipeptid, burada X45 Eldir. 11. Madde 9”a göre polipeptid, burada X45 Sldir. 12. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X46 E ve Slden seçilir. 13. Madde 12”ye göre polipeptid, burada X46 E,dir. 14. Madde 12lye göre polipeptid, burada X46 Sldir.

. Madde 12”ye göre polipeptid, burada X46 Dldir. 16. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X45X46 EE, ES, SE ve SS”den seçilir. 17. Madde 167ya göre polipeptid, burada X45X46 ES ve SE,den seçilir. 18. Madde 17”ye göre polipeptid, burada X45X46 ES,dir. 19. Madde 173ye göre polipeptid, burada X45X46 SE°dir.

. Madde 17”ye göre polipeptid, burada X45X46 SD,dir. 21. Herhangi bir önceki maddeye göre polipeptid, burada X47 Sldir. 22. Madde 1-211in herhangi birine göre polipeptid olup, ilave amino asit kalintilar içerir. 23. Madde 22'ye göre polipeptid olup, söz konusu polipeptidin C-ucunda ilave amino asit kalintilar içerir. 46 EP-19147 24. Madde 23,e göre polipeptid olup, burada söz konusu polipeptidin C-ucunda ilave amino asit kalintilar, AP içerir.

. Madde 22'ye göre polipeptid olup, söz konusu polipeptidin N-ucunda ilave amino asit kalintilar içerir. 26. Madde 25”e göre polipeptid olup, burada söz konusu polipeptidin N-ucunda ilave amino asit kalintilar AEAKYAK içerir. 27. Madde 22-26”in herhangi birine göre polipeptid olup, burada söz konusu ilave amino asit kalintilar, polipeptidin baglanma, üretim, satlastirma, stabilizasyon, kenetlenme veya saptanma amaci için ilave edilir. 28. Madde 22-277nin herhangi birine göre polipeptid olup, burada söz konusu ilave amino asit kalintilar, bir veya daha fazla polipeptid bölge olusturur. 29. Madde 28,e göre polipeptid olup, burada söz konusu bir veya daha fazla polipeptid bölge, bir baglama islevi, bir enzimatik islev, bir metal iyon selatlania islevi ve bir floresan islevi, veya bunlarin karisimlarinin grubundan seçilen bir isleve sahiptir.

. Madde l-27°nin herhangi birine göre polipeptid olup, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içerir: YAK LX;-X,!X4AX5X7L|X1. X1vLPNLX-›~^X17Xi.^-.ÜX.4 XsiAl'IX;P.X›.LX,-iiX.uX›i. pX'!.OSXmX;r~LLXJ;.E AKKLX45X4›3)(::O ÄPÇ Ve l'NK LXL'X'!X.1AX.~,X7L|X~ XwLPNLXiHX 7XI›I,(JXJV XL'IAI*IX;'r-x;'êiLX;s-X;'«.Xu pXjÄOSXJGXJtLLXgiE AKKLXJSXihx4'O ÂP, burada her bir Xy madde l-2l *in herhangi birinde taniinlandigi gibidir. 31. Madde 30`a göre polipeptid olup, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisi içerir: ADNNFNK LX:X'.X4AXanLIXA.;X iLPNLX'hXrX1.=.QX.›1' XgiAFIX;çX;.;LX,.i.:.X_.~._.X_i:_- PX;.;›OSX_.:.X3::LLX3.,E AKKinçxano APK ÂDNKFNK LX,AX;X4AX.,X7LIXiv;i XHLPNLXMXivXwÜXn; XgiAFIX;5X;›;LX;-:.X;~;.X3:; pX;.;OSX_-.:.X3;5LLX-_i.,E AKKLX43X45Xr0 APK 47 EP-19147 VUNKFNK inxxiAxnxiLixi.. XisLPNLXi›-.Xi7Xisi(JX.\ XgiAFIX;çX;.;LX,.›.:.)(;~;.X_i;; PX;.;›OSX,`-_`X3:_«LLX±_.E AKKLX4:X;5X;+O APK "J'UAKYAK LX;X;X;AX»;X,YLIX13 X LPNLXiaXiTX'HQX':: XEIAFIXJEX;0;LXS:.X{:~XJJS pX;.;~OSX,çX-3:5LLX1,E AKKLXxXsrxs-O APK VC ÂEAKYAK EX;IX1X.-.AXr.X›EIX~.i XiiLPNLX-;XuXHOXm XgiAFIX_:ç)(_..7LX_-...)(_-._.X_i;; pX;.;›OSX_;:.X3:5LLX4›_.E AKKLX4:MX;O APK burada her bir Xy madde 1-21 ,in herhangi birinde tanimlandigi gibidir. 32. Önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip madde 1-31'in herhangi birine göre polipeptid olup, burada söz konusu hedef istege bagli olarak ABD, HER2, TNFu, EGFR, IGFlR, IgG, PDGFRß, HER3, C5, FcRn, CAIX, amiloid ß, CD4, IL8, IL6 ve insülinden olusan gruptan seçilir. 33. Bir parça olarak madde 1-32,nin herhangi birine göre bir polipeptid içeren Iîizyon polipeptid. 34. Madde l-33”ün herhangi birine göre polipeptid veya lüzyon polipeptid olup ayrica bir etiket içerir.

. Madde 1-343ün herhangi birine göre polipeptid veya iüzyon polipeptid olup ayrica bir terapötik madde içerir. 36. Madde 1-33,ün herhangi birine göre bir polipeptid veya füzyon polipeptidi kodlayan polinükleotid. 37. Bir ortak yapi iskelesini baz alan polipeptid varyantlarin popülasyonu, popülasyonda her bir polipeptid, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içerir: I) EX2X3X4AX6X7EIXIO Xi iLPNLXiÖXwXisQXzo XziAFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q, burada X2, X3, X4, X6, X7, Xio, X”, X”, Xlg, Xgo, X21, X25 VC X28,Il'l her biri bagimsiz olarak herhangi bir amino asit kalintisina karsilik gelir; ve 48 EP-19147 burada, birbirinden bagimsiz olarak, XI(i N ve T7den seçilir; X26 K ve S7den seçilir; X29X30PX32 DDPS ve RQPE”den seçilir; X35 A ve S7den seçilir; X36 E ve N,den seçilir; X39 A, C ve S”den seçilir; X45 E ve Slden seçilir; X46 D, E ve S`den seçilir; X47 A ve S,den seçilir; ve ii) X45 N oldugunda X46,nin D veya E olmamasi kaydiyla, i),de tanimlanan diziye en az %91 özdeslige sahip bir amino asit dizisi. 38. Madde 37'ye göre popülasyon olup, en az lxlO4 benzersiz polipeptid molekül içerir. 39. Madde 38'e göre popülasyon olup, en az 1x`106 benzersiz polipeptid molekül içerir. 40. Madde 39'a göre popülasyon olup, en az lxlO8 benzersiz polipeptid molekül içerir. 41. Madde 40'a göre popülasyon olup, en az 1xlO10 benzersiz polipeptid molekül içerir. 42. Madde 41 'e göre popülasyon olup, en az 1x1012 benzersiz polipeptid molekül içerir. 43. Madde 42`ye göre popülasyon olup, en az lxlO'4 benzersiz polipeptid molekül içerir. 44. Polinükleotidlerin popülasyonu olup, özelligi, bunun her bir üyesinin, madde 37-43,ün herhangi birine göre polipeptidlerin bir popülasyonunun bir üyesini kodlamasidir. 49 EP-19147 45. Madde 37-43°ün herhangi birine göre polipeptidlerin bir popülasyonunun, madde 44,e göre bir polinükleotid popülasyonuyla kombinasyonu, burada polipeptidlerin söz konusu popülasyonunun her bir üyesi, genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlarla üyeyi kodlayan polinükleotidle fiziksel olarak veya mekansal olarak iliskilidir. 46. Madde 45'e göre kombinasyon olup, burada söz konusu genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, bir faj gösterge sistemi içerir. 47. Madde 45”e göre kombinasyon olup, burada söz konusu genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, bir hücre yüzeyi seçim gösterge sistemini içerir. 48. Madde 47'ye göre kombinasyon olup, burada söz konusu hücre yüzey gösterge sistemi, prokaryotik hücreler içerir. 49. Madde 48,e göre kombinasyon olup, burada söz konusu prokaryotik hücreler, Gram- pozitif hücrelerdi. 50. Madde 47'ye göre kombinasyon olup, burada söz konusu hücre yüzey gösterge sistemi, ökaryotik hücreler içerir. 51. Madde 50aye göre kombinasyon olup, burada söz konusu ökaryotik hücreler, maya hücreleridir. 52. Madde 45” göre kombinasyon olup, burada söz konusu genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, bir hücre içermeyen gösterge sistemi içerir. 53. Madde 52,ye göre kombinasyon olup, burada SÖZ konusu hücre içermeyen gösterge sistemi, bir ribozom gösterge sistemi içerir. 54. Madde 52,ye göre kombinasyon olup, burada söz konusu hücre içermeyen gösterge sistemi, bir in vitro bölümlesme gösterge sistemi içerir. 55. Madde 52'ye göre kombinasyon olup, burada söz konusu hücre içermeyen gösterge sistemi, ci's göstergesi için bir sistem içerir. 56. Madde 52,ye göre kombinasyon olup, burada hücre içermeyen gösterge sistemi, bir mikro-bilye gösterge sistemi içerir. 50 EP-19147 57. Madde 45,e göre koinbinasyon olup, burada söz konusu genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, bir göstergesi olmayan sistem içerir. 58. Madde 57'ye göre kombinasyon olup, burada söz konusu göstergesi olmayan sistem, protein-fragmani bölümlesme analizidir. 59. Polipeptidlerin bir popülasyonundan önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin seçilmesine yönelik usul olup, asagidaki asamalari içerir: (a) madde 37-43”ün herhangi birine polipeptidlerin bir popülasyonunun sunulmasi; (b) polipeptidlerin popülasyonunun, hedef ve hedef için bir afiniteye sahip en az bir arzu edilen polipeptid arasinda spesifik etkilesimi saglayabilen kosullar altinda önceden belirlenmis hedefle temas haline getirilmesi; ve (c) söz konusu spesifik etkilesim baz alinarak, polipeptidlerin geri kalan popülasyonundan en az bir arzu edilen polipeptidin seçilmesi. 60. Madde 59'a göre usul olup, burada asama (a), madde 44,e göre polinükleotidlerin bir popülasyonunun sunulmasina ve polipeptidlerin söz konusu popülasyonunu elde etmek için söz konusu polinükleotidlerin popülasyonunun eksprese edilmesine yönelik hazirlayici asamalar içerir. 61. Madde 60“a göre usul olup, burada polipeptidlerin söz konusu popülasyonunun her bir üyesi, genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar araciligiyla söz konusu üyeyi kodlayan polinükleotidle fiziksel olarak veya mekansal olarak iliskilidir. 62. Madde 61 ,e göre usul olup, burada söz konusu genotip-fenotip kenetlenmesi için araçlar, madde 46-585in herhangi birinde tanimlandigi gibidir. 63. Önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidi kodlayan bir polinükleotidin izole edilmesine yönelik usul olup, asagidaki asainalari içerir: 0 söz konusu arzu edilen polipeptid ve madde 5 9”a göre usul kullanilarak polipeptidlerin bir popülasyonunun kodlayan polinükleotidin seçilmesi; ve - arzu edilen polipeptidi kodlayan bu sekilde ayrilan polinükleotidin izole edilmesi. 64. Usul for identifying önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptid, asagidaki asamalari içerir: 0 madde 63`e göre usulün kullanildigi söz konusu arzu edilen polipeptidi kodlayan bir polinükleotidin izole edilmesi; ve 0 Söz konusu arzu edilen polipeptidi amino asit dizisinin çikarilmasiyla olusturinak için polinükleotidin siralanmasi. 65. Polipeptidlerin bir popülasyonundan önceden belirlenmis bir hedef için bir aIiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin seçilmesi ve tanimlamasi için usul olup, asagidaki asamalari içerir: (a) ayri bir tasiyici veya bilye üzerinde madde 37-43 ,ün herhangi birine göre polipeptidlerin bir popülasyonunun her bir üyesinin sentezlenmesi; (b) önceden belirlenmis hedefle polipeptidin etkilesimini baz alan tasiyicilarin veya bilyelerin seçilmesi veya zenginlestirilmesi; ve (c) polipeptidin, protein karakterizasyon metodolojisiyle tanimlanmasi. 69. Madde 65,e göre usul olup, burada asama (c),de kullanilan protein karakterizasyon metodolojisi, kütle spektrometrik analizdir.

Claims (15)

ISTEMLER

1. Asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içeren polipeptid olup, herhangi bir amino asit kalintisidir; ve burada, birbirinden bagimsiz olarak, Xig N ve T°den seçilir; Xzö K ve Siden seçilir; X29X30PX32 DDPS ve RQPE”den seçilir; X35 A ve S,den seçilir; X36 E ve N7den seçilir; X39 A, C ve Saden seçilir; X45 E ve S'den seçilir; X46 D, E ve S”den seçilir; X47 A ve S”den seçilir; ve ii) X45 N oldugunda X46'nin D veya E olmamasi kaydiyla, i),de tanimlanan diziye en az %91 özdeslige sahip bir amino asit dizisi.

2. Istem 1”e göre polipeptid olup, burada X45 S9dir.

3. Istem 1 veya 27ye göre polipeptid olup, burada X45X46 ES ve SE”den seçilir.

4. Istem l-3°ün herhangi birine göre polipeptid olup, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisi içerir: YÂK LX;-X1X.xAXiiXrL|Xii XHLPNLX'eIXVXHan XLIAI*lX;-nX;›:1LX.vi!XiQX.-i'i PX';_OSX35X;5LLXJ._.E AKKLXuXmgXiro AP; Ve FNK EX;›X3X4AX,,XTE:|X~; X~LPNLXieX TXiaiOXnJ XmAI*IXAXMLXRXHXM pXJ;OSXJSX'JL-LLX19E AKKLXuGüeXJ-'O Ap, burada her bir Xy istein 1-4`ün herhangi birinde tanimlandigi gibidir, burada y, i) ile tanimlanan polipeptid dizisi içerisinde kalinti X°in amino asit pozisyonunu belirtir.

5. Füzyon polipeptidi olup, bir parça olarak istem l-4”ün herhangi birine göre bir polipeptid

6. Istem 1-5°in herhangi birine göre bir polipeptid veya Eizyon polipeptidi kodlayan polinükleotid.

7. Bir ortak yapi iskelesini baz alan polipeptid varyantlarm popülasyonu olup, popülasyonda her bir polipeptid, asagidakilerden seçilen bir amino asit dizisini içerir: herhangi bir amino asit kalintisina karsilik gelir; ve burada, birbirinden bagimsiz olarak, Xiö N ve T7den seçilir; X26 K ve S°den seçilir; X29X30PX37_ DDPS ve RQPE”den seçilir; X35 A ve S'den seçilir; X36 E ve N,den seçilir; X39 A, C ve Siden seçilir; X45 E ve S°den seçilir; X46 D, E ve S”den seçilir; X47 A ve S,den seçilir; ve ii) X45 N oldugunda X46'nin D veya E olmamasi kaydiyla, i)7de tanimlanan diziye en az %91 özdeslige sahip bir amino asit dizisi.

8. Istem 7`ye göre popülasyon olup, en az 1 x 104 benzersiz polipeptid moleküller içerir.

9. Polinükleotidlerin popülasyonu olup, özelligi, bunun her bir üyesinin, istem 7-87in herhangi birine göre polipeptidlerin bir popülasyonunun bir üyesini kodlamasidir.

10. Istem 9°a göre bir polinükleotid p0pülasy0nla istem 7-8'in herhangi birine göre bir polipeptid popülasyonun kombinasyonu olup, burada polipeptidlerin söz konusu popülasyonunun her bir üyesi genotip-fenotip kenetleninesi için araçlarla söz konusu üyeyi kodlayan polinükleotidle fiziksel olarak veya mekansal olarak iliskilidir.

11. Istem lO”a göre kombinasyon olup, burada genotip-fenotip kenetlenmesi için söz konusu araçlar, bir faj gösterge sistemini içerir.

12. Önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin, polipeptidlerin bir popülasyonundan seçilmesine yönelik usul olup, asagidaki asamalari (a) istem 7-8”in herhangi birine göre polipeptidlerin bir popülasyonunun sunulmasi; (b) polipeptidlerin popülasyonunun, hedef ve hedef için bir afiniteye sahip en az bir arzu edilen polipeptid arasinda spesifik etkilesimi saglayabilen kosullar altinda önceden belirlenmis hedefle temas haline getirilmesi; ve (c) söz konusu spesifik etkilesimi baz alarak, polipeptidlerin geri kalan popülasyonundan en az bir arzu edilen polipeptidin seçilmesi.

13. Önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidi kodlayan bir polinükleotidin izole edilmesine yönelik usul olup, asagidaki asamalari içerir: - istem 12,ye göre usul kullanilarak söz konusu arzu edilen polipeptidin ve bunu polipeptidlerin bir popülasyonundan kodlayan polinükleotidin seçilmesi; ve - arzu edilen polipeptidi kodlayan bu sekilde ayrilan polinükleotidin izole edilmesi.

14. Önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip arzu edilen bir polipeptidin tanimlanmasina yönelik usul olup, asagidaki asamalari içerir: - istem 137e göre usul kullanilarak söz konusu arzu edilen polipeptidi kodlayan bir polinükleotidin izole edilmesi; ve - söz konusu arzu edilen polipeptidin amino asit dizisinin çikarilmasiyla olusturulmasi için polinükleotidin siralanmasi.

15. Polipeptidlerin bir popülasyonundan önceden belirlenmis bir hedef için bir afiniteye sahip olan, arzu edilen bir polipeptidin seçilmesi ve tanimlanmasina yönelik usul olup, asagidaki asamalari içerir: (a) bir ayri tasiyici veya bilye üzerinde istem 7-8,in herhangi birine göre polipeptidlerin bir popülasyonunun her bir üyesinin sentezlenmesi; (b) polipeptidin önceden belirlenmis hedefle etkilesimini baz alarak tasiyicilarin veya bilyelerin seçilmesi veya zenginlestirilmesi; ve (c) polipeptidin protein karakterizasyon metodolo j isiyle tanimlanmasi.