CN109562167A - 联合治疗 - Google Patents

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Abstract

治疗认知或神经变性疾病的方法，其包括对需要这种治疗的患者施用有效量的抗N3pGlu Abeta抗体、抗Abeta抗体，或结合淀粉状蛋白β并共价附着聚乙二醇分子的抗体片段，以及有效量的抗Tau抗体的组合。

Description

联合治疗
本申请要求2016年8月9日提交的标题为“联合治疗”的美国临时专利申请系列号62/372,453、2016年8月10日提交的标题为“联合治疗”的美国临时专利申请系列号62/373,022及2016年8月17日提交的标题为“联合治疗”的美国临时专利申请系列号62/375,992的优先权，其全部公开内容在此引入作为参考。
本发明涉及抗Tau抗体与抗N3pGlu Abeta抗体、螯合淀粉状蛋白β肽的抗体(抗Aβ抗体)和结合淀粉状蛋白β肽并共价附着聚乙二醇(PEG)分子的抗体片段之一的组合，以及使用该组合的方法，用于治疗表征为淀粉状蛋白斑形成和/或淀粉状蛋白β(Abeta或Aβ)肽沉积和异常tau聚集的神经变性疾病，如阿尔茨海默病(AD)。
AD是在世界范围内影响数百万患者的毁灭性神经变性疾病。鉴于目前批准上市的药物仅为患者提供暂时的症状裨益，AD治疗中存在显著未得到满足的需要。AD表征为脑中Abeta的产生、聚集和沉积及异常tau聚集。
已显示特异性靶向N3pGlu Abeta的抗体降低体内Aβ斑块水平(美国专利申请公开号2013/0142806)。这些抗体在本文中称为“抗N3pGlu Abeta抗体”。N3pGlu Abeta也称为N3pGlu Aβ、N3pG、N3pE或A betap3-42，是仅见于斑块中的截短形式的Abeta肽。虽然N3pGluAbeta肽是脑中沉积Abeta的次要成分，但研究已证明，N3pGlu Abeta肽具有攻击性聚集特性，并在沉积级联早期累积。
已显示特异性靶向并螯合Aβ肽的抗体降低体内游离Aβ和斑块水平(美国专利号7,195,761和8,591,894)。这些抗体在本文中称为“抗Aβ抗体”。
已显示包含在人Aβ肽的残基13-28之间特异性结合Aβ肽而不特异性结合淀粉状蛋白前体蛋白(“APP”)的抗体片段并共价附着一个或多个聚乙二醇(PEG)分子的分子降低体内游离Aβ(参见例如美国专利号8,066,999)。这些分子在本文中称为“PEG-抗Aβ抗体片段”。
此外，动物模型研究已显示，tau聚集体散布神经元突触连接并螯合单体(天然或非聚集)tau，诱导tau聚集体形成。神经变性疾病(如AD)中tau聚集和累积的神经解剖学进程提示，tau原纤维聚集沿神经元网络蔓延(propagation)，最终导致微管不稳定化，并最终导致局部神经元功能受损。这提示tau聚集和累积的甚至小幅减少也可能导致神经元内神经原纤维缠结(NFT)的长期显著减少，从而提供治疗裨益，尤其是在AD的治疗中。
希望得到特异性结合tau聚集体并减少tau聚集体形成的蔓延的抗体(在本文中称为“抗Tau抗体”)与结合N3pGlu Abeta的抗体的组合来提供对神经变性障碍如AD的治疗。这种组合还将优选比任一种抗体单用更有效。例如，与每种抗体单用相比，用这种组合治疗可允许使用更低剂量的任一种或两种抗体，可能导致副作用更低(或一种或另一种治疗的持续时间更短)同时保持有效性。认为用tau抗体靶向tau聚集体将减少tau聚集体形成、NFT形成和神经元丢失的蔓延，用N3pGlu抗体靶向沉积形式的Abeta的去除将便于已有斑块沉积物的吞噬去除，同时通过抑制Abeta斑块的产生来减少或阻止Abeta的进一步沉积。
另外，希望得到抗Tau抗体与结合Abeta肽的抗体的组合来提供对神经变性障碍如AD的治疗。这种组合还将优选比任一种抗体单用更有效。例如，与每种抗体单用相比，用这种组合治疗可允许使用更低剂量的任一种或两种抗体，可能导致副作用更低(或一种或另一种治疗的持续时间更短)同时保持有效性。认为用tau抗体靶向tau聚集体将减少tau聚集体形成、NFT形成和神经元丢失的蔓延，用抗Aβ抗体靶向Aβ肽的螯合将便于Aβ肽的清除，防止斑块形成。
此外，希望得到抗Tau抗体与结合Aβ肽(特异性在人Aβ肽的残基13-28之间，不特异性结合APP)的分子的组合来提供对神经变性障碍如AD的治疗。这种组合还将优选比任一种抗体单用更有效。例如，与每种分子单用相比，用这种组合治疗可允许使用更低剂量的任一种或两种分子，可能导致副作用更低(或一种或另一种治疗的持续时间更短)同时保持有效性。认为用抗tau抗体靶向tau聚集体将减少tau聚集体形成、NFT形成和神经元丢失的蔓延，用PEG-抗Aβ抗体片段靶向Aβ肽(在残基13-28之间)将可用作表征为淀粉状蛋白斑和异常tau聚集的形成的神经变性疾病的治疗。
因此，本发明提供治疗认知或神经变性疾病的方法，其包括对需要这种治疗的患者施用有效量的抗Tau抗体与有效量的抗N3pGlu Abeta抗体、结合Abeta肽的抗体和/或PEG-抗Aβ抗体片段的组合。本发明还提供治疗临床或临床前AD的方法，其包括对需要这种治疗的患者施用有效量的抗Tau抗体与有效量的抗N3pGlu Abeta抗体、结合Abeta肽的抗体和/或PEG-抗Aβ抗体片段的组合。本发明还提供治疗前驱(prodromal)AD(有时也称为轻度认知缺损或MCI)、轻度AD、中度AD和/或严重AD的方法，其包括对需要这种治疗的患者施用有效量的抗Tau抗体与有效量的抗N3pGlu Abeta抗体、结合Abeta肽的抗体和/或PEG-抗Aβ抗体片段的组合。
本发明还提供在诊断患有临床前AD或临床AD的患者中减慢认知衰退的方法，其包括对需要这种治疗的患者施用有效量的抗Tau抗体与有效量的抗N3pGlu Abeta抗体、结合Abeta肽的抗体和/或PEG-抗Aβ抗体片段的组合。本发明还提供在诊断患有临床前AD或临床AD的患者中减慢功能衰退的方法，其包括对需要这种治疗的患者施用有效量的抗Tau抗体与有效量的抗N3pGlu Abeta抗体、结合Abeta肽的抗体和/或PEG-抗Aβ抗体片段的组合。本发明还提供在脑脊液(CSF)中具有低水平Aβ1-42或脑中具有低水平Aβ斑块的无症状患者中预防记忆丧失或认知衰退的方法，其包括施用有效量的抗Tau抗体与有效量的抗N3pGluAbeta抗体、结合Abeta肽的抗体和/或PEG-抗Aβ抗体片段的组合。
在另一实施方案中，本发明提供治疗已知具有引起阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者的方法，其包括施用有效量的抗Tau抗体与有效量的抗N3pGlu Abeta抗体、结合Abeta肽的抗体和/或PEG-抗Aβ抗体片段的组合。在另一实施方案中，本发明提供用于防止轻度认知缺损进展至AD的方法，其包括对需要这种治疗的患者施用有效量的抗Tau抗体与有效量的抗N3pGlu Abeta抗体、结合Abeta肽的抗体和/或PEG-抗Aβ抗体片段的组合。
本实施方案还提供抗N3pGlu Abeta，用于与抗Tau抗体同时、分开或顺次组合用于治疗。本实施方案还提供抗Aβ抗体，用于与抗Tau抗体同时、分开或顺次组合用于治疗。本实施方案还提供PEG-抗Aβ抗体片段，用于与抗Tau抗体同时、分开或顺次组合用于治疗。
本发明还提供药物组合物，其包含含有一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的抗N3pGlu Abeta抗体、结合Abeta肽的抗体和PEG-抗Aβ抗体片段之一，与含有一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的抗Tau抗体的药物组合物组合。
此外，本发明提供试剂盒，其包含含有抗N3pGlu Abeta抗体、结合Abeta肽的抗体和PEG-抗Aβ抗体片段之一的抗Tau抗体。本发明还提供试剂盒，其包含药物组合物，该药物组合物包含含有一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的抗Tau抗体及抗N3pGlu Abeta抗体、结合Abeta肽的抗体和PEG-抗Aβ抗体片段之一。本文所用的“试剂盒”包括各成分的分开的容器，其中一种成分是单个包装中的抗Tau抗体，另一种成分是单个包装中的抗N3pGluAbeta抗体、结合Abeta肽的抗体和PEG-抗Aβ抗体片段之一。“试剂盒”还可以包括含有将各成分作为组合施用的说明书的分开的包装中的各成分的分开的容器，其中一种成分是抗Tau抗体，另一种成分是抗N3pGlu Abeta抗体、结合Abeta肽的抗体和PEG-抗Aβ抗体片段之一。
本发明还提供抗N3pGlu Abeta抗体、结合Abeta肽的抗体和PEG-抗Aβ抗体片段之一的用途，用于制备用于治疗AD、轻度AD、前驱AD或用于防止轻度认知缺损进展至AD的药物，其中药物与抗Tau抗体同时、分开或顺次施用。
抗Tau抗体
在本发明的一个实施方案中，抗Tau抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中HC包含重链可变区(HCVR)，LC包含轻链可变区(LCVR)，该HCVR包含互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，该LCVR包含CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3。根据本发明的抗Tau抗体的具体实施方案，LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.69给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.70给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.71给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.72给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.73给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.74给出。在一个实施方案中，本发明提供结合人tau的单克隆抗体，其包含LCVR和HCVR，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.76给出。在另一实施方案中，本发明提供结合人tau的单克隆抗体，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.67给出，HC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.68给出。
本发明的抗Tau抗体可以用已知方法制备和纯化。例如，可以克隆编码HC(例如通过SEQ ID NO.68给出的氨基酸序列)(如通过SEQ ID NO.77给出的cDNA序列)和LC(例如通过SEQ ID NO.67给出的氨基酸序列)(如通过SEQ ID NO.78给出的cDNA序列)的cDNA序列并改造入GS(谷氨酰胺合成酶)表达载体。然后可将改造的免疫球蛋白表达载体稳定转染入CHO细胞。如本领域技术人员将理解，抗体的哺乳动物表达将通常在Fc区中高度保守的N糖基化位点产生糖基化。可以针对特异性结合tau聚集体的抗体的表达验证稳定克隆。可将阳性克隆扩增入无血清培养基,在生物反应器中进行抗体生产。可通过常规技术纯化抗体已分泌入其中的培养基。例如，可方便地将培养基加至已用相容的缓冲液如磷酸缓冲盐溶液平衡的Protein A或G Sepharose FF柱。洗柱以去除非特异性结合成分。例如通过pH梯度洗脱结合的抗体，如通过SDS-PAGE检测抗体级分，然后合并。抗体可用常见技术浓缩和/或除菌过滤。可溶性聚集体和多聚体可通过常见技术有效去除，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石层析。产物可以立即冷冻于例如-70℃，或者可以冷冻干燥。
本发明的抗Tau抗体结合人tau。在一个实施方案中，本发明的抗tau抗体结合人tau的构象表位。在具体实施方案中，人tau的构象表位包括人tau的氨基酸残基7-9和312-322，其中人tau的氨基酸序列通过SEQ ID NO.79给出。
抗N3pGlu Abeta抗体
在本发明的一个实施方案中，抗N3pGlu Abeta抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中该LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其选自：
a)LCDR1是SEQ ID NO.17，LCDR2是SEQ ID NO.18，LCDR3是SEQ ID NO.19，HCDR1是SEQ ID NO.20，HCDR2是SEQ ID NO.22，HCDR3是SEQ ID NO.23；
b)LCDR1是SEQ ID NO.17，LCDR2是SEQ ID NO.18，LCDR3是SEQ ID NO.19，HCDR1是SEQ ID NO.21，HCDR2是SEQ ID NO.22，HCDR3是SEQ ID NO.24；
c)LCDR1是SEQ ID NO.17，LCDR2是SEQ ID NO.18，LCDR3是SEQ ID NO.19，HCDR1是SEQ ID NO.36，HCDR2是SEQ ID NO.22，HCDR3是SEQ ID NO.37；
d)LCDR1是SEQ ID NO.4，LCDR2是SEQ ID NO.6，LCDR3是SEQ ID NO.7，HCDR1是SEQID NO.1，HCDR2是SEQ ID NO.2，HCDR3是SEQ ID NO.3；和
e)LCDR1是SEQ ID NO.4，LCDR2是SEQ ID NO.5，LCDR3是SEQ ID NO.7，HCDR1是SEQID NO.1，HCDR2是SEQ ID NO.2，HCDR3是SEQ ID NO.3。
在其他实施方案中，抗N3pGlu Abeta抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中该LCVR和HCVR选自：
a)SEQ ID NO.25的LCVR和SEQ ID NO.26的HCVR；
b)SEQ ID NO.25的LCVR和SEQ ID NO.27的HCVR；
c)SEQ ID NO.32的LCVR和SEQ ID NO.34的HCVR；
d)SEQ ID NO.9的LCVR和SEQ ID NO.8的HCVR；和
e)SEQ ID NO.10的LCVR和SEQ ID NO.8的HCVR。
在其他实施方案中，抗N3pGlu Abeta抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中该LC和HC选自：
a)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.29的HC；
b)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.30的HC；
c)SEQ ID NO.33的LC和SEQ ID NO.35的HC；
d)SEQ ID NO.12的LC和SEQ ID NO.11的HC；和
e)SEQ ID NO.13的LC和SEQ ID NO.11的HC。
在其他实施方案中，抗N3pGlu Abeta抗体包含两条轻链(LC)和两条重链(HC)，其中每条LC和每条HC选自：
a)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.29的HC；
b)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.30的HC；
c)SEQ ID NO.33的LC和SEQ ID NO.35的HC；
d)SEQ ID NO.12的LC和SEQ ID NO.11的HC；和
e)SEQ ID NO.13的LC和SEQ ID NO.11的HC。
在一些实施方案中，抗N3pGlu Abeta抗体包含抗体I，其具有分别为SEQ ID NO.12和11的轻链(LC)和重链(HC)。抗体I还具有分别为SEQ ID NO.9和8的轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)。抗体I的HCVR还包含SEQ ID NO.1的HCDR1、SEQ ID NO.2的HCDR2和SEQID NO.3的HCDR3。抗体I的LCVR还包含SEQ ID NO.4的LCDR1、SEQ ID NO.6的LCDR2和SEQ IDNO.7的LCDR3。
在一些实施方案中，抗N3pGlu Abeta抗体包含抗体II，其具有分别为SEQ IDNO.13和11的轻链(LC)和重链(HC)。抗体II还具有分别为SEQ ID NO.10和8的轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)。抗体II的HCVR还包含SEQ ID NO.1的HCDR1、SEQ ID NO.2的HCDR2和SEQ ID NO.3的HCDR3。抗体II的LCVR还包含SEQ ID NO.4的LCDR1、SEQ ID NO.5的LCDR2和SEQ ID NO.7的LCDR3。
在一些实施方案中，抗N3pGlu Abeta抗体包含B12L，其具有分别为SEQ ID NO.28和29的轻链(LC)和重链(HC)。B12L还具有分别为SEQ ID NO.25和26的轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)。B12L的HCVR还包含SEQ ID NO.20的HCDR1、SEQ ID NO.22的HCDR2和SEQID NO.23的HCDR3。B12L的LCVR还包含SEQ ID NO.17的LCDR1、SEQ ID NO.18的LCDR2和SEQID NO.19的LCDR3。
在一些实施方案中，抗N3pGlu Abeta抗体包含R17L，其具有分别为SEQ ID NO.28和30的轻链(LC)和重链(HC)。R17L还具有分别为SEQ ID NO.25和27的轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)。R17L的HCVR还包含SEQ ID NO.21的HCDR1、SEQ ID NO.22的HCDR2和SEQID NO.24的HCDR3。R17L的LCVR还包含SEQ ID NO.17的LCDR1、SEQ ID NO.18的LCDR2和SEQID NO.19的LCDR3。
在一些实施方案中，抗N3pGlu Abeta抗体包含hE8L，其具有分别为SEQ ID NO.33和35的轻链(LC)和重链(HC)。hE8L还具有分别为SEQ ID NO.32和34的轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)。hE8L的HCVR还包含SEQ ID NO.36的HCDR1、SEQ ID NO.22的HCDR2和SEQID NO.37的HCDR3。hE8L的LCVR还包含SEQ ID NO.17的LCDR1、SEQ ID NO.18的LCDR2和SEQID NO.19的LCDR3。
本领域普通技术人员将理解并认可，2014年3月25日授权的标题为“Anti-N3pGluAmyloid Beta Peptide Antibodies and Uses Thereof”的美国专利号8,679,498B2(美国系列号13/810,895)中鉴定并公开了“抗N3pGlu Abeta抗体”及具体抗体“B12L”和“R17L”，连同本领域普通技术人员制备和使用该抗体的方法。参见例如美国专利号8,679,498B2的表1。这两种抗体(例如“B12L”和“R17L”)中的每一种都可以用作本发明的抗N3pGlu Abeta抗体。在其他实施方案中，抗N3pGlu Abeta抗体可以包含本文所述抗体“hE8L”。在其他实施方案中，抗N3pGlu Abeta抗体可以包含本文所述“抗体I”。还在其他实施方案中，抗N3pGluAbeta抗体可以包含本文所述“抗体II”。
本发明的抗N3pGlu Abeta抗体结合N3pGlu Aβ。N3pGlu Aβ的序列是氨基酸序列SEQ ID NO.31。Aβ的序列是SEQ ID NO.38。
抗Aβ抗体
在本发明的一个实施方案中，抗Aβ抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中HC包含重链可变区(HCVR)，LC包含轻链可变区(LCVR)，该HCVR包含互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，该LCVR包含CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3。根据本发明的抗Aβ抗体的具体实施方案，LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.39给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.40给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.41给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.42给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.43给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.44给出。在一个实施方案中，本发明提供结合人tau的单克隆抗体，其包含LCVR和HCVR，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.45给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.46给出。在更具体的实施方案中，LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.47给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ IDNO.48给出。在另一实施方案中，本发明提供结合人tau的单克隆抗体，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.49给出，HC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.50给出。
本领域普通技术人员将理解并认可，2007年3月27日授权的标题为“HumanizedAntibodies that Sequester ABeta Peptide”的美国专利号7,195,761及2013年11月26日授权的标题为“Humanized Antibodies that Sequester ABeta Peptide”的美国专利号8591894中鉴定并公开了本发明的抗Aβ抗体，连同本领域普通技术人员制备和使用该抗体的方法，两个专利在此引入作为参考。
PEG-抗Aβ抗体片段
在本发明的一个实施方案中，提供在人Aβ肽(SEQ ID NO.56)的残基13-28之间特异性结合人Aβ肽而不特异性结合APP的PEG-抗Aβ抗体片段。根据这类实施方案，PEG-抗Aβ抗体片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3。根据本发明的PEG-抗Aβ抗体片段的具体实施方案，PEG-抗Aβ抗体片段是Fab，LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.58给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.59给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.60给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.61给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.62或SEQID NO.63给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.64给出。根据这类实施方案，PEG分子共价附着于HCVR或LCVR之一。根据具体实施方案，PEG分子共价附着于CDR。在甚至更具体的实施方案中，PEG分子共价附着于CDR内的半胱氨酸残基，例如PEG-抗Aβ抗体片段的HCVR的通过SEQ ID NO.62给出的HCDR2内的半胱氨酸残基。在具体实施方案中，PEG分子通过马来酰亚胺连接附着于半胱氨酸。在甚至更具体的实施方案中，PEG分子具有约0.5kD至约30kD之间的分子量。在甚至更具体的实施方案中，PEG分子具有约20kD的分子量。
在一个实施方案中，本发明提供在人Aβ肽的残基13-28之间特异性结合人Aβ肽而不特异性结合APP的PEG-抗Aβ抗体片段。在具体实施方案中，PEG-抗Aβ抗体片段是包含LCVR和HCVR的Fab，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.53给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQID NO.54给出。根据具体实施方案，PEG分子共价附着于该HCVR(SEQ ID NO.54)的氨基酸位置56的半胱氨酸残基。在具体实施方案中，PEG分子通过马来酰亚胺连接附着于半胱氨酸。在甚至更具体的实施方案中，PEG分子具有约0.5kD至约30kD之间的分子量。在甚至更具体的实施方案中，PEG分子具有约20kD的分子量。
在一个实施方案中，本发明提供在人Aβ肽的残基13-28之间特异性结合人Aβ肽而不特异性结合APP的PEG-抗Aβ抗体片段。具体实施方案包含含有LCVR和HCVR的Fab，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQID NO.53给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.55给出。根据具体实施方案，PEG分子共价附着于抗体片段的铰链区。在具体实施方案中，PEG分子通过马来酰亚胺连接共价附着于铰链区。在甚至更具体的实施方案中，PEG分子具有约0.5kD至约30kD之间的分子量。在甚至更具体的实施方案中，PEG分子具有约20kD的分子量。
在另一具体实施方案中，本发明提供在人Aβ肽的残基13-28之间特异性结合人Aβ肽而不特异性结合APP的PEG-抗Aβ抗体片段。根据该具体实施方案，PEG-抗Aβ抗体片段包含Fab，该Fab包含具有通过SEQ ID NO.53给出的氨基酸序列的LCVR和具有通过SEQ ID NO.54给出的氨基酸序列的HCVR，其中PEG分子共价附着于该HCVR的氨基酸位置56的半胱氨酸残基，PEG分子具有约20kD的分子量。在其他具体实施方案中，PEG分子通过马来酰亚胺连接共价附着于铰链区。
在另一具体实施方案中，本发明提供在人Aβ肽的残基13-28之间特异性结合人Aβ肽而不特异性结合APP的PEG-抗Aβ抗体片段。该具体实施方案包含Fab，该Fab具有具有通过SEQ ID NO.53给出的氨基酸序列的LCVR和具有通过SEQ ID NO.55给出的氨基酸序列的HCVR，其中PEG分子通过马来酰亚胺连接共价附着于PEG-抗Aβ抗体片段的铰链区，PEG分子具有约20kD的分子量。
本领域普通技术人员将理解并认可，2011年11月29日授权的标题为“Pegylated AβFAB”的美国专利号8,066,999中鉴定并公开了本发明的PEG-抗Aβ抗体片段，连同本领域普通技术人员制备和使用该PEG-抗Aβ抗体片段的方法，该专利在此引入作为参考。
定义
本文所用的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的两条重链(HC)和两条轻链(LC)的免疫球蛋白分子。每条LC和HC的氨基端部分包含通过包含在其中的互补决定区(CDR)负责抗原识别的可变区。CDR之间散布更保守的称为构架区的区域。基于诸如以下的众所周知的编号惯例将氨基酸分配至本发明的抗体的LCVR和HCVR区内的CDR结构域：Kabat等,Ann.NY Acad.Sci.190:382-93(1971)；Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242(1991)；和North编号惯例(North等,ANew Clustering ofAntibody CDR Loop Conformations,Journal of Molecular Biology,406:228-256(2011))。
本文所用的术语“抗体片段”指抗体的保留特异性结合抗原(例如人Aβ肽)的能力的一个或多个片段。术语“抗体片段”内所涵盖的分子的实例包括：(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，其是包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；和(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546)。此外，虽然Fv片段的两个结构域(VL和VH)由分开的基因编码，但可以用重组方法通过合成接头将它们连接，该合成接头使得能将它们制备为其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见Bird等(1988)Science 242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)的单条蛋白质链。这类单链抗体也旨在涵盖在术语“抗体片段”之内。其他形式的单链抗体如双抗体也为术语“抗体片段”所涵盖。双抗体是二价双特异性结合蛋白质，其中VH和VL结构域表达在单条多肽链上，但使用太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger,P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.等(1994)Structure 2:1121-1123)。
本发明的PEG-抗Aβ抗体片段共价附着一个或多个PEG分子。术语“聚乙二醇”和“PEG”旨在可互换使用，指本领域已知的聚乙二醇或其衍生物(参见例如美国专利号5,445,090；5,900,461；5,932,462；6,436,386；6,448,369；6,437,025；6,448,369；6,495,659；6,515,100；和6,514,491)。优选地，PEG共价附着于PEG-抗Aβ抗体片段的一个或多个赖氨酸或半胱氨酸残基。更优选地，PEG共价附着于PEG-抗Aβ抗体片段的HCVR中的一个或多个赖氨酸或半胱氨酸残基。甚至更优选地，PEG共价附着于PEG-抗Aβ抗体片段的CDR内的一个或多个赖氨酸或半胱氨酸残基。最优选地，PEG附着于该SEQ ID NO:54的HCVR的氨基酸位置56的半胱氨酸残基。备选地，PEG分子可以通过PEG-抗Aβ抗体片段铰链区的接头或间隔区分子附着于抗体片段。向铰链区加入接头和间隔区分子为本领域公知。此外，可以通过本领域公知的技术将PEG分子共价附着于PEG-抗Aβ抗体片段的修饰的非天然氨基酸。
在其典型形式中，“PEG”是含末端羟基的线性聚合物，具有化学式HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，其中n为从约8至约4000。末端氢可以用保护性基团如烷基或烷醇(alkanol)基团(M-PEG)取代。优选地，PEG具有至少一个羟基，更优选地，它是末端羟基。正是优选活化此羟基来与肽反应。用多种化学修饰来制备含有官能团的活性PEG衍生物，如活性碳酸盐、活性酯、醛、tresylate，或使用适合用于偶联至给定靶分子的PEG-丙醛。然后使活化的PEG衍生物共价连接至多肽药物上的反应性基团。有多种形式的PEG可用于本发明。本领域中存在许多PEG衍生物，且适合用于本发明。共价附着于本发明的PEG-抗Aβ抗体片段的PEG分子并非旨在限于具体的类型或大小。PEG分子的分子量优选从约0.5千道尔顿(kD)至约100kD，更优选从约5kD至约30kD，最优选从约1kD至约20kD。PEG分子可以是线性或分枝的，本发明的PEG-抗Aβ抗体片段可以具有1、2、3、4、5或6个附着于肽的PEG分子。最优选每个PEG-抗Aβ抗体片段附着一个PEG分子；但是，在每个PEG-抗Aβ抗体片段存在一个以上PEG分子时，优选存在不超过6个。还考虑可修改PEG分子的两端用于将两个或多个PEG-抗Aβ抗体片段交叉连接在一起。将PEG分子附着至蛋白质、抗体及其片段的方法为本领域公知。
在本发明的具体实施方案中，抗体和抗体片段或编码抗体和抗体片段的核酸可以以分离的形式提供。本文所用的术语“分离的”指这样的蛋白质、肽或核酸，其不见于自然界中，且不含或基本不含见于细胞环境中的其他大分子种类。本文所用的“基本不含”意指目的蛋白质、肽或核酸包含超过80％，优选超过90％，更优选超过95％(以摩尔为基础)所存在的大分子种类。在本发明的具体实施方案中，抗体和/或抗体片段或编码抗体和/或抗体片段的核酸可以以分离的形式提供。本文所用的术语“分离的”指这样的蛋白质、肽或核酸，其不见于自然界中，且不含或基本不含见于细胞环境中的其他大分子种类。本文所用的“基本不含”意指目的蛋白质、肽或核酸包含超过80％，优选超过90％，更优选超过95％(以摩尔为基础)所存在的大分子种类。
本发明的抗体和/或抗体片段表达和分泌之后，澄清培养基以去除细胞，并用许多常用技术中的任一种纯化经澄清的培养基。纯化的抗体或片段可以按照众所周知的用于配制用于胃肠外施用尤其是皮下、鞘内或静脉内施用的蛋白质和抗体的方法配制为药物组合物。抗体或片段可以与适当的可药用赋形剂一起冷冻干燥，然后在使用前用基于水的稀释剂复溶。备选地，抗体可配制在水溶液中并在使用前保存。在任一种情况下，抗体药物组合物的保存形式和注射形式将包含一种或多种可药用赋形剂，可药用赋形剂是抗体之外的成分。成分是否可药用取决于其对安全性和有效性的影响或对药物组合物安全性、纯度和效价的影响。如果判定成分对安全性或有效性(或对安全性、纯度或效价)有非常不利的影响而保证它不用于对人类施用的组合物，则它对用于抗体或片段的药物组合物而言不是可药用的。
本文提到的术语“表征为Aβ沉积的疾病”是在病理学上表征为脑中或脑血管系统中的Aβ沉积物的疾病。这包括诸如AD、唐氏综合征和脑淀粉状血管病的疾病。术语“表征为异常tau聚集的疾病”指表征为tau聚集体形成、NFT形成和神经元丢失中的至少一种的蔓延的疾病。这包括诸如AD、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底变性和皮克病的疾病。
作为本领域技术人员，主诊医师或医护专业人员可通过使用已知的技术和通过观察结果来容易地确定AD的临床诊断、分段或进展。这通常包括某种形式的脑成像(例如MRI、淀粉状蛋白PET)、精神或认知评估(例如临床痴呆评定量表-方框总结(CDR-SB)、简易精神状态测验25(MMSE)或阿尔茨海默病评估量表-认知(ADAS-Cog))或功能评估(例如阿尔茨海默病协作研究-日常生活活动(ADCS-ADL))。本文所用的“临床阿尔茨海默病”是AD的诊断阶段。它包括诊断为前驱阿尔茨海默病、轻度AD、中度AD和严重AD的病症。术语“临床前阿尔茨海默病”是临床AD之前的阶段，其中生物标志(如通过淀粉状蛋白PET测定的CSF Aβ42水平或沉积脑斑块)可测量的改变指示具有进展至临床AD的阿尔茨海默病病理的患者的最早病征。这通常在诸如记忆丧失和意识混乱的症状引起注意之前。
本文所用的术语“治疗”包括限制、减慢、终止、减少或逆转已有症状、障碍、病症或疾病(如AD)的进展或严重度。
本文所用的术语“患者”指人。
本文所用的术语“抑制Abeta肽的产生”用来指降低患者中Abeta肽的体内水平。
术语“预防”意指对无症状患者或临床前AD患者预防性施用本文所述抗体和/或抗体片段的组合以防止疾病进展。
本文所用的术语“有效量”指对患者施用的抗N3pGlu Abeta抗体、抗Aβ抗体或PEG-抗Aβ抗体片段的量或剂量及抗Tau抗体的量或剂量，其在诊断或治疗下在患者中提供希望得到的效应。应理解，以在身体中提供有效水平的抗N3pGlu Abeta抗体、抗Aβ抗体或PEG-抗Aβ抗体片段和抗Tau抗体的任何方式，通过抗N3pGlu Abeta抗体、抗Aβ抗体或PEG-抗Aβ抗体片段与抗Tau抗体一起进行本发明的联合治疗。
作为本领域技术人员，主诊医师可通过使用已知的技术和通过观察在类似情境下获得的结果来容易地确定有效量。在患者有效量的确定中，主诊医师考虑许多因素，包括但不限于：患者的类别；其大小、年龄和一般健康；所涉及的具体疾病或障碍；疾病或障碍的程度或涉及或严重度；个体患者的反应；所施用的具体化合物；施用方式；所施用的制备物的生物利用率特征；所选择的剂量方案；并行药物的使用；及其他相关情境。例如，可基于通过florbetapir PET成像(具有可接受的患者安全性特征)观察到的显著淀粉状蛋白减少的达到来确定抗N3pGlu抗体的有效量。可基于模型化游离血浆Aβ降低(具有可接受的患者安全性特征)的程度来确定抗Aβ抗体或PEG-抗Aβ抗体片段的有效量。此外，例如，可基于通过tauPET成像(具有可接受的患者安全性特征)观察到的tau NFT进程减慢的达到来确定抗Tau抗体的有效量。
此外，在本发明的组合中，抗体或片段通常在宽剂量范围内有效。在一些情况下，低于前述范围下限的剂量水平可以更适当，而在其他情况下，仍可利用具有可接受的不良事件的更大剂量，因此以上剂量范围并非旨在以任何方式限制本发明的范围。
本发明的抗体或片段优选配制为通过任何使得抗体可生物利用的途径施用的药物组合物。施用途径可以任何方式改变，受限于药物的物理特性及患者和护理者的方便性。优选地，药物组合物用于胃肠外施用，如静脉内或皮下施用。根据具体实施方案，抗N3pGluAbeta抗体、抗Aβ抗体或PEG-抗Aβ抗体片段可以皮下施用，抗Tau抗体可以静脉内施用。在其他具体实施方案中，抗N3pGlu Abeta抗体、抗Aβ抗体或PEG-抗Aβ抗体片段和抗Tau抗体都可以静脉内施用或都可以皮下施用。药物组合物和制备药物组合物的方法为本领域公知。(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(D.B.Troy,Editor,第21版,Lippincott,Williams&Wilkins,2006)。
本文所用的短语“与…组合”指如同时或以任何顺序顺次或以其任意组合施用抗N3pGlu Abeta抗体、抗Aβ抗体或PEG-抗Aβ抗体片段与抗Tau抗体。两种分子可以作为同一药物组合物的部分或在分开的药物组合物中施用。抗N3pGlu Abeta抗体、抗Aβ抗体或PEG-抗Aβ抗体片段可以在施用抗Tau抗体之前、与施用抗Tau抗体同时或在施用抗Tau抗体之后或以其某种组合施用。
本文所用的“BSA”指牛血清白蛋白；“EDTA”指乙二胺四乙酸；“ee”指对映体过量；“Ex”指实例；“F12”指Ham’s F12培养基；“hr”指小时；“HRP”指辣根过氧化物酶；“IC50”指药物产生该药物可能的最大抑制反应的50％的浓度；“min”指分钟；“PBS”指磷酸缓冲盐溶液；“PDAPP”指血小板衍生淀粉状蛋白前体蛋白；“Prep”指制备；“psi”指磅/平方英寸；“Rt”指保留时间；“SCX”指强阳离子交换层析；“THF”指四氢呋喃；“TMB”指3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(teramethylbenzidine)。
实施例
以下实施例旨在说明而非限制本发明。
抗Tau抗体
改造的抗Tau抗体的表达
本发明的改造的抗Tau抗体可以基本按以下表达和纯化。用包含DNA序列SEQ IDNO.78(编码SEQ ID NO.67的LC氨基酸序列)和DNA序列SEQ ID NO.77(编码SEQ ID NO.68的HC氨基酸序列)的谷氨酰胺合成酶(GS)表达载体通过电穿孔转染中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)。表达载体编码SV早期(猿猴病毒40E)启动子和GS基因。GS的表达允许生物合成CHO细胞所需的氨基酸谷氨酰胺。转染后，用50μM L-甲硫氨酸亚砜亚胺(methioninesulfoximine，MSX)对细胞进行混合选择。利用MSX对GS的抑制来提高选择的严格性。可以针对表达内源水平的GS的CHO野生型细胞选择表达载体cDNA整合入宿主细胞基因组的转录活性区的细胞。将转染群体按低密度接种平板，以允许稳定表达细胞近克隆长出(close-to-clonal outgrowth)。针对抗体表达筛选主孔，然后在无血清悬浮培养物中放大规模用于生产。
将抗体已分泌进入其中的澄清培养基加至用相容的缓冲液如磷酸缓冲盐溶液(pH7.4)平衡的Protein A亲和柱。用1M NaCl洗柱以去除非特异性结合成分。例如用pH(约)3.5的柠檬酸钠洗脱结合的抗Tau抗体，用1M Tris缓冲液中和级分。如通过SDS-PAGE或分析型大小排阻检测抗Tau抗体级分，然后合并。可溶性聚集体和多聚体可以通过常用技术有效去除，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石层析。用常用技术浓缩和/或除菌过滤本发明的抗Tau抗体。这些层析步骤之后的抗Tau抗体的纯度大于95％。本发明的抗Tau抗体可以立即冷冻于-70℃或在4℃保存若干个月。
抗Tau抗体的结合动力学和亲和力
用以2000仪器(在25℃用HBS-EP+运行缓冲液(GE Healthcare,10mM Hepes pH7.4+150mM NaCl+3mM EDTA+0.05％表面活性剂P20)灌注)测量的表面等离振子共振(SPR)测定来测量示例性抗Tau抗体(具有SEQ ID NO.68的HC和SEQ ID NO.67的LC二者)与人单体(例如天然或非聚集体)tau和人tau聚集体(二者都具有SEQ ID NO.79所示氨基酸序列)二者的结合。
除非另有说明，所有试剂和材料都来自AB(Upsala,瑞典)。用在全部四个流动池(FC)上包含固定化蛋白A(用标准NHS-EDC胺偶联产生)的CM5芯片来利用捕获方法。通过稀释入运行缓冲液按0.5μg/mL配制抗体样品。通过稀释入运行缓冲液将单体tau和原纤维tau配制为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.82、3.91、1.95和0(空白)nM的浓度。每个分析循环包括：(1)在分开的流动池(FC2、FC3和FC4)上捕获抗体样品；(2)按50μL/分钟流速在各FC上注入250μL(300秒)单体tau或tau原纤维聚集体；(3)返回缓冲液流20分钟以监测解离期；(4)用25μL(30秒)甘氨酸pH1.5注射再生芯片表面；(5)用50μL(60秒)HBS-EP+注射平衡芯片表面。
用标准双重参考处理与tau聚集体结合的数据，并用4.1版本的Biacore2000Evaluation软件拟合至1:1结合模型，以确定结合速率(kon,M-1s-1单位)、解离速率(koff,s-1单位)和Rmax(RU单位)。从KD＝koff/kon关系计算平衡解离常数(KD)，以摩尔单位表示。由于快速的结合和解离速率，与单体tau结合的数据不能通过上述SPR准确测定。因此，通过使用稳态结合拟合模型从抗原浓度对响应单位的曲线图获得与单体tau结合的KD。表1中提供得到的结合数据。
表1：与人单体和聚集体tau二者的SPR结合数据
*KD结果视为相对值，因为结果未针对亲和力(avidity)的影响归一化。
表1中提供的结果证明，示例性抗Tau抗体对tau聚集体确实具有显著的结合亲和力，而对单体tau不具有可测量到的结合，使得可通过Biacore分析准确测定亲和力值(由于快速的结合和解离速率)。
用酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定示例性抗Tau抗体(具有SEQ ID NO.68的HC和SEQ ID NO.67的LC二者)与来自AD脑匀浆的聚集体tau原纤维的相对结合亲和力。从来自AD患者脑的约80g皮质制备AD脑匀浆。简言之，按约10ml/1g(组织)将缓冲液(TBS/1mM PMSF/1X蛋白酶抑制剂混合物(Roche,p/n.11 697 498 001)和磷酸酶抑制剂(ThermoFischer,p/n.78428))加至AD脑组织。用手持式Kinematica Polytron按速度6-7匀浆组织。然后用Parr Bomb(Parr Instrument,p/n.4653)按1500psi氮气进一步匀浆组织30分钟。4℃、28,000g(J14Beckman转子)离心匀浆30分钟。收集上清，合并，并在Sepharose400Superflow的4cm高保护柱上运行，以去除较大的碎片，然后按每小时50-60ml的流速在25ml MC1-Affigel 10柱上运行，以纯化MC1结合的tau原纤维。为了最大化纯化回收，将上清在4℃在18-20小时内通过MC-1柱循环。去除保护柱，用至少40柱体积的TBS冲洗MC1柱。然后用2柱体积的3M KSCN洗脱结合的tau聚集体，按约1ml级分收集。通过微量滴定板Bradford测定检查各洗脱级分中的蛋白质浓度。将包含正值蛋白质水平的级分合并，用Centricon(Millipore Ultracel-30K)在4℃浓缩至约2ml，并用Slide-A-Lyzer透析盒(10KMWCO 3-12ml,Pierce)对1升TBS过夜透析。通过使用DA-9捕获抗体和CP27检测抗体的夹心ELISA测量从AD脑匀浆纯化的tau原纤维内的tau浓度。
按对应于0.7μg/ml总tau的浓度将PBS中的纯化tau原纤维(50μl)包被在96孔板(Coastar,p/n.3690)的孔上。4℃过夜孵育平板，然后用150μl PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤三次，在100μl BB3(ImmunoChemistry Technology,p/n.643)中室温封闭至少1小时(通常2小时)。封闭后，从孔去除封闭缓冲液。将示例性抗Tau抗体(具有SEQ IDNO.68的HC和SEQ ID NO.67的LC二者)在0.25％酪蛋白缓冲液中稀释至1000nM母液，然后以两倍稀释系列稀释23次。将50μl母液和系列稀释的抗体加至分开的孔，室温孵育2小时，然后用200μl/孔PBST洗涤平板4次。加入50μl抗人IgG-HRP抗体(1:4000稀释入0.25％酪蛋白缓冲液)，室温孵育1小时，然后用200μl/孔PBST洗涤平板4次。加入50μl TMB/H2O2，室温孵育约10分钟。通过加入50μl终止液(2N H2SO4)终止反应，在450nm测量比色信号。将数据输入Prism 6(GraphPad)程序，用非线性回归曲线拟合和S型剂量反应产生EC50值。结果显示在表2中。
表2.与纯化的AD Tau原纤维结合的EC50比较
<u>所测定的抗体</u> <u>EC<sub>50</sub>(pM)</u>
示例性抗Tau mAb 6.8
如表2中所反映，本发明的示例性tau单克隆抗体显示对纯化的tau原纤维的显著亲和力(如通过EC50测量)。
体外靶标接合研究
通过福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)脑切片的免疫组织化学染色来测定示例性抗Tau抗体(具有SEQ ID NO.68的HC和SEQ ID NO.67的LC二者)与源自人脑的聚集tau的结合，该切片获自：“正常”个体(显示最小程度tau聚集)；AD患者(显示严重tau聚集和NFT形成，以及淀粉状蛋白斑病理)；PD患者(显示严重tau聚集)。还对源自不具有人tau的“对照”野生型小鼠的脑切片进行染色，以确定背景非特异性染色水平。
将FFPE切片脱蜡和再水化。然后对切片进行抗原修复(使用Lab Vision PT模块系统，Thermo Scientific)，其包括在柠檬酸缓冲液(Thermo Scientific,p/n.TA-250-PM1X)中100℃加热切片20分钟，然后在dH2O中冷却切片。然后使切片暴露于以下7个孵育步骤(室温)：(1)0.03％H2O2中10分钟；(2)1:20稀释在PBST中的正常山羊血清(Vector Labs.,p/n.S-1000)中30分钟；(3)示例性抗Tau抗体(归一化至1mg/ml，然后在与切片孵育前1:4000稀释在PBST中)中60分钟；(4)含浓度1.1μg/ml的兔抗人IgG4(抗示例性抗体的Fc区)的PBST中30分钟；(5)1:200稀释在PBST中的生物素化山羊抗兔IgG(Vector Labs.,p/n.BA-1000)中30分钟；(6)抗生物素蛋白-生物素复合物溶液(Vector Labs.,p/n.PK-7100)中30分钟；(7)3,3′-二氨基联苯胺(Vector Labs.,p/n.SK-4105)中5分钟。在以上7个步骤的各步骤之间用PBST洗涤切片。以上7个孵育步骤之后，用苏木精复染切片，脱水，加盖玻片。对于小鼠“对照”组织切片，修改以上流程：在孵育步骤(3)中使用1:8000稀释(与1:4000稀释相对)的示例性抗Tau抗体；用1:200稀释在PBST中的生物素化山羊抗人IgG(Vector Labs.p/n.BA-3000)中30分钟的单个步骤替换孵育步骤(4)和(5)。
按照基本如上文所述的方法，进行了示例性抗Tau抗体与源自人脑的tau的结合的分析。结果在表3中提供。
表3.FFPE AD脑切片中聚集tau的结合的半定量分析
表3中提供的结果反映出，与对照样品相比，示例性抗Tau抗体显示对来自AD和PD患者的海马脑切片中聚集tau的染色水平显著更高。另外，由于AD和PD表征为编码tau的基因的不同剪接变体，这些结果支持这样的结论，示例性抗Tau抗体特异性结合包含AD和PD二者的tau聚集体共同的人tau氨基酸残基7-9和312-322(基于SEQ ID NO.79的示例性人tau的残基编号)的构象表位。
体内中和Tau聚集体蔓延
已知在注射入正常10周龄雌性P301S小鼠时，来自约5月龄P301S小鼠的匀浆脑干制备物诱导天然非聚集体tau的聚集，证明tau聚集的蔓延样效应。与上文所述基本相同，制备来自4.5至5月龄P301S小鼠的脑干组织的匀浆制备物。
用5μl匀浆脑制备物和7.5μg示例性抗Tau抗体(具有SEQ ID NO.68的HC和SEQ IDNO.67的LC二者)(N＝12)或7.5μg对照人IgG4抗体(N＝11)在海马左半球中注射正常10周龄雌性P301S小鼠。注射后4周，处死小鼠，收集左半球和右半球，石蜡包埋，将6μm连续切片封固在载玻片上。将包含前卤点(A-P＝-2.30)的载玻片脱蜡，再水化包埋组织，并通过在柠檬酸缓冲液中100℃加热载玻片20分钟来进行抗原修复。将载玻片在dH2O中冷却，并按以下步骤室温孵育：(a)(0.03％)H2O2中30分钟；(b)1:20稀释的正常山羊血清中30分钟；(c)1:8000稀释的PG-5抗体(稀释在PBST中)(PG-5抗体获自耶什华大学阿尔贝特·爱因斯坦医学院(Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University)Peter Davies博士实验室；PG-5抗体特异性结合磷酸化时的tau残基409处的丝氨酸，残基编号基于SEQ IDNO.79的示例性人tau)；(d)1:200稀释的生物素化山羊抗小鼠IgG抗体(稀释在PBST中)中30分钟；(e)抗生物素蛋白-生物素复合物溶液中30分钟；和(f)3,3′-二氨基联苯胺中5分钟。在各步骤之间用PBST进行洗涤。在3,3′-二氨基联苯胺中孵育5分钟后，用苏木精复染切片，脱水，加盖玻片。按20x放大通过Scanscope AT Slide Scanner(Aperio)测量染色信号。用Imagescope Software(v.11.1.2.780,Aperio)的正像素算法定量PG-5免疫反应性并表示为百分比。结果在表4中提供。
表4.左海马和右海马中各自的平均％PG-5免疫反应性
表4中提供的结果证明，与对照IgG4抗体相比，示例性抗Tau抗体降低了左海马和右海马二者中的tau聚集水平。如图所示，与对照IgG4抗体相比，示例性抗Tau抗体分别在左海马中产生60.5％的tau聚集减少，在右海马中产生66.5％的tau聚集减少。这些结果证明，示例性抗Tau抗体对tau聚集的蔓延具有中和活性。
抗N3pGlu Aβ抗体
改造的抗N3pGlu Aβ抗体的表达和纯化
本发明的抗N3pGlu Aβ抗体(例如抗体I或II)可以基本按以下表达和纯化。用包含编码SEQ ID NO.12或13的LC氨基酸序列的DNA序列和编码SEQ ID NO:11的HC氨基酸序列的DNA序列的谷氨酰胺合成酶(GS)表达载体通过电穿孔转染中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)。表达载体编码SV早期(猿猴病毒40E)启动子和GS基因。转染后，用0-50μM L-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)对细胞进行混合选择。然后在无血清悬浮培养物中放大所选择的混合细胞或主孔规模用于生产。
将抗体已分泌进入其中的澄清培养基加至用相容的缓冲液如磷酸缓冲盐溶液(pH7.4)平衡的Protein A亲和柱。用1M NaCl洗柱以去除非特异性结合成分。例如用pH(约)3.5的柠檬酸钠洗脱结合的抗N3pGlu Aβ抗体，用1M Tris缓冲液中和级分。如通过SDS-PAGE或分析型大小排阻检测抗N3pGlu Aβ抗体级分，然后合并。将本发明的抗N3pGlu Aβ抗体(抗体I或抗体II)浓缩在pH 7.4的PBS缓冲液或pH约6的10mM柠檬酸钠缓冲液、150mM NaCl中。最终的物质可以用常用技术除菌过滤。抗N3pGlu Aβ抗体的纯度大于95％。本发明的抗N3pGluAβ抗体(抗体I或抗体II)可以立即冷冻于-70℃或在4℃保存若干个月。
抗N3pGlu Aβ抗体的结合亲和力和动力学
用3000(GE Healthcare)通过表面等离振子共振来测量抗N3pGluAβ抗体(抗体I或抗体II)与pE3-42Aβ或与Aβ1-40肽的结合亲和力和动力学。通过经CMS芯片上的固定化蛋白A捕获抗N3pGlu Aβ抗体、流过从100nM向下2倍系列稀释至3.125nM的pE3-42Aβ或Aβ1-40肽来测量结合亲和力。实验于25℃在HBS-EP buffer(GE Healthcare BR100669；10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％表面活性剂P20,pH7.4)中进行。
对于每个循环，按10μL/分钟流速注入浓度10μg/mL的抗体溶液来捕获抗体。按50μL/分钟注入250μL结合肽，然后解离10分钟。按10μL/mL流速注入5μL pH 1.5的甘氨酸缓冲液再生芯片表面。将数据拟合至1:1Langmiur结合模型以导出kon、koff，并计算KD。
按照基本如上文所述的方法，观察到了一下参数(表5中所示)。
表5.抗N3pGlu Aβ抗体的结合亲和力和动力学。
抗体 k<sub>on</sub>(x10<sup>5</sup>1/MS) k<sub>off</sub>(x10<sup>-4</sup>1/s) K<sub>D</sub>(nM)
I 1.39 1.31 0.71
II 3.63 1.28 0.35
未检测到与Aβ1-40的可观结合，表明与Aβ1-40相比，抗体I和抗体II特异性结合pE3-42Aβ肽。
抗N3pGlu Aβ抗体的体外靶标接合
为了在来自固定的PDAPP脑的脑切片上测定体外靶标接合，用外源加入的抗N3pGlu Aβ抗体(抗体I或抗体II)进行免疫组织化学分析。用20μg/mL本发明的示例性N3pGlu Aβ抗体(抗体I或抗体II)孵育来自老年PDAPP小鼠(25月龄)的恒冷连续冠状切片。利用对人IgG特异的第二HRP试剂，并用DAB-Plus(DAKO)显示沉积斑块。用生物素化鼠3D6抗体孵育后第二Step-HRP孵育作为阳性对照。阳性对照抗体(生物素化3D6)标记PDAPP海马中显著量的沉积Aβ，抗N3pGlu Aβ抗体(抗体I或抗体II)标记一部分沉积。这些组织学研究证明，抗N3pGlu Aβ抗体(抗体I或抗体II)在体外接合沉积Aβ靶标。
抗Aβ抗体
示例性抗Aβ抗体的合成
细胞和抗体。小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0获自ATCC(Manassas,Va.)，在37℃CO2培养箱中维持在含10％FBS(目录号SH32661.03,HyClone,Logan,Utah)的DME培养基中。小鼠266杂交瘤细胞先培养在含10％FBS(HyClone)、10mM HEPES、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、25μg/ml庆大霉素的RPMI-1640培养基中，然后在滚瓶中在含2％低Ig FBS(目录号30151.03,HyClone)的无血清培养基(杂交瘤SFM,目录号12045–076,LifeTechnologies,Rockville,Md.)中扩增至2.5升体积。用protein-G Sepharose柱通过亲和层析从培养上清纯化小鼠单克隆抗体266(Mu266)。用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin(目录号21338ZZ,Pierce,Rockford,Ill.)制备生物素化Mu266。
可变区cDNA的克隆。按照厂家的流程用TRIzol试剂(Life Technologies)从约107个杂交瘤细胞提取总RNA，并用PolyATract mRNA Isolation System(Promega,Madison,Wis.)分离poly(A)+RNA。按照厂家的流程用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech,Palo Alto,Calif.)合成双链cDNA。使用分别退火至小鼠κ和γ链恒定区的3’引物及SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit中提供的5’通用引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增轻链和重链的可变区cDNA。对于VL PCR，3’引物具有序列：
5′-TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3′[SEQ ID NO:51]，残基17-46杂交至小鼠Cκ区。对于VH PCR，3’引物具有简并序列：
残基17-50杂交至小鼠γ链CHI。将VL和VH cDNA亚克隆入pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)进行序列测定。按照厂家说明书通过含荧光双脱氧链终止剂(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)的PCR循环测序反应进行DNA测序。在Model377DNA Sequencer(Applied Biosystems)上分析测序反应。
人源化266(Hu266)可变区的构建。按Queen等[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029–10033(1988)]所述进行小鼠抗体V区的人源化。根据序列同源性选择用作Mu266CDR受体的人V区构架。用计算机程序ABMOD和ENCAD[Levitt,M.,J.Mol.Biol.168:595–620(1983)]来构建可变区的分子模型。用Mu266的相应残基替换预测为与CDR接触的人源化V区中的氨基酸。这在重链中的残基46、47、49和98处及轻链中的残基51处进行。将发现在同一V区亚组罕见的人源化V区中的氨基酸改变为共有氨基酸，以消除潜在的免疫原性。这在轻链中的残基42和44处进行。
用长度在从约65至80个碱基范围内的8条重叠的合成寡核苷酸构建和扩增轻链和重链可变区基因[He,X.Y.等,J.Immunol.160:029–1035(1998)]。将寡核苷酸配对退火，并用DNA聚合酶I的Klenow片段延伸，产生4个双链片段。将得到的片段配对变性、退火，并用Klenow延伸，产生2个片段。将这些片段配对变性、退火，并再次延伸，产生全长基因。用Expand High Fidelity PCR System(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,Ind.)通过PCR扩增得到的产物。对PCR扩增片段进行凝胶纯化，克隆入pCR4Blunt-TOPO载体。序列确认后，用MluI和XbaI消化VL和VH，凝胶纯化，并分别亚克隆入用于表达轻链和重链的载体，得到pVk-Hu266和pVg1-Hu266[Co,M.S.等,J.Immunol.148:1149–1154(1992)]。从这些质粒表达的成熟人源化266抗体(Hu266)具有SEQ ID NO:49的轻链和SEQ ID NO:50的重链。
稳定转染。按(Co等,1992)所述按360V和25μF使用Gene Pulser仪器(BioRad,Hercules,Calif.)，通过电穿孔达到稳定转染入小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0。转染前，用FspI线性化pVk-Hu266和pVg1-Hu266质粒DNA。用20μg pVk-Hu266和40μg pVg1-Hu266转染约107Sp2/0细胞。将转染的细胞悬浮在含10％FBS的DME培养基中，接种入若干96孔板。48小时后，应用选择培养基(含10％FBS、HT培养基添加剂、0.3mg/ml黄嘌呤和1μg/ml霉酚酸的DME培养基)。起始选择后约10天，通过下文所示ELISA测定培养上清中的抗体产生。在含10％FBS的DME培养基中扩增高产克隆，并进一步测定抗体表达。然后使所选择的克隆适应在杂交瘤SFM中生长。
ELISA测量抗体表达。用100μl含1μg/ml山羊抗人IgG、Fcγ片段特异、多克隆抗体(目录号109-005-098,Jackson ImmunoResearch,West Grove,Pa.)的0.2M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.4)在4℃过夜包被96孔ELISA平板(Nunc-Immuno plate,目录号439454,NalgeNunc,Naperville,Ill.)的孔。用洗涤缓冲液(含0.1％Tween 20的PBS)洗涤后，用400μl Superblock封闭缓冲液(目录号37535,Pierce)封闭孔30分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤。将含Hu226的样品适当稀释在ELISA缓冲液(含1％BSA和0.1％Tween 20的PBS)中，加至ELISA平板(100μl/孔)。用人源化抗CD33IgG1单克隆抗体HuM195(Co等,1992,上文)作为标准品。ELISA平板在室温孵育2小时，用洗涤缓冲液洗涤孔。然后向各孔加入100μl 1/1,000稀释在ELISA缓冲液中的HRP缀合山羊抗人κ多克隆抗体(目录号1050-05,SouthernBiotechnology,Birmingham,Ala.)。室温孵育1小时后，用洗涤缓冲液洗涤，向各孔加入100μl ABTS底物(目录号507602和506502,Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,Md.)。通过每孔加入100μl 2％草酸终止显色。用OPTImax酶标仪(MolecularDevices,Menlo Park,Calif.)读取415nm吸光度。
Hu266的纯化。使高表达Hu266的Sp2/0稳定转染子之一(克隆1D9)适应在杂交瘤SFM中生长，并在滚瓶中扩增至2升。在细胞活率达到10％或以下时收集耗尽的培养上清，上样至protein-ASepharose柱。用PBS洗柱，然后用0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.5)、0.1M NaCl洗脱抗体。将洗脱的蛋白质对更换三次的2升PBS透析，滤过0.2μm滤器，然后保存于4℃。通过测量280nm吸光度来测定抗体浓度(1mg/ml＝1.4A280)。按照标准流程在4-20％梯度凝胶(目录号EC6025,Novex,San Diego,Calif.)上进行Tris-甘氨酸缓冲液中的SDS-PAGE。将纯化的人源化266抗体还原，并在SDSPAGE凝胶上运行。全抗体显示分子量约为25kDa和50kDa的两条带。这些结果与从其氨基酸组成计算的轻链和重链或重链片段的分子量一致。
示例性抗Aβ抗体的体外结合特性
在比较ELISA中使用生物素化小鼠266抗体，将按上文所述合成和纯化的人源化266抗体(Hu266)的结合功效与小鼠266抗体(Mu266)相比较。用100μl含与BSA缀合的β-淀粉状肽(1–42)的0.2M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH 9.4)(10μg/mL)在4℃过夜包被96孔ELISA平板(Nunc-immuno plate,目录号439454,NalgeNunc)的孔。通过将7.5mg Aβ1-42-Cys43(C末端半胱氨酸Aβ1-42,AnaSpec)溶解在500μL二甲基亚砜中然后立即加入1,500μL蒸馏水来配制Aβ1-42-BSA缀合物。将两(2)毫克马来酰亚胺活化的牛血清白蛋白(Pierce)溶解在200μL蒸馏水中。将两种溶液组合，混匀，并使其在室温静置两(2)小时。用凝胶层析柱来将未反应的肽与Aβ1-42-Cys-BSA缀合物分开。
使用ELISA洗板机，用含0.1％Tween 20的磷酸缓冲盐溶液(PBS)(洗涤缓冲液)洗涤孔，通过每孔加入300μL SuperBlock试剂(Pierce)封闭孔。封闭30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤孔，并去除过量液体。
按每孔100μl终体积一式三份加入ELISA缓冲液中的生物素化Mu266(0.3μg/ml终浓度)和竞争抗体(Mu266或Hu266；750μg/ml终浓度起始，3倍系列稀释)的混合物。作为无竞争抗体的对照，加入100μl 0.3μg/ml生物素化Mu266。作为背景对照，加入100μl ELISA缓冲液。室温孵育ELISA平板90分钟。用洗涤缓冲液洗涤孔后，向每孔加入100μl 1μg/ml的HRP缀合链霉抗生物素蛋白(目录号21124,Pierce)。室温孵育平板30分钟，用洗涤缓冲液洗涤。加入100μl/孔的ABTS过氧化物酶底物(Kirkegaard&Perry Laboratories)进行显色。通过加入100μl/孔2％草酸终止显色。读取415nm吸光度。使用本领域公知的方法，将吸光度对竞争抗体浓度的对数作图，将曲线拟合至数据点(使用Prism)，并测定各抗体的IC50。
小鼠266的平均IC50为4.7μg/mL(三次独立实验，标准差＝1.3μg/mL)，人源化266的平均IC50为7.5μg/mL(三次独立实验，标准差＝1.1μg/mL)。基本按上文所述进行了第二组三次实验，测定小鼠266的平均IC50为3.87μg/mL(SD＝0.12μg/mL)，测定人266的IC50为4.0μg/mL(SD＝0.5μg/mL)。根据这些结果，我们得出结论，人源化266具有与小鼠抗体266的结合特性非常相似的结合特性。因此，我们预期人源化266与小鼠266相比具有非常相似的体外和体内活性，在人类中将显示用小鼠266在小鼠中证明的相同效应。
基本按上文所述测定了按上文所述合成和纯化的人源化266抗体对Aβ1-42的亲和力(KD＝Kd/Ka)。使用上述方法，发现人源化266对Aβ1-42的亲和力为4pM。
人体液中加入的Aβ肽的中和
将人脑脊液(CSF)(50μl)和人血浆(50μl)样品按以下室温孵育1小时：
1.单独；
2.连同5ng Aβ40肽；或
3.5ng Aβ40肽加1mg单克隆抗体266(描述于例如在此引入作为参考的美国专利号5,766,846中)。
然后将样品在4-25％非变性梯度凝胶上电泳(即非变性梯度电泳(NDGGE))，并转移至硝酸纤维素膜。然后用丽春红染色印迹，或者对于Western印迹，用抗Aβ肽的前五个氨基酸的生物素标记单克隆抗体(3D6)探测，用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶显色，并通过增强型化学发光(ECL)检测。用Pharmacia分子量标记估计包含在印迹上的条带中的物质的水合直径。因此，如果Aβ肽结合于其他分子，则它将按得到的复合物的大小运行。
含或不含5ng Aβ肽的CSF的Western印迹显示无Aβ肽响应抗体3D6介导的检测的迹象。针对人血浆获得了相似的结果。尽管用相同的技术和在相同的CSF样品上通过SDS-PAGE后的Western印迹可检测到Aβ肽，但情况确实如此。据推测，Aβ肽和所测试的流体中其他因子之间的相互作用阻止了此肽的检测。但是，在孵育中加入Mab 266时，血浆中和CSF中都存在代表与抗体复合的螯合Aβ肽的特征性条带。主带在约11nm水合直径处，对应于抗体单体，13nm处附加的较小条带对应于抗体二聚体。
螯合抗体的特异性
使用了包含50μl人CSF或10μl APPV717F CSF的样品。APPV717F是代表阿尔茨海默病小鼠模型的转基因小鼠，其中表达含有家族性阿尔茨海默病突变的人淀粉状蛋白前体蛋白转基因，导致在中枢神经系统中产生人Aβ肽。
将样品与或不与多种Mab(1μg)室温孵育1小时，然后按上文所述(人体液中加入的Aβ肽的中和)在4-25％NDGGE上电泳并印迹至硝酸纤维素膜上。抗体如下：
Mab 266(结合13–28位)；
Mab 4G8(结合17–24位)；
QCBpan(1–40位的兔多克隆抗体)；
小鼠IgG(非特异性)；
Mab 3D6(结合1–5位)；
Mab 21F12(结合33–42位)；
Mab 6E10(结合1–17位)；和
QCB40,42(抗Aβ40和Aβ42的兔多克隆抗体)。
Aβ肽抗体复合物的检测如上文所述(“人体液中加入的Aβ肽的中和”中)。与Mab266孵育的人CSF中相似的检测，在一些情况下，将结合Aβ肽羧基端的QCB40,42替换为3D6。
结果显示，所测试的抗体中，仅Mab 4G8和Mab 266允许检测到Aβ肽。
结果显示，对于人CSF，仅Mab 266和Mab 4G8能够以可检测到的量螯合抗体Aβ复合物(同样，无任何抗体时，未检测到Aβ)。Mab 266还能够产生与用含来自APPV717F转基因小鼠的CSF的人CSF获得的结果相似的结果。无论用3D6还是QCB40,42抗体来显示Western印迹，用Mab 266都可在人CSF中螯合Aβ肽。
体内Aβ肽螯合
A.转基因APPV717F小鼠(也称PDAPP小鼠)过量表达突变体形式的人APP蛋白。这些小鼠在CAN中产生人Aβ，具有在CSF和血浆中循环的高水平人Aβ肽。用盐水或100μg Mab 266静脉内注射8月龄小鼠。起始注射后10分钟及起始注射后20小时再次对它们采血。
按上文所述(人体液中加入的Aβ肽的中和)用抗体3D6通过NDGGE和Western印迹分析包含20μl来自各动物的血浆的样品。注射盐水的动物在10分钟或20小时后未显示特征性11nm螯合Aβ肽条带的存在。但是，注射Mab 266的两只动物确实在20小时后显示此条带的出现。
B.此研究中使用2月龄APPV717F小鼠。在第0天，小鼠接受无Mab266、1mg Mab 266或100μg此抗体。在施用抗体前两天及第1、3、5和7天采集血浆样品。按上文所述(人体液中加入的Aβ肽的中和)对样品进行NDGGE后进行Western印迹，用3D6检测。在施用Mab 266后的所有时间点，除非用蛋白G(其结合免疫球蛋白，因此有效去除Mab 266)处理血浆样品，均可检测到266/Aβ复合物。除在注射100μg Mab 266的动物中在第七天有轻微下降外，发现复合物水平在所测试的时期内一致；一般而言，施用100μg的动物中的水平始终低于在施用1mg此抗体的小鼠中所见的水平。
C.对2月龄APPV717F小鼠静脉内施用1mg Mab 266，从每只小鼠采集25μl血浆样品。除用生物素化3D6结合后用链霉抗生物素蛋白125I(Amersham)检测和暴露于磷光体成像屏外，按上文所述对血浆样品进行NDGGE后进行Western印迹。与使用与饱和水平的Mab 266复合的已知量的Aβ40并类似地检测的标准曲线比较，估计复合物水平。结合Mab 266的Aβ肽的量估计在约100ng/ml，代表与这些小鼠中的内源性Aβ肽(其测定为约100pg/ml)相比提高约1,000倍。这也类似于APPV717F脑中Aβ沉积之前的Aβ肽能够(50–100ng/g)；APPV717F Tg小鼠中的人AβP和人Aβ几乎仅在脑中产生。因此，Mab 266在血浆中的存在作为Aβ肽池发挥作用，便于Aβ肽从CNS净流出进入血浆。这种净流出增加可能产生自Aβ从CNS流出至血浆增加以及阻止血浆中Aβ重新进入脑二者。
通过在Tris-三羟甲基甲基甘氨酸SDS-PAGE凝胶上运行20μL使用蛋白G结合小球的蛋白G暴露之前或之后的在注射1mg Mab 266后24小时从APPV717F小鼠获得的血浆样品后用抗Aβ抗体6E10进行Western印迹来确认所螯合的Aβ肽的正确大小。在4-8kD处检测到蛋白G排除的条带，与Aβ肽单体和可能的二聚体的存在一致。
D.用PBS(n＝7)或500μg生物素化Mab 266(即m266B)(n＝9)腹腔内处理2月龄APPV717F小鼠。在注射前和注射后24小时，用Johnson-Wood,K.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997).94:1550–1555和Bales,K.R.等,Nature Genet(1997)17:263–264的ELISA方法的修改分析血浆总Aβ肽。通过使用m3D6包被的96孔Optiplates(Packard,Inc.)来测量结合m266B的总Aβ。在包被平板中过夜孵育稀释的血浆样品和标准品(不同浓度的Aβ40和m266B)，用125I-链霉抗生物素蛋白测定总Aβ/m266B复合物的量。此外，在24小时时间点，首先用蛋白G处理血浆样品以定量未结合Mab266的Aβ肽，通过ELISA测定CSF中的Aβ总和Aβ42。在注射PBS的动物中，血浆Aβ肽水平在注射前后均为140pg/ml。注射Mab 266的小鼠在注射前的血浆水平相似，但在注射24小时后未结合Mab 266的Aβ肽水平检测不到。
还测量了CSF中的水平，CSF代表CNS内的胞外区室，CSF中的分子浓度在某种程度上反映脑的胞外间隙中的物质浓度。从大池区室分离CSF。用戊巴比妥麻醉小鼠，去除从颅底至第一脊椎的肌肉系统。通过在解剖显微镜下用显微操作针小心地穿刺覆盖大池的蛛网膜并将CSF吸入聚丙烯吸头来收集CSF。注射后24小时，发现注射Mab 266的小鼠的CSF中总Aβ肽增加，与注射PBS的小鼠相比，在CSF中获得了Aβ42的约两倍增加。变性凝胶电泳后用Aβ42特异性抗体21F12进行Western印迹确认了此结果。
在另一实验中，用PBS或Mab 266静脉内注射3月龄APPV717F Tg小鼠，评估CSF中的Aβ40和Aβ42水平二者如下：
为了测量Aβ40，利用了对Aβ40特异的单克隆抗体m2G3。通过用125I-链霉抗生物素蛋白替换链霉抗生物素蛋白-HRP试剂，将(Johnson-Wood,K.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:1550–1555)所述ELISA修改为RIA。对于血浆和CSF样品，在缓冲液中缺乏胍的非变性条件下进行该方法。为了评估脑匀浆中的碳酸盐可溶性和不可溶性Aβ，用100mM碳酸盐、40mM NaCl、pH 11.5(4℃)匀浆样品，10,000×g离心15分钟，按(Johnson-Wood,K.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:1550–1555)所述和上文所列评估上清(可溶性)和沉淀(不可溶性)级分中的Aβ。通过修改的RIA进行血浆中Aβ/Mab 266复合物的测量。用生物素化Mab 266(Mab266B)注射小鼠并在多个时间点分离血浆。通过使用m3D6包被的96孔Optiplates(Packard,Inc.)来测量结合于Mab 266的总Aβ。在包被平板中过夜孵育稀释的血浆样品和标准品(不同浓度的Aβ40和Mab 266B)，用125I-链霉抗生物素蛋白测定总Aβ/Mab266B复合物的量。
静脉注射Mab 266后3小时，存在CSF Aβ40水平的两倍增加和Aβ42的非显著性增加。但是，在24小时和72小时都存在CSF中Aβ40和Aβ42二者的2至3倍增加。用合并CSF的变性凝胶分析后的AβWestern印迹获得了相似的结果。通过CSF水平在某种程度上反映出的Aβ通过脑组织液流出可能造成了所观察到的CSF Aβ的增加。
值得注意的是，CSF Aβ肽水平的变化不可能是由于Mab 266进入CSF，因为注射后24小时测量到的水平(低于Mab 266血浆水平的0.1％)不足以造成变化。这些结果表明，Aβ肽是由于抗体在血流中的存在而从脑实质抽出进入CSF。
在相同小鼠中测量了大脑皮质匀浆中可溶于PBS或碳酸盐缓冲液的Aβ肽形式，该小鼠已注射Mab 266，其中按上文所述分析了CSF。观察到了皮质匀浆中这些可溶性形式的类似增加。
Mab 266对脑中Aβ的影响
每2周IP注射盐水、Mab 266(500μg)或对照小鼠IgG(100μg,Pharmigen)处理4月龄APPV717F+/+小鼠，处理5个月。在9月龄处死小鼠，测定皮质中的Aβ沉积。按Holtzman,D.M.等,Ann.Neurol.(2000)97:2892–2897所述在直接覆盖背侧海马的皮质中定量用兔pan-Aβ抗体(QCB,Inc.)鉴定的Aβ免疫反应性覆盖的％面积。
在此年龄，各组约一半的小鼠仍未开始发展Aβ沉积。但是，在266治疗组中，皮质中具有>50％Aβ负荷的小鼠的％显著更小(P＝0.02,卡方检验)。虽然APPV717F小鼠可在9个月内发展大量Aβ沉积，但存在很大的变异性，约50％显示无沉积，约50％显示实质性沉积。在PBS和IgG处理的动物中，6/14和5/13小鼠超过50％的皮质为Aβ染色覆盖，而Mab 266处理的14只小鼠中只有1只具有此水平的染色。所有组中几乎50％的动物至9月龄时仍尚未发展Aβ沉积。后者似乎是由于我们的群组中单只小鼠的亲本来源，因为即使所研究的所有小鼠都确认为APPV717F+/+，也仅在源自4/8繁殖对的小鼠中观察到高水平Aβ沉积(高病理同窝仔)。源自另外4个繁殖对的小鼠基本无Aβ沉积(低病理同窝仔)。用亲本来源作为协变量，Mab 266在减少Aβ沉积中具有强烈、显著的作用(p＝0.0082)。
PEG-抗Aβ抗体片段
鼠266和人源化1A1Fab类似物的纯化
命名为“266”的鼠单克隆抗体(m266)最初是通过用包含人Aβ肽的残基13-28的肽免疫制备的，将m266的Fab片段命名为(m266-Fab)。确认该抗体与此肽免疫反应。M266的制备之前已述(参见例如美国专利号8,066,999和7,195,761)。为了将PEG分子共价附着至m266-Fab，可突变Fab以在重链可变区的CDR2中引入半胱氨酸残基(N56C)，并以下文所示方式(体外PEG化和表征)PEG化。由于此处的实施例描述在鼠系统中进行的实验，使用鼠单克隆抗体和抗体片段即可满足要求。但是，在本发明的预期用于人用的治疗方法中，优选本发明的抗体和抗体片段的人源化形式。在以下实施例中提到的抗Aβ抗体片段1A1-Fab是包含SEQ ID NO.53的LCVR和SEQ ID NO.54的HCVR的人源化抗体Fab片段。
用包括阳离子交换层析后用Superdex 75树脂(GE Healthcare)进行大小排阻层析的两步层析策略纯化来自用m266-Fab或人源化1A1Fab和类似物转染的细胞的培养上清。收集后，用TFF浓缩培养上清，并在4℃对20倍过量体积的10mM乙酸钠pH5过夜透析。通过离心去除沉淀，将上清上样在用10mM乙酸钠pH5平衡的SP sepharose(GE Healthcare)填装床上。用含连续更大量NaCl的10mM乙酸钠pH5洗柱，直至Fab片段在约90至110mM NaCl洗脱。鉴定包含活性Fab的柱级分并合并。用离心浓缩装置(Millipore)减小体积并更换缓冲液(PBS)。调节最终体积至13ml，上样在Superdex 75大小排阻柱上。鉴定在约50kD洗脱的包含Fab的级分并合并，用于进一步表征和PEG化。
体外PEG化和表征
封闭从细胞培养物纯化的1A1-Fab上的N56C半胱氨酸用于PEG化。用Pierce的Reduce-ImmTM固定化还原剂小球来选择性还原N56C半胱氨酸。从厂家提供的柱提取还原剂小球并以分批模式使用。首先用8ml 10mM DTT在Reduce-IMM平衡缓冲液#1(磷酸钠+EDTA,pH 8.0)中活化～4ml小球30分钟。然后用PBS洗涤小球3次。向小球加入18ml含1.7mg/ml1A1N56C Fab的PBS pH 7.4，向混合物加入10mM EDTA。室温旋转孵育混合物4-5小时。用HandeeTM树脂分离器将Fab从小球分开，并用PBS洗涤小球。组合Fab和洗液，并与5倍摩尔过量的PEG-马来酰亚胺(20kPEG来自NOF；10kPEG来自Sunbio；SkPEG来自Nektar)反应1小时。对4L 10mM乙酸钠缓冲液pH 5.0透析反应混合物，使得Fab和Fab-PEG可以捕获在用10mM乙酸钠缓冲液pH 5.0平衡的SP sepharose柱上。用盐梯度洗脱未反应的Fab和Fab-PEG。它们在50mM至70mM NaCl之间洗脱。用PBS作为流动相通过大小排阻层析(Superdex75柱,GEHealthcare)进一步纯化蛋白质。还原反应规模可以放大和缩小。可用相似的方法来制备PEG化鼠266Fab N56C。
用大小排阻层析分析样品来确认PEG加至Fab。用TSK G3000PW XL(TosohBioscience)柱进行大小排阻层析。使用按214nm运行的Agilent HP1100系列分析型HPLC，用pH 7.4的PBS加0.35M NaCl按0.5ml/分钟运行柱。此外，用SDS-PAGE分析了样品。将10μg纯化物质上样在4-12％Bis-Tris Gel上，用SimplyBlueTM SafeStain染色。
PDAPP小鼠中的1A1-Fab PEG皮下PK/PD研究
在转基因PDAPP幼鼠(3月龄)中进行研究，以考察抗体片段和抗体片段-Aβ复合物的药代动力学/药效动力学血浆反应。考察了若干抗体片段，包括：人源化1A1-Fab；1A1-Fab+SKD PEG；1A1-Fab+10KD PEG；和1A1-Fab+20KD PEG。
PDAPP+/-小鼠皮下注射1mg/kg的各抗体片段，随后取决于抗体片段注射组在不同时间点分离血浆。以下时间点用于多种注射组：
1A1-Fab在给药后1、4、8、12、24和48小时采血；
1A1-Fab+5KD PEG在给药后1、4、8、24、48、96和168小时采血；
1A1-Fab+10KD PEG在给药后1、4、8、24、48、96和168小时采血；
1A1-Fab+20KD PEG在给药后1、8、24、48、96、168和240小时采血。
每个时间点每个注射组分析总计五只动物。将得到的血浆样品分装，保存在-80℃。
A.Fab PK分析方法
用夹心ELISA测定1A1 Fab的血浆1A1Fab浓度。用山羊抗IgGκ标准品包被平板，将对照样品和研究样品加至平板，然后室温孵育1小时。用山羊抗人IgG进行检测，然后用OPD进行比色反应。平板以A700为参考读取A493吸光度。
使用4/5参数算法，从用含已知量的1A1 Fab的小鼠血浆制备的标准曲线测定来自血浆样品的浓度；Fab和Fab-5K PEG测定的范围是0.003至0.3μg/mL；Fab-10K PEG测定的范围是0.006至0.2和0.04至0.4μg/mL；Fab 20K PEG测定的范围是0.02-0.4和0.04-0.4μg/mL。结果证明，与非PEG化1A1 Fab(在24小时后检测不到)相比，加入PEG分子和增大PEG分子大小提高了PEG化Fab在血浆中的保留(20K PEG化1A1 Fab在96小时后为77ng/ml)。
B.1A1AβELISA测定
该ELISA与上文针对m266所述基本相同。通过将血浆稀释入样品稀释液来制备样品以产生以下：20％血浆、0.5M胍、5mM Tris pH 8.0、0.5×蛋白酶抑制剂混合物、20μg/ml1A1和PBS。在这些测定中测量的Aβ肽是全长Aβ1-40或Aβ1-42。在15、30和60分钟在650nm监测比色进程。结果显示在下文表6中。
表6：药效动力学结果：Aβ的平均血浆浓度(pg/ml)
来自表6的数据证明，共价附着PEG分子的人源化Fab提供了理想的PK/PD特征，允许灵活的给药方案，同时防止抗体片段-抗原复合物长时间累积在血浆循环中。
用KinExA测量平衡常数
由于抗原Fab复合物解离速率慢，用KinExA分析作为正交法来通过平衡结合分析测量结合亲和力。用KinExA 3000仪器(Sapidyne Inst.Inc.)来测量结合动力学。简言之，将抗原共价偶联至琼脂糖小球，在仪器上检测游离Fab/Fab-PEG与小球的结合。为了测量Kd，将包含含有序列向下稀释的抗原人可溶性Abeta(1-40)(0-10nM)的Fab/Fab-PEG(1A1-Fab-20kPEG为20pM或500pM，1A1Fab为5pM或50pM)的单个管在含1mg/ml BSA的PBS中37℃孵育30-50小时，以确保达到平衡。孵育后，按照厂家说明书在KinExA 3000上测定各平衡样品中的游离Fab/Fab-PEG。用KinExA 3000软件通过n-Curve Analysis测定Kd值。结果证明，1A1Fab紧密结合人Aβ(19pM)，与m266Fab(240pM)相比亲和力高～10倍。此外，20K PEG在N56C位点处共价附着对1A1-Fab的亲和力无影响(12pM)。
使用基于细胞的ELISA的淀粉状蛋白前体蛋白(APP)结合分析
为了评估266Fab/mAb与Abeta前体APP的交叉反应性，使用了稳定表达APP(aa 1-751)的HEK 293细胞。这些细胞是通过将APP(1-751)基因克隆入包含新霉素抗性标记的质粒构建的。将重组质粒转染入HEK293，在200μg/ml G418中选择细胞以产生过量表达的稳定细胞系。对于结合测定，将75,000个APP 751细胞接种在PDL包被的96孔板的每个孔中。在生长培养基(DMEM F12、5％FBS、10mM Hepes pH7.5、200μg/ml G418)中孵育2天后，弃除液体，加入含10mg/ml BSA的PBS(含Ca/Mg)中的20μg/ml的Fab或mAb。在4℃进行2小时结合，用10mg/ml BSA洗涤细胞3次。加入PBS/BSA(Southern Biotech)中的对人或小鼠轻链特异的二抗(辣根过氧化物酶(hrp)缀合抗κ轻链)。PBS/BSA中1:5000的稀释度用于抗人轻链，1:2000用于抗小鼠轻链。4℃孵育1小时后，用BSA/PBS洗涤细胞5次。通过加入底物TMB 10分钟来测量hrp活性，作为Fab/mAb与APP结合的函数。将反应转移至透明96孔板测量650nm吸光度。数据显示，PEG化(5kD、10kD和20kD)1A1-Fab和m266-Fab赋予对Abeta而非APP的选择性。
示例性抗N3pGlu Aβ抗体和抗Tau抗体联合
体内鼠联合研究
以下实施例显示可以如何设计研究来(在动物模型中)验证本发明的抗N3pGluAbeta抗体与本发明的抗Tau抗体的组合可以用于治疗表征为Aβ沉积和异常tau聚集的疾病，如AD。但应理解，以下描述以说明而非限制的方式给出，本领域普通技术人员可以进行多种修改。
为了在本文所述联合治疗中评价抗N3pGlu Abeta抗体(如hE8L、抗体I或抗体II)的Abeta斑块降低和示例性抗Tau抗体的tau聚集蔓延中和，通过tau转基因小鼠(例如JNPL3或Tg4510)与APP转基因小鼠品系(例如Tg2576或PDAPP或APP敲入)杂交产生tau/APP鼠后代。上述tau/APP转基因小鼠已显示，淀粉状沉积可加速tau病理的传播。可将tau/APP转基因小鼠分入以下治疗组：(a)对照抗体(30mg/kg)；(b)抗N3pGlu Abeta抗体(15mg/kg)和对照抗体(15mg/kg)；(c)抗Tau抗体(15mg/kg)和对照抗体(15mg/kg)；和(d)抗N3pGlu Abeta抗体(15mg/kg)和抗Tau抗体(15mg/kg)。
治疗期后，可以处死小鼠，收集脑和脊髓组织。Tau聚集病理和淀粉状斑块病理可以按上文所述评估。为了评估Aβ减少，通过夹心ELISA在胍增溶的组织匀浆中测定实质Aβ浓度。用研磨珠均质技术(bead beater technology)进行组织提取，其中在含1ml硅化玻璃珠的2ml深孔平皿中，在1ml 5.5M胍/50mM Tris/0.5X蛋白酶抑制剂混合物pH 8.0中提取冷冻组织(震荡密封的平板各3分钟的两个间隔)。通过夹心ELISA针对Abeta1-40和Abeta1-42分析得到的组织裂解物：将研磨珠均质样品1:10稀释在2％BSA/PBS-T中，并滤过样品过滤平板(Millipore)。在加至样品板之前将样品、空白、标准品、质控样品进一步稀释在含0.55M胍/5mM Tris的2％BSA/PBST中。将参考标准品稀释在样品稀释剂中。用样品孵育用15μg/ml的捕获抗体21F12(抗Abeta42)或2G3(抗Abeta40)包被的平板，用稀释在2％BSA/PBS-T中的生物素化3D6(抗Abeta1-x)、然后用1:20K稀释在2％BSA/PBS-T中的NeutrAvidin-HRP(Pierce)和TMB(Pierce)显色来达到检测。从标准曲线推算Aβ水平，最终组织浓度计算为纳克Aβ/毫克组织湿重。沉积Aβ所占据的海马和皮质的％面积可以在组织学上测定。用10μg/ml生物素化3D6(抗Abeta1-x)或阴性对照鼠IgG(生物素化)孵育恒冷连续冠状切片(7至10μm厚)。利用对生物素特异的第二HRP试剂，用DAB-Plus(DAKO)显示沉积Aβ。通过用Image Pro plus软件(Media Cybernetics)分析所捕获的图像，在海马或皮质内确定的目的区域中定量免疫反应性Aβ沉积。此研究可以显示，抗N3pGlu Abeta抗体和抗Tau抗体联合治疗可以产生Aβ减少和tau聚集体蔓延减少二者的组合。
体内联合研究
以下实施例显示可以如何设计研究来验证本发明的抗N3pGlu Abeta抗体与本发明的抗Tau抗体的组合可以用于治疗表征为Aβ沉积和异常tau聚集的疾病，如AD。但应理解，以下描述以说明而非限制的方式给出，本领域普通技术人员可以进行多种修改。
为了在本文所述联合治疗中评价抗N3pGlu Abeta抗体(如hE8L、抗体I或抗体II)的Abeta斑块减少和示例性抗Tau抗体的tau聚集蔓延中和，可以通过生物标志和/或使用经验证的分级量表的认知和功能衰退评估来评估疾病进展的延迟。
可将患者分为包括双盲安慰剂和联合治疗组的治疗组。联合治疗组施用有效量的抗N3pGlu Abeta抗体(抗N3pGlu抗体的有效量可基于通过florbetapir PET成像观察到的显著淀粉状蛋白减少的达到来确定，例如3-40mg/kg IV)与有效量的抗Tau抗体(抗Tau抗体的有效量可基于通过tau PET成像观察到的tau NFT进程减慢的达到来确定，例如200-2800mg IV)的组合。可以包括单一治疗分组(抗N3pGlu Abeta抗体单一治疗组按与联合治疗组中的抗N3pGlu Abeta抗体相同的剂量；抗Tau抗体单一治疗组按与联合治疗组中的抗Tau抗体相同的剂量)来进一步阐明每一单个抗体对疾病改变的贡献。此外，可以基于临床前或临床AD的诊断或基于患者(虽然无AD症状)具有AD致病遗传突变的诊断表征治疗组。例如，分组可以包括以下一个或多个：(a)无症状但为AD致病遗传突变阳性；(b)临床前AD；(c)前驱AD；(d)轻度AD；(e)中度AD；和(f)严重AD。各治疗组可以每月接受该治疗一次，治疗期3个月至24个月(且可以接受该治疗不同时期，例如，N3PGlu Abeta抗体治疗期3-6个月，抗tau抗体治疗期24个月)。
治疗期后，通过以下生物标志评估中的一项或多项来评估AD神经变性：(a)TauPET成像(评估NFT累积)；(b)体积测定MRI(评估神经解剖学萎缩)；(c)FDG-PEG PET成像(评估代谢减退)；(d)florbetapir灌注PET成像(评估代谢减退)；(e)CSF tau浓度(评估神经变性)；(f)CSF磷酸化Tau浓度(评估神经变性)；(g)CSF神经丝轻链浓度(评估神经变性)；(h)CSF神经粒蛋白浓度(评估神经变性)；和(i)florbetapir PET成像(评估淀粉状斑块病理)。此外，可以应用一个或多个经验证的分级量表评估各治疗组的认知和功能衰退，例如ADAS-cog、MMSE、CDR-SB、ADCS-ADL和功能性活动问卷(FAQ)。
此研究可以显示，本发明的抗N3pGlu Abeta抗体和本发明的抗Tau抗体联合治疗可以产生Aβ减少和tau聚集体蔓延减少二者的组合。
示例性抗Aβ抗体和抗Tau抗体联合
体内鼠联合研究
以下实施例显示可以如何设计研究来(在动物模型中)验证本发明的抗Aβ抗体与本发明的抗Tau抗体的组合可以用于治疗表征为淀粉状斑块形成和异常tau聚集的疾病，如AD。但应理解，以下描述以说明而非限制的方式给出，本领域普通技术人员可以进行多种修改。
为了在本文所述联合治疗中评价示例性抗Aβ抗体螯合Aβ的影响和示例性抗Tau抗体的tau聚集蔓延中和，通过tau转基因小鼠(例如JNPL3或Tg4510)与APP转基因小鼠品系(例如Tg2576或PDAPP或APP敲入)杂交产生tau/APP鼠后代。上述tau/APP转基因小鼠已显示，淀粉状沉积可加速tau病理的传播。可将tau/APP转基因小鼠分入以下治疗组：(a)对照抗体(30mg/kg)；(b)抗Aβ抗体(15mg/kg)和对照抗体(15mg/kg)；(c)抗Tau抗体(15mg/kg)和对照抗体(15mg/kg)；和(d)抗Aβ抗体(15mg/kg)和抗Tau抗体(15mg/kg)。
治疗期后，可以处死小鼠，收集脑和脊髓组织。Tau聚集病理和淀粉状斑块病理可以按上文所述评估。游离血浆Aβ水平可以按上文所述评估。为了评估Aβ减少，通过夹心ELISA在胍增溶的组织匀浆中测定实质Aβ浓度。用研磨珠均质技术进行组织提取，其中在含1ml硅化玻璃珠的2ml深孔平皿中，在1ml 5.5M胍/50mM Tris/0.5X蛋白酶抑制剂混合物pH8.0中提取冷冻组织(震荡密封的平板各3分钟的两个间隔)。通过夹心ELISA针对Abeta1-40和Abeta1-42分析得到的组织裂解物：将研磨珠均质样品1:10稀释在2％BSA/PBS-T中，并滤过样品过滤平板(Millipore)。在加至样品板之前将样品、空白、标准品、质控样品进一步稀释在含0.55M胍/5mM Tris的2％BSA/PBST中。将参考标准品稀释在样品稀释剂中。用样品孵育用15μg/ml的捕获抗体21F12(抗Abeta42)或2G3(抗Abeta40)包被的平板，用稀释在2％BSA/PBS-T中的生物素化3D6(抗Abeta1-x)、然后用1:20K稀释在2％BSA/PBS-T中的NeutrAvidin-HRP(Pierce)和TMB(Pierce)显色来达到检测。从标准曲线推算Aβ水平，最终组织浓度计算为纳克Aβ/毫克组织湿重。沉积Aβ所占据的海马和皮质的％面积可以在组织学上测定。用10μg/ml生物素化3D6(抗Abeta1-x)或阴性对照鼠IgG(生物素化)孵育恒冷连续冠状切片(7至10μm厚)。利用对生物素特异的第二HRP试剂，用DAB-Plus(DAKO)显示沉积Aβ。通过用Image Pro plus软件(Media Cybernetics)分析所捕获的图像，在海马或皮质内确定的目的区域中定量免疫反应性Aβ沉积。此研究可以显示，抗Aβ抗体和抗Tau抗体联合治疗可以产生游离Aβ水平降低、淀粉状斑块减少和tau聚集体蔓延减少的组合。
体内联合研究
以下实施例显示可以如何设计研究来验证本发明的抗Aβ抗体与本发明的抗Tau抗体的组合可以用于治疗表征为淀粉状斑块形成和异常tau聚集的疾病，如AD。但应理解，以下描述以说明而非限制的方式给出，本领域普通技术人员可以进行多种修改。
为了在本文所述联合治疗中评价示例性抗Aβ抗体螯合Aβ的影响和示例性抗Tau抗体的tau聚集蔓延中和，可以通过生物标志和/或使用经验证的分级量表的认知和功能衰退评估来评估疾病进展的延迟。
可将患者分为包括双盲安慰剂和联合治疗组的治疗组。联合治疗组施用有效量的抗Aβ抗体(抗Aβ抗体的有效量可以例如基于模拟的游离血浆Aβ的显著减少的达到来确定，例如3-40mg/kg IV)与有效量的抗Tau抗体(抗Tau抗体的有效量可以例如基于通过tau PET成像观察到的tau NFT进程减慢的达到来确定，例如200-2800mg IV)的组合。可以包括单一治疗分组(抗Aβ抗体单一治疗组按与联合治疗组中的抗Aβ抗体相同的剂量；抗Tau抗体单一治疗组按与联合治疗组中的抗Tau抗体相同的剂量)来进一步阐明每一单个抗体对疾病改变的贡献。此外，可以基于临床前或临床AD的诊断或基于患者(虽然无AD症状)具有AD致病遗传突变的诊断表征治疗组。例如，分组可以包括以下一个或多个：(a)无症状但为AD致病遗传突变阳性；(b)临床前AD；(c)前驱AD；(d)轻度AD；(e)中度AD；和(f)严重AD。各治疗组可以每月接受该治疗一次，治疗期3个月至24个月(且可以接受该治疗不同时期，例如，抗Aβ抗体治疗期3-6个月，抗tau抗体治疗期24个月)。
治疗期后，通过以下生物标志评估中的一项或多项来评估AD神经变性：(a)TauPET成像(评估NFT累积)；(b)体积测定MRI(评估神经解剖学萎缩)；(c)FDG-PEG PET成像(评估代谢减退)；(d)florbetapir灌注PET成像(评估代谢减退)；(e)CSF tau浓度(评估神经变性)；(f)CSF磷酸化Tau浓度(评估神经变性)；(g)CSF神经丝轻链浓度(评估神经变性)；(h)CSF神经粒蛋白浓度(评估神经变性)；和(i)florbetapir PET成像(评估淀粉状斑块病理)。此外，可以应用一个或多个经验证的分级量表评估各治疗组的认知和功能衰退，例如ADAS-cog、MMSE、CDR-SB、ADCS-ADL和功能性活动问卷(FAQ)。
此研究可以显示，本发明的抗Aβ抗体和本发明的抗Tau抗体联合治疗可产生血浆游离Aβ和CSF Aβ减少及tau聚集体蔓延减少二者的组合。
示例性PEG-抗Aβ抗体片段和抗Tau抗体联合
体内鼠联合研究
以下实施例显示可以如何设计研究来(在动物模型中)验证本发明的PEG-抗Aβ抗体片段与本发明的抗Tau抗体的组合可以用于治疗表征为淀粉状斑块形成和异常tau聚集的疾病，如AD。但应理解，以下描述以说明而非限制的方式给出，本领域普通技术人员可以进行多种修改。
为了在本文所述联合治疗中评价示例性PEG-抗Aβ抗体片段降低血浆Aβ的影响和示例性抗Tau抗体的tau聚集蔓延中和，通过tau转基因小鼠(例如JNPL3或Tg4510)与APP转基因小鼠品系(例如Tg2576或PDAPP或APP敲入)杂交产生tau/APP鼠后代。上述tau/APP转基因小鼠已显示，淀粉状沉积可加速tau病理的传播。可将tau/APP转基因小鼠分入以下治疗组：(a)对照抗体(30mg/kg)；(b)PEG-抗Aβ抗体片段(15mg/kg)和对照抗体(15mg/kg)；(c)抗Tau抗体(15mg/kg)和对照抗体(15mg/kg)；和(d)PEG-抗Aβ抗体片段(15mg/kg)和抗Tau抗体(15mg/kg)。
治疗期后，可以处死小鼠，收集脑和脊髓组织。Tau聚集病理可以按上文所述评估。血浆Aβ水平可以按上文所述(及按之前例如在U.S.No.7,195,761中所述)评估。为了评估Aβ减少，通过夹心ELISA在胍增溶的组织匀浆中测定实质Aβ浓度。用研磨珠均质技术进行组织提取，其中在含1ml硅化玻璃珠的2ml深孔平皿中，在1ml 5.5M胍/50mM Tris/0.5X蛋白酶抑制剂混合物pH 8.0中提取冷冻组织(震荡密封的平板各3分钟的两个间隔)。通过夹心ELISA针对Abeta1-40和Abeta1-42分析得到的组织裂解物：将研磨珠均质样品1:10稀释在2％BSA/PBS-T中，并滤过样品过滤平板(Millipore)。在加至样品板之前将样品、空白、标准品、质控样品进一步稀释在含0.55M胍/5mM Tris的2％BSA/PBST中。将参考标准品稀释在样品稀释剂中。用样品孵育用15μg/ml的捕获抗体21F12(抗Abeta42)或2G3(抗Abeta40)包被的平板，用稀释在2％BSA/PBS-T中的生物素化3D6(抗Abeta1-x)、然后用1:20K稀释在2％BSA/PBS-T中的NeutrAvidin-HRP(Pierce)和TMB(Pierce)显色来达到检测。从标准曲线推算Aβ水平，最终组织浓度计算为纳克Aβ/毫克组织湿重。沉积Aβ所占据的海马和皮质的％面积可以在组织学上测定。用10μg/ml生物素化3D6(抗Abeta1-x)或阴性对照鼠IgG(生物素化)孵育恒冷连续冠状切片(7至10μm厚)。利用对生物素特异的第二HRP试剂，用DAB-Plus(DAKO)显示沉积Aβ。通过用Image Pro plus软件(Media Cybernetics)分析所捕获的图像，在海马或皮质内确定的目的区域中定量免疫反应性Aβ沉积。此研究可以显示，PEG-抗Aβ抗体片段和抗Tau抗体联合治疗可以产生Aβ水平降低、淀粉状斑块减少和tau聚集体蔓延减少的组合。
体内联合研究
以下实施例显示可以如何设计研究来验证本发明的PEG-抗Aβ抗体片段与本发明的抗Tau抗体的组合可以用于治疗表征为淀粉状斑块形成和异常tau聚集的疾病，如AD。但应理解，以下描述以说明而非限制的方式给出，本领域普通技术人员可以进行多种修改。
为了在本文所述联合治疗中评价示例性PEG-抗Aβ抗体片段降低血浆Aβ的影响和示例性抗Tau抗体的tau聚集蔓延中和，可通过生物标志和/或使用经验证的分级量表的认知和功能衰退评估来评估疾病进展的延迟。
可将患者分为包括双盲安慰剂和联合治疗组的治疗组。联合治疗组施用有效量的PEG-抗Aβ抗体片段(PEG-抗Aβ抗体片段的有效量可以例如基于模拟的游离血浆Aβ的显著减少的达到来确定，例如每周皮下25-200mg)与有效量的抗Tau抗体(抗Tau抗体的有效量可以例如基于通过tau PET成像观察到的tau NFT进程减慢的达到来确定，例如200-2800mg IV)的组合。可以包括单一治疗分组(PEG-抗Aβ抗体片段单一治疗组按与联合治疗组中的PEG-抗Aβ抗体片段相同的剂量；抗Tau抗体单一治疗组按与联合治疗组中的抗Tau抗体相同的剂量)来进一步阐明每一单个抗体对疾病改变的贡献。此外，可以基于临床前或临床AD的诊断或基于患者(虽然无AD症状)具有AD致病遗传突变的诊断表征治疗组。例如，分组可以包括以下一个或多个：(a)无症状但为AD致病遗传突变阳性；(b)临床前AD；(c)前驱AD；(d)轻度AD；(e)中度AD；和(f)严重AD。各治疗组可以每月接受该治疗一次，治疗期3个月至24个月(且可以接受该治疗不同时期，例如，PEG-抗Aβ抗体片段治疗期3-6个月，抗tau抗体治疗期24个月)。
治疗期后，通过以下生物标志评估中的一项或多项来评估AD神经变性：(a)TauPET成像(评估NFT累积)；(b)体积测定MRI(评估神经解剖学萎缩)；(c)FDG-PEG PET成像(评估代谢减退)；(d)florbetapir灌注PET成像(评估代谢减退)；(e)CSF tau浓度(评估神经变性)；(f)CSF磷酸化Tau浓度(评估神经变性)；(g)CSF神经丝轻链浓度(评估神经变性)；(h)CSF神经粒蛋白浓度(评估神经变性)；和(i)florbetapir PET成像(评估淀粉状斑块病理)。此外，可以应用一个或多个经验证的分级量表评估各治疗组的认知和功能衰退，例如ADAS-cog、MMSE、CDR-SB、ADCS-ADL和功能性活动问卷(FAQ)。
此研究可以显示，本发明的PEG-抗Aβ抗体片段和本发明的抗Tau抗体联合治疗可以产生血浆和CSF Aβ减少及tau聚集体蔓延减少二者的组合。
序列
SEQ ID NO.1-HCDR1-抗N3pGlu抗体(抗体I和抗体II)
KASGYTFTDYYIN
SEQ ID NO.2-HCDR2-抗N3pGlu抗体(抗体I和抗体II)
WINPGSGNTKYNEKFKG
SEQ ID NO.3-HCDR3-抗N3pGlu抗体(抗体I和抗体II)
TREGETVY
SEQ ID NO.4-LCDR1-抗N3pGlu抗体(抗体I和抗体II)
KSSQSLLYSRGKTYLN
SEQ ID NO.5-LCDR2-抗N3pGlu抗体(抗体II)
YAVSKLDS
SEQ ID NO.6-LCDR2-抗N3pGlu抗体(抗体I)
YDVSKLDS
SEQ ID NO.7-LCDR3-抗N3pGlu抗体(抗体I和抗体II)
VQGTHYPFT
SEQ ID NO.8-HCVR-抗N3pGlu抗体(抗体I和抗体II)
SEQ ID NO.9-LCVR-抗N3pGlu抗体(抗体I)
SEQ ID NO.10-LCVR-抗N3pGlu抗体(抗体II)
SEQ ID NO.11-HC-抗N3pGlu抗体(抗体I和抗体II)
SEQ ID NO.12-LC-抗N3pGlu抗体(抗体I)
SEQ ID NO.13-LC-抗N3pGlu抗体(抗体II)
SEQ ID NO.14-用于表达SEQ ID NO.11的HC的示例性DNA
SEQ ID NO.15-用于表达SEQ ID NO.12的LC的示例性DNA
SEQ ID NO.16-用于表达SEQ ID NO.13的LC的示例性DNA
SEQ ID NO.17-抗N3pGlu抗体(LCDR1-B12L/R17L/hE8L)
KSSQSLLYSRGKTYLN
SEQ ID NO.18-抗N3pGlu抗体(LCDR2-B12L/R17L/hE8L)
AVSKLDS
SEQ ID NO.19-抗N3pGlu抗体(LCDR3-B12L/R17L/hE8L)
VQGTHYPFT
SEQ ID NO.20-抗N3pGlu抗体(HCDR1-B12L)
GYDFTRYYIN
SEQ ID NO.21-抗N3pGlu抗体(HCDR1-R17L)
GYTFTRYYIN
SEQ ID NO.22-抗N3pGlu抗体(HCDR2-B12L/R17L/hE8L)
WINPGSGNTKYNEKFKG
SEQ ID NO.23-抗N3pGlu抗体(HCDR3-B12L)
EGITVY
SEQ ID NO.24-抗N3pGlu抗体(HCDR3-R17L)
EGTTVY
SEQ ID NO.25-抗N3pGlu抗体(LCVR-B12L/R17L)
SEQ ID NO.26-抗N3pGlu抗体(HCVR-B12L)
SEQ ID NO.27-抗N3pGlu抗体(HCVR–R17L)
SEQ ID NO.28-抗N3pGlu抗体(LC-B12L/R17L)
SEQ ID NO.29-抗N3pGlu抗体(HC-B12L)
SEQ ID NO.30-抗N3pGlu抗体(HC–R17L)
SEQ ID NO.31-N3pGlu Aβ
SEQ ID NO.32-抗N3pGlu抗体(LCVR-hE8L)
SEQ ID NO.33-抗N3pGlu抗体(LC-hE8L)
SEQ ID NO.34-抗N3pGlu抗体(HCVR-hE8L)
SEQ ID NO.35-抗N3pGlu抗体(HC-hE8L)
SEQ ID NO.36-抗N3pGlu抗体(HCDR1-hE8L)
GYTFTDYYIN
SEQ ID NO.37-抗N3pGlu抗体(HCDR3-hE8L)
EGETVY
SEQ ID NO.38-Aβ1-42
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
SEQ ID NO.39-示例性抗Aβ抗体的LCDR1
RSSQSLIYSDGNAYLH
SEQ ID NO.40-示例性抗Aβ抗体的LCDR2
KVSNRFS
SEQ ID NO.41-示例性抗Aβ抗体的LCDR3
SQSTHVPWT
SEQ ID NO.42-示例性抗Aβ抗体的HCDR1
RYSMS
SEQ ID NO.43-示例性抗Aβ抗体的HCDR2
QINSVGNSTYYPDTVKG
SEQ ID NO.44-示例性抗Aβ抗体的HCDR3
GDY
SEQ ID NO.45-示例性抗Aβ抗体的LCVR
其中位置2的Xaa2是Val或Ile
其中位置7的Xaa7是Ser或Thr
其中位置14的Xaa14是Thr或Ser
其中位置15的Xaa15是Leu或Pro
其中位置30的Xaa30是Ile或Val
其中位置50的Xaa50是Arg、Gln或Lys
其中位置88的Xaa88是Val或Leu
其中位置105的Xaa105是Gln或Gly
其中位置108的Xaa108是Lys或Arg
其中位置109的Xaa109是Val或Leu
SEQ ID NO.46-示例性抗Aβ抗体的HCVR
其中位置1的Xaa1是Glu或Gln
其中位置7的Xaa7是Ser或Leu
其中位置46的Xaa46是Glu、Val、Asp或Ser
其中位置63的Xaa63是Thr或Ser
其中位置75的Xaa是Ala、Ser、Val或Thr
其中位置76的Xaa是Lys或Arg
其中位置89的Xaa是Glu或Asp
其中位置107的Xaa是Leu或Thr
SEQ ID NO.47-示例性抗Aβ抗体的LCVR
SEQ ID NO.48-示例性抗Aβ抗体的HCVR
SEQ ID NO.49-示例性抗Aβ抗体的LC
SEQ ID NO.50-示例性抗Aβ抗体的HC
SEQ ID NO.51-用于VL PCR的3’引物
SEQ ID NO.52-用于VH PCR的3’引物
SEQ ID NO.53-示例性PEG-抗Aβ抗体片段的LCVR
SEQ ID NO.54-示例性PEG-抗Aβ抗体片段的HCVR
其中，通过马来酰亚胺连接用20KD PEG聚乙二醇化残基56的Cys
SEQ ID NO.55-示例性PEG-抗Aβ抗体片段的HCVR
SEQ ID NO.56-Aβ肽的氨基酸残基13-28
HHQKLVFFAEDVGSNK
SEQ ID NO.57-Aβ肽的氨基酸残基14-28
HQKLVFFAEDVGSNK
SEQ ID NO.58-示例性PEG-抗Aβ抗体片段的LCDR1
SSSQSLIYSDGNAYLH
SEQ ID NO.59-示例性PEG-抗Aβ抗体片段的LCDR2
KVSNRFS
SEQ ID NO.60-示例性PEG-抗Aβ抗体片段的LCDR3
TQSTHSPWT
SEQ ID NO.61-示例性PEG-抗Aβ抗体片段的HCDR1
GYTFSRYSMS
SEQ ID NO.62-示例性PEG-抗Aβ抗体片段的HCVR2
QINIRGCNTYYPDTVK
SEQ ID NO.63-示例性PEG-抗Aβ抗体片段的HCDR2
QINIRGNNTYYPDTVKG
SEQ ID NO.64-示例性PEG-抗Aβ抗体片段的HCDR3
GDF
SEQ ID NO.65-编码示例性PEG-抗Aβ抗体片段的LCVR(SEQ ID NO.53)的cDNA
SEQ ID NO.66-编码示例性PEG-抗Aβ抗体片段的HCVR(SEQ ID NO.54)的cDNA
SEQ ID NO.67-示例性抗Tau抗体的LC
SEQ ID NO.68-示例性抗Tau抗体的HC
SEQ ID NO.69-示例性抗Tau抗体的LCDR1
RSSQSLVHSNQNTYLH
SEQ ID NO.70-示例性抗Tau抗体的LCDR2
YKVDNRFS
SEQ ID NO.71-示例性抗Tau抗体的LCDR3
SQSTLVPLT
SEQ ID NO.72-示例性抗Tau抗体的HCDR1
KGSGYTFSNYWIE
SEQ ID NO.73-示例性抗Tau抗体的HCDR2
EILPGSDSIKYEKNFKG
SEQ ID NO.74-示例性抗Tau抗体的HCDR3
ARRGNYVDD
SEQ ID NO.75-示例性抗Tau抗体的LCVR
SEQ ID NO.76-示例性抗Tau抗体的HCVR
SEQ ID NO.77-编码示例性HC(SEQ ID NO:68)的核苷酸序列
SEQ ID NO.78-编码示例性LC(SEQ ID NO:67)的核苷酸序列
SEQ ID NO.79-人全长Tau的氨基酸序列

Claims (72)

1.治疗患有表征为淀粉状蛋白β(Aβ)沉积的疾病的患者的方法，其包括对需要这种治疗的患者施用有效量的抗N3pGlu Abeta与有效量的抗Tau抗体的组合，其中抗Tau抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.69给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.70给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.71给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.72给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.73给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出。
2.权利要求1的方法，其中抗Tau抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.76给出。
3.权利要求2的方法，其中抗Tau抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.67给出，HC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.68给出。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中抗N3pGlu Abeta抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其选自：
a)LCDR1是SEQ ID NO.17，LCDR2是SEQ ID NO.18，LCDR3是SEQ ID NO.19，HCDR1是SEQID NO.20，HCDR2是SEQ ID NO.22，HCDR3是SEQ ID NO.23；
b)LCDR1是SEQ ID NO.17，LCDR2是SEQ ID NO.18，LCDR3是SEQ ID NO.19，HCDR1是SEQID NO.21，HCDR2是SEQ ID NO.22，HCDR3是SEQ ID NO.24；
c)LCDR1是SEQ ID NO.17，LCDR2是SEQ ID NO.18，LCDR3是SEQ ID NO.19，HCDR1是SEQID NO.36，HCDR2是SEQ ID NO.22，HCDR3是SEQ ID NO.37；
d)LCDR1是SEQ ID NO.4，LCDR2是SEQ ID NO.6，LCDR3是SEQ ID NO.7，HCDR1是SEQ IDNO.1，HCDR2是SEQ ID NO.2，HCDR3是SEQ ID NO.3；和
e)LCDR1是SEQ ID NO.4，LCDR2是SEQ ID NO.5，LCDR3是SEQ ID NO.7，HCDR1是SEQ IDNO.1，HCDR2是SEQ ID NO.2，HCDR3是SEQ ID NO.3。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中抗N3pGlu Abeta抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR和HCVR选自：
a)SEQ ID NO.25的LCVR和SEQ ID NO.26的HCVR；
b)SEQ ID NO.25的LCVR和SEQ ID NO.27的HCVR；
c)SEQ ID NO.32的LCVR和SEQ ID NO.34的HCVR；
d)SEQ ID NO.9的LCVR和SEQ ID NO.8的HCVR；和
e)SEQ ID NO.10的LCVR和SEQ ID NO.8的HCVR。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中抗N3pGlu Abeta抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述LC和HC选自：
a)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.29的HC；
b)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.30的HC；
c)SEQ ID NO.33的LC和SEQ ID NO.35的HC；
d)SEQ ID NO.12的LC和SEQ ID NO.11的HC；和
e)SEQ ID NO.13的LC和SEQ ID NO.11的HC。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中抗N3pGlu Abeta抗体包含两条轻链(LC)和两条重链(HC)，其中每条LC和每条HC选自：
a)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.29的HC；
b)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.30的HC；
c)SEQ ID NO.33的LC和SEQ ID NO.35的HC；
d)SEQ ID NO.12的LC和SEQ ID NO.11的HC；和
e)SEQ ID NO.13的LC和SEQ ID NO.11的HC。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中表征为Aβ沉积和异常tau聚集的疾病选自临床或临床前阿尔茨海默病(AD)。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中表征为Aβ沉积的疾病选自前驱AD、轻度AD、中度AD或严重AD。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中抗N3pGlu Abeta抗体和抗Tau抗体同时施用。
11.权利要求1至9中任一项的方法，其中抗N3pGlu Abeta抗体在施用抗Tau抗体之前施用。
12.药物组合物，其包含含有一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的抗N3pGluAbeta抗体，与含有一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的抗Tau抗体的药物组合物组合，其中抗Tau抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.69给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.70给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.71给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.72给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.73给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出。
13.权利要求12的药物组合物，其中抗Tau抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ IDNO.76给出。
14.权利要求12的药物组合物，其中抗Tau抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.67给出，HC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.68给出。
15.权利要求13至14中任一项的药物组合物，其中抗N3pGlu Abeta抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其选自：
a)LCDR1是SEQ ID NO.17，LCDR2是SEQ ID NO.18，LCDR3是SEQ ID NO.19，HCDR1是SEQID NO.20，HCDR2是SEQ ID NO.22，HCDR3是SEQ ID NO.23；
b)LCDR1是SEQ ID NO.17，LCDR2是SEQ ID NO.18，LCDR3是SEQ ID NO.19，HCDR1是SEQID NO.21，HCDR2是SEQ ID NO.22，HCDR3是SEQ ID NO.24；
c)LCDR1是SEQ ID NO.17，LCDR2是SEQ ID NO.18，LCDR3是SEQ ID NO.19，HCDR1是SEQID NO.36，HCDR2是SEQ ID NO.22，HCDR3是SEQ ID NO.37；
d)LCDR1是SEQ ID NO.4，LCDR2是SEQ ID NO.6，LCDR3是SEQ ID NO.7，HCDR1是SEQ IDNO.1，HCDR2是SEQ ID NO.2，HCDR3是SEQ ID NO.3；和
e)LCDR1是SEQ ID NO.4，LCDR2是SEQ ID NO.5，LCDR3是SEQ ID NO.7，HCDR1是SEQ IDNO.1，HCDR2是SEQ ID NO.2，HCDR3是SEQ ID NO.3。
16.权利要求13至15中任一项的药物组合物，其中抗N3pGlu Abeta抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR和HCVR选自：
a)SEQ ID NO.25的LCVR和SEQ ID NO.26的HCVR；
b)SEQ ID NO.25的LCVR和SEQ ID NO.27的HCVR；
c)SEQ ID NO.32的LCVR和SEQ ID NO.34的HCVR；
d)SEQ ID NO.9的LCVR和SEQ ID NO.8的HCVR；和
e)SEQ ID NO.10的LCVR和SEQ ID NO.8的HCVR。
17.权利要求13至16中任一项的药物组合物，其中抗N3pGlu Abeta抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述LC和HC选自：
a)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.29的HC；
b)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.30的HC；
c)SEQ ID NO.33的LC和SEQ ID NO.35的HC；
d)SEQ ID NO.12的LC和SEQ ID NO.11的HC；和
e)SEQ ID NO.13的LC和SEQ ID NO.11的HC。
18.权利要求13至17中任一项的药物组合物，其中抗N3pGlu Abeta抗体包含两条轻链(LC)和两条重链(HC)，其中每条LC和每条HC选自：
a)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.29的HC；
b)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.30的HC；
c)SEQ ID NO.33的LC和SEQ ID NO.35的HC；
d)SEQ ID NO.12的LC和SEQ ID NO.11的HC；和
e)SEQ ID NO.13的LC和SEQ ID NO.11的HC。
19.用于治疗AD的试剂盒，其中试剂盒包含有效量的抗N3pGlu Abeta抗体和有效量的抗Tau抗体，其中抗Tau抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.69给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.70给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.71给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.72给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.73给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出。
20.权利要求19的试剂盒，其中抗Tau抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ IDNO.76给出。
21.权利要求19的试剂盒，其中抗Tau抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.67给出，HC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.68给出。
22.权利要求19至21中任一项的试剂盒，其中抗N3pGlu Abeta抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其选自：
a)LCDR1是SEQ ID NO.17，LCDR2是SEQ ID NO.18，LCDR3是SEQ ID NO.19，HCDR1是SEQID NO.20，HCDR2是SEQ ID NO.22，HCDR3是SEQ ID NO.23；
b)LCDR1是SEQ ID NO.17，LCDR2是SEQ ID NO.18，LCDR3是SEQ ID NO.19，HCDR1是SEQID NO.21，HCDR2是SEQ ID NO.22，HCDR3是SEQ ID NO.24；
c)LCDR1是SEQ ID NO.17，LCDR2是SEQ ID NO.18，LCDR3是SEQ ID NO.19，HCDR1是SEQID NO.36，HCDR2是SEQ ID NO.22，HCDR3是SEQ ID NO.37；
d)LCDR1是SEQ ID NO.4，LCDR2是SEQ ID NO.6，LCDR3是SEQ ID NO.7，HCDR1是SEQ IDNO.1，HCDR2是SEQ ID NO.2，HCDR3是SEQ ID NO.3；和
e)LCDR1是SEQ ID NO.4，LCDR2是SEQ ID NO.5，LCDR3是SEQ ID NO.7，HCDR1是SEQ IDNO.1，HCDR2是SEQ ID NO.2，HCDR3是SEQ ID NO.3。
23.权利要求19至21中任一项的试剂盒，其中抗N3pGlu Abeta抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR和HCVR选自：
a)SEQ ID NO.25的LCVR和SEQ ID NO.26的HCVR；
b)SEQ ID NO.25的LCVR和SEQ ID NO.27的HCVR；
c)SEQ ID NO.32的LCVR和SEQ ID NO.34的HCVR；
d)SEQ ID NO.9的LCVR和SEQ ID NO.8的HCVR；和
e)SEQ ID NO.10的LCVR和SEQ ID NO.8的HCVR。
24.权利要求19至21中任一项的试剂盒，其中抗N3pGlu Abeta抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述LC和HC选自：
a)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.29的HC；
b)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.30的HC；
c)SEQ ID NO.33的LC和SEQ ID NO.35的HC；
d)SEQ ID NO.12的LC和SEQ ID NO.11的HC；和
e)SEQ ID NO.13的LC和SEQ ID NO.11的HC。
25.权利要求19至21中任一项的试剂盒，其中抗N3pGlu Abeta抗体包含两条轻链(LC)和两条重链(HC)，其中每条LC和每条HC选自：
a)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.29的HC；
b)SEQ ID NO.28的LC和SEQ ID NO.30的HC；
c)SEQ ID NO.33的LC和SEQ ID NO.35的HC；
d)SEQ ID NO.12的LC和SEQ ID NO.11的HC；和
e)SEQ ID NO.13的LC和SEQ ID NO.11的HC。
26.在诊断患有选自前驱AD、轻度AD、中度AD和严重AD的病症的患者中减慢认知衰退的方法，其包括施用有效量的权利要求12至18中任一项的药物组合物。
27.治疗患有表征为淀粉状蛋白斑和异常tau聚集的形成的疾病的患者的方法，其包括对需要这种治疗的患者施用有效量的抗Aβ抗体和PEG-抗Aβ抗体片段之一与有效量的抗Tau抗体的组合，其中抗Tau抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.69给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.70给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.71给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.72给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.73给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出。
28.权利要求27的方法，其中抗Tau抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.76给出。
29.权利要求27中任一项的方法，其中抗Tau抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.67给出，HC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.68给出。
30.权利要求27至29中任一项的方法，其中有效量的抗Aβ抗体与抗Tau抗体组合施用，
其中抗Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.39给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.40给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.41给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.42给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.43给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.44给出。
31.权利要求30的方法，其中抗Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中
LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.45给出，其中位置2的Xaa是Val或Ile，位置7的Xaa是Ser或Thr，位置14的Xaa是Thr或Ser，位置15的Xaa是Leu或Pro，位置30的Xaa是Ile或Val，位置50的Xaa是Arg、Gln或Lys，位置88的Xaa是Val或Leu，位置105的Xaa是Gln或Gly，位置108的Xaa是Lys或Arg，位置109的Xaa是Val或Leu；和
HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.46给出，其中位置1的Xaa是Glu或Gln，位置7的Xaa是Ser或Leu，位置46的Xaa是Glu、Val、Asp或Ser，位置63的Xaa是Thr或Ser，位置75的Xaa是Ala、Ser、Val或Thr，位置76的Xaa是Lys或Arg，位置89的Xaa是Glu或Asp，位置107的Xaa是Leu或Thr。
32.权利要求30的方法，其中抗Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.47给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.48给出。
33.权利要求30的方法，其中抗Aβ抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.49给出，HC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.50给出。
34.权利要求30至33中任一项的方法，其中抗Aβ抗体包含两条轻链(LC)和两条重链(HC)，其中每条LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.49给出，每条HC的氨基酸序列通过SEQ IDNO.50给出。
35.权利要求27至29中任一项的方法，其中有效量的PEG-抗Aβ抗体片段与抗Tau抗体组合施用，
其中PEG-抗Aβ抗体片段包含Fab，所述Fab包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.58给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ IDNO.59给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.60给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ IDNO.61给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.62或SEQ ID NO.63给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.64给出，其中PEG-抗Aβ抗体片段在半胱氨酸处共价附着PEG分子。
36.权利要求35的方法，其中PEG-抗Aβ抗体片段包含Fab，所述Fab包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.53给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.54给出，其中PEG分子共价附着于SEQ ID NO.54的半胱氨酸残基56。
37.权利要求35的方法，其中PEG-抗Aβ抗体片段包含Fab，所述Fab包含轻链可变区(LCVR)、重链可变区(HCVR)和铰链区，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.53给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.54给出，其中PEG分子共价附着于铰链区残基。
38.权利要求35至37中任一项的方法，其中PEG分子具有约0.5kD至约30kD之间的分子量。
39.权利要求35至37中任一项的方法，其中PEG分子具有约20kD的分子量。
40.权利要求35至39中任一项的方法，其中PEG分子通过马来酰亚胺连接共价附着于PEG-抗Aβ抗体片段的半胱氨酸。
41.权利要求27至40中任一项的方法，其中表征为淀粉状蛋白斑快和异常tau聚集的形成的疾病选自临床或临床前阿尔茨海默病(AD)。
42.权利要求27至40中任一项的方法，其中表征为淀粉状蛋白斑快和异常tau聚集的形成的疾病选自前驱AD、轻度AD、中度AD或严重AD。
43.权利要求27至42中任一项的方法，其中抗Aβ抗体和PEG-抗Aβ抗体片段之一与抗Tau抗体同时施用。
44.权利要求27至42中任一项的方法，其中抗Aβ抗体和PEG-抗Aβ抗体片段之一在施用抗Tau抗体之前施用。
45.药物组合物，其包含含有一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的抗Aβ抗体和PEG-抗Aβ抗体片段之一，与含有一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的抗Tau抗体的药物组合物组合，其中抗Tau抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.69给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.70给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.71给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.72给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.73给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出。
46.权利要求45的药物组合物，其中抗Tau抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ IDNO.76给出。
47.权利要求45的药物组合物，其中抗Tau抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.67给出，HC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.68给出。
48.权利要求45至47中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含抗Aβ抗体，
其中抗Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.39给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.40给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.44给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.42给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.43给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.44给出。
49.权利要求48的药物组合物，其中抗Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中
LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.45给出，其中位置2的Xaa是Val或Ile，位置7的Xaa是Ser或Thr，位置14的Xaa是Thr或Ser，位置15的Xaa是Leu或Pro，位置30的Xaa是Ile或Val，位置50的Xaa是Arg、Gln或Lys，位置88的Xaa是Val或Leu，位置105的Xaa是Gln或Gly，位置108的Xaa是Lys或Arg，位置109的Xaa是Val或Leu；和
HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.46给出，其中位置1的Xaa是Glu或Gln，位置7的Xaa是Ser或Leu，位置46的Xaa是Glu、Val、Asp或Ser，位置63的Xaa是Thr或Ser，位置75的Xaa是Ala、Ser、Val或Thr，位置76的Xaa是Lys或Arg，位置89的Xaa是Glu或Asp，位置107的Xaa是Leu或Thr。
50.权利要求48的药物组合物，其中抗Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.47给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ IDNO.48给出。
51.权利要求48的药物组合物，其中抗Aβ抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.49给出，HC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.50给出。
52.权利要求48的药物组合物，其中抗Aβ抗体包含两条轻链(LC)和两条重链(HC)，其中每条LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.49给出，每条HC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.50给出。
53.权利要求45至47中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含PEG-抗Aβ抗体片段，其中PEG-抗Aβ抗体片段包含Fab，所述Fab包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.58给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.59给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.60给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.61给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.62或SEQ ID NO.63给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.64给出，其中PEG-抗Aβ抗体片段在半胱氨酸处共价附着PEG分子。
54.权利要求53的药物组合物，其中PEG-抗Aβ抗体片段包含Fab，所述Fab包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.53给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.54给出，其中PEG分子共价附着于SEQ ID NO.54的半胱氨酸残基56。
55.权利要求53的药物组合物，其中PEG-抗Aβ抗体片段包含Fab，所述Fab包含轻链可变区(LCVR)、重链可变区(HCVR)和铰链区，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.53给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.55给出，其中PEG分子共价附着于铰链区残基。
56.权利要求53至55中任一项的药物组合物，其中PEG分子具有约0.5kD至约30kD之间的分子量。
57.权利要求53至55中任一项的药物组合物，其中PEG分子具有约20kD的分子量。
58.权利要求53至57中任一项的药物组合物，其中PEG分子通过马来酰亚胺连接共价附着于PEG-抗Aβ抗体片段的半胱氨酸。
59.在诊断患有选自前驱AD、轻度AD、中度AD和严重AD的病症的患者中减慢认知衰退的方法，其包括施用有效量的权利要求45至58中任一项的药物组合物。
60.用于治疗AD的试剂盒，其中试剂盒包含有效量的抗Aβ抗体和PEG-抗Aβ抗体片段之一及有效量的抗Tau抗体，其中抗Tau抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.69给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.70给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.71给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.72给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.73给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出。
61.权利要求60的试剂盒，其中抗Tau抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.75给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ IDNO.76给出。
62.权利要求60的试剂盒，其中抗Tau抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.67给出，HC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.68给出。
63.权利要求60至62中任一项的试剂盒，其中试剂盒包含抗Aβ抗体，
其中抗Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.39给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.40给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.41给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.42给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.43给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.44给出。
64.权利要求63的试剂盒，其中抗Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中
LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.45给出，其中位置2的Xaa是Val或Ile，位置7的Xaa是Ser或Thr，位置14的Xaa是Thr或Ser，位置15的Xaa是Leu或Pro，位置30的Xaa是Ile或Val，位置50的Xaa是Arg、Gln或Lys，位置88的Xaa是Val或Leu，位置105的Xaa是Gln或Gly，位置108的Xaa是Lys或Arg，位置109的Xaa是Val或Leu；和
HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.46给出，其中位置1的Xaa是Glu或Gln，位置7的Xaa是Ser或Leu，位置46的Xaa是Glu、Val、Asp或Ser，位置63的Xaa是Thr或Ser，位置75的Xaa是Ala、Ser、Val或Thr，位置76的Xaa是Lys或Arg，位置89的Xaa是Glu或Asp，位置107的Xaa是Leu或Thr。
65.权利要求63的试剂盒，其中抗Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.47给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.48给出。
66.权利要求63的试剂盒，其中抗Aβ抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.49给出，HC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.50给出。
67.权利要求63至66中任一项的试剂盒，其中抗Aβ抗体包含两条轻链(LC)和两条重链(HC)，其中每条LC的氨基酸序列通过SEQ ID NO.49给出，每条HC的氨基酸序列通过SEQ IDNO.50给出。
68.权利要求60至62中任一项的试剂盒，其中试剂盒包含PEG-抗Aβ抗体片段，其中PEG-抗Aβ抗体片段包含Fab，所述Fab包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.58给出，LCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.59给出，LCDR3的氨基酸序列通过SEQ ID NO.60给出，HCDR1的氨基酸序列通过SEQ ID NO.61给出，HCDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO.62或SEQ ID NO.63给出，HCDR3的氨基酸序列通过SEQ IDNO.64给出，其中PEG-抗Aβ抗体片段在半胱氨酸处共价附着PEG分子。
69.权利要求68的试剂盒，其中PEG-抗Aβ抗体片段包含Fab，所述Fab包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.53给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.54给出，其中PEG分子共价附着于SEQ ID NO.54的半胱氨酸残基56。
70.权利要求68的试剂盒，其中PEG-抗Aβ抗体片段包含Fab，所述Fab包含轻链可变区(LCVR)、重链可变区(HCVR)和铰链区，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.53给出，HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO.55给出，其中PEG分子共价附着于铰链区残基。
71.权利要求68至70中任一项的试剂盒，其中PEG分子具有约0.5kD至约30kD之间的分子量。
72.权利要求68至70中任一项的试剂盒，其中PEG分子具有约20kD的分子量。
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