JP2009524641A - 対立遺伝子排除 - Google Patents
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Abstract
Description
抗体の構造は当技術分野で周知である。大部分の天然抗体は四量体であり、2本の重鎖と2本の軽鎖を含む。重鎖はそれぞれの重鎖に沿ってほぼ中間に位置するヒンジドメイン間のジスルフィド結合を介して相互に連結されている。軽鎖はそれぞれの重鎖とヒンジドメインのN末端側で会合している。それぞれの軽鎖は、通常、各重鎖とヒンジドメインに近いジスルフィド結合により結合している。
<抗体を原料とした産物の製造>
抗体を原料とした産物の遺伝子工学による製造、特にヒトまたはヒト化抗体を原料とした産物の製造は、新規なクラスの医薬、診断法および試薬の生成をもたらすと同時に、新規な産業、雇用および富の創造の機会の創出をもたらした(www.drugresearcher.com、www.leaddiscovery.co.uk参照)。抗体を原料とした産物は通常、天然の四量体抗体から導かれる。抗体を原料とした産物の製造に関する特許および特許出願は多くある。これらの特許および特許出願は、(例えばトランスジェニックマウスからの)誘導の経路、製造の経路および産物に特異的な物質の事柄に関する。そのような抗体を原料とした産物は、抗体断片を介して完全な四量体抗体から一本鎖Fv(scFv)分子までさまざまである。
〔実施例〕
<方法>
・構築物
ゲノムコスミドライブラリーを、標準法を用いてラマ(Lama Glama)の末梢血細胞から作成した。2つの異なる生殖細胞系列VHHを、それらの配列、停止コドンを含まないオープンリーディングフレームおよびルフランの番号付け[32]に従う42、50および52位の親水性のアミノ酸コドンの存在、ならびに49位に親水性のアミノ酸を含むものと含まないものに基づいて選択した。一方はIGHV1S1(受託番号AF305944)と同一であり、もう一方はIGHV1S3(受託番号AF305946)と94%の同一性を有する。2つのクローン(ヒト重鎖DおよびJ領域、CμおよびCδを含有するクローン1065N8ならびにCγ3遺伝子を含有するクローン1115 N15)をヒトゲノムPacライブラリーRPCI−11(BACPAC Recource Center,USA)から選択した。異なるヒトゲノムライブラリー(Incyte Genomics,CA,USA)からのBacクローン11771をCγ2遺伝子およびIg重鎖LCRの供給源として用いた[33]。標準技法を用いて、Cγ3およびCγ2遺伝子を別々にpFastBac(Invitrogen)にサブクローニングした。単一の点突然変異(G〜A)[34]またはCH1エキソンの完全な欠失を相同組換えにより達成した[35]。同様にfrtおよびloxP部位をCμスイッチ領域の前に導入し、2番目のloxP部位をCγ2スイッチ領域の前に設置し、MGSまたはMGΔを得た。
・トランスジェニックマウスの生成、育種および遺伝子型同定
220KbのMGSまたはMGΔまたはMΔGΔ断片、150KbのGSまたはGΔ断片(図1)をベクター配列から精製し、受精したFVB X B16/μMT−/−卵の前核に2ng/μlの濃度で注入した。5’および3’末端プローブを用いる尾由来DNAのサザンブロット分析により、トランスジェニック遺伝子座を、完全性およびコピーの数についてチェックした。トランスジェニックμMT+/−樹立系統をμMT−/−バックグラウンドの系統として育種した。以下のプライマー:Asp5IgMfw:5’−GCGGGTACCGAATGGTGGCAGGGATGGCTC−3’(配列番号1)と、HLL−MDには、Asp3’IgG2rv:5’−CGCGGTACCCTGCGGTGTGGGACAGAGCTG−3’(配列番号2)の組合せ、または、MGSには、Asp3’IgMrv:5’−CGCGGTACCACGGCCACGGCCACGCTGCTCGATTC−3’(配列番号3)の組合せ、およびμMT遺伝子型には、MIGMEMBINTRON1:fw:5’−CCAGTCAATACTACTCGCTAAGATTC−3’(配列番号4)とMIGMEMBEXON1rv:5’−CAGTGGTCCACAGTTTCTCAAAGC−3’(配列番号5)の組合せを用いるPCR(94℃にて45秒間の変性、60℃にて30秒間のアニーリングおよび72℃にて1分40秒間の伸張で30サイクル)により遺伝子型同定を行った。
・RT−PCR
Ultraspec RNA単離系統(Biotecx Laboratories,Houston)を用いて全RNAを単離した。逆転写酵素(Superscript II、Life technology)およびオリゴ(dT)プライマーを用いてcDNAを合成した。以下のプライマー:LVHHfw:5’−AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG−3’(配列番号6)と、HINGEIgG2rv:5’CACTCGACACAACATTTGCGCTC−3’(配列番号7)またはhIgMCH2rv:CACTTTGGGAGGCAGCTCAGC−3’(配列番号8)の組み合わせを用いてPCRを行った。増幅は、94℃にて30秒間の変性、60℃にて30秒間のアニーリングおよび72℃にて1分間の伸張で30サイクル間であった。PCR産物をpGEM Tイージーベクター(Promega)にクローニングし、T7またはSP6プライマーを用いて配列決定した。
・フローサイトメトリー分析:
単細胞懸濁液を、既に記載したようにPBS中のリンパ器官から調製した45。約1×106個の細胞を、96ウェルプレート中のPBS/0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)中の抗体を用いて4℃にて30分間インキュベートした。細胞をPBS/0.5% BSAで2回洗浄した。それぞれのサンプルについて、FACScanアナライザー(Becton Dickinson,Sunnyvale,CA)を用いて3×104イベントが記録された。CellQuestバージョン1.0コンピュータソフトウェアを用いてFACSデータを分析した。Becton Dickinson FACS Caliburで四色分析を行った。使用した大部分の抗体は記載されている[36];FITCコンジュゲート抗ヒトIgGおよび抗ヒトIgMはSigma(Zwijndrecht,NL)より購入した。
・Ig遺伝子再構成分析
wtマウスMΔGΔおよびGΔトランスジェニックマウスの脾臓および肝臓から単細胞懸濁液を作成した。MACS CD45(B220)MicroBeads(Miltenyi Biotec,Germany)をAutomacsセパレーターで製造業者の説明書に従って用いて 約90%の純度までB細胞を確実に選択した[37]。ゲノムDNAをHind III消化させ、Hybondナイロンフィルター上でブロットした。32P放射標識されたJκプローブ(Jκ1およびJκ5領域のゲノムDNAからのPCR増幅より入手)および32P放射標識された炭酸脱水酵素II(CAII)プローブを用いてフィルターをハイブリダイズした。肝臓DNAを流してκ生殖細胞系列の構成シグナルを示した(2.8Kbバンド)。4kbバンドとハイブリダイズするCAIIプローブを負荷対照として用いた。Tyfoon9200(Amerscham Biosciences)でフィルターを走査した。生殖細胞系Jκバンドの強度を、Image Quant5.2ソフトウェアを用いて定量し、負荷対照のそれに正規化し、対照肝臓DNA(100%とする)の割合で表した。異なる再構成イベントの増幅のためのハイブリドーマ由来のゲノムDNAで使用されるPCRプライマーは次の通りであった、
IGHJlR:5’−CCAGTGCTGGAAGTATTCAGC−3’(配列番号9)、
IGHJ2R:5’−CAGAGATCGAAGTACCAGTAG−3’(配列番号10)、
IGHJ3R:5’−GGCCCCAGAYATCAAAAGCAT−3’(配列番号11)、
IGHJ4R:5’−GGCCCCAGTAGTCAAAGTAGT−3’(配列番号12)、
IGHJ5R:5’−CCCAGGRGTCGAACCAGTTGT−3’(配列番号13)、
IGHJ6R:5’−CCAGAACGTCCATRYMGTAGTA−3’(配列番号14)。
・DNA FISH分析
標的DNAの調製:モノクローナルハイブリドーマ細胞をDMEM/10% FCS中で培養し、Heiskanen[38]に記載されるようにアガロースに包埋した。GΔトランスジェニック系統1のマウス由来の肺を収集し、単細胞懸濁液を作った。包埋した細胞をプロテイナーゼKおよびリボヌクレアーゼHで処理した。機械的に伸張されたDNAを、ポリ−L−リシンスライド(Sigma)上で電子レンジと別のスライドの端を用いて調製した。
・免疫化およびハイブリドーマ作成
8週齢のマウスを、Specolアジュバント(IDDLO,Lelystadt,NL)または事前処方DKTPワクチンを含む5〜20μgの抗原で0、14、28、42日に皮下注射し、50日に腹腔内注射して免疫した。0、14および45日に採血した。56日にClonalCellTMHYキット(StemCell Technologies,Canada)を製造業者の説明書に従って用いて、脾臓細胞をSp2−O−Agl4骨髄腫細胞株(R.Haperenより寄贈)と融合させた。DKTPワクチンはNetherlands Vaccine Institute(Bilthoven,NL)より得られた。
・sdABライブラリーの構築およびスクリーニング
Ultraspec RNA単離系統(Biotecx Laboratories Inc,Houston,Texas,USA)を用いて、DKTP免疫単一コピーGΔおよびTNFα免疫MΔGΔマウスの脾臓から全RNAを単離した。cDNAはオリゴ(dT)プライマーを用いて作成した。VHHDJ断片をコードするDNA断片を、特異的プライマー:vh1 back Sfi Iプライマー[40〜42]を、hIgG2hingrevプライマー(5’−AATCTGGGCAGCGGCCGCCTCGACACAACATTTGCGCTC−3’(配列番号15))またはCH2huIgMrevプライマー(5’−TGGGACGAAGACGGCCGCTTTGGGAGGCAGCTCGGCAAT−3’(配列番号16))と組み合せたものを用いてPCRにより増幅させた。増幅したVHHDJ(約400bp)をSfi I/Not I消化させ、ゲル精製し、Sfi I/NotI消化ファージミドpHEN由来ベクターにクローニングした。TG1エレクトロコンピテント細胞(Stratagene La Jolla,USA)への形質転換により、ヒト単一のドメイン抗体ライブラリーが得られた。プラスチック(希釈されていないワクチンをコートしたイムノチューブ)に吸着させたDKTPワクチン抗原または精製されたヒトTNFα(Biosource International,USA)へのパニングを用いて、2ラウンドの選択を行った。
・免疫細胞化学およびウエスタンブロット
rtTAの存在に応答するマーカープラスミドでトランスフェクトされたtet−on細胞系統の細胞をスライド上で増殖させた。ドキシサイクリン誘導の24時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒド/PBSに固定し、0.5% Triton−X−100/PBSで透過処理した。rtTAに対するHCAbを1:50希釈して使用し、その後ヤギ抗ヒトIgG FITC染色(Sigma,1:500希釈)に使用した。マーカータンパク質を前記に記載したように検出した51。ウエスタンブロットは、ヤギ抗ヒトIgG−HRP(Sigma,1/2500希釈)、ヒトIgM−HRP(Sigma,1/2500希釈)を用いる標準法であった。
・Superose6ゲル濾過
200mM KCl/20mM HEPES−KOH pH 7.9/1mM MgCl2/0.5mM EGTA/20%グリセロールで平衡したSuperose6 10/30カラムを備えるAKTA FPLC装置(Amersham Biosciences,Piscataway NJ)を用いて、MΔGΔマウス血清およびヒト対照血清のサイズ分画を行った。100μl/分の流量を用いて、500μlの画分を回収し、100%トリクロロ酢酸でで沈殿させ、SDS−PAGE(還元条件下)に続いてウエスタンブロット免疫ブロット法により解析した。
・BIAcore測定
実験は、BIAcore3000表面プラズモン共鳴バイオセンサー(Biacore AB,Uppsala,Sweden)にて行った。製造業者の提供する標準的なNHS−EDCキットを用いて3000共鳴単位(RU、任意の結合応答単位)のレベルまでCM5センサーチップ上に精製タンパク質を固定化した。10mM Hepes、pH7.4、150mM NaCl、2mM EDTA、0.005% Tween20中、40マイクログラム/mlの一定の流速で抗体を固定化抗原に通過させた。製造業者のBIA評価ソフトウェアを用いて平衡時の応答を記録し、カーブフィッティングを使用して平衡解離定数を得た。
<結果>
・ラクダ科動物様CH1スプライス変異は、ヒト重鎖遺伝子座におけるエキソンスキッピングには不十分である。
・CH1領域を欠くヒト遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスの解析
CH1のスプライシング問題を克服するために、本発明者らは3種類の新規構築物を生成した(図1)。全てがCH1を欠失させたCγ2およびCγ3を含有し、1つはCμおよびCδを含むもの(MGΔ)であり、1つはCμおよびCδを含まないもの(GΔ)であり、1つはCH1を欠失させたCμセグメントを有するもの(MΔGΔ)であった。μMTバックグラウンドにおいて、異なるコピー数(1〜5コピー)の3つのMGΔ、6つのGΔおよび4つのMΔGΔトランスジェニックマウス系統を得た。骨髄(BM)および脾臓においてB細胞の成長を解析した。異なるコピー数のマウスで同じ結果を得た。
・GΔおよびMΔGΔの発現はμMTマウスにおけるB細胞の成長を救済する
MGΔマウスはμMTバックグラウンドにおいてB細胞の成長を救済することができなかったが、一方、GΔおよびMΔGΔ構築物はB細胞の成長を効果的に救済した。B220/CD19陽性細胞の救済は、異なるリンパ系コンパートメントにおいて、コピー数に関係なく、30〜100%間であった(図2A)。これは、B220対ヒトIgMまたはヒトIgG染色を用いたBMのフローサイトメトリーによって確認される(図2B)。MΔGΔマウスは、野生型またはμMTマウスに存在しないヒトIgM産生細胞をBMにおいて含有する。従って、これらの細胞は、これらの細胞がヒトIgGを含有しないように、クラススイッチを受けなかった。GΔマウスはヒトIgG発現B細胞だけを含む。MGΔマウスは、細胞表面でヒトIgを発現するB細胞を含有するとしても非常に少なく、興味深いことに、B220細胞の一部は細胞内IgMを発現するが、IgGは発現しない(図2B)。MΔGΔおよびGΔマウス(下記参照)とは対照的に、MGΔマウスはマウスIg軽鎖を発現する(図6G)。これらの結果は、異なる構築物中でCμおよびCγ遺伝子が発現されることを示し、CH1が存在しないことがVHHに基づく抗体の細胞表面発現にとって重大であることが強く示唆される。
・ヒトHCAb IgGおよびIgMはBMでのB細胞の成長中にマウス(プレ)BCRに機能的に置き換わる
小型静止プレB細胞への大循環の発展進行中、特異的細胞表面マーカーの発現はプレBCR依存的にダウンレギュレートされる[36]。プレBCRに機能的に置き換わるヒトHCAbの能力を調査するために、様々なマーカーの発現をFACSにより解析した。プロB細胞は、高レベルの細胞質SLC、IL−7RおよびCD43を発現するが、これらはプレBCR発現時にダウンレギュレートされ、成熟B細胞では存在しない(図2C、μMTマウスからのプロB細胞、wtマウスの表面IgM−プロB/プレB細胞画分および表面IgM+B細胞画分と比較)。
・複数の再配列および対立遺伝子排除
免疫後、MΔGΔおよびGΔ系統から、特に5コピーGΔ系統1で多数のハイブリドーマを作製した(下記参照)。配列解析により、多コピーGΔ遺伝子座において1つ以上の再配列が起こり得ることが示された。解析した5つの異なる5コピーハイブリドーマのうち、1つのハイブリドーマ(G20)はフレーム内にある1つのコピーを再配列し;2つのハイブリドーマ(T7およびT12)は各々2つの再配列を有し、そのうちの1つの再配列は両方のハイブリドーマにおいてフレーム外であり;1つのハイブリドーマ(T3)は2つのフレーム内再配列(J2およびJ4)を有し;一方、1つのハイブリドーマ(T1)はフレーム内の2つの再配列(J2およびJ4)を含む4つの再配列を有した。
・GΔ、MΔGΔおよびMGΔトランスジェニックマウスにおける脾臓B細胞
導入遺伝子がμMTマウスにおけるB細胞分化に与える影響を評価するために、本発明者らはCD21/CD23プロフィールを用いてフローサイトメトリーにより脾臓B細胞亜集団サイズを調べた(図4A)。GΔマウスでは、CD21lowCD23low未成熟B細胞の割合は正常な範囲にあり、ヒト単鎖IgG発現細胞は濾胞(FO;CD21+CD23+)B細胞へも辺縁帯(MZ;CD21highCD23low)B細胞へも分化し得た。MΔGΔマウスでは、未成熟B細胞画分が増加し、HCAb−IgM発現細胞のFOおよびMZ−8 B細胞への分化がいくらか損なうことを示している。これらの脾臓では、CD23発現の減少は、B−1 B細胞系統への分化を示す、CD43およびCD5の表面発現レベルの増加を伴っていた。MGΔトランスジェニックマウスに存在する少数のヒトIgM発現B細胞(マウス軽鎖も発現する、図6参照)は、MΔGΔトランスジェニックマウスにおけるものと同様のFO/MZ分布を現した。MGΔマウスは違うが、MΔGΔおよびGΔマウスは、正常な脾臓構造を有し、白脾髄の外側境界に存在する濾胞および辺縁帯を含有するB細胞リッチな領域で囲まれた動脈周囲リンパ球鞘(PALS)に集中しているT細胞の分離を示す(図4B)。
・単一コピー遺伝子座は効果的に救済し、CH1の不在が必須である
GΔ系統1マウス(図2A)は5コピーのGΔ遺伝子座を含有するため、従って効果的な救済が遺伝子座のコピー数と関係がある可能性があった。しかし、5コピーGΔ系統1からFlpeR系統23との交配によるFlp組換えにより得られた単一コピートランスジェニック系統は、B細胞の成長を同程度まで救済した(図4D、図2A)。単一コピーの遺伝子座は救済に十分であり、そしてCH1領域を含むCμ定常領域の存在が阻害性であることを、非救済単一コピー系統MGΔ(系統3)から、単一コピーGΔ系統をもたらすCre組換え(cre発現系統への品種改良)によりCμおよびCδ領域を欠失させることによって確認した(図4D)。それまで非救済であった遺伝子座はその時点で他のGΔ系統と同じB細胞の成長9を与える。従って、コピー数は救済に影響を及ぼさず、Cμ領域にCH1が存在することによりB細胞救済が阻害される(下記も参照)。
・MΔGΔおよびGΔトランスジェニックマウスにおいてマウスIg軽鎖遺伝子座は再配列しない
マウスIg軽鎖タンパク質はMΔGΔおよびGΔマウスでは血清のウエスタンブロット(図なし、図2Cおよび6A参照)によってまたはFACSによって検出されず、マウス軽鎖遺伝子が再配列しないことが示唆された。これは、サザンブロット解析により選別された脾臓B220+細胞画分および肝臓細胞のDNAにおけるIgκ遺伝子座生殖細胞系列シグナルの密度を比較することによって確認され(図5AおよびB)、これによりマウス軽鎖は再配列せず、生殖細胞系列構成を保つことが示される。対照的に、MGΔ/μMTマウスの少数のヒトIg発現細胞において軽鎖が検出される(図6G参照)。
・GΔ/μMTおよびMΔGΔ/μMTマウスの血清分析
ヒトIgMはMΔGΔ血清に存在し、ヒトIgGはMΔGΔマウス血清およびGΔマウス血清の両方に存在した。免疫されていない成体動物では、ヒトIgM(<50μg/ml)およびIgG(200〜1000μg/ml)は、正常ヒトIgH遺伝子座を有する正常マウスまたはトランスジェニックマウスに見られるものと同様のレベルで存在する[65]。6種全てのGΔマウスの血清のゲル電気泳動では、非還元性条件下で約70kD、還元性条件下で約35kDのMWを有するHCAbのIgGが現われ、軽鎖を欠く重鎖二量体とCH1エキソンを欠く各重鎖と一致した(図6A、B)。
・MGΔマウスの血清分析
MGΔ/μMT系統の末梢および脾臓では、B220陽性細胞はほとんど見られず(野生型の1%未満)、極まれに小さなB細胞集団が脾臓において見られる(図4B)。精製後にのみ血清中に少量のヒトIgMおよびIgGが検出された(図6E、F)。これらのマウスにおけるヒトIgMは、還元性条件下では通常のサイズであったが、一方、循環しているヒトIgGはより短く(CH1の欠失に一致する、見かけのMWは35kD)。興味深いことに、ヒトIgMと結合していると思われるマウスκ軽鎖も検出された(図6G)。
・MΔGΔおよびGΔマウスの免疫化は抗原特異的Ab産生をもたらす
GΔ/μMTマウスを大腸菌hsp70、DKTP(ジフテリア毒素、百日咳菌の全細胞溶解物、破傷風毒素ならびに不活化ポリオウイルス1型、2型および3型)およびrtTAで免疫し[50]、一方、MΔGΔマウスをヒトTNFαで免疫した。ELISAで陽性であった血清を有するマウスから、ファージディスプレイライブラリーによりハイブリドーマまたは単一ドメインAb(sdAb)を用いて個々の完全抗体を単離した。
<結論>
本明細書において、本発明者らは、μMTマウスにおけるB細胞の成長を救済し、結果的に機能性HCAb産生をもたらす修飾HCAb遺伝子座の発現を報告した。これらのマウスを免疫して、抗原特異的HCAbを産生させることができる。ラクダ科動物の場合、HCAbの分泌にはCH1の除去が不可欠であるが、CH1の排除には3’CH1/イントロン境界における単一ラクダ科動物(総説30)スプライス変異では不十分であり、従って少なくともヒト遺伝子座において、単にこの単一点突然変異以上のものが必要である。CH1をVHHとともに有するIgMはB細胞の成長を妨げるが、これは恐らく、プレBCRとの関連でIgM表面分子の効果のない会合に起因する。対照的に、HCD様ヒトμタンパク質を発現するマウスは、λ5とは無関係にSCIDバックグラウンドにおいて正常CD43プレB細胞を生じる[54]。末端切断型Cμタンパク質は、関連L鎖なしにB細胞表面で発現され、自己会合を介してシグナル伝達するプレBCRによく似ていると考えられる[55]。
<実施例3および4>
本発明の第1の態様の好ましい実施形態では、前の実施例に記載される、当技術分野で公知の方法(Janssens et al 2006)を用いて、機能性ヒトVH領域全数を、ヒトVH領域(またはそれらの変異体)を、全DH領域、全JH領域ならびにCμ、Cγ2、Cγ3およびCα領域と3’LCRの組合せを含む複数の修飾ヒト遺伝子座にクローニングすることによって増加させる。この手順は、独立した遺伝子座の複数の同一VH領域または独立した遺伝子座の異なるVH領域を用いて行うことができる。異なる遺伝子座は同一重鎖領域または異なる重鎖領域を含有し得る。実施例3は、重鎖領域の異なる組合せを有する遺伝子座の同一VH領域を有する遺伝子座に関し、実施例4は同一重鎖定常領域と異なるVH領域を有する2つの遺伝子座に関する。両実施例において、さらに遺伝子座を追加してよいことは明らかである。
[参考文献]
Claims (34)
- 複数の異種VH重鎖遺伝子座を哺乳類に供与するステップを含み、各VH重鎖遺伝子座が、1つ以上のV遺伝子セグメントと、1つ以上のD遺伝子セグメントと、1つ以上のJ遺伝子セグメントと、発現されたときにCH1ドメインを含まずに前記遺伝子座の少なくとも1つからVH重鎖のみ抗体を発現する重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントとを含む、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類におけるVH重鎖のみ抗体の産生方法。
- 各VH重鎖遺伝子座が1つ以上のV遺伝子セグメントを含む、請求項1に記載の方法。
- 各遺伝子座がV遺伝子セグメントのみを含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 各V遺伝子セグメントが、他の全てのV遺伝子セグメントと異なっている、請求項3に記載の方法。
- 各V遺伝子セグメントが他の全てのV遺伝子セグメントと同一である、請求項3に記載の方法。
- 各遺伝子座中の残りの遺伝子セグメントが他の全ての遺伝子座中の遺伝子セグメントと同じである、請求項5に記載の方法。
- 各遺伝子座中の残りの遺伝子セグメントが他の全ての遺伝子座中の遺伝子セグメントと異なる、請求項5に記載の方法。
- 各遺伝子座が複数のV遺伝子セグメントを含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 任意の1つの遺伝子座中のV遺伝子セグメントが全て同じ種の生物に由来する、請求項8に記載の方法。
- 任意の1つの遺伝子座中のV遺伝子セグメントが異なる種の生物に由来する、請求項8に記載の方法。
- V遺伝子セグメントがヒト起源のものである、請求項9に記載の方法。
- 複数の重鎖遺伝子座が、複数の遺伝子座に分散された、改良された溶解度特性を有する39個の機能性ヒトV遺伝子セグメントおよび操作された前記ヒトV遺伝子セグメントの変異体のうちの、任意の数または任意の組合せを含む、請求項1〜4および8〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 各異なる重鎖遺伝子座がヒトを除くトランスジェニック哺乳類のゲノム中の単一コピーとして存在する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 各VH重鎖遺伝子座が1〜40個のD遺伝子セグメントを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- D遺伝子セグメントがヒトD遺伝子セグメントである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- それぞれのVH重鎖遺伝子座が1〜20個のJ遺伝子セグメントを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- J遺伝子セグメントがヒトJ遺伝子セグメントである、請求項16に記載の方法。
- 各VH重鎖遺伝子座が同一のDおよびJ遺伝子セグメントを含有する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 各VH重鎖遺伝子座が、DおよびJ遺伝子セグメントの異なる組合せを含有する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 各VH重鎖遺伝子座が1個以上のV遺伝子セグメント、25個の機能性ヒトD遺伝子セグメントおよび6個のヒトJ遺伝子セグメントを含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 各VH重鎖遺伝子座が、インビボでエフェクター機能をもたらす少なくとも1つの重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントを含み、定常領域は、発現されたときに、抗体中にCH1ドメインを含まない、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 各遺伝子座が、1つの特定の定常領域をコードする遺伝子セグメントを1つのみ含む、請求項21に記載の方法。
- 各遺伝子座が、それぞれ異なる定常領域をコードする、1個よりも多くの遺伝子セグメントを含む、請求項21に記載の方法。
- 各遺伝子座が、同一の定常領域をコードする遺伝子セグメントを含有する、請求項21〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 各遺伝子座が、異なる定常領域コード遺伝子セグメントまたは定常領域コード遺伝子セグメントの異なる組合せを有する、請求項21〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 重鎖定常領域をコードする各遺伝子セグメントが、Cδ、Cγ1−4、Cμ、CεまたはCα1−2クラスの1個以上の重鎖定常領域エキソンを含むが、但し重鎖定常領域遺伝子セグメントがCH1ドメインを発現しない、請求項21〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 重鎖定常領域がヒト起源のものである、請求項21〜26のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトを除くトランスジェニック哺乳類における2以上の異種のVH重鎖遺伝子座が同一の染色体上に直列に存在する、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトを除くトランスジェニック哺乳類における1つ以上の異種のVH重鎖遺伝子座が異なる染色体上に存在する、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトを除くトランスジェニック哺乳類がげっ歯類である、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- げっ歯類がマウスである、請求項30に記載の方法。
- 請求項1〜31のいずれか一項に記載の複数の異種のVH重鎖遺伝子座を含む、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類。
- 請求項32に記載のヒトを除くトランスジェニック哺乳類を抗原で免疫することによる、重鎖のみ抗体の産生方法。
- 請求項32に記載のヒトを除くトランスジェニック哺乳類を抗原で免疫するステップと、
B細胞ハイブリドーマを生成するステップと、
抗原特異的な重鎖のみ抗体を発現している細胞を選択するステップと、
抗原特異的な組換え親和性成熟VH重鎖のみ抗体を単離するステップと
を含む、高親和性の抗原特異的VH重鎖のみ抗体の産生方法。
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