RS61347B1

RS61347B1 - Stabilni polipeptidi koji se vezuju za humani komplement c5

Info

Publication number: RS61347B1
Application number: RS20210005A
Authority: RS
Inventors: Joakim Nilsson; Erik Nordling; Patrik Strömberg
Original assignee: Ipc Research Llc
Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2021-02-26
Also published as: RU2016111115A; WO2015028558A1; JP2020172505A; BR122023020080A2; CA2926976A1; SI3038633T1; IL244218A0; JP2016529270A; SMT202100006T1; JP6767865B2; CN105658228A; HUE052613T2; NZ718153A; PH12016500371B1; RU2020128977A; PT3038633T; AU2014314222B2; BR112016003142A2; RU2733897C2; US20160311870A1

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na polipeptide koji se vezuju za komponentu humanog komplementa 5 (C5) i na upotrebu takvih polipeptida u terapiji.

STANJE TEHNIKE

[0002] Protein komplementa C5 predstavlja centralnu komponentu sistema komplementa; ključni deo urođenog imunog sistema. Sistem komplementa predstavlja složeni imunološki nadzor sa brojnim zadacima u strogo kontrolisanim, različitim procesima. Funkcioniše kao odbrambeni sistem prve linije domaćina protiv infekcije drugim organizmima, i takođe u razlikovanju zdravih tkiva domaćina od ćelijskih ostataka i apoptičnih i nekrotičnih ćelija. Dalje, uključen je u čišćenje imunih kompleksa, regulaciju adaptivnog imunog odgovora, pospešivanje regeneracije tkiva, angiogenezu, mobilizaciju matičnih ćelija i razvoj centralnog nervnog sistema (Woodruff et al. Mol Immunol 2011, 48 (14):1631-1642); Ricklin et al. Nat Immunol 2010, 11(9):785-795). Svaki okidač, na primer pogrešna ili neograničena aktivacija ili nedovoljna regulacija, koji narušava fini balans aktivacije komplementa i regulacije može da dovede do patoloških stanja uključujući samo-napadanje ćelija domaćina koje dovode do priličnog oštećenja tkiva.

[0003] Sistem komplementa se sastoji od oko 30 proteina. Postoje tri puta da se komplement inicira; klasičan put koji upošljava C1q kako bi prepoznao imune komplekse na površini ćelija; put lektina koji se inicira kada lektin koji vezuje manozu (MBL) prepozna određene šećere; i alternativni put koji je iniciran spontano hidrolizom faktora komplementa 3 (C3), procesom koji suprimiraju određeni površinski molekuli ćelija sisara koji nisu prisutni na patogenim organizmima koji napadaju. Alternativni put takođe dejstvuje kao petlja za pojačavanje za sistem komplementa. Sva tri puta se približavaju na nivou C3. Cepanje C3 na C3a i C3b dovodi do stvaranja konvertaze koja za uzvrat cepa faktor komplementa 5 (C5) na C5a i C5b. C5a predstavlja veoma potentno sredstvo privlačenja raznih imunih ćelija dok C5b oligomerizuje sa C6-9 kako bi se formirala pora poznata kao kompleks membranskog napada (MAC) ili ponekad terminalni kompleks komplementa (TCC). Aktivacija sistema komplementa dovodi do brojnih mehanizama sa ciljem neutralisanja patogenih organizama; stvaranje MAC na površini ćelije kao što su bakterije koje napadaju dovodi do lize, deponovanje C3 i C4 proizvoda cepanja C3b i C4b pomaže opsonizaciju koja dovodi do fagocitoze patogenih organizama makrofagovima a anafilatoksini kao što su C3a i C5a privlače monocite i neutrofile na mesto aktivacije, uzvodno regulišu površinske markere koji dovode do povećane imunološke osetljivosti i do otpuštanja citokina.

[0004] C5 predstavlja 190-kDa glikoprotein koji se sastoji od 2 disulfidom povezana polipeptidna lanca, alfa i beta, molekulske mase od 115 i 75 kDa, redom (Tack et al. Biochem 1979, 18:1490-1497). Haviland et al. (J Immun 1991, 146: 362-368) su konstruisali kompletnu cDNK sekvencu humanog komplementa pro-C5, za koji je predviđeno da kodira 1,676-aminokiselinski promolekul koji sadrži 18-aminokiselinski vodeći peptid i 4-aminokiselinski veznik koji razdvaja beta i alfa lance (SEQ ID NO: 251). Budući da je C5 uobičajen za sve puteve aktivacije komplementa, blokiranje C5 će zaustaviti napredovanje kaskade nevezano od stimulansa i samim tim će sprečiti svojstva brisanja aktivacije terminalnog komplementa pri čemu imunozaštitne i imunoregulatorne funkcije proksimalne kaskade komplementa ostaju netaknute.

[0005] Ključna uloga sistema komplementa u odbrani od patogena generalno predstavlja zanimljiv cilj za farmaceutsku intervenciju. Ovo je naglašeno činjenicom da mnoge mutacije ili oštećena regulacija komplementa je uključena u razne bolesti i stanja. U ove spadaju povećana osetljivost na autoimune bolesti kao što je sistemski eritemski lupus (SLE) kod kojeg deponovanje imunih kompleksa predstavlja okidače klasičnog puta (Manderson et al. Annu Rev Immunol 2004, 22:431-456). Pored toga, mutacije komplementnih proteina C1-C5 često dovode do SLE ili simptoma koji podsećaju na SLE. Druge autoimune bolesti sa jakim učešćem sistema komplementa su reumatoidni arthritis (RA) gde imuni kompleksi mogu da aktiviraju komplement u RA zglobu, Sjögren-ov sindrom, dermatomiozitis i druge bolesti pokrenute autoantitelima kao što su Gilijen Bareov sindrom (GBS), Fišerov sindrom (Kaida et al. J. Neuroimmun 2010, 223:5-12), različiti tipovi vaskulitisa, sistemska skleroza, anti-glomerularna bazalna membrana (anti-GBM) i anti-fosfolipidni sindrom (APS) (Chen et al. J Autoimmun 2010, 34:J276-J286). Dalje, inhibicija komplementa je dokazano efikasna kod životinjskih modela takvih različitih stanja kao što su periodontitis (Abe et al. J Immunol 2012, 189:5442-5448), zarastanje rana (Cazender et al. Clin Dev Immunol 2012, objava na internetu), rast tumora (Markiewski et al. Nat Immunol 2008, 9:1225-1235) i očne bolesti kao što su uveitis i makularna degeneracija povezana sa godinama (AMD) (Copli Et al. Clin Exp Immunol 2009, 159:303-314).

[0006] Antitela usmerena na humani komplement C5 su poznata iz, npr., WO 95/29697; WO 02/30985; i WO 2004/007553. Ekulizumab (Soliris™) je humanizovano monoklonalno antitelo usmereno protiv proteina C5 i sprečava cepanje C5 na C5a i C5b. Ekulizumab se pokazao da je efikasan u lečenju paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH), retke i ponekad životno ugrožavajuće bolesti krvi koju karakteriše intravaskularna hemolitička anemija, trombofilija i nefunkcionisanje kičmene moždine, i odobrena je za indikaciju. Ekulizumab je u novije vreme takođe odobren od strane FDA za lečenje atipičnog hemolitičkog sindroma (aHUS), retke ali životno ugrožavajuće bolesti uzrokovane gubitkom kontrole alternativnog komplementnog puta koji dovodi do prekomerne aktivacije koja se manifestuje kao trombotička mikroangiopatija (TMA) koja dovodi do konstantnog rizika oštećenja vitalnih organa kao što su bubrezi, srce i mozak. Kod aHUS, transplantacija oštećenog organa kao što je jetra samo privremeno pomaže pacijentu da nastavi da proizvodi mutirani oblik kontrolnog proteina (najčešće faktora komplementa H ili drugih proteina alternativnog puta). Povezana bolest sa prolaznom akutnom patofiziologijom je HUS uzrokovana infekcijom Shiga toksinom pozitivne E. coli (STEC-HUS) i postoje obećavajući klinički podaci koji ukazuju na efikasnost takođe za ovo stanje (Lapeyraque et al, N Engl J Med 2011, 364:2561-2563). Konačno, C5 blokirajuće antitelo ekulizumab je dokazano efikasno u sprečavanju odbacivanja posredovanog antitelom (AMR) kod primalaca izuzetno neusklađenih bubrega (Stegall, M. D. et al. Am J Transplant 2011, 11:2405-2413), i kod lečenja autoimunih neutropatija kao što su optički neuromijelitis i mijastenija gravis (Pittock et al. Lancet Neurol 2013, 12:554-562; Howard et al. Muscle Nerve 2013, 48:76-84).

[0007] Izuzev antitela pune dužine, u literaturi su opisani jednolančani varijabilni fragmenti (scFV), minitela i aptameri koji ciljaju C5. Ovi C5 inhibitori mogu da se vezuju za različita mesta (epitope) na C5 molekulu i mogu da imaju različite režime dejstvovanja. Na primer, dok ekulizumab stupa u interakciju sa C5 na nekoj udaljenosti od mesta cepanja konvertaze, minitelo Mubodina® stupa u interakciju sa mestom cepanja C5. C5 inhibitorni protein Ornithodoros moubata inhibitor komplementa (OmCI, Nunn, M. A. et al. J Immunol 2005, 174:2084-2091) od mekog krpelja Ornithodoros moubata je hipotetisan kako bi se vezao za distalni kraj CUB-C5d-MG8 superdomena, koji je blizu mesta cepanja konvertaze (Fredslund et al. Nat Immunol 2008, 9 (7):753-760). Nasuprot gore pomenuta tri proteina koja inhibiraju cepanje C5, monoklonalno antitelo TNX-558 se vezuje za C5a epitop prisutan i na netaknutom C5 i otpuštenom C5a bez inhibiranja cepanja C5. (Fung et al. Clin Exp Immunol 2003, 133 (2):160-169).

[0008] C5 vezujući polipeptidi, koji obuhvataju C5 vezujući motiv, su otkriveni u međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/SE2013/050139, objavljenoj kao WO 2013/126006. Određenije, WO 2013/126006 otkriva C5 vezujući motiv, BM, koji se sastoji od aminokiselinske sekvence

EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25X26LX28D,

pri čemu, nezavisno jedni od drugih,

X2je izabran od H, Q, S, T i V;

X3je izabran od I, L, M i V;

X4je izabran od A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T i Y;

X6je izabran od N i W;

X7je izabran od A, D, E, H, N, Q, R, S i T;

X11je izabran od A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T i Y;

X16je izabran od N i T;

X17je izabran od I, L i V;

X18je izabran od A, D, E, H, K, N, Q, R, S i T;

X21je izabran od I, L i V;

X25je izabran od D, E, G, H, N, S i T;

X26je izabran od K i S; i

X28je izabran od A, D, E, H, N, Q, S, T i Y.

[0009] Primeri konkretnih C5 vezujućih motiva, kako je prethodno otkriveno u WO 2013/126006, su prikazani kao SEQ ID NO: 1-248 u ovoj patentnoj prijavi.

[0010] Poznato je iz WO 2013/126006 da dodatni peptidi ili polipeptidi mogu da poboljšaju stabilizaciju C5 vezujućih polipeptida. Jedan primer takvog polipeptida je albumin vezujući domen (ABD) prikazan kao SEQ ID NO: 250 u ovom opisu. Drugi primeri pogodnih albumin vezujućih domena su otkriveni u WO 2009/016043 i WO 2012/004384. ABD-produženi polipeptid se vezuje za serumski albumin in vivo, i ima koristi od produženog poluživota, koji povećava neto poluživot samog polipeptida (pogledati npr. WO 91/01743).

[0011] Kontinuirano pružanje sredstava sa uporednim C5 blokirajućim dejstvom ostaje pitanje suštinskog interesa unutar oblasti. Određenije, postoji kontinuirana potreba za molekulima koji sprečavaju terminalnu kaskadu komplementa kao što je stvaranje pro-zapaljenskog molekula C5a. Od velikog je značaja takođe obezbeđivanje upotreba takvih molekula u lečenju bolesti.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0012]

Fig.1 ilustruje SDS-PAGE gel u kojem trake predstavljaju C5 vezujuće jedinjenje PSI0242 (SEQ ID NO: 249) (0) pre ispitivanja stabilnosti; i (2w) nakon 2 nedelje od ispitivanja stabilnosti.

Fig.2 predstavlja hromatogram iz HPLC obrnute faze PSI0242 (SEQ ID NO: 249) pre ispitivanja stabilnosti (podebljana linija) i nakon 2 nedelje ispitivanja stabilnosti (tačkasta linija).

Fig.3 ilustruje SDS-PAGE gel u kojem prva linija sadrži SeeBlue 2P marker veličine, a trake predstavljaju (0) početne uzorke; i (2w) uzorci nakon 2 nedelje od ispitivanja stabilnosti. Fig.3A: SEQ ID NO: 249; Fig.3B: SEQ ID NO: 261; Fig.3C: SEQ ID NO: 262; Fig.3D: SEQ ID NO: 264.

Fig.4 predstavlja hromatogram iz HPLC obrnute faze C5 vezujućeg jedinjenja (SEQ ID NO: 253) pre ispitivanja stabilnosti (podebljana linija) i nakon 2 nedelje ispitivanja stabilnosti (tačkasta linija). Fig.5 predstavlja hromatogram iz HPLC obrnute faze C5 vezujućeg jedinjenja (SEQ ID NO: 264) pre ispitivanja stabilnosti (podebljana linija) i nakon 2 nedelje ispitivanja stabilnosti (tačkasta linija). Fig.6A-D prikazuju slike SDS-PAGE gelova u poređenju sa originalnim i modifikovanim polipeptidnim varijantama (0) pre i (2w) posle 2 nedelje od ispitivanja stabilnosti. Marker molekulske veličine (Mw) je bio proteinski standard Novex® Sharp Pre-stained Protein Standard (216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3.5 kDa). Fig.6A prikazuje gel HER2 vezujućih polipeptida pri čemu trake prikazuju traku 1: Mw, traku 2: (0) Z02891 (SEQ ID NO: 272), traku 3: (2w) Z02891 (SEQ ID NO: 272), traku 4: Mw, traku 5: (0) Z17341 (SEQ ID NO: 273), traku 6: (2w) Z17341 (SEQ ID NO: 273), traku 7: (0) Z17342 (SEQ ID NO: 274), traku 8: (2w) Z17342 (SEQ ID NO: 274). Fig.6B predstavlja gel PDGF-Rβ vezujućih polipeptida pri čemu te trake prikazuju: traku 1: Mw, traku 2: (0) Z15805 (SEQ ID NO: 275), traku 3: (2w) Z15805 (SEQ ID NO: 275), traku 4: Mw, traku 5: (0) Z17343 (SEQ ID NO: 276), traku 6: (2w) Z17343 (SEQ ID NO: 276), traku 7: (0) Z17344 (SEQ ID NO: 277), traku 8: (2w) Z17344 (SEQ ID NO: 277). Fig.6C prikazuje gel FcRn vezujućih polipeptida pri čemu te trake prikazuju: traku 1: (0) Z10103 (SEQ ID NO: 278), traku 2: (2w) Z10103 (SEQ ID NO: 278), traku 3: Mw, traku 4: (0) Z17347 (SEQ ID NO: 279), traku 5: (2w) Z17347 (SEQ ID NO: 279), traku 6: (0) Z17348 (SEQ ID NO: 280), traku 7: (2w) Z17348 (SEQ ID NO: 280). Dijagonalne trake primećene na Fig.6C predstavlja artefakt koji nastaje iz otiska drugog gela obojen u istom kontejneru. Fig.6D predstavlja gel CAIX vezujućih polipeptida pri čemu te trake prikazuju traku 1:Mw, traku 2: (0) Z09782 (SEQ ID NO: 281), traku 3: (2w) Z09782 (SEQ ID NO: 281), traku 4: Mw, traku 5: (0) Z17351 (SEQ ID NO: 282), traku 6: (2w) Z17351 (SEQ ID NO: 282), traku 7: (0) Z17352 (SEQ ID NO: 283), traku 8: (2w) Z17352 (SEQ ID NO: 283); traku 9: (0) Z17355 (SEQ ID NO: 284), traku 10: (2w) Z17355 (SEQ ID NO: 284), traku 11: (0) Z17357 (SEQ ID NO: 285), traku 12: (2w) Z17357 (SEQ ID NO: 285), traku 13: (0) Z17359 (SEQ ID NO: 286), traku 14: (2w) Z17359 (SEQ ID NO: 286), traku 15: (0) Z17360 (SEQ ID NO: 287), traku 16: (2w) Z17360 (SEQ ID NO: 287).

Fig.7 predstavlja tabelu koja prikazuje aminokiselinske sekvence:

- primera C5 vezujućih motiva (SEQ ID NO: 1-248);

- C5 vezujućeg jedinjenja označenog sa PSI0242 (SEQ NO: 249);

- albumin vezujućeg domena (SEQ ID NO: 250);

- unosa Swiss-Prot P01031 humanog C5 (SEQ ID NO:251) pri čemu α-lanac odgovara aminokiselinskim ostacima 678-1676 a β-lanac odgovara aminokiselinskim ostacima 19-673; - primera modifikovanih C5 vezujućih polipeptida (SEQ ID NO: 260, 265-267).

- primera modifikovanih C5 vezujućih jedinjenja (SEQ ID NO: 252-259, 261-264, 268-270).

- primera varijanti polipeptida sa vezujućim afinitetom za druge ciljane molekule (SEQ ID NO: 272, 275, 278, 281)

- primera stabilnosti poboljšanih varijanti polipeptida sa vezujućim afinitetom za druge ciljeve sa (SEQ ID NO: 273-274, 276-277, 279-280, 282-287).

OTKRIVANJE OVOG PRONALASKA

[0013] Iznenađujuće se došlo do zaključka da su C5 vezujući polipeptidi i jedinjenja, pri čemu su aminokiselinske sekvence modifikovane na specifičnim položajima, poboljšali stabilnost u poređenju sa prethodno poznatim C5 vezujućim polipeptidima i jedinjenjima.

[0014] Shodno tome, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid koji može da vezuje komponentu humanog komplementa 5 (C5), pri čemu pomenuti polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu:

[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q

pri čemu, nezavisno jedni od drugih,

[BM] predstavlja C5 vezujući motiv koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu

EX9X10X11A X13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35;

pri čemu, nezavisno jedni od drugih,

X9je izabran od H, Q, S, T i V;

X10je izabran od I, L, M i V;

X11je izabran od A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T i Y;

X13je izabran od N i W;

X14je izabran od A, D, E, H, N, Q, R, S i T;

X18je izabran od A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T i Y;

X23je izabran od N i T;

X24je izabran od I, L i V;

X25je izabran od A, D, E, H, K, N, Q, R, S i T;

X28je izabran od I, L i V;

X32je izabran od D, E, G, H, N, S i T;

X33je izabran od K i S; i

X35je izabran od A, D, E, H, N, Q, S, T i Y;

[L2] je izabran od DDPS i RQPE;

X42je izabran od A i S;

X43je izabran od N i E;

X46je izabran od A, S i C;

X52je izabran od E, N i S;

X53je izabran od D, E i S, pod uslovom da X53ne predstavlja D kada X52predstavlja N; i

X54je izabran od A i S.

[0015] Pronalazači su iznenađujuće otkrili da modifikacija ili supstitucija aminokiselinskog ostat(a)ka na određenom položaju(ima) aminokiselinske sekvence C5 vezujućih polipeptida kako je opisano u WO 2013/126006 poboljšava stabilnost C5 vezujućih polipeptida dok se biološko dejstvo, kao što je afinitet vezivanja za komponentu humanog komplementa 5 (C5) i inhibicija funkcije puta komplementa, suštinski zadržava. Stoga, biološko dejstvo modifikovanih C5 vezujućih polipeptida može da se poredi sa biološkim dejstvom poznatih C5 vezujućih polipeptida. Ispitivanje stabilnosti C5 vezujućih polipeptida ovog pronalaska pokazuje supstituciju ili u X52, od N do E ili S, ili X53, od D do E ili S, poboljšava stabilnost. Štaviše, zaključeno je da konkretna aminokiselinska supstitucija u [L2] nezavisno može da promoviše stabilnost.

[0016] Pojmovi "C5 vezujući" i "vezujući afinitet za C5" kako se ovde upotrebljavaju u ovoj specifikaciji se odnose na svojstvo polipeptida koji može da se ispituje na primer radi upotrebe tehnologije površinske rezonance plazmona, kao što je u Biacore instrumentu (GE Healthcare). C5 vezujući afinitet može npr. da se ispituje u eksperimentu u kojem je CP imobilisan na senzornom čipu Biacore instrumenta, a uzorak koji se testira se prenosi do čipa. Alternativno, polipeptid koji se ispituje je imobilisan na senzornom čipu instrumenta, a uzorak koji sadrži C5, ili njegov fragment, se prenosi do čipa. Stručnjak može zatim da interpretira rezultate dobijene ovakvim eksperimentima kako bi se utvrdila najmanja kvalitativna mera vezivanja polipeptida za C5. Ukoliko je kvantitativna mera poželjna, na primer da bi se odredila očigledna ravnotežna konstanta disocijacije KDza interakciju, takođe mogu da se koriste postupci površinske rezonance plazmona. Vrednosti vezivanja mogu na primer biti definisane u Biacore 2000 instrumentu (GE Healthcare). C5 je imobilisan na senzornom čipu merenja, a uzorci polipeptida čiji afinitet bi trebalo da se odredi su pripremljeni serijskim razblaženjem i ubrizgavaju se preko čipa. KDvrednosti zatim mogu da se izračunaju iz rezultata na primer 1:1 Langmuir modela vezivanja BIAevaluation softvera koji obezbeđuje proizvođač instrumenta. C5 ili njegov fragment koji se koriste kod KDodređivanja mogu na primer da obuhvate aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 251. Primeri kako C5 vezujući afinitet može da se ispita su dati ovde, pogledati primer 3 i 5.

[0017] U poželjnom obliku ovog pronalaska, pomenuti polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu: AEAKYAK-[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP

pri čemu, nezavisno jedni od drugih,

[BM], [L2], X42, X43, X46, X52, X53i X54su kao što su prethodno definisani.

[0018] Kako je prethodno otkriveno u WO 2013/126006, C5 vezujući polipeptid prema ovom pronalasku može da čini deo skupa proteinskog domena trostrukih spirala. Pomenuti C5 vezujući

motiv [BM] suštinski može da čini deo dve alfa spirale, sa korelacionom petljom, unutar pomenutog slupa trostrukih spirala. Druga korelaciona petlja, koja je ovde označena kao [L2], povezuje se sa C5 vezujućim motivom za treću alfa spiralu, koja je označena kao "kičma".

[0019] U jednom načinu ostvarivanja, C5 vezujući motiv [BM] je suštinski otkriven u WO 2013/126006. Međutim, prema ovom pronalasku C5 vezujući motiv se poželjno sastoji od 28, pre nego 29, aminokiselina, i pored toga može da nosi dalje aminokiselinske supstitucije.

[0020] U poželjnom načinu ostvarivanja, C5 vezujući motiv [BM] je suštinski onakav kako je otkriven u WO 2013/126006. Pomenuti [BM] je shodno tome polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu: EX9X10X11A X13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35;

pri čemu, nezavisno jedni od drugih,

X9je izabran od H, Q, S, T i V;

X10je izabran od I, L, M i V;

X11je izabran od A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T i Y;

X13je izabran od N i W;

X14je izabran od A, D, E, H, N, Q, R, S i T;

X18je izabran od A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T i Y;

X23je izabran od N i T;

X24je izabran od I, L i V;

X25je izabran od A, D, E, H, K, N, Q, R, S i T;

X28je izabran od I, L i V;

X32je izabran od D, E, G, H, N, S i T;

X33je izabran od K i S;

X35je izabran od A, D, E, H, N, Q, S, T i Y.

[0021] U daljem poželjnom aspektu, [BM] obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od položaja 1-28 u SEQ ID NOS: 1-248. Poželjnije, [BM] obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane kao položaji 1-28 u SEQ ID NO: 1.

[0022] U daljem aspektu, C5 vezujući polipeptid prema ovom pronalasku obuhvata aminokiselinsku sekvencu:

pri čemu, nezavisno jedni od drugih,

X9je izabran od H, Q, S, T i V;

X10je izabran od I, L, M i V;

X11je izabran od A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T i Y;

X13je izabran od N i W;

X14je izabran od A, D, E, H, N, Q, R, S i T;

X18je izabran od A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T i Y;

X23je izabran od N i T;

X24je izabran od I, L i V;

X25je izabran od A, D, E, H, K, N, Q, R, S i T;

X28je izabran od I, L i V;

X32je izabran od D, E, G, H, N, S i T;

X33je izabran od K i S;

X35je izabran od A, D, E, H, N, Q, S, T i Y;

[L2] je izabran od DDPS i RQPE;

X42je izabran od A i S;

X43je izabran od N i E;

X46je izabran od A, S i C;

X52je izabran od E, N i S;

X54je izabran od A i S.

[0023] U poželjnim oblicima ovog pronalaska, najmanje jedan od sledećih osamnaest, opciono devetnaest, uslova je ispunjen:

X9predstavlja V,

X10predstavlja L,

X11predstavlja E,

X13predstavlja W,

X14predstavlja D,

opciono X17predstavlja D,

X18predstavlja R,

X23predstavlja T,

X24predstavlja I,

X25predstavlja E,

X28predstavlja L,

X32predstavlja N,

X33predstavlja K,

X35predstavlja D,

[L2] predstavlja DDPS,

X42predstavlja S,

X43predstavlja E,

X46predstavlja S,

X54predstavlja S.

[0024] Poželjnije, najmanje dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest ili devetnaest gore pomenutih uslova je ispunjeno.

[0025] U jednom načinu ostvarivanja, X52i X53su nezavisno izabrani od E i S. Poželjno, (a) X52predstavlja S a X53predstavlja E, ili (b) X52predstavlja E a X53predstavlja S.

[0026] U jednom načinu ostvarivanja, X52predstavlja S a X53predstavlja D.

[0027] U drugom načinu ostvarivanja, X52predstavlja N a X53predstavlja E.

[0028] U daljem aspektu, polipeptid prema ovom pronalasku obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, ili SEQ ID NO: 267.

[0029] U daljem aspektu, obezbeđeno je jedinjenje koje može da vezuje C5, pri čemu pomenuto jedinjenje obuhvata:

a. najmanje jedan C5 vezujući polipeptid kako je prethodno definisano;

b. najmanje jedan albumin vezujući domen streptokoknog proteina G, ili njegov derivat; i c. opciono, najmanje jednu vezujuću grupu za vezivanje pomenutog najmanje jednog albumin vezujućeg domena ili njegovog derivata za C ili N terminal pomenutog najmanje jednog C5 vezujućeg polipeptida.

[0030] Poželjno, pomenuti albumin vezujući domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 250.

[0031] Poželjno, pomenuta vezujuća grupa predstavlja peptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu KVX60GS, pri čemu X60je izabran od D, E i A. Kada X60predstavlja D, poželjno jedinjenje obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 253. Kada X60predstavlja E, poželjna jedinjenja obuhvataju ili se sastoje od aminokiselinske sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 269 ili SEQ ID NO: 270. Kada X60predstavlja A, poželjno jedinjenje obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 262. U gore navedenim aminokiselinskim sekvencama C5 vezujućih jedinjenja, aminokiselinski ostaci 1-57 predstavljaju aminokiselinsku sekvencu C5 vezujućeg polipeptida, ostaci 58-62 predstavljaju aminokiselinsku sekvencu veznika, a ostaci 63-108 predstavljaju aminokiselinsku sekvencu albumin vezujućeg domena.

[0032] U jednom načinu ostvarivanja, vezujuća grupa nije prisutna.

[0033] Kako je prethodno bilo reči, poželjni C5 vezujući polipeptidi prema ovom pronalasku uključuju one gde su X52i X53nezavisno izabrani od E i S. Konkretno, jedinjenja prema ovom pronalasku mogu biti dobijena od PSI0242 (SEQ ID NO: 249) ali imaju modifikacije u najmanje jednom od položaja 52, 53 i 60. Na primer, kako je prikazano na Fig.7 i listi sekvenci, poželjno jedinjenje označeno kao PSI0378 (SEQ ID NO: 261) nosi aminokiselinske supstitucije N52S, D53E i D60E; poželjno jedinjenje označeno kao PSI0379 (SEQ ID NO: 262) nosi aminokiselinske supstitucije N52S, D53E i D60A; poželjno jedinjenje označeno kao PSI0381 (SEQ ID NO: 263) nosi aminokiselinske supstitucije N52E, D53S i D60E; i poželjno jedinjenje označeno kao PSI0383 (SEQ ID NO: 264) nosi aminokiselinske supstitucije N52S, D53E i D60E. Dalje, SEQ ID NO: 264 takođe nosi supstitucije u petlji [L2], naime D36R, D37Q i S39E. Štaviše, poželjno jedinjenje označeno kao PSI0403 (SEQ ID NO: 269) nosi aminokiselinske supstitucije D53E i D60E, i poželjno jedinjenje označeno kao PSI0404 (SEQ ID NO: 270) nosi aminokiselinske supstitucije N52S i D60E.

[0034] Kao što je gore navedeno, pronalazači su iznenađujuće došli do zaključka da aminokiselinske supstitucije u određenim položajima aminokiselinske sekvence C5 vezujućih polipeptida kako je opisano u WO 2013/126006 može da poboljša stabilnost. Takve supstitucije poboljšavaju stabilnost C5 vezujućih jedinjenja dok biološko dejstvo, kao što je vezujuća sposobnost C5 i inhibicija hemolize in vitro, ostaje zadržano. Ispitivanje stabilnosti C5 vezujućih jedinjenja ovog pronalaska pokazuje da na primer svaki od N52S (X52) i D53E (X53) (SEQ ID NO: 253) pojedinačno, kao i uklanjanje D60 (X60) (SEQ ID NO: 259 kojoj nedostaje vezujuća grupa) poboljšava stabilnost. Kombinacija supstitucija N52S, D53E i D60E ili D60A dalje poboljšava stabilnost (SEQ ID NO: 261 i SEQ ID NO: 262). Za svaku od kombinovanih supstitucija N52S i D60E (SEQ ID NO: 270) i D53E i D60E (SEQ ID NO: 269) je slično zaključeno da poboljšava stabilnost. Ovo ukazuje da je svaka od navedenih aminokiselinskih supstitucija uključena u poboljšavanje stabilnosti polipeptida, i samim tim da će svaka od ovih supstitucija obezbediti dalje stabilizovane C5 vezujuće polipeptide i jedinjenja u poređenju sa prethodno poznatim C5 vezujućim polipeptidima i jedinjenjima.

[0035] Međutim, stručnjak će moći da identifikuje polipeptide i/ili jedinjenja koja imaju modifikacije u najmanje jednom od položaja 52, 53 i 60, i/ili u petlji [L2], ali koja takođe nosi dodatne modifikacije kao što su supstitucije, mala brisanja, umetanja ili inverzije, a nevezano za to imaju suštinski otkrivena biološka dejstva i poboljšanu stabilnost. Dalje, C5 vezujući polipeptid i/ili jedinjenje prema ovom pronalasku bi moglo da obuhvata dalje C terminalne i/ili N terminalne aminokiseline koje poboljšavaju proizvodnju, prečišćavanje, stabilizaciju in vivo ili in vitro, kuplovanje, ili detekciju polipeptida.

[0036] Zaključeno je da uklanjanje D60 ili aminokiselinska supstitucija u položaju 60 od SEQ ID NO: 249 sama poboljšava stabilnost C5 vezujućih jedinjenja ovog pronalaska u poređenju sa prethodno poznatim C5 vezujućim jedinjenjima. Poželjno, vezujuća grupa je KVEGS (X60=E) dok X52X53može biti ND, a primer poželjnog jedinjenja koje nosi takvu vezujuću grupu je PSI0410 (SEQ ID NO: 268). U drugom poželjnom načinu ostvarivanja, D60 i čitava vezujuća grupa je odsutna a primer takvog jedinjenja je poželjno jedinjenje označeno kao PSI0369 (SEQ ID NO: 259).

[0037] Za konkretne aminokiselinske supstitucije u petlji [L2] je zaključeno da poboljšavaju stabilnost C5 vezujućih jedinjenja (npr. SEQ ID NO: 252) ovog pronalaska u poređenju sa prethodno poznatim C5 vezujućim jedinjenjima.

[0038] U ovaj pronalazak su uključeni C5 vezujući polipeptidi i jedinjenja kako je prethodno opisano, za upotrebu u terapiji. Određenije, C5 vezujući polipeptidi i jedinjenja prema ovom pronalasku su korisni u postupcima za lečenje i/ili profilaksu C5-povezanih stanja, kao što su zapaljenske bolesti; autoimune bolesti; infektivne bolesti; kardiovaskularne bolesti; neurodegenerativni poremećaji; povrede kalema; očne bolesti; bolesti bubrega; plućne bolesti; hematološke bolesti kao što je paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH); alergijske bolesti i dermatološke bolesti.

[0039] U postupcima za lečenje i/ili profilaksu, pomenuti C5 vezujući polipeptid ili jedinjenje poželjno može da se daje intravenski, supkutano, inhalacijom, nazalno, oralno, intravitrealno, ili topikalno.

PRIMERI PRIMER 1: Ispitivanje stabilnosti poznatog C5 inhibitora

[0040] C5 vezujuće jedinjenje označeno kao PSI0242 (SEQ ID NO: 249) je formulisano u 25 mM NaP /125 mM NaCl pH 7.0 i podvrgnuto ispitivanju stabilnosti u ubrzanim uslovima tokom 2 nedelje na 37 °C. Stabilnost je izmerena pojavom novih varijanti nakon ispitivanja stabilnosti putem SDS-PAGE i HPLC (RPC) reverzne faze. Kod obe analize početni uzorak i onaj koji je podvrgnut ispitivanju stabilnosti su paralelno izvedeni. Za SDS-PAGE, 7,5 µg proteina je napunjeno u svaki bunarčić. RPC je izvedena na Agilent 1100 HPLC pomoću mobilne faze koja se sastoji od 0,1 % trifluorosirćetne kiseline (TFA) u vodi, i pomoću mobilne faze B koja se sastoji od 0,1 % TFA / 45 % MeOH / 45 % izopropilamina (IPA) / 10 % vode.

[0041] Rezultati pokazuju da su novi oblici proteina formirani tokom inkubacije, pri čemu su ti novi oblici vizualizovani kao trake u SDS-PAGE (Fig.1) i kao novi pikovi u hromatogramima HPLC (RPC) obrnute faze (Fig.2). Na Fig.2, glavni pik nakon 2 nedelje inkubacije odgovara 57 % originalnog proteinskog uzorka.

[0042] Položaji 1-60 u SEQ ID NO: 249 odgovaraju polipeptidu Z06175a, prethodno otkrivenom u WO 2013/126006 kao SEQ ID NO: 753. PSI0242 (SEQ ID NO: 249) je proizveden suštinski kako je otkriveno u WO 2013/126006.

PRIMER 2: Stabilnost modifikovanih C5 vezujućih polipeptida i jedinjenja

[0043] Modifikovani C5 vezujući polipeptidi i jedinjenja su sintetisani i prečišćeni suštinski kako je opisano u WO 2013/126006.

[0044] Ukratko, DNK koja kodira C5 vezujuće Z varijante je predstavljala kodon E. coli optimizovan i sintetisan putem GeneArt, GmbH. Sintetički geni koji predstavljaju C5 vezujuće Z varijante su podklonirani i eksprimirani u E. coli.

[0045] Intracelularno eksprimirane Z varijante su prečišćene pomoću konvencionalnih postupaka hromatografije. Homogenizcija i razbistravanje su izvedeni sonifikacijom nakon koje su usledili centrifuga i filtracija. Anjonsko izmenjivačka hromatografija je korišćena kao faza hvatanja. Dalje prečišćavanje je dobijeno hromatografijom hidrofobne interakcije. Prečišćavanja su izvedena u kiselim uslovima (pH 5.5). Poliranje i razmena pufera je izvedena pomoću ekskluzione hromatografije.

[0046] Prečišćeni proteini su formulisani u 25 mM NaP /125 mM NaCl pH 7.0 i podvrgnuti ispitivanju stabilnosti u uslovima ubrzanog starenja tokom 2 nedelje na 37 °C. Stabilnost je izmerena pojavom novih varijanti nakon ispitivanja stabilnosti putem SDS-PAGE i HPLC (RPC) obrnute faze. U obe analize početni uzorak i onaj koji je podvrgnut ispitivanju stabilnosti su paralelno ispitivani. Za SDS-PAGE, 7.5 µg protein je napunjen u svaki bunarčić. Primer dobijenog gela je prikazan na Fig.3.

[0047] RPC je izvedena na Agilent 1100 HPLC pomoću mobilne faze A koja se sastoji od 0,1 % trifluorosirćetne kiseline (TFA) u vodi, i mobilne faze koja se sastoji od 0,1 % TFA / 45 % MeOH / 45 % izopropilamina (IPA) / 10 % vode. Primer dobijenog hromatograma je prikazan na Fig.4 za SEQ ID NO: 253.

[0048] Rezultati ispitivanja stabilnosti su ukratko prikazani u tabeli I, u nastavku.

TABELA I

[0049] Iz tabele I može da se zaključi da određeni modifikovani C5 vezujući polipeptidi ili jedinjenja imaju poboljšana svojstva, kao što je povećana stabilnost, kada se uporedi sa PSI0242. Takvi poboljšani C5 vezujući polipeptidi ili jedinjenja uključuju PSI0334 (SEQ ID NO: 253), PSI0340 (SEQ ID NO: 258), PSI0369 (SEQ ID NO: 259), PSI0377 (SEQ ID NO: 260), PSI0378 (SEQ ID NO: 261), PSI0379 (SEQ ID NO: 262), PSI0381 (SEQ ID NO: 263), PSI0383 (SEQ ID NO: 264), PSI0400 (SEQ ID NO: 267), PSI0410 (SEQ ID NO: 268), PSI0403 (SEQ ID NO: 269) i PSI0404 (SEQ ID NO: 270). U šest pomenutih varijanti (SEQ ID NO: 253, 260, 261, 262, 264 i 267), aminokiselinski ostaci u položajima 52-53 su supstituisani od ND (cf PSI0242) do SE. U SEQ ID NO: 263, odgovarajuća supstitucija je od ND do ES. U SEQ ID NO: 269 jedini aminokiselinski ostatak u položaju 53 je supstituisan od D do E, dok u SEQ ID NO: 270 aminokiselinski ostatak u položaju 52 je supstituisan od N do S.

[0050] Dalje, za PSI0378 (SEQ ID NO: 261), PSI0381 (SEQ ID NO: 263), PSI0383 (SEQ ID NO: 264), PSI0410 (SEQ ID NO: 268), PSI0403 (SEQ ID NO: 269) i PSI0404 (SEQ ID NO: 270) je zajednička supstitucija aminokiselinskog ostatka od D do E u položaju 60.

[0051] Kombinovana korist stabilnosti koja pojačava supstitucije u položaju 52 ili 53 i položaju 60 može da se vidi na Fig.5, koja prikazuje hromatogram PSI0383 (SEQ ID NO: 264). U PSI0379 (SEQ ID NO: 262) supstitucija u položaju 60 je od D do A.

[0052] U PSI0369 (SEQ ID NO: 259) vezujuća grupa (uključujući D60) je sveukupno uklonjena, čime se dobija stabilnije C5 vezujuće jedinjenje i čime se ukazuje na uticaj položaja 60 na stabilnost C5 vezujućih jedinjenja.

PRIMER 3: Vezivanje modifikovanih jedinjenja za humani C5

[0053] Albumin u humanom serumu je imobilisan na Amine Reactive 2. generacije (AR2G) Dip i Read biosenzorima (Pall Life sciences (ForteBio) Cat # 18-5092) kuplovanjem amina. PSI0242 (SEQ ID NO: 249; 1 µM) i C5 vezujuća jedinjenja (1 µM) u puferu za čitanje (HBS-EP pufer spreman za upotrebu 200 ml, GE Healthcare #BR100188) su napunjena, svaku na odvojeni senzor sa HSA, tokom 120 sekundi nakon čega je usledilo snimanje bazne linije tokom 60 sekundi u puferu za čitanje pre podvrgavanja humanom C5 (Quidel Cat # 403) u koncentracijama koje su u opsegu od 0.79 nM do 25 nM u puferu za čitanje sa ciklusom regeneracije i baznom linijom koja snima između svake koncentracije. Uslovi regeneracije za senzore su 10 mM glicin, pH 2 (tri pulsa sa 30 sekundi i puferom u radu u trajanju od 60 sekundi). Svaki spektogram je referentno oduzet naspram analognog konstrukta koji sadrži albumin vezujući domen (SEQ ID NO: 250) ali bez dejstva vezivanja C5. Podaci su analizirani prema Langmuir 1:1 modelu pomoću ForteBio Analysis 7.1 (Pall Life sciences (ForteBio) kinetički softver).

[0054] KDinterakcije sa C5 u odnosu na PSI0242 (SEQ ID NO: 249) su prikazani u tabeli II. KDPSI0242 je varirao do 1-3 nM u različitim ispitivanjima.

[0055] Rezultati u tabeli II pokazuju da C5 vezujuća jedinjenja prema ovom pronalasku imaju sposobnost vezivanja za humani C5 koja je slična onom za vezivanje polipeptida PSI0242 (SEQ ID NO: 249) otkrivenom u WO 2013/126006.

TABELA II

PRIMER 4: Stabilnost hemijski sintetisanog C5 vezujućeg polipeptida

[0056] Hemijski sintetisan PSI0400 (SEQ ID NO: 267) je naručen od BACHEM AG. Stabilnost polipeptida je ispitana prema istoj metodologiji kao u primeru 2. Rezultati ispitivanja stabilnosti su prikazani u tabeli III.

TABELA III

[0057] Stabilnost PSI0400 je mogla da se uporedi sa polipeptidima koji su proizvedeni u E.coli u primeru 2.

[0058] Integritet savijanja PSI0400 (SEQ ID NO: 267) je upoređen sa rekombinantnim C5 vezujućim polipeptidom (PSI0257, SEQ ID NO: 271), proizvedenim prema postupcima primera 2, pomoću spektara dalekog UV kružnog dihroizma (CD).

[0059] CD spektri su snimljeni pomoću J-720 CD spektropolarimetra (Jasco, Japan). Uzorci su razblaženi do 0,17 mg/ml koncentracije proteina pomoću Pi pufera (5 mM Na-K-PO4, pH 7,0). CD spektar Pi pufera je prvo snimljen, zatim su spektri snimljeni za svaki od uzoraka i na kraju ponovo za Pi bufer. Kako se spektri dva pufera podudaraju, spektar koji je prvo snimljen je korišćen kao spektar pufera. Spektar pufera je ublažen pomoću Savitzky-Golay postupka sa širinom konvolucije od 25. Drugi spektri su ublaženi prema istom postupku sa širinom konvolucije od 15. Ublaženi spektar pafera je zatim oduzet od svakog od ublaženih spektara. CDNN program je korišćen kako bi se ocenio sadržaj proteina sekundarne strukture i dobijene ocene su prikazane u tabeli IV. Rezultati su pokazali da nijedna od dve aminokiselinske supstitucije na položaju 52 i 53 niti proizvodnja polipeptida hemijskom sintezom utiču na sadržaj sekundarne strukture hemijski sintetisanog polipeptida. Integritet sadržaja sekundarne strukture je upoređen sa rekombinantno proizvedenim PSI0257 (SEQ ID NO: 271).

TABELA IV

PRIMER 5: Vezivanje modifikovanih jedinjenja i polipeptida za humani C5

[0060] Vezujući afinitet C5 vezujućih jedinjenja PSI0242 (SEQ ID NO: 249), PSI0340 (SEQ ID NO: 258), PSI0378 (SEQ ID NO: 261), i PSI0410 (SEQ ID NO: 268) i C5 vezujući polipeptid PSI0400 (SEQ ID NO: 267) za humani C5 su analizirani pomoću Biacore T200 instrumenta (GE Healthcare). Humani C5 (A403, Quidel Corporation) je kuplovan sa M5 senzornim čipom (900 RU) pomoću hemije aminskog kuplovanja prema protokolu proizvođača. Kuplovanje je izvedeno ubrizgavanjem hC5 u koncentraciji od 7.5 µg/mL u 10 mM Na-acetat pufera pH=5 (GE Healthcare). Referentna ćelija je tretirana istim reagensima bez ubrizgavanja humanog C5. Vezivanje C5 sredstava za vezivanje za imobilisani hC5 je ispitano postupkom pojedinačne ciklične kinetike, u kojoj je pet koncentracija uzorka, obično 25, 12.5, 6.25, 3.12 i 1.56 nM u HBS-EP puferu (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfaktant P20, GE Healthcare) ubrizgano jedna za drugom pri brzini protoka od 30 µL/min na 25°C u istom ciklusu bez regeneracije između injekcija. Podaci iz referentne ćelije su oduzeti da bi se nadoknadile promene u zapreminskom indeksu prelamanja. U većini slučajeva, injekcija HBS-EP je takođe uključena kao kontrola tako da su senzogrami dvostruko prazni. Površine su regenerisane u HBS-EP puferu. Kinetičke konstante su izračunate iz senzograma pomoću Langmuir 1:1 modela analita softvera Biacore T200 Evaluation Software version 1.0. Dobijene KDvrednosti interakcija su prikazane u tabeli V.

TABELA V

[0061] Stabilnost koja pojačava aminokiselinske supstitucije nisu štetne za mogućnost molekula da se vezuju za C5 i samim tim ne utiču na njihova biološka dejstva.

PRIMER 6: Inhibicija hemolize

[0062] Za ispitivanja funkcije klasičnog puta komplementa i njegove inhibicije C5 vezujućim jedinjenjima PSI0378 (SEQ ID NO: 261) i PSI0410 (SEQ ID NO: 268), i C5 vezujućim polipeptidom PSI0400 (SEQ ID NO: 267), ovčiji eritrociti su pripremljeni od sveže cele kozje krvi u Alseverovom rastvoru (Švedski nacionalni veterinarski institut) i zatim su tretirani zečijim anti-ovčijim antiserumom eritrocita (Sigma) kako bi postao ovčiji eritrocit sintetisan antitelom (EA). Ceo postupak se izvodi u aseptičnim uslovima. Svi reagensi su iz komercijalnih izvora.

[0063] In vitro ispitivanje je izvedeno u mikrotitarskoj ploči u obliku slova U sa 96 bunarčića uzastopnim dodavanjima ispitivanog proteina, seruma komplementa i EA suspenzije. Konačne koncentracije svih reagenasa, u ukupnoj reakcionoj zapremini od 50 µL po bunarčiću i na pH 7.3-7.4, su bile: 0.15 mM CaCl 2; 0.5 mM MgCl 2; 3 mM NaN 3; 138 mM NaCl; 0.1 % želatin; 1.8 mM veronal-natrijuma; 3.1 mM barbiturna kiselina; 5 miliona EA; serum komplementnog proteina C5 u odgovarajućem razblaženju, i C5 vezujuće jedinjenje ili polipeptid u željenim koncentracijama.

[0064] C5 vezujuća jedinjenja i polipeptid su bili prethodno inkubirani goreopisanim komplementnim serumom tokom 20 minuta na ledu pre započinjanja reakcije dodavanjem EA suspenzije. Hemolitička reakcija je ostavljena da se odvija na 37 °C za vreme mešanja tokom 45 minuta i zatim je opciono završena dodavanjem 100 µL ledeno-hladnog fiziološkog rastvora koji sadrži 0.02 % Tween 20. Ćelije su centrifugirane do dna a gornja porcija, koja odgovara 100 µL supernatanta, je prebačena u transparentnu mikroploču sa bunarčićima ravnog dna i dopunjenim do polovine. Rezultati reakcije su analizirani kao optička gustina pomoću mikrotitarske ploče na talasnoj dužini od 415 nm.

[0065] Na svim testiranjima, kontrolni uzorak (PSI0242, SEQ ID NO: 249) i nosač su bili uključeni u svaku ploču da bi se definisale vrednosti za neinhibirane i u potpunosti inhibirane reakcije, redom. Ove vrednosti su iskorišćene kako bi se izračunao % inhibicije hemolize komplementa u bilo kojoj datoj koncentraciji uzorka. Inhibitorne potentnosti (IC 50-vrednosti) ispitivanih C5 vezujućih jedinjenja i polipeptida su definisane primenom istog ispitivanja u prisustvu kontrolisane koncentracije humanog C5 dodatog u serum koji je lišen C5. Za izuzetno potentne inhibitore (niske nanomolarne do subnanomolarne), konačna C5 koncentracija reakcione mešavine je kontrolisana na 0.1 nM, što je opciono utvrđeno pomoću istrošenih ili deficitarnih seruma. Rezultati su predstavljeni u tabeli VI u nastavku.

TABELA VI

[0066] Rezultati ispitivanja hemolize pokazuju da poboljšana C5 vezujuća jedinjenja SEQ ID NO: 261 i 268 mogu da se porede sa referentnim jedinjenjem. C5 vezujući polipeptid SEQ ID NO: 267 je bio funkcionalan u ispitivanju ali pošto ne sadrži albumin vezujući domen rezultati ne mogu direktno da se porede sa referentnim jedinjenjem.

PRIMER 7: Vezivanje za humani albumin

[0067] Za ocenu vezujućeg afiniteta C5 vezujućih jedinjenja za albumin, korišćeni su humani albumin ELISA koji koristi rekombinantni humani albumin (omotač) i komercijalno dostupna antitela (primarna i detektujuća) nabavljena od Novozymes, Affibody AB i DakoCytomation, tim redom. Standard postupka pripremljen od PSI0242 (SEQ ID NO:249), koji obuhvata C5 vezujući polipeptid i albumin vezujući domen streptokoknog proteina G, je korišćen za kvantifikaciju uzoraka. Mikroploča sa 96 bunarčića je obložena rekombinantnim albuminom. Ploča je zatim oprana fosfatom puferisanim fiziološkim rastvorom koji sadrži 0.05 % Tween 20 (PBST) i blokirana 1-2 sata % kaseinom u PBS. Nakon pranja ploče, standard, kontrole postupka i kontrolni uzorak i ispitivani uzorci su dodati u ploču. Nakon inkubacije od 2 sata, nevezani materijal je uklonjen pranjem. Kozje Anti-Affibody® IgG (Affibody AB, kataloški br.

20.1000.01.0005) je dodato u bunarčiće i ploča je inkubirana 1.5 sat kako bi se omogućilo vezivanje za vezana C5 vezujuća jedinjenja. Nakon pranja, zečji anti-kozji IgG HRP je ostavljen da se vezuje za kozja antitela tokom 1 sata. Nakon finalnog pranja, količina vezanog HRP je detektovana dodavanjem TMB supstrata, koji je pretvoren u plavi proizvod putem enzima. Dodavanje 1 M hlorovodonične kiseline nakon 30 minuta je zaustavilo reakciju i boja sadržaja bunarčića se promenila iz plave u žutu. Apsorbanca na 450 nm je izmerena fotometrijski, pomoću apsorbance na 650 nm kao referentne talasne dužine. Intenzitet boje je bio proporcionalan količini PSI0242 (SEQ ID NO:249) i koncentracije uzoraka su određene iz standardne krive.

[0068] C5 vezujuća jedinjenja koja obuhvataju albumin vezujući domen streptokoknog proteina G su se pokazala da mogu da se vezuju za humani albumin i podaci su predstavljeni u tabeli VII u nastavku.

TABELA VII

[0069] Rezultati ispitivanja su pokazivali da su obe istražene stabilnosti poboljšale da C5 vezujuća jedinjenja održavaju svoju sposobnost da se vezuju za humani albumin.

PRIMER 8: 3 mesečno ispitivanje stabilnosti C5 vezujućih polipeptida/jedinjenja

[0070] C5 vezujući polipeptidi/jedinjenja koja su pokazala poboljšanu stabilnost u poređenju sa PSI0242 tokom 2 nedelje ispitivanja stabilnosti na 37 °C (primer 2) su podvrgnuti dužem 3-mesečnom ispitivanju stabilnosti na 37 °C. Postavka ispitivanja stabilnosti je bila onakva kako je opisana u primeru 2 a procena stabilnosti je urađena merenjem glavnog pika procenta hromatograma ukupnog sadržaja proteina HPLC obrnute faze (RPC), pri čemu je RPC postupak izveden kako je opisano u primeru 2. Podaci od 2 nedelje iz primera 2 su uključeni u tabelu VIII u nastavku kako bi tumačenje bilo lakše.

TABELA VIII

S

[0071] C5 vezujuća jedinjenja sa aminokiselinskim supstitucijama u položaju 52, 53 od ND do SE i zamenom u položaju 60 od D do E ili A (SEQ ID NO: 261, 264, i 262) u poređenju sa PSI0242 imaju veću proporciju proteina u originalnom obliku nakon 3 meseca na 37 °C nego što PSI0242 (SEQ ID NO: 249) ima nakon 2 nedelje u istim uslovima. Druga jedinjenja takođe pokazuju povećanu stabilnost.

PRIMER 9: Stabilnost slično modifikovanih polipeptida

[0072] Prethodno poznate varijante polipeptida izvedene iz proteina Z (Grönwall et al. J Biotechnol 2007, 128:162-183) sa vezujućim afinitetom za druge ciljane molekule od C5 su slično modifikovane u konkretnim položajima aminokiselinske sekvence kako bi se stabilnost poboljšala. Izbor i proizvodnja originalnih varijanti polipeptida sa vezujućim afinitetom za humani epidermalni receptor faktora rasta 2 (HER2), beta receptor faktora rasta dobijenog iz trombocita (PDGF-Rβ), neonatalni Fc receptor (FcRn), i ugljena anhidraza IX (CAIX) je otkrivena u npr. WO 2009/080810, WO

2009/077175, PCT/EP2014/055299, i WO 2014/096163. Varijante polipeptida koje je poboljšala stabilnost su proizvedene putem mutageneze usmerene na mesto na izabranim položajima aminokiselinske sekvence. Stabilnost koja poboljšava aminokiselinske supstitucije u varijantama polipeptida Z02891 (SEQ ID NO: 272), koje ciljaju HER2; Z15805 (SEQ ID NO: 275), koje ciljaju PDGF-Rβ; Z10103 (SEQ ID NO: 278), koje ciljaju FcRn; i Z09782 (SEQ ID NO: 281), koji cilja CAIX, su označeni u tabeli IX u nastavku. Ove varijante polipeptida koje je poboljšala stabilnost se razlikuju od C5 vezujućih polipeptida ovog pronalaska na primer u tome da imaju vezujući motiv [BM] sa vezujućim afinitetom za HER2, PDGF-Rβ, FcRn, i CAIX.

[0073] Sve varijante su klonirane sa N-terminalom 6 x histidin-tag (His6) a postignuti konstrukti su kodirali polipeptide u formatu MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]. Mutacije su uvedene u plazmidima varijanti polipeptida pomoću preklapajućih parova prajmera oligonukleotida koji kodiraju željene aminokiselinske supstitucije i primenjivanjem utvrđenih tehnika molekularne biologije. Tačne plazmidne sekvence su verifikovane DNK sekvenciranjem.

[0074] E coli (soj T7E2) ćelije (GeneBridge) su transformisane plazmidima koji sadrže fragmente gena koji kodiraju originalne i modifikovane polipeptide. Ćelije su kultivisane na 37 °C u TSB-YE medijumu koji je dopunjen sa 50 µg/ml kanamicina a ekspresija proteina je naknadno izazvana dodavanjem IPTG.

Peletirane ćelije su bile prekinute pomoću FastPrep®-24 homogenizatora (Nordic Biolabs) a ćelijski ostatak je uklonjen centrifugiranjem. Svaki supernatant koji sadrži varijantu polipeptida kao His6-tagovani protein je prečišćen imobilisanom hromatografijom afiniteta metalnog jona (IMAC) pomoću His GraviTrapTM kolone (GE Healthcare) prema uputstvima proizvođača. Prečišćene varijante polipeptida su bile puferom izmenjene u fosfatom puferisan fiziološki rastvor (PBS; 1.47 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, pH 7.4) pomoću PD-10 kolona za odstranjivanje soli (GE Healthcare). Pravi identitet svakog polipeptida je verifikovan putem SDS-PAGE i HPLC-MS.

TABELA IX.

[0075] Pored susptitucija jedne od (SEQ ID NO: 284-287) ili obe od (SEQ ID NO: 273-274, 276-277, 279-280, 282-283) N52 i D53, supstitucije su takođe izvedene u položajima koji odgovaraju petlji [L2]. Stoga, u varijantama polipeptida SEQ ID NO: 274, 277, 280, 283, 285, i 287, [L2] predstavlja RQPE.

[0076] Za izvođenje ispitivanja stabilnosti, polipeptidne varijante, formulisane u PBS pH 7.4, su razblažene do 1 mg/ml a 200 µl alikvotova je inkubirano na 37 °C tokom 2 nedelje. Uzorci uzeti pre i posle ispitivanja stabilnosti su analizirani putem SDS-PAGE pomoću 10% Bis-Tris NuPAGE gelova (Invitrogen) i punjenjem 5 µg proteina u svaki bunarčić. Dobijeni gelovi obojeni Coomassie blue su prikazani na Fig.6. Stabilnost je ocenjena pojavom novih varijanti nakon inkubacije na povišenoj temperaturi a mutirane varijante su upoređene sa odgovarajućim originalnim polipeptidima.

[0077] Sve polipeptidne varijante sa modifikacijama datim u tabeli IX su pokazali poboljšanu stabilnost u poređenju sa odgovarajućim originalnim polipeptidom u smislu da druga traka iznad glavne trake ustanovljene za uzorke originalnog polipeptida nije vidljiva u uzorcima modifikovanih polipeptida sa supstitucijom D53E i/ili N52S, pogledati Fig.6. Polipeptidi sa supstitucijama D53E i/ili N52S kombinovani sa supstitucijama D36R, D37Q i S39E su pokazali slične profile na SDS-PAGE gelu. Supstitucija D53E sama ili u kombinaciji sa supstitucijama D36R, D37Q i S39E je izgledala da smanjuje količinu vrsta sa alternativnom konformacijom ustanovljenom kao druga traka na SDS-PAGE gelu, ali nije mogla u potpunosti da spreči stvaranje ove vrste.

[0078] Pored toga, vezujuća sposobnost modifikovanih polipeptidnih varijanti je ispitana. Sve polipeptidne varijante su zadržale svoj vezujući afinitet za njihov cilj nakon što su modifikovane (nisu prikazani rezultati).

[0079] Prethodno predstavljeni rezultati za varijante polipeptida koje imaju vezujući afinitet za druge ciljane molekule a koji nisu C5 odgovaraju dobro rezultatima prikazanim za C5 vezujuće polipeptide i jedinjenja ovog pronalaska (pogledati npr. primer 2 i 4). Stoga, pokazuje se da konkretne aminokiselinske modifikacije kako je ovde opisano imaju efekat stabilizovanja nevezano za aminokiselinsku sekvencu [BM]. Za aminokiselinske modifikacije ili supstitucije kako je to ovde opisano se samim tim smatra da poboljšavaju stabilnost svih C5 vezujućih polipeptida i jedinjenja kako je opisano ovde i u WO 2013/126006.

Claims

Patentni zahtevi 1. Polipeptid koji može da vezuje komponentu humanog komplementa 5 (C5), pri čemu pomenuti polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu: [BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q pri čemu, nezavisno jedni od drugih, [BM] predstavlja C5 vezujući motiv koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu EX9X10X11A X13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35; pri čemu, nezavisno jedni od drugih, X9je izabran od H, Q, S, T i V; X10je izabran od I, L, M i V; X11je izabran od A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T i Y; X13je izabran od N i W; X14je izabran od A, D, E, H, N, Q, R, S i T; X18je izabran od A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T i Y; X23je izabran od N i T; X24je izabran od I, L i V; X25je izabran od A, D, E, H, K, N, Q, R, S i T; X28je izabran od I, L i V; X32je izabran od D, E, G, H, N, S i T; X33je izabran od K i S; i X35je izabran od A, D, E, H, N, Q, S, T i Y; [L2] je izabran od DDPS i RQPE; X42je izabran od A i S; X43je izabran od N i E; X46je izabran od A, S i C; X52je izabran od E, N i S; X53je izabran od D, E i S, pod uslovom da X53ne predstavlja D kada X52predstavlja N; i X54je izabran od A i S.
2. Polipeptid prema zahtevu 1, pri čemu pomenuti polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu: AEAKYAK-[BM-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP pri čemu, nezavisno jedni od drugih, [BM], [L2], X42, X43, X46, X52, X53i X54su kao što je definisano u zahtevu 1.
3. Polipeptid prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu su X52i X53nezavisno izabrani od E i S; X52predstavlja S a X53predstavlja E; X52predstavlja E a X53predstavlja S; X52predstavlja S a X53predstavlja D, ili X52predstavlja N a X53predstavlja E.
4. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu:

pri čemu, nezavisno jedni od drugih, X9je izabran od H, Q, S, T i V; X10je izabran od I, L, M i V; X11je izabran od A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T i Y; X13je izabran od N i W; X14je izabran od A, D, E, H, N, Q, R, S i T; X18je izabran od A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T i Y; X23je izabran od N i T; X24je izabran od I, L i V; X25je izabran od A, D, E, H, K, N, Q, R, S i T; X28je izabran od I, L i V; X32je izabran od D, E, G, H, N, S i T; X33je izabran od K i S; X35je izabran od A, D, E, H, N, Q, S, T i Y; [L2] je izabran od DDPS i RQPE; X42je izabran od A i S; X43je izabran od N i E; X46je izabran od A, S i C; X52je izabran od E, N i S; X53je izabran od D, E i S, pod uslovom da X53ne predstavlja D kada X52predstavlja N; i X54je izabran od A i S.
5. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je najmanje jedan od sledećih uslova ispunjen: X9predstavlja V, X10predstavlja L, X11predstavlja E, X13predstavlja W, X14predstavlja D, X18predstavlja R, X23predstavlja T, X24predstavlja I, X25predstavlja E, X28predstavlja L, X32predstavlja N, X33predstavlja K, X35predstavlja D, [L2] predstavlja DDPS, X42predstavlja S, X43predstavlja E, X46predstavlja S, X54predstavlja S.
6. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu [BM] obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od položaja 1-28 u SEQ ID NOS: 1-248, poželjno pri čemu [BM] obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao položaji 1-28 u SEQ ID NO: 1.
7. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 6, izabran od polipeptida koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266 i SEQ ID NO: 267.
8. Jedinjenje koje može da vezuje C5, pri čemu pomenuto jedinjenje obuhvata: a. najmanje jedan C5 vezujući polipeptid prema bilo kom od prethodnih zahteva; b. najmanje jedan albumin vezujući domen streptokoknog proteina G; i c. opciono, najmanje jednu vezujuću grupu za vezivanje pomenutog najmanje jednog albumin vezujućeg domena sa C ili N terminalom pomenutog najmanje jednog C5 vezujućeg polipeptida, pri čemu je pomenuta vezujuća grupa poželjno peptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu KVX60GS, pri čemu je X60izabran od D, E i A.
9. Jedinjenje prema zahtevu 8, pri čemu X60predstavlja E a pomenuto jedinjenje predstavlja polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 269 ili SEQ ID NO: 270.
10. Jedinjenje prema zahtevu 8, pri čemu X60predstavlja A a pomenuto jedinjenje predstavlja polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 262.
11. C5 vezujući polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-7 ili C5 vezujuće jedinjenje prema bilo kom od zahteva 8-10 za upotrebu u terapiji.
12. C5 vezujući polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-7 ili C5 vezujuće jedinjenje prema bilo kom od zahteva 8-10 za upotrebu u postupku za lečenje i/ili profilaksu stanja povezanog sa C5.
13. C5 vezujući polipeptid za upotrebu prema zahtevu 12 ili C5 vezujuće jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 12, pri čemu pomenuto stanje povezano sa C5 predstavlja stanje izabrano iz grupe koju čine zapaljenske bolesti; autoimune bolesti; infektivne bolesti; kardiovaskularne bolesti; neurodegenerativni poremećaji; povreda kalema; očne bolesti; bolesti bubrega; plućne bolesti; hematološke bolesti kao što je paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH); alergijske bolesti i dermatološke bolesti.
14. C5 vezujući polipeptid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 11-13 ili C5 vezujuće jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od zahteva 11-13, pri čemu se pomenuti C5 vezujući polipeptid ili jedinjenje daje intravenski, supkutano, inhalacijom, nazalno, oralno, intravitrealno, ili topikalno.