JP2019525920A - 併用療法 - Google Patents

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Abstract

認知疾患または神経変性疾患を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の抗タウ抗体と組み合わせて、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、抗Ａベータ抗体、またはアミロイドベータに結合し、かつポリエチレングリコール分子に共有結合している抗体断片を投与することを含む、方法。

Description

本出願は、ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ ＴＨＥＲＡＰＹと題する、２０１６年８月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３７２，４５３号、ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ ＴＨＥＲＡＰＹと題する、２０１６年８月１０日に出願された、米国仮特許出願第６２／３７３，０２２号、およびＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ ＴＨＥＲＡＰＹと題する、２０１６年８月１７日に出願された、米国仮特許出願第６２／３７５，９９２号の優先権を主張するものであり、これらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
抗タウ抗体と、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、アミロイドベータペプチドを封鎖する抗体（抗Ａβ抗体）、およびアミロイドベータペプチドに結合し、かつポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共有結合している抗体断片のうちの１つとの組み合わせ、ならびアルツハイマー病（ＡＤ）などの、アミロイド斑の形成および／またはアミロイドβ（ＡベータまたはＡβ）ペプチドの沈着および異常なタウ凝集を特徴とする神経変性疾患の治療のためのその使用方法に関する。
ＡＤは、世界中で何百万人もの患者を冒す破壊的な神経変性障害である。患者に一時的な症候的利益のみを提供する市場で現在認可されている薬剤を考慮すれば、ＡＤの治療における満たされていない重大な必要性が存在する。ＡＤは、Ａベータの生成、凝集、および沈着、ならびに脳における異常なタウ凝集を特徴とする。
Ｎ３ｐＧｌｕＡベータを特異的に標的とする抗体が、Ａβ斑レベルをインビボで低下させることが示されている（米国特許出願公開第２０１３／０１４２８０６号）。これらの抗体は、本明細書で「抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ」と称される。Ｎ３ｐＧｌｕＡβ、Ｎ３ｐＧ、Ｎ３ｐＥ、またはＡベータｐ３−４２とも称されるＮ３ｐＧｌｕＡベータは、斑でのみ見られるＡベータペプチドの短縮型である。Ｎ３ｐＧｌｕＡベータペプチドが脳内に沈着したＡベータの微量構成成分であるが、研究により、Ｎ３ｐＧｌｕＡベータペプチドが攻撃的な凝集特性を有し、沈着カスケードに初期に蓄積することが実証されている。
Ａβを特異的に標的とし、それを封鎖する抗体が、遊離Ａβおよび斑レベルをインビボで低下させることが示されている（米国特許第７，１９５，７６１号および同第８．５９１，８９４号）。これらの抗体は、本明細書で「抗Ａβ抗体」と称される。
ヒトＡβペプチドの残基１３〜２８の間でＡβペプチドに特異的に結合し、アミロイド前駆体タンパク質（「ＡＰＰ」）に特異的に結合せず、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共有結合する抗体断片を含む分子は、インビボで遊離Ａβを低下させることが示されている（例えば、米国特許第８，０６６，９９９号参照）。これらの分子は、本明細書では「ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片」と称される。
さらに、動物モデルの研究により、ニューロンのシナプス接合部全体にタウ凝集体が広がり、タウ凝集体形成を誘導する単量体（天然または非凝集）タウを封鎖することが示されている。ＡＤなどの神経変性疾患におけるタウ凝集および蓄積の神経解剖学的進行は、タウフィブリル凝集がニューロンネットワークに沿って伝播し、最終的には微小管の不安定化をもたらし、最終的には局在化した神経機能障害をもたらすことを示唆している。これは、タウの凝集および蓄積のわずかな減少でさえ、ニューロン内神経原線維変化（ＮＦＴ）の長期的な有意な減少をもたらし、したがって、特にＡＤの治療において治療上の利益を提供することを示唆している。
タウ凝集体に特異的に結合し、タウ凝集体形成の伝播を減少させる抗体（本明細書では「抗タウ抗体」と称される）のＮ３ｐＧｌｕＡベータに結合する抗体との組み合わせは、ＡＤなどの神経変性疾患のための治療を提供するために望ましい。このような組み合わせは、好ましくはいずれかの抗体単独よりも有効であるだろう。例えば、かかる組み合わせでの治療は、各抗体の単独での使用と比較して、より少ない用量のいずれかまたは両方の抗体の使用を可能にし、潜在的には、有効性を維持しながらより少ない副作用（どれか一方の療法より短い持続期間）をもたらし得る。タウ抗体によりタウ凝集体を標的とすることにより、凝集体形成、ＮＦＴ形成、およびニューロン欠損を低減させ、ならびにＮ３ｐＧｌｕ抗体によりＡベータの沈着形態の除去を標的とすることにより、既存の斑沈着物の食作用性除去が容易になり、同時にＡベータの生成を阻害することによってＡベータのさらなる沈着が低減または阻止されると考えられている。
また、抗タウ抗体と、Ａベータペプチドに結合する抗体との組み合わせは、ＡＤなどの神経変性障害の治療を提供するために望ましい。このような組み合わせは、好ましくはいずれかの抗体単独よりも有効であるだろう。例えば、かかる組み合わせでの治療は、各抗体の単独での使用と比較して、より少ない用量のいずれかまたは両方の抗体の使用を可能にし、潜在的には、有効性を維持しながらより少ない副作用（どちらか一方の療法より短い持続期間）をもたらし得る。タウ抗体によりタウ凝集体を標的とすることにより、凝集体形成、ＮＦＴ形成、およびニューロン欠損を低減させ、ならびに抗Ａβ抗体によりＡβペプチドの封鎖を標的とすることにより、Ａβペプチドのクリアランスを促進し、斑形成を防止すると考えられている。
さらに、抗タウ抗体とＡβペプチドに結合し（およびヒトＡβペプチドの残基１３〜２８と特異的に結合し、ＡＰＰには特異的に結合しない）分子との組み合わせは、ＡＤなどの神経変性障害の治療を提供するために望ましい。このような組み合わせは、好ましくはいずれかの抗体単独よりも有効であるだろう。例えば、かかる組み合わせでの治療は、各分子の単独での使用と比較して、より少ない用量のいずれかまたは両方の分子の使用を可能にし、潜在的には、有効性を維持しながらより少ない副作用（どちらか一方の療法より短い持続期間）をもたらし得る。タウ抗体によりタウ凝集体を標的とすることにより、凝集体形成、ＮＦＴ形成、およびニューロン欠損を低減させ、ならびにＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片によりＡβペプチド（残基１３〜２８）を標的とすることにより、アミロイド斑の形成および異常なタウ凝集を特徴とする神経変性疾患の治療として有用となると考えられている。
したがって、本発明は、認知または神経変性疾患を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の抗タウ抗体を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、および／またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を組み合わせて投与することを含む方法を提供する。本発明は、臨床期または前臨床期のＡＤを治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の抗タウ抗体を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、および／またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を組み合わせて投与することを含む方法をさらに提供する。本発明はまた、前駆ＡＤ（軽度認知障害、またはＭＣＩとも称されることがある）、軽度ＡＤ、中度ＡＤ、および／または重度ＡＤを治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の抗タウ抗体を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、および／またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を組み合わせて投与することを含む方法を提供する。
本発明は、前臨床期ＡＤまたは臨床期ＡＤと診断された患者において認知機能低下を遅延させる方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の抗タウ抗体を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、および／またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を組み合わせて投与することを含む方法をさらに提供する。本発明は、前臨床期ＡＤまたは臨床期ＡＤと診断された患者において機能低下を遅延させる方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の抗タウ抗体を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、および／またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を組み合わせて投与することを含む方法をさらに提供する。本発明は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に低レベルのＡβ１−４２または脳内にＡβ斑を有する無症候性患者において記憶喪失または認知機能低下を予防する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の抗タウ抗体を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、および／またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を組み合わせて投与することを含む方法をさらに提供する。
別の実施形態では、本発明は、アルツハイマー病により生じる遺伝子突然変異を有することが知られる無症候性患者を治療する方法であって、有効量の抗タウ抗体を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、および／またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を組み合わせて投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、軽度認知障害のＡＤへの進行の予防のための方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の抗タウ抗体を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、および／またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を組み合わせて投与することを含む方法を提供する。
本発明の実施形態はまた、治療において使用するために、抗タウ抗体と同時に、別々に、または連続的に組み合わせて使用するための抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体を提供する。本発明の実施形態はまた、治療において使用するために、抗タウ抗体と同時に、別々に、または連続的に組み合わせて使用するための抗Ａβ抗体を提供する。本発明の実施形態はまた、治療において使用するために、抗タウ抗体と同時に、別々に、または連続的に組み合わせて使用するためのＰＥＧ−抗Ａβ抗体を提供する。
本発明は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む抗タウ抗体の薬学的組成物と組み合わせた、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、およびＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のうちの１つを含む薬学的組成物をさらに提供する。
さらに、本発明は、抗タウ抗体と共に、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、およびＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のうちの１つを含むキットを提供する。本発明はさらに、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む抗タウ抗体を含む医薬組成物と、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、およびＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のうちの１つとを含むキットをさらに提供する。本明細書中で使用される場合、「キット」は、各成分の別個の容器を含み、単一のパッケージ内の１つの成分が抗タウ抗体であり、単一パッケージ内の別の成分が、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、およびＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のうちの１つである。「キット」はまた、各成分の別個の容器を含み、別個のパッケージ内の１つの成分が抗タウ抗体であり、別の成分が、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、およびＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のうちの１つであり、各成分を組み合わせて投与するための使用説明書を伴う。
本発明は、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、Ａベータペプチドに結合する抗体、およびＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のうちの１つの、ＡＤ、軽度ＡＤ、前駆ＡＤの治療のための、または軽度認知障害のＡＤへの進行を予防するための医薬品の製造のための使用をさらに提供し、この医薬品は、抗タウ抗体と同時に、別個にまたは連続して投与されるためのものである。
抗タウ抗体
本発明の一実施形態では、抗タウ抗体は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含み、ＨＣは、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣは、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、該ＨＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、該ＬＣＶＲは、ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。本発明の抗タウ抗体の特定の実施形態によれば、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６９によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７０によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号７１によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７２によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号７４によって示される。一実施形態では、本発明は、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む、ヒトタウに結合するモノクローナル抗体を提供し、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号７５によって示され、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号７６によって示される。さらなる実施形態では、本発明は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む、ヒトタウに結合するモノクローナル抗体を提供し、ＬＣのアミノ酸配列は、配列番号６７によって示され、ＨＣのアミノ酸配列は、配列番号６８によって示される。
本発明の抗タウ抗体は、既知の方法を用いて調製および精製することができる。例えば、ＨＣ（例えば、配列番号６８によって示されるアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡ配列、例えば、配列番号７７によって示されるｃＤＮＡ配列、およびＬＣ（例えば、配列番号６７によって示されるアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡ配列、例えば配列番号７８によって示されるｃＤＮＡ配列を、クローンして、ＧＳ（グルタミンシンセターゼ）発現ベクター中に遺伝子操作することができる。次いで、遺伝子操作を受けた免疫グロブリン発現ベクターを、ＣＨＯ細胞中に安定してトランスフェクトすることができる。当業者であれば理解されるように、抗体の哺乳動物発現は、典型的には、Ｆｃ領域の高度に保存されたＮ−グリコシル化部位でのグリコシル化をもたらすであろう。安定なクローンは、タウ凝集体に特異的に結合する抗体の発現について確認することができる。陽性クローンは、バイオリアクターにおける抗体産生のために無血清培地中で増殖させることができる。抗体が分泌された培地は、従来の技術によって精製され得る。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水のような適合する緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ ＡまたはＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムに便利に適用され得る。カラムを洗浄して、非特異的結合構成成分を除去する。結合した抗体は、例えばｐＨ勾配により溶出され、抗体分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって検出され、その後プールされる。抗体は、一般的な技法を用いて濃縮および／または滅菌濾過され得る。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技法によって効率的に除去することができる。生成物は、例えば−７０℃で直ちに凍結させてもよく、または凍結乾燥させてもよい。
本発明の抗タウ抗体は、ヒトタウに結合する。一実施形態では、本発明の抗タウ抗体は、ヒトタウの立体配座エピトープに結合する。特定の実施形態では、ヒトタウの配座エピトープは、ヒトタウのアミノ酸残基７〜９および３１２〜３２２を含み、ヒトタウのアミノ酸配列は、配列番号７９によって示される。
抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体
本発明の一実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらは、
ａ）ＬＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号２３であること、
ｂ）ＬＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号２４であること、
ｃ）ＬＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３７あること、
ｄ）ＬＣＤＲ１が配列番号４であり、ＬＣＤＲ２が配列番号６であり、ＬＣＤＲ３が配列番号７であり、ＨＣＤＲ１が配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３であること、
ｅ）ＬＣＤＲ１が配列番号４であり、ＬＣＤＲ２が配列番号５であり、ＬＣＤＲ３が配列番号７であり、ＨＣＤＲ１が配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３であること、からなる群から選択される。
他の実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、
ａ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２６のＨＣＶＲ、
ｂ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２７のＨＣＶＲ、
ｃ）配列番号３２のＬＣＶＲおよび配列番号３４のＨＣＶＲ、
ｄ）配列番号９のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、ならびに
ｅ）配列番号１０のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、ＬＣおよびＨＣは、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群から選択される。
他の実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣおよび各ＨＣは、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、それぞれ、配列番号１２および配列番号１１の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を有する抗体Ｉを含む。抗体Ｉは、それぞれ、配列番号９および配列番号８の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をさらに有する。抗体ＩのＨＣＶＲは、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３をさらに含む。抗体ＩのＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号６のＬＣＤＲ２、および配列番号７のＬＣＤＲ３をさらに含む。
いくつかの実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、それぞれ、配列番号１３および配列番号１１の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を有する抗体ＩＩを含む。抗体ＩＩは、それぞれ、配列番号１０および配列番号８の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をさらに有する。抗体ＩＩのＨＣＶＲは、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３をさらに含む。抗体ＩＩのＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号７のＬＣＤＲ３をさらに含む。
いくつかの実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、それぞれ、配列番号２８および配列番号２９の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を有するＢ１２Ｌを含む。Ｂ１２Ｌは、それぞれ、配列番号２５および配列番号２６の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をさらに有する。Ｂ１２ＬのＨＣＶＲは、配列番号２０のＨＣＤＲ１、配列番号２２のＨＣＤＲ２、および配列番号２３のＨＣＤＲ３をさらに含む。Ｂ１２ＬのＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号１７のＬＣＤＲ１、配列番号１８のＬＣＤＲ２、および配列番号１９のＬＣＤＲ３をさらに含む。
いくつかの実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、それぞれ、配列番号２８および配列番号３０の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を有するＲ１７Ｌを含む。Ｒ１７Ｌは、それぞれ、配列番号２５および配列番号２７の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をさらに有する。Ｒ１７ＬのＨＣＶＲは、配列番号２１のＨＣＤＲ１、配列番号２２のＨＣＤＲ２、および配列番号２４のＨＣＤＲ３をさらに含む。Ｒ１７ＬのＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号１７のＬＣＤＲ１、配列番号１８のＬＣＤＲ２、および配列番号１９のＬＣＤＲ３をさらに含む。
いくつかの実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、それぞれ、配列番号３３および配列番号３５の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を有するｈＥ８Ｌを含む。ｈＥ８Ｌは、それぞれ、配列番号３２および配列番号３４の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をさらに有する。ｈＥ８ＬのＨＣＶＲは、配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号２２のＨＣＤＲ２、および配列番号３７のＨＣＤＲ３をさらに含む。ｈＥ８ＬのＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号１７のＬＣＤＲ１、配列番号１８のＬＣＤＲ２、および配列番号１９のＬＣＤＲ３をさらに含む。
当業者であれば、「抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体」、ならびに特異的抗体「Ｂ１２Ｌ」および「Ｒ１７Ｌ」が、２０１４年３月２５日に発行された米国特許第８，６７９，４９８Ｂ２号、名称「Ａｎｔｉ−Ｎ３ｐＧｌｕ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｂｅｔａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」（米国第１３／８１０，８９５号）において、当業者により該抗体を作製および使用するための方法とともに特定および開示されることを理解および認識するであろう。例えば、米国特許第８，６７９，４９８Ｂ２号の表１を参照されたい。これらの２つの抗体（例えば、「Ｂ１２Ｌ」および「Ｒ１７Ｌ」）は各々、本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体として使用され得る。他の実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、本明細書に記載される抗体「ｈＥ８Ｌ」を含み得る。さらなる実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、本明細書に概説される「抗体Ｉ」を含み得る。なおさらなる実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、本明細書に概説される「抗体ＩＩ」を含み得る。
本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体は、Ｎ３ｐＧｌｕＡβに結合する。Ｎ３ｐＧｌｕＡβの配列は、配列番号３１のアミノ酸配列である。Ａβの配列は、配列番号３８である。
抗Ａβ抗体
本発明の一実施形態では、抗Ａβ抗体は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含み、ＨＣは、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣは、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、該ＨＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、該ＬＣＶＲは、ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。本発明の抗Ａβ抗体の特定の実施形態によれば、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号３９によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４０によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号４１によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号４２によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号４４によって示される。一実施形態では、本発明は、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む、ヒトタウに結合するモノクローナル抗体を提供し、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号４５によって示され、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号４６によって示される。いくつかのさらにより具体的な実施形態では、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号４７によって示され、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号４８によって示される。さらなる実施形態では、本発明は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む、ヒトタウに結合するモノクローナル抗体を提供し、ＬＣのアミノ酸配列は、配列番号４９によって示され、ＨＣのアミノ酸配列は、配列番号５０によって示される。
当業者であれば、本発明の抗Ａβ抗体が、２００７年３月２７日に発行された米国特許第７，１９５，７６１号、名称「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ Ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ ＡＢｅｔａ Ｐｅｐｔｉｄｅ」、および２０１３年１１月２６日に発行された米国特許第８，５９１，８９４号、名称「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ Ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ ＡＢｅｔａ Ｐｅｐｔｉｄｅ」（これらの両方が、参照により本明細書に組み込まれる）において、当業者により該抗体を作製および使用するための方法とともに特定および開示されることを理解および認識するであろう。
ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片
本発明の一実施形態では、ヒトＡβペプチド（配列番号５６）の残基１３〜２８の間でヒトＡβペプチドに特異的に結合し、ＡＰＰには特異的に結合しないＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が提供される。このような実施形態によれば、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む。本発明のＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片の特定の実施形態によれば、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片は、Ｆａｂであり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号５８によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５９によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号６０によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６１によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６２または配列番号６３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号６４によって示される。このような実施形態によれば、ＰＥＧ分子は、ＨＣＶＲまたはＬＣＶＲのうちの１つに共有結合している。特定の実施形態によれば、ＰＥＧ分子は、ＣＤＲに共有結合している。さらにより特定の実施形態では、ＰＥＧ分子は、ＣＤＲ内のシステイン残基、例えば、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＨＣＶＲの配列番号６２によって示されるＨＣＤＲ２内のシステイン残基に共有結合している。特定の実施形態において、ＰＥＧ分子は、マレイミド結合を介してシステインに結合される。さらにより特定の実施形態では、ＰＥＧ分子は、約０．５ｋＤ〜約３０ｋＤの分子量を有する。さらにより特定の実施形態では、ＰＥＧ分子は、約２０ｋＤの分子量を有する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡβペプチドの残基１３〜２８の間でヒトＡβペプチドに特異的に結合し、ＡＰＰには特異的に結合しないＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を提供する。特定の実施形態では、一実施形態では、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片は、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含むＦａｂであり、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号５３によって示され、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号５４によって示される。特定の実施形態によれば、ＰＥＧ分子は、該ＨＣＶＲ（配列番号５４）のアミノ酸５６位のシステイン残基に共有結合している。特定の実施形態において、ＰＥＧ分子は、マレイミド結合を介してシステインに結合される。さらにより特定の実施形態では、ＰＥＧ分子は、約０．５ｋＤ〜約３０ｋＤの分子量を有する。さらにより特定の実施形態では、ＰＥＧ分子は、約２０ｋＤの分子量を有する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡβペプチドの残基１３〜２８の間でヒトＡβペプチドに特異的に結合し、ＡＰＰには特異的に結合しないＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を提供する。特定の実施形態は、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含むＦａｂを含み、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号５３によって示され、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号５５によって示される。特定の実施形態によれば、ＰＥＧ分子は、抗体断片のヒンジ領域に共有結合している。特定の実施形態において、ＰＥＧ分子は、マレイミド結合を介してヒンジ領域に共有結合される。さらにより特定の実施形態では、ＰＥＧ分子は、約０．５ｋＤ〜約３０ｋＤの分子量を有する。さらにより特定の実施形態では、ＰＥＧ分子は、約２０ｋＤの分子量を有する。
さらなる特定の実施形態では、本発明は、ヒトＡβペプチドの残基１３〜２８の間でヒトＡβペプチドに特異的に結合し、ＡＰＰには特異的に結合しないＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を提供する。特定の実施形態によれば、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片は、配列番号５３によって示されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよび配列番号５４によって示されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含むＦａｂを含み、ＰＥＧ分子は、該ＨＣＶＲのアミノ酸５６位のシステイン残基に共有結合しており、ＰＥＧ分子は、約２０ｋＤの分子量を有する。さらなる特定の実施形態では、ＰＥＧ分子は、マレイミド結合を介してヒンジ領域に共有結合されている。
さらなる特定の実施形態では、本発明は、ヒトＡβペプチドの残基１３〜２８の間でヒトＡβペプチドに特異的に結合し、ＡＰＰには特異的に結合しないＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を提供する。該特定の実施形態は、配列番号５３によって示されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよび配列番号５５によって示されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含むＦａｂを含み、ＰＥＧ分子は、マレイミド結合を介してＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のヒンジ領域に共有結合しており、ＰＥＧ分子は、約２０ｋＤの分子量を有する。
当業者であれば、本発明のＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年１１月２９日に発行された米国特許第８，０６６，９９９号、名称「Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ Ａβ ＦＡＢ」において、当業者により該ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を作製および使用するための方法とともに特定および開示されることを理解および認識するであろう。
定義
本明細書で使用されるとき、「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）を含む免疫グロブリン分子である。各ＬＣおよびＨＣのアミノ末端部分は、内部に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を介して抗原認識に関与する可変領域を含む。ＣＤＲには、フレームワーク領域と呼ばれるより保存的な領域が散在している。本発明の抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲドメインへのアミノ酸の割当ては、以下のような周知の番号付け規則に基づいている：Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））、およびＮｏｒｔｈ付番規則（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６：２２８−２５６（２０１１））。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、抗原（例えば、ヒトＡβペプチド）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。「抗体断片」という用語に包含される分子の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ´）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ならびに（ｖ）ＶＨドメインからなる、ａＡｂ断片（Ｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を用いて、それらがＶＬおよびＶＨ領域が対合して、一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって結合され得る（単鎖ＦＶ（ｓｃＦＶ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６：およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照）。このような一本鎖抗体もまた、「抗体断片」という用語に包含されることが意図される。二重特異性抗体などの一本鎖抗体の他の形態も用語「抗体断片」に包含される。二重特異性抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用すし、これにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメイと対合させて、２つの抗原結合部位を作成する二価の二重特異性結合タンパク質である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．、ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照）。
本発明のＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片は、１つ以上のＰＥＧ分子に共有結合している。用語「ポリエチレングリコール」および「ＰＥＧ」は互換的に使用され、当技術分野において既知のポリエチレングリコールまたはその誘導体を意味することが意図される（例えば、米国特許第５，４４５，０９０号；同第５，９００，４６１号；同第５，９３２，４６２号；同第６，４３６，３８６号；同第６，４４８，３６９号；同第６，４３７，０２５号；同第６，４４８，３６９号；同第６，４９５，６５９号；同第６，５１５，１００号、および同第６，５１４，４９１号を参照）。好ましくは、ＰＥＧは、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片の１つ以上のリジンまたはシステイン残基に共有結合している。より好ましくは、ＰＥＧは、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＨＣＶＲ中の１つ以上のリジンまたはシステイン残基に共有結合している。さらにより好ましくは、ＰＥＧは、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＣＤＲ内の１つ以上のリジンまたはシステイン残基に共有結合している。最も好ましくは、ＰＥＧは、該配列番号５４のＨＣＶＲのアミノ酸５６位のシステイン残基に結合している。あるいは、ＰＥＧ分子は、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のヒンジ領域に対するリンカーまたはスペーサー分子を介して、抗体断片に結合され得る。ヒンジ領域へのリンカーおよびスペーサー分子の添加は、当技術分野において周知である。さらに、ＰＥＧ分子は、当技術分野で周知の技術によって、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片の改変された非天然アミノ酸に共有結合することができる。
その典型的な形態では、「ＰＥＧ」は末端ヒドロキシル基を有する線状ポリマーであり、式：ＨＯ−ＣＨ２ ＣＨ２−（ＣＨ２ ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ ＣＨ２−ＯＨを有し、式中ｎは、約８〜約４０００である。末端水素は、アルキル基またはアルカノール基（Ｍ−ＰＥＧ）などの保護基で置換されていてもよい。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも１個のヒドロキシ基を有し、より好ましくは、これは末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基は、好ましくはペプチドと反応するように活性化されるものである。様々な化学修飾を用いて、活性カーボネート、活性エステル、アルデヒド、トレシレートなどの官能基を有する活性ＰＥＧ誘導体を調製するか、または所与の標的分子へのカップリングに適したＰＥＧ−プロピオンアルデヒドを使用する。次いで、活性化されたＰＥＧ誘導体は、ポリペプチド薬剤上の反応性基に共有結合される。本発明に有用な多くの形態のＰＥＧが存在する。ＰＥＧの多数の誘導体が当該技術分野において存在し、本発明での使用に適している。本発明のＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片に共有結合したＰＥＧ分子は、特定の種類またはサイズに限定されることを意図するものではない。ＰＥＧ分子の分子量は、好ましくは約０．５キロダルトン（ｋＤ）〜約１００ｋＤ、より好ましくは約５ｋＤ〜約３０ｋＤ、最も好ましくは約１ｋＤ〜約２０ｋＤである。ＰＥＧ分子は、直鎖または分岐鎖であってもよく、本発明のＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片は、ペプチドに結合した１、２、３、４、５、または６個のＰＥＧ分子を有していてもよい。ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片当たり１つのＰＥＧ分子が結合していることが最も好ましいが、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片当たり２つ以上のＰＥＧ分子が存在する場合、６個以下であることが好ましい。ＰＥＧ分子の両端が２つ以上のＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を一緒に架橋するように適合されてもよいことがさらに企図される。タンパク質、抗体およびその断片にＰＥＧ分子を結合させる方法は、当技術分野において周知である。
本発明の特定の実施形態では、抗体および抗体断片、またはそれらをコードする核酸は、単離された形態で提供され得る。本明細書で使用される場合、「単離」という用語は、天然では見出されない、かつ細胞環境において見出される他の高分子種を含まないか、または実質的に含まない、タンパク質、ペプチド、または核酸を指す。「実質的に含まない」とは、本明細書で使用されるとき、目的とするタンパク質、ペプチド、または核酸が、存在する高分子種の８０％超（モル基準）、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超を含むことを意味する。本発明の特定の実施形態では、抗体および／もしくは抗体断片、またはそれらをコードする核酸は、単離された形態で提供され得る。本明細書で使用される場合、「単離」という用語は、天然では見出されない、かつ細胞環境において見出される他の高分子種を含まないか、または実質的に含まない、タンパク質、ペプチド、または核酸を指す。「実質的に含まない」とは、本明細書で使用されるとき、目的とするタンパク質、ペプチド、または核酸が、存在する高分子種の８０％超（モル基準）、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超を含むことを意味する。
本抗体ならびに／または抗体断片の発現および分泌後、培地が浄化されて細胞が除去され、浄化された培地が多くの一般に使用されている技法のうちのいずれかを使用して精製される。精製された抗体または断片は、非経口投与、特に皮下、髄腔内、または静脈内投与のためにタンパク質および抗体を製剤化するための周知の方法に従って薬学的組成物に製剤化され得る。本抗体または断片は、適切な薬学的に許容される賦形剤と一緒に凍結乾燥され、その後、使用前に水性希釈剤で再構成され得る。あるいは、本抗体は、水溶液中で製剤化され、使用前に保管され得る。いずれの場合にも、本抗体の薬学的組成物の保管形態および注入形態は、本抗体以外の成分である薬学的に許容される賦形剤（複数可）を含む。成分が薬学的に許容されるかは、薬学的組成物の安全性および有効性、または薬学的組成物の安全性、純度、および効力へのその影響に依存する。成分がヒトへの投与のための組成物中に使用されていないことを保証するために、その成分が安全性もしくは有効性（または安全性、純度、もしくは効力）に十分に好ましくない影響を及ぼすと判断されるならば、そのときは本抗体または断片の薬学的組成物中での使用には薬学的に許容されない。
「Ａβの沈着を特徴とする疾患」という用語は、脳内または脳脈管構造内のＡβ沈着物によって病理学的を特徴とする疾患である。これには、ＡＤ、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症等の疾患が含まれる。「異常タウ凝集を特徴とする疾患」という用語は、タウ凝集体形成、ＮＦＴ形成、およびニューロン損失のうちの少なくとも１つの伝播を特徴とする疾患を指す。これには、ＡＤ、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症、およびピック病などの疾患が含まれる。
アルツハイマー病の臨床診断、病期分類、または進行は、当業者としての担当診断医または医療従事者によって、既知の技法を用いることにより、かつ結果を観察することにより容易に判定され得る。これは一般に、ある形態の脳斑イメージング（例えば、ＭＲＩ、アミロイドＰＥＴ）、精神もしくは認知評価（例えば、臨床的認知症重症度判定尺度（ＣＤＲ−ＳＢ）、ミニメンタルステート検査２５（ＭＭＳＥ）、またはアルツハイマー病評価尺度−認知（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ））、または機能評価（例えば、アルツハイマー病共同研究−日常生活動作（ＡＤＣＳ−ＡＤＬ）を含む。本明細書で使用される「臨床期アルツハイマー病」とは、アルツハイマー病の診断された病期である。それは、前駆アルツハイマー病、軽度ＡＤ、中度ＡＤ、および重度ＡＤと診断される状態を含む。「前臨床期アルツハイマー病」という用語は、臨床期アルツハイマー病に先立つ病期であり、バイオマーカー（ＣＳＦ Ａβ４２レベルまたはアミロイドＰＥＴによる沈着脳斑など）の測定可能な変化が、臨床期アルツハイマー病へ進行するアルツハイマー病理を有する患者の最初期の徴候を示す。これは通常、記憶喪失および混乱のような症状が顕著となる前である。
本明細書で使用されるとき、「治療すること」、「治療する」、または「治療」という用語は、ＡＤなどの既存の症状、障害、状態、または疾患の進行もしくは重症度を抑制するか、遅延させるか、停止させるか、軽減するか、または逆転させることを含む。
本明細書で使用されるとき、用語「患者」は、ヒトを指す。
本明細書で使用される場合、用語「Ａベータペプチドの産生の阻害」は、患者におけるＡベータペプチドのインビボレベルの減少を意味するとみなされる。
「予防」という用語は、疾患の進行を予防するための無症候性患者または前臨床期アルツハイマー病を有する患者への本明細書に概説される抗体および／または抗体断片の組み合わせの予防的投与を意味する。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、診断または治療時に患者において所望の効果を提供する、患者に投与される、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、抗Ａβ抗体またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片の量もしくは用量、および抗タウ抗体の量もしくは用量を指す。本発明の併用療法は、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、抗Ａβ抗体またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片、これと共に抗タウ抗体によって、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、抗Ａβ抗体またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片、および抗タウ抗体の体内の有効レベルを提供する任意の方法において実行される。
有効量は、当業者のような担当診断医により、既知技法の使用により、および同様の状況下で得られた結果を観察することによって容易に決定され得る。患者のための有効量を決定する際には、患者の種、そのサイズ、年齢、および全体的な健康状態、関与する特定の疾患または障害、疾患または障害の程度または関与または重症度、個々の患者の応答、投与される特定の化合物、投与の様式、投与される製剤の生物学的利用率特性、選択された投与レジメン、付随する薬物の使用、ならびにその他の関連する状況を含むが、これらに限定されない、多数の要因が担当診断医によって考慮される。例えば、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体は、（許容される患者の安全性プロファイルを用いて）フロルベタピルＰＥＴイメージングによる有意なアミロイド減少の達成に基づいて決定され得る。有効量の抗Ａβ抗体またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片は、モデル化された遊離血漿Ａβ低下の程度に基づいて（許容される患者の安全性プロファイルを用いて）決定することができる。さらに、例えば、有効量の抗タウ抗体は、タウＰＥＴイメージ（許容可能な患者の安全性プロファイルを用いて）によるタウＮＦＴの進行の遅延の達成に基づいて決定することができる。
さらに、本抗体または断片は、本発明の組み合わせにおいて広い投薬量範囲にわたって一般的に有効である。ある場合には、前述の範囲の下限値未満の投薬量レベルが十分過ぎる場合がある一方で、他の場合には、さらにより多くの用量が許容される有害事象を伴って用いられてもよく、それ故に、上述の投薬量範囲は、決して本発明の範囲を限定するようには意図されていない。
本発明の抗体および断片は、好ましくは、抗体を生物学的に利用可能にする任意の経路によって投与される薬学的組成物として製剤化される。投与経路は、いずれの方法においても変えることができ、薬物の物理的特性ならびに患者および介護人の利便性によって限定され得る。好ましくは、本薬学的組成物は、静脈内または皮下投与等の非経口投与用である。特定の実施形態によれば、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、抗Ａβ抗体、またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片は、皮下投与することができ、抗タウ抗体は、静脈内投与することができる。他の特定の実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、抗Ａβ抗体、またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片と、抗タウ抗体との両方を静脈内投与してもよく、または両方を皮下投与してもよい。薬学的組成物およびその調製方法は、当該技術分野において周知である。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ，Ｅｄｉｔｏｒ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６を参照されたい。）
本明細書中で使用される場合、「組み合わせて」という語句は、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、抗Ａβ抗体、またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片と、抗タウ抗体とを、同時に、または任意の順序で連続して投与すること、もしくはこれらの任意の組み合わせを指す。２つの分子は、同じ薬学的組成物の一部としてまたは別個の薬学的組成物としてのいずれかで投与され得る。抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体、抗Ａβ抗体、またはＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片は、抗タウ抗体の投与前に、それと同時に、またはその投与に続いて、もしくはこれらのいくつかの組み合わせで投与することができる。
本明細書で使用されるとき、「ＢＳＡ」とは、ウシ血清アルブミンを指し、「ＥＤＴＡ」とは、エチレンジアミン四酢酸を指し、「ｅｅ」とは、鏡像体過剰率を指し、「Ｅｘ」とは、実施例を指し、「Ｆ１２」とは、ハムＦ１２培地を指し、「ｈｒ」とは、時間（複数可）を指し、「ＨＲＰ」とは、西洋ワサビペルオキシダーゼを指し、「ＩＣ５０」とは、薬剤に対して可能な最大阻害応答の５０％をもたらすその薬剤の濃度を指し、「ｍｉｎ」とは、分（複数可）を指し、「ＰＢＳ」とは、リン酸緩衝生理食塩水を指し、「ＰＤＡＰＰ」とは、血小板由来アミロイド前駆体タンパク質を指し、「Ｐｒｅｐ」とは、調製を指し、「ｐｓｉ」とは、毎平方インチ当たりポンドを指し、「Ｒｔ」とは、保持時間を指し、「ＳＣＸ」とは、強陽イオン交換クロマトグラフィーを指し、「ＴＨＦ」とは、テトラヒドロフランを指し、「ＴＭＢ」とは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを指す。
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。
抗タウ抗体
遺伝子操作を受けた抗タウ抗体の発現
本発明の抗タウ抗体は、本質的に以下の通りに調製および精製することができる。配列番号７８のＤＮＡ配列（配列番号６７のＬＣアミノ酸配列をコードする）および配列番号７７のＤＮＡ配列（配列番号６８のＨＣアミノ酸配列をコードする）を含有するグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）は、電気穿孔によってチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）をトランスフェクトするために使用される。この発現ベクターは、ＳＶ初期（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳの遺伝子をコードする。ＧＳの発現は、ＣＨＯ細胞によって必要とされるアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成を可能にする。トランスフェクション後、細胞を５０μＭ Ｌ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）でバルク選択にかける。ＭＳＸによるＧＳの阻害は、選択のストリンジェンシーを高めるために利用される。宿主細胞ゲノムの転写活性領域に発現ベクターｃＤＮＡを組み込んだ細胞が、内在的レベルのＧＳを発現するＣＨＯ野生型細胞に対して選択され得る。トランスフェクトされたプールを低密度でプレーティングして、安定した発現細胞のクローンに近い成長を可能にする。マスターウェルを、抗体発現についてスクリーニングされ、その後、無血清懸濁培養で増殖させて、産生に使用される。
抗体が分泌された浄化培地が、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）等の適合性緩衝液で平衡化されたタンパク質Ａ親和性カラムに適用される。このカラムを１Ｍ ＮａＣｌで洗浄して、非特異的結合構成成分を除去する。結合した抗タウ抗体は、例えば、ｐＨ（約）３．５でクエン酸ナトリウムで溶出され、そして分画を１Ｍのトリス緩衝液で中和する。抗タウ抗体分画が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析的サイズ排除等によって検出され、その後、プールされる。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技法によって効率的に除去することができる。本発明の抗タウ抗体は、一般的な技術を用いて濃縮および／または滅菌濾過される。これらのクロマトグラフィーステップ後の抗体の純度は、９５％を超える。本発明の抗タウ抗体は、−７０℃で即座に凍結され得るか、または４℃で数ヶ月間保管され得る。
抗タウ抗体の結合反応速度および親和性
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００装置（ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋３ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を用いて２５℃準備刺激した）で測定した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、例示した抗タウ抗体（配列番号６８の量ＨＣおよび配列番号６７の両ＬＣを有する）のヒト単量体（例えば、天然または非凝集体）タウおよびヒトタウ凝集体（両者ともに、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有する）の両方への結合を測定する。
記載のものを除き、全ての試薬および材料は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＡＢ（Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。４つ全てのフローセル（ＦＣ）上の（標準ＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを使用して生成された）固定化タンパク質Ａを含有するＣＭ５チップを使用して、捕捉方法を用いる。抗体試料は、ランニング緩衝液中に希釈することによって０．５μｇ／ｍＬに調製する。単量体タウおよびフィブリルタウは、ランニング緩衝液に希釈することによって、２０００、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３、７．８２、３．９１、１．９５、および０（ブランク）ｎＭの濃度に調製する。各分析サイクルは、（１）別々のフローセル（ＦＣ２、ＦＣ３、およびＦＣ４）上の抗体試料の捕捉；（２）５０μＬ／分の速度でそれぞれのＦＣに単量体タウまたはタウフィブリル凝集物の２５０μＬ（３００秒）を注入する；（３）緩衝液フローに２０分間戻って、解離相をモニターする；（４）２５μＬ（３０秒）のグリシン、ｐＨ１．５の注入によるチップ表面の再生；（５）ＨＢＳ−ＥＰ＋の５０μＬ（６０秒）注入によるチップ表面の平衡化からなる。
タウ凝集体への結合のデータを、標準的な二重参照を用いて処理し、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン４．１を用いて１：１結合モデルに適合させて、会合速度（ｋｏｎ、Ｍ−１ｓ−１単位）、解離速度（ｋｏｆｆ、ｓ−１単位）、およびＲｍａｘ（ＲＵ単位）を決定する。ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎの関係から平衡解離定数（ＫＤ）を計算し、これはモル単位によるものである。単量体タウに対する結合のデータは、急速オン速度およびオフ速度のために上記のようにＳＰＲによって正確に決定することはできない。したがって、単量体タウへの結合についてのＫＤは、応答単位に対する抗原の濃度をプロットすることから定常状態結合適合モデルを使用することによって得られる。得られた結合データを表１に示す。
表１：ヒト単量体および凝集体タウの両方へのＳＰＲ結合データ
＊ＫＤ結果は、結果が結合活性の影響に関して正規化されていないため、相対的であると考えられる。
表１によって示される結果は、親和性値がＢｉａｃｏｒｅ分析によって正確に決定され得る（タウ凝集体に対する迅速なオン−およびオフ−レートのために）ように、例示した抗タウ抗体がタウ凝集体に対して有意な結合親和性を有し、かつ単量体タウに対しては測定可能な結合を有さないことを裏付けている。
例示した抗タウ抗体（配列番号６８の両方のＨＣおよび配列番号６７の両方のＬＣを有する）の相対的結合親和性を決定するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、ＡＤ脳ホモジェネートからのタウフィブリルを凝集させる。ＡＤ脳ホモジネートは、ＡＤ患者の脳から約８０ｇの皮質から調製される。簡単に言うと、緩衝液（ＴＢＳ／１ｍＭ ＰＭＳＦ／１Ｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，ｐ／ｎ．１１ ６９７４９８００１）およびホスファターゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ，ｐ／ｎ．７８４２８））を、約１０ｍｌ／１ｇ（組織）でＡＤ脳組織に添加する。組織を、手持ち式Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ Ｐｏｌｙｔｒｏｎを用いて、速度６〜７でホモジナイズする。次いで、Ｐａｒｒ Ｂｏｍｂ（Ｐａｒｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ｐ／ｎ．４６５３）を用いて、１５００ｐｓｉの窒素で３０分間さらにホモジナイズする。ホモジネートを２８，０００ｇ（Ｊ１４ Ｂｅｃｋｍａｎ ｒｏｔｏｒ）で４℃で３０分間遠心分離する。上清を回収し、プールし、セファロース４００ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗの４ｃｍ高ガードカラム上を流して、大きな組織片を除去し、次いで、ＭＣ１結合タウフィブリルを精製するために、２５ｍｌ ＭＣ１−Ａｆｆｉｇｅｌ １０カラムを毎時５０〜６０ｍｌの流速で流す。精製の回収を最大にするために、上清を４℃で１８〜２０時間かけてＭＣ−１カラムを通して再循環させる。ガードカラムを除去し、ＭＣ１カラムを少なくとも４０カラム容量のＴＢＳで洗浄する。次いで、結合したタウ凝集物を２カラム容量の３Ｍ ＫＳＣＮで溶出し、約１ｍｌの分画に集める。各溶出分画中のタンパク質濃度を、マイクロタイタープレートＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによってチェックする。陽性タンパク質レベルを含む分画をプールし、４℃でＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋ）を用いて約２ｍｌに濃縮し、１ＬのＴＢＳに対してＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（１０Ｋ ＭＷＣＯ ３〜１２ｍｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて一晩透析する。ＡＤ脳ホモジネートから精製したタウフィブリル内のタウの濃度を、ＤＡ−９捕捉抗体およびＣＰ２７検出抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。
ＰＢＳ中の精製タウフィブリル（５０μｌ）を、９６ウェルプレート（Ｃｏａｓｔａｒ、ｐ／ｎ．３６９０）を０．７μｇ／ｍｌ総タウに相当する濃度で添加した。プレートを４℃で一晩インキュベートした後、１５０μｌのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、１００μｌのＢＢ３（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｐ／ｎ．６４３）を室温で少なくとも１時間（通常２時間）インキュベートする。ブロッキング後、ブロッキング緩衝液をウェルから除去する。例示した抗タウ抗体（配列番号６８の両方のＨＣおよび配列番号６７の両方のＬＣを有する）を０．２５％カゼイン緩衝液で１０００ｎＭストックに希釈し、次いで２倍希釈で連続的に２３倍に希釈する。５０μｌのストックおよび連続希釈された抗体を別々のウェルに添加し、室温で２時間インキュベートし、その後プレートを２００μｌのＰＢＳＴ／ウェルで４回洗浄する。５０μｌの抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（０．２５％カゼイン緩衝液に１：４０００で希釈）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、プレートを２００μｌのＰＢＳＴ／ウェルで４回洗浄する。５０μｌのＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２を添加し、室温で約１０分間インキュベートする。５０μｌの停止溶液（２ＮのＨ２ＳＯ４）を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍで比色シグナルを測定する。データをＰｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ）プログラムに入力し、ＥＣ５０値を非線形回帰曲線フィットおよびシグモイド用量反応を用いて生成する。結果を表２に示す。
表２精製されたＡＤタウフィブリルへの結合のＥＣ５０の比較
表２に反映されるように、本発明の例示したタウモノクローナル抗体は、精製されたタウフィブリルに対する有意な親和性（ＥＣ５０によって測定される）を示す。
エクスビボ標的捕捉試験
「正常な」固体（最小のタウ凝集を示している）；ＡＤ患者（重度のタウ凝集およびＮＦＴ形成、ならびにアミロイド斑病変を示している）；ＰＤ患者（重度のタウ凝集を示している）から得られたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）脳切片の免疫組織化学染色により、例示的な抗タウ抗体（配列番号６８の両方のＨＣおよび配列番号６７の両方のＬＣを有する）のヒト脳に由来する凝集タウとの結合を決定する。バックグラウンド非特異的染色レベルを決定するために、ヒトタウを有さない「対照」野生型マウスに由来する脳切片についても染色を行う。
ＦＦＰＥ切片は、脱パラフィンされ、再水和される。その後、抗原検索（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ ＰＴモジュールシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを使用）を、切片に対して行い、これは、クエン酸緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｐ／ｎ．ＴＡ−２５０−ＰＭ１Ｘ）中で切片を１００℃で２０分間加熱し、次いでｄＨ２０中で切片を冷却することを含む。次いで、切片を以下の７つのインキュベーション工程（室温で）に暴露する：（１）０．０３％のＨ２Ｏ２中で１０分；（２）ＰＢＳＴ中で希釈された正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ．，ｐ／ｎ．Ｓ−１０００）の１：２０希釈液中で３０分；（３）例示した抗タウ抗体（１ｍｇ／ｍｌに標準化され、次いで、切片とのインキュベーション前にＰＢＳＴで希釈して１：４０００に希釈）チュで６０分；（４）ＰＢＳＴ中の１．１μｇ／ｍｌの濃度で、ウサギ抗ヒトＩｇＧ４（例示した抗体のＦｃ領域に対して産生）中で３０分；（５）ＰＢＳＴ中で希釈されたビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ．，ｐ／ｎ．ＢＡ−１０００）の１：２００希釈液中で３０分；（６）アビジン−ビオチン複合体溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ．，ｐ／ｎ．ＰＫ−７１００）中で３０分；（７）（３，３’−ジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ．，ｐ／ｎ．ＳＫ−４１０５）中で５分。切片は、上記の７つの工程のそれぞれの間でＰＢＳＴを用いて洗浄される。上記の７つのインキュベーション工程の後、切片をヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバースリップさせる。マウス「対照」組織切片については、上記プロトコールを、例示した抗タウ抗体の１：８０００希釈物（１：４０００希釈物とは対照的に）を用いることによってインキュベーション工程（３）で変更され、ならびにインキュベーション工程（４）および（５）を１回の３０分間のＰＢＳＴ中のビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ．，ｐ／ｎ．ＢＡ−３０００）の１：２００希釈で置き換えることによって変更される。
実質的に上記の手順に続いて、例示的した抗タウ抗体のヒトの脳由来のタウに対する結合の分析が行われる。結果を表３に提供する。
表３ＦＦＰＥ ＡＤ脳切片における凝集タウに対する結合の半定量的分析。
表３に示す結果は、例示した抗タウ抗体が対照試料と比較して海馬脳切片においてＡＤ患者およびＰＤ患者の両方からの凝集タウに対する有意に高いレベルの染色を示すことを反映する。さらに、ＡＤおよびＰＤが、タウをコードする遺伝子の明確に区別できるスプライシング変異体を特徴とするために、これらの結果は、例示した抗タウ抗体が、ＡＤおよびＰＤの両方のタウ凝集体に共通のヒトタウのアミノ酸残基７〜９および３１２〜３２２（配列番号７９の例示したヒトタウに基づいて番号付けされた残基）を含む立体配座エピトープに特異的に結合するという結論を支持する。
タウ凝集体伝播のインビボ中和
およそ５ヶ月齢のＰ３０１Ｓマウスからのホモジネート脳幹調製物は、正常な１０週齢の雌Ｐ３０１Ｓマウスの海馬に注射すると、未処置の非凝集タウの凝集を誘導し、タウ凝集の伝播様作用を示すことが知られている。４．５〜５ヶ月齢のＰ３０１Ｓマウスの脳幹組織のホモジネート調製物を、上記と実質的に同じように調製する。
正常な１０週齢の雌Ｐ３０１Ｓマウスに海馬の左半球に５μｌのホモジネート脳調製物および７．５μｇの例示的な抗タウ抗体（配列番号６８の両方ＨＣおよび配列番号６７の両方のＬＣを有する）（Ｎ＝１２）、または７．５μｇの対照ヒトＩｇＧ４抗体（Ｎ＝１１）のいずれかを注射する。注射後４週間、マウスを殺処分し、左右の半球を集め、パラフィン包埋し、６μｍの連続切片をガラススライド上に載せる。ブレグマ（Ａ−Ｐ＝−２．３０）を含むスライドを、脱パラフィンし、包埋組織を再水和し、スライドをクエン酸緩衝液中で１００℃に２０分間加熱することによって、抗原回復を行う。スライドをｄＨ２Ｏ中で冷却し、以下の工程に従って室温でインキュベートする：（ａ）（０．０３％）Ｈ２Ｏ２中で１０分；（ｂ）正常ヤギ血清の１：２０の希釈物中で３０分；（ｃ）ＰＧ−５抗体（ＰＢＳＴ中で希釈）（Ｙｅｓｈｉｖａ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＡｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ医科大学のＰｅｔｅｒ Ｄａｖｉｅｓ博士の実験室から得られたＰＧ−５抗体；ＰＧ−５抗体はリン酸化されると、残基４０９のセリンに特異的に結合し、残基は、配列番号７９の例示したヒトタウに基づいて番号付けされ）の１：８０００希釈物中で６０分；（ｄ）ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＰＢＳＴで希釈）の１：２００希釈液中で３０分；（ｅ）アビジン−ビオチン複合体溶液中で３０分、および（ｆ）３，３’−ジアミノベンジジン中で５分。ＰＢＳＴは、それぞれの工程間の洗浄で使用される。３，３’−ジアミノベンジジン中の５分間のインキュベーション後、切片をヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバースリップさせる。染色シグナルを、Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ ＡＴ Ｓｌｉｄｅ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｐｅｒｉｏ）により倍率２０倍で測定する。ＰＧ−５免疫反応性を定量し、Ｉｍａｇｅｓｃｏｐｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ．１１．１．２．７８０、Ａｐｅｒｉｏ）の陽性ピクセルアルゴリズムを用いてパーセンテージとして表す。結果を表４に提供する。
表４左海馬および右海馬のそれぞれにおける平均％ＰＧ−５免疫反応性。
表４に提供した結果は、例示した抗タウ抗体が対照ＩｇＧ４抗体と比較して、左海馬および右海馬の両方におけるタウ凝集のレベルを低下させることを実証している。示すように、例示した抗タウ抗体は、対照のＩｇＧ４抗体と比較して、左海馬におけるタウ凝集の６０．５％のより大きな減少、および右海馬におけるタウ凝集の６６．５％より大きな減少をそれぞれ生じる。これらの結果は、例示した抗タウ抗体が、タウ凝集の伝播に対する中和活性を有することを実証している。
抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体
遺伝子操作を受けた抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体の発現および精製
本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体（例えば、抗体ＩまたはＩＩ）は、本質的に以下のように発現および精製され得る。配列番号１２または１３のＬＣアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列および配列番号１１のＨＣアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含有するグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）は、電気穿孔によってチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）をトランスフェクトするために使用される。この発現ベクターは、ＳＶ初期（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳの遺伝子をコードする。トランスフェクトした後、細胞は、０〜５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）でのバルク選択を受ける。その後、選択されたバルク細胞またはマスターウェルが無血清懸濁培養で増殖させて、産生で使用される。
抗体が分泌された浄化培地が、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）等の適合性緩衝液で平衡化されたタンパク質Ａ親和性カラムに適用される。このカラムは１Ｍ ＮａＣｌで洗浄して、非特異的結合構成成分を除去する。結合した抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体は、例えば、ｐＨ（約）３．５でクエン酸ナトリウムで溶出され、そして分画を１Ｍのトリス緩衝液で中和する。抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体画分がＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析的サイズ排除等によって検出され、その後、プールされる。本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体（抗体Ｉまたは抗体ＩＩ）は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）または１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（およそｐＨ６）中のいずれかで濃縮される。最終材料は、一般的な技法を使用して滅菌濾過され得る。抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体の純度は、９５％超である。本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体（抗体Ｉまたは抗体ＩＩ）は、−７０℃で即座に凍結され得るか、または４℃で数ヶ月間保管され得る。
抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体の結合親和性および反応速度
抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体（抗体Ｉまたは抗体ＩＩ）のｐＥ３−４２ ＡβペプチドまたはＡβ １−４０ペプチドに対する結合親和性および動態は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。結合親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＣＭＳチップ上に固定化されたタンパク質Ａを介して抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体を捕捉し、２倍連続希釈で１００ｎＭから開始して３．１２５ｎＭまでｐＥ３−４２ ＡβペプチドまたはＡβ１−４０ペプチドを流すことによって測定される。これらの実験は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ１００６６９、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で、２５℃で行われる。
各サイクルについて、抗体は、１０μＬ／分の流量での１０μｇ／ｍＬの濃度の抗体溶液の５μＬ注入により捕捉される。ペプチドは、５０μＬ／分での２５０μＬ注入により結合され、その後１０分間解離される。チップ表面は、１０μＬ／ｍＬの流量でグリシン緩衝液（ｐＨ１．５）の５μＬ注入で再生される。データは、１：１ラングミュア結合モデルに適合され、ｋｏｎおよびｋｏｆｆを導出し、ＫＤを計算する。
本質的に上に記載される手順に従って、以下のパラメータ（表５によって示される）が観察された。
表５抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体の結合親和性および反応速度。
Ａβ １−４０への認識できる結合は検出されず、抗体Ｉおよび抗体ＩＩがＡβ １−４０と比較してｐＥ３−４２ Ａβペプチドに特異的に結合したことを示す。
抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体のエクスビボ標的捕捉
固定したＰＤＡＰＰ脳由来の脳切片におけるエクスビボ標的会合を決定するために、外因的に付加された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体（抗体Ｉまたは抗体ＩＩ）を用いて免疫組織化学的分析を行う。老齢ＰＤＡＰＰマウス（２５ヶ月齢）由来のクリオスタット連続冠状切片を、２０μｇ／ｍＬの本発明の例示のＮ３ｐＧｌｕＡβ抗体（抗体Ｉまたは抗体ＩＩ）とインキュベートする。ヒトＩｇＧに特異的な二次ＨＲＰ試薬を用い、沈着したプラークをＤＡＢ−Ｐｌｕｓ（ＤＡＫＯ）で可視化する。ビオチン化ネズミ３Ｄ６抗体、続いてＳｔｅｐ−ＨＲＰ二次を、陽性対照として使用する。陽性対照抗体（ビオチン化３Ｄ６）は、ＰＤＡＰＰ海馬中のかなりの量の沈着したＡβを標識し、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体（抗体Ｉまたは抗体ＩＩ）は、沈着物のサブセットを標識した。これらの組織学的研究により、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体（抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）がエクスビボで沈着したＡβ標的に会合したことが実証された。
抗Ａβ抗体
例示した抗Ａβ抗体の合成
細胞および抗体。マウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１０％ＦＢＳ（Ｃａｔ＃ＳＨ３２６６１．０３、ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）を含有するＤＭＥ培地中で維持した。マウス２６６ハイブリドーマ細胞を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのグルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で最初に増殖させ、ローラーボトルにおいて、２％低Ｉｇ ＦＢＳ（カタログ番号３０１５１．０３、ＨｙＣｌｏｎｅ）を含有する無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ、Ｃａｔ＃１２０４５−０７６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で２．５リットルの容量まで増殖させた。マウスモノクローナル抗体２６６（Ｍｕ２６６）をプロテインＧセファロースカラムを用いた親和性クロマトグラフィーにより培養上清から精製した。ビオチン化Ｍｕ２６６を、ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｃａｔ＃２１３３８ＺＺ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて調製した。
可変領域ｃＤＮＡのクローニング。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて約１０７個のハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ ｍＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）でポリ（Ａ）＋ＲＮＡを供給元のプロトコールに従って単離した。供給元のプロトコールに従って、ＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。軽鎖および重鎖の可変領域ｃＤＮＡを、それぞれマウスカッパおよびガンマ鎖定常領域にアニールする３’プライマーおよびＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットに提供される５’ユニバーサルプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＶＬ ＰＣＲについては、３’プライマーは以下の配列を有する：
マウスＣｋ領域にハイブリダイズする残基１７〜４６を有する５´−ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ−３´［配列番号５１］。ＶＨ ＰＣＲについては、３’プライマーは変性配列を有する：
マウスガンマ鎖ＣＨＩにハイブリダイズする残基１７〜５０を有する
［配列番号５２］。配列決定のために、ＶＬおよびＶＨ ｃＤＮＡを、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にサブクローニングした。ＤＮＡ配列決定を、製造業者の指示に従って、蛍光ジデオキシ鎖ターミネーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いたＰＣＲサイクル配列決定反応によって行った。配列決定反応は、Ｍｏｄｅｌ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。
ヒト化２６６（Ｈｕ２６６）可変領域の構築。マウス抗体Ｖ領域のヒト化は、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８８）］によって概説されているように行った。Ｍｕ２６６ ＣＤＲのアクセプターとして使用されるヒトＶ領域フレームワークを、配列相同性に基づいて選択した。コンピュータプログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ［Ｌｅｖｉｔｔ、Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５−６２０（１９８３）］を用いて、可変領域の分子モデルを構築した。ＣＤＲと接触すると予測されたヒト化Ｖ領域のアミノ酸を、Ｍｕ２６６の対応する残基で置換させた。これは、重鎖の残基４６、４７、４９、および９８、ならびに軽鎖の残基５１で行った。同じＶ領域サブグループにおいて稀であることが判明したヒト化Ｖ領域のアミノ酸は、免疫原性の可能性を排除するためにコンセンサスアミノ酸に変更された。これは、軽鎖の残基４２および４４で行われた。
軽鎖および重鎖の可変領域遺伝子を構築し、長さ約６５〜８０個の塩基の８つの重複する合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した［Ｈｅ、Ｘ．Ｙ．、ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：０２９−１０３５（１９９８）］。オリゴヌクレオチドを対をなしてアニーリングさせ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で伸長させ、４本の二本鎖断片を得た。得られた断片を変性させ、対をなしてアニールさせ、クレノーで伸長させて２つの断片を得た。これらの断片を変性させ、対をなしてアニールさせ、再び伸長させて完全長の遺伝子を得た。得られた産物をＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ増幅断片をゲル精製し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。配列確認の後、ＶＬおよびＶＨ遺伝子をＭＩｕＩおよびＸｂａＩで消化し、ゲル精製し、軽鎖および重鎖の発現のためのベクターにそれぞれサブクローニングし、ｐＶｋ−Ｈｕ２６６およびｐＶｇ１−Ｈｕ２６６を作製した［Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９−１１５４（１９９２）］。これらのプラスミドから発現された成熟ヒト化２６６抗体（Ｈｕ２６６）は、配列番号４９の軽鎖および配列番号５０の重鎖を有する。
安定なトランスフェクション。マウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０への安定なトランスフェクションは、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を３６０Ｖおよび２５μＦで記載したようにエレクトロポレーションすることにより行った（Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。トランスフェクションの前に、ｐＶｋ−Ｈｕ２６６およびｐＶｇ１−Ｈｕ２６６プラスミドＤＮＡを、ＦｓｐＩを用いて線状化した。およそ１０７個のＳｐ２／０細胞を、２０ｇのｐＶｋ−Ｈｕ２６６および４０μｇのｐＶｇ１−Ｈｕ２６６でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥ培地に懸濁させ、いくつかの９６ウェルプレートにプレーティングした。４８時間後、選択培地（１０％のＦＢＳ、ＨＴ培地補充物、０．３ｍｇ／ｍｌキサンチン、および１μｇ／ｍｌのミコフェノール酸を含むＤＭＥ培地）を塗布した。選択開始約１０日後、培養上清を以下に示すようにＥＬＩＳＡにより抗体産生についてアッセイした。高収量クローンを１０％のＦＢＳを含むＤＭＥ培地で増殖させ、さらに抗体発現について分析した。次いで、選択されたクローンを、ハイブリドーマＳＦＭにおける増殖に適合させた。
ＥＬＩＳＡによる抗体発現の測定。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏプレート、Ｃａｔ＃４３９４５４、ＮａｌｇｅＮｕｎｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、Ｉｌｌ．）のウェルを、０．２Ｍの炭酸ナトリウム−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４）中の１００μｌの１μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的ポリクローナル抗体（Ｃａｔ＃ １０９−００５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で、４℃で一晩コーティングした。Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄した後、ウェルを４００μｌのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ＃３７５３５、Ｐｉｅｒｃｅ）で３０分間ブロックし、次いでＷａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。Ｈｕ２６６を含有する試料をＥＬＩＳＡ緩衝液（１％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）中で適切に希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（１００μｌ／ウェル）に適用した。標準として、ヒト化抗ＣＤ３３ ＩｇＧ１モノクローナル抗体ＨｕＭ１９５（Ｃｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９２、上記）を使用した。ＥＬＩＳＡプレートを室温で２時間インキュベートし、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、ＥＬＩＳＡ緩衝液中の１００μｌの１／１，０００希釈ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトカッパポリクローナル抗体（Ｃａｔ＃１０５０−０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を各ウェルに適用した。室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄した後、１００μｌのＡＢＴＳ基質（Ｃａｔ＃５０７６０２および５０６５０２、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を各ウェルに添加した。ウェルあたり１００μｌの２％のシュウ酸を添加することによって、発色を停止させた。吸光度は、ＯＰＴＩｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて４１５ｎｍで読み取った。
Ｈｕ２６６のの精製。高Ｈｕ２６６発現Ｓｐ２／０の安定トランスフェクタント（クローン１Ｄ９）のうちの１つを、ハイブリドーマＳＦＭ中での増殖に適合させ、ローラーボトル中で２リットルまで増殖させた。細胞生存率が１０％以下に達したときに、使用済み培養上清を回収し、プロテインＡセファロースカラムに充填した。抗体を０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）、０．１ＭのＮａＣｌで溶出する前にカラムをＰＢＳで洗浄した。溶出したタンパク質を、２リットルのＰＢＳの３回の交換に対して透析し、０．２μｍのフィルターで濾過してから、４℃で保存した。抗体濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した（１ｍｇ／ｍｌ＝１．４Ａ２８０）。トリス−グリシン緩衝液中のＳＤＳ−ＰＡＧＥを、４〜２０％勾配ゲル（Ｃａｔ＃ＥＣ６０２５、Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の標準手順に従って実施した。精製されたヒト化２６６抗体を還元し、ＳＤＳＰＡＧＥゲル上に移動させた。全抗体は、およそ分子量２５ｋＤａおよび５０ｋＤａの２つのバンドを示す。これらの結果は、それらのアミノ酸組成から計算された軽鎖および重鎖または重鎖断片の分子量と一致する。
例示的な抗Ａβ抗体のインビトロ結合特性
上記のように合成および精製したヒト化２６６抗体（Ｈｕ２６６）の結合効力を、比較ＥＬＩＳＡにおいてビオチン化マウス２６６抗体を用いてマウス２６６抗体（Ｍｕ２６６）と比較した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ免疫プレート、カタログ番号４３９４５４、ＮａｌｇｅＮｕｎｃ）のウェルを、０．２Ｍの炭酸ナトリウム／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４）中のＢＳＡに抱合体した１００μｌのβ−アミロイドペプチド（１〜４２）（１０μｇ／ｍＬ）と共に４℃で一晩インキュベートした。７．５ｍｇのＡβ１〜４２−Ｃｙｓ４３（Ｃ末端システインＡβ１〜４２、ＡｎａＳｐｅｃ）を、５００μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、次いで直ちに１，５００μＬの蒸留水を加えることにより、Ａβ１〜４２−ＢＳＡ抱合体を調製した。マレイミド活性化ウシ血清アルブミン（Ｐｉｅｒｃｅ）の２ミリグラムを、蒸留水２００μＬ中に溶解した。２つの溶液を合わせて、完全に混合し、室温で２時間放置させた。ゲルクロマトグラフィーカラムを使用して、未反応ペプチドをＡβ１〜４２−Ｃｙｓ−ＢＳＡ抱合体から分離した。
ＥＬＩＳＡプレート洗浄器を使用して０．１％のＴｗｅｅｎ２０（Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でウェルを洗浄した後、ウェル当たり３００μＬのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加することによって、ウェルをブロックした。ブロッキングの３０分後、ウェルを洗浄し、過剰の液体を除去した。
ＥＬＩＳＡ緩衝液中のビオチン化Ｍｕ２６６（０．３μｇ／ｍｌの最終濃度）および競合抗体（Ｍｕ２６６またはＨｕ２６６；７５０μｇ／ｍｌ最終濃度および連続３倍希釈開始）の混合物を、ウェル当たり１００μｌの最終容量で三通りで添加した。非競合対照として、０．３μｇ／ｍｌのビオチン化Ｍｕ２６６の１００μｌを添加した。バックグラウンド対照として、１００μｌのＥＬＩＳＡ緩衝液を添加した。ＥＬＩＳＡプレートを室温で９０分間インキュベートした。 Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒでウェルを洗浄した後、１μｇ／ｍｌの ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｃａｔ＃２１１２４、Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌを各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間インキュベートし、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した。発色のために、１００μｌ／ウェルのＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。１００μｌ／ウェルの２％シュウ酸を添加することによって、発色を停止させた。吸光度を４１５ｎｍで読み取った。吸光度を競合物濃度の対数に対してプロットし、曲線をデータ点に適合させ（Ｐｒｉｓｍを用いて）、当技術分野で周知の方法を用いて、各抗体についてＩＣ５０を決定した。
マウス２６６についての平均ＩＣ５０は、４．７μｇ／ｍＬ（３回の別々の実験、標準偏差＝１．３μｇ／ｍＬ）であって、ヒト化２６６については、７．５μｇ／ｍＬ（３回の別々の実験、標準偏差＝１．１μｇ／ｍＬ）であった。３回の実験の第２のセットを、本質的に上記のように行い、マウス２６６についての平均ＩＣ５０は３．８７μｇ／ｍＬ（ＳＤ＝０．１２μｇ／ｍＬ）であると測定され、ヒト２６６については、ＩＣ５０は４．０μｇ／ｍＬ（ＳＤ＝０．５μｇ／ｍＬ）であると測定された。これらの結果に基づいて、ヒト化２６６は、マウス抗体２６６のものと非常に類似した結合特性を有すると結論付ける。したがって、我々は、ヒト化２６６がマウス２６６と比較して非常に類似したインビトロおよびインビボ活性を有し、マウスにおいてマウス２６６によって示されたのと同じ効果をヒトにおいて示すことを期待する。
Ａβ１〜４２に対して上記のように合成および精製されたヒト化２６６抗体の親和性（ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ）を、本質的に上記のように決定した。上記の方法を用いて、Ａβ１〜４２に対するヒト化２６６の親和性は４ｐＭであることが判明した。
ヒト体液中に添加されたＡβペプチドの封鎖
ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）（５０μｌ）およびヒト血漿（５０μｌ）の試料を以下のように室温で１時間インキュベートした：
１．単独；
２．５ｎｇのＡβ４０ペプチドと共に；または
３．５ｎｇのＡβ４０ペプチド＋１ｍｇのモノクローナル抗体２６６（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７６６，８４６号に記載されている）。
次いで、試料を４〜２５％の非変性勾配ゲル、すなわち非変性勾配電気泳動（ＮＤＧＧＥ）で電気泳動し、ニトロセルロースに移した。次いで、ブロットをＰｏｎｃｅａｕ Ｓで染色し、またはウェスタンブロットについては、Ａβペプチドの最初の５つのアミノ酸に対して向けられるビオチン標識モノクローナル抗体（３Ｄ６）でプローブされ、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼで発色させて、増強された化学発光（ＥＣＬ）によって検出された。ブロット上のバンドに含まれる材料の水和直径をファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）分子量マーカーを用いて推定した。したがって、Ａβペプチドが他の分子に結合する場合、それは得られる複合体のサイズで移動するであろう。
５ｎｇのＡβペプチドの有無にかかわらず、ＣＳＦのウェスタンブロットは、抗体３Ｄ６によって媒介される検出に応答するＡβペプチドの証拠を示さない。ヒト血漿についても同様の結果が得られる。これは、ＡβペプチドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出され、続いて同じ技術を用いてかつ同じＣＳＦ試料においてウェスタンブロットによって検出され得るという事実にもかかわらず、真実であった。おそらく、Ａβペプチドの検出は、このペプチドと試験された体液中の他の因子との間の相互作用によって妨害された。しかし、Ｍａｂ２６６をインキュベーションに添加すると、抗体と複合体を形成した封鎖されたＡβペプチドを表す特徴的なバンドが、血漿およびＣＳＦの両方に存在する。主要なバンドは約１１ｎｍの水和直径であり、抗体二量体に相当する１３ｎｍでさらに小さなバンドを有する抗体単量体に相当する。
封鎖抗体の特異性
５０μｌのヒトＣＳＦまたは１０μｌのＡＰＰＶ７１７Ｆ ＣＳＦを含有する試料を使用した。ＡＰＰ Ｖ７１７Ｆは、家族性アルツハイマー病突然変異を有するヒトアミロイド前駆体タンパク質導入遺伝子が発現され、中枢神経系におけるヒトＡβペプチドの産生をもたらす、アルツハイマー病のマウスモデルを表すトランスジェニックマウスである。
試料を種々のＭａｂ（１μｇ）の有る無しで室温で１時間インキュベートし、次いで４〜２５％ＮＤＧＧＥ上で電気泳動し、上記のようにニトロセルロース上にブロットした（ヒトの体液中に添加されたＡβペプチドを封鎖する）。抗体は以下の通りであった：
Ｍａｂ ２６６（１３〜２８位に結合する）；
Ｍａｂ ４Ｇ８（１７〜２４位に結合する）；
ＱＣＢｐａｎ（１〜４０位に対するウサギポリクローナル）；
マウスＩｇＧ（非特異的）；
Ｍａｂ ３Ｄ６（１〜５位に結合する）；
Ｍａｂ ２１Ｆ１２（３３〜４２位に結合する）：
Ｍａｂ ６Ｅ１０（１〜１７位に結合する）；および
ＱＣＢ４０、４２（Ａβ４０およびＡβ４２に対するウサギポリクローナル）。
Ａβペプチド抗体複合体の検出は、上記の通りであった（ヒトの体液中に添加されたＡβペプチドの封鎖において）。Ｍａｂ ２６６とインキュベートしたヒトＣＳＦ中の同様の検出は、いくつかの例ではＡβペプチドのカルボキシル末端に結合するＱＣＢ４０、４２ を３Ｄ６に置き換えた。
これらの結果は、試験した抗体のうち、Ｍａｂ ４Ｇ８およびＭａｂ ２６６のみがＡβペプチドの検出を可能にすることを示した。
これらの結果は、ヒトＣＳＦについて、Ｍａｂ ２６６およびＭａｂ ４Ｇ８のみが検出可能な量の抗体Ａβ複合体を封鎖することができたことを示した（これもまた、抗体なしでは、Ａβは検出されない）。Ｍａｂ ２６６はまた、ＡＰＰＶ７１７Ｆ トランスジェニックマウス由来のＣＳＦを用いて、ヒトＣＳＦで得られたものと同様の結果を生じさせることができた。Ａβペプチドは、３Ｄ６またはＱＣＢ４０、４２抗体がウェスタンブロットを顕色するために使用されたかどうかにかかわらず、Ｍａｂ ２６６を用いてヒトＣＳＦ中に封鎖され得る。
インビボでのＡβペプチドの封鎖
Ａ．ＰＤＡＰＰとも呼ばれる、トランスジェニックＡＰＰＶ７１７Ｆマウスは、ヒトＡＰＰタンパク質の変異型を過剰発現する。これらのマウスは、ＣＮＳにおいてヒトＡβを産生し、ＣＳＦおよび血漿中を循環するヒトＡβペプチドのレベル上昇を有する。８ヶ月齢のマウスに、生理食塩水または１００μｇのＭａｂ ２６６を静脈注射した。これらは、最初の注射から１０分後に、そして最初の注射後に２０時間後に再び採血した。
各動物由来の血漿２０μｌを含有する試料を、上述のように抗体３Ｄ６を用いたＮＤＧＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した（ヒト体液中に添加されたＡβの封鎖）。生理食塩水を注射した動物は、特徴的な１１ｎｍの封鎖されたＡβペプチドバンドの存在を、１０分後または２０時間後のいずれでも示さなかった。しかし、Ｍａｂ ２６６を注射した２匹の動物は、２０時間後にこのバンドの出現を示した。
Ｂ．２ヶ月齢のＡＰＰＶ７１７Ｆマウスをこの試験で使用した。０日目に、マウスには、Ｍａｂ ２６６を投与しなかったか、１ｍｇ Ｍａｂ ２６６、または１００μｇのこの抗体を投与した。血漿試料を、抗体の投与の２日前、および１、３、５お、よび７日目に採取した。血漿試料をＮＤＧＧＥ、続いてウエスタンブロッティングにかけ、上述したように３Ｄ６を用いた検出にかけた（ヒト血清中に添加されたＡβペプチドの封鎖）。Ｍａｂ ２６６の投与後の全ての時点で、血漿試料を免疫グロブリンに結合するプロテインＧで処理しない限り、従ってＭａｂ ２６６を効果的に除去しない限り、２６６／Ａβ複合体が検出された。試験した期間にわたって一貫したレベルの複合体が、１００μｇのＭａｂ ２６６を注射した動物における７日目のわずかな低下を除いて見出され、一般に、１００μｇを投与された動物のレベルは、この抗体１ｍｇを投与されたマウスにおいて見出されたレベルよりも一貫して低かった。
Ｃ．２ヶ月齢のＡＰＰＶ７１７Ｆマウスに、１ｍｇのＭａｂ ２６６を静脈内投与し、２５μｌの血漿試料をそれぞれ採取した。ビオチン化された３Ｄ６との結合に続いてストレプトアビジン１２５Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）での検出およびリン光イメージングスクリーニングへの暴露を除いて、上記のように血漿試料をＮＤＧＧＥ、続いてウェスタンブロットにかけた。複合体のレベルは、Ｍａｂ ２６６の飽和レベルとのＡβ４０複合体の既知の量を用いて、標準曲線と比較して推定され、同様に検出された。Ｍａｂ ２６６に結合したＡβペプチドの量は、約１００ｎｇ／ｍｌと推定され、これは約１００ｐｇ／ｍｌであると決定されたこれらのマウスの内因性Ａβペプチドに対して約１，０００倍の増加を表す。これはまた、Ａβ沈着前のＡＰＰ Ｖ７１７Ｆ脳におけるＡβペプチドのレベル（５０〜１００ｎｇ／ｇ）と同様であり、ＡＰＰＶ７１７Ｆ ＴｇマウスにおけるヒトＡβＰおよびヒトＡβは、脳内でほぼ単独で産生される。したがって、血漿中のＭａｂ ２６６の存在は、ＣＮＳから血漿中へのＡβペプチドの正味の排出を促進するＡβペプチドシンクとして作用するようである。この増加した正味の流出は、ＣＮＳから血漿へのＡβ流出の増加と、血漿中のＡβの脳への再流入を防止することの両方に起因する可能性が高い。
封鎖されたＡβペプチドの正しいサイズは、１ｍｇのＭａｂ ２６６の注射から２４時間後にＡＰＰＶ７１７Ｆマウスから得られた血漿試料２０μＬを、トリス−トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を流し、続いてタンパク質Ｇ結合ビーズを用いるタンパク質Ｇ曝露の前に、またはその後に、抗Ａβ抗体６Ｅ１０を用いてウェスタンブロッっティングすることによって確認した。タンパク質Ｇによって枯渇したバンドが４〜８ｋＤで検出され、Ａβペプチドの単量体および場合によっては二量体の存在と一致した。
Ｄ．２ヶ月齢のＡＰＰＶ７１７Ｆマウスを、ＰＢＳ（ｎ＝７）または５００μｇビオチン化Ｍａｂ ２６６−すなわち−ｍ２６６Ｂ（ｎ＝９）のいずれかで腹腔内処置した。注射の前および２４時間後の両方で、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）．９４：１５５０−１５５５；およびＢａｌｅｓ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ（１９９７）１７：２６３−２６４のＥＬＩＳＡ法の改良例を用いて、血漿を総Ａβペプチドについて分析した。ｍ２６６Ｂに結合した総Ａβを、ｍ３Ｄ６でコーティングした９６ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅｓ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。希釈した血漿試料および標準（Ａβ４０およびｍ２６６Ｂの様々な濃度）を、コーティングしたプレート中で一晩インキュベートし、総Ａβ／ｍ２６６Ｂ複合体の量を、１２５Ｉ−ストレプトアビジンを用いて決定した。加えて、２４時間の時点で、血漿試料を先ずタンパク質Ｇで処理して、Ｍａｂ ２６６に結合していないＡβペプチドを定量し、そしてＣＳＦ中のＡβ合計およびＡβ２４２をＥＬＩＳＡによって決定したＰＢＳを注射した動物では、血漿Ａβペプチドレベルは、注射前後のいずれにおいても１４０ｐｇ／ｍｌであった。血漿レベルは、注射前のＭａｂ ２６６注射マウスにおいて同様であったが、注射後２４時間でＭａｂ ２６６に結合しなかったＡβペプチドレベルは検出不可能であった。
ＣＳＦ中のレベルも測定され、ＣＳＦはＣＮＳ内の細胞外区画を表し、ＣＳＦ中の分子の濃度は、脳の細胞外空間内の物質の濃度をある程度反映する。ＣＳＦを大槽区画から単離した。マウスをペントバルビタールで麻酔し、頭蓋骨の基部から最初の椎骨までの筋肉を除去した。ＣＳＦは、解剖顕微鏡下で微小針で槽を覆うクモ膜を注意深く穿刺し、ＣＳＦをポリプロピレンマイクロピペットに回収することによって収集した。注射後２４時間で、のＭａｂ ２６６を注射したマウスのＣＳＦにおける総Ａβペプチドの増加が見出され、そしてＰＢＳを注射したマウスと比較して、Ａβ４２における約２倍の増加がＣＳＦ中で得られた。これは、変性ゲル電気泳動、続いてＡβ４２特異的抗体２１Ｆ１２を用いたウエスタンブロッティングを用いて確認した。
追加の実験では、３ヶ月齢のＡＰＰＶ７１７Ｆ Ｔｇマウスに、ＰＢＳまたはＭａｂ ２６６をのいずれかを静脈内注射し、ＣＳＦ中のＡβ４０およびＡβ４２レベルの両方を、以下の通りに評価した。
Ａβ４０の測定については、Ａβ４０に特異的なモノクローナル抗体ｍ２Ｇ３を利用した。記載されたＥＬＩＳＡ（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）９４：１５５０−１５５５）を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ試薬を１２５Ｉ−ストレプトアビジンで置き換えることにより、ＲＩＡに改良した。血漿およびＣＳＦ試料については、緩衝液中にグアニジンを含まない非変性条件下で手順を実施した。脳ホモジネート中のカーボネート可溶性および不溶性Ａβの評価については、試料を１００ｍＭの炭酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ１１．５（４℃）でホモジナイズし、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離し、（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）９４：１５５０−１５５５）に記載され、上記列挙のように、Ａβを上清（可溶性）およびペレット（不溶性）分画で評価した。血漿中のＡβ／Ｍａｂ ２６６複合体の測定は、改変ＲＩＡによって行った。マウスにビオチン化Ｍａｂ ２６６（Ｍａｂ ２６６Ｂ）を注射し、血漿を複数の時点で単離した。Ｍａｂ ２６６に結合した総Ａβを、ｍ３Ｄ６でコーティングした９６ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅｓ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。希釈した血漿試料および標準（Ａβ４０およびＭａｂ ２６６Ｂの様々な濃度）を、コーティングしたプレート中で一晩インキュベートし、総Ａβ／Ｍａｂ ２６６Ｂ複合体の量を、１２５１Ｉ−ストレプトアビジンを用いて決定した。
Ｍａｂ ２６６の静脈内注射の３時間後には、ＣＳＦのＡβ４０レベルの２倍の増加があり、Ａβ４２では有意な増加はなかった。しかし、両方の２４および７２時間の時点で、ＣＳＦ中のＡβ４０およびＡβ４２の両方で２倍から３倍の増加があった。同様な結果が、変性ゲル分析、続いてプールされたＣＳＦのＡβウエスタンブロッティングを用いて得られた。ＣＳＦレベルによってある程度反映された脳間質液を介したＡβの流出は、ＣＳＦのＡβの観察された増加を説明すると考えられる。
Ｍａｂ ２６６の０．１％未満の血漿レベルである注入２４時間後のレベルが変化を説明するには不十分であるため、ＣＳＦのＡβペプチドレベルの変化が、ＣＳＦへのＭａｂ ２６６の侵入によるものではあり得ないことが重要である。これらの結果は、血流中の抗体の存在によってＡβペプチドが脳実質からＣＳＦ中に回収されることを示唆している。
ＰＢＳまたは炭酸緩衝液に可溶性であるＡβペプチドの形態を、Ｍａｂ ２６６を注射した同じマウスの大脳皮質ホモジネート中で測定し、ＣＳＦを上記のように分析した。皮質ホモジネートにおけるこれらの可溶性形態の同様の増加が観察された。
脳内のＡβに及ぼすＭａｂ ２６６の効果
４ヶ月齢のＡＰＰＶ７１７Ｆ＋／＋マウスを、生理食塩水、Ｍａｂ ２６６（５００μｇ）、または対照マウスＩｇＧ（１００μｇ、Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）のＩＰ注射で２週間ごとに５ヶ月間処置した。マウスを９ヶ月齢で殺処分し、皮質におけるＡβ沈着を測定した。ウサギｐａｎ−Ａβ抗体（ＱＣＢ，Ｉｎｃ．）で同定されたＡβ免疫反応性によってカバーされた％面積を、Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２０００）９７：２８９２−２８９７によって記載されたように、背側海馬のすぐ上にある皮質において定量化した。この年齢では、各群の約半数がまだＡβ沈着を発症し始めていない。しかしながら、皮質中の＞５０％のＡβ負荷を有するマウスの％は、２６６処置群において有意に少なかった（ｐ＝０．０２、カイ二乗検定）。ＡＰＰＶ７１７Ｆマウスは、９ヶ月までに大量のＡβ沈着物を発生させ得るが、沈着物を示さない約５０％および実質沈着物を示す約５０％で大きな変動性がある。ＰＢＳおよびＩｇＧで処理した動物では、６／１４および５／１３のマウスが、５０％超のＡβ染色によってカバーされた皮質を有し、Ｍａｂ ２６６で処置された１４匹のマウスのうちの１匹のみがこのレベルの染色を有した。全ての群の動物のほぼ５０％は、９ヶ月齢までにＡβ沈着をまだ発症していなかった。後者は、試験された全てのマウスがＡＰＰＶ７１７Ｆ＋／＋であることが確認されたにもかかわらず、高レベルのＡβ沈着が４／８の交配対に由来するマウスにおいてのみ観察されたため（高病理同腹子）、コホートにおける個々のマウスの親の起源に起因するようである。他の４匹の交配対に由来するマウスは、Ａβ沈着物を実質的に含まなかった（低病理同腹子）。共変量としての親の起源を用いると、Ｍａｂ ２６６がＡβ沈着を減少させる強力で有意な効果があった（ｐ＝０．００８２）。
ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片
ネズミ２６６およびヒト化１Ａ１ Ｆａｂ類似体の精製
「２６６」（ｍ２６６）と命名されたマウスモノクローナル抗体は、最初にヒトＡβペプチドの残基１３〜２８からなるペプチドで免疫化することによって調製され、ｍ２６６のＦａｂ断片を（ｍ２６６−Ｆａｂ）と命名する。この抗体は、このペプチドと免疫反応することが確認されている。ｍ２６６の調製は以前に記載されている（例えば、米国特許第８，０６６，９９９号および同第７，１９５，７６１号を参照）。ｍ２６６−ＦａｂにＰＥＧ分子を共有結合させるために、Ｆａｂを突然変異させて、重鎖可変部のＣＤＲ２（Ｎ５６Ｃ）にシステイン残基を導入し、以下に示すような（インビトロでのＰＥＧ化および特性化）方法でＰＥＧ化することができる。ここでの例は、マウス系で行われた実験を記載しているので、ネズミモノクローナル抗体および抗体断片の使用は満足のいくものである。しかし、ヒトの使用を意図した本発明の治療方法では、本発明の抗体および抗体断片のヒト化形態が好ましい。以下の実施例で言及される抗Ａβ抗体断片、１Ａ１−Ｆａｂは、配列番号５３のＬＣＶＲおよび配列番号５４のＨＣＶＲを含むヒト化抗体Ｆａｂ断片である。
ｍ２６６−Ｆａｂまたはヒト化１Ａ１ Ｆａｂおよび類似体でトランスフェクトされた細胞からの培養上清を、陽イオン交換クロマトグラフィー、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーからなる２段階クロマトグラフィーストラテジーを使用して精製する。採取後、培養上清をＴＦＦを用いて濃縮し、２０倍過剰量の１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５に対して、４℃で一晩透析する。沈殿物を遠心分離によって除去し、上清を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５を充填したＳＰセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の充填床に充填する。約９０〜１１０ｍＭのＮａＣｌで溶出されるまで、連続してより多量のＮａＣｌを含有する１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５でカラムを洗浄する。活性Ｆａｂを含有するカラム分画を特定し、プールする。遠心濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて容量を減らし、緩衝液（ＰＢＳ）交換する。最終容量を１３ｍｌに調整し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイジングカラムに充填する。約５０ｋＤで溶出するＦａｂ含有分画を特定し、さらなる特性化およびＰＥＧ化のためにプールする。
インビトロでのＰＥＧ化および特性化
細胞培養物から精製された１Ａ１−Ｆａｂ上のＮ５６Ｃシステインを、ＰＥＧ化のためにブロックする。ＰｉｅｒｃｅのＲｅｄｕｃｅ−Ｉｍｍ（商標）固定化還元剤ビーズを使用して、Ｎ５６Ｃシステインを選択的に還元する。還元剤ビーズは、製造業者によって提供されたカラムから抽出され、バッチモードで使用される。〜４ｍｌのビーズを、Ｒｅｄｕｃｅ−ＩＭＭ平衡化緩衝液＃１（リン酸ナトリウム＋ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中の１０ｍＭのＤＴＴ８ｍＬで３０分間、最初に活性化する。次いで、このビーズをＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＳ ｐＨ７．４中の１．７ｍｇ／ｍｌの１Ａ１Ｎ５６Ｃ Ｆａｂの１８ｍｌをビーズに添加し、１０ｍＭのＥＤＴＡを混合物に添加する。混合物を回転させ、室温で４〜５時間インキュベートする。ＦａｂをＨａｎｄｅｅ（商標）樹脂分離器を用いてビーズから分離させ、ビーズをＰＢＳで洗浄する。Ｆａｂおよび洗浄液を合わせ、５倍モル過剰のＰＥＧ−マレイミド（ＮＯＦからの２０ｋＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏからの１０ｋＰＥＧ；ＮｅｋｔａｒからのＳｋＰＥＧ）と１時間反応させる。反応混合物を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０の４Ｌに対して透析し、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０で平衡化したＳＰセファロースカラムでＦａｂおよびＦａｂ−ＰＥＧを捕捉できるようにする。未反応ＦａｂおよびＦａｂ−ＰＥＧを塩勾配で溶出させる。これらは、５０ｍＭ〜７０ｍＭのＮａＣｌで溶出される。このタンパク質を、移動相としてＰＢＳを含むサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりさらに精製する。還元反応は拡大縮小することができる。同様の方法を用いて、ＰＥＧ化マウス２６６ Ｆａｂ Ｎ５６Ｃを調製することができる。
試料をサイズ排除クロマトグラフィーで分析して、ＦａｂへのＰＥＧの添加を確認する。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＴＳＫ Ｇ３０００ＰＷ ＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カラムを用いて行う。このカラムは、２１４ｎｍで操作するＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００シリーズ分析用ＨＰＬＣを使用して、ｐＨ７．４の０．３５ＭのＮａＣｌを加えたＰＢＳを用いて０．５ｍｌ／分で流す。さらに、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。１０μｇの精製物質を、４〜１２％のＮｕＰａｇｅ（登録商標）ビス−トリスゲルに充填し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色する。
ＰＤＡＰＰマウスにおける１Ａ１−Ｆａｂ ＰＥＧ皮下ＰＫ／ＰＤ試験
抗体断片および抗体断片−Ａβ複合体の薬物動態／薬力学的血漿応答を検討するために、若年（３ヶ月齢）のトランスジェニックＰＤＡＰＰマウスで試験を行う。ヒト化１Ａ１−Ｆａｂ；１Ａ１−Ｆａｂ＋ＳＫＤ ＰＥＧ；１Ａ１−Ｆａｂ＋１０ＫＤ ＰＥＧ；および１Ａ１−Ｆａｂ＋２０ＫＤ ＰＥＧを含むいくつかの抗体断片が検討されている。
ＰＤＡＰＰ＋／−マウスに１ｍｇ／ｋｇのそれぞれの抗体断片を皮下注射し、続いて抗体断片注射群に応じて異なる時点で血漿を単離する。様々な注入群には以下の時点が使用される：
１Ａ１−Ｆａｂは、投与後１、４、８、１２、１８、２４、および４８時間に採血する。
１Ａ１−Ｆａｂ＋５ＫＤ ＰＥＧは、投与後１、４、８、２４、４８、９６、および１６８時間に採血する
１Ａ１−Ｆａｂ＋１０ＫＤ ＰＥＧは、投与後１、４、８、２４、４８、９６、および１６８時間に採血する
１Ａ１−Ｆａｂ＋２０ＫＤ ＰＥＧは、投与後１、８、２４、４８、９６、１６８、および２４０時間に採血する
各時点で注射群ごとに合計５匹の動物を分析する。得られた血漿試料を小分けし、−８０度で保存する。
ＡＦａｂ ＰＫ分析のための方法論
１Ａ１ Ｆａｂについての血漿１Ａ１ Ｆａｂ濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて決定する。プレートをヤギ抗ヒトＩｇＧカッパ標準でコーティングし、対照試料、および試験試料をプレートに添加し、次いで室温で１時間インキュベートする。ヤギ抗ヒトＩｇＧを検出、続いて比色分析用のＯＰＤに用いる。Ａ７００の参照値を用いて、Ａ４９３の吸光度でプレートを読み取る。
血漿試料からの濃度は、４／５パラメータアルゴリズムを用いてマウス血漿中の既知量の１Ａ１ Ｆａｂを用いて調製した標準曲線から決定し、ＦａｂおよびＦａｂ−５Ｋ ＰＥＧアッセイの範囲は０．００３〜０．３μｇ／ｍＬであり、Ｆａｂ−１０Ｋ ＰＥＧアッセイの範囲は、０．００６〜０．２および０．０４〜０．４μｇ／ｍＬであり、Ｆａｂ ２０Ｋ ＰＥＧアッセイの範囲は、０．０２〜０．４および０．０４〜０．４μｇ／ｍＬである。結果は、ＰＥＧ分子の添加およびＰＥＧ分子のサイズの増加が、非ＰＥＧ化１Ａ１ Ｆａｂ（２４時間後に検出不能）と比較して、血漿中のＰＥＧ化Ｆａｂの保持を増加させることを示す（２０ＫのＰＥ化１Ａ１ Ｆａｂについて９６時間後に７７ｎｇ／ｍｌ）。
Ｂ．１Ａ１Ａβ ＥＬＩＳＡアッセイ
このＥＬＩＳＡは、ｍ２６６に関して上述したものと本質的に同じである。試料希釈液に血漿を希釈することによって試料を調製して、次の：２０％の血漿、０．５Ｍのグアニジン、５ｍＭのトリスｐＨ ８．０、０．５×プロテアーゼ阻害剤カクテル、２０μｇ／ｍｌ １Ａ１、およびＰＢＳを得る。これらのアッセイで測定されるＡβペプチドは、完全長Ａβ１〜４０またはＡβ１〜４２である。比色の進行は、６５０ｎｍで１５、３０、および６０分でモニターされる。結果を以下の表６に示す。
表６：薬力学的結果：Ａβ４０に対する平均血漿濃度（ｐｇ／ｍｌ）
表６からのデータは、ＰＥＧ分子に共有結合したヒト化Ｆａｂが、抗体断片−抗原複合体が長期間にわたり血漿循環中に蓄積するのを防止しながら、柔軟な投薬スケジュールを可能にする理想的なＰＫ／ＰＤプロファイルを提供することを実証している。
ＫｉｎＥｘＡによる平衡定数の測定
ＫｉｎＥｘＡ分析は、抗原Ｆａｂ複合体の緩慢なオフ速度に起因する平衡結合分析による結合親和性を測定するための直交アプローチとして使用される。ＫｉｎＥｘＡ ３０００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔ．Ｉｎｃ．）を用いて結合動力学を測定する。簡潔に言うと、抗原はセファロースビーズに共有結合され、遊離Ｆａｂ／Ｆａｂ−ＰＥＧのビーズへの結合が機器上で検出される。Ｋｄを測定するために、連続的に希釈された抗原ヒト可溶性Ａベータ（１〜４０）（０〜１０ｎＭ）を減少させたＦａｂ／Ｆａｂ−ＰＥＧ（１Ａ１−Ｆａｂ−２０ｋＰＥＧについては２０ｐＭまたは５００ｐＭ、１Ａ１Ｆａｂについては５ｐＭまたは５０ｐＭ）を、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢＳ中、３７℃で３０〜５０時間インキュベートして、平衡達成を確実にする。インキュベーション後、各平衡試料中の遊離のＦａｂ／Ｆａｂ−ＰＥＧを、ＫｉｎＥｘＡ ３０００上で製造業者の指示に従って測定する。Ｋｄ値は、ＫｉｎＥｘＡ ３０００ソフトウェアを用いたｎ−曲線分析によって決定される。これらの結果は、１Ａ１ Ｆａｂが、ｍ２６６ Ｆａｂ（２４０ｐＭ）に比べて〜１０倍高い親和性で、強固にヒトＡβ（１９ｐＭ）に結合することを実証している。加えて、Ｎ５６Ｃ部位における２０Ｋ ＰＥＧの共有結合は、１Ａ１−Ｆａｂ（１２ｐＭ）の親和性に影響を与えない。
細胞ベースのＥＬＩＳＡを用いたアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）結合分析
Ａベータ前駆体ＡＰＰを用いた２６６ Ｆａｂｓ／ｍＡｂの交差反応性を評価するために、ＡＰＰを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞（ａａ １〜７５１）を使用する。これらの細胞は、ＡＰＰ（１〜７５１）遺伝子をネオマイシン耐性マーカーを含有するプラスミドにクローニングすることによって作製される。組換えプラスミドをＨＥＫ２９３にトランスフェクトし、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を選択して、過剰発現する安定な細胞株を作製する。結合アッセイについては、７５，０００個のＡＰＰ ７５１細胞を、ＰＤＬでコーティングした９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングする。増殖培地（ＤＭＥＭ Ｆ１２、５％のＦＢＳ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８）中で２日間インキュベートした後、液体を除去し、２０μｇ／ｍｌのＦａｂまたはｍＡｂをＰＢＳ（Ｃａ／Ｍｇ）を１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む溶液に添加した。結合は４℃で２時間進行し、細胞を１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで３回洗浄する。ヒト軽鎖またはマウス軽鎖に特異的な二次抗体（西洋わさびペルオキシダーゼ（ｈｒｐ）結合抗カッパ軽鎖）をＰＢＳ／ＢＳＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加える。抗ヒト軽鎖には、ＰＢＳ／ＢＳＡで１：５０００の希釈液を使用し、抗マウス軽鎖には１：２０００を使用する。４℃で１時間インキュベートした後、細胞をＢＳＡ／ＰＢＳで５回洗浄する。基質ＴＭＢを１０分間添加することにより、ＡＰＰへのＦａｂ／ｍＡｂ結合の関数としてのＨｒｐ活性を測定する。反応物を透明な９６ウェルプレートに移し、６５０ｎｍでの吸光度を測定する。データは、ＰＥＧ化（５ｋＤ、１０ｋＤ）および２０ｋＤ）１Ａ１−Ｆａｂおよびｍ２６６−Ｆａｂが、ＡＰＰよりもＡベータペプチドに対する選択性を付与することを示す。
例示した抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体および抗タウ抗体の組み合わせ
インビボ組み合わせ試験
以下の実施例は、本発明の抗タウ抗体と組み合わせた本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体の組み合わせが、ＡＤなどのＡβ沈着および異常なタウ凝集を特徴とする疾患の治療に有用であり得ることを検証するために、試験がどのように設計され得るかを例証する。しかしながら、以下の説明が例証として記載されており、限定するものではなく、様々な修正が当業者によって加えられ得ることを理解されたい。
本明細書に記載の併用療法において、ｈＥ８Ｌ、抗体Ｉまたは抗体ＩＩなどの抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体のＡベータ斑低下、および例示した抗タウ抗体のタウ凝集伝播の中和を評価するために、タウ／ＡＰＰネズミ子孫を、ＡＰＰトランスジェニックマウス系統（例えば、Ｔｇ２５７６またはＰＤＡＰＰまたはＡＰＰノックイン）を用いたタウトランスジェニックマウス（例えば、ＪＮＰＬ３またはＴｇ４５１０）の交配を介して生成する。タウ／ＡＰＰトランスジェニックマウスは、上記のように、アミロイド沈着がタウ病変の広がりを促進し得ることを示している。タウ／ＡＰＰトランスジェニックマウスは、（ａ）対照抗体（３０ｍｇ／ｋｇ）；（ｂ）抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）および対照抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｃ）抗タウ抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）および対照抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｄ）抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）および抗タウ抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）からなる処置群に分けることができる。
処置期間の後、マウスを殺処分し、脳および脊髄組織を収集することができる。タウ凝集病変およびアミロイド斑病変は、上記のように評価することができる。Ａβ減少を評価するために、実質のＡβ濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡによるグアニジン可溶化組織ホモジネート中で測定する。組織抽出を、凍結した組織を１ｍＬのシリコン処理したガラスビーズを含有する２ｍＬのディープウェルディッシュ中の１ｍＬの５．５Ｍグアニジン／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．５倍プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｐＨ８．０）中に抽出するビーズビーター技術を用いて行う（密封プレートを３分間隔で２回振盪した）。結果として生じた組織溶解物を、Ａベータ１−４０およびＡベータ１−４２についてサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析し、ビーズビーター試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中に１：１０で希釈し、試料濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過する。試料、ブランク、標準物、品質管理試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中０．５５Ｍグアニジン／５ｍＭのトリス中にさらに希釈した後に、試料プレートに充填する。参照標準物を試料希釈剤中に希釈する。捕捉抗体２１Ｆ１２（抗Ａベータ４２）または２Ｇ３（抗Ａベータ４０）で１５μｇ／ｍＬで被覆したプレートを試料とインキュベートし、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中に希釈したビオチン化３Ｄ６（抗Ａベータ１−ｘ）、続いて、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中１：２０Ｋ希釈 ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出を達成し、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色現像する。Ａベータレベルを標準曲線から内挿し、最終組織濃度を組織１ミリグラム（湿重量）当たりのＡβのナノグラムとして計算する。沈着したＡβによって占有された海馬および皮質の面積パーセントを組織学的決定する。クリオスタット連続冠状切片（厚さ７〜１０μｍ）を１０μｇ／ｍＬのビオチン化３Ｄ６（抗Ａベータ１−ｘ）または陰性対照マウスＩｇＧ（ビオチン化）とインキュベートする。ビオチンに特異的な二次ＨＲＰ試薬を用い、沈着したＡβをＤＡＢ−Ｐｌｕｓ（ＤＡＫＯ）で可視化する。海馬または皮質内の目的とする定義された領域内の免疫反応性Ａβ沈着を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて捕捉した画像を分析することによって定量化する。この試験は、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体と抗タウ抗体との併用療法が、Ａβ減少とタウ凝集体伝播の減少の両方の組み合わせをもたらし得ることを示し得る。
インビボ組み合わせ試験
以下の実施例は、本発明の抗タウ抗体と組み合わせた本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体の組み合わせが、ＡＤなどのＡβ沈着および異常なタウ凝集を特徴とする疾患の治療に有用であり得ることを検証するために、試験がどのように設計され得るかを例証する。しかしながら、以下の説明が例証として記載されており、限定するものではなく、様々な修正が当業者によって加えられ得ることを理解されたい。
ｈＥ８Ｌ、抗体Ｉまたは抗体ＩＩなどの抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体のＡベータ斑低下、および例示した抗タウ抗体のタウ凝集伝播の中和を、本明細書に記載の併用療法で評価するために、疾患の進行における遅延が、検証された評価尺度を用いて、バイオマーカーおよび／または認知的ならびに機能的衰退評価によって評価することができる。
患者は、二重盲検プラセボ群と併用療法群とからなる治療群に分けることができる。併用療法群には、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体（有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体は、フロルベタピルＰＥＴイメージングによる有意なアミロイド減少の達成、例えば、３〜４０ｍｇ／ｋｇ ＩＶに基づいて決定され得る）が、有効量の抗タウ抗体（有効量の抗タウ抗体は、タウＰＥＴイメージングによるタウＮＦＴの進行の遅延の達成、例えば、２００〜２８００ｍｇ ＩＶの達成に基づいて決定され得る）と組み合わせて投与され得る。単剤群（併用療法群における抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体と同じ用量での抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体の単独療法群；および併用療法における抗タウ抗体と同じ用量での抗タウ抗体の単独療法群）が、疾患修飾に対する個々の抗体の寄与をさらに解明するために含まれ得る。さらに、処置群は、前臨床期または臨床期ＡＤの診断に基づいて、または患者（ＡＤについては無症候性であるが）がＡＤ疾患を引き起こす遺伝子変異を有するという診断に基づいて特徴付けられることができる。例えば、群は、（ａ）無症候性であるがＡＤを引き起こす遺伝的突然変異陽性；（ｂ）前臨床期ＡＤ；（ｃ）前駆ＡＤ；（ｄ）軽度ＡＤ；（ｅ）中度ＡＤ；および（ｆ）重度ＡＤのうちの１つ以上を含み得る。各治療群は、３ヶ月〜２４ヶ月の治療期間１ヶ月に１回それぞれの処置を受けることができる（そして、例えば、それぞれの異なる治療期間、例えば、Ｎ３ＰＧｌｕＡベータ抗体については３〜６ヶ月の治療期間、および抗タウ抗体については２４ヶ月の治療期間で受けることができる）。
治療期間の後、ＡＤ神経変性は、以下のバイオマーカー評価のうちの１つ以上によって評価することができる：（ａ）タウＰＥＴイメージング（ＮＦＴ蓄積の評価）；（ｂ）容積測定ＭＲＩ（神経解剖学的萎縮の評価）；（ｃ）ＦＤＧ−ＰＥＧ ＰＥＴイメージング（代謝低下の評価）；（ｄ）フロルベタピル灌流ＰＥＴ画像化（代謝低下の評価）；（ｅ）ＣＳＦタウ濃度（神経変性の評価）；（ｆ）ＣＳＦリン酸化タウ濃度（神経変性の評価）；（ｇ）ＣＳＦニューロフィラメント軽鎖濃度（神経変性の評価）；（ｈ）ＣＳＦニューログレニン濃度（神経変性の評価）；（ｉ）フロルベタピルＰＥＴイメージング（アミロイド斑病変の評価）。さらに、ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ、ＭＭＳＥ、ＣＤＲ−ＳＢ、ＡＤＣＳ−ＡＤＬ、および機能的活動アンケート（ＦＡＱ）など、各処置群の認知および機能低下を評価する１つ以上の検証された評価尺度を適用することができる。この試験は、本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体と本発明の抗タウ抗体との併用療法が、Ａベータ減少、およびタウ凝集体伝播の減少の両方の組み合わせをもたらし得ることを示し得る。
例示した抗Ａβ抗体および抗タウ抗体の組み合わせ
インビボ組み合わせ試験
以下の実施例は、本発明の抗タウ抗体と組み合わせた本発明の抗Ａβ抗体の組み合わせが、ＡＤなどのアミロイド斑の形成および異常なタウ凝集を特徴とする疾患の治療に有用であり得ることを（動物モデルにおいて）検証するために、試験がどのように設計され得るかを例証する。しかしながら、以下の説明が例証として記載されており、限定するものではなく、様々な修正が当業者によって加えられ得ることを理解されたい。
本明細書に記載の併用療法において、例示した抗Ａβ抗体によるＡβの封鎖の影響、および例示した抗タウ抗体のタウ凝集伝播の中和を評価するために、タウ／ＡＰＰネズミ子孫を、ＡＰＰトランスジェニックマウス系統（例えば、Ｔｇ２５７６またはＰＤＡＰＰまたはＡＰＰノックイン）を用いたタウトランスジェニックマウス（例えば、ＪＮＰＬ３またはＴｇ４５１０）の交配を介して生成する。タウ／ＡＰＰトランスジェニックマウスは、上記のように、アミロイド沈着がタウ病変の広がりを促進し得ることを示している。タウ／ＡＰＰトランスジェニックマウスは、（ａ）対照抗体（３０ｍｇ／ｋｇ）；（ｂ）抗Ａβ抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）および対照抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｃ）抗タウ抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）および対照抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｄ）抗Ａβ抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）および抗タウ抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）からなる処置群に分けることができる。
処置期間の後、マウスを殺処分し、脳および脊髄組織を収集することができる。タウ凝集病理およびアミロイド斑病変は、上記のように評価することができる。遊離血漿Ａβレベルは、上記のように評価され得る。Ａβ減少を評価するために、実質のＡβ濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡによるグアニジン可溶化組織ホモジネート中で測定する。組織抽出を、凍結した組織を１ｍＬのシリコン処理したガラスビーズを含有する２ｍＬのディープウェルディッシュ中の１ｍＬの５．５Ｍグアニジン／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．５倍プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｐＨ８．０）中に抽出するビーズビーター技術を用いて行う（密封プレートを３分間隔で２回振盪した）。結果として生じた組織溶解物を、Ａベータ１−４０およびＡベータ１−４２についてサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析し、ビーズビーター試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中に１：１０で希釈し、試料濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過する。試料、ブランク、標準物、品質管理試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中０．５５Ｍグアニジン／５ｍＭ Ｔｒｉｓ中にさらに希釈した後に、試料プレートに充填する。参照標準物を試料希釈剤中に希釈する。捕捉抗体２１Ｆ１２（抗Ａベータ４２）または２Ｇ３（抗Ａベータ４０）で１５μｇ／ｍＬで被覆したプレートを試料とインキュベートし、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中に希釈したビオチン化３Ｄ６（抗Ａベータ１−ｘ）、続いて、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中１：２０Ｋ希釈 ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出を達成し、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色現像する。Ａβレベルを標準曲線から内挿し、最終組織濃度を組織１ミリグラム（湿重量）当たりのＡβのナノグラムとして計算する。沈着したＡβによって占有された海馬および皮質の面積パーセントを組織学的決定する。クリオスタット連続冠状切片（厚さ７〜１０μｍ）を１０μｇ／ｍＬのビオチン化３Ｄ６（抗Ａベータ１−ｘ）または陰性対照マウスＩｇＧ（ビオチン化）とインキュベートする。ビオチンに特異的な二次ＨＲＰ試薬を用い、沈着したＡβをＤＡＢ−Ｐｌｕｓ（ＤＡＫＯ）で可視化する。海馬または皮質内の目的とする定義された領域内の免疫反応性Ａβ沈着を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて捕捉した画像を分析することによって定量化する。この試験は、抗Ａβ抗体と抗タウ抗体との併用療法が、遊離Ａβレベルの減少、アミロイド斑減少、およびタウ凝集体伝播の減少の組み合わせをもたらし得ることを示し得る。
インビボ組み合わせ研究
以下の実施例は、本発明の抗タウ抗体と組み合わせた本発明の抗Ａβ抗体の組み合わせが、ＡＤなどのアミロイド斑の形成および異常なタウ凝集を特徴とする疾患の治療に有用であり得ることを検証するために、試験がどのように設計され得るかを例証する。しかしながら、以下の説明が例証として記載されており、限定するものではなく、様々な修正が当業者によって加えられ得ることを理解されたい。
例示した抗Ａβ抗体のＡβの封鎖の影響、および例示した抗タウ抗体のタウ凝集伝播の中和を、本明細書に記載の併用療法で評価するために、疾患の進行における遅延が、検証された評価尺度を用いて、バイオマーカーおよび／または認知的ならびに機能的衰退評価によって評価することができる。
患者は、二重盲検プラセボ群と併用療法群とからなる治療群に分けることができる。併用療法群には、有効量の抗Ａβ抗体（有効量の抗Ａβ抗体は、例えば、モデル化された遊離血漿Ａβの有意な減少の達成、例えば、３〜４０ｍｇ／ｋｇ ＩＶに基づいて決定され得る）が、有効量の抗タウ抗体（有効量の抗タウ抗体は、例えばタウＰＥＴイメージングによるタウＮＦＴの進行の遅延の達成、例えば、２００〜２８００ｍｇ ＩＶの達成に基づいて決定され得る）と組み合わせて投与され得る。単剤群（併用療法群における抗Ａβ抗体と同じ用量での抗Ａβ抗体の単独療法群；および併用療法における抗タウ抗体と同じ用量での抗タウ抗体の単独療法群）が、疾患修飾に対する個々の抗体の寄与をさらに解明するために含まれ得る。さらに、処置群は、前臨床期または臨床期ＡＤの診断に基づいて、または患者（ＡＤについては無症候性であるが）がＡＤ疾患を引き起こす遺伝子変異を有するという診断に基づいて特徴付けらることができる。例えば、群は、（ａ）無症候性であるがＡＤを引き起こす遺伝的突然変異陽性；（ｂ）前臨床期ＡＤ；（ｃ）前駆ＡＤ；（ｄ）軽度ＡＤ；（ｅ）中度ＡＤ；および（ｆ）重度ＡＤのうちの１つ以上を含み得る。各治療群は、３ヶ月〜２４ヶ月の治療期間１ヶ月に１回それぞれの処置を受けることができる（そして、例えば、それぞれの異なる治療期間、例えば、抗Ａβ抗体については３〜６ヶ月の治療期間、および抗タウ抗体については２４ヶ月の治療期間で受けることができる）。
治療期間の後、ＡＤ神経変性は、以下のバイオマーカー評価のうちの１つ以上によって評価することができる：（ａ）タウＰＥＴイメージング（ＮＦＴ蓄積の評価）；（ｂ）容積測定ＭＲＩ（神経解剖学的萎縮の評価）；（ｃ）ＦＤＧ−ＰＥＧ ＰＥＴイメージング（代謝低下の評価）；（ｄ）フロルベタピル灌流ＰＥＴ画像化（代謝低下の評価）；（ｅ）ＣＳＦタウ濃度（神経変性の評価）；（ｆ）ＣＳＦリン酸化タウ濃度（神経変性の評価）；（ｇ）ＣＳＦニューロフィラメント軽鎖濃度（神経変性の評価）；（ｈ）ＣＳＦニューログレニン濃度（神経変性の評価）；（ｉ）フロルベタピルＰＥＴイメージング（アミロイド斑病変の評価）。さらに、ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ、ＭＭＳＥ、ＣＤＲ−ＳＢ、ＡＤＣＳ−ＡＤＬ、および機能的活動アンケート（ＦＡＱ）など、各処置群の認知および機能低下を評価する１つ以上の検証された評価尺度を適用することができる。
この試験は、本発明の抗Ａβ抗体と本発明の抗タウ抗体との併用療法が、遊離血漿ならびにＣＳＦのＡβ減少、およびタウ凝集体伝播の減少の両方の組み合わせをもたらし得ることを示し得る。
例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片および抗タウ抗体の組み合わせ
インビボ組み合わせ試験
以下の実施例は、本発明の抗タウ抗体と組み合わせた本発明のＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片の組み合わせが、ＡＤなどのアミロイド斑の形成および異常なタウ凝集を特徴とする疾患の治療に有用であり得ることを（動物モデルにおいて）検証するために、試験がどのように設計され得るかを例証する。しかしながら、以下の説明が例証として記載されており、限定するものではなく、様々な修正が当業者によって加えられ得ることを理解されたい。
本明細書に記載の併用療法において、例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片による血漿Ａβの減少の影響、および例示した抗タウ抗体のタウ凝集伝播の中和を評価するために、タウ／ＡＰＰネズミ子孫を、ＡＰＰトランスジェニックマウス系統（例えば、Ｔｇ２５７６またはＰＤＡＰＰまたはＡＰＰノックイン）を用いたタウトランスジェニックマウス（例えば、ＪＮＰＬ３またはＴｇ４５１０）の交配を介して生成する。タウ／ＡＰＰトランスジェニックマウスは、上記のように、アミロイド沈着がタウ病変の広がりを促進し得ることを示している。タウ／ＡＰＰトランスジェニックマウスは、（ａ）対照抗体（３０ｍｇ／ｋｇ）；（ｂ）ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片（１５ｍｇ／ｋｇ）および対照抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｃ）抗タウ抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）および対照抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）；（ｄ）ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片（１５ｍｇ／ｋｇ）および抗タウ抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）からなる処置群に分けることができる。
処置期間の後、マウスを殺処分し、脳および脊髄組織を収集することができる。タウ凝集病変は、上記のように評価することができる。血漿Ａβレベルは、上記のように評価することができる（例えば、以前に米国特許第７，１９５，７６１号に記載されているように）。Ａβ減少を評価するために、実質のＡβ濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡによるグアニジン可溶化組織ホモジネート中で測定する。組織抽出を、凍結した組織を１ｍＬのシリコン処理したガラスビーズを含有する２ｍＬのディープウェルディッシュ中の１ｍＬの５．５Ｍグアニジン／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．５倍プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｐＨ８．０）中に抽出するビーズビーター技術を用いて行う（密封プレートを３分間隔で２回振盪した）。結果として生じた組織溶解物を、Ａベータ１−４０およびＡベータ１−４２についてサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析し、ビーズビーター試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中に１：１０で希釈し、試料濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過する。試料、ブランク、標準物、品質管理試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中０．５５Ｍグアニジン／５ｍＭ Ｔｒｉｓ中にさらに希釈した後に、試料プレートに充填する。参照標準物を試料希釈剤中に希釈する。捕捉抗体２１Ｆ１２（抗Ａベータ４２）または２Ｇ３（抗Ａベータ４０）で１５μｇ／ｍＬで被覆したプレートを試料とインキュベートし、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中に希釈したビオチン化３Ｄ６（抗Ａベータ１−ｘ）、続いて、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中１：２０Ｋ希釈 ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出を達成し、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色現像する。Ａベータレベルを標準曲線から内挿し、最終組織濃度を組織１ミリグラム（湿重量）当たりのＡβのナノグラムとして計算する。沈着したＡβによって占有された海馬および皮質の面積パーセントを組織学的決定する。クリオスタット連続冠状切片（厚さ７〜１０μｍ）を１０μｇ／ｍＬのビオチン化３Ｄ６（抗Ａベータ１−ｘ）または陰性対照マウスＩｇＧ（ビオチン化）とインキュベートする。ビオチンに特異的な二次ＨＲＰ試薬を用い、沈着したＡβをＤＡＢ−Ｐｌｕｓ（ＤＡＫＯ）で可視化する。海馬または皮質内の目的とする定義された領域内の免疫反応性Ａβ沈着を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて捕捉した画像を分析することによって定量化する。この試験は、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片と抗タウ抗体との併用療法が、Ａβレベルの減少、アミロイド斑減少、およびタウ凝集体伝播の減少の組み合わせをもたらし得ることを示し得る。
インビボ組み合わせ研究
以下の実施例は、本発明の抗タウ抗体と組み合わせた本発明のＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片の組み合わせが、ＡＤなどのアミロイド斑の形成および異常なタウ凝集を特徴とする疾患の治療に有用であり得ることを検証するために、試験がどのように設計され得るかを例証する。しかしながら、以下の説明が例証として記載されており、限定するものではなく、様々な修正が当業者によって加えられ得ることを理解されたい。
例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片の血漿Ａβの減少の影響、および例示した抗タウ抗体のタウ凝集伝播の中和を、本明細書に記載の併用療法で評価するために、疾患の進行における遅延が、検証された評価尺度を用いて、バイオマーカーおよび／または認知的ならびに機能的衰退評価によって評価することができる。
患者は、二重盲検プラセボ群と併用療法群とからなる治療群に分けることができる。併用療法群には、有効量のＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片（有効量のＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片は、例えば、モデル化された遊離血漿Ａβの有意な減少の達成、例えば、１週間当たり２５〜２００ｍｇ皮下に基づいて決定され得る）が、有効量の抗タウ抗体（有効量の抗タウ抗体は、例えばタウＰＥＴイメージングによるタウＮＦＴの進行の遅延の達成、例えば、２００〜２８００ｍｇ ＩＶの達成に基づいて決定され得る）と組み合わせて投与され得る。単剤群（併用療法群におけるＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片と同じ用量でのＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片の単独療法群；および併用療法における抗タウ抗体と同じ用量での抗タウ抗体の単独療法群）が、疾患修飾に対する個々の抗体の寄与をさらに解明するために含まれ得る。さらに、処置群は、前臨床期または臨床期ＡＤの診断に基づいて、または患者（ＡＤについては無症候性であるが）がＡＤ疾患を引き起こす遺伝子変異を有するという診断に基づいて特徴付けられることができる。例えば、群は、（ａ）無症候性であるがＡＤを引き起こす遺伝的突然変異陽性；（ｂ）前臨床期ＡＤ；（ｃ）前駆ＡＤ；（ｄ）軽度ＡＤ；（ｅ）中度ＡＤ；および（ｆ）重度ＡＤのうちの１つ以上を含み得る。各治療群は、３ヶ月〜２４ヶ月の治療期間１ヶ月に１回それぞれの処置を受けることができる（そして、例えば、それぞれの異なる治療期間、例えば、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片については３〜６ヶ月の治療期間、および抗タウ抗体については２４ヶ月の治療期間で受けることができる）。
治療期間の後、ＡＤ神経変性は、以下のバイオマーカー評価のうちの１つ以上によって評価することができる：（ａ）タウＰＥＴイメージング（ＮＦＴ蓄積の評価）；（ｂ）容積測定ＭＲＩ（神経解剖学的萎縮の評価）；（ｃ）ＦＤＧ−ＰＥＧ ＰＥＴイメージング（代謝低下の評価）；（ｄ）フロルベタピル灌流ＰＥＴ画像化（代謝低下の評価）；（ｅ）ＣＳＦタウ濃度（神経変性の評価）；（ｆ）ＣＳＦリン酸化タウ濃度（神経変性の評価）；（ｇ）ＣＳＦニューロフィラメント軽鎖濃度（神経変性の評価）；（ｈ）ＣＳＦニューログレニン濃度（神経変性の評価）；（ｉ）フロルベタピルＰＥＴイメージング（アミロイド斑病変の評価）。さらに、ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ、ＭＭＳＥ、ＣＤＲ−ＳＢ、ＡＤＣＳ−ＡＤＬ、および機能的活動アンケート（ＦＡＱ）など、各処置群の認知および機能低下を評価する１つ以上の検証された評価尺度を適用することができる。
この試験は、本発明のＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片と本発明の抗タウ抗体との併用療法が、血漿ならびにＣＳＦのＡβ減少、およびタウ凝集体伝播の減少の両方の組み合わせをもたらし得ることを示し得る。
配列
配列番号１−ＨＣＤＲ１−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＩＮ
配列番号２−ＨＣＤＲ２−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ
配列番号３−ＨｃＤＲ３−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＴＲＥＧＥＴＶＹ
配列番号４−ＬＣＤＲ１−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮ
配列番号５−ＬＣＤＲ２−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体ＩＩ）
ＹＡＶＳＫＬＤＳ
配列番号６−ＬＣＤＲ２−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体Ｉ）
ＹＤＶＳＫＬＤＳ
配列番号７−ＬＣＤＲ３−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＶＱＧＴＨＹＰＦＴ
配列番号８−ＨＣＶＲ−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＧＥＴＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９−ＬＣＶＲ−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体Ｉ）
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＤＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＶＱＧＴＨＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１０−ＬＣＶＲ−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体ＩＩ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＶＳＫＬＤＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＶＱＧＴＨＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１１−ＨＣ−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＧＥＴＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号１２−ＬＣ−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体Ｉ）
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＤＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＶＱＧＴＨＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹ ＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１３−ＬＣ−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（抗体ＩＩ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＶＳＫＬＤＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＶＱＧＴＨＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹ ＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１４−配列番号１１のＨＣを発現するために例示したＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＡＴＴＡＴＡＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＧＡＡＧＧＣＧＡＧＡＣＧＧＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ
配列番号１５−配列番号１２のＬＣを発現するために例示したＤＮＡ
ＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＴＡＧＴＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＣＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＧＣＣＴＡＡＴＴＴＡＴＧＡＴＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＴＧＣＡＡＧＧＴＡＣＡＣＡＣＴＡＣＣＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
配列番号１６−配列番号１３のＬＣを発現するために例示したＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＣＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＴＧＣＡＧＧＧＴＡＣＡＣＡＴＴＡＴＣＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
配列番号１７−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＬＣＤＲ１−Ｂ１２Ｌ／Ｒ１７Ｌ／ｈＥ８Ｌ）
ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮ
配列番号１８−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＬＣＤＲ２−Ｂ１２Ｌ／Ｒ１７Ｌ／ｈＥ８Ｌ）
ＡＶＳＫＬＤＳ
配列番号１９−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＬＣＤＲ３−Ｂ１２Ｌ／Ｒ１７Ｌ／ｈＥ８Ｌ）
ＶＱＧＴＨＹＰＦＴ
配列番号２０−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣＤＲ１−Ｂ１２Ｌ）
ＧＹＤＦＴＲＹＹＩＮ
配列番号２１−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣＤＲ１−Ｒ１７Ｌ）
ＧＹＴＦＴＲＹＹＩＮ
配列番号２２−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣＤＲ２−Ｂ１２Ｌ／Ｒ１７Ｌ／ｈＥ８Ｌ）
ＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ
配列番号２３−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣＤＲ３−Ｂ１２Ｌ）
ＥＧＩＴＶＹ
配列番号２４−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣＤＲ３−Ｒ１７Ｌ）
ＥＧＴＴＶＹ
配列番号２５−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＬＣＶＲ−Ｂ１２Ｌ／Ｒ１７Ｌ）
配列番号２６−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣＶＲ−Ｂ１２Ｌ）
配列番号２７−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣＶＲ−Ｒ１７Ｌ）
配列番号２８−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＬＣ−Ｂ１２Ｌ／Ｒ１７Ｌ）
配列番号２９−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣ−Ｂ１２Ｌ）
配列番号３０−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣ−Ｒ１７Ｌ）
配列番号３１−Ｎ３ｐＧｌｕＡβ
［ｐＥ］ＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ
配列番号３２−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＬＣＶＲ−ｈＥ８Ｌ）
配列番号３３−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＬＣ−ｈＥ８Ｌ）
配列番号３４−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣＶＲ−ｈＥ８Ｌ）
配列番号３５−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣ−ｈＥ８Ｌ）
配列番号３６−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣＤＲ１−ｈＥ８Ｌ）
ＧＹＴＦＴＤＹＹＩＮ
配列番号３７−抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ＨＣＤＲ３−ｈＥ８Ｌ）
ＥＧＥＴＶＹ
配列番号３８−Ａβ１−４２
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ
配列番号３９−例示した抗Ａβ抗体のＬＣＤＲ１
ＲＳＳＱＳＬＩＹＳＤＧＮＡＹＬＨ
配列番号４０−例示した抗Ａβ抗体のＬＣＤＲ２
ＫＶＳＮＲＦＳ
配列番号４１−例示した抗Ａβ抗体のＬＣＤＲ３
ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ
配列番号４２−例示した抗Ａβ抗体のＨＣＤＲ１
ＲＹＳＭＳ
配列番号４３−例示した抗Ａβ抗体のＨＣＤＲ２
ＱＩＮＳＶＧＮＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧ
配列番号４４−例示した抗Ａβ抗体のＨＣＤＲ３
ＧＤＹ
配列番号４５−例示した抗Ａβ抗体のＬＣＶＲ
ＤＸａａ２ ＶＭＴＱＸａａ７ ＰＬＳＬＰＶＸａａ１４ Ｘａａ１５ ＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＸａａ３０ ＹＳＤＧＮＡＹＬＨＷＦＬＱＫＰＧＱＳＰＸａａ５０ ＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸａａ８８ ＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＸａａ１０５ ＧＴＸａａ１０８ Ｘａａ１０９ ＥＩＫＲ
式中、２位のＸａａ２は、ＶａｌまたはＩｌｅである。
式中、７位のＸａａ７は、ＳｅｒまたはＴｈｒである。
式中、１４位のＸａａ１４は、ＴｈｒまたはＳｅｒである。
式中、１５位のＸａａ１５は、ＬｅｕまたはＰｒｏである。
式中、３０位のＸａａ３０は、ＩｌｅまたはＶａｌである。
式中、５０位のＸａａ５０は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、またはＬｙｓである。
式中、８８位のＸａａ８８は、ＶａｌまたはＬｅｕである。
式中、１０５位のＸａａ１０５は、ＧｌｎまたはＧｌｙである。
式中、１０８位のＸａａ１０８は、ＬｙｓまたはＡｒｇである。
式中、１０９位のＸａａ１０９は、ＶａｌまたはＬｅｕである。
配列番号４６−例示した抗Ａβ抗体のＨＣＶＲ
Ｘａａ１ ＶＱＬＶＥＸａａ７ ＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＸａａ４６ ＬＶＡＱＩＮＳＶＧＮＳＴＹＹＰＤＸａａ６３ ＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＸａａ７５ Ｘａａ７６ ＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＸａａ８９ ＤＴＡＶＹＹ ＣＡＳＧＤ ＹＷＧＱＧＴＸａａ１０７ ＶＴＶＳＳ
式中、１位のＸａａ１は、ＧｌｕまたはＧｌｎである。
式中、７位のＸａａ７は、ＳｅｒまたはＬｅｕである。
式中、４６位のＸａａ４６は、Ｇｌｕ、Ｖａｌ，Ａｓｐ、またはＳｅｒである。
式中、６３位のＸａａ６３は、ＴｈｒまたはＳｅｒである。
式中、７５位のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＴｈｒである。
式中、７６位のＸａａは、ＬｙｓまたはＡｒｇである。
式中、８９位のＸａａは、ＧｌｕまたはＡｓｐである。
式中、１０７位のＸａａは、ＬｅｕまたはＴｈｒである。
配列番号４７−例示した抗Ａβ抗体のＬＣＶＲ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＩＹＳＤＧＮＡＹＬＨＷＦＬＱＫＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号４８−例示した抗Ａβ抗体のＨＣＶＲ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＡＱＩＮＳＶＧＮＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４９−例示した抗Ａβ抗体のＬＣ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＩＹＳＤＧＮＡＹＬＨＷＦＬＱＫＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号５０−例示した抗Ａβ抗体のＨＣ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＡＱＩＮＳＶＧＮＳＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号５１−ＶＬ ＰＣＲのための３’プライマー
ｔａｔａｇａｇｃｔｃ ａａｇｃｔｔｇｇａｔ ｇｇｔｇｇｇａａｇａ ｔｇｇａｔａｃａｇｔ ｔｇｇｔｇｃ
配列番号５２−ＶＨ ＰＣＲのための３’プライマー
ｔａｔａｇａｇｃｔｃ ａａｇｃｔｔｃｃａｇ ｔｇｇａｔａｇａｃｈ ｇａｔｇｇｇｇｓｔｇ ｔｙｇｔｔｔｔｇｇｃ
配列番号５３−例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＬＣＶＲ
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＳＳＳＱＳＬＩＹＳＤＧＮＡＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＴＱＳＴＨＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号５４−例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＨＣＶＲ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＳＲＹＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＱＩＮＩＲＧＣＮＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＴＧＤＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
式中、残基５６におけるＣｙｓは、マレイミド結合を介して２０ＫＤのＰＥＧでＰＥＧ化されている。
配列番号５５−例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＨＣＶＲ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＳＲＹＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＱＩＮＩＲＧＮＮＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＴＧＤＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５６−Ａβペプチドのアミノ酸残基１３〜２８
ＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ
配列番号５７−Ａβペプチドのアミノ酸残基１４〜２８
ＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ
配列番号５８−例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＬＣＤＲ１
ＳＳＳＱＳＬＩＹＳＤＧＮＡＹＬＨ
配列番号５９−例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＬＣＤＲ２
ＫＶＳＮＲＦＳ
配列番号６０−例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＬＣＤＲ３
ＴＱＳＴＨＳＰＷＴ
配列番号６１−例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＨＣＤＲ１
ＧＹＴＦＳＲＹＳＭＳ
配列番号６２−例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＨＣＶＲ２
ＱＩＮＩＲＧＣＮＴＹＹＰＤＴＶＫ
配列番号６３−例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＨＣＤＲ２
ＱＩＮＩＲＧＮＮＴＹＹＰＤＴＶＫＧ
配列番号６４−例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＨＣＤＲ３
ＧＤＦ
配列番号６５−例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＬＣＶＲ（配列番号５３）をコードするｃＤＮＡ
配列番号６６−例示したＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のＨＣＶＲ（配列番号５４）をコードするｃＤＮＡ
配列番号６７−例示した抗タウ抗体のＬＣ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＱＮＴＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＶＤＮＲＦＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＳＱＳＴＬＶＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号６８−例示した抗タウ抗体のＨＣ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＳＮＹＷＩＥＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＤＳＩＫＹＥＫＮＦＫＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＲＧＮＹＶＤＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号６９−例示した抗タウ抗体のＬＣＤＲ１
ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＱＮＴＹＬＨ
配列番号７０−例示した抗タウ抗体のＬＣＤＲ２
ＹＫＶＤＮＲＦＳ
配列番号７１−例示した抗タウ抗体のＬＣＤＲ３
ＳＱＳＴＬＶＰＬＴ
配列番号７２−例示した抗タウ抗体のＨＣＤＲ１
ＫＧＳＧＹＴＦＳＮＹＷＩＥ
配列番号７３−例示した抗タウ抗体のＨＣＤＲ２
ＥＩＬＰＧＳＤＳＩＫＹＥＫＮＦＫＧ
配列番号７４−例示した抗タウ抗体のＨＣＤＲ３
ＡＲＲＧＮＹＶＤＤ
配列番号７５−例示した抗タウ抗体のＬＣＶＲ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＱＮＴＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＶＤＮＲＦＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＳＱＳＴＬＶＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号７６−例示した抗タウ抗体のＨＣＶＲ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＳＮＹＷＩＥＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＤＳＩＫＹＥＫＮＦＫＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＲＧＮＹＶＤＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７７−例示したＨＣ（配列番号６８）をコードするヌクレオチド配列
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配列番号７８−例示したＬＣ（配列番号６７）をコードするヌクレオチド配列
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配列番号７９−ヒト完全長タウのアミノ酸配列
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Claims (72)

  1. アミロイドβ（Ａβ）の沈着を特徴とする疾患を有する患者を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の抗タウ抗体と組み合わせて有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータを投与することを含み、前記抗タウ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６９によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７０によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７１によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号７２によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７５によって示される、方法。
  2. 前記抗タウ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号７５によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号７６によって示される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抗タウ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号６７によって示され、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号６８によって示される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらが、
    ａ）ＬＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号２３であること、
    ｂ）ＬＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号２４であること、
    ｃ）ＬＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３７あること、
    ｄ）ＬＣＤＲ１が配列番号４であり、ＬＣＤＲ２が配列番号６であり、ＬＣＤＲ３が配列番号７であり、ＨＣＤＲ１が配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３であること、
    ｅ）ＬＣＤＲ１が配列番号４であり、ＬＣＤＲ２が配列番号５であり、ＬＣＤＲ３が配列番号７であり、ＨＣＤＲ１が配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３であること、からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲが、
    ａ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２６のＨＣＶＲ、
    ｂ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２７のＨＣＶＲ、
    ｃ）配列番号３２のＬＣＶＲおよび配列番号３４のＨＣＶＲ、
    ｄ）配列番号９のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、ならびに
    ｅ）配列番号１０のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣおよびＨＣが、
    ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
    ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
    ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
    ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
    ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣおよび各ＨＣが、
    ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
    ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
    ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
    ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
    ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. Ａβの沈着および異常なタウ凝集を特徴とする疾患が、臨床期アルツハイマー病（ＡＤ）または前臨床期アルツハイマー病からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. Ａβの沈着を特徴とする前記疾患が、前駆ＡＤ、軽度ＡＤ、中度ＡＤ、または重度ＡＤから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体および前記抗タウ抗体が同時に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が前記抗タウ抗体の投与の前に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  12. １つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む抗タウ抗体の薬学的組成物と組み合わされた、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体を含む薬学的組成物であって、前記抗タウ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６９によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７０によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７１によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号７２によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７５によって示される、薬学的組成物。
  13. 前記抗タウ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号７５によって示され前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号７６によって示される、請求項１２に記載の薬学的組成物。
  14. 前記抗タウ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号６７によって示され、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号６８によって示される、請求項１２に記載の薬学的組成物。
  15. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらが、
    ａ）ＬＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号２３であること、
    ｂ）ＬＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号２４であること、
    ｃ）ＬＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３７あること、
    ｄ）ＬＣＤＲ１が配列番号４であり、ＬＣＤＲ２が配列番号６であり、ＬＣＤＲ３が配列番号７であり、ＨＣＤＲ１が配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３であること、
    ｅ）ＬＣＤＲ１が配列番号４であり、ＬＣＤＲ２が配列番号５であり、ＬＣＤＲ３が配列番号７であり、ＨＣＤＲ１が配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３であること、からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の薬学的組成物。
  16. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲが、
    ａ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２６のＨＣＶＲ、
    ｂ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２７のＨＣＶＲ、
    ｃ）配列番号３２のＬＣＶＲおよび配列番号３４のＨＣＶＲ、
    ｄ）配列番号９のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、ならびに
    ｅ）配列番号１０のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、からなる群から選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  17. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣおよびＨＣが、
    ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
    ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
    ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
    ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
    ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群から選択される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  18. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣおよび各ＨＣが、
    ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
    ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
    ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
    ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
    ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群から選択される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  19. ＡＤの治療のためのキットであって、前記キットが、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体および有効量の抗タウ抗体を含み、前記抗タウ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６９によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７０によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７１によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号７２によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７５によって示される、キット。
  20. 前記抗タウ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号７５によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号７６によって示される、請求項１９に記載のキット。
  21. 前記抗タウ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号６７によって示され、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号６８によって示される、請求項１９に記載のキット。
  22. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらが、
    ａ）ＬＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号２３であること、
    ｂ）ＬＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号２４であること、
    ｃ）ＬＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３７あること、
    ｄ）ＬＣＤＲ１が配列番号４であり、ＬＣＤＲ２が配列番号６であり、ＬＣＤＲ３が配列番号７であり、ＨＣＤＲ１が配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３であること、
    ｅ）ＬＣＤＲ１が配列番号４であり、ＬＣＤＲ２が配列番号５であり、ＬＣＤＲ３が配列番号７であり、ＨＣＤＲ１が配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３であること、からなる群から選択される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のキット。
  23. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲが、
    ａ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２６のＨＣＶＲ、
    ｂ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２７のＨＣＶＲ、
    ｃ）配列番号３２のＬＣＶＲおよび配列番号３４のＨＣＶＲ、
    ｄ）配列番号９のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、ならびに
    ｅ）配列番号１０のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、からなる群から選択される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のキット。
  24. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣおよびＨＣが、
    ｆ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
    ｇ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
    ｈ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
    ｉ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
    ｊ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群から選択される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のキット。
  25. 前記抗Ｎ３ｐＧｌｕＡベータ抗体が、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣおよび各ＨＣが、
    ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
    ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
    ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
    ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
    ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群から選択される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のキット。
  26. 前駆ＡＤ、軽度ＡＤ、中度ＡＤ、および重度ＡＤから選択される状態と診断された患者における認知機能低下を遅延させる方法であって、有効量の請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
  27. アミロイド斑の形成および異常なタウ凝集を特徴とする疾患を有する患者を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の抗タウ抗体と組み合わせて有効量の抗Ａβ抗体およびＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のうちの１つを投与することを含み、前記抗タウ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６９によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７０によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７１によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号７２によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７５によって示される、方法。
  28. 前記抗タウ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号７５によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号７６によって示される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記抗タウ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号６７によって示され、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号６８によって示される、請求項２７に記載の方法。
  30. 有効量の前記抗Ａβ抗体が、前記抗タウ抗体と組み合わせて投与され、
    前記抗Ａβ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号３９によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４０によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号４１によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号４２によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号４４によって示される、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記抗Ａβ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、
    前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４５によって示され、２位のＸａａが、ＶｌｅまたはＩｌｅであり、７位のＸａａが、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、１４位のＸａａが、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、１５位のＸａａが、ＬｅｕまたはＰｒｏであり、３０位のＸａａが、ＩｌｅまたはＶａｌであり、５０位のＸａａが、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、またはＬｙｓであり、８８位のＸａａが、ＶａｌまたはＬｅｕであり、１０５位のＸａａが、ＧｌｎまたはＧｌｙであり、１０８位のＸａａが、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、かつ１０９位のＸａａが、ＶａｌまたはＬｅｕであり、
    前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４６によって示され、
    １位のＸａａが、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、７位のＸａａが、ＳｅｒまたはＬｅｕであり、４６位のＸａａが、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり、６３位のＸａａが、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、７５位のＸａａが、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＴｈｒであり、７６位のＸａａが、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、８９位のＸａａが、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、かつ１０７位のＸａａが、ＬｅｕまたはＴｈｒである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記抗Ａβ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４７によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４８によって示される、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記抗Ａβ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号４９によって示され、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号５０によって示される、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記抗Ａβ抗体が、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号４９によって示され、各ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号５０によって示される、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 有効量の前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、前記抗タウ抗体と組み合わせて投与され、
    前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、Ｆａｂを含み、前記Ｆａｂが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号５８によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号５９によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号６０によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６１によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号６２または配列番号６３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号６４によって示され、前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、システインにおいてＰＥＧ分子に共有結合されている、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、Ｆａｂを含み、前記Ｆａｂが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号５３によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号５４によって示され、前記ＰＥＧ分子が、配列番号５４のシステイン残基５６において共有結合されている、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、Ｆａｂを含み、前記Ｆａｂが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、およびヒンジ領域を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号５３によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号５４によって示され、前記ＰＥＧ分子が、前記ヒンジ領域の残基に共有結合されている、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記ＰＥＧ分子が、約０．５ｋＤ〜約３０ｋＤの分子量を有する、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ＰＥＧ分子が、約２０ｋＤの分子量を有する、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ＰＥＧ分子が、マレイミド結合を介して前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片の前記システインに共有結合している、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. アミロイド斑の形成および異常なタウ凝集を特徴とする前記疾患が、臨床期アルツハイマー病（ＡＤ）または前臨床期アルツハイマー病からなる群から選択される、請求項２７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. アミロイド斑の形成および異常なタウ凝集を特徴とする前記疾患が、前駆ＡＤ、軽度ＡＤ、中度ＡＤ、または重度ＡＤから選択される、請求項２７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記抗Ａβ抗体および前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のうちの１つと、前記抗タウ抗体とが同時に投与される、請求項２７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記抗Ａβ抗体および前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のうちの前記１つが、前記抗タウ抗体の前記投与の前に投与される、請求項２７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  45. １つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む抗タウ抗体の薬学的組成物と組み合わされた、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、抗Ａβ抗体およびＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のうちの１つを含む薬学的組成物であって、前記抗タウ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６９によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７０によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７１によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号７２によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７５によって示される、薬学的組成物。
  46. 前記抗タウ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号７５によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号７６によって示される、請求項４５に記載の薬学的組成物。
  47. 前記抗タウ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号６７によって示され、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号６８によって示される、請求項４５に記載の薬学的組成物。
  48. 前記薬学的組成物が、抗Ａβ抗体を含み、
    前記抗Ａβ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号３９によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４０によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号４４によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号４２によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号４４によって示される、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  49. 前記抗Ａβ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、
    前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４５によって示され、２位のＸａａが、ＶｌｅまたはＩｌｅであり、７位のＸａａが、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、１４位のＸａａが、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、１５位のＸａａが、ＬｅｕまたはＰｒｏであり、３０位のＸａａが、ＩｌｅまたはＶａｌであり、５０位のＸａａが、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、またはＬｙｓであり、８８位のＸａａが、ＶａｌまたはＬｅｕであり、１０５位のＸａａが、ＧｌｎまたはＧｌｙであり、１０８位のＸａａが、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、かつ１０９位のＸａａが、ＶａｌまたはＬｅｕであり、
    前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４６によって示され、
    １位のＸａａが、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、７位のＸａａが、ＳｅｒまたはＬｅｕであり、４６位のＸａａが、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり、６３位のＸａａが、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、７５位のＸａａが、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＴｈｒであり、７６位のＸａａが、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、８９位のＸａａが、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、かつ１０７位のＸａａが、ＬｅｕまたはＴｈｒである、請求項４８に記載の薬学的組成物。
  50. 前記抗Ａβ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４７によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４８によって示される、請求項４８に記載の薬学的組成物。
  51. 前記抗Ａβ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号４９によって示され、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号５０によって示される、請求項４８に記載の薬学的組成物。
  52. 前記抗Ａβ抗体が、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号４９によって示され、各ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号５０によって示される、請求項４８に記載の薬学的組成物。
  53. 前記薬学的組成物が、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を含み、
    前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、Ｆａｂを含み、前記Ｆａｂが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号５８によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号５９によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号６０によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６１によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号６２または配列番号６３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号６４によって示され、前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、システインにおいてＰＥＧ分子に共有結合されている、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  54. 前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、Ｆａｂを含み、前記Ｆａｂが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号５３によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号５４によって示され、前記ＰＥＧ分子が、配列番号５４のシステイン残基５６において共有結合されている、請求項５３に記載の薬学的組成物。
  55. 前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、Ｆａｂを含み、前記Ｆａｂが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、およびヒンジ領域を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号５３によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号５５によって示され、前記ＰＥＧ分子が、前記ヒンジ領域の残基に共有結合されている、請求項５３に記載の薬学的組成物。
  56. 前記ＰＥＧ分子が、約０．５ｋＤ〜約３０ｋＤの分子量を有する、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  57. 前記ＰＥＧ分子が、約２０ｋＤの分子量を有する、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  58. 前記ＰＥＧ分子が、マレイミド結合を介して前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片の前記システインに共有結合している、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  59. 前駆ＡＤ、軽度ＡＤ、中度ＡＤ、および重度ＡＤから選択される状態と診断された患者における認知機能低下を遅延させるための方法であって、有効量の請求項４５〜５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
  60. ＡＤの治療のためのキットであって、前記キットが、有効量の抗Ａβ抗体およびＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片のうちの１つと、有効量の抗タウ抗体とを含み、前記抗タウ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６９によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７０によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７１によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号７２によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７５によって示される、キット。
  61. 前記抗タウ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号７５によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号７６によって示される、請求項６０に記載のキット。
  62. 前記抗タウ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号６７によって示され、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号６８によって示される、請求項６０に記載のキット。
  63. 前記キットが、抗Ａβ抗体を含み、
    前記抗Ａβ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号３９によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４０によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号４１によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号４２によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号４４によって示される、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載のキット。
  64. 前記抗Ａβ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、
    前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４５によって示され、２位のＸａａが、ＶｌｅまたはＩｌｅであり、７位のＸａａが、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、１４位のＸａａが、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、１５位のＸａａが、ＬｅｕまたはＰｒｏであり、３０位のＸａａが、ＩｌｅまたはＶａｌであり、５０位のＸａａが、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、またはＬｙｓであり、８８位のＸａａが、ＶａｌまたはＬｅｕであり、１０５位のＸａａが、ＧｌｎまたはＧｌｙであり、１０８位のＸａａが、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、かつ１０９位のＸａａが、ＶａｌまたはＬｅｕであり、
    前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４６によって示され、
    １位のＸａａが、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、７位のＸａａが、ＳｅｒまたはＬｅｕであり、４６位のＸａａが、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり、６３位のＸａａが、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、７５位のＸａａが、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＴｈｒであり、７６位のＸａａが、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、８９位のＸａａが、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、かつ１０７位のＸａａが、ＬｅｕまたはＴｈｒである、請求項６３に記載のキット。
  65. 前記抗Ａβ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４７によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４８によって示される、請求項６３に記載のキット。
  66. 前記抗Ａβ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号４９によって示され、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号５０によって示される、請求項６３に記載のキット。
  67. 前記抗Ａβ抗体が、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号４９によって示され、各ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号５０によって示される、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載のキット。
  68. 前記キットが、ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片を含み、
    前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、Ｆａｂを含み、前記Ｆａｂが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号５８によって示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号５９によって示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号６０によって示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６１によって示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号６２または配列番号６３によって示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号６４によって示され、前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、システインにおいてＰＥＧ分子に共有結合されている、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載のキット。
  69. 前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、Ｆａｂを含み、前記Ｆａｂが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号５３によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号５４によって示され、前記ＰＥＧ分子が、配列番号５４の前記システイン残基５６において共有結合されている、請求項６８に記載のキット。
  70. 前記ＰＥＧ−抗Ａβ抗体断片が、Ｆａｂを含み、前記Ｆａｂが、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、およびヒンジ領域を含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号５３によって示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号５５によって示され、前記ＰＥＧ分子が、前記ヒンジ領域の残基に共有結合されている、請求項６８に記載のキット。
  71. 前記ＰＥＧ分子が、約０．５ｋＤ〜約３０ｋＤの分子量を有する、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載のキット。
  72. 前記ＰＥＧ分子が、約２０ｋＤの分子量を有する、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載のキット。
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