BR112020018563A2

BR112020018563A2 - Anticorpos de domínio único que se ligam à neurotoxina do tétano

Info

Publication number: BR112020018563A2
Application number: BR112020018563-9A
Authority: BR
Inventors: Abraham Johannes De Smit; Michaël Marie Harmsen
Original assignee: Smivet B.V.
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2020-12-29
Also published as: AU2019233603A1; MX2020009507A; JP2024023268A; MA51996A; CN112135840A; CN117964751A; EP3765495A1; CN112135840B; JP2021516682A; US20220275066A1; WO2019175250A1

Abstract

anticorpos de domínio único que se ligam à neurotoxina do tétano. a presente invenção se refere a anticorpos de domínio único (sdas) que têm a capacidade de se ligar à neurotoxina do tétano. a invenção se refere ainda a construtos polipeptídicos que compreendem um sda, bem como um sda que tem a capacidade de se ligar a uma proteína do soro, preferencialmente a albumina sérica ou imunoglobulina. a invenção também se refere a ácidos nucleicos que codificam tais sdas ou construtos polipeptídicos, a composições farmacêuticas que compreendem tais sdas ou construtos polipeptídicos, uso médico dos mesmos e ao seu uso no tratamento do tétano.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTICORPOS DE DOMÍNIO ÚNICO QUE SE LIGAM À NEUROTOXINA DO TÉTANO” Campo da Invenção

[001] A presente invenção, entre outros, se refere a anticorpos de domínio único (SDA) com a capacidade de se ligar à neurotoxina do tétano, construtos polipeptídicos que compreendem tais SDAs, composições que compreendem tais SDAs e/ou construtos polipeptídicos e a fragmentos de DNA que codificam tais SDA e/ou construtos polipeptídicos. Além disso, a invenção se refere a células hospedeiras que compreendem tais fragmentos de DNA, métodos para a produção de tais SDAs e/ou construtos polipeptídicos e ao uso de tais SDAs e/ou construtos polipeptídicos e/ou composições no tratamento ou prevenção de doenças após infecção por Clostridium tetani.

Fundamentos da Invenção

[002] O tétano, uma doença causada pela bactéria Clostridium tetani, foi descrito pela primeira vez no Egito há cerca de 3.000 anos.

[003] A toxemia do tétano é causada por uma neurotoxina específica; neurotoxina do tétano (TeNT) produzida pela bactéria Clostridium tetani. Quase todos os mamíferos, incluindo seres humanos, são suscetíveis. Seres humanos, cavalos e cordeiros estão entre os mais sensíveis de todas as espécies. Cães e gatos são relativamente mais resistentes. O tétano é encontrado em todo o mundo, mas a ocorrência de C. tetani no solo e a incidência de tétano em pessoas, cavalos e cordeiros são maiores nas partes mais quentes dos vários continentes. Na maioria dos casos, a bactéria C. tetani é introduzida nos tecidos por meio de feridas. O tétano normalmente ocorre após feridas profundas, onde o crescimento bacteriano anaeróbio é facilitado. Em cordeiros, porém, e às vezes em outras espécies, o tétano também pode ocorrer após a docagem ou castração.

[004] A neurotoxina do tétano é uma protease de ligação ao zinco que cliva a sinaptobrevina, uma proteína de membrana associada à vesícula. A clivagem dessa proteína leva à inibição da liberação de neurotransmissores. A toxina é absorvida pelos nervos motores na área de infecção e viaja retrógrada pelo trato nervoso até a medula espinhal, onde causa o tétano ascendente.

[005] TeNT é sintetizado como uma única cadeia polipeptídica de 150 kDa. Esse polipeptídeo é clivado em uma cadeia pesada (H) de 100 kDa e uma cadeia leve (L) de 50 kDa que são mantidas juntas por uma ligação dissulfeto e formam a toxina ativa. A digestão da holotoxina com papaína resulta no fragmento B, que é composto pela cadeia leve TeNT e a metade amino terminal da cadeia pesada TeNT (HN),

e fragmento C (HC ou TTC) que contém a metade carboxi terminal da cadeia pesada. Experimentos in vitro sugeriram que HC é responsável pela ligação aos neurônios através dos gangliosídeos, enquanto o fragmento HN desempenha um papel na internalização e na translocação da membrana.

[006] O período de incubação (o tempo desde a infecção até o primeiro sintoma) pode ser tão curto quanto 24 horas ou tantos meses após a inoculação com C. tetani.

Esse intervalo é um reflexo da distância que a toxina deve percorrer no sistema nervoso e pode estar relacionado à quantidade de toxina liberada. O período de início é o tempo entre o primeiro sintoma e o início da paralisia espástica. O período de incubação geralmente é em média de 10 a 14 dias. A rigidez localizada, geralmente envolvendo os músculos masseteres e os músculos do pescoço, dos membros posteriores e da região da ferida infectada, é observada primeiro; a rigidez geral torna-se pronunciada cerca de 1 dia depois, e espasmos tônicos e hiperestesia tornam-se evidentes. Por causa de sua resistência relativamente alta à toxina do tétano, cães e gatos frequentemente têm um longo período de incubação e frequentemente desenvolvem tétano localizado; entretanto, o tétano generalizado se desenvolve nessas espécies. Uma descrição abrangente da neurotoxina do tétano (e a neurotoxina botulínica relacionada) pode ser encontrada em

Originalmente publicado por Plenum Press, Nova York em

1993. Uma revisão relativa ao tétano, sua causa e efeitos, bem como métodos de tratamento pode, por exemplo, ser encontrada em Farrar, J.J. et al., em J. Neurol Neurosurg Psychiatry 69:292 a 301 (2000).

[007] A imunização passiva com antitoxina tetânica policlonal humana ou, por exemplo, equina encurta o curso e pode reduzir a gravidade do tétano. O anti-soro equino (Fab) é preparado a partir de um pool de soro coletado de equinos imunizados e tem meia-vida de 12 a 20 horas em seres humanos (Flanagan RJ, Jones AL. Drug Saf.

2004;27(14):1115-33). A forma equina (ou bovina), usada em todo o mundo em desenvolvimento, causa reações anafiláticas incidentais, mas é muito mais barata e mais fácil de produzir do que o soro de um doador humano.

[008] O tratamento da doença tetânica consiste na administração de antibióticos ou metronidazol, pelo tratamento do local da infecção (por exemplo, enxaguado, drenado e desbridado), administração de antitoxina e cuidados de suporte (por exemplo, relaxante muscular, sedativo, hidratação, etc.). A imunização passiva com preparações contendo imunoglobulinas (por exemplo, purificadas e fragmentadas) obtidas de ovelhas ou cavalos ativamente imunizados fornece proteção eficaz em animais não imunizados e seres humanos. A antitoxina do tétano (por exemplo, na forma de SDAs ou soro imune) pode ser usada em pelo menos 3 cenários diferentes: como parte de um procedimento padrão pré-operatório, em animais que estão feridos, mas ainda não doentes e, em terceiro lugar, em um cenário terapêutico quando o animal está sofrendo de tétano. Há diferença na dose de antitoxina usada, dependendo do tratamento profilático ou terapêutico, sendo esse último em uma dose 2 a 20 vezes maior dependendo da espécie. Em casos de tétano, podem ser necessários tratamentos diários.

[009] Até hoje, a administração de anti-soro produzido em, e. cavalos e voluntários humanos é o único tratamento para a doença tetânica aguda. Em princípio, uma possível alternativa poderia ser oferecida por anticorpos purificados e suas variantes manipuladas, como fragmentos de ligação ao antígeno (Fab) e fragmentos variáveis de cadeia única (scFv). SDAs antitoxina tetânica produzidos in vitro, evitando doadores animais e humanos, ainda não estão comercialmente disponíveis como medicamentos humanos ou veterinários. Um exemplo de fragmentos variáveis de cadeia única da toxina anti-tétano é descrito por Nathan Scott et al., em Molecular Immunology 47: 1.931 a 1.941 (2010).

[0010] No entanto, embora úteis, os anticorpos comuns e suas variantes de engenharia Fab e scFv têm várias limitações. Exemplos de tais limitações são baixa solubilidade, baixa estabilidade e altos custos e uso de animais (Doshi, R. et al., Scientific Reports 4:6760 DOI;

10.1030/srep06760). Esses anticorpos regulares e seus fragmentos têm peso molecular relativamente grande: o MW médio de anticorpos regulares é de cerca de 160 kDa, Fabs têm um MW de 65 kDa e mesmo o scFv relativamente pequeno tem um MW de 28 kDa.

[0011] Além disso, há o problema da baixa viabilidade da produção: a produção de proteínas maiores às vezes é problemática e, em qualquer caso, cara.

[0012] As regiões monoméricas, hipervariáveis, de ligação ao antígeno de anticorpos homodiméricos, apenas de cadeia pesada (HCAbs) naturalmente encontrados em camelídeos e algumas espécies de tubarões não têm muitas das desvantagens dos anticorpos comuns e suas variantes manipuladas Fab e scFv. Por razões de clareza, esse domínio variável derivado de uma molécula de cadeia pesada naturalmente desprovida de cadeia leve também é referido como um VHH quando derivado de camelídeos e VNAR quando derivado de tubarões para distinguir o mesmo do VH convencional de imunoglobulinas de quatro cadeias. Por conveniência, os VHHs anti-TeNT serão adicionalmente referidos aqui como anticorpos de domínio único (SDAs).

[0013] Uma família de patentes iniciais relativa à estrutura, composição, preparação e usos de anticorpos de cadeia pesada desprovidos de cadeias leves e os fragmentos de ligação de antígeno isolados dos mesmos é a família de patentes que compreende EP 0656946. Essas moléculas de domínio único são, entre outros, também descrito por Hamers-Casterman, C. et al., Nature 363: 446 a 448 (1993).

Eles podem ser derivados de espécies de Camelídeos, por exemplo, em camelo, lhama, dromedário, alpaca e guanaco. Em comparação com os anticorpos normais e seus fragmentos, o tamanho molecular dos SDAs é o menor (cerca de 15 kDa). SDA também são muito robustos, altamente resistentes à desnaturação/degradação térmica, têm alta solubilidade aquosa e, em geral, são alta e funcionalmente expressos com o uso de sistemas de expressão microbiana padrão. Além disso, SDA também tem distribuição corporal superior e penetração nos tecidos. Isso os torna atraentes para uso clínico.

[0014] Um exemplo de SDAs com capacidade de se ligar ao toxoide do tétano é descrito em Arbabi Ghahroudi (M.

Arbabi Ghahroudi, A. Desmyter, L. Wyns, R. Hamers, S.

Muyldermans. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Letters 414 (1997) 521 a 526). O documento WO 96/34103 revela SDAs com capacidade de se ligar ao toxoide do tétano. Estudos em camundongos mostram que a administração de baixas doses de toxinas dos SDAs permitiu a sobrevivência de cerca de 40 a 50% dos camundongos tratados após 2 a 4 dias. Esses resultados também são relatados em Arbabi Ghahroudi et al., FEBS LETTERS (1997), 414, 521 a

526. Rossotti et al. (MABS, DOI:

10.1080/19420862.2015.1068491) descrevem a ligação de SDAs à toxina do tétano.

[0015] Um problema específico observado com as neurotoxinas de Clostridium é sua toxicidade extremamente alta. TeNT é tóxico em seres humanos já em concentrações tão baixas de 0,1 a 2,5 ng/kg e, em outros animais, já em concentrações baixas de 0,1 a 5 ng/kg. Em cavalos, a dose letal é, por exemplo, entre 0,1 e 0,3 ng/kg. Isso significa que apenas os anticorpos de alta afinidade com capacidade de se ligar ao TeNT e, subsequentemente, prevenir a absorção no neurônio, terão a capacidade de reduzir o nível de TeNT livre a um nível que suprime ou até mesmo evita os sintomas fatais de tétano após a infecção por Clostridium tetani ter ocorrido.

[0016] A medição direta das interações biomoleculares desempenha um papel importante na descoberta e no desenvolvimento de medicamentos bioterapêuticos.

Informações precisas sobre a taxa de formação do complexo biomolecular e estabilidade do complexo são componentes-

chave de uma interação fármaco-alvo. A afinidade de uma interação afeta diretamente a dose na qual um biofármaco é eficaz. A afinidade de um anticorpo para um antígeno pode ser determinada experimentalmente com o uso de qualquer método adequado, consulte, por exemplo, Berzofsky et al., “Antibody-Antigen Interactions”, em Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nova York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nova York, N.Y. (1992); e métodos descritos no presente documento, Lad, L. et al., Journal of Biomolecular Screening 2015, Vol. 20(4) 498 a 507, Yang, D. et al., doi:10.3791/55659). A afinidade medida de uma interação específica anticorpo-proteína alvo pode variar se medida em diferentes condições (por exemplo, concentração de sal, pH). Assim, as medições de afinidade ou avidez no caso de SDAs multiméricos (por exemplo, KD, ka, kdis) são preferencialmente realizadas com soluções padronizadas de anticorpo e antígeno e um tampão padronizado.

[0017] Até agora, no entanto, os SDAs anti-TeNT têm um KD que excede 1 a 10 nM ou mesmo 35 nM, indicando uma afinidade mais baixa. Isso pode ser visto, entre outros, em Rossotti et al. (2015, mAbs, 7:5, 820 a 828, DOI:

10.1080/19420862.2015.1068491) e em Arbabi Ghahroudi, referido acima.

Sumário da Invenção

[0018] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um anticorpo de domínio único (SDA) com capacidade de se ligar à neurotoxina do tétano (TeNT), em que o SDA tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 17, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

[0019] Em uma modalidade preferencial, o SDA tem uma identidade geral de sequência de aminoácidos de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou, de preferência, 100% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 17, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

[0020] Alternativamente, ou em combinação com uma modalidade anterior, em uma outra modalidade preferencial, as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 são pelo menos 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou, de preferência, 100%.

[0021] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um construto polipeptídico que compreende pelo menos um SDA com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção e pelo menos um SDA com capacidade de se ligar a uma proteína sérica. De preferência, a proteína sérica é albumina sérica ou uma imunoglobulina. Mais preferencialmente, a imunoglobulina é imunoglobulina G (IgG). Em uma modalidade preferencial, o SDA com capacidade de se ligar a albumina sérica tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 40, 37, 38, 39, 41 e 42 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%. Em uma modalidade preferencial, o SDA com capacidade de se ligar à imunoglobulina tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 30, 27, 28, 29, 31, 32, 33 e 34 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

[0022] Em uma modalidade preferencial, o construto polipeptídico compreende pelo menos dois SDAs com capacidade de se ligar a TeNT, em que cada um dos pelo menos dois SDAs com capacidade de se ligar a TeNT tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos

70% com uma sequência selecionada da seleção A; SEQ ID NO: 24, ou seleção B; SEQ ID NO: 25, ou seleção C; SEQ ID NO: 20, ou seleção D; SEQ ID NO: 17 ou 19 ou seleção E; SEQ ID NO: 22, 15, 23 ou 14, com a condição de que os pelo menos dois SDAs não compreendam uma sequência da mesma seleção e com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

[0023] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um SDA com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção e/ou pelo menos um construto polipeptídico de acordo com a invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável. De preferência, a composição compreende pelo menos dois SDAs com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção e/ou pelo menos um construto polipeptídico de acordo com a invenção.

[0024] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um SDA com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção ou um construto polipeptídico de acordo com a invenção para uso como um medicamento.

[0025] Em ainda outro aspecto, a presente invenção se refere a um SDA com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção, um construto polipeptídico de acordo com a invenção ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção, para uso na prevenção ou tratamento da doença/sintomas de Clostridium tetani.

[0026] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um fragmento de DNA que codifica um SDA com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção ou a um construto polipeptídico de acordo com a invenção.

[0027] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um ácido nucleico que compreende um fragmento de DNA de acordo com a invenção, em que o fragmento de DNA está operacionalmente ligado a um promotor e opcionalmente a outros elementos reguladores.

[0028] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico de acordo com a invenção.

[0029] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para a produção de um SDA de acordo com a invenção ou um construto polipeptídico de acordo com a invenção, em que o método compreende as etapas de a) cultivar uma célula hospedeira de acordo com a invenção sob condições que permitem a expressão do SDA ou construção polipeptídica; e opcionalmente b) recuperar o SDA ou construto polipeptídico de pelo menos uma dentre as células hospedeiras e o meio de cultura.

[0030] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um kit de diagnóstico que compreende pelo menos um SDA com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção.

Descrição da Invenção

[0031] Surpreendentemente, foi constatado agora que podem ser obtidos os SDAs anti-TeNT que têm um KD que é significativamente menor do que aquele dos SDAs anti-TeNT conhecidos e que têm atividade neutralizadora da toxina do tétano in vivo. Esses novos SDAs anti-TeNT têm a vantagem de terem a capacidade de se ligar a TeNT com uma afinidade extremamente alta. Isso muda o equilíbrio entre as moléculas TeNT livres e ligadas extremamente longe para as moléculas TeNT ligadas, que por sua vez suprime suficientemente os sintomas fatais do tétano após a infecção com Clostridium tetani.

[0032] Vários grupos de SDAs anti-TeNT foram agora identificados com valores de KD abaixo de 1 nM. A Figura 1 mostra as sequências de sete grupos ou exemplos de membros de grupos (Grupo A, B, C, D e um membro de cada um dos grupos E, F e G) de SDAs. As três regiões sombreadas indicam onde as regiões hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs) estão localizadas. Como pode ser visto na Figura 1, existe alguma variação natural entre SDAs individuais. Essas variações podem ser devidas a (uma) diferença (ou diferenças) de aminoácido na sequência geral ou por deleções, substituições, inserções, inversões ou adições de (um) aminoácido (ou aminoácidos) na dita sequência. As substituições de aminoácidos que não alteram essencialmente as atividades biológicas e imunológicas foram descritas, por exemplo, por Neurath et al em “The Proteins” Academic Press New York (1979). As substituições de aminoácidos entre aminoácidos relacionados ou substituições que ocorreram frequentemente na evolução são, entre outros, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, lle/Val (consulte Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat.

Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, supl.

3). Outras substituições de aminoácidos incluem Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/lle, Leu/Val e Ala/Glu. Com base nesta informação, Lipman e Pearson desenvolveram um método para comparação rápida e sensível de proteínas (Science 227, 1.435 a 1.441, 1985) e determinação da similaridade funcional entre proteínas homólogas. As substituições de aminoácidos das modalidades exemplificadoras desta invenção, bem como as variações com deleções e/ou inserções estão dentro do escopo da invenção, desde que as proteínas resultantes não sejam essencialmente afetadas em suas propriedades antigênicas ou imunogênicas.

[0033] Isso explica porque os SDAs de acordo com a invenção podem ter níveis globais de identidade de sequência de aminoácidos de cerca de 70%, embora ainda representem a mesma proteína no sentido de que a proteína ainda tem um valor KD de < 1 nM. Essas variações na sequência de aminoácidos de um certo SDA de acordo com a invenção que ainda fornecem um SDA com um valor KD de < 1 nM são consideradas como “não afetando essencialmente as propriedades antigênicas ou imunogênicas da dita proteína”.

[0034] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno, de preferência um anticorpo de domínio único (SDA), com capacidade de se ligar à neurotoxina do tétano (TeNT), em que o domínio de ligação ao antígeno tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 17, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de regiões CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

[0035] Alternativamente dito, nesse aspecto, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno que se liga especificamente à neurotoxina do tétano (TeNT). De preferência, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que compreende 4 regiões estruturais, FR1 a FR4, e 3 regiões determinantes de complementaridade, CDR1 a CDR3, que estão operacionalmente ligadas na ordem FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FR4. De preferência, a CDR1 tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de CDR1 das sequências VHH SEQ ID NO: 13 a 26, como mostrado na Figura 1 ou uma sequência de aminoácidos que difere da CDR1 em um ou dois dos resíduos de aminoácidos; b) a CDR2 tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de CDR2 das sequências VHH SEQ ID NO: 13 a 26, como mostrado na Figura 1 ou uma sequência de aminoácidos que difere da CDR2 em um, dois, três ou quatro dos resíduos de aminoácidos; e, c) a CDR3 tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de CDR3 das sequências VHH SEQ ID NO: 13 a 26, como mostrado na Figura 1 ou uma sequência de aminoácidos que difere do CDR3 em um, dois, três, quatro ou cinco dos resíduos de aminoácidos; e em que cada uma das regiões de arcabouço tem pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de estrutura de qualquer uma das SEQ ID NO: 13 a 26, como mostrado na Figura 1. De preferência, CDR1, CDR2 e CDR3 são da mesma SEQ ID NO. Mais preferencialmente, a região de arcabouço é da mesma SEQ ID NO que as regiões determinantes de complementaridade.

[0036] Um nível geral de identidade de sequência de aminoácidos de uma certa porcentagem, como aqui usado, como cerca de 70%, significa que o nível de identidade de sequência de aminoácidos de toda a proteína de ligação ao antígeno - em outras palavras: quando as duas sequências estão alinhadas ao longo de seu comprimento total FR1-CDR1-

FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 - é cerca de 70%. Assim, “geral”

neste contexto é usado para incluir CDRs 1 a 3. “Identidade de sequência” ou “identidade” é aqui definida como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácidos

(polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais sequências de ácido nucleico (polinucleotídeo), conforme determinado pela comparação das sequências.

Na técnica, “identidade” também significa o grau de parentesco de sequência entre as sequências de aminoácidos ou de ácido nucleico, conforme o caso, conforme determinado pela correspondência entre as cadeias de tais sequências. “Similaridade” entre duas sequências de aminoácidos é determinada comparando a sequência de aminoácidos e seus substitutos de aminoácidos conservados de um polipeptídeo com a sequência de um segundo polipeptídeo. “Identidade” e “similaridade” pode ser facilmente calculado por métodos conhecidos.

Os termos

“identidade de sequência” ou “similaridade de sequência”

significam que duas sequências de (poli)peptídeos ou duas sequências de nucleotídeos, quando alinhadas de maneira ideal, de preferência ao longo de todo o comprimento (pelo menos da sequência mais curta na comparação) e maximizando o número de correspondências e minimiza o número de lacunas, como pelos programas ClustalW (1.83), GAP ou

BESTFIT com o uso de parâmetros padrão, compartilham pelo menos uma certa porcentagem de identidade de sequência conforme definido em outro lugar neste documento.

O GAP usa o algoritmo de alinhamento global Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências em todo o seu comprimento,

maximizando o número de correspondências e minimizando o número de lacunas.

Geralmente, os parâmetros padrão de GAP são usados, com uma penalidade de criação de lacuna = 50 é

ClustalW (1,83) com o uso de uma matriz de blosum e configurações padrão (penalidade de abertura de lacuna: 10;

penalidade de extensão de lacuna: 0,05). Os alinhamentos de sequência e pontuações para a identidade de sequência percentual podem ser determinados com o uso de programas de computador, como o GCG Wisconsin Package, Versão 10.3,

disponível na Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego,

CA 92121-3752 EUA, ou com o uso de software de código aberto, como o programa “needle” (com o uso do algoritmo global Needleman Wunsch) ou “water” (com o uso do algoritmo local Smith Waterman) em (nucleotídeos)/8 (proteínas) e penalidade de extensão de lacuna = 3 (nucleotídeos) / 2

(proteínas). Para nucleotídeos, a matriz de pontuação padrão usada é nwsgapdna e para proteínas a matriz de pontuação padrão é Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992,

PNAS 89, 915 a 919). Um programa de alinhamento múltiplo preferencial para alinhar sequências de proteínas da invenção EmbossWIN versão 2.10.0, com o uso dos mesmos parâmetros que para GAP acima, ou com o uso das configurações padrão (tanto para ‘needle’ quanto para ‘water’ e ambos para proteína e para alinhamentos de DNA, a penalidade de abertura de lacuna padrão é 10,0 e a penalidade de extensão de lacuna padrão é 0,5; matrizes de pontuação padrão são Blossum62 para proteínas e DNAFull para DNA). Quando as sequências têm comprimentos gerais substancialmente diferentes, os alinhamentos locais, como aqueles que usam o algoritmo Smith Waterman, são preferenciais. Alternativamente, a similaridade ou identidade percentual pode ser determinada pesquisando em bancos de dados públicos, com o uso de algoritmos como FASTA, BLAST, etc.

[0037] O alinhamento de domínios variáveis de anticorpos rearranjados pode exigir introduções de lacunas extensas no final das regiões CDR. Especialmente, a região CDR3 às vezes requer tais extensões de lacunas longas. Sem querer se limitar a nenhuma teoria, isso provavelmente se deve ao processo molecular específico de recombinação VDJ que forma CDR3. Como resultado, os programas de software padrão para alinhamento de DNA ou proteína podem falhar no alinhamento adequado dos domínios SDA reorganizados. O programa IMGT/V-QUEST (Brochet, X. et al., Nucl. Acids Res.

36, W503-508 (2008) foi especialmente desenvolvido para análise de sequência, incluindo alinhamento, de domínios variáveis de anticorpo, incluindo SDAs e é, portanto, um programa preferencial para determinar o alinhamento. O mesmo pode ser acessado da internet em www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest (IMGT/V-QUEST versão de programa: 3.4.9 datado de 9 de janeiro de 2018 – AMGT/V- QUEST lançamento do diretório de referência: 201807-3 datado de 14 fevereiro de 2018). Isso resulta no alinhamento do SDA de acordo com o sistema de numeração IMGT e identificação das três regiões CDR e quatro FR. O programa também tem uma opção para identificação de inserções e exclusões incomuns. Subsequentemente, a identidade de sequência dos CDRs e FR pode ser determinada.

[0038] Opcionalmente, ao determinar o grau de similaridade de aminoácidos, o versado também pode levar em consideração as chamadas substituições “conservativas” de aminoácidos, como será claro para o versado. As substituições conservativas de aminoácidos se referem à permutabilidade de resíduos com cadeias laterais similares.

Por exemplo, um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais hidroxil alifáticas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos conservativos preferenciais são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina. As variantes de substituição da sequência de aminoácidos aqui revelada são aquelas em que pelo menos um resíduo nas sequências reveladas foi removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. De preferência, a mudança de aminoácido é conservativa. As substituições conservativas preferenciais para cada um dos aminoácidos de ocorrência natural são as seguintes: Ala a Ser; Arg a Lys; Asn a Gln ou His; Asp a Glu; Cys a Ser ou Ala; Gln a Asn; Glu a Asp; Gly a Pro; His a Asn ou Gln; Ile a Leu ou Val; Leu a Ile ou Val; Lys a Arg; Gln ou Glu; Met a Leu ou Ile; Phe a Met, Leu ou Tyr; Ser a Thr; Thr a Ser; Trp a Tyr; Tyr a Trp ou Phe; e, Val a Ile ou Leu.

[0039] SDAs preferenciais de acordo com a invenção compreendem a sequência de aminoácidos VEDG na posição 50a- 50d. Isso está no meio da região FR2, adjacente ao resíduo Arg 50 (posição 45 de Kabat) que é frequentemente mencionado na literatura SDA como a substituição de aminoácido mais típica dos SDAs. SDAs convencionais normalmente contêm um Leu na posição IMGT 50 que faz contato hidrofóbico com o domínio VL. SDAs geralmente têm um Arg na posição 50 IMGT. Essa substituição torna a interface VL anterior mais hidrofílica. A inserção do VEDG torna a região FR2 mais hidrofílica e diminui seu ponto isoelétrico, aumentando sua solubilidade e reduzindo a chance de agregação.

[0040] Em uma modalidade preferencial, uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção compreende um ou mais domínios de ligação simples, em que um único domínio de ligação não compreende uma cadeia leve e em que o domínio de ligação único compreende a capacidade total de ligação ao antígeno. De preferência, uma proteína de ligação ao antígeno da invenção é selecionada do grupo que consiste em um anticorpo que compreende cadeias pesadas e desprovido de cadeias leves, um fragmento do mesmo, um afficorpo (Nord et al. (1997) Nature Biotechnology 15:772 a 777), um anticorpo de domínio único e um fragmento do mesmo. Exemplos de proteínas de ligação ao antígeno de acordo com a invenção são SDA derivadas de camelídeo ou anticorpos de cadeia pesada de tubarão que são naturalmente desprovidos de cadeias leves e afficorpos. De preferência, uma proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo que compreende apenas cadeias pesadas e que é naturalmente desprovido de cadeias leves ou fragmento de anticorpo das mesmas, como por exemplo um VHH (derivado de camelídeos) ou VNAR (derivado de tubarões). Alternativamente, (e também preferencial) a proteína de ligação ao antígeno da invenção pode ser derivada de um anticorpo naturalmente desprovido de cadeias leves ou um fragmento do mesmo, por exemplo, por modificação, como mutação. Podem ser obtidos anticorpos naturalmente desprovidos de cadeias leves, por exemplo, por imunização de camelídeos (por exemplo, lhamas, camelos, dromedários, camelos bactrianos, alpacas, vicunhas e guanacos) ou tubarões (ver mais adiante). Esses anticorpos compreendem apenas cadeias pesadas e são desprovidos de cadeias leves. A vantagem desses anticorpos de cadeia pesada de domínio único é que os mesmos são excepcionalmente estáveis, pequenos e são facilmente produzidos em organismos hospedeiros, como Saccharomyces cerevisiae.

[0041] Assim, uma proteína de ligação ao antígeno da invenção compreende preferencialmente um domínio variável derivado de imunoglobulina que compreende um sítio de ligação ao antígeno completo para o epítopo em uma molécula alvo em uma única cadeia polipeptídica. Essas proteínas de ligação ao antígeno incluem especificamente, sem limitação: 1) anticorpos obtidos de camelídeos e tubarões que consistem apenas em cadeias pesadas e que são naturalmente desprovidos de cadeias leves; 2) domínios variáveis dos anticorpos definidos em 1), geralmente referidos como domínios VHH ou fragmentos VNAR, coletivamente referidos aqui como anticorpos de domínio único (SDAs); 3) formas manipuladas dos anticorpos definidos em 1) ou domínios em 2), como, por exemplo, anticorpos “camelidados” ou “(camelizados)” nos quais as sequências de arcabouço de um domínio VHH de camelídeo (ou tubarão) são enxertadas com CDRs obtidas de outras fontes; 4) formas manipuladas de domínios variáveis do tipo imunoglobulina em que as sequências de arcabouço de uma variedade de moléculas do tipo imunoglobulina são combinadas com CDRs específicas para uma dada molécula alvo como, por exemplo, descrito no documento WO 04/108749.

[0042] Em uma proteína de ligação ao antígeno preferencial da invenção, a única cadeia polipeptídica do domínio variável que compreende a capacidade total de ligação ao antígeno preferencialmente tem uma sequência de aminoácidos e estrutura que pode ser considerada como sendo composta por quatro regiões de arcabouço ou “FRs” , que são referidas na técnica e aqui como “região de arcabouço 1” ou “FR1”; como “região de arcabouço 2” ou “FR2”; como “região de arcabouço 3” ou “FR3”; e como “região de arcabouço 4” ou “FR4”, respectivamente; quais regiões de arcabouço são interrompidas por três regiões determinantes de complementaridade ou “CDRs”, que são referidas na técnica como “Região Determinante de Complementaridade 1” ou “CDR1”; como “Região Determinante de Complementaridade 2” ou “CDR2”; e como “Região Determinante de Complementaridade 3” ou “CDR3”, respectivamente. Estas regiões de arcabouço e regiões determinantes de complementaridade são, de preferência, operativamente ligadas na ordem FR1-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4 (do terminal amino ao terminal carboxi).

[0043] O número total de resíduos de aminoácidos no domínio variável com capacidade total de ligação ao antígeno pode estar na região de 110-135 e, de preferência, está na região de 115-129. No entanto, um domínio variável com capacidade total de ligação ao antígeno de acordo com a invenção não é particularmente limitado quanto ao seu comprimento e/ou tamanho, uma vez que o domínio atende aos requisitos funcionais adicionais aqui descritos e/ou é adequado para os fins aqui descritos. Os resíduos de aminoácidos de um domínio variável com capacidade total de ligação ao antígeno são numerados de acordo com a numeração geral para domínios VH dada por Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest (5a Edição), Publicação NIH no 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1991)), como aplicado a domínios VHH de camelídeos por Riechmann e Muyldermans (1999, J. Immunol. Methods 231 (1-2): 25 a 38, consulte, por exemplo, a Figura 2 da dita referência) e por Harmsen et al. (2000, Molecular Immunology 37: 579 a 590, consulte, por exemplo, a Figura 1 da dita referência).

[0044] Nesse aspecto, deve-se notar que - como é bem conhecido na técnica para domínios VH e para domínios VHH - o número total de resíduos de aminoácidos em cada uma das CDRs pode variar e pode não corresponder ao número total de resíduos de aminoácidos indicados pela numeração de Kabat.

No entanto, com base nos aminoácidos conservados da região de arcabouço, um versado na técnica será capaz de alinhar as respectivas regiões de arcabouço e determinantes de complementaridade de acordo com as definições de Kabat para aqueles domínios variáveis com ligação total ao antígeno.

Exemplos dos mesmos são dados na definição das regiões determinantes de complementaridade nas sequências de aminoácidos da ligação de VHH a TeNT, imunoglobulina e albumina sérica como representado nas Figuras 1 a 3, respectivamente. Métodos alternativos para numerar os resíduos de aminoácidos de domínios VH, cujos métodos também podem ser aplicados de uma maneira análoga aos domínios VHH de camelídeos e a domínios variáveis com capacidade total de ligação ao antígeno, são o método descrito por Chothia et al. (Nature 342, 877 a 883 (1989)),

a chamada “definição AbM” e a chamada “definição de contato”, ou o sistema de numeração IMGT (Lefranc et al., 1999, Nucl. Acids Res. 27: 209-212).

[0045] Sabe-se que as três regiões hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDR1, 2 e 3) são as regiões que desempenham um papel principal na determinação real da especificidade e das características de ligação dos SDAs.

[0046] É de notar que a variação da sequência de aminoácidos na região CDR1 e na região CDR2 dentro dos vários grupos apresentados na Figura 1 é relativamente baixa, isto é, inferior do que nas partes não relacionadas com CDR dos vários SDAs. A região CDR1 compreende em média 8 ou 9 aminoácidos e a variação dentro dos grupos se refere a apenas 1 ou 2 aminoácidos, isto é, cerca de 25%. A região CDR2 mostra aproximadamente os mesmos níveis de variação.

Pode-se presumir que o nível de identidade nessa região não será inferior a 75%. Na maioria dos casos, o nível de identidade será ainda mais alto, isto é, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100%. Também é notado que a variação da sequência de aminoácidos na região CDR3, que geralmente é considerada a região mais importante envolvida na ligação, é menor do que nas partes relacionadas a CDR dos vários SDAs. Apenas como um exemplo: o nível de identidade na região CDR3 entre os quatro membros do grupo de SDA A identificados até agora e mostrados na Figura 1 é de cerca de 95%. O nível de identidade nessa região entre os três membros do grupo B é de cerca de 92% e no grupo C é de 94%. Os dois SDAs do grupo D têm um nível de identidade de CDR3 de cerca de 75%. Quanto às regiões CDR1 e CDR2, pode-se presumir que o nível de identidade nessa região não será inferior a 75%. Na maioria dos casos, o nível de identidade será ainda maior, ou seja, pelo menos 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100%.

[0047] A condição de que as identidades de sequência de aminoácidos das regiões CDR1, 2 e 3 sejam de pelo menos 75% implica que uma proteína de ligação ao antígeno que cai dentro do escopo da invenção tem uma região CDR1, 2 e 3 que tem uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 75% com aquela de qualquer uma das regiões CDR1, 2 e 3 dentro das sequências de aminoácidos selecionadas do grupo de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26.

[0048] De preferência, a proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT tem uma identidade de sequência geral com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26 que excede 70%, por exemplo, pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100% nessa ordem de preferência.

[0049] Alternativamente ou em combinação com uma modalidade anterior, em uma modalidade preferencial, as identidades de sequência das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são pelo menos 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100% nessa ordem de preferência. Essas identidades de sequência podem ser determinadas independentemente umas das outras.

[0050] Assim, uma forma preferencial dessa modalidade se refere a uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção, em que a proteína de ligação ao antígeno tem uma identidade de sequência de aminoácidos global de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou, de preferência, 100% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%. Assim, uma forma mais preferencial dessa modalidade se refere a uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção, em que a proteína de ligação ao antígeno tem uma identidade de sequência de aminoácidos global de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26, com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100%.

[0051] Uma proteína de ligação ao antígeno da invenção que pode se ligar a, que tem afinidade para, que tem a capacidade de se ligar a e/ou que tem especificidade para um antígeno específico, como TeNT, pode ser considerada “contra” ou “dirigido contra” o dito antígeno (por exemplo, TeNT). O termo “especificidade” se refere ao número de diferentes tipos de antígenos ou determinantes antigênicos aos quais uma determinada molécula de proteína de ligação ao antígeno pode se ligar. A especificidade de uma proteína de ligação ao antígeno pode ser determinada com base na afinidade e/ou avidez. A afinidade, representada pela constante de equilíbrio para a dissociação de um antígeno com uma proteína de ligação ao antígeno (KD), é uma medida para a força de ligação entre um determinante antigênico e um sítio de ligação ao antígeno na proteína de ligação ao antígeno. Alternativamente, a afinidade também pode ser expressa como a constante de afinidade (KA), que é 1/KD. A afinidade pode ser determinada de uma maneira conhecida por si só, dependendo da combinação específica da proteína de ligação ao antígeno e do antígeno de interesse. Avidez é aqui entendida como se referindo à força de ligação de uma molécula alvo com múltiplos sítios de ligação por um complexo maior de agentes de ligação, isto é, a força de ligação de ligação multivalente. A avidez está relacionada à afinidade entre um determinante antigênico e seu sítios de ligação ao antígeno na molécula de ligação ao antígeno e ao número de sítios de ligação presentes na molécula de ligação ao antígeno. A afinidade, por outro lado, se refere a sistemas de ligantes receptores monovalentes simples.

[0052] Normalmente, as proteínas de ligação ao antígeno da invenção que têm a capacidade de se ligar a TeNT irão ligar TeNT com uma constante de dissociação (KD) de cerca de 10-5 a 10-12 M ou menos, e de preferência 10-7 a 10-12 M ou menos e mais preferencialmente 10-8 a 10-12 M ou menos, e/ou com uma afinidade de ligação de pelo menos 10-7 M, preferencialmente pelo menos 10-8 M, mais preferencialmente pelo menos 10-9 M, como pelo menos 10-10, 10-11, 10-12 M ou mais. Qualquer valor de KD superior a 10-4 M (isto é, inferior a 100 µM) é geralmente considerado como indicando uma ligação não específica. De preferência, um polipeptídeo da invenção se ligará a TeNT com uma afinidade inferior a 500 nM, preferencialmente inferior a 200 nM, mais preferencialmente inferior a 10 nM, como inferior a 500 pM. A ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno a um antígeno ou determinante antigênico pode ser determinada de qualquer maneira adequada conhecida por si só, incluindo, por exemplo, análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva, como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios enzimáticos (EIA) e ensaios de competição em sanduíche, e as diferentes variantes dos mesmos conhecidas por si só na técnica.

[0053] O toxoide tetânico é uma forma atenuada de TeNT, por exemplo, um TeNT tratado com formaldeído. As proteínas de ligação ao antígeno preferenciais da invenção que têm a capacidade de se ligar a uma toxina bacteriana, como TeNT, também têm a capacidade de se ligar ao toxoide do tétano. A capacidade de ligação ao toxoide é vantajosa devido ao fato de que permite a avaliação das proteínas de ligação ao antígeno de acordo com a invenção sem requerer o uso de TeNT.

[0054] Acima, as vantagens dos SDAs sobre os anticorpos clássicos, como características de ligação, resistência à desnaturação/degradação térmica, solubilidade aquosa, distribuição corporal e penetração nos tecidos foram abordadas.

[0055] No entanto, uma desvantagem dos fragmentos de

SDA é sua meia-vida sérica relativamente curta, uma vez administrados ao corpo; sua taxa de eliminação do sangue é alta. A meia-vida típica de um VHH monovalente pode ser de cerca de 2 horas e a depuração ocorre em 1 dia (Harmsen, M.M. et al, Vaccine 23: 4926:-4934 (2005)). Essa desvantagem se deve ao seu peso molecular relativamente pequeno. Meramente como regra prática: uma molécula com um M.W. mínimo de 50 a 60 kDa, mais preferencialmente de 60 a 70 kDa, teria uma meia-vida significativamente mais longa.

[0056] Essa desvantagem pode, por exemplo, ser superada através da administração intravenosa contínua de fragmentos de SDA. Essa abordagem é do ponto de vista do bem-estar animal, praticidade e também do ponto de vista econômico, embora não seja um método preferencial. Por essa razão, outras maneiras foram tentadas e encontradas para superar esse problema.

[0057] Uma abordagem amplamente usada para reduzir a taxa de eliminação é a conjugação direta a uma segunda molécula que tem uma meia-vida sérica longa inerente. Um desses métodos é aumentar o tamanho hidrodinâmico da proteína por ligação química do polietilenoglicol (PEG), que pode produzir um medicamento com meia-vida terminal em seres humanos de até 14 dias. Outra abordagem é expressar a proteína terapêutica como uma fusão genética com uma proteína natural que tem uma meia-vida sérica longa;

albumina sérica de 67 kDa (SA) ou a porção Fc de um anticorpo, que adiciona 60 a 70 kDa adicional em sua forma dimérica natural, dependendo da glicosilação. Isso fornece compostos que têm meia-vida terminal em seres humanos de vários dias.

[0058] Na presente invenção, é escolhida outra abordagem. A solução fornecida na presente invenção e discutida em mais detalhes abaixo se refere a uma combinação de pelo menos um SDA com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção que é acoplado através de um ligante com pelo menos outro SDA que é direcionado a outra proteína (uma não-TeNT). Como aqui usado, a dita outra proteína, que não é uma proteína TeNT, é uma proteína que está presente no corpo humano ou animal, de preferência no sangue, de preferência, uma proteína sérica. Exemplos de tais proteínas serão dados abaixo, em que o conceito é explicado com mais detalhes.

[0059] Um exemplo de tal combinação é uma combinação que compreende um SDA de acordo com a invenção, com capacidade de se ligar a TeNT, um ligante e um SDA que é direcionado a outra proteína (uma não-TeNT).

[0060] Escusado será dizer que as combinações que, por exemplo, compreendem dois ou mais SDAs com a capacidade de se ligar a TeNT conectado por meio de um ligante e ainda conectado por meio de um ligante com, por exemplo, pelo menos um SDA que é direcionado a outra proteína (não-TeNT), de preferência uma proteína sérica, pode até ser mais eficiente na neutralização de TeNT. De preferência, os dois ou mais SDAs com capacidade de se ligar a TeNT seriam direcionados contra diferentes epítopos de TeNT.

[0061] Como aqui usado, quaisquer combinações de pelo menos um SDA com a capacidade de se ligar a TeNT, pelo menos um ligante e pelo menos um outro SDA que é direcionado a outra proteína (não TeNT) também são referidas como um construto polipeptídico. A seção de Exemplos abaixo fornece exemplos amplos de tais construtos polipeptídicos.

[0062] O conceito de um ligante é discutido abaixo com mais detalhes. Basicamente, a função de um vinculador é conectar SDAs. O ligante é um peptídeo relativamente curto que adota uma conformação flexível e não estruturada. Em princípio, o peptídeo ligante não deve, ou tão pouco quanto possível, interferir na atividade de montagem e ligação dos domínios que o mesmo conecta.

[0063] Um construto polipeptídico de acordo com a invenção poderia, por exemplo, têm um tamanho de cerca de 2 x 15 kDa para um construto polipeptídico que compreende um SDA com capacidade de se ligar a um epítopo TeNT, um ligante e um segundo SDA com capacidade de se ligar a outra proteína. O mesmo teria, por exemplo, um tamanho de cerca de 3 x 15 kDa para um construto polipeptídico que compreende um SDA com capacidade de se ligar a um primeiro epítopo TeNT, um segundo SDA com capacidade de se ligar a um segundo epítopo TeNT e um terceiro SDA com capacidade de se ligar a outra proteína.

[0064] A vantagem de tais construtos polipeptídicos é que o seu comprimento relativamente curto torna facilmente possível sintetizar o mesmo quimicamente ou expressar um fragmento de DNA que codifica o construto polipeptídico em um sistema de expressão adequado de uma forma economicamente viável.

[0065] Indiscutivelmente, tais construtos polipeptídicos, como tal, ainda teriam, em princípio, uma meia-vida relativamente curta (seu MW ainda estaria abaixo de 50 a 60 kDa, ou abaixo de 60 a 70 kDa), mas os mesmos diferem significativamente dos construtos monoméricos descritos acima naquele administrados ao corpo, os mesmos se ligam por meio de seu “SDA com capacidade de se ligar a outra proteína” à dita outra proteína, levando assim a uma molécula que tem um tamanho consideravelmente maior do que o construto polipeptídico como tal. Os construtos polipeptídicos ligados resultantes teriam MW que excedem significativamente 60 kDa.

[0066] Essa abordagem tem a vantagem de que os construtos polipeptídicos podem ser facilmente produzidas

(vide supra) e, ao mesmo tempo, resolve o problema da meia- vida curta de moléculas pequenas: uma vez administradas, se formarão moléculas grandes que superam esse problema.

[0067] A dita outra proteína (a não-TeNT) seria preferencialmente uma proteína sérica, de modo que o SDA com capacidade de se ligar à dita outra proteína (a não- TeNT) entraria facilmente em contato próximo com aquela proteína após a administração parenteral.

[0068] Assim, em uma modalidade, a invenção se refere a uma forma particular de uma proteína de ligação ao antígeno da invenção: uma proteína de ligação ao antígeno multivalente. A proteína de ligação ao antígeno multivalente compreende as sequências de aminoácidos de pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT conforme definido acima e de pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno que tem a capacidade de se ligar a uma proteína sérica. As sequências de aminoácidos das pelo menos duas proteínas de ligação ao antígeno serão geralmente fundidas cabeça com cauda, isto é, o terminal C da sequência mais terminal N fundido com o terminal N da segunda sequência e assim por diante. As sequências de aminoácidos de pelo menos duas proteínas de ligação ao antígeno podem ser fundidas diretamente ligadas ou por meio de um ligante ou espaçador. As proteínas de ligação ao antígeno multivalentes da invenção podem ser produzidas pela expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína multivalente em que duas ou mais sequências de codificação das proteínas de ligação ao antígeno estão operativamente ligadas entre si no mesmo quadro de leitura. O versado na técnica saberá como fundir operacionalmente sequências de codificação de proteínas.

[0069] Assim, em outro aspecto, a presente invenção se refere a um construto polipeptídico (ou proteína de fusão) que compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção e pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a uma proteína sérica. As duas ou mais sequências de aminoácidos estão preferencialmente ligadas entre si por uma fusão genética em que as sequências de nucleótidos que codificam as respectivas sequências de aminoácidos estão operacionalmente ligadas umas às outras no quadro por meios conhecidos por si só na técnica. As sequências de aminoácidos podem ser ligadas diretamente ou opcionalmente através de um espaçador ou sequência de aminoácidos ligante.

[0070] Além disso, essa proteína sérica seria de preferência uma proteína relativamente grande: o tamanho do produto formado após a ligação da construção polipeptídica à proteína sérica deve, de preferência, exceder 60 kDa para fornecer uma meia-vida mais longa. Exemplos de proteínas séricas grandes são, entre outros, albumina sérica e imunoglobulina sérica (Ig), por exemplo, imunoglobulina G (IgG).

[0071] Portanto, uma forma preferencial dessa modalidade da presente invenção se refere a um construto polipeptídico que compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção e pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a uma proteína sérica em que a dita proteína sérica é albumina sérica, preferencialmente albumina sérica Equina, Porcina, Felina ou Canina.

[0072] Em modalidades preferenciais, o construto polipeptídico que compreende pelo menos um SDA com capacidade de se ligar a uma proteína sérica de acordo com a invenção e pelo menos um SDA com capacidade de se ligar a TeNT tem pelo menos um SDA que se liga a um epítopo linear e pelo menos um segundo SDA que se liga a um epítopo conformacional. Mais preferencialmente, o construto tem um SDA que se liga a um epítopo linear e dois SDAs que se ligam a um epítopo conformacional.

[0073] Portanto, uma modalidade altamente preferencial se refere a um construto polipeptídico que compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno, de preferência uma SDA, com capacidade de se ligar a uma proteína sérica e pelo menos uma primeira e uma segunda proteína de ligação ao antígeno, de preferência cada um SDA, com capacidade de ligação a uma toxina bacteriana, preferencialmente uma toxina de Clostridium, mais preferencialmente uma toxina de Cl. tetani, Cl. botuli ou Cl. Difficile, mais preferencialmente TeNT, em que a primeira proteína de ligação à toxina se liga a um epítopo linear, mais preferencialmente em que a primeira proteína de ligação à toxina se liga a um epítopo linear e a segunda proteína de ligação à toxina se liga a um epítopo conformacional.

[0074] Outra modalidade altamente preferencial se refere a um construto polipeptídico que compreende pelo menos uma primeira e uma segunda proteína de ligação ao antígeno, de preferência cada um SDA, com capacidade de se ligar a uma toxina bacteriana, preferencialmente uma toxina de Clostridium, mais preferencialmente uma toxina de Cl.

tetani, Cl. botuli ou Cl. Difficile, mais preferencialmente TeNT, em que a primeira proteína de ligação à toxina se liga a um epítopo linear, mais preferencialmente em que a primeira proteína de ligação à toxina se liga a um epítopo linear e a segunda proteína de ligação à toxina se liga a um epítopo conformacional.

[0075] A albumina sérica está presente no corpo em concentrações relativamente altas. Isso significa que um construto polipeptídico de acordo com a invenção que compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar à albumina sérica, uma vez administrado ao corpo, formaria facilmente um grande produto através da ligação à albumina sérica. No entanto, também para a proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar à albumina sérica, um baixo valor de KD, por exemplo, abaixo de 1 microM seria o preferencial. A presente invenção fornece proteínas de ligação ao antígeno com a capacidade de se ligarem à albumina sérica. Seis exemplos de tais proteínas de ligação ao antígeno e suas sequências são fornecidos na Figura 3. As três regiões sombreadas indicam onde as regiões hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs) estão localizadas. A presente invenção, de fato, fornece SDAs que se ligam à albumina sérica com um KD baixo (0,5 a 300 nM), como pode ser visto na Tabela 28.

[0076] A Tabela 18 e a Figura 6 na seção de exemplo mostram, entre outros, os resultados da meia-vida em porcos de vários construtos polipeptídicos em que um SDA com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção é acoplado a um SDA com capacidade de se ligar a albumina sérica de acordo com a invenção. Como se torna imediatamente evidente a partir da tabela, tais construtos polipeptídicos têm uma meia-vida média surpreendentemente alta de entre 100 e 150 horas. Uma meia-vida similar (117 horas) foi relatada (Hoefman et al., 2015) para outros anticorpos de domínio único estendido de meia-vida de albumina.

A Tabela 33 na seção do Exemplo (exemplo 23)

mostra a constatação surpreendente de que um construto polipeptídico, em que um SDA com capacidade de se ligar a

TeNT de acordo com a invenção é acoplado a um SDA com capacidade de se ligar a albumina sérica de acordo com a invenção, quando administrado a Equinos, teve uma meia-vida média entre 396 e 609 horas.

Construtos polipeptídicos preferenciais de acordo com a invenção, que compreendem pelo menos um SDA de acordo com a invenção com capacidade de se ligar a TeNT, e pelo menos um SDA de acordo com a invenção com capacidade de se ligar a uma proteína sérica

(como SVA12), têm uma meia-vida média de pelo menos 200 horas, de preferência de pelo menos 250 horas, mais preferencialmente de pelo menos 300 horas, ainda mais preferencialmente de pelo menos 350 horas, ainda mais preferencialmente de pelo menos 375 horas, ainda mais preferencialmente de pelo menos 380 horas, ainda mais preferencialmente de pelo menos 390 horas, ainda mais preferencialmente de pelo menos 395 horas, ainda mais preferencialmente de pelo menos 450 horas, ainda mais preferencialmente de pelo menos 475 horas, mais preferencialmente ainda de pelo menos 500 horas, ainda mais preferencialmente de pelo menos 550 horas, com máxima preferência de pelo menos 600 horas; em que a meia-vida é de preferência meia-vida em cavalos, mais preferencialmente conforme determinado no exemplo 23.

[0077] Ainda mais surpreendente, a presente invenção, entre outros, fornece SDAs que mostram uma grande extensão de ligação entre espécies. A ligação entre espécies é entendida como a ligação à albumina sérica de mais de uma espécie. Seis exemplos de SDAs com capacidade de se ligarem à albumina sérica de acordo com a invenção e suas sequências são fornecidos na Tabela 6 e são discutidos abaixo.

[0078] Uma vantagem clara dos SDAs com ligação entre espécies, isto é, com capacidade de se ligar à albumina sérica de mais de uma espécie animal, teria a vantagem de poderem ser usados em um construto polipeptídico de acordo com a invenção que pode ser usada em mais de um animal espécies.

[0079] Assim, em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno que se liga especificamente à albumina sérica, em que a proteína de ligação ao antígeno compreende preferencialmente uma sequência de aminoácidos que compreende 4 regiões de arcabouço, FR1 a FR4, e 3 regiões determinantes de complementaridade, CDR1 a CDR3, que estão operacionalmente ligadas na ordem FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. De preferência, a CDR1 tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de CDR1 das sequências VHH SEQ ID NO: 37 a 42, como mostrado na

Figura 2 ou uma sequência de aminoácidos que difere da CDR1 em um ou dois dos resíduos de aminoácidos; b) a CDR2 tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de CDR2 das sequências VHH SEQ ID

NO: 37 a 42, como mostrado na Figura 2 ou uma sequência de aminoácidos que difere da CDR2 em um, dois, três ou quatro dos resíduos de aminoácidos; e, c) a CDR3 tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de CDR3 das sequências VHH SEQ ID NO: 37 a 42,

como mostrado na Figura 2 ou uma sequência de aminoácidos que difere do CDR3 em um, dois, três, quatro ou cinco dos resíduos de aminoácidos; e em que cada uma das regiões de arcabouço tem pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,

90, 95 ou 100% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de estrutura de qualquer uma das SEQ ID NO:

37 a 42, como mostrado na Figura 2. De preferência, CDR1,

CDR2 e CDR3 são da mesma SEQ ID NO.

Mais preferencialmente,

a região de arcabouço é da mesma SEQ ID NO que as regiões determinantes de complementaridade.

Alternativamente dito,

nesse aspecto, a invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno, de preferência um SDA, com capacidade de se ligar à albumina sérica, em que a proteína de ligação ao antígeno tem uma identidade de sequência de aminoácidos global de pelo menos 70% com uma sequência selecionada de o grupo que consiste em SEQ ID NO: 40, 37, 38, 39, 41 ou 42 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

De preferência, a proteína de ligação ao antígeno tem a capacidade de se ligar à albumina sérica Equino, Porcino, Felino ou Canino.

[0080] De preferência, uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar à albumina sérica de acordo com a invenção tem uma identidade de sequência geral com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 e 42 que excede 70%, por exemplo, pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100% nessa ordem de preferência. De preferência, o nível de identidade das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 é de pelo menos 75%.

[0081] Alternativamente ou em combinação com uma modalidade anterior, em uma modalidade preferencial, as identidades de sequência das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são pelo menos 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100% nessa ordem de preferência. Essas identidades de sequência podem ser determinadas independentemente umas das outras.

[0082] Assim, uma forma preferencial dessa modalidade se refere a uma proteína de ligação ao antígeno com a capacidade de se ligar à albumina sérica de acordo com a invenção que tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou de preferência 100% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 e 42 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%. Assim, uma forma mais preferencial dessa modalidade se refere a uma proteína de ligação ao antígeno com a capacidade de se ligar à albumina sérica de acordo com a invenção, em que a proteína de ligação ao antígeno tem uma identidade de sequência de aminoácidos global de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 e 42, com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100%.

[0083] Conforme mencionado acima, proteínas com ligação a antígenos com capacidade de se ligar à albumina sérica de mais de uma espécie animal teriam a vantagem de poderem ser usados em um construto polipeptídico de acordo com a invenção que pode ser usada em mais de um animal espécies. A presente invenção fornece várias proteínas de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar à albumina do soro mostrando essa ligação de espécies cruzadas. Como pode ser visto na Tabela 6, especialmente SVA12L (SEQ ID NO: 40) e SVA06L (SEQ ID NO: 39) fornecem forte ligação cruzada de espécies no sentido de que se liga à albumina sérica de caninos, equinos, felinos e suínos. Como também pode ser visto nas Tabelas 6 e 28, especialmente SVA16L (SEQ ID NO: 37) fornece forte ligação cruzada de espécies no sentido de que se liga à albumina sérica de caninos, equinos e felinos.

[0084] Portanto, uma forma mais preferencial dessa modalidade se refere a uma proteína de ligação ao antígeno com a capacidade de se ligar à albumina sérica de acordo com a invenção que tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 37, 39 e 40 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos do CDR1, CDR2 e CDR3 sejam pelo menos 75%, de preferência pelo menos 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%.

[0085] Portanto, uma forma mais preferencial de uma modalidade da presente invenção se refere a um construto polipeptídico (ou proteína de fusão) que compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção e pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de ligação à albumina do soro, em que a dita pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar à albumina sérico é preferencialmente uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção, conforme referido acima.

[0086] Outra forma preferencial de uma modalidade da presente invenção se refere a um construto polipeptídico (ou proteína de fusão) que compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção e pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a uma proteína sérica, em que a dita proteína sérica é uma imunoglobulina.

[0087] Uma forma mais preferencial dessa modalidade se refere a um construto polipeptídico de acordo com a invenção que compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT e pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a uma proteína sérica, em que a dita proteína sérica é uma imunoglobulina IgG, preferencialmente equina, suína, camundongo, porquinho da índia, humano, bovino, felino ou canino.

[0088] As imunoglobulinas, como a albumina sérica, estão presentes no corpo em concentrações relativamente altas. Isso significa que um construto polipeptídico de acordo com a invenção que compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar à imunoglobulina, uma vez administrado ao corpo, formaria facilmente um grande produto através da ligação à imunoglobulina. No entanto, também para a proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a imunoglobulina, um valor de KD baixo, por exemplo, abaixo de 1 µM seria preferencial.

[0089] A presente invenção fornece proteínas de ligação ao antígeno que se ligam a Ig com um KD adequado.

Oito exemplos de proteínas de ligação ao antígeno de acordo com a invenção que se ligam a imunoglobulina com um KD baixo e suas sequências são fornecidos na Figura 2. As três regiões sombreadas indicam onde as regiões hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs) estão localizadas.

[0090] Assim, em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno que se liga especificamente à imunoglobulina (Ig), em que a proteína de ligação ao antígeno compreende preferencialmente uma sequência de aminoácidos que compreende 4 regiões de arcabouço, FR1 a FR4, e 3 regiões determinantes de complementaridade, CDR1 a CDR3, que estão operacionalmente ligadas na ordem FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. De preferência, a CDR1 tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de CDR1 das sequências VHH SEQ ID NO: 27 a 34, como mostrado na

Figura 3 ou uma sequência de aminoácidos que difere da CDR1 em um ou dois dos resíduos de aminoácidos; b) a CDR2 tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de CDR2 das sequências VHH SEQ ID

NO: 27 a 34, como mostrado na Figura 3 ou uma sequência de aminoácidos que difere da CDR2 em um, dois, três ou quatro dos resíduos de aminoácidos; e, c) a CDR3 tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de CDR3 das sequências VHH SEQ ID NO: 27 a 34,

como mostrado na Figura 3 ou uma sequência de aminoácidos que difere do CDR3 em um, dois, três, quatro ou cinco dos resíduos de aminoácidos; e em que cada uma das regiões de arcabouço tem pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,

27 a 34, como mostrado na Figura 3. De preferência, CDR1, CDR2 e CDR3 são da mesma SEQ ID NO. Mais preferencialmente, a região de arcabouço é da mesma SEQ ID NO que as regiões determinantes de complementaridade. Alternativamente dito, nesse aspecto, a invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno, de preferência um anticorpo de domínio único (SDA), com capacidade de se ligar à imunoglobulina (Ig), em que a proteína de ligação ao antígeno tem uma identidade de sequência de aminoácidos global de pelo menos 70% com uma sequência selecionada de o grupo que consiste em SEQ ID NO: 30, 27, 28, 29, 31, 32, 33 ou 34 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

[0091] De preferência, uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a Ig tem uma identidade de sequência geral com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34 que excede 70%, por exemplo, pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100% nessa ordem de preferência. De preferência, as identidades de sequência das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 é de pelo menos 75%.

[0092] Assim, uma forma preferencial dessa modalidade se refere a uma proteína de ligação ao antígeno com a capacidade de se ligar à Ig de acordo com a invenção que tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

[0093] Mais preferencialmente, um SDA com capacidade de se ligar a Ig terá um nível de homologia geral com uma sequência selecionada do grupo de SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34, que excede 70%, por exemplo 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100% nessa ordem de preferência, onde preferencialmente, o nível de identidade da região CDR1, CDR2 e CDR3 será 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100% nessa ordem de preferência.

[0094] Assim, uma forma mais preferencial dessa modalidade se refere a uma proteína de ligação ao antígeno com a capacidade de se ligar à Ig de acordo com a invenção que tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82,

83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34, com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100%.

[0095] De acordo com a Tabela 7, o SVG 23 é específico para caninos, enquanto o SVG03 é específico para equinos.

[0096] Ainda mais surpreendentemente, a presente invenção fornece SDAs com capacidade de se ligar a Ig que mostram uma grande extensão de ligação entre espécies. Como também pode ser visto na Tabela 7, especialmente SVG06 e SVG13 fornecem ligação cruzada de espécies muito forte no sentido de que se ligam a Ig (fragmento Fab) de, por exemplo, felinos, caninos, equinos, humanos e suínos.

Também de acordo com a Tabela 7, especialmente SVG24 fornece uma ligação cruzada muito forte entre espécies no sentido de que se liga a Ig (fragmento Fc) tanto de caninos como de equinos.

[0097] Portanto, uma forma ainda mais preferencial dessa modalidade se refere a uma proteína de ligação ao antígeno com a capacidade de se ligar à Ig de acordo com a invenção que tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79,

80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27, 30, 31, 32 e 33 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

[0098] Uma forma ainda mais preferencial dessa modalidade se refere a uma proteína de ligação ao antígeno com a capacidade de se ligar à Ig de acordo com a invenção que tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou de preferência 100% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27, 30, 31, 32 e 33, com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100%.

[0099] Portanto, uma outra forma mais preferencial de uma modalidade da presente invenção se refere a um construto polipeptídico (ou proteína de fusão) que compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção e pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de ligação à proteína sérica, em que a dita proteína sérica é uma Ig, em que a dita proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar à Ig é preferencialmente uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção, conforme referido acima.

[00100] Deve ser notado que, geralmente, a ordem das várias proteínas de ligação ao antígeno no construto polipeptídico de acordo com a invenção (sua localização em relação ao terminal N e terminal C do construto polipeptídico) pode variar. Isso se deve ao fato de a dobradiça (ou dobradiças) adotar uma conformação não estruturada e flexível; sua principal função é conectar as várias proteínas de ligação ao antígeno.

[00101] Conforme indicado acima, em um aspecto, a presente invenção se refere a um construto polipeptídico (ou proteína de fusão) que compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção e pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a uma proteína sérica. Ainda mais surpreendentemente, um efeito sinérgico inesperado foi encontrado para construtos polipeptídicos de acordo com a invenção que compreendem dois ou mais SDAs com capacidade de se ligar a TeNT.

Construtos bivalentes fornecem um nível ainda mais forte de ligação a TeNT no teste de neutralização de toxina de camundongo do que, por exemplo, uma mistura de dois construtos de valência única. Esse efeito é ainda mais significativo quando o construto polipeptídico compreende dois ou mais SDAs com capacidade de se ligar a TeNT que se ligam a diferentes epítopos de TeNT. Isso pode ser visto na Tabela 15, onde uma visão geral é mostrada das características de ligação ao epítopo de vários SDAs com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção.

[00102] Como fica imediatamente claro na Tabela 12, cinco seleções diferentes de SDAs com capacidade de se ligar a TeNT foram identificadas: seleção A; SVT02, seleção B; SVT03, seleção C; SVT15, seleção D; SVT06/08 e seleção E; SVT13/16/22/34.

[00103] Constatou-se, por exemplo, que um construto polipeptídico que compreende dois SDAs: (i) um SDA com capacidade de se ligar a TeNT e que tem a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 17 e (ii) um SDA com capacidade de se ligar a TeNT e que tem a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 15, fornece um forte efeito sinérgico. A capacidade de neutralização de TeNT de tal construto é significativamente mais forte do que a de SVT-06 e SVT-16 SDAs únicos (consulte as Tabelas 19 e 20, exemplo 17).

[00104] Por esta razão, em uma modalidade ainda mais preferencial, um construto polipeptídico de acordo com a invenção compreende pelo menos duas proteínas de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção. De preferência, cada uma das pelo menos duas proteínas de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com uma sequência selecionada da seleção A; SEQ ID NO: 24, ou seleção B; SEQ ID NO: 25, ou seleção C; SEQ ID NO: 20, ou seleção D; SEQ ID NO: 17 ou 19 ou seleção E; SEQ ID NO: 22, 15, 23 ou 14, com a condição de que os pelo menos dois SDAs não compreendam uma sequência da mesma seleção e com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%. Assim, alternativamente dito, cada uma das pelo menos duas proteínas de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em: (I) SEQ ID NO:24; (II) SEQ ID NO:25; (III) SEQ ID NO:20; (IV) SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:19; e (V) SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23 ou SEQ ID NO:14; com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

[00105] Um construto polipeptídico de acordo com a invenção compreende preferencialmente 2, 3 ou 4 proteínas de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção, mais preferencialmente 2 ou 3, mais preferencialmente 2 proteínas de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT. Em uma modalidade preferencial, um construto polipeptídico de acordo com a invenção compreende duas proteínas de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT e que têm uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com as sequências: (I) SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:17; (II) SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO:17; (III) SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:17; (IV) SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:24; ou (V) SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:20; com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

[00106] Um construto polipeptídico de acordo com a invenção de preferência compreende uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a uma proteína sérica.

[00107] Meramente como um exemplo: tal construto polipeptídico de acordo com a invenção poderia, por exemplo, compreender um SDA com capacidade de se ligar a

TeNT tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com a seleção C; SEQ ID NO: 20 com a condição de que a identidade de sequência de aminoácidos da região CDR1, CDR2 e CDR3 tenha uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, e um SDA com capacidade de se ligar a TeNT tenha uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com seleção D; SEQ ID NO: 17 com a condição de que a identidade de sequência de aminoácidos da região CDR1, CDR2 e CDR3 tenha uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 75%.

[00108] De preferência, as proteínas de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de tais construtos têm uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou preferencialmente 100% com a sequência selecionada dentre a seleção A; SEQ ID NO: 24, ou seleção B; SEQ ID NO: 25, ou seleção C; SEQ ID NO: 20, ou seleção D; SEQ ID NO: 17 ou 19 ou seleção E; SEQ ID NO: 22, 15, 23 ou 14.

[00109] Mais preferencialmente, as proteínas de ligação ao antígeno de tais construtos têm uma identidade geral de sequência de aminoácidos de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 , 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou de preferência 100% com a sequência selecionada dentre a seleção A; SEQ ID NO: 24, ou seleção B; SEQ ID NO: 25, ou seleção C; SEQ ID NO: 20, ou seleção D; SEQ ID NO: 17 ou 19 ou seleção E; SEQ ID NO: 22, 15, 23 ou 14, as identidades de sequência de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são de pelo menos 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mesmo 100%.

[00110] Em uma modalidade mais preferencial, um construto polipeptídico de acordo com a invenção compreende a proteína de ligação ao antígeno que tem a sequência representada na SEQ ID NO: 15, a proteína de ligação ao antígeno que tem a sequência representada na SEQ ID NO: 17 e a proteína de ligação ao antígeno que tem a sequência representada na SEQ ID NO: 40. Mais preferencialmente, o construto polipeptídico compreende o SDA com a sequência representada na SEQ ID NO: 17 (SVT-06), o SDA que tem a sequência representada na SEQ ID NO: 15 (SVT16) e o SDA que tem a sequência representada na SEQ ID NO: 40 (SVA12) na ordem específica terminal N- SEQ ID NO: 17-SEQ ID NO: 15- SEQ ID NO: 40-terminal C. Ainda mais preferencialmente, o construto polipeptídico tem a sequência de aminoácidos conforme representado na SEQ ID NO: 51, 77 ou 78, de preferência 51 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,

83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 , 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou de preferência 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 51, 77 ou 78, de preferência 51, em que as identidades de sequência das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são pelo menos 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou de preferência 100%. O construto polipeptídico pode, por exemplo, ser alterado pela exclusão do marcador His6 e/ou alterando ou substituindo as sequências do ligante conforme representado na SEQ ID NO: 51, 77 ou 78, de preferência 51.

[00111] Em modalidades altamente preferenciais, o construto polipeptídico tem a sequência de aminoácidos conforme representado na SEQ ID NO: 51 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%, de preferência 80%, mais preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95%, ainda mais preferencialmente 98%, com a máxima preferência 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 51, em que as identidades de sequência das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são pelo menos 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%, preferencialmente 80%, mais preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95%, ainda mais preferencialmente 98%, com a máxima preferência

100%. O construto polipeptídico pode, por exemplo, ser alterado pela exclusão do marcador His6 e/ou alterando ou substituindo as sequências do ligante conforme representado na SEQ ID NO: 51.

[00112] Em modalidades altamente preferenciais, o construto polipeptídico tem a sequência de aminoácidos conforme representado na SEQ ID NO: 77 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%, de preferência 80%, mais preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95%, ainda mais preferencialmente 98%, com a máxima preferência 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 77, em que as identidades de sequência das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são pelo menos 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%, preferencialmente 80%, mais preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95%, ainda mais preferencialmente 98%, com a máxima preferência 100%. O construto polipeptídico pode, por exemplo, ser alterado pela exclusão do marcador His6 e/ou alterando ou substituindo as sequências do ligante conforme representado na SEQ ID NO: 77.

[00113] Em modalidades altamente preferenciais, o construto polipeptídico tem a sequência de aminoácidos conforme representado na SEQ ID NO: 78 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%, de preferência 80%, mais preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95%, ainda mais preferencialmente 98%, com a máxima preferência 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 78, em que as identidades de sequência das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são pelo menos 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%, preferencialmente 80%, mais preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95%, ainda mais preferencialmente 98%, com a máxima preferência 100%. O construto polipeptídico pode, por exemplo, ser alterado pela exclusão do marcador His6 e/ou alterando ou substituindo as sequências do ligante conforme representado na SEQ ID NO: 78.

[00114] Em uma forma mais preferencial, o construto polipeptídico de acordo com a invenção tem a sequência representada na SEQ ID NO: 51, 47, 48, 52, 53, 61, 62, 49, 50, 77 ou 78, de preferência conforme descrito em SEQ ID NO: 51, 47, 48, 52, 53, 61, 62, 49, 77 ou 78, mais preferencialmente conforme descrito em SEQ ID NO: 51, 47, 48, 52, 53, 61, 62 ou 49, com a máxima preferência conforme descrito em SEQ ID NO: 51, em que as identidades de sequência das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são pelo menos 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou de preferência 100%.

[00115] Foi também surpreendentemente notado que combinações de diferentes SDAs de acordo com a invenção, quando misturados, mostram um efeito de neutralização de toxina mais forte em um teste de neutralização de toxina do tétano de camundongo (TNT). Isso é mostrado nas Tabelas 21 a 23 da seção de Exemplos. As Tabelas 21 e 24 mostram as várias combinações testadas. A Tabela 24 mostra que o único SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 fornece 50% de proteção em camundongos em uma determinada diluição, enquanto a combinação de SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2- SVA12M2-H6 e SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 fornece 100% de proteção em camundongos na mesma diluição.

[00116] Como mencionado acima, os vários SDAs em construtos polipeptídicos de acordo com a invenção são preferencialmente conectados uns aos outros através de peptídeos ligantes. Os peptídeos ligantes são sequências de aminoácidos comumente usados para conectar fisicamente domínios polipeptídicos.

[00117] Tal ligante pode ser qualquer ligante conhecido pelo versado na técnica. Por exemplo, o ligante pode ser um polímero biocompatível com um comprimento de 1 a 100 átomos. Isso pode, por exemplo, ser um polímero existente de resíduos de poli-lisina, poli-glicina, poli- glutamato, poli-isoleucina, poli-serina ou poli-arginina, ou uma combinação dos mesmos. A maioria dos peptídeos de ligação são compostos de módulos repetitivos de um ou mais dos aminoácidos glicina e serina. Meramente como um exemplo: tais ligantes podem, por exemplo, ter as seguintes sequências: Gly4- Ser-Gly3-Ser ou (Gly4-Ser)n, em que n é 2, 3, 4, 5 ou 6, preferencialmente 4, 5 ou 6.

[00118] De preferência, é usado o ligante de 15 aminoácidos (G4S)3 que é composto por três repetições consecutivas da sequência de aminoácidos (Gly)4 -Ser. Este ligante foi inicialmente usado para a produção de Fvs de cadeia simples [27], mas também tem sido frequentemente usado para a fusão de VHHs [28]. É um ligante flexível que facilita a ligação independente a diferentes sítios antigênicos. Esse peptídeo ligante foi bem caracterizado na técnica (por exemplo, dentro do contexto de um domínio Fv de cadeia simples (scFv) de um anticorpo) e demonstrou adotar uma conformação flexível não estruturada. Além disso, esse peptídeo ligante não interfere na atividade de montagem e ligação dos domínios que o mesmo conecta.

(Freund, C. et al., FEBS 320: 97 (1993)). Outros exemplos de dobradiças adequadas são fornecidos, entre outros, no documento EP2655624.

[00119] Outros ligantes mais rígidos para fusão de domínios de proteína também são conhecidos. Huston JS, et al., Proc Natl Acad Sci. 1988;85:5879-83, [28] Mukherjee J, et al., PLoS ONE. 2012;7: e29941, [29] Sepulveda J, et al., Infect Immun. 2010;78:756-63, [30] Vance DJ, et al., J Biol Chem. 2013;288:36538-47, [31] Klein JS, et al., Protein Eng Des Sel. 2014;27:325-30, Trinh R, et al., Mol Immunol.

2004;40:717-22.

[00120] A seção de Exemplos (vide infra) apresenta exemplos de ligantes usados na presente invenção.

[00121] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um fragmento de DNA que codifica uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção ou que codifica um construto polipeptídico de acordo com a invenção. Tais fragmentos de DNA compreendem a informação genética que codifica o SDA ou construto polipeptídico.

[00122] Em outro aspecto, a invenção se refere a um ácido nucleico que compreende um fragmento de DNA que codifica uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção ou um construto polipeptídico de acordo com a invenção como aqui definido acima. Um ácido nucleico preferencial de acordo com a invenção é um construto de ácido nucleico, como, por exemplo, um plasmídeo, em que o fragmento de DNA está operacionalmente ligado a um promotor e opcionalmente a outros elementos reguladores, como, por exemplo, terminadores, intensificadores, sinais de poliadenilação, sequências de sinal para secreção e similares.

Tais construtos de ácido nucleico são particularmente úteis para a produção das proteínas de ligação ao antígeno ou construtos polipeptídicos da invenção com o uso de técnicas recombinantes em que uma sequência de nucleotídeos (fragmento de DNA) que codifica a proteína de ligação ao antígeno de interesse é expressa em células hospedeiras adequadas, como descrito em Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene

Publishing e Wiley Interscience, Nova York (1987) e em

Sambrook e Russell (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory

Manual (3a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold

Spring Harbor Laboratory Press, Nova York). Como aqui usado, o termo “operacionalmente ligado” se refere a uma ligação de elementos polinucleotídicos em uma relação funcional.

Um ácido nucleico está “operacionalmente ligado”

quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico.

Por exemplo, um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se afetar a transcrição da sequência de codificação.

Ligado operacionalmente significa que as sequências de DNA sendo ligadas são tipicamente contíguas e, quando necessário para unir duas regiões de codificação de proteínas, contíguas e em fase de leitura.

[00123] Um promotor adequado é um promotor que é reconhecido em uma célula hospedeira e conduz nessa célula hospedeira a expressão da informação genética que a mesma controla. Combinações de promotor/célula hospedeira adequadas já são conhecidas há décadas na técnica.

[00124] Tais ácidos nucleicos podem ser inseridos em uma célula hospedeira adequada permitindo a expressão da proteína de ligação ao antígeno ou do construto polipeptídico sob o controle do promotor adequado.

[00125] A expressão de fragmentos de DNA que compreendem um ácido nucleico que codifica qualquer um dos SDAs de acordo com a invenção ou qualquer um dos construtos polipeptídicos de acordo com a invenção pode ser realizada em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas. Os sistemas de expressão em todas essas células hospedeiras são conhecidos na técnica há décadas.

[00126] Um livro clássico que descreve vários sistemas de expressão é “Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems” por Gerd Gellissen (Editor). ISBN: 978-3-527- 31036-4, dezembro de 2004, Editora Wiley-Blackwell.

[00127] Uma visão geral dos métodos para a expressão de proteínas heterólogas em células de inseto é fornecida em “Opportunities and challenges for the baculovirus expression system”, (Monique M. van Oers, Journal of

Invertebrate Pathology, Volume 107, Suplemento, julho de 2011, páginas S3–S15). Métodos específicos para a expressão de SDAs de camelídeos em hospedeiros eucarióticos inferiores, como bolores e leveduras, são apresentados, entre outros, no documento EP0698097. Além disso, a seção de Exemplos, mais especificamente os Exemplos 6 e 14 (vide infra), fornece exemplos detalhados da expressão de SDAs em levedura.

[00128] Assim, em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico conforme definido acima. De preferência, a célula hospedeira é uma célula hospedeira para a produção de uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção ou um construto polipeptídico de acordo com a invenção.

[00129] A célula hospedeira pode ser qualquer célula hospedeira com capacidade de produzir uma proteína de ligação ao antígeno da invenção, incluindo, por exemplo, uma célula hospedeira procariótica, como, por exemplo, E.

coli, ou uma célula hospedeira de mamífero, planta, inseto, fungo ou levedura (cultivada), incluindo, por exemplo, células CHO, células BHK, linhas celulares humanas (incluindo HeLa, COS e PER.C6), células Sf9 e células Sf+.

Uma célula hospedeira preferencial para a produção de uma proteína de ligação ao antígeno da invenção é, no entanto, uma célula de um micro-organismo eucariótico, como leveduras e fungos filamentosos. Célula hospedeira de levedura preferencial, por exemplo, incluem, por exemplo Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Pichia angusta e Kluyveromyces lactis. As cepas, construtos e condições de fermentação preferenciais para a produção da proteína de ligação ao antígeno da invenção são descritos por van de Laar, et al., (2007, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 96, no 3: 483 a 494). Por exemplo, a produção das proteínas de ligação ao antígeno pode ser realizada em biorreatores padrão com um volume de trabalho entre 10 e 10.000 litros.

[00130] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para a produção de uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção ou um construto polipeptídico de acordo com a invenção, em que o dito método compreende as etapas de a) cultivar uma célula hospedeira que compreende um antígeno de ligação à proteína de acordo com a invenção ou um construto polipeptídico de acordo com a invenção em condições que permitem a expressão da proteína de ligação ao antígeno ou construto polipeptídico; e opcionalmente b) recuperar, colher ou purificar a proteína de ligação ao antígeno ou construto polipeptídico de pelo menos uma dentre as células hospedeiras e o meio de cultura. As condições adequadas podem incluir o uso de um meio adequado, a presença de uma fonte adequada de alimentos e/ou nutrientes adequados, uma temperatura adequada e, opcionalmente, a presença de um fator ou composto indutor adequado (por exemplo, quando as sequências de nucleotídeos da invenção estão sob o controle de um promotor induzível); todos os quais podem ser selecionados pelo versado na técnica.

Sob tais condições,

as sequências de aminoácidos da invenção podem ser expressas de uma forma constitutiva, de uma forma transitória ou apenas quando induzida de forma adequada.

As proteínas de ligação ao antígeno da invenção podem então ser isoladas da célula hospedeira/organismo hospedeiro e/ou do meio em que a dita célula hospedeira ou organismo hospedeiro foi cultivado, com o uso de técnicas de isolamento e/ou purificação de proteínas conhecidas por si só, como técnicas de cromatografia (preparativa) e/ou eletroforese, técnicas de precipitação diferencial,

técnicas de afinidade (por exemplo, com o uso de uma sequência de aminoácidos clivável específica fundida com a sequência de aminoácidos da invenção) e/ou técnicas imunológicas preparativas (ou seja, com o uso de anticorpos contra a proteína de ligação ao antígeno a ser isolada). Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno ou construto polipeptídico produzido e opcionalmente recuperado é ainda misturado com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00131] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção e/ou pelo menos um construto polipeptídico de acordo com a invenção que compreende pelo menos uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de ligação a TeNT de acordo com a invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende pelo menos duas proteínas de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção e/ou pelo menos um construto de polipeptídeo de acordo com a invenção que compreende pelo menos duas proteínas de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção.

[00132] Um carreador farmaceuticamente aceitável como aqui usado pode ser tão simples como, por exemplo, água estéril, uma solução de sal fisiológico ou um tampão, por exemplo, uma solução aquosa tamponada com força iônica fisiológica e/ou osmolaridade (como, por exemplo, PBS).

[00133] A formulação de medicamentos, as formas de administração e o uso de excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos e usuais na técnica e, por exemplo, descritas em Remington; The Science and Practice of Pharmacy, 21ª edição de 2005, University of Sciences na

Filadélfia. As composições farmacêuticas e medicamentos de acordo com a invenção são preferencialmente formulados para serem adequados para administração intravenosa ou subcutânea, ou intramuscular, embora outras vias de administração possam ser consideradas, como administração mucosa ou administração intradérmica e/ou intracutânea, por exemplo, por injeção.

[00134] Tais composições, bem como uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção e/ou o construto polipeptídico de acordo com a invenção, podem ser usadas com sucesso para uso no tratamento ou prevenção de doença clínica após infecção por Clostridium tetani.

[00135] Portanto, em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção ou um construto polipeptídico de acordo com a invenção para uso como um medicamento.

[00136] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção e/ou um construto polipeptídico de acordo com a invenção e/ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção, para uso na prevenção ou tratamento de doenças após infecção por Clostridium tetani. Alternativamente dito, nesse aspecto, a invenção se refere ao uso de uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção e/ou um construto polipeptídico de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento para prevenção ou tratamento de doença após infecção por Clostridium tetani.

Alternativamente, nesse aspecto, a invenção se refere a um método de prevenção ou tratamento de doenças após infecção por Clostridium tetani, em que um é administrada a um indivíduo em necessidade uma quantidade terapeuticamente suficiente de uma proteína de ligação ao antígeno de acordo com a invenção e/ou um construto polipeptídico da invenção.

Assim, nesse aspecto, uma proteína de ligação ao antígeno, um construto polipeptídico e/ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção é usada para prevenir o tétano ou para tratar o tétano.

[00137] Como aqui usado, os termos “tratar”, “tratamento” ou “que trata” se referem à aplicação ou administração de uma proteína de ligação ao antígeno, construto polipeptídico e/ou composição farmacêutica da invenção a um indivíduo que tem tétano, em que o objeto é curar, reverter parcial ou completamente, aliviar, melhorar, inibir, atrasar, suprimir, diminuir ou parar a progressão ou gravidade do tétano ou dos sintomas associados ao tétano. O termo “tratar” inclui reduzir ou aliviar pelo menos um efeito adverso ou sintoma de tétano.

O tratamento geralmente é “eficaz” se um ou mais sintomas ou marcadores clínicos forem reduzidos. Alternativamente, o tratamento é “eficaz” se a progressão do tétano for reduzida ou interrompida.

Ou seja, “tratamento” inclui não apenas a melhora dos sintomas ou marcadores, mas também a cessação ou, pelo menos, a desaceleração do progresso ou a piora dos sintomas que seriam esperados na ausência de tratamento.

Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, sem limitação, alívio de um ou mais sintomas,

diminuição da extensão da doença, estado de doença estabilizado (ou seja, sem agravamento), atraso ou desaceleração da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão (seja parcial ou total),

seja detectável ou indetectável.

O termo “tratamento” do tétano também inclui o alívio dos sintomas ou efeitos colaterais do tétano (incluindo tratamento paliativo). Como aqui usado, o termo “prevenir”, “prevenção” ou “preventivo”

(também referido como profilático) se refere à aplicação ou administração de uma proteína de ligação ao antígeno,

construto polipeptídico e/ou composição farmacêutica de acordo com a invenção a um indivíduo que está em risco de desenvolver tétano, com a finalidade de prevenir o início,

aliviar, melhorar, aliviar, inibir a progressão, reduzir a gravidade e/ou reduzir a incidência de um ou mais sintomas ou características de uma doença futura do tétano.

Assim,

uma proteína de ligação ao antígeno, construto polipeptídico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser administrada a um indivíduo que não exibe sinais de tétano e/ou a um indivíduo que exibe apenas sinais precoces de tétano, de preferência com o propósito de diminuir o risco de desenvolver patologia associada ao tétano.

[00138] Em uma modalidade, o indivíduo é um animal, incluindo seres humanos, de preferência um mamífero, mais preferencialmente um mamífero não humano, ainda mais preferencialmente um Equino, Canino, Felino, Porcino ou um membro da família de ruminantes Bovidae (por exemplo Bovino, Caprino) Os indivíduos preferenciais de acordo com a invenção são, por exemplo, Equus ferus, Equus africanus, Canis familiaris, Felis catus, Sus scrofa domesticus, Bos taurus, Ovis aries e Capra aegagrus hircus, com a máxima preferência Equus ferus.

[00139] A imunização passiva com uma proteína de ligação ao antígeno contra TeNT ou construto polipeptídico de acordo com a invenção pode ser usada em pelo menos 3 cenários diferentes. Por exemplo, em um cenário profilático como parte de um procedimento padrão pré-operatório, ou em indivíduos que estão feridos e possivelmente infectados com Clostridium tetani, mas ainda não estão doentes. Em terceiro lugar, em um cenário terapêutico quando o indivíduo está sofrendo de tétano. Há uma diferença na dosagem dependendo do tratamento profilático ou terapêutico, por exemplo, o último com uma dose 2 a 20 vezes maior dependendo da espécie. Uma pequena quantidade da dose de antitoxina (por exemplo, 1000 IU) também pode ser administrada localmente em torno do local da ferida.

Várias vias de administração podem ser aplicadas, como a via intramuscular, subcutânea, intravenosa, epidural, subaracnoide ou intratecal. Proteínas de ligação ao antígeno de acordo com a invenção e/ou construtos polipeptídicos de acordo com a invenção que têm a capacidade de neutralizar eficazmente a toxina do tétano podem ser utilizados da seguinte maneira. A preparação a ser administrada deve resultar preferencialmente numa concentração sanguínea de pelo menos 0,01 a 0,1 UI/ml.

Portanto, a dosagem é preferencialmente baseada na massa corporal/volume sanguíneo.

[00140] Meramente como um exemplo: em casos humanos estabelecidos, os pacientes devem receber 500 a 1.000 UI/kg por via intravenosa ou intramuscular. Para SDA SVT06-SVT16- SVA12 (SEQ ID NO.: 51) isso resultaria em uma dosagem máxima de 0,5 a 1 mg/kg. A dose do produto antitoxina equina clássico para casos estabelecidos em pequenos animais (felinos e caninos) é de 100 a 1.000 UI/kg administrada por via intravenosa. Para SDA SVT06-SVT16- SVA12, isso resultaria em uma dosagem máxima de 0,1 a 1 mg/kg. Animais maiores recebem uma dose proporcionalmente menor do que animais menores. Por exemplo, cavalos podem, como tratamento pré-operatório, receber 7.500 a 11.000 IU intramuscular ou subcutâneo, um potro com até 100 kg 3.000 a 4.000 IU por meio de qualquer via. Cavalos feridos (que não sofrem de tétano) podem, como tratamento preventivo, receber 15.000 a 20.000 UI por via intramuscular ou subcutânea, um potro de até 100 kg 6.500 a 8.000 UI por qualquer via. Cavalos que sofrem de tétano devem receber pelo menos 50.000 a 60.000 UI por uma via (se a preparação permitir) ou pela combinação de várias vias.

[00141] Em casos clínicos, o tratamento do tétano pode ser repetido diariamente, dependendo do efeito observado.

[00142] Todas as dosagens recomendadas geralmente fornecem proteção passiva por pelo menos 3 semanas. Mais uma vez, apenas a título de exemplo: a meia-vida do construto SVT06-SVT16-SVA12 (SEQ ID NO: 51) mostrou ser tal que após a administração de 0,3 mg/kg a suínos 21 dias depois, um nível sérico de 0,1 micrograma/ml (igualando mais que 0,1 IU (Exemplo 17, Tabela 25)) ainda era detectável, como pode ser visto no Exemplo 16, Figura 6. O mesmo construto, SVT06-SVT16-SVA12 (SEQ ID NO: 51), quando administrado (0,17 mg/kg, intramuscular) a equinos leva a um nível sérico de 0,4 a 0,6 micrograma/ml (Exemplo 23) 21 dias depois, um nível que é totalmente protetor.

[00143] A quantidade de antitoxina (também conhecida como “potência” ou “capacidade neutralizante”) é fornecida em Unidades Internacionais (UI). O primeiro marco na padronização global do toxoide de tétano foi o estabelecimento do Padrão Internacional para a antitoxina tetânica de origem equina em 1928, que foi substituído em 1969 (Comitê de Especialistas da OMS em Padronização Biológica. Vigésimo Segundo Relatório. Gênova, Organização Mundial da Saúde, 1970 (WHO Technical Report Series, no 444). A disponibilidade e o uso dessa preparação permitiram que os toxoides fossem avaliados em termos de sua capacidade de produzir antitoxina tetânica em humanos e permitiu que as unidades de proteção para a antitoxina fossem definidas em Unidades Internacionais (UI). A capacidade de neutralização pode, por exemplo, ser determinada como mostrado no Exemplo 17 (“Análise de SDA para capacidade de neutralização da toxina do tétano em um modelo de camundongo”).

[00144] As dosagens de antitoxina comercialmente recomendadas para as espécies diferem e são baseadas principalmente em dados empíricos. Várias vias de administração podem ser aplicadas, como a via intramuscular, subcutânea, intravenosa, epidural, subaracnoide ou intratecal. Proteínas de ligação ao antígeno que têm a capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção e que têm a capacidade de neutralizar efetivamente a toxina do tétano podem ser utilizadas da mesma maneira. Uma dose de antitoxina deve resultar preferencialmente em uma concentração sanguínea de pelo menos 0,01 a 0,1 UI/ml. Em casos humanos estabelecidos, os pacientes preferencialmente recebem 500 a 1.000 UI/kg de antitoxina equina por via intravenosa ou intramuscular. Até

5.000 a 8.000 UI de imunoglobulina antitetânica humana podem ser administradas por via intramuscular, dependendo da preparação usada. A dose preferencial do produto clássico de antitoxina equina para casos estabelecidos em pequenos animais (como, por exemplo, felinos e caninos) é de 100 a 1.000 unidades/kg administradas por via intravenosa. Animais maiores recebem uma dose proporcionalmente menor do que animais menores. Por exemplo, cavalos podem, como tratamento pré-operatório, receber 7.500 a 8.500 IU intramuscular ou subcutâneo, um potro com até 100 kg 3.000 a 4.000 IU por meio de qualquer via. Cavalos feridos (que não sofrem de tétano) podem, como tratamento preventivo, receber 15.000 a 17.000 UI por via intramuscular ou subcutânea, um potro de até 100 kg 6.500 a

8.000 UI por qualquer via. Cavalos que sofrem de tétano são administrados de preferência com pelo menos 50.000 UI por qualquer via (se a preparação permitir) ou por meio da combinação de várias vias. Em casos clínicos, o tratamento do tétano pode ser repetido diariamente, dependendo do efeito observado. Todas as dosagens recomendadas geralmente fornecem proteção passiva por até 1 a 3 semanas, dependendo da espécie e do tratamento administrado. Além da imunização passiva, a vacinação ativa deve ser administrada preferencialmente a um indivíduo, a chamada imunização passiva-ativa. Isso fornece imunidade de curto prazo (passiva) e imunidade humoral de longo prazo (ativa). Como o primeiro está diminuindo, o segundo aparece e assim evita uma janela de não proteção. A imunização ativa pode ser realizada com o toxoide do tétano formulado. Essas vacinas toxoides à base de toxoide do tétano estão disponíveis comercialmente. As vacinas à base de toxoides podem ser administradas concomitantemente com a antitoxina à base de SDA e são preferencialmente repetidas em 21 dias.

[00145] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a testes de diagnóstico para a detecção de TeNT ou anticorpos anti-TeNT em, por exemplo, fluidos corporais.

Tais testes de diagnóstico, visando a detecção in vitro de toxinas ou anticorpos anti-TeNT, por exemplo, no sangue de um ser humano ou animal são atualmente bastante complicados e demorados. Isso tem a ver com, entre outros, com o fato de que mesmo níveis muito baixos de TeNT no sangue são altamente tóxicos e, como consequência, esses testes devem ser muito sensíveis. A presente invenção agora fornece proteínas de ligação ao antígeno que mostram uma afinidade muito alta (isto é, baixo valor de KD) para TeNT. Os testes de diagnóstico à base de tais proteínas de ligação ao antígeno são, por definição, muito sensíveis e, portanto, tais proteínas de ligação ao antígeno são altamente adequadas para uso em testes de diagnóstico.

[00146] Meramente como um exemplo de tal teste: em um teste ELISA de sanduíche clássico, bem conhecido por décadas na técnica, uma placa de 96 poços ou placa de micropoços, material carreador de dispositivo de fluxo lateral ou mesmo um chip, pode ser revestido com uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. Novamente; apenas como um exemplo: SDA SVT06 pode ser usado para a etapa de revestimento. Devido às suas excelentes características de afinidade, o SDA SVT06 ligará fortemente até mesmo quantidades mínimas de TeNT, se presente. Em uma segunda etapa, o fluido corporal a ser rastreado quanto à presença de TeNT pode ser adicionado ao poço. Se TeNT estiver presente, o mesmo se ligará ao SDA SVT06. Após uma etapa de lavagem, por exemplo, SDA SVT15 conjugado pode ser adicionado aos poços. Se TeNT estiver presente no fluido corporal e, portanto, ligado a SDA SVT06, SDA SVT15 conjugado pode se ligar a outro epítopo do TeNT ligado e em uma etapa de cor subsequente ocorrerá uma reação de cor, indicando assim a presença de quantidades mínimas de TeNT.

[00147] Igualmente, as proteínas de ligação ao antígeno com a capacidade de se ligarem a TeNT de acordo com a invenção são adequadas em testes para a detecção de anticorpos contra TeNT em fluidos corporais. Nesses testes, o fluido corporal a ser testado pode ser misturado a uma pequena quantidade de toxina. Se os anticorpos anti-TeNT estiverem presentes, os mesmos se ligarão à toxina. Depois disso (de preferência após a remoção dos complexos anticorpo-TeNT), o fluido corporal pode ser submetido ao ELISA sanduíche descrito acima, a fim de ver se alguma toxina ainda está presente. Se for esse o caso, isso demonstra que o fluido corporal estava livre de anticorpos anti-TeNT.

[00148] Igualmente, os SDAs com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção são adequados em testes em que a atividade de clivagem proteolítica da cadeia L de TeNT é usada para detecção de TeNT que é capturado com o uso de um receptor que se liga à cadeia H de TeNT. Atualmente, tal ensaio de ligação e clivagem (BINACLE) está sendo desenvolvido (Behrensdorf-Nicol et al., 2015, ALTEX 32, 137 a 142). Os VHHs monovalentes mencionados acima podem servir como domínios de ligação em tais ensaios. A ligação multivalente de TeNT SDA SVT06- SVT16-SVA12 é ainda mais preferencial para tal aplicação,

uma vez que mostra maior afinidade e se liga a dois sítios antigênicos TeNT separados, o que aumenta a chance de se ligar apenas a formas TeNT ativas.

[00149] Assim, ainda outra modalidade da presente invenção se refere a kits de diagnóstico que compreendem uma proteína de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção. Esses kits de diagnóstico podem, por exemplo, compreender ainda uma placa de 96 poços, uma placa de micropoços ou um chip que é pré- revestido com uma ou mais das proteínas de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção. Poderia, por exemplo, também, ou em vez disso, compreender uma ou mais das proteínas de ligação ao antígeno com capacidade de se ligar a TeNT de acordo com a invenção em uma forma conjugada. Esse kit de diagnóstico pode compreender ainda instruções para realizar o teste de diagnóstico.

[00150] A presente invenção também se refere a kits de diagnóstico para a detecção de albumina de espécies específicas em carne processada, por exemplo carne de gado moída. Esses kits de diagnóstico, visando a detecção de albumina equina, por exemplo, na carne moída em embutidos, atualmente são bastante complicados e demorados. A presente invenção agora fornece proteínas de ligação ao antígeno que mostram uma alta capacidade de ligação à albumina equina.

Consequentemente, a invenção fornece um método para detectar albumina, em que o método compreende as etapas de: i) fornecer um SDA com capacidade de se ligar à albumina sérica, de preferência que tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 40, 37, 38, 39, 41 e 42 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

ii) colocar o SDA da etapa i) em contato com uma amostra de teste; e iii) detectar possível ligação entre o SDA da etapa i) e a albumina presente na amostra da etapa ii).

[00151] As características e definições do SDA da etapa i) são conforme descritas em outro lugar neste documento. A amostra da etapa ii) é preferencialmente uma amostra que compreende carne processada, mais preferencialmente carne processada suspeita de compreender carne de mais de uma espécie. A albumina que é detectada é preferencialmente albumina equina. A detecção na etapa iii) pode ser realizada com o uso de qualquer método conhecido na técnica, como ELISA, ressonância plasmônica de superfície ou calorimetria de titulação isotérmica. O método é preferencialmente um método in vitro.

Consequentemente, a invenção também se refere ao uso de um

SDA da etapa i) para a detecção de uma albumina.

[00152] Meramente como um exemplo de tal teste: em um teste ELISA de sanduíche clássico, bem conhecido por décadas na técnica, uma placa de 96 poços ou placa de micropoços, sensor ou, por exemplo, um microchip pode ser revestido com uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. Novamente; apenas como um exemplo: SDA SVA12 ou SVA16 pode ser usado para a etapa de revestimento. Devido às suas características de ligação muito altas, esses SDA irão capturar até mesmo quantidades mínimas de albumina, se presente. Em uma segunda etapa, a carne moída dissolvida em um fluido a ser rastreado quanto à presença de albumina pode ser adicionada ao poço. Se a albumina estiver presente, a mesma se ligará, por exemplo, a SDA SVA12 ou SVA16. Após uma etapa de lavagem, SDA SVA06 ou SVA07 conjugado pode ser adicionado aos poços. Se a albumina estiver presente no fluido corporal e, portanto, ligada a SDA SVA12 ou SVA16, SDA SVA06 ou SVA07 conjugado se liga a outro epítopo da albumina e em uma etapa de cor subsequente uma reação de cor ocorre, indicando assim a presença de quantidades mínimas de albumina.

[00153] A presente invenção também se refere a plataformas de biossensores para a determinação da caracterização de afinidade de, por exemplo, anticorpos monoclonais Equinos. Essas plataformas podem usar, por exemplo, o SDA SVG24L para capturar Ig equina em sensores ou microchips após o qual a interação com proteínas alvo pode ser analisada.

[00154] O uso de baixas concentrações de SDAs é altamente preferencial. Para isso, é preferencial que também uma rápida associação à toxina e ainda mais uma dissociação muito retardada da toxina, para evitar que a exerça sua atividade, e que possa recircular por período prolongado em animais (intoxicados) (consulte os exemplos 16 e 22).

Tabela 1. Relação Entre o Nome dos Vários SDAs, Iniciadores etc. e Construtos como Usado Aqui e Sua SEQ ID NO na Listagem de Sequências. Quando duas SEQ ID NO são fornecidas, o número entre parênteses é o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da outra SEQ ID NO.

Plasmíde Nome SEQ ID NO o BOLI192 1 LAM07 2 LAM08 3 BOLI401 4 SacI-BstEII 5 MPE25 6 MPE26 7 RevSeq 8 BOLI166 9 BOLI188 10 pUR4585A 11 pUR4585G 12 SVT20 13 SVT34 14 SVT16 15

SVT25 16 SVT06 17 SVT31 18 SVT08 19 SVT15 20 SVT29 21 SVT13 22 SVT22 23 SVT02 24 SVT03 25 SVT05 26 SVG13 27 SVG18 28 SVG19 29 SVG06 30 SVG23 31 SVG24 32 SVG03 33 SVG07 34 sdAb-31 35 sdAb-32 36 SVA16 37 SVA04 38 SVA06 39 SVA12 40 SVA02 41 SVA07 42 SVT02-GS2-SVG06M4-H6 pRL482 43 SVT06-GS2-SVG06M4-H6 pRL483 44 SVT15-3FW4M-GS2-SVG6M4-H6 pRL484 45 SVT16-L123Q-GS2-SVG06M4-H6 pRL485 46 SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVG-06M4-H6 pRL486 47 SVT02-GS3-SVT06-GS2-SVG06M4-H6 pRL487 48 SVT06-GS3-SVT15-3FW4M-GS2-SVG06M4-H6 pRL488 49 SVT06-GS2-SVA12M2-H6 pRL489 50 SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6* pRL490 51 SVT06-GS3-SVT02-GS2-SVG06M4-H6 pRL491 52 SVT02-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVG06M4-H6 pRL492 53 SVT02-GS2-SVA12M2-H6 pRL493 (54) 65 SVT15-3FW4M-GS2-SVA12M2-H6 pRL494 (55) 66 SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 pRL495 (56) 67 SVT02-GS2-SVG13M4-H6 pRL496 (57) 68 SVT06-GS2-SVG13M4-H6 pRL497 (58) 69 SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 pRL498 (59) 70

SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 pRL499 (60) 71 SVT02-SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 pRL500 (61) 72 SVT06-SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 pRL501 (62) 73 SVT08-GS2-SVG13M4-H6 pRL502 (63) 74 iniciador VH2B 64 SVT06-GS3-SVT15-3FW4M-GS2-SVA12M2-H6 pRL505 (75) 77 SVT15-3FW4M-GS3-SVT06-GS2-SVG13M5-H6 pRL506 (76) 78 *Também abreviado como SVT06-SVT16-SVA12.

[00155] Neste documento e em suas reivindicações, o verbo "compreender" e suas conjugações são usados em seu sentido não limitativo para significar que os itens após a palavra estão incluídos, mas os itens não mencionados especificamente não são excluídos. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui a possibilidade de que mais do que um dos elementos esteja presente, a menos que o contexto exija claramente que exista um e apenas um dos elementos. O artigo indefinido “um” ou “uma” normalmente significa “pelo menos um”.

[00156] O termo “cerca de” ou “aproximadamente”, quando usada em associação com um valor numérico (por exemplo, cerca de 10), preferencialmente significa que o valor pode ser o valor dado (de 10) mais ou menos 0,1% do valor.

[00157] Todas as referências de patentes e literatura citadas no presente relatório descritivo são incorporadas em sua totalidade ao presente documento a título de referência.

[00158] Salvo indicação em contrário, a prática da invenção irá empregar métodos convencionais padrão de biologia molecular, virologia, microbiologia ou bioquímica.

Essas técnicas são descritas em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; em Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; nos Volumes 1 e 2 de Ausubel et al.

(1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA; e nos Volumes I e II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edição, Academic Press (UK); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait editor); Nucleic Acid Hybridization (Hames e Higgins, eds.).

[00159] Os exemplos a seguir são oferecidos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de forma alguma.

Descrição das Figuras

[00160] Figura 1 - Sequências de SDAs de ligação a TeNT isoladas (clones de SVT) que foram posteriormente produzidas por levedura. SDAs são alinhados e numerados de acordo com o sistema IMGT. Traços indicam lacunas introduzidas para alinhamento de sequência. As definições das diferentes regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e regiões de arcabouços (FR) também estão de acordo com o sistema IMGT. As três regiões CDR são indicadas em fundo cinza. Posições adicionais 50a a 50d foram inseridas em FR2 para acomodar a inserção incomum de 4 aminoácidos nessa região de SVT06, SVT08 e SVT31. Resíduos adicionais também foram introduzidos em CDR2 para acomodar o CDR2 longo de SVT05. Uma lacuna adicional foi introduzida na posição 60 de IMGT de SVT16 e SVT25 para alinhar os resíduos 62 e 63 desses SDAs com resíduos idênticos em SVT20 e SVT34. A classificação dos SDAs em subfamílias e a classificação em grupos CDR3 é indicada para cada SDA [52]

[00161] Figura 2 - Sequências de SDAs de ligação a IgG isoladas (clones SVG) que foram posteriormente produzidos por levedura e dois SDAs de referência (sdAb-31 e sdAb-32). SDAs são alinhados e numerados de acordo com o sistema IMGT. Traços indicam lacunas introduzidas para alinhamento de sequência. As definições das diferentes regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e regiões de arcabouços (FR) também estão de acordo com o sistema IMGT. As três regiões CDR são indicadas em fundo cinza. A classificação dos SDAs em subfamílias e a classificação em grupos CDR3 é indicada para cada SDA [52].

[00162] Figura 3 - Sequências de SDAs de ligação a Alb isoladas (clones de SVA) que foram posteriormente produzidas por levedura. SDAs são alinhados e numerados de acordo com o sistema IMGT. Traços indicam lacunas introduzidas para alinhamento de sequência. As definições das diferentes regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e regiões de arcabouços (FR) também estão de acordo com o sistema IMGT. As três regiões CDR são indicadas em fundo cinza. A classificação dos SDAs em subfamílias e a classificação em grupos CDR3 é indicada para cada SDA[52].

[00163] Figura 4 - Análise de Western blot de SVT SDAs que se ligam a TeNT. As tiras de transferência de TeNT separadas por SDS-PAGE redutor foram incubadas com VHHs biotinilados indicados no topo. A posição dos marcadores de peso molecular relevantes é indicada. Espera-se que a cadeia pesada de TeNT migre em cerca de 100 kDa e a cadeia leve em cerca de 50 kDa.

[00164] Figura 5A - Análise SDS PAGE de SDAs monoméricos e multiméricos. O SDA carregado é indicado acima de cada pista. No caso de SDAs multiméricos, o plasmídeo pRL que codifica o SDA também é indicado. A posição dos SDAs monoméricos e multiméricos é indicada por setas à direita de cada painel. O peso molecular das proteínas marcadoras é indicado à direita. Painel A, SDAs multiméricos contendo SVG06 e três SDAs monoméricos de referência.

[00165] Figura 5B - Painel B, SDAs multiméricos contendo SVA12 ou SVG13 e seus SDAs monoméricos correspondentes. A ordem dos SDAs de ligação de TeNT nesse gel é sempre SVT02, SVT16, SVT06 e SVT15-3FW4M em SDAs monoméricos e multiméricos.

[00166] Figura 6A - Meia-vida sérica de SDAs multiméricos injetados (i.m.) em leitões. Os SDAs foram injetados no tempo de 0 h e os soros foram coletados em 1, 2, 4, 8, 11, 14, 21 e 28 dias. A quantidade de SDA presente nas amostras de soro foi medida por ELISA. São apresentados a média e o desvio padrão de 6 leitões (paineis A-D).

Painel A: SVT06-GS2-SVA12M2-H6 (0,2 mg/kg).

[00167] Figura 6B - Painel B: SVT06-GS3-SVT16-L123Q- GS2-SVA12M2-H6 (0,3 mg/kg).

[00168] Figura 6C - Painel C: SVT16-L123Q-GS2- SVA12M2-H6 (0,5 mg/kg).

[00169] Figura 6D - Painel D: SVT16-L123Q-GS2- SVG13M4-H6 (0,5 mg/kg). O ajuste da curva para medição da meia-vida sérica foi feito com dados de 24 a 96 h (previsto 48 h) ou de 96 a 504 h (previsto 96 h).

Exemplos

1. Geração de Biblioteca de Exibição de Fago e Imunização de Lhama

[00170] Lhamas (Lama glama) (no 9236 e 9237) foram imunizadas de maneira idêntica. Uma vacina antitetânica comercialmente disponível (pronta para uso, à base de toxoide do tétano) foi injetada intramuscularmente sem adição de adjuvante adicional, 1 ml por lhama, na coxa direita em 0, 21 e 42 dias após a imunização primária (DPI). Uma mistura de antígeno alvo de 0,5 mg de IgG de cavalo chrompure (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA), 0,5 mg de IgG de cão chrompure (Jackson Immunoresearch Laboratories), 0,5 mg de cavalo Alb (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA), 0,5 mg de cão Alb (Molecular Innovations, Novi, MI) e 8 µg do fragmento C da toxina do tétano recombinante (rTTC; Reagent Proteins, San Diego, CA, EUA). Experimentos in vitro [5] indicaram que o fragmento C (também denominado Hc ou TTC) é responsável pela ligação da toxina do tétano aos neurônios. A mistura de antígenos foi emulsionada com adjuvante Stimune (Thermofisher Scientific, Lelystad, Holanda) e injetada por via intramuscular na coxa esquerda de cada lhama a 0 e 21 DPI. Uma mistura idêntica de antígenos com adjuvante com o adjuvante IMS1312 (Seppic, França) foi injetada por via intramuscular na coxa esquerda de cada lhama a 42 DPI.

Amostras de sangue heparinizado (150 ml) foram coletadas a 28 e 49 DPI e os linfócitos do sangue periférico (PBLs) foram isolados imediatamente. Amostras de sangue para preparação de soro foram coletadas a 0, 28 e 49 DPI.

[00171] O RNA total foi extraído de PBLs usando o kit RNeasy Maxi (Qiagen) e usado para a preparação de cDNA com o uso de iniciação dT18 e transcriptase reversa Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA). Três PCRs específicos para SDAs foram realizados com o uso dos iniciadores BOLI192 (AACAGTTAAG CTTCCGCTTG CGGCCGCTAC TTCATTCGTT CCTGAGGAGA CGGT, SEQ ID NO: 1), lam07 (AACAGTTAAG CTTCCGCTTG CGGCCGCGGA GCTGGGGTCT TCGCTGTGGT GCG, SEQ ID NO: 2), e uma mistura de iniciadores lam08 (AACAGTTAAG CTTCCGCTTG CGGCCGCTGG TTGTGGTTTT GGTGTCTTGG GTT, SEQ ID NO: 3) e BOLI401 (AACAGTTAAG CTTCCGCTTG CGGCCGCTGG TTGTGGTTGT GGTATCTTGG GTT, SEQ ID NO: 4), todos os três em combinação com o iniciador VH2B (SEQ ID NO: 64)

[45]. Os fragmentos de PCR resultantes foram digeridos com PstI e NotI e inseridos no plasmídeo de exibição de fago pRL144 [19]. As ligações foram usadas para transformar células TG1 de E. coli (Lucigen, Middleton, WI, EUA) por eletroporação, resultando em doze bibliotecas (designadas pAL808 a pAL819).

2. Produção de Levedura de Anticorpo de Domínio Único cAb- TT2

[00172] Um anticorpo de domínio único (SDA) cAb-TT2

[46] que se liga à holotoxina do tétano, mas não a rTTC, foi produzido em levedura de padeiro para uso na seleção de exibição de fago subsequente de SDAs de ligação de TeNT. Um gene sintético que codifica este SDA como fusão com a sequência de sinal da invertase de levedura e o líder 5’ foi gerado como fragmento SacI-BstEII. Foi inserido no plasmídeo pRL188, resultando na produção do SDA ligado à região de dobradiça longa da lhama, contendo uma única cisteína e um marcador his6 [2]. Tal formato de expressão é especialmente adequado para a imobilização de SDA em superfícies sólidas [3]. O cAb-TT2 SDA foi produzido na cepa de levedura de padeiro SU51 em escala de 150 ml, purificado por cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC), e parte do SDA isolado foi biotinilado conforme descrito anteriormente [3].

3. Seleção de Exibição de Fago de SDAs de Ligação de TeNT

[00173] Os seguintes reagentes foram usados para seleção de exibição de fago. O cAb-TT2 produzido por levedura é descrito no exemplo anterior. Um mAb TT10 neutralizador da toxina do tétano [47, 48] foi adquirido junto ao National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC; Potters Bar, Reino Unido). Holotoxina de tétano autêntica (TeNT) foi adquirida de List Biological Laboratories (Campbell, CA), rTTC é descrito no exemplo 1.

[00174] As doze bibliotecas foram usadas para resgate de fago com o uso de fago auxiliar VCSM13 e as seleções de exibição de fago foram realizadas conforme descrito anteriormente [49]. No entanto, foi usado um procedimento que foi modificado das seguintes maneiras: • Placas de ELISA de 96 poços foram usadas para seleção em vez de imunotubos [50] • menores quantidades de fago de cerca de 1010 unidades de transdução (TU) foram usadas em cada panning • tripsina foi usada para eluição de fago [74] • As bibliotecas de fago dos três isotipos (iniciadores de dobradiça) foram agrupadas.

[00175] Além disso, as seleções foram realizadas com ELISAs de fago simultâneos para monitorar os diferentes procedimentos de panning e decidir quais testes de panning deveriam ser usados posteriormente.

[00176] As bibliotecas de exibição de fago foram triadas em duas rodadas de seleção de exibição de fago de SDAs que se ligam a TeNT ou rTTC diretamente revestido.

[00177] Além disso, as seleções foram realizadas em TeNT capturado com cAb-TT2 SDA ou com mAb TT10.

Ocasionalmente, diferentes antígenos foram usados na segunda rodada de exibição de fago, em comparação com a primeira rodada.

[00178] ELISAs para detectar a ligação a antígenos diretamente revestidos de SDAs solúveis presentes em sobrenadantes de cultura de E. coli diluídos em dez vezes empregando um conjugado de mAb anti-myc tag PO de camundongo para detecção de SDA foram realizados como descrito anteriormente [19]. No entanto, TeNT e rTTC foram revestidos a 1 µg/ml com o uso de tampão PBS enquanto que cAb-TT2 foi revestido a 1 µg/ml em tampão carbonato/bicarbonato 50 mM (pH 9,6).

[00179] Apenas são relatados os valores de absorvância dos clones SDA que finalmente foram expressos em levedura.

[00180] Para identificar ligantes individuais de TeNT, oito placas de 96 poços foram inoculadas com clones individuais da segunda rodada de seleção e induzidas para a produção de SDA solúvel em placas de 96 poços, conforme descrito anteriormente [49]. Diferentes antígenos e diluições de 10 vezes de sobrenadantes de E. coli contendo o SDA solúvel foram usados nos ELISAs. Todos os clones foram triados em ELISAs em TeNT e rTTC diretamente revestidos, em TeNT capturado por cAb-TT2.

[00181] Além disso, todos os clones foram selecionados em um ELISA de inibição de ligação GT1b-TeNT para detectar SDAs que inibem a interação toxina - receptor. O ELISA de inibição de TeNT-GT1b é mais adequado para comparar a ligação à toxina e a capacidade de bloqueio de ligação a neurônios de diferentes SDAs, devido ao fato de que não depende, por exemplo, da eficiência de biotinilação, acessibilidade de marcadores de epítopo e desnaturação devido ao procedimento de revestimento.

[00182] O ELISA de inibição de GT1b-TeNT foi realizado de acordo com [8]. Placas de poliestireno de 96 poços foram revestidas com gangliosídeo GT1b a 10 µg/ml de cérebro bovino (Sigma Aldrich, St Louis, MO) em metanol a

100 µl/poço por incubação durante a noite à temperatura ambiente (TA). Durante a incubação durante a noite, o metanol evapora completamente. Todas as incubações subsequentes foram realizadas em PBS contendo BSA a 0,5% e Tween-20 a 0,05% por 1 hora à temperatura ambiente após lavagem manual das placas com PBS. 1 µg/ml de TeNT (List Biological Laboratories) foi pré-incubado com SDAs, sobrenadantes de cultura de E. coli ou mAbs em 100 µl/poço em uma placa ELISA de poliestireno de 96 poços separada e incubados por 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, 90 µl dessas amostras foram transferidos para as placas revestidas com GT1b e incubadas por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram, então, incubadas com 100 µl/poço de soro de lhama diluído em 1.000 vezes 9237 de 49 DPI. Foi detectado IgG de lhama ligada com conjugado IgG-PO anti- lhama de cabra (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). PO ligado foi detectado por coloração com TMB. A reação foi interrompida com ácido sulfúrico e a absorvância a 450 nm foi medida com espectrofotômetro.

[00183] Para a determinação do SDA (purificado por streaking, colônia única colhida), fragmentos de DNA de sequência para análise de sequência foram obtidos por PCR em células TG1 de E. coli com os iniciadores MPE25 (TTTCTGTATGGGGTTTTGCTA, SEQ ID NO: 6) e MPE26 (GGATAACAATTTCACACAGGA, SEQ ID NO: 7). A análise da sequência foi feita com o uso do Kit de Sequenciamento de Ciclo BigDye Terminator v1.1 e um sequenciador de DNA ABI3130 automatizado (Applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d IJssel, Holanda). O fragmento de PCR purificado foi usado como modelo em combinação com os iniciadores MPE25 e RevSeq (TCACACAGGAAACAGCTATGAC, SEQ ID NO: 8). Todas as sequências foram determinadas a partir de duas reações. Toda a interpretação da sequência foi realizada com base na sequência SDA traduzida. O sítio PstI usado para a clonagem de SDA se sobrepõe aos aminoácidos 4 e 5 do SDA maduro.

Portanto, a sequência QVQ (aminoácidos 1-3) que é codificada pelo vetor de exibição de fago usado foi anexada ao terminal N de SDA. Os SDAs foram alinhados de acordo com o sistema de numeração IMGT [51] da região de codificação SDA madura, terminando na sequência VTVSS. SDAs foram classificados em subfamílias como realizado anteriormente

[52]. A subfamília C indica convencionais como SDA, sem os resíduos FR2 que são típicos de SDAs. Esses SDAs são frequentemente produzidos em níveis mais baixos. As subfamílias 1, 2 e 3 designadas SDAs indicam três subfamílias genuínas de SDA. A subfamília X indica SDAs que não são classificáveis. Os SDAs também foram classificados em grupos de CDR3 com base em ter comprimento de CDR3 idêntico e pelo menos 65% de identidade de sequência em CDR3. As sequências de SDA também foram inspecionadas quanto à presença de sítios potenciais de N-glicosilação (Asn-X-Ser/Thr, em que X é qualquer aminoácido exceto Pro).

Os clones selecionados para a expressão de levedura não tinham esses sítios de N-glicosilação.

[00184] A Tabela 2 mostra quatorze clones de SDA de ligação a TeNT que começam com “SVT” seguido por um número.

Dois SDAs, SVT02 e SVT03, que foram selecionados em cAb-TT2 ou mAb TT10 capturado TeNT, respectivamente, se ligaram a cAb-TT2 capturado TeNT, mas não se ligaram a TeNT ou rTTC diretamente revestido e não inibiram a interação GT1b-TeNT como o a absorvância medida foi comparável à observada com os sobrenadantes de cultura de E. coli que não contêm um SDA (Tabela 2). Esses SDAs provavelmente se ligam a um epítopo TeNT cuja conformação é afetada pela adsorção passiva ao poliestireno, resultando em antigenicidade reduzida, conforme observado anteriormente com outros antígenos [3, 53]. Outros doze SDAs, dos quais onze SDAs foram selecionados em TeNT ou rTTC revestido diretamente, se ligaram tanto a TeNT diretamente revestido quanto capturado, a rTTC revestido diretamente e inibiram a interação TeNT-GT1b (Tabela 2). Três SDAs, SVT05, SVT06 e SVT08, mostram apenas inibição parcial da interação GT1b- TeNT à medida que os valores de absorvância diminuem de cerca de 1,3 em amostras sem SDA para 0,72 a 0,99.

[00185] As sequências dos catorze SVT SDAs formam sete grupos CDR3 indicados pelas letras A a G (Figura 1).

Os clones dos mesmos grupos CDR3 geralmente se comportam de forma similar em ELISA (Tabela 2). Os doze clones dos grupos A, B, C, D e G de CDR3 inibem a interação GT1b-TeNT e ligam-se a TeNT e rTTC diretamente revestidos, bem como a TeNT capturado por cAb-TT2. Os clones SVT02 e SVT03 que formam os grupos CDR3 E e F não inibem a interação GT1b- TeNT e não se ligam a TeNT ou rTTC diretamente revestido, embora se liguem a TeNT capturado por cAb-TT2. Vários recursos de sequência notáveis são observados com os vários SDAs que são discutidos por grupo de CDR3.

[00186] Os quatro clones de SDA do grupo A de CDR3 e os dois clones de SDA que formam o grupo C de CDR3 contêm um Leu na posição IMGT 123, que está associado a um nível de produção mais baixo na levedura [11]. Os dois clones de SDA do grupo C de CDR3 também têm Lys120 e Ile122, que é típico do segmento J7 que codifica FR4, que está associado ao nível de produção de SDA reduzido em levedura [11]. Isso sugere que esses SDAs são mais produzidos com as mutações K120Q, I122T e L123Q.

[00187] Todos os três clones de SDA do grupo B de CDR3 contêm uma inserção incomum da sequência de aminoácidos VEDG na posição 50a-50d. Isso está no meio da região FR2, adjacente ao resíduo Arg 50 (posição 45 de Kabat) que é frequentemente mencionado na literatura SDA como a substituição de aminoácido mais típica dos SDAs.

SDAs convencionais normalmente contêm um Leu na posição IMGT 50 que faz contato hidrofóbico com o domínio VL. SDAs geralmente têm um Arg na posição 50 IMGT. Essa substituição torna a interface VL anterior mais hidrofílica [1]. É mais provável que a inserção dos resíduos hidrofílicos D (Asp) e E (Glu) da inserção VEDG também torne a região FR2 mais hidrofílica. Em parte por causa desses resíduos ácidos, o ponto isoelétrico previsto (IEP) desses clones é baixo. Um IEP baixo é mais frequentemente observado com SDAs e está associado ao aumento da solubilidade de SDAs [54]. É de notar também que as regiões CDR2 e CDR3 são bastante longas. Um CDR3 longo é comumente observado com SDAs [1, 52]. Um CDR2 longo é menos comum e provavelmente surge devido à hipermutação somática [55].

[00188] Os clones SVT13 e SVT22 que formam o grupo D de CDR3 têm um Cys na posição 55 IMGT e um Cys em CDR3 que muito provavelmente formam uma ligação dissulfeto adicional que é típica da subfamília 3 SDAs [52]. Embora as sequências de CDR3 sejam claramente homólogas, SVT13 e SVT22 são altamente diversas e apresentam 32 diferenças de aminoácidos.

[00189] O único clone SVT05 do grupo CDR3 G tem um CDR2 muito longo de 17 resíduos (consulte discussão acima para CDR3 grupo B) e um IEP baixo.

4. Seleção de Exibição de Fago de SDAs de Ligação de IgG

[00190] A seleção de exibição de fago de SDAs de ligação a IgG foi essencialmente realizada como descrito no exemplo anterior com o uso de IgG diretamente revestido de cão ou cavalo. Para selecionar os SDAs que se ligam a IgG de cachorro e cavalo, a segunda rodada de seleção foi realizada não apenas em IgG da mesma origem de espécie, mas também em IgG de outras espécies.

[00191] Para identificar ligantes individuais de IgG, seis placas de 96 poços foram inoculadas com clones individuais da segunda rodada de seleção e induzidas para a produção de SDA solúvel em placas de 96 poços [49]. Todos os clones foram selecionados para ligação a IgG diretamente revestido de diferentes espécies e fragmentos Fab e Fc em ELISA, conforme descrito anteriormente [19]. Os antígenos IgG de cavalo e cachorro são descritos no exemplo 1. Fc de IgG de cavalo era da Fitzgerald Industries (Tompkinsville, KY) e o Fab de cão era da Rockland Immunochemicals.

[00192] Apenas são relatados os valores de absorvância dos clones SDA que finalmente foram expressos em levedura. Para este propósito, clones de ligação de IgG que se ligam aos respectivos antígenos de cão e cavalo, e de preferência ainda mais espécies, foram preferencialmente selecionados. Além disso, os clones que se ligam a fragmentos Fab foram selecionados preferencialmente. Esses

SDAs são mais adequados para aplicações terapêuticas, uma vez que a interferência com a ligação ao receptor Fc neonatal (Brambell) envolvido na meia-vida de IgG não é esperada para SDAs de ligação de Fab e uma vez que o reconhecimento de multiespécies torna improvável que a variação alotípica de IgG possa causar falha no reconhecimento o IgG em um determinado animal individual.

[00193] A Tabela 3 mostra oito clones SDA de ligação a IgG que começam com “SVG” seguido por um número. O valor de absorvância de fundo com o uso de sobrenadante de cultura de E. coli sem SDA em IgG de cavalo é 0,26, que é consideravelmente mais alto do que em outras amostras de IgG. Isto pode indicar a ligação de IgG de cavalo ao conjugado de peroxidase usado. A absorvância máxima no ELISA entre os diferentes SDAs também é altamente variável, presumivelmente devido ao fato de que o antígeno usado para o revestimento não é uma proteína pura, mas uma mistura de diferentes IgGs de diferentes isotipos e com diferentes domínios variáveis. Os SDAs SVG03 e SVG24 ligam-se ao fragmento Fc de cavalo, mas não ao fragmento Fab de cão ou cavalo. SDA SVG23 liga-se apenas a IgG de cão. Uma vez que não liga o Fab de cão, presumivelmente liga o Fc de cão.

SVG03 liga-se a IgG de cavalo, mas não a IgG de cão, humano, suíno, bovino ou porquinho-da-Índia. O SVG24 liga- se ao IgG de cão, cavalo e suíno, mas não ao IgG humano,

bovino e porquinho-da-Índia. Assim, os três SDAs específicos para Fc também têm uma especificidade de espécie. Os SDAs SVG06, SVG07, SVG13, SVG18 e SVG19 ligam- se ao fragmento Fab de cão e cavalo, mas não ao fragmento Fc de cavalo. Os mesmos se ligam a IgG de todas as seis espécies mencionadas. Assim, os cinco SDAs específicos de Fab também têm uma especificidade de espécie muito mais ampla.

[00194] A análise de sequência foi realizada conforme descrito no exemplo anterior. Os oito clones selecionados para a produção de levedura (Figura 2) pertencem todos a diferentes grupos CDR3. Todos os três SDAs ligam-se a fragmentos Fab de IgG de cão e cavalo e a IgG de todas as seis espécies testadas. Todos os três SDAs e SVG06 são SDAs convencionais (subfamília C). Todos carecem da substituição de Trp 118 (resíduo 103 de acordo com o esquema de numeração de Kabat) por um resíduo hidrofílico, frequentemente Lys, que é frequentemente observado com tais SDAs [56]. SVG13, além disso, tem um Lys na posição 120 e Leu na posição 123, enquanto SVG06 tem mutações Glu na posição 120 e Leu na posição 123 que são todas típicas do segmento J7 usado em FR4 associado ao nível de produção de SDA reduzido em levedura [11].

[00195] A maioria dos SDAs são similares a VHs da família VH3 humana. No entanto, o SVG07 é mais similar a

VHs da família VH4 humana. Tais SDAs foram observados anteriormente [57]. Para referência, dois SDAs da família VH4 isolados de camelos (sdAb-31 e sdAb-32) estão incluídos no alinhamento SDA (Figura 2). A sequência de aminoácidos de FR1, FR2 e FR3 de SVG07 é idêntica à de sdAb31 e/ou sdAb32 e diferente de outros SDAs nas posições IMGT 9, 14, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 39, 42, 45, 53, 54, 68, 69, 71, 74, 77, 82, 83, 86, 87, 92, 94 e 95.

5. Seleção de Exibição de Fago de SDAs de Ligação de Alb

[00196] A seleção de exibição de fago de SDAs de ligação a Alb foi essencialmente realizada conforme descrito nos exemplos anteriores com o uso de Alb diretamente revestido de cão ou cavalo descrito no exemplo

1. Para selecionar os SDAs que se ligam a Alb de cachorro e cavalo, a segunda rodada de seleção foi realizada não apenas em Alb da mesma origem de espécie, mas também em Alb de outras espécies.

[00197] Para identificar ligantes individuais de Alb, duas placas de 96 poços foram inoculadas com clones individuais da segunda rodada de seleção e induzidas para a produção de SDA solúvel em placas de 96 poços [49]. Todos os clones foram selecionados para ligação a Alb de cão, cavalo e humano revestido diretamente em ELISA, conforme descrito anteriormente [19]. Alb humano era de um fornecedor comercial (Jackson Immunoresearch Laboratories).

[00198] Apenas são relatados os valores de absorvância dos clones SDA que finalmente foram mostrados em levedura. Para este propósito, clones de ligação de Alb que se ligam aos respectivos antígenos de cão e cavalo foram preferencialmente selecionados. A Tabela 4 mostra seis clones de ligação a Alb que começam com “SVA” seguido por um número. Nenhum dos SDAs se liga ao Alb humano. Todos os SDAs se ligam a Alb de cavalo. SDA SVA07 não se liga ao cão Alb, enquanto SDAs SVA02, SVA04, SVA06, SVA12 e SVA16 se ligam a Alb de cão. Assim, cinco SDAs que se ligam a Alb de cão e cavalo foram obtidos.

[00199] A análise de sequência foi realizada conforme descrito nos exemplos anteriores. Os seis clones selecionados para a produção de levedura (Figura 3) pertencem todos a diferentes grupos CDR3. Todos são SDAs genuínos da subfamília 1 [52]. Todos carecem de características peculiares de sequência de proteínas, como longas inserções ou resíduos de FR4 associados à produção reduzida de SDA na levedura [11].

6. Produção de Levedura de Novos SDAs Isolados por Exibição de Fago

[00200] Quatorze SVT SDAs (Tabela 2), oito SVG SDAs (Tabela 3) e seis SVA SDAs (Tabela 4) foram produzidos por expressão de levedura secretora. Para esse propósito, as regiões de codificação SDA foram amplificadas por PCR a partir dos plasmídeos de exibição de fago (exemplos 3 a 5) e cortadas com PstI e BstEII para ligação com o plasmídeo pUR4585 cortado de forma similar. pUR4585 é um vetor de transporte de levedura - E. coli adequado para a expressão de SDAs fundidos no terminal C aos marcadores c-myc e his6.

SDAs produzidos desaa maneira são indicados pelo sufixo “L”. Os plasmídeos derivados de pUR4585 que codificam esses SDAs são indicados pelo nome do SDA e pelo prefixo “p”, além do sufixo “L”. Além disso, três SVT SDAs mutantes com mutações na região FR4 para aumentar o nível de produção de levedura foram produzidos (consulte os exemplos 3 e [11]): • SDA SVT15L-3FW4M é um derivado de SVT15L contendo mutações K120Q, I122T e L123Q • SDA SVT20L-L123Q é um derivado de SVT20L contendo mutação L123Q • SDA SVT34L-L123Q é um derivado de SVT34L contendo mutação L123Q

[00201] Estas mutações foram introduzidas pela produção de fragmentos PstI-BstEII sintéticos contendo essas mutações e subsequente inserção no plasmídeo pUR4585.

O local BstEII usado para subclonagem é um sítio altamente conservado em FR4, mas sem alguns SDAs. Esse foi o caso com SVT16, SVT20, SVT25 e SVT34. Portanto, esse sítio foi silenciosamente introduzido nesses quatro SDAs autênticos, bem como em SVT20L-L123Q e SVT34L-L123Q, produzindo fragmentos PstI-BstEII sintéticos e subsequente inserção em pUR4585. Todos os plasmídeos de expressão de levedura foram sequenciados conforme descrito no exemplo 3, mas com o uso de DNA de plasmídeo purificado como molde em combinação com os iniciadores BOLI166 (ATGATGCTTTTGCAAGCCTTC, SEQ ID NO: 9) e BOLI188 (TTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG, SEQ ID NO: 10). O plasmídeo derivado de pUR4585 que codifica SVT29 codificou uma mutação silenciosa de A para G na posição 60 após o sítio PstI (CCTGTCGAGCCTACG (SEQ ID NO: 11) mutado para CCTGTCGGGCCTACG (SEQ ID NO: 12)) isso foi ignorado, pois era silenciosa.

[00202] Plasmídeos derivados de pUR4585 foram introduzidos na cepa de Saccharomyces cerevisiae W303-1a (ATCC número 208352; MATa, ade2-1, ura3-1, his3-11, trp1-1, leu2-3, leu2-112, can1-100) por seleção para o marcador leu2 auxotrófico. Os plasmídeos pSVT13L, pSVT15L, pSVT20L e pSVT34L também foram introduzidos na cepa SU51, que é mais comumente usada para a produção de SDA [19, 58]. A cultura de levedura para a produção de SDA e purificação de SDA a partir do sobrenadante de cultura gasto por IMAC foi realizada conforme descrito anteriormente [19, 58]. Os SDAs purificados foram concentrados e o tampão trocado por solução salina tamponada com fosfato (PBS) por meio do uso de dispositivos de concentração centrífuga de corte de peso molecular Amicon Ultra 3-kDa (Millipore, Bedford, MA). A concentração de SDA foi determinada com o uso do ensaio de proteína Biorad (Hercules, CA) e um padrão de IgG bovino. A partir desses estoques, uma amostra foi biotinilada com Sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce, Rockford, IL) com uma razão em peso entre proteína e biotina de 5. MAbs de camundongo, Alb e IgG de cavalo e cão e TeNT foram biotinilados de maneira similar.

[00203] Com base no rendimento de SDA purificado, o nível de produção de SDA segregado por levedura por litro de volume de cultura também foi determinado (Tabela 5).

SDAs foram produzidos principalmente na cepa de fermento de padeiro W303-1a, no entanto, para comparação dos níveis de produção de levedura, quatro SDAs de SVT também foram produzidos na cepa SU51 [58]. O aumento no nível de produção com o uso da cepa SU51 variou de 2,5 a 13,6 vezes, dependendo da natureza do SDA. Os SDAs mutantes contendo várias mutações FR4 foram produzidos em níveis 2,6 vezes a 5,2 vezes mais elevados em comparação com os SDAs de tipo selvagem (Tabela 5), consistente com constatações anteriores [11].

[00204] O baixo nível de produção de SVG07L de 0,15 mg/l pode estar relacionado a esse SDA ser similar aos SDAs da família de genes VH4 humanos. Foi sugerido anteriormente que os SDAs convencionais (subfamília C na Tabela 5) são produzidos em níveis baixos [61]. No entanto, três SDAs convencionais, SVG06L, SVG13L e SVG19L são produzidos em níveis razoavelmente elevados de pelo menos 1,59 mg/l (Tabela 5).

7. Ligação de Antígeno de SVA SDAs Produzidos por Levedura

[00205] A ligação de SVA SDAs a Alb de diferentes espécies foi analisada em ELISA revestindo antígenos a placas e detectando os mesmos principalmente com SDAs não marcados, empregando o marcador myc para detecção de SDA.

Os ELISAs foram realizados essencialmente conforme descrito no exemplo 3. Albuminas de soro purificadas foram revestidas a uma concentração de 5 µg/ml. A fonte Alb de cavalo e cão é descrita no exemplo 1. Alb bovino e ovalbumina de frango eram da Sigma Aldrich, albumina humana da Jackson Immunoresearch Laboratories e albumina de camundongo, ovelha e suína da Antibodies Online (Beijing, CN). A albumina de gato foi capturada a partir de soro normal de gato diluído 500 vezes (Agrisera Antibodies, Vännäs, Suécia) em placas revestidas com IgG de Alb anti- gato de cabra adsorvido por imunoafinidade 1.000 vezes diluído (Antibodies Online). Então, as placas foram incubadas com séries de diluição dupla de SDA começando com concentração de 1 µg/ml de SDA em doze poços. Os SDAs foram detectados com o uso de 0,5 µg/ml de conjugado de peroxidase mAb clone anti-myc 9E10 (Roche Applied Science).

Os dados de absorvância foram avaliados em planilha Excel®

(Microsoft Corporation, Redmond, EUA) para calcular o valor máximo de A450. Uma curva logística de quatro parâmetros foi ajustada para absorvância e concentrações de SDA para interpolar a Concentração Efetiva (CE) resultando em um valor de absorvância de 0,2 para cada SDA em cada ELISA.

[00206] Os controles negativos sem revestimento de antígeno, sem SDA ou com um SDA específico (SVT06L) resultaram em valores de absorvância abaixo de 0,15 (Tabela 6). Valores de absorvância acima de 0,15 foram considerados indicativos de ligação a Alb. Clones SVA12L e SVA16L se ligam a Alb de cavalo e cão com altos valores de absorvância (>1). SVA12L também liga a Alb suíno com alta e a Alb de gato com valores de absorvância mais baixos. Alb de gato foi capturado do soro normal com um anticorpo policlonal revestido. Como resultado, o valor de absorvância mais baixo observado não indica necessariamente uma ligação menos eficiente a Alb de gato em comparação com Alb de outras espécies. De fato, no exemplo 18 (Tabela 28), é mostrado que SVA12L e SVA06L se ligam com afinidade muito similar a Alb felino (disponível comercialmente). Além disso, (exemplo 18) é mostrado que SVA12L e SVA06L se ligam com afinidade similar a Alb Equino e Canino. Um ensaio de competição (ELISA) mostrou que SVA06L e SVA12L reconhecem epítopos diferentes (dados não mostrados).

[00207] Ambos SVA12L e SVA16L titulam em ELISA para baixas concentrações de SDA de cerca de 10 ng/ml. SVA02L, SVA04L, SVA06L e SVA07L também se ligam a várias espécies de Alb, mas frequentemente com valores de absorvância mais baixos e titulações de SDA mais altas do que SVA12L e SVA16L. SVA02L e SVA06L também se ligam a Alb de camundongo.

[00208] Nenhum dos SDAs se ligam a Alb humano, ovelha, bovino ou frango. A ligação de ELISA dos SVAs produzidos por levedura é consistente com a ligação do SDA correspondente produzido em E. coli (Exemplo 5; Tabela 4) com uma exceção notável: o clone SVA04L não se liga a Alb de cão, enquanto sua contraparte produzida em E. coli ligou-se a Alb de cão com o alto valor de absorvância de 1,533. Isso pode ser devido ao clone produzido por E. coli não ser monoclonal, mas sim representar uma mistura de dois clones que produzem SDAs diferentes. Uma vez que o SDA produzido por levedura é clonal e mais elaboradamente testado como uma série de diluição de SDA, em vez de em um único poço, os resultados com base em SDA produzido por levedura são mais confiáveis.

[00209] O clone SVA12L foi selecionado para o desenvolvimento de SDAs multiméricos (consulte os exemplos 14, 15, 16, 17 e 18), uma vez que se liga a Alb de cavalo, cão, suíno e felino e é eficientemente produzido em levedura (3,85 mg/l com o uso da cepa W303- 1a). SVA12L não se liga a Alb de camundongo em ELISA e, portanto, é improvável que confira alongamento de meia-vida em camundongos (exemplo 17). SVA06L é o candidato adequado para o alongamento da meia-vida de SDA em camundongos.

8. Ligação de Antígeno de SVG SDAs Produzidos por Levedura

[00210] A ligação de oito SVG SDAs produzidos por levedura a IgG de diferentes origens de espécies e fragmentos de anticorpos Fab, F(ab’)2 e Fc de algumas espécies foi analisada de maneira similar àquela descrita no exemplo anterior. A fonte de vários IgGs e seus fragmentos é descrita no exemplo 4. A gama globulina (GG) de camundongo, gato, ovelha, bovino e porquinho-da-Índia, bem como o fragmento F(ab’)2 de cavalo, foi obtido junto a Jackson Immunoresearch Laboratories. O fragmento Fc de cão foi obtido junto a Rockland Immunochemicals. Os resultados são descritos na Tabela 7. Três ELISAs continham um fundo relativamente alto, presumivelmente devido à reação cruzada do conjugado de mAb PO anti-myc de camundongo com os antígenos revestidos (nota de rodapé b na Tabela 7).

Portanto, os valores de absorvância nesses ELISAs foram subtraídos de fundo (nota de rodapé b na Tabela 7). Os valores de absorvância subtraídos de fundo acima de 0,2 foram considerados indicativos de ligação ao antígeno.

[00211] A ligação de ELISA dos SVG SDAs produzidos por levedura é consistente com a ligação do SDA correspondente produzido em E. coli (exemplo 4) com duas exceções. Em primeiro lugar, o SDA SVG07L produzido por levedura liga-se apenas a IgG de cão, enquanto a E. coli produziu SDA correspondente a IgG de todas as espécies analisadas. Possivelmente, isso pode ser parcialmente explicado pelo valor de corte arbitrário de A450=0,2 escolhido por ser muito alto. Em segundo lugar, o clone SVG24L produzido por levedura não se liga a IgG suína, ao passo que sua contraparte produzida por E. coli o fez. Isso poderia ser novamente devido ao valor de corte arbitrário de A450=0,2 escolhido por ser muito alto. Alternativamente, essa ligação de clones produzidos por E. coli também pode resultar do fato de que esses clones não são monoclonais.

Tal artefato não é provável para os SDAs produzidos por leveduras. Assim, os dados da ligação ELISA dos SDAs produzidos por levedura são mais confiáveis.

[00212] Os SDAs SVG06L e SVG13L ligam-se a fragmentos Fab e IgG de todas as espécies analisadas, exceto frango, quando um valor de absorvância subtraído de fundo acima de 0,2 é considerado indicativo de ligação ao antígeno. O valor de absorvância de 0,164 em IgG de frango de SVG13 provavelmente representa a ligação a IgG de frango, uma vez que a maioria dos outros SDAs têm valores de absorvância abaixo de 0,08 nesse ELISA. SDA SVG19L mostra similaridade de sequência considerável com SDA

SVG13L (Exemplo 4) e mostra um padrão de ligação similar a SVG13L, mas não se liga com valores de absorvância de 0,2 acima do fundo para IgG de camundongo, ovelha e suína.

SVG03L é específico para Fc de cavalo e SVG23L para fragmento Fc de cão. SVG24L reconhece predominantemente Fc de cavalo e cão.

[00213] SDA SVG13L é mais adequado para o desenvolvimento de SDAs multiméricos, uma vez que se liga a Fab e IgG de todas as espécies analisadas e é bem produzido (não otimizado) em levedura (1,6 mg/l).

[00214] SDA SVG06L também é adequado para o desenvolvimento de SDAs multiméricos, uma vez que se liga a Fab e IgG de todas as espécies analisadas, exceto frango e também é produzido (não otimizado) em levedura (1,8 mg/l).

9. Especificidade de Espécies de SDAs de Ligação de IgG

[00215] A ligação em ELISA a IgGs de várias espécies de quatro SDAs de ligação a IgG porcino (clones VI) isolados anteriormente [19] foi comparada com SDA SVG13L que reage com IgGs da maioria das espécies. Os ELISAs foram realizados conforme descrito no exemplo 8. Os resultados (Tabela 8) mostram que SDAs VI-4L, VI-8L, VI-11L e VI-14L não se ligam a IgG bovino, gato, cão, camundongo e humano.

Possivelmente se ligam a IgG de ovelha, uma vez que a absorvância máxima é ligeiramente aumentada acima do fundo sem SDA. SDA VI-11L além disso, liga-se ao IgG de cavalo.

No entanto, em todos os casos, SVG13L produz valores de absorvância muito mais altos em IgG de todas as espécies, exceto IgG suína. Na IgG suína, pelo contrário, todos os clones VI apresentam valores de absorvância mais elevados do que SVG13L.

10. Ligação de Antígeno de SVT SDAs Produzidos por Levedura

[00216] Vários SDAs produzidos por levedura e seis mAbs anti-TeNT foram analisados quanto à ligação ao antígeno em ELISA de um modo similar àquela descrita para SVA e SVG SDAs. Os mAbs anti-TeNT foram obtidos de diferentes fornecedores. Sua origem e informações fornecidas pelo fornecedor sobre a neutralização de TeNT em bioensaio de camundongo ou ligação de antígeno em Western blot são descritas na Tabela 9. Parte desses mAbs foi biotinilado conforme descrito no exemplo 6.

[00217] Foi analisada a ligação de SDAs ou mAbs não marcados a placas de TeNT, rTTC ou poliestireno revestidas diretamente sem revestimento de antígeno, bem como a TeNT que foi capturado por cAb-TT2 SDA adsorvido passivamente.

Veja os exemplos 1 e 3 para tais procedimentos de revestimento de antígeno. Essas placas foram, então, incubadas com séries de diluição de SDAs ou mAbs não marcados e posteriormente processadas como descrito no exemplo 7, mas com o uso de um conjugado de imunoglobulina PO anti-camundongo de coelho diluído 2.000 vezes (Dako,

Glostrup, Dinamarca) para detecção de mAbs de camundongo e sem titulação dos SDAs em placas revestidas com rTTC. Além disso, a ligação de SDAs ou mAbs biotinilados a TeNT e cAb- TT2 capturados diretamente revestidos foi analisada de maneira similar com o uso de 0,5 µg/ml de conjugado de estreptavidina-PO (Jackson Immunoresearch Laboratories) para detecção de SDA. Finalmente, a inibição da interação GT1b-TeNT de SDAs ou mAbs não marcados foi analisada como descrito no exemplo 3 com o uso de séries de diluição dupla de SDAs ou mAbs ao longo de 11 poços começando em uma concentração de 1 µg/ml de SDA ou 10 µg/ml de mAb.

[00218] Os resultados são descritos na Tabela 10. Os valores de absorvância em placas sem revestimento de antígeno TeNT específico foram inferiores a 0,07. Também em ELISAs com SDA SVA12L de controle - com exceção do ELISA de inibição de GT1b-TeNT - os valores de absorvância foram no máximo 0,155 (TeNT diretamente revestido e SDAs ou mAbs biotinilados) ou 0,072 (outros ELISAs). Assim, os valores de absorvância acima de 0,2 são indicativos de ligação ao antígeno. Os ELISAs com SDAs ou mAbs biotinilados em TeNT diretamente revestido ou TeNT capturado foram geralmente consistentes com ELISAs similares com o uso de SDAs ou mAbs não marcados. Nenhum dos SDAs ou mAbs biotinilados foi negativo em um ELISA em que sua contraparte não marcada foi positiva. Isso mostra que a biotinilação nunca anulou a ligação ao antígeno. Frequentemente, os SDAs biotinilados deram valores de absorvância ligeiramente maiores no TeNT capturado (por exemplo, os três SDAs do grupo B de CDR3 SVT06L, SVT08L e SVT31L). Exceções notáveis são os mAbs B417M e 11n185 que geralmente fornecem valores de absorvância mais baixos e CE > 50 vezes maior quando biotinilados, indicando que a biotinilação foi menos eficaz ou afetou a ligação do antígeno por esses mAbs. No caso do mAb B417M, a presença de HSA a 0,5% como agente estabilizador poderia ter diminuído sua eficiência de biotinilação.

[00219] Em geral, a ligação por ELISA de SVT SDAs produzidos por levedura é consistente com a ligação por ELISA de suas contrapartes produzidas por E. coli (exemplo 3; Tabela 2). Conforme observado anteriormente no exemplo 3, com exceção de SVT02L e SVT03L, todos os SDAs se ligam ao rTTC. Como observado anteriormente, a falha em detectar a ligação de SVT02 e SVT03 a rTTC pode ser devido ao revestimento direto de rTTC, uma vez que esses SDAs também falham em se ligar diretamente ao TeNT revestido enquanto se ligam ao TeNT capturado. Além disso, como observado anteriormente, os três SDAs do grupo B de CDR3 SVT06L, SVT08L e SVT31L, bem como SVT05L, inibem apenas parcialmente a interação TeNT-GT1b com valores mínimos de absorvância de cerca de 0,5 e valores de EC relativamente altos. Além disso, como observado anteriormente, SDA SVT03L não inibe a interação TeNT-GT1b. No entanto, o clone SVT02L produzido por levedura também mostra inibição parcial de TeNT-GT1b com um valor de EC > 1.000 ng/ml, enquanto sua contraparte produzida por E. coli não mostrou qualquer inibição. Essa diferença pode ser simplesmente devido ao uso de uma concentração de SDA muito baixa no caso do SDA produzido por E. coli que foi usado na diluição do sobrenadante de E. coli dez vezes maior com concentração de SDA desconhecida. A ligação observada de SVT03L produzida por levedura biotinilada ao TeNT diretamente revestido apenas na concentração de SDA mais alta analisada também não foi observada antes e pode ser explicada de forma similar pela concentração de SDA mais alta usada (consulte o exemplo 11).

[00220] Os três SDAs mutantes de SVT15L, SVT20L e SVT34L têm valores de absorvância máxima e valores de EC similares aos de suas contrapartes de tipo selvagem nos ELISAs com o uso de SDAs biotinilados e no ELISA de inibição de GT1b-TeNT. Isso sugere que as mutações da estrutura 4 introduzidas para aumentar a ligação ao antígeno não afetam a ligação TeNT. Aqui, os valores de EC são determinados no valor de absorvância correspondente a 50% de inibição da inibição de TeNT-GT1b (IC50). Os valores de IC50 variam de 34 a 986 ng/ml. Os clones do grupo B de

CDR3 apresentam valores de IC50 mais elevados (317 a 986 ng/ml) do que os clones dos grupos A, C e D de CDR3 (34 a 133 ng/ml). Os clones do mesmo grupo CDR3 diferem no valor de IC50 com no máximo um fator 4.

[00221] Seis mAbs foram incluídos na análise. O mAb 11n185 foi selecionado devido ao fato que se liga à cadeia leve de TeNT. Os outros cinco mAbs foram selecionados devido ao fato de que neutralizam TeNT em um bioensaio em camundongo. Os mAbs se ligam nos diferentes ELISAs como segue:

1. mAbs 14F5 e 6F55 ligam-se de forma menos eficiente ao TeNT revestido diretamente em comparação com o TeNT capturado, similar a SVT02L e SVT03L.

2. Apenas os mAbs 6E7 e 6F57 inibem a interação TeNT- GT1b em ELISA. Os mesmos têm um IC50 que é consideravelmente maior do que o IC50 da maioria dos SDAs.

3. Enquanto a maioria dos SDAs se ligam ao rTTC, apenas dois dos seis mAbs se ligam a rTTC. Isso sugere que a neutralização de TeNT por três mAbs não é baseada na inibição da interação TeNT-GT1b.

11. SDAs Caracterizados por Ligação ao Fragmento C de TeNT (ligação de rTTC).

[00222] Dois SDAs (SVT02L e SVT03L) não se ligam a TeNT diretamente revestido e, portanto, sua ligação ao fragmento C diretamente revestido (rTTC) de TeNT (também denominado Hc ou TTC) é inconclusiva em relação à especificidade da partícula, uma vez que a adsorção passiva poderia ter anulado o antígeno ligação (exemplo 10). A ligação desses SDAs a rTTC capturada com mAb 6E7 foi, portanto, analisada de uma maneira similar àquela descrita no exemplo 10. Seis poços de uma placa de 96 poços foram revestidos com TeNT (0,75 µg/ml) e 18 poços com mAb 6E7 (1 µg/ml). Seis poços revestidos com mAb 6E7 foram subsequentemente incubados com 2 µg/ml de rTTC, seis poços adicionais com 0,75 µg/ml de TeNT enquanto os seis poços restantes com revestimento com mAb 6E7 foram incubados com tampão ELISA (controle negativo). Subsequentemente, seis SDAs foram incubados nos quatro poços com diferentes antígenos revestidos a 2 µg/ml de concentração de SDA. O SDA ligado foi detectado por incubação com conjugado de mAb PO anti-myc.

[00223] Os resultados (Tabela 11) mostram que: • Os controles negativos SVA12L e revestimento de mAb 6E7 sem antígeno capturado são negativos (absorvância <0,07).

• A captura de TeNT ou rTTC com mAb 6E7 ou revestimento direto de TeNT é bem-sucedida, pois é detectado por SVT16L (alta absorvância) e SVT15-3FW4M (baixa absorvância).

• SVT02L e SVT03L são funcionais devido ao fato de que se ligam a TeNT capturado.

• O SVT03L se liga a TeNT diretamente revestido, embora com A450 inferior ao TeNT capturado, ao passo que o SVT02L não se liga a TeNT diretamente revestido.

• SVT02L e SVT03L não se ligam a rTTC capturado com mAb 6E7. Uma vez que reconhecem outro sítio antigênico além do mAb 6E7 (exemplo 13), isso não é devido ao uso do mAb 6E7 para captura.

[00224] Portanto, SVT02L e SVT03L ligam outra parte TeNT diferente da presente em rTTC. Essa observação é consistente com a incapacidade de esses SDAs inibir a interação TeNT-GT1b (exemplo 10).

12. Análise Western Blot de Ligação de TeNT de SVT SDAs

[00225] A ligação de clones de SVT à cadeia leve ou pesada de TeNT foi analisada por Western blotting (Figura 4) como realizado anteriormente [19] com o uso de 2,5 µg de TeNT autêntico por gel e com o uso de 0,5 µg/ml de SDA biotinilado (exemplo 6) e 0,1 µg/ml de conjugado de estreptavidina PO (Jackson Immunoresearch Laboratories) para imunotransferência. SDA SVA12L foi usado como um controle negativo. A maioria dos SDAs não mostrou ligação à cadeia leve ou pesada em Western blot. Isso pode ser devido a esses SDAs que reconhecem epítopos conformacionais. No entanto, SDAs SVT06 e SVT08 se ligam a um polipeptídeo de cerca de 100 kDa que deve representar a cadeia pesada de

TeNT. Esses clones pertencem ao mesmo grupo CDR3 (grupo B) e reconhecem o mesmo sítio antigênico (Tabela 12). Ambos os SDAs também se ligam ao rTTC (Tabelas 2 e 10), que é derivado da cadeia pesada. Portanto, a ligação em Western blot à cadeia pesada de TeNT de SDAs SVT06 e SVT08 é consistente com observações anteriores.

13. Mapeamento do Antígeno da Toxina do Tétano por SDAs (SVT)

[00226] Os sítios antigênicos de SVT SDAs e seis mAbs anti-TeNT foram mapeados por ELISA de bloqueio/competição com o uso de SDAs e mAbs biotinilados.

Se possível, dois representantes de cada grupo de CDR3 foram usados para esse propósito. SDAs foram selecionados principalmente com base em seu valor de IC50 na interação TeNT-GT1b. No entanto, SVT29L foi produzido por levedura a apenas 0,07 mg/l e, portanto, substituído por SVT15L-3FW4M.

Os ELISAs de competição/bloqueio foram realizados com o uso de procedimentos ELISA similares àqueles descritos no exemplo anterior, mas com o uso de 0,5 µg/ml de TeNT para revestimento direto. Foi usado um SDA biotinilado ou concentração de mAb que resultou em um valor de absorvância quase máximo e competiu/bloqueou esse SDA ou mAb com 5 µg/ml de vários SDAs ou mAbs não marcados. As placas revestidas com TeNT foram primeiro incubadas com o SDA ou mAb não marcado em 90 µl/poço durante 30 min (etapa de bloqueio). Em seguida, foram adicionados 10 µl de SDA ou mAb biotinilado a 50 µg/ml e incubados durante mais 30 min (etapa de competição). No caso de SVT02 e SVT04 biotinilado, TeNT foi capturado com cAb-TT2 uma vez que esses SDAs se ligam apenas a TeNT capturado, mas não a TeNT diretamente revestido. Em todos os outros casos, foram usados antígenos revestidos diretamente. Um controle sem revestimento de antígeno e um controle sem SDA biotinilado foram incluídos. O percentual de inibição da ligação do antígeno devido a um SDA competidor/bloqueador foi, então, calculada como 100-100* ([A450 com SDA ou mAb competidor] - [A450 sem revestimento de Ag])/([A450 sem SDA ou mAb competidor] - [ A450 sem revestimento de Ag]). Todos os SDAs e mAbs bloquearam a ligação de sua contraparte biotinilada em pelo menos 75%, indicando que o ensaio era válido.

[00227] Foram identificados pelo menos cinco sítios antigênicos independentes indicados pelas letras A-E (Tabelas 12 e 13). Como esperado, os SDAs do mesmo grupo CDR3 sempre fazem parte do mesmo sítio antigênico. SVT02L, mAb 14F5 e mAb 6F55 formam o sítio antigênico A. Esses três SDAs ou mAbs também mostram outras características similares em outros ELISAs. O mais notável é sua ligação mais eficiente a TeNT capturado em comparação a TeNT diretamente revestido. Isso sugere que sua ligação é altamente dependente da conformação terciária de TeNT correta. SVT03L é um único SDA formando o sítio antigênico B. SVT15L e seu derivado mutante SVT15L-3FW4M do sítio antigênico C. SVT06L, SVT08L, mAb 6E7 e mAb 6F57 do sítio antigênico D. Espera-se que esses SDAs sejam menos dependentes da conformação correta do sítio antigênico, uma vez que também se ligam a TeNT em Western blot (exemplo 12). Consistente com essa noção, a competição parcial por clones de outros sítios antigênicos não ocorre para esses quatro SDAs ou mAbs. Os SDAs SVT13, SVT16, SVT22 e SVT34, representando dois grupos CDR3, formam o sítio antigênico E.

[00228] Os resultados dos clones de SVT estão resumidos na Tabela 12. Em geral, os resultados são consistentes com a visão geral sobre a especificidade de Ag de SDAs e a estrutura antigênica de TeNT: • SDAs do mesmo grupo CDR3 caem no mesmo sítio antigênico.

• SDAs ou mAbs do mesmo sítio antigênico mostram especificidade de ligação ao antígeno similar: - SDAs ou mAbs do sítio antigênico A se ligam a um epítopo que é conformacionalmente sensível, uma vez que mostram ligação reduzida após revestimento direto de TeNT.

- SDAs do sítio antigênico D ligam-se a TeNT Hc em Western blot.

- SDAs e mAbs de sítios antigênicos C, D e E todos inibem a interação TeNT-GT1b, enquanto SDAs ou mAbs de sítios antigênicos A e B não.

• SDAs ou mAbs que inibem a interação TeNT-GT1b todos se ligam a rTTC.

[00229] É digno de nota que o clone SVT02 agora mostra se ligar ao mesmo sítio antigênico que dois mAbs relatados para neutralizar TeNT em um bioensaio em camundongo. Isso sugere fortemente que o SVT02 também pode neutralizar TeNT, embora não tenha inibido a interação TeNT-GT1b. Os mAbs neutralizantes de TeNT que não inibem a interação GT1b foram descritos anteriormente [68]. Da mesma forma, os clones SVT06 e SVT08 provavelmente neutralizam TeNT (exemplo 17), uma vez que competem com dois mAbs neutralizantes. O clone SVT06 é mais adequado para trabalhos adicionais, pois é produzido em um nível superior. Os SDAs dos sítios antigênicos C e E não competem com nenhum dos mAbs neutralizantes. No entanto, esses SDAs inibem a interação TeNT-GT1b. Portanto, é provável que neutralizem TeNT, apenas para ser comprovado em ensaios in vivo (exemplo 17). Os SDAs SVT02L, SVT06L, SVT15L-3FW4M e SVT16L são, portanto, blocos de construção recomendados para a geração de SDAs multiméricos (Tabela 13).

14. Produção de Levedura de SDAs Multiméricos

[00230] SDAs multiméricos foram produzidos por meio da produção de integrantes MIRY estáveis [75] com o uso do plasmídeo pRL44 [69] na cepa de levedura SU50 [70], a fim de aumentar os níveis de produção de SDA. Em média, esses integrantes MIRY têm um nível de produção cinco vezes maior de SDAs em comparação com plasmídeos baseados em 2 mícrons.

Foram gerados doze plasmídeos que codificam SDAs multiméricos (Tabela 14) compostos por fusões de SVT-SDAs de ligação a TeNT com SVA12 SDA de ligação a Alb (5 plasmídeos), SVG06 SDA de ligação a IgG (2 plasmídeos) ou SVG13 SDA de ligação a IgG (5 plasmídeos). Os elementos a partir dos quais esses SDAs multiméricos foram produzidos são os seguintes: GS3: ligante (G4S)3 descrito anteriormente [27] GS2: ligante (G4S)2 derivado do plasmídeo pRL144

[19] H6: marcador his6, códon de parada dupla e sítio HindIII como em pRL188 [2] SVG06M4: SVG06 com quatro mutações: Q1E, Q5V, E120Q, L123Q SVG13M4: SVG13 com quatro mutações: Q1E, Q5V, K120Q, L123Q SVA12M2: SVA12 com duas mutações: Q1E, Q5V SVT15-3FW4M: SVT15 sem sítio SacI interno e 3 mutações: K120Q, I122T, L123Q SVT16-L123Q: SVT16 com sítio BstEII silenciosamente restaurado e mutação L123Q

[00231] Fragmentos sintéticos SacI-HindIII foram produzidos e subsequentemente subclonados no plasmídeo pRL44 [69] com o uso dos sítios SacI e HindIII, resultando nos plasmídeos pRL482 a pRL501 (Tabela 14).

[00232] A cepa SU50 de levedura de padeiro (MATa; cir°; leu2-3, -112; his4-519; can1; [70]) foi transformada com plasmídeos linearizados com HpaI pRL482 em pRL501 por eletroporação [71] e leu+ auxotróficos foram selecionados.

Um único transformante purificado por colônia foi induzido para expressão de SDA em escala de 0,5 l em frascos agitadores e SDA foi purificado do sobrenadante de cultura gasto por IMAC [58]. SDA foi subsequentemente purificado adicionalmente por cromatografia de troca catiônica em uma coluna de sefarose SP como descrito anteriormente [44] com ligeiras modificações. SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, NJ) e tampão de acetato de sódio 25 mM pH 4,7 foram usados para ligação de SDA à coluna. O SDA ligado foi eluído com um gradiente de 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1 M de NaCl em tampão de ligação. O SDA ligado geralmente eluiu entre 0,4 e 0,8 M de NaCl (Tabela 14). Foi concentrado e trocado por tampão para PBS com o uso de dispositivos de concentração centrífuga de corte de peso molecular de 3 kDa. A concentração de SDA foi determinada com o uso do ensaio de ácido bicinchônico (BCA, Pierce cat no, 23212) e um padrão de albumina de soro bovino (Thermo Scientific, Rockford, IL). Com base no rendimento de SDA purificado, foi calculado o nível de produção dos SDAs multiméricos em levedura (Tabela 14).

[00233] SDAs mono e multiméricos foram analisados por meio da redução de SDS PAGE com o uso de géis NuPage Novex 4% -12% Bis-Tris com tampão de corrida MOPS (Invitrogen) e coloração com reagente Gelcode Blue (Thermo Scientific). Em contraste com os SDAs multiméricos, os SDAs monoméricos contêm um marcador myc além do marcador his6.

Os SDAs monoméricos que continham um marcador myc produziram uma molécula adicional com uma massa molecular superior de cerca de 2 kDa que não é observada com a maioria dos SDAs multiméricos que não têm o marcador myc (Figuras 5A e B). Essa molécula adicional representa presumivelmente a O-glicosilação parcial que é dependente da presença do marcador myc. Essas moléculas foram observadas anteriormente [44]. SVT15-3FW4M SDA, além dessa variante O-glicosilada presumida, produz uma molécula com cerca de 2 kDa de massa molecular inferior que presumivelmente representa SDA degradado (Figura 5B).

[00234] A análise SDS PAGE de dois SVG06M4 contendo SDAs multiméricos (Figura 5A) revela uma banda dupla na posição de SDA2s que não é observada com SDAs multiméricos contendo SVA12M2 ou SVG13M4 SDAs (Figura 5B). Uma vez que esse SDA é sempre colocado no terminal C nos SDAs multiméricos, é mais provável a degradação no terminal C de SVG06M4. Isso pode ser devido à introdução das mutações E120Q e L123Q no terminal C de SVG06M4 em SDAs multiméricos. Isso implicaria na perda do marcador his6 em tais SDAs. Uma vez que os SDAs foram inicialmente purificados por IMAC, isso significaria que tal degradação ocorreu após a purificação de IMAC.

[00235] Todos os SDAs multiméricos contendo SVG13M4 e SVA12M2 migraram nas posições esperadas com base em sua massa molecular prevista (Figura 5B). SVG13L SDA monomérico migra ligeiramente mais rápido do que o SVA12L SDA, consistente com o peso molecular mais baixo de cerca de 1 kDa do SVA12L. Esse padrão também é visto ao comparar SVG13L e SVA12L contendo SDAs multiméricos compostos por dois (SDA2) ou três (SDA3) domínios de SDA.

15. Ligação de Antígeno Biespecífico ou Bivalente de SDAs Multiméricos

[00236] As várias capacidades de ligação ao antígeno alvo dos vários SDAs produzidos por leveduras multiméricas foram avaliadas, entre outras, em ELISA. Controles de SDAs monovalentes que formaram os blocos de construção desses SDAs multiméricos foram incluídos. Os ELISAs foram realizados basicamente conforme descrito nos exemplos anteriores. Foram realizados sete tipos diferentes de ELISA

(Tabelas 15 e 16). O ELISA de inibição de GT1b-TeNT foi descrito anteriormente nos exemplos 3 e 10. Três outros ELISAs serviram para medir a ligação monovalente de SDA a TeNT adsorvido passivamente (0,75 µg/ml), Alb (5 µg/ml) ou IgG (5 µg/ml), onde tanto um mAb de marcador anti-his quanto um soro anti-SDA policlonal foram usados para detecção de SDA. Para medir a ligação biespecífica a TeNT e IgG ou Alb ou TeNT bivalente de ligação a TeNT e Alb de cavalo também foram biotinilados com o uso de Sulfo-NHS-LC- biotina (Pierce, Rockford, IL) com uma razão em peso entre proteína e biotina de 5, conforme descrito anteriormente

[72]. Os mesmos foram usados em três ELISAs para medir: - ligação biespecífica a IgG ou Alb de cão revestido (5 µg/ml) e TeNT biotinilado (0,25 µg/ml) - ligação biespecífica a TeNT (0,75 µg/ml) que foi capturado com cAb-TT2 adsorvido passivamente (1 µg/ml) e Alb de cavalo biotinilado (1 µg/ml) - ligação bivalente a TeNT revestido (0,75 µg/ml) e TeNT biotinilado (0,25 µg/ml)

[00237] Placas de 96 poços de poliestireno foram revestidas com os antígenos necessários dissolvidos em PBS (TeNT) ou NaHCO3 50 mM pH 9,2 (todos os outros antígenos) de um dia para o outro a 4 °C a 100 µl/poço. Todas as incubações subsequentes foram realizadas, após a lavagem das placas com o uso de 100 µl/poço em tampão ELISA (leite desnatado a 1%; Tween-20 a 0,05%; NaCl 0,5 M; KCl 2,7 mM; KH2PO4 2,8 mM; Na2HPO4 8,1 mM; pH 7,4), por 1 h à temperatura ambiente. Placas revestidas com cAb-TT2 foram subsequentemente incubadas com TeNT em tampão ELISA. Então, as placas foram incubadas com séries de diluição dupla de SDA começando com concentração de 1 µg/ml de SDA em doze poços. Em alguns ELISAs, os SDAs ligados foram detectados diretamente com o uso de conjugado de BMG-his-1 mAb PO de clone anti-his6 diluído 1.000 vezes (hisPO; Roche Applied Science) ou conjugado Ig PO anti-lhama de cabra diluído

10.000 vezes (GALPO; Bethyl Laboratories) . Em outros ELISAs, as placas com SDAs ligados foram incubadas com TeNT biotinilado ou Alb de cavalo biotinilado. Os antígenos biotinilados foram, então, detectados com 0,5 µg/ml de um conjugado de estreptavidina PO (StrepPO; Jackson Immunoresearch Laboratories). PO ligado foi, então, detectado por coloração com 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina.

Depois de parar a reação pela adição de ácido sulfúrico 0,5 M (50 µl por poço), a absorvância a 450 nm foi medida com o uso de um espectrofotômetro. Os dados de absorvância foram avaliados em planilha Excel® (Microsoft Corporation, Redmond, EUA). Isso foi usado para calcular o valor máximo de A450. Uma curva logística de quatro parâmetros foi ajustada para absorvância e concentrações de SDA com o uso de software de computador apropriado. Essa curva foi usada para interpolar a Concentração Efetiva (CE) resultando em um valor de absorvância particular para cada SDA em cada ELISA. O valor exato de absorvância usado para interpolação da concentração de SDA (consulte a Tabela 14) variou entre diferentes ELISAs, dependendo dos valores de absorvância de fundo na ausência de SDA e dos valores máximos de absorvância observados com diferentes SDAs.

[00238] Os resultados dos vários ELISAs são apresentados como absorvância máxima alcançada (absorvância mínima para ELISA de inibição de TeNT-GT1b; Tabela 15) e Concentração Efetiva de SDA (Tabela 16). Desses ELISAs pode-se concluir que: - O ELISA de inibição de GT1b-TeNT mostra que todos os SDAs contendo SVT02, bem como SVAs monoméricos e SDAs de SVG, não inibem, enquanto todos os SDAs monoméricos e multiméricos adicionais inibem. Isso é consistente com observações anteriores em SDAs monoméricos SVT06L, SVT15L e SVT16L (Exemplo 10).

- O ELISA com TeNT e biotina-TeNT tem altos valores de absorvância máxima de 1,63 e 1,72 com SDAs multiméricos, como esperado, mas valores de absorvância mais baixos de no máximo 1,12 com alguns SDAs multiméricos biespecíficos e valores de absorvância ligeiramente aumentados de no máximo 0,35 com alguns SDAs monoméricos, o que não é esperado. A absorvância de fundo é de cerca de 0,14. É possível que haja uma ponte devido à presença de IgG ou Alb em leite que é usado como agente bloqueador. No entanto, esses resultados indicam ligação de TeNT bivalente pelos dois SDAs bivalentes e biespecíficos.

- Como observado anteriormente, SDAs multiméricos contendo um domínio SVT02 SDA nunca se ligam a TeNT diretamente revestido.

- Em ELISA com cAb-TT2 capturado TeNT e Alb de cavalo biotinilado, o SVA12L SDA monomérico não se liga e todos os SDAs multiméricos contendo SVA12 SDA se ligam, incluindo SVT02-GS2-SVA12M2-H6 que não se ligou a TeNT diretamente revestido.

- O SVT15-3FW4M SDA e SVT15-3FW4M-GS2-SVG06M4-H6 SDA parecem ser ineficientemente reconhecidos pelo conjugado anti-his6 mAb PO, mas é bem detectado com GALPO ou em ELISA de inibição de GT1b-TeNT. Isso é consistente com a degradação proteolítica C-terminal do marcador his6 que também foi observado em SDS-PAGE (exemplo 14).

- SVT02-GS2-SVG06M4-H6 (exemplo 14) mostrou degradação em SDS-PAGE que pode indicar perda do marcador his6 da maioria das moléculas de SDA, o que pode explicar o baixo valor de absorvância em um ELISA em IgG de cão com o uso de mAb anti-his6 para detecção de SDA. Para esse SDA biespecífico particular, isso não pode ser confirmado pela demonstração da ligação a TeNT com o uso de GALPO ou no

ELISA de inibição de GT1b-TeNT, uma vez que SVT02 não se liga a TeNT diretamente revestido tampouco inibe no ELISA de GT1b-TeNT.

- Todos os SDAs multiméricos, incluindo SVT02-GS2- SVG06M4-H6 e SVT15-3FW4M-GS2-SVG06M4-H6, ligam-se a TeNT e a Alb ou IgG, conforme demonstrado pelo ELISA com o uso de IgG de cão ou revestimento de Alb de cão e TeNT biotinilado. SDAs monoméricos não mostram ligação nesses ELISAs.

- STV02-GS2-SVG13M4-H6 rende um valor de absorvância máxima em IgG de cão de 0,18 que é muito mais baixo do que os outros SDAs multiméricos contendo SVG13M4, mas comparável ao valor de 0,16 para SVG13L monomérico e claramente acima dos valores de fundo de 0,05 a 0,06 observados para SVT-SDAs monoméricos não específicos. Isso indica que STV02-GS2-SVG13M4-H6 se liga a IgG de cão. Isso é confirmado pelos valores de absorvância mais altos com o uso de TeNT biotinilado para detecção de STV02-GS2-SVG13M4- H6 ligado a placas revestidas com IgG de cão.

[00239] Tomados em conjunto, todos os SDAs multiméricos mostram ligação biespecífica a TeNT e IgG ou Alb, mas alguns SDAs não mostram ligação forte em ELISAs específicos, uma vez que não se ligam a TeNT diretamente revestido (SVT02 contendo SDAs), ou não inibem GT1b-TeNT (SVT02 contendo SDAs) ou perderam o his-tag C-terminal

(SVT02-GS2-SVG06M4-H6 e SVT15-3FW4M-GS2-SVG06M4-H6).

[00240] Para confirmar a natureza biespecífica/bivalente dos SDAs multiméricos, foi usado um segundo sistema de ensaio completamente diferente. A interferometria em biolamada (BLI) foi usada como técnica analítica para medir as interações entre TeNT (holotoxina), albumina (cavalo) e vários SDAs. BLI é uma técnica óptica que analisa o padrão de interferência de ondas de luz refletidas de duas superfícies. Mudanças no número de moléculas ligadas ao biossensor causam uma mudança espectral no padrão de comprimento de onda de interferência que é medido (tempo real) e relatado em mudança nanométrica (nm). A plataforma Octet® fornece com isso os meios para obter informações precisas sobre a taxa de formação do complexo biomolecular entre SDAs e antígenos alvo. O instrumento Octet Red96 (ForteBio) foi equipado com biossensores de estreptavidina (SAX). Para medições, 10 µg/ml de TeNT biotinilado (bio-T, Tabela 17a) ou Albumina de cavalo biotinilada (bio-Ah, Tabela 17b), chamado de ligante, foi acoplado a sensores SAX por 10 minutos. Os sensores (carregados com o respectivo antígeno alvo) foram então transferidos para uma solução que continha um SDA específico (mono ou multimérico) a 100 nM, e foi medido se a interação ocorresse por 4 minutos. Em uma próxima etapa, os sensores, agora ligados com SDA mono ou multimérico,

foram transferidos em uma solução e deixados reagir com um segundo analito seja a toxina não marcada (TeNT, a 100 nM) ou a albumina de cavalo (Ah, a 100 nM) por 5 minutos. A interação (deslocamento de nm) entre o sensor e o analito foi novamente monitorada.

[00241] Os resultados foram analisados e as Tabelas 17a e 17b abaixo mostram os resultados para diferentes SDAs (mono e multiméricos).

[00242] A partir dos resultados, pode-se concluir que: - SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 demonstra ligação bivalente a duas moléculas TeNT-TeNT.

- SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 e SVT06- GS2-SVA12M2-H6 demonstram ligação biespecífica a TeNT e albumina de cavalo em duas configurações de teste diferentes.

- SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 e SVT16L tiveram a capacidade de se ligar a TeNT.

- SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 e o SVG13L não tiveram, como esperado, a capacidade de interagir com a albumina de cavalo.

16. Análise da Meia-vida Multimérica do Soro de SDA em Suínos

[00243] Vários ensaios in vitro (exemplos 4, 5, 7, 8, 9, 15 e 18) com SDAs mono e multiméricos demonstraram que esses SDAs podem se ligar a componentes do sangue de várias espécies (por exemplo, equino, canino, felino e suíno). Para avaliar as características in vivo de alguns dos SDAs no que diz respeito ao prolongamento da meia-vida sérica, foi realizado um experimento com animais.

O experimento animal foi realizado em suínos, sendo um verdadeiro cruzamento de espécies, uma vez que os SDAs foram gerados com o uso apenas de proteínas Equinas e

Caninas.

Para esse propósito, foram usados 24 leitões com cerca de 6 semanas de idade, consistindo em 12 machos e 12 fêmeas.

Os mesmos foram pesados 10 dias antes da inoculação

SDA multimérica e alocados em quatro grupos de 6 leitões cada um com distribuição igual de gênero, preferencialmente pesos corporais médios iguais e distribuição preferencialmente igual de leitões de acordo com a origem da porca.

Os grupos (Tabela 18) são indicados pelo nome do plasmídeo que codifica os SDAs biespecíficos (pRL489,

pRL490, pRL495 e pRL499) a serem injetados intramuscularmente.

Três leitões do grupo pRL489, dois machos e uma fêmea, também receberam um segundo SDA biespecífico codificado pelo plasmídeo pRL276 denominado

M8ggsVI4q6e [44]. Este SDA biespecífico contém o mesmo domínio SDA de ligação de IgG que SDA2 K609ggsVI-4q6e que foi usado anteriormente para medir a meia-vida [19], mas um domínio SDA fundido diferente que é específico para o antígeno do vírus da febre aftosa (FMDV).

[00244] Os leitões foram pesados um dia antes da inoculação com SDA (dia-1). Com base nestes pesos corporais, foi calculada a dosagem dos SDAs multiméricos (Tabela 18). As dosagens aumentaram de 0,2, 0,3 a 0,5 mg/kg para cada grupo. SDAs esterilizados por filtro diluídos em PBS foram injetados por via intramuscular em um único local na coxa traseira em um volume de cerca de 5 ml. Amostras de sangue para preparação de soro foram coletadas da veia jugularis imediatamente antes da inoculação do SDA e 1, 2, 4, 8, 11, 14, 21 e 28 dias após a inoculação do SDA. O peso corporal dos leitões também foi determinado no final do experimento no dia 28 a fim de compensar a meia-vida sérica para o crescimento dos animais.

[00245] Os níveis de SDA no soro foram determinados por ELISA com o uso de holotoxina TeNT ou FMDV e um conjugado de mAb PO anti-tag. Para esse propósito, placas de poliestireno de 96 poços revestidas com holotoxina TeNT a 2 µg/ml em PBS ou SDA M23F específico para FMDV O1 manisa

[2] dissolvido em tampão de revestimento (tampão de NaHCO3 50 mM pH 9,2) durante a noite a 4 °C a 100 µl/poço. Todas as incubações subsequentes foram realizadas, após lavagem das placas com tampão, durante 1 hora à temperatura ambiente. Placas revestidas com M23F foram subsequentemente incubadas com 5 µg/ml 146S de FMDV O1 Manisa em tampão

ELISA. Então, as placas foram incubadas com duas séries de diluições de SDA em oito poços, começando com o padrão SDA de 1 µg/ml e 0,1 µg/ml em duas séries e soros de leitão diluídos em cinco vezes. Soros de leitões inoculados com SVT06 ou SVT16 contendo SDAs multiméricos foram incubados em placas revestidas com TeNT, enquanto soros de leitões inoculados com M8ggsVI4q6e foram incubados em placas revestidas com FMDV. Placas revestidas com TeNT foram subsequentemente incubadas com conjugado anti-his6 mAb-PO e placas revestidas com FMDV com conjugado anti-myc mAb-PO.

PO ligado foi, então, detectado por coloração com 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina. Depois de parar a reação pela adição de ácido sulfúrico 0,5 M, a absorvância a 450 nm foi medida com o uso de um espectrofotômetro. Uma curva logística de quatro parâmetros foi ajustada para absorvância e concentrações de SDA de padrões. Essa curva foi usada para interpolar a concentração de SDA resultando em um valor de absorvância particular para cada amostra de soro em cada ELISA. As concentrações séricas calculadas de SDA foram exportadas para um modelo de planilha Excel® (Microsoft Corporation, Redmond, EUA).

[00246] O peso do leitão aumentou de cerca de 10 kg para cerca de 25 kg durante o período de 4 semanas de coleta de soro. Compensou-se o aumento do peso corporal na medição da meia-vida sérica como segue. Para cada leitão,

assumiu-se que o aumento do peso corporal por hora depende do peso corporal inicial e se ajusta à fórmula BW(t)=BW(0)*T^t, que pode ser reescrito como T=10^(log10(BW(t)/BW(0))/t), em que t é o tempo em horas, em que BW(t) é o peso corporal no tempo t, BW(0) é o peso corporal no tempo 0, T é o ganho de peso fracionário por hora.

[00247] Isso permite o cálculo do fator T a partir dos pesos dos leitões no dia -1 e no dia 28. Em pontos de tempo intermediários entre o dia -1 e o dia 28, compensou- se o aumento do peso corporal multiplicando a concentração de VHH medida por T^t.

[00248] A meia-vida sérica terminal foi calculada de acordo com a fórmula: SDA(t) = SDA(0)*(0,5^(t/T½ß)), em que t é o tempo em horas, em que SDA (0) é a concentração de SDA no primeiro ponto de tempo usado, para cálculo de meia-vida que é compensado pelo aumento de peso corporal, SDA(t) é a concentração de SDA no tempo t, T½ß é a meia-vida terminal.

[00249] Uma vez que as amostras do dia 28 continham um nível SDA mais baixo, conforme revelado pelos valores de absorvância que eram frequentemente menores do que 3 vezes o valor de absorvância de fundo, esses dados foram omitidos da análise. A meia-vida sérica foi calculada a partir das amostras do dia 4 ao dia 21. A função Solver do Microsoft

Excel foi usada para ajustar as concentrações de SDA contra o tempo de acordo com a fórmula acima para cada leitão individual. A média e o desvio padrão de T½ß foram calculados.

[00250] O volume de biodistribuição de IgG injetada por via intravenosa em humanos é de 60 ml/kg de peso corporal de acordo com as referências em [73]. Portanto, espera-se que a concentração inicial (dia 1-2) de SDA no sangue seja um pouco menor do que 1/0,06=16,67 vezes a dose injetada, uma vez que a maior parte do SDA está inicialmente no sangue. Isso se encaixa perfeitamente para os três SDAs de ligação de Alb e SDA de controle M8ggsVI- 4q6e que têm concentrações iniciais de SDA acima de 2 mg/l (Figura 6), mas é consideravelmente menor para SVT16-L123Q- GS2-SVG13M4-H6, consistente com sua baixa meia-vida.

[00251] O T½ß de SDAs a partir do dia 4 (96 h) foi calculado, incluindo a compensação de peso corporal, e os mesmos estão resumidos na Tabela 18. O T½ß de M8ggsVI-4q6e é menor que o T½ß de K609ggsVI-4q6e medido anteriormente

[19]. Isso pode ser devido aos diferentes SDAs fundidos ou a uma diferença entre os dois experimentos com animais.

[00252] Todos os três SDAs multiméricos de ligação a Alb mostraram um T½ß variando de 111 a 135 horas, com baixos desvios padrão. Isso é mais alto do que o T½ß de 82 horas do controle positivo SDA M8ggsVI-4q6e. Todos esses três SDAs multiméricos continham o domínio SDA de ligação a Alb SVA12M2, fundido com SVT06, SVT16-L123Q ou fundido com ambos os domínios SVT SDA em um SDA multimérico.

Aparentemente, a meia-vida impulsionada por SVA12M2 não é afetada pelo SVT SDA específico fundido a isso, nem pelo número de SDAs fundidos a isso.

[00253] O T½ß de SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 contendo o SVG13 SDA direcionado contra IgG é de apenas 20 horas. O T½ß está claramente aumentado em comparação com um monômero de controle SDA K609ggsK812 que não se liga às proteínas séricas e tem um T½ß de 1,8 hora [19], indicando que ocorreu extensão da meia-vida. No entanto, isso é muito menor do que o T½ß dos SDAs multiméricos de ligação a Alb.

A ligação de SVG13L a IgG suína em ELISA resultou em valores de absorvância máxima mais baixos e valores de EC mais baixos para IgG suína em comparação com IgG felina, equina, canina e humana (Tabela 8). Isso sugere que a ligação de SVG13L a outra IgG que não a IgG suína é de maior afinidade e leva, consequentemente, a uma meia-vida sérica mais prolongada nessas espécies.

[00254] A afinidade de SVA12L para albumina equina, canina e felina varia entre 10 a 270 nM, e foi de aproximadamente 159 nM para albumina suína (exemplo 18).

Portanto, uma meia-vida sérica similar ou ainda melhor de SVA12 quando incluída em SDAs multiméricos pode ser esperada in vivo em equinos, caninos e felinos.

[00255] O controle positivo M8ggsVI-4q6e contém o domínio SDA VI-4 como também contido em VI-4L (exemplo 9).

Os SDAs VI-4L, VI8L, VI11L e VI14L têm uma afinidade (KD) de 1-33 nM para IgG porcino [19,44]. O SDA SVG13 forneceu valores de EC comparáveis para IgG equina, canina e felina como os SDAs VI4L, VI8L, VI11L e VI14L demonstraram contra IgG suína (Tabela 8). Portanto, uma meia-vida sérica similar de SVG13 pode ser esperada in vivo em espécies equinas, caninas e felinas.

17. Análise de SDA para Capacidade de Neutralização de Toxina do Tétano em um Modelo de Camundongo

[00256] Ensaios in vitro (exemplos 3, 10, 11, 12, 13, 15 e 18) com SDAs à base de SVT mono e multimérico demonstraram que esses SDAs podem se ligar de forma eficiente à holotoxina do tétano em vários ambientes de teste experimental. Para avaliar as características in vivo de alguns desses SDAs, foi realizado um experimento em animais para avaliar sua capacidade de neutralização da toxina do tétano. Seis amostras de SDA candidatas (consulte a Tabela 19) foram testadas quanto à potência da toxina antitetânica com o uso do teste de neutralização da toxina de camundongo. Um SDA monomérico (SVT03L), quatro SDAs biespecíficos (SVT02-GS2-SVG13M4-H6, SVT06-GS2-SVG13M4-H6, SVT153FW4M-GS2-SVG13M4-H6, SVT16L123Q-GS2-SVG13M4-H6,

SVT153FW4M-GS2-SVG13M4-H6, SVT16L123Q-GS2-SVG13M4-H6) e tétano) e SDA bivalente (para toxina do tétano) (SVT06-GS3-

SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6) foram avaliados no teste de neutralização de toxina de camundongo (TNT). Foi realizado seguindo um método similar ao descrito na monografia 0091 da Farmacopeia Europeia para a antitoxina do tétano.

O ensaio foi realizado com o uso de um nível de sensibilidade mais alto do que o método descrito na monografia Ph Eur

0091, permitindo a detecção de menores quantidades de anticorpos neutralizantes de toxinas a fim de determinar com precisão os pontos finais de neutralização dos SDAs.

O nível de dose de toxina do tétano (NIBSC: AWX 4664, diluída a 1/100) do ensaio realizado por a Lp/200. Uma antitoxina de referência do tétano TE3 (pré-diluída de 1/400 a 0,025

IU/ml na primeira diluição) foi incluída (um grupo de 4 camundongos) em cada estudo que permitiu a determinação da potência para cada amostra de teste.

Cada vez um volume fixo de 0,35 ml de toxina foi misturado com 2,15 ml de amostra de teste de SDA pré-diluída e deixada em repouso por 30 minutos antes da injeção em camundongos (0,5 ml s.c., coxa esquerda). Cada amostra pré-diluída foi diluída em série com tampão para criar uma série de diluição dupla ou quatro vezes maior.

Cada diluição de SDA teve n=4 camundongos.

Os animais foram observados durante 96 horas quanto a sinais de paresia do tétano.

Em cada ensaio, o TE3 de referência foi diluído (duas ou quatro vezes) com tampão. Em cada estudo, foram usados (1, 2 e 3) camundongos NIH fêmeas, 16 a 20g, com idade de 5 a 6 semanas. No total, foram realizados 3 estudos consecutivos.

[00257] No estudo 1, as amostras de SDA foram diluídas de modo que a concentração inicial de cada SDA na mistura de ensaio fosse 1.000 nM para todos os candidatos, exceto para SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6, em que a quantidade na mistura era de 100 nM. Cada candidato foi, então, diluído em série para criar uma série de diluição dupla de 5 ou 6 diluições no total (consulte a Tabela 19).

Cada diluição foi misturada com uma quantidade fixa de toxina do tétano e deixada em repouso por 30 minutos antes da injeção em camundongos (0,5 ml s.c., coxa esquerda).

Cada grupo de diluição tinha n=4 camundongos. Os animais foram observados durante 96 horas quanto a sinais de paresia do tétano. A proporção de camundongos protegidos em cada diluição é mostrada na Tabela 19.

[00258] Nenhum efeito neutralizante da toxina do tétano in vivo, em nível de 1.000 nM, foi observado para os SDAs SVT02-GS2-SVG13M4-H6, SVT03L e SVT16-L123Q-GS2- SVG13M4-H6.

[00259] Os SDAs SVT06-GS2-SVG13M4-H6 e SVT15-3FW4M- GS2-SVG13M4-H6 forneceram proteção, nas concentrações de

1.000 nM e 500 nM. Ambos os SDAs tiveram a capacidade de neutralizar a toxina do tétano de forma eficaz quando testados neste modelo in vivo.

[00260] O SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 SDA forneceu proteção total em todas as 6 diluições. Embora administrado a uma concentração 10 vezes inferior, esse SDA bivalente (isto é, para TeNT) foi mais potente do que todos os outros SDAs biespecíficos. Além disso, o SVA12L SDA fundido aos dois SVT SDAs fundidos (SVT06-GS3-SVT16-L123Q) (in vitro) não se liga à albumina de camundongo. Portanto, esse SDA multimérico neutraliza a toxina do tétano de forma muito eficiente no tempo de incubação de 30 minutos que é fornecido.

[00261] Com base na concentração da antitoxina de referência TE3 (pré-diluída 1/400 a 0,025 IU/ml na primeira diluição) no ponto final (meio caminho entre as etapas de diluição 2 e 3), a potência para cada amostra de teste pode ser expressa em UI/ml. Observe que onde nenhum ponto final foi obtido, a potência é expressa como <(se 0% de proteção em todas as diluições) ou > (se 100% de proteção em todas as diluições). Os dados são mostrados na Tabela 20.

[00262] O ponto final para a antitoxina de referência estava no meio do caminho entre as diluições 2 e 3 = 1,3 ml na mistura de ensaio (0,0325 UI na mistura de ensaio). Para as amostras desconhecidas, no ponto final há 0,0325 IU na mistura de ensaio = 0,0325 IU em 2,15 ml que =

0,0151 IU/ml. Esse valor pode então ser multiplicado pelo respectivo fator de diluição total do SDA relevante.

[00263] O SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 trivalente tem a maior potência (proteção inferior a 3,1 nM) de todas as amostras testadas. É um SDA trivalente, com um SDA (SVA12), de três SDAs ligados, que se liga à albumina de várias espécies. Os outros dois SDAs (SVT06 e SVT16) ligam-se com alta afinidade (baixo valor KD para a toxina do tétano e cada um se liga a um domínio diferente (exemplo 13, 15,18).

[00264] Posteriormente, outro TNT teve que ser realizado (estudo 2) para determinar o ponto final de proteção para SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6. Além disso, na literatura [7,42] é descrito que a mistura de anticorpos monoclonais de camundongo dirigidos contra diferentes epítopos pode fornecer um efeito sinérgico para o nível de neutralização da toxina do tétano. Um efeito similar foi observado para scFvs que podem neutralizar a toxina do tétano [67]. Outros [24] publicaram que um nanocorpo de toxina antitetânica bivalente não levou a uma eficácia melhorada forte quando comparado à forma monomérica. Portanto, além desse segundo teste, foi avaliado se as combinações desses diferentes SDAs multiméricos quando misturados em uma solução mostrariam um efeito de neutralização de toxina mais forte (efeito sinérgico) do que quando testado isoladamente, consulte a Tabela 21 para o esquema testado. O ensaio foi realizado como descrito acima.

[00265] Os resultados do segundo teste de neutralização de toxina de camundongo são mostrados na Tabela 22a e 22b e 23. O ponto final para a antitoxina de referência foi o mesmo que no estudo 1, a meio caminho entre as diluições 2 e 3 = 1,3 ml na mistura do ensaio (0,0325 UI na mistura do ensaio). O mesmo cálculo de potência (com base nas concentrações relevantes na primeira diluição) pode, portanto, ser seguido para o grupo 7 (SDA único), conforme mostrado no estudo 1. Para as combinações de SDA, não é possível fornecer uma estimativa para a potência de cada SDA na mistura, pois a contribuição relativa de cada SDA é desconhecida. A potência da mistura pode, no entanto, ser descrita como a concentração mais baixa (nM) na qual a mistura SDA forneceu uma proteção de 100% (Tabela 22b).

[00266] Os SDAs multiméricos SVT15-3FW4M-GS2- SVG13M4-H6 e SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 quando misturados com SVT06-GS2-SVG13M4-H6 a 62,5 nM (grupo 1 e 3) forneceram proteção pelo menos > 125 vezes o nível mais alto, a concentração final de ambos os SDAs foi de 3,91 nM no total, do que quando SVT06-GS2-SVG13M4-H6 foi testado como molécula única (500 nM). Assim, foi demonstrada uma evidência clara de um forte efeito sinérgico entre esses SDAs (consulte as Tabelas 21a + 21b).

[00267] Os camundongos no Grupo 5 estavam desprotegidos, o que mostra que nesta mistura, e nessas concentrações dos SDAs relevantes, nenhum efeito sinérgico foi encontrado para SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 e SVT16- L123Q-GS2-SVG13M4-H6.

[00268] O SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 novamente forneceu proteção total em todas as diluições. A diluição final na qual a proteção total foi encontrada tinha uma quantidade de SDA igual a 0,2 nM (Tabela 23). A potência desse SDA consequentemente é > 1.478 IU/mg.

[00269] A partir dos dados do estudo 2, não se pode excluir se os SDAs SVT02-GS2-SVG13M4-H6 e SVT03L podem ter um efeito sinérgico, uma vez que o efeito sinérgico dos outros SDAs nas misturas por si só está presente na diluição final. As concentrações finais de no grupo 2 e 4 dos SDAs individuais SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 e SVT16- L123Q-GS2-SVG13M4-H6 quando misturados com SVT06-GS2- SVG13M4-H6 foi, no entanto, duas vezes menor do que isso dos mesmos SDAs no grupo 1 e 3. Na concentração mais baixa (0,97 nM na etapa de diluição final), a proteção total foi encontrada.

[00270] Subsequentemente, um terceiro estudo foi realizado para determinar o ponto final de potência do candidato SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 (consulte a Tabela 24 abaixo). Nesse estudo, foi decidido implantar uma diluição de 4 vezes por etapa. Além disso, a fim de investigar se o único SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2- SVA12M2-H6 multimérico único foi mais potente do que quando os dois SDAs SVT06-GS2-SVG13M4-H6 e SVT16-L123Q-GS2- SVG13M4-H6, as moléculas foram misturadas e diluídas da mesma maneira que esse grupo também foi incluído.

[00271] Para investigar se SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4- H6 poderia aumentar ainda mais a potência do único SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6, a mistura de ambos foi testada também em um grupo separado.

[00272] No estudo 3, o ponto final para a antitoxina de referência (TE-3) foi ligeiramente diferente do obtido no estudo 1 e no estudo 2 com apenas 75% dos animais protegidos na diluição 2 (Tabela 24). Usando o método de Spearman-Karber para calcular a dose protetora de 50%, a concentração de antitoxina no ponto final é calculada como 0,034 IU na mistura do ensaio (nas fases 1 e 2, o ponto final para a referência estava no meio do caminho entre as diluições 2 e 3 = 0,0325 IU na mistura de ensaio).

[00273] Para SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2- H6, que foi testado individualmente, o ponto final é a diluição 1 (50% dos animais protegidos) e a diluição 1 contém 0,034 IU na mistura de ensaio (= 0,034 IU em 2,15 ml da amostra de teste e 0,0158 IU/ml). Um título de neutralização pode ser calculado multiplicando o fator de diluição total para a amostra pela concentração de antitoxina no ponto final, conforme mostrado na Tabela 25.

[00274] A capacidade de neutralização da toxina do tétano muito alta para SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2- SVA12M2-H6 foi novamente confirmada. A potência do estoque principal para esse SDA multimérico particular foi calculada a partir dos resultados desse ensaio particular em 11.474 IU/ml, o que equivaleria a mais de 1.500 IU/por mg de proteína. Em outro ensaio com etapas de diluições menores de 0,2 nM em diante, a capacidade de neutralização desse SDA pode ser determinada com ainda mais precisão.

[00275] Notavelmente, SVA12L não se liga a Alb de camundongo e, portanto, é improvável que dê alongamento de meia-vida em camundongos e contribua para a potência medida (exemplo 7) após administrar o mesmo aos camundongos.

[00276] A indicação de um efeito sinérgico da combinação de SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 e SVT15- 3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 foi demonstrada a 0,4 nM de SDA total fornecendo proteção total.

[00277] Nenhuma proteção foi observada nesse ensaio para a combinação do candidato SVT06-GS2-SVG13M4-H6 e SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6. Portanto, com base nos resultados mostrados acima, pode-se concluir que a concentração total desse par de SDA necessária para dar proteção total estaria na faixa de 0,4 a 4 nM, resultando em uma quantidade de 0,2 a 2 nM ou menos para os SDAs individuais na mistura.

[00278] Portanto, os três estudos realizados mostram que o SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 multimérico bivalente e biespecífico único fornece um nível muito alto de proteção contra a toxina do tétano extremamente potente.

Além disso, isso superou o forte efeito sinérgico visto após a mistura dos dois SDAs biespecíficos únicos SVT06- GS2-SVG13M4-H6 e SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6. O SVG13L SDA mostrou se ligar a IgG de camundongo (exemplo 8), o que pode ter contribuído para a potência desses SDAs biespecíficos após a administração da mistura a camundongos. O SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 bivalente biespecífico tem como uma única molécula mais potência do que as propriedades suprassinérgicas de neutralização da toxina do tétano mostradas na mistura, essa é uma característica notável.

18. Determinação de Afinidade de Diferentes SDAs Contra TeNT, Albumina e Imunoglobulina

[00279] Vários SDAs foram testados quanto às suas características de ligação ao alvo (TeNT, albumina e imunoglobulina de diferentes espécies). As características de ligação da toxina do tétano são importantes na capacidade de cada SVT SDA para neutralizar a toxina do tétano in vivo (exemplo 17). Os SVA e SVG SDAs, uma vez fundidos aos SVT SDAs, servem para prolongar a meia-vida sérica terminal dos SVT SDAs. Assim, para os SVA e SVG, as características de ligação dos SDAs [19, 22, 23, 25] aos diferentes componentes do sangue são importantes. Para fins veterinários, é importante abordar as diferenças de espécies entre esses componentes do sangue. Para certos alvos de doenças cruzadas (por exemplo, tétano), seria preferencial usar um único SDA para uso terapêutico em várias espécies, em vez de desenvolver para cada espécie um SDA terapêutico separado.

[00280] Aqui, a técnica de interferometria de biocamada (BLI) foi usada para medir as interações entre TeNT, albumina de diferentes espécies e imunoglobulinas de diferentes espécies e vários SDAs mono e multiméricos. BLI é uma técnica analítica ótica que analisa os padrões de interferência entre ondas de luz. Mudanças no número de moléculas (analito) ligadas ao biossensor (revestidas com ligante) causam uma mudança espectral (mudança de nm) no padrão de comprimento de onda de interferência (= sinal) que é medido em tempo real. KD é a constante de afinidade, ou constante de dissociação de equilíbrio, que é uma medida de quão firmemente o ligante se liga ao analito. Isso representa a razão entre a taxa de ativação e a taxa de desativação e pode ser calculado com o uso de ka e kdis. KD é expresso em unidades molares (M). O KD corresponde à concentração de analito na qual 50% dos sítios de ligação do ligante são ocupados em equilíbrio, ou a concentração na qual o número de moléculas de ligante com analito ligado é igual ao número de moléculas de ligante sem analito ligado.

Existe uma relação inversa entre KD e afinidade, uma constante de afinidade menor indica uma interação mais estreita, ou maior afinidade do analito para o ligante.

[00281] Para medir as interações entre os alvos e SDAs, o instrumento Octet Red96 (Pall Life Sciences) foi equipado com estreptavidina (SA/SAX), Anti-Penta-HI (HIS1K) ou, por exemplo, Ni-NTA (NTA) Dip e biossensores ReadTM (FortéBio).

[00282] Para determinar a afinidade de ligação de SDAs à toxina do tétano 2 µg/ml de biotinilado (consulte o exemplo 3) TeNT foi acoplado a sensores SA. Os SDAs foram diluídos em tampão PBS (PBS 10X Fischer científico, cat BP399-1 e WFI, Hyclone, cat no SH3022110) contendo Tween 20 a 0,02% (ACROS ORGANICS, CAT no 233362500) (PBSTween) em uma série de diluição dupla de 100 nM a 1,56 nM (SVT02-GS2- SVG13M4-H6, SVT03L, SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 e SVT16L123Q-GS2-SVG13M4-H6), ou uma série de diluição dupla de 10 nM a 0,156 nM (SVT06-GS2-SVG13M4-H6, SVT06-GS2- SVA12M2-H6 e SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6). As séries de diluição de SDA foram incubadas com sensores acoplados a TeNT por 5 minutos (concentração inicial de 100 nM) ou 10 minutos (concentração inicial de 10 nM) seguido por uma etapa de dissociação em PBS-Tween por mais 10 minutos (SVT02-GS2-SVG13M4-H6, SVT03L, SVT15-3FW4M-GS2- SVG13M4-H6 e SVT16L123Q-GS2-SVG13M4-H6) ou 60 minutos (SVT06-GS2-SVG13M4-H6, SVT06-GS2-SVA12M2-H6 e SVT06-GS3- SVT16-L123Q-SVA1212M2-H6).

[00283] Para determinar a afinidade de ligação dos SDAs SVT06L, SVT15L e SVT16L à toxina do tétano, 5 µg/ml do respectivo SDA biotinilado foi acoplado aos sensores SA e à toxina do tétano, em uma série de diluição dupla de 75 nM a 4,69 nM foram incubados com os sensores acoplados a SDA por 5 minutos, seguidos por uma etapa de dissociação em PBS- Tween por mais 30 minutos.

[00284] Os resultados foram, então, analisados com o uso do software ForteBio Data Analysis para determinar a constante de afinidade (KD, que é kdiss/ka). A Tabela 27 mostra os dados de afinidade para vários SDAs purificados.

[00285] Os SDAs biespecíficos e monoméricos (SVT02- GS2-SVG13M4-H6, SVT06-GS2-SVG13M4-H6, SVT06-GS2-SVA12M2-H6, SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6, SVT06L, SVT15L, SVT16L, SVT16L123Q-GS2-SVA12M2-H6, SVT16L123Q-GS2-SVG13M4-H6) ligados com afinidades subnanomolar a picomolar a TeNT.

Para a capacidade de neutralização ReNT, essa é uma característica fundamental. Uma associação rápida e uma dissociação fortemente retardada dos SDAs à base de SVT evitam que a toxina exerça sua atividade de maneira rápida e durável em baixas concentrações de toxina que são normalmente encontradas em animais intoxicados.

[00286] Especialmente a estabilidade do complexo de toxina do tétano e SDA é importante, pois irá prevenir, por exemplo, a absorção da toxina no neurônio. Valores de dissociação muito baixos (Kdis) foram encontrados para os SDAs SVT03L, SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6, SVT06-GS3-SVT15- 3FW4M-GS2-SVG06M4-H6 e SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2- H6.

[00287] Para três de quatro destes SDAs de ligação do fragmento C, SVT06-GS2-SVG13M4-H6, SVT15-3FW4M-GS2- SVG13M4-H6 and SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6, excelentes propriedades de neutralização de toxinas foram demonstradas quando testados como SDA único (a níveis < 4 µg/ml e < 30 ng/ml) e misturados (a níveis < 30 ng/ml, consulte o exemplo 17) em um TNT in vivo.

[00288] A avidez (KD) para TeNT dos três SDAs contendo dois domínios SVT, SVT06-GS3-SVT02-GS2-SVG06M4-H6, SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 and SVT06-GS3-SVT16- L123Q-GS2-SVA12M2-H6 encontra-se na faixa picomolar. Para SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 a avidez medida é de 13 picomolar e esse SDA mostrou excelentes propriedades de neutralização da toxina do tétano no modelo de neutralização de toxina in vivo (exemplo 17).

[00289] Esse SDA tem uma afinidade cerca de dez vezes maior (valor KD inferior) do que as afinidades de SDAs monoméricos comparáveis ou VHHs multiméricos contendo apenas um domínio SDA de ligação de TeNT correspondente (SVT06 ou SVT16), sugerindo que ambos os domínios SDA presentes em SVT06-GS3-SVT16- L123Q-GS2-SVA12M2-H6 têm a capacidade de ligação simultânea ao antígeno.

[00290] Para determinar a afinidade de ligação dos SDAs à albumina do soro, vários ensaios foram realizados.

Em primeiro lugar, 1,0 (SVA06L) ou 1,5 (SVA12L, SVA16L) micrograma/ml de SDA foi acoplado a sensores Ni-NTA (tempo de carregamento de 15 min). A albumina equina, canina ou felina foi adicionada como analito, em uma série de diluição dupla de 76,9 nM a 4,81 nM (albumina de cavalo ou cão ou gato) para SVA06L. Para SVA12L, foi usada uma série de diluições duplas de 307,7 nM a 19,2 nM (albumina de cavalo ou cão), ou 615,4 nM a 38,5 nM (albumina de gato).

Para SVA16L, foi usada uma série de diluições duplas de 100 nM a 3,1 nM (albumina de cavalo, cão e gato). As albuminas foram reagidas nos sensores revestidos com SDA (SVA06L e SVA12L) por 1 minuto seguido por uma etapa de dissociação em PBST durante mais 2 minutos, para SVA16L os intervalos foram de 3 e 5 minutos, respectivamente.

[00291] Para determinar a afinidade de SVA12L para albumina de suíno, uma série de diluição dupla de 250 a 15,6 nM foi usada, aqui uma etapa de associação e dissociação de um minuto foi usada.

[00292] Os resultados foram, então, analisados com o uso do software ForteBio Data Analysis. A Tabela 28 mostra os dados dos SDAs testados.

[00293] Vários SDAs que se ligam à parte Fc da imunoglobulina Equina ou Canina também foram testados quanto às suas características de ligação. Em primeiro lugar, para determinar a afinidade dos SDAs SVG03L, SVG23L e SVG24L quando se ligam a IgG Equina (Fc) (Fitzgerald, cat no 31C-CH0804), uma configuração foi usada quando 0,5 µg/ml do SDA foi acoplado aos sensores NTA. O ensaio scout mostrou que o SVG23L não se ligou à proteína Fc Equina usada. O IgG Equino (Fc) foi diluído em PBS Tween em uma série de diluição dupla de 50 nM a 3,13 nM para SDA SVG03L.

O IgG Equino (Fc) foi diluído em PBS Tween em uma série de diluição dupla de 100 nM a 6,25 nM para SDA SVG24L. As séries de diluição de Fc foram incubadas com sensores acoplados a SDA por 3 minutos (fase de associação) seguido por uma etapa de dissociação em PBST durante 10 minutos.

[00294] Para determinar a afinidade de SDAs SVG03L, SVG23L e SVG24L quando se ligam a IgG Canina (Fc) (Rockland, cat no 004-0103), uma configuração foi usada em que 1 µg/ml de SDA foi acoplado a sensores NTA. O ensaio scout mostrou que o SVG03L não se ligou à proteína Fc Canina usada. O IgG Canina (Fc) foi diluído em PBS Tween em uma série de diluição dupla de 40 nM a 2,5 nM para SDA SVG23L. O IgG Canina (Fc) foi diluído em PBS Tween em uma série de diluição dupla de 400 nM a 18,80 nM para SDA SVG24L. As séries de diluição de Fc foram incubadas com sensores acoplados a SDA por 70 a 100 segundos (fase de associação) seguido por uma etapa de dissociação em PBST durante 5 minutos.

[00295] Os resultados foram, então, analisados com o uso do software ForteBio Data Analysis. A Tabela 35 mostra os dados para os SDAs testados contra a parte Fc da imunoglobulina Equina ou Canina.

[00296] Como a albumina e a imunoglobulina são proteínas séricas abundantes, a afinidade dos SDAs pela albumina ou imunoglobulina não precisa ser muito alta para que a maioria das moléculas de SDAs se liguem a esses alvos. Consistente com esta noção, foi observado que a extensão da meia-vida sérica de proteínas terapêuticas com o uso de domínios de ligação de albumina bacteriana geneticamente modificados não era principalmente dependente da afinidade pela albumina. Se os valores de KD fossem inferiores a 100 nM (afinidade de ligação aumentada), a meia-vida no soro não era afetada pela afinidade. Somente quando os valores de KD se aproximaram de 1 µM a meia-vida sérica diminuiu ligeiramente [36,37].

[00297] Para os SDAs SVA06L, SVA12L e SVA16L, a afinidade para albumina de origem porcina, equina, canina ou felina variou entre 1 a 275 nM e todos estavam abaixo de

1.000 nM. Para o SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 multimérico, uma meia-vida sérica de aproximadamente 110 a 145 horas foi estimada em suínos jovens. 21 dias após a administração dos SDAs SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2- SVA12M2- H6 (0,3 mg/kg), SVT06-GS2-SVA12M2-H6 (0,2 mg/kg) e SVT16- L123Q-GS2-SVA12M2-H6 (0,5 mg/kg) ainda eram detectáveis no soro de suínos. Assim, para SDA SVA12L a dosagem administrada, a quantidade de SDAs fundidos ao mesmo e o tipo de SDA não influenciaram significativamente a meia- vida em suínos. Uma vez que todos os SVAs foram gerados com albumina equina e canina, um perfil de meia-vida similar pode ser esperado para esses SDAs em equinos, caninos e felinos.

[00298] Para os SDAs SVG03L, SVG23L e SVG24L, a constante de afinidade KD para a parte Fc da imunoglobulina de origem Equina ou Canina variou entre 0,1 a 4 nM e todos estavam abaixo de 10 nM. O uso desses ligantes pode ser benéfico na interferência com diferentes processos imunológicos (a.o. ativação da via do complemento, reações de hipersensibilidade tipo I, alergia, atopia).

19. Construção e Produção de SDAs Multiméricos Adicionais Contra TeNT

[00299] Dois SDAs mais multiméricos (SVT06-GS3- SVT15-3FW4M-GS2-SVA12M2-H6 e SVT15-3FW4M-GS3-SVT06-GS2- SVG13M5-H6) foram produzidos tornando integrantes MIRY estáveis [75] com o uso do plasmídeo pRL44 [69] na cepa de levedura SU50 [70]. Os elementos a partir dos quais esses SDAs multiméricos foram produzidos são os seguintes: GS3: ligante (G4S)3 descrito anteriormente [27] GS2: ligante (G4S)2 derivado do plasmídeo pRL144

[19] H6: marcador his6, códon de parada dupla e sítio HindIII como em pRL188 [2] SVG13M5: SVG13 com cinco mutações: Q1E, Q5V, W118R, K120Q, L123Q SVA12M2: SVA12 com duas mutações: Q1E, Q5V SVT15-3FW4M: SVT15 sem sítio SacI interno e 3 mutações: K120Q, I122T, L123Q SVT16-L123Q: SVT16 com sítio BstEII silenciosamente restaurado e mutação L123Q

[00300] Fragmentos sintéticos SacI-HindIII foram produzidos e subsequentemente subclonados no plasmídeo pRL44 [69] com o uso dos sítios SacI e HindIII, resultando nos plasmídeos pRL505 e pRL506 (Tabela 34).

[00301] A cepa SU50 de levedura de padeiro (MATa;

cir°; leu2-3, -112; his4-519; can1; [70]) foi transformada com plasmídeos linearizados com HpaI pRL505 e pRL506 por eletroporação [71] e leu+ auxotróficos foram selecionados.

Um único transformante purificado por colônia foi induzido para expressão de SDA em escala de 0,5 l e SDA foi purificado do sobrenadante de cultura gasto por IMAC [58].

SDA foi subsequentemente purificado adicionalmente por cromatografia de troca catiônica em uma coluna de sefarose SP como descrito anteriormente [44] com ligeiras modificações. SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, NJ) e tampão de acetato de sódio 25 mM pH 4,7 foram usados para ligação de SDA à coluna. O SDA ligado foi eluído com um gradiente de 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1 M de NaCl em tampão de ligação. O SDA ligado geralmente eluiu entre 0,4 e 0,6 M de NaCl (Tabela 34). Foi concentrado e trocado por tampão para PBS com o uso de dispositivos de concentração centrífuga de corte de peso molecular de 3 kDa. A concentração de SDA foi determinada com o uso do ensaio de ácido bicinchônico (BCA, Pierce cat no, 23212) e um padrão de albumina de soro bovino (Thermo Scientific, Rockford, IL). Com base no rendimento de SDA purificado, foi calculado o nível de produção dos SDAs multiméricos em levedura (Tabela 34).

[00302] SDAs multiméricos foram analisados por meio da redução de SDS PAGE com o uso de géis NuPage Novex 4% -

12% Bis-Tris com tampão de corrida MOPS (Invitrogen) e coloração com reagente Gelcode Blue (Thermo Scientific).

Ambos os SDAs multiméricos migraram nas posições esperadas com base em sua massa molecular prevista. Dos estoques, uma amostra foi biotinilada (Sulfo-NHS-LC-biotin, Pierce, Cat.

no 21335, lote no OE185235A) com uma proporção de peso apropriada de proteína para biotina.

20. Outras Características de Ligações de Vários SDAs contra TeNT

[00303] Ensaios adicionais foram realizados para estudar a ligação de uma seleção de SDAs quando comparados a cAb-TT1 e cAb-TT2 [46] ao usar o instrumento Octet Red96 (Pall Life Sciences) quando equipado com biossensores de estreptavidina (SA). Para esse propósito, foi avaliada a afinidade de ligação dos SDAs SVT06L, SVT15L and SVT06-GS3- SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6, cAb-TT1 e cAb-TT2 à toxina do tétano.

[00304] Para determinar a afinidade de ligação à toxina do tétano, os SDAs biotinilados foram acoplados a sensores SA (consulte o exemplo 18). Uma série de diluição dupla da toxina do tétano foi preparada, para detalhes do ensaio, consulte a Tabela 29. Após a otimização do ensaio adicional, os SDAs foram incubados com as diferentes diluições da toxina do tétano, a etapa de associação (2 a 8 minutos), seguida por uma etapa de dissociação em PBS-Tween

(2 a 10 minutos). Os resultados foram, então, analisados com o uso do software FortéBio Data Analysis para determinar a constante de afinidade (KD), a Tabela 29 mostra os dados de afinidade para cada SDA.

[00305] Os resultados do teste anterior (consulte a Tabela 27) de SVT06L, SVT15L e SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2- SVA12M2-H6 foram repetidos nessa configuração de ensaio e confirmam a alta afinidade para a toxina do tétano. Para cAb-TT1 e cAb-TT2, foi confirmada a afinidade mais baixa publicada. Especialmente a rápida dissociação de cAb-TT1 e cAb-TT2 é notável. No entanto, isso está de acordo com os resultados de um teste de neutralização de toxina em camundongos, como descrito no documento WO96/34103, em que após a aplicação de 4 µg de cAb-TT2 75% dos camundongos morreram após 4 dias. Em contrapartida, SVT06-GS3-SVT16- L123Q-GS2-SVA12M2-H6 protegeu camundongos quando usado em baixos níveis de nanogramas (20 a 30 ng/ml) em vários TNTs realizados sequencialmente contra uma dose letal 5x maior da toxina do tétano.

[00306] Para determinar a afinidade de 2 SDAs multiméricos adicionais (SVT06-GS3-SVT15-3FW4M-GS2-SVA12M2- H6 e SVT15-3FW4M-GS3-SVT06-GS2-SVG13M5-H6) ao ligar-se à toxina do tétano, foi usada uma configuração de 4 µg/ml de TeNT biotinilado foi acoplado a sensores SA. Os SDAs (incl.

SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6) foram diluídos em tampão PBS contendo Tween 20 a 0,02% (PBSTween) em uma série de diluição dupla de 10 nM a 0,62 nM. As séries de diluições de SDA foram incubadas com sensores acoplados a TeNT por 3 minutos (fase de associação) seguido por uma etapa de dissociação em PBS-Tween por mais 15 minutos. Os resultados foram, então, analisados com o uso do software FortéBio Data Analysis para determinar a constante de afinidade (KD) para cada SDA.

[00307] A partir desse estudo, os SDAs biespecíficos (ligação à toxina do tétano e albumina ou IgG) e bivalentes (para a toxina do tétano) ligados com afinidades sub- nanomolares a picomolares para TeNT, consulte a Tabela 30.

Espera-se que esses SDAs (SVT06-GS3-SVT15-3FW4M-GS2- SVA12M2-H6 e SVT15-3FW4M-GS3-SVT06-GS2-SVG13M5-H6) forneçam neutralização eficaz da toxina do tétano in vivo em níveis de nanogramas baixos com base nos resultados fornecidos no exemplo 17.

21. Outras Características de Ligações de Vários SDAs Multiméricos Contra Albumina Equina, Humana ou Canina

[00308] A fim de determinar a afinidade de ligação de uma seleção de SDAs bivalentes e biespecíficos (multiméricos) para albumina de soro equino, canino e humano, ensaios adicionais foram realizados.

[00309] Para determinar a afinidade de 3 SDAs multiméricos (SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6, SVT06-

GS3-SVT15-3FW4M-GS2-SVA12M2-H6 e SVT15-3FW4M-GS3-SVT06-GS2- SVG13M5-H6) quando se liga à albumina equina, após a otimização, uma configuração foi usada em que 2,5 microgramas/ml de (Sulfo-NHS-LC-biotin, Pierce, Cat. no 21335, lote no OE185235A, a uma razão em peso apropriada entre proteína a biotina) Equina biotinilado ou 5,0 microgramas de albumina humana foi acoplado a sensores SA.

Após a otimização adicional, dois desses SDAs (SVT06-GS3- SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6, SVT06-GS3-SVT15-3FW4M-GS2- SVA12M2-H6) foram diluídos em tampão PBS contendo Tween 20 a 0,02% (PBSTween) em uma série de diluição dupla de 10 nM a 0,62 nM. As séries de diluições de SDA foram incubadas com sensores acoplados a albumina Equina por 6 a 10 minutos (fase de associação) seguido por uma etapa de dissociação em PBS-Tween por mais 10 minutos. Para SVT15-3FW4M-GS3- SVT06-GS2-SVG13M5-H6, foi escolhida uma concentração de 100 nM.

[00310] O monômero SDA SVA12L e todos os 3 SDAs multiméricos foram avaliados quanto às características de ligação por afinidade à albumina humana a uma concentração de 100 nM.

[00311] Para determinar a afinidade dos 3 SDAs multiméricos (SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6, SVT06- GS3-SVT15-3FW4M-GS2-SVA12M2-H6 and SVT15-3FW4M-GS3-SVT06- GS2-SVG13M5-H6) quando se liga a albumina canina, após a otimização, uma configuração foi usada em que 1,25 micrograma/ml de SDA multimérico biotinilado (consulte o exemplo 19) foi acoplado a sensores SA. A albumina canina foi diluída em tampão PBS contendo Tween 20 a 0,02% (PBSTween) em uma série de diluição dupla de 500 nM a 16 nM. As séries de diluição de albumina foram incubadas com os respectivos sensores SDA acoplados por 4 a 5 minutos (fase de associação) seguido por uma etapa de dissociação em PBS-Tween por mais 5 a 10 minutos.

[00312] Os resultados foram, então, analisados com o uso do software ForteBio Data Analysis. As Tabelas 31a e 31b mostram os dados para os SDAs testados. Nenhum dos SDAs mono ou multiméricos se ligou à albumina humana, como esperado. Constatou-se que o SDA multimérico SVT15-3FW4M- GS3-SVT06-GS2-SVG13M5-H6 não se ligava à albumina Equina, Humana ou Canina, conforme esperado.

[00313] Para os SDAs multiméricos SVT06-GS3-SVT16- L123Q-GS2-SVA12M2-H6 e SVT06-GS3-SVT15-3FW4M-GS2-SVA12M2- H6, a constante de afinidade KD para albumina de origem equina ou canina variou entre 0,5 a 1,5 nM e 250 a 400 nM, respectivamente. Para o SDA multimérico SVT06-GS3-SVT16- L123Q-GS2-SVA12M2-H6, uma meia-vida sérica de aproximadamente 110 a 145 horas (4,5 a 6 dias) foi encontrada em suínos (consulte o exemplo 16) e uma meia- vida sérica de aproximadamente 510 horas (21,25 dias) foi encontrada em equinos (consulte o exemplo 23). Com base nos dados de afinidade, pode-se esperar uma meia-vida similar para SVT06-GS3-SVT15-3FW4M-GS2-SVA12M2-H6 em Suínos e Equinos.

22. A Afinidade de vários SDAs para TeNT conforme determinado por uma Outra Metodologia (Sistema WAVE Creoptix).

[00314] Para vários SDAs, a constante de afinidade para o TeNT alvo estava na faixa de pM, conforme determinado pelo instrumento Octet Red96. A fim de confirmar essas constatações, uma tecnologia adicional, foi usada a metodologia de Interferometria Grating-Coupled (GCI) proprietária dos sensores CreoptixTM [76]. GCI é um método baseado em interferometria de guia de ondas para monitorar e caracterizar as interações moleculares e determinar as taxas cinéticas, constantes de afinidade e concentrações dos analitos que interagem. A interferometria de guia de onda, como outros métodos sem rótulo óptico, como a ressonância de plasma de superfície (SPR), detecta mudanças no índice de refração dentro de um campo evanescente perto de uma superfície do sensor devido a mudanças na massa pela formação complexa das moléculas interagentes. A combinação de dois métodos muito sensíveis, ou seja, interferometria e detecção de guia de onda óptico planar leva a limites de detecção muito baixos.

[00315] Experimentos de afinidade (KD) de vários SDAs mono e multiméricos com TeNT como alvo foram realizados com o instrumento Creoptix WAVE (Creoptix AG, Waedenswil, Suíça), a 30 °C. Foram seguidos os protocolos do software de controle WAVE para condicionamento do chip (4PCP-S), imobilização de proteínas e realização de experimentos cinéticos. Produtos químicos padrão foram usados.

[00316] A toxina tetânica biotinilada (10 microgramas/ml) foi imobilizada no chip de estreptavidina PCH com injeção de 10 microlitros/min e duração de injeção de 120 s nos canais relevantes. Todas as experiências foram realizadas com tampão PBS contendo Tween 20 a 0,02% (PBSTween) como tampão de corrida. As características de ligação foram avaliadas para vários SDAs (mono e multiméricos) em cinco concentrações (100 a 1,2 nM, etapas de diluição de 3 vezes). A fase de associação para os SDAs avaliados foi de 4 minutos. Para SVT 03L, SVT06-GS3-SVT16- L123Q-GS2-SVA12M2-H6 e SVT15-3FW4M-GS3-SVT06-GS2-SVG13M5- H6, o período de dissociação foi de 6.000 segundos. Para SVT06-SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 e SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4- H6, a duração de dissociação foi ajustada em 1.000 e 12.000 segundos, respectivamente. Os resultados foram então analisados com o uso do software Creoptix Data Analysis para determinar a constante de afinidade (KD), os resultados são mostrados na Tabela 32.

[00317] Os resultados confirmam as constatações anteriores no que diz respeito à dissociação lenta e associação rápida de cada um dos SDAs testados. O KD dos SDAs testados variou entre 1,0 a 25 pM.

23. Análise da Meia-vida Sérica de um SDA Multimérico em Equinos.

[00318] Para SDA SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2- H6, a determinação da meia-vida sérica também foi realizada em equinos. Uma espécie-alvo relevante, uma vez que os SDAs foram gerados pelo uso de proteínas de albumina equina e canina apenas. Para esse propósito, foram usados três pôneis de 4,5 a 6,5 anos (fêmeas). Os mesmos foram pesados antes da inoculação intramuscular. Com base nos pesos corporais, foi calculada a quantidade necessária de SDA multimérico (dosagem de 0,17 mg/kg) por animal. SDA esterilizado por filtro diluído em PBS foi injetado por via intramuscular em um único local na coxa traseira em um volume de cerca de 2,5 ml. Amostras de sangue para preparação de soro foram coletadas da veia jugularis imediatamente antes e em 1, 2, 4, 7, 10, 13, 17 e 21 dias após a inoculação do SDA.

[00319] Os níveis de SDA no soro foram determinados por ELISA com o uso de holotoxina TeNT e um conjugado de mAb PO anti-tag. Para esse propósito, placas de poliestireno de 96 poços revestidas com holotoxina TeNT a 2 µg/ml em PBS dissolvido em tampão de revestimento (tampão NaHCO3 50 mM pH 9,2) de um dia para o outro a 4 °C a 100 µl/poço. Todas as incubações subsequentes foram realizadas, após a lavagem das placas com tampão ELISA (leite desnatado a 1%; Tween-20 a 0,05%; NaCl 0,5 M; KCl 2,7 mM; KH2PO4 2,8 mM ; Na2HPO4 8,1 mM; pH 7,4, 100 µl/poço), por 1 hora à temperatura ambiente. As placas revestidas com TeNT foram incubadas com séries de diluição dupla em oito poços, por coluna, começando em 1 micrograma/ml e 0,1 micrograma/ml com um padrão SDA, um soro nulo adicionado com 1 micrograma/ml SDA na coluna 3 e os nove soros coletados de um animal nas colunas 4 a 12. Os soros foram inicialmente diluídos cinco vezes e posteriormente duas vezes diluídos em oito poços. Após a lavagem, as placas revestidas com TeNT foram subsequentemente incubadas com um conjugado anti-his6 mAb-PO (1/1.000, Roche, Cat. no 11965085001). PO ligado foi, então, detectado por coloração com 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina (Surmodics; Cat. no TMBW-1000-01).

Depois de parar a reação pela adição de ácido sulfúrico 0,5 M, a absorvância a 450 nm foi medida com o uso de um espectrofotômetro. Os dados de absorvância foram avaliados com o uso de um programa de software comercial adequado.

Uma curva logística de quatro parâmetros foi ajustada para absorvância e concentrações de SDA de padrões. Essa curva foi usada para interpolar a concentração de SDA resultando em um valor de absorvância particular para cada amostra de soro em cada ELISA. As concentrações séricas calculadas de SDA foram exportadas para um modelo de planilha Excel® (Microsoft Corporation, Redmond, EUA).

[00320] A meia-vida sérica terminal foi calculada de acordo com a fórmula: SDA(t) = SDA(0)*(0,5^(t/T½ß)), em que t é o tempo em horas, em que SDA (0) é a concentração de SDA no primeiro ponto de tempo usado, para cálculo de meia-vida que é compensado pelo aumento de peso corporal, SDA(t) é a concentração de SDA no tempo t, T½ß é a meia-vida terminal.

[00321] A meia-vida sérica foi calculada a partir dos dados recuperados das amostras do dia 2 ao dia 21. A função Solver do Microsoft Excel foi usada para ajustar as concentrações de SDA contra o tempo de acordo com a fórmula acima para cada animal individual. A média e o desvio padrão de T½ß foram calculados (consulte a Tabela 3).

[00322] Os animais inoculados com o SDA SVT06-GS3- SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 de ligação à albumina bivalente e multimérico biespecífico apresentaram um T½ß médio de 510 h. Esse SDA multimérico continha o domínio SDA de ligação à albumina SVA12M2, ligado aos domínios SDA SVT06 e SVT16- L123Q em um SDA multimérico. Aos 21 dias após a administração do SDA, um nível sérico de 0,4 a 0,6 micrograma/ml foi medido para três animais, portanto, com base nos dados mostrados no exemplo 17, todos os animais teriam sido protegidos contra o tétano, estando os níveis muito acima do nível mínimo necessário (0,1 IU/ml). Como esperado, a meia-vida sérica calculada para o SDA SVT06-

GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 em equinos excede a medida e calculada para suínos.

Isso apoia os cálculos que preveem que uma meia-vida sérica longa similar pode ser esperada para os caninos.

Tabela 2. Seleção de Exibição de Fago e Ligação em ELISA de SDAs de Ligação de TeNT Produzidos por E. Coli.

Condições de seleção de exibição de Absorbância a 450 nm fago em ELISA TeNT rTTC Antígeno na primeira Antígeno na segunda Diret diret GT1b- TeNT rodada rodada ament ament e e reves Captura Concentração Concentração CDR3 TeNT tido do por inibiçã reves SDA (µg/ml) Antígeno (µg/ml) Antígeno IEPe Grupo cAb-TT2 o tido Nenhum NAa NA NA NA NA NA 1,302 0,053 0,058 0,054 Nenhum NA NA NA NA NA NA 1,257 0,056 0,059 0,054 SVT20 0,1 TeNT 1 TeNT 9,5 A 0,132 1,076 0,685 0,165 SVT34 0,1 TeNT 1 rTTC 9,4 A 0,117 1,433 0,483 0,160 SVT16 1 rTTC 1 TeNT 8,9 A 0,120 1,039 0,736 0,151 SVT25 0,1 TeNT 1 rTTC 9,2 A 0,139 1,135 0,427 0,211 SVT06 1 TeNT 0,1 TeNT 4,7 B 0,720 1,037 0,683 0,105 SVT31 1 rTTC 1 rTTC 5,0 B 0,105 1,379 1,095 0,218 SVT08 0,1 TeNT 0,1 TeNT 5,0 B 0,746 1,067 0,510 0,130 SVT15 1 TeNT 1 rTTC 7,0 C 0,190 1,026 0,680 0,099 SVT29 1 TeNT 1 TeNT 7,1 C 0,152 1,282 0,868 0,111 SVT13 0,1/1c cAb-TT2-TeNT 1/1 cAb-TT2-TeNT 7,8 D 0,196 0,762 0,165 0,128 SVT22 1 rTTC 1 TeNT 7,8 D 0,137 1,082 0,299 0,138 cAb-TT2- SVT02 1/1b 1/1 cAb-TT2-TeNT 9,5 E 1,338 0,078 0,511 0,060 TeNTd mAb TT10- mAb TT10- SVT03 1/1 d 1/1 8,7 F 1,286 0,091 0,534 0,061 TeNT TeNT SVT05 1 rTTC 0,1 TeNT 5,0 G 0,985 1,037 0,548 0,108 a NA, não aplicável b 1/1 indica que tanto o anticorpo de captura quanto TeNT foram usados em 1 µg/ml c 0,1/1 indica que o anticorpo de captura foi usado a 0,1 µg/ml e TeNT a 1 µg/ml d TeNT foi capturado com cAb-TT2 diretamente revestido ou mAb TT10. e Previsto a partir da sequência SDA madura terminando no resíduo IMGT 128 usando web.expasy.org/compute_pi/, resolução está na média.

Tabela 3. Histórico de Seleção de Exibição de Fago e Ligação em ELISA de SDAs de Ligação de IgG Produzidos por E. Coli.

Condições de seleção de exibição de fago Antígeno na Antígeno na Absorbância a 450 nm em rodada 1 rodada 2 ELISA Concen- Concen- Cobaia Equi Human Suí Porci Bovi Equi Equi Cã Nenhu tração IgG tração IgG Cão no o no no no no no o m Orige Orig SDA (µg/ml) (µg/ml) IgG IgG IgG IgG IgG IgG Fc Fab Fab m em Nenh 0,0 0,0 0,07 0,06 0,06 0,06 0,05 0,0 0,0 NAa NA NA NA 0,255 um 62 74 3 2 0 5 5 54 60 Nenh 0,0 0,0 0,07 0,08 0,07 0,06 0,05 0,0 0,0 NA NA NA NA 0,261 um 68 74 2 2 3 7 3 57 53 SVG1 Equin Equi 0,6 0,5 0,19 0,57 0,27 0,09 0,22 0,5 0,0 1 1 0,436 3 o no 93 24 5 9 2 7 2 90 51

SVG1 Equi 1,0 0,0 0,09 0,17 0,12 0,07 0,32 1,3 0,0 1 Cão 1 0,478 8 no 03 96 7 4 4 2 0 65 50 SVG1 Equin 1,0 0,3 0,14 0,43 0,45 0,07 0,47 1,2 0,0 1 1 Cão 0,681 9 o 18 09 6 5 3 9 2 23 69 SVG0 Equin 0,2 0,3 0,13 0,20 0,17 0,07 0,08 0,1 0,0 1 1 Cão 0,325 6 o 77 65 1 4 2 3 9 78 59 SVG2 1,7 0,0 0,09 0,06 0,06 0,07 0,05 0,0 0,0 1 Cão 1 Cão 0,260 3 35 73 2 8 2 2 6 61 90 SVG2 Equin 1,7 0,0 0,34 0,06 0,07 1,66 0,06 0,0 0,0 1 1 Cão 0,765 4 o 41 84 1 8 5 9 0 74 63 SVG0 Equin Equi 0,0 0,0 0,07 0,06 0,06 0,47 0,05 0,0 0,0 1 1 1,102 3 o no 70 76 5 3 1 6 7 54 51 SVG0 Equin 0,4 0,1 0,10 0,24 0,12 0,09 0,15 0,4 0,0 1 1 Cão 0,401 7 o 79 70 3 9 1 9 2 54 60 aNA, não aplicável Tabela 4. Histórico de Seleção de Exibição de Fago e Ligação em ELISA de SDAs de Ligação de Alb Produzidos por E. Coli.

Condições de seleção de exibição de fago Antígeno rodada 1 Antígeno rodada 2 Concen Concen Absorbância a 450 nm em ELISA tração Alb tração Alb SDA (µg/ml) Origem (µg/ml) Origem Equino Cão Humano Nenhum Nenhum NAa NA NA NA 0,087 0,115 0,083 0,135

Nenhum NA NA NA NA 0,064 0,081 0,057 0,080 SVA16 1 Equino 1 Cão 2,110 2,020 0,083 0,064 SVA04 1 Cão 1 Equino 2,013 1,533 0,085 0,151 SVA06 1 Equino 1 Cão 1,655 1,987 0,067 0,108 SVA12 1 Cão 1 Equino 1,999 1,775 0,057 0,058 SVA02 1 Cão 1 Cão 1,904 1,873 0,065 0,066 SVA07 1 Equino 1 Equino 1,455 0,059 0,062 0,060 a NA, não aplicável Tabela 5. Produção de Levedura de SDAs.

Rendiment Nível de Razão Razão SDA Subfam. Cepa de o Total Produ SU51/W303- Mutante/Tipo SDA (designação de mlc Levedura de SDA ção 1a Nível de Selvagem Nível acordo com [52]) (mg) (mg/l) Produção de Produção SVT02L W303-1a 1 500 0,868 1,74 ND ND SVT03L W303-1a 1 500 0,222 0,44 ND ND SVT05L W303-1a X 500 0,076 0,15 ND ND SVT06L W303-1a X 500 2,208 4,42 ND ND SVT08L W303-1a X 500 1,024 2,05 ND ND SVT13L W303-1a 3 500 1,276 2,55 ND ND SVT15L W303-1a 1 500 0,202 0,40 ND ND SVT15L W303-1a 1 50 0,016 0,32 ND ND SVT15L-3FW4M W303-1a 1 50 0,093 1,87 ND 5,2 SVT16L W303-1a 1 500 1,043 2,09 ND ND SVT20L W303-1a 1 50 0,022 0,43 ND ND SVT20L W303-1a 1 500 0,126 0,25 ND ND

SVT20L-L123Q W303-1a 1 50 0,061 1,22 ND 3,6 SVT22L W303-1a 3 500 0,310 0,62 ND ND SVT25L W303-1a 1 500 0,023 0,05 ND ND SVT29L W303-1a 1 500 0,037 0,07 ND ND SVT31L W303-1a X 500 0,177 0,35 ND ND SVT34L W303-1a 1 500 0,218 0,44 ND ND SVT34L W303-1a 1 50 0,037 0,73 ND ND SVT34L-L123Q W303-1a 1 50 0,076 1,52 ND 2,6 SVG03L W303-1a 1 50 0,015 0,29 ND ND SVG06L W303-1a C 50 0,090 1,81 ND ND SVG07L W303-1a C 50 0,007 0,15 ND ND SVG13L W303-1a C 50 0,079 1,59 ND ND SVG18L W303-1a C 50 0,015 0,30 ND ND SVG19L W303-1a C 50 0,082 1,65 ND ND SVG23L W303-1a 1 50 0,021 0,41 ND ND SVG24L W303-1a 1 50 0,049 0,99 ND ND SVA02L W303-1a 1 50 0,011 0,22 ND ND SVA04L W303-1a 1 50 0,009 0,18 ND ND SVA06L W303-1a 1 50 0,011 0,21 ND ND SVA07L W303-1a 1 50 0,141 2,82 ND ND SVA12L W303-1a 1 50 0,192 3,85 ND ND SVA16L W303-1a 1 50 0,037 0,73 ND ND SVT13L SU51 3 50 0,320 6,39 2,5 ND SVT15L SU51 1 50 0,047 0,94 2,6 ND SVT20L SU51 1 50 0,190 3,79 11,1 ND SVT34L SU51 1 50 0,397 7,93 13,6 ND

Tabela 6. Ligação ELISA de clones SVA a Diferentes Antígenos.

Albumina de diferentes espécies Camund SDA Equino Cão Suíno Gato Humano Ovino Bovino Frango Nenhum ongo Valor máximo de absorvância a 450 nm SVA16L 1,822 1,761 0,066 0,079 0,083 0,056 0,060 0,051 0,053 0,052 SVA04L 0,190 0,069 0,107 0,080 0,087 0,052 0,052 0,050 0,052 0,050 SVA06L 0,483 0,921 0,360 0,288 0,158 0,050 0,052 0,052 0,054 0,051 SVA12L 1,950 1,674 0,057 1,371 0,202 0,056 0,054 0,055 0,055 0,051 SVA02L 0,809 0,579 0,191 0,085 0,089 0,078 0,061 0,054 0,059 0,057 SVA07L 0,550 0,056 0,079 0,084 0,086 0,060 0,055 0,056 0,057 0,054 SVT06L 0,056 0,053 0,073 0,080 0,099 0,065 0,060 0,051 0,057 0,051 Sem SDA 0,074 0,086 0,097 0,085 0,060 0,124 0,104 0,069 0,068 0,065 Concentração Eficaz de SDA (ng/ml) resultando em A450 nm = 0,2a SVA16L 3,6 6,4 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 SVA04L >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 SVA06L 235 51 180 344 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 SVA12L 3,7 9,1 >1.000 21 673 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 SVA02L 149 171 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 SVA07L 238 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 SVT06L >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 Sem SDA >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 a >1000 indica que a absorvância está abaixo de 0,2 na concentração SDA mais alta analisada

Tabela 7. Ligação ELISA de Clones SVG a Diferentes Antígenos.

IgG purificado ou fragmentos de anticorpo derivados da mesma Equino Equino Equino Equino Cão Cão Cão IgG b Fab2 Fab Fc IgG Fc Fab A450 nm por EC 0,4 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 SDA Valor máximo de absorvância a 450 nm (fundo subtraído)b SVG03L 1,393 0,132 0,096 1,438 0,080 0,146 0,083 SVG06L 0,284 0,330 0,333 0,096 1,297 0,109 1,308 SVG07L 0,074 0,100 0,085 0,066 0,242 0,073 0,210 SVG13L 0,533 0,826 0,853 0,094 1,611 0,089 1,603 SVG18L 0,127 0,149 0,144 0,064 0,743 0,071 1,168 SVG19L 0,253 0,299 0,303 0,068 0,876 0,073 1,216 SVG23L 0,056 0,078 0,074 0,063 0,618 1,400 0,065 SVG24L 0,088 0,089 0,194 1,184 0,847 1,446 0,089 Concentração efetiva de SDA (ng/ml), resultando nos valores de absorbância

SDA indicadosa SVG03L 16 >1.000 >1.000 35 >1.000 >1.000 >1.000 SVG06L 237 184 184 >1.000 12 >1.000 20 SVG07L >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 441 >1.000 818 SVG13L 45 37 44 >1.000 9,7 >1.000 13 SVG18L >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 37 >1.000 29 SVG19L 212 215 305 >1.000 29 >1.000 26 SVG23L >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 252 78 >1.000 SVG24L >1.000 >1.000 >1.000 109 50 28 >1.000

IgG purificada de diferentes espécies animais Camundon Porquinho-da- Suíno Gato Humano Ovino Bovino Frango go Índia A450 nm GG IgG GG GG GG b IgG GG b IgG para EC 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 0,4 0,2 SDA Valor máximo de absorvância a 450 nm (fundo subtraído)b SVG03L 0,093 0,105 0,088 0,193 0,180 0,083 0,079 0,114 SVG06L 0,708 0,402 1,609 1,301 0,328 0,721 0,070 1,075 SVG07L 0,073 0,103 0,116 0,164 0,114 0,108 0,074 0,137 SVG13L 1,002 0,436 1,633 1,255 0,277 0,704 0,164 1,309 SVG18L 0,075 0,100 0,233 0,142 0,131 0,101 0,470 0,146 SVG19L 0,136 0,114 0,583 0,249 0,162 0,322 0,397 0,318 SVG23L 0,068 0,089 0,071 0,121 0,101 0,077 0,064 0,076 SVG24L 0,091 0,132 0,108 0,139 0,144 0,087 0,069 0,094 Concentração efetiva de SDA (ng/ml), resultando nos valores de absorbância

SDA indicadosa SVG03L >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 SVG06L 58 71 7,5 8,6 258 19 >1.000 19 SVG07L >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 SVG13L 19 54 7,8 12 391 19 >1.000 9,3 SVG18L >1.000 >1.000 683 >1.000 >1.000 >1.000 45 >1.000 SVG19L >1.000 >1.000 58 223 >1.000 127 65 126 SVG23L >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 SVG24L >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 a >1000 indica que na concentração mais alta de SDA a absorbância analisada está abaixo do valor necessário. b Para compensar o fundo elevado, o valor abs dos SDAs individuais foi subtraído com um valor de 0,2 (IgG de cavalo e GG de frango) ou 0,1 (GG de ovelha). Os valores de absorvância em que as concentrações efetivas são calculadas são aumentados com esses valores subtraídos para esses três ELISAs.

Tabela 8. Ligação de SDAs Produzidos por Leveduras Monovalentes a IgG de Oito Espécies.

A450 máximo em IgG de diferentes espécies SDA bovino gato cão cavalo humano camundongo ovelha suíno SVG13L 0,71 1,32 1,34 1,05 1,16 1,13 0,66 0,74 VI-4L 0,14 0,10 0,11 0,30 0,17 0,11 0,25 1,62 VI-8L 0,11 0,11 0,10 0,29 0,14 0,11 0,23 1,75 VI-11L 0,14 0,11 0,09 0,57 0,13 0,10 0,31 1,86 VI-14L 0,15 0,12 0,11 0,31 0,18 0,13 0,21 1,83 Nenhum 0,14 0,10 0,08 0,27 0,14 0,10 0,18 0,12 ECA450=0,3 (ng/ml) em IgG de diferentes espécies a SVG13L 49 8 7 5 14 17 145 51 VI-4L >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 10 VI-8L >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 5 VI-11L >1.000 >1.000 >1.000 226 >1.000 >1.000 980 3 VI-14L >1.000 >1.000 >1.000 875 >1.000 >1.000 >1.000 4 Nenhum >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 >1.000 a >1.000 indica que a absorvância de 0,3 não é atingida na concentração de SDA mais alta analisada.

Tabela 9. mAbs contra TeNT. TeNT Neutralização Em camundongo Western mAb Fornecedor Cat. no Bioensaio Blotting 6E7 a ThermoFisher HYB 278-17-02 Sim desconhecido 14F5 a ThermoFisher HYB 278-14-02 Sim desconhecido 6F55b US Biological T2962-33 Sim desconhecido 6F57 b US Biological T2962-35 Sim desconhecido 11n185 c US Biological T2962-01E desconhecido Sim (Lc) B417M Antibodies Online ABIN349738 Sim Sim TT10 d NIBSC 10/134 Sim Sim (Hc) a mAbs 6E7 e 14F5 ligam sítios antigênicos independentes de acordo com o fabricante b mAbs 6F55 e 6F57 ligam sítios antigênicos independentes de acordo com o fabricante c mAb 11n185 se liga à cadeia leve de TeNT de acordo com o fabricante d Referências: [48, 62].

Tabela 10. Ligação de Antígeno de Diferentes Clones de SVT e mAbs.

Nenh Antígeno: TeNT TeNT TeNTa rTTC TeNT TeNT TeNT TeNT TeNTa TeNT TeNT um cAbTT cAb- - cAbTT2 GT1b - - - cAb-TT2 - GT1b - 2 TT2 biotinilação Não Não Não Não Não Sim Sim Não Não Não Sim Sim SDA/mAb: Valor max. de absorvância (Min.para EC (ng/ml) resultando em A450 CDR3 inibição de GT1b-TeNT)b indicado SDA ou mAb Grupo 0,2 0,15 0,59 0,4 0,2

1,01 0,05 SVT16L A 1,575 0,363 0,129 1,423 0,971 1,1 3,2 47 0,52 1,6 1 9 0,96 0,05 SVT20L A 1,536 0,327 0,117 1,204 0,535 1,2 3,1 39 2,1 4,5 7 6 0,26 0,06 >1.00 SVT20L-L123Q A 0,857 0,098 0,096 1,328 0,698 4 38 1,4 2,8 5 3 0 0,93 0,05 SVT25L A 1,559 0,362 0,106 0,985 0,302 3,6 6,4 133 43 84 6 4 0,88 0,06 SVT34L A 1,537 0,335 0,103 1,293 0,669 1 3,2 46 1,7 3,5 6 7 0,55 0,05 SVT34L-L123Q A 1,011 0,178 0,137 1,209 0,518 2 5,9 34 2 3,2 9 6 0,54 0,06 SVT06L B 1,392 0,409 0,481 1,507 1,204 1,7 2,6 317 0,39 0,37 3 9 0,50 0,05 SVT08L B 1,367 0,360 0,486 1,574 1,200 2,2 3,6 411 0,4 0,52 2 4 0,48 0,05 SVT31L B 1,318 0,270 0,568 1,430 1,033 2,4 4,3 986 0,98 1,5 3 6 0,52 0,05 SVT15L C 1,337 0,477 0,140 1,401 0,825 2,8 5,7 72 2,8 5,7 8 9 0,20 0,05 SVT15L3FW4M C 0,817 0,195 0,127 1,372 0,697 3,8 9,8 39 2 3,5 6 6 0,58 0,05 SVT29L C 1,516 0,429 0,135 1,128 0,596 2,6 6,3 114 6,9 14 0 6 1,10 0,05 SVT13L D 1,544 0,487 0,126 1,484 1,056 1,9 4,1 82 0,57 1,3 5 9 0,98 0,06 SVT22L D 1,593 0,318 0,107 1,337 0,799 2 5,4 105 1,3 2,6 1 5 0,05 0,05 >1.00 >1.00 >1.00 SVT02L E 0,077 0,196 0,576 0,191 0,530 36 11 7 8 0 0 0

0,05 0,05 >1.00 >1.00 >1.00 SVT03L F 0,104 0,304 0,903 0,233 0,493 1,9 2,8 3 3 0 0 0 0,60 0,05 >1.00 SVT05L G 1,292 0,375 0,655 1,260 0,622 0,51 0,86 0,98 1,7 4 5 0 0,05 0,05 >1.00 >1.00 >1.00 >1.00 SVA12L 0,071 0,056 0,711 0,155 0,072 >1.000 7 1 0 0 0 0 0,05 0,05 >1.00 mAb B417M 1,646 1,393 0,833 0,630 0,299 3,3 <0,49 124 27 2 2 0 1,79 0,06 mAb 6E7 1,832 1,375 0,420 1,656 1,566 1,2 1 1410 1,4 1,2 4 5 0,05 0,05 >1.00 mAb 14F5 0,318 1,240 0,979 0,461 1,259 81 3,2 406 8,1 1 6 00 1,76 0,04 mAb 6F57 1,765 1,354 0,568 1,259 0,965 3,4 4,1 1590 24 18 4 9 0,04 0,05 >1.00 mAb 6F55 0,217 0,956 0,974 0,226 0,630 504 18 >100 134 8 2 0 0,04 0,04 >1.00 >1.00 mAb 11n185 1,841 0,061 0,945 0,294 0,100 2,3 >100 >1.000 8 8 0 0 a No ELISA de inibição de GT1b-TeNT, o valor máximo de absorvância na ausência de SDA é

0,999. b Para a inibição do GT1b-TeNT, os valores de absorbância do ELISA abaixo de 0,7 são considerados positivos.

Para todos os demais ELISAs, os valores de absorvância acima de 0,2 são considerados indicativos de ligação ao antígeno.

Tabela 11. Ligação ao rTTC de dois clones SVT que não se ligam diretamente ao TeNT e aos três SDAs de controle.

Absorvância a 450 nm Revestimento: TeNT 6E7 6E7 6E7 Etapa de SDA nenhuma rTTC nenhuma TeNT captura: SVA12L 0,048 0,059 0,059 0,059 SVT02L 0,062 0,062 0,067 1,189 SVT03L 0,331 0,061 0,070 1,325 SVT15L-3FW4M 0,477 0,528 0,063 0,236 SVT16L 1,269 1,377 0,063 1,131

Tabela 12. ELISAs de Agrupamento de Epítopos (Competição/Bloqueio) de SVT SDAs e mAbs Anti- TeNT.

% inibição da ligação de SDA biotinilado ou mAba SDA ou mAbb

S V

T m 0

A 2 b m

L 1

A 4 b

S

F 6 5

V F T

S 5

S

V 5 0

V 3

T

T 1

L 1 5 5

S L L -

V 3

T S F

V 0 6

W

T 4 m

L 0

M

A 8 b m

L 6

A

E b 6

S 7

F V T

S 5 7

V 1 3

T S

L 1

V 6

T L

S 2

V 2 m

T L

A 3

S b m í 4

B A

L t 4 b i 1 1 o 7 1 a

M n n 1 t 8 i g 5 ê n i c SVT02L 96 97 94 9 6 12 2 16 8 19 21 26 3 -16 -11 19 A mAb 14F5 81 78 54 28 6 16 12 22 -16 9 42 0 -28 20 35 14 A mAb 6F55 72 85 78 10 4 41 16 30 29 -24 39 17 10 12 33 27 A SVT03L 10 -8 35 97 12 10 10 10 -12 17 23 18 10 -4 0 -26 B SVT15L 6 7 -2 -5 96 96 1 15 6 4 2 5 2 10 5 0 C SVT15L-3FW4M 10 2 -4 -8 96 95 7 6 6 6 -5 3 4 3 -9 -1 C SVT06L 11 11 4 -3 14 12 96 97 67 53 7 -3 3 11 4 5 D SVT08L 7 3 1 0 6 12 95 96 66 50 5 8 6 8 0 4 D mAb 6E7 12 8 1 4 4 7 18 35 75 64 -3 -2 1 7 0 6 D mAb 6F57 4 3 -1 -3 -1 10 45 49 88 85 -4 0 7 11 1 -3 D SVT13L 7 5 1 1 -19 8 1 13 2 0 95 91 92 91 4 2 E SVT22L 4 0 -2 5 2 11 6 1 8 10 95 92 94 93 -2 3 E SVT16L 13 6 -3 -1 12 17 -8 2 6 2 96 95 96 95 -1 -2 E SVT34L 2 4 -3 0 3 14 -2 -4 10 13 93 93 94 95 -2 2 E mAb B417M -220 -23 -44 7 66 -33 11 -56 66 65 6 -56 66 -43 79 -146 - mAb 11n185 -43 -24 -17 19 18 3 5 -4 19 16 1 -14 38 -11 15 84 - a Valores acima ou iguais a 50 são indicados na cor de fundo cinza. b SDA biotinilado ou mAb está em linhas e o SDA ou mAb não marcado em colunas.

Tabela 13. Visão Geral dos Clones SVT Mais Adequados para Construção de SDA Multimérico e mAbs de Referência.

Neutralizaç Ligação Cepa de ão de TeNT Inibição de Ligação de TeNT levedura em Sítio SDA Biotinilado Grupo TeNT-GT1b Ligação em diretamen W303-1a nível bioensaio antig ou mAb CDR3 (IC50 em a rTTC b Western te de produção a de ênico ng/ml) blotd revestido de SDA Camundongo e c (mg/l)f desconhecid SVT02L E >1.000 Não - A Não 1,74 o mAb 14F5 - >10.000 Não Sim ND A Reduzido - mAb 6F55 - >10.000 Não Sim ND A Reduzido - desconhecid SVT03L F >1.000 Não - B Reduzido 0,44 o desconhecid SVT15L C 72 Sim - C Bom 0,40 o desconhecid SVT15L-3FW4M C 39 Sim - C Bom 1,87 o desconhecid SVT06Lg B 317 Sim Hc D Bom 4,42 o desconhecid SVT08Lg B 411 Sim Hc D Bom 2,05 o mAb 6E7 - 1.410 Sim Sim ND D Bom - mAb 6F57 - 1.590 Sim Sim ND D Bom - SVT13L D 82 Sim desconhecid - E Bom 2,55 o desconhecid SVT22L D 105 Sim - E Bom 0,62 o desconhecid SVT16L A 47 Sim - E Bom 2,09 o desconhecid SVT34L A 46 Sim - E Bom 0,44 o mAb B417M - >10.000 Não Sim ND - Bom - desconhecid mAb 11n185 - >10.000 Não Lcc - Bom - o a da Tabela 10. b da Tabela 10. Valor de absorvância acima de 0,2 é considerado uma ligação positiva (Sim). c De acordo com o fabricante. d Hc, cadeia pesada; Lc, cadeia leve; os traços indicam que nenhuma ligação é detectável em

Western blot; ND, não determinado. e Reduzido indica que o valor máximo de A450 é mais alto em TeNT capturado por cAb-TT2 do que em TeNT revestido diretamente (Tabela 10). f da Tabela 5, culturas de 500 ml de SDAs do tipo selvagem. g Inserção incomum de sequência VEDG após a posição de IMGT 50.

Tabela 14. Produção de SDA Multimérico em Levedura com o Uso de Transformantes do tipo MIRY.

Elui em Nível Frações de SP-seph. De produção de SDAb Plasmídeo SDA Multimérico IEPa (M NaCl) (mg/l) pRL482 SVT02-GS2-SVG06M4-H6 9,1 0,4 a 0,6 11 pRL484 SVT15-3FW4M-GS2-SVG6M4-H6 6,9 0,4 a 0,6 2,6 pRL489 SVT06-GS2-SVA12M2-H6 5,8 0,4 a 0,6 11 pRL490 SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 6,4 0,4 a 0,6 10 pRL493 SVT02-GS2-SVA12M2-H6 9,1 0,4 a 0,6 0,97 pRL494 SVT15-3FW4M-GS2-SVA12M2-H6 6,8 0,4 a 0,6 34 pRL495 SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 8,6 0,4 a 0,6 99 pRL496 SVT02-GS2-SVG13M4-H6 8,8 0,4 a 0,6 17 pRL497 SVT06-GS2-SVG13M4-H6 5,5 0,6 a 0,8 0,93 pRL498 SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 6,3 0,6 a 0,8 41 pRL499 SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 7,8 0,4 a 0,6 97 pRL501 SVT06-SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 6,0 0,4 a 0,6 0,2 a Previsto a partir da sequência de SDA multimérico maduro com o uso de web.expasy.org/cgi- bin/compute_pi/pi_tool. b O nível de produção na cepa de levedura SU50 foi calculado a partir do rendimento de SDA purificado de culturas de 0,5 l.

Tabela 15. Análise Funcional de SDAs Produzidos por Levedura Multimérica por ELISA: Valores de Absorvância.

IgG/Al IgG/Al Antígeno TeNT TeNT TeNT TeNT TeNT ba ba cAb- Capturado com GT1b TT2 Detecção Ab ou antígeno TeNT TeNT Alb L9237c biotinilado StrepP StrepP StrepP PO-Conjugado hisPO hisPO GALPO GALPO

O O O Valor máximo de absorvância (Mínimo para Plasmídeo SDA inibição de GT1b-TeNT) pSVA12L SVA12L 0,26 0,24 0,22 1,47 0,13 0,14 0,89 pRL489 SVT06-GS2-SVA12M2-H6 1,56 0,66 1,47 1,67 1,59 1,21 0,18 SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2- pRL490 1,55 1,62 1,45 1,51 1,72 1,41 0,13 SVA12M2-H6 pRL493 SVT02-GS2-SVA12M2-H6 1,29 0,18 1,10 1,91 0,10 0,09 0,66 pRL494 SVT15-3FW4M-GS2-SVA12M2-H6 1,34 0,64 1,34 1,55 1,35 1,36 0,15 pRL495 SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 1,28 0,78 1,37 1,78 1,67 1,39 0,15 pRL482 SVT02-GS2-SVG06M4-H6 1,00 0,14 NDb 0,06 0,06 0,10 0,82 pRL484 SVT15-3FW4M-GS2-SVG06M4-H6 1,30 0,29 ND 0,07 0,37 1,23 0,12 pRL496 SVT02-GS2-SVG13M4-H6 1,32 0,19 ND 0,18 0,06 0,09 0,77 pRL497 SVT06-GS2-SVG13M4-H6 1,61 0,98 ND 1,18 1,44 1,20 0,22 pRL498 SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 1,47 0,78 ND 1,00 1,51 1,16 0,13 pRL499 SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 1,50 1,12 ND 0,69 1,45 1,22 0,13 pRL501 SVT06-SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 1,69 1,73 ND 0,78 1,62 1,37 0,13 pSVG06L SVG06L 0,11 0,14 ND 0,56 0,05 0,07 0,80 pSVG13L SVG13L 0,11 0,17 ND 0,16 0,08 0,09 0,72 pSVT02L SVT02L 0,10 0,16 ND 0,06 0,06 0,08 0,77 pSVT06L SVT06L 0,12 0,35 ND 0,05 1,44 0,32 0,27 pSVT15L-3FW4M SVT15L-3FW4M 0,14 0,20 ND 0,05 0,19 0,35 0,19 pSVT16L SVT16L 0,19 0,18 ND 0,06 1,56 0,44 0,18 Sem SDA 0,09 0,15 ND 0,06 0,06 0,08 0,88 a SVA12 contendo os poços de SDAs foram revestidos com Alb de cão, para todos os outros poços de SDAs foram revestidos com IgG de cão, Alb Equino biotinilado foi usado b ND, não determinado c Soro de lhama de animal L9237 (49 dpi), diluído 1:1000 (consulte o exemplo 1)

Tabela 16. Análise Funcional de SDAs Produzidos por Levedura Multimérica por ELISA: Concentração Eficaz de SDA.

IgG/Alb IgG/Alb Antígeno a TeNT TeNT a TeNT TeNT TeNT Capturado com cAb-TT2 GT1b Anticorpo de detecção ou TeNT TeNT Albb L9237d antígeno biotinilado PO-Conjugado StrepPO StrepPO StrepPO hisPO hisPO GALPO GALPO A450 para valor de EC 0,3 0,3 0,7 0,2 0,15 0,15 0,56 Plasmídeo SDA Concentração Eficaz de SDA (ng/ml) >1.00 pSVA12L SVA12L >1.000c >1.000 >1.000 50 >1.000 >1.000 0 pRL489 SVT06-GS2-SVA12M2-H6 0,8 19 1,5 39 3,5 1,1 55 SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2- pRL490 1,5 5,4 1,8 71 3,8 1,1 49 SVA12M2-H6 >1.00 pRL493 SVT02-GS2-SVA12M2-H6 14 >1.000 11 13 >1.000 >1.000 0 pRL494 SVT15-3FW4M-GS2-SVA12M2-H6 11 33 3,9 76 8 2 78 pRL495 SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 4,3 15 2,5 34 2,9 1 45 >1.00 pRL482 SVT02-GS2-SVG06M4-H6 26,5 >1.000 NDe >1.000 >1.000 >1.000 0 pRL484 SVT15-3FW4M-GS2-SVG06M4-H6 8,3 >1.000 ND >1.000 37 4,3 131 >1.00 pRL496 SVT02-GS2-SVG13M4-H6 9,1 >1.000 ND >1.000 >1.000 >1.000 0 pRL497 SVT06-GS2-SVG13M4-H6 <0,49 9,6 ND 46 3,4 2 93 pRL498 SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 2,2 23 ND 63 4,9 2 77 pRL499 SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 2,6 13 ND 127 8 3 73 SVT06-SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4- pRL501 1,2 5,3 ND 134 11 4 35 H6 >1.00 pSVG06L SVG06L >1.000 >1.000 ND 164 >1.000 >1.000 0 >1.00 pSVG13L SVG13L >1.000 >1.000 ND >1.000 >1.000 >1.000 0 >1.00 pSVT02L SVT02L >1.000 >1.000 ND >1.000 >1.000 >1.000 0 pSVT06L SVT06L >1.000 64 ND >1.000 4,9 14 33 pSVT15L- SVT15L-3FW4M >1.000 >1.000 ND >1.000 26 6 31 3FW4M pSVT16L SVT16L >1.000 >1.000 ND >1.000 1,4 5 21 >1.00 Sem SDA >1.000 >1.000 ND >1.000 >1.000 >1.000 0 a SVA12 contendo poços de SDAs foram revestidos com Alb de cão, enquanto para todos os poços de SDAs adicionais foram revestidos com IgG de cão b Alb de cavalo biotinilado foi usado c >1000, na concentração SDA mais alta usada, a absorvância para calcular o valor de EC não é atingida d Soro de lhama de animal L9237 (49 dpi), diluído 1:1000 (consulte o exemplo 1) e ND, não determinado

Tabela 17a Análise Funcional de SDAs Multiméricos por Interferometria de Biocamada para TeNT e Albumina de Cavalo (TeNT Carregado)

2o 1o teste analit 2o sinal Ligação de TeN-TeNT Ligante 1o analito de amostra (SDA) Sinal d o de de teste Bivalente ou TeNT- Carregado (nm) amostr (nm) Ah Biespecífica a bio-Tb SVA12L 0,01 TeNT 0,02 não bio-T SVG13L 0,02 TeNT 0,03 não bio-T SVT16L 0,11 TeNT 0,01 não bio-T SVT16-GS2-SVA12M2-H6 0,19 TeNT 0,02 não bio-T SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 0,18 TeNT 0,03 não SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2- bio-T 0,32 TeNT 0,15 sim H6 bio-T M8ggsVI4q6e 0,02 TeNT 0,03 não bio-T PBSTa 0,01 TeNT 0,03 não bio-T SVA12L 0,02 Ah 0,01 não bio-T SVG13L 0,02 Ah 0,01 não bio-T SVT16L 0,11 Ah 0,01 não bio-T SVT16-GS2-SVA12M2-H6 0,19 Ah 0,17 sim bio-T SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 0,18 Ah 0,00 não SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2- bio-T 0,33 Ah 0,26 sim H6 bio-T M8ggsVI4q6ec 0,02 Ah 0,01 não bio-T PBST 0,01 Ah 0,01 não a Tampão, controle negativo. b Sinal médio após carregar TeNT era 2,05 nm c Controle negativo de SDA, SDA biespecífico [44] d Um desvio (nm) no padrão de comprimento de onda de interferência causado pela ligação do analito

Tabela 17b Análise Funcional de SDAs Multiméricos por Interferometria de Biocamada para TeNT

(Albumina Equina Carregada)

Ligant Ligação e 1o sinal de 2o analito 2o sinal de 1o analito de amostra (SDA) biespecífica Carreg tested (nm) de amostra teste (nm) de Ah-TeNT ado bio- SVA12L 0,08 TeNT 0,01 não Ahb bio-Ah SVG13L 0,01 TeNT 0,02 não bio-Ah SVT16L 0,02 TeNT 0,01 não bio-Ah SVT16-GS2-SVA12M2-H6 0,17 TeNT 0,47 sim bio-Ah SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 0,02 TeNT 0,02 não SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2- bio-Ah 0,21 TeNT 0,53 sim H6 bio-Ah M8ggsVI4q6ec 0,01 TeNT 0,02 não bio-Ah PBST 0,00 TeNT 0,02 não a Tampão, controle de fundo.

b Sinal médio após carregar albumina de cavalo foi 0,78 nm c Controle negativo de SDA, SDA biespecífico [44] d Um desvio (nm) no padrão de comprimento de onda de interferência causado pela ligação do analito

Tabela 18 Meia-vida de Soro Terminal de SDAs Multiméricos em Suínos

Região Dosagem de Ajuste de SDA de Curva T½ßc Plasmídeo SDA (mg/kg) (horas) (horas) pRL489 SVT06-GS2-SVA12M2-H6 0,2 96-504 135 ± 19 pRL490 SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 0,3 96-504 122 ± 13 pRL495 SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 0,5 96-504 111 ± 13 pRL499 SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 0,5 24-96 21b ± 3.8 pRL276 M8ggsVI-4q6ea 0,5 96-504 82 ± 4,5 .a consulte a referência [19] b Estimativa baseada na suposição de que os níveis diminuíram até o nível de detecção em uma amostra de 96 h. c Média e desvio padrão (incluindo aumento de peso corporal).

Tabela 19. SDAs Inoculados, Concentração da Solução Estoque e Proporção de Camundongos Protegidos (em%) no Final do Reste (estudo 1).

Proporção (%) de camundongos (n=4) protegidos no final do teste SDA / Referência 1a 2 4 8 16 32 64 SVT02-GS2-SVG13M4-H6 0 0 0 0 0 0 0 SVT03L 0 0 0 0 0 0 NDc SVT06-GS2-SVG13M4-H6 100 75 0 0 0 0 0 SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 100 100 0 0 25 0 0 SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 0 0 0 0 0 0 0 SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 100 100 100 100 100 100 ND b Antitoxina de referência (TE3 ) 100 100 0 0 0 0 ND a Fator de diluição, a concentração inicial na diluição 1 de todos os SDAs é 1.000 nM, exceto para o SDA3 é 100 nM. b Imunoglobulina Tetânica Humana; tem uma capacidade de neutralização da toxina do tétano de quantidade fixa (Unidades Internacionais), aqui foi usada uma solução estoque de 10 IU/ml que foi pré-diluída de 1/400 a 0,025 IU/ml. c ND= não determinado

Tabela 20. Resumo dos Pontos Finais para SDAs e Potência em

IU/mg

Concentração Fator de de SDA Potênci SDA diluição fornecendo ac final proteção IU/mg total (nM) SVT02-GS2-SVG13M4-H6 <1 -- >1.000d SVT03L <1 -- >1.000 SVT06-GS2-SVG13M4-H6 2,4 a 1,04 1.000e SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 2,8b1,21 500 SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 <1 -- >1.000 SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2- >32 3,1 > 93,1 SVA12M2-H6 aMétodo de Spearman-Kaerber usado para o cálculo (100% na diluição 1, 75% na diluição 2 e 0% na diluição 3) b geomédia de 2 (diluição número 2) e 4 (diluição número

3) c Potência de antitoxina do tétano (Unidades

Internacionais/mg) da solução estoque mestre d Sem proteção no nível de 1.000 nM e Proteção total na concentração testada

Tabela 21. Esquema dos SDAs Avaliados em Diferentes

Misturas (ou individuais) no TNT (estudo 2)

Grupo SDA 1 2 3 4 5 6 7b SVT02-GS2-SVG13M4- 31,25 31,25 H6 SVT03L 31,25 31,25 SVT06-GS2-SVG13M4- 62,5a 31,25 62,5 31,25 H6 SVT15-3FW4M-GS2- 62,5 31,25 62,5 62,5 SVG13M4-H6 SVT16-L123Q-GS2- 62,5 31,25 62,5 SVG13M4-H6 SVT06-GS3-SVT16- L123Q-GS2-SVA12M2- 6,25 6,25 H6 nM total por grupo 125 125 125 125 125 68,75 6,25 a Quantidade (nM) de cada SDA na mistura no ponto inicial b Único grupo contendo um único SDA Tabela 22a. Proporção de Camundongos Protegidos (em %) no Final do Teste de Avaliação da Mistura (estudo 2).

Total Grupo 1b 2 4 8 16 32 nMa 1 100c 125 100 100 100 100 100 2 100 125 100 100 100 100 100 3 100 125 100 100 100 100 100 4 100 125 100 100 100 100 100 5 0 0 125 0 0 0 0 6 100 68,75 100 100 100 100 100 7 100 6,25 100 100 100 100 100 referência 100 100 0 0 0 0 TE3d a Na diluição 1 b Diluição testada, as etapas de diluição dupla seguem c Quantidade total de camundongos por diluição é 4 d Prediluído para 0,025 IU/ml Tabela 22b. Resumo dos Pontos Finais para SDAs Misturados Quantidade total Concentração de Proteção a Grupo de SDA na 1a SDA(s) fornecendo essa diluição (nM) proteção total (nM) concentração 1 125 ≤ 3,91 Sim 2 125 ≤ 3,91 Sim 3 125 ≤ 3,91 Sim 4 125 ≤ 3,91 Sim 5 125 >125 Não 6 68,75 ≤ 2,15 Sim

Tabela 23. Resumo dos Pontos Finais e Potência em IU/ml para Amostras Individuais Fator Fator Diluiç Fator de Potênc de ão de Grupo SDA diluiç iaa diluiç Final Dil. ão IU/mg ão no Final total SVT06-GS3-SVT16- 743.68 7 23.240 > 6 > 32 > 1478 L123Q-GS2-SVA12M2-H6 0 a Potência de antitoxina tetânica (Unidades Internacionais/mg) Tabela 24. Proporção de camundongos (n=4) protegidos (como %) no final do teste (estudo 3).

Tot 2 16 10 Grupo al 1b 4 5 64 24 nMa 6 5 SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 1 0,2 c 0 0 0 0 0 0 SVT06-GS2-SVG13M4-H6 + 2 0,4 0 0 0 0 0 0 SVT16-L123Q-GS2-SVG13M4-H6 1 SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6 + 3 0,4 0 0 0 0 0 0 SVT15-3FW4M-GS2-SVG13M4-H6 0 1 TE-3 de referência prediluído para 0,025 7 0 000 0 IU/ml 5 0 a Na diluição 1 b Primeira diluição com concentração inicial conforme mostrado, seguem-se as etapas de diluição de quatro vezes c Quantidade total de camundongos por diluição é 4

Tabela 25. Resumo dos pontos finais e potência em IU/ml para amostras individuais Fator Diluiç Fator Fator Potênc de ão de de Grupo SDA iaa diluiç Final Dil. diluiçã IU/mg ão no Final o total SVT06-GS3-SVT16- 726.22 1.509, 1 1 1 726.222 L123Q-GS2-SVA12M2-H6 2 7 a Potência da antitoxina do tétano (Unidades Internacionais/mg) calculada na etapa de diluição de 4 vezes, resultados do estudo 3 da referência TE-3.

Tabela 26. Resumo dos pontos finais para SDAs misturados Concentração mais Proteção a SDA total (nM) na 1a baixa (nM) Grupo essa diluição fornecendo concentração proteção total 2 0,4 > 0,4 Não 3 0,4 0,4-0,1 Sim Tabela 27 Determinação de afinidade/avidez de ligação de TeNT de vários SDAs mono- e multiméricos purificados kdis R- SDA KD (M) ka (1/ Ms) (1/s) quadrado SVT02-GS2-SVG13M4-H6 9,87E-11 1,23E+06 1,21E-04 0,992 <1,0E- SVT03L 5,65E+06 <1,0E-07 0,914 12a SVT06-GS2-SVG13M4-H6 1,23E-10 6,7E+05 8,24E-05 0,998 SVT06-GS2-SVA12M2-H6 1,51E-10 5,91E+05 8,90E-05 0,992 SVT15-3FW4M-GS2- 1,58E-11 4,29E+05 6,77E-06 0,998 SVG13M4-H6 SVT06L 5,35E-10 1,17E+05 6,27E-05 0,999 SVT15L 4,13E-10 9,36E+04 3,87E-05 0,998 SVT16L 3,39E-10 9,16E+05 3,11E-04 0,996 SVT16-L123Q-GS2- 2,24E-10 8,86E+05 1,99E-04 0,998 SVA12M2-H6 SVT16-L123Q-GS2- 2,27E-10 6,65E+05 1,84E-04 0,999 SVG13M4-H6

SVT06-GS3-SVT02-GS2- 1,30E-10 3,29E+05 4,27E-05 0,998 SVG06M4-H6b SVT06-GS3-SVT15- <1,0E- 6,91E+04 <1,0E-07 0,997 3FW4M-GS2-SVG06M4-H6b 12a SVT06-GS3-SVT16- 1,33E-11 9,89E+05 1,32E-05 0,998 L123Q-GS2-SVA12M2-H6b a KD não foi calculado devido ao fato de que o SDA não se dissociou da toxina do tétano no decurso de tempo estudado.

No caso do valor kdis, o valor 1,0E-07 é escolhido para ambos os SDAs, o valor KD para SVT03L é estimado em 1,77E- 14 e para SVT06-GS3-SVT15-3FW4M-GS2-SVG06M4-H6 seria 1,45E- 12 . b Bivalente para TeNT, portanto, medição de avidez

Tabela 28 Dados de Afinidade para SDAs Purificados Contra

Alb (Equino, Porcino, Canino e Felino)

Espécie de ka kdis R SDA KD (M) albumina (1/Ms) (1/s) quadrado 1,59E- SVA12L Suína 1,50E+05 2,38E-02 0,990 07 SVA06L Suína SVA16L Suína 1,07E- SVA12L Equina 1,01E+05 1,09E-03 0,999 08 1,35E- SVA06L Equina 7,26E+05 9,77E-03 0,971 08 1,06E- SVA16L Equina 2,29E+05 2,42E-03 0,999 08 2,71E- SVA12L Canina 4,59E+04 1,25E-02 0,990 07 3,16E- SVA06L Canina 7,11E+05 2,24E-03 0,998 09 1,11E- SVA16L Canina 4,35E+05 4,83E-03 0,997 08 1,90E- SVA12L Felina 3,88E+04 7,37E-04 0,999 08 1,20E- SVA06L Felina 7,29E+05 8,78E-04 0,996 09 1,95E- SVA16L Felina 1,47E+05 2,87E-04 0,976 09

Tabela 29 Determinação de Afinidade/Avidez de Ligação de

TeNT de Vários SDAs Purificados Mono e Multiméricos.

Concentraçã Concentraçã o de SDA o (nM) de R- carregament k (1/ kdis (Ligante analito KD (M) a quadrad o de Ms) (1/s) ) (TeNT) o ligante (µg/ml) 2,24E 5,03E+0 1,13E SVT06L 0,6 0,94-15 1 -10 5 -04 7,72E 1,11E+0 8,57E SVT15L 0,3 2,5-20 0,998 -10 5 -05 SVT06- GS3- SVT16- 1,10E 3,98E+0 4,39E L123Q- 0,3 2,5-20 0,999 -11 5 -06 GS2- SVA12M2- H6a 4,31E 4,91E+0 2,12E cAb-TT1 0,6 25-400 0,951 -08 4 -03 6,01E 8,41E+0 5,05E cAb-TT2 0,3 0,75-12 0,998 -09 5 -03 a Bivalente para TeNT, portanto, medição de avidez Tabela 30 Determinação de Afinidade/Avidez de Ligação de TeNT de 3 SDAs Multiméricos.

Concentração SDA (µg/ml) de Concentração R- KD ka (1/ kdis (Analito carregamento de analito quadr (M) Ms) (1/s) ) de ligante (SDA) (nM) ado (TeNT) SVT06- GS3- SVT16- <1,0E 5,38E+0 <3,18E L123Q- 4 0,63 a 10 0,999 -12 5 -07 GS2- SVA12M2- H6b

SVT06- GS3- SVT15- < <1,0E 9,40E+0 3FW4M- 4 0,63 a 10 3,2E- 0,999 -12a 5 GS2- 07 SVA12M2- H6b SVT15- 3FW4M- GS3- < <1,0E 4,84E+0 SVT06- 4 0,63 a 10 1,99E- 0,999 -12a 5 GS2- 07 SVG13M5- H6b a KD não foi calculado devido ao fato de que o SDA não se dissociou da toxina do tétano no decurso de tempo estudado. . Se para SVT06-GS3-SVT16-L123Q-GS2-SVA12M2-H6, SVT06-GS3- SVT15-3FW4M-GS2-SVA12M2-H6 e SVT15-3FW4M-GS3-SVT06-GS2- SVG13M5 para o valor de kdis, o valor 3,18E-07, 3.2E-07 e

1.99E-07 é escolhido, respectivamente, os valores de KD seriam 5,91E-13, 3,4E-13 e 4,1E-13, respectivamente. b Bivalente para TeNT, portanto, medição de avidez Tabela 31a A Afinidade de Ligação de SDAs Multiméricos para Albumina Sérica Equina ou Humana Concentraç ão de Espéci Concentraç SDA carregamen R- e de ão de KD ka (1/ kdis (Analit to de quadra Albumi analito (M) Ms) (1/s) o) ligante do na SDA) (nM) (Alb) (µg/ml) SVT06- GS3- SVT16- 6,46E 2,16E+ 1,39E L123Q- Equina 2,5 0,63 – 10 1 -10 05 -04 GS2- SVA12M2 -H6

SVT06- GS3- SVT15- 1,34E 1,1E+0 1,51E 3FW4M- Equina 2,5 0,63 – 10 1 -09 5 -04 GS2- SVA12M2 -H6 SVT15- 3FW4M- GS3- Sem SVT06- Equina 2,5 100 Sinal GS2- SVG13M5 -H6a Sem SVA12L Humana 5 100 Sinal SVT06- GS3- SVT16- Sem L123Q- Humana 5 100 Sinal GS2- SVA12M2 -H6 SVT06- GS3- SVT15- Sem 3FW4M- Humana 5 100 Sinal GS2- SVA12M2 -H6 SVT15- 3FW4M- GS3- Sem SVT06- Humana 5 100 Sinal GS2- SVG13M5 -H6a a SVG13M5 se liga a, por exemplo, fragmento Fab de IgG humana ou equina

Tabela 31b A Afinidade de Ligação de SDAs Multiméricos a

Albumina Sérica Canina de Soro concen tração Conce Espé de ntraç cies carreg ão de ka kdis R- de amento K SDA (Ligante) Anali D (1/ (1/s quad Albu de (M) to Ms) ) rado mina Ligant (Alb) e (nM) (SDA)( µg/ml) SVT06-GS3-SVT16- Cani 16- 2,68E 2,3E+ 6,20 0,99 1,25 L123Q-GS2-SVA12M2-H6 na 500 -07 04 E-03 8 SVT06-GS3-SVT15- Cani 16- 3,75E 1,6E+ 6,16 0,99 1,25 3FW4M-GS2-SVA12M2-H6 na 500 -07 04 E-03 8 SVT15-3FW4M-GS3- Cani 16- Sem 1,25 SVT06-GS2-SVG13M5-H6a na 500 Sinal a SVG13M5 se liga a, por exemplo, fragmento Fab de IgG

Canina

Tabela 32 Afinidade/Avidez de Ligação de TeNT de SDAs

Multiméricos quando Avaliados com o Sistema WAVE CreoptixTM

Ligan te Flux Analit (TeNT o de o R- k ) anal (SDA) KD ka (1/ dis max SDA (analito) (1/s captu ito Concen (M) Ms) (pg/m ) rado (µl/ tração m2 ) (pg/m min) (nM) m2 ) 1,2 a 1,4E- 4,62E 6,64 SVT03L 252,7 54 14,5 100 12 +06 E-06 SVT15-3FW4M-GS2- 1,2 a 20,9E 3,90E 8,15 216,6 60 30,4 SVG13M4-H6 100 -12 05 E-06 SVT06-SVT16-L123Q- 1,2 a 15,9 4,17E 6,61 181,1 60 37,5 GS2-SVG13M5-H6a,b 100 E-12 +05 E-06 SVT06-GS3-SVT16- 1,2 a 8,86 1,14E 1,01 L123Q-GS2-SVA12M2- 239,6 54 44,7 100 E-12 +06 E-05 H6a

SVT15-3FW4M-GS3- 1,2 a 22,9 1,19E 2,73 SVT06-GS2-SVG13M5- 176,5 60 27,6 100 E-12 +06 E-05 H6a a Bivalente para TeNT, portanto, medição de avidez b Bivalente, com dois SDAs de SVT fundidos sem ligante intermediários Tabela 33 Meia-vida de Soro Terminal de SVT06-GS3-SVT16- L123Q-GS2-SVA12M2-H6 (pRL490) em Equinos (dose i.m. 0,17 mg/kg) Concentração medida (miligrama/litro) Regi Tempo ão (hora 0 24 48 96 168 240 312 408 504 de s) Ajus T½ßa Anim te (hora al De Tempo s) no curv (dias 0 1 2 4 7 10 13 17 21 a ) (dia s) <0,0 1,0 1,1 0,9 0,8 0,8 0,7 0,6 0,6 2 9 14 64 97 07 06 33 61 05 <0,1 0,5 0,7 0,6 0,4 0,5 0,4 0,4 0,3 510±1 5 2-21 0 19 36 64 83 49 88 86 95 07 <0,0 1,0 1,3 1,2 1,0 1,0 0,7 0,7 0,5 6 9 8 2 1 4 1 95 08 93 a Média e desvio padrão.

Tabela 34. Produção de SDA Multimérico em Levedura com o Uso de Transformantes do tipo MIRY.

Elui em Nível Frações De de SP- produçã seph. o de SDAb Plasmí (M SDA Multimérico IEPa (mg/l) deo NaCl)

SVT06-GS3-SVT15-3FW4M-GS2- 0,4 a pRL505 5,94 3,2 SVA12M2-H6 0,6 SVT15-3FW4M-GS3-SVT06-GS2- 0,4 a pRL506 5,80 4,8 SVG13M5-H6 0,6 a Previsto a partir da sequência de SDA multimérico maduro com o uso de web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool. b O nível de produção na cepa de levedura SU50 foi calculado a partir do rendimento de SDA purificado de culturas de 0,5 l.

Tabela 35 Afinidade de Vários SDAs para IgG Equina e Canina espécies de R^2 SDA KD (M) ka (1/Ms) kdis (1/s) IgG (Fc) Total SVG03L a Fc de Cavalo 4,30 E-10 1,14 E+06 4,91 E-04 0,987 sem SVG23La Fc de Cavalo afinidade SVG24L a Fc de Cavalo 3,45 E-09 1,02 E+05 3,53 E-04 0,996 sem SVG03L Fc de cão afinidade SVG23L Fc de cão 2,15 E-10 2,43E+06 5,21E-04 0,991 SVG24L Fc de cão 2,22 E-09 1,55E+05 3,44E-04 0,992 a SDA que se liga a fragmento Fc Referências

[1] Hamers-Casterman C et a. Nature. 1993;363:446-8.

[2] Harmsen MM et al. Vet Microbiol. 2007;120:193-206.

[3] Harmsen MM et al. J Immunoassay Immunochem.

2012;33:234-51.

[4] Rossetto O et al. Tetanus neurotoxin. Toxicon.

2013;66:59-63.

[5] Herreros J et al. Biochem J. 2000;347 Pt 1:199-

204.

[6] Fitzsimmons SP et al. Vaccine. 2000;19:114-21.

[7] Yousefi M et al. Human vaccines & immunotherapeutics. 2014;10:344-51.

[8] Scott N et al. Mol Immunol. 2010;47:1931-41.

[9] Sagt CM et al. Appl Environ Microbiol.

2000;66:4940-4.

[10] Liu L. J Pharm Sci. 2015;104:1866-84.

[11] Gorlani A et al. Protein Eng Des Sel. 2012;25:39-

46.

[12] Liu JL et al. Microbial cell factories.

2015;14:158.

[13] Goldman ER et al. Protein Expr Purif.

2014;95:226-32.

[14] Van de Laar T et al. Biotechnol Bioeng.

2007;96:483-94.

[15] Batra SK et al. Curr Opin Biotechnol.

2002;13:603-8.

[16] Iznaga-Escobar N et al. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 2004;26:123-7.

[17] Kontermann RE. Curr Opin Biotechnol. 2011;22:868-

76.

[18] Klooster R et al. J Immunol Methods. 2007;324:1-

12.

[19] Harmsen MM et al. Vaccine. 2005;23:4926-34.

[20] Coppieters K et al. Arthritis Rheum.

2006;54:1856-66.

[21] Holliger P et al. Nat Biotechnol. 1997;15:632-6.

[22] Holt LJ et al. Protein Eng Des Sel. 2008;21:283-

8.

[23] Hutt M et al. J Biol Chem. 2012;287:4462-9.

[24] Rossotti MA et al. mAbs. 2015;7:820-8.

[25] Walker A et al. Protein Eng Des Sel. 2010;23:271-

8.

[26] Terryn S et al. PLoS ONE. 2014;9:e109367.

[27] Huston JS et al. Proc Natl Acad Sci.

1988;85:5879-83.

[28] Mukherjee J et al. PLoS ONE. 2012;7:e29941.

[29] Sepulveda J et al. Infect Immun. 2010;78:756-63.

[30] Vance DJ et al. J Biol Chem. 2013;288:36538-47.

[31] Klein JS et al. Protein Eng Des Sel. 2014;27:325-

30.

[32] Trinh R et al. Mol Immunol. 2004;40:717-22.

[33] Beirnaert E. Improved nanobodies™ against tumor necrosis factor-alpha. 2006.

[34] WO2011064382

[35] Conrath KE et al. J Biol Chem. 2001;276:7346-50.

[36] Hopp J et al. Protein Eng Des Sel. 2010;23:827-

34.

[37] Jacobs SA et al. Protein Eng Des Sel.

2015;28:385-93.

[38] Fridy PC et al. Nat Methods. 2014;11:1253-60.

[39] Chaudhury C et al. J Exp Med. 2003;197:315-22.

[40] Nagel J et al. J Immunol. 1973;110:1388-95.

[41] Mizuguchi J et al. Naturwissenschaften.

1982;69:597-8.

[42] Volk WA et al. Infect Immun. 1984;45:604-9.

[43] Harmsen MM et al. Appl Microbiol Biotechnol.

2009;84:1087-94.

[44] Harmsen MM et al. Vet Microbiol. 2008;132:56-64.

[45] Frenken LGJ et al. J Biotechnol. 2000;78:11-21.

[46] Arbabi-Ghahroudi M et al. FEBS Lett.

1997;414:521-6.

[47] Xing DK et al. Biologicals. 1996;24:57-65.

[48] Coombes L et al. Biologicals. 2012;40:466-72.

[49] McCafferty J, Johnson KS. Em: Phage display of peptides and proteins. 1996. p. 79-111.

[50] Lou J et al. J Immunol Methods. 2001;253:233-42.

[51] Lefranc MP, Methods Mol Biol. 2004;248:27-49.

[52] Harmsen MM et al. Mol Immunol. 2000;37:579-90.

[53] Butler JE. Methods. 2000;22:4-23.

[54] Arbabi-Ghahroudi M et al. Protein engineering, design & selection : PEDS. 2009;22:59-66.

[55] de Wildt RM et al. J Mol Biol. 1999;294:701-10.

[56] Desmyter A et al. J Biol Chem. 2001;276:26285-90.

[57] Deschacht N et al. J Immunol. 2010;184:5696-704.

[58] Van der Vaart JM em Methods Mol Biol. Totowa, NJ: Humana Press; 2002. p. 359-66.

[59] Harmsen MM et al. Appl Microbiol Biotechnol.

1996;46:365-70.

[60] Harmsen MM et al. Appl Microbiol Biotechnol.

2002;60:449-54.

[61] Harmsen MM et al. Appl Microbiol Biotechnol.

2007;77:13-22.

[62] Sheppard AJ et al. Infect Immun. 1984;43:710-4.

[63] Emsley P et al. J Biol Chem. 2000;275:8889-94.

[64] Fotinou C et al. J Biol Chem. 2001;276:32274-81.

[65] Chen C, Baldwin MR, Barbieri JT. Biochemistry.

2008;47:7179-86.

[66] Chen C, Fu Z, Kim JJ, Barbieri JT, Baldwin MR. J Biol Chem. 2009;284:26569-77.

[67] Wang H, Yu R, Fang T, Yu T, Chi X, Zhang X, et al. Toxins. 2016;8.

[68] Kenimer JG et al. Infect Immun. 1983;42:942-8.

[69] Harmsen MM et al. Vet Microbiol. 2005;111:89-98.

[70] Giuseppin ML et al. Appl Environ Microbiol.

1993;59:52-9.

[71] Becker DM, Guarente L. Methods Enzymol.

1991;194:182-7.

[72] Harmsen MM et al. Vaccine. 2011;29:2682-90.

[73] Van Oers JW, Tilders FJ. Endocrinology.

1991;128:496-503.

[74] Verheesen & Laeremans. Methods Mol Biol 2012; 911: 81-104.

[75] Gorlani A et al. Methods Mol Biol. 2012;911:277- 86

[76] Kozma, F. et al. Biosensors and Bioelectronics 2014 , 58:287–307.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo de domínio único (SDA) com capacidade de se ligar à neurotoxina do tétano (TeNT) caracterizado pelo fato de que o SDA tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 17, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

2. SDA, de acordo com a reivindicação 1, em que o SDA é caracterizado pelo fato de que tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou preferencialmente 100% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 17, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

3. SDA, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as sequências de amionoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 são pelo menos 76 ou preferencialmente 100%.

4. Construto polipeptídico caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um SDA com capacidade de se ligar a TeNT, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e pelo menos um SDA com capacidade de se ligar a uma proteína do soro.

5. Construto polipeptídico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteína do soro é albumina sérica ou uma imunoglobulina.

6. Construto polipeptídico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o SDA com capacidade de se ligar à albumina sérica tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 40, 37, 38, 39, 41 e 42 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

7. Construto polipeptídico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a imunoglobulina é imunoglobulina G (IgG).

8. Construto polipeptídico, de acordo com a reivindicação 5 ou 7, caracterizado pelo fato de que o SDA com capacidade de se ligar à imunoglobulina tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 30, 27, 28, 29, 31, 32, 33 e 34 com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

9. Construto polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, em que o construto polipeptídico é caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos dois SDAs com capacidade de se ligar a TeNT, em que cada um dos pelo menos dois SDAs com capacidade de se ligar a TeNT tem uma identidade de sequência de aminoácidos geral de pelo menos 70% com uma sequência selecionada da seleção A; SEQ ID NO: 24, ou seleção B; SEQ ID NO: 25, ou seleção C; SEQ ID NO: 20, ou seleção D; SEQ ID NO: 17 ou 19 ou seleção E; SEQ ID NO: 22, 15, 23 ou 14, com a condição de que os pelo menos dois SDAs não compreendam uma sequência da mesma seleção e com a condição de que as identidades de sequência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 sejam de pelo menos 75%.

10. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um SDA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e/ou pelo menos um construto polipeptídico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 9, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a composição compreende pelo menos dois SDAs com capacidade de se ligar a TeNT, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e/ou pelo menos um construto polipeptídico, conforme definidos na reivindicação 9.

12. SDA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou construto polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado pelo fato de que é para uso como medicamento.

13. SDA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, um construto polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que é para uso na prevenção ou tratamento de doença/sintomas de Clostridium tetani.

14. Fragmento de DNA caracterizado pelo fato de que codifica um SDA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou um construto polipeptídico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 9.

15. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento de DNA, conforme definido na reivindicação 14, em que o fragmento de DNA, conforme definido na reivindicação 14, está operacionalmente ligado a um promotor e opcionalmente a outros elementos reguladores.

16. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 15.

17. Método para a produção de um SDA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de um construto polipeptídico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 9, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de a) cultivar uma célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 16, sob condições que permitem a expressão do SDA ou construto polipeptídico; e opcionalmente b) recuperar o SDA ou construto polipeptídico de pelo menos um dentre as células hospedeiras e o meio de cultura.

18. Kit de diagnóstico caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um SDA com capacidade de se ligar a TeNT, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.