KR20160048121A - 인간 보체 c5에 결합하는 안정한 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아미노산 서열
[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
를 포함하며, 여기서 [BM]은 C5 결합 모티프이고; [L2]는 상호연결 루프이고; X42는 A 및 S로부터 선택되고; X43은 N 및 E로부터 선택되고; X46은 A, S 및 C로부터 선택되고; X52는 E, N 및 S로부터 선택되고; X53은 D, E 및 S로부터 선택되며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아니고; X54는 A 및 S로부터 선택된 것인, 인간 보체 성분 5 (C5)에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

인간 보체 C5에 결합하는 안정한 폴리펩티드 {STABLE POLYPEPTIDES BINDING TO HUMAN COMPLEMENT C5}
본 발명은 인간 보체 성분 5 (C5)에 결합하는 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드의 요법에서의 용도에 관한 것이다.
보체 단백질 C5는 보체계의 중심 성분으로; 선천성 면역계의 주요 부분이다. 보체계는 긴밀하게 제어되는 다양한 과정에서 수많은 임무를 수행하는 복잡한 면역 감시 시스템이다. 이는 다른 유기체에 의한 감염에 대해 제1선 숙주 방어 시스템으로서 기능하고, 또한 건강한 숙주 조직을 세포 파편 및 아폽토시스성 및 괴사성 세포로부터 구별하는 기능을 한다. 또한, 이는 면역 복합체의 클리어런스, 적응 면역 반응의 조절, 조직 재생의 촉진, 혈관신생, 줄기 세포의 이동 및 중추 신경계의 발달에 관여한다 (Woodruff et al. Mol Immunol 2011, 48 (14):1631-1642); Ricklin et al. Nat Immunol 2010, 11(9):785-795). 임의의 촉발인자, 예를 들어 보체 활성화 및 조절의 정밀한 균형을 방해하는 잘못된 또는 비제한된 활성화 또는 불충분한 조절은 광범위한 조직 손상으로 이어지는 숙주 세포의 자가-공격을 비롯한 병리학적 상태로 이어질 수 있다.
보체계는 약 30종의 단백질로 이루어진다. 보체를 개시시키는 3가지 경로; 세포 표면 상의 면역 복합체를 인식하는데 C1q를 사용하는 전형적 경로; 만노스-결합 렉틴 (MBL)이 특정 당을 인식할 때 개시되는 렉틴 경로; 및 침입 병원체 상에 존재하지 않는 특정 포유동물 세포 표면 분자에 의해 억제되는 과정인, 보체 인자 3 (C3)의 가수분해에 의해 자발적으로 개시되는 대체 경로가 존재한다. 대체 경로는 또한 보체계에 대한 증폭 루프로서 작용한다. 모든 3가지 경로는 C3의 수준에서 수렴된다. C3의 C3a 및 C3b로의 절단은 컨버타제의 형성으로 이어지고, 이는 이어서 보체 인자 5 (C5)를 C5a 및 C5b로 절단한다. C5a는 다양한 면역 세포의 매우 강력한 유인물질인 반면에, C5b는 C6-9와 함께 올리고머화하여 (막 공격 복합체 (MAC) 또는 때때로 말단 보체 복합체 (TCC)로 공지됨) 세공을 형성한다. 보체계의 활성화는 병원체의 중화를 목적으로 하는 다수의 메카니즘으로 이어지며; 침입 박테리아와 같은 세포의 표면 상에의 MAC의 형성은 용해로 이어지고, C3 및 C4 절단 생성물 C3b 및 C4b의 침착은 옵소닌화를 도와 대식세포에 의한 병원체의 식세포작용으로 이어지고, 아나필라톡신, 예컨대 C3a 및 C5a는 단핵구 및 호중구를 활성화 부위로 유인하고, 표면 마커를 상향-조절하며, 이는 증가된 면역학적 감수성 및 시토카인의 방출로 이어진다.
C5는 분자량이 각각 115 및 75 kDa인 2개의 디술피드-연결된 폴리펩티드 쇄, 알파 및 베타로 구성된 190-kDa 당단백질이다 (Tack et al. Biochem 1979, 18:1490-1497). 하빌랜드(Haviland) 등은 (J Immun 1991, 146: 362-368) 18-아미노산 리더 펩티드 및 베타 및 알파 쇄를 분리하는 4-아미노산 링커를 함유하는 1,676-아미노산 전구-분자 (서열 251)를 코딩하는 것으로 추정되는 인간 보체 전구-C5의 완전한 cDNA 서열을 구축하였다. C5는 보체 활성화의 모든 경로에 공통적이기 때문에, C5의 차단은 자극에도 불구하고 캐스케이드의 진행을 정지시킬 것이고, 그에 의해 근위 보체 캐스케이드의 면역보호 및 면역조절 기능은 무손상 상태로 두면서 말단 보체 활성화의 유해한 특성을 방지할 것이다.
일반적으로 병원체에 대한 방어에서의 보체계의 주요 역할은 이를 제약 개입에 대한 관심 표적이 되게 한다. 이는 보체의 많은 돌연변이 또는 손상된 조절이 다양한 질환 및 상태에 관여한다는 사실에 의해 강조된다. 이는 자가면역 질환, 예컨대 면역 복합체의 침착이 전형적 경로를 촉발시키는 전신 홍반성 루푸스 (SLE)에 대한 증가된 감수성을 포함한다 (Manderson et al. Annu Rev Immunol 2004, 22:431-456). 또한, 보체 단백질 C1-C5의 돌연변이는 종종 SLE 또는 SLE 유사 증상을 야기한다. 보체계가 강력하게 관여하는 다른 자가면역 질환은 면역 복합체가 류마티스 관절염 (RA) 관절 내의 보체를 활성화시킬 수 있는 RA, 쇼그렌 증후군, 피부근염 및 다른 자가항체 유발 질환, 예컨대 길랑-바레 증후군 (GBS), 피셔 증후군 (Kaida et al. J. Neuroimmun 2010, 223:5-12), 상이한 유형의 혈관염, 전신 경화증, 항-사구체 기저막 (항-GBM) 및 항-인지질 증후군 (APS)이다 (Chen et al. J Autoimmun 2010, 34:J276-J286). 또한, 보체 억제는 치주염 (Abe et al. J Immunol 2012, 189:5442-5448), 상처 치유 (Cazender et al. Clin Dev Immunol 2012, on-line publication), 종양 성장 (Markiewski et al. Nat Immunol 2008, 9:1225-1235) 및 눈의 질환, 예컨대 포도막염 및 연령-관련 황반 변성(AMD) (Copland et al. Clin Exp Immunol 2009, 159:303-314)과 같은 다양한 상태의 동물 모델에서 효과적인 것으로 증명되었다.
인간 보체 C5를 표적으로 하는 항체는 예를 들어 WO 95/29697; WO 02/30985; 및 WO 2004/007553에 공지되어 있다. 에쿨리주맙 (솔리리스(Soliris)™)은 단백질 C5에 대해 지시된 인간화 모노클로날 항체이고, C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 방지한다. 에쿨리주맙은 혈관내 용혈성 빈혈, 혈전성향증 및 골수 부전을 특징으로 하는 희귀하고 때때로 생명을 위협하는 혈액 질환인 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH)를 치료하는데 효과적인 것으로 밝혀졌고, 이러한 적응증에 대해 승인받았다. 에쿨리주맙은 또한 혈전성 미세혈관병증 (TMA)으로 나타나는 과다활성화를 유발하여 생명유지 기관, 예컨대 신장, 심장 및 뇌에 대한 지속적인 손상 위험을 초래하는, 대체 보체 경로의 제어 상실에 의해 유발되는 희귀하지만 생명을 위협하는 질환인 비정형 용혈성 증후군 (aHUS)의 치료에 대해 최근에 FDA에 의해 승인받았다. aHUS에서, 간이 제어 단백질 (가장 종종 보체 인자 H 또는 대체 경로의 다른 단백질)의 돌연변이된 형태를 계속 생산하기 때문에 손상된 기관의 이식은 환자를 단지 일시적으로 돕는다. 일과성 급성 병리생리상태를 갖는 관련 질환은 시가(Shiga) 독소 양성 이. 콜라이(E. coli)의 감염에 의해 유발되는 HUS (STEC-HUS)로, 이러한 상태에 대해서도 효능을 시사하는 유망한 임상 데이터가 존재한다 (Lapeyraque et al., N Engl J Med 2011, 364:2561-2563). 마지막으로, C5 차단 항체 에쿨리주맙은 매우 불일치하는 신장의 수용자에서 항체 매개 거부 (AMR)를 방지하고 (Stegall, M. D. et al. Am J Transplant 2011, 11:2405-2413), 자가면역 신경병증, 예컨대 시신경척수염 및 중증 근무력증을 치료하는데 (Pittock et al. Lancet Neurol 2013, 12:554-562; Howard et al. Muscle Nerve 2013, 48:76-84) 효과적인 것으로 증명되었다.
전장 항체 외의, C5를 표적으로 하는 단일-쇄 가변 단편 (scFV), 미니바디 및 압타머가 문헌에 기재되어 있다. 이들 C5 억제제는 C5 분자 상의 상이한 부위 (에피토프)에 결합할 수 있고, 상이한 작용 방식을 가질 수 있다. 예를 들어, 에쿨리주맙은 컨버타제 절단 부위와 약간 떨어진 거리에서 C5와 상호작용하는 반면에, 미니바디 무보디나(Mubodina)®는 절단 부위의 C5와 상호작용한다. 연진드기 오르니토도로스 모우바타(Ornithodoros moubata)로부터의 C5 억제 단백질 오르니토도로스 모우바타 보체 억제제 (OmCI, Nunn, M. A. et al. J Immunol 2005, 174:2084-2091)는 컨버타제 절단 부위에 근접한 CUB-C5d-MG8 슈퍼도메인의 원위 말단에 결합하는 것으로 가정되었다 (Fredslund et al. Nat Immunol 2008, 9 (7):753-760). C5의 절단을 억제하는 상기 언급된 3종의 단백질과 대조적으로, 모노클로날 항체 TNX-558은 C5의 절단을 억제하지 않으면서 무손상 C5 및 방출된 C5a 둘 다에 존재하는 C5a 에피토프에 결합한다. (Fung et al. Clin Exp Immunol 2003, 133 (2):160-169).
C5 결합 모티프를 포함하는 C5 결합 폴리펩티드는 WO 2013/126006으로서 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/SE2013/050139에 개시되어 있다. 특히, WO 2013/126006은 아미노산 서열
EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25 X26LX28D
로 이루어지고, 여기서 서로 독립적으로
X2는 H, Q, S, T 및 V로부터 선택되고;
X3은 I, L, M 및 V로부터 선택되고;
X4는 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
X6은 N 및 W로부터 선택되고;
X7은 A, D, E, H, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X11은 A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
X16은 N 및 T로부터 선택되고;
X17은 I, L 및 V로부터 선택되고;
X18은 A, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X21은 I, L 및 V로부터 선택되고;
X25는 D, E, G, H, N, S 및 T로부터 선택되고;
X26은 K 및 S로부터 선택되고;
X28은 A, D, E, H, N, Q, S, T 및 Y로부터 선택된 것인 C5 결합 모티프, BM을 개시한다.
WO 2013/126006에서 이전에 개시된 특정 C5 결합 모티프의 예는 본 특허 출원에서 서열 1-248로 제시된다.
WO 2013/126006으로부터, 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드가 C5 결합 폴리펩티드의 안정화를 개선시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 이러한 폴리펩티드의 한 예는 본 명세서에서 서열 250으로 제시된 알부민 결합 도메인 (ABD)이다. 적합한 알부민 결합 도메인의 다른 예는 WO 2009/016043 및 WO 2012/004384에 개시되어 있다. ABD-연장 폴리펩티드는 생체내에서 혈청 알부민에 결합하고, 폴리펩티드 자체의 순 반감기를 증가시키는 그의 보다 긴 반감기로부터 이익을 얻는다 (예를 들어, WO 91/01743 참조).
대등한 C5 차단 활성을 갖는 작용제의 계속적인 제공은 관련 기술분야에서 실질적인 관심사로 남아있다. 특히, 말단 보체 캐스케이드 뿐만 아니라 염증유발 분자 C5a의 형성을 방지하는 분자에 대한 필요가 계속 존재한다. 또한, 질환의 치료에서 이러한 분자의 용도를 제공하는 것이 큰 관심 대상이다.
도 1은 SDS-PAGE 겔을 도시하며, 여기서 밴드는 (0) 안정성 시험 전; 및 (2w) 안정성 시험 2주 후의 C5 결합 화합물 PSI0242 (서열 249)를 나타낸다.
도 2는 안정성 시험 전 (실선) 및 안정성 시험 2주 후 (점선) PSI0242 (서열 249)의 역상 HPLC로부터의 크로마토그램이다.
도 3은 SDS-PAGE 겔을 도시하며, 여기서 제1 레인은 씨블루(SeeBlue) 2P 크기 마커를 함유하고, 밴드는 (0) 최초 샘플; 및 (2w) 안정성 시험 2주 후 샘플을 나타낸다. 도 3A: 서열 249; 도 3B: 서열 261; 도 3C: 서열 262; 도 3D: 서열 264.
도 4는 안정성 시험 전 (실선) 및 안정성 시험 2주 후 (점선) C5 결합 화합물 (서열 253)의 역상 HPLC로부터의 크로마토그램이다.
도 5는 안정성 시험 전 (실선) 및 안정성 시험 2주 후 (점선) C5 결합 화합물 (서열 264)의 역상 HPLC로부터의 크로마토그램이다.
도 6a-d는 (0) 안정성 시험 전 및 (2w) 2주 후의 원래 및 변형 폴리펩티드 변이체를 비교한 SDS-PAGE 겔 영상을 보여준다. 분자 크기 마커 (Mw)는 노벡스(Novex)® 선명한 사전염색된 단백질 표준물 (216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3.5 kDa)이다. 도 6a는 HER2 결합 폴리펩티드의 겔을 보여주며, 여기서 레인은 레인 1: Mw, 레인 2: (0) Z02891 (서열 272), 레인 3: (2w) Z02891 (서열 272), 레인 4: Mw, 레인 5: (0) Z17341 (서열 273), 레인 6: (2w) Z17341 (서열 273), 레인 7: (0) Z17342 (서열 274), 레인 8: (2w) Z17342 (서열 274)를 보여준다. 도 6b는 PDGF-Rβ 결합 폴리펩티드의 겔이며, 여기서 레인은: 레인 1: Mw, 레인 2: (0) Z15805 (서열 275), 레인 3: (2w) Z15805 (서열 275), 레인 4: Mw, 레인 5: (0) Z17343 (서열 276), 레인 6: (2w) Z17343 (서열 276), 레인 7: (0) Z17344 (서열 277), 레인 8: (2w) Z17344 (서열 277)를 보여준다. 도 6c는 FcRn 결합 폴리펩티드의 겔을 보여주며, 여기서 레인은: 레인 1: (0) Z10103 (서열 278), 레인 2: (2w) Z10103 (서열 278), 레인 3: Mw, 레인 4: (0) Z17347 (서열 279), 레인 5: (2w) Z17347 (서열 279), 레인 6: (0) Z17348 (서열 280), 레인 7: (2w) Z17348 (서열 280)을 보여준다. 도 6c에서 관찰되는 대각선 밴드는 동일한 용기 내에서 염색된 제2 겔로부터의 흔적에 의해 생성된 부산물이다. 도 6d는 CAIX 결합 폴리펩티드의 겔이며, 여기서 레인은 레인 1: Mw, 레인 2: (0) Z09782 (서열 281), 레인 3: (2w) Z09782 (서열 281), 레인 4: Mw, 레인 5: (0) Z17351 (서열 282), 레인 6: (2w) Z17351 (서열 282), 레인 7: (0) Z17352 (서열 283), 레인 8: (2w) Z17352 (서열 283); 레인 9: (0) Z17355 (서열 284), 레인 10: (2w) Z17355 (서열 284), 레인 11: (0) Z17357 (서열 285), 레인 12: (2w) Z17357 (서열 285), 레인 13: (0) Z17359 (서열 286), 레인 14: (2w) Z17359 (서열 286), 레인 15: (0) Z17360 (서열 287), 레인 16: (2w) Z17360 (서열 287)을 보여준다.
도 7은
- C5 결합 모티프의 예 (서열 1-248);
- PSI0242로 명명된 C5 결합 화합물 (서열 249);
- 알부민 결합 도메인 (서열 250);
- 인간 C5의 스위스-프롯 엔트리 P01031 (서열 251), 여기서 α-쇄는 아미노산 잔기 678-1676에 상응하고, β-쇄는 아미노산 잔기 19-673에 상응함;
- 변형된 C5 결합 폴리펩티드의 예 (서열 260, 265-267);
- 변형된 C5 결합 화합물의 예 (서열 252-259, 261-264, 268-270);
- 다른 표적 분자에 대해 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드 변이체의 예 (서열 272, 275, 278, 281);
- 다른 표적에 대해 결합 친화도를 갖는 안정성 개선된 폴리펩티드 변이체의 예 (서열 273-274, 276-277, 279-280, 282-287)
의 아미노산 서열을 보여주는 표이다.
놀랍게도, 특정 위치에서 아미노산 서열이 변형된 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물이 이전에 공지된 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물과 비교할 경우에 개선된 안정성을 갖는다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은
(a) 아미노산 서열
[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
[BM]은 C5 결합 모티프이고;
[L2]는 DDPS 및 RQPE로부터 선택되고;
X42는 A 및 S로부터 선택되고;
X43은 N 및 E로부터 선택되고;
X46은 A, S 및 C로부터 선택되고;
X52는 E, N 및 S로부터 선택되고;
X53은 D, E 및 S로부터 선택되며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아니고;
X54는 A 및 S로부터 선택된 것인 폴리펩티드; 및
(b) (a)의 폴리펩티드와 적어도 89% 아미노산 서열 동일성을 가지며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아닌 폴리펩티드
로부터 선택된, 인간 보체 성분 5 (C5)에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명자들은 놀랍게도, WO 2013/126006에 기재된 바와 같은 C5 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열의 특정 위치(들)에서의 아미노산 잔기(들)의 변형 또는 치환이 생물학적 활성, 예컨대 인간 보체 성분 5 (C5)에 대한 결합 친화도 및 보체 경로 기능의 억제는 본질적으로 유지시키면서, C5 결합 폴리펩티드의 안정성을 개선시킨다는 것을 발견하였다. 따라서, 변형된 C5 결합 폴리펩티드의 생물학적 활성은 공지된 C5 결합 폴리펩티드의 생물학적 활성과 대등하다. 본 발명의 C5 결합 폴리펩티드의 안정성 시험은 X52에서 N으로부터 E 또는 S로의, 또는 X53에서 D로부터 E 또는 S로의 치환이 안정성을 개선시킨다는 것을 입증하였다. 또한, [L2]에서의 특정 아미노산 치환이 독립적으로 안정성을 촉진시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
본 명세서에 사용된 용어 "C5 결합" 및 "C5에 대한 결합 친화도"는, 예를 들어 예컨대 비아코어(Biacore) 기기 (지이 헬스케어(GE Healthcare))에서 표면 플라즈몬 공명 기술의 사용에 의해 시험될 수 있는 폴리펩티드의 특성을 지칭한다. C5 결합 친화도는 예를 들어 C5를 비아코어 기기의 센서 칩 상에 고정시키고, 시험할 폴리펩티드를 함유하는 샘플을 칩 위로 통과시키는 실험에서 시험될 수 있다. 대안적으로, 시험할 폴리펩티드를 기기의 센서 칩 상에 고정시키고, C5 또는 그의 단편을 함유하는 샘플을 칩 위로 통과시킨다. 이어서 통상의 기술자는 이러한 실험에 의해 수득된 결과를 해석하여 C5에 대한 폴리펩티드의 결합의 적어도 정성적인 측정치를 확립할 수 있다. 예를 들어 상호작용에 대한 겉보기 평형 해리 상수 KD를 결정하기 위해 정량적인 측정치를 원하는 경우에, 표면 플라즈몬 공명 방법을 또한 사용할 수 있다. 결합 값은 예를 들어 비아코어 2000 기기 (지이 헬스케어)에서 규정될 수 있다. C5는 측정 센서 칩 상에 고정되고, 친화도를 결정하고자 하는 폴리펩티드 샘플은 연속 희석에 의해 준비되고 칩 위로 주입된다. 이어서 KD 값은 예를 들어 기기 제조업체에 의해 제공된 비아이밸루에이션 소프트웨어의 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용한 결과로부터 계산될 수 있다. KD 결정에 사용된 C5 또는 그의 단편은 예를 들어 서열 251에 의해 나타내어지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. C5 결합 친화도가 어떻게 시험될 수 있는지의 예가 본원에서 주어지며, 실시예 3 및 5를 참조한다.
본 발명의 바람직한 형태에서, 상기 폴리펩티드는
(a) 아미노산 서열
AEAKYAK-[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP
를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
[BM], [L2], X42, X43, X46, X52, X53 및 X54가 상기 정의된 바와 같은 폴리펩티드; 및
(b) (a)의 폴리펩티드와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 가지며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아닌 폴리펩티드
로부터 선택된다.
이전에 WO 2013/126006에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드는 3-나선 다발 단백질 도메인의 부분을 형성할 수 있다. 상기 C5 결합 모티프 [BM]은 본질적으로 상기 3-나선 다발 내에 상호연결 루프를 갖는 2개의 알파 나선 부분을 형성할 수 있다. 본원에서 [L2]로 지칭되는 제2 상호연결 루프는 C5 결합 모티프를 "백본"으로 지칭되는 제3 알파 나선에 연결시킨다.
한 실시양태에서, C5 결합 모티프 [BM]은 본질적으로 WO 2013/126006에 개시된 바와 같다. 그러나, 본 발명에 따른 C5 결합 모티프는 바람직하게는 29개보다는 28개의 아미노산으로 이루어지고, 또한 추가의 아미노산 치환을 보유할 수 있다.
따라서 한 실시양태에서, 상기 [BM]은 WO 2013/126006에 개시된 바와 같은 [BM]과 비교할 경우에, 예를 들어 위치 17에서 적어도 하나의 추가의 아미노산 치환을 보유한다. 따라서, 상기 [BM]은 하기:
(a) 아미노산 서열
EX9X10X11A X13X14EIDX17X18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35
를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
X9가 H, Q, S, T 및 V로부터 선택되고;
X10이 I, L, M 및 V로부터 선택되고;
X11이 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
X13이 N 및 W로부터 선택되고;
X14가 A, D, E, H, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X17이 D 및 E로부터 선택되고;
X18이 A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
X23이 N 및 T로부터 선택되고;
X24가 I, L 및 V로부터 선택되고;
X25가 A, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X28이 I, L 및 V로부터 선택되고;
X32가 A, D, E, G, H, N, S 및 T로부터 선택되고;
X33이 K 및 S로부터 선택되고;
X35가 A, D, E, H, N, Q, S, T 및 Y로부터 선택된 것인 폴리펩티드; 및
(b) (a)의 폴리펩티드와 적어도 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드
로부터 선택된 폴리펩티드이다.
바람직한 실시양태에서, C5 결합 모티프 [BM]은 본질적으로 WO 2013/126006에 개시된 바와 같다. 상기 [BM]은 따라서
(a) 아미노산 서열
EX9X10X11A X13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35
를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
X9가 H, Q, S, T 및 V로부터 선택되고;
X10이 I, L, M 및 V로부터 선택되고;
X11이 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
X13이 N 및 W로부터 선택되고;
X14가 A, D, E, H, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X18이 A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
X23이 N 및 T로부터 선택되고;
X24가 I, L 및 V로부터 선택되고;
X25가 A, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X28이 I, L 및 V로부터 선택되고;
X32가 D, E, G, H, N, S 및 T로부터 선택되고;
X33이 K 및 S로부터 선택되고;
X35가 A, D, E, H, N, Q, S, T 및 Y로부터 선택된 것인 폴리펩티드; 및
(b) (a)의 폴리펩티드와 적어도 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드
로부터 선택된 폴리펩티드이다.
추가의 바람직한 측면에서, [BM]은 서열 1-248에서 위치 1-28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그것으로 이루어진다. 보다 바람직하게는, [BM]은 서열 1에서 위치 1-28로 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그것으로 이루어진다.
추가 측면에서, 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드는
(a) 아미노산 서열
AEAKYAKEX9X10X11AX13X14EIX17X18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP
를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
X9가 H, Q, S, T 및 V로부터 선택되고;
X10이 I, L, M 및 V로부터 선택되고;
X11이 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
X13이 N 및 W로부터 선택되고;
X14가 A, D, E, H, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X17이 D 및 E로부터 선택되고;
X18이 A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
X23이 N 및 T로부터 선택되고;
X24가 I, L 및 V로부터 선택되고;
X25가 A, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X28이 I, L 및 V로부터 선택되고;
X32가 A, D, E, G, H, N, S 및 T로부터 선택되고;
X33이 K 및 S로부터 선택되고;
X35가 A, D, E, H, N, Q, S, T 및 Y로부터 선택되고;
[L2]가 DDPS 및 RQPE로부터 선택되고;
X42가 A 및 S로부터 선택되고;
X43이 N 및 E로부터 선택되고;
X46이 A, S 및 C로부터 선택되고;
X52가 E, N 및 S로부터 선택되고;
X53이 D, E 및 S로부터 선택되며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아니고;
X54가 A 및 S로부터 선택된 것인 폴리펩티드; 및
(b) (a)의 폴리펩티드와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 가지며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아닌 폴리펩티드
로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드는
(a) 아미노산 서열
AEAKYAKEX9X10X11AX13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP
를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
X9가 H, Q, S, T 및 V로부터 선택되고;
X10이 I, L, M 및 V로부터 선택되고;
X11이 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
X13이 N 및 W로부터 선택되고;
X14가 A, D, E, H, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X18이 A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
X23이 N 및 T로부터 선택되고;
X24가 I, L 및 V로부터 선택되고;
X25가 A, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X28이 I, L 및 V로부터 선택되고;
X32가 D, E, G, H, N, S 및 T로부터 선택되고;
X33이 K 및 S로부터 선택되고;
X35가 A, D, E, H, N, Q, S, T 및 Y로부터 선택되고;
[L2]가 DDPS 및 RQPE로부터 선택되고;
X42가 A 및 S로부터 선택되고;
X43이 N 및 E로부터 선택되고;
X46이 A, S 및 C로부터 선택되고;
X52가 E, N 및 S로부터 선택되고;
X53이 D, E 및 S로부터 선택되며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아니고;
X54가 A 및 S로부터 선택된 것인 폴리펩티드; 및
(b) (a)의 폴리펩티드와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 가지며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아닌 폴리펩티드
로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 형태에서, 하기 18개, 임의로 19개 중 적어도 하나의 조건이 충족된다:
X9는 V이고,
X10은 L이고,
X11은 E이고,
X13은 W이고,
X14는 D이고,
임의로 X17은 D이고,
X18은 R이고,
X23은 T이고,
X24는 I이고,
X25는 E이고,
X28은 L이고,
X32는 N이고,
X33은 K이고,
X35는 D이고,
[L2]는 DDPS이고,
X42는 S이고,
X43은 E이고,
X46은 S이고,
X54는 S이다.
보다 바람직하게는, 상기 조건 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개 또는 19개가 충족된다.
한 실시양태에서, X52 및 X53은 독립적으로 E 및 S로부터 선택된다. 바람직하게는, (a) X52는 S이고 X53은 E이거나, 또는 (b) X52는 E이고 X53은 S이다.
한 실시양태에서, X52는 S이고 X53은 D이다.
또 다른 실시양태에서, X52는 N이고 X53은 E이다.
추가 측면에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 서열 260, 서열 265, 서열 266, 또는 서열 267로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
추가 측면에서,
a. 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드;
b. 스트렙토코쿠스 단백질 G의 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체; 및
c. 임의로, 상기 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체를 상기 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드의 C 또는 N 말단에 연결시키기 위한 적어도 하나의 연결 모이어티
를 포함하는, C5에 결합할 수 있는 화합물이 제공된다.
바람직하게는, 상기 알부민 결합 도메인은 서열 250으로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 연결 모이어티는 아미노산 서열 KVX60GS를 포함하며, 여기서 X60이 D, E 및 A로부터 선택된 것인 펩티드이다. X60이 D인 경우에, 바람직한 화합물은 서열 253으로 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그것으로 이루어진다. X60이 E인 경우에, 바람직한 화합물은 서열 261, 서열 263, 서열 264, 서열 269 또는 서열 270으로 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그것으로 이루어진다. X60이 A인 경우에, 바람직한 화합물은 서열 262로 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그것으로 이루어진다. C5 결합 화합물의 상기 열거된 아미노산 서열에서, 아미노산 잔기 1-57은 C5 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, 잔기 58-62는 링커의 아미노산 서열을 나타내고, 잔기 63-108은 알부민 결합 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
한 실시양태에서, 연결 모이어티는 부재한다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명에 따른 바람직한 C5 결합 폴리펩티드는 X52 및 X53이 독립적으로 E 및 S로부터 선택된 것을 포함한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 화합물은 PSI0242 (서열 249)로부터 유래될 수 있지만, 위치 52, 53 및 60 중 적어도 하나에서 변형을 갖는다. 예를 들어, 도 7 및 서열 목록에서 제시된 바와 같이, PSI0378 (서열 261)로 명명되는 바람직한 화합물은 아미노산 치환 N52S, D53E 및 D60E를 보유하고; PSI0379 (서열 262)로 명명되는 바람직한 화합물은 아미노산 치환 N52S, D53E 및 D60A를 보유하고; PSI0381 (서열 263)로 명명되는 바람직한 화합물은 아미노산 치환 N52E, D53S 및 D60E를 보유하고; PSI0383 (서열 264)으로 명명되는 바람직한 화합물은 아미노산 치환 N52S, D53E 및 D60E를 보유한다. 추가로, 서열 264는 또한 루프 [L2]에서의 치환, 즉 D36R, D37Q 및 S39E를 보유한다. 또한, PSI0403 (서열 269)으로 명명되는 바람직한 화합물은 아미노산 치환 D53E 및 D60E를 보유하고, PSI0404 (서열 270)로 명명되는 바람직한 화합물은 아미노산 치환 N52S 및 D60E를 보유한다.
상기 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 WO 2013/126006에 기재된 바와 같은 C5 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열의 특정 위치에서의 아미노산 치환이 안정성을 개선시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 치환은 생물학적 활성, 예컨대 C5 결합 능력 및 시험관내 용혈 억제를 유지시키면서 C5 결합 화합물의 안정성을 개선시킨다. 본 발명의 C5 결합 화합물의 안정성 시험은 예를 들어 각각의 N52S (X52) 및 D53E (X53) (서열 253)가 개별적으로, 뿐만 아니라 D60 (X60)의 제거 (서열 259, 연결 모이어티가 결여됨)가 안정성을 개선시킴을 입증한다. 치환 N52S, D53E 및 D60E 또는 D60A의 조합은 안정성을 추가로 개선시킨다 (서열 261 및 서열 262). 각각의 조합된 치환, N52S 및 D60E (서열 270) 및 D53E 및 D60E (서열 269)는 안정성을 개선시키는 것으로 유사하게 발견되었다. 이는 각각의 열거된 아미노산 치환이 폴리펩티드의 안정성을 개선시키는데 관여하고, 따라서 각각의 이들 치환이 이전에 공지된 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물과 비교하여 추가로 안정화된 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물을 제공할 것임을 나타낸다.
그러나, 통상의 기술자는 위치 52, 53 및 60 중 적어도 하나에서 및/또는 루프 [L2]에서 변형을 갖지만, 또한 치환, 적은 결실, 삽입 또는 역전과 같은 추가의 변형을 보유하고, 그럼에도 불구하고 개시된 생물학적 활성 및 개선된 안정성을 실질적으로 갖는 폴리펩티드 및/또는 화합물을 확인할 수 있을 것이다. 추가로, 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드 및/또는 화합물은 폴리펩티드의 생산, 정제, 생체내 또는 시험관내 안정화, 커플링 또는 검출을 개선시키는 추가의 C 말단 및/또는 N 말단 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 측면에서,
a. 하기:
a-1. 아미노산 서열
[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
[BM]은 C5 결합 모티프이고;
[L2]는 DDPS 및 RQPE로부터 선택되고;
X42는 A 및 S로부터 선택되고;
X43은 N 및 E로부터 선택되고;
X46은 A, S 및 C로부터 선택되고;
X52는 E, N 및 S로부터 선택되고;
X53은 D, E 및 S로부터 선택되고;
X54는 A 및 S로부터 선택된 것인 폴리펩티드; 및
a-2. a-1의 폴리펩티드와 적어도 89% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드
로부터 선택된, 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드;
b. 스트렙토코쿠스 단백질 G의 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체; 및
c. 상기 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체를 상기 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드의 C 또는 N 말단에 연결시키기 위한 적어도 하나의 연결 모이어티
를 포함하며; 여기서 연결 모이어티는 KVEGS 또는 KVAGS를 포함하거나, 또는 그것으로 이루어지거나; 또는 상기 연결 모이어티는 부재하는 것인, C5에 결합할 수 있는 화합물이 제공된다.
단독으로 서열 249의 위치 60에서의 D60의 제거 또는 아미노산 치환은 이전에 공지된 C5 결합 화합물과 비교하여 본 발명의 C5 결합 화합물의 안정성을 개선시킨다는 것을 발견하였다. 바람직하게는, 연결 모이어티는 KVEGS (X60=E)인 한편, X52X53은 ND일 수 있고, 이러한 연결 모이어티를 보유하는 바람직한 화합물의 예는 PSI0410 (서열 268)이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, D60 및 전체 연결 모이어티는 부재하고, 이러한 화합물의 예는 PSI0369 (서열 259)로 명명된 바람직한 화합물이다.
상기 측면의 실시양태에서, [BM] 및 알부민 결합 도메인은 상기 관련 측면에서 정의된 바와 같다. 바람직하게는, [L2]는 DDPS이다.
추가 측면에서,
a. 하기:
a-1. 아미노산 서열
[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
[BM]은 C5 결합 모티프이고;
[L2]는 RQPE이고;
X42는 A 및 S로부터 선택되고;
X43은 N 및 E로부터 선택되고;
X46은 A, S 및 C로부터 선택되고;
X52는 E, N 및 S로부터 선택되고;
X53은 D, E 및 S로부터 선택되고;
X54는 A 및 S로부터 선택된 것인 폴리펩티드; 및
a-2. a-1의 폴리펩티드와 적어도 89% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드
로부터 선택된, 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드;
b. 스트렙토코쿠스 단백질 G의 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체; 및
c. 임의로, 상기 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체를 상기 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드의 C 또는 N 말단에 연결시키기 위한 적어도 하나의 연결 모이어티
를 포함하는, C5에 결합할 수 있는 화합물이 제공된다.
루프 [L2]에서의 특정 아미노산 치환은 이전에 공지된 C5 결합 화합물과 비교하여 본 발명의 C5 결합 화합물 (예를 들어, 서열 252)의 안정성을 개선시킨다는 것을 발견하였다. 상기 측면의 실시양태에서, 상기 [BM] 및 알부민 결합 도메인은 개별적으로 상기 관련 측면에서 정의된 바와 같다. 바람직하게는, 상기 연결 모이어티는 아미노산 서열 KVX60GS를 포함하며 여기서 X60이 D, E 및 A로부터 선택된 것인 펩티드이다.
본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가로, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대 발현 벡터가 본 발명에 포함된다. 또한, 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 포함된다.
요법에 사용하기 위한, 상기 기재된 바와 같은 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물이 본 발명에 포함된다. 특히, 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물은 C5-관련 상태, 예컨대 염증성 질환; 자가면역 질환; 감염성 질환; 심혈관 질환; 신경변성 장애; 이식편 손상; 안질환; 신장 질환; 폐 질환; 혈액 질환, 예컨대 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH); 알레르기성 질환 및 피부과 질환의 치료 및/또는 예방 방법에 유용하다.
치료 및/또는 예방 방법에서, 상기 C5 결합 폴리펩티드 또는 화합물은 바람직하게는 정맥내로, 피하로, 흡입에 의해, 비강으로, 경구로, 유리체내로 또는 국소로 투여될 수 있다.
실시예
실시예 1: 공지된 C5 억제제의 안정성 시험
PSI0242 (서열 249)로 명명된 C5 결합 화합물을 25 mM NaP /125 mM NaCl pH 7.0 중에서 제제화하고, 37℃에서 2주 동안 가속 안정성 연구를 수행하였다. 안정성은 안정성 시험 후 SDS-PAGE 및 역상 HPLC (RPC)에 의한 새로운 변이체의 출현에 의해 측정하였다. 둘 다의 분석에서, 최초 샘플 및 안정성 연구를 수행한 샘플을 나란히 구동시켰다. SDS-PAGE의 경우에, 7.5 μg 단백질을 각각의 웰에 로딩시켰다. RPC는 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 이루어진 이동상 A를 사용하고, 0.1% TFA / 45% MeOH / 45% 이소프로필아민 (IPA) / 10% 물로 이루어진 이동상 B를 사용하여 애질런트(Agilent) 1100 HPLC 상에 구동시켰다.
결과는 인큐베이션 동안 새로운 형태의 단백질이 형성되었음을 보여주었고, 이들 새로운 형태는 SDS-PAGE에서 밴드로서 (도 1) 및 역상 HPLC (RPC) 크로마토그램에서 새로운 피크로서 (도 2) 가시화되었다. 도 2에서, 2주 인큐베이션 후의 주요 피크는 원래 단백질 샘플의 57%에 상응하였다.
서열 249에서 위치 1-60은, 이전에 WO 2013/126006에서 서열 753으로서 개시된, 폴리펩티드 Z06175a에 상응한다. PSI0242 (서열 249)는 본질적으로 WO 2013/126006에 개시된 바와 같이 생산하였다.
실시예 2: 변형된 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물의 안정성
변형된 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물을 본질적으로 WO 2013/126006에 기재된 바와 같이 합성하고 정제하였다.
간략하게, C5 결합 Z 변이체를 코딩하는 DNA를 이. 콜라이 코돈 최적화하고, 진아트, 게엠베하(GeneArt, GmbH)에 의해 합성하였다. C5 결합 Z 변이체를 나타내는 합성 유전자를 이. 콜라이에 서브클로닝하여 발현시켰다.
세포내 발현된 Z 변이체를 통상의 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제하였다. 균질화 및 정화는 초음파처리에 이어 원심분리 및 여과에 의해 수행하였다. 음이온 교환 크로마토그래피를 포획 단계로서 사용하였다. 추가 정제는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 정제는 산성 조건 (pH 5.5) 하에 실시하였다. 폴리싱 및 완충제 교환은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행하였다.
정제된 단백질을 25 mM NaP /125 mM NaCl pH 7.0 중에서 제제화하고, 37℃에서 2주 동안 가속 안정성 연구를 수행하였다. 안정성은 안정성 시험 후 SDS-PAGE 및 역상 HPLC (RPC)에 의한 새로운 변이체의 출현에 의해 측정하였다. 둘 다의 분석에서, 최초 샘플 및 안정성 연구를 수행한 샘플을 나란히 구동시켰다. SDS-PAGE의 경우에, 7.5 μg 단백질을 각각의 웰에 로딩시켰다. 생성된 겔의 예를 도 3에 제시한다.
RPC는 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 이루어진 이동상 A, 및 0.1% TFA / 45% MeOH / 45% 이소프로필아민 (IPA) / 10% 물로 이루어진 이동상 B를 사용하여 애질런트 1100 HPLC 상에 구동시켰다. 생성된 크로마토그램의 예를 서열 253에 대한 것으로 도 4에 제시한다.
안정성 시험의 결과를 하기 표 I에 요약하였다.
<표 I>
Figure pct00001
표 I로부터, 특정 변형된 C5 결합 폴리펩티드 또는 화합물이 PSI0242와 비교할 경우에 개선된 특성, 예컨대 증가된 안정성을 갖는 것으로 결론내릴 수 있다. 이러한 개선된 C5 결합 폴리펩티드 또는 화합물은 PSI0334 (서열 253), PSI0340 (서열 258), PSI0369 (서열 259), PSI0377 (서열 260), PSI0378 (서열 261), PSI0379 (서열 262), PSI0381 (서열 263), PSI0383 (서열 264), PSI0400 (서열 267), PSI0410 (서열 268), PSI0403 (서열 269) 및 PSI0404 (서열 270)를 포함한다. 언급된 변이체 중 6종 (서열 253, 260, 261, 262, 264 및 267)에서, 위치 52-53의 아미노산 잔기는 ND (cf PSI0242)로부터 SE로 치환되었다. 서열 263에서, 상응하는 치환은 ND로부터 ES로이다. 서열 269에서는 위치 53의 아미노산 잔기 만이 D로부터 E로 치환되었고, 한편 서열 270에서는 위치 52의 아미노산 잔기가 N으로부터 S로 치환되었다.
추가로, PSI0378 (서열 261), PSI0381 (서열 263), PSI0383 (서열 264), PSI0410 (서열 268), PSI0403 (서열 269) 및 PSI0404 (서열 270)는 공통적으로 위치 60에서 D에서 E로의 아미노산 잔기 치환을 갖는다.
위치 52 또는 53 및 위치 60에서의 안정성 증진 치환의 조합 이익은 PSI0383 (서열 264)의 크로마토그램을 보여주는 도 5에서 관찰할 수 있다. PSI0379 (서열 262)에서 위치 60에서의 치환은 D로부터 A로이다.
PSI0369 (서열 259)에서 링커 모이어티 (D60 포함)를 전부 제거하였고, 이는 보다 안정한 C5 결합 화합물이 생성되게 하고, C5 결합 화합물의 안정성에 대한 위치 60의 영향을 보여주었다.
실시예 3: 변형된 화합물의 인간 C5에 대한 결합
인간 혈청 알부민을 아민 반응성 제2 세대 (AR2G) 딥 및 판독 바이오센서 (폴 라이프 사이언시스(Pall Life sciences) (포르테바이오(ForteBio)) Cat # 18-5092)에 아민 커플링에 의해 고정시켰다. 판독 완충제 (HBS-EP 사용준비 완충제 200 ml, 지이 헬스케어 #BR100188) 중 PSI0242 (서열 249; 1 μM) 및 C5 결합 화합물 (1 μM)을 각각 HSA가 존재하는 개별 센서 상에 120초 동안 로딩시킨 다음, 판독 완충제 중에서 60초 동안 기준선 기록한 후, 판독 완충제 중 0.79 nM 내지 25 nM 범위의 농도에서 인간 C5 (퀴델(Quidel) Cat # 403)에 대해, 재생 사이클 및 각각의 농도 사이에서의 기준선 기록을 병행하면서, 적용하였다. 센서에 대한 재생 조건은 10 mM 글리신, pH 2 (30초 3개 펄스 및 60초 동안 구동 완충제)였다. 각각의 분광도는 알부민 결합 도메인 (서열 250)을 함유하지만 C5 결합 능력은 없는 유사한 구축물에 대해 차감된 참조값이다. 데이터를 포르테바이오 어낼리시스(ForteBio Analysis) 7.1 (폴 라이프 사이언시스 (포르테바이오) 동역학 소프트웨어)을 사용하여 랭뮤어 1:1 모델에 따라 분석하였다.
C5와의 상호작용의 KD를 PSI0242 (서열 249)와 대비하여 표 II에 제시한다. PSI0242의 KD는 상이한 구동에서 1-3 nM로 달라졌다.
표 II의 결과는 본 발명에 따른 C5 결합 화합물이 WO 2013/126006에 개시된 폴리펩티드 PSI0242 (서열 249)의 그것과 유사한 인간 C5에 대한 결합 능력을 가짐을 나타낸다.
<표 II>
Figure pct00002
실시예 4: 화학적으로 합성된 C5 결합 폴리펩티드의 안정성
바켐 아게(BACHEM AG)로부터 화학적으로 합성된 PSI0400 (서열 267)을 주문하였다. 폴리펩티드의 안정성을 실시예 2와 동일한 방법론에 따라 시험하였다. 안정성 시험의 결과를 표 III에 제시한다.
<표 III>
Figure pct00003
PSI0400의 안정성은 실시예 2에서 이. 콜라이에서 생산된 폴리펩티드와 대등하였다.
PSI0400 (서열 267)의 폴드의 완전성을 실시예 2의 방법에 따라 생산된 재조합 C5 결합 폴리펩티드 (PSI0257, 서열 271)와, 원 UV 원형 이색성 (CD) 스펙트럼을 사용하여 비교하였다.
CD 스펙트럼을 J-720 CD 분광편광계 (일본 야스코(Jasco))에 의해 기록하였다. 샘플을 Pi 완충제 (5 mM Na-K-PO4, pH 7.0)를 사용하여 0.17 mg/ml 단백질 농도로 희석시켰다. Pi 완충제의 CD 스펙트럼을 먼저 기록한 다음, 각각의 샘플에 대한 스펙트럼을 기록하고, 마지막으로 Pi 완충제에 대해 다시 기록하였다. 2개의 완충제 스펙트럼이 일치하였기 때문에, 먼저 기록된 스펙트럼을 완충제 스펙트럼으로서 사용하였다. 완충제 스펙트럼을 사비츠키-골레이(Savitzky-Golay) 절차를 사용하여 25의 컨볼루션 폭으로 평활하게 하였다. 다른 스펙트럼을 동일한 절차에 따라 15의 컨볼루션 폭으로 평활하게 하였다. 이어서 평활화된 완충제 스펙트럼을 각각의 다른 평활화된 스펙트럼으로부터 차감하였다. CDNN 프로그램을 사용하여 단백질의 2차 구조 함량을 추정하고, 생성된 추정치를 표 IV에 제시한다. 결과는 위치 52 및 53에서의 2개의 아미노산 치환 또는 화학적 합성에 의한 폴리펩티드 생산의 어떤 것도 화학적으로 합성된 폴리펩티드의 2차 구조 함량에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었다. 2차 구조 함량의 완전성을 재조합적으로 생산된 PSI0257 (서열 271)과 비교하였다.
<표 IV>
Figure pct00004
실시예 5: 변형된 화합물 및 폴리펩티드의 인간 C5에 대한 결합
C5 결합 화합물 PSI0242 (서열 249), PSI0340 (서열 258), PSI0378 (서열 261), 및 PSI0410 (서열 268) 및 C5 결합 폴리펩티드 PSI0400 (서열 267)의 인간 C5에 대한 결합 친화도를 비아코어 T200 기기 (지이 헬스케어)를 사용하여 분석하였다. 인간 C5 (A403, 퀴델 코포레이션(Quidel Corporation))를 제조업체의 프로토콜에 따라 아민 커플링 화학을 사용하여 CM5 센서 칩 (900 RU)에 커플링시켰다. 커플링은 10 mM Na-아세테이트 완충제 pH=5 (지이 헬스케어) 중 7.5 μg/mL 농도의 hC5를 주입함으로써 수행하였다. 참조 셀을 동일한 시약으로 처리하되 인간 C5는 주입하지 않았다. 고정된 hC5에 대한 C5 결합제의 결합은, HBS-EP 완충제 (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 지이 헬스케어) 중 5가지 농도의 샘플, 전형적으로 25, 12.5, 6.25, 3.12 및 1.56 nM을 차례로, 주입 사이에 재생 없이 동일한 사이클에서 25℃에서 30 μL/분의 유량으로 주입하는, 단일 사이클 동역학 방법을 사용하여 연구하였다. 참조 셀로부터의 데이터를 차감하여 벌크 굴절률 변화를 보상하였다. 대부분의 경우에, HBS-EP의 주입을 또한 대조군으로서 포함시켜 센소그램을 이중 블랭크화하였다. 표면을 HBS-EP 완충제 중에서 재생시켰다. 비아코어 T200 평가 소프트웨어 버전 1.0의 랭뮤어 1:1 분석물 모델을 사용하여 센소그램으로부터 동역학 상수를 계산하였다. 생성된 상호작용 KD 값을 표 V에 작성하였다.
<표 V>
Figure pct00005
안정성 증진 아미노산 치환은 분자가 C5에 결합하는 능력에 유해하지 않았고, 따라서 그의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않았다.
실시예 6: 용혈의 억제
전형적 보체 경로 기능, 및 C5 결합 화합물 PSI0378 (서열 261) 및 PSI0410 (서열 268), 및 C5 결합 폴리펩티드 PSI0400 (서열 267)에 의한 그의 억제의 연구를 위해, 양 적혈구를 알시버 용액 (스웨덴 국립 수의학 연구소) 중 신선한 양 전혈로부터 준비하고, 이후 이를 토끼 항-양 적혈구 항혈청 (시그마(Sigma))으로 처리하여 항체 감작화된 양 적혈구 (EA)가 되게 하였다. 전체 과정은 무균 조건 하에 수행하였다. 모든 다른 시약은 상업적 공급원으로부터의 것이다.
시험관내 검정은 96-웰 U자형 마이크로타이터 플레이트에서 시험 단백질, 보체 혈청 및 EA 현탁액의 연속 첨가에 의해 구동시켰다. 웰당 50 μL의 총 반응 부피 및 pH 7.3-7.4에서 모든 시약의 최종 농도는 다음과 같았다: 0.15 mM CaCl 2; 0.5 mM MgCl 2; 3 mM NaN 3; 138 mM NaCl; 0.1% 젤라틴; 1.8 mM 바르비탈나트륨; 3.1 mM 바르비투르산; 5백만개의 EA; 적합하게 희석된 보체 단백질 C5 혈청, 및 목적하는 농도의 C5 결합 화합물 또는 폴리펩티드.
C5 결합 화합물 및 폴리펩티드를 빙상에서 20분 동안 상기 기재된 보체 혈청과 사전-인큐베이션시킨 후, EA 현탁액의 첨가에 의해 반응을 개시시켰다. 37℃에서 45분 동안의 교반 동안 용혈성 반응이 진행되게 한 다음, 0.02% 트윈(Tween) 20을 함유하는 100 μL 빙냉 염수의 첨가에 의해 임의로 종료시켰다. 세포를 저부로 원심분리하고, 100 μL 상청액에 해당하는 상부 부분을 반-면적 및 편평-바닥 웰을 갖는 투명 마이크로플레이트로 옮겼다. 반응 결과를 415 nm의 파장에서 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도로서 분석하였다.
모든 시험의 경우에, 대조군 샘플 (PSI0242, 서열 249) 및 비히클을 각각의 플레이트에 포함시켜 비억제 및 완전 억제 반응에 대한 값을 각각 규정하였다. 이들 값을 사용하여 임의의 주어진 샘플 농도에서 보체 용혈의 % 억제를 계산하였다. 시험된 C5 결합 화합물 및 폴리펩티드의 억제 효력 (IC 50-값)은, 첨가된 제어 농도의 인간 C5의 존재 하에서의 동일한 검정을 C5 고갈 혈청에 적용하여 규정하였다. 고도로 강력한 억제제 (낮은 나노몰 내지 나노몰 미만)의 경우에 반응 혼합물의 최종 C5 농도는, C5 고갈 또는 결핍 혈청을 사용하여 임의로 확립한 0.1 nM로 제어하였다. 결과를 하기 표 VI에 제시한다.
<표 VI>
Figure pct00006
용혈 검정으로부터의 결과는 개선된 C5 결합 화합물 서열 261 및 268이 참조 화합물과 대등함을 보여준다. C5 결합 폴리펩티드 서열 267은 검정에서 기능적이었지만, 이것은 알부민 결합 도메인을 함유하지 않기 때문에, 결과를 참조 화합물과 직접 비교할 수 없었다.
실시예 7: 인간 알부민에 대한 결합
알부민에 대한 C5 결합 화합물 결합 친화도의 평가를 위해, 각각 노보자임스(Novozymes), 아피바디 AB(Affibody AB) 및 다코시토메이션(DakoCytomation)으로부터 구입한 재조합 인간 알부민 (코팅) 및 상업적으로 입수가능한 항체 (1차 및 검출)를 사용하는 인간 알부민 ELISA를 사용하였다. C5 결합 폴리펩티드 및 스트렙토코쿠스 단백질 G의 알부민 결합 도메인을 포함하는 PSI0242 (서열 249)로부터 제조된 방법 표준물을 샘플의 정량화를 위해 사용하였다. 96-웰 마이크로플레이트를 재조합 인간 알부민으로 코팅하였다. 이어서 플레이트를 0.05% 트윈 20을 함유하는 포스페이트 완충 염수 (PBST)로 세척하고, PBS 중 1% 카세인으로 1-2시간 동안 차단시켰다. 플레이트 세척 후에, 표준물, 방법 대조군, 대조군 샘플 및 시험 샘플을 플레이트에 첨가하였다. 2시간 동안 인큐베이션한 후에, 미결합 물질을 세척에 의해 제거하였다. 염소 항-아피바디® IgG (아피바디 AB, 카탈로그 번호 20.1000.01.0005)를 웰에 첨가하고, 플레이트를 1.5시간 동안 인큐베이션하여, 결합된 C5 결합 화합물에 결합하게 하였다. 세척 후에, 토끼 항-염소 IgG HRP가 염소 항체에 1시간 동안 결합되게 하였다. 최종 세척 후 결합된 HRP의 양을, 효소에 의해 청색 생성물로 전환되는 TMB 기질의 첨가에 의해 검출하였다. 30분 후 1 M 염산을 첨가하여 반응을 정지시켰고, 웰 내용물의 색상이 청색에서 황색으로 변하였다. 참조 파장으로서 650 nm에서의 흡광도를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 광도측정에 의해 측정하였다. 색상 강도는 PSI0242 (서열 249)의 양에 비례하였고, 표준 곡선으로부터 샘플 농도를 결정하였다.
스트렙토코쿠스 단백질 G의 알부민 결합 도메인을 포함하는 C5 결합 화합물은 인간 알부민에 결합할 수 있는 것으로 증명되었고, 데이터를 하기 표 VII에 제시한다.
<표 VII>
Figure pct00007
검정으로부터의 결과는 조사된 둘 다의 안정성 개선된 C5 결합 화합물이 인간 알부민에 결합하는 그의 능력을 유지한다는 것을 보여주었다.
실시예 8: C5 결합 폴리펩티드/화합물의 3개월 안정성 시험
37℃에서의 2주 안정성 시험 (실시예 2)에서 PSI0242와 비교하여 개선된 안정성을 나타낸 C5 결합 폴리펩티드/화합물에 대해 37℃에서의 보다 긴 3개월 안정성 시험을 수행하였다. 안정성 시험의 설정은 실시예 2에 기재된 바와 같았고, 안정성의 평가는 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행된 역상 HPLC (RPC) 방법에 의해 총 단백질 함량의 크로마토그램 백분율의 주요 피크를 측정함으로써 수행하였다. 해석을 보다 용이하게 하기 위해 실시예 2로부터의 2주 데이터를 하기 표 VIII에 포함시켰다.
<표 VIII>
Figure pct00008
위치 52, 53에서 ND로부터 SE로의 아미노산 치환 및 위치 60에서 D로부터 E 또는 A로의 대체를 갖는 C5 결합 화합물 (서열 261, 264, 및 262)은 PSI0242와 비교하여, 동일한 조건에서 2주 후에 PSI0242 (서열 249)가 갖는 것보다 37℃에서 3개월 후에 보다 높은 비율의 원래 형태의 단백질을 가졌다. 다른 화합물도 또한 증가된 안정성을 나타내었다.
실시예 9: 유사하게 변형된 폴리펩티드의 안정성
C5 외의 다른 표적 분자에 대해 결합 친화도를 갖는 단백질 Z로부터 유래된 이전에 공지된 폴리펩티드 변이체 (Groenwall et al. J Biotechnol 2007, 128:162-183)를 안정성을 개선시키기 위해 아미노산 서열의 특정 위치에서 유사하게 변형시켰다. 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 혈소판-유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGF-Rβ), 신생아 Fc 수용체 (FcRn), 및 탄산 안히드라제 IX (CAIX)에 대해 결합 친화도를 갖는 원래 폴리펩티드 변이체의 선택 및 생산은 예를 들어 WO 2009/080810, WO 2009/077175, PCT/EP2014/055299, 및 WO 2014/096163에 개시되어 있다. 안정성 개선된 폴리펩티드 변이체를 아미노산 서열의 선택된 위치에서의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 생산하였다. HER2를 표적으로 하는 폴리펩티드 변이체 Z02891 (서열 272); PDGF-Rβ를 표적으로 하는 Z15805 (서열 275); FcRn을 표적으로 하는 Z10103 (서열 278); 및 CAIX를 표적으로 하는 Z09782 (서열 281)에서의 안정성 개선 아미노산 치환이 하기 표 IX에 명시되어 있다. 이들 안정성 개선된 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 이들이 HER2, PDGF-Rβ, FcRn, 및 CAIX에 대해 결합 친화도를 갖는 결합 모티프 [BM]을 갖는다는 점에서 본 발명의 C5 결합 폴리펩티드와 상이하다.
모든 변이체를 N-말단 6 x 히스티딘-태그 (His6)와 함께 클로닝하였고, 달성된 구축물은 폴리펩티드를 MGSSHHHHHHLQ-[Z#####] 포맷으로 코딩하였다. 목적하는 아미노산 치환을 코딩하는 중첩 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하고 확립된 분자 생물학 기술을 적용함으로써 돌연변이를 폴리펩티드 변이체의 플라스미드에 도입하였다. 정확한 플라스미드 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
이. 콜라이 (균주 T7E2) 세포 (진브리지(GeneBridge))를 원래의 폴리펩티드 및 변형된 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 단편을 함유하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 세포를 50 μg/ml 카나마이신으로 보충된 TSB-YE 배지 중에서 37℃에서 배양하고, 이어서 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 펠릿화 세포를 패스트프렙(FastPrep)®-24 균질화기 (노르딕 바이오랩스(Nordic Biolabs))를 사용하여 파괴시키고, 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하였다. His6-태그부착된 단백질로서 폴리펩티드 변이체를 함유하는 각각의 상청액을 His 그래비트랩(GraviTrap)™ 칼럼 (지이 헬스케어)을 사용하는 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 제조업체의 지침에 따라 정제하였다. 정제된 폴리펩티드 변이체를 PD-10 탈염 칼럼 (지이 헬스케어)을 사용하여 포스페이트-완충 염수 (PBS; 1.47 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, pH 7.4)로 완충제 교환하였다. 각각의 폴리펩티드의 정확한 동일성을 SDS-PAGE 및 HPLC-MS에 의해 확인하였다.
<표 IX>
Figure pct00009
N52 및 D53 중 어느 하나 (서열 284-287) 또는 둘 다 (서열 273-274, 276-277, 279-280, 282-283)의 치환 이외에, 루프 [L2]에 상응하는 위치에서 또한 치환을 수행하였다. 이에 따라, 서열 274, 277, 280, 283, 285, 및 287의 폴리펩티드 변이체에서, [L2]는 RQPE이다.
안정성 시험을 수행하기 위해, PBS pH 7.4 중에서 제제화된 폴리펩티드 변이체를 1 mg/ml로 희석하고, 200 μl 분취물을 37℃에서 2주 동안 인큐베이션하였다. 안정성 시험 전 및 후에 수집된 샘플을 10% 비스-트리스 NuPAGE 겔 (인비트로젠(Invitrogen))을 사용하는 SDS-PAGE에 의해 각각의 웰에 5 μg 단백질을 로딩하여 분석하였다. 생성된 쿠마시 블루 염색된 겔을 도 6에 제시한다. 안정성은 상승된 온도에서의 인큐베이션 후에 새로운 변이체의 출현에 의해 평가하였고, 돌연변이된 변이체를 각각의 원래의 폴리펩티드와 비교하였다.
표 IX에 개략된 바와 같은 변형을 갖는 모든 폴리펩티드 변이체는 원래의 폴리펩티드 샘플에 대해 관찰된 주요 밴드 바로 위의 제2 밴드가 치환 D53E 및/또는 N52S를 갖는 변형된 폴리펩티드 샘플에서는 보이지 않는다는 점에서 각각의 원래의 폴리펩티드와 비교하여 개선된 안정성을 나타내었고, 도 6을 참조한다. 치환 D36R, D37Q 및 S39E와 조합된 치환 D53E 및/또는 N52S를 갖는 폴리펩티드는 SDS-PAGE 겔 상에서 유사한 프로파일을 나타내었다. 치환 D53E 단독 또는 치환 D36R, D37Q 및 S39E와의 조합은 SDS-PAGE 겔 상에서 제2 밴드로서 관찰된 대안적 확인을 갖는 종의 양을 감소시키는 것으로 보이지만, 이러한 종의 형성을 완전히 방지할 수는 없었다.
또한, 변형된 폴리펩티드 변이체의 결합 능력을 시험하였다. 모든 폴리펩티드 변이체는 변형 후에 그의 표적에 대한 그의 결합 친화도를 유지하였다 (결과는 제시하지 않음).
C5 외의 다른 표적 분자에 대해 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드 변이체에 대한 상기 제시된 결과는 본 발명의 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물에 대해 제시된 결과와 잘 상응한다 (예를 들어, 실시예 2 및 4 참조). 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 특정 아미노산 변형은 [BM]의 아미노산 서열과 관계없이 안정화 효과를 갖는 것으로 보인다. 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 변형 또는 치환은 따라서 본원 및 WO 2013/126006에 기재된 바와 같은 모든 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물의 안정성을 개선시키는 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> Swedish Orphan Biovitrum AB <120> STABLE POLYPEPTIDES BINDING TO HUMAN COMPLEMENT C5 <130> 21070713 <160> 287 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 1 Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 2 Glu Val Leu Glu Ala Trp Asn Glu Ile Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 3 Glu Val Ile Glu Ala Trp Asn Glu Ile Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 4 Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile Asp 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Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 252 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Arg Gln Pro Glu Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 253 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 253 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 254 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 254 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Leu His Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 255 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 255 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 256 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 256 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 257 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 257 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Ala 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 258 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 258 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 259 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 259 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala 50 55 60 Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg 65 70 75 80 Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp 85 90 95 Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 <210> 260 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 260 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro 50 55 <210> 261 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 261 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys Val Glu Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 262 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 262 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys Val Ala Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 263 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 263 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Glu Ser Ser Gln Ala Pro Lys Val Glu Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 264 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 264 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Arg Gln Pro Glu Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys Val Glu Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 265 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 265 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Glu Ser Ser Gln Ala Pro 50 55 <210> 266 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 266 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Arg Gln Pro Glu Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro 50 55 <210> 267 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 267 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 268 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 268 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Glu Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 269 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 269 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Val Glu Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 270 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 270 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Glu Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 100 105 <210> 271 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 271 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser 50 55 60 <210> 272 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 272 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 273 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 273 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 274 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 274 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Lys Leu Tyr Arg Gln Pro Glu Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 275 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 275 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Ile Glu Ala Ala Ala Glu Ile 1 5 10 15 Asp Ala Leu Pro Asn Leu Thr Arg Arg Gln Trp Asn Ala Phe Ile Lys 20 25 30 Lys Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 276 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 276 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Ile Glu Ala Ala Ala Glu Ile 1 5 10 15 Asp Ala Leu Pro Asn Leu Thr Arg Arg Gln Trp Asn Ala Phe Ile Lys 20 25 30 Lys Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 277 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 277 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Ile Glu Ala Ala Ala Glu Ile 1 5 10 15 Asp Ala Leu Pro Asn Leu Thr Arg Arg Gln Trp Asn Ala Phe Ile Lys 20 25 30 Lys Leu Val Arg Gln Pro Glu Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 278 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 278 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Asp Ala Ala Ala His Glu Ile 1 5 10 15 Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe Ile His 20 25 30 Lys Leu Ala Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 279 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 279 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Asp Ala Ala Ala His Glu Ile 1 5 10 15 Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe Ile His 20 25 30 Lys Leu Ala Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 280 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 280 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Asp Ala Ala Ala His Glu Ile 1 5 10 15 Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe Ile His 20 25 30 Lys Leu Ala Arg Gln Pro Glu Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 281 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 281 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Leu Phe Ala Gly Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ser Asp Leu Pro Asn Leu Thr Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Phe Ile Tyr 20 25 30 Lys Leu Trp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 282 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 282 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Leu Phe Ala Gly Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ser Asp Leu Pro Asn Leu Thr Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Phe Ile Tyr 20 25 30 Lys Leu Trp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 283 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 283 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Leu Phe Ala Gly Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ser Asp Leu Pro Asn Leu Thr Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Phe Ile Tyr 20 25 30 Lys Leu Trp Arg Gln Pro Glu Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 284 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 284 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Leu Phe Ala Gly Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ser Asp Leu Pro Asn Leu Thr Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Phe Ile Tyr 20 25 30 Lys Leu Trp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 285 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 285 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Leu Phe Ala Gly Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ser Asp Leu Pro Asn Leu Thr Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Phe Ile Tyr 20 25 30 Lys Leu Trp Arg Gln Pro Glu Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 286 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 286 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Leu Phe Ala Gly Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ser Asp Leu Pro Asn Leu Thr Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Phe Ile Tyr 20 25 30 Lys Leu Trp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 287 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 287 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Leu Phe Ala Gly Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ser Asp Leu Pro Asn Leu Thr Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Phe Ile Tyr 20 25 30 Lys Leu Trp Arg Gln Pro Glu Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55

Claims (28)

  1. (a) 아미노산 서열
    [BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
    를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
    [BM]은 C5 결합 모티프이고;
    [L2]는 DDPS 및 RQPE로부터 선택되고;
    X42는 A 및 S로부터 선택되고;
    X43은 N 및 E로부터 선택되고;
    X46은 A, S 및 C로부터 선택되고;
    X52는 E, N 및 S로부터 선택되고;
    X53은 D, E 및 S로부터 선택되며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아니고;
    X54는 A 및 S로부터 선택된 것인 폴리펩티드; 및
    (b) (a)의 폴리펩티드와 적어도 89% 아미노산 서열 동일성을 가지며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아닌 폴리펩티드
    로부터 선택된, 인간 보체 성분 5 (C5)에 결합할 수 있는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 아미노산 서열
    AEAKYAK-[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP
    를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
    [BM], [L2], X42, X43, X46, X52, X53 및 X54가 제1항에 정의된 바와 같은 폴리펩티드; 및
    (b) (a)의 폴리펩티드와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 가지며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아닌 폴리펩티드
    로부터 선택된 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X52 및 X53이 독립적으로 E 및 S로부터 선택된 것인 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, (a) X52가 S이고 X53이 E이거나, 또는 (b) X52가 E이고 X53이 S인 폴리펩티드.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, X52가 S이고 X53이 D인 폴리펩티드.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, X52가 N이고 X53이 E인 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, [BM]이
    (a) 아미노산 서열
    EX9X10X11A X13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35
    를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
    X9가 H, Q, S, T 및 V로부터 선택되고;
    X10이 I, L, M 및 V로부터 선택되고;
    X11이 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
    X13이 N 및 W로부터 선택되고;
    X14가 A, D, E, H, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
    X18이 A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
    X23이 N 및 T로부터 선택되고;
    X24가 I, L 및 V로부터 선택되고;
    X25가 A, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
    X28이 I, L 및 V로부터 선택되고;
    X32가 D, E, G, H, N, S 및 T로부터 선택되고;
    X33이 K 및 S로부터 선택되고;
    X35가 A, D, E, H, N, Q, S, T 및 Y로부터 선택된 것인 폴리펩티드; 및
    (b) (a)의 폴리펩티드와 적어도 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드
    로부터 선택된 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 아미노산 서열
    AEAKYAKEX9X10X11AX13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP
    를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
    X9가 H, Q, S, T 및 V로부터 선택되고;
    X10이 I, L, M 및 V로부터 선택되고;
    X11이 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
    X13이 N 및 W로부터 선택되고;
    X14가 A, D, E, H, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
    X18이 A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
    X23이 N 및 T로부터 선택되고;
    X24가 I, L 및 V로부터 선택되고;
    X25가 A, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
    X28이 I, L 및 V로부터 선택되고;
    X32가 D, E, G, H, N, S 및 T로부터 선택되고;
    X33이 K 및 S로부터 선택되고;
    X35가 A, D, E, H, N, Q, S, T 및 Y로부터 선택되고;
    [L2]가 DDPS 및 RQPE로부터 선택되고;
    X42가 A 및 S로부터 선택되고;
    X43이 N 및 E로부터 선택되고;
    X46이 A, S 및 C로부터 선택되고;
    X52가 E, N 및 S로부터 선택되고;
    X53이 D, E 및 S로부터 선택되며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아니고;
    X54가 A 및 S로부터 선택된 것인 폴리펩티드; 및
    (b) (a)의 폴리펩티드와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 가지며, 단 X52가 N인 경우에 X53은 D가 아닌 폴리펩티드
    로부터 선택된 폴리펩티드.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 하기 조건 중 적어도 하나를 충족시키는 폴리펩티드.
    X9가 V이고,
    X10이 L이고,
    X11이 E이고,
    X13이 W이고,
    X14가 D이고,
    X18이 R이고,
    X23이 T이고,
    X24가 I이고,
    X25가 E이고,
    X28이 L이고,
    X32가 N이고,
    X33이 K이고,
    X35가 D이고,
    [L2]가 DDPS이고,
    X42가 S이고,
    X43이 E이고,
    X46이 S이고,
    X54가 S이다.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, [BM]이 서열 1-248에서 위치 1-28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, [BM]이 서열 1에서 위치 1-28로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 260, 서열 265, 서열 266 또는 서열 267로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로부터 선택된 폴리펩티드.
  13. a. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드;
    b. 스트렙토코쿠스 단백질 G의 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체; 및
    c. 임의로, 상기 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체를 상기 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드의 C 또는 N 말단에 연결시키기 위한 적어도 하나의 연결 모이어티
    를 포함하는, C5에 결합할 수 있는 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 알부민 결합 도메인이 서열 250으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 연결 모이어티가 아미노산 서열 KVX60GS를 포함하는 펩티드이며, 여기서 X60이 D, E 및 A로부터 선택된 것인 화합물.
  16. 제15항에 있어서, X60이 D인 화합물.
  17. 제16항에 있어서, 서열 253으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 화합물.
  18. 제15항에 있어서, X60이 E인 화합물.
  19. 제18항에 있어서, 서열 261, 서열 263, 서열 264, 서열 269 또는 서열 270으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 화합물.
  20. 제15항에 있어서, X60이 A인 화합물.
  21. 제20항에 있어서, 서열 262로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 화합물.
  22. 제15항에 있어서, 연결 모이어티가 부재하는 것인 화합물.
  23. a. 하기:
    a-1. 아미노산 서열
    [BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
    를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
    [BM]은 C5 결합 모티프이고;
    [L2]는 DDPS 및 RQPE로부터 선택되고;
    X42는 A 및 S로부터 선택되고;
    X43은 N 및 E로부터 선택되고;
    X46은 A, S 및 C로부터 선택되고;
    X52는 E, N 및 S로부터 선택되고;
    X53은 D, E 및 S로부터 선택되고;
    X54는 A 및 S로부터 선택된 것인 폴리펩티드; 및
    a-2. a-1의 폴리펩티드와 적어도 89% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드
    로부터 선택된, 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드;
    b. 스트렙토코쿠스 단백질 G의 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체; 및
    c. 상기 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체를 상기 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드의 C 또는 N 말단에 연결시키기 위한 적어도 하나의 연결 모이어티
    를 포함하며; 여기서 연결 모이어티는 KVEGS 또는 KVAGS를 포함하거나; 또는 상기 연결 모이어티는 부재하는 것인, C5에 결합할 수 있는 화합물.
  24. a. 하기:
    a-1. 아미노산 서열
    [BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
    를 포함하며, 여기서 서로 독립적으로
    [BM]은 C5 결합 모티프이고;
    [L2]는 RQPE이고;
    X42는 A 및 S로부터 선택되고;
    X43은 N 및 E로부터 선택되고;
    X46은 A, S 및 C로부터 선택되고;
    X52는 E, N 및 S로부터 선택되고;
    X53은 D, E 및 S로부터 선택되고;
    X54는 A 및 S로부터 선택된 것인 폴리펩티드; 및
    a-2. a-1의 폴리펩티드와 적어도 89% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드
    로부터 선택된, 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드;
    b. 스트렙토코쿠스 단백질 G의 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체; 및
    c. 임의로, 상기 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체를 상기 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드의 C 또는 N 말단에 연결시키기 위한 적어도 하나의 연결 모이어티
    를 포함하는, C5에 결합할 수 있는 화합물.
  25. 제1항 내지 제12항 및 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 C5 결합 폴리펩티드 또는 C5 결합 화합물.
  26. 제1항 내지 제12항 및 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, C5-관련 상태의 치료 및/또는 예방 방법에 사용하기 위한 C5 결합 폴리펩티드 또는 C5 결합 화합물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 C5-관련 상태가 염증성 질환; 자가면역 질환; 감염성 질환; 심혈관 질환; 신경변성 장애; 이식편 손상; 안질환; 신장 질환; 폐 질환; 혈액 질환, 예컨대 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH); 알레르기성 질환 및 피부과 질환으로부터 선택된 상태인 C5 결합 폴리펩티드 또는 C5 결합 화합물.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내로, 피하로, 흡입에 의해, 비강으로, 경구로, 유리체내로 또는 국소로 투여되는 C5 결합 폴리펩티드 또는 C5 결합 화합물.
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