CN105658228B - 结合人类补体c5的稳定多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够结合人类补体组分5(C5)的多肽，所述多肽包含氨基酸序列[BM]‑[L2]‑QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q，其中[BM]是C5结合基序；[L2]是互相连接的环；X42选自A和S；X43选自N和E；X46选自A、S和C；X52选自E、N和S；X53选自D、E和S，条件是当X52是N时，X53不是D；并且X54选自A和S。

Description

结合人类补体C5的稳定多肽
技术领域
本发明涉及结合人类补体组分5(C5)的多肽，以及所述多肽在治疗中的用途。
背景技术
补体蛋白C5是补体系统的主要成分；先天免疫系统的关键部分。补体系统是一个复杂免疫监测系统，其具有受到严格控制、在多种过程中的许多任务。它作为抵御其他生物感染的第一道宿主防御系统起作用，并且也将健康的宿主组织与细胞碎片、凋亡的和坏死的细胞区别开。此外，它参与了清除免疫复合体、调节适应性免疫反应、促进组织再生、血管生成、干细胞动员和中枢神经系统的发育(woodruff等Mol Immunol 2011，48(14)：1631-1642；Ricklin等Nat Immunol 2010，11(9)：785-795)。扰乱补体激活和调节的精细平衡的任何触发，例如错误的或无限制地激活或不足的调节，可能导致包括自我攻击宿主细胞导致大量组织损伤的病态状况。
补体系统由30种蛋白质组成。存在三种启动补体的途径：经典途径使用C1q识别细胞表面的免疫复合体；当甘露醇结合凝集素(MBL)识别某些糖时，启动凝集素途径；和由补体因子3(C3)水解自发启动的备用途径，该过程受到在入侵病原体上不存在的某些哺乳动物细胞表面分子的抑制。这条备用途径也作为补体系统的放大环路。所有三条途径汇聚于C3级别。C3裂解成C3a和C3b导致形成转化酶，这种转化酶转而裂解补体因子5(C5)成C5a和C5b。C5是各种免疫细胞的非常有效的引诱剂，而C5b与C6-9寡聚体化形成被称为膜攻击复合体(MAC)或有时末端补体复合体(TTC)的孔。补体系统激活导致许多机制，目的是中和病原体；在细胞诸如入侵细菌表面形成MAC导致溶解，沉积C3和C4裂解产物C3b和C4b有助于调理素作用，导致由巨噬细胞吞噬病原体的作用和过敏毒素诸如C3a和C5a吸引单核细胞和中性粒细胞到激活的位点，上调表面标志物，导致增强的免疫敏感性和细胞因子的释放。
C5是190-kDa的糖蛋白，包含两个二硫键连接的多肽链α和β，其分子质量分别是115和75kDa(Tack等Biochem 1979，18：1490-1497)。Haviland等(J Immun 1991，146:362-368)构建人类补体pro-C5的完整的cDNA序列，所述cDNA序列被预测编码一个1676个氨基酸的前体分子，这个前体分子包含18个氨基酸的前导肽和分开β和α链的4个氨基酸接头(SEQID NO:251)。由于C5为所有补体激活途径共有，不论刺激为何，阻断C5将终止级联反应的进程，从而防止末端补体激活的有害的性质，同时使邻近的补体级联的免疫保护和免疫调节功能保持原样。
补体系统在抵御病原菌中的总体关键作用使其成为用于药物学介入的令人关注的目标。补体的许多突变或受损的调节参与各种疾病和状况的事实强调了这点。这些包括对自身免疫性疾病诸如系统红斑狼疮(SLE)增强的易感性，其中免疫复合体沉积引发经典途径(Manderson等Annu Rev Immunol 2004，22：431-456)。此外，补体蛋白C1-C5的突变常常导致SLE或类似SLE的症状。补体系统强烈参与的其他自身免疫性疾病是风湿性关节炎(RA)，其中免疫复合体可能激活在RA关节处的补体、
Figure BDA0000968783320000021
氏综合征、皮肌炎、和其他自身抗体驱动的疾病诸如Guillain-Barré综合征(GBS)、Fisher综合征(Kaida等J.Neuroimmun2010，223：5-12)、不同类型的血管炎、系统性硬化病、抗小球的基膜(anti-GBM)和抗磷脂综合征(APS)(Chen等J Autoimmun 2010，34：J276-J286)。而且，在诸如牙周炎(Abe等JImmunol 2012，189：5442-5448)、伤口愈合(Cazender等Clin Dev Immunol 2012，在线出版)、肿瘤生长(Markiewski等Nat Immunol 2008，9：1225-1235)和眼部疾病(诸如葡萄膜炎和年龄相关的黄斑变性(AMD))(Copland等Clin Exp Immunol 2009，159：303-314)的不同状况的动物模型中，补体抑制已经被证明有效。
靶向人类补体C5的抗体从例如，WO 95/29697、WO 02/30985和WO 2004/007553可知。依库丽单抗(SolirisTM)是一种针对蛋白C5的人源化的单克隆抗体并且防止C5裂解成C5a和C5b。依库丽单抗已经显示出在治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)中是有效的，并且被批准用于这种适应症，PNH是一种罕见的并且有时危及生命的以血管内溶血性贫血、血栓形成倾向和骨髓衰竭为特征的血液疾病。依库丽单抗最近也被FDA批准用于治疗非典型的溶血综合征(aHUS)，一种由于备用补体途径失控导致过度激活引起的罕见但危及生命的疾病，表现为：血栓性微血管病(TMA)，导致损害生命器官诸如肾脏、心脏和脑的持续危险。在aHUS中，移植受损的器官只能暂时地帮助患者，因为肝脏继续产生控制蛋白(通常是补体因子H或备用途径的其他蛋白)的突变形式。短暂的急性的病理生理的相关疾病是由通过感染志贺毒素阳性大肠杆菌(STEC-HUS)导致的HUS，并且也存在对这一病症暗示药效的有希望的临床数据(Lapeyraque等N Engl J Med 2011，364：2561-2563)。最后，C5阻断抗体依库丽单抗已经证明在高度不匹配的肾脏接受者中防止抗体介导的排斥(AMR)是有效的(Stegall，M.D.等Am J Transplant 2011,11：2405-2413)，及在治疗自身免疫神经病诸如视神经脊髓炎和重症肌无力中是有效的(Pittock等Lancet Neurol 2013，12：554-562；Howard等Muscle Nerve 2013，48：76-84)。
除了全长的抗体，在文献中描述了靶向C5的单链可变片段(scFV)、小体(minibody)和适配体。这些C5抑制物可结合在C5分子的不同位点(表位)并且可具有不同的作用模式。例如，依库丽单抗在转化酶裂解位点的一定距离处与C5相互作用，而小体
Figure BDA0000968783320000031
与C5的裂解位点相互作用。来自于软蜱非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata)的C5抑制蛋白非洲钝缘蜱补体抑制物(OmCI，Nunn，M.A.等J Immunol 2005，174：2084-2091)已被猜测结合至在转化酶裂解位点附近的CUB-C5d-MG8超级结构域的远端(Fredslund等Nat Immunol 2008，9(7)：753-760)。与上述提到的抑制C5裂解的三种蛋白不同，单克隆抗体TNX-558结合至在完整的C5和释放的C5a均存在的C5a表位而不抑制C5的裂解(Fung等Clin Exp Immunol 2003，133(2)：160-169)。
包含C5结合基序的C5结合多肽，公开在国际专利申请号PCT/SE2013/050139，作为WO 2013/126006公布。特别是，WO 2013/126006公开了由氨基酸序列
EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25X26LX28D组成的C5结合基序BM，
其中彼此独立地，
X2选自H、Q、S、T和V；
X3选自I、L、M和V；
X4选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T和Y；
X6选自N和W；
X7选自A、D、E、H、N、Q、R、S和T；
X11选自A、E、G、H、K、L、Q、R、S、T和Y；
X16选自N和T；
X17选自I、L和V；
X18选自A、D、E、H、K、N、Q、R、S和T；
X21选自I、L和V；
X25选自D、E、G、H、N、S和T；
X26选自K和S；并且
X28选自A、D、E、H、N、Q、S、T和Y。
特定C5结合基序的例子，如之前在WO 2013/126006中公开的，在本专利申请中如SEQ ID NO:1-248所示。
从WO 2013/126006可知，额外的肽或多肽可增强C5结合多肽的稳定。这种多肽的一个例子是如本说明书中的SEQ ID NO:250所示的白蛋白结合结构域(ABD)。合适的白蛋白结合结构域的其他例子公开在WO 2009/016043和WO 2012/004384。ABD延伸的多肽在体内结合至血清白蛋白，并且得益于其较长的半衰期，增加多肽自身的净半衰期(见例如WO 91/01743)。
持续提供具有相当的C5阻断活性的试剂依然在本领域是实质利益问题。特别是，对防止末端补体级联和促炎分子C5a形成的分子存在持续需要。提供这种分子在疾病治疗中的用途也是很有用。
附图简述
图1图解SDS-PAGE凝胶，其中条带代表C5结合化合物PSI0242(SEQ ID NO:249)(0)稳定性测试之前；和(2w)两周稳定性测试之后。
图2是稳定性测试之前(实线)和两周稳定性测试之后(虚线)来自于PSI0242(SEQID NO:249)的反相HPLC的色谱图。
图3图解SDS-PSGE凝胶，其中第一泳道包含SeeBlue 2P大小标记物并且条带代表(0)起始样品；和(2w)两周稳定性测试之后的样品。图3A：SEQ ID NO:249；图3B：SEQ ID NO:261；图3C：SEQ ID NO:262；图3D：SEQ ID NO:264。
图4是稳定性测试之前(实线)和两周稳定性测试之后(虚线)来自于C5结合化合物(SEQ ID NO:253)的反相HPLC的色谱图。
图5是稳定性测试之前(实线)和两周稳定性测试之后(虚线)来自C5结合化合物(SEQ ID NO:264)的反相HPLC的色谱图。
图6A-D显示SDS-PAGE凝胶图像，比较两周稳定性测试之前(0)和之后(2w)原始的和修饰的多肽变体。分子大小标记物(Mw)是
Figure BDA0000968783320000051
Sharp预染蛋白标准(216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)。图6A显示HER2结合多肽的凝胶，其中泳道显示泳道1：Mw，泳道2：(0)Z02891(SEQ ID NO:272)，泳道3：(2w)Z02891(SEQ ID NO:272)，泳道4：Mw，泳道5：(0)Z17341(SEQ ID NO:273)，泳道6：(2w)Z17341(SEQ ID NO:273)，泳道7：(0)Z17342(SEQ ID NO:274)，泳道8：(2w)Z17342(SEQ ID NO:274)。图6B是PDGF-Rβ结合多肽的凝胶，其中泳道显示：泳道1：Mw，泳道2：(0)Z15805(SEQ ID NO:275)，泳道3：(2w)Z15805(SEQ IDNO:275)，泳道4：Mw，泳道5：(0)Z17343(SEQ ID NO:276)，泳道6：(2w)Z17343(SEQ ID NO:276)，泳道7：(0)Z17344(SEQ ID NO:277)，泳道8：(2w)Z17344(SEQ ID NO:277)。图6C显示FcRn结合多肽的凝胶，其中泳道显示：泳道1：(0)Z10103(SEQ ID NO:278)，泳道2：(2w)Z10103(SEQ ID NO:278)，泳道3：Mw，泳道4：(0))Z17347(SEQ ID NO:279)，泳道5：(2w)Z17347(SEQ ID NO:279)，泳道6：(0)Z17348(SEQ ID NO:280)，泳道7：(2w)Z17348(SEQ IDNO:280)。图6C中见到的对角线的条带是由于在同一个容器内来自于第二次凝胶染色的印记造成的伪迹。图6D是CAⅨ结合多肽的凝胶，其中泳道显示泳道1：Mw，泳道2：(0)Z09782(SEQ ID NO:281)，泳道3：(2w)Z09782(SEQ ID NO:281)，泳道4：Mw，泳道5：(0)Z17351(SEQID NO:282)，泳道6：(2w)Z17351(SEQ ID NO:282)，泳道7：(0)Z17352(SEQ ID NO:283)，泳道8：(2w)Z17352(SEQ ID NO:283)，泳道9：(0)Z17355(SEQ ID NO:284)，泳道10：(2w)Z17355(SEQ ID NO:284)，泳道11：(0)Z17357(SEQ ID NO:285)，泳道12：(2w)Z17357(SEQID NO:285)，泳道13：(0)Z17359(SEQ ID NO:286)，泳道14：(2w)Z17359(SEQ ID NO:286)，泳道15：(0)Z17360(SEQ ID NO:287)，泳道16：(2w)Z17360(SEQ ID NO:287)。
图7是显示以下的氨基酸序列的表：
-C5结合基序的例子(SEQ ID NO:1-248)；
-C5结合化合物，命名为PSI0242(SEQ ID NO:249)；
-白蛋白结合结构域(SEQ ID NO:250)；
-人类C5(SEQ ID NO:251)的Swiss-Prot登记号P01031，其中α链对应于氨基酸残基678-1676，β链对应于氨基酸残基19-673；
-修饰的C5结合多肽的例子(SEQ ID NO:260、265-267)。
-修饰的C5结合化合物的例子(SEQ ID NO:252-259、261-264、268-270)。
-对其他靶分子有结合亲和力的多肽变体的例子(SEQ ID NO:272、275、278、281)
-对其他靶分子有结合亲和力的稳定性改善的多肽变体的例子(SEQ ID NO:273-274、276-277、279-280、282-287)。
发明内容
惊奇地发现：其中氨基酸序列在特定位置已被修饰的C5结合多肽和化合物，当与之前已知的C5结合多肽和化合物相比时，具有增强的稳定性。
因此，本发明提供了能够结合人类补体组分5(C5)的多肽，所述多肽选自：
(a)包含氨基酸序列
[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q的多肽
其中彼此独立地，
[BM]是C5结合基序；
[L2]选自DDPS和RQPE；
X42选自A和S；
X43选自N和E；
X46选自A、S和C；
X52选自E、N和S；
X53选自D、E和S，条件是当X52是N时，X53不是D；
并且
X54选自A和S；和
(b)与(a)的多肽具有至少89％氨基酸序列同一性的多肽，条件是当X52是N时，X53不是D。
发明人出人意外地发现，在如WO 2013/126006所述的C5结合多肽的氨基酸序列中的某些位置的氨基酸残基修饰或取代改善C5结合多肽的稳定性，而生物活性诸如对人类补体组分5(C5)的结合亲和力和补体途径功能的抑制本质上被保留。因此，修饰的C5结合多肽的生物活性与已知的C5结合多肽的生物活性相当。本发明的C5结合多肽的稳定性测试证明，在X52从N取代为E或S或在X53从D取代为E或S改善稳定性。此外发现，在[L2]中特定的氨基酸取代可独立地促进稳定性。
如在本说明书使用的术语“C5结合”和“对C5的结合亲和力”指的是多肽可被例如通过使用表面等离子共振技术诸如在Biacore仪器(GE Healthcare)中测试的性质。C5结合亲和力可例如在实验中被测试，其中C5被固定在Biacore仪器的传感器芯片，并且包含将待检多肽的样品通过芯片。或者，待测多肽被固定在仪器的传感器芯片，并且包含C5或其片段的样品通过芯片。本领域技术人员可然后解释通过这样的实验得到的结果来建立多肽对C5结合的至少定性测量。如果想要得到定量测量，例如确定相互作用的表观平衡解离常数KD，表面等离子共振方法也可被使用。结合值可例如在Biacore 2000仪器(GE Healthcare)被定义。C5被固定在测定的传感器芯片上，而且待确定亲和力的多肽样品通过连续稀释被制备并注入通过芯片。KD值可然后从结果使用例如由仪器厂商提供的BIAevaluation软件的1:1Langmuir结合模型被计算。KD确定中使用的C5或其片段可例如包含由SEQ ID NO:251代表的氨基酸序列。C5结合亲和力可被如何测试的例子在本文提供，参见实施例3和5。
在本发明的优选形式中，所述多肽选自：
(a)包含氨基酸序列
AEAKYAK-[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP的多肽
其中彼此独立地，
[BM]、[L2]、X42、X43、X46、X52、X53和X54如上文定义；和
(b)与(a)的多肽具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽，条件是当X52是N时，X53不是D。
如以前在WO 2013/126006中公开的，根据本发明的C5结合多肽可形成三螺旋束蛋白结构域的部分。所述C5结合基序[BM]在所述三螺旋束中，本质上可形成有一个互相连接的环的两个α螺旋的部分。第二个互相连接的环，此处被称为[L2]，连接C5结合基序与被称为“骨架”的第三个α螺旋。
在一个实施方案中，C5结合基序[BM]本质上如在WO 2013/126006公开的。然而，根据本发明，C5结合基序优选地由28个而不是29个氨基酸组成，并且可此外携带另外的氨基酸取代。
因此在一个实施方案中，当与如在WO 2013/126006中公开的[BM]相比时，所述[BM]携带至少一个另外的氨基酸取代，例如在位置17。因此，所述[BM]是选自以下的多肽：
(a)包含氨基酸序列
EX9X10X11AX13X14EIDX17X18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35的多肽；
其中彼此独立地；
X9选自H、Q、S、T和V；
X10选自I、L、M和V；
X11选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T和Y；
X13选自N和W；
X14选自A、D、E、H、N、Q、R、S和T；
X17选自D和E；
X18选自A、E、G、H、K、L、Q、R、S、T和Y；
X23选自N和T；
X24选自I、L和V；
X25选自A、D、E、H、K、N、Q、R、S和T；
X28选自I、L和V；
X32选自A、D、E、G、H、N、S和T；
X33选自K和S；
X35选自A、D、E、H、N、Q、S、T和Y；和
(b)与(a)的多肽具有至少85％氨基酸序列同一性的多肽。
在优选的实施方案中，C5结合基序[BM]本质上如在WO 2013/126006公开的。所述[BM]相应地是选自以下的多肽：
(a)包含氨基酸序列
EX9X10X11AX13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35的多肽；
其中彼此独立地；
X9选自H、Q、S、T和V；
X10选自I、L、M和V；
X11选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T和Y；
X13选自N和W；
X14选自A、D、E、H、N、Q、R、S和T；
X18选自A、E、G、H、K、L、Q、R、S、T和Y；
X23选自N和T；
X24选自I、L和V；
X25选自A、D、E、H、K、N、Q、R、S和T；
X28选自I、L和V；
X32选自D、E、G、H、N、S和T；
X33选自K和S；
X35选自A、D、E、H、N、Q、S、T和Y；和
(b)与(a)的多肽具有至少85％氨基酸序列同一性的多肽。
在另一优选方面，[BM]包含选自由在SEQ ID NO:1-248中位置1-28组成的组的氨基酸序列或由选自由在SEQ ID NO:1-248中位置1-28组成的组的氨基酸序列组成。更优选的，[BM]包含在SEQ ID NO:1中位置1-28所示的氨基酸序列或由在SEQ ID NO:1中位置1-28所示的氨基酸序列组成。
在另一方面，根据本发明的C5结合多肽选自：
(a)包含氨基酸序列
AEAKYAKEX9X10X11AX13X14EIX17X18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP的多肽；
其中彼此独立地，
X9选自H、Q、S、T和V；
X10选自I、L、M和V；
X11选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T和Y；
X13选自N和W；
X14选自A、D、E、H、N、Q、R、S和T；
X17选自D和E；
X18选自A、E、G、H、K、L、Q、R、S、T和Y；
X23选自N和T；
X24选自I、L和V；
X25选自A、D、E、H、K、N、Q、R、S和T；
X28选自I、L和V；
X32选自A、D、E、G、H、N、S和T；
X33选自K和S；
X35选自A、D、E、H、N、Q、S、T和Y；
[L2]选自DDPS和RQPE；
X42选自A和S；
X43选自N和E；
X46选自A、S和C；
X52选自E、N和S；
X53选自D、E和S，条件是当X52是N时，X53不是D；
并且
X54选自A和S；和
(b)与(a)的多肽具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽，条件是当X52是N时，X53不是D。
在优选的实施方案中，根据本发明的C5结合多肽选自：
(a)包含氨基酸序列
AEAKYAKEX9X10X11AX13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP的多肽；
其中彼此独立地；
X9选自H、Q、S、T和V；
X10选自I、L、M和V；
X11选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T和Y；
X13选自N和W；
X14选自A、D、E、H、N、Q、R、S和T；
X18选自A、E、G、H、K、L、Q、R、S、T和Y；
X23选自N和T；
X24选自I、L和V；
X25选自A、D、E、H、K、N、Q、R、S和T；
X28选自I、L和V；
X32选自D、E、G、H、N、S和T；
X33选自K和S；
X35选自A、D、E、H、N、Q、S、T和Y；
[L2]选自DDPS和RQPE；
X42选自A和S；
X43选自N和E；
X46选自A、S和C；
X52选自E、N和S；
X53选自D、E和S，条件是当X52是N时，X53不是D；
并且
X54选自A和S；和
(b)与(a)的多肽具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽，条件是当X52是N时，X53不是D。
在本发明的优选形式中，满足下列18个，任选地19个，条件中的至少一个：
X9是V，
X10是L，
X11是E，
X13是W，
X14是D，
任选地X17是D，
X18是R，
X23是T，
X24是I，
X25是E，
X28是L，
X32是N，
X33是K，
X35是D，
[L2]是DDPS，
X42是S，
X43是E，
X46是S，
X54是S。
更优选的是，满足上述条件中的至少二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八或十九个。
在一个实施方案中，X52和X53独立地选自E和S。优选的是，(a)X52是S并且X53是E，或(b)X52是E并且X53是S。
在一个实施方案中，X52是S并且X53是D。
在另一实施方案中，X52是N并且X53是E。
在另一方面，根据本发明的多肽包含SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:265、SEQ ID NO:266或SEQ ID NO:267所示的氨基酸序列。
在另一方面，提供能够结合C5的化合物，所述化合物包含：
a.至少一个如上面定义的C5结合多肽；
b.链球菌蛋白G的至少一个白蛋白结合结构域，或其衍生物；和
c.任选地，至少一个连接部分，所述连接部分用于连接所述至少一个白蛋白结合结构域或其衍生物与所述至少一个C5结合多肽的C末端或N末端。
优选地，所述白蛋白结合结构域包含如SEQ ID NO:250所示的氨基酸序列。
优选地，所述连接部分是包含氨基酸序列KVX60GS的肽，其中X60选自D、E和S。当X60是D时，优选的化合物包含SEQ ID NO:253所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:253所示的氨基酸序列组成。当X60是E时，优选的化合物包含SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:263、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:269或SEQ ID NO:270所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:263、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:269或SEQ ID NO:270所示的氨基酸序列组成。当X60是A时，优选的化合物包含SEQ ID NO:262所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:262所示的氨基酸序列组成。在上述列出的C5结合化合物的氨基酸序列中，氨基酸残基1-57代表C5结合多肽的氨基酸序列，残基58-62代表接头的氨基酸序列，并且残基63-108代表白蛋白结合结构域的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述连接基团不存在。
如上面讨论的，根据本发明的优选的C5结合多肽包括其中X52和X53独立地选自E和S的那些多肽。特别地，根据本发明的化合物能够衍生自PSI0242(SEQ ID NO:249)但在位置52、53和60中的至少一个有修饰。例如，如图7和序列表所示，命名为PSI0378的优选化合物(SEQ ID NO:261)携带氨基酸取代N52S、D53E和D60E；命名为PSI0379的优选化合物(SEQ IDNO:262)携带氨基酸取代N52S、D53E和D60A；命名为PSI0381的优选化合物(SEQ ID NO:263)携带氨基酸取代N52E、D53S和D60E；和命名为PSI0383的优选化合物(SEQ ID NO:264)携带氨基酸取代N52S、D53E和D60E。另外，SEQ ID NO:264在环[L2]中也携带取代，即D36R、D37Q和S39E。而且，命名为PSI0403的优选化合物(SEQ ID NO:269)携带氨基酸取代D53E和D60E，并且命名为PSI0404的优选化合物(SEQ ID NO:270)携带氨基酸取代N52S和D60E。
如上面解释的，发明人惊奇地发现，在如WO 2013/126006描述的C5结合多肽的氨基酸序列中的某些位置的氨基酸取代可改善稳定性。这种取代改善C5结合化合物的稳定性，而生物活性诸如C5结合能力和体外溶血抑制被保留。本发明的C5结合化合物的稳定性测试证明，例如N52S(X52)和D53E(X53)(SEQ ID NO:253)中的每个单独地，以及去除D60(X60)(SEQ ID NO:259缺少连接部分)改善稳定性。取代N52S、D53E和D60E或D60A的组合进一步改善稳定性(SEQ ID NO:261和SEQ ID NO:262)。N52S和D60E(SEQ ID NO:270)与D53E和D60E(SEQ ID NO:269)的组合取代的每种已被类似地发现改善稳定性。这预示着，每种列出的氨基酸取代参与改善多肽的稳定性，并且因此这些取代的每种将提供相比于以前已知的C5结合多肽和化合物更加稳定的C5结合多肽和化合物。
然而，本领域技术人员将能够鉴定在52、53和60的至少一个位置、和/或在环[L2]中具有修饰，但也携带额外的修饰如取代、小缺失、插入或倒置，本质上仍然具有公开的生物活性和改善的稳定性的多肽和/或化合物。而且，根据本发明的C5结合多肽和/或化合物能够包含改善多肽的生产、纯化、体内或体外稳定化、偶联或检测的另外的C末端和/或N末端氨基酸。
在本发明的另一方面，提供能够结合C5的化合物，所述化合物包含：
a.至少一个C5结合多肽，所述多肽选自：
a-1.包含氨基酸序列
[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q的多肽
其中彼此独立地，
[BM]是C5结合基序；
[L2]选自DDPS和RQPE；
X42选自A和S；
X43选自N和E；
X46选自A、S和C；
X52选自E、N和S；
X53选自D、E和S；
X54选自A和S；和
a-2.与a-1.的多肽具有至少89％氨基酸序列同一性的多肽；
b.链球菌蛋白G的至少一个白蛋白结合结构域，或其衍生物；和
c.至少一个连接部分，所述连接部分用于连接所述至少一个白蛋白结合结构域或其衍生物与所述至少一个C5结合多肽的C末端或N末端，其中所述连接部分包含KVEGS或KVAGS或由KVEGS或KVAGS组成；或其中所述连接部分不存在。
已经发现，单独去除SEQ ID NO:249的D60或在位置60的氨基酸取代与以前已知的C5结合化合物相比，改善本发明的C5结合化合物的稳定性。优选地，连接部分是KVEGS(X60＝E)而X52X53可以是ND，且携带这种连接部分的优选化合物的例子是PSI0410(SEQ ID NO:268)。在另外的优选实施方案中，D60和整个连接部分不存在，并且这种化合物的一个例子是命名为PSI0369的优选化合物(SEQ ID NO:259)。
在上述方面的实施方案中，[BM]和白蛋白结合结构域如以上相关方面定义的。优选地，[L2]是DDPS。
在另一方面，提供能够结合C5的化合物，所述化合物包含：
a.至少一个C5结合多肽，所述多肽选自：
a-1.包含氨基酸序列
[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q的多肽
其中彼此独立地，
[BM]是C5结合基序；
[L2]是RQPE；
X42选自A和S；
X43选自N和E；
X46选自A、S和C；
X52选自E、N和S；
X53选自D、E和S；
X54选自A和S；和
a-2.与a-1.的多肽具有至少89％氨基酸序列同一性的多肽；
b.链球菌蛋白G的至少一个白蛋白结合结构域，或其衍生物；和
c.任选地，至少一个连接部分，所述连接部分用于连接所述至少一个白蛋白结合结构域或其衍生物与所述至少一个C5结合多肽的C末端或N末端。
已发现在环[L2]中特定的氨基酸取代与以前已知的C5结合化合物相比改善本发明的C5结合化合物(例如SEQ ID NO:252)的稳定性。在上述方面的实施方案中，所述[BM]和白蛋白结合结构域单独地如以上相关方面定义的。优选地，所述连接部分是包含氨基酸序列KVX60GS的肽，其中X60选自D、E和A。
本发明包括编码根据本发明的多肽的多核苷酸。本发明中还包括载体，诸如表达载体，所述载体包含编码根据本发明的多肽的多核苷酸。也包括包含此类载体的宿主细胞。
本发明包括如以上描述的C5结合多肽和化合物，所述C5结合多肽和化合物用于在治疗中使用。特别地，根据本发明的C5结合多肽和化合物在用于治疗和/或预防C5相关状况诸如炎性疾病；自身免疫性疾病；传染病；心血管疾病；神经退行性疾病；移植物损伤；眼病；肾病；肺病；血液病诸如阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)；变应性疾病和皮肤病的方法中是有用的。
在用于治疗或预防的方法中，所述C5结合多肽或化合物可优选地被静脉内、皮下、通过吸入、经鼻、口服、玻璃体内或局部施用。
实施例
实施例1：已知C5抑制物的稳定性测试
命名为PSI0242(SEQ ID NO:249)的C5结合化合物在25mM NaP/125mM NaCl pH7.0中配制，并且经过在37℃两周加速的稳定性研究。稳定性通过稳定性测试之后以SDS-PAGE和反相HPLC(RPC)进行新的变体的出现来测量。在两个分析中起始的样品和经过稳定性研究的样品被并行运行。对于SDS-PAGE，7.5μg蛋白被加载至每个孔。RPC在Agilent1100HPLC上运行，使用由水中0.1％三氟乙酸(TFA)组成的流动相A，并且使用由0.1％TFA/45％MeOH/45％异丙胺(IPA)/10％水组成的流动相B。
结果表明，在孵育期间形成新形式的蛋白，这些新的形式显现为SDS-PAGE中的条带(图1)和反相HPLC(RPC)色谱图中的新的峰(图2)。图2中，2周孵育后的主峰对应于原始的蛋白样品的57％。
SEQ ID NO:249中的位置1-60对应于多肽Z06175a，以前在WO 2013/126006中公开为SEQ ID NO:753。PSI0242(SEQ ID NO:249)本质上如在WO 2013/126006公开的产生。
实施例2：修饰的C5结合多肽和化合物的稳定性
修饰的C5结合多肽和化合物本质上如在WO 2013/126006中描述的合成和纯化。
简单地说，将编码C5结合Z变体的DNA大肠杆菌密码子优化并由GeneArt，GmbH合成。代表C5结合Z变体的合成的基因在大肠杆菌中被亚克隆和表达。
细胞内表达的Z变体使用传统的色谱方法被纯化。均化作用和澄清通过声处理，随后是离心和过滤而进行。阴离子交换色谱被用作捕获步骤。进一步的纯化通过疏水互作色谱获得。纯化在酸性条件下(pH 5.5)完成。提炼(polishing)和缓冲液交换通过分子筛层析完成。
纯化的蛋白在25mM NaP/125mM NaCl pH 7.0中配制，并经过在37℃2周加速的稳定性研究。稳定性通过测量稳定性测试之后以SDS-PAGE和反相HPLC(RPC)进行的新的变体的出现来测量。在两个分析中起始的样品和经过稳定性研究的样品被并行运行。对于SDS-PAGE，7.5μg蛋白被加载至每个孔。所得凝胶的实例显示在图3。
RPC在Agilent 1100HPLC上运行，使用由水中0.1％三氟乙酸(TFA)组成的流动相A，和由0.1％TFA/45％MeOH/45％异丙胺(IPA)/10％水组成的流动相B。对于SEQ ID NO:253，所得色谱图的实例显示在图4。
稳定性测试的结果总结在下面的表Ⅰ。
表Ⅰ
Figure BDA0000968783320000191
Figure BDA0000968783320000201
从表I可以推论，某些修饰的C5结合多肽或化合物当与PSI0242相比时具有改善的特性，诸如增加的稳定性。这类改善的C5结合多肽或化合物包括PSI0334(SEQ ID NO:253)、PSI0340(SEQ ID NO:258)、PSI0369(SEQ ID NO:259)、PSI0377(SEQ ID NO:260)、PSI0378(SEQ ID NO:261)、PSI0379(SEQ ID NO:262)、PSI0381(SEQ ID NO:263)、PSI0383(SEQ IDNO:264)、PSI0400(SEQ ID NO:267)、PSI0410(SEQ ID NO:268)、PSI0403(SEQ ID NO:269)和PSI0404(SEQ ID NO:270)。在提及的变体中的六个(SEQ ID NO:253、260、261、262、264和267)中，在位置52-53的氨基酸残基已被从ND(参考PSI0242)取代为SE。在SEQ ID NO:263中，相应的取代为从ND至ES。在SEQ ID NO:269中，只有在位置53的氨基酸残基已被从D取代为E，而在SEQ ID NO:270中在位置52的氨基酸残基已被从N取代为S。
另外，PSI0378(SEQ ID NO:261)、PSI0381(SEQ ID NO:263)、PSI0383(SEQ ID NO:264)、PSI0410(SEQ ID NO:268)、PSI0403(SEQ ID NO:269)和PSI0404(SEQ ID NO:270)在位置60具有共同的从D到E的氨基酸残基取代。
在位置52或53和位置60的稳定性增强的取代的组合益处在图5可见，图5显示PSI0383(SEQ ID NO:264)的色谱图。PSI0379(SEQ ID NO:262)中在位置60的取代是从D到A。
PSI0369(SEQ ID NO:259)中连接部分(包括D60)被完全去除，产生更加稳定的C5结合化合物并且表明位置60对C5结合化合物稳定性的影响。
实施例3：修饰的化合物与人类C5的结合
人类血清白蛋白通过胺偶联被固定在Amine Reactive 2nd generation(AR2G)Dip and Read Biosensors(Pall Life sciences(ForteBio)Cat#18-5092)。在读取缓冲液(即用型HBS-EP缓冲液200ml，GE Healthcare#BR100188)中的PSI0242(SEQ ID NO:249；1μM)和C5结合化合物(1μM)被加载，每个被加载至带有HSA的单独的传感器上120秒，随后在读取缓冲液中基线记录60秒，然后在经读取缓冲液中浓度范围从0.79nM至25nM的人类C5(Quidel Cat#403)处理，各浓度之间一个再生循环和一个基线记录。传感器的再生条件是10mM甘氨酸、pH 2(三个30秒的脉冲和60秒的运行缓冲液)。每个光谱图针对包含白蛋白结合结构域(SEQ ID NO:250)但无C5结合能力的类似构建体减去参考。根据Langmuir 1:1模型使用ForteBio Analysis 7.1(Pall Life sciences(ForteBio)kinetics software)分析数据。
相对于PSI0242(SEQ ID NO:249)的与C5相互作用的KD显示在表Ⅱ。不同运行中PSI0242的KD从1-3nM变化。
表Ⅱ中的结果表明，根据本发明的C5结合化合物具有对人类C5的结合能力，所述结合能力与在WO 2013/126006公开的多肽PSI0242(SEQ ID NO:249)的结合能力类似。
表II
Figure BDA0000968783320000211
Figure BDA0000968783320000221
实施例4：化学合成的C5结合多肽的稳定性
化学合成的PSI0400(SEQ ID NO:267)订购自BACHEM AG。根据实施例2中的同样的方法，多肽的稳定性被测试。稳定性测试的结果显示在表Ⅲ。
表Ⅲ
SEQ ID NO: 名称 SDS-PAGE条带 RPC前峰 主峰(％总蛋白) RPC后峰
267 PSI0400 1 0 91 0
PSI0400的稳定性与实施例2中大肠杆菌中产生的多肽是相当的。
使用远UV圆二色性(CD)光谱，将PSI0400(SEQ ID NO:267)的折叠的完整性与根据实施例2的方法产生的重组C5结合多肽(PSI0257,SEQ ID NO:271)相比。
CD光谱被用J-720CD分光偏振计(Jasco，Japan)记录。样品用Pi缓冲液(5mM Na-K-PO4，pH 7.0)稀释至0.17mg/ml蛋白浓度。首先记录Pi缓冲液的CD光谱，然后记录每个样品的光谱，最后再次记录Pi缓冲液的光谱。当两种缓冲液的光谱重叠时，先记录的光谱被用作缓冲液光谱。缓冲液的光谱被使用卷积宽度为25的Savitzky-Golay程序平滑化。其余的光谱根据卷积宽度为15的同样的程序被平滑化。平滑化的缓冲液光谱然后被从每个其他平滑化的光谱减去。CDNN程序被用来估计蛋白质的二级含量并且所得估计值呈现在表Ⅳ。结果显示，在位置52和53两个氨基酸的取代和通过化学合成的多肽产生均不影响化学合成的多肽的二级结构含量。将二级结构含量的完整性与重组产生的PSI0257(SEQ ID NO:271)比较。
表Ⅳ
SEQ ID NO:271 SEQ ID NO:267
螺旋 63％ 69％
反平行 3％ 2％
平行 3％ 3％
β转角 13％ 12％
无规卷曲 13％ 11％
实施例5：修饰的化合物和多肽对人类C5的结合
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)分析C5结合化合物PSI0242(SEQ ID NO:249)、PSI0340(SEQ ID NO:258)、PSI0378(SEQ ID NO:261)和PSI0410(SEQ ID NO:268)和C5结合多肽PSI0400(SEQ ID NO:267)对人类C5的结合亲和力。人类C5(A403，QuidelCorporation)根据制造商的方案使用胺偶联化学反应被偶联至CM5传感器芯片(900RU)。通过注射10mM Na-乙酸缓冲液pH＝5(GE Healthcare)中浓度为7.5μg/mL的hC5完成偶联。参考细胞用同样的试剂处理但未注射人类C5。使用单周期动力学方法研究C5结合物对固定的hC5的结合，其中在同一个周期中五个浓度的样品，典型地HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.005％Surfactant P20,GE Healthcare)中25、12.5、6.25、3.12和1.56nM，在25℃以30μL/min的流速被依次注射，注射之间无再生。参考细胞的数据被减去以补偿大量折光率的变化。在大多数情况下，也包括HBS-EP的注射作为对照，所以传感图是双白的。表面在HBS-EP缓冲液中再生。使用Biacore T200Evaluation软件版本1.0的Langmuir 1:1分析物模型从传感图计算动力学常数。所得的相互作用的KD值在表Ⅴ中被制成表格。
表Ⅴ
Figure BDA0000968783320000231
Figure BDA0000968783320000241
增强稳定性的氨基酸取代对于分子结合至C5的能力不是有害的，因此不影响它们的生物活性。
实施例6：抑制溶血
对于研究经典补体途径功能和C5结合化合物PSI0378(SEQ ID NO:261)和PSI0410(SEQ ID NO:268)、和C5结合多肽PSI0400(SEQ ID NO:267)对其的抑制，绵羊红细胞制备自Alsever's溶液(Swedish National Veterinary Institute)中新鲜的绵羊全血，并且此后用兔抗绵羊红细胞抗血清(Sigma)处理以成为抗体敏化的绵羊红细胞(EA)。整个过程在无菌状况下进行。所有其他试剂来自商业来源。
体外分析在96孔U形微量滴定板中通过连续添加测试蛋白、补体血清和EA悬浮液运行。在每孔总反应体积为50μL和在pH 7.3-7.4中，所有试剂的最终浓度是：0.15mMCaCl2；0.5mM MgCl2；3mM NaN3；138mM NaCl；0.1％明胶；1.8mM巴比妥钠；3.1mM巴比妥酸；5百万EA；适当稀释的补体蛋白C5血清，和所需浓度的C5结合化合物或多肽。
在加入EA悬浮液启动反应之前，C5结合化合物和多肽在冰上用上面描述的补体血清预先孵育20min。溶血反应被容许在37℃搅动进行45min，然后任选地通过加入100μL冰冷的含有0.02％Tween 20的盐水被终止。细胞被离心至底部，上面部分相当于100μL上清液，被转移至透明的具有半区域和平底孔的微孔板。在415nm波长使用微量滴定板读数仪以光密度分析反应结果。
在所有测试情况下，对照样品(PSI0242，SEQ ID NO:249)和媒介物被包括在每个板内分别用来定义未被抑制的和完全抑制的反应的值。这些值被用来计算在任意给定样品浓度补体溶血抑制的百分比。测试的C5结合化合物和多肽的抑制效价(IC 50-值)被定义为在加入C5耗尽血清的受控浓度的人类C5存在下，进行同样的分析。对于高效力的抑制物(低纳摩尔到亚纳摩尔)，反应混合物的最终C5浓度被控制在0.1nM，其任选地通过使用C5耗尽或缺失血清被确立。结果显示在下面的表Ⅵ中。
表Ⅵ
SEQ ID NO: 名称 效价(％) IC 50(nM)
249 PSI0242 100 0.47
261 PSI0378 83 0.58
267 PSI0400 - 4
268 PSI0410 107 0.49
溶血分析结果显示，改善的C5结合化合物SEQ ID NO:261和268与参考化合物相当。C5结合多肽SEQ ID NO:267在上述分析中是有功能的，但因其不含有白蛋白结合结构域，结果不能直接与参考化合物比较。
实施例7：结合至人类白蛋白
为了评定C5结合化合物对白蛋白的结合亲和力，使用人类白蛋白ELISA，该人类白蛋白ELISA使用的重组人类白蛋白(包被)和市售的抗体(一抗和检测)分别购买自Novozymes、Affibody AB和DakoCytomation。从PSI0242(SEQ ID NO:267)制备的、包含C5结合多肽和链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域的方法标准，被用于样品定量。96孔微量滴定板被用重组人类血清覆盖表面。该板然后用含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)洗涤并用含1％酪蛋白的PBS封闭1-2小时。经过板洗涤后，标准、方法对照、样品对照和测试样品被加入板中。孵育2小时后，未结合的材料通过洗涤被去掉。山羊
Figure BDA0000968783320000252
IgG(Affibody AB,cat no.20.1000.01.0005)被加入至孔，并且板被孵育1.5小时以容许结合至结合的C5结合化合物。洗涤之后，兔抗山羊IgG HRP被容许结合至山羊抗体1小时。最终洗涤之后，结合的HRP的量通过加入被酶转化为蓝色产物的TMB底物来检测。30分钟后加入1M盐酸终止反应并且孔内容物的颜色从蓝色变为黄色。使用650nm的吸光度作为参考波长，用分光光度计测定450nm的吸光度。颜色的强度与PSI0242(SEQ ID NO:249)的量成比例，并且样品的浓度从标准曲线确定。
包含链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域的C5结合化合物证明能够结合至人类白蛋白，并且数据呈现在下面的表Ⅶ。
表Ⅶ
Figure BDA0000968783320000251
Figure BDA0000968783320000261
从分析得到的结果显示，研究的两种稳定性改善的C5结合化合物均保持它们结合人类白蛋白的能力。
实施例8：C5结合多肽/化合物的3个月稳定性测试
对在37℃2周稳定性测试(实施例2)中与PSI0242相比显示出改善的稳定性的C5结合多肽/化合物进行在37℃更长的3个月的稳定性测试。稳定性测试的设置同实施例2描述的，并且稳定性的评价通过用反相HPLC(RPC)测量色谱图主峰占总蛋白含量的百分比来进行，所述RPC方法的完成同在实施例2描述的。来自于实施例2的两周的数据被包括在下面的表Ⅷ中以使解释更容易。
表Ⅷ
Figure BDA0000968783320000262
在位置52、53氨基酸从ND取代为SE和在位置60从D更换为E或A的C5结合化合物(SEQ ID NO:261、264和262)与PSI0242相比，在37℃3个月之后比相同条件下2周后的PSI0242(SEQ ID NO:249)具有更高比例的起始形式的蛋白。其他的化合物也显示增加的稳定性。
实施例9：类似修饰多肽的稳定性
以前已知的起源于蛋白Z的(
Figure BDA0000968783320000263
等J Biotechnol 2007,128:162-183)具有对除了C5以外其他靶分子结合亲和力的多肽变体在氨基酸序列的特定位置被类似地修饰以便改善稳定性。对人类表皮生长因子受体2(HER2)、血小板源生长因子受体β(PDGF-Rβ)、新生儿Fc受体(FcRn)和碳酸酐酶Ⅸ(CAⅨ)具有结合亲和力的原始多肽变体的选择和生产公开在例如WO 2009/080810、WO 2009/077175、PCT/EP2014/055299和WO 2014/096163中。通过在氨基酸序列的选定位置定点诱变生产稳定性改善的多肽变体。在靶向HER2的多肽变体Z02891(SEQ ID NO:272)、靶向PDGF-Rβ的Z15805(SEQ ID NO:275)、靶向FcRn的Z10103(SEQ ID NO:278)和靶向CAⅨ的Z09782(SEQ ID NO:281)中，稳定性改善的氨基酸取代在下面的表Ⅸ中详细说明。这些稳定性改善的多肽变体与本发明的C5结合多肽不同，例如在于它们具有对HER2、PDGF-Rβ、FcRn和CAⅨ具有结合亲和力的结合基序[BM]。
所有的变体被克隆以带有N-末端6x组氨酸标签(His6)，并且得到的MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]格式的构建体编码多肽。使用编码期望的氨基酸取代的重叠寡核苷酸引物对并通过应用确定的分子生物学技术，将突变引入多肽变体的质粒。正确的质粒序列通过DNA测序被核实。
用含有编码原始和修饰的多肽的基因片段的质粒转化大肠杆菌(菌株T7E2)细胞(GeneBridge)。细胞在补加了50μg/ml卡那霉素的TSB-YE培养基中37℃培养，蛋白表达随后通过加入IPTG被诱导。使用
Figure BDA0000968783320000272
匀质器(Nordic Biolabs)破碎颗粒状细胞，通过离心去掉细胞碎片。根据制造商说明使用His GraviTrapTM柱(GE Healthcare)通过固定的金属离子亲和层析(IMAC)纯化含有作为His6标记蛋白的多肽变体的每份上清液。使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)，将纯化的多肽变体对磷酸盐缓冲盐水(PBS；1.47mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.68mM KCl,pH 7.4)进行缓冲液交换。每个多肽正确的身份通过SDS-PAGE和HPLC-MS核实。
表Ⅸ
Figure BDA0000968783320000271
除了取代N52和D53中一个(SEQ ID NO:284-287)或两个(SEQ ID NO:273-274、276-277、279-280、282-283)，取代也进行在相应于环[L2]的位置。因此，在SEQ ID NO:274、277、280、283、285和287的多肽变体中，[L2]是RQPE。
为了进行稳定性测试，将在PBS pH 7.4中配制的，被稀释至1mg/ml和200μl等分试样的多肽变体在37℃孵育2周。稳定性测试之前和之后收集的样品通过SDS-PAGE分析，使用10％Bis-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen)并且加载5μg蛋白至每个孔。所得的考马斯蓝染色的凝胶显示在图6。通过在升高的温度孵育之后新变体的出现和比较突变的变体与各自原始的多肽评价稳定性。
从在原始多肽样品观察到的紧靠主带之上的第二条带在具有D53E和/或N52S取代的修饰的多肽的样品中不可见的意义上说，如表Ⅸ中概述的具有修饰的所有多肽变体显示相比于各自原始的多肽改善的稳定性，见图6。具有取代D53E和/或N52S联合取代D36R、D37Q和S39E的多肽在SDS-PAGE凝胶上显示类似的特征。单独的取代D53E或与取代D36R、D37Q和S39E联合似乎减少另外确认的在SDS-PAGE凝胶上观察为第二条带的种类的量，但不能完全防止这种类的形成。
此外，测试修饰的多肽变体的结合能力。经修饰之后所有多肽变体保持它们对其靶的结合亲和性(结果未显示)。
上文呈现的多肽变体具有对除了C5之外其他靶分子的结合亲和力结果与本发明的C5结合多肽和化合物呈现的(见例如实施例2和4)很好地对应。因此，如本文描述的特定氨基酸修饰表现为具有稳定效果，而与[BM]的氨基酸序列无关。如本文描述的氨基酸修饰或取代因此被认为改善如在本文和WO 2013/126006描述的所有C5结合多肽和化合物的稳定性。
Figure IDA0000968783380000011
Figure IDA0000968783380000021
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Claims (27)

1.能够结合人类补体组分5(C5)的多肽，所述多肽包含氨基酸序列[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
其中彼此独立地，
[BM]是C5结合基序，所述C5结合基序包含氨基酸序列EX9X10X11A X13X14EIDX18LPNLX23X2 4X25QWX28AFIX32X33LX35；
其中彼此独立地，
X9选自H、Q、S、T和V；
X10选自I、L、M和V；
X11选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T和Y；
X13选自N和W；
X14选自A、D、E、H、N、Q、R、S和T；
X18选自A、E、G、H、K、L、Q、R、S、T和Y；
X23选自N和T；
X24选自I、L和V；
X25选自A、D、E、H、K、N、Q、R、S和T；
X28选自I、L和V；
X32选自D、E、G、H、N、S和T；
X33选自K和S；
X35选自A、D、E、H、N、Q、S、T和Y；
[L2]选自DDPS和RQPE；
X42选自A和S；
X43选自N和E；
X46选自A、S和C；
X52选自E、N和S；
X53选自D、E和S，条件是当X52是N时，X53不是D；
并且
X54选自A和S。
2.根据权利要求1所述的多肽，所述多肽包含氨基酸序列
AEAKYAK-[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP
其中彼此独立地，
[BM]、[L2]、X42、X43、X46、X52、X53和X54如权利要求1中定义。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中X52和X53独立地选自E和S。
4.根据权利要求3所述的多肽，其中(a)X52是S并且X53是E，或(b)X52是E并且X53是S。
5.根据权利要求1或2所述的多肽，其中X52是S并且X53是D。
6.根据权利要求1或2所述的多肽，其中X52是N并且X53是E。
7.根据权利要求1所述的多肽，所述多肽包含氨基酸序列
AEAKYAKEX9X10X11AX13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP；
其中彼此独立地，
X9选自H、Q、S、T和V；
X10选自I、L、M和V；
X11选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T和Y；
X13选自N和W；
X14选自A、D、E、H、N、Q、R、S和T；
X18选自A、E、G、H、K、L、Q、R、S、T和Y；
X23选自N和T；
X24选自I、L和V；
X25选自A、D、E、H、K、N、Q、R、S和T；
X28选自I、L和V；
X32选自D、E、G、H、N、S和T；
X33选自K和S；
X35选自A、D、E、H、N、Q、S、T和Y；
[L2]选自DDPS和RQPE；
X42选自A和S；
X43选自N和E；
X46选自A、S和C；
X52选自E、N和S；
X53选自D、E和S，条件是当X52是N时，X53不是D；
并且
X54选自A和S。
8.根据权利要求1、2、4或7所述的多肽，其中满足下列条件中的至少一个：
X9是V，
X10是L，
X11是E，
X13是W，
X14是D，
X18是R，
X23是T，
X24是I，
X25是E，
X28是L，
X32是N，
X33是K，
X35是D，
[L2]是DDPS，
X42是S，
X43是E，
X46是S，
X54是S。
9.根据权利要求1、2、4和7中任一项所述的多肽，其中[BM]包含选自由SEQ ID NO:1-248中位置1-28组成的组的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的多肽，其中[BM]包含SEQ ID NO:1中位置1-28所示的氨基酸序列。
11.根据权利要求1、2、4、7和10中任一项所述的多肽，所述多肽选自包含SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:265、SEQ ID NO:266或SEQ ID NO:267所示的氨基酸序列的多肽。
12.能够结合C5的化合物，所述化合物包含：
a.至少一种根据前述权利要求中任一项所述的多肽；
b.链球菌蛋白G的至少一个白蛋白结合结构域；和
c.任选地，至少一个连接部分，所述连接部分用于连接所述至少一个白蛋白结合结构域与所述至少一种多肽的C末端或N末端。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中所述白蛋白结合结构域包含SEQ ID NO:250所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求12或13所述的化合物，其中所述连接部分是包含氨基酸序列KVX60GS的多肽，其中X60选自D、E和A。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中X60是D。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中所述化合物是包含SEQ ID NO:253所示氨基酸序列的多肽。
17.根据权利要求14所述的化合物，其中X60是E。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中所述化合物是包含SEQ ID NO:261、SEQ IDNO:263、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:269或SEQ ID NO:270所示氨基酸序列的多肽。
19.根据权利要求14所述的化合物，其中X60是A。
20.根据权利要求19所述的化合物，其中所述化合物是包含SEQ ID NO:262所示氨基酸序列的多肽。
21.根据权利要求14所述的化合物，其中所述连接部分不存在。
22.能够结合C5的化合物，所述化合物包含：
a.至少一个C5结合多肽，所述多肽包含氨基酸序列
[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
其中彼此独立地，
[BM]是C5结合基序，所述C5结合基序包含氨基酸序列EX9X10X11A X13X14EIDX18LPNLX23X2 4X25QWX28AFIX32X33LX35；
其中彼此独立地，
X9选自H、Q、S、T和V；
X10选自I、L、M和V；
X11选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T和Y；
X13选自N和W；
X14选自A、D、E、H、N、Q、R、S和T；
X18选自A、E、G、H、K、L、Q、R、S、T和Y；
X23选自N和T；
X24选自I、L和V；
X25选自A、D、E、H、K、N、Q、R、S和T；
X28选自I、L和V；
X32选自D、E、G、H、N、S和T；
X33选自K和S；
X35选自A、D、E、H、N、Q、S、T和Y；
[L2]选自DDPS和RQPE；
X42选自A和S；
X43选自N和E；
X46选自A、S和C；
X52选自E、N和S；
X53选自D、E和S；
X54选自A和S；
b.链球菌蛋白G的至少一个白蛋白结合结构域；和
c.至少一个连接部分，所述连接部分用于连接所述至少一个白蛋白结合结构域与所述至少一个C5结合多肽的C末端或N末端；其中所述连接部分包含KVEGS或KVAGS；或其中所述连接部分不存在。
23.能够结合C5的化合物，所述化合物包含：
a.至少一个C5结合多肽，所述多肽包含氨基酸序列
[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
其中彼此独立地，
[BM]是C5结合基序，所述C5结合基序包含氨基酸序列EX9X10X11A X13X14EIDX18LPNLX23X2 4X25QWX28AFIX32X33LX35；
其中彼此独立地，
X9选自H、Q、S、T和V；
X10选自I、L、M和V；
X11选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T和Y；
X13选自N和W；
X14选自A、D、E、H、N、Q、R、S和T；
X18选自A、E、G、H、K、L、Q、R、S、T和Y；
X23选自N和T；
X24选自I、L和V；
X25选自A、D、E、H、K、N、Q、R、S和T；
X28选自I、L和V；
X32选自D、E、G、H、N、S和T；
X33选自K和S；
X35选自A、D、E、H、N、Q、S、T和Y；
[L2]是RQPE；
X42选自A和S；
X43选自N和E；
X46选自A、S和C；
X52选自E、N和S；
X53选自D、E和S；
X54选自A和S；
b.链球菌蛋白G的至少一个白蛋白结合结构域；和
c.任选地，至少一个连接部分，所述连接部分用于连接所述至少一个白蛋白结合结构域与所述至少一个C5结合多肽的C末端或N末端。
24.根据权利要求1-11中任一项所述的多肽或根据权利要求12-23中任一项所述的化合物在制备用于治疗和/或预防C5相关状况的药物中的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述C5相关状况是选自炎性疾病；自身免疫性疾病；传染病；心血管疾病；神经退行性疾病；移植物损伤；眼病；肾病；肺病；血液病；变态反应病和皮肤病的状况。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述血液病是阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的用途，其中所述药物被静脉内、皮下、通过吸入、经鼻、口服、玻璃体内或局部施用。
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