KR20200033807A - 전압-게이팅된 칼슘 채널 보조 서브유닛 α2δ 및 이의 용도 - Google Patents
전압-게이팅된 칼슘 채널 보조 서브유닛 α2δ 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 전압-게이티드 칼슘 채널 보조 서브유닛 α2δ-1, 예를 들어, 간질 및 신경병성 통증에서 치료 효과를 발휘하는 것으로 알려진 가바펜티노이드 화합물의 표적/수용체에 관한 것이다. 가바펜티노이드는 α2δ-1 의 N-말단에 위치한 RRR 모티프 내에서 결합 아르기닌(R)을 통해 이의 작용을 발휘하는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 VGCC_a2 도메인 내에 위치하고 α2δ-1 의 IKAK 아미노산 서열 내에 위치하는 가바펜티노이드에 대한 신규한 결합 부위를 기재하고 있다. 이러한 새롭게 확인된 아미노산 결합 부위는 신경병성 통증에서 치료 특성을 갖는 신규 화합물의 확인 및 특성 및 α2δ-1 이 포함된 다른 질환 및 조건에 유용하다.
Description
본 발명은 전압-게이팅된 칼슘 채널(vcc)에 관한 것으로서, 특히 배타적이지는 않지만, 전압-게이팅된 칼슘 채널의 α2δ-1 서브유닛 내에 위치하는 신규한 펩티드에 관한 것이고, 이는 결합 부위, 예를 들어 가바펜티노이드를 형성한다. 본 발명은 또한 단리된 펩티드를 포함하는 시험 시스템, 및 펩티드에 결합하는 제제를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 펩티드를 제조하는 방법, 상기 펩티드를 사용하여 확인된 제제, 상기 단리된 펩티드에 결합할 수 있는 항체, 상기 펩티드의 돌연변이된 버전을 발현하는 동물 및 이들의 용도를 포함한다.
전압-게이팅된 칼슘(CaV) 채널은 신경전달 방출 및 근육 수축을 포함하는, 여기 가능한 세포에서 많은 핵심 기능을 위한 필수 성분이다. α1 서브유닛은 칼슘 채널 차단제에 결합하도록 발견되고, 기공-형성 채널 서브유닛인 것으로 확인되었다. 그 후, β 및 α2δ 서브유닛은 보조 또는 액세서리 서브유닛이라고 명명된다[1].
4개의 α2δ 서브유닛 유전자가 확인되었다. Cana2D1은 골격 근육에서 최초로 확인된 α2δ-1을 암호화한다. 이는 심장 및 평활근 및 두뇌 내에 존재한다. α2δ-2 및 α2δ-3을 인코딩하는 cana2D2 및 cana2D3 유전자는 뉴런에서, 그리고 일부 다른 조직에서 차별적으로 발현된다[2]. Ctna2D4는 주로 비-뉴런인 발현을 나타낸다[3].
α2δ-1 서브유닛은 다수의 세포 부착 및 세포외 매트릭스 단백질(서열번호 1)에 결합하는데 관여하는 것으로 알려져 있는 폰 빌레브랜드 인자 A(VWF-a 또는 VWA) 도메인을 비롯한 특정 도메인을 포함한다. VWA 도메인은 그들의 금속 이온-의존 부착 부위(MIDAS) 모티프를 통해 단백질-단백질 상호작용에 관여한다. 또한, VWA 도메인의 하류에 위치하는 α2δ 서브유닛의 2개의 박테리아 화학감각적 또는 캐시 도메인이 존재한다[4].
VWA_N 및 VWF-A 도메인의 근사 위치, 2개의 박테리아 화학감각적 도메인(cahe1 및 cahe2) 및 상기 전압-게이티드 칼슘 채널 Α2 도메인(VGCC_Α2)이 도 1 에 도시되어 있다.
α2δ 서브유닛 및 그들의 결합 리간드는 신경병성 통증, 간질[1,5,10] 및 보다 낮은 요로 증상(WO2004054560 A1)을 포함하는 다수의 질환 및 병태, 폐쇄성 폐 질환(WO2004054577 A1), 성 기능장애(US7432299 B2) 및 가와사키병(EP 2116 618 A1)에서 치료 표적으로서 고려된다.
또한, 녹아웃 마우스에서 α2δ-1 서브유닛의 표적화된 붕괴는 치명적이 아니고, 이러한 동물은 유의하게 감소된 L-형 Ca 전류 피크 전류 진폭을 나타내는 고-친화도 가바펜틴 결합 부위가 결여된다[9].
또한, α2δ-1 서브유닛은 암[16, WO201112266]에서의 치료 표적과 관련되어 있고, 시냅토발생[17, US201110104181 a1]의 변조에 관련되어 있다.
α2δ-1은 신경 손상(신경병성 통증)[1]과 관련된 만성 통증의 발달에서 중앙 역할을 하는 것으로 잘 확립되어 있다. 실험 말초 신경 손상은 손상된 감각적 뉴런(제3자 뉴런 및 Drg)에서 상승된 α2δ-1 mRNA 수준을 생성할 뿐만 아니라 DRGs 내 α2δ-1 단백질의 상응하는 증가 및 척추 코드를 포함한다[6,7].
진통에서 α2δ-1 서브유닛의 역할은 형질전환 동물(마우스) 모델을 사용하여 더욱 연구되었다. 형질전환 마우스에서 신경 조직에서의 α2δ-1의 과발현은 과대증 및 촉각 이질통의 손상-관련 신경병성 표현형을 나타내었다. 이는, 신경병성 통증 표현형의 개발에 관여하는 서브유닛으로서의 α2δ-1을 명확하게 확립한다[8]. 천연 α2δ-1_/_마우스는 기계적 및 냉간 민감도에 있어서의 마킹된 행동 결핍을 나타내었고, 보다 상세하게는 열결핍 임계치에서의 변화가 없는 것을 특징으로 한다. 보다 낮은 기계적 감도는 광범위 뉴런의 생체내 전기생리학적 반응에 의해 감소되었다. Cav2. 2 수준은 뇌 및 척추 코드 시냅토좀에서 α2δ-1-/-로부터 감소한다. 기계적 과민증을 경감시키기 위한 항-상피성 약물 프레가발린의 능력은 부분적인 뇌 결찰 신경병증 α2δ-1-/-마우스에서 손실된다. 그 후, α2δ-1은 신경병성 통증의 이 신경 손상 모델에서 기계적 과민증의 신속한 발달에 필수적인 것으로 밝혀졌다[9,13].
프레가발린(PGB)은 진통제, 항경련제 및 항불안제 활성을 갖는 합성 분지쇄의 γ-아미노산(GABA)이고, 상기 전압-게이팅된 칼슘 채널 서브유닛 α2δ-1 및 α2δ-2에 대한 강력하고 선택적인 결합을 나타낸다[10, WO2008004067 a2].
본 발명은 또한 신경병성 통증(즉, 진통 활성)에 치료적 용도를 갖는 항진균성 약물이다[10]. 두 화합물은 RRR 모티프에 위치한 아미노산 상에서, α2δ-1 및 α2δ-2 결합한다[11, 12]. 본 발명은 위치 217(즉, 성숙한 α2δ-1 단백질의 단백질 서열에 상응하는 서열번호 1의 위치 241)에서 아르기닌(R)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 종래 기술에 나타낸 바와 같이, 그들의 진통 효과에 대해 α2δ-1 수용체 상의 가바펜티노이드의 결합이 요구된다[1]. 프레가발린의 결합은 23 nM의 IC50을 나타내었고, NVA1309의 결합은 인간 전압-게이팅된 칼슘 채널 서브유닛 α2δ-1을 과발현하는 재조합 막을 사용하여 2.1nM 의 IC50을 나타내었다(PCT/EP2014/077937). α2δ-1의 RRR 모티프의 돌연변이(RRA에 대해 돌연변이된 RRR)를 갖는 노크-인 돌연변이 마우스에서, RRA에 대해 돌연변이된 α2δ-1의 RRR 모티프에 의해 유발되는 만성 통증을 완화하는데 더 이상 유효하지 않았다[13, WO2004089071A1]. 이들 데이터는 신경병성 통증에서의 가바펜티노이드 약물의 치료 효과를 담당하는 단백질 표적으로서 α2δ-1을 추가로 확인하였다.
따라서, 가바펜티노이드가 다양한 조건을 치료하는 데 효과적이라는 것이 잘 알려져 있다. 그러나, 임상적으로 사용될 수 있는 매우 많은 가바펜티노이드가 확인되거나 개발되었다.
따라서, α2δ-1 서브유닛에 결합함으로써 전압-게이팅된 칼슘 채널의 기능을 변경하는 제제를 확인하는 새로운 방법에 대한 필요성이 존재한다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에 따르면, 단편으로 이루어진 단리된 α2δ-1 펩티드가 제공된다. 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
상기 공지된 RRR 모티프와 같이, 가바펜티노이드, 가바펜틴 및 프레가발린을 결합하는 것은 담당하는 공지의 RRR 모티프를 포함한다, 제1 측면에 따른 펩티드는 전압-게이팅된 칼슘 채널의 α2δ-1 서브유닛의 VGCC_a2 도메인으로부터 유도된다. RRR 모티프는 제1 양태에 따른 펩티드와 구별되며; 원위치에서, RRR 모티프는 성숙한 α2δ-1 단백질의 VWA 도메인의 상류에 위치한다(도 1 및 2 참조). 따라서, 제1 양태에 따른 펩티드에 상응하는 α2δ-1 서브유닛의 영역은 RRR 모티프(예컨대, 실시예 참조)와 독립적으로 특정 피티노이드에 의해 결합될 수 있다. 따라서, 제1 측면에 따른 펩티드는 α2δ-1 서브유닛에 결합하는 새로운 제제를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이들 제제는 티노이노이드 또는 비-가바펜티노이드일 수 있고, 이들은 전압-게이팅된 칼슘 채널의 α2δ-1 서브유닛이 역할을 하는 조건을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
α2δ-1 서브유닛은 전압-게이팅된 칼슘 채널들의 보조 또는 액세서리 서브유닛이다. 전압-게이팅된 칼슘 채널들의 α1 서브유닛과 달리, 이는 보조 또는 액세서리 서브유닛이라고 지칭된다, 이러한 전압-게이트 채널의 기공-형성 서브유닛 중 하나가 아니다. 한 구체예에서, 인간 α2δ-1 서브유닛은 본 명세서에서 서열번호 1에 제시된 서열을 포함한다:
제1 측면에 따른 단리된 α2δ-1 펩티드는, 본 명세서에서 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열의 단편을 다음과 같이 포함할 수 있다:
서열번호 5의 아미노산 서열은 서열번호 1에 따라 α2δ-1 서브유닛의 단편이다.
또 다른 구체예에서, 단편은 본 명세서에서 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다:
서열번호 5의 아미노산 서열은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 서열번호 5의 아미노산 서열은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이를 포함하지 않는다. 서열번호 20 의 산 서열을 포함하며, 또한 N-말단 및 C-말단 아미노산을 추가로 포함한다. 따라서, 다른 구체예에서, 단편은 본 명세서에서 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산을 추가로 포함하고, 서열번호 5 내에 배치된 서열번호 20과 동일한 단편의 N-말단 및/또는 C-말단에 위치하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 아미노산에 상응한다.
또 다른 구체예에서, 단편은 본 명세서에서 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다:
또 다른 구체예에서, 단편은 본 명세서에서 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다:
또 다른 구체예에서, 단편은 본 명세서에서 서열번호 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다:
상기 α2δ-1 펩티드는 서열번호 20 내지 23 중 어느 하나에 정의된 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 서열번호 20 내지 서열번호 23의 처음 4개의 아미노산은 돌연변이되거나 변경되거나 치환되지 않는다. 가장 바람직하게는, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 또는 서열번호 23의 제4 아미노산(즉, K(리신))은 돌연변이되거나 변경되거나 치환되지 않는다.
RRR 모티프는 가바펜티노이드, 가바펜틴 및 프레가발린을 위한 공지된 결합 부위이다. 따라서, 다른 구체예에서, 제1 측면에 따른 펩티드는 RRR 모티프를 포함할 수 있거나, RRR 모티프를 포함하는 별도의 펩티드에 결합할 수 있다.
제2 측면에 따르면, 결합하거나 결합할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다. 상기 제1 측면에 따른 펩티드 또는 하기 양태 중 어느 하나에 언급된 펩티드와 상호작용하는 것을 특징으로 한다.
항체는 상기 제1 측면에 따른 단리된 α2δ-1 펩티드에 대한 면역특이성을 갖는 전체 항체(즉, 면역글로불린)일 수 있거나, 하기 양태 중 어느 하나에 언급된 펩티드, 바람직하게는 상기 항체는 세포외 도메인 또는 이의 기능적 단편이다. 이러한 항체 단편은 상응하는 전장 항체의 하나 이상의 항원 결합 영역을 보유한다. 항체 또는 이의 단편은 hucor 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 항체 또는 이의 기능적 단편은 인간 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편은 VL 단편, VH 단편, Fd 단편, Fd 단편일 수 있다, Fab 단편, Fab'단편 또는 F(ab')2 단편을 포함한다. 항체는 단일쇄 Fv(scFv)또는 이중특이적 항체(BsAb)일 수 있다.
항체 또는 기능적 단편은 1가, 2가 또는 다가 일 수 있다.
1가 항체는 중성을 포함하는 이량체(HL)이고, (H) 쇄를 갖는 디설파이드 브리지(disulfide bridge)에 의해 결합된 쇄(chain)을 포함한다. 하나 이상의 다이설파이드 브릿지에 의해 결합된 2개의 이량체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 다가 항체는 또한 예를 들어 다중 이량체를 연결함으로써 제조될 수 있다. 항체 분자의 기본 구조는 2개의 동일한 경쇄로 구성되고, 비공유 결합 및 디설파이드 결합에 의해 연결될 수 있는 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 약 110 아미노산의 아미노-말단 가변 영역, 및 쇄의 나머지 부분에서 일정한 서열을 포함한다. 가변 영역은 몇몇 초가변 영역, 또는 상보성 결정 영역(cdr)을 포함한다. 상기 항체 분자의 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 항원, 즉 상기 제1 측면에 따른 펩티드에 대한 특이성을 결정하는 것을 특징으로 한다. 중쇄 및 경쇄의 cdr의 어느 한 측면은 프레임워크 영역이고, Cdr을 앵커하고 배향하는 아미노산의 비교적 보존된 서열이다. 항체 단편은 이중특이적 항체(BsAb) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 또는 인간화된 항체" 는 모노클로날 항체와 같은 항체를 의미할 수 있다, α2δ-1 펩티드에 대한 면역특이성을 나타내는 특정 인간 항체에 있어서 발견되는 것과 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 중쇄 CDR 과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 참조 서열에 비해 상당한 양의 서열 동일성을 나타낸다. 이러한 동일성은 본 발명을 나타내는 것으로 한정적으로 알려져 있거나 인식가능하다. 특정 인간 항체의 아미노산 서열. 실질적으로 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR 아미노산 서열은, 예를 들어, 아미노산의 미량 변형 또는 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 인간 항체는 α2δ-1 재조합 펩티드에 대해 선택적으로 결합하는 기능을 유지한다.
용어 "인간 모노클로날 항체"는 실질적으로 또는 전체적으로 인간 CDR 아미노산 서열을 갖는 단클론 항체를 포함할 수 있다, 예를 들어, 파아지 라이브러리, 림프구 또는 하이브리도마 세포에 의한 생산과 같은 재조합 방법에 관한 것이다.
항체는 재조합 항체가 될 수 있다. "재조합 인간 항체"라는 용어는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산된 인간 항체를 포함할 수 있다.
용어 "항원 결합 영역"은, 예를 들어, 표적 항원에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 항체의 영역을 의미할 수 있다, α2δ-1 펩티드, 또는 이의 에피토프를 포함한다. 결합 영역은 초가변 CDR 또는 이의 기능적 부분일 수 있다. CDR의 "기능적 부분"이라는 용어는 표적 항원에 대한 특이적 친화성을 나타내는 CDR 내의 서열을 의미할 수 있다. CDR의 기능적 부분은 α2δ-1 펩티드에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있다.
용어 "CDR"은 중쇄와 경쇄 가변 쇄에서 초가변 영역을 의미할 수 있다. 항체의 중쇄 및 경쇄 각각에 하나, 2개, 3개 이상의 Cdr이 존재할 수 있다. 보통, 함께 구성될 때, 항원-결합 부위, 즉 항원이 결합하거나 특이적으로 반응하는 3 차원 결합 부위를 형성하는 각 쇄에 적어도 3개의 cdr이 존재한다. 그러나, 일부 항체의 중쇄에 4개의 Cdr이 존재할 수 있다.
CDR의 정의는 또한 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 특정 CDR 또는 그의 기능적 부분을 포함하는 정확한 잔수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는, 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 주어진 특정 CDR을 포함하는 지를 일상적으로 결정할 수 있다.
항체의 "기능적 단편"은 기능적 활성을 보유하는 항체의 일부를 의미할 수 있다. 기능적 활성은, 예를 들어, 항원 결합 활성 또는 특이성일 수 있다. 기능적 활성은, 예를 들어, 항체 불변 영역에 의해 제공되는 효과기 함수일 수 있다. 용어 "기능적 단편"은 또한, 이를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체의 프로테아제 분해 또는 환원에 의해 생성된 단편 및 당업자에게 공지된 재조합 DNA 방법에 의해 제조된다. 인간 모노클로날 항체 기능적 단편은, 예를 들어, 개별 중쇄 또는 경쇄 및 이의 단편을 포함하고, VH 및 Fd와 같은 1가 단편; Fv, Fab 및 Fab'와 같은 1가 단편을 포함한다. F(ab')2; 단일쇄 Fv(scFv); 및 Fc 단편과 같은 2가 단편을 포함한다.
용어 "VL 단편"은 Cdr을 포함하는 경쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 모노클로날 항체의 경쇄 단편을 의미할 수 있다. VL 단편은 경쇄 불변 영역 서열을 더 포함할 수 있다.
용어 "VH 단편"은 Cdr을 포함하는 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 모노클로날 항체의 중쇄의 단편을 의미한다.
용어 "Fd 단편"은 제1 중쇄 불변 영역에 결합된 중쇄 가변 영역을 의미할 수 있다, "Fd 단편"은 경쇄를 포함하지 않으며, 중쇄의 제2 및 제 3 불변 영역을 포함하지 않는다.
용어 "Fv 단편"은 인간 모노클로날 항체의 1가 항원-결합 단편을 의미할 수 있고, 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하며, 상기 중쇄 및 경쇄의 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 예를 들어 cdr을 포함한다. 예를 들어, Fv 단편은 중쇄 및 경쇄 모두의 약 110 아미노산의 아미노 말단 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함한다.
용어 "Fab 단편"은 Fv 단편보다 큰 인간 모노클로날 항체의 1가 항원-결합 단편을 의미할 수 있다. 예를 들어, Fab 단편은 가변 영역, 및 중쇄 및 경쇄의 제1 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 따라서, Fab 단편은, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄의 약 0 내지 약 220의 아미노산 잔기를 추가로 포함한다.
용어 "Fab' 단편"은 Fab 단편보다 큰 인간 모노클로날 항체의 1가 항원-결합 단편을 의미할 수 있다. 예를 들어, Fab' 단편은 모든 경쇄를 포함한다, 중쇄의 가변 영역, 및 중쇄의 제1 및 제2 불변 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, Fab' 단편은 중쇄의 아미노산 잔기 220 내지 330의 일부 또는 전부를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "F(ab')2 단편"은 인간 모노클로날 항체의 2가 항원-결합 단편을 의미할 수 있다. F(ab))2 단편은, 예를 들어, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하고, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 제1 불변 영역의 전부 또는 일부를 더 포함할 수 있다.
용어 "단일쇄 Fv(scFv)"는 단쇄 링커 펩티드와 연결된 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합(fusion)을 의미할 수 있다.
용어 "이중특이적 항체(Bab)"는 더 짧은 결합 펩티드에 의해 서로 연결된 2 개의 scFv를 포함하는 이중특이적 항체를 의미할 수 있다.
제3 양태에 따르면, 제1 양태의 펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
바람직하게는, 핵산은 제1 양태에 따라 재조합 α2δ-1 펩티드를 암호화하거나, 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
제4 양태에 따르면, 상기 제3 양태에 따른 핵산을 포함하는 유전 구축물이 제공된다.
제5 양태에 따르면, 제4 양태에 따른 유전 구축물을 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
제6 양태에 따르면, 상기 제4 양태에 따른 유전 구축물, 또는 상기 제5 양태에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
제7 양태에 따르면, (i) 상기 제6 양태에 따른 하나 이상의 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 세포로부터 펩티드를 분리하는 단계를 포함하는, 단리된 α2δ-1 재조합 펩티드의 제조 방법이 제공된다.
제8 양태에 따르면, 제1 양태에 따른 α2δ-1 펩티드, 또는 상기 제7 양태에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 α2δ-1 펩티드를 포함하는 막, 미셀 또는 리포좀이 제공된다.
바람직하게는, 막, 미셀, 리포좀 또는 α2δ-1 펩티드는 재조합이다. 막은 플라즈마 막 또는 세포소기관 막일 수 있다.
제9 양태에 따르면, 전압-게이팅된 칼슘 채널의 α2δ-1 단백질에 결합하는 제제를 확인하는 결합 검정 기술이 제공되고, 제1 양태에 따른 펩티드를 포함하는 분석 기술, 또는 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
분석 기술은 단리된 펩티드에 결합하는 양성 대조군을 포함할 수 있다. 상기 양성 대조군은 약물이 될 수 있다, 상기 시험 시스템의 단리된 펩티드에 결합하는 펩티드 또는 제제를 포함한다.
[화학식 I]
[(1R,5S,6S)-3-에틸-6-(1H-테트라졸-5-일메틸)-6-비시클로[3.2.o]헵트-3-에닐]메탄아민
시험 시스템은 단리된 펩티드에 결합하지 않는 음성 대조군을 포함할 수 있다. 상기 음성 대조군은 상기 시험 시스템의 단리된 펩티드에 결합되지 않는 약물, 펩티드 또는 작용제일 수 있다.
바람직한 양태에서, 시험 시스템은 양성 대조군 및 음성 대조군을 포함할 수 있다. 또한, 시험 시스템은 필요에 따라 추가 대조군을 포함할 수 있다. 시험 시스템은 또한 사용하기 위한 명령어를 포함할 수 있다.
시험 시스템은 제1 양태의 펩티드 또는 기재에 결합된 제11 양태의 방법에 언급된 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 기재에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다.
제10 양태에 따르면, 서열번호 20의 서열에 상응하는 야생형 α2δ-1 단백질의 영역에서 돌연변이를 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 포유동물이 제공된다.
돌연변이는 하나 이상의 점 돌연변이일 수 있다. 점 돌연변이는 치환, 삽입, 결실 또는 프레임 쉬프트 돌연변이일 수 있다.
상기 돌연변이는 서열번호 20의 서열에 상응하는 α2δ-1 단백질의 영역에서 리신의 하나 또는 둘 다의 치환 또는 삭제가 될 수 있다. 상기 돌연변이는 제2 리신의 결실 또는 치환이다. 상기 치환은 안정한 치환 또는 유사한 아미노산을 위한 치환일 수 있다.
비-인간 포유류는 육식 동물(carnivore)(고양이 또는 개), 설치류(마우스 또는 래트), 래빗, 토끼, 원숭이 또는 유인원일 수 있다.
제11 양태에 따르면, 전압-게이팅된 칼슘 채널의 α2δ-1 단백질에 결합하는 제제를 확인하는 방법이 제공되고, 상기 제1 양태에 따른 제제와 상기 펩티드 사이의 결합을 검출하는 단계, 또는 서열번호 20에 설정된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제11 양태에 따른 방법은 단리된 펩티드에 결합하는 가바펜티노이드 및 비-가바펜티노이드를 확인하기 위해 사용될 수 있다. α2δ-1 단백질에 결합하는 신규한 가바펜티노이드를 확인하는 공지된 방법은 시험 제제(즉, 단리된 α2δ-1 펩티드에 결합할 수 있는 것으로 의심되는 제제) 및 상기 α2δ-1 펩티드의 상류에 위치하는 RRR 모티프를 포함하는 막 결합된 3D-단백질 사이의 결합을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 제1 양태에 따른 펩티드 또는 제11 양태의 방법에 언급된 펩티드는 NVA1309와 같은 피티노이드에 결합하는 3차/3차원(3D) 구조를 필요로 하지 않는다. 이는 시험 제제가 결합할 수 있는 부위(즉, 펩티드/단백질)의 생산 및 발현을 단순화할 수 있기 때문에 유리하다.
또한, 펩티드 선형 구조의 결과로서, 분석/기술/시험 시스템에서 사용될 수 있고, 형광 강도, 발광, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 역 표면 플라즈몬 공명(rSPR), 질량 분석, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석/이온화 질량 분석/시간(MALDI/TOF), 형광 편광, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 시분해 형광(TRF), 균질 시분해 형광(HTREF/TR-FRET), 알파 스크린 기술, 형광 수명, 단편 상보성 또는 FLIPR(칼슘 판독을 위한)을 포함한다. 전체-길이 α2δ-1 단백질의 3차/3D 구조와 호환되지 않을 수 있다. 제1 양태의 펩티드 사이의 결합을 검출하는데 사용될 수 있는 대안적인 분석/기법/시험 시스템(또는 제11 양태의 방법), ELISA, 방사성리간드 및 결합 검정 및 면역침강 등이 될 수 있다.
따라서, 제11 양태에 따른 방법은 흡광도, 형광 강도, 발광, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 역 표면 플라즈몬 공명(rSPR), 질량 분석, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석/이온화 질량 분석/시간(MALDI/TOF), 형광 편광, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 시분해 형광(TRF), 균질 시분해 형광(HTREF/TR-FRET), 알파 스크린 기술, 형광 수명, 단편 컴플리먼트, FLIPR, ELISA, 방사성리간드 및 결합 검정 또는 면역침강을 이용하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 시험 제제와 펩티드 사이의 결합을 검출하기 전에, 상기 제11 양태에 따른 방법은 상기 제1 양태에 따라 상기 시험 제제와 상기 펩티드를 접촉시키는 단계를 포함하거나, 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 가바펜티노이드, 비-가바펜티노이드, 펩티드, 소분자 또는 항체가 될 수 있다.
소분자는 900 달톤 이하의 분자량을 갖는 유기 화합물이다.
가바펜티노이드는 α2δ-1 서브유닛을 포함하는 전압-게이팅된 칼슘 채널의 활성을 조절한다(즉, 억제 또는 향상시킬 수 있는 제제이다). 바람직하게는, 가바펜티노이드는 α2δ-1 서브유닛을 포함하는 전압-게이팅된 칼슘 채널의 활성을 조절하는 약제이다. 전압-게이팅된 칼슘 채널의 활성은 전압-게이팅된 채널의 기공-형성, α1 서브유닛을 통한 칼슘 이온의 통과에 응답하여 생성된 전류에 대응한다. 패치 클램핑, 전압 클램핑 및 다른 전기생리학적 기술을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 이 활성을 측정할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 가바펜티노이드는 α2δ-1 서브유닛을 포함하는 전압-게이팅된 칼슘 채널의 활성 또는 전류를 조절하는 작용제일 수 있다. 바람직하게는, 하기 화학식 II로 정의된 GABA 고리를 포함하는 감마-아미노부티르산(GABA)의 유도체이다:
[화학식 II]
제12 양태에 따르면, 치료 또는 약제로서 사용하기 위한, 제11 양태에 따른 방법에 의해 확인된 제제가 제공된다.
제13 양태에 따르면, α2δ-1 서브유닛이 치료 표적인 의학적 상태의 치료에 사용하기 위한 제11 양태에 따른 방법에 의해 확인된 제제가 제공되고, 의학적 상태는 통증, 신경병성 통증, 말초 신경계 통증, 중추 신경계 통증, 통각과민, 촉각 이질통, 섬유근육통, 하지 불안 증후군, 간질, 불안 장애, 편두통, 사회 불안 장애, 공황 장애, 조증, 양극성 장애, 알코올 금단, 암, 요로 감염, 폐쇄성 폐 질환, 성 기능장애, 가와사키병 심혈관 질환(예컨대, 협심증, 심근경색, 심부전) 및 호흡기 질환(예컨대, 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환)을 포함한다.
제14 양태에서, α2δ-1 서브유닛이 치료 표적인 조건을 치료, 예방 또는 개선하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 대상에게, 상기 제11 양태에 따라 상기 방법에 의해 확인된 치료제의 치료 효과량을 투여하는 단계를 포함한다.
"대상체"는 척추동물, 포유동물 또는 가축 동물이다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물 및 약제는 임의의 포유동물, 예를 들어 가축(예컨대, 말)을 치료하기 위해 사용될 수 있고, 애완동물, 또는 다른 수의학 용도로 사용될 수 있다. 그러나, 가장 바람직하게는, 피험자는 인간이다.
α2δ-1 서브유닛이 치료 표적인 상태는 통증, 신경병성 통증, 말초 신경계 통증, 중추신경계 통증, 통각과민, 촉각 이질성, 섬유근육통, 하지 불안 증후군, 간질, 범불안 장애, 편두통, 사회 불안 장애, 공황 장애, 조증, 양극성 장애, 알코올 금단, 암, 요로 감염, 폐쇄성 폐 질환, 성 기능장애, 가와사키병, 심혈관 질환(협심증, 심근경색, 심부전) 및 호흡기 질환(예컨대, 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환)을 포함한다.
제15 양태에 따르면, 제11 양태에 따른 방법에 의해 확인된 제제, 및 약학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 제제의 약학 조성물이 제공된다.
제16 양태에 따르면, 이에 결합하는 제제를 확인하기 위한, 단리된 α2δ-1 펩티드를 포함하는 펩티드의 용도가 제공되고, 상기 펩티드는 제1 양태에 따른 펩티드, 또는 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다.
이에 결합되어 있는 제제는 가바펜티노이드일 수 있다.
제17 양태에 따르면, α2δ-1 서브유닛이 치료 표적인 의학적 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있는 제제를 식별하기 위한 α2δ-1 펩티드의 용도가 제공되고, 상기 펩티드는 제1 양태에 따른 펩티드이거나, 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
의학적 상태는 통증, 신경병성 통증, 말초 신경계 통증, 중추 신경계 통증, 통각과민, 촉각 이질통, 섬유근육통, 하지 불안 증후군, 간질, 범불안 장애, 편두통, 사회 불안 장애, 공황 장애, 조증, 양극성 장애, 알코올 금단, 암, 요로 감염, 폐쇄성 폐 질환, 성 기능장애, 가와사키병, 심혈관 질환(예컨대, 협심증, 심근경색, 심부전) 및 호흡기 질환(예컨대, 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환)을 포함한다.
본 발명에 따른 제제, 가바펜티노이드, 비-가바펜티노이드 및 조성물은 단일 요법에서 사용될 수 있는 의약에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이고, 본 명세서에서 언급된 모든 조건의 개시를 처리, 예방 또는 지연시키는 것을 목적으로 한다. 대안적으로, 본 발명에 따른 이러한 제제, 가바펜티노이드, 비-가바펜티노이드 및 조성물은 보조제로 사용될 수 있거나, 본 명세서에서 언급된 모든 조건의 개시를 치료, 예방 또는 지연시키는 공지된 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 제제는, 특히 조성물이 사용될 수 있는 방식에 따라 다수의 상이한 형태를 갖는 조성물에 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 분말, 정제, 캡슐, 액체, 연고, 크림, 겔, 하이드로겔, 에어로졸, 스프레이, 미셀 용액, 경피 패치 형태일 수 있고, 리포좀 현탁액 또는 치료를 필요로 하는 사람 또는 동물에 투여될 수 있는 임의의 다른 적합한 형태를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 약제의 비히클은 그것이 주어진 대상에 의해 잘 견딜 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 따른 약제, 예를 들어, 가바펜티노이드 및 비-가바펜티노이드를 다양한 방식으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여가 필요할 수 있으며, 이 경우 제제가 조성물 내에 포함될 수 있고, 예를 들어, 정제, 캡슐 또는 액체의 형태로 경구적으로 섭취될 수 있다. 본 발명의 가바펜티노이드를 포함하는 조성물은 흡입(예컨대, 비강)에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 또한 국소 사용을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 크림 또는 연고를 피부에 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 제제, 가바펜티노이드, 비-가바펜티노이드 및 조성물은 또한 저속 또는 지연 방출 장치 내에 혼입될 수 있다. 이러한 장치는, 예를 들어, 피부 상에 또는 그 아래에 삽입될 수 있고, 약제는 주 또는 심지어 당개월 동안 방출될 수 있다. 장치는 치료 부위에 적어도 인접하여 위치될 수 있다. 이러한 장치는 본 발명에 따라 사용되는 작용제가 필요하며 정상적인 투여(예컨대, 적어도 1회 주입)를 필요로 하는 경우에 특히 유리할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 제제, 가바펜티노이드, 비-가바펜티노이드 및 조성물은 혈액 스트림으로의 주입에 의해 또는 치료를 필요로 하는 부위로 직접 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제는 종양 또는 뉴런에 적어도 인접하여 주입될 수 있다. 주사는 정맥(볼루스 또는 주입) 또는 피하(볼루스 또는 주입), 또는 피내(볼루스 또는 주입)일 수 있다.
제제의 양, 예를 들어, 가바펜티노이드가 포함된다는 것을 알 수 있고, 필요한 경우 생물학적 활성 및 생체이용성에 의해 요구되는 생체 활성 및 생체이용성에 의해 결정되고, 상기 광조절자의 물리화학적 특성 및 상기 광조절자의 물리화학적 특성 또는 복합 치료법(combined therapy)에서 사용되는지 여부를 결정하는 것을 특징으로 한다. 또한, 투여 빈도는 치료될 대상 내의 제제 또는 항체의 반감기에 의해 영향을 받을 것이다. 투여되는 최적의 투여량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 사용 시 특정 작용제에 따라 달라질 것이고, 약학 조성물의 강도, 투여 방식, 및 본 명세서에서 언급된 조건 중 임의의 것의 진전을 포함한다. 치료되는 특정 대상에 따른 추가적인 인자들은 피험자 나이, 체중, 성별, 다이어트, 및 투여 시간을 포함하여, 투여량을 조절할 필요가 있을 것이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 제제의 0.01 ㎍/kg 체중 내지 400 mg/kg 체중의 일일 용량이 본 명세서에서 언급된 임의의 병태를 치료하거나 개선하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는, 일일 용량은 0.01 mg/kg 체중 내지 400 mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 0.1 mg/kg 체중 내지 200 mg/kg 체중, 가장 바람직하게는 약 1 mg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중이다.
제제, 가바펜티노이드, 비-가바펜티노이드 또는 조성물은, 본 명세서에서 언급된 병태의 발병 전, 동안 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일일 용량은 단일 투여(예컨대, 단일 일일 주입)로 주어질 수 있다. 대안적으로, 제제, 가바펜티노이드, 비-가바펜티노이드 및 조성물은 하루 동안 2회 이상 투여하는 것을 필요로 할 수 있다. 예로서, 제제는 치료되는 질환의 심각성에 따라 2회 이상 투여될 수 있다. 1 일 용량은 25 mg 내지 7000 mg(즉, 70 kg 의 체중을 가정함)이다. 피험자 수용 치료는 잠을 깰 때 제1 용량을 취할 수 있고, 그 후, 2회 투여 방식으로, 또는 그 후 3- 는 4-시간 간격으로 제2 용량을 취할 수 있다.
대안적으로, 저속 방출 장치가, 반복 용량을 투여할 필요없이 환자에게 본 발명에 따른 제제의 최적의 용량을 제공하는데 사용될 수 있다.
제약 산업에 의해 통상적으로 사용되는 것과 같은 공지된 방법(예컨대, 생체내 실험, 임상 시험 등)을 포함하는 특정 제제를 형성하는데 사용될 수 있고, 정확한 치료 형태(예컨대, 제제의 일일 용량 및 투여 빈도 등)를 포함하는 특정 제제를 형성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 "치료 효과량"은 피험자에게 투여될 때 제제의 양이고, 가바펜티노이드를 의미한다, 본 명세서에서 언급된 병태 중 임의의 것을 치료하는데 필요한 비-가바펜티노이드 및 조성물, 또는 신경병성 통증을 억제하는 것과 같은 원하는 효과를 생성할 수 있다.
예를 들어, 사용된 치료제의 치료 효과량은 약 0. 01 mg 내지 약 800 mg, 바람직하게는 약 0.01 mg 내지 약 500 mg일 수 있다. 제제의 양은 약 0.1 mg 내지 약 250 mg, 가장 바람직하게는 약 0.1 mg 내지 약 20 mg인 것이 바람직하다.
본 명세서에서 언급되는 "약학적으로 허용되는 비히클"은 임의의 공지된 화합물 또는 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 약학 조성물을 제형화하는 데 유용한 공지된 화합물의 조합이다.
한 구체예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 고체인 것일 수 있고, 조성물은 분말 또는 정제의 형태일 수 있다. 고체 약학적으로 허용가능한 비히클은 향미제, 윤활제로서 작용할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있고, 현탁제, 염료, 충전제, 활제, 압축 보조제, 불활성 결합제, 감미제, 보존제, 염료, 코팅 또는 정제-붕해제를 포함한다. 또한, 비히클은 캡슐화 물질일 수 있다. 분말에서, 비히클은 본 발명에 따른 미세분할된 활성제와 혼합되고, 미분된 고형물은 본 발명에 따른 미세분할된 활성제와 혼합된다. 정제에 있어서, 활성제(예컨대, 펩티드 또는 항체)가 포함된다. 필요한 압축 특성을 갖는 비히클과 적합한 비율로 혼합하여 원하는 형상 및 크기로 압축시킬 수 있다. 바람직하게는, 분말 및 정제는 활성제의 99% 이하를 함유한다. 적합한 고체 비히클은, 예를 들어, 칼슘 포스페이트, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 당, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 저융점 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약학 비히클은 겔일 수 있고, 조성물은 크림 등의 형태일 수 있다.
그러나, 제약 비히클은 액체일 수 있고, 약학 조성물은 용액의 형태이다. 액체 비히클은 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭서 및 가압 조성물을 제조하는데 사용된다. 본 발명에 따른 활성제는 물, 유기 용매, 또는 약학적으로 허용되는 오일 또는 지방의 혼합물과 같은 약학적으로 허용되는 액체 비히클에 용해 또는 현탁될 수 있다. 액체 비히클은 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 향미제, 현탁제, 증점제, 색상, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투압-조절제와 같은 기타 적합한 약학 첨가제를 함유할 수 있다. 경구 및 비경구 투여를 위한 액체 비히클의 적합한 예는 물(전술한 바와 같은 부분 함유 첨가제)을 포함한다. 셀룰로스 유도체(바람직하게는 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스 용액), 알콜(1가 알콜 및 다가 알콜, 예를 들어 글리콜) 및 이들의 유도체, 및 오일(예컨대, 분별된 코코넛 오일 및 아라미드유)을 포함한다. 비경구 투여를 위해, 비히클은 또한 에틸 올레이트 및 이소프로필 미리스테이트와 같은 유성 에스테르일 수 있다. 멸균 액체 비히클은 비경구 투여를 위한 멸균 액체 형태 조성물에 유용하다. 가압된 조성물에 대한 액체 비히클은 할로겐화 탄화수소 또는 다른 약학적으로 허용되는 추진제일 수 있다.
멸균 용액 또는 현탁액인 액체 약학 조성물은, 예를 들어, 근육내, 경막내, 경막외, 복강내, 정맥 및 특히 피하 주사에 의해 사용될 수 있다. 제제, 조성물 또는 항체는 멸균 물, 염수 또는 다른 적절한 멸균 주사가능한 매질을 사용하여 투여 시에 용해 또는 현탁될 수 있는 멸균 고체 조성물로서 제조될 수 있다.
본 발명의 제제 및 조성물은 다른 용질 또는 현탁제를 함유하는 멸균 용액 또는 현탁액의 형태로 경구 투여될 수 있고(예를 들어, 용액 등장성), 담즙염, 아카시아, 젤라틴, 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트 80(소르비톨의 올레에이트 에스테르) 및 에틸렌 옥사이드와 공중합된 무수물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 비-가바펜티노이드 및 조성물은 또한 액체 또는 고체 조성물 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구 투여에 적합한 조성물은 전분, 캡슐, 과립, 정제 및 분말 및 액체 형태를 포함하고, 예를 들어 용액, 시럽, 엘릭서 및 현탁액을 포함한다. 비경구 투여에 유용한 형태는 멸균 용액, 에멀젼 및 현탁액을 포함한다.
본 발명은 임의의 핵산 또는 펩티드 또는 변이체, 유도체 또는 유사체로 확장한다는 것이 이해될 것이다, 이의 변이체 또는 단편을 포함하는, 본 명세서에서 언급된 임의의 서열의 아미노산 또는 핵산 서열을 실질적으로 포함하는 것을 특징으로 한다. 용어 "실질적으로 아미노산/뉴클레오타이드/펩티드 서열", "변이체" 및"단편", 본 명세서에서 언급된 서열 중 어느 하나의 아미노산/뉴클레오타이드/펩티드 서열과 적어도 40%의 서열 동일성을 갖는 서열이 될 수 있고, 예를 들어, 본원에 기재된 핵산 또는 폴리펩티드와 40% 동일성을 제공한다.
아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열은 50% 초과, 더욱 바람직하게는 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 더욱 바람직하게는 80% 초과의 서열 동일성이 또한 고려된다. 바람직하게는, 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열은 본 명세서에서 언급된 임의의 서열과 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 가장 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는다. 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열은 본 명세서에서 언급된 임의의 서열과 100% 동일성을 가질 수 있다.
당업자는 2개의 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열 사이의 백분율 동일성을 계산하는 방법을 이해할 것이다. 2개의 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열 사이의 백분율 동일성(%)을 계산하기 위해, 두 서열의 정렬이 먼저 준비되어야 하고, 이어서 서열 동일성 값을 계산한다. 2개의 서열에 대한 백분율 동일성(%)은 하기 방법에 따라 상이한 값을 취할 수 있다: (i) 서열을 정렬하는데 사용되는 방법, 예를 들어 ClustalW BLAST, FASTA, Smith-Waterman(상이한 프로그램에서 구현됨), 또는 3D 비교로부터의 구조적 정렬에 의해 사용되는 파라미터, 및 (ii) 정렬 방법, 예를 들어, 국소 대 글로벌 정렬, 사용된 쌍-스코어 매트릭스(예컨대, BLOSUM62, PAM250, Gonnet 등), 및 갭-패널티, 예를 들어, 기능적 형태 및 상수에 의해 사용되는 파라미터.
정렬을 통해, 2개의 서열 사이의 백분율 동일성을 계산하는 많은 상이한 방법이 존재한다. 예를 들어, (i) 최단 시퀀스의 길이; (ii) 정렬 길이; (iii) 비갭 위치의 수; (iv) 오버행(overhang)을 제외한 불안정한 위치의 수를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 백분율 동일성이 또한 강하게 길다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 한 쌍의 서열이 더 짧아짐에 따라, 서열 동일성이 기회에 의해 발생할 것을 예상할 수 있다.
따라서, 단백질 또는 DNA 서열의 정확한 정렬은 복잡한 공정이라는 것이 이해될 것이다. 대중적인 다중 정렬 프로그램은 Herw(Thompson et al, 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680;Thompson Et al, 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882)이고, 본 발명에 따른 단백질 또는 DNA의 다중 정렬을 생성하는 바람직한 방법이다. Sealw에 대한 적합한 파라미터는 다음과 같을 수 있다: DNA 정렬을 위해: 갭 개방 페널티 = 15. 0, 갭 연장 페널티 = 6. 66, 및 매트릭스 = 동일성. 단백질 정렬을 위해, 갭 개방 페널티 = 10. 0, 갭 연장 페널티 = 0. 2, 및 매트릭스 = Gonnet. DNA 및 단백질 정렬에 대해: ENDGAP = 1, 및 GAPDIST = 4. 당업자는 최적의 서열 정렬을 위한 이들 및 다른 파라미터들을 변경할 필요가 있을 수 있음을 알 것이다.
바람직하게는, 2개의 아미노산/폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열 사이의 비율(%)의 계산은 이러한 정렬로부터 계산될 수 있다. (N/T) * 100이며, 여기서 N은 서열이 동일한 잔기를 공유하는 위치의 수이고, T는 갭을 포함하지만 오버행을 제외한 위치의 총 수이다. 따라서, 2개의 서열 사이의 백분율 동일성(%)을 계산하기 위한 가장 바람직한 방법은 (i) 적절한 세트의 파라미터들을 이용하여 상기 트레드렛 프로그램을 이용하여 시퀀스 정렬을 준비하는 단계 (i)을 포함하고, (ii) N 및 T의 값을 하기 화학식 서열 동일성 =(N/T)* 100으로 삽입하는 단계를 포함한다.
유사한 서열을 확인하기 위한 대안적인 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에서 언급된 임의의 서열 또는 엄격한 조건 하에서 이들의 상보적인 서열과 혼성화하는 서열에 의해 인코딩될 것이다. 엄격한 조건에 의해, 본 발명은 3x 염화나트륨/나트륨 시트레이트(SSC)에서 DNA 또는 RNA를 여과하기 위한 뉴클레오타이드 혼성화를 의미한다. 약 45℃에서, 하나 이상의 세척을 수행한다. 약 20 내지 65℃에서 0.2 x SSC/0.1% SDS를 포함할 수 있다. 대안적으로, 실질적으로 유사한 폴리펩티드가 서로 상이할 수 있다. 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 서열로부터 5, 10, 20, 50 또는 100개의 아미노산을 포함한다.
유전자 코드의 축퇴에 기인하여, 본 명세서에 기재된 임의의 핵산 서열은 이에 의해 코딩되는 단백질의 서열에 실질적으로 영향을 주지 않고 변경되거나 변경될 수 있고, 그 변형을 제공한다는 것이 명백하다. 적합한 뉴클레오티드 변이체는 서열 내에 동일한 아미노산을 코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경된 서열을 가지며, 따라서 사일런트 변화를 생성한다. 다른 적합한 변이체는 상동성 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 것이다, 상기 아미노산 치환 치환체에 대한 유사한 생물물리적 특성의 측쇄와 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되어 보존적 변화를 생성하는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 소 비극성 소수성 아미노산은 글리신, 알라닌, 류신, 이소루이신, 발린, 프롤린 및 메티오닌 등을 포함한다. 큰 비극성 소수성 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 노산을 포함한다. 따라서, 아미노산이 유사한 생물학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환될 수 있고, 당업자는 이들 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 알 수 있을 것이다.
아미노산 치환:
아미노산 치환을 펩티드 서열, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30 치환에 제조할 수 있다. 보존적 치환은 유사한 화학 구조, 유사한 화학적 특성 또는 유사한 측쇄 부피(side-chain volume)와 유사한 화학적 구조의 다른 아미노산으로 아미노산을 대체한다. 도입되는 아미노산은 유사한 극성, 친수성, 소수성, 염기성, 산도, 중립성, 또는 이들의 치환에 대한 전하를 가질 수 있다. 대안적으로, 보존적 치환은 미리 존재하는 방향족 또는 지방족 아미노산의 위치에 방향족 또는 지방인 다른 아미노산을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 변화는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 하기 표 1에 정의된 바와 같은 20개의 주요 아미노산의 특성에 따라 선택될 수 있다. 아미노산이 유사한 극성을 갖는 경우, 이는 또한 표 2의 아미노산 측쇄에 대한 소수성 스케일을 기준으로 결정할 수 있다.
[표 1]
아미노산의 화학적 특성
[표 2]
소수성 스케일
보존적 치환에는 아미노산 서열의 하나 이상의 잔기가 제거되고 다른 잔류물이 그 위치에 삽입되어 있는 것이다. 이러한 치환은 일반적으로 단백질의 활성을 유지하는 것이 바람직할 때 하기 표 3에 따라 제조된다. 표 2는 단백질의 아미노산을 대체할 수 있는 아미노산을 나타내고, 일반적으로 보존적 치환으로 간주된다.
[표 3]
유사한 치환은 아미노산 서열의 하나 이상의 잔기가 제거되고 다른 잔류물이 그 위치에 삽입되어 있는 것이다. 이러한 치환은 일반적으로 단백질의 활성을 유지하는 것이 요구되는 경우 하기 표 4에 따라 제조된다. 표 4는 단백질의 아미노산을 대체할 수 있는 아미노산을 나타내고, 일반적으로 구조적 및 기능적 치환으로 간주된다. 예를 들어, 표 4의 컬럼 1의 잔기는 컬럼 2의 잔기로 치환될 수 있다. 또한, 표 4의 컬럼 2의 잔기는 컬럼 1의 잔기로 치환될 수 있다.
[표 4]
표 2에 비해 덜 보존성이 있는 치환은, 유지시 그들의 효과에 비해 더 크게 달라지는 잔류물을 선별함으로써 선택될 수 있다: (a) 예를 들어, 시트 또는 나선형 형태로 치환 영역 내의 폴리펩티드 주쇄의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크. 일반적으로 단백질 특성의 가장 큰 변화를 생성하는 것으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔류물, 예를 들어, 세닐 또는 트레닐이 소수성 잔기, 예를 들어 류실, 이소류실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알란일로 치환되거나; (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기로 치환되거나; (c) 전기양성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 라이실, 아르기닐 또는 히스티딜이 전기음성 잔기, 예컨대 글루타밀 또는 아스파르틸로 치환괴거나; (d) 벌크 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예를 들어 글리신으로 치환되는 것일 것이다.
본 명세서에 기술된 모든 특징(임의의 수반되는 청구범위, 요약서 및 도면 포함), 및/또는 개시된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계는 적어도 일부 이러한 특징 및/또는 단계가 상호 배타적인 것을 제외하고, 임의의 조합으로 상기 양태와 조합될 수 있다.
본 발명을 보다 잘 이해하기 위해, 본 발명의 실시예가 어떻게 영향을 받을 수 있는지를 보여주기 위한 것이다, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 이하, 첨부 도면을 참조하여, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
도 1은 cana2D1에 의해 코딩되는 인간 α2δ-1 서브유닛의 위상 도메인/특징을 보여주는 개략도이다.
도 2는 인간 α2δ-1 서브유닛의 도메인 조직화를 나타내는 개략도이다. 본 발명은 VGCC_α2 도메인 내의 can2D1 도메인 및 α2δ-1 재조합 펩티드 서열의 토폴로지를 구체적으로 나타낸다.
도 3은 구축물 1(서열번호 2)의 개략도이다. 이는 가바펜틴/프레가발린 결합 부위 모티프를 함유하지만 VWA_N, VWF_a 및 VGGC-α2 도메인의 다운스트림(downstream)의 카복시-말단 영역을 갖지 않는 절두된 α2δ-1 단편이다.
도 4는 구축물 2(서열번호 3)의 개략도이다. 이는 가바펜틴/프레가발린 결합 부위 모티프를 함유하지만 VWA_N이 결여된 절두된 α2δ-1 단편이다, VWF_a 및 카복시-말단 영역이 VGGC-α2 도메인의 다운스트림 및 또한 캐시 1 도메인이 없는 것을 특징으로 한다.
도 5는 고정된 α2δ-1 구축물 1에 대한 NVA1309의 결합을 위한 SPR 센소그램을 도시한다.
도 6은 고정된 α2δ-1 구축물 2에 대한 NVA1309의 결합을 위한 SPR 센소그램을 나타낸다.
도 7은 고정화된 α2δ-1 구축물 1 및 2에 대한 프레가발린의 결합을 위한 SPR 센소그램을 도시한다.
도 8a 및 8b는 화합물 NVA1309의 특이적 SPR 결합 및 절단된 α2δ-1 구축물 1 및 2를 나타낸다.
도 9a는 블랭크-감산된 센소그램 오버레이를 도시한다. Tva9의 결합을 나타내는 SPR 센소그램은 고정된 펩티드 1에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다(가바펜틴/프레가발린 결합 부위를 함유함). 도 9b는 도 9a의 RU400 값을 나타낸다.
도 10은 고정화된 펩티드 1(P1)에 대한 프레가발린의 결합을 위한 SPR 센소그램을 도시한다.
도 11은 VGGC_α2 도메인을 함유하는 α2δ-1 재조합 펩티드를 고정화시킨 NVA1309의 결합을 위한 SPR 센소그램을 나타낸다.
도 12는 VGGC_α2 도메인을 함유하는 α2δ-1 재조합 펩티드를 고정화시킨 화합물 NVA1309의 특이적 SPR 결합을 나타낸다.
도 13a는 고정화된 펩티드 3(카복시 말단 VGGC_α2 영역)에 NVA1309의 결합을 위한 SPR 센소그램을 도시한다. 블랭크-감산된 센소그램 오버레이. 도 13b는 도 13a의 RU400 값을 나타낸다.
도 14a는 고정된 펩티드에 NVA1309의 결합을 위한 SPR 센소그램을 도시한다. 블랭크-감산된 센소그램 오버레이. 도 14b는 도 14a의 RU400 값을 나타낸다.
도 15는 고정된 펩티드 P4 및 P6에 NVA1309의 결합을 위한 RU400 플롯이다.
도 16a는 펩티드 P4:센소그램 오버레이에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다. 도 16b는 펩티드 P13:센소그램 오버레이에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다. 도 16c는 펩티드 P4 및 P13:RU400 플롯에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다.
도 17a는 펩티드 P14다:센소그램 오버레이에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸. 도 17b는 펩티드 P4 및 P14:RU400 플롯에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다.
도 18a는 펩티드 P4:센소그램 오버레이에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다. 도 18b는 펩티드 P15:센소그램 오버레이에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다. 도 18c는 펩티드 P4 및 P15:RU400 플롯에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다.
도 19는 바이아코어 CM5 센서 칩 표면 상에 화합물 NVA1309의 공유 고정을 나타낸다.
도 20은 바이아코어 CM5 광학 센서 칩의 표면에 공유 결합된 VGGC_α2 도메인을 포함하는 α2δ-1 재조합 펩티드의 특이적 SPR 결합을 나타낸다.
도 21은 α2δ-1 재조합 펩티드/NVA1309 결합 곡선의 수학적 센소그램 피팅(langlans 1:1 결합 모델)을 도시한다.
도 22a 내지 22d는 인간 재조합 α2δ-1 단백질(PR1-4)-NVA1309 결합 곡선을 인코딩하는 α2δ-1 구축물(pp4-P4)의 SPR 센소그램 피팅을 나타낸다.
도 2는 인간 α2δ-1 서브유닛의 도메인 조직화를 나타내는 개략도이다. 본 발명은 VGCC_α2 도메인 내의 can2D1 도메인 및 α2δ-1 재조합 펩티드 서열의 토폴로지를 구체적으로 나타낸다.
도 3은 구축물 1(서열번호 2)의 개략도이다. 이는 가바펜틴/프레가발린 결합 부위 모티프를 함유하지만 VWA_N, VWF_a 및 VGGC-α2 도메인의 다운스트림(downstream)의 카복시-말단 영역을 갖지 않는 절두된 α2δ-1 단편이다.
도 4는 구축물 2(서열번호 3)의 개략도이다. 이는 가바펜틴/프레가발린 결합 부위 모티프를 함유하지만 VWA_N이 결여된 절두된 α2δ-1 단편이다, VWF_a 및 카복시-말단 영역이 VGGC-α2 도메인의 다운스트림 및 또한 캐시 1 도메인이 없는 것을 특징으로 한다.
도 5는 고정된 α2δ-1 구축물 1에 대한 NVA1309의 결합을 위한 SPR 센소그램을 도시한다.
도 6은 고정된 α2δ-1 구축물 2에 대한 NVA1309의 결합을 위한 SPR 센소그램을 나타낸다.
도 7은 고정화된 α2δ-1 구축물 1 및 2에 대한 프레가발린의 결합을 위한 SPR 센소그램을 도시한다.
도 8a 및 8b는 화합물 NVA1309의 특이적 SPR 결합 및 절단된 α2δ-1 구축물 1 및 2를 나타낸다.
도 9a는 블랭크-감산된 센소그램 오버레이를 도시한다. Tva9의 결합을 나타내는 SPR 센소그램은 고정된 펩티드 1에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다(가바펜틴/프레가발린 결합 부위를 함유함). 도 9b는 도 9a의 RU400 값을 나타낸다.
도 10은 고정화된 펩티드 1(P1)에 대한 프레가발린의 결합을 위한 SPR 센소그램을 도시한다.
도 11은 VGGC_α2 도메인을 함유하는 α2δ-1 재조합 펩티드를 고정화시킨 NVA1309의 결합을 위한 SPR 센소그램을 나타낸다.
도 12는 VGGC_α2 도메인을 함유하는 α2δ-1 재조합 펩티드를 고정화시킨 화합물 NVA1309의 특이적 SPR 결합을 나타낸다.
도 13a는 고정화된 펩티드 3(카복시 말단 VGGC_α2 영역)에 NVA1309의 결합을 위한 SPR 센소그램을 도시한다. 블랭크-감산된 센소그램 오버레이. 도 13b는 도 13a의 RU400 값을 나타낸다.
도 14a는 고정된 펩티드에 NVA1309의 결합을 위한 SPR 센소그램을 도시한다. 블랭크-감산된 센소그램 오버레이. 도 14b는 도 14a의 RU400 값을 나타낸다.
도 15는 고정된 펩티드 P4 및 P6에 NVA1309의 결합을 위한 RU400 플롯이다.
도 16a는 펩티드 P4:센소그램 오버레이에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다. 도 16b는 펩티드 P13:센소그램 오버레이에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다. 도 16c는 펩티드 P4 및 P13:RU400 플롯에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다.
도 17a는 펩티드 P14다:센소그램 오버레이에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸. 도 17b는 펩티드 P4 및 P14:RU400 플롯에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다.
도 18a는 펩티드 P4:센소그램 오버레이에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다. 도 18b는 펩티드 P15:센소그램 오버레이에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다. 도 18c는 펩티드 P4 및 P15:RU400 플롯에 대한 NVA1309의 결합을 나타낸다.
도 19는 바이아코어 CM5 센서 칩 표면 상에 화합물 NVA1309의 공유 고정을 나타낸다.
도 20은 바이아코어 CM5 광학 센서 칩의 표면에 공유 결합된 VGGC_α2 도메인을 포함하는 α2δ-1 재조합 펩티드의 특이적 SPR 결합을 나타낸다.
도 21은 α2δ-1 재조합 펩티드/NVA1309 결합 곡선의 수학적 센소그램 피팅(langlans 1:1 결합 모델)을 도시한다.
도 22a 내지 22d는 인간 재조합 α2δ-1 단백질(PR1-4)-NVA1309 결합 곡선을 인코딩하는 α2δ-1 구축물(pp4-P4)의 SPR 센소그램 피팅을 나타낸다.
실시예
본 발명자들은, NVA1309의 결합 프로파일(binding profile)에서 개별 α2δ-1 도메인의 중요성을 탐지하는 것으로 결정되었다. 프리레틴 및 가바펜틴이 비교예에 사용되었다. 재조합 합성 DNA 클로닝에 의해 2개의 절단된 α2δ-1 단백질이 생성되었다. CHO 세포에서 His-태깅된 GST 융합 단백질로서 일시적으로 발현된다. 또한, Cana2D1(인간 α2δ-1) 효모(Cana2D1;CUSABIO, Cat No Bcs-YP004407HU)에서 생산된 재조합 펩티드[13]가 또한 사용되어 있다. 도 2는 Ggf2D1 도메인의 토폴로지 및 VGCC_α2 도메인을 포함하는 α2δ-1 재조합 펩티드 서열을 나타낸다.
또한, 정의된 α2δ-1 영역을 나타내는 합성 펩티드 세트와 함께 α2δ-1 재조합 펩티드 및 이의 돌연변이 유도체를 표적 결합 실험에 사용하였다. 실시간 결합 평가를 위한 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술을 이용한다. 또한, NVA1309가 높은 친화성을 갖는 재조합 전장 α2δ-1 단백질에 결합하는 것으로 밝혀졌다. α2δ-1 재조합 펩티드에 관한 것이다. 또한, 화합물 NVA1309는 종래 기술(R217)에 기재된 프레글린/가바펜틴 결합 부위를 포함하는 합성 펩티드에 특이적으로 결합하였다. α2δ-1 재조합 펩티드 내에 포함된 α2δ-1VGCC_Α2 도메인의 카복시-말단 아미노산 영역 내의 부위에 독립적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 신규 및 예상치 못한 발견은 종래 기술에서 확인되지 않았던 인간 cana2D1 상의 가바펜티노이드 화합물에 대한 신규 및 독립적인 표적 결합 부위의 존재를 발견하였다. 이러한 예상치 못한 발견과 관련된 지지 데이터는 하기 실시예에서 상세하게 논의된다.
표면 플라즈몬 공명(SPR)
표면 플라스몬 공명(SPR;바이아코어) 기술을 이용하여 α2δ-1 표적 분자의 상이한 영역을 포함하는 재조합 단편 및 합성 펩티드에 대한 가바펜티노이드, NVA1309 의 결합 및 합성 펩티드를 조사하였다.
SPR 기술에 의한 생체분자 상호작용 분석은 광학 센서 칩을 적용하여 분자 사이의 실시간 결합 사건을 연구할 수 있게 한다. 비-표지된 단백질(예컨대, 항체/항원, 재조합 수용체, 리간드) 또는 저분자량 화합물(예컨대, 약물 후보)은 표적 결합 강도를 평가하고 정확한 결합 동역학(on/off rate, affinity)을 결정하는데 충분하다.
실시예 1: 가바펜티노이드 NVA1309의 1-결합 및 절단된 재조합 α2δ-1 단백질, 구축물 1(서열번호 2) 및 구축물 2(서열번호 3)
바이아코어 장비에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술을 이용하여 결합 실험을 수행하였다. 재조합 구축물 1 및 구출물 2를 각각 2개의 상이한 유동 셀(FC2 및 FC3)의 표면에 고정시키고, 상기 바이아코어 아민 결합 시험 시스템을 이용하여, 공유 아민 결합 화학 반응에 의한 바이아코어 CM5 광학 센서 칩의 제조 방법에 관한 것이다. 인간 IgG는 인트라-분석 배경 결합 대조로서 기준 유동 세포 FC1에 고정되었다. 화합물 NVA1309를 농도 증가에 따라 분석물로 주입하고 결합 반응을 실시간 센소그램 의 발생에 의해 모니터링하였다.
2개의 재조합 절두된 α2δ-1 단편(구출물 1 및 2; 도 3 및 4 참조)을 포함하며, 보고된 프레가발린 결합 부위를 포함하는, NVA1309를 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이들 2개의 절두된 α2δ-1 단백질은 재조합 합성 DNA 클로닝에 의해 생성되었고, CHO 세포에서 his-태깅된 GST 융합 단백질로서 일시적으로 발현되었다.
구축물 1
구축물 1(서열번호 2)은 다음이 결핍된다:
a) 폰 빌레브란드 인자 타입 A(VWA) 및 캐시 도메인을 포함하는 단백질의 N-말단에서 발견되는 아미노 말단 VWA_N 도메인. 척추동물, 초파리 및 C. Elegans에서 발견되었지만, 다른 진핵생물에서 아직 확인되지 않았다. 이들은 아마도 일부 전압-의존 칼슘 채널 서브유닛의 기능에 관여한다;
b) 완전 폰 빌레브란드 인자 타입 A 도메인; 및
c) (i) 상기 가바펜틴/프레가발린 결합 부위 모티프, (ii) 캐시 1 도메인, α2δ-1 및 다양한 세균 주화성 수용체를 비롯한 넓은 범위의 단백질의 소-분자 인식에서 역할을 하는 것으로 예측되는 세포외 단백질 도메인, 및 (iii) VGGC_a2 도메인, 캐시 도메인의 N-말단으로의 다양한 신경 전압-의존 칼슘 채널(VGCC) 서브유닛에 존재하는 특정 도메인을 포함하는 VGGC-α2 도메인의 하류에 있는 모든 카복시-말단 영역.
구축물 2
구축물 2(서열번호 3)는 구축물 1과 동일하지만 캐시 1 도메인이 부족하다.
센소그램 주행 조건은 다음과 같다:
화합물 스톡 용액: 20 mM, HBS-P 완충액
화합물 작업 스톡 농도 0.66 내지 3.62 mM
주행 완충액: HBS-P
유속: 30 ㎕/min
결과는 도 5 및 도 6에서 인간 IgG 기준으로부터 감산된 곡선으로서 제시된다.
화합물 NVA1309에 대해 적용되는 가장 높은 농도에 상응하는, 500 μM의 농도로 분석물(previrol)로서 프리레신을 주입하였다(도 7 참조).
서브트랙티브 결합 센소그램은 절두된 α2δ-1 리간드 모두에 대한 프레가발린 결합의 결여를 명확하게 보여주지만, 2개의 절두된 단백질이 비손상 가바펜틴/프레가발린 결합 모티프(RRR)(도 3 및 도 4 참조). 분석물로서 가바펜틴을 사용하여 유사한 데이터를 수득하였고, α2δ-1 구축물 1 및 2 모두에 대해 어떠한 결합도 관찰되지 않는다.
400초 동안 측정된 상대 SPR 반응 단위를 취하였다. 기준 보고 포인트로서 주입 후(RU400; 초기 해리 상), 화합물 NVA1309의 농도 의존성 결합 및 절단된 재조합 α2δ-1 구축물에 대한 프레가발린 결합의 결여가 명백하게 입증된다. NVA1309의 특이적 SPR 결합 및 절단된 α2δ-1 단편들에 대한 프리레신의 특이적 SPR 결합은 도 8a 및 도 8b에 도시되어 있다.
실시예 2: α2δ-1의 가바펜틴/프레가발린 결합 부위를 포함하는 합성 펩티드에 대한 가바펜티노이드 화합물 NVA1309의 결합
본 발명은 α2δ-1의 VWF_a 도메인의 상류에 보고된 가바펜틴/프레가발린 결합 부위를 포함하는 합성 펩티드를 생성하였다, 3개의 글리신 및 말단 시스테인(펩티드 1, P1; 서열번호 4)으로 이루어진 가요성 스페이서로의 카복시-말단 융합된다:
이 펩티드는 바이아코어 티올 커플링 절차를 따라, 바이아코어 티올 커플링 시험 시스템을 사용하여 바이아코어 CM5 광학 센서 칩의 표면(FC2)에 카복시-말단 시스테인을 통해 공유결합된다. 티올 커플링은 고정된 펩티드 분자의 균일한 표면 제시를 가능하게 하고, 펩티드의 아미노산 서열에 의해 결정되는 입체적 형태를 채택하기 위한 자유를 제공한다. 화합물 NVA1309를 농도 증가에 따라 분석물로 주입하였고, 결합 반응은 블랭크 FC1 덱스트란 기준 표면으로부터 감산된 곡선으로서 제시된 실시간 센소그램의 발생에 의해 모니터링하였다.
센소그램 주행 조건은 다음과 같다:
화합물 스톡 용액: 50 mM, DMSO
화합물 작업 스톡 희석: 0.5 내지 2 mM
주행 완충액: HBS-P
유속:30 ㎕/min
400초 동안 측정된 상대 SPR 반응 단위를 취하였다. 기준 보고 포인트로서 주입 후(RU400; 초기 해리 상), 보고된 가바펜틴/프레가발린 결합 부위를 포함하는 합성 펩티드에 대한 화합물 NVA1309의 농도 의존적 결합이 명백하게 입증된다(도 9a 및 도 9b 참조).
분석물로서 프레가발린은 펩티드 P1 리간드에 결합하기 위한 양성 SPR 신호가 없는 것으로 나타났으며, 이는 실시예 1에 나타낸 데이터(도 10 참조)를 확인하였다.
실시예 3: 공지된 가바펜틴/프레가발린 결합 부위가 아닌 VGCC_a2 도메인을 포함하는 α2δ-1 재조합 펩티드(서열번호 5)에 대한 가바펜티노이드 화합물 NVA1309의 결합
VGGC_α2 도메인을 포함하는 α2δ-1 재조합 펩티드 및 카복시 말단 근처의 단일 시스테인을 함유하는 재조합 펩티드, 및 상기 공유 티올 결합 화학 반응에 따라 상기 바이아코어 티올 커플링 시험 시스템을 이용하여 상기 바이아코어 CM5 광학 센서 칩의 표면에 고정되었다. 이러한 고정화 공정은 랜덤화된 아민 결합 절차 보다 센서 칩 표면에 리간드 분자의 입체적으로 균일한 부착을 제공한다. 소 혈청 알부민(BSA)은 인트라-분석 배경 결합 대조군으로서 기준 유동 세포(FC1)에 고정되었다. 화합물 NVA1309는 농도 증가에 따라 분석물로 주입되었고, 결합 반응은 BSA 기준(도 11 참조)으로부터의 감산된 곡선으로서 제시된 실시간 센소그램의 발생에 의해 모니터링되었다.
센소그램 주행 조건은 다음과 같다:
화합물 스톡 용액: 50 mM, 디메틸 설폭사이드(DMSO)
화합물 작업 희석: 0.5 내지 2 mM
주행 완충액: HBS-P
유속: 30 ㎕/분
400초 동안 측정된 상대적 SPR 반응 단위를 포함한다. 기준 보고 포인트로서 주입 후(RU400; 초기 해리 상), α2δ-1 재조합 펩티드에 대한 화합물 NVA1309의 농도 의존적 결합이 명백하게 입증된다(도 11 및 12 참조).
실시예 4: α2δ-1의 VGGC α2 도메인의 카복시 말단 아미노산 영역을 포함하는 합성 펩티드에 대한 가바펜티노이드 화합물 NVA1309의 특이적인 결합
3개의 글리신 및 말단 시스테인(펩티드 3; 서열번호 6)으로 이루어진 가요성 스페이서에 의해 말단 융합된 카복시-말단 융합 단백질을 나타내는 합성 펩티드를 제조하였다.
펩티드 P3, 카복시-말단 VGGC_α2 영역(I) + GGGGC 앵커
이 펩티드는 바이아코어 티올 커플링 절차를 따르는 바이아코어 티올 커플링 시험 시스템을 사용하여 바이아코어 CM5 광학 센서 칩의 표면(FC2)에 카복시-말단 시스테인을 통해 공유결합된다. 이러한 전략은 고정된 펩티드 분자의 균일한 표면 제시를 가능하게 하고, 펩티드의 아미노산 서열에 의해 결정된 입체적 형태를 채택하기 위한 자유를 제공한다. 화합물 NVA1309를 농도 증가에 따라 분석물로 주입하고 결합 반응을 블랭크 FC1 덱스트란 기준 표면(도 13a 참조)으로부터 감산된 곡선으로서 제시된 실시간 센소그램의 발생에 의해 모니터링하였다.
센소그램 주행 조건은 다음과 같다:
화합물 스톡 용액: 50 mM, 디메틸 설폭사이드(DMSO)
화합물 작업 희석: 0.5 내지 2 mM
주행 완충액: HBS-P(바이아코어)
유속: 30 ㎕/분
400초 동안 측정된 상대 SPR 반응 단위를 취하였다. 기준 보고 포인트로서 주입 후(RU400; 초기 해리 상), 펩티드 P3에 대한 화합물 NVA1309의 농도 의존적 결합, α2δ-1 VGGC_α2 영역(I) 도메인의 카복시-말단 말단에 대한 상동성이 명확하게 입증된다(도 13b 참조).
실시예 5: VGGC α2 표적 도메인의 카복시 말단 영역 상의 가바펜티노이드 화합물 NVA1309 결합 부위의 맵핑: 코어 아미노산 서열 IKAKLEETITOA에 대한 결합
3개의 글리신 및 말단 시스테인로 이루어진 가요성 스페이서(펩티드 4; 서열번호 7)에 카복시-말단 융합된 펩티드 3(서열번호 6)에 포함된 코어 아미노산 서열 IKAKLEETITOAGGGC를 포함하는 합성 펩티드를 구축하였다.
이 펩티드는 바이아코어 티올 결합 절차에 따라 실시예 4에 기재된 바와 같은 바이아코어 CM5 광학 센서 칩의 표면(FC2)에 카복시-말단 시스테인을 통해 공유결합되었다. 화합물 NVA1309를 농도 증가에 따라 분석물로 주입한 후 결합 반응을 블랭크 FC1 덱스트란 기준 표면(도 14a 및 14b)으로부터 감산된 곡선으로서 나타낸 실시간 센소그램의 발생에 의해 모니터링하였다.
센소그램 주행 조건은 다음과 같다:
화합물 스톡 용액: 50 mM, 디메틸 설폭사이드(DMSO)
화합물 작업 희석: 0.5 내지 2 mM
주행 완충액: HBS-P
유속: 30 ㎕/min
3개의 글리신 및 말단 시스테인로 이루어진 가요성 스페이서(펩티드 P6; 서열번호 8)에 카복시-말단 융합된 최종 다운스트림 VGGC_α2 아미노산으로 연장된 펩티드 P4의 카복시-말단 절반에 의해 추가의 펩티드를 합성하였다:
이 펩티드는 바이아코어 티올 결합 절차를 이용하여 새로운 바이아코어 CM5 광학 센서 칩의 표면(FC3)에 카복시-말단 시스테인을 통해 공유적으로 커플링되었다. 펩티드 P4를 양성 기준 대조군으로서 FC2에 고정시키고, 유동 셀 FC1을 음의 배경 결합 기준으로서 남겨두었다. 화합물 NVA1309를 농도 증가에 따라 분석물로 주입하였고, 결합 반응은 이전 실시예에서 기술된 바와 같은 실시간 센소그램의 생성에 의해 모니터링되고, 블랭크 FC1 덱스트란 기준 표면으로부터 감산된 곡선으로서 제시되었다.
펩티드 P4 및 P6에 대한 블랭크 감산된 센소그램으로부터 얻은 상대 SPR R400 보고 포인트 응답 단위는 도 15에서 직접 비교하였다.
실시예 5에 개시된 실험의 결과는 α2δ-1 VGGC_α2의 카복시-말단 말단에서의 아미노산 서열 연신 IKAKLEETITQA를 분명히 증명한다. 도메인은 화합물 NVA1309에 대한 신규 결합 부위를 정의한다. 이 서열의 아미노-말단 부분의 결실 및 펩티드 P6(서열번호 1)에 나타난 바와 같은 VGGC_α2의 카복시-말단 말단의 추가 연장8)NVA1309 결합 용량의 현저한 손실을 나타내었다. 따라서, 펩티드 P4(서열번호 7), IKAKLE의 아미노-말단 부분은 화합물 NVA1309 표적 결합에 기여한다.
실시예 6: 신규 VGGC_α2-가바펜티노이드 결합 부위(펩티드 P4 스캐닝)의 분자 특성
펩티드 P4 서열(서열번호 7)로부터 유도된 펩티드로 일련의 3개의 농도의 SPR 결합 실험을 수행하였다. 이러한 펩티드는 결합 화합물 NVA1309에서 단일 펩티드 4-함유된(P4) 아미노산 잔기의 중요성을 결정하기 위해 디자인되었다. 하기 펩티드를 제조하였다:
펩티드 P8(서열번호 9)
이는 역 펩티드 P4 + GGGC 앵커이다.
펩티드 P9(서열번호 10)
이는 P4 유사체이다 - 모든 아미노산이 가장 유사한 것 + GGGGC 앵커에 의해 치환된다.
펩티드 P10(서열번호 11)
이는 양으로 하전된 측쇄 A-치환된 P4 + GGGGC 앵커로부터 유도된다.
펩티드 P11(서열번호 12)
이는 음으로 하전된 측쇄 A-치환된 P4 + GGGGC 앵커로부터 유도된다.
펩티드 P12(서열번호 13)
이는 극성 측쇄의 A-치환된 P4 + GGGGC 앵커로부터 유도된다.
바이아코어 티올 결합 절차 및 SPR 결합 실험을 따르는 말단 시스테인을 통해 광학 센서 칩에 공유 결합된 합성 펩티드를 이전 실시예에서와 동일한 조건 하에서 정확하게 수행하였다. 단일 펩티드의 상대적 결합 강도를 3개의 농도 RU400 값으로부터 판독하였고, 펩티드 P4 기준(P4: RU400 = 100%)의 백분율로서 계산하였다. 이 실시예의 비교 결과는 표 5에 요약되어 있다.
[표 5]
펩티드 P4 스캐닝 결합 실험의 결과
역 펩티드 P8에 대한 결합의 결여에 의해 지지된다. 펩티드 P4 스캐닝 실험의 결과는 펩티드 P4에 대한 화합물 NVA1309의 결합 특이성을 확인하고, 비손상 N-말단 아미노산 모티프 IKAKLE가 NVA1309 결합에 특히 중요하다.
실시예 7: 인간 α2δ의 VGCC_a2 도메인 내의 가바펜티노이드 NVA1309의 신규한 결합 부위의 더욱 상세한 확인
본 발명자들은 펩티드 P4(서열번호 7), P13(서열번호 14), P14(서열번호 15) 및 P15(서열번호 16)를 합성하고 사용하였다. 상세한 내용은 하기를 참조한다.
펩티드 P4
양성 결합 참조(100% 상대 결합): α28-1vcc-2 도메인(MP3) + GGGGC 앵커의 카복시-말단 영역에 상동성이 있다.
펩티드 P13
P4 유사체; K2 A-치환된 + GGGGC 앵커.
펩티드 P14
P4 유사체; K4 A-치환된 + GGGGC 앵커.
펩티드 P15
P4의 아미노-말단 부분 + GGGGC 앵커.
펩티드 P4는 티올 커플링 화학물질을 사용하여 기준 표적-리간드로서 바이아코어 CM5 광학 센서 칩의 유동 셀 2(FC2)의 표면에 카복시 말단 시스테인을 통해 공유결합하였다. 펩티드 P13은 동일한 센서 칩의 유동 셀 3(FC3)의 표면에 공유 티올 결합된다. 블랭크 카복실-덱스트란 표면을 나타내는 유동 셀 FC1을 네가티브(블랭크) 결합 기준로서 사용하였다.
펩티드 P4 및 P13에 대한 NVA1309의 결합 검정
펩티드 P4 및 P13에 대한 NVA1309의 결합은 농도 의존적 센소그램의 생성에 의해 분석되었다. (배경 감산된 센소그램 FC2-FC1 및 FC3-FC1)(도 16a 내지 16c)
펩티드 P4 및 P14에 대한 NVA1309의 결합 검정
펩티드 P14에 대한 농도 의존적 센소그램의 생성에 의해 펩티드 P4 및 P14 에 NVA1309의 결합을 분석하였다(도 17a 참조). 펩티드 P4(FC2-FC1; 도 16a)에 대해 얻어진 상응하는 값과 P14 데이터를 비교하는 RU400 플롯이 도 17b에 도시되어 있다.
펩티드 P4 및 P15에 대한 NVA1309의 결합 검정
표 18a 내지 도 18c(배경 감산된 센소그램 FC4-FC1 및 FC2-FC1)에 나타낸 농도 의존 센소그램의 생성에 의해, 펩티드 P4 및 P15에 NVA1309의 결합을 새로운 바이아코어 CM5 센서 칩 상에서 분석하였다.
도 16 내지 18에 예시된 데이터는 신규 발견된 VGCC_a2 표적에 대한 화합물 NVA1309의 결합의 특이성을 확인한다. 펩티드 P4를 온-칩 기준(on-chip reference)으로서 사용하면, 표 6에 제시된 상대적인 RU400 값 및 결합 점수는 일관되고, IKAK 서열의 중요도와, 특히 표적에 결합하는 화합물 NVA1309에 대한 위치 4의 리신의 중요성을 강조한다(K). P4(ETITQA)의 카복시-말단 반쪽 자체는 NVA1309와 상호작용하도록 충분하지 않은 것으로 밝혀졌다.
[표 6]
P4, P13, P14 및 P15를 이용한 NVA1309에 대한 상대적인 펩티드 결합 데이터의 요약
실시예 8: 바이아코어 CM5 광학 센서 칩의 표면 상에 공유적으로 고정화되어 있는 가바펜티노이드 화합물 NVA1309 상에 VGCC_a2 도메인을 함유하는 α2δ-1 재조합 단백질(서열번호 5)의 결합
이전의 실시예에 제시된 데이터를 확인하기 위해, 재조합 전장 α2δ1 구축물(서열번호 1)과 같은 큰 단백질에 대한 바이아코어 SPR 실험을 가능하게 하기 위해, 화합물 NVA1309의 단일 1차 아미노기를 덱스트란 매트릭스의 카복실 기에 공유 결합시켜 리간드로서 화합물 NVA1309를 사용할 수 있는 SPR 프로토콜을 확립하였다.
포스페이트 완충 염수(PBS로 2 mM로 희석된 50 mM 스톡 용액에 화합물 NVA1309를 적용하여, 화합물 NVA1309의 센서 칩에 대한 화학적 결합을 달성하고, 후속적으로 상기 바이아코어 아민 커플링 시험 시스템에 권장된 프로토콜을 따르는 것을 특징으로 한다.
하기 리간드를 바이아코어 CM5 센서 칩의 표면에 결합시켰다.
유동 셀 1(FC1): 아민(에탄올아민) 활성화 블랭크 표면
유동 셀 2(FC2): 비관련 단백질 1(..RU)
유동 셀 3(FC3): 비관련 단백질 2(..RU)
유동 셀 4(FC4): NVA1309(44 RU)
α2δ-1 재조합 펩티드(1 μg)를 모든 유동 세포에 분석물로 통과시켰다. FC1의 감산된 센소그램이 도 20에 도시되어 있다.
고정된 NVA1309에 대한 α2δ-1 재조합 펩티드 결합의 친화성을 추정하기 위해, 상기 결합 센소그램을 랑뮤어 1:1 상호작용 알고리즘(Biaevaluation 4.1 software)(도 21 참조)을 적용하는 수학적 곡선 피팅에 의해 분석하였다.
α2δ-1 재조합 펩티드 VGGC_α2-NVA1309 상호작용의 동역학은 도 21에 나타낸 곡선 피팅에 기초하여, 운동 결합 상수(k-on; ka, k-off; kd)의 결정에 의해 평가하였다. 평형 해리 상수 kd = kd/ka를 계산하고, 화합물-표적 결합 친화성의 단일 농도 추정치를 제공한다.
[표 7]
α2δ-1 재조합 펩티드-NVA1309 표적 상호작용(단일 농도 데이터)의 운동 상수 및 결합 친화도
실시예 9: 바이아코아 CM5 광학 센서 칩의 표면에 공유 고정되어 있는 화합물 NVA1309로의 인간 재조합 전장 α2δ-1 단백질(서열번호 1) 및 이의 유도체(서열번호 19)의 결합
표준 DNA 클로닝 및 발현 기술에 의해 생성된 단일 아미노산 잔기를 함유하는 재조합 전장 α2δ-1 단백질 및 돌연변이체를 표준 DNA 클로닝 및 발현 기술에 의해 생성시키고, 아미노산 결합 화합물 NVA1309에 대한 SPR 결합을 위한 분석물로 사용하였다. 표 8에 나타낸 분석물 단백질이 조사되었다:
[표 8]
인간 재조합 전장 α2δ-1 단백질 및 이의 알라닌 돌연변이체
PR1은 천연 야생형 인간 α2δ-1 단백질을 나타내고, PR2는 종래 기술 및 문헌에서 보고된 바와 같이 RRR 모티프 내에서 가바펜틴/프레가발린을 위한 결합 부위로서 기재된 단일 아르기닌(R) 및 알라닌(A)의 치환을 포함한다. PR3은 α2δ-1 표적 상의 피티노이드 NVA1309에 대한 신규 결합 부위를 나타내는 단일 리신(K) 내지 알라닌(A) 치환을 포함하고, 실시예 7 에 개시된 바와 같이, Pr4 단백질은 PR2 및 PR3에서와 같은 점 돌연변이를 모두 포함한다.
각각의 α2δ-1 구축물는 NVA1309 센서 칩 표면에 걸쳐 3개의 농도에서 분석물로 실행되었다(NVA1309 표면 밀도 = 204 RU).
운동 결합 상수(k-on; ka, k-off; kd)를 수학적 센소그램 피팅에 의해 블랭크 아민 활성화된 감산된 센소그램으로부터 측정하였다. 피팅 고선은 도 22a 내지 22d에 도시되어 있다.
운동 상수의 계산을 위해, 생체평가 4.1 소프트웨어를 이용하여 질량 전달 제한 보정(적용가능한 경우)을 보충한 랑뮤어 1:1 상호작용 알고리즘을 적용하였다. 평형 해리 상수 KD = kd/ka를 계산하였다. 모든 재조합 단백질에 대해 얻은 운동 결합 상수 및 계산된 친화성을 표 9에 요약하였다.
[표 9]
동적 상수 및 재조합 α2δ-1 단백질-NVA1309 표적 상호작용의 결합 친화도
결론
I-NVA1309는 표적과의 상호작용의 신규한 메카니즘을 나타낸다
NVA1309는 종래 기술에 기술된 가바펜티노이드와 상이한 분자 상호작용 메카니즘에 의해 α2δ-1에 결합하는 가바펜티노이드이다. NVA1309는 재조합 절두된 α2δ-1 단백질 모두에 결합할 수 있는 반면, 프레가발린을 위해 결합 신호가 획득되지 않았다. 이들 2개의 절두된 α2δ-1 단편들에 대한 프레가발린의 결합은 종래 기술 및 공개된 문헌에 청구된 바와 같이 기대된다[13].
이러한 놀라운 발견은 표적 상호작용 모드에 대한 화합물 NVA1309와 프레가발린 사이의 기본적인 차이를 분명히 증명한다. 완전 길이 α2δ-1 단백질의 완전한 3차원 접지가 프레가발린이 공지된 결합 영역(RRR) 모티프와 상호작용하는데 필요하다는 것을 알 수 있다. 문헌에 기재된 바와 같이, 이러한 구조적 제한은 NVA1309에 대해 강제적이다[18].
이러한 예상치 못한 발견은 또한 화합물 NVA1309가 단합성 펩티드에 배타적으로 결합할 수 있다는 것을 보여줌으로써 더욱 확장되었다. α2δ-1(펩티드 P1; 서열 Id4)의 VWA 도메인의 상류에 보고된 PGB 결합 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 대조적으로, 프리레페린은 이 펩티드에 결합할 수 없다.
II-NVA1309는 α2δ-1 내의 신규한 표적 영역과 상호작용한다
화합물 NVA1309는, 보고된 프레가발린 결합 서열의 하류에 위치하는 α2δ-1 단백질의 VGGC_α2 도메인 내의 영역에 독립적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 효모로서 발현되고, VGGC_α2 도메인을 포함하는 α2δ-1 재조합 펩티드가 개시되어 있으나, 선행 기술의 프레가발린/가바펜틴 결합 부위(RRR)(서열 Id5)에서 알려져 있지 않은 SPR 결합 실험에 사용하였다.
예상외로, 화합물 NVA1309는 VWF_A 도메인의 상류에 α2δ-1 영역이 결여된 재조합 α2δ-1 재조합 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있고, 문헌은 프레가발린 및 가바펜틴에 대한 결합 부위로서 언급한다. 특이적(소 혈청 알부민, BSA와 음성 결합 대조용 BSA)으로 증명된 결합 또한 농도 의존성이다.
VGGC_α2 결합 영역 내의 합성 펩티드를 이용한 SPR 결합 검정을 화합물 NVA1309로 수행하고, 특이적 결합 영역을 VGGC_Α2 도메인의 카복시-말단 아미노산 부분으로 추가로 좁았다. 이는 합성 펩티드(펩티드 P3; 서열번호 11)에 대한 NVA1309 결합을 입증함으로써 달성되었다. 상기 카복시 말단 VGGC_α2 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더 짧은 펩티드(펩티드 P4(서열번호 7)) 및 펩티드 P6(서열번호 8)을 를 갖는 추가의 SPR 결합 실험, 뿐만 아니라 알라닌 치환된 아미노산 잔기, P9(서열번호 10), 펩티드 P10(서열번호 11), 펩티드 P11(서열번호 11), 펩티드 P12(서열번호13)를 함유하는 P4 펜티드-유도체는 표적-화합물 NVA1309 상호작용에 관여하는 신규 결합 영역으로서 서열 IKAKLEETITQA를 포함하는 아미노산 스트레스의 확인을 허용한다.
재조합 전장 α2δ-1 단백질(서열번호 1) 뿐만 아니라 α2δ-1 재조합 펩티드(서열번호5)를 갖는 화합물 NVA1309를 SPR 분석에 의해 확인한 후, 그 단일 1차 아미노기를 통한 광학 센서 칩 표면에 대한 공유 결합 후, 상기 재조합 단백질을 용액 중에 분석물로 적용하여 분석하였다. 단일 재조합 전장 α2δ-1 돌연변이된 단백질은 선행 기술에 기재된 바와 같이, 프레가발린 결합 부위 내에 포함된 각각의 아미노산 잔기에 대한 알라닌 치환(서열번호 14) 및/또는 새로 검출된 카복시 말단 VGGC_α2 영역 IKAKLEETITQA(서열번호 15, 서열번호 16)에 포함된 아미노산 잔기가 공유 고정된 화합물 NVA1309에 결합하는 것으로 나타났다.
SPR 센소그램으로부터 얻은 운동 결합 상수의 결정은 화합물 NVA1309에 대한 다양한 분석물의 결합 친화도(KD 값)의 계산을 허용하였고, 화학 고정화 화합물 NVA1309에 대한 다양한 분석물의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 신규한 및 예상치 못한 발견은, 종래 기술에서 보고된 바와 같이, 가바펜티노이드 가바펜틴 및 프레가발린의 표적 상호작용 결합 특성과 상이한, 가바펜티노이드 화합물 NVA1309와의 표적 상호작용의 독특한 모드를 개시한다. 또한, 이러한 발견들은, 잠재적으로 독특한 생물학적/약리학적 특성을 갖는 신규한 전압-게이팅된 칼슘 채널 조절자의 식별을 위해 사용되는 신규하고 진보적인 기초를 구성한다.
본 발명의 실시예 1 내지 9에 기재된 결과는 전압-게이트 칼슘(CaV)채널의 보조 α2δ-1 서브유닛의 VGGC_α2 도메인 내의 피티노이드 화합물에 대한 신규 결합 부위의 확인 및 분자 특성을 설명한다. 이 표적 부위는, 높은 친화도 결합 포켓을 생성하기 위해 VWA 도메인의 상류에 위치한 종래 기술에서 보고된 가바펜틴/프레가발린 결합 부위와 상승적으로 작용할 수 있다. 그러나, 새로 확인된 신규 VGGC_α 2-위치 결합 부위는 또한 신규 치료 활성 칼슘 채널 조절자의 식별 및 개발을 위한 독립형 표적으로서 작용할 수 있다.
서열 목록
펩티드 아미노산 서열
서열번호 1(인간 전장 α2δ-1, 넘버링은 신호 펩티드를 포함한다):
서열번호 2(재조합 α2δ-1 절두 1, 구축물 1):
서열번호 3(재조합 α2δ-1 절두 2, 구축물 2):
서열번호 4(펩티드 P1, 프레가발린 결합 부위를 함유함):
서열번호 5(재조합 CACNA2D1(Cusabio) 단편):
서열번호 6(펩티드 P3, 카복시-말단 VGGC_α2 영역(I) + GGGGC 앵커):
서열번호 7(펩티드 P4, 카복시-말단 VGGC_α2 영역(II) + GGGGC 앵커):
서열번호 8(펩티드 P6, 카복시-말단 VGGC_α2 영역(IV) + GGGGC 앵커):
서열번호 9(펩티드 P8, 역 펩티드 P4 + GGGGC 앵커):
서열번호 10(펩티드 P9, P4 유사체 - 가장 유사한 것의 의해 치환된 모두 aa + GGGGC 앵커):
서열번호 11(펩티드 P10, P4 유사체 - 양으로 하전된 측쇄 A-치환된 + GGGC 앵커):
서열번호 12(펩티드 P11, P4 유사체 - 음으로 하전된 측쇄 A-치환된 + GGGC 앵커):
서열번호 13(펩티드 P12, P4 유사체 - 극성 측쇄 A-치환된 + GGGC 앵커):
서열번호 14(펩티드 P13, 위치 2의 리신(K)이 알라닌(A)에 의해 치환된 P4 유사체 + GGGC 앵커):
서열번호 15(펩티드 P14, 위치 4의 리신(K)이 알라닌(A)에 의해 치환된 P4 유사체 + GGGC 앵커):
서열번호 16(펩티드 P15, P4의 아미노-말단 부분 + GGGGC 앵커만을 함유하는 P4 유사체):
서열번호 17(R217A 돌연변이를 갖는 전장 인간 α2δ-1 재조합 단백질 PR2):
서열번호 18(K634A 돌연변이를 갖는 전장 인간 α2δ-1 재조합 단백질 PR3):
서열번호 19(R217A + K634A 돌연변이를 갖는 전장 인간 α2δ-1 재조합 단백질 PR4):
서열번호 20
서열번호 21
서열번호 22
서열번호 23
서열번호 24(PGB 결합 부위)
서열번호 25(RRR 모티프)
비-특허문헌
Claims (28)
- 서열번호 5에 실질적으로 제시된 아미노산 서열의 단편으로 이루어지고, 서열번호 20에 실질적으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 α2δ-1 펩티드.
- 제1항에 있어서,
단편이 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산을 추가로 포함하고, 서열번호 5 내에 배치된 서열번호 20과 동일한 단편의 N-말단 및/또는 C-말단에 위치하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 아미노산에 상응하는, α2δ-1 펩티드. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
서열번호 20 내지 23 중 어느 한 서열번호에 실질적으로 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 α2δ-1 펩티드. - 제3항에 있어서,
서열번호 20 내지 23의 처음 4개의 아미노산이 돌연변이되거나 변경되거나 치환되지 않고, 바람직하게는, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 또는 서열번호 23의 제4 아미노산(즉, K(리신))이 돌연변이되거나 변경되거나 치환되지 않는, α2δ-1 펩티드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
RRR 모티프를 추가로 포함하거나, RRR 모티프를 포함하는 별도의 펩티드에 접합되는 α2δ-1 펩티드. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 α2δ-1 펩티드에 결합할 수 있거나 이와 상호작용할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 α2δ-1 펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
- 제7항에 있어서,
서열번호 20에 실질적으로 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산. - 제7항 또는 제8항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 유전 구축물.
- 제9항에 따른 유전 구축물을 포함하는 재조합 벡터.
- 제9항에 따른 유전 구축물 또는 제10항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- (i) 하나 이상의 제11항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(ii) 상기 숙주 세포로부터 펩티드를 단리하여 단리된 α2δ-1 재조합 펩티드를 생성하는 단계
를 포함하는, 단리된 α2δ-1 재조합 펩티드의 제조 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 α2δ-1 펩티드, 또는 제12항에 따른 제조 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 α2δ-1 펩티드를 포함하는 막, 미셀 또는 리포좀.
- 제13항에 있어서,
재조합 막, 미셀, 리포좀 또는 α2δ-1 펩티드. - 제14항에 있어서,
막이 플라즈마 막 또는 세포소기관 막인, 막, 미셀, 리포좀 또는 α2δ-1 펩티드. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 α2δ-1 펩티드, 또는 서열번호 20에 실질적으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는, 전압-게이팅된 칼슘 채널의 α2δ-1 단백질에 결합하는 제제를 확인하기 위한 결합 검정 시험 시스템.
- 제16항에 있어서,
단리된 펩티드에 결합하는 양성 대조군을 포함하는 시험 시스템. - 제16항 또는 제17항에 있어서,
단리된 펩티드에 결합하지 않는 음성 대조군을 포함하는 시험 시스템. - 전압-게이팅된 칼슘 채널의 α2δ-1 단백질에 결합하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 제제와 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 α2δ-1 펩티드, 또는 서열번호 20에 실질적으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
- 제19항에 있어서,
흡광도, 형광 강도, 발광, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 역 표면 플라즈몬 공명(rSPR), 형광 편광, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 시분해 형광(TRF), 균질 시분해 형광(HTREF/TR-FRET), 알파 스크린 기술, 형광 수명, 단편 상보성 또는 FLIPR(칼슘 판독에 대한), ELISA, 방사성리간드 결합 검정 또는 면역침강을 사용하는 단계를 포함하는 방법. - 제19항 또는 제20항에 있어서,
시험 제제와 펩티드 사이의 결합을 검출하기 전에, 상기 시험 제제, 및 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 α2δ-1 펩티드, 또는 서열번호 20에 실질적으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법. - 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인되는, 치료법에, 약제로서 또는 진단에 사용하기 위한 약제.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인되는, α2δ-1 서브유닛이 치료 표적인 의학적 상태의 치료에 사용하기 위한 제제로서,
상기 의학적 상태가 통증, 신경병성 통증, 말초 신경계 통증, 중추 신경계 통증, 통각과민, 촉각 이질통, 섬유근육통, 하지 불안 증후군, 간질, 범불안 장애, 편두통, 사회 불안 장애, 공황 장애, 조증, 양극성 장애, 알코올 금단, 암, 요로 감염, 폐쇄성 폐 질환, 성 기능장애, 가와사키병, 심혈관 질환(예컨대, 협심증, 심근경색, 심부전) 및 호흡기 질환(예컨대, 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환)으로부터 선택되는, 제제. - 치료 효과량의 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인되는 제제를 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, α2δ-1 서브유닛이 치료 표적인 상태의 치료, 예방 또는 개선 방법.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인되는 제제, 및 약학적으로 허용되는 비히클을 포함하는, 제제의 약학 조성물.
- 단리된 α2δ-1 펩티드를 포함하는, 결합하는 제제를 확인하기 위한 펩티드의 용도로서, 상기 펩티드가 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 α2δ-1 펩티드, 또는 서열번호 20에 실질적으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 용도.
- α2δ-1 서브유닛이 치료 표적인 의학적 상태의 치료에 사용될 수 있는 제제를 확인하기 위한 단리된 α2δ-1 펩티드의 용도로서, 상기 펩티드가 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 α2δ-1 펩티드이거나, 서열번호 20에 실질적으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 용도.
- 제26항 또는 제27항에 있어서,
의학적 상태가 통증, 신경병성 통증, 말초 신경계 통증, 중추 신경계 통증, 통각과민, 촉각 이질통, 섬유근육통, 하지 불안 증후군, 간질, 범불안 장애, 편두통, 사회 불안 장애, 공황 장애, 조증, 양극성 장애, 알코올 금단, 암, 요로 감염, 폐쇄성 폐 질환, 성 기능장애, 가와사키병, 심혈관 질환(예컨대, 협심증, 심근경색, 심부전) 및 호흡기 질환(예컨대, 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환)으로부터 선택되는, 용도.
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