JP2021516682A - 破傷風神経毒素に結合する単一ドメイン抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、破傷風神経毒素に結合する能力を有する単一ドメイン抗体（ＳＤＡ）に関する。本発明は、そのようなＳＤＡ、並びに血清タンパク質、好ましくは血清アルブミン又は免疫グロブリンに結合する能力を有するＳＤＡを含むポリペプチドコンストラクトにさらに関する。また、本発明は、そのようなＳＤＡ又はポリペプチドコンストラクトをコードする核酸、そのようなＳＤＡ又はポリペプチドコンストラクトを含む医薬組成物、その医学的使用、及び破傷風を処置する際のその使用とも関連する。【選択図】なし

Description

本発明は、破傷風神経毒素に結合する能力を有する単一ドメイン抗体（ＳＤＡ）、そのようなＳＤＡを含むポリペプチドコンストラクト、そのようなＳＤＡ及び／又はポリペプチドコンストラクトを含む組成物、並びにそのようなＳＤＡ及び／又はポリペプチドコンストラクトをコードするＤＮＡ断片に特に関する。さらに、本発明は、そのようなＤＮＡ断片を含む宿主細胞、そのようなＳＤＡ及び／又はポリペプチドコンストラクトを製造するための方法、並びに破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）感染後に疾患を処置又は予防する際の、そのようなＳＤＡ及び／又はポリペプチドコンストラクト及び／又は組成物の使用に関する。
破傷風は、バクテリアの破傷風菌により引き起こされる疾患であり、約３０００年前にエジプトにおいて最初に記載された。
破傷風毒血症は、特定の神経毒；バクテリアの破傷風菌により産生される破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）により引き起こされる。ヒトを含むほとんどすべての哺乳動物は易罹患性である。ヒト、ウマ、及び仔ヒツジは、すべての種のなかで最も感受性が高い部類である。イヌ及びネコは、比較的抵抗性を有する。破傷風は全世界で見出されるが、しかし土壌内破傷風菌発生率、並びに人、ウマ、及び仔ヒツジにおける破傷風罹病率は、様々な大陸の温暖な部分においてより高い。ほとんどの場合、バクテリアの破傷風菌は創傷を通じて組織内に導入される。破傷風は、嫌気性バクテリアの増殖が促進される深い貫通性の創傷に一般的に起因する。しかしながら、仔ヒツジでは、時にその他の種でも、破傷風は、断尾又は去勢にも起因し得る。
破傷風神経毒素は、小胞関連膜タンパク質のシナプトブレビンを切断する亜鉛結合型プロテアーゼである。このタンパク質が切断されると、神経伝達物質の放出阻害が引き起こされる。毒素は、感染エリア内の運動神経により吸収され、そして神経索から脊髄に向かって逆行性に移動し、そこで上行性破傷風を引き起こす。
ＴｅＮＴは、１５０ｋＤａの単一ポリペプチド鎖として合成される。このポリペプチドは、ジスルフィド結合により互いに保持され活性な毒素を形成する１００ｋＤａの重鎖（Ｈ）及び５０ｋＤａの軽鎖（Ｌ）に切断される。パパインを用いてホロ毒素を消化すると、ＴｅＮＴ軽鎖、及びＴｅＮＴ重鎖のアミノ末端側の半分（ＨＮ）から構成される断片Ｂ、並びに重鎖のカルボキシ末端側の半分を含有する断片Ｃ（ＨＣ又はＴＴＣ）をもたらす。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＨＣは、ガングリオシドを通じてニューロンとの結合に関与する一方、ＨＮ断片は、内在化及び膜移行において役割を演じていることが示唆された。
潜伏期間（感染から最初の症状までの時間）は、破傷風菌のイノキュレーション後、短くて２４時間、長くて何カ月であり得る。この間隔は、毒素が神経系内を移動しなければならない距離を反映し、また放出された毒素の量と関連し得る。発症期間は、最初の症状と痙性麻痺の開始との間の時間である。潜伏期間は、通常平均１０〜１４日間である。咀嚼筋及び頸部の筋肉、後肢、並びに感染した創傷の領域を含め、局所的硬直が、多くの場合最初に認められる；全身的な硬直が約１日後に顕著となり、そして強直性痙攣及び知覚過敏が明白となる。破傷風毒素に対するその比較的高い抵抗性から、イヌ及びネコは、長い潜伏期間を多くの場合有し、また局所的な破傷風を頻繁に発症する；しかしながら、これらの種では全身性の破傷風も確かに発症する。破傷風神経毒素（及び関連するボツリヌス神経毒素）の網羅的記載が、ＢＯＴＵＬＩＮＵＭ ＡＮＤ ＴＥＴＡＮＵＳ ＮＥＵＲＯＴＯＸＩＮＳ、ＩＳＢＮ ９７８−１−４７５７−９５４４−８、（Ｃ）１９９３ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出され得る。当初はＰｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋより１９９３年に公表された。破傷風、その原因及び効果に関係するレビュー、並びに処置方法は、例えば、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６９：２９２〜３０１（２０００）のＦａｒｒａｒ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．に見出すことができる。
ポリクロナールのヒト、又は例えばウマ破傷風抗毒素を用いて受動免疫を行えば、破傷風の進行過程が短縮し、また重症度を軽減させ得る。ウマ抗血清（Ｆａｂ）は、免疫化されたウマから収集された血清のプール品から調製され、またヒトでは、１２〜２０時間の半減期を有する（Ｆｌａｎａｇａｎ ＲＪ，Ｊｏｎｅｓ ＡＬ．Ｄｒｕｇ Ｓａｆ．２００４；２７（１４）：１１１５〜３３）。ウマ（又はウシ）の形態は、発展途上世界全体を通じて使用されており、アナフィラキシー反応を偶発的に引き起こすが、しかしその製造は、ヒトドナー血清よりもはるかに安価且つ容易である。
破傷風疾患の処置は、抗生物質又はメトロニダゾールの投与、感染部位の処置（例えば、フラッシング、ドレイニング、及び郭清）、抗毒素投与及び支持療法（例えば、骨格筋弛緩薬、鎮静剤、水分補給等）から構成される。能動免疫されたヒツジ又はウマから得られた免疫グロブリン（例えば、精製及び断片化された）を含有する調製物を用いた受動免疫は、免疫化されていない動物及びヒトに有効な保護を提供する。破傷風抗毒素（例えば、ＳＤＡ又は免疫血清の形態）は、少なくとも３つの異なるシナリオにおいて、つまり術前の標準的な手技の一環として、受傷しているがしかしまだ罹患していない動物において、及び第三に動物が破傷風に罹患しているときの治療シナリオにおいて、使用可能である。予防上又は治療上の処置に応じて、使用される抗毒素の用量に差異が存在するが、治療的には、種に応じて２〜２０倍高い用量である。破傷風の場合、毎日の処置が必要となり得る。
今日まで、例えば、ウマ及びヒト志願者を対象に提案された抗血清の投与は、急性破傷風疾患に対する処置のみである。原理的には、可能な代替法が、精製された抗体、及びその工学的に操作されたバリアント、例えば抗原結合断片（Ｆａｂ）及び単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）等により提供可能であった。動物及びヒトドナーを避けつつ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された破傷風抗毒素ＳＤＡは、ヒト又は獣医学用医薬品としていまだ市販されていない。抗破傷風毒素の単鎖可変断片の例は、Ｎａｔｈａｎ Ｓｃｏｔｔらにより、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４７：１９３１〜１９４１（２０１０）において記載されている。
しかしながら、有用であるものの、一般的な抗体及びその工学的に操作されたバリアントであるＦａｂ及びｓｃＦｖはいくつかの制限を有する。そのような制限の例として、低溶解度、低安定性、及び高コスト、及び動物利用が挙げられる（Ｄｏｓｈｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ４：６７６０ ＤＯＩ；１０．１０３０／ｓｒｅｐ０６７６０）。そのような通常抗体及びその断片は、比較的高い分子量を有する：通常抗体の平均ＭＷは、約１６０ｋＤａであり、Ｆａｂは６５ｋＤａのＭＷを有し、比較的小型のｓｃＦｖでさえも２８ｋＤａのＭＷを有する。
この上に、製造フィージビリティーに乏しいという問題が存在する：より大きなタンパク質の製造は、時に解決が困難であり、またいずれにせよ費用がかかる。
ラクダ類及びサメのいくつかの種において天然に見出されるホモ二量体の重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）の単量体高頻度可変性抗原結合領域は、一般的な抗体及びその工学的に操作されたバリアントであるＦａｂ及びｓｃＦｖの欠点の多くを欠いている。明確化するために、軽鎖を本来欠損している重鎖分子に由来するこの可変ドメインは、それを４本の鎖からなる免疫グロブリンの従来型のＶＨと区別するために、ラクダ類に由来するときＶＨＨとも呼ばれ、またサメに由来するときＶＮＡＲとも呼ばれる。便宜上、抗ＴｅＮＴ ＶＨＨは、単一ドメイン抗体（ＳＤＡ）と、本明細書ではさらに呼ばれる。
軽鎖を欠損している重鎖抗体、及び単離されたその抗原結合断片の構造、組成物、調製物、及び使用に関係する初期の特許ファミリーは、欧州特許第０６５６９４６号を含む特許ファミリーである。そのような単一ドメイン分子は、とりわけＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６〜４４８（１９９３）によりやはり記載されている。単一ドメイン分子は、ラクダ科の種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコに由来し得る。通常抗体及びその断片と比較して、ＳＤＡの分子サイズは最小である（約１５ｋＤａ）。ＳＤＡは、非常に強固で、変性／熱的分解に対して極めて抵抗性でもあり、高い水性溶解度を有し、そして一般的に、標準的な微生物発現系を使用して高度且つ機能的に発現される。さらに、ＳＤＡは、優れた体内分布及び組織穿通も有する。これは、臨床で使用するのに魅力的なものにしている。
破傷風トキソイドに結合する能力を有するＳＤＡの例は、Ａｒｂａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ（Ｍ．Ａｒｂａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ａ．Ｄｅｓｍｙｔｅｒ，Ｌ．Ｗｙｎｓ，Ｒ．Ｈａｍｅｒｓ，Ｓ．Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｃａｍｅｌ ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１４（１９９７）５２１−５２６）に記載されている。国際公開第９６／３４１０３号は、破傷風トキソイドに結合する能力を有するＳＤＡについて開示する。マウス試験は、ＳＤＡを低毒素用量で投与すれば、２〜４日間後に、処置されたマウスの約４０〜５０％の生存を可能にしたことを示す。これらの結果は、Ａｒｂａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ（１９９７）、４１４、５２１〜５２６においてやはり報告されている。Ｒｏｓｓｏｔｔｉら（ＭＡＢＳ、ＤＯＩ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１５．１０６８４９１）は、破傷風毒素に結合するＳＤＡについて記載する。
クロストリジウム菌神経毒について認められた固有の問題は、その極めて高い毒性である。ＴｅＮＴは、ヒトでは０．１〜２．５ｎｇ／ｋｇほどに低濃度であってもすでに、またその他の動物では０．１〜５ｎｇ／ｋｇほどに低濃度であっても、すでに毒性である。ウマでは、致死量は、例えば０．１〜０．３ｎｇ／ｋｇである。これは、破傷風菌による感染が一旦生じてしまったら、ＴｅＮＴに結合する能力を有する高親和性抗体、及びその後のニューロンにおける取り込みの阻止のみが、破傷風の致命的症状を抑制する又は回避さえするレベルまで、フリーのＴｅＮＴのレベルを低下させることができることを意味する。
生体分子の相互作用の直接測定が、生物学的治療用薬物の発見及び開発において重要な役割を演じている。生体分子複合体の形成速度及び複合体の安定性に関する正確な情報は、薬物−標的相互作用の重要なコンポーネントである。相互作用の親和性は、生物製剤が有効である用量に直接影響を及ぼす。抗体の抗原に対する親和性は、任意の適する方法を使用して実験的に決定可能であり、例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．、”Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；及びＬａｄ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ２０１５，Ｖｏｌ．２０（４）４９８〜５０７、Ｙａｎｇ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．、ｄｏｉ：１０．３７９１／５５６５９）に記載の方法を参照されたい。特定の抗体−標的タンパク質相互作用において、その測定される親和性は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合には変動し得る。従って、親和性又は多量体のＳＤＡの場合のアビディティー（例えば、ＫＤ，ｋａ，ｋｄｉｓ）の測定は、標準化された抗体及び抗原の溶液、並びに標準化されたバッファーを用いてなされることが好ましい。
しかしながら、今日まで、抗ＴｅＮＴ ＳＤＡが有するＫＤは、１〜１０ｎＭを上回り又は３５ｎＭさえも上回り、これは親和性が低いことを示す。これは、とりわけＲｏｓｓｏｔｔｉら（２０１５、ｍＡｂｓ、７：５、８２０〜８２８、ＤＯＩ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１５．１０６８４９１）、及び上記参照のＡｒｂａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉに認めることができる。
１つの態様では、本発明は、破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）に結合する能力を有する単一ドメイン抗体（ＳＤＡ）であって、配列番号１７、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％であるＳＤＡに関する。
好ましい実施形態では、ＳＤＡは、配列番号１７、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６からなる群から選択される配列と、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は好ましくは１００％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である。
或いは、又はこれまでの実施形態と組み合わせて、さらに好ましい実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性は、少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は好ましくは１００％である。
さらなる態様では、本発明は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つのＳＤＡ、及び血清タンパク質に結合する能力を有する少なくとも１つのＳＤＡを含むポリペプチドコンストラクトに関する。好ましくは、血清タンパク質は、血清アルブミン又は免疫グロブリンである。より好ましくは、免疫グロブリンは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。好ましい実施形態では、血清アルブミンに結合する能力を有するＳＤＡは、配列番号４０、３７、３８、３９、４１、及び４２からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である。好ましい実施形態では、免疫グロブリンに結合する能力を有するＳＤＡは、配列番号３０、２７、２８、２９、３１、３２、３３、及び３４からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である。
好ましい実施形態では、ポリペプチドコンストラクトは、ＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも２つのＳＤＡを含み、ＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも２つのＳＤＡのそれぞれは、選択肢Ａ；配列番号２４、又は選択肢Ｂ；配列番号２５、又は選択肢Ｃ；配列番号２０、又は選択肢Ｄ；配列番号１７若しくは１９、又は選択肢Ｅ；配列番号２２、１５、２３、若しくは１４から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但し少なくとも２つのＳＤＡは、同一の選択肢に由来する配列を含まず、並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性は、少なくとも７５％である。
さらなる態様では、本発明は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つのＳＤＡ、及び／又は本発明による少なくとも１つのポリペプチドコンストラクト、及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物に関する。好ましくは、組成物は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも２つのＳＤＡ、及び／又は本発明による少なくとも１つのポリペプチドコンストラクトを含む。
さらなる態様では、本発明は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有するＳＤＡ、又は医薬としての使用のための本発明によるポリペプチドコンストラクトに関する。
なおも別の態様では、本発明は、破傷風菌の疾患／症状の予防又は処置における使用のための、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有するＳＤＡ、本発明によるポリペプチドコンストラクト、又は本発明による医薬組成物に関する。
さらなる態様では、本発明は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有するＳＤＡ、又は本発明によるポリペプチドコンストラクトをコードするＤＮＡ断片に関する。
別の態様では、本発明は、本発明によるＤＮＡ断片を含む核酸であって、前記ＤＮＡ断片が、プロモーター、及び任意選択でその他の調節エレメントと作動可能にリンクしている核酸に関する。
さらなる態様では、本発明は、本発明による核酸を含む宿主細胞に関する。
いっそうさらなる態様では、本発明は、本発明によるＳＤＡ、又は本発明によるポリペプチドコンストラクトを製造するための方法であって、ａ）ＳＤＡ又はポリペプチドコンストラクトの発現を可能にする条件下で、本発明による宿主細胞を培養するステップと、任意選択でｂ）宿主細胞及び培養培地のうちの少なくとも１つからＳＤＡ又はポリペプチドコンストラクトを回収するステップとを含む方法に関する。
１つの態様では、本発明は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つのＳＤＡを含む診断キットに関する。
単離され、後に酵母菌内産生されたＴｅＮＴ結合ＳＤＡ（ＳＶＴクローン）の配列を示す図である。ＳＤＡは、ＩＭＧＴシステムに基づきアライメントされており、及び番号付けされている。横線は配列アラインメントにおいて導入されたギャップを示唆する。異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）の定義も、ＩＭＧＴシステムにやはり基づく。３つのＣＤＲ領域をグレーのバックグラウンドで示す。追加の位置５０ａ〜５０ｄが、ＳＶＴ０６、ＳＶＴ０８、及びＳＶＴ３１のこの領域における４つのアミノ酸のまれな挿入に対処するためにＦＲ２に挿入された。追加の残基も、ＳＶＴ０５の長いＣＤＲ２に対処するために、ＣＤＲ２に導入された。追加のギャップが、ＳＶＴ１６及びＳＶＴ２５のＩＭＧＴ位置６０に、これらのＳＤＡの残基６２及び６３をＳＶＴ２０及びＳＶＴ３４内の同一の残基とアライメントするために導入された。ＳＤＡのサブファミリーへの分類、及びＣＤＲ３群への分類が、各ＳＤＡについて示されている［５２］ 単離され、後に酵母菌内産生されたＩｇＧ結合ＳＤＡ（ＳＶＧクローン）、及び２つの参照ＳＤＡ（ｓｄＡｂ−３１、及びｓｄＡｂ−３２）の配列を示す図である。ＳＤＡは、ＩＭＧＴシステムに基づきアライメントされており、及び番号付けされている。横線は配列アラインメントにおいて導入されたギャップを示唆する。異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）の定義も、ＩＭＧＴシステムにやはり基づく。３つのＣＤＲ領域をグレーのバックグラウンドで示す。ＳＤＡのサブファミリーへの分類、及びＣＤＲ３群への分類が、各ＳＤＡについて示されている［５２］。 単離され、後に酵母菌内産生されたＡｌｂ結合ＳＤＡ（ＳＶＡクローン）の配列を示す図である。ＳＤＡは、ＩＭＧＴシステムに基づきアライメントされており、及び番号付けされている。横線は配列アラインメントにおいて導入されたギャップを示唆する。異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）の定義も、ＩＭＧＴシステムにやはり基づく。３つのＣＤＲ領域をグレーのバックグラウンドで示す。ＳＤＡのサブファミリーへの分類、及びＣＤＲ３群への分類が、各ＳＤＡについて示されている［５２］。 ＴｅＮＴに結合するＳＶＴ ＳＤＡのウェスタンブロット分析を示す図である。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したＴｅＮＴのブロットストリップを、最上部に示すビオチン化されたＶＨＨと共にインキュベートした。関連する分子量マーカーの位置を示す。ＴｅＮＴ重鎖は、約１００ｋＤａに移動し、及び軽鎖は約５０ｋＤａに移動するものと予期される。 単量体及び多量体ＳＤＡのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。ローディングされたＳＤＡは、各レーンの上部に表示されている。多量体ＳＤＡの場合、ＳＤＡをコードするｐＲＬプラスミドも表示されている。単量体ＳＤＡ及び多量体ＳＤＡの位置は、各パネルの右側において矢印により表示されている。マーカータンパク質の分子量は、右側に表示されている。パネルＡ、ＳＶＧ０６を含有する多量体ＳＤＡ、及び３つの参照単量体ＳＤＡ。 パネルＢ、ＳＶＡ１２又はＳＶＧ１３を含有する多量体ＳＤＡ、及びその対応する単量体ＳＤＡを示す図である。このゲル内のＴｅＮＴ結合ＳＤＡの順序は、単量体及び多量体ＳＤＡの両方において、常にＳＶＴ０２、ＳＶＴ１６、ＳＶＴ０６、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍである。 仔ブタに注射した（ｉ．ｍ．）多量体ＳＤＡの血清半減期を示す図である。ＳＤＡは、０時間において注射され、そして血清が、１、２、４、８、１１、１４、２１、及び２８日目に収集された。血清サンプル中に存在するＳＤＡの量は、ＥＬＩＳＡにより測定した。仔ブタ６匹の平均値と標準偏差（パネルＡ〜Ｄ）を掲載する。パネルＡ：ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６（０．２ｍｇ／ｋｇ）。 パネルＢ：ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６（０．３ｍｇ／ｋｇ）を示す図である。 パネルＣ：ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６（０．５ｍｇ／ｋｇ）を示す図である。 パネルＤ：ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６（０．５ｍｇ／ｋｇ）を示す図である。血清半減期の測定に対する曲線近似を、２４〜９６時間（４８時間予測）、又は９６〜５０４時間（９６時間予測）から得られたデータを用いて実施した。
〔発明の説明〕
驚くべきことに、公知の抗ＴｅＮＴ ＳＤＡのＫＤよりも有意に低いＫＤを有し、及びｉｎ ｖｉｖｏで破傷風毒素中和活性を有する抗ＴｅＮＴ ＳＤＡが取得可能であることが今や判明した。そのような新規の抗ＴｅＮＴ ＳＤＡは、極めて高い親和性を伴い、ＴｅＮＴに結合する能力を有するという長所を有する。これは、フリーのＴｅＮＴ分子と結合したＴｅＮＴ分子との間のバランスを、極端に結合したＴｅＮＴ分子の側に変化させ、ひいては破傷風菌に感染した後でも、破傷風の致命的な症状を十分に抑制する。
１ｎＭ未満のＫＤ値を有する抗ＴｅＮＴ ＳＤＡのいくつかの群が今や特定されている。図１は、ＳＤＡの群のメンバー（群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、並びに群Ｅ、Ｆ、及びＧそれぞれから１つのメンバー）について、その７つの群又は例の配列を示す。３つの影付きの領域は、高度可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）が位置する場所を示す。図１から分かる通り、いくつかの天然の変動が個々のＳＤＡ間に確かに存在する。これらの変動は、全体的な配列内のアミノ酸の相違（複数可）に起因し、又は前記配列内のアミノ酸（複数可）の欠損、置換、挿入、反転（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、若しくは付加による可能性がある。生物学的及び免疫学的活性を実質的に変化させないアミノ酸置換は、例えば”Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）においてＮｅｕｒａｔｈらにより記載されている。関連するアミノ酸の間のアミノ酸置換又は進化において頻繁に生じている置換は、特にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．、Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、１９７８、ｖｏｌ．５、ｓｕｐｐｌ．３を参照）。その他のアミノ酸置換として、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、及びＡｌａ／Ｇｌｕが挙げられる。この情報に基づき、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは、迅速且つ高感度でタンパク質を比較し（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７、１４３５〜１４４１、１９８５）、及び相同的タンパク質間の機能的類似性を決定する方法を開発した。本発明の代表的な実施形態のアミノ酸置換、並びに欠損及び／又は挿入を有する変動は、得られたタンパク質が、その抗原特性又は免疫原特性において実質的に影響を受けない限り、本発明の範囲内である。
これは、本発明によるＳＤＡが、約７０％の全体的なアミノ酸配列同一性レベルを有しながら、該タンパク質が＜１ｎＭのＫＤ値を依然として有するという意味において、それが同一のタンパク質を依然として表し得る理由を説明する。＜１ｎＭのＫＤ値を有するＳＤＡを依然として提供する、本発明による特定のＳＤＡのアミノ酸配列内のこのような変動は、「前記タンパク質の抗原特性又は免疫原特性に実質的に影響を及ぼさない」と考えられる。
第１の態様では、本発明は、破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）に結合する能力を有する抗原結合タンパク質、好ましくは単一ドメイン抗体（ＳＤＡ）であって、抗原結合ドメインが、配列番号１７、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である抗原結合タンパク質に関する。
換言すれば、この態様では、本発明は、破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質に関する。好ましくは、抗原結合タンパク質は、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順番で作動可能にリンクしている４つのフレームワーク領域、ＦＲ１〜ＦＲ４、及び３つの相補性決定領域、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＣＤＲ１は、図１に示すように、ＶＨＨの配列番号１３〜２６のＣＤＲ１配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は１若しくは２つのアミノ酸残基においてＣＤＲ１とは異なるアミノ酸配列を有する；ｂ）ＣＤＲ２は、図１に示すように、ＶＨＨの配列番号１３〜２６のＣＤＲ２配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は１、２、３、若しくは４つのアミノ酸残基においてＣＤＲ２とは異なるアミノ酸配列を有する；及び、ｃ）ＣＤＲ３は、図１に示すように、ＶＨＨの配列番号１３〜２６のＣＤＲ３配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は１、２、３、４、若しくは５つのアミノ酸残基においてＣＤＲ３とは異なるアミノ酸配列を有する；但し、図１に示すように、フレームワーク領域のそれぞれは、配列番号１３〜２６のいずれか１つのフレームワークアミノ酸配列と、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００％のアミノ酸同一性を有する。好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、同一の配列番号に由来する。より好ましくは、フレームワーク領域は、相補性決定領域と同一の配列番号に由来する。
全体的なアミノ酸配列同一性レベルの特定のパーセント、例えば約７０％等とは、本明細書で使用する場合、全抗原結合タンパク質のアミノ酸配列同一性のレベルが、換言すれば、２つの配列が、その全長ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４にわたりアライメントされたときに、約７０％であることを意味する。従って、この文脈において「全体的な」は、ＣＤＲ１〜３を含めるように使用される。「配列同一性」又は「同一性」は、本明細書においては、配列を比較することにより決定される、２つ若しくはそれ超のアミノ酸（ポリペプチド若しくはタンパク質）配列、又は２つ若しくはそれ超の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関連性として定義される。当技術分野において、「同一性」は、場合に応じて、そのような配列のストリング間の一致性により決定される、アミノ酸又は核酸配列の間の配列関連性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列の間の「類似性」は、一方のポリペプチドのアミノ酸配列、及びその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により容易に計算可能である。用語「配列同一性」又は「配列類似性」とは、２つの（ポリ）ペプチド又は２つのヌクレオチド配列が、例えばデフォルトパラメーターを使用して、ＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３）、ＧＡＰ、又はＢＥＳＴＦＩＴのプログラムによるなどして、好ましくは全長（少なくとも比較対象内の最も短い配列の）にわたり、最適にアライメントされ、一致の数を最大化させ、且つギャップの数を最低限に抑えたときに、少なくとも本明細書で別途定義するような配列同一性の特定のパーセントを共有することを意味する。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をその全長にわたりアライメントし、一致の数を最大化させ、且つギャップの数を最低限に抑える。一般的に、ＧＡＰデフォルトパラメーターが使用され、但しギャップクリエイションペナルティ＝５０は、ｂｌｏｓｕｍ行列及びデフォルト設定（ギャップ開始ペナルティ：１０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５）を使用するＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３）である。配列アラインメント及びパーセント配列同一性に対するスコアは、コンピュータープログラム、例えばＡｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ社、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１−３７５２ ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３等を使用して、又はオープンソースソフトウェア、例えばプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルなＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する）、若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルなＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する）等を、（ヌクレオチド）／８（タンパク質）において、及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）を使用して決定され得る。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、またタンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ ８９、９１５〜９１９）。本発明のタンパク質配列をアライメントするための好ましい多重アライメントプログラムであるＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０は、上記ＧＡＰと同一のパラメーターを使用し、又はデフォルト設定を使用する（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方について、及びタンパク質及びＤＮＡアライメントの両方について、デフォルトギャップ開始ペナルティは１０．０であり、またデフォルトギャップ伸長ペナルティは０．５である；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質についてＢｌｏｓｓｕｍ６２、及びＤＮＡについてはＤＮＡＦｕｌｌである）。配列が実質的に異なる全長を有するとき、ローカルアライメント、例えばＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するアライメント等が好ましい。或いはパーセント類似性又は同一性は、アルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等を使用して、公開データベースと照合調査することにより決定され得る。
再構成された抗体の可変ドメインのアライメントは、ＣＤＲ領域の末端部において広範なギャップ導入を必要とし得る。特に、ＣＤＲ３領域は、そのような長いギャップ伸長を時に必要とする。いかなる理論にも拘泥するつもりもないが、これは、ＣＤＲ３を形成するＶＤＪ組換えの固有の分子プロセスにおそらくは起因する。その結果、ＤＮＡ又はタンパク質アライメント用の標準的なソフトウェアプログラムは、再構成されたＳＤＡドメインを適切にアライメントすることができない可能性がある。プログラムＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６、Ｗ５０３〜５０８（２００８））は、ＳＤＡを含む抗体可変ドメインのアライメントを含め、配列分析用として特に開発され、従ってアライメントを決定するのに好ましいプログラムである。ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ（２０１８年１月９日付けのＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴプログラムバージョン：３．４．９−ＡＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ参照ディレクトリリリース：２０１８年２月１４日付けの２０１８０７−３）においてインターネットからアクセス可能である。これはＩＭＧＴナンバリングシステムに基づく、ＳＤＡのアライメント、並びに３つのＣＤＲ及び４つのＦＲ領域の同定をもたらす。該プログラムは、まれな挿入及び欠損の同定に関するオプションも有する。その後、ＣＤＲ及びＦＲの配列同一性が決定可能である。
任意選択で、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者は、当業者にとって明白であるように、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換も考慮することができる。保存的なアミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンである；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンである；及びイオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書で開示されるアミノ酸配列の置換型のバリアントは、開示される配列内の少なくとも１つの残基が除去され、そしてその場所に異なる残基が挿入されたバリアントである。好ましくは、アミノ酸の変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれについて好ましい保存的置換は以下の通りである：ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ又はＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；Ｇｌｎ又はＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ又はＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ、又はＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ又はＰｈｅ；及びＶａｌからＩｌｅ又はＬｅｕ。
本発明による好ましいＳＤＡは、位置５０ａ〜５０ｄにおいてアミノ酸配列ＶＥＤＧを含む。これは、ＳＤＡの最も代表的なアミノ酸置換としてＳＤＡ文献に多く記載される残基Ａｒｇ５０（Ｋａｂａｔ位置４５）に隣接したＦＲ２領域の中央に位置する。従来のＳＤＡは、ＶＬドメインとの疎水的接触を引き起こすＩＭＧＴ位置５０においてＬｅｕを通常含有する。ＳＤＡは、ＩＭＧＴ位置５０においてＡｒｇを有する頻度が最も高い。この置換は、従前のＶＬインターフェースをより親水性にする。ＶＥＤＧの挿入は、ＦＲ２領域をより親水性にし、その等電点を低下させ、その溶解度を増加させ、そして凝集の機会を低下させる。
好ましい実施形態では、本発明による抗原結合タンパク質は、１つ又は複数の単一結合ドメインを含み、それによって単一結合ドメインは軽鎖を含まず、またそれによって単一結合ドメインは、完全な抗原結合能力を備える。好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質は、重鎖を含み、且つ軽鎖が欠損している抗体、その断片、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：７７２〜７７７）、単一ドメイン抗体、及びその断片からなる群から選択される。本発明による抗原結合タンパク質の例は、軽鎖が本来欠損しているラクダ類又はサメ重鎖のみの抗体、及びアフィボディに由来するＳＤＡである。好ましくは、抗原結合タンパク質は、重鎖のみを含み、且つ軽鎖が本来欠損している抗体、又はその抗体断片、例えばＶＨＨ（ラクダ類に由来する）、又はＶＮＡＲ（サメに由来する）等である。或いは、（及びやはり好ましい）本発明の抗原結合タンパク質は、例えば、突然変異等の改変により軽鎖が本来欠損している抗体、又はその断片に由来し得る。軽鎖が本来欠損している抗体は、例えばラクダ類（例えば、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、アルパカ、ビクーニャ、及びグアナコ）、又はサメ（下記をさらに参照）の免疫化により取得され得る。これらの抗体は、重鎖のみを含み、且つ軽鎖が欠損している。このような単一ドメイン重鎖抗体の長所として、例外的に安定で小さく、また宿主微生物、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等内で容易に産生されることが挙げられる。
従って、本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは単一のポリペプチド鎖内に、標的分子上のエピトープに対する完全な抗原結合部位を備える免疫グロブリン由来の可変ドメインを含む。そのような抗原結合タンパク質として、
１）重鎖のみから構成され、且つ軽鎖を本来欠損しているラクダ類及びサメから取得可能な抗体；
２）ＶＨＨドメイン又はＶＮＡＲ断片と通常呼ばれ、本明細書では、まとめて単一ドメイン抗体（ＳＤＡ）と呼ばれる、１）で定義する抗体の可変ドメイン；
３）ラクダ類（又はサメ）ＶＨＨドメインのフレームワーク配列が、別の供給源から得られるＣＤＲとグラフト結合している、１）で定義する抗体、又は２）のドメインの工学的に操作された形態、例えば「ラクダ類化（camelidised）」、又は「ラクダ化（camelised）」抗体等；
４）例えば、国際公開第０４／１０８７４９号に記載されているように、様々な免疫グロブリン様分子に由来するフレームワーク配列が、所与の標的分子に対して特異的なＣＤＲと結びついている、免疫グロブリン様の可変ドメインの工学的に操作された形態
が特に挙げられるが、但しこれらに限定されない。
本発明の好ましい抗原結合タンパク質では、完全な抗原結合能力を備える可変ドメインの単一のポリペプチド鎖は、好ましくは、４つのフレームワーク領域又は「ＦＲ」から構成されると考えられ得るアミノ酸配列及び構造を有し、それらは、当技術分野及び本明細書において、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」とそれぞれ呼ばれるが、それらフレームワーク領域は、当技術分野において「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」とそれぞれ呼ばれる３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲ」により中断されている。これらのフレームワーク領域、及び相補性決定領域は、好ましくは、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順番（アミノ末端からカルボキシ末端に向かって）で作動可能にリンクしている。
完全な抗原結合能力を有する可変ドメイン内のアミノ酸残基の総数は、１１０〜１３５の領域内にあり得るが、好ましくは１１５〜１２９の領域内にある。しかしながら、本発明に基づく完全な抗原結合能力を有する可変ドメインは、ドメインが本明細書で概説されるさらなる機能的要件を満たし、及び／又は本明細書に記載される目的に適するならば、その長さ及び／又はサイズに関して特に制限されない。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓにより（１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１−２）：２５〜３８、例えば前記参考資料の図２を参照）、及びＨａｒｍｓｅｎらにより（２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３７：５７９〜５９０、例えば前記参考資料の図１を参照）、ラクダ類に由来するＶＨＨドメインに適用されるように、完全な抗原結合能力を有する可変ドメインのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔらにより考案された、ＶＨドメインに対する一般的なナンバリングに基づき番号付けされる（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９９１））。
このような観点において、留意すべき点として、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインについて当技術分野において周知の通り、ＣＤＲのそれぞれに含まれるアミノ酸残基の総数は変動する可能性があり、そしてＫａｂａｔナンバリングにより示されるアミノ酸残基の総数に対応しない可能性があることが挙げられる。しかしながら、フレームワーク領域の保存されたアミノ酸に基づき、当業者は、完全な抗原結合を有する当該可変ドメインに対するＫａｂａｔの定義に基づき、各フレームワーク、及び相補性決定領域をアライメントすることができる。その例は、図１〜３にそれぞれ示すように、ＴｅＮＴ、免疫グロブリン、及び血清アルブミンに結合するＶＨＨのアミノ酸配列内の相補性決定領域の定義において与えられる。ＶＨドメインのアミノ酸残基をナンバリングするための代替的方法は、ラクダ類に由来するＶＨＨドメインに対して、及び完全な抗原結合能力を有する可変ドメインに対しても、類似した方式で適用可能であるが、その方法は、Ｃｈｏｔｈｉａらにより記載される方法であり（Ｎａｔｕｒｅ ３４２、８７７〜８８３（１９８９））、いわゆる「ＡｂＭ定義」、及びいわゆる「接触定義」、又はＩＭＧＴナンバリングシステムである（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２０９〜２１２）。
３つの高度可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ１、２、及び３）は、ＳＤＡの特異性及び結合特性を実際に決定する際に、主要な役割を演ずる領域であることが公知である。
図１に示す様々な群内のＣＤＲ１領域及びＣＤＲ２領域に含まれるアミノ酸配列の変動は、比較的低い、すなわち様々なＳＤＡの非ＣＤＲ関連部分内の変動よりも低いことに留意されたい。ＣＤＲ１領域は平均８又は９個のアミノ酸を含み、及びその群内の変動は、１又は２個のアミノ酸のみ、すなわち約２５％と関係する。ＣＤＲ２領域は、ほぼ同一レベルの変動を示す。この領域の同一性のレベルは、７５％を下回らないと推測され得る。ほとんどの場合、同一性のレベルはいっそうより高い、すなわち７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９であり、又は１００％でさえある。結合に関与する最も重要な領域と一般的に考えられているＣＤＲ３領域内のアミノ酸配列変動は、様々なＳＤＡの非ＣＤＲ関連部分内の変動よりも低いことにもやはり留意されたい。単なる例として：これまでに特定され図１に示されているＳＤＡグループＡに属する４メンバー間のＣＤＲ３領域内の同一性のレベルは約９５％である。グループＢに属する３メンバー間の当該領域における同一性のレベルは約９２％であり、またグループＣでは、それは９４％である。グループＤに属する２つのＳＤＡは、約７５％のＣＤＲ３同一性レベルを有する。ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域については、この領域内の同一性のレベルは７５％を下回らないと推測され得る。ほとんどの場合、同一性のレベルはいっそうより高く、すなわち少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９であり、又は１００％でさえある。
但しＣＤＲ１、２、及び３領域のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である、という条件は、本発明の範囲内に含まれる抗原結合タンパク質は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６の群から選択されるアミノ酸配列内のＣＤＲ１、２、及び３領域のいずれとも、少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するＣＤＲ１、２、及び３領域を有することを示唆する。
好ましくは、ＴｅＮＴに結合する能力を有する抗原結合タンパク質は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６からなる群から選択される配列と、７０％、例えば、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％を上回り、又は１００％でさえある全体的な配列同一性を、そのような好ましい順序で有する。
或いは、又はこれまでの実施形態と組み合わせて、好ましい実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の配列同一性は、以下の好ましい順序で、少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％であり、又は１００％でさえある。これらの配列同一性は互いに独立的に決定可能である。
従って、この実施形態の好ましい形態は、抗原結合タンパク質が、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６からなる群から選択される配列と、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、又は好ましくは１００％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である、本発明による抗原結合タンパク質に関する。従って、この実施形態のより好ましい形態は、抗原結合タンパク質は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６からなる群から選択される配列と、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、又は１００％でさえある全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性が少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％であり、又は１００％でさえある、本発明による抗原結合タンパク質に関する。
特異抗原、例えばＴｅＮＴ等と結合することができ、それに対して親和性を有し、それに結合する能力を有し、及び／又はそれに対して特異性を有する本発明の抗原結合タンパク質は、前記抗原（例えば、ＴｅＮＴ）に対して「対立性」、又は「標的性」であるといわれる場合もある。用語「特異性」とは、特定の抗原結合タンパク質分子が結合することができる、異なる種類の抗原又は抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は親和性及び／又はアビディティーに基づき決定可能である。親和性は、抗原と抗原結合タンパク質との解離平衡定数（ＫＤ）により表され、抗原決定基と抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度に対する指標である。或いは、親和性は、１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）として表すこともできる。親和性は、抗原結合タンパク質と目的とする抗原との固有の組み合わせに応じて、それ自体が公知である方式で決定可能である。アビディティーとは、複数の結合部位を有する標的分子の、結合物質のより大型の複合体による結合強度、すなわち、多価結合の結合強度を指すものと本明細書では理解される。アビディティーは、抗原結合分子上の抗原決定基とその抗原結合部位との間の親和性、及び抗原結合分子上に存在する結合部位の数の両方と関連する。一方、親和性とは、単純な一価の受容体リガンドシステムを指す。
一般的に、ＴｅＮＴに結合する能力を有する本発明の抗原結合タンパク質は、約１０−５〜１０−１２Ｍ以下、及び好ましくは１０−７〜１０−１２Ｍ以下、及びより好ましく１０−８〜１０−１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、並びに／或いは少なくとも１０−７Ｍ、好ましくは少なくとも１０−８Ｍ、より好ましくは少なくとも１０−９Ｍ、例えば少なくとも１０−１０、１０−１１、１０−１２Ｍ、又はそれ超等の結合親和性で、ＴｅＮＴと結合する。１０−４Ｍを上回る任意のＫＤ値（すなわち、１００μＭ未満）は、非特異的結合を示唆するものと一般的に考えられる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満等の親和性でＴｅＮＴに結合する。抗原又は抗原決定基に対する抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ分析及び／又は競合結合アッセイ法、例えばラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、及びサンドイッチ競合アッセイ等、並びに当技術分野においてそれ自体が公知であるその異なる変法を含む、それ自体が公知である任意の適する方式で決定可能である。
破傷風トキソイドは、ＴｅＮＴの減弱された形態、例えばホルムアルデヒド処置済みのＴｅＮＴである。細菌毒素、例えばＴｅＮＴ等に結合する能力を有する本発明の好ましい抗原結合タンパク質は、破傷風トキソイドにも結合する能力を有する。トキソイド結合能力は、ＴｅＮＴを使用する必要もなく、本発明による抗原結合タンパク質の評価を可能にするので有利である。
その上、古典的抗体に対するＳＤＡの長所、例えば結合特性、変性／熱分解に対する抵抗性、水性溶解度、体内分布、及び組織穿通等について対処されている。
しかしながら、ＳＤＡ断片の欠点は、身体に一旦投与されたときのその比較的短い血清半減期である；それが血液から排除される速度は速い。一価のＶＨＨの代表的な半減期は、約２時間であり得るが、また排除は１日内に生ずる（Ｈａｒｍｓｅｎ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ、Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：４９２６〜４９３４（２００５））。この欠点は、その分子量が比較的低いことに起因する。大雑把にすぎないが、５０〜６０ｋＤａ、より好ましくは６０〜７０ｋＤａの最低限度のＭ．Ｗ．を有する分子は、有意により長い半減期を有する。
この欠点は、例えばＳＤＡ断片の静脈内連続投与を通じて克服することができた。このアプローチは、動物福祉、実用性の観点、並びに経済的な観点に由来するが、しかし好ましい方法ではない。このような理由により、その他の方法が試みられ、そしてこの問題を克服することを見出した。
排除速度を低下させるための幅広く使用されているアプローチは、固有の長期血清半減期を有する第２の分子への直接コンジュゲーションである。１つのそのような方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の化学的連結により、タンパク質の流体力学的サイズを増加させることであり、ヒトにおいて最長１４日間の最終半減期を有する薬物を生成することができる。別のアプローチは、長期血清半減期を有する天然タンパク質；６７ｋＤａの血清アルブミン（ＳＡ）又は抗体のＦｃ部分（グリコシル化に応じてその天然の二量体形態において追加の６０〜７０ｋＤａを付加する）との遺伝子融合体として、治療用タンパク質を発現することである。これは、ヒトにおいて数日間の最終半減期を有する化合物を提供する。
本発明では、別のアプローチが選択される。本発明において提供され、及び下記でより詳細に考察される解決策は、リンカーを介してカップリングしている本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つのＳＤＡと、別の（非ＴｅＮＴ）タンパク質を標的とする少なくとも別のＳＤＡとの組み合わせに関する。本明細書で使用する場合、ＴｅＮＴタンパク質ではない前記別のタンパク質は、ヒト又は動物の体内、好ましくは血液中に存在するタンパク質、好ましくは血清タンパク質である。そのようなタンパク質の例は、以下で取り上げられ、その概念がより詳細に説明される。
そのような組み合わせの例は、ＴｅＮＴに結合する能力を有する本発明によるＳＤＡ、リンカー、及び別の（非ＴｅＮＴ）タンパク質を標的とするＳＤＡを含む組み合わせである。
例えば、リンカーを介して接続しており、及び例えば別の（非ＴｅＮＴ）タンパク質、好ましくは血清タンパク質を標的とする少なくとも１つのＳＤＡとリンカーを介してさらに接続している、ＴｅＮＴに結合する能力を有する２つ又はそれ超のＳＤＡを含む組み合わせは、ＴｅＮＴの中和においてより効率的でさえあり得ることは言うまでもない。好ましくは、ＴｅＮＴに結合する能力を有する２つ又はそれ超のＳＤＡは、ＴｅＮＴの異なるエピトープを標的とする。
本明細書で使用する場合、ＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つのＳＤＡ、少なくとも１つのリンカー、及び別の（非ＴｅＮＴ）タンパク質を標的とする少なくとも１つのその他のＳＤＡからなる任意のそのような組み合わせは、ポリペプチドコンストラクトともさらに呼ばれる。下記の実施例セクションは、そのようなポリペプチドコンストラクトの十分な例を提供する。
リンカーの概念は、以下でより詳細に考察される。基本的に、リンカーの機能は、ＳＤＡを結びつけることである。リンカーは、非構造化された可撓性の立体構造を採る比較的短いペプチドである。原則として、リンカーペプチドは、それが結びつけるドメインのアセンブリ及び結合活性を妨害すべきでない、又はできる限りそうすべきでない。
本発明によるポリペプチドコンストラクトは、例えばＴｅＮＴエピトープに結合する能力を有する１つのＳＤＡ、リンカー、及び別のタンパク質に結合する能力を有する第２のＳＤＡを含むポリペプチドコンストラクトについて、約２×１５ｋＤａのサイズを有する。それは、例えば第１のＴｅＮＴエピトープに結合する能力を有する１つのＳＤＡ、第２のＴｅＮＴエピトープに結合する能力を有する第２のＳＤＡ、及び別のタンパク質に結合する能力を有する第３のＳＤＡを含むポリペプチドコンストラクトについて、約３×１５ｋＤａのサイズを有する。
そのようなポリペプチドコンストラクトの長所は、その長さが比較的短いので、経済的に実現可能な方式で容易にそれを化学合成する、又は好適な発現系においてポリペプチドコンストラクトをコードするＤＮＡ断片を発現させることが可能となることである。
考察の余地はあるにしても、そのようなポリペプチドコンストラクトは、原則的にはなおも比較的短い半減期（そのＭ．Ｗ．はなおも５０〜６０ｋＤａ未満、又は６０〜７０Ｄａ未満である）を有するが、しかし身体に一旦投与されたら、該ポリペプチドコンストラクトは、その「別のタンパク質に結合する能力を有するＳＤＡ」を通じて前記別のタンパク質と結合し、これによりそのようなポリペプチドコンストラクトよりも顕著に大きなサイズを有する分子をもたらす、という点において上記単量体コンストラクトとは有意に異なる。得られた結合後のポリペプチドコンストラクトは、６０ｋＤａを有意に上回るＭ．Ｗ．を有する。
このアプローチは、ポリペプチドコンストラクトは容易に生成可能であり（上記参照）、また同時にそれは小分子の短い半減期の問題も解決するという長所を有する：一旦投与されると、この問題を克服する大型の分子が形成される。
前記別の（非ＴｅＮＴ）タンパク質に結合する能力を有するＳＤＡが、非経口投与後に、当該タンパク質と容易に密接に接触するように、前記別の（非ＴｅＮＴ）タンパク質は、好ましくは血清タンパク質である。
従って、１つの実施形態では、本発明は本発明の抗原結合タンパク質の特定の形態：多価抗原結合タンパク質に関係する。多価抗原結合タンパク質は、本明細書において上記定義するようなＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質、及び血清タンパク質に結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を含む。少なくとも２つの抗原結合タンパク質のアミノ酸配列は、ヘッドトゥーテールで通常融合しており、すなわち、最もＮ末端側にある配列のＣ末端が第２の配列のＮ末端に融合している等。少なくとも２つの抗原結合タンパク質のアミノ酸配列は、直接リンクして、又はリンカー若しくはスペーサーを介して融合し得る。本発明の多価抗原結合タンパク質は、多価タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現により生成され得るが、但し抗原結合タンパク質の２つ又はそれ超のコーディング配列は、同一のリーディングフレーム内で共に作動可能にリンクしている。当業者は、タンパク質コーディング配列を作動可能に融合させる方法について理解する。
従って、別の態様では、本発明は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質、及び血清タンパク質に結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含むポリペプチドコンストラクト（又は融合タンパク質）に関する。２つ又はそれ超のアミノ酸配列は、好ましくは遺伝子融合により共にリンクしているが、但し各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野においてそれ自体が公知である手段により、インフレームで作動可能に共にリンクしている。アミノ酸配列は、直接、又は任意選択でスペーサー若しくはリンカーアミノ酸配列を介してリンクし得る。
さらに、この血清タンパク質は、好ましくは比較的大型のタンパク質である：ポリペプチドコンストラクトが血清タンパク質に結合した後に形成される生成物のサイズは、より長い半減期を実現するために、好ましくは６０ｋＤａを上回るべきである。大型の血清タンパク質の例は、とりわけ血清アルブミン、及び血清免疫グロブリン（Ｉｇ）、例えば免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。
従って、本発明のこの実施形態の好ましい形態は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質、及び血清タンパク質に結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含むポリペプチドコンストラクトに関するが、但し前記血清タンパク質は、血清アルブミン、好ましくはウマ、ブタ、ネコ、又はイヌの血清アルブミンである。
好ましい実施形態では、本発明による血清タンパク質に結合する能力を有する少なくとも１つのＳＤＡ、及びＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つのＳＤＡを含むポリペプチドコンストラクトは、線状エピトープと結合する少なくとも１つのＳＤＡ、及び高次構造エピトープと結合する少なくとも第２のＳＤＡを有する。より好ましくは、コンストラクトは、線状エピトープと結合する１つのＳＤＡ、及び高次構造エピトープに結合する２つのＳＤＡを有する。
従って、極めて好ましい実施形態は、血清タンパク質に結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質、好ましくはＳＤＡ、並びに細菌毒素、好ましくクロストリジウム菌毒素、より好ましくは破傷風菌、ボツリヌス菌（Ｃｌ．ｂｏｔｕｌｉ）、又はクロストリジウム・ディフィシレ菌（Ｃｌ．Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素、最も好ましくはＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも第１及び第２の抗原結合タンパク質、好ましくはそれぞれＳＤＡを含むポリペプチドコンストラクトであって、第１の毒素結合タンパク質が線状エピトープに結合し、より好ましくは第１の毒素結合タンパク質が線状エピトープと結合し、及び第２の毒素結合タンパク質が高次構造エピトープと結合するポリペプチドコンストラクトに関する。
別の極めて好ましい実施形態は、細菌毒素、好ましくはクロストリジウム菌毒素、より好ましくは破傷風菌、ボツリヌス菌、又はクロストリジウム・ディフィシレ菌の毒素、最も好ましくはＴｅＮＴに結合する能力を有する、少なくとも第１及び第２の抗原結合タンパク質、好ましくはそれぞれＳＤＡを含むポリペプチドコンストラクトであって、第１の毒素結合タンパク質が線状エピトープと結合し、より好ましくは第１の毒素結合タンパク質が線状エピトープと結合し、及び第２の毒素結合タンパク質が高次構造エピトープと結合するポリペプチドコンストラクトに関する。
血清アルブミンは、比較的高濃度で体内に存在する。これは、血清アルブミンに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含む本発明によるポリペプチドコンストラクトは、一旦体内に投与されると、血清アルブミンとの結合を通じて大型の生成物を容易に形成することを意味する。それにもかかわらず、血清アルブミンに結合する能力を有する抗原結合タンパク質の場合であっても、ＫＤ値は低いことが、例えば１マイクロＭ未満であることが好ましい。本発明は、血清アルブミンに結合する能力を有する抗原結合タンパク質を提供する。そのような抗原結合タンパク質の６つの例及びその配列は、図３に提示されている。３つの影付きの領域は、高度可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）が位置する場所を示唆する。本発明は、実際、表２８でわかる通り、低いＫＤ（０．５〜３００ｎＭ）で血清アルブミンに結合するＳＤＡを提供する。
実施例セクション内の表１８及び図６は、とりわけ、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有するＳＤＡが、本発明による血清アルブミンに結合する能力を有するＳＤＡとカップリングしている様々なポリペプチドコンストラクトのブタにおける半減期の結果を示している。表からすぐに明らかなように、そのようなポリペプチドコンストラクトは、驚くべきことに１００〜１５０時間の長い平均半減期を有する。類似した半減期（１１７時間）が、その他のアルブミン半減期延長型単一ドメイン抗体について報告された（Ｈｏｅｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１５年）。実施例セクション（実施例２３）内の表３３は、ポリペプチドコンストラクト（本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有するＳＤＡが、本発明による血清アルブミンに結合する能力を有するＳＤＡとカップリングしている）は、ウマに投与されたとき、３９６〜６０９時間の平均半減期を有したという、驚くべき知見を示している。ＴｅＮＴに結合する能力を有する本発明による少なくとも１つのＳＤＡ、及び血清タンパク質に結合する能力を有する本発明による少なくとも１つのＳＤＡ（例えば、ＳＶＡ１２等）を含む、本発明による好ましいポリペプチドコンストラクトは、少なくとも２００時間、好ましくは少なくとも２５０時間、より好ましくは少なくとも３００時間、なおいっそうより好ましくは少なくとも３５０時間、なおいっそうより好ましくは少なくとも３７５時間、なおいっそうより好ましくは少なくとも３８０時間、なおいっそうより好ましくは少なくとも３９０時間、なおいっそうより好ましくは少なくとも３９５時間、なおいっそうより好ましくは少なくとも４５０時間、なおいっそうより好ましくは少なくとも４７５時間、より好ましくはなおも少なくとも５００時間、なおいっそうより好ましくは少なくとも５５０時間、最も好ましくは少なくとも６００時間の平均半減期を有するが、但し該半減期は、好ましくはウマにおける半減期であり、より好ましくは実施例２３において決定される通りである。
よりいっそう驚くべきことに、本発明は、広範囲の異種間結合を示すＳＤＡを特に提供する。異種間結合は、２つ以上の種の血清アルブミンに結合することと理解される。本発明による血清アルブミンに結合する能力を有するＳＤＡの６つの例及びその配列は、表６に提供され、また以下で考察される。
異種間結合を有する、すなわち２つ以上の動物種の血清アルブミンに結合する能力を有するＳＤＡの明白な長所は、２つ以上の動物種を対象として使用可能である本発明によるポリペプチドコンストラクトにおいて、そのようなＳＤＡが使用可能であるという長所を有する。
従って、別の態様では、本発明は、血清アルブミンと特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順番で作動可能にリンクしている４つのフレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ４、及び３つの相補性決定領域ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を好ましくは含む抗原結合タンパク質に関する。好ましくは、ＣＤＲ１は、図２に示すような、ＶＨＨ配列番号３７〜４２のＣＤＲ１配列、又はアミノ酸残基の１若しくは２つにおいてＣＤＲ１とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；ｂ）ＣＤＲ２は、図２に示すような、ＶＨＨ配列番号３７〜４２のＣＤＲ２配列、又はアミノ酸残基の１、２、３、若しくは４つにおいてＣＤＲ２とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；及びｃ）ＣＤＲ３は、図２に示すような、ＶＨＨ配列番号３７〜４２のＣＤＲ３配列、又はアミノ酸残基の１、２、３、４、若しくは５つにおいてＣＤＲ３とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；但し、フレームワーク領域のそれぞれは、図２に示すように、配列番号３７〜４２のいずれか１つのフレームワークアミノ酸配列と、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００％のアミノ酸同一性を有する。好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、同一の配列番号に由来する。より好ましくは、フレームワーク領域は、相補性決定領域と同一の配列番号に由来する。換言すれば、この態様では、本発明は、血清アルブミンに結合する能力を有する抗原結合タンパク質、好ましくはＳＤＡであって、配列番号４０、３７、３８、３９、４１、又は４２からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である抗原結合タンパク質に関する。好ましくは、抗原結合タンパク質は、ウマ、ブタ、ネコ、又はイヌの血清アルブミンに結合する能力を有する。
好ましくは、本発明による血清アルブミンに結合する能力を有する抗原結合タンパク質は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、及び４２からなる群から選択される配列と、７０％を上回る、例えば少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９を上回る、又は１００％でさえある全体的な配列同一性を、そのような好ましい順序で有する。好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の同一性のレベルは、少なくとも７５％である。
或いは、又はこれまでの実施形態と組み合わせて、好ましい実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の配列同一性は、以下のような好ましい順序で、少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９であり、又は１００％でさえある。これらの配列同一性は互いに独立的に決定可能である。
従って、この実施形態の好ましい形態は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、及び４２からなる群から選択される配列と、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は好ましくは１００％の全体的なアミノ酸配列同一性を有する、本発明による血清アルブミンに結合する能力を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である抗原結合タンパク質に関する。従って、この実施形態のより好ましい形態は、本発明による血清アルブミンに結合する能力を有する抗原結合タンパク質であって、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、及び４２からなる群から選択される配列と、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％でさえある全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性が、少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９であり、又は１００％でさえある抗原結合タンパク質に関する。
上記のように、２つ以上の動物種の血清アルブミンに結合する能力を有する抗原結合タンパク質は、それが２つ以上の動物種において使用可能である、本発明によるポリペプチドコンストラクトにおいて使用可能であるという長所を有する。本発明は、そのような異種間結合を示す血清アルブミンに結合する能力を有する、いくつかの抗原結合タンパク質を提供する。表６で見てわかる通り、特にＳＶＡ１２Ｌ（配列番号４０）及びＳＶＡ０６Ｌ（配列番号３９）は、イヌ、ウマ、ネコ、及びブタの血清アルブミンと結合するという意味において、強い異種間結合を提供する。やはり、表６及び表２８で見てわかる通り、特にＳＶＡ１６Ｌ（配列番号３７）は、イヌ、ウマ、及びネコのいずれの血清アルブミンとも結合するという意味において、強い異種間結合を提供する。
従って、この実施形態のより好ましい形態は、配列番号３７、３９、及び４０からなる群から選択される配列と、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％である、本発明による血清アルブミンに結合する能力を有する抗原結合タンパク質に関する。
従って、本発明の実施形態のより好ましい形態は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質、及び血清アルブミンに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含み、但し血清アルブミンに結合する能力を有する前記少なくとも１つの抗原結合タンパク質は、好ましくは上記参照の本発明による抗原結合タンパク質である、ポリペプチドコンストラクト（又は融合タンパク質）に関する。
本発明の実施形態の別の好ましい形態は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質、及び血清タンパク質に結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含み、但し前記血清タンパク質が免疫グロブリンである、ポリペプチドコンストラクト（又は融合タンパク質）に関する。
この実施形態のより好ましい形態は、ＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質、及び血清タンパク質に結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含み、但し前記血清タンパク質が、ＩｇＧ免疫グロブリン、好ましくはウマ、ブタ、マウス、モルモット、ヒト、ウシ、ネコ、又はイヌのＩｇＧ免疫グロブリンである、本発明によるポリペプチドコンストラクトに関する。
免疫グロブリンは、血清アルブミンのように、比較的高濃度で身体内に存在する。これは、免疫グロブリンに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含む本発明によるポリペプチドコンストラクトは、一旦身体に投与されると、血清免疫グロブリンとの結合を通じて大型の生成物を容易に形成することを意味する。それにもかかわらず、免疫グロブリンに結合する能力を有する抗原結合タンパク質の場合でも、低ＫＤ値、例えば１μＭ未満が好ましい。
本発明は、好適なＫＤを有する、Ｉｇに結合する抗原結合タンパク質を提供する。低ＫＤを有する、免疫グロブリンに結合する本発明による抗原結合タンパク質の８つの例、及びその配列が図２に提供されている。３つの影付きの領域は、高度可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）が位置する場所を示唆する。
従って、別の態様では、本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順番で作動可能にリンクしている４つのフレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ４、及び３つの相補性決定領域ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を好ましくは含む抗原結合タンパク質に関する。好ましくは、ＣＤＲ１は、３図に示すように、ＶＨＨ配列番号２７〜３４のＣＤＲ１配列、又はアミノ酸残基の１若しくは２つにおいてＣＤＲ１とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ｂ）ＣＤＲ２は、図に３示すように、ＶＨＨ配列番号２７〜３４のＣＤＲ２配列、又は１、２、３、若しくは４つのアミノ酸残基においてＣＤＲ２とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、及びｃ）ＣＤＲ３は、図３に示すように、ＶＨＨ配列番号２７〜３４のＣＤＲ３配列、又は１、２、３、４、若しくは５つのアミノ酸残基においてＣＤＲ３とは異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、但しフレームワーク領域のそれぞれは、図３に示すように、配列番号２７〜３４のうちのいずれか１つのフレームワークアミノ酸配列と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００％のアミノ酸同一性を有する。好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、同一の配列番号に由来する。より好ましくは、フレームワーク領域は、相補性決定領域と同一の配列番号に由来する。換言すれば、この態様では、本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）に結合する能力を有する抗原結合タンパク質、好ましくは単一ドメイン抗体（ＳＤＡ）であって、配列番号３０、２７、２８、２９、３１、３２、３３、又は３４からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である抗原結合タンパク質に関する。
好ましくは、Ｉｇに結合する能力を有する抗原結合タンパク質は、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、及び３４からなる群から選択される配列と、７０％を上回る、例えば少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９を上回り、又は１００％でさえある全体的な配列同一性を、そのような好ましい順序で有する。好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の配列同一性は、少なくとも７５％である。
従って、この実施形態の好ましい形態は、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、及び３４からなる群から選択される配列と、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である、本発明によるＩｇに結合する能力を有する抗原結合タンパク質に関する。
より好ましくは、Ｉｇに結合する能力を有するＳＤＡは、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、又は３４の群から選択される配列と、７０％を上回る、例えば下記の好ましい順序で７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９を上回る、又は１００％でさえある全体的な相同性レベルを有し、但し、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の同一性のレベルは、下記の好ましい順序で７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９であり、又は１００％でさえある。
従って、この実施形態のより好ましい形態は、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、及び３４からなる群から選択される配列と、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性が、少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は好ましくは１００％である、本発明によるＩｇに結合する能力を有する抗原結合タンパク質に関する。
表７によれば、ＳＶＧ２３はイヌに対して特異的である一方、ＳＶＧ０３はウマに対して特異的である。
よりいっそう驚くべきことに、本発明は、幅広い範囲にわたり異種間結合を示すＩｇに結合する能力を有するＳＤＡを提供する。やはり、表７で見てわかる通り、特にＳＶＧ０６及びＳＶＧ１３は、それらが、例えばネコ、イヌ、ウマ、ヒト、及びブタのＩｇ（Ｆａｂ断片）に結合するという意味において、非常に強い異種間結合を実現する。やはり表７に従えば、特にＳＶＧ２４は、それがイヌ及びウマの両方のＩｇ（Ｆｃ断片）と結合するという意味において、非常に強い異種間結合を実現する。
従って、この実施形態のよりいっそう好ましい形態は、配列番号２７、３０、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列と、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である、本発明によるＩｇに結合する能力を有する抗原結合タンパク質に関する。
この実施形態のなおもよりいっそう好ましい形態は、配列番号２７、３０、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列と、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は好ましくは１００％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性が、少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は好ましくは１００％である、本発明によるＩｇに結合する能力を有する抗原結合タンパク質に関する。
従って、本発明の実施形態の別のより好ましい形態は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質、及び血清タンパク質に結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含み、但し前記血清タンパク質がＩｇであり、Ｉｇに結合する能力を有する前記少なくとも１つの抗原結合タンパク質が、好ましくは上記参照の本発明による抗原結合タンパク質である、ポリペプチドコンストラクト（又は融合タンパク質）に関する。
本発明によるポリペプチドコンストラクト内の様々な抗原結合タンパク質の順序（ポリペプチドコンストラクトのＮ末端及びＣ末端に対するその場所）は変化し得ることが一般的に言えることに留意すべきである。これは、ヒンジ部（複数可）が、非構造化された、可撓性の立体構造を採るという事実に起因する；その主要な機能は、様々な抗原結合タンパク質に結びつくことである。
上記で示唆したように、１つの態様では、本発明は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質、及び血清タンパク質に結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含むポリペプチドコンストラクト（又は融合タンパク質）に関する。よりいっそう驚くべきことに、予期せぬ相乗的効果が、ＴｅＮＴに結合する能力を有する２つ又はそれ超のＳＤＡを含む、本発明によるポリペプチドコンストラクトについて判明した。二価のコンストラクトは、マウス毒素中和テストにおいて、例えば２つの単価コンストラクトの混合物よりもいっそう強いレベルのＴｅＮＴに対する結合を実現する。この効果は、ポリペプチドコンストラクトが、ＴｅＮＴの異なるエピトープに結合する、ＴｅＮＴに結合する能力を有するＳＤＡを２つ又はそれ超含むとき、よりいっそう有意である。これは、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する様々なＳＤＡのエピトープ結合特性について、その概要を示す表１５から見て取ることができる。
表１２からすぐに明らかなように、ＴｅＮＴに結合する能力を有するＳＤＡについて５つの異なる選択肢を特定した：選択肢Ａ；ＳＶＴ０２、選択肢Ｂ；ＳＶＴ０３、選択肢Ｃ；ＳＶＴ１５、選択肢Ｄ；ＳＶＴ０６／０８、及び選択肢Ｅ；ＳＶＴ１３／１６／２２／３４。
例えば、２つのＳＤＡ：（ｉ）ＴｅＮＴに結合する能力を有し、及び配列番号１７に基づくアミノ酸配列を有するＳＤＡ、並びに（ｉｉ）ＴｅＮＴに結合する能力を有し、及び配列番号１５に基づくアミノ酸配列を有するＳＤＡを含むポリペプチドコンストラクトは、強い相乗的効果をもたらすことが見出された。そのようなコンストラクトのＴｅＮＴ中和能力は、単一のＳＶＴ−０６、及びＳＶＴ−１６ ＳＤＡの中和能力よりも有意に強い（表１９及び表２０、実施例１７を参照）。
このような理由により、よりいっそう好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドコンストラクトは、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも２つの抗原結合タンパク質を含む。好ましくは、ＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも２つの抗原結合タンパク質のそれぞれは、選択肢Ａ；配列番号２４、又は選択肢Ｂ；配列番号２５、又は選択肢Ｃ；配列番号２０、又は選択肢Ｄ；配列番号１７若しくは１９、又は選択肢Ｅ；配列番号２２、１５、２３、若しくは１４から選択される配列と、少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有するが、但し少なくとも２つのＳＤＡは同一の選択肢に由来する配列を含まず、並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性は少なくとも７５％である。従って、換言すれば、ＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも２つの抗原結合タンパク質のそれぞれは、
（ｉ）配列番号２４；
（ｉｉ）配列番号２５；
（ｉｉｉ）配列番号２０；
（ｉｖ）配列番号１７、又は配列番号１９；及び
（ｖ）配列番号２２、配列番号１５、配列番号２３、又は配列番号１４；
からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、
但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である。
本発明によるポリペプチドコンストラクトは、好ましくは２、３、又は４つの本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する２、３、又は４つの抗原結合タンパク質、より好ましくは２又は３つ、最も好ましくはＴｅＮＴに結合する能力を有する２つの抗原結合タンパク質を含む。好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドコンストラクトは、ＴｅＮＴに結合する能力を有する２つの抗原結合タンパク質を含み、並びに配列：
（ｉ）配列番号１５、及び配列番号１７；
（ｉｉ）配列番号２４、及び配列番号１７；
（ｉｉｉ）配列番号２０、及び配列番号１７；
（ｉｖ）配列番号１５、及び配列番号２４；又は
（ｖ）配列番号２４、及び配列番号２０；
と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である。
本発明によるポリペプチドコンストラクトは、好ましくは血清タンパク質に結合する能力を有する１つの抗原結合タンパク質を含む。
単なる例として：本発明によるそのようなポリペプチドコンストラクトは、例えば、ＴｅＮＴに結合する能力を有するＳＤＡを含むことができ、選択肢Ｃ；配列番号２０と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有し、またＴｅＮＴに結合する能力を有するＳＤＡは、選択肢Ｄ；配列番号１７と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有する。
好ましくは、そのようなコンストラクトのＴｅＮＴに結合する能力を有する抗原結合タンパク質は、選択肢Ａ；配列番号２４、又は選択肢Ｂ；配列番号２５、又は選択肢Ｃ；配列番号２０、又は選択肢Ｄ；配列番号１７若しくは１９、又は選択肢Ｅ；配列番号２２、１５、２３、若しくは１４から選択される配列と、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は好ましくは１００％の全体的なアミノ酸配列同一性を有する。
より好ましくは、そのようなコンストラクトの抗原結合タンパク質は、選択肢Ａ；配列番号２４、又は選択肢Ｂ；配列番号２５、又は選択肢Ｃ；配列番号２０、又は選択肢Ｄ；配列番号１７若しくは１９、又は選択肢Ｅ；配列番号２２、１５、２３、若しくは１４から選択される配列と、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は好ましくは１００％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、そしてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列同一性は、少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は好ましくは１００％である。
より好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドコンストラクトは、配列番号１５に示すような配列を有する抗原結合タンパク質、配列番号１７に示すような配列を有する抗原結合タンパク質、及び配列番号４０に示すような配列を有する抗原結合タンパク質を含む。より好ましくは、ポリペプチドコンストラクトは、Ｎ末端−配列番号１７−配列番号１５−配列番号４０−Ｃ末端という特定の順番で、配列番号１７に示すような配列を有するＳＤＡ（ＳＶＴ−０６）、配列番号１５に示すような配列を有するＳＤＡ（ＳＶＴ１６）、及び配列番号４０に示すような配列を有するＳＤＡ（ＳＶＡ１２）を含む。なおいっそうより好ましくは、ポリペプチドコンストラクトは、配列番号５１、７７、若しくは７８、好ましくは５１に示すようなアミノ酸配列、又は配列番号５１、７７、又は７８、好ましくは５１と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の配列同一性が、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は好ましくは１００％である。ポリペプチドコンストラクトは、例えば、Ｈｉｓ６タグを除去することにより、及び／又は配列番号５１、７７、若しくは７８、好ましくは５１に示すようなリンカー配列を変化させ、若しくは交換することにより、変化させることができる。
極めて好ましい実施形態では、ポリペプチドコンストラクトは、配列番号５１に示すようなアミノ酸配列、又は配列番号５１と、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、なおいっそうより好ましくは９５％、なおいっそうより好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の配列同一性が、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、なおいっそうより好ましくは９５％、なおいっそうより好ましくは９８％、最も好ましくは１００％である。ポリペプチドコンストラクトは、例えば、Ｈｉｓ６タグを除去することにより、及び／又は配列番号５１に示すようなリンカー配列を変化させ、若しくは交換することにより変化させることができる。
極めて好ましい実施形態では、ポリペプチドコンストラクトは、配列番号７７に示すようなアミノ酸配列、又は配列番号７７と、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、なおいっそうより好ましくは９５％、なおいっそうより好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の配列同一性が、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、なおいっそうより好ましくは９５％、なおいっそうより好ましくは９８％、最も好ましくは１００％である。ポリペプチドコンストラクトは、例えば、Ｈｉｓ６タグを除去することにより、及び／又は配列番号７７に示すようなリンカー配列を変化させ、若しくは交換することにより、変化させることができる。
極めて好ましい実施形態では、ポリペプチドコンストラクトは、配列番号７８に示すようなアミノ酸配列、又は配列番号７８と、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、なおいっそうより好ましくは９５％、なおいっそうより好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の配列同一性が、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、なおいっそうより好ましくは９５％、なおいっそうより好ましくは９８％、最も好ましくは１００％である。ポリペプチドコンストラクトは、例えばＨｉｓ６タグを除去することにより、及び／又は配列番号７８に示すようなリンカー配列を変化させ、若しくは交換することにより変化させることができる。
最も好ましい形態では、本発明によるポリペプチドコンストラクトは、配列番号５１、４７、４８、５２、５３、６１、６２、４９、５０、７７、又は７８に示すような、好ましくは配列番号５１、４７、４８、５２、５３、６１、６２、４９、７７、又は７８に示すような、より好ましくは配列番号５１、４７、４８、５２、５３、６１、６２、又は４９に示すような、最も好ましくは配列番号５１に示すような配列を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の配列同一性が、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は好ましくは１００％である。
本発明による異なるＳＤＡの組み合わせが、共に混合したとき、マウス破傷風毒素中和テスト（ＴＮＴ）においてより強い毒素中和効果を示すということも、驚くべきことに認められた。これを実施例セクションの表２１〜表２３に示す。表２１及び表２４は、テストした様々な組み合わせを示す。表２４は、単一のＳＤＡであるＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６は、マウスを対象に所定の希釈において５０％の保護を実現する一方、ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、とＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６との組み合わせは、マウスを対象に同一の希釈において、１００％の保護を実現することを示す。
上記のように、本発明によるポリペプチドコンストラクトにおける様々なＳＤＡは、好ましくはリンカーペプチドを通じて相互に結びついている。リンカーペプチドは、ポリペプチドドメインを物理的に結びつけるのに一般的に使用されるアミノ酸の配列である。
そのようなリンカーは、当業者にとって公知の任意のリンカーであり得る。例えば、リンカーは、原子１〜１００個の長さを有する生体適合性ポリマーであり得る。これは、例えば、ポリ−リジン、ポリ−グリシン、ポリ−グルタミン酸、ポリ−イソロイシン、ポリ−セリン、若しくはポリ−アルギニン残基として、又はその組み合わせで存在するポリマーであり得る。ほとんどのリンカーペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸グリシン及びセリンの反復モジュールから構成される。単なる例として：そのようなリンカーは、例えば下記の配列を有する可能性がある：Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ３−Ｓｅｒ、又は（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ、但しｎは、２、３、４、５、又は６、好ましくは４、５、又は６である。
好ましくは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒの３つの連続した繰り返しから構成される１５個のアミノ酸（Ｇ４Ｓ）３リンカーが使用される。このリンカーは、単鎖のＦｖの製造で最初に使用されたが［２７］、ＶＨＨの融合でも多くの場合使用されている［２８］。異なる抗原部位に独立的に結合するのを容易にする可撓性のリンカーである。このリンカーペプチドは、当技術分野において十分に特徴づけがなされており（例えば、抗体単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ドメインの文脈において）、また非構造化された可撓性の立体構造を採ることが明らかにされている。さらに、このリンカーペプチドは、それが結びつくドメインのアセンブリ及び結合活性を妨害しない（Ｆｒｅｕｎｄ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ ３２０：９７（１９９３））。好適なヒンジのその他の例は、とりわけ欧州特許第２６５５６２４号に提示されている。
タンパク質ドメイン融合用のその他のより硬質なリンカーも公知である。Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１９８８；８５：５８７９〜８３、［２８］Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｊ，ｅｔ ａｌ．、ＰＬｏＳ ＯＮＥ．２０１２；７：ｅ２９９４１、［２９］Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ Ｊ，ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２０１０；７８：７５６〜６３、［３０］Ｖａｎｃｅ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１３；２８８：３６５３８〜４７、［３１］Ｋｌｅｉｎ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１４；２７：３２５〜３０、Ｔｒｉｎｈ Ｒ，ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；４０：７１７−２２。
実施例セクション（下記参照）は、本発明で使用されるリンカーの例を示す。
さらなる態様では、本発明は、本発明による抗原結合タンパク質をコードする、又は本発明によるポリペプチドコンストラクトをコードするＤＮＡ断片に関する。そのようなＤＮＡ断片は、ＳＤＡ又はポリペプチドコンストラクトをコードする遺伝情報を含む。
別の態様では、本発明は、本発明による抗原結合タンパク質、又は本明細書において上記定義の本発明によるポリペプチドコンストラクトをコードするＤＮＡ断片を含む核酸に関する。本発明による好ましい核酸は、核酸コンストラクト、例えばプラスミド等であり、ＤＮＡ断片が、プロモーターと、及び任意選択でその他の調節エレメント、例えばターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、分泌等のためのシグナル配列等と作動可能にリンクしている。そのような核酸コンストラクトは、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７） ａｎｄ ｉｎ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）等に記載されているように、目的とする抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ＤＮＡ断片）を、好適な宿主細胞内で発現させる組換え技術を使用して、本発明の抗原結合タンパク質又はポリペプチドコンストラクトを製造するのに特に有用である。本明細書で使用する場合、用語「作動可能にリンクしている」とは、機能的に関連しているポリヌクレオチドエレメントの結合を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的に関連して配置されるとき、「作動可能にリンクしている」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響を及ぼす場合には、コーディング配列と作動可能にリンクしている。「作動可能にリンクしている」とは、リンクするＤＮＡ配列同士が、一般的に連続的であり、また２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、連続的であり、且つリーディングフレーム内にあることを意味する。
好適なプロモーターは、宿主細胞内で認識されるプロモーターであり、そして当該宿主細胞内で、それがコントロールする遺伝情報の発現を推進する。好適なプロモーター／宿主細胞の組み合わせは、当技術分野において数十年にわたりすでに公知である。
そのような核酸は、好適な宿主細胞中に挿入可能であり、好適なプロモーターのコントロール下での抗原結合タンパク質又はポリペプチドコンストラクトの発現を可能にする。
本発明によるＳＤＡのいずれか、又は本発明によるポリペプチドコンストラクトのいずれかをコードする核酸を含むＤＮＡ断片の発現は、原核生物及び真核生物の宿主細胞において実施可能である。これらすべての宿主細胞内の発現系は、当技術分野において数十年にわたり公知である。
非常に多くの発現系について記載する古典的な教科書は、Ｇｅｒｄ Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ（編）による“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｎｏｖｅｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ”。ＩＳＢＮ：９７８−３−５２７−３１０３６−４、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００４、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌである。
昆虫細胞において異種タンパク質を発現するための方法の概要は、“Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ”、（Ｍｏｎｉｑｕｅ Ｍ．ｖａｎ Ｏｅｒｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ １０７、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｊｕｌｙ ２０１１、Ｐａｇｅｓ Ｓ３〜Ｓ１５）で得られる。下等真核生物の宿主、例えば糸状菌及び酵母菌等においてラクダ類ＳＤＡを発現させるための具体的な方法は、欧州特許第０６９８０９７号においてとりわけ提示されている。さらに、実施例セクション、より詳細には実施例６及び１４（下記参照）は、酵母菌におけるＳＤＡの発現の詳細な例を提供する。
従って、さらなる態様では、本発明は、上記定義の核酸を含む宿主細胞に関する。好ましくは、宿主細胞は、本発明による抗原結合タンパク質、又は本発明によるポリペプチドコンストラクトを製造するための宿主細胞である。
宿主細胞は、例えばＣＨＯ−細胞、ＢＨＫ−細胞、ヒト細胞株（ＨｅＬａ、ＣＯＳ、及びＰＥＲ．Ｃ６を含む）、Ｓｆ９細胞、及びＳｆ＋細胞を含む、例えば原核生物の宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、又は（培養された）哺乳動物、植物、昆虫、真菌、又は酵母菌の宿主細胞等を含む、本発明の抗原結合タンパク質を産生する能力を有する任意の宿主細胞であり得る。しかしながら、本発明の抗原結合タンパク質を製造するための好ましい宿主細胞は、真核生物の微生物、例えば酵母菌や糸状菌等の細胞である。好ましい酵母菌宿主細胞として、例えば例えばサッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、及びクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。本発明の抗原結合タンパク質を製造するための好ましい菌株、コンストラクト、及び発酵条件は、ｖａｎ ｄｅ Ｌａａｒらにより記載されている（２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．９６、Ｎｏ．３：４８３〜４９４）。例えば、抗原結合タンパク質の製造は、１０〜１０，０００リットルのワーキングボリュームを有する標準的なバイオリアクター内で実施可能である。
別の態様では、本発明は、本発明による抗原結合タンパク質又は本発明によるポリペプチドコンストラクトを製造するための方法であって、ａ）抗原結合タンパク質又はポリペプチドコンストラクトの発現を可能にする条件下で、本発明による抗原結合タンパク質又は本発明によるポリペプチドコンストラクトを含む宿主細胞を培養するステップと、任意選択でｂ）宿主細胞及び培養培地のうちの少なくとも１つから、抗原結合タンパク質又はポリペプチドコンストラクトを回収、採取、又は精製するステップとを含む方法に関する。好適な条件は、好適な培地の使用、好適な食物源及び／又は好適な栄養分の存在、好適な温度、及び任意選択で好適な誘発因子又は化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターのコントロール下に置かれているとき）を含み得る；そのすべては、当業者により選択され得る。そのような条件において、本発明のアミノ酸配列は、構成的な様式において、一時的な方法において、又は好適に誘発されたときに限り発現され得る。本発明の抗原結合タンパク質は、次に、それ自体が公知であるタンパク質の単離及び／又は精製技術、例えば（調製的）クロマトグラフィー及び／又は電気泳動技術、示差沈殿技術、アフィニティー技術（例えば、本発明のアミノ酸配列と融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を使用して）、及び／又は調製的免疫学的技術（すなわち、単離の対象である抗原結合タンパク質に対する抗体を使用して）等を使用して、宿主細胞／宿主微生物から、及び／又は前記宿主細胞若しくは宿主微生物を培養した培地から単離され得る。一実施形態では、産生され、そして任意選択で回収された抗原結合タンパク質又はポリペプチドコンストラクトは、薬学的に許容できる担体とさらに混合される。
別の態様では、本発明は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質、及び／又は本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含む、本発明による少なくとも１つのポリペプチドコンストラクト、及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物に関する。さらに好ましい実施形態では、医薬組成物は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも２つの抗原結合タンパク質、及び／又は本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも２つの抗原結合タンパク質を含む、本発明による少なくとも１つのポリペプチドコンストラクトを含む。
薬学的に許容できる担体は、本明細書で使用する場合、できる限り単純な、例えば滅菌水、生理的食塩水、又はバッファー、例えば生理学的イオン強度及び／又は浸透圧での緩衝化された水性溶液（例えばＰＢＳ等）であり得る。
医薬の製剤化、投与の方法、及び薬学的に許容できる添加物の使用は公知であり、また当技術分野において慣例的であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００５、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに記載されている。本発明による医薬組成物及び医薬は、好ましくは静脈内、又は皮下、又は筋肉内投与に適するように製剤化されるが、但しその他の投与経路、例えば注射による、例えば粘膜投与、或いは皮内（intradermal）及び／又は皮内（intracutaneous）投与等が想定可能である。
そのような組成物、並びに本発明による抗原結合タンパク質、及び／又は本発明によるポリペプチドコンストラクトは、破傷風菌感染後の臨床疾患を処置又は予防における使用に成功裏に使用可能である。
従って、さらなる態様では、本発明は、医薬としての使用のための本発明による抗原結合タンパク質、又は本発明によるポリペプチドコンストラクトに関する。
さらなる態様では、本発明は、破傷風菌感染後の疾患の予防又は処置のける使用のための、本発明による抗原結合タンパク質、及び／又は本発明によるポリペプチドコンストラクト、及び／又は本発明による医薬組成物に関する。換言すれば、この態様では、本発明は、破傷風菌感染後の疾患について、その予防又は処置用の医薬を製造するための本発明による抗原結合タンパク質、及び／又は本発明によるポリペプチドコンストラクトの使用に関する。或いは、この態様では、本発明は、破傷風菌感染後の疾患を予防又は処置する方法であって、それを必要としている対象が、治療上十分量の本発明による抗原結合タンパク質及び／又は本発明のポリペプチドコンストラクトを投与される方法に関する。従って、この態様では、本発明による抗原結合タンパク質、ポリペプチドコンストラクト、及び／又は医薬組成物が、破傷風を予防する、又は破傷風を処置するのに使用される。
本明細書で使用する場合、用語「〜を処置する」、「処置」、又は「〜を処置すること」とは、本発明の抗原結合タンパク質、ポリペプチドコンストラクト、及び／又は医薬組成物を、破傷風を有する対象に適用又は投与することを指し、その目的は、破傷風の進行若しくは重症度、又は破傷風と関連する症状を治癒させ、部分的若しくは完全に好転させ、緩和し、良化させ、阻害し、遅延させ、抑制し、減速させ、又は停止させることである。用語「〜を処置すること」には、破傷風の少なくとも１つの副作用又は症状を低下させ又は緩和することが含まれる。１つ若しくは複数の症状又は臨床マーカーが低下する場合には、処置は一般的に「有効」である。或いは、破傷風の進行が低下又は停止する場合には、処置は「有効」である。すなわち、「処置」には、症状又はマーカーの改善に限らず、処置が存在しないときに想定される症状の進行若しくは悪化の停止、又は少なくとも遅延も含まれる。有益な又は所望の臨床結果として、検出可能であるか又は検出不能であるかを問わず、１つ又は複数の症状（複数可）の軽減、疾患の範囲の縮減、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的又は全体的を問わない）が挙げられるが、但しこれらに限定されない。破傷風の用語「処置」には、破傷風の症状又は副作用の緩和の実現も含まれる（姑息的処置を含む）。本明細書で使用する場合、用語「〜を予防する」、「予防」、又は「予防的」（予防上（prophylactic）とも呼ばれる）とは、本発明による抗原結合タンパク質、ポリペプチドコンストラクト、及び／又は医薬組成物を、破傷風を発症するリスクを有する対象に適用又は投与することを指し、将来的な破傷風疾患の１つ若しくは複数の症状又は特質について、その発現を予防し、それを緩和し、良化させ、軽減し、その進行を阻害し、その重症度を低下させ、及び／又はその罹病率を低下させることを目的とする。従って、本発明による抗原結合タンパク質、ポリペプチドコンストラクト、又は医薬組成物は、好ましくは、破傷風と関連する病理を発症するリスクを減少させることを目的として、破傷風の兆候を示さない対象及び／又は破傷風の初期の兆候のみを示す対象に投与され得る。
一実施形態では、対象は、ヒト、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト以外の哺乳動物、なおいっそうより好ましくはウマ、イヌ、ネコ、ブタ、又は反芻動物科のウシ科のメンバー（例えばウシ、ヤギ）を含む動物である。本発明による好ましい対象は、例えばノウマ（Ｅｑｕｕｓ ｆｅｒｕｓ）、アフリカノロバ（Ｅｑｕｕｓ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、イエイヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、イエネコ（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ）、ブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、ヒツジ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）、及びヤギ（Ｃａｐｒａ ａｅｇａｇｒｕｓ ｈｉｒｃｕｓ）、最も好ましくはノウマである。
本発明によるＴｅＮＴに対する抗原結合タンパク質、又はポリペプチドコンストラクトを用いた受動免疫は、少なくとも３つの異なるシナリオにおいて使用可能である。例えば、術前の標準的手技の一環としての予防的シナリオにおいて、又は受傷しており、おそらくは破傷風菌に感染したが、しかしまだ罹患していない対象における予防的シナリオにおいて。第３に、対象が破傷風に罹患している際の治療シナリオにおいて。予防処置又は治療処置に応じて、投薬量に差異が存在し、例えば後者の場合、用量は種に応じて２〜２０倍の高い。少量の抗毒素用量（例えば、１０００ＩＵ）が、創傷部位近傍に局所的に投与される場合もある。いくつかの投与経路、例えば筋肉内、皮下、静脈内、硬膜外、クモ膜下、又は髄腔内の経路等が適用可能である。破傷風毒素を効率的に中和することができる本発明による抗原結合タンパク質及び／又は本発明によるポリペプチドコンストラクトは、以下の方式で利用可能である。投与される調製物は、好ましくは、少なくとも０．０１〜０．１ＩＵ／ｍｌの血液濃度を引き起こすべきである。従って、投薬量は、好ましくは体重／血液量に基づく。
単なる例として：確立されたヒトの症例では、患者は、５００〜１０００ＩＵ／ｋｇを静脈内又は筋肉内に受けるべきである。ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＳＶＴ１６−ＳＶＡ１２（配列番号５１）の場合、これは最大０．５〜１ｍｇ／ｋｇの投薬量を引き起こす。小動物（ネコ及びイヌ）を対象として、確立された症例に対して古典的なウマ抗毒素製品を投与する場合、用量は静脈内投与で１００〜１０００ＩＵ／ｋｇである。ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＳＶＴ１６−ＳＶＡ１２の場合、これは、最大０．１〜１ｍｇ／ｋｇの投薬量を引き起こす。より大型の動物は、より小型の動物よりも比例的に少ない用量の投与を受ける。例えば、ウマは、術前処置として、７５００〜１１０００ＩＵの筋肉内又は皮下の投与、最大１００ｋｇの子ウマは、いずれかの経路を経由して３０００〜４０００ＩＵの投与を受け得る。受傷したウマ（破傷風に罹患していない）は、予防処置として、１５０００〜２００００ＩＵの筋肉内又は皮下の投与、最大１００ｋｇの子ウマは、いずれかの経路を経由して６５００〜８０００ＩＵの投与を受け得る。破傷風に罹患したウマは、１つの経路（調製物が許容する場合）を経由して、又はいくつかの経路の組み合わせを経由して、少なくとも５００００〜６００００ＩＵの投与を受けるべきである。
臨床症例では、破傷風の処置は、認められた効果に応じて毎日反復され得る。
すべての推奨投薬量は、受動防御を、少なくとも３週間の長きにわたり通常提供する。やはり、単なる例として：コンストラクトＳＶＴ０６−ＳＶＴ１６−ＳＶＡ１２（配列番号５１）の半減期は、実施例１６の図６で見てわかる通り、ブタに０．３ｍｇ／ｋｇを投与した後、２１日経過時点で、０．１マイクログラム／ｍｌの血清レベル（０．１ＩＵ超に等しい（実施例１７、表２５））がなおも検出可能であるというようなことが明らかにされた。同一のコンストラクトＳＶＴ０６−ＳＶＴ１６−ＳＶＡ１２（配列番号５１）をウマに投与したとき（０．１７ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）、２１日間経過時点で、十分に保護性のレベルである、０．４〜０．６マイクログラム／ｍｌの血清レベル（実施例２３）をもたらした。
抗毒素の量（「効力」又は「中和能力」とも呼ばれる）は、国際単位（ＩＵ）で表される。破傷風トキソイドの国際標準化における最初のマイルストーンは、１９２８年におけるウマ起源の破傷風抗毒素に対する国際標準の確立であり、それは１９６９年に置き換えられた（ＷＨＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ。Ｔｗｅｎｔｙ−ｓｅｃｏｎｄ ｒｅｐｏｒｔ。Ｇｅｎｅｖａ、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、１９７０（ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎｏ．４４４）。この調製物の入手可能性及び使用は、トキソイドについて、ヒトを対象に破傷風抗毒素を生成するその能力に関する評価を可能にし、そして抗毒素について保護的ユニットが国際単位（ＩＵ）で定義されるのを可能にした。中和能力は、例えば実施例１７に示すように決定可能である（「マウスモデルにおける破傷風毒素中和能力に関するＳＤＡの分析」）。
種に対する商業的に推奨される抗毒素投薬量は異なり、そして実験データに主に基づく。いくつかの投与経路、例えば筋肉内、皮下、静脈内、硬膜外、クモ膜下、又は髄腔内の経路等が適用可能である。本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有し、且つ破傷風毒素を効率的に中和することができる抗原結合タンパク質は、同様に利用可能である。抗毒素の用量は、好ましくは少なくとも０．０１〜０．１ＩＵ／ｍｌの血中濃度を引き起こすはずである。確立されたヒトの症例では、患者には、好ましくは５００〜１０００ＩＵ／ｋｇのウマ抗毒素が静脈内又は筋肉内に投与される。使用される調製物に応じて、最大５０００〜８０００ＩＵのヒト抗破傷風免疫グロブリンが筋肉内に投与され得る。小動物（例えば、ネコ及びイヌ等）における確立された症例に対する古典的なウマ抗毒素製品の好ましい用量は、静脈内投与で１００〜１０００ユニット／ｋｇである。より大型の動物は、より小型の動物よりも比例的に少ない用量の投与を受ける。例えば、ウマは、術前処置として７５００〜８５００ＩＵの筋肉内又は皮下の投与、最大１００ｋｇの子ウマは、いずれかの経路を経由して３０００〜４０００ＩＵの投与を受け得る。受傷したウマ（破傷風に罹患していない）は、予防処置として１５０００〜１７０００ＩＵの筋肉内又は皮下の投与、最大１００ｋｇの子ウマは、いずれかの経路を経由して６５００〜８０００ＩＵの投与を受け得る。破傷風に罹患したウマには、好ましくは任意の経路により（調製物が許容する場合）、又はいくつかの経路の組み合わせにより、少なくとも５００００ＩＵが投与される。破傷風の臨床症例では、処置は認められた効果に応じて毎日反復され得る。すべての推奨投薬量は、種及び実施した処置に応じて、受動防御を、１〜３週間の長きにわたり通常提供する。受動免疫に付加して、能動的ワクチン接種、いわゆる受動能動免疫が、好ましくは対象に投与されるべきである。これは、短期免疫（受動的）、及び長期体液性免疫（能動的）の両方を提供する。第１の免疫が減衰すると第２の免疫が出現し、従って保護されないウインドウが回避される。能動免疫は、製剤化された破傷風トキソイドを用いて達成可能である。そのような破傷風に基づくトキソイドワクチンは市販されている。トキソイドに基づくワクチンは、ＳＤＡに基づく抗毒素と同時に投与可能であり、好ましくは２１日内で反復される。
さらなる態様では、本発明は、例えば、体液中のＴｅＮＴ又は抗ＴｅＮＴ抗体を検出するための診断テストに関する。例えば、ヒト又は動物の血液中の毒素又は抗ＴｅＮＴ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出を目的とするそのような診断テストは、現在、非常に複雑で時間がかかる。これは、とりわけ、血液中でＴｅＮＴのレベルが非常に低くても毒性が高く、その結果としてそのようなテストは非常に高感度でなければならないという事実を踏まえて実施しなければならない。本発明は、ＴｅＮＴに対して非常に高い親和性（すなわち、低ＫＤ値）を示す抗原結合タンパク質をここに提供する。そのような抗原結合タンパク質に基づく診断テストは、当然ながら非常に高感度であり、従ってそのような抗原結合タンパク質は、診断テストにおける使用に非常に適する。
そのようなテストの単なる例として：当技術分野において数十年にわたり周知されている古典的サンドイッチＥＬＩＳＡテストでは、９６ウェルプレート、又はマイクロウェルプレート、ラテラルフローデバイス担体材料、又はチップさえも、本発明による１つ又は複数の抗原結合タンパク質でコーティング可能である。やはり、単なる例として、ＳＤＡ ＳＶＴ０６がコーティングステップで使用され得る。その優れた親和性特性に起因して、ＳＤＡ ＳＶＴ０６は、存在する場合には、微量のＴｅＮＴとさえも強く結合する。第２のステップでは、ＴｅＮＴの存在についてスクリーニングされる体液がウェルに添加可能である。ＴｅＮＴが存在する場合には、これはＳＤＡ ＳＶＴ０６に結合する。洗浄ステップの後、例えば、コンジュゲートしたＳＤＡ ＳＶＴ１５がウェルに添加可能である。ＴｅＮＴが体液中に存在し、従ってＳＤＡ ＳＶＴ０６に結合した場合には、コンジュゲートしたＳＤＡ ＳＶＴ１５は、結合したＴｅＮＴの別のエピトープと結合することができ、そして後続する発色ステップにおいて、発色反応が行われ、従って微量のＴｅＮＴであっても、その存在を明らかにする。
同じように、体液中でＴｅＮＴに対する抗体を検出するためのテストにおいて、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する抗原結合タンパク質が適する。そのようなテストでは、テストされる体液は、少量の毒素と混合可能である。抗ＴｅＮＴ抗体が存在する場合には、該抗体は毒素と結合する。その後（好ましくは、抗体−ＴｅＮＴ複合体の除去後）、毒素がなおも存在するか確かめるために、体液は上記サンドイッチＥＬＩＳＡの対象となり得る。存在する場合には、これは、体液には抗ＴｅＮＴ抗体が含まれないことを示す。
同じように、ＴｅＮＴ Ｌ−鎖のタンパク質分解切断活性が、ＴｅＮＴ Ｈ−鎖に結合する受容体を使用して捕捉されるＴｅＮＴの検出に使用されるテストにおいて、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有するＳＤＡが適する。現在のところ、そのような結合−切断（ＢＩＮＡＣＬＥ）アッセイ法は、開発途上にある（Ｂｅｈｒｅｎｓｄｏｒｆ−Ｎｉｃｏｌ ｅｔ ａｌ．、２０１５、ＡＬＴＥＸ ３２、１３７〜１４２）。上記記載の一価ＶＨＨは、そのようなアッセイにおける結合ドメインとして役に立つことができた。多価ＴｅＮＴ結合ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＳＶＴ１６−ＳＶＡ１２は、より高い親和性を示し、そして２つの異なるＴｅＮＴ抗原部位と結合し、それが活性なＴｅＮＴの形態とのみ結合する機会を増加させるので、そのような用途にとってよりいっそう好ましい
従って、本発明のなおも別の実施形態は、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する抗原結合タンパク質を含む診断キットに関する。そのような診断キットは、例えば本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する抗原結合タンパク質のうちの１つ又は複数を用いて事前コーティングされた９６ウェルプレート、マイクロウェルプレート、又はチップをさらに含み得る。それは、例えば、付加的又は代替的に、コンジュゲートした形態で、本発明によるＴｅＮＴに結合する能力を有する抗原結合タンパク質のうちの１つ又は複数を含み得る。そのような診断キットは、診断テストを実施するための指示書をさらに含み得る。
本発明は、加工肉、例えば細切れにされた牛肉内の特定種のアルブミンを検出するための診断キットとも関連する。例えばソーセージ中の挽肉に含まれるウマアルブミンの検出を目的とするそのような診断キットは、現在のところ、極めて複雑であり、且つ時間がかかる。本発明は、ウマアルブミンに対して高い結合能力を示す抗原結合タンパク質を、ここに提供する。従って、本発明は、アルブミンを検出する方法であって、
ｉ）好ましくは配列番号４０、３７、３８、３９、４１、及び４２からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である、血清アルブミンに結合する能力を有するＳＤＡを提供するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）のＳＤＡを、テストサンプルと接触させるステップと、
ｉｉｉ）ステップｉ）のＳＤＡと、ステップｉｉ）のサンプル中に存在するアルブミンとの間の結合の可能性を検出するステップと
を含む方法を提供する。
ステップｉ）のＳＤＡの特質及び定義は、本明細書に別途記載されている通りである。ステップｉｉ）のサンプルは、好ましくは、加工肉、より好ましくは２つ以上の種に由来する肉を含むことが疑われる加工肉を含むサンプルである。検出されるアルブミンは、好ましくはウマアルブミンである。ステップｉｉｉ）における検出は、当技術分野において公知の任意の方法、例えばＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴法、又は等温滴定熱量測定法等を使用して実施可能である。方法は、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。従って、本発明は、アルブミンを検出するためのステップｉ）のＳＤＡの使用とも関連する。
そのようなテストの単なる例として：当技術分野において数十年にわたり周知されている古典的サンドイッチＥＬＩＳＡテストでは、９６ウェルプレート、又はマイクロウェルプレート、センサー、又は例えばマイクロチップは、１つ又は複数の本発明による抗原結合タンパク質でコーティングされ得る。やはり単なる例として、ＳＤＡ ＳＶＡ１２、又はＳＶＡ１６が、コーティングステップで使用され得る。その非常に高い結合特性に起因して、これらのＳＤＡは、存在する場合には、微量であってもアルブミンを捕捉する。第２ステップでは、アルブミンの存在についてスクリーニングされる液体に溶解した細切れ肉が、ウェルに添加可能である。アルブミンが存在する場合、これは例えばＳＤＡ ＳＶＡ１２、又はＳＶＡ１６に結合する。洗浄ステップの後、コンジュゲートしたＳＤＡ ＳＶＡ０６又はＳＶＡ０７が、ウェルに添加可能である。アルブミンが体液中に存在する、従ってＳＤＡ ＳＶＡ１２、又はＳＶＡ１６に結合している場合には、コンジュゲートしたＳＤＡ ＳＶＡ０６、又はＳＶＡ０７は、アルブミンの別のエピトープと結合し、そして後続する発色ステップにおいて発色反応が行われ、従って微量のアルブミンであってもその存在を明らかにする。
本発明は、例えば、ウマモノクロナール抗体の親和性の特徴づけを明確にするためのバイオセンサープラットフォームとも関連する。そのようなプラットフォームは、センサー又はマイクロチップ上にて、例えばウマＩｇを捕捉するＳＤＡ ＳＶＧ２４Ｌを使用し得るが、その後、標的タンパク質との相互作用が分析され得る。
ＳＤＡを低濃度で使用することが極めて好ましい。このためには、毒素がその活性を発揮するのを防止するために、毒素との迅速な会合に加えて、それよりもさらに毒素との解離が十分遅延すること、及び（中毒状態の）動物において長期間再循環可能であることが好ましい（実施例１６及び２２を参照）。
Figure 2021516682
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本書類及びその特許請求の範囲では、動詞「〜を含む」及びその活用形は、その非限定的な意味合いで使用され、該単語の後の事項は、包含的であるが、しかし特に記載されない事項は除外されないことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」により要素を引用することは、文脈が唯一無二の要素が存在することを明確に要件とする場合を除き、２つ以上の要素が存在する可能性を除外しない。不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、従って「少なくとも１つ」を通常意味する。
単語「約」又は「およそ」は、数値（例えば、約１０）と関連付けて使用されるとき、該数値は、該数値よりも０．１％大きい、又は小さい所与の（１０の）数値であり得ることを好ましくは意味する。
本明細書で引用されたすべての特許及び引用文献は、本明細書により参考としてそのまま援用されている。
別途記載しない限り、本発明の実践法は、分子生物学、ウイルス学、微生物学、又は生化学の標準的従来法を採用する。そのような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４）のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＵＳＡの第１巻及び第２巻；Ｂｒｏｗｎ（１９９８）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＬａｂＦａｘ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（ＵＫ）の第Ｉ巻及びＩＩ巻；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ． Ｇａｉｔ ｅｄｉｔｏｒ）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ編）に記載されている。
下記の実施例は、説明目的に限定して提供されており、またいかなる場合においても、本発明の範囲を限定するように意図されない。
１．ラマの免疫化、及びファージディスプレイライブラリーの生成
ラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）（ｎｏ．９２３６、及び９２３７）を同一の方式で免疫化した。市販の破傷風ワクチン（既製タイプ、破傷風トキソイドに基づく）を、一次免疫化後の０、２１、及び４２日目（ＤＰＩ）において、ラマ１匹当たり１ｍｌで、右側大腿部内に、さらなるアジュバント添加を行わずに筋肉内注射した。０．５ｍｇのｃｈｒｏｍｐｕｒｅウマＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）、０．５ｍｇのｃｈｒｏｍｐｕｒｅイヌＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、０．５ｍｇのウマＡｌｂ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｌｉｍｅｒｉｃｋ、ＰＡ）、０．５ｍｇのイヌＡｌｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ社、Ｎｏｖｉ、ＭＩ）、及び８μｇの組換え破傷風毒素断片Ｃ（ｒＴＴＣ；Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からなる標的抗原混合物を調製した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ 実験では［５］、断片Ｃ（Ｈｃ又はＴＴＣとも命名される）が、ニューロンに対する破傷風毒素の結合に関与していることが示唆された。抗原混合物を、Ｓｔｉｍｕｎｅアジュバント（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて乳化し、そして０、及び２１ＤＰＩにおいて、各ラマの左側大腿部内に筋肉内注射した。ＩＭＳ１３１２アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ社，Ｆｒａｎｃｅ）を用いてアジュバント化された同一の抗原混合物を、４２ＤＰＩにおいて各ラマの左側大腿部内に筋肉内注射した。ヘパリン処理された血液サンプル（１５０ｍｌ）を２８及び４９ＤＰＩにおいて取得し、そして末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を速やかに単離した。血清調製用の血液サンプルを、０、２８、及び４９ＤＰＩにおいて取得した。
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してＰＢＬから抽出し、そしてｄＴ１８プライミング、及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用するｃＤＮＡの調製で使用した。プライマーのＢＯＬＩ１９２（ＡＡＣＡＧＴＴＡＡＧ ＣＴＴＣＣＧＣＴＴＧ ＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣ ＴＴＣＡＴＴＣＧＴＴ ＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡ ＣＧＧＴ、配列番号１）、ｌａｍ０７（ＡＡＣＡＧＴＴＡＡＧ ＣＴＴＣＣＧＣＴＴＧ ＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡ ＧＣＴＧＧＧＧＴＣＴ ＴＣＧＣＴＧＴＧＧＴ ＧＣＧ、配列番号２）、及びプライマーｌａｍ０８（ＡＡＣＡＧＴＴＡＡＧ ＣＴＴＣＣＧＣＴＴＧ ＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧ ＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴ ＧＧＴＧＴＣＴＴＧＧ ＧＴＴ、配列番号３）及びＢＯＬＩ４０１（ＡＡＣＡＧＴＴＡＡＧ ＣＴＴＣＣＧＣＴＴＧ ＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧ ＴＴＧＴＧＧＴＴＧＴ ＧＧＴＡＴＣＴＴＧＧ ＧＴＴ、配列番号４）の混合物を使用して、ＳＤＡに対して特異的なＰＣＲを３回実施し、３回すべてプライマーＶＨ２Ｂ（配列番号６４）と組み合わせた［４５］。得られたＰＣＲ断片をＰｓｔＩ及びＮｏｔＩを用いて消化し、そしてファージディスプレイプラスミドｐＲＬ１４４に挿入した［１９］。ライゲーションを使用して、エレクトロポレーションによる大腸菌ＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ社、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）の形質変換を行い、１２個のライブラリーが得られた（ｐＡＬ８０８〜ｐＡＬ８１９と命名）。
２．ｃＡｂ−ＴＴ２単一ドメイン抗体の酵母菌内産生
破傷風ホロ毒素に結合するが、しかしｒＴＴＣには結合しない単一ドメイン抗体（ＳＤＡ）ｃＡｂ−ＴＴ２［４６］を、後続するＴｅＮＴ結合ＳＤＡのファージディスプレイ選択で使用するために、パン酵母菌において産生させた。酵母菌インベルターゼシグナル配列及び５’−リーダーに対する融合体としてこのＳＤＡをコードする合成遺伝子を、ＳａｃＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片として生成した。その合成遺伝子をプラスミドｐＲＬ１８８内に挿入すると、単一のシステイン及びｈｉｓ６−タグを含有するラマ長鎖ヒンジ領域とリンクしたＳＤＡの生成を引き起こした［２］。そのような発現フォーマットは、ＳＤＡの固体表面への固定化に特に適する［３］。ｃＡｂ−ＴＴ２ ＳＤＡを、パン酵母菌菌株ＳＵ５１内、１５０ｍｌスケールにおいて産生させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製し、そして単離されたＳＤＡの一部を、以前記載された通りにビオチン化した［３］。
３．ＴｅＮＴ結合ＳＤＡのファージディスプレイ選択
下記の試薬を、ファージディスプレイ選択で使用した。酵母菌内産生ｃＡｂ−ＴＴ２は、これまでの実施例に記載されている。破傷風毒素中和ｍＡｂ ＴＴ１０［４７、４８］を、国立生物製品基準規制機構（ＮＩＢＳＣ；Ｐｏｔｔｅｒｓ Ｂａｒ、英国）から購入した。真正破傷風ホロ毒素（ＴｅＮＴ）を、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＣＡ）から購入し、ｒＴＴＣは実施例１に記載されている。
１２個のライブラリーを、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を使用するファージレスキューで使用し、そしてファージディスプレイ選択を以前記載された通りに実施した［４９］。しかしながら、下記のように改変された手順を使用した：
ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅではなく、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを選択で使用した［５０］
約１０１０形質導入ユニット（ＴＵ）のより少量のファージを各パニングで使用した
トリプシンをファージの溶出で使用した［７４］
３つのアイソタイプ（ヒンジプライマー）のファージライブラリーをプールした。
さらに、異なるパニング手順をモニタリングし、そしてどのパニングテストをさらに使用すべきか決定するために、同時ファージＥＬＩＳＡを用いて選択を実施した。
直接コーティングされたＴｅＮＴ又はｒＴＴＣに結合するＳＤＡの２ラウンドのファージディスプレイ選択において、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングした。
ｃＡｂ−ＴＴ２ ＳＤＡを用いて、又はｍＡｂ ＴＴ１０を用いて捕捉されたＴｅＮＴにおいて、さらなる選択を実施した。時に、第１のラウンドと比較して、異なる抗原を第２のファージディスプレイラウンドにおいて使用した。
１０倍希釈された大腸菌培養物上清中に存在する可溶性ＳＤＡが、直接コーティングされた抗原に結合するのを検出するために、ＳＤＡ検出用としてマウスｍＡｂ抗ｍｙｃタグＰＯ−コンジュゲートを利用するＥＬＩＳＡを、以前記載された通りに実施した［１９］。しかしながら、ＴｅＮＴ及びｒＴＴＣは、ＰＢＳバッファーを使用して１μｇ／ｍｌでコーティングされた一方、ｃＡｂ−ＴＴ２は、５０ｍＭの炭酸／重炭酸バッファー（ｐＨ９．６）中、１μｇ／ｍｌでコーティングされた。酵母菌中でも最終的に発現したＳＤＡクローンの吸収値のみを報告する。
個々のＴｅＮＴバインダーを同定するために、８個の９６ウェルプレートに、第２のパニングラウンドから得られた個々のクローンをイノキュレーションし、そして以前記載された通りに、９６ウェルプレート内で、可溶性ＳＤＡの産生について誘発した［４９］。異なる抗原、及び可溶性ＳＤＡを含有する大腸菌上清の１０倍希釈物を、ＥＬＩＳＡで使用した。すべてのクローンを、直接コーティングされたＴｅＮＴ及びｒＴＴＣ上、ｃＡｂ−ＴＴ２捕捉ＴｅＮＴ上で、ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングした。
さらに、毒素−受容体相互作用を阻害するＳＤＡを検出するために、すべてのクローンをＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ結合阻害ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。ＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ阻害ＥＬＩＳＡは、例えばビオチン化効率、エピトープタグのアクセス性、及びコーティング手順に起因する変性に依存しないので、異なるＳＤＡの毒素結合及びニューロン結合ブロッキング能力を比較するのに最も適する。
ＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ阻害ＥＬＩＳＡを、［８］に基づき実施した。９６ウェルのポリスチレンプレートを、メタノール中、１０μｇ／ｍｌのウシ脳由来のＧＴ１ｂガングリオシド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて、１００μｌ／ウェルにおいて、室温（ＲＴ）、オーバーナイトでインキュベーションすることによりコーティングした。オーバーナイトインキュベーション期間中に、メタノールは完全に蒸発する。後続するすべてのインキュベーションを、ＰＢＳを用いてプレートをマニュアル洗浄した後、０．５％のＢＳＡ、及び０．０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳ中、ＲＴにて、１時間実施した。１μｇ／ｍｌのＴｅＮＴ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、ＳＤＡ、大腸菌培養物上清又はｍＡｂと共に、分離型９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレート中、１００μｌ／ウェルで事前インキュベートし、そしてＲＴで１時間インキュベートした。次にこれらのサンプル９０μｌを、ＧＴ１ｂ−コーティングプレートに移し、そしてＲＴで１時間インキュベートした。プレートを、次に１００μｌ／ウェル、１０００倍希釈されたラマ９２３７血清（４９ＤＰＩ）と共にインキュベーションした。結合したラマＩｇＧを、ヤギ抗ラマＩｇＧ−ＰＯコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）を用いて検出した。結合したＰＯを、ＴＭＢを用いて染色することにより検出した。硫酸を用いて反応を停止し、そして４５０ｎｍにおける吸収を、分光光度計を用いて測定した。
ＳＤＡ（ストリーキングにより精製、単一コロニーを採取）配列を決定するために、プライマーとしてＭＰＥ２５（ＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧＧＧＧＴＴＴＴＧＣＴＡ、配列番号６）、及びＭＰＥ２６（ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ、配列番号７）を用いて、大腸菌ＴＧ１細胞上でＰＣＲにより、配列分析用のＤＮＡ断片を取得した。配列分析を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１サイクルシークエンシングキット、及び自動化されたＡＢＩ３１３０ ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｎｉｅｕｗｅｒｋｅｒｋ ａ／ｄ ＩＪｓｓｅｌ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して実施した。精製されたＰＣＲ断片を、プライマーのＭＰＥ２５及びＲｅｖＳｅｑ（ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ、配列番号８）と組み合わせてテンプレートとして使用した。すべての配列を２つの反応から決定した。すべての配列解釈を、翻訳後のＳＤＡ配列に基づき実施した。ＳＤＡクローニングで使用されるＰｓｔＩ部位は、成熟したＳＤＡのアミノ酸４及び５と重複する。従って、使用されるファージディスプレイベクターによりコードされる配列ＱＶＱ（アミノ酸１〜３）が、ＳＤＡのＮ末端に付加された。配列ＶＴＶＳＳで終わる成熟したＳＤＡコード領域のＩＭＧＴナンバリングシステム［５１］に基づき、ＳＤＡをアライメントした。ＳＤＡを以前実施した通りにサブファミリーに分類した［５２］。サブファミリーＣは、ＳＤＡに典型的なＦＲ２残基を欠いている従来型ＳＤＡを表す。そのようなＳＤＡは、多くの場合低レベルで生成される。サブファミリー１、２、及び３と命名されたＳＤＡは、３つの真正ＳＤＡサブファミリーを表す。サブファミリーＸは、分類不可能なＳＤＡを表す。ＳＤＡは、同一のＣＤＲ３長さ、及びＣＤＲ３において少なくとも６５％の配列同一性を有することに基づき、ＣＤＲ３群としても分類された。ＳＤＡ配列は、潜在的Ｎ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、式中Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸である）の存在についても検査された。酵母菌発現用として選択されたクローンは、そのようなＮ−グリコシル化部位を欠いた。
表２は、「ＳＶＴ」で始まり、その後に番号が続く１４個のＴｅＮＴ結合ＳＤＡクローンを示す。ｃＡｂ−ＴＴ２、又はｍＡｂ ＴＴ１０捕捉ＴｅＮＴ上でそれぞれ選択された２つのＳＤＡ、ＳＶＴ０２、及びＳＶＴ０３は、確かにｃＡｂ−ＴＴ２捕捉ＴｅＮＴに結合したが、しかし直接コーティングされたＴｅＮＴ又はｒＴＴＣには結合せず、また測定された吸収は、ＳＤＡを含有しない大腸菌培養物上清について観測された吸収と同等であったので、ＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ相互作用を阻害しなかった（表２）。これらのＳＤＡは、立体構造がポリスチレンに対する受動吸着により影響を受けるＴｅＮＴエピトープにおそらくは結合し、その他の抗原について以前観測されたように、抗原性の低下を引き起こす［３、５３］。さらなる１２個のＳＤＡは、そのうちの１１個のＳＤＡが直接コーティングされたＴｅＮＴ又はｒＴＴＣ上で選択されたが、直接コーティングされたＴｅＮＴ及び捕捉されたＴｅＮＴの両方に、直接コーティングされたｒＴＴＣに確かに結合し、またＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ相互作用を阻害した（表２）。３つのＳＤＡ、ＳＶＴ０５、ＳＶＴ０６、及びＳＶＴ０８に限り、吸収値がＳＤＡを含まないサンプル中の約１．３から０．７２〜０．９９まで減少したので、ＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ相互作用の部分的阻害を示す。
１４個のＳＶＴ ＳＤＡの配列は、文字Ａ〜Ｇにより表される７つのＣＤＲ３群を形成する（図１）。同一のＣＤＲ３群に由来するクローンは、ＥＬＩＳＡにおいて、一般的に類似した挙動を示す（表２）。ＣＤＲ３群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＧに由来する１２個のクローンは、いずれもＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ相互作用を阻害し、また直接コーティングされたＴｅＮＴ及びｒＴＴＣ、並びにｃＡｂ−ＴＴ２捕捉ＴｅＮＴに結合する。ＣＤＲ３群のＥ及びＦを形成するクローンＳＶＴ０２及びＳＶＴ０３は、ＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ相互作用を阻害せず、また直接コーティングされたＴｅＮＴにもｒＴＴＣにも結合しないが、但しそれらはｃＡｂ−ＴＴ２捕捉ＴｅＮＴに確かに結合する。いくつかの配列の顕著な特質が、ＣＤＲ３の群毎に考察される様々なＳＤＡについて観測されている。ＣＤＲ３群のＡに由来する４つのＳＤＡクローン、及びＣＤＲ３群のＣを形成する２つのＳＤＡクローンは、酵母菌において産生レベルが低いことと関連するＬｅｕをＩＭＧＴ位置１２３に含有する［１１］。ＣＤＲ３群のＣに由来する２つのＳＤＡクローンは、酵母菌においてＳＤＡ産生レベルが低下することと関連するＦＲ４をコードするＪ７セグメントに典型的であるＬｙｓ１２０、及びＩｌｅ１２２も有する［１１］。これは、これらのＳＤＡは、Ｋ１２０Ｑ、Ｉ１２２Ｔ、及びＬ１２３Ｑの突然変異を伴って、より高度に産生されることを示唆する。
ＣＤＲ３群のＢに由来する３つのＳＤＡクローンは、いずれも位置５０ａ〜５０ｄにおいてアミノ酸配列ＶＥＤＧのまれな挿入を含有する。これは、残基Ａｒｇ５０（Ｋａｂａｔ位置４５）に隣接するＦＲ２領域の中央に位置し、ＳＤＡの最も典型的なアミノ酸置換としてＳＤＡ文献にしばしば記載される。従来のＳＤＡは、ＩＭＧＴ位置５０に、ＶＬドメインと疎水的接触をなすＬｅｕを通常含有する。ＳＤＡは、ＩＭＧＴ位置５０にＡｒｇをほとんどの場合有する。この置換は、従前のＶＬ界面をより親水性にする［１］。ＶＥＤＧ挿入のうちの親水性残基Ｄ（Ａｓｐ）及びＥ（Ｇｌｕ）の挿入も、ＦＲ２領域をより親水性にしている可能性が極めて高い。これらの酸性残基を理由の一部として、これらのクローンの予測された等電点（ＩＥＰ）は低い。ＩＥＰが低いのは、ＳＤＡではより高頻度で観測され、またＳＤＡの溶解度の増加と関連する［５４］。ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域が極めて長尺である点も特筆される。長尺のＣＤＲ３は、ＳＤＡでは極めて一般的に観察される［１、５２］。長尺のＣＤＲ２はそれほど一般的ではなく、体細胞性の高頻度突然変異に起因しておそらく生ずる［５５］。
ＣＤＲ３群のＤを形成するクローンＳＶＴ１３及びＳＶＴ２２は、ＩＭＧＴ位置５５にＣｙｓ、及びＣＤＲ３内に、サブファミリー３のＳＤＡに典型的であり、追加のジスルフィド結合を形成する可能性が極めて高いＣｙｓを有する［５２］。ＣＤＲ３配列は、明らかに相同的であるであるものの、ＳＶＴ１３及びＳＶＴ２２は高度に多様であり、また３２個のアミノ酸の相違を示す。
ＣＤＲ３群のＧに由来する単一クローンＳＶＴ０５は、１７個の残基からなる非常に長いＣＤＲ２（ＣＤＲ３群のＢに対する上記考察を参照）、及び低ＩＥＰを有する。
４．ＩｇＧ結合ＳＤＡのファージディスプレイ選択
ＩｇＧ結合ＳＤＡのファージディスプレイ選択は、これまでの実施例に記載したように、直接コーティングされたイヌ又はウマ由来のＩｇＧを使用して実質的に実施した。イヌ及びウマＩｇＧの両方に結合するＳＤＡを選択するために、第２ラウンドのパニングでは、同一種起源のＩｇＧについてだけでなく、その他の種のＩｇＧについても実施した。
個々のＩｇＧバインダーを同定するために、６個の９６ウェルプレートに、第２のパニングラウンドから得られた個々のクローンをイノキュレーションし、及び９６ウェルプレート内で、可溶性ＳＤＡの産生を誘発した［４９］。すべてクローンを、これまでの記載に従い、ＥＬＩＳＡにおいて、直接コーティングされた異なる種のＩｇＧ、及びＦａｂ、及びＦｃ断片に対する結合についてスクリーニングした［１９］。ウマ及びイヌのＩｇＧ抗原は、実施例１に記載されている。ウマＩｇＧ Ｆｃは、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社（Ｔｏｍｐｋｉｎｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）から、及びイヌＦａｂは、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手した。
酵母菌中でも最終的に発現したＳＤＡクローンの吸収値のみを報告する。この目的のために、イヌ及びウマの両方、及び好ましくはよりいっそう多くの種の抗原それぞれに結合するＩｇＧ結合クローンを優先的に選択した。さらに、Ｆａｂ断片に結合するクローンを優先的に選択した。ＩｇＧの半減期に関与する新生児期のＦｃ（Ｂｒａｍｂｅｌｌ）受容体との結合の妨害は、Ｆａｂ結合ＳＤＡについては予期されないこと、及び複数種を認識するので、アロタイプのＩｇＧ変動があっても、特定の個々の動物においてＩｇＧを認識できなくなり得ることはまず考えられないことから、これらのＳＤＡは治療用途に最も適する。
表３は、「ＳＶＧ」から始まり、その後に数字が続く８個のＩｇＧ結合ＳＤＡクローンを示す。ウマＩｇＧにおいてＳＤＡを含まない大腸菌培養物上清を使用したときのバックグラウンド吸収値は、０．２６であり、その他のＩｇＧサンプルよりも顕著に高い。これは、使用したペルオキシダーゼ−コンジュゲートに対するウマＩｇＧの結合を示唆し得る。ＥＬＩＳＡにおける最大吸収も、異なるＳＤＡ間で極めて可変であるが、その理由としておそらくは、コーティングに使用した抗原は純粋なタンパク質ではなく、むしろアイソタイプが異なり、可変ドメインも異なる、異なるＩｇＧからなる混合物であることが挙げられる。ＳＤＡのＳＶＧ０３及びＳＶＧ２４は、ウマ由来のＦｃ断片に結合するが、しかしイヌ又はウマ由来のＦａｂ断片には結合しない。ＳＤＡのＳＶＧ２３は、イヌＩｇＧとのみ結合する。ＳＶＧ２３は、イヌＦａｂと結合しないので、イヌＦｃとおそらく結合する。ＳＶＧ０３は、ウマ由来のＩｇＧと結合するが、しかしイヌ、ヒト、ブタ、ウシ、又はモルモット由来のＩｇＧとは結合しない。ＳＶＧ２４は、イヌ、ウマ、及びブタのＩｇＧと結合するが、しかしヒト、ウシ、及びモルモットのＩｇＧとは結合しない。従って、３つのＦｃ特異的ＳＤＡは、種特異性も有する。ＳＤＡのＳＶＧ０６、ＳＶＧ０７、ＳＶＧ１３、ＳＶＧ１８、及びＳＶＧ１９は、イヌ及びウマ由来のＦａｂ断片に結合するが、しかしウマＦｃ断片とは結合しない。それらＳＤＡは、上記６つの種すべてのＩｇＧと結合する。従って、５つのＦａｂ特異的ＳＤＡは、かなり広い種特異性も有する。
配列分析を、これまでの実施例に記載するように実施した。酵母菌内産生用に選択された８つのクローン（図２）は、いずれも異なるＣＤＲ３群に属する。３つのＳＤＡは、いずれもイヌ及びウマＩｇＧのＦａｂ断片、及びテストされた６つの種すべてのＩｇＧと結合する。３つのＳＤＡのすべて、及びＳＶＧ０６は、従来型のＳＤＡ（サブファミリーＣ）である。それらはいずれも、そのようなＳＤＡについて多くの場合観測されるＴｒｐ１１８（Ｋａｂａｔナンバリングスキームに基づく残基１０３）から親水性残基、多くの場合Ｌｙｓへの置換を欠く［５６］。ＳＶＧ１３は、位置１２０にＬｙｓ、及び位置１２３においてＬｅｕをさらに有する一方、ＳＶＧ０６は、位置１２０にＧｌｕ、及び位置１２３にＬｅｕの突然変異を有し、それらは、いずれも酵母菌内ＳＤＡ産生レベルの低下と関連する、ＦＲ４におけるＪ７セグメントの使用に典型的である［１１］。
ほとんどのＳＤＡは、ヒトＶＨ３ファミリーＶＨと類似している。しかしながら、ＳＶＧ０７は、ヒトＶＨ４ファミリーＶＨとより類似している。そのようなＳＤＡは、以前に観測されていた［５７］。参考まで、ラクダから単離された２つのＶＨ４ファミリーＳＤＡ（ｓｄＡｂ−３１及びｓｄＡｂ−３２）が、ＳＤＡアライメント（図２）に含まれている。ＳＶＧ０７のＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３のアミノ酸配列は、ｓｄＡｂ３１及び／又はｓｄＡｂ３２の配列と同一であり、そしてＩＭＧＴ位置９、１４、１６、１７、１８、２０、２２、２４、２５、３９、４２、４５、５３、５４、６８、６９、７１、７４、７７、８２、８３、８６、８７、９２、９４、及び９５においてその他のＳＤＡとは異なる。
５．Ａｌｂ結合ＳＤＡのファージディスプレイ選択
Ａｌｂ結合ＳＤＡのファージディスプレイ選択は、実施例１に記載するイヌ又はウマ由来の直接コーティングされたＡｌｂを使用して、これまでの実施例に記載するように実質的に実施した。イヌ及びウマＡｌｂの両方に結合するＳＤＡについて選択するために、第２ラウンドのパニングを、同一種起源のＡｌｂだけでなく、その他の種のＡｌｂにおいても実施した。
個々のＡｌｂバインダーを同定するために、２個の９６ウェルプレートに、第２パニングラウンドから得られた個々のクローンをイノキュレーションし、そして９６ウェルプレート内での可溶性ＳＤＡの産生について誘発した［４９］。すべてのクローンを、これまでの記載に従い、ＥＬＩＳＡにおいて、直接コーティングされたイヌ、ウマ、及びヒトのＡｌｂに対する結合についてスクリーニングした［１９］。ヒトＡｌｂは、市販の供給業者（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）から入手した。
酵母菌中でも最終的に発現したＳＤＡクローンの吸収値のみを示す。この目的のために、イヌ及びウマの両方の抗原それぞれに結合するＡｌｂ結合クローンを優先的に選択した。表４は、「ＳＶＡ」から始まり、その後に数字が続く６つのＡｌｂ結合クローンを示す。ＳＤＡのいずれもヒトＡｌｂに結合しない。すべてのＳＤＡはウマＡｌｂに結合する。ＳＤＡのＳＶＡ０７は、イヌＡｌｂに結合しない一方、ＳＤＡのＳＶＡ０２、ＳＶＡ０４、ＳＶＡ０６、ＳＶＡ１２、及びＳＶＡ１６は、イヌＡｌｂに確かに結合する。従ってイヌ及びウマＡｌｂの両方に結合する５つのＳＤＡを取得した。
配列分析を、これまでの実施例に記載するように実施した。酵母菌内産生用として選択された６つのクローン（図３）は、すべて異なるＣＤＲ３群に属する。それらは、すべてサブファミリー１の真正ＳＤＡである［５２］。それらはいずれも、特有のタンパク質配列上の特質、例えば長い挿入等、又は酵母菌中でのＳＤＡ産生の低下と関連するＦＲ４残基を欠く［１１］。
６．ファージディスプレイにより単離された新規ＳＤＡの酵母菌内産生
１４個のＳＶＴ ＳＤＡ（表２）、８個のＳＶＧ ＳＤＡ（表３）、及び６個のＳＶＡ ＳＤＡ（表４）が、分泌性酵母菌発現により生成した。この目的のために、ＳＤＡコード領域を、ファージディスプレイプラスミドからＰＣＲにより増幅し（実施例３〜５）、そしてＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩを用いて裁断し、同様に裁断されたｐＵＲ４５８５プラスミドとライゲーションした。ｐＵＲ４５８５は、ｃ−ｍｙｃ及びｈｉｓ６タグにＣ末端側で融合したＳＤＡの発現に適する酵母菌−大腸菌シャトルベクターである。この方式で生成されたＳＤＡを接尾辞「Ｌ」により示す。そのようなＳＤＡをコードするｐＵＲ４５８５に由来するプラスミドを、接尾辞「Ｌ」に付加してＳＤＡの名称及び接頭辞「ｐ」により表す。さらに、ＦＲ４領域内に酵母菌内産生レベルを増加させる突然変異を有する３つの変異体ＳＶＴ ＳＤＡを生成した（実施例３及び［１１］を参照）：
ＳＤＡ ＳＶＴ１５Ｌ−３ＦＷ４Ｍは、突然変異Ｋ１２０Ｑ、Ｉ１２２Ｔ、及びＬ１２３Ｑを含有するＳＶＴ１５Ｌの誘導体である
ＳＤＡ ＳＶＴ２０Ｌ−Ｌ１２３Ｑは、突然変異Ｌ１２３Ｑを含有するＳＶＴ２０Ｌの誘導体である
ＳＤＡ ＳＶＴ３４Ｌ−Ｌ１２３Ｑは、突然変異Ｌ１２３Ｑを含有するＳＶＴ３４Ｌの誘導体である
これらの突然変異は、これらの突然変異を含有する合成ＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片を生成すること、及びプラスミドｐＵＲ４５８５への後続する挿入により導入した。サブクローニングで使用されるＢｓｔＥＩＩ部位は、ＦＲ４において高度に保存されている部位であるが、しかしいくつかのＳＤＡでは欠損している。これは、ＳＶＴ１６、ＳＶＴ２０、ＳＶＴ２５、及びＳＶＴ３４のケースに当て嵌まる。従ってこの部位は、合成ＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片を生成すること、及びｐＵＲ４５８５への後続する挿入により、これら４つの真正ＳＤＡ、並びにＳＶＴ２０Ｌ−Ｌ１２３Ｑ、及びＳＶＴ３４Ｌ−Ｌ１２３Ｑに非表現的に導入された。すべての酵母菌発現プラスミドについて、実施例３に記載されるように、しかしテンプレートとして精製されたプラスミドＤＮＡを、プライマーＢＯＬＩ１６６（ＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＣＴＴＣ、配列番号９）、及びＢＯＬＩ１８８（ＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧ、配列番号１０）と組み合わせて使用して配列検証を行った。ＳＶＴ２９をコードするｐＵＲ４５８５由来のプラスミドは、ＰｓｔＩ部位の後の位置６０においてＡからＧへの非表現的な突然変異（ＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＣＴＡＣＧ（配列番号１１）からＣＣＴＧＴＣＧＧＧＣＣＴＡＣＧ（配列番号１２）への突然変異）をコードしたが、それは非表現的であったので無視された。
ｐＵＲ４５８５由来のプラスミドを、栄養要求性のｌｅｕ２マーカーについて選択することにより、サッカロマイセス・セレビシエ菌株Ｗ３０３−１ａ（ＡＴＣＣ番号２０８３５２；ＭＡＴａ、ａｄｅ２−１、ｕｒａ３−１、ｈｉｓ３−１１、ｔｒｐ１−１、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｃａｎ１−１００）に導入した。プラスミドｐＳＶＴ１３Ｌ、ｐＳＶＴ１５Ｌ、ｐＳＶＴ２０Ｌ、及びｐＳＶＴ３４Ｌを、ＳＤＡの生成でより一般的に使用される菌株ＳＵ５１にも導入した［１９、５８］。ＳＤＡを産生させるための酵母菌培養、及びＩＭＡＣによる培養済みの培養物上清からのＳＤＡの精製を、以前記載された通りに実施した［１９、５８］。精製したＳＤＡを濃縮し、そしてＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３ｋＤａ分子量カットオフ遠心濃縮デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用することにより、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にバッファー交換した。ＳＤＡ濃度を、Ｂｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）タンパク質アッセイ、及びウシＩｇＧ標準を使用して決定した。これらのストックから、サンプルを、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、ビオチンに対するタンパク質の重量比を５としてビオチン化した。マウスｍＡｂ、ウマ及びイヌのＡｌｂ及びＩｇＧ、並びにＴｅＮＴを同様にビオチン化した。
精製後のＳＤＡの収率に基づき、培養容積１リットル当たりの酵母菌により分泌されたＳＤＡの産生レベルも決定した（表５）。ＳＤＡを、パン酵母菌菌株Ｗ３０３−１ａにおいて主に産生させたが、酵母菌内産生レベルを比較するために、４つのＳＶＴ ＳＤＡも菌株ＳＵ５１において産生させた［５８］。菌株ＳＵ５１を使用したときの産生レベルの増加は、ＳＤＡの性質に依存して２．５倍〜１３．６倍異なる。野生型ＳＤＡと比較してそれより２．６倍〜５．２倍高いレベルで、様々なＦＲ４突然変異を含有する変異体ＳＤＡが生成したが（表５）、以前の知見と整合する［１１］。
０.１５ｍｇ／ＬというＳＶＧ０７Ｌの産生レベルの低さは、このＳＤＡがヒトＶＨ４遺伝子ファミリーのＳＤＡと類似していることと関連し得る。従来型ＳＤＡ（表５のサブファミリーＣ）は低レベルで産生することが以前示唆された［６１］。しかしながら、３つの従来型ＳＤＡ、ＳＶＧ０６Ｌ、ＳＶＧ１３Ｌ、及びＳＶＧ１９Ｌは、少なくとも１．５９ｍｇ／Ｌの合理的に高いレベルで産生する（表５）。
７．酵母菌内産生ＳＶＡ ＳＤＡの抗原結合
抗原をプレートにコーティングし、そしてＳＤＡ検出用にｍｙｃタグを利用しながら、非標識ＳＤＡを主に用いてそれを検出することにより、異なる種に由来するＡｌｂに対するＳＶＡ ＳＤＡの結合を、ＥＬＩＳＡで分析した。ＥＬＩＳＡを、実施例３に記載されるように実質的に実施した。精製された血清アルブミンを５μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。ウマ及びイヌＡｌｂの供給源は、実施例１に記載されている。ウシＡｌｂ、及びニワトリオバルブミンを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から、ヒトアルブミンをＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から、及びマウス、ヒツジ、及びブタアルブミンをＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｏｎｌｉｎｅ社（Ｂｅｉｊｉｎｇ、ＣＮ）から入手した。ネコアルブミンを、５００倍希釈された正常なネコ血清（Ａｇｒｉｓｅｒａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社、Ｖａｎｎａｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）から、１０００倍希釈された免疫親和性吸着ヤギ抗ネコＡｌｂ ＩｇＧ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｏｎｌｉｎｅ社）でコーティングされたプレート上で捕捉した。次にプレートを、１μｇ／ｍｌのＳＤＡ濃度で開始し１２ウェルにわたるＳＤＡの２倍希釈系列と共にインキュベートした。ＳＤＡを、０．５μｇ／ｍｌの抗ｍｙｃクローン９Ｅ１０ｍＡｂペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して検出した。吸収データを、エクセル（Ｅｘｃｅｌ）（登録商標）スプレッドシートテンプレート（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＵＳＡ）を使用して評価し、最大Ａ４５０値を計算した。４パラメーターロジスティック曲線を吸収及びＳＤＡ濃度に近似させて、有効濃度（ＥＣ）を内挿すると、各ＥＬＩＳＡにおいて各ＳＤＡについて０．２の吸収値が得られた。
抗原がコーティングされていない、ＳＤＡを含まない、又は非特異的ＳＤＡ（ＳＶＴ０６Ｌ）を含む陰性コントロールは、いずれも０．１５未満の数値をもたらした（表６）。０．１５を上回る吸収値が、Ａｌｂ結合を示唆すると考えられた。クローンＳＶＡ１２Ｌ及びＳＶＡ１６Ｌは、高い（＞１）吸収値を伴いウマ及びイヌＡｌｂに結合する。ＳＶＡ１２Ｌも、ブタＡｌｂに高い吸収値を伴い、及びネコＡｌｂとは低めの吸収値を伴い、結合する。ネコＡｌｂは、コーティングされたポリクロナール抗体を用いて正常な血清から捕捉された。その結果、観測された低めの吸収値は、その他の種に由来するＡｌｂと比較して、ネコＡｌｂとそれほど効率的に結合しないことを必ずしも示唆しない。実際、実施例１８（表２８）では、ＳＶＡ１２Ｌ及びＳＶＡ０６Ｌは、非常に類似した親和性を伴い、ネコＡｌｂ（市販品）に結合することが明らかである。さらに、ＳＶＡ１２Ｌ及びＳＶＡ０６Ｌは、類似した親和性を伴い、ウマ及びイヌＡｌｂに結合することが明らかである（実施例１８）。競合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）では、ＳＶＡ０６Ｌ及びＳＶＡ１２Ｌは異なるエピトープを認識することが明らかとなった（データ図示せず）。
ＳＶＡ１２Ｌ及びＳＶＡ１６Ｌの両方は、ＥＬＩＳＡにおいて約１０ｎｇ／ｍｌという低ＳＤＡ濃度の力価を有する。ＳＶＡ０２Ｌ、ＳＶＡ０４Ｌ、ＳＶＡ０６Ｌ、及びＳＶＡ０７ＬもいくつかのＡｌｂ種に結合するが、しかしＳＶＡ１２Ｌ及びＳＶＡ１６Ｌよりも低い吸収値、及びより高いＳＤＡ力価を多くの場合有する。ＳＶＡ０２Ｌ及びＳＶＡ０６ＬはマウスＡｌｂにも結合する。
ＳＤＡのいずれも、ヒト、ヒツジ、ウシ、又はニワトリのＡｌｂに結合しない。酵母菌内産生ＳＶＡ ＳＤＡのＥＬＩＳＡ結合は、大腸菌内で産生させた対応するＳＤＡの結合と整合するが（実施例５；表４）、但し１つの重要な例外を有する：クローンＳＶＡ０４Ｌは、イヌＡｌｂと結合しない一方、その大腸菌内産生のカウンターパートは１．５３３という高吸収値を伴いイヌＡｌｂに結合した。これは、大腸菌内産生クローンはモノクロナールではなく、むしろ異なるＳＤＡを生成する２つのクローンの混合物に該当することに起因し得る。酵母菌内産生ＳＤＡはクローン性であり、また単一のウェル内ではなくＳＤＡ希釈系列として、より入念にテストされているので、酵母菌内産生ＳＤＡに基づく結果はより信頼性がある。
クローンＳＶＡ１２Ｌは、ウマ、イヌ、ブタ、及びネコＡｌｂのいずれにも結合し、また酵母菌において効率的に産生されるので（菌株Ｗ３０３−１ａを使用して３．８５ｍｇ／Ｌ）、それを多量体ＳＤＡの開発用として選択した（実施例１４、１５、１６、１７、及び１８を参照）。ＳＶＡ１２Ｌは、ＥＬＩＳＡにおいてマウスＡｌｂに結合せず、従ってマウスにおいては半減期の延長を実現しそうにない（実施例１７）。ＳＶＡ０６Ｌが、マウスにおけるＳＤＡ半減期延長に適する候補である。
８．酵母菌内産生ＳＶＧ ＳＤＡの抗原結合
種の起源が異なるＩｇＧ、及びいくつかの種の抗体断片Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｃに対する８つの酵母菌内産生ＳＶＧ ＳＤＡの結合を、これまでの実施例の記載と同様に分析した。いくつかのＩｇＧ及びその断片の供給源は実施例４に記載されている。マウス、ネコ、ヒツジ、ウシ、及びモルモットのγグロブリン（ＧＧ）並びにウマＦ（ａｂ’）２断片を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から得た。イヌＦｃ断片を、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から得た。結果を表７に記載する。マウス抗ｍｙｃ ｍＡｂ ＰＯ−コンジュゲートとコーティングされた抗原との交差反応におそらく起因して、３つのＥＬＩＳＡには比較的高いバックグラウンドが含まれた（表７の脚注ｂ）。従って、これらのＥＬＩＳＡにおける吸収値について、バックグラウンドが差し引かれた（表７の脚注ｂ）。バックグラウンドが差し引かれた吸収値が０．２を上回るとすれば、それは抗原結合を示唆すると考えられた。
酵母菌内産生ＳＶＧ ＳＤＡのＥＬＩＳＡ結合は、大腸菌において産生された対応するＳＤＡの結合と整合する（実施例４）が、２つの例外を有する。第１に、酵母菌内産生ＳＤＡ ＳＶＧ０７Ｌは、イヌＩｇＧとのみ結合する一方、対応する大腸菌内産生ＳＤＡは、分析したすべての種のＩｇＧに結合した。おそらくはこれは、結合に対して選択されたＡ４５０＝０．２という任意的なカットオフ値が過剰に高いことに一部説明可能である。第２に、酵母菌内産生クローンＳＶＧ２４Ｌは、ブタＩｇＧに結合しない一方、その大腸菌内産生のカウンターパートは結合した。これも、結合に対して選択されたＡ４５０＝０．２という任意的なカットオフ値が過剰に高いことにやはり起因し得る。或いは、そのような大腸菌内産生クローンの結合もまた、これらのクローンがモノクロナールでないことに起因し得る。そのようなアーチファクトは、酵母菌内産生ＳＤＡについて起こり得ない。従って、酵母菌内産生ＳＤＡのＥＬＩＳＡ結合のデータは、より信頼性がある。
バックグラウンドが差し引かれた吸収値が０．２を上回り、それが抗原結合を示唆するものと解釈されるとき、ＳＤＡ ＳＶＧ０６Ｌ及びＳＶＧ１３Ｌは、ニワトリを除く分析されたすべての種のＦａｂ断片、及びＩｇＧに結合する。ほとんどのその他のＳＤＡは、このＥＬＩＳＡにおいて０．０８未満の吸収値を有するので、ＳＶＧ１３のニワトリＩｇＧにおける０．１６４という吸収値は、ニワトリＩｇＧとの結合をおそらくは表している。ＳＤＡ ＳＶＧ１９Ｌは、ＳＤＡ ＳＶＧ１３Ｌに対してかなりの配列類似性を示し（実施例４）、またＳＶＧ１３Ｌと類似した結合パターンを示すが、しかしマウス、ヒツジ、及びブタのＩｇＧとは、バックグラウンドを上回る０．２の吸収値を伴い結合しない。ＳＶＧ０３ＬはウマＦｃに対して特異的であり、及びＳＶＧ２３ＬはイヌＦｃ断片に対して特異的である。ＳＶＧ２４Ｌは、主としてウマ及びイヌＦｃを認識する。
ＳＤＡ ＳＶＧ１３Ｌは、分析したすべての種のＦａｂ及びＩｇＧと結合し、また酵母菌内で十分に産生される（最適化されなくても）（１．６ｍｇ／Ｌ）ので、多量体ＳＤＡの開発に最も適する。
ＳＤＡ ＳＶＧ０６Ｌも、ニワトリを除く分析したすべての種のＦａｂ及びＩｇＧと結合し、またやはり酵母菌内で十分に産生される（最適化されなくても）（１．８ｍｇ／Ｌ）ので、多量体ＳＤＡの開発にやはり適する。
９．ＩｇＧ結合ＳＤＡの種特異性
様々な種に由来するＩｇＧに対する、以前単離されたブタＩｇＧ結合ＳＤＡ（ＶＩ−クローン）４例［１９］のＥＬＩＳＡにおける結合を、ほとんどの種のＩｇＧと反応するＳＤＡ ＳＶＧ１３Ｌと比較した。ＥＬＩＳＡは、実施例８に記載されるように実施した。結果（表８）より、ＳＤＡ ＶＩ−４Ｌ、ＶＩ−８Ｌ、ＶＩ−１１Ｌ、及びＶＩ−１４Ｌは、ウシ、ネコ、イヌ、マウス、及びヒトのＩｇＧに結合しないことが分かる。最大吸収が、ＳＤＡを含まないバックグラウンドを上回りわずかに増加しているので、おそらくは、それらはヒツジＩｇＧには結合する。ＳＤＡ ＶＩ−１１Ｌはさらに、ウマＩｇＧと結合する。しかしながら、すべての事例において、ＳＶＧ１３Ｌは、ブタＩｇＧを除くすべての種に由来するＩｇＧにおいて、かなり高めの吸収値をもたらす。ブタＩｇＧでは、逆に、すべてのＶＩクローンは、ＳＶＧ１３Ｌよりも高い吸収値をもたらす。
１０．酵母菌内産生ＳＶＴ ＳＤＡの抗原結合
ＳＶＡ、及びＳＶＧ ＳＤＡについて記載された方式と類似した方式で、いくつかの酵母菌内産生ＳＤＡ、及び６つの抗ＴｅＮＴｍＡｂを、ＥＬＩＳＡにおいて抗原結合について分析した。抗ＴｅＮＴｍＡｂを異なる供給業者から取得した。それらの起源、及びマウスバイオアッセイにおけるＴｅＮＴの中和又はウェスタンブロットにおける抗原結合について、供給業者より提供された情報を表９に記載する。これらのｍＡｂの一部は、実施例６に記載されるようにビオチン化された。
直接コーティングされたＴｅＮＴ、ｒＴＴＣ、又は抗原でコーティングされないポリスチレン製プレートに対する、並びに受動的に吸着されたｃＡｂ−ＴＴ２ ＳＤＡにより捕捉されたＴｅＮＴに対する非標識ＳＤＡ又はｍＡｂの結合を分析した。そのような抗原コーティング手順については、実施例１及び３を参照されたい。これらのプレートを、次に非標識ＳＤＡ又はｍＡｂの希釈系列と共にインキュベーションし、そして実施例７に記載されるように、但しマウスｍＡｂを検出するために２０００倍希釈したウサギ抗マウス免疫グロブリンＰＯコンジュゲート（Ｄａｋｏ社、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、及びｒＴＴＣコーティングプレート上でＳＤＡを漸増添加せずにさらに処理した。さらに、直接コーティングされたＴｅＮＴ、及びｃＡｂ−ＴＴ２捕捉ＴｅＮＴに対するビオチン化されたＳＤＡ又はｍＡｂの結合を、ＳＤＡを検出するために、０．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＰＯコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用して、類似した方式で分析した。最終的に、非標識ＳＤＡ又はｍＡｂのＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ相互作用阻害を、ＳＤＡにつき１μｇ／ｍｌ、又はｍＡｂにつき１０μｇ／ｍｌの濃度で始まる、１１ウェルにわたるＳＤＡ又はｍＡｂの２倍希釈系列を使用して、実施例３に記載するように分析した。
結果を表１０に記載する。特異的ＴｅＮＴ抗原コーティングを有さないプレートでの吸収値は０．０７未満であった。コントロールのＳＤＡ ＳＶＡ１２Ｌを用いたＥＬＩＳＡにおいても、ＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ阻害ＥＬＩＳＡを除き、吸収値は、最大で０．１５５（直接コーティングされたＴｅＮＴ、及びビオチン化されたＳＤＡ、若しくはｍＡｂ）、又は０．０７２（その他のＥＬＩＳＡ）であった。従って、０．２を上回る吸収値は、抗原結合を示唆する。直接コーティングされたＴｅＮＴ又は捕捉されたＴｅＮＴ上でビオチン化されたＳＤＡ又はｍＡｂを用いたＥＬＩＳＡは、非標識ＳＤＡ又はｍＡｂを使用する類似したＥＬＩＳＡと一般的に整合した。ビオチン化されたＳＤＡ又はｍＡｂのいずれも、ＥＬＩＳＡにおいて陰性ではなかったが、その非標識カウンターパートは陽性であった。これは、ビオチン化は抗原結合を無効にしないことを示している。多くの場合、ビオチン化されたＳＤＡは、捕捉されたＴｅＮＴにおいてわずかに高めの吸収値をもたらした（例えば、ＣＤＲ３群Ｂの３つのＳＤＡ ＳＶＴ０６Ｌ、ＳＶＴ０８Ｌ、及びＳＶＴ３１Ｌ）。特筆すべき例外として、ビオチン化されたとき、低めの吸収値及び＞５０倍高いＥＣを一般的にもたらすｍＡｂ Ｂ４１７Ｍ、及び１１ｎ１８５は、ビオチン化はそれほど有効ではない、又はこれらのｍＡｂによる抗原結合に影響を与えたことを示唆する。ｍＡｂ Ｂ４１７Ｍの場合、安定化剤として０．５％のＨＳＡの存在が、そのビオチン化効率を減少させた可能性がある。
一般的に、酵母菌内産生ＳＶＴ ＳＤＡのＥＬＩＳＡ結合は、その大腸菌内産生カウンターパートのＥＬＩＳＡ結合と整合する（実施例３；表２）。実施例３で以前指摘した通り、ＳＶＴ０２Ｌ及びＳＶＴ０３Ｌを例外として、すべてのＳＤＡはｒＴＴＣに結合する。以前指摘した通り、ｒＴＴＣに対するＳＶＴ０２及びＳＶＴ０３の結合を検出できなかったのは、ｒＴＴＣの直接コーティングに起因し得る。これらのＳＤＡが、直接コーティングされたＴｅＮＴにもやはり結合できなかった一方、捕捉されたＴｅＮＴには確かに結合したからである。さらに、以前観測されたように、ＣＤＲ３群Ｂの３つのＳＤＡ ＳＶＴ０６Ｌ、ＳＶＴ０８Ｌ、及びＳＶＴ３１Ｌの他、ＳＶＴ０５Ｌは、ＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ相互作用を部分的に阻害するにすぎず、そのときの最低吸収値は約０．５、及びＥＣ値は比較的高めである。さらに、以前観測されたように、ＳＤＡ ＳＶＴ０３Ｌは、ＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ相互作用を阻害しない。しかしながら、酵母菌内産生クローンＳＶＴ０２Ｌは、＞１０００ｎｇ／ｍｌのＥＣ値で部分的なＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ阻害もやはり示す一方、その大腸菌内産生カウンターパートは阻害を一切示さなかった。この差異は、大腸菌内産生ＳＤＡの場合、ＳＤＡ濃度が未知の大腸菌上清を１０倍希釈して使用された過剰に低いＳＤＡ濃度の使用に単に起因し得る。分析されたＳＤＡの最高濃度においてのみ、直接コーティングされたＴｅＮＴに対するビオチン化された酵母菌内産生ＳＶＴ０３Ｌの結合が観測されたが、それも以前には観測されず、使用したＳＤＡ濃度がより高かったことにより同様に説明がつき得る（実施例１１を参照）。
ＳＶＴ１５Ｌ、ＳＶＴ２０Ｌ、及びＳＶＴ３４Ｌの３つの変異体ＳＤＡは、ビオチン化されたＳＤＡを使用するＥＬＩＳＡ、及びＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ阻害ＥＬＩＳＡにおいて、その野生型カウンターパートと類似した最大吸収値及びＥＣ値を有する。これは、抗原結合を増加させるために導入されたフレームワーク４突然変異は、ＴｅＮＴ結合に影響を及ぼさないことを示唆する。ここでは、ＥＣ値は、ＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ阻害の５０％阻害（ＩＣ５０）に対応する吸収値において決定される。ＩＣ５０値は、３４〜９８６ｎｇ／ｍｌで変動する。ＣＤＲ３群Ｂに由来するクローンは、ＣＤＲ３群Ａ、Ｃ、及びＤに由来するクローン（３４〜１３３ｎｇ／ｍｌ）よりも高いＩＣ５０値（３１７〜９８６ｎｇ／ｍｌ）を示す。同一のＣＤＲ３群に由来するクローンのＩＣ５０値は、最大で４倍異なる。
６つのｍＡｂが分析に含まれた。ＴｅＮＴ軽鎖と結合するので、ｍＡｂ １１ｎ１８５を選択した。マウスバイオアッセイにおいてＴｅＮＴを中和するので、さらなる５つのｍＡｂを選択した。ｍＡｂは異なるＥＬＩＳＡにおいて、以下のように結合する：
１．ｍＡｂの１４Ｆ５及び６Ｆ５５は、ＳＶＴ０２Ｌ及びＳＶＴ０３Ｌと類似して、捕捉されたＴｅＮＴと比較してそれよりも非効率的に直接コーティングされたＴｅＮＴと結合する。
２．ｍＡｂ６Ｅ７及び６Ｆ５７のみが、ＥＬＩＳＡにおいてＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ相互作用を阻害する。両者は、ほとんどのＳＤＡのＩＣ５０よりも顕著に高いＩＣ５０を有する。
３．ほとんどのＳＤＡはｒＴＴＣに結合する一方、６つのｍＡｂのうち２つのみがｒＴＴＣと結合する。これは、３つのｍＡｂによるＴｅＮＴの中和はＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ相互作用の阻害に基づかないことを示唆する。
１１．ＴｅＮＴの断片Ｃに対する結合について特徴づけられたＳＤＡ（ｒＴＴＣ結合）
２つのＳＤＡ（ＳＶＴ０２Ｌ及びＳＶＴ０３Ｌ）は直接コーティングされたＴｅＮＴに結合せず、従ってＴｅＮＴの直接コーティングされた断片Ｃ（ｒＴＴＣ）（Ｈｃ又はＴＴＣとも命名される）に対するその結合については、粒子の特異性に関して結論に達してない（実施例１０）。受動吸着が抗原結合を無効にした可能性があるからである。ｍＡｂ６Ｅ７を用いて捕捉されたｒＴＴＣに対するこれらのＳＤＡの結合が、従って実施例１０の記載と同様に分析された。９６ウェルプレートの６個のウェルをＴｅＮＴ（０．７５μｇ／ｍｌ）で、及び１８個のウェルをｍＡｂ６Ｅ７（１μｇ／ｍｌ）でコーティングした。６つのｍＡｂ６Ｅ７コーティングウェルを２μｇ／ｍｌのｒＴＴＣと共に、６つのさらなるウェルを０．７５μｇ／ｍｌのＴｅＮＴと共にその後インキュベートした一方、ｍＡｂ６Ｅ７がコーティングされた残りの６つのウェルをＥＬＩＳＡバッファー（陰性コントロール）と共にインキュベートした。その後、６つのＳＤＡを、２μｇ／ｍｌのＳＤＡ濃度で、異なる抗原がコーティングされた４つのウェル内でインキュベートした。抗ｍｙｃＭＡｂ ＰＯ−コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、結合したＳＤＡを検出した。
結果（表１１）は、下記事項を示す：
陰性コントロールのＳＶＡ１２Ｌ、及び捕捉された抗原を含まないｍＡｂ６Ｅ７コーティングは、陰性である（吸収＜０．０７）。
ｍＡｂ６Ｅ７を用いたＴｅＮＴ又はｒＴＴＣの捕捉又はＴｅＮＴの直接コーティングは、ＳＶＴ１６Ｌ（高い吸収）、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ（より低い吸収）により検出されるので、成功である。
ＳＶＴ０２Ｌ及びＳＶＴ０３Ｌは、捕捉されたＴｅＮＴに結合するので、機能的である。
ＳＶＴ０３Ｌは、捕捉されたＴｅＮＴよりも低いＡ４５０を有するものの、直接コーティングされたＴｅＮＴに確かに結合する一方、ＳＶＴ０２Ｌは、直接コーティングされたＴｅＮＴに全く結合しない。
ＳＶＴ０２Ｌ及びＳＶＴ０３Ｌは、ｍＡｂ６Ｅ７を用いて捕捉されたｒＴＴＣに結合しない。両者は、ｍＡｂ６Ｅ７とは別の抗原部位を認識するので（実施例１３）、これは捕捉用としてｍＡｂ６Ｅ７を使用したことによらない。
従って、ＳＶＴ０２Ｌ及びＳＶＴ０３Ｌは、ｒＴＴＣ中に存在する部分とは別のＴｅＮＴ部分と結合する。この観察知見は、これらのＳＤＡがＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ相互作用を阻害することができないことと整合する（実施例１０）。
１２．ＳＶＴ ＳＤＡのＴｅＮＴ結合のウェスタンブロット分析
ＴｅＮＴの軽鎖又は重鎖に対するＳＶＴクローンの結合を、これまでに実施したように［１９］、１ゲル当たり２．５μｇの真正ＴｅＮＴを使用し、並びに免疫ブロッティング用として０．５μｇ／ｍｌのビオチン化されたＳＤＡ（実施例６）、及び０．１μｇ／ｍｌのストレプトアビジンＰＯコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用してウェスタンブロッティングにより分析した（図４）。ＳＤＡ ＳＶＡ１２Ｌを、陰性コントロールとして使用した。ほとんどのＳＤＡは、ウェスタンブロットにおいて、軽鎖又は重鎖のいずれに対しても結合を示さなかった。これは、高次構造エピトープを認識するそのようなＳＤＡに起因し得る。しかしながら、ＳＤＡ ＳＶＴ０６、及びＳＶＴ０８は、ＴｅＮＴ重鎖に該当するに間違いない約１００ｋＤａのポリペプチドと結合する。これらのクローンは同一のＣＤＲ３群（群Ｂ）に属し、そして同一の抗原部位を認識する（表１２）。ＳＤＡのいずれも、重鎖に由来するｒＴＴＣ（表２及び表１０）にも結合する。従って、ＴｅＮＴ重鎖に対するＳＤＡ ＳＶＴ０６及びＳＶＴ０８のウェスタンブロットにおける結合は、以前の観察知見と整合する。
１３．ＳＤＡ（ＳＶＴ）による破傷風毒素抗原のマッピング
ＳＶＴ ＳＤＡ、及び６つの抗ＴｅＮＴｍＡｂの抗原部位を、ビオチン化されたＳＤＡ及びｍＡｂを使用するブロッキング／競合ＥＬＩＳＡによりマッピングした。可能な場合、各ＣＤＲ３群の２つの代表例をこの目的のために使用した。ＳＤＡは、ＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ相互作用におけるそのＩＣ５０値に基づき、主に選択した。しかしながら、酵母菌内で産生されたＳＶＴ２９Ｌは、０．０７ｍｇ／Ｌにすぎず、従ってＳＶＴ１５Ｌ−３ＦＷ４Ｍに置き換えた。競合／ブロッキングＥＬＩＳＡを、これまでの実施例に記載された手順と類似したＥＬＩＳＡ手順を使用して、但し直接コーティング用として０．５μｇ／ｍｌのＴｅＮＴを使用して実施した。ほぼ最大の吸収値をもたらすビオチン化ＳＤＡ又はｍＡｂ濃度を使用し、そして５μｇ／ｍｌの様々な非標識ＳＤＡ又はｍＡｂを用いることで、このＳＤＡ又はｍＡｂと競合させ、それをブロッキングした。ＴｅＮＴコーティングプレートを、非標識ＳＤＡ又はｍＡｂと共に、９０μｌ／ウェル中、３０分間、最初にインキュベートした（ブロッキングステップ）。次に５０μｇ／ｍｌのビオチン化されたＳＤＡ又はｍＡｂ、１０μｌを添加し、そしてさらに３０分間インキュベートした（競合ステップ）。ビオチン化されたＳＶＴ０２及びＳＶＴ０４の場合、これらのＳＤＡは捕捉されたＴｅＮＴにのみ結合し、直接コーティングされたＴｅＮＴには結合しないので、ｃＡｂ−ＴＴ２を用いてＴｅＮＴを捕捉した。その他のすべてのケースでは、直接コーティングされた抗原を使用した。抗原コーティングを有さないコントロール、及びビオチン化されたＳＤＡを有さないコントロールが含まれた。ＳＤＡの競合／ブロッキングに起因する抗原結合の阻害率（％）を、次に１００−１００×（［競合するＳＤＡ又はｍＡｂが存在するＡ４５０］−［Ａｇコーティングを有さないＡ４５０］）／（［競合するＳＤＡ又はｍＡｂが存在しないＡ４５０］−［Ａｇコーティングを有さないＡ４５０］）として計算した。すべてのＳＤＡ及びｍＡｂは、そのビオチン化されたカウンターパートの結合を少なくとも７５％ブロッキングし、アッセイは有効であることを示唆した。
文字Ａ〜Ｅにより表される少なくとも５つの独立した抗原部位を同定した（表１２及び表１３）。予期される通り、同一のＣＤＲ３群に由来するＳＤＡは、常に同一の抗原部位の部分である。ＳＶＴ０２Ｌ、ｍＡｂ１４Ｆ５、及びｍＡｂ６Ｆ５５は抗原部位Ａを形成する。これら３つのＳＤＡ又はｍＡｂは、その他のＥＬＩＳＡにおいて、その他の類似した特徴も示す。最も特筆すべきことには、それらは、直接コーティングされたＴｅＮＴと比較して、それよりも効率的に捕捉されたＴｅＮＴに結合する。これは、その結合は、正しいＴｅＮＴ三次構造に極めて依存的であることを示唆する。ＳＶＴ０３Ｌは、抗原部位Ｂを形成する単一のＳＤＡである。ＳＶＴ１５Ｌ、及びその変異体誘導体ＳＶＴ１５Ｌ−３ＦＷ４Ｍは、抗原部位Ｃを形成する。ＳＶＴ０６Ｌ、ＳＶＴ０８Ｌ、ｍＡｂ６Ｅ７、及びｍＡｂ６Ｆ５７は、抗原部位Ｄを形成する。これらのＳＤＡは、ウェスタンブロットにおいてＴｅＮＴにも結合するので、抗原部位の正しい立体構造にそれほど依存しないものと予想される（実施例１２）。
この概念と整合して、その他の抗原部位に由来するクローンによる部分的な競合は、これら４つのＳＤＡ又はｍＡｂについて生じない。２つのＣＤＲ３群を代表するＳＤＡ ＳＶＴ１３、ＳＶＴ１６、ＳＶＴ２２、及びＳＶＴ３４は、抗原部位Ｅを形成する。
ＳＶＴクローンの結果を表１２にまとめる。一般的に、結果は、ＳＤＡのＡｇ特異性及びＴｅＮＴの抗原構造に関する一般的見解と整合する：
同一のＣＤＲ３群のＳＤＡは、同一の抗原部位に分類される。
同一の抗原部位のＳＤＡ又はｍＡｂは、類似した抗原結合特異性を示す：
抗原部位ＡのＳＤＡ又はｍＡｂは、ＴｅＮＴの直接コーティングに対して結合の低下を示すので、立体構造的に敏感なエピトープと結合する
抗原部位ＤのＳＤＡは、ウェスタンブロットにおいてＴｅＮＴ Ｈｃと結合する。
抗原部位Ｃ、Ｄ、及びＥのＳＤＡ及びｍＡｂは、いずれもＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ相互作用を阻害する一方、抗原部位Ａ及びＢのＳＤＡ又はｍＡｂは阻害しない。
ＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ相互作用を阻害するＳＤＡ又はｍＡｂは、いずれもｒＴＴＣに結合する。
クローンＳＶＴ０２は、マウスバイオアッセイにおいてＴｅＮＴを中和することが報告された２つのｍＡｂと同一の抗原部位と結合することがここで明らかにされることは特筆される。これは、ＳＶＴ０２は、ＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ相互作用を阻害しなかったが、ＴｅＮＴをやはり中和し得ることを強く示唆する。ＧＴ１ｂ相互作用を阻害しないＴｅＮＴ中和ｍＡｂは以前に記載されている［６８］。同様に、クローンＳＶＴ０６及びＳＶＴ０８は、２つの中和ｍＡｂと競合するので、ＴｅＮＴをおそらくは中和する（実施例１７）。クローンＳＶＴ０６はより高いレベルで産生されたので、さらなる研究に最も適する。抗原部位Ｃ及びＥに由来するＳＤＡは、中和ｍＡｂのいずれとも競合しない。しかしながら、これらのＳＤＡは、ＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ相互作用を確かに阻害する。従って、これらのＳＤＡはＴｅＮＴを中和する可能性が高いが、ただこれは、未だｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて証明されていない（実施例１７）。ＳＤＡ ＳＶＴ０２Ｌ、ＳＶＴ０６Ｌ、ＳＶＴ１５Ｌ−３ＦＷ４Ｍ、及びＳＶＴ１６Ｌは、従って多量体ＳＤＡを生成するための推奨される構成ブロックである（表１３）。
１４．多量体ＳＤＡの酵母菌内産生
ＳＤＡ産生レベルを増加させるために、多量体ＳＤＡを、プラスミドｐＲＬ４４を使用して［６９］、酵母菌菌株ＳＵ５０において［７０］、安定なＭＩＲＹ組み込み体を作成することにより生成した［７５］。そのようなＭＩＲＹ組み込み体は、２ミクロンベースのプラスミドと比較して、それより５倍増加したＳＤＡの産生レベルを平均して有する。ＴｅＮＴ結合ＳＶＴ−ＳＤＡとＡｌｂ結合ＳＶＡ１２ＳＤＡ（５個のプラスミド）、ＩｇＧ結合ＳＶＧ０６ＳＤＡ（２個のプラスミド）、又はＩｇＧ結合ＳＶＧ１３ＳＤＡ（５個のプラスミド）の融合体から構成される、多量体ＳＤＡをコードする１２個のプラスミドを生成した（表１４）。これらの多量体ＳＤＡが作成されたエレメントは以下の通り：
ＧＳ３：以前に記載されている（Ｇ４Ｓ）３リンカー［２７］
ＧＳ２：ｐＲＬ１４４プラスミドに由来する（Ｇ４Ｓ）２リンカー［１９］
Ｈ６：ｐＲＬ１８８と同様に、ｈｉｓ６タグ、ダブル終止コドン、及びＨｉｎｄＩＩＩ部位［２］
ＳＶＧ０６Ｍ４：４つの突然変異：Ｑ１Ｅ、Ｑ５Ｖ、Ｅ１２０Ｑ、Ｌ１２３Ｑを有するＳＶＧ０６
ＳＶＧ１３Ｍ４：４つの突然変異：Ｑ１Ｅ、Ｑ５Ｖ、Ｋ１２０Ｑ、Ｌ１２３Ｑを有するＳＶＧ１３
ＳＶＡ１２Ｍ２：２つの突然変異：Ｑ１Ｅ、Ｑ５Ｖを有するＳＶＡ１２
ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ：内部ＳａｃＩ部位を有さず、及び３つの突然変異：Ｋ１２０Ｑ、Ｉ１２２Ｔ、Ｌ１２３Ｑを有するＳＶＴ１５
ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ：非表現的に復元されたＢｓｔＥＩＩ部位、及びＬ１２３Ｑ突然変異を有するＳＶＴ１６
合成ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を生成し、そしてその後、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してプラスミドｐＲＬ４４にサブクローン化し［６９］、プラスミドｐＲＬ４８２〜ｐＲＬ５０１を得た（表１４）。
パン酵母菌菌株ＳＵ５０（ＭＡＴａ；ｃｉｒ°；ｌｅｕ２−３，−１１２；ｈｉｓ４−５１９；ｃａｎ１；［７０］）を、ＨｐａＩ−線状化プラスミドｐＲＬ４８２〜ｐＲＬ５０１を用いてエレクトロポレーションにより形質変換し［７１］、そしてｌｅｕ＋栄養素要求体を選択した。単一のコロニー精製後の形質転換体を、ＳＤＡ発現用として、シェーカーフラスコ中、０．５Ｌスケールで誘発し、そしてＳＤＡを、培養済みの培養物上清からＩＭＡＣにより精製した［５８］。ＳＤＡを、以前記載されたように［４４］、但し若干の改変を加えて、ＳＰセファロースカラム上で、陽イオン交換クロマトグラフィーにより、その後さらに精製した。ＳＰセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、及び２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７バッファーを、カラムにＳＤＡを結合させるのに使用した。結合したＳＤＡを、結合バッファー中で、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、及び１ＭのＮａＣｌのステップグラジエントを用いて溶出させた。結合したＳＤＡは、０．４と０．８Ｍの間のＮａＣｌにおいて一般的に溶出した（表１４）。３ｋＤａ分子量カットオフ遠心濃縮デバイスを使用してこれを濃縮し、そしてＰＢＳにバッファー交換した。ＳＤＡ濃度を、ビシンコニン酸アッセイ法（ＢＣＡ、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２３２１２）、及びウシ血清アルブミン標準（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して決定した。精製後のＳＤＡ収率に基づき、酵母菌における多量体ＳＤＡの産生レベルを計算した（表１４）。
単量体及び多量体ＳＤＡを、ＭＯＰＳ泳動バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ ４％〜１２％ビス−トリスゲルを使用する還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ、そしてＧｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた染色により分析した。多量体ＳＤＡとは対照的に、単量体ＳＤＡは、ｈｉｓ６タグに付加してｍｙｃタグを含有する。ｍｙｃタグを含有した単量体ＳＤＡは、ｍｙｃタグを欠くほとんどの多量体ＳＤＡについて観測されない約２ｋＤａ高めの分子質量を有する追加の分子をもたらした（図５Ａ及び図５Ｂ）。この追加の分子は、ｍｙｃタグの存在に依存的な部分的Ｏ−グリコシル化におそらくは該当する。そのような分子は以前に観測されている［４４］。この推定されたＯ−グリコシル化バリアントに付加して、ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ ＳＤＡは、分解したＳＤＡにおそらくは該当する約２ｋＤａ低めの分子質量を有する分子を生成する（図５Ｂ）。
ＳＶＧ０６Ｍ４を含有する多量体ＳＤＡの２例について行ったＳＤＳ ＰＡＧＥ分析より、ＳＤＡ２の位置のダブルバンドが明らかであるが（図５Ａ）、それはＳＶＡ１２Ｍ２を含有する多量体ＳＤＡ又はＳＶＧ１３Ｍ４ ＳＤＡでは観測されない（図５Ｂ）。このＳＤＡは、多量体ＳＤＡのＣ末端に常に配置されるので、ＳＶＧ０６Ｍ４のＣ末端における分解の可能性が極めて高い。これは、多量体ＳＤＡ内のＳＶＧ０６Ｍ４のＣ末端において突然変異Ｅ１２０Ｑ及びＬ１２３Ｑが導入されたことに起因し得る。それは、そのようなＳＤＡにおけるｈｉｓ６タグの喪失を意味する。ＳＤＡはＩＭＡＣにより最初に精製されたので、これはそのような分解がＩＭＡＣ精製後に生じたことを意味する。
ＳＶＧ１３Ｍ４並びにＳＶＡ１２Ｍ２を含有する多量体ＳＤＡは、そのすべてが、その予測された分子質量に基づき予期される位置に移動した（図５Ｂ）。単量体ＳＶＧ１３Ｌ ＳＤＡは、ＳＶＡ１２Ｌ ＳＤＡよりもわずかに速く移動し、約１ｋＤａ低めの分子量のＳＶＡ１２Ｌと整合する。そのようなパターンは、２つ（ＳＤＡ２）、又は３つ（ＳＤＡ３）のＳＤＡドメインから構成される、ＳＶＧ１３Ｌ及びＳＶＡ１２Ｌを含有する多量体ＳＤＡを比較する際にも認められる。
１５．多量体ＳＤＡの二重特異的又は二価抗原結合
様々な多量体酵母菌内産生ＳＤＡのいくつかの標的抗原結合能力を、ＥＬＩＳＡにおいて特に評価した。これら多量体ＳＤＡの構成ブロックを形成する一価のＳＤＡのコントロールが含まれた。ＥＬＩＳＡを、以前の実施例に記載されるように基本的に実施した。異なる７種類のＥＬＩＳＡを実施した（表１５及び表１６）。ＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ阻害ＥＬＩＳＡは、実施例３及び実施例１０においてすでに記載されている。抗ｈｉｓタグｍＡｂ及びポリクロナール抗ＳＤＡ血清の両方がＳＤＡ検出用として使用された３つのさらなるＥＬＩＳＡが、受動吸着されたＴｅＮＴ（０．７５μｇ／ｍｌ）、Ａｌｂ（５μｇ／ｍｌ）、又はＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）に対する一価のＳＤＡの結合を測定するのに役立った。ＴｅＮＴ、及びＩｇＧ若しくはＡｌｂに対する二重特異性結合、又は二価のＴｅＮＴ結合を測定するために、以前記載されたように、ビオチンに対するタンパク質の重量比として５を用い、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、ＴｅＮＴ、及びウマＡｌｂもビオチン化した［７２］。それらを、下記事項を測定するために３つのＥＬＩＳＡで使用した：
コーティングされたイヌＩｇＧ又はＡｌｂ（５μｇ／ｍｌ）、及びビオチン化されたＴｅＮＴ（０．２５μｇ／ｍｌ）に対する二重特異性結合
受動吸着されたｃＡｂ−ＴＴ２（１μｇ／ｍｌ）を用いて捕捉されたＴｅＮＴ（０．７５μｇ／ｍｌ）、及びビオチン化されたウマＡｌｂ（１μｇ／ｍｌ）に対する二重特異性結合
コーティングされたＴｅＮＴ（０．７５μｇ／ｍｌ）、及びビオチン化されたＴｅＮＴ（０．２５μｇ／ｍｌ）に対する二価の結合
ポリスチレン製９６ウェルプレートを、ＰＢＳ（ＴｅＮＴ）、又は５０ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２（すべてのさらなる抗原）のいずれかに溶解した必要とされる抗原を用いて、１００μｌ／ウェル、４℃、オーバーナイトでコーティングした。ＥＬＩＳＡバッファー（１％のスキムミルク；０．０５％のツイーン２０；０．５ＭのＮａＣｌ；２．７ｍＭのＫＣｌ；２．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；ｐＨ７．４）中、１００μｌ／ウェルを使用して、ＲＴにおいて１時間プレートを洗浄した後、すべての後続するインキュベーションを実施した。ｃＡｂ−ＴＴ２コーティングプレートを、ＥＬＩＳＡバッファー中、ＴｅＮＴと共にその後インキュベートした。次にプレートを、１μｇ／ｍｌのＳＤＡ濃度で始まり、１２ウェルにわたる２倍ＳＤＡ希釈系列と共にインキュベートした。いくつかのＥＬＩＳＡでは、結合したＳＤＡを、１０００倍希釈した抗ｈｉｓ６クローンＢＭＧ−ｈｉｓ−１ＭＡｂ ＰＯコンジュゲート（ｈｉｓＰＯ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）、又は１０，０００倍希釈したヤギ抗ラマＩｇ ＰＯコンジュゲート（ＧＡＬＰＯ；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用して直接検出した。その他のＥＬＩＳＡでは、結合したＳＤＡを含むプレートを、ビオチン化されたＴｅＮＴ又はビオチン化されたウマＡｌｂと共にインキュベートした。ビオチン化された抗原を、次に０．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンＰＯコンジュゲート（ＳｔｒｅｐＰＯ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて検出した。結合したＰＯは、次に３，３’，５，５’テトラメチルベンジジンを用いて染色することにより検出した。０．５Ｍの硫酸の添加（１ウェル当たり５０μｌ）により反応を停止した後、４５０ｎｍにおける吸収を、分光光度計を使用して測定した。吸収データを、エクセル（登録商標）スプレッドシートテンプレート（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＵＳＡ）を使用して評価した。これを、最大Ａ４５０値を計算するのに使用した。４パラメーターロジスティック曲線を、適切なコンピューターソフトウェアを使用して、吸収及びＳＤＡ濃度に近似させた。この曲線を、有効濃度（ＥＣ）を内挿するのに使用し、各ＥＬＩＳＡにおける各ＳＤＡについて具体的な吸収値をもたらした。ＳＤＡ濃度の内挿で使用される正確な吸収値（表１４を参照）は、ＳＤＡが存在しない場合のバックグラウンド吸収値、及び異なるＳＤＡにおいて観測された最大吸収値に依存して、異なるＥＬＩＳＡ間で変動した。
様々なＥＬＩＳＡの結果を、到達した最大吸収（ＴｅＮＴ−ＧＴ１ｂ阻害ＥＬＩＳＡの場合、最低吸収；表１５）、及びＳＤＡの有効濃度（表１６）の両方について提示する。これらのＥＬＩＳＡから、以下のように結論付けることができる：
ＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ阻害ＥＬＩＳＡは、ＳＶＴ０２含有ＳＤＡ、並びに単量体のＳＶＡ、及びＳＶＧ ＳＤＡはいずれも阻害しない一方、すべてのさらなる単量体及び多量体ＳＤＡは確かに阻害することを示す。これは、単量体ＳＤＡ ＳＶＴ０６Ｌ、ＳＶＴ１５Ｌ、及びＳＶＴ１６Ｌにおける以前の観察知見と整合する（実施例１０）。
ＴｅＮＴ及びビオチン−ＴｅＮＴを用いたＥＬＩＳＡは、多量体ＳＤＡについて、１．６３及び１．７２という高い最大吸収値を予期された通り有するが、しかしいくつかの二重特異性多量体ＳＤＡについて最大で１．１２という低めの吸収値、並びにいくつかの単量体ＳＤＡについて最大で０．３５というわずかに増加した吸収値（これは予想外である）を有する。バックグラウンド吸収は、約０．１４である。ミルク中に存在し、ブロッキング剤として使用されるＩｇＧ又はＡｌｂに起因して、ブリッジングが存在する可能性がある。それにもかかわらず、これらの結果は、２つの二価ＳＤＡ及び二重特異性ＳＤＡによる二価のＴｅＮＴ結合を示唆する。
以前観測されたように、ＳＶＴ０２ ＳＤＡドメインを含有する多量体ＳＤＡは、直接コーティングされたＴｅＮＴに決して結合しない。
ｃＡｂ−ＴＴ２で捕捉されたＴｅＮＴ、及びビオチン化されたウマＡｌｂを用いたＥＬＩＳＡでは、単量体ＳＶＡ１２Ｌ ＳＤＡは結合せず、また直接コーティングされたＴｅＮＴには結合しなかったＳＶＴ０２−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６を含む、ＳＶＡ１２ ＳＤＡを含有するすべての多量体ＳＤＡは確かに結合する。
ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ ＳＤＡ、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ０６Ｍ４−Ｈ６ ＳＤＡは、抗ｈｉｓ６ＭＡｂ ＰＯ−コンジュゲートにより非効率的に認識されていると思われるが、しかしＧＡＬＰＯを用いて、又はＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ阻害ＥＬＩＳＡにおいて十分に検出される。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでも認められたｈｉｓ６タグのＣ末端タンパク質分解と整合する（実施例１４）。
ＳＶＴ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ０６Ｍ４−Ｈ６（実施例１４）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分解（ほとんどのＳＤＡ分子からｈｉｓ６タグが失われたことを示唆し得る）を示したが、それはＳＤＡ検出用として抗ｈｉｓ６ｍＡｂを使用する、イヌＩｇＧ上でのＥＬＩＳＡにおける低吸収値を説明することができる。この特定の二重特異性ＳＤＡの場合、ＳＶＴ０２は、直接コーティングされたＴｅＮＴに結合せず、またＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ ＥＬＩＳＡにおいて阻害もしないので、これは、ＧＡＬＰＯを使用してＴｅＮＴに対する結合を実証することにより、又はＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ阻害ＥＬＩＳＡにおいて確認不可能である。
イヌＩｇＧ又はイヌＡｌｂコーティングＴｅＮＴ、及びビオチン化されたＴｅＮＴを使用するＥＬＩＳＡにより実証されるように、ＳＶＴ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ０６Ｍ４−Ｈ６、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ０６Ｍ４−Ｈ６を含むすべての多量体ＳＤＡは、ＴｅＮＴ、及びＡｌｂ又はＩｇＧのいずれにも結合する。単量体ＳＤＡは、これらのＥＬＩＳＡにおいて結合を示さない。
ＳＴＶ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６は、イヌＩｇＧにおいて、ＳＶＧ１３Ｍ４を含有する他の多量体ＳＤＡよりもかなり低い０．１８という最大吸収値をもたらすが、しかし単量体ＳＶＧ１３Ｌにおける０．１６という数値とは同等であり、また非特異的単量体ＳＶＴ−ＳＤＡにおいて観測された０．０５〜０．０６というバックグラウンド値を明らかに上回る。これは、ＳＴＶ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６はイヌＩｇＧと結合することを示唆する。これは、イヌＩｇＧでコーティングされたプレートに結合したＳＴＶ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６を検出するために、ビオチン化されたＴｅＮＴを使用したときに、より高い吸収値により確認される。
これらを総じて考慮すると、すべての多量体ＳＤＡは、ＴｅＮＴ、及びＩｇＧ又はＡｌｂのいずれかに二重特異性結合を示すが、しかしいくつかのＳＤＡは直接コーティングされたＴｅＮＴに結合しないので（ＳＶＴ０２含有ＳＤＡ）、又はそれらはＧＴ１ｂ−ＴｅＮＴ相互作用を阻害しないので（ＳＶＴ０２含有ＳＤＡ）、又はそれらはＣ末端ｈｉｓ−タグを失っているので（ＳＶＴ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ０６Ｍ４−Ｈ６、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ０６Ｍ４−Ｈ６）、特異的ＥＬＩＳＡにおいて強い結合を示さない。
多量体ＳＤＡの二重特異性／二価の性質を確認するために、第２の完全に異なるアッセイ系を使用した。バイオレイヤーインターフェロメトリー（ＢＬＩ）を、ＴｅＮＴ（ホロ毒素）、アルブミン（ウマ）、及びいくつかのＳＤＡ間の相互作用を測定するための分析技法として使用した。ＢＬＩは、２つの表面から反射された光の波の干渉パターンを分析する光学的技術である。バイオセンサーに結合した分子の数の変化は、干渉波長パターンにおいてスペクトルシフトを引き起こし、同シフトは、ナノメータ（ｎｍ）シフトとして測定（リアルタイム）及び報告される。オクテット（Ｏｃｔｅｔ）（登録商標）プラットフォームは、ＳＤＡと標的抗原との間の生体分子複合体形成速度について正確な情報を取得する手段を、これによって提供する。Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）は、ストレプトアビジン（ＳＡＸ）バイオセンサーを装備していた。測定では、リガンドと呼ばれる１０μｇ／ｍｌのビオチン化されたＴｅＮＴ（ｂｉｏ−Ｔ、表１７ａ）、又はビオチン化されたウマアルブミン（ｂｉｏ−Ａｈ、表１７ｂ）を、ＳＡＸセンサーに１０分間カップリングさせた。センサー（各標的抗原がローディングされている）を、１００ｎＭで特異的ＳＤＡ（単量体又は多量体）を含有する溶液中に移し、そして相互作用が生じたかを４分間測定した。次のステップでは、センサー（ここでは単量体又は多量体ＳＤＡと結合している）を溶液中に移し、そして第２のアナライトである非標識毒素（ＴｅＮＴ、１００ｎＭ）又はウマアルブミン（Ａｈ、１００ｎＭ）のいずれかと５分間反応させた。センサーとアナライトとの間の相互作用（ｎｍシフト）を再度モニタリングした。結果を分析し、下記の表１７ａ及び１７ｂは、異なるＳＤＡ（単量体及び多量体）に対する結果を示す。
結果から以下のように結論付けることができる：
ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６は、２つのＴｅＮＴ−ＴｅＮＴ分子に対して二価結合を示す。
ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、及びＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６は、２つの異なるテスト構成において、ＴｅＮＴ及びウマアルブミンに対して二重特異性結合を示す。
ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６及びＳＶＴ１６Ｌは、ＴｅＮＴに結合することが可能であった。
ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６及びＳＶＧ１３Ｌは、予期された通り、ウマアルブミンと相互作用することはできなかった。
１６．ブタにおける多量体ＳＤＡ血清半減期の分析
単量体及び多量体ＳＤＡを用いたいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（実施例４、５、７、８、９、１５、及び１８）では、これらのＳＤＡは、いくつかの種（例えば、ウマ、イヌ、ネコ、及びブタ）の血液成分と結合することができることが実証された。ＳＤＡのいくつかについて、血清半減期の延長に関するそのｉｎ ｖｉｖｏでの特徴を評価するために、動物実験を実施した。ＳＤＡはウマ及びイヌタンパク質のみの使用により生成したので、動物実験は、真に異種間となるようにブタを対象に実施した。この目的のために、オス１２匹、及びメス１２匹からなる約６週齢の仔ブタ２４匹を使用した。多量体ＳＤＡのイノキュレーションの前にそれらを１０日間秤量し、並びにそれぞれ性別の分布が等しく、好ましくは平均体重が等しく、及び好ましくは母ブタの起源に基づき仔ブタの分布が等しい、仔ブタ６匹からなる４群に割り振った。群（表１８）は、筋肉内注射される二重特異性ＳＤＡをコードするプラスミドの名称（ｐＲＬ４８９、ｐＲＬ４９０、ｐＲＬ４９５、及びｐＲＬ４９９）によりそれぞれ示す。群ｐＲＬ４８９の仔ブタ３匹（オス２匹及びメス１匹）は、Ｍ８ｇｇｓＶＩ４ｑ６ｅと呼ばれるプラスミドｐＲＬ２７６によりコードされる第２の二重特異性ＳＤＡの投与も受けた［４４］。この二重特異性ＳＤＡは、半減期を測定するのに以前使用された［１９］が、しかし口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）抗原に対して特異的である異なる融合型ＳＤＡドメインであるＳＤＡ２ Ｋ６０９ｇｇｓＶＩ−４ｑ６ｅと同一のＩｇＧ結合ＳＤＡドメインを含有する。
仔ブタをＳＤＡイノキュレーションの１日前に秤量した（−１日目）。これらの体重に基づき、多量体ＳＤＡの投与量を計算した（表１８）。投薬量は、群毎に０．２、０．３〜０．５ｍｇ／ｋｇまで増加した。ＰＢＳ内で希釈されたフィルター滅菌処理済みのＳＤＡを、約５ｍｌの容積で、後部大腿部に、単一部位において筋肉内注射した。血清調製用の血液サンプルを、ＳＤＡイノキュレーション直前、並びにＳＤＡイノキュレーション後の１、２、４、８、１１、１４、２１、及び２８日目に、頸静脈から収集した。仔ブタの体重は、動物の成長について血清半減期を補正するために、２８日目の実験終了時にも決定した。
血清中のＳＤＡレベルを、ＴｅＮＴホロ毒素又はＦＭＤＶ、及び抗タグＭＡｂ ＰＯ−コンジュゲートを使用してＥＬＩＳＡにより測定した。この目的のために、９６ウェルポリスチレン製プレートを、ＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌのＴｅＮＴホロ毒素、又はコーティングバッファー（５０ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２バッファー）に溶解した、ＦＭＤＶ Ｏ１ ｍａｎｉｓａに対して特異的なＳＤＡ Ｍ２３Ｆ［２］を用いて、４℃、１００μｌ／ウェル、オーバーナイトでコーティングした。バッファーを用いてプレートを洗浄した後、すべての後続するインキュベーションを、ＲＴにおいて１時間実施した。Ｍ２３Ｆコーティングプレートを、５μｇ／ｍｌのＦＭＤＶ Ｏ１ ｍａｎｉｓａの１４６Ｓと共に、ＥＬＩＳＡバッファー中でその後インキュベートした。次に、プレートを、１μｇ／ｍｌ及び０．１μｇ／ｍｌの両ＳＤＡ標準について、その濃度から始まり、８ウェルにわたるＳＤＡの２倍希釈系列、２シリーズ、及び５倍希釈された仔ブタ血清と共にインキュベートした。ＳＶＴ０６又はＳＶＴ１６含有多量体ＳＤＡを用いてイノキュレーションした仔ブタの血清を、ＴｅＮＴコーティングプレート上でインキュベートした一方、Ｍ８ｇｇｓＶＩ４ｑ６ｅを用いてイノキュレーションした仔ブタに由来する血清をＦＭＤＶコーティングプレート上でインキュベートした。ＴｅＮＴコーティングプレートを、抗ｈｉｓ６ ｍＡｂ−ＰＯコンジュゲートと共に、及びＦＭＤＶコーティングプレートを、抗ｍｙｃＭＡｂ−ＰＯコンジュゲートと共に、その後インキュベートした。結合したＰＯを、次に３，３’，５，５’テトラメチルベンジジンを用いて染色することにより検出した。０．５Ｍの硫酸の添加により反応を停止した後、４５０ｎｍにおける吸収を、分光光度計を使用して測定した。４パラメーターロジスティック曲線を、標準の吸収及びＳＤＡ濃度に近似させた。この曲線を、ＳＤＡ濃度を内挿するのに使用し、各ＥＬＩＳＡにおける各血清サンプルについて具体的な吸収値をもたらした。計算後の血清ＳＤＡ濃度を、エクセル（登録商標）スプレッドシートテンプレート（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＵＳＡ）にエクスポートした。
仔ブタの体重は、血清収集の４週間において約１０ｋｇ〜約２５ｋｇ増加した。血清半減期測定において体重が増加した場合、以下のように補正した。仔ブタ毎に、１時間当たりの体重増加は、最初の体重に依存すると仮定し、式ＢＷ（ｔ）＝ＢＷ（０）＊Ｔｔ（Ｔ＝１０（ｌｏｇ１０（ＢＷ（ｔ）／ＢＷ（０））／ｔ）と書き直すことができる）に当て嵌めた。式中、ｔは時間（時）であり、ＢＷ（ｔ）は時間ｔにおける体重であり、ＢＷ（０）は時間０における体重であり、Ｔは１時間当たりの体重増加分である。
これは、−１日目、及び２８日目における仔ブタの体重からのファクターＴの計算を可能にする。−１日目〜２８日目の間の中間の時点において、次にＴｔを用いて測定されたＶＨＨ濃度を掛け算することにより、体重増加について補正した。
最終血清半減期を下記の式に基づき計算した：
ＳＤＡ（ｔ）＝ＳＤＡ（０）＊（０．５（ｔ／Ｔ１／２β））、式中、ｔは時間（時）であり、ＳＤＡ（０）は、使用した最初の時点におけるＳＤＡ濃度（半減期の計算では体重増加について補正される）であり、ＳＤＡ（ｔ）は、時間ｔにおけるＳＤＡ濃度であり、Ｔ１／２βは最終半減期である。
２８日目のサンプルには、多くの場合バックグラウンド吸収値の３倍未満である吸収値から明らかなように、低めのＳＤＡレベルが含まれたので、これらのデータを分析から除外した。血清半減期を４日目〜２１日目のサンプルから計算した。個々の仔ブタ毎に、上記式に基づき、時間に対してＳＤＡ濃度を当て嵌めるのに、マイクロソフト社エクセルのＳｏｌｖｅｒ機能を使用した。Ｔ１／２βの平均及び標準偏差を、次に計算した。
静脈内注射したＩｇＧのヒトにおける生体分布容積は、［７３］の参考資料によれば、６０ｍｌ／ｋｇ体重である。従って、血液中のＳＤＡの初期（１〜２日目）濃度は、ほとんどのＳＤＡは当初血液中にあるので、注射した用量の１／０．０６＝１６．６７倍よりもわずかに低くなるものと予期される。これは、２ｍｇ／Ｌを上回る初期のＳＤＡ濃度を有する３つのＡｌｂ結合ＳＤＡ、及びコントロールＳＤＡ Ｍ８ｇｇｓＶＩ−４ｑ６ｅについてうまく当て嵌まる（図６）が、しかしＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６の場合、極めて低く、その短い半減期と整合する。
４日目（９６時間）から開始するＳＤＡのＴ１／２β（体重補正を含む）を計算し、それを表１８にまとめる。Ｍ８ｇｇｓＶＩ−４ｑ６ｅのＴ１／２βは、以前測定されたＫ６０９ｇｇｓＶＩ−４ｑ６ｅのＴ１／２βよりも低い［１９］。これは、融合したＳＤＡが異なること、又は２つの動物実験の間の差異に起因し得る。
３つすべてのＡｌｂ結合多量体ＳＤＡは、１１１〜１３５時間の範囲のＴ１／２βを示し、その標準偏差は小さかった。これは、陽性コントロールＳＤＡ Ｍ８ｇｇｓＶＩ−４ｑ６ｅの８２時間のＴ１／２βよりも高い。これら３つすべての多量体ＳＤＡには、ＳＶＴ０６、ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑのいずれかに融合し、又はこれらのＳＶＴ ＳＤＡドメインの両方に融合して多量体ＳＤＡとなる、Ａｌｂ結合ＳＤＡドメインＳＶＡ１２Ｍ２が含まれた。明らかに、ＳＶＡ１２Ｍ２によりもたらされる半減期は、それに融合した特異的ＳＶＴ ＳＤＡにより、またそれに融合したＳＤＡの数にも影響を受けない。
ＩｇＧを標的とするＳＶＧ１３ ＳＤＡを含有するＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６のＴ１／２βは２０時間に過ぎない。Ｔ１／２βは、血清タンパク質と結合せず、そして１．８時間のＴ１／２βを有するコントロールのモノマーＳＤＡ Ｋ６０９ｇｇｓＫ８１２［１９］と比較して明らかに増加し、半減期延長が生じたことを示唆する。それにもかかわらず、これは、Ａｌｂ結合多量体ＳＤＡのＴ１／２βよりもかなり低い。ＥＬＩＳＡにおいて、ＳＶＧ１３ＬがブタＩｇＧと結合すると、その結果、ネコ、ウマ、イヌ、及びヒトＩｇＧと比較したとき、ブタＩｇＧの方が最大吸収値は低く、またＥＣ値も低かった（表８）。これは、ブタＩｇＧ以外のその他のＩｇＧに対するＳＶＧ１３Ｌの結合は、より高い親和性を有し、従ってこれらの種においてより延長した血清半減期をもたらすことを示唆する。
ウマ、イヌ、及びネコアルブミンに対するＳＶＡ１２Ｌの親和性は１０〜２７０ｎＭで変動し、そしてブタアルブミンについておよそ１５９ｎＭであった（実施例１８）。従ってＳＶＡ１２の類似した血清半減期、又はより良好でありさえする血清半減期が、多量体ＳＤＡに含まれるとき、ウマ、イヌ、及びネコにおいてｉｎ ｖｉｖｏで予期され得る。
陽性コントロールＭ８ｇｇｓＶＩ−４ｑ６ｅは、ＶＩ−４Ｌにも含まれるように、ＳＤＡドメインＶＩ−４を含有する（実施例９）。ＳＤＡ ＶＩ−４Ｌ、ＶＩ８Ｌ、ＶＩ１１Ｌ、及びＶＩ１４Ｌは、ブタＩｇＧに対して１〜３３ｎＭの親和性（ＫＤ）を有する［１９，４４］。ＳＤＡ ＶＩ４Ｌ、ＶＩ８Ｌ、ＶＩ１１Ｌ、及びＶＩ１４ＬがブタＩｇＧに対して示したように、ＳＤＡ ＳＶＧ１３は、ウマ、イヌ、及びネコＩｇＧに対して同等のＥＣ値を示した（表８）。従って、ＳＶＧ１３の類似した血清半減期が、ウマ、イヌ、及びネコ種において、ｉｎ ｖｉｖｏで予期され得る。
１７．マウスモデルにおける破傷風毒素中和能力に関するＳＤＡの分析
単量体及び多量体ＳＶＴに基づくＳＤＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（実施例３、１０、１１、１２、１３、１５、及び１８）を行い、これらのＳＤＡは、いくつかの実験的なテスト構成において破傷風ホロ毒素に有効に結合することができることを実証した。これらのＳＤＡのいくつかについてｉｎ ｖｉｖｏでの特徴を評価するために、その破傷風毒素中和能力を評価する動物実験を実施した。マウス毒素中和テストを使用して、６つの候補ＳＤＡサンプル（表１９を参照）を、抗破傷風毒素効力についてテストした。１つの単量体ＳＤＡ（ＳＶＴ０３Ｌ）、４つの二重特異性ＳＤＡ（ＳＶＴ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ１５３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ１６Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６）、及び１つの二重特異性（アルブミン及び破傷風に対する）、及び二価の（破傷風毒素に対する）ＳＤＡ（ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６）を、マウス毒素中和テスト（ＴＮＴ）において評価した。破傷風抗毒素に関するヨーロッパ薬局方モノグラフ００９１に記載される方法と類似した方法に従い、実施した。ＳＤＡの中和エンドポイントを正確に決定するために、Ｐｈ Ｅｕｒモノグラフ００９１に記載の方法よりも高い感度レベルを使用してアッセイを実施し、より低い量の毒素中和抗体の検出を可能にした。実施したアッセイの破傷風毒素（ＮＩＢＳＣ：ＡＷＸ４６６４、１／１００に希釈）用量レベルは、Ｌｐ／２００であった。各試験において、参照破傷風抗毒素ＴＥ３（最初の希釈において０．０２５ＩＵ／ｍｌまで１／４００事前希釈）を含め（１群マウス４匹）、テストサンプル毎に効力の決定を可能にした。毎回、０．３５ｍｌの容積が固定された毒素を、２．１５ｍｌの事前希釈されたＳＤＡテストサンプルと混合し、そして３０分間放置した後、マウスに注射した（０．５ｍｌ ｓ．ｃ．、左大腿部）。各事前希釈されたサンプルを、バッファーを用いて連続希釈して、２倍又は４倍希釈系列を作出した。各ＳＤＡ希釈は、ｎ＝４匹のマウスを有した。動物を、破傷風麻痺の兆候について９６時間観察した。各アッセイにおいて、参照ＴＥ３をバッファーで希釈した（２倍又は４倍）。各試験（１、２、及び３）において、メスＮＩＨマウス、１６〜２０ｇ、５〜６週齢を使用した。合計３回の試験を連続して実施した。
試験１では、アッセイ混合物中の各ＳＤＡの開始濃度が、ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６（混合物中の量は１００ｎＭであった）を除くすべての候補について１０００ｎＭとなるように、ＳＤＡサンプルを希釈した。各候補を次に連続希釈して、全体で５又は６希釈からなる２倍希釈系列を作出した（表１９を参照）。各希釈物を固定された量の破傷風毒素と混合し、そして３０分間放置した後、マウスに注射した（０．５ｍｌ ｓ．ｃ．、左大腿部）。各希釈群はｎ＝４匹のマウスを有した。動物を、破傷風麻痺の兆候について９６時間観察した。各希釈において保護されたマウスの割合を表１９に示す。
ＳＤＡ ＳＶＴ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ０３Ｌ、及びＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６について、１０００ｎＭのレベルではｉｎ ｖｉｖｏでの破傷風毒素中和効果は認められなかった。
ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６は、いずれも１０００ｎＭ及び５００ｎＭの濃度において保護を実現した。両ＳＤＡは、このｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいてテストしたとき、破傷風毒素を効率的に中和することが可能であった。
ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６ ＳＤＡは、６希釈すべてにおいて完全な保護を実現した。１／１０の低濃度で投与したにもかかわらず、この二価（すなわち、ＴｅＮＴに対して）のＳＤＡは、その他のすべての二重特異性ＳＤＡよりも強力であった。さらに、２融合型のＳＶＴ ＳＤＡ（ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ）に融合したＳＶＡ１２Ｌ ＳＤＡは、（ｉｎ ｖｉｔｒｏで）マウスアルブミンに結合しない。従って、この多量体ＳＤＡは、設定された３０分というインキュベーション時間内に破傷風毒素を非常に効率的に中和する。エンドポイント（希釈ステップ２及び３の中間）における参照抗毒素ＴＥ３（最初の希釈において０．０２５ＩＵ／ｍｌまで１／４００事前希釈）の濃度に基づき、テストサンプル毎の効力を、ＩＵ／ｍｌで表すことができる。エンドポイントが得られなかった場合、効力は、＜（すべての希釈において０％保護の場合）、又は＞（すべての希釈において１００％保護の場合）として表されることに留意すること。データを表２０に示す。
参照抗毒素に関するエンドポイントは、アッセイ混合物において希釈２及び３の中間＝１．３ｍｌであった（アッセイ混合物中、０．０３２５ＩＵ）。未知のサンプルの場合、エンドポイントにおいて、アッセイ混合物中には０．０３２５ＩＵ存在する＝２．１５ｍｌ中に０．０３２５ＩＵ＝０．０１５１ＩＵ／ｍｌ。この数値は、次に関連するＳＤＡの各総希釈係数で掛け算され得る。
三価のＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６は、テストしたすべてのサンプルのうちで最高の効力を有する（３．１ｎＭよりも低い濃度において保護する）。いくつかの種のアルブミンと結合するのは、３つのリンクしたＳＤＡのうち、その１つにＳＤＡ（ＳＶＡ１２）を有する三価ＳＤＡである。他の２つのＳＤＡ（ＳＶＴ０６及びＳＶＴ１６）は高い親和性（低ＫＤ値）で破傷風毒素と結合し、そしてそれぞれは異なるドメインに結合する（実施例１３、１５，１８）。
その後、ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６について保護のエンドポイントを決定するために、別のＴＮＴを実施しなければならなかった（試験２）。さらに、文献［７，４２］では、異なるエピトープを標的とするマウスモノクロナール抗体を混合すると、破傷風毒素の中和レベルに対して相乗的効果を発揮し得ることが記載されている。類似した効果が、破傷風毒素を中和することができるｓｃＦｖについて観察された［６７］。その他の資料［２４］では、二価の抗破傷風毒素ナノボディは、単量体の形態と比較したとき、有効性の強い改善を実現しないことが公表された。従って、さらに、この第２のテストでは、これらの異なる多量体ＳＤＡの併用物が、溶液中で共に混合されたとき、単独でテストしたときよりも強い毒素中和効果（相乗的効果）を示すか評価された。テストされたスキームについては表２１を参照されたい。アッセイは、上記のように実施した。
第２のマウス毒素中和テストの結果を、表２２ａ、及び２２ｂ、及び２３に示す。参照抗毒素に関するエンドポイントは、試験１と同一であり、アッセイ混合物において希釈２及び３の中間＝１．３ｍｌであった（アッセイ混合物中、０．０３２５ＩＵ）。従って、試験１に示す計算と同一の効力計算（初回希釈時の関連する濃度に基づき）が群７（単一のＳＤＡ）に適用される。ＳＤＡを併用する場合、各ＳＤＡの相対的寄与は不明であるので、混合物内の各ＳＤＡの効力について推定値を提供することは不可能である。しかしながら、混合物の効力は、ＳＤＡ混合物が１００％保護を実現した最低濃度（ｎＭ）として記載することができる（表２２ｂ）。
多量体のＳＤＡ ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６及びＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６が、ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６と、６２．５ｎＭで混合したとき（群１及び３）、ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６を単一の分子（５００ｎＭ）としてテストしたときよりも、少なくとも＞１２５倍高いレベルで保護を実現した（両ＳＤＡの最終濃度は全体で３．９１ｎＭであった）。従って、これらのＳＤＡの間の強い相乗的効果の明白なエビデンス（表２１ａ＋表２１ｂを参照）が実証された。
群５のマウスは保護されなかったが、これは、この混合物では、関連するＳＤＡのこれらの濃度において、ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６及びＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６について、相乗的効果が見出されなかったことを示している。
ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６は、やはりすべての希釈において完全な保護を実現した。完全な保護が見出された最終希釈物は０．２ｎＭに等しいＳＤＡ量を有した（表２３）。このＳＤＡの効力は、従って＞１４７８ＩＵ／ｍｇである。
試験２のデータから、混合物内のその他のＳＤＡの相乗的効果が最終希釈物中に単独で存在するので、ＳＤＡ ＳＶＴ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６及びＳＶＴ０３Ｌが相乗的効果を有し得ることを除外することはできない。しかしながら、個々のＳＤＡ ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、及びＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６の群２及び４の最終濃度は、ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６と混合したとき、群１及び３の同一のＳＤＡの最終濃度よりも１／２低かった。最低濃度（最終希釈ステップにおいて０．９７ｎＭ）において完全な保護が見出された。その後、候補ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６の効力のエンドポイントを決定するために、第３試験を実施した（下記の表２４を参照）。この試験では、１ステップ毎に４倍希釈を実施するように決定された。さらに、単一の多量体ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６が単独でも、２つのＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、及びＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６分子を混合し、そして同様に希釈したときよりも強力であるか調査するために、この群もやはり含まれた。
ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６は、単一のＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６の効力をさらに増加させるか調査するために、両者混合物を別の群においてやはりテストした。
試験３では、参照抗毒素（ＴＥ−３）に関するエンドポイントは、試験１及び試験２で得られたエンドポイントとはわずかに異なり、希釈２においては動物の７５％が保護されたにすぎない（表２４）。５０％保護用量を計算するためにＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を使用すると、エンドポイントにおける抗毒素の濃度は、アッセイ混合物中、０．０３４ＩＵとして計算される（第１段階及び第２段階では、参照に対するエンドポイントは、希釈２及び３の中間＝アッセイ混合物中０．０３２５ＩＵであった）。
ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６では、それは個別にテストされたが、エンドポイントは希釈１であり（動物の５０％が保護された）、及び希釈１は、アッセイ混合物中で０．０３４ＩＵを含有する（＝テストサンプル２．１５ｍｌ中０．０３４ＩＵ、すなわち０．０１５８ＩＵ／ｍｌ）。中和力価は、表２５に示すように、サンプルに対応する総希釈係数に、エンドポイントにおける抗毒素の濃度を掛け算することにより計算可能である。
ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６について非常に高い破傷風毒素中和能力が再度確認された。この特定の多量体ＳＤＡに関するマスターストックの効力を、この特定のアッセイの結果から１１，４７４ＩＵ／ｍｌ（タンパク質１ｍｇ当たり１５００ＩＵ超に等しい）として計算した。０．２ｎＭからそれ以降のより小規模な希釈ステップを用いた別のアッセイでは、このＳＤＡの中和能力はよりいっそう正確に決定可能である。
特に、ＳＶＡ１２Ｌは、マウスＡｌｂに結合せず、従ってマウスにおいて半減期の延長をもたらしたり、またそれをマウスに投与した後の効力測定値（実施例７）に寄与したりする可能性は低い。
ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６とＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６とを併用したときの相乗的効果の兆候は、完全な保護を実現する０．４ｎＭの総ＳＤＡにおいて実証された。
候補ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６及びＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６の併用物について、このアッセイにおいて保護は認められなかった。従って、上記結果に基づき、完全な保護をもたらすのに必要とされるこのＳＤＡの対の総濃度は、０．４〜４ｎＭの範囲であり、混合物内の個々のＳＤＡについて０．２〜２ｎＭ又はそれより低い量となると結論付けることができる。
従って、実施した３つの試験より、単一の二価及び二重特異性多量体ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６は、極めて強力な破傷風毒素に対して非常に高レベルの保護を実現することが分かる。さらに、それは、単一の二重特異性ＳＤＡであるＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６及びＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６の２つを混合した後に認められた強い相乗的効果よりも優れていた。ＳＶＧ１３Ｌ ＳＤＡは、混合物をマウスに投与した後、これら二重特異性ＳＤＡの効力に寄与し得るマウスＩｇＧ（実施例８）に結合することが判明した。二価の二重特異性ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６は、単一分子として、混合物が示す超相乗的な破傷風毒素中和特性よりも高い効力を有し、これは顕著な特性である。
１８．異なるＳＤＡがＴｅＮＴ、アルブミン、及び免疫グロブリンに対して有する親和性の決定
いくつかのＳＤＡを、その標的（異なる種のＴｅＮＴ、アルブミン、及び免疫グロブリン）結合特性についてテストした。破傷風毒素結合特性は、各ＳＶＴ ＳＤＡが破傷風毒素をｉｎ ｖｉｖｏで中和する能力において特に重要である（実施例１７）。ＳＶＡ、及びＳＶＧ ＳＤＡが、一旦ＳＶＴ ＳＤＡに融合すれば、ＳＶＴ ＳＤＡの最終血清半減期を延ばすのに役立つ。従って、ＳＶＡ及びＳＶＧ ＳＤＡにとって、異なる血液成分に対する結合特性［１９、２２、２３、２５］は、重要である。獣医学的目的にとって、さらに、そのような血液成分間の種の相違に対処することが重要である。特定の異種間疾患標的（例えば、破傷風）の場合、種毎に個別の治療用ＳＤＡを開発する代わりに、いくつかの種を対象とする治療用途で、単一のＳＤＡを使用することが好ましい。
ここでは、バイオレイヤーインターフェロメトリー（ＢＬＩ）技術を、ＴｅＮＴ、異なる種のアルブミン、及び異なる種の免疫グロブリン、並びにいくつかの単量体及び多量体ＳＤＡの間の相互作用を測定するのに使用した。ＢＬＩは、光の波の間の干渉パターンを分析する光学的分析技法である。バイオセンサー（リガンドでコーティングされている）に結合した分子（アナライト）の数の変化は、干渉波長パターン（＝シグナル）においてスペクトルのシフト（ｎｍシフト）を引き起こし、リアルタイムで測定される。ＫＤは、リガンドがそのアナライトとどのくらいしっかりと結合するかに関する指標である親和定数又は平衡解離定数である。それは、解離速度に対する会合速度の比を表し、ｋａ及びｋｄｉｓを使用して計算可能である。ＫＤはモルユニット（Ｍ）で表される。ＫＤは、平衡時に、リガンド結合部位の５０％が専有されるアナライトの濃度、又はアナライトと結合しているリガンド分子の数がアナライトと結合していないリガンド分子の数に等しい濃度に対応する。ＫＤ及び親和性の間に逆相関が存在し、親和定数がより小さければ、より厳格な相互作用、又はリガンドに対するアナライトのより強い親和性を示唆する。
標的とＳＤＡとの間の相互作用を測定するために、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６装置（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）は、ストレプトアビジン（ＳＡ／ＳＡＸ）、Ａｎｔｉ−Ｐｅｎｔａ−ＨＩ（ＨＩＳ１Ｋ）、又は例えばＮｉ−ＮＴＡ（ＮＴＡ）ディップアンドリード（Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ）（商標）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）を備えた。
破傷風毒素に対するＳＤＡの結合親和性を決定するために、２μｇ／ｍｌのビオチン化された（実施例３を参照）ＴｅＮＴをＳＡセンサーとカップリングさせた。ＳＤＡを、０．０２％ツイーン２０（ＡＣＲＯＳ ＯＲＧＡＮＩＣＳ社、カタログ番号２３３３６２５００）を含有するＰＢＳバッファー（ＰＢＳ１０×Ｆｉｓｃｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ｃａｔ ＢＰ３９９−１、及びＷＦＩ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２２１１０）（ＰＢＳＴｗｅｅｎ）中で、１００ｎＭ〜１．５６ｎＭの２倍希釈系列（ＳＶＴ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ０３Ｌ、ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、及びＳＶＴ１６Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６）、又は１０ｎＭ〜０．１５６ｎＭの２倍希釈系列（ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、及びＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６）として希釈した。ＳＤＡ希釈系列を、ＴｅＮＴカップリングセンサーと共に５分間（１００ｎＭの開始濃度）、又は１０分間（１０ｎＭの開始濃度）インキュベートし、その後ＰＢＳ−ツイーン中で、さらに１０分間（ＳＶＴ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ０３Ｌ、ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、及びＳＶＴ１６Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６）、又は６０分間（ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、及びＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＳＶＡ１２１２Ｍ２−Ｈ６）解離ステップを実施した。
破傷風毒素に対するＳＤＡ ＳＶＴ０６Ｌ、ＳＶＴ１５Ｌ、及びＳＶＴ１６Ｌの結合親和性を決定するために、５μｇ／ｍｌの各ビオチン化されたＳＤＡをＳＡセンサーとカップリングさせ、そして破傷風毒素（７５ｎＭ〜４．６９ｎＭの２倍希釈系列）を、ＳＤＡカップリングセンサーと共に５分間インキュベートし、その後ＰＢＳ−ツイーン中で解離ステップをさらに３０分間実施した。
次に、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアを使用して結果を分析し、親和定数（ＫＤ、ｋｄｉｓｓ／ｋａ）を決定した。表２７は、いくつかの精製後のＳＤＡについて親和性データを示す。
二重特異性及び単量体ＳＤＡ（ＳＶＴ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ０６Ｌ、ＳＶＴ１５Ｌ、ＳＶＴ１６Ｌ、ＳＶＴ１６Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、ＳＶＴ１６Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６）は、サブナノモル〜ピコモルの親和性でＴｅＮＴに結合した。ＴｅＮＴの中和能力にとって、これは重要な特徴である。ＳＶＴに基づくＳＤＡが迅速に会合し、そして極めてゆっくりと解離することで、毒素が注入された動物に通常見出される低い毒素濃度において、迅速且つ長期にわたる方式で毒素がその活性を発揮するのを阻止する。
特に、破傷風毒素及びＳＤＡの複合体の安定性は、例えばニューロンにおける毒素の取り込みを阻止するので重要である。非常に低い解離（Ｋｄｉｓ）値が、ＳＤＡ ＳＶＴ０３Ｌ、ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ０６Ｍ４−Ｈ６、及びＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６について見出された。
これら４つの断片Ｃ結合ＳＤＡのうちの３つ（ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、及びＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６）について、ｉｎ ｖｉｖｏ ＴＮＴにおいて、単一のＳＤＡとして（＜４μｇ／ｍｌ、及び＜３０ｎｇ／ｍｌレベルにおいて）、及び共に混合して（＜３０ｎｇ／ｍｌレベルにおいて、実施例１７を参照）テストしたとき、優れた毒素中和特性が実証された。
２つのＳＶＴドメインを含有する３つのＳＤＡ（ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ０２−ＧＳ２−ＳＶＧ０６Ｍ４−Ｈ６、ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、及びＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６）のＴｅＮＴに対するアビディティー（ＫＤ）は、ピコモルの範囲内である。ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６の場合、測定されたアビディティーは１３ピコモルであり、そしてこのＳＤＡは、ｉｎ ｖｉｖｏ毒素中和モデルにおいて優れた破傷風毒素中和特性を示した（実施例１７）。
このＳＤＡは、比較可能な単量体ＳＤＡ、又は１つの対応するＴｅＮＴ結合ＳＤＡドメイン（ＳＶＴ０６、又はＳＶＴ１６）のみを含有する多量体ＶＨＨの親和性よりも約１０倍高い親和性（低いＫＤ値）を有し、ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６中に存在する両方のＳＤＡドメインは、同時に抗原に結合する能力を有することを示唆する。
血清アルブミンに対するＳＤＡの結合親和性を決定するために、いくつかのアッセイを実施した。初めに、１．０（ＳＶＡ０６Ｌ）、又は１．５（ＳＶＡ１２Ｌ、ＳＶＡ１６Ｌ）マイクログラム／ｍｌのＳＤＡをＮｉ−ＮＴＡセンサー（ローディング時間１５分）とカップリングさせた。ＳＶＡ０６Ｌに対して、ウマ、イヌ、又はネコアルブミンを、７６．９ｎＭ〜４．８１ｎＭ（ウマ、又はイヌ、又はネコアルブミン）の２倍希釈系列でアナライトとして添加した。ＳＶＡ１２Ｌの場合、３０７．７ｎＭ〜１９．２ｎＭ（ウマ、又はイヌアルブミン）、又は６１５．４ｎＭ〜３８．５ｎＭ（ネコアルブミン）の２倍希釈系列を使用した。ＳＶＡ１６Ｌの場合、１００ｎＭ〜３．１ｎＭ（ウマ、イヌ、及びネコアルブミン）の２倍希釈系列を使用した。アルブミンを、ＳＤＡ（ＳＶＡ０６Ｌ、及びＳＶＡ１２Ｌ）コーティングセンサー上で１分間反応させ、その後さらに２分間、ＰＢＳＴｗｅｅｎ中での解離ステップが続いたが、但しＳＶＡ１６Ｌの場合、間隔はそれぞれ３分及び５分であった。
ブタアルブミンに対するＳＶＡ１２Ｌの親和性を決定するために、２５０〜１５．６ｎＭの２倍希釈系列を使用したが、ここでは１分間の会合及び解離ステップを使用した。
次に、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアを使用して結果を分析した。表２８は、テストしたＳＤＡに関するデータを示す。
ウマ又はイヌ免疫グロブリンのＦｃ部分に結合するいくつかのＳＤＡも、その結合特性についてテストした。初めに、ウマＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社、カタログ番号３１Ｃ−ＣＨ０８０４）に結合したときのＳＤＡ ＳＶＧ０３Ｌ、ＳＶＧ２３Ｌ、及びＳＶＧ２４Ｌの親和性を決定するために、０．５μｇ／ｍｌのＳＤＡがＮＴＡセンサーとカップリングした構成を使用した。スカウトアッセイは、ＳＶＧ２３Ｌは、使用したウマＦｃタンパク質に結合しないことを示した。ＳＤＡ ＳＶＧ０３Ｌでは、ウマＩｇＧ（Ｆｃ）を、ＰＢＳＴｗｅｅｎ中、５０ｎＭ〜３．１３ｎＭの２倍希釈系列として希釈した。ＳＤＡ ＳＶＧ２４Ｌでは、ウマＩｇＧ（Ｆｃ）を、ＰＢＳＴｗｅｅｎ中、１００ｎＭ〜６．２５ｎＭの２倍希釈系列として希釈した。Ｆｃ希釈系列を、ＳＤＡカップリングセンサーと共に３分間（会合段階）インキュベートし、その後、ＰＢＳＴｗｅｅｎ中、１０分間の解離ステップが続いた。
イヌＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社、カタログ番号００４−０１０３）に結合するときの、ＳＤＡ ＳＶＧ０３Ｌ、ＳＶＧ２３Ｌ、及びＳＶＧ２４Ｌの親和性を決定するために、１μｇ／ｍｌのＳＤＡがＮＴＡセンサーとカップリングした構成を使用した。スカウトアッセイは、ＳＶＧ０３Ｌは使用したイヌＦｃタンパク質に結合しないことを示した。ＳＤＡ ＳＶＧ２３Ｌでは、イヌＩｇＧ（Ｆｃ）を、ＰＢＳＴｗｅｅｎ中、４０ｎＭ〜２．５ｎＭの２倍希釈系列として希釈した。ＳＤＡ ＳＶＧ２４Ｌでは、イヌＩｇＧ（Ｆｃ）を、ＰＢＳＴｗｅｅｎ中、４００ｎＭ〜１８．８０ｎＭの２倍希釈系列として希釈した。Ｆｃ希釈系列を、ＳＤＡカップリングセンサーと共に７０〜１００秒間（会合段階）インキュベートし、その後、ＰＢＳＴｗｅｅｎ中、５分間の解離ステップが続いた。
次に、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアを使用して結果を分析した。表３５は、ウマ又はイヌ免疫グロブリンのＦｃ部分に対してテストしたＳＤＡに関するデータを示す。
アルブミン及び免疫グロブリンは豊富に存在する血清タンパク質であることから、ほとんどのＳＤＡ分子がこの標的と結合するようにするために、アルブミン又は免疫グロブリンに対するＳＤＡの親和性が非常に高くある必要はない。この概念と整合して、遺伝子工学的に操作された細菌アルブミン結合ドメインを使用するタンパク質治療薬の血清半減期の延長は、アルブミンに対する親和性にほとんど依存しないことが観測されている。ＫＤ値が１００ｎＭよりも低い（結合親和性が高まっている）場合、血清半減期は、親和性により影響を受けなかった。ＫＤ値が１μＭに接近したときに限り、血清半減期はわずかに減少した［３６，３７］。
ＳＤＡ ＳＶＡ０６Ｌ、ＳＶＡ１２Ｌ、及びＳＶＡ１６Ｌの場合、ブタ、ウマ、イヌ、又はネコ起源のアルブミンに対する親和性は、１〜２７５ｎＭで変動し、すべて１０００ｎＭ未満であった。多量体ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６の場合、およそ１１０〜１４５時間の血清半減期が、若年のブタにおいて見積もられた。投与後２１日目において、ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６（０．３ｍｇ／ｋｇ）、ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６（０．２ｍｇ／ｋｇ）、及びＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６（０．５ｍｇ／ｋｇ）が、ブタの血清中でなおも検出可能であった。従って、ＳＤＡ ＳＶＡ１２Ｌの場合、投薬量、それに融合したＳＤＡの量、及びＳＤＡの種類は、ブタにおける半減期に対して有意に影響しなかった。すべてのＳＶＡ ＳＤＡは、ウマ及びイヌアルブミンを用いて生成されたので、これらＳＤＡについて、類似した半減期プロファイルが、ウマ、イヌ、及びネコにおいて予期され得る。
ＳＤＡ ＳＶＧ０３Ｌ、ＳＶＧ２３Ｌ、及びＳＶＧ２４Ｌの場合、ウマ又はイヌ起源の免疫グロブリンのＦｃ部分に対する親和定数ＫＤは、０．１〜４ｎＭで変動し、すべて１０ｎＭ未満であった。これらのバインダーの使用は、異なる免疫学的プロセス（特に、補体経路の活性化、Ｉ型過敏症反応、アレルギー、アトピー）を妨害する際に有益となり得る。
１９．ＴｅＮＴに対するさらなる多量体ＳＤＡの構築及び製造
さらに２つの多量体ＳＤＡ（ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ３−ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ５−Ｈ６）を、酵母菌菌株ＳＵ５０［７０］において、プラスミドｐＲＬ４４［６９］を使用して、安定なＭＩＲＹ組み込み体［７５］を作成することにより生成した。これらの多量体ＳＤＡが作成されたエレメントは以下の通り：
ＧＳ３： 以前記載された（Ｇ４Ｓ）３リンカー［２７］
ＧＳ２： ｐＲＬ１４４プラスミドに由来する（Ｇ４Ｓ）２リンカー［１９］
Ｈ６： ｐＲＬ１８８と同様に、ｈｉｓ６タグ、ダブル終止コドン、及びＨｉｎｄＩＩＩ部位［２］
ＳＶＧ１３Ｍ５： ５つの突然変異：Ｑ１Ｅ、Ｑ５Ｖ、Ｗ１１８Ｒ、Ｋ１２０Ｑ、Ｌ１２３Ｑを有するＳＶＧ１３
ＳＶＡ１２Ｍ２： ２つの突然変異：Ｑ１Ｅ、Ｑ５Ｖを有するＳＶＡ１２
ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ： 内部ＳａｃＩ部位を有さず、及び３つの突然変異：Ｋ１２０Ｑ、Ｉ１２２Ｔ、Ｌ１２３Ｑを有するＳＶＴ１５
ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ： 非表現的に復元されたＢｓｔＥＩＩ部位、及びＬ１２３Ｑ突然変異を有するＳＶＴ１６
合成ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を生成し、その後ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してプラスミドｐＲＬ４４［６９］中にサブクローン化し、プラスミドｐＲＬ５０５及びｐＲＬ５０６を得た（表３４）。
パン酵母菌菌株ＳＵ５０（ＭＡＴａ；ｃｉｒ°；ｌｅｕ２−３，−１１２；ｈｉｓ４−５１９；ｃａｎ１；［７０］）を、ＨｐａＩ−線状化プラスミドｐＲＬ５０５及びｐＲＬ５０６を用いて、エレクトロポレーションにより形質変換し［７１］、そしてｌｅｕ＋栄養素要求体を選択した。単一コロニー精製された形質転換体を、０．５ＬスケールにおいてＳＤＡ発現用として誘発し、そしてＳＤＡを培養済みの培養物上清からＩＭＡＣにより精製した［５８］。ＳＤＡを、以前記載されたように［４４］、但し若干の改変を加えて、ＳＰセファロースカラム上で、陽イオン交換クロマトグラフィーにより、その後さらに精製した。ＳＰセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、及び２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７バッファーを、カラムにＳＤＡを結合させるのに使用した。結合したＳＤＡを、結合バッファー中で、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、及び１ＭのＮａＣｌのステップグラジエントを用いて溶出させた。結合したＳＤＡは、０．４〜０．６ＭのＮａＣｌにおいて一般的に溶出した（表３４）。３ｋＤａ分子量カットオフ遠心濃縮デバイスを使用してこれを濃縮し、ＰＢＳにバッファー交換した。ＳＤＡ濃度を、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２３２１２）、及びウシ血清アルブミン標準（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して決定した。精製後のＳＤＡ収率に基づき、酵母菌における多量体ＳＤＡの産生レベルを計算した（表３４）。
多量体ＳＤＡを、ＭＯＰＳ泳動バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ４％〜１２％ビス−トリスゲルを使用する還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ、及びＧｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた染色により分析した。多量体ＳＤＡのいずれも、その予測された分子質量に基づき予期される位置に移動した。ストックから、ビオチンに対するタンパク質のしかるべき重量比を用いて、サンプルをビオチン化した（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ番号２１３３５、ロット番号ＯＥ１８５２３５Ａ）。
２０．ＴｅＮＴに対するいくつかのＳＤＡのさらなる結合特性
ｃＡｂ−ＴＴ１及びｃＡｂ−ＴＴ２と比較したとき［４６］、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６装置（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したとき、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーを装備したときに、選択されたＳＤＡについて、その結合を試験するために、さらなるアッセイを実施した。この目的のために、破傷風毒素に対するＳＤＡ ＳＶＴ０６Ｌ、ＳＶＴ１５Ｌ、及びＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、ｃＡｂ−ＴＴ１、及びｃＡｂ−ＴＴ２の結合親和性を評価した。
破傷風毒素に対する結合親和性を決定するために、ビオチン化されたＳＤＡをＳＡセンサーとカップリングさせた（実施例１８を参照）。破傷風毒素の２倍希釈系列を調製したが、アッセイの詳細については表２９を参照されたい。さらにアッセイを最適化した後、ＳＤＡを、破傷風毒素の異なる希釈物と共にインキュベートし、会合ステップ（２〜８分）、その後にＰＢＳ−ツイーン中での解離ステップ（２〜１０分）が続いた。次に、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアを使用して結果を分析し、親和定数（ＫＤ）を決定した。表２９はＳＤＡ毎に親和性データを示す。
ＳＶＴ０６Ｌ、ＳＶＴ１５Ｌ、及びＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６の以前のテスト結果（表２７を参照）が、このアッセイ構成において繰り返され、破傷風毒素に対する高い親和性が確認されている。ｃＡｂ−ＴＴ１及びｃＡｂ−ＴＴ２の場合、公表されたような低めの親和性が確認された。特に、ｃＡｂ−ＴＴ１及びｃＡｂ−ＴＴ２の両者において、その急速な解離が顕著である。しかしながら、これは、国際公開第９６／３４１０３号に記載されるように、４μｇのｃＡｂ−ＴＴ２を適用した後、７５％のマウスが４日後に死亡したマウス毒素中和テストから得られた結果と整合する。対照的に、ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６は、低ナノグラムレベル（２０〜３０ｎｇ／ｍｌ）において使用したとき、いくつかの連続して実施されたＴＮＴにおいて、致死量の５倍を上回る破傷風毒素に対してマウスを保護した。
２つの追加の多量体ＳＤＡ（ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ３−ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ５−Ｈ６）について、破傷風毒素に結合するときのその親和性を決定するために、４μｇ／ｍｌのビオチン化されたＴｅＮＴをＳＡセンサーとカップリングさせた構成を使用した。ＳＤＡ（ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６を含む）を０．０２％のツイーン２０を含有するＰＢＳバッファー（ＰＢＳＴｗｅｅｎ）中、１０ｎＭ〜０．６２ｎＭの２倍希釈系列として希釈した。ＳＤＡ希釈系列を、ＴｅＮＴ−カップリングセンサーと共に３分間インキュベートし（会合段階）、その後ＰＢＳ−ツイーン中での解離ステップがさらに１５分間続いた。次に、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアを使用して結果を分析し、ＳＤＡ毎に親和定数（ＫＤ）を決定した。
この試験から、二重特異性（破傷風毒素、及びアルブミン又はＩｇＧに結合する）、及び二価（破傷風毒素に対する）ＳＤＡは、サブナノモル〜ピコモルの親和性でＴｅＮＴに結合した。表３０を参照されたい。これらのＳＤＡ（ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ３−ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ５−Ｈ６）は、実施例１７で提供される結果に基づき、低ナノグラムレベルにおいて、破傷風毒素の有効な中和をｉｎ ｖｉｖｏで実現することが予期される。
２１．ウマ、ヒト、又はイヌアルブミンに対するいくつかの多量体ＳＤＡのさらなる結合特性
選択された二価及び二重特異性（多量体）ＳＤＡについて、ウマ、イヌ、及びヒト血清アルブミンに対するその結合親和性を決定するために、追加のアッセイを実施した。
３つの多量体ＳＤＡ（ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ３−ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ５−Ｈ６）について、ウマアルブミンに結合したときに、その親和性を決定するために、最適化後、２．５マイクログラム／ｍｌのビオチン化された（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ番号２１３３５、ロット番号ＯＥ１８５２３５Ａ、ビオチンに対するタンパク質のしかるべき重量比において）ウマアルブミン、又は５．０マイクログラムのヒトアルブミンをＳＡセンサーとカップリングさせた構成を使用した。さらに最適化した後、これら２つのＳＤＡ（ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６）を０．０２％のツイーン２０を含有するＰＢＳバッファー（ＰＢＳＴｗｅｅｎ）中、１０ｎＭ〜０．６２ｎＭの２倍希釈系列として希釈した。ＳＤＡ希釈系列を、ウマアルブミンカップリングセンサーと共に６〜１０分間（会合段階）インキュベートし、その後ＰＢＳ−ツイーン中での解離ステップがさらに１０分間続いた。ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ３−ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ５−Ｈ６の場合、１００ｎＭの濃度を選択した。
モノマーＳＤＡ ＳＶＡ１２Ｌ、及び３つすべての多量体ＳＤＡを、ヒトアルブミンに対する親和性結合特性について、１００ｎＭの濃度において評価した。
３つの多量体ＳＤＡ（ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ３−ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ５−Ｈ６）について、イヌアルブミンに結合したときに、その親和性を決定するために、最適化した後、１．２５マイクログラム／ｍｌのビオチン化された多量体ＳＤＡ（実施例１９を参照）をＳＡセンサーとカップリングさせた構成を使用した。イヌアルブミンを、０．０２％のツイーン２０を含有するＰＢＳバッファー（ＰＢＳＴｗｅｅｎ）中、５００ｎＭ〜１６ｎＭの２倍希釈系列として希釈した。アルブミン希釈系列を、各ＳＤＡカップリングセンサーと共に４〜５分（会合段階）インキュベートし、その後ＰＢＳ−ツイーン中での解離ステップが、さらに５〜１０分間続いた。
次に、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアを使用して結果を分析した。表３１ａ及び表３１ｂは、ＳＤＡについてテストを行い、そのデータを示す。単量体又は多量体ＳＤＡのいずれも、ヒトアルブミンに結合しないことが、予期された通り判明した。多量体ＳＤＡ ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ３−ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ５−Ｈ６は、ウマ、ヒト、又はイヌアルブミンに結合しないことが、予期された通り判明した。
多量体ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、及びＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６の場合、ウマ又はイヌ起源のアルブミンに対する親和定数ＫＤは、０．５〜１．５ｎＭ、及び２５０〜４００ｎＭで、それぞれ変動した。多量体ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６の場合、およそ１１０〜１４５時間（４．５〜６日）の血清半減期がブタにおいて判明し（実施例１６を参照）、またおよそ５１０時間（２１．２５日）の血清半減期がウマにおいて判明した（実施例２３を参照）。親和性データに基づき、ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６について、ブタ及びウマにおいて類似した半減期を予期することができる。
２２．別の方法（Ｃｒｅｏｐｔｉｘ ＷＡＶＥシステム）により決定される、ＴｅＮＴに対するいくつかのＳＤＡの親和性
いくつかのＳＤＡについて、標的のＴｅＮＴに対する親和定数は、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６装置により決定したときｐＭの範囲内であった。この知見を確認するために、追加の技術、Ｃｒｅｏｐｔｉｘ（クレオプティクス）(商標)センサー専用のグレーティング−カップルドインターフェロメトリー（ＧＣＩ）法［７６］を使用した。ＧＣＩは、分子間相互作用をモニタリングし、及び特徴づけ、並びに相互作用するアナライトの動力学的速度、親和定数、及び濃度を決定するための導波路インターフェロメトリーに基づく方法である。その他の光学的ラベルフリー法、例えば表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）等と同様に、導波路インターフェロメトリーは、相互作用する分子が複合体形成することによる質量変化に起因して、センサー表面近傍のエバネッセント場内に生ずる屈折率変化を検出する。２つの非常に鋭敏な方法、すなわちインターフェロメトリー及び平面光導波路センシングを併用すれば、非常に低い検出限界を実現する。
標的としてＴｅＮＴを用いた、いくつかの単量体及び多量体ＳＤＡの親和性（ＫＤ）実験を、Ｃｒｅｏｐｔｉｘ ＷＡＶＥ装置（Ｃｒｅｏｐｔｉｘ ＡＧ社、Ｗａｅｄｅｎｓｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、３０℃において実施した。チップ（４ＰＣＰ−Ｓ）のコンディショニング、タンパク質の固定化、及び反応速度実験の実施については、ＷＡＶＥコントロールソフトウェア内のプロトコールを順守した。標準的な化学物質を使用した。
１０マイクロリッター／分の注入を１２０秒間にわたり、関連するチャンネル上で行うことにより、ビオチン化された破傷風毒素（１０マイクログラム／ｍｌ）を、ＰＣＨ−ストレプトアビジンチップ上に固定化した。すべての実験を、泳動バッファーとして０．０２％のツイーン２０を含有するＰＢＳバッファー（ＰＢＳＴｗｅｅｎ）を用いて実施した。結合特性を、いくつかのＳＤＡ（単量体及び多量体）について、５つの濃度（１００〜１．２ｎＭ、３倍希釈ステップ）において評価した。評価されたＳＤＡにおける会合段階は４分であった。ＳＶＴ ０３Ｌ、ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ３−ＳＶＴ０６−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ５−Ｈ６の場合、解離期間は６０００秒であった。ＳＶＴ０６−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６、及びＳＶＴ１５−３ＦＷ４Ｍ−ＧＳ２−ＳＶＧ１３Ｍ４−Ｈ６の場合、解離期間を１０００秒及び１２０００秒にそれぞれ設定した。次に、Ｃｒｅｏｐｔｉｘデータ分析ソフトウェアを使用して結果を分析し、親和定数（ＫＤ）を決定した。結果を表３２に示す。
結果は、テストしたＳＤＡのそれぞれの低速解離及び高速会合に関して、以前の知見を確認する。テストしたＳＤＡのＫＤは、１．０〜２５ｐＭで変動した。
２３．ウマにおける多量体ＳＤＡの血清半減期の分析
ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６について、血清半減期の決定を、ウマにおいても実施した。ＳＤＡはウマ及びイヌアルブミンタンパク質のみの使用により生成したので、関連する標的種である。この目的のために、４．５〜６．５歳のポニー（メス）３頭を使用した。それらを筋肉内イノキュレーションの前に秤量した。体重に基づき、動物１頭当たりの多量体ＳＤＡの必要とされる量を計算した（０．１７ｍｇ／ｋｇで投薬）。フィルター滅菌処理されたＳＤＡをＰＢＳに溶解し、それを単一部位において後部大腿部中に約２．５ｍｌの容積で筋肉内注射した。血清調製用の血液サンプルを、ＳＤＡイノキュレーションの直前、並びにその後の１、２、４、７、１０、１３、１７、及び２１日目において頸静脈から収集した。
血清中のＳＤＡレベルを、ＴｅＮＴホロ毒素及び抗タグｍＡｂ ＰＯ−コンジュゲートを使用するＥＬＩＳＡにより測定した。この目的のために、９６ウェルポリスチレン製プレートを、コーティングバッファー（５０ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２バッファー）に溶解したＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌのＴｅＮＴホロ毒素で、１００μｌ／ウェル、４℃、オーバーナイトでコーティングした。ＥＬＩＳＡバッファー（１％のスキムミルク；０．０５％のツイーン２０；０．５ＭのＮａＣｌ；２．７ｍＭのＫＣｌ；２．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；ｐＨ７．４、１００μｌ／ウェル）を用いて、プレートを洗浄した後、すべての後続するインキュベーションをＲＴにおいて１時間実施した。ＴｅＮＴコーティングプレートを、８ウェルにわたる２倍希釈系列と共にインキュベートし、カラム毎に、ＳＤＡ標準について１マイクログラム／ｍｌ及び０．１マイクログラム／ｍｌの両方、カラム３では１マイクログラム／ｍｌのＳＤＡでスパイクされたヌル血清、及びカラム４〜１２では９個の収集した動物の血清から開始した。血清を最初５倍希釈し、さらに８ウェルにわたり２倍希釈した。洗浄後、ＴｅＮＴコーティングプレートを、その後抗ｈｉｓ６ｍＡｂ−ＰＯコンジュゲート（１／１０００、Ｒｏｃｈｅ社、カタログ番号１１９６５０８５００１）と共にインキュベートした。結合したＰＯを、次に３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ社；カタログ番号ＴＭＢＷ−１０００−０１）を用いて染色することにより検出した。０．５Ｍの硫酸の添加により反応を停止した後、４５０ｎｍにおける吸収を、分光光度計を使用して測定した。吸収データを、好適な市販ソフトウェアプログラムを使用して評価した。４パラメーターロジスティック曲線を、標準の吸収及びＳＤＡ濃度に近似させた。この曲線を、ＳＤＡ濃度を内挿するのに使用して、各ＥＬＩＳＡにおける各血清サンプルについて具体的な吸収値を得た。計算後の血清ＳＤＡ濃度を、エクセル(登録商標)スプレッドシートテンプレート（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＵＳＡ）にエクスポートした。
最終血清半減期を下記の式に基づき計算した：
ＳＤＡ（ｔ）＝ＳＤＡ（０）＊（０．５（ｔ／Ｔ１／２β））、式中、ｔは時間（時）であり、ＳＤＡ（０）は使用した最初の時点におけるＳＤＡ濃度（半減期の計算では体重増加について補正される）であり、ＳＤＡ（ｔ）は、時間ｔにおけるＳＤＡ濃度であり、Ｔ１／２βは最終半減期である。
血清半減期を、２日目〜２１日目のサンプルから取り出されたデータから計算した。マイクロソフトエクセルのＳｏｌｖｅｒ機能を、個々の動物毎に、上記式に基づき、時間に対してＳＤＡ濃度を近似させるのに使用した。Ｔ１／２βの平均及び標準偏差を次に計算した（表３３を参照）。
（ウマ）アルブミン結合二価及び二重特異性多量体ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６を用いてイノキュレーションした動物は、平均５１０時間のＴ１／２βを示した。この多量体ＳＤＡは、アルブミン結合ＳＤＡドメインＳＶＡ１２Ｍ２を含有し、ＳＶＴ０６、及びＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ ＳＤＡドメインとリンクして多量体ＳＤＡとなる。ＳＤＡ投与後の２１日目に、動物３匹について０．４〜０．６マイクログラム／ｍｌの血清レベルが測定され、従って実施例１７に示すデータに基づけば、必要とされる最低レベル（０．１ＩＵ／ｍｌ）よりもはるかに高いレベルであるので、すべての動物が破傷風に対して保護されたであろう。予期された通り、ウマを対象としたとき、ＳＤＡ ＳＶＴ０６−ＧＳ３−ＳＶＴ１６−Ｌ１２３Ｑ−ＧＳ２−ＳＶＡ１２Ｍ２−Ｈ６について計算して得られた血清半減期は、ブタについて測定及び計算された血清半減期を上回る。これは、イヌについても類似した長期血清半減期が予期され得ることを予測する計算を支持する。
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Claims (18)

  1. 破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）に結合する能力を有する単一ドメイン抗体（ＳＤＡ）であって、配列番号１７、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である単一ドメイン抗体（ＳＤＡ）。
  2. 配列番号１７、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６からなる群から選択される配列と少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は好ましくは１００％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である、請求項１に記載のＳＤＡ。
  3. ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が、少なくとも７６％又は好ましくは１００％である、請求項１又は請求項２に記載のＳＤＡ。
  4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の、ＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つのＳＤＡ、及び血清タンパク質に結合する能力を有する少なくとも１つのＳＤＡを含むポリペプチドコンストラクト。
  5. 前記血清タンパク質が、血清アルブミン又は免疫グロブリンである、請求項４に記載のポリペプチドコンストラクト。
  6. 血清アルブミンに結合する能力を有するＳＤＡが、配列番号４０、３７、３８、３９、４１、及び４２からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である、請求項５に記載のポリペプチドコンストラクト。
  7. 前記免疫グロブリンが、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である、請求項５に記載のポリペプチドコンストラクト。
  8. 前記免疫グロブリンに結合する能力を有するＳＤＡが、配列番号３０、２７、２８、２９、３１、３２、３３、及び３４からなる群から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但しＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％である、請求項５又は７に記載のポリペプチドコンストラクト。
  9. ＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも２つのＳＤＡを含み、ＴｅＮＴに結合する能力を有する前記少なくとも２つのＳＤＡのそれぞれが、選択肢Ａ；配列番号２４、又は選択肢Ｂ；配列番号２５、又は選択肢Ｃ；配列番号２０、又は選択肢Ｄ；配列番号１７若しくは１９、又は選択肢Ｅ；配列番号２２、１５、２３、若しくは１４から選択される配列と少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、但し前記少なくとも２つのＳＤＡが、同一の選択肢に由来する配列を含まず、並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列同一性が、少なくとも７５％である、請求項４〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドコンストラクト。
  10. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＳＤＡ、及び／又は請求項４〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドコンストラクト、及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
  11. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも２つのＳＤＡ、及び／又は請求項９に記載の少なくとも１つのポリペプチドコンストラクトを含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 医薬としての使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＳＤＡ、又は請求項４〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドコンストラクト。
  13. 破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）の疾患／症状の予防又は処置における使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＳＤＡ、請求項４〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドコンストラクト、又は請求項１０若しくは１１に記載の医薬組成物。
  14. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＳＤＡ、又は請求項４〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドコンストラクトをコードするＤＮＡ断片。
  15. 請求項１４に記載のＤＮＡ断片を含む核酸であって、請求項１４に記載のＤＮＡ断片が、プロモーター、及び任意選択でその他の調節エレメントと作動可能にリンクしている核酸。
  16. 請求項１５に記載の核酸を含む宿主細胞。
  17. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＳＤＡ、又は請求項４〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドコンストラクトを製造する方法であって、ａ）ＳＤＡ又はポリペプチドコンストラクトの発現を可能にする条件下で、請求項１６に記載の宿主細胞を培養するステップと、任意選択でｂ）宿主細胞及び培養培地のうちの少なくとも１つからＳＤＡ又はポリペプチドコンストラクトを回収するステップとを含む方法。
  18. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＴｅＮＴに結合する能力を有する少なくとも１つのＳＤＡを含む診断キット。
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