ES2872081T3

ES2872081T3 - Ratones con cadena ligera universal humanizada

Info

Publication number: ES2872081T3
Application number: ES19184217T
Authority: ES
Inventors: John Mcwhirter; Lynn Macdonald; Sean Stevens; Samuel Davis; David R Buckler; Karolina A Hosiawa; Andrew J Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2032-08-03
Also published as: ZA201401006B; NZ781020A; US20220394959A1; NZ743520A; MX357623B; RS59728B1; MX2021001074A; BR112014002713A2; PL3572517T3; CN107602696B; EP3865581A1; EP2739740A1; MX2014001454A; AU2018203592B2; IL297371A; JP2019062906A; US20190133094A1; CY1122435T1; JP2017006146A; AU2012294624A1

Abstract

Un ratón cuyo genoma comprende: (a) al menos un segmento génico VH humano no reordenado, al menos un segmento génico DH humano no reordenado y al menos un segmento génico JH humano no reordenado unidos operativamente a un gen de región constante de cadena pesada endógeno en un locus de cadena pesada endógeno; (b) no más de una, o no más de dos, secuencias Vk/Jk humanas reordenadas unidas operativamente a un gen de región constante de cadena ligera k endógeno en un locus de cadena ligera k endógeno; y (c) una secuencia de ácido nucleico ectópico que codifica una proteína ADAM6a de ratón funcional o un ortólogo funcional, un homólogo funcional o un fragmento funcional de la misma y una secuencia de ácido nucleico ectópico que codifica una proteína ADAM6b de ratón funcional o un ortólogo funcional, un homólogo funcional o un fragmento funcional de la misma, en donde las proteínas, ortólogos, homólogos o fragmentos de ADAM6 son funcionales en un ratón macho, en donde dicha función está asociada con la fertilidad del ratón macho, en donde el genoma del ratón carece de: un gen ADAM6 endógeno funcional en el locus ADAM6 endógeno, un segmento génico Vk de inmunoglobulina endógeno funcional, y un segmento génico Jk de inmunoglobulina endógeno funcional.

Description

DESCRIPCIÓN

Ratones con cadena ligera universal humanizada

Campo de la invención

Ratones, células, embriones, tejidos y ácidos nucleicos aislados genéticamente modificados para producir anticuerpos y secuencias que codifican dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulinas humanas, incluyendo anticuerpos biespecíficos e incluyendo anticuerpos biespecíficos que comprenden cadenas ligeras universales. Composiciones y métodos que implican ratones genéticamente modificados con reemplazos de línea germinal en el locus variable de cadena pesada de ratón endógeno, que comprenden locus de cadena ligera modificados que expresan cadenas ligeras derivadas de no más de uno o dos segmentos génicos V de cadena ligera diferentes, en donde los ratones están además genéticamente modificados en su línea germinal de tal manera que los ratones macho que llevan estas modificaciones son fértiles. Se proporcionan ratones genéticamente modificados que expresan cadenas ligeras universales y dominios variables de cadena pesada humanizada, en donde los ratones comprenden una actividad ADAM6 que es funcional en un ratón macho.

Antecedentes

El desarrollo de anticuerpos para su uso como agentes terapéuticos humanos tiene una historia larga y compleja. Un avance significativo ha sido la capacidad de producir esencialmente secuencias de anticuerpos completamente humanos para usar en el diseño de agentes terapéuticos humanos eficaces con un potencial reducido de inmunogenicidad. Hoy en día existen ratones que se modifican en su línea germinal para generar secuencias de anticuerpos humanos derivados de segmentos genéticos no reordenados (pesados y ligeros) como transgenes o como reemplazos en los locus de inmunoglobulinas de ratón endógenos. El reemplazo de secuencias variables de ratón con secuencias variables humanas en locus endógenos en ratones, como con ratones humanizados con VELOCIMMUNE®, permite que el sistema inmunitario del ratón funcione esencialmente de manera normal. Como resultado, exponer a estos ratones a un antígeno de elección genera una población maravillosamente diversa y rica de linfocitos B clonalmente seleccionados que expresan dominios variables humanos mutados somáticamente de alta afinidad que pueden usarse para producir anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el antígeno de elección.

Los dominios variables humanos producidos en ratones humanizados se pueden usar para diseñar anticuerpos biespecíficos completamente humanos, es decir, proteínas de unión que son heterodímeros de cadenas pesadas, donde difieren las identidades y especificidades de unión de los dominios variables de cadena pesada. Pero seleccionar cadenas ligeras que puedan asociarse y expresarse de manera eficaz con los heterodímeros de cadena pesada no tiene una solución fácil. El desarrollo de dominios variables de cadena ligera humana para su uso en agentes terapéuticos humanos es ciertamente posible en ratones humanizados, pero no hay soluciones fáciles para seleccionar qué cadenas ligeras se asociarán y expresarán de manera eficaz con cadenas pesadas que tengan características de unión deseadas, donde las cadenas ligeras no sean perjudiciales para la expresión o comportamiento de unión de ambas cadenas pesadas.

Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad en la técnica de composiciones y métodos para desarrollar regiones variables de inmunoglobulinas humanas para su uso en agentes terapéuticos humanos, incluyendo regiones variables de inmunoglobulinas humanas generadas a partir de secuencias de ácidos nucleicos en locus de inmunoglobulinas de ratón endógenos.

Sumario

Se describen ratones que expresan dominios variables de inmunoglobulinas humanas que son adecuados para su uso en proteínas de unión biespecíficas, incluyendo anticuerpos biespecíficos, en donde los ratones comprenden una humanización de un locus variable de cadena pesada de ratón endógeno, en donde los ratones macho que comprenden la humanización son fértiles, y en donde los ratones comprenden además una humanización de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno que da como resultado que el ratón exprese un repertorio de cadenas ligeras de inmunoglobulinas que deriva de no más de uno, o no más de dos, segmentos génicos V A y/o k.

Se proporcionan ratones modificado por ingeniería genética que seleccionan dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulinas humanas madurados por afinidad adecuados derivados de un repertorio de segmentos V, D y J de cadena pesada humana no reordenados, en donde los dominios variables de cadena pesada humana madurados por afinidad se asocian y expresan con una cadena ligera universal humanizada. La cadena ligera universal humanizada se expresa a partir de un locus que comprende no más de uno o no más de dos segmentos V de cadena ligera humana y un segmento J humano unidos operativamente a un gen constante de cadena ligera, o no más de una o no más de dos secuencias de ácidos nucleicos humano reordenadas (VA/JA, Vk/Jk, VA/Jk o Vk/JA) que codifican un dominio variable de cadena ligera unido operativamente a un gen constante de cadena ligera. En diversas realizaciones, el dominio de cadena ligera universal humanizada se empareja con una pluralidad de dominios variables de cadena pesada humana madurados por afinidad, en donde la pluralidad de dominios variables de cadena pesada se une específicamente a diferentes epítopos o antígenos. En particular, se proporciona un ratón cuyo genoma comprende:

(a) al menos un segmento génico Vh humano no reordenado, al menos un segmento génico Dh humano no reordenado y al menos un segmento génico Jh humano no reordenado unidos operativamente a un gen de región constante de cadena pesada endógeno en un locus de cadena pesada endógeno;

(b) no más de una, o no más de dos, secuencias Vk/Jk humanas reordenadas unidas operativamente a un gen de región constante de cadena ligera k endógeno en un locus de cadena ligera k endógeno; y

(c) una secuencia de ácido nucleico ectópico que codifica una proteína ADAM6a de ratón funcional o un ortólogo funcional, un homólogo funcional o un fragmento funcional de la misma y una secuencia de ácido nucleico ectópico que codifica una proteína ADAM6b de ratón funcional o un ortólogo funcional, un homólogo funcional o un fragmento funcional de la misma, en donde las proteínas, ortólogos, homólogos o fragmentos de ADAM6 son funcionales en un ratón macho, en donde dicha función está asociada con la fertilidad del ratón macho,

en donde el genoma del ratón carece de:

un gen ADAM6 endógeno funcional en el locus ADAM6 endógeno,

un segmento génico Vk de inmunoglobulina endógeno funcional, y

un segmento génico Jk de inmunoglobulina endógeno funcional.

Además, se proporciona un método de fabricación de un anticuerpo que comprende:

(a) inmunizar un ratón de la invención;

(b) expresar en una célula:

(i) una secuencia de nucleótidos de cadena pesada humana que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada humana aislada de dicho ratón, unida operativamente a una secuencia génica de región constante de cadena pesada humana;

(ii) una secuencia de nucleótidos de cadena ligera humana que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera k humana aislada de dicho ratón, unida operativamente a una secuencia génica de región constante de cadena ligera humana; y

(c) mantener la célula en condiciones suficientes para expresar un anticuerpo completamente humano, y (d) aislar el anticuerpo.

Adicionalmente, se proporciona una célula de ratón cuyo genoma comprende:

en donde el genoma de la célula de ratón carece de:

un gen ADAM6 endógeno funcional en el locus ADAM6 endógeno,

un segmento génico Vk de inmunoglobulina endógeno funcional, y

un segmento génico Jk de inmunoglobulina endógeno funcional.

También se describen construcciones de ácidos nucleicos, células, embriones, ratones, y se proporcionan métodos para producir ratones que comprenden un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada y un locus variable de cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, en donde el ratón expresa una de no más de dos cadenas ligeras universales y los ratones que son machos muestran fertilidad de tipo silvestre.

También se describe un ratón modificado que comprende en su línea germinal un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada en un locus de cadena pesada de ratón endógeno y un locus variable de cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, en donde el ratón expresa una cadena ligera universal, y en donde el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional de la misma. En varios casos, el locus variable de cadena ligera de inmunoglobulina humanizada está en un locus de cadena ligera de ratón endógeno.

En una realización, el locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada comprende un reemplazo en el locus variable de cadena pesada de ratón endógeno la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón funcionales con uno o más segmentos génicos V humano, D humano y J humano, en donde el uno o más segmentos V, D y J humanos están unidos operativamente y son capaces de reordenarse para formar un gen V/D/J reordenado que está unido operativamente a una secuencia constante de cadena pesada.

En una realización, el ratón comprende un locus de cadena ligera que está modificado por ingeniería para producir una cadena ligera universal, en donde la cadena ligera universal es una cadena ligera que deriva de un locus de cadena ligera que comprende una única secuencia V/J de cadena ligera humana reordenada. También se divulga un ratón que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un único segmento V de cadena ligera de inmunoglobulina humana que es capaz de reordenarse con un segmento génico J de cadena ligera humana (seleccionado de uno o una pluralidad de segmentos J) y que codifica un dominio variable de cadena ligera humana. En otro caso, el ratón comprende no más de dos segmentos V de cadena ligera humana en el locus de cadena ligera, cade segmento V de los mismos es capaz de reordenarse con un segmento génico J humano (seleccionado de uno o una pluralidad de segmentos J de la cadena ligera) y codificar un dominio variable de cadena ligera humana reordenada.

En un caso, el segmento V de la cadena ligera humana único está operativamente unido a un segmento J de cadena ligera humana seleccionado de Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5, en donde el segmento V de cadena ligera humana único es capaz de reordenarse para formar una secuencia que codifica un gen de región variable de cadena ligera con cualquiera de los uno o más segmentos J de cadena ligera humana.

En una realización, el ratón comprende un locus de cadena ligera endógeno que comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos V y J de ratón con no más de una, o no más de dos, secuencias de ácidos nucleicos reordenadas (V/J). En una realización, las no más de una o no más de dos secuencias de ácidos nucleicos reordenadas (V/J) se seleccionan de Vk1-39Jk5, Vk3-20Jk1 humana y una combinación de las mismas.

En una realización, el ratón carece de un locus de cadena ligera endógeno funcional que sea capaz de expresar un dominio variable de cadena ligera de ratón. En una realización, el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable de una cadena ligera universal en un locus k. En una realización, el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable de una cadena ligera universal en un locus A.

En una realización, la secuencia V/J reordenada humana está operativamente unida a una secuencia líder humana o de ratón. En una realización, la secuencia líder es una secuencia líder de ratón. En una realización específica, la secuencia líder de ratón es una secuencia líder Vk3-7 de ratón.

En una realización, la secuencia V/J reordenada está operativamente unida a una secuencia promotora de inmunoglobulina. En una realización, la secuencia promotora es una secuencia promotora humana. En una realización específica, el promotor de inmunoglobulina humana es un promotor Vk3-15 humano.

La secuencia (V/J) reordenada está operativamente unida a un gen Ck de ratón. En particular, en el ratón proporcionado, el genoma del ratón comprende no más de una, o no más de dos, secuencias Vk/Jk humanas reordenadas operativamente unidas a un gen de región constante de cadena ligera k endógeno en un locus de cadena ligera k endógeno.

En una realización, la secuencia (V/J) reordenada está presente en un locus de cadena ligera k, en que el locus de cadena ligera k comprende un potenciador intrónico k de ratón, un potenciador 3' k de ratón o tanto un potenciador intrónico como un potenciador 3'. El locus k es un locus k endógeno.

En una realización, el ratón comprende un locus k que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de una cadena ligera universal, y el ratón comprende un locus de la cadena ligera lambda (A) de inmunoglobulina no funcional. En una realización específica, el locus de la cadena ligera A comprende una deleción de una o más secuencias del locus, en donde la una o más deleciones hacen que el locus de la cadena ligera A sea incapaz de reordenarse para formar un gen de cadena ligera. En otra realización, se suprimen la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos V del locus de la cadena ligera A. En otra realización, el ratón comprende una deleción de la totalidad o sustancialmente todos, los locus variables de cadena ligera endógenos.

En una realización, el ratón comprende además en su línea germinal una secuencia seleccionada de un potenciador k intrónico de ratón 5' con respecto a la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada o los segmentos genéticos no reordenados, un potenciador 3' k de ratón y una combinación de los mismos.

En una realización, la secuencia de dominio variable de cadena ligera universal del ratón comprende una o más hipermutaciones somáticas; en una realización, la secuencia de dominio variable comprende una pluralidad de hipermutaciones somáticas.

En una realización, el ratón produce una cadena ligera universal que comprende un dominio variable humano mutado somáticamente. En una realización, la cadena ligera comprende un dominio variable humano mutado somáticamente derivado de un segmento V humano, un segmento J humano y un gen Ck de ratón. En una realización, el ratón no expresa una cadena ligera A.

En una realización, la secuencia variable humana es una secuencia Vk1-39Jk5 humana reordenada y el ratón expresa una cadena ligera quimérica inversa que comprende (i) un dominio variable derivado de Vk1-39Jk5 y (ii) un Ck de ratón; en donde la cadena ligera se asocia con una cadena pesada quimérica inversa que comprende (i) un Ch de ratón y (ii) un dominio variable de cadena pesada humana mutado somáticamente. En una realización, el ratón expresa una cadena ligera que está mutada somáticamente.

En una realización, la secuencia variable humana es una secuencia Vk3-20Jk1 humana reordenada y el ratón expresa una cadena ligera quimérica inversa que comprende (i) un dominio variable derivado de Vk3-20Jk1 , (ii) un Ck de ratón; en donde la cadena ligera se asocia con una cadena pesada quimérica inversa que comprende (i) un Ch de ratón y (ii) un dominio variable de cadena pesada humana mutado somáticamente.

En una realización, el ratón comprende tanto una secuencia Vk1-39Jk5 humana reordenada como una secuencia Vk3-20Jk1 humana reordenada, y el ratón expresa una cadena ligera quimérica inversa que comprende (i) una cadena ligera que comprende un dominio variable derivado de la secuencia Vk1-39Jk5 o la secuencia Vk3-20Jk1 y (ii) un Ck de ratón; en donde la cadena ligera se asocia con una cadena pesada quimérica inversa que comprende (i) un Ch de ratón y (ii) un dominio variable de cadena pesada humana mutado somáticamente. En una realización, el ratón expresa una cadena ligera que está mutada somáticamente.

En una realización, el ratón expresa un anticuerpo quimérico inverso que comprende una cadena ligera que comprende una Ck de ratón y un dominio variable humano mutado somáticamente derivado de una secuencia Vk1-39Jk5 humana reordenada o una secuencia Vk3-20Jk1 humana reordenada, y una cadena pesada que comprende un Ch de ratón y un dominio variable de cadena pesada humana mutado somáticamente, en donde el ratón no expresa un anticuerpo completamente de ratón y no expresa un anticuerpo completamente humano. En una realización, el ratón comprende un locus de cadena ligera k que comprende un reemplazo de segmentos génicos de cadena ligera k de ratón endógenos con la secuencia Vk1-39Jk5 humana reordenada o la secuencia Vk3-20Jk1 humana reordenada, y comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de ratón endógenos con un repertorio completo o sustancialmente completo de segmentos génicos V, D y J de cadena pesada humana.

En un aspecto, se proporciona un ratón modificado genéticamente que expresa una única cadena ligera k derivada de no más de una, o no más de dos, secuencias de cadena ligera k reordenadas, en donde el ratón, tras la inmunización con antígeno, muestra un título sérico que es comparable a un ratón de tipo silvestre inmunizado con el mismo antígeno. En una realización específica, el ratón expresa una secuencia de cadena ligera k única, en donde la secuencia de cadena ligera k única deriva de no más de una secuencia de cadena ligera k reordenada. En una realización, el título sérico se caracteriza como inmunoglobulina total. En una realización específica, el título sérico se caracteriza como título específico de IgM. En una realización específica, el título sérico se caracteriza como título específico de IgG. En una realización más específica, la secuencia de cadena ligera k reordenada se selecciona de una secuencia Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1. En una realización, la secuencia de cadena ligera k reordenada es una secuencia Vk1-39Jk5. En una realización, la secuencia de cadena ligera k reordenada es una secuencia Vk3-20Jk1.

En un aspecto, el ratón genéticamente modificado proporcionado expresa una pluralidad de cadenas pesadas de inmunoglobulinas asociadas con una única secuencia de cadena ligera. La cadena pesada comprende una secuencia humana. La secuencia humana incluye al menos una secuencia variable y también puede comprender una secuencia humana seleccionada de un CH1, una bisagra, un CH2, un CH3 y una combinación de los mismos. La cadena ligera única comprende una secuencia humana. La secuencia humana incluye al menos una secuencia variable y también puede comprender una secuencia humana seleccionada de una secuencia constante y una combinación de las mismas. En una realización, el ratón comprende un locus de inmunoglobulina endógeno desactivado y expresa la cadena pesada de un transgén o episoma extracromosómico. En una realización, el ratón comprende un reemplazo en un locus de ratón endógeno de algunos o todos los segmentos génicos de cadena pesada de ratón endógenos (es decir, V, D, J), y/o algunas o todas las secuencias constantes de cadena pesada de ratón endógenas (por ejemplo, CHi, bisagra, CH2, CH3, o una combinación de los mismos), y/o algunas o todas las secuencias de cadena ligera de ratón endógenas (por ejemplo, V, J, constante, o una combinación de las mismas), con una o más secuencias de inmunoglobulinas humanas.

En una realización, el ratón, después de la reordenación de uno o más segmentos génicos V, D y J, el ratón comprende en su genoma al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón o un homólogo o un ortólogo o un fragmento funcional del mismo. En una realización, después de la reordenación, el ratón comprende en su genoma al menos dos secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen ADAM6 de ratón o un homólogo o un ortólogo o un fragmento funcional del mismo. En una realización, después de la reordenación, el ratón comprende en su genoma al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón o un homólogo o un ortólogo o un fragmento funcional del mismo. En una realización, el ratón comprende el gen ADAM6 o un homólogo o un ortólogo o un fragmento funcional del mismo en un linfocito B.

[Eliminado].

También se divulgan ratones macho que comprenden una secuencia ADAM6 o un homólogo o un ortólogo o un fragmento funcional de la misma en una ubicación en el genoma de ratón que se aproxima a la ubicación del alelo endógeno ADAM6 de ratón, por ejemplo, 3' de una secuencia del segmento génico V final y 5' de un segmento génico D inicial.

En una realización, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 o un homólogo o un ortólogo o un fragmento funcional de la misma flanqueada cadena arriba, cadena abajo o cadena arriba y cadena abajo (con respecto a la dirección de transcripción de la secuencia ADAM6) de una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento génico de región variable de inmunoglobulina. En una realización específica, el segmento génico de la región variable de inmunoglobulina es un segmento génico humano. En una realización, el segmento génico de región variable de inmunoglobulina es un segmento génico humano, y la secuencia que codifica la ADAM6 de ratón o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional de la misma en un ratón está entre segmentos génicos V humanos; en una realización, el ratón comprende dos o más segmentos génicos V humanos, y la secuencia está en una posición entre el segmento génico V final y el penúltimo segmento génico V; en una realización, la secuencia está en una posición que sigue al segmento génico V final y al primer segmento génico D. En las realizaciones descritas en el presente documento, referencia a "ADAM6" significa "ADAM6 y ADAM6b".

El locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada carece de un gen ADAM6 de ratón endógeno funcional en el locus ADAM6 endógeno. En una realización, el locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada comprende un gen ADAM6 que es funcional en un ratón macho. En una realización específica, el gen ADAM6 que es funcional en el ratón macho es un gen ADAM6 de ratón, y el gen ADAM6 de ratón se coloca dentro o inmediatamente adyacente al locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada.

En una realización, el locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada carece de un gen ADAM6 de ratón endógeno, y el ratón comprende una secuencia ADAM6 ectópica que es funcional en un ratón macho. En una realización, el gen ADAM6 ectópico que es funcional en el ratón macho es un gen ADAM6 de ratón. En una realización, el gen ADAM6 de ratón está en el mismo cromosoma que el locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada. En una realización, el gen ADAM6 de ratón está en un cromosoma diferente al locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada. En una realización, el gen ADAM6 del ratón está en un episoma.

En un caso, el ratón comprende un primer alelo de cadena pesada endógeno y un segundo alelo de cadena pesada endógeno, y el primer alelo de cadena pesada endógeno comprende una deleción de un locus ADAM6 de ratón, y el primer alelo de cadena pesada endógeno comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos V, D y J de ratón funcionales con uno o más segmentos V, D y J humanos. En una realización, el primer y el segundo alelos de cadena pesada endógenos comprenden cada uno una deleción de un locus ADAM6 de ratón endógeno, y el primer y el segundo alelos de cadena pesada endógenos comprenden un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos V, D y J de ratón funcionales con uno o más segmentos V, D y J humanos. En una realización, el primer y/o el segundo alelo comprende una secuencia de ácido nucleico ectópico que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional de la misma. En una realización, la secuencia de ácido nucleico ectópico se ubica 3' (con respecto a la direccionalidad transcripcional del locus variable de la cadena pesada) de un segmento génico V de ratón final y se ubica 5' (con respecto a la direccionalidad transcripcional de la secuencia constante) de un gen constante de cadena pesada de ratón (o quimérico humano/ratón) o fragmento del mismo (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica Ch1 y/o bisagra Ch2 y/o Ch3 humanas y/o de ratón). En una realización, la secuencia de ácido nucleico ectópico se ubica cadena abajo (con respecto a la dirección de transcripción del locus del segmento V) de un segmento V y cadena arriba de un segmento D. En una realización, la secuencia de ácido nucleico ectópico se ubica entre el penúltimo segmento V más 3' y el último segmento V más 3'. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico ectópico se ubica entre el segmento V humano Vh1-2 y el segmento V humano V^h6- 1. En una realización, la secuencia de nucleótidos entre los dos segmentos génicos V humanos se coloca en orientación de transcripción opuesta con respecto a los segmentos génicos V humanos. En una realización específica, la secuencia de nucleótidos codifica, de 5 'a 3' con respecto a la dirección de transcripción de los genes ADAM6 y la secuencia ADAM6a seguida de una secuencia ADAM6b. En una realización específica, los genes ADAM6 están orientados en orientación transcripcional opuesta en comparación con los segmentos V flanqueantes cadena arriba y cadena abajo.

Se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica ADAM6a de ratón o un fragmento funcional de la misma y/o una secuencia que codifica ADAM6b de ratón o un fragmento funcional de la misma, en donde la ADAM6a y/o ADAM6b o uno o varios fragmentos funcionales de los mismos están operativamente unidos a un promotor. El promotor puede ser un promotor humano. El promotor puede ser el promotor ADAM6 de ratón. El promotor ADAM6 puede comprender una secuencia localizada entre el primer codón del primer gen ADAM6 más cercano al segmento génico D^hde ratón más 5' y la secuencia de señal de recombinación del segmento génico Dh más 5', en donde se indica 5' con respecto a dirección de transcripción de los genes de inmunoglobulinas de ratón. El promotor puede ser un promotor vírico. El promotor vírico puede ser un promotor de citomegalovirus (CMV). El promotor puede ser un promotor de ubiquitina.

En una realización, el ADAM6a y/o ADAM6b de ratón se seleccionan de ADAM6a de la SEQ ID NO: 1 y/o ADAM6b de secuencia de la SEQ ID NO: 2. En una realización, el promotor ADAM6 de ratón es un promotor de ^sE^qID NO: 3. En una realización específica, el promotor ADAM6 de ratón comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3 directamente cadena arriba (con respecto a la dirección de transcripción de ADAM6a) del primer codón de ADAM6a y se extiende hasta el final de la SEQ ID NO: 3 cadena arriba de la región codificante de ADAM6. En otra realización específica, el promotor ADAM6 es un fragmento que se extiende desde aproximadamente 5 a aproximadamente 20 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio de ADAM6a a aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 2 kb o 3 kb o más cadena arriba del codón de inicio de ADAM6a.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma que cuando se coloca en un ratón que es infértil o que tiene baja fertilidad debido a la falta de ADAM6, mejora la fertilidad o restaura la fertilidad a una fertilidad de tipo silvestre. En una realización, la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma confiere a un ratón macho la capacidad de producir un espermatozoide que es capaz de atravesar un oviducto de ratón hembra para fertilizar un óvulo de ratón.

Los ratones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6, o un ortólogo o un homólogo o un fragmento de la misma, que es funcional en un ratón macho. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico está dentro o adyacente a una secuencia de ácido nucleico humano que comprende uno o más segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina. En una realización, el uno o más segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina está en un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno modificado. En una realización, la modificación comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón funcionales con una pluralidad de segmentos de segmentos génicos de cadena pesada humana no reordenados que están operativamente unidos a un gen de región constante de ratón endógeno. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico está entre dos segmentos V humanos. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico está entre un segmento V humano y un segmento D humano. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico está entre un segmento D humano y un segmento J humano. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico está cadena arriba del segmento V humano más 5' (con respecto a la dirección de transcripción del segmento V). En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico está entre un segmento J humano y una secuencia génica de región constante de cadena pesada de ratón endógena.

En una realización, los ratones macho son capaces de generar descendencia mediante el apareamiento, con una frecuencia que es casi la misma que la de un ratón de tipo silvestre. En una realización, los ratones macho producen espermatozoides que puede transitar desde el útero de un ratón a través de un oviducto de ratón para fertilizar un óvulo de ratón; en una realización específica, los espermatozoides de los ratones transitan a través del oviducto casi tan eficazmente como los espermas de un ratón de tipo silvestre. En una realización, aproximadamente el 50% o más de los espermatozoides producidos en el ratón muestran la capacidad de entrar y/o transitar un oviducto para fertilizar un óvulo de ratón.

El ratón carece de un locus ADAM6 endógeno funcional, en donde el ratón comprende una secuencia de nucleótidos ectópica que complementa la pérdida de la función ADAM6 de ratón en un ratón macho. En una realización, la secuencia de nucleótidos ectópica confiere al ratón macho la capacidad de producir descendencia que es comparable a un ratón macho de tipo silvestre correspondiente que contiene un gen ADAM6 endógeno funcional. En una realización, la secuencia confiere al ratón la capacidad de formar un complejo de ADAM2 y/o ADAM3 y/o ADAM6 sobre la superficie del espermatozoide del ratón. En una realización, la secuencia confiere al ratón la capacidad de viajar desde un útero de ratón a través de un oviducto de ratón a un óvulo de ratón para fertilizar el óvulo.

En una realización, el ratón carece de un locus ADAM6 endógeno funcional y comprende una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una ADAM6 o un ortólogo o un homólogo o un fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho y en donde el ratón macho produce al menos aproximadamente un 50%, 60 %, 70 %, 80%, o 90% de la cantidad de camadas que produce un ratón de tipo silvestre de la misma edad y cepa en un período de seis meses.

En una realización, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótidos ectópica produce al menos aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 2,5 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, o aproximadamente 10 veces o más de progenie cuando se reproduce durante un período de seis meses que un ratón de la misma edad y la misma cepa o similar que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia de nucleótidos ectópica que se reproduce sustancialmente durante el mismo período de tiempo y en sustancialmente las mismas condiciones.

En una realización, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótidos ectópica produce un promedio de al menos aproximadamente 2 veces, 3 veces o 4 veces mayor número de cachorros por camada en un período de reproducción de 4 o 6 meses que un ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia de nucleótidos ectópica, y que se reproduce durante el mismo período de tiempo.

En una realización, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótidos ectópica es un ratón macho, y el ratón macho produce espermatozoides que cuando se recuperan de los oviductos aproximadamente 5- 6 horas después de la copulación refleja una migración en el oviducto que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, 100 veces, 110 veces, o 120 veces o más que el espermatozoide de un ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia de nucleótidos ectópica.

En una realización, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótidos ectópica cuando copula con un ratón hembra genera esperma que es capaz de atravesar el útero y entrar y atravesar el oviducto dentro de aproximadamente 6 horas con una eficacia que es aproximadamente igual a la del esperma de un ratón de tipo silvestre.

En una realización, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia de nucleótidos ectópica produce aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, o aproximadamente 4 veces o más camadas en un período de tiempo comparable que un ratón que carece del gen ADAM6 funcional y que carece de la secuencia de nucleótidos ectópica.

También se describe un ratón que comprende un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno humanizado y una modificación de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón, en donde el ratón expresa un linfocito B que comprende una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana reordenada unida operativamente a una secuencia génica de región constante de cadena pesada humana o de ratón, y el linfocito B comprende en su genoma (p. ej., en un cromosoma de linfocitos B) un gen que codifica una ADAM6 o un ortólogo o un homólogo o un fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho (por ejemplo, un gen ADAM6 de ratón, por ejemplo, ADAM6a de ratón y/o ADAM6b de ratón), en donde los dominios variables de las cadenas ligeras de inmunoglobulina A o k de los ratones derivan de no más de uno o no más de dos segmentos génicos V de cadena ligera.

En un caso, la secuencia de inmunoglobulina reordenada unida operativamente a la secuencia génica de la región constante de cadena pesada comprende una secuencia V, D y/o J de cadena pesada humana; una secuencia V, D y/o J de cadena pesada de ratón; una secuencia V y/o J de cadena ligera humana o de ratón. En un caso, la secuencia génica de la región constante de cadena pesada comprende una secuencia de cadena pesada humana o de ratón seleccionada del grupo que consiste en un Ch1, una bisagra, un Ch2, un Ch3 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el ratón proporcionado es adecuado para producir anticuerpos que tienen la misma cadena ligera, en donde la totalidad o sustancialmente todos los anticuerpos producidos en el ratón se expresan con la misma cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende un dominio variable humano, y en donde los anticuerpos comprenden una cadena pesada que comprende un dominio variable humano.

En un aspecto, el ratón proporcionado se caracteriza por la incapacidad del ratón para producir un linfocito B que exprese un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina que deriva de una secuencia de cadena ligera reordenada que no es una secuencia Vk1-39Jk5 humana o una secuencia Vk3-20Jk1 humana.

En una realización, el ratón muestra una proporción de cadena ligera k: A que es aproximadamente la misma que la de un ratón que comprende un complemento de tipo silvestre de segmentos génicos V y J de cadena ligera de inmunoglobulina.

En un aspecto, se proporciona un ratón como se describe en el presente documento que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina derivada de una secuencia Vk1-39Jk5 humana o una secuencia Vk3-20Jk1 humana, en donde el ratón comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de ratón endógenos con uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena pesada humana, y el ratón muestra una proporción de (a) linfocitos B CD19+ que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera A, a (b) linfocitos B CD19+ que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera k, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20.

En una realización, el ratón expresa una cadena ligera k única, en donde la cadena ligera k única deriva de una secuencia Vk1-39Jk5 humana y la proporción de linfocitos B CD19+ que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera A a linfocitos B CD19+ que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera k es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20; en una realización, la proporción es de aproximadamente 1 a al menos aproximadamente 66; en una realización específica, la relación es de aproximadamente 1 a 66.

En una realización, el ratón expresa una cadena ligera k única, en donde la cadena ligera k única deriva de una secuencia Vk3-20Jk5 humana y la proporción de linfocitos B CD19+ que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera A a linfocitos B CD19+ que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera k es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20; en una realización, la proporción es de aproximadamente 1 a aproximadamente 21. En realizaciones específicas, la proporción es 1 a 20 o 1 a 21.

En una realización, el porcentaje de linfocitos B IgK+ IgA+ en el ratón es aproximadamente el mismo que en un ratón de tipo silvestre. En una realización específica, el porcentaje de linfocitos B IgK+ IgA+ en el ratón es aproximadamente de aproximadamente un 2 a aproximadamente un 6 por ciento. En una realización específica, el porcentaje de linfocitos B IgK+ IgA+ en un ratón en donde la cadena ligera k reordenada única deriva de una secuencia Vk1-39Jk5 es de aproximadamente un 2 a aproximadamente un 3; en una realización específica, aproximadamente un 2,6. En una realización específica, el porcentaje de linfocitos B IgK+ IgA+ en un ratón en donde la cadena ligera k reordenada única deriva de una secuencia V^k3-20J^k1 es de aproximadamente un 4 a aproximadamente un 8; en una realización específica, aproximadamente un 6.

En una realización, el ratón no comprende una modificación que reduzca o elimine la capacidad del ratón de mutar somáticamente cualquier locus funcional de cadena ligera del mouse. En una realización, el único locus funcional de cadena ligera en el ratón expresa una cadena ligera que comprende un dominio variable humano derivado de una secuencia reordenada seleccionada de una secuencia Vk1-39Jk5 humana, una secuencia Vk3-20Jk1 humana y una combinación de las mismas.

En un aspecto, se proporciona el ratón modificado genéticamente que expresa una única cadena ligera k derivada de no más de una, o no más de dos, secuencias de cadena ligera k reordenadas, en donde el ratón muestra el uso de la cadena ligera ^kque es aproximadamente 100 veces o más, al menos aproximadamente 200 veces o más, al menos aproximadamente 300 veces o más, al menos aproximadamente 400 veces o más, al menos aproximadamente 500 veces o más, al menos aproximadamente 600 veces o más, al menos aproximadamente 700 veces o más, al menos aproximadamente 800 veces o más, al menos aproximadamente 900 veces o más, al menos aproximadamente 1000 veces o más, mayor que el uso de la misma cadena ligera k (es decir, derivada del mismo segmento V y el mismo segmento J, o derivado del mismo segmento V/J reordenado) mostrado por un ratón que soporta un locus de cadena ligera k humana completo o sustancialmente completo. En una realización específica, el ratón que lleva un locus de cadena ligera k humana completo o sustancialmente completo carece de una secuencia de cadena ligera k de ratón no reordenada funcional. En una realización específica, el ratón expresa la cadena ligera k única de no más de una secuencia de cadena ligera k reordenada. En una realización, el ratón comprende una copia de una secuencia de cadena ligera k reordenada (por ejemplo, un heterocigoto). En una realización, el ratón comprende dos copias de una secuencia de cadena ligera k reordenada (por ejemplo, un homocigoto). En una realización más específica, la secuencia de cadena ligera k reordenada se selecciona de una secuencia Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1. En una realización, la secuencia de cadena ligera k reordenada es una secuencia Vk1-39Jk5. En una realización, la secuencia de cadena ligera k reordenada es una secuencia Vk3-20Jk1.

En un aspecto, el ratón modificado genéticamente proporcionado expresa una única cadena ligera derivada de no más de una, o no más de dos, secuencias de cadena ligera k reordenadas, en donde la cadena ligera en el ratón genéticamente modificado muestra un nivel de expresión que es al menos 10 veces a aproximadamente 1.000 veces, 100 veces a aproximadamente 1.000 veces, 200 veces a aproximadamente 1.000 veces, 300 veces a aproximadamente 1.000 veces, 400 veces a aproximadamente 1.000 veces, 500 veces a aproximadamente 1.000 veces, 600 veces a aproximadamente 1.000 veces, 700 veces a aproximadamente 1.000 veces, 800 veces a aproximadamente 1.000 veces, o 900 veces a aproximadamente 1.000 veces mayor que la expresión de la misma cadena ligera reordenada mostrada por un ratón que lleva un locus variable de cadena ligera k humana completo o sustancialmente completo. En una realización, la cadena ligera comprende una secuencia humana. En una realización, la cadena ligera única deriva de una secuencia de cadena ligera k reordenada seleccionada de una Vk1-39Jk5 humana, una Vk3-20Jk1 humana, y una combinación de las mismas.

En una realización, el nivel de expresión de la cadena ligera, con el fin de comparar la expresión de la cadena ligera con la expresión en un ratón que comprende un locus variable de cadena ligera sustancialmente completamente humanizado, se caracteriza cuantificando ARNm de la secuencia de la cadena ligera transcrita (de la una o dos secuencias reordenadas), y comparándolas con la secuencia de cadena ligera transcrita de un ratón que lleva un locus de cadena ligera completo o sustancialmente completo.

También se describe un método para producir un anticuerpo, que comprende expresar en una célula (a) una primera secuencia de ácido nucleico de dominio variable de cadena pesada humana de un ratón inmunizado como se describe en el presente documento fusionada con una secuencia del gen Ch humano; (b) una secuencia de ácido nucleico de dominio variable de cadena ligera humana de un ratón inmunizado como se describe en el presente documento fusionada con una secuencia del gen Cl humano; y, (c) mantener la célula en condiciones suficientes para expresar un anticuerpo completamente humano y aislar el anticuerpo. En una realización, la célula comprende una segunda secuencia de ácido nucleico de dominio variable de cadena pesada humana de un segundo ratón inmunizado como se describe en el presente documento fusionada con una secuencia de gen Ch humano, la primera secuencia de ácido nucleico de cadena pesada codifica un primer dominio variable de cadena pesada que reconoce un primer epítopo, y la segunda secuencia de ácido nucleico de cadena pesada codifica un segundo dominio variable de cadena pesada que reconoce un segundo epítopo, en donde el primer epítopo y el segundo epítopo no son idénticos.

También se describe un método para producir una proteína de unión a epítopo, que comprende exponer un ratón como se describe en el presente documento con un antígeno que comprende un epítopo de interés, mantener el ratón en condiciones suficientes para que el ratón genere una molécula de inmunoglobulina que se una específicamente al epítopo de interés y aislar la molécula de inmunoglobulina que se une específicamente al epítopo de interés; en donde la proteína de unión a epítopo comprende una cadena pesada que comprende un dominio variable humano mutado somáticamente y un Ch de ratón, asociados con una cadena ligera que comprende un Cl de ratón y un dominio variable humano derivado de un Vk1-39Jk5 humano reordenado o un Vk3-20Jk1 humano reordenado.

También se describe un método para producir una proteína de unión a antígeno biespecífica, que comprende exponer un primer ratón como se describe en el presente documento a un primer antígeno de interés que comprende un primer epítopo, exponer un segundo ratón como se describe en el presente documento a un segundo antígeno de interés que comprende un segundo epítopo, permitir que el primer y el segundo ratón monten respuestas inmunitarias a los antígenos de interés, identificar en el primer ratón una primera región variable de cadena pesada humana que se une al primer epítopo del primer antígeno de interés, identificar en el segundo ratón una segunda región variable de cadena pesada humana que se une al segundo epítopo del segundo antígeno de interés, producir un primer gen de cadena pesada completamente humano que codifica una primera cadena pesada que se une al primer epítopo del primer antígeno de interés, producir un segundo gen de cadena pesada completamente humano que codifica una segunda cadena pesada que se une al segundo epítopo del segundo antígeno de interés, expresar la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada en una célula que expresa una única cadena ligera completamente humana derivada de un segmento génico Vk1-39 humano o Vk3-20 humano para formar una proteína de unión a antígeno biespecífica, y aislar la proteína de unión a antígeno biespecífica.

En un caso, el primer antígeno y el segundo antígeno no son idénticos.

En un caso, el primer antígeno y el segundo antígeno son idénticos, y el primer epítopo y el segundo epítopo no son idénticos. En un caso, la unión de la primera región variable de cadena pesada al primer epítopo no bloquea la unión de la segunda región variable de cadena pesada al segundo epítopo.

En un caso, el primer antígeno se selecciona de un antígeno soluble y un antígeno de superficie celular (por ejemplo, un antígeno tumoral), y el segundo antígeno comprende un receptor de superficie celular. En una realización específica, el receptor de superficie celular es un receptor de inmunoglobulina. En una realización específica, el receptor de inmunoglobulina es un receptor de Fc. En un caso, el primer antígeno y el segundo antígeno son el mismo receptor de superficie celular, y la unión de la primera cadena pesada al primer epítopo no bloquea la unión de la segunda cadena pesada al segundo epítopo.

En una realización, el dominio variable de la cadena ligera de la cadena ligera comprende de 2 a 5 mutaciones somáticas. En una realización, el dominio variable de la cadena ligera es una cadena ligera afín mutada somáticamente expresada en un linfocito B del primer o segundo ratón inmunizado con el primer o el segundo dominio variable de cadena pesada.

En un aspecto, se proporciona una célula que expresa una proteína de unión a epítopo, en donde la célula comprende: (a) una secuencia de nucleótidos humana que codifica un dominio variable de cadena ligera humana que deriva de una Vk1-39Jk5 humana reordenada o una Vk3-20Jk1 humana reordenada, en donde la secuencia de ácido nucleico humana se fusiona (directamente o a través de un enlazador) a una secuencia de ácido nucleico de dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana (por ejemplo, una secuencia de ADN de dominio constante k humano); y, (b) una primera secuencia de ácido nucleico de dominio variable de cadena pesada humana que codifica un dominio variable de cadena pesada humana derivada de una primera secuencia de nucleótidos de dominio variable de cadena pesada humana, en donde la primera secuencia de nucleótidos de dominio variable de cadena pesada humana se fusiona (directamente o a través de un enlazador) a una secuencia de ácido nucleico de dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana (por ejemplo, una secuencia de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgE humana); en donde la proteína de unión a epítopo reconoce un primer epítopo. En una realización, la proteína de unión a epítopo se une al primer epítopo con una constante de disociación inferior a 10-6 M, inferior a 10-8 M, inferior a 10-9 M, inferior a 10-10 M, inferior a 10-11 M, o inferior a 10-12 M. En una realización, la célula comprende una segunda secuencia de nucleótidos humana que codifica un segundo dominio variable de cadena pesada humana, en donde la segunda secuencia humana se fusiona (directamente o a través de un enlazador) a una secuencia de ácido nucleico de dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana, y en donde el segundo dominio variable de cadena pesada humana no reconoce específicamente el primer epítopo (por ejemplo, presenta una constante de disociación de, por ejemplo, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, o superior), y en donde la proteína de unión a epítopo se une tanto al primer epítopo como al segundo epítopo, y en donde la primera y la segunda cadenas pesadas de inmunoglobulina se asocian cada una con una cadena ligera de acuerdo con (a). En una realización, el segundo dominio Vh se une al segundo epítopo con una constante de disociación que es inferior a 10-6 M, inferior a 10-7 M, inferior a 10-8 M, inferior a 10-9 M, inferior a 10-10 M, inferior a 10-11 M o inferior a 10-12 M.

En una realización, la proteína de unión a epítopo comprende una primera cadena pesada de inmunoglobulina y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina, cada una asociada con una cadena ligera universal (por ejemplo, una cadena ligera derivada de una secuencia variable de cadena ligera humana reordenada seleccionada de una Vk1-39Jk5 humana o una Vk3-20Jk1 humana),en donde la primera cadena pesada de inmunoglobulina se une a un primer epítopo con una constante de disociación en el intervalo nanomolar (por ejemplo, 1 nM a 100 nM) a picomolar (por ejemplo, 1 pM a 100 pM), la segunda cadena pesada de inmunoglobulina se une un segundo epítopo con una constante de disociación en el intervalo nanomolar a picomolar (por ejemplo, 1 pM a 100 nM), el primer epítopo y el segundo epítopo no son idénticos, la primera cadena pesada de inmunoglobulina no se une al segundo epítopo o se une al segundo epítopo con una constante de disociación más débil que el intervalo micromolar (por ejemplo, el intervalo milimolar), la segunda cadena pesada de inmunoglobulina no se une al primer epítopo o se une al primer epítopo con una constante de disociación más débil que el intervalo micromolar (por ejemplo, el intervalo milimolar) y uno o más de los dominios variables (es decir, uno o más del dominio variable de cadena ligera, el dominio variable de cadena pesada de la primera cadena pesada de inmunoglobulina, y el dominio variable de cadena pesada) de la segunda cadena pesada de inmunoglobulina está mutado somáticamente. En una realización, la unión de la proteína de unión a epítopo al primer epítopo no bloquea la unión de la proteína de unión a epítopo al segundo epítopo.

En una realización, la primera cadena pesada de inmunoglobulina comprende un determinante de unión a proteína A de tipo silvestre, y la segunda cadena pesada carece de un determinante de unión a proteína A de tipo silvestre. En una realización, la primera cadena pesada de inmunoglobulina se une a la proteína A en condiciones de aislamiento, y la segunda cadena pesada de inmunoglobulina no se une a la proteína A o se une a la proteína A al menos 10 veces, unas cien veces o unas mil veces más débil que la primera cadena pesada de inmunoglobulina se une a la proteína A en condiciones de aislamiento. En una realización específica, la primera y la segunda cadenas pesadas son isotipos de IgG1, en donde la segunda cadena pesada comprende una modificación seleccionada entre 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), y una combinación de las mismas, y en donde la primera cadena pesada carece de dicha modificación.

En un aspecto, un ratón, embrión o célula como se describe en el presente documento comprende un locus de cadena ligera k que conserva elementos reguladores o de control endógenos, por ejemplo, un potenciador intrónico k de ratón, un potenciador 3' k de ratón, o tanto un potenciador intrónico como un potenciador 3', en donde los elementos reguladores o de control facilitan la mutación somática y la maduración por afinidad de una secuencia expresada del locus de la cadena ligera k.

En un aspecto, se proporciona una célula de ratón que se aísla de un ratón como se describe en el presente documento. Por lo tanto, también se proporciona una célula de ratón cuyo genoma comprende:

(b) no más de una, o no más de dos, secuencias Vk/Jk humanas reordenadas unidas operativamente a un gen de región constante de cadena ligera k endógena en un locus de cadena ligera k endógeno; y

en donde el genoma de la célula de ratón carece de:

un gen ADAM6 endógeno funcional en el locus ADAM6 endógeno,

un segmento génico Vk de inmunoglobulina endógeno funcional, y

un segmento génico Jk de inmunoglobulina endógeno funcional.

En una realización, la célula es una célula ES. En una realización, la célula es un linfocito. En una realización, el linfocito es un linfocito B. En una realización, el linfocito B expresa una cadena pesada quimérica que comprende un dominio variable derivado de un segmento génico V humano; y una cadena ligera derivada de (a) una secuencia Vk1-39/J humana reordenada, (b) una secuencia Vk3-20/J humana reordenada, o (c) una combinación de las mismas; en donde el dominio variable de cadena pesada está fusionado a una región constante de ratón y el dominio variable de cadena ligera está fusionado a una región constante de ratón o humana. En una realización, la célula es un linfocito B y el linfocito B comprende una secuencia que codifica un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana reordenada y una secuencia que codifica un dominio variable de cadena ligera universal, en donde el linfocito B comprende en un cromosoma una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo o un homólogo o un fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho; en una realización, el linfocito B de ratón comprende dos alelos de la secuencia de ácido nucleico.

En un aspecto, la célula de ratón proporcionada, comprende un primer cromosoma que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada que comprende segmentos V, D y J humanos no reordenados; un segundo cromosoma que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humanizada que codifica una cadena ligera, en donde el locus de cadena ligera comprende no más de una o no más de dos secuencias Vk /Jk de cadena ligera humana reordenadas operativamente unidas a un gen constante de cadena ligera k endógena ; y un tercer cromosoma que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo o un homólogo o un fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. En una realización, el primer y tercer cromosomas son iguales. En una realización, el segundo y tercer cromosomas son iguales. En una realización, el primer, el segundo y el tercer cromosomas son cada uno diferentes. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica la ADAM6 de ratón o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional de la misma está presente en dos copias. En una realización, la célula es una célula somática. En una realización específica, la célula somática es un linfocito B. En una realización, la célula es una célula germinal.

En un aspecto, se proporciona u hibridoma, en donde el hibridoma se produce con linfocito B de un ratón como se descritas en el presente documento. En una realización específica, el linfocito B es de un ratón como se describe en el presente documento que se ha inmunizado con un antígeno que comprende un epítopo de interés, y el linfocito B expresa una proteína de unión que se une al epítopo de interés, la proteína de unión tiene un dominio variable de cadena pesada humana mutado somáticamente y una región constante de cadena pesada de ratón, y tiene un dominio variable de cadena ligera humana derivado de un Vk1-39Jk5 humano reordenado o un V k3-20Jk1 humano reordenado y un Cl de ratón.

También se describe una célula que comprende un gen de cadena pesada completamente humano que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer dominio variable de cadena pesada de un ratón como se describe en el presente documento, y un gen de cadena ligera completamente humano que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de cadena ligera universal como se describe en el presente documento. En un caso, la célula comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo dominio variable de cadena pesada de un ratón como se describe en el presente documento, en donde el primer y el segundo dominio variable de cadena pesada son diferentes. En una realización, la célula se selecciona entre CHO, COS, 293, HeLa, y una célula retiniana que expresa una secuencia de ácido nucleico vírico (por ejemplo, una célula PERC.6™).

También se describe un embrión de ratón, en donde el embrión comprende una célula ES donante que deriva de un ratón como se describe en el presente documento.

También se describe el uso de un embrión de ratón que comprende una modificación genética como se describe en el presente documento, en donde el uso comprende producir un ratón genéticamente modificado como se describe en el presente documento.

También se describe un dominio variable de cadena pesada humana y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera humana de un anticuerpo producido en un ratón como se describe en el presente documento.

También se describe una secuencia de nucleótidos de dominio variable de cadena pesada humana y una secuencia de nucleótidos de dominio variable de cadena ligera humana de un anticuerpo producido en un ratón como se describe en el presente documento.

También se describe un anticuerpo o proteína de unión a antígeno o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, Fab, F(ab)2, scFv) producido en un ratón como se describe en el presente documento.

En un aspecto, el ratón proporcionado se produce usando un vector de direccionamiento, una construcción de nucleótidos o una célula como se describe en el presente documento.

En un aspecto, el ratón proporcionó una progenie del apareamiento de un primer ratón como se describe en el presente documento con un segundo ratón que es un ratón de tipo silvestre o genéticamente modificado.

También se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para producir un anticuerpo completamente humano, o una proteína de unión a antígeno completamente humana que comprende un dominio variable de inmunoglobulina o un fragmento funcional del mismo.

También se describe el uso de un ratón o tejido o célula como se describe en el presente documento para producir un anticuerpo biespecífico completamente humano.

También se describe el uso de una secuencia de ácido nucleico producida por un ratón como se describe en el presente documento, en donde el uso comprende expresar la secuencia de ácido nucleico en la producción de un agente terapéutico humano.

También se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para producir una línea celular inmortalizada.

También se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para producir un hibridoma o cuadroma.

También se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para producir una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina o un fragmento de la misma. En una realización, la secuencia de ácido nucleico se usa para producir un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En un caso, el ratón se usa para producir una proteína de unión a antígeno seleccionada de un anticuerpo, un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), un scFv, un bis-scFV, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un V-NAR, un VHH, un VL, un F(ab), un F(ab)2, una DVD (es decir, proteína de unión a antígeno de dominio variable dual), una SVD (es decir, proteína de unión a antígeno de dominio variable único) o un acoplador de linfocitos T biespecífico (BiTE).

También se describe el uso del ratón como se describe en el presente documento para la producción de un medicamento (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno), o para la fabricación de una secuencia que codifica una secuencia variable de un medicamento (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno), se proporciona para el tratamiento de una enfermedad o trastorno humano.

Cualquiera de las realizaciones y aspectos descritos en el presente documento pueden usarse juntos entre sí, salvo que se indique otra cosa o sea evidente a partir del contexto. Otras realizaciones serán evidentes para aquellos expertos en la materia a partir de una revisión de la siguiente descripción.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1A muestra una ilustración general, no a escala, para el reemplazo genómico directo de aproximadamente tres megabases (Mb) del locus del gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (símbolos cerrados) con aproximadamente una megabase (Mb) del locus del gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana (símbolos abiertos).

La FIG. 1B muestra una ilustración general, no a escala, para el reemplazo genómico directo de aproximadamente tres megabases (Mb) del locus del gen variable de la cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón (símbolos cerrados) con aproximadamente 0,5 megabases (Mb) de la primera, o proximal, de dos repeticiones casi idénticas del locus del gen variable de la cadena ligera k de inmunoglobulina humana (símbolos abiertos).

La FIG. 2A muestra una ilustración detallada, no a escala, para tres etapas iniciales (A-C) para el reemplazo genómico directo del locus del gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que da como resultado la deleción de todos los segmentos génicos Vh, Dh y Jh de ratón y el reemplazo con tres Vh humanos, todos los segmentos génicos Dh y Jh humanos. Se muestra un vector de direccionamiento para la primera inserción de segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina humana (3hVH BACvec) con un brazo de homología de ratón 5' de 67 kb, un casete de selección (rectángulo abierto), un sitio de recombinación específico del sitio (triángulo abierto), un fragmento genómico humano de 145 kb y un brazo de homología de ratón 3' de 8 kb. Se muestran segmentos génicos de inmunoglobulinas humanas (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados), casetes de selección adicionales (rectángulos abiertos) y sitios de recombinación específicos del sitio (triángulos abiertos) insertados a partir de vectores de direccionamiento posteriores.

La FIG. 2B muestra una ilustración detallada, no a escala, para seis etapas adicionales (D-I) para el reemplazo genómico directo del locus del gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que da como resultado la inserción de 77 segmentos génicos Vh humanos adicionales y la eliminación del casete de selección final. Se muestra un vector de direccionamiento para la inserción de segmentos génicos Vh humanos adicionales (18hVH BACvec) para la inserción inicial de segmentos génicos de cadena pesada humana (alelo híbrido 3hVH-CRE) con un brazo de homología de ratón 5' de 20 kb, un casete de selección (rectángulo abierto), un fragmento genómico humano de 196 kb y un brazo de homología humano de 62 kb que se solapa con el extremo 5 'de la inserción inicial de los segmentos génicos de cadena pesada humana que se muestra con un sitio de recombinación específico del sitio (triángulo abierto) ubicado en 5' de los segmentos génicos humanos. Se muestran segmentos génicos de inmunoglobulinas humanas (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados) y casetes de selección adicionales (rectángulos abiertos) insertados por vectores de direccionamiento posteriores.

La FIG. 2C muestra una ilustración detallada, no a escala, para tres etapas iniciales (A-C) para el reemplazo genómico directo del locus del gen variable de la cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón que da como resultado la deleción de todos los segmentos génicos Vk y Jk de ratón (Alelo Híbrido IgK-CRE). Se muestran casetes de selección (rectángulos abiertos) y sitios de recombinación específicos del sitio (triángulos abiertos) insertados a partir de vectores de direccionamiento.

La FIG. 2D muestra una ilustración detallada, no a escala, para 5 etapas adicionales (D-H) para el reemplazo genómico directo del locus del gen variable de la cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón que da como resultado la inserción de todos los segmentos génicos Vk y Jk humanos en la repetición proximal y la deleción del casete de selección final (Alelo Híbrido 40hVKdHyg). Se muestran segmentos génicos de inmunoglobulinas humanas (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados) y casetes de selección adicionales (rectángulos abiertos) insertados por vectores de direccionamiento posteriores.

La FIG. 3A muestra una ilustración general de las ubicaciones de los conjuntos de cebadores/sondas de PCR cuantitativa (qPCR) para la exploración de células ES para la inserción de secuencias de genes de cadena pesada humana y la pérdida de secuencias de genes de cadena pesada de ratón. La estrategia de exploración en células ES y ratones para la primera inserción de genes de cadena pesada humana se muestra con conjuntos de cebador/sonda de qPCR para la región suprimida (sondas de "pérdida" C y D), la región insertada (sondas G y H de "hIgH") y regiones flanqueantes (sondas de "retención" A, B, B, E y F) en un cromosoma de ratón no modificado (arriba) y un cromosoma correctamente dirigido (abajo).

La FIG. 3B muestra un cálculo representativo del número de copias de la sonda observadas en células ES precursoras y modificadas para la primera inserción de segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina humana. El número de copias de la sonda observadas para las sondas A a F se calculó como 2/2AACt. AACt se calcula como prom [ACt (muestra) - medACt (control)] donde ACt es la diferencia en Ct entre las sondas de prueba y de referencia (entre 4 y 6 sondas de referencia según el ensayo). El término medACt (control) es la mediana de ACt de múltiples (> 60) muestras de ADN no dirigidas de células ES precursoras. Se ensayó cada clon de células ES modificadas por sextuplicado. Para calcular el número de copias de las sondas G y H de IgH en las células ES precursoras, se supuso que estas sondas tenían un número de copias de 1 en las células ES modificadas y se utilizó un Ct (umbral de ciclo, por sus siglas en inglés, cycle treshold) máximo de 35 aunque no se observó amplificación.

La FIG. 3C muestra un cálculo representativo de los números de copias para cuatro ratones de cada genotipo que se calcularon de manera similar usando solo sondas D y H. Ratones de tipo silvestre: ratones TS; Ratones heterocigotos para la primera inserción de segmentos génicos de inmunoglobulina humana: Ratones HET; Ratones homocigoto para la primera inserción de segmentos génicos de inmunoglobulina humana: Ratones Homo.

La FIG. 4A muestra una ilustración de las tres etapas empleadas para la construcción de 3hVH BACvec por recombinación homóloga bacteriana (BHR, por sus siglas en inglés). Se muestran segmentos génicos de inmunoglobulinas humanas (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados), casetes de selección (rectángulos abiertos) y sitios de recombinación específicos del sitio (triángulos abiertos) insertados a partir de vectores de direccionamiento.

La FIG. 4B muestra electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE por sus siglas en inglés) de tres clones BAC (B1, B2 y B3) después de la digestión con Notl. Los marcadores M1, M2 y M3 son marcadores de PFG de intervalo bajo, intervalo medio y escalera lambda, respectivamente (New England BioLabs, Ipswich, MA).

La FIG. 5A muestra una ilustración esquemática, no a escala, de modificaciones secuenciales del locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón con cantidades crecientes de segmentos de genes de cadena pesada de inmunoglobulina humana. Se realizaron ratones homocigotos a partir de cada una de las tres etapas diferentes de la humanización de la cadena pesada. Los símbolos abiertos reflejan la secuencia humana; los símbolos cerrados reflejan la secuencia de ratón.

La FIG. 5B muestra una ilustración esquemática, no a escala, de modificaciones secuenciales del locus de la cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón con cantidades crecientes de segmentos de genes de la cadena ligera k de inmunoglobulina humana. Se realizaron ratones homocigotos a partir de cada una de las tres etapas diferentes de la humanización de la cadena ligera k. Los símbolos abiertos reflejan la secuencia humana; los símbolos cerrados reflejan la secuencia de ratón.

La FIG.6 muestra gráficos de puntos FACS de poblaciones de linfocitos B en ratones humanizados de tipo silvestre y VELOCIMMUNE®. Se tiñeron células de bazo (fila superior, tercera fila a partir de la fila superior e inferior) o ganglio linfático inguinal (segunda fila de la parte superior) de ratones de tipo silvestre (ts) o VELOCIMMUNE® 1 (V1), VELOCIMMUNE® 2 (V2) o VELOCIm Mu NE® 3 (V3) se tiñeron para determinar linfocitos B que expresaban IgM de superficie (fila superior y segunda fila desde la parte superior), inmunoglobulina de superficie que contiene cadenas ligeras k o A (tercera fila desde la parte superior) o IgM de superficie de haplotipos específicos (fila inferior) y poblaciones separadas por FACS.

La FIG. 7A muestra secuencias representativas de CDR3 de cadena pesada de anticuerpos VELOCIMMUNE® seleccionados al azar alrededor de la unión Vh-Dh-Jh (CDR3), demostrando diversidad de unión y adiciones de nucleótidos. Las secuencias de CDR3 de cadena pesada se agrupan de acuerdo con el uso del segmento génico Dh, cuya línea germinal se proporciona sobre cada grupo en negrita. Los segmentos génicos Vh para cada secuencia CDR3 de cadena pesada se observan entre paréntesis en el extremo 5' de cada secuencia (por ejemplo, 3-72 es Vh3-72 humano). Los segmentos génicos Jh para cada CDR3 de cadena pesada se observan entre paréntesis en el extremo 3' de cada secuencia (por ejemplo, 3 es Jh3 humano). Las SEQ ID NO para cada secuencia mostrada son los siguientes, de arriba a abajo: SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39.

La FIG. 7B muestra secuencias representativas de CDR3 de cadena ligera de anticuerpos VELOCIMMUNE® seleccionados al azar alrededor de la unión Vk-Jk (CDR3), demostrando diversidad de unión y adiciones de nucleótidos. Los segmentos génicos Vk para cada secuencia de CDR3 de cadena ligera se indican entre paréntesis en el extremo 5' de cada secuencia (por ejemplo, 1-6 es V k1-6 humano). Los segmentos génicos Jk para cada CDR3 de cadena ligera se observan entre paréntesis en el extremo 3' de cada secuencia (por ejemplo, 1 es Jk1 humano). Las SEQ ID NO para cada secuencia mostrada son los siguientes, de arriba a abajo: SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58.

La FIG. 8 muestra las frecuencias de hipermutación somática de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos VELOCIMMUNE® puntuadas (después de la alineación con las secuencias de la línea germinal apareadas) como porcentaje de secuencias cambiadas en cada posición de nucleótido (NT; columna izquierda) o aminoácido (AA; columna derecha) entre conjuntos de 38 (IgM no inmunizada), 28 (IgG no inmunizada), 32 (IgK no inmunizada de IgG), 36 (IgG inmunizada) o 36 (Igk inmunizada de IgG) secuencias. Las barras sombreadas indican la ubicación de las CDR.

La FIG. 9A muestra los niveles de inmunoglobulina sérica para los isotipos IgM e IgG en ratones de tipo silvestre (barras abiertas) o VELOCIMMUNE® (barras cerradas).

La FIG. 9B muestra los niveles de inmunoglobulina sérica para el isotipo IgA en ratones de tipo silvestre (barras abiertas) o VELOCIMMUNE® (barras cerradas).

La FIG. 9C muestra los niveles de inmunoglobulina sérica para el isotipo IgE en ratones de tipo silvestre (barras abiertas) o VELOCIMMUNE® (barras cerradas).

La FIG. 10A muestra títulos de IgG específicos de antígeno contra el receptor de interleucina-6 de suero siete ratones VELOCIMMUNE® (VI) y cinco ratones de tipo silvestre (TS) después de dos (sangrado 1) o tres (sangrado 2 ) rondas de inmunización con ectodominio del receptor de interleucina-6.

La FIG. 10B muestra títulos de isotipo IgG específicos para el receptor anti-interleucina-6 de siete ratones VELOCIMMUNE® (VI) y cinco ratones de tipo silvestre (TS).

La FIG. 11A muestra la distribución de afinidad de anticuerpos monoclonales anti receptor de interleucina-6 generados en ratones VELOCIMMUNE®.

La FIG. 11B muestra el bloqueo específico de antígeno de anticuerpos monoclonales anti receptor de interleucina-6 generados en ratones VELOCIMMUNE® (VI) y de tipo silvestre (TS).

La FIG. 12 muestra una ilustración esquemática, no a escala, de genes ADAM6a y ADAM6b de ratón en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. Se muestra un vector de direccionamiento (Vector de Direccionamiento mADAM6) utilizado para la inserción de ADAM6a y ADAM6b de ratón en un locus de cadena pesada endógeno humanizado con un casete de selección (HYG: higromicina) flanqueado por sitios de recombinación específicos del sitio (Frt) que incluyen sitios de restricción modificados por ingeniería en los extremos 5' y 3'.

La FIG. 13 muestra una ilustración esquemática, no a escala, de un pseudogén ADAM6 humano (hADAM6^ ) ubicado entre los segmentos genéticos variables de cadena pesada humana 1-2 (Vh1-2) y 6-1 (Vh6-1). Se muestra un vector de direccionamiento para la recombinación homóloga bacteriana (Vector de Direccionamiento hADAM6^ ) para suprimir un pseudogén ADAM6 humano e insertar sitios de restricción únicos en un locus de cadena pesada humana con un casete de selección (NEO: neomicina) flanqueado por sitios de recombinación específicos del sitio (loxP) incluyendo sitios de restricción modificados por ingeniería en los extremos 5' y 3'. Se muestra una ilustración, no a escala, del locus de cadena pesada humanizado dirigido resultante que contiene un fragmento genómico que codifica para los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón, que incluye un casete de selección flanqueado por sitios de recombinación específicos del sitio.

La FIG. 14A muestra gráficos de contorno FACS de linfocitos seleccionados en singletes para la expresión superficial de IgM y B220 en la médula ósea para ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana (H/k) y ratones homocigotos para cadena ligera k humana pesada y humana locus de genes variables que tienen un fragmento genómico de ratón insertado que comprende genes ADAM6 de ratón (H/^k-A6). El porcentaje de linfocitos B inmaduros (B220intIgM+) y maduros (B220highIgM+) se observa en cada gráfico de contorno.

La FIG. 14B muestra el número total de linfocitos B inmaduros (B220intIgM+) y maduros (B220highIgM+) en la médula ósea aislados de fémures de ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana (H/k) y ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica para genes ADAM6 de ratón (H/^k-A6). La FIG. 15A muestra gráficas de contorno FACS de linfocitos B CD19+ seleccionados para la expresión superficial de c-kit y CD43 en la médula ósea para ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena ligera k (H/k) humana y pesada humana y ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera ^khumana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica para genes ADAM6 de ratón (H/K-A6). El porcentaje de linfocitos pro-B (CD19+CD43+ckit+) y pre-B (CD19+CD43'ckit) se observa en los cuadrantes superior derecho e inferior izquierdo, respectivamente, de cada gráfico de contorno.

La FIG. 15B muestra el número total de linfocitos pro-B (CD19+CD43+ckit+) y linfocitos pre-B (CD19+CD43'ckit) en la médula ósea aislados de fémures de ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana (H/k) y ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera ^khumana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que comprende genes ADAM6 de ratón (H/k-A6).

La FIG. 16A muestra gráficos de contorno FACS de linfocitos seleccionados en singletes para la expresión superficial de CD19 y CD43 en la médula ósea para ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana (H/k) y ratones homocigotos para cadena ligera k humana pesada y humana locus de genes variables que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica para genes ADAM6 de ratón (H/^k-A6). El porcentaje de linfocitos B inmaduros (CD19+^cD43‘), pre-B (CDl9+CD43int) y pro-B (CD19+CD43+) se observa en cada gráfico de contorno.

La FIG. 16B muestra histogramas de linfocitos B inmaduros (CD19+CD43') y pre-B (CD19+CD43int) en la médula ósea de ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana (H/k) y ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana que tienen un fragmento genómico ectópico de ratón que codifica para genes ADAM6 de ratón (^h/^k-A6).

La FIG. 17A muestra gráficos de contorno FACS de linfocitos seleccionados en singletes para la expresión superficial deCD19 y CD3 en esplenocitos para ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana (H/k) y ratones homocigotos para cadena ligera k humana pesada y humana locus de genes variables que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica para genes ADAM6 de ratón (H/^k-A6). El porcentaje de linfocitos B (CD19+CD3') y T (CD19'CD3+) se observa en cada gráfico de contorno. La FIG. 17B muestra gráficos de contorno de FAC para linfocitos B CD19+ seleccionados para la expresión superficial de la cadena ligera IgA e IgK en el bazo de ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera K humana (H/k) y ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que comprende genes ADAM6 de ratón (H/^k-A6). El porcentaje de linfocitos B lgA+ (cuadrante superior izquierdo) e lgK° (cuadrante inferior derecho) se observa en cada gráfico de contorno.

La FIG. 17C muestra el número total de linfocitos B CD19+ en el bazo de ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana (H/k) y ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que comprende genes ADAM6 de ratón (H/^k-A6).

La FIG. 18A muestra gráficas de contorno FACS de linfocitos B CD19+ seleccionados para la expresión superficial de IgM en el bazo de ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana (H/k) y ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que comprende genes ADAM6 de ratón (H/^k-A6). El porcentaje de linfocitos B (CD19+IgDhighIgMint) se observa en cada gráfico de contorno. La flecha en el gráfico de contorno derecho ilustra el proceso de maduración de los linfocitos B en relación con la expresión de superficie de IgM e IgD.

La FIG. 18B muestra el número total de linfocitos B en el bazo de ratones homocigóticos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana (H/k) y ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica para genes ADAM6 de ratón (H/^k-A6) durante la maduración de CD19+IgMhighIgDint a CD19+IgMintIgDhigh.

La FIG. 19 ilustra una estrategia de direccionamiento para reemplazar segmentos génicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón endógenos con una región génica Vk1-39Jk5 humana.

La FIG. 20 ilustra una estrategia de direccionamiento para reemplazar segmentos génicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón endógenos con una región génica Vk3-20Jk1 humana.

La FIG. 21 ilustra una estrategia de direccionamiento para reemplazar segmentos génicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón endógenos con una región génica VpreB/JA5 humana.

La FIG. 22 muestra el porcentaje de linfocitos B CD19+ (eje y) de sangre periférica de ratones de tipo silvestre (TS), ratones homocigotos para una región de cadena ligera Vk1-39Jk5 reordenada humana modificada por ingeniería (Vk1-39Jk5 HO) y ratones homocigotos para una región de cadena ligera Vk3-20Jk1 reordenada humana modificada por ingeniería (Vk3-20Jk1 HO).

La FIG. 23A muestra la expresión relativa de ARNm (eje y) de una cadena ligera derivada de Vk1-39 en un ensayo de PCR cuantitativa utilizando sondas específicas para la unión de una región de cadena ligera Vk1-39Jk5 reordenada humana modificada por ingeniería (Sonda de Unión Vk1-39Jk5) y el segmento génico Vk1-39 humano (sonda Vk1-39) en un ratón homocigoto para un reemplazo de los segmentos génicos Vk y Jk endógenos con segmentos génicos Vk y Jk (Hk) humanos, un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón heterocigoto para una región de cadena ligera Vk1-39Jk5 reordenada humana modificada por ingeniería (Vk1-39Jk5 HET). Las señales se normalizan a la expresión de Ck de ratón. N.D.: no detectado.

La FIG. 23B muestra la expresión relativa de ARNm (eje y) de una cadena ligera derivada de Vk1-39 en un ensayo de PCR cuantitativa utilizando sondas específicas para la unión de una región de cadena ligera Vk1-39Jk5 reordenada humana modificada por ingeniería (Sonda de Unión Vk1-39Jk5) y el segmento génico Vk1-39 humano (sonda Vk1-39) en un ratón homocigoto para un reemplazo de los segmentos génicos Vk y Jk endógenos con segmentos génicos Vk y Jk (Hk) humanos, un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para una región de cadena ligera Vk1-39Jk5 reordenada humana modificada por ingeniería (Vk1-39Jk5 HO). Las señales se normalizan a la expresión de Ck de ratón.

La FIG. 23A muestra la expresión relativa de ARNm (eje y) de una cadena ligera derivada de Vk3-20 en un ensayo de PCR cuantitativa utilizando sondas específicas para la unión de una región de cadena ligera Vk3-20Jk1 reordenada humana modificada por ingeniería(Sonda de Unión Vk3-20Jk1 ) y el segmento génico Vk3-20 humano (sonda Vk3-20) en un ratón homocigoto para un reemplazo de los segmentos génicos Vk y Jk endógenos con segmentos génicos Vk y Jk (Hk) humanos, un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón heterocigoto (HET) y homocigoto (HO) para una región de cadena ligera Vk3-20Jk1 humana reordenada modificada por ingeniería. Las señales se normalizan a la expresión de Ck de ratón.

La FIG. 24A muestra el título de IgM (izquierda) e IgG (derecha) en tipo silvestre (TS; N = 2) y ratones homocigotos para una región de cadena ligera Vk1-39Jk5 reordenada humana modificada por ingeniería (Vk1-39Jk5 HO; N = 2) inmunizados con p-galactosidasa.

La FIG. 24B muestra el título de inmunoglobulinas totales (IgM, IgG, IgA) en tipo silvestre (TS; N = 5) y ratones homocigotos para una región de cadena ligera Vk3-20Jk1 reordenada humana modificada por ingeniería (Vk3-20Jk1 HO; N = 5) inmunizados con p-galactosidasa.

Descripción detallada

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (Vh) y una región constante de cadena pesada (Ch). La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (Vl) y una región constante de cadena ligera (Cl). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada Vh y Vl comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (las CDR de cadena pesada pueden abreviarse como HCDR1, HCDR2 y HCDR3; las CDR de cadena ligera pueden abreviarse como LCDR1, LCDR2 y LCDR3. La expresión " alta afinidad" se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd con respecto a su epítopo diana de aproximadamente 10-9 M o inferior (por ejemplo, aproximadamente 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, o aproximadamente 1 x 10-12 M). En una realización, K^dse mide mediante resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo, BIACORE™; en otra realización, La Kd se mide mediante ELISA.

La frase "anticuerpo biespecífico" incluye un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a dos o más epítopos. Los anticuerpos biespecíficos generalmente comprenden dos cadenas pesadas no idénticas, y cada cadena pesada se une específicamente a un epítopo diferente en dos moléculas diferentes (por ejemplo, diferentes epítopos en dos inmunógenos diferentes) o en la misma molécula (por ejemplo, diferentes epítopos en el mismo inmunógeno). Si un anticuerpo biespecífico es capaz de unirse selectivamente a dos epítopos diferentes (un primer epítopo y un segundo epítopo), la afinidad de la primera cadena pesada por el primer epítopo generalmente será de al menos uno a dos o tres o cuatro o más órdenes de magnitud más baja que la afinidad de la primera cadena pesada para el segundo epítopo, y viceversa. Los epítopos específicamente unidos por el anticuerpo biespecífico pueden estar en la misma diana o en una diana diferente (por ejemplo, en la misma proteína o en otra diferente). Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos, por ejemplo, mediante la combinación de cadenas pesadas que reconocen diferentes epítopos del mismo inmunógeno. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias variables de cadena pesada que reconocen diferentes epítopos del mismo inmunógeno pueden fusionarse con secuencias de ácidos nucleicos que codifican regiones constantes de cadena pesada iguales o diferentes, y dichas secuencias pueden expresarse en una célula que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina. Un anticuerpo biespecífico típico tiene dos cadenas pesadas, cada una con tres CDR de cadena pesada, seguidas de un dominio Ch1 (N-terminal a C-terminal), una bisagra, un dominio Ch2 y un dominio Ch3, y una cadena ligera de inmunoglobulina que no confiere especificidad de unión a epítopo pero que puede asociarse con cada cadena pesada, o que puede asociarse con cada cadena pesada y que puede unirse a uno o más de los epítopos unidos por las regiones de unión al epítopo de la cadena pesada, o que pueden asociarse con cada cadena pesada y permitir la unión de una o ambas cadenas pesadas a uno o ambos epítopos.

El término "célula" incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen las de procariotas y eucariotas (de una única célula o de múltiples células), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobacterias, células fúngicas, células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insectos infectadas por baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células de animales no humanos, células humanas o fusiones de células tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas realizaciones, la célula es una célula humana, de mono, de simio, de hámster, de rata o de ratón. En algunas realizaciones, la célula es eucariota y se selecciona entre las siguientes células: CHO (p.ej., CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula retiniana, Vero, CV1, de riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral y una línea celular derivada de una célula anteriormente mencionada. En algunas realizaciones, la célula comprende uno o más genes víricos, por ejemplo, una célula retiniana que expresa un gen vírico (por ejemplo, una célula PER.C6™).

La frase "región determinante de complementariedad", o el término "CDR", incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de unos genes de inmunoglobulina de un organismo que normalmente (es decir, en un animal de tipo silvestre) aparece entre dos regiones marco en una región variable de una cadena ligera o pesada de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de linfocitos T). Una CDR puede estar codificada por, por ejemplo, una secuencia de línea germinal o una secuencia reordenada o no reordenada, y, por ejemplo, por un linfocito B no tratado o uno maduro o por un linfocito T. Una CDR puede estar mutada somáticamente (por ejemplo, variar de una secuencia codificada en la línea germinal de un animal), humanizada y/o modificada con sustituciones adiciones o deleciones de aminoácidos. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDR pueden estar codificadas por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de la línea germinal) que no son contiguas (por ejemplo, en una secuencia de ácido nucleico no reordenada) pero son contiguas en una secuencia de ácido nucleico de linfocitos B, por ejemplo, como resultado de cortar y empalmar o conectar las secuencias (por ejemplo, recombinación V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).

El término "conservativa", cuando se usa para describir una sustitución conservativa de aminoácidos, incluye la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido que tiene un grupo R de la cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservativa de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de una región variable para unirse específicamente a un epítopo diana con una afinidad deseada. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadenas laterales hidroxil alifáticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativa incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/arginina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato y asparagina/glutamina. En algunas realizaciones, una sustitución de aminoácidos conservativa puede ser una sustitución de cualquier resto natural en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, la mutagénesis por barrido de alanina. En algunas realizaciones, se realiza una sustitución conservativa que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. En algunas realizaciones, la sustitución es una sustitución moderadamente conservativa en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

En algunas realizaciones, las posiciones de los restos en una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina difieren en una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunas realizaciones, las posiciones de los restos en una cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma (por ejemplo, un fragmento que permite la expresión y la secreción de, por ejemplo, por ejemplo, un linfocito B) no son idénticas a una cadena ligera cuya secuencia de aminoácidos se enumera en el presente documento, pero difiere en una o más sustituciones de aminoácidos conservativas.

La frase "proteína de unión a epítopo" incluye una proteína que tiene al menos una CDR y que es capaz de reconocer selectivamente un epítopo, por ejemplo, es capaz de unir un epítopo con una Kd que es aproximadamente uno micromolar o inferior (por ejemplo, una K^dque es alrededor de 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10- 10 M, 1 x 10-11 M, o aproximadamente 1 x 10-12 M). Las proteínas de unión a epítopos terapéuticas (por ejemplo, anticuerpos terapéuticos) con frecuencia requieren una Kd que se encuentre en el intervalo nanomolar o picomolar.

La frase "fragmento funcional" incluye fragmentos de proteínas de unión a epítopo que pueden expresarse, secretares y unirse específicamente a un epítopo con una Kd en el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar. El reconocimiento específico incluye tener una Kd que esté al menos en el intervalo micromolar, el intervalo nanomolar o el intervalo picomolar.

La expresión "línea germinal" incluye referencia a una secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina en una célula no mutada somáticamente, por ejemplo, un linfocito B o pre-B o una célula hematopoyética no mutados somáticamente.

La frase "cadena pesada", o "cadena pesada de inmunoglobulina" incluye una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier organismo. Los dominios variables de cadena pesada incluyen tres CDR de cadena pesada y cuatro regiones FR, a menos que se especifique otra cosa. Los fragmentos de cadenas pesadas incluyen CDR, CDR y FR y combinaciones de los mismos. Una cadena pesada típica tiene, siguiendo el dominio variable (de N-terminal a C-terminal), un dominio Ch1, una bisagra, un dominio Ch2 y un dominio Ch3. Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que es capaz de reconocer específicamente un epítopo (por ejemplo, reconocer el epítopo con una Kd en el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar), que es capaz de expresarse y secretarse a partir de una célula, y que comprende al menos una CDR.

El término "identidad" cuando se usa en relación con la secuencia, incluye la identidad determinada por una serie de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que se pueden usar para medir la identidad de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las identidades se determinan usando una alineación ClustalW v. 1.83 (lenta) empleando una penalización de hueco abierto de 10,0, una penalización por extensión de hueco de 0,1 y usando una matriz de similitud de Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). La longitud de las secuencias comparadas con respecto a la identidad de las secuencias dependerá de las secuencias concretas, pero en el caso de un dominio constante de cadena ligera, la longitud debe contener una secuencia de longitud suficiente para plegarse en un dominio constante de cadena ligera que sea capaz de asociarse consigo mismo para formar un dominio constante de cadena ligera canónico, por ejemplo, capaz de formar dos láminas beta que comprenden hebras beta y capaces de interactuar con al menos un dominio Ch1 de un ser humano o un ratón. En el caso del dominio Ch1, la longitud de la secuencia debe contener una secuencia de longitud suficiente para plegarse en un dominio Ch1 que sea capaz de formar dos láminas beta que comprendan cadenas beta y que pueda interactuar con al menos un dominio constante de cadena ligera de un ratón o un ser humano.

La frase "molécula de inmunoglobulina" incluye dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas pueden ser idénticas o diferentes, y las cadenas ligeras pueden ser idénticas o diferentes.

La frase "cadena ligera" incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo y, a menos que se especifique otra cosa, incluye cadenas ligeras k y A humanas y una VpreB, así como cadenas ligeras sustitutas. Los dominios variables de cadena ligera (Vl) incluyen generalmente tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones marco conservadas (FR, a menos que se especifique otra cosa. Generalmente, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo, un dominio Vl que incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 y un dominio de región constante de cadena ligera. Las cadenas ligeras incluyen aquellas, por ejemplo, que no se unen selectivamente a un primer o segundo epítopo unido selectivamente por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras también incluyen aquellas que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada a unirse y el reconocer, uno o más epítopos unidos de forma selectiva por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen.

Las cadenas ligeras universales, o cadenas ligeras comunes, se refiere a cadenas ligeras producidas en ratones como se describe en el presente documento, en donde los ratones están altamente restringidos en la selección de segmentos de genes disponibles para producir un dominio variable de cadena ligera. Como resultado, tales ratones producen una cadena ligera derivada de, en una realización, no más de uno o dos segmentos V de cadena ligera no reordenados y no más de uno o dos segmentos J de cadena ligera no reordenados (por ejemplo, un V y un J, dos V y un J, un V y dos J, dos V y dos J). En una realización, no más de una o dos secuencias V/J de cadena ligera reordenadas, por ejemplo, una secuencia Vk1-39Jk5 humana reordenada o una secuencia V k3-20Jk1 humana reordenada. En diversas realizaciones, las cadenas ligeras universales incluyen versiones mutadas somáticamente (por ejemplo, maduradas por afinidad).

La frase "mutada somáticamente " incluye una referencia a una secuencia de ácido nucleico de un linfocito B que ha sufrido un cambio de clase, en donde la secuencia de ácido nucleico de una región variable de inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada o que incluye una secuencia de CDR o FR de cadena pesada) en el linfocito B con cambio de clase no es idéntica a la secuencia de ácido nucleico en el linfocito B antes del cambio de clase, tales como, por ejemplo, una diferencia en una secuencia de ácido nucleico de CDR o marco entre un linfocito B que no haya sufrido una cambio de clase y un linfocito B que haya sufrido un cambio de clase. "Mutada somáticamente" incluye una referencia a secuencias de ácidos nucleicos de linfocitos B madurados por afinidad que no son idénticas a las correspondientes secuencias de la región variable de inmunoglobulina en linfocitos B que no están madurados por afinidad (es decir, secuencias en el genoma de células de la línea germinal). La frase "mutada somáticamente" también incluye una referencia a una secuencia de ácido nucleico de la región variable de inmunoglobulina de un linfocito B después de la exposición del linfocito B a un epítopo de interés, en donde la secuencia de ácido nucleico difiere de la secuencia de ácido nucleico correspondiente antes de la exposición del linfocito B al epítopo de interés. La frase "mutada somáticamente" se refiere a secuencias de anticuerpos que se han generado en un animal, por ejemplo, un ratón que tiene secuencias de ácidos nucleicos de región variable de inmunoglobulina humana, en respuesta a una exposición a inmunógeno, y que resultan de los procesos de selección inherentemente operativos en tal un animal.

El término "no reordenada", con respecto a secuencias de ácidos nucleicos, incluye secuencias de ácidos nucleicos que existen en la línea germinal de una célula animal.

La frase "dominio variable" incluye una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (modificada según se desee) que comprende las siguientes regiones de aminoácidos, en secuencia de N-terminal a C-terminal (a menos que se indique lo contrario): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Ratones con Locus de Inmunoglobulina Humanizada

El ratón como modelo genético ha sido potenciado en gran medida por las tecnologías transgénicas y de supresión génica, que han permitido el estudio de los efectos de la sobreexpresión o deleción dirigida de genes específicos. A pesar de todas sus ventajas, el ratón todavía presenta obstáculos genéticos que lo convierten en un modelo imperfecto para enfermedades humanas y una plataforma imperfecta para probar agentes terapéuticos humanos o hacerlos. En primer lugar, aunque aproximadamente el 99% de los genes humanos tienen un homólogo de ratón (Waterston, R.H., et. al. (2002). Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420, 520-562.), con frecuencia, los posibles agentes terapéuticos no logran una reacción cruzada o logran una reacción cruzada inadecuada, con los ortólogos de ratón de las dianas humanas previstas. Para evitar este problema, los genes diana seleccionados se pueden "humanizar", es decir, el gen del ratón se puede eliminar y reemplazar por la secuencia del gen ortólogo humano correspondiente (p. ej., documento US 6.586.251, documento US 6.596.541 y documento US 7.105.348). Inicialmente, los esfuerzos para humanizar genes de ratones mediante una estrategia de "humanización por supresión génica más transgénica" implicaron cruzar un ratón que porta una deleción (es decir, nuligénico) del gen endógeno con un ratón que porta un transgén humano integrado al azar (véase, por ejemplo, Bril, W.S., et al. (2006). Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution. Thromb Haemost 95, 341-347; Homanics, G.E., et al. (2006). Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease. BMC Med Genet 7, 33; Jamsai, D., et al. (2006). A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia. Genomics 88(3):309-15; Pan, Q., et al. (2006). Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function: human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3 gamma- and CD3 gammadelta-deficient mice. Mol Immunol 43, 1741-1750). Pero esos esfuerzos se vieron obstaculizados por las limitaciones de tamaño; las tecnologías de supresión génica convencionales no fueron suficientes para reemplazar directamente genes de ratones grandes con sus homólogos genómicos humanos grandes. Raramente se intenta un enfoque simple de reemplazo homólogo directo, en el que un gen endógeno de ratón se reemplaza directamente por el gen homólogo humano en la misma ubicación genética precisa del gen de ratón (es decir, en el locus endógeno de ratón), debido a dificultades técnicas. Hasta ahora, los esfuerzos de reemplazo directo incluyeron procedimientos elaborados y complicados, lo que limitó la longitud del material genético que se podía manejar y la precisión con la que se podía manipular.

Los transgenes de inmunoglobulinas humanas introducidos exógenamente se reordenan en linfocitos B precursores en ratones (Alt, F.W., Blackwell, T.K., y Yancopoulos, G.D. (1985). Immunoglobulin genes in transgenic mice. Trends Genet 1, 231-236). Este hallazgo se explotó mediante ratones modificados por ingeniería utilizando el enfoque supresión génica más transgénica para expresar anticuerpos humanos (Green, L.L. et al. (1994). Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat Genet 7, 13-21; Lonberg, N. (2005). Human antibodies from transgenic animals. Nat Biotechnol 23, 1117-1125; Lonberg, N., et al. (1994). Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368, 856 859; Jakobovits, A., et al. (2007). From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice. Nat Biotechnol 25, 1134-1143). Los locus de cadena pesada y cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón endógenos se inactivaron en estos ratones mediante la deleción dirigida de porciones pequeñas pero críticas de cada locus endógeno, seguida de la introducción de locus de genes de inmunoglobulinas humanas como grandes transgenes aleatoriamente integrados, como se describe anteriormente o como minicromosomas (Tomizuka, K., et al. (2000). Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 722-727). Tales ratones representaron un avance importante en la ingeniería genética; los anticuerpos monoclonales completamente humanos aislados de ellos produjeron un posible agente terapéutico prometedor para tratar una variedad de enfermedades humanas (Gibson, T.B., et al. (2006). Randomized phase III trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer 6, 29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim, Y.H., et al. (2007). Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma. Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005; Maker, A.V., et al. (2005). Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2 : a phase I/II study. Ann Surg Oncol 12 , 1005-1016; McClung, M.R., et al. (2006). Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density. N Engl J Med 354, 821-831). Pero, como se analiza anteriormente, estos ratones muestran un desarrollo comprometido de linfocitos B y deficiencias inmunitarias en comparación con los ratones de tipo silvestre. Tales problemas potencialmente limitan la capacidad de los ratones para soportar una respuesta humoral intensa y, en consecuencia, para generar anticuerpos completamente humanos contra algunos antígenos. Las deficiencias pueden deberse a: (1) funcionalidad ineficaz debido a la introducción aleatoria de los transgenes de inmunoglobulinas humanas y la expresión incorrecta resultante debido a la falta de elementos de control cadena arriba y cadena abajo (Garrett, F.E., et al. (2005). Chromatin architecture near a potential 3' end of the igh locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites. Mol Cell Biol 25, 1511-1525; Manis, J.P., et al. (2003). Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory region. Mol Immunol 39, 753-760; Pawlitzky, I., et al. (2006). Identification of a candidate regulatory element within the 5' flanking region of the mouse Igh locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, and E2A. J Immunol 176, 6839-6851); 2) interacciones entre especies ineficaces entre dominios constantes humanos y componentes de ratón del complejo de señalización del receptor de linfocitos B en la superficie celular, lo que puede perjudicar los procesos de señalización necesarios para la maduración, proliferación y supervivencia normales de linfocitos B (Hombach, J., et al. (1990). Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class. Nature 343, 760-762); y (3) interacciones entre especies ineficaces entre inmunoglobulinas humanas solubles y receptores Fc de ratón que podrían reducir la selección por afinidad (Rao, S.P., et al. (2002). Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells. J Immunol 169, 1859 1868) and immunoglobulin serum concentrations (Brambell, F.W., et al. (1964). A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism. Nature 203, 1352-1354; Junghans, R.P., and Anderson, C.L. (1996). The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm, F., et al. (2006). Antibody-mediated regulation of the immune response. Scand J Immunol 64, 177-184; Nimmerjahn, F., and Ravetch, J.V. (2007). Fc- receptors as regulators of immunity. Adv Immunol 96, 179-204). Estas deficiencias pueden corregirse mediante la humanización in situ de solo las regiones variables de los locus de inmunoglobulinas de ratón dentro de sus ubicaciones naturales en los locus endógenos de cadena pesada y ligera. Esto daría como resultado, de forma eficaz, ratones que producen anticuerpos quiméricos inversos (es decir, V humana: C de ratón) que serían capaces de interacciones y selección normales con el entorno de ratón basándose en la conservación de las regiones constantes de ratón. Adicionalmente, dichos anticuerpos quiméricos inversos se vuelven a elaborar fácilmente en anticuerpos completamente humanos para fines terapéuticos.

Se describe un método para un reemplazo genético in situ grande de los genes variables de inmunoglobulinas de línea germinal de ratón con genes variables de inmunoglobulinas de línea germinal humana mientras se mantiene la capacidad de los ratones para generar descendencia. De manera específica, se describe el reemplazo preciso de seis megabases de los locus de genes variables tanto de cadena pesada como de cadena ligera k de inmunoglobulinas de ratón con sus homólogos humanos mientras se deja intactas las regiones constantes del ratón. Como resultado, se han creado ratones que tienen un reemplazo preciso de todo su repertorio variable de inmunoglobulinas de línea germinal con secuencias variables equivalentes de inmunoglobulinas de línea germinal humana, mientras se mantienen regiones constantes de ratón. Las regiones variables humanas están unidas a regiones constantes de ratón para formar locus de inmunoglobulinas quiméricos humano-de ratón que se reordenan y expresan a niveles fisiológicamente apropiados. Los anticuerpos expresados son "quimeras inversas", es decir, comprenden secuencias de región variable humana y secuencias de región constante de ratón. Estos ratones que tienen regiones variables de inmunoglobulinas humanizadas que expresan anticuerpos que tienen regiones variables humanas y regiones constantes de ratón se denominan ratones humanizados VELCOIMMUNE®.

Los ratones humanizados VELOCIMMUNE® muestran un sistema inmunitario humoral completamente funcional que es esencialmente indistinguible del de los ratones de tipo silvestre. Muestran poblaciones de células normales en todas las etapas del desarrollo de linfocitos B. Muestran una morfología normal de los órganos linfoides. Las secuencias de anticuerpos de ratones humanizados VELOCIMMUNE® muestran reordenamiento normal de segmentos variables e hipermutación somática normal. Las poblaciones de anticuerpos en estos ratones reflejan distribuciones de isotipos que resultan del cambio de clase normal (por ejemplo, cambio cis de isotipo normal). La inmunización de ratones humanizados VELOCIMMUNE® da como resultado respuestas humorales potentes que generan una gran diversidad de anticuerpos que tienen dominios variables de inmunoglobulinas humanas adecuados como candidatos terapéuticos. Esta plataforma proporciona una fuente abundante de secuencias de región variable de inmunoglobulinas humanas maduradas por afinidad para producir anticuerpos y otras proteínas de unión a antígeno farmacéuticamente aceptables.

Es el reemplazo preciso de las secuencias variables de inmunoglobulinas de ratón con secuencias variables de inmunoglobulinas humanas que permite producir ratones humanizados VELOCIMMUNE®. Sin embargo, incluso un reemplazo preciso de las secuencias de inmunoglobulinas endógenas de ratón en locus de cadena pesada y ligera con secuencias de inmunoglobulinas humanas equivalentes, por recombinación secuencial de tramos muy grandes de secuencias de inmunoglobulinas humanas, puede presentar ciertos desafíos debido a la evolución divergente de los locus de inmunoglobulinas entre ratón y hombre. Por ejemplo, las secuencias intergénicas intercaladas dentro de los locus de inmunoglobulinas no son idénticas entre ratones y seres humanos y, en algunas circunstancias, pueden no ser funcionalmente equivalentes. Las diferencias entre los ratones y los seres humanos en sus locus de inmunoglobulinas aún pueden dar como resultado anormalidades en ratones humanizados, particularmente cuando se humanizan o manipulan determinadas porciones de locus de cadena pesada de inmunoglobulinas de ratón endógenos. Algunas modificaciones en los locus de cadena pesada de inmunoglobulinas de ratón son perjudiciales. Las modificaciones perjudiciales pueden incluir, por ejemplo, la pérdida de la capacidad de los ratones modificados para aparearse y producir descendencia.

Se realizó un reemplazo preciso, a gran escala, in situ de seis megabases de las regiones variables de los locus de cadena pesada y ligera de inmunoglobulinas de ratón (Vh-Dh-Jh y Vk-Jk) con las secuencias genómicas humanas de 1,4 megabases correspondientes, mientras se dejaban las secuencias de ratón flanqueantes intactas y funcionales dentro de los locus híbridos, incluidos todos los genes de cadena constante de ratón y las regiones de control transcripcional de locus (Figura 1). De manera específica, las secuencias de genes humanos Vh, Dh, Jh, V k y Jk se introdujeron mediante la inserción gradual de 13 vectores de direccionamiento BAC quiméricos que llevan fragmentos solapantes de los locus variables de la línea germinal humana en células ES de ratón usando tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos N.° 6.586.251 y Valenzuela, D.M., et al. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21.652-659).

La humanización de los genes de inmunoglobulinas de ratón representa la mayor modificación genética del genoma de ratón hasta la fecha. Si bien los esfuerzos previos con transgenes de inmunoglobulinas humanas integrados aleatoriamente han tenido cierto éxito (analizado anteriormente), el reemplazo directo de los genes de inmunoglobulinas de ratón con sus homólogos humanos aumenta drásticamente la eficacia con la que se pueden generar anticuerpos completamente humanos de manera eficaz en ratones normales. Adicionalmente, tales ratones muestran una diversidad drásticamente incrementada de anticuerpos completamente humanos que se pueden obtener después de la inmunización con prácticamente cualquier antígeno, en comparación con los ratones que llevan locus endógenos discapacitados y transgenes de anticuerpos completamente humanos. Múltiples versiones de locus humanizados reemplazados muestran niveles completamente normales de linfocitos B maduros e inmaduros, en comparación con los ratones con transgenes humanos integrados aleatoriamente, que muestran poblaciones de linfocitos B significativamente reducidas en diversas etapas de diferenciación. Si bien los esfuerzos para aumentar el número de segmentos de genes humanos en ratones transgénicos humanos han reducido tales defectos, los repertorios de inmunoglobulinas expandidas no han corregido por completo las reducciones en las poblaciones de linfocitos B en comparación con los ratones de tipo silvestre.

A pesar de la función inmunitaria humoral casi de tipo silvestre observada en ratones con locus de inmunoglobulinas reemplazados, existen otros desafíos encontrados al emplear un reemplazo directo de la inmunoglobulina que no se encuentra en algunos enfoques que emplean transgenes integrados aleatoriamente. Las diferencias en la composición genética de los locus de inmunoglobulinas entre ratones y seres humanos han conducido al descubrimiento de secuencias beneficiosas para la reproducción de ratones con segmentos de genes de inmunoglobulinas reemplazados. De manera específica, los genes ADAM de ratón ubicados dentro del locus de inmunoglobulinas endógeno están presentes de manera óptima en ratones con locus de inmunoglobulinas reemplazados, debido a su papel en la fertilidad.

Ubicación Genómica y Función de ADAM6 de Ratón

Los ratones macho que carecen de la capacidad de expresar cualquier proteína ADAM6 funcional muestran un defecto grave en la capacidad de los ratones para aparearse y generar descendencia. Los ratones carecen de la capacidad de expresar una proteína ADAM6 funcional en virtud de un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos de región variable de inmunoglobulinas de ratón con segmentos génicos de región variable humana. La pérdida de la función ADAM6 se debe a que el locus ADAM6 está ubicado dentro de una región del locus génico de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno, próximo al extremo 3' del locus del segmento génico Vh que está cadena arriba de los segmentos génicos Dh. Con el fin de criar ratones que sean homocigotos para un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos de genes variables de cadena pesada de ratones endógenos con segmentos de genes variables de cadena pesada humana, generalmente es un enfoque engorroso configurar machos y hembras que sean homocigotos para el reemplazo y aguardar un apareamiento productivo. Las camadas exitosas son relativamente raras, y el tamaño promedio de la camada es muy bajo. En cambio, se han empleado machos heterocigotos para el reemplazo para aparearse con hembras homocigotas para el reemplazo para generar progenie que sea heterocigota para el reemplazo, y a continuación se cría un ratón homocigoto a partir de la misma. Los presentes inventores han determinado que la causa probable de la pérdida de fertilidad en los ratones macho es la ausencia en los ratones macho homocigotos de una proteína ADAM6 funcional.

La proteína ADAM6 es un miembro de la familia de proteínas ADAM, donde ADAM es el acrónimo de A Disintegrin And Metaloprotease (A Desintegrina y Metaloproteasa). La familia de proteínas ADAM es grande y diversa, con diversas funciones. Algunos miembros de la familia ADAM están implicados en la espermatogénesis y la fertilización. Por ejemplo, ADAM2 codifica una subunidad de la proteína fertilina, que está implicada en las interacciones espermatozoide-óvulo. ADAM3, o ciritestina, parece necesaria para la unión de los espermatozoides a la zona pelúcida. La ausencia de ADAM2 o ADAM3 da como resultado infertilidad. Se ha postulado que ADAM2, ADAM3 y ADAM6 forman un complejo sobre la superficie de los espermatozoides de ratón.

El gen ADAM6 humano, que normalmente se encuentra entre los segmentos V^h1-2 y V^h6-1 del gen V^hhumano, parece ser un pseudogén (Figura 12). En ratones, hay dos genes ADAM6, ADAM6a y ADAM6b que se encuentran en una región intergénica entre los segmentos génicos Vh y Dh de ratón, y en el ratón, los genes a y b están orientados en una orientación transcripcional opuesta a la orientación de transcripción de los segmentos génicos de inmunoglobulinas circundantes (Figura 11). En ratones, aparentemente se necesita un locus ADAM6 funcional para la fertilización normal. Un locus o secuencia ADAM6 funcional, entonces, se refiere a un locus o secuencia ADAM6 que puede complementar, o rescatar, la fertilización reducida drásticamente mostrada en ratones macho con locus ADAM6 endógenos ausentes o dañados.

La posición de la secuencia intergénica en ratones que codifica ADAM6a y ADAM6b hace que la secuencia intergénica sea susceptible de modificación al modificar una cadena pesada de ratón endógena. Cuando los segmentos génicos Vh se suprimen o reemplazan, o cuando los segmentos génicos Dh se suprimen o reemplazan, existe una alta probabilidad de que un ratón resultante exhiba un déficit grave en la fertilidad. Para compensar el déficit, el ratón se modifica para incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que complementará la pérdida en la actividad de ADAM6 debido a una modificación del locus de ADAM6 de ratón endógeno. En diversas realizaciones, la secuencia de nucleótidos complementaria es una que codifica una ADAM6a de ratón, una ADAM6b de ratón, o un homólogo o un ortólogo o un fragmento funcional de la misma que rescata el déficit de fertilidad.

La secuencia de nucleótidos que rescata la fertilidad se puede colocar en cualquier posición ectópica adecuada. Se puede colocar en cualquier posición ectópica adecuada en el genoma. En una realización, la secuencia de nucleótidos se puede introducir en un transgén que se integra aleatoriamente en el genoma de ratón. En una realización, la secuencia puede mantenerse de manera episómica, es decir, en un ácido nucleico separado en lugar de en un cromosoma de ratón. Las posiciones adecuadas incluyen posiciones que son transcripcionalmente permisivas o activas, por ejemplo, un locus ROSA26.

El término "ectópico" pretende incluir un desplazamiento, o una localización en una posición que normalmente no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, la localización de una secuencia de ácido nucleico en una posición que no es la misma posición en la que se encuentra la secuencia de ácido nucleico en un ratón de tipo silvestre). El término en diversas realizaciones se usa en el sentido de que su objetivo está fuera de su posición normal o apropiada. Por ejemplo, la frase "una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica..." se refiere a una secuencia de nucleótidos que aparece en una posición en la que normalmente no se encuentra en el ratón. Por ejemplo, en el caso de una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón (o un ortólogo o un homólogo o un fragmento de la misma que proporciona el mismo o similar beneficio de fertilidad en ratones macho), la secuencia puede colocarse en una posición diferente en el genoma del ratón de la que normalmente se encuentra en un ratón de tipo silvestre. Un homólogo o un ortólogo funcional de ADAM6 de ratón es una secuencia que confiere un rescate de la pérdida de fertilidad (por ejemplo, la pérdida de la capacidad de un ratón macho de generar descendencia por apareamiento) que se observa en un ratón ADAM6'/_. Los homólogos u ortólogos funcionales incluyen proteínas que tienen al menos aproximadamente 89% de identidad o más, por ejemplo, hasta un 99% de identidad, con la secuencia de aminoácidos de ADAM6a y/o con la secuencia de aminoácidos de ADAM6b, y que pueden complementar o rescatar la capacidad de aparearse con éxito, de un ratón que tiene un genotipo que incluye una deleción o supresión génica de ADAM6a y/o ADAM6b.

La posición ectópica puede estar en cualquier lugar (por ejemplo, como con la inserción aleatoria de un transgén que contiene una secuencia ADAM6 de ratón), o puede estar, por ejemplo, en una posición que se aproxima (pero no es exactamente la misma) a su ubicación en un ratón de tipo silvestre (por ejemplo, en un locus de inmunoglobulina de ratón endógeno modificado, pero cadena arriba o cadena abajo de su posición natural, por ejemplo, dentro de un locus de inmunoglobulina modificado pero entre diferentes segmentos génicos, o en una posición diferente en una secuencia intergénica V-D de ratón). Un ejemplo de una localización ectópica es la localización dentro de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada. Por ejemplo, un ratón que comprende un reemplazo de uno o más segmentos génicos Vh endógenos con segmentos génicos Vh humanos, en donde el reemplazo elimina una secuencia ADAM6 endógena, puede modificarse por ingeniería para tener una secuencia ADAM6 de ratón ubicada dentro de la secuencia que contiene los segmentos génicos Vh humanos. La modificación resultante generaría una secuencia ADAM6 de ratón (ectópica) dentro de una secuencia génica humana, y la localización (ectópica) de la secuencia ADAM6 de ratón dentro de la secuencia génica humana puede aproximarse a la posición del pseudogén ADAM6 humano (es decir, entre dos segmentos V) o puede aproximarse a la posición de la secuencia ADAM6 de ratón (es decir, dentro de la región intergénica V-D).

En diversos aspectos, se pueden producir ratones que comprenden deleciones o reemplazos del locus de la región variable de cadena pesada endógeno o porciones del mismo que contienen una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una proteína que confiere beneficios de fertilidad similares a ADAM6 de ratón (por ejemplo, un ortólogo o un homólogo o un fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho). La secuencia de nucleótidos ectópica puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que es un homólogo o un ortólogo de ADAM6 (o fragmento de la misma) de una cepa de ratón diferente o una especie diferente, por ejemplo, una especie de roedor diferente, y que confiere un beneficio en la fertilidad, por ejemplo, mayor número de camadas durante un período de tiempo específico, y/o mayor número de crías por camada, y/o la capacidad de un espermatozoide de un ratón macho para atravesar un oviducto de ratón para fertilizar un óvulo de ratón.

En una realización, la ADAM6 es un homólogo o un ortólogo que es al menos del 89% al 99% idéntico a una proteína ADAM6 de ratón (por ejemplo, al menos del 89% al 99% idéntico al ADAM6a de ratón o ADAM6b de ratón). En una realización, la secuencia de nucleótidos ectópica codifica una o más proteínas seleccionadas independientemente de una proteína al menos 89% idéntica a ADAM6a de ratón, una proteína al menos 89% idéntica a ADAM6b de ratón y una combinación de las mismas. En una realización, el homólogo u ortólogo es una proteína de rata, hámster, ratón o cerdo de guinea que es o está modificada para ser aproximadamente un 89% o más idéntica a ADAM6a de ratón y/o ADAM6b de ratón. En una realización, el homólogo u ortólogo es un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a ADAM6a de ratón y/o ADAM6b de ratón.

ADAM6 Ectópica en Ratones con Cadena Pesada Humanizada

Los ratones que producen anticuerpos humanos han estado disponibles desde hace algún tiempo. Aunque representan un avance importante en el desarrollo de anticuerpos terapéuticos humanos, estos ratones muestran una serie de anomalías significativas que limitan su utilidad. Por ejemplo, muestran un desarrollo comprometido de linfocitos B. El desarrollo comprometido puede deberse a una variedad de diferencias entre los ratones transgénicos y los ratones de tipo silvestre.

Los anticuerpos humanos podrían no interactuar de manera óptima con los receptores de linfocitos pre B o linfocitos B de ratón en la superficie de las células de ratón que indican la maduración, la proliferación o la supervivencia durante la selección clonal. Los anticuerpos completamente humanos podrían no interactuar óptimamente con un sistema receptor de Fc de ratón; los ratones expresan receptores de Fc que no muestran una correspondencia uno a uno con los receptores de Fc humanos. Por último, varios ratones que producen anticuerpos completamente humanos no incluyen todas las secuencias genuinas de ratón, por ejemplo, elementos potenciadores y otros elementos de control de locus cadena abajo, que pueden ser necesarios para el desarrollo de linfocitos B de tipo silvestre.

Los ratones que producen anticuerpos completamente humanos generalmente comprenden locus de inmunoglobulinas endógenos que están desactivados de alguna manera, y los transgenes humanos que comprenden segmentos de genes de inmunoglobulinas variables y constantes se introducen en una ubicación aleatoria en el genoma de ratón. Mientras el locus endógeno esté lo suficientemente desactivado como para no reordenar los segmentos génicos para formar un gen de inmunoglobulina funcional, el objetivo de producir anticuerpos completamente humanos en dicho ratón se puede lograr, aunque con el desarrollo comprometido de linfocitos B.

Aunque esté obligado a producir anticuerpos completamente humanos a partir del locus transgénico humano, la generación de anticuerpos humanos en un ratón aparentemente es un proceso desfavorable. En algunos ratones, el proceso es tan desfavorable que da como resultado la formación de cadenas pesadas quiméricas, variables humanas/constantes de ratón (pero no cadenas ligeras) a través del mecanismo de cambio trans. Mediante este mecanismo, las transcripciones que codifican anticuerpos completamente humanos experimentan el cambio de isotipo en trans a partir del isotipo humano a un isotipo de ratón. El proceso es en trans, porque el transgén completamente humano está ubicado aparte del locus endógeno que conserva una copia no dañada de un gen de región constante de cadena pesada de ratón. Aunque en tales ratones el cambio trans es fácilmente evidente, el fenómeno aún es insuficiente para rescatar el desarrollo de linfocitos B, que sigue estando francamente afectado. En cualquier caso, los anticuerpos con cambio en trans producidos en dichos ratones conservan cadenas ligeras completamente humanas, ya que el fenómeno del cambio en trans aparentemente no se produce con respecto a las cadenas ligeras; el cambio en trans probablemente se basa en secuencias de cambio en locus endógenos utilizados (aunque de manera diferente) en el isotipo normal con cambio en cis. Por lo tanto, incluso cuando los ratones modificados por ingeniería para producir anticuerpos completamente humanos seleccionan un mecanismo de cambio en trans para producir anticuerpos con regiones constantes de ratón, la estrategia sigue siendo insuficiente para rescatar el desarrollo normal de los linfocitos B.

Una preocupación principal en la producción de agentes terapéuticos humanos basados en anticuerpos es hacer una diversidad suficientemente grande de secuencias de región variable de inmunoglobulinas humanas para identificar dominios variables útiles que reconozcan específicamente epítopos concretos y se unan a ellos con una afinidad deseable, generalmente, pero no siempre, con alta afinidad. Antes del desarrollo de los ratones humanizados VELOCIMMUNE®, no había indicios de que los ratones que expresaban regiones variables humanas con regiones constantes de ratón presentaran diferencias significativas con respecto a los ratones que producían anticuerpos humanos a partir de un transgén. Esa suposición, sin embargo, era incorrecta.

Los ratones humanizados VELOCIMMUNE®, que contienen un reemplazo preciso de regiones variables de inmunoglobulinas de ratón con regiones variables de inmunoglobulinas humanas en los locus de ratón endógenos, presentan una similitud extraordinaria con los ratones de tipo silvestre respecto al desarrollo de linfocitos B. En un desarrollo sorprendente y asombroso, los ratones humanizados VELOCIMMUNE® mostraron una respuesta de tipo silvestre esencialmente normal a la inmunización que difería solo en un aspecto significativo respecto a los ratones de tipo silvestre, las regiones variables generadas en respuesta a la inmunización son completamente humanas.

Los ratones humanizados VELOCIMMUNE® contienen un reemplazo preciso a gran escala de las regiones variables de la línea germinal de cadena pesada de inmunoglobulina (IgH) y cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, cadena ligera k, IgK) de ratón con las regiones variables de inmunoglobulina humana correspondientes, en los locus endógenos. En total, se reemplazan aproximadamente seis megabases de locus de ratón con aproximadamente 1,4 megabases de secuencia genómica humana. Este reemplazo preciso da como resultado un ratón con locus de inmunoglobulina híbridos que producen cadenas pesadas y ligeras que tienen regiones variables humanas y una región constante de ratón. El reemplazo preciso de los segmentos Vh-Dh-Jh y Vk-Jk de ratón dejan secuencias de ratón flanqueantes intactas y funcionales en los locus de inmunoglobulina híbridos. El sistema inmunitario humoral del ratón funciona como el de un ratón de tipo silvestre. El desarrollo de linfocitos B no está impedido en cualquier respecto significativo y se genera una rica diversidad de regiones variables humanas en el ratón tras la exposición al antígeno.

Los ratones humanizados VELOCIMMUNE® son posibles debido a que los segmentos génicos de inmunoglobulina para las cadenas pesadas y ligeras k se reordenan de manera similar en seres humanos y ratones, lo que no equivale a decir que sus locus sean iguales o incluso que claramente no lo son. Sin embargo, los locus son lo suficientemente similares como para que la humanización del locus del gen variable de cadena pesada se pueda lograr reemplazando aproximadamente 3 millones de pares de bases de secuencia contigua de ratón que contiene todos los segmentos génicos V^h, D^h, y J^hcon aproximadamente 1 millón de bases de secuencia genómica humana contigua cubriendo básicamente la secuencia equivalente de un locus de inmunoglobulina humana.

En algunas realizaciones, el reemplazo adicional de determinadas secuencias de genes de la región constante de ratón con secuencias de genes humanos (por ejemplo, el reemplazo de la secuencia Ch1 de ratón con la secuencia Ch1 humana y el reemplazo de la secuencia Cl de ratón con la secuencia Cl humana) da como resultado ratones con locus de inmunoglobulinas híbridos que producen anticuerpos que tienen regiones variables humanas y regiones constantes parcialmente humanas, adecuadas para, por ejemplo, producir fragmentos de anticuerpos completamente humanos, por ejemplo, Fab completamente humanos. Los ratones con locus de inmunoglobulina híbridos muestran una reordenación de segmentos génicos variables normal, hipermutación somática normal y cambio de clase normal. Estos ratones muestran un sistema inmunitario humoral que es indistinguible del de ratones de tipo silvestre y presentan poblaciones de células normales en todas las etapas de desarrollo de linfocitos B y estructuras de órganos linfoides normales, incluso en los casos donde los ratones carecen de un repertorio completo de segmentos génicos de región variable humana. La inmunización de estos ratones da como resultado respuestas humorales fuertes que presentan una gran diversidad de uso de segmentos génicos variables.

El reemplazo preciso de los segmentos génicos de la región variable de línea germinal de ratón permite producir ratones que tienen locus de inmunoglobulina parcialmente humanos. Debido a que los locus de inmunoglobulina parcialmente humanos se reordenan, hipermutan y cambian de clase de manera normal, los locus de inmunoglobulina parcialmente humanos generan anticuerpos en un ratón que comprende regiones variables humanas. Pueden identificarse y clonarse secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables, después se fusionan (por ejemplo, en un sistema in vitro) con cualquier secuencia de elección, por ejemplo, cualquier isotipo de inmunoglobulina adecuado para un uso particular, dando como resultado un anticuerpo o una proteína de unión a antígeno procedente completamente de secuencias humanas.

Se utilizó humanización a gran escala mediante métodos de ingeniería por recombinación para modificar las células madre embrionarias de ratón (ES) para reemplazar con precisión hasta 3 megabases del locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que incluía esencialmente todos los segmentos génicos Vh, Dh y Jh de ratón con segmentos génicos humanos equivalentes con una secuencia genómica humana de hasta 1 megabase que contiene algunos o esencialmente todos los segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos. Se usó hasta un segmento de 0,5 megabases del genoma humano que comprende una de las dos repeticiones que codifica esencialmente todos los segmentos génicos Vk y Jk humanos para reemplazar un segmento de 3 megabase del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón que contiene esencialmente todos los segmentos génicos Vk y Jk de ratón.

Los ratones con tales locus de inmunoglobulinas reemplazados pueden comprender una interrupción o deleción del locus de ADAM6 de ratón endógeno, que normalmente se encuentra entre el segmento génico V^hmás 3' y el segmento génico Dh más 5' en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. La interrupción en esta región puede conducir a la reducción o eliminación de la funcionalidad del locus de ADAM6 de ratón endógeno. Si los segmentos génicos Vh más 3' del repertorio de cadenas pesadas humanas se usan en un reemplazo, una región intergénica que contiene un pseudogén que parece ser un pseudogén ADAM6 humano está presente entre estos segmentos génicos Vh, es decir, entre Vh1-2 y Vh1-6 humanos. Sin embargo, los ratones macho que comprenden esta secuencia intergénica humana muestran poca o ninguna fertilidad.

Se describen ratones que comprenden los locus reemplazados como se describe anteriormente, y que también comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópico que codifica una ADAM6 de ratón, donde los ratones muestran fertilidad esencialmente normal. En una realización, la secuencia de ácido nucleico ectópico es la SEQ ID NO: 3, localizada entre Vh1-2 y Vh1-6 humanos en el locus de cadena pesada de ratón endógeno modificado. La dirección de transcripción de los genes ADAM6 de la SEQ ID NO: 3 es opuesta con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos génicos Vh humanos circundantes. Aunque los ejemplos en el presente documento muestran el rescate de la fertilidad colocando la secuencia ectópica entre los segmentos génicos Vh humanos indicados, los expertos reconocerán que se espera que la ubicación de la secuencia ectópica en cualquier locus transcripcionalmente permisivo adecuado en el genoma del ratón (o incluso extracromosómicamente) rescate de manera similar la fertilidad en un ratón macho.

El fenómeno de complementar un ratón que carece de un locus ADAM6 funcional con una secuencia ectópica que comprende un gen ADAM6 de ratón o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional del mismo es un método general que es aplicable al rescate de cualquier ratón con locus ADAM6 endógenos no funcionales o mínimamente funcionales. Por lo tanto, un gran número de ratones que comprenden una modificación disruptiva de ADAM6 del locus de cadena pesada de inmunoglobulina puede rescatarse con las composiciones y métodos de la invención. En consecuencia, la invención comprende ratones con una amplia variedad de modificaciones de locus de cadenas pesadas de inmunoglobulinas que comprometen la función endógena de ADAM6 presente ectópicamente. Algunos ejemplos (no limitantes) se proporcionan en la presente descripción. Además de los ratones humanizados VELOCIMMUNE® descritos, se pueden usar las composiciones y métodos relacionados con ADAM6 en muchas aplicaciones, por ejemplo, cuando se modifica un locus de cadena pesada de una gran variedad de formas.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional (o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional de la misma), un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh de ratón con uno o más segmentos génicos Vh humanos, un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Dh y segmentos génicos Jh de ratón con segmentos génicos Dh humanos y Jh humanos; en donde el ratón carece de un Ch1 y/o región bisagra. En una realización, el ratón produce una proteína de unión a un dominio variable único que es un dímero de cadenas de inmunoglobulinas seleccionadas entre: (a) Vh humana- Ch1 de ratón - Ch2 de ratón - Ch3 de ratón; (b) Vh humana -bisagra de ratón - Ch2 de ratón- Ch3 de ratón; y, (c) Vh humana- Ch2 de ratón- Ch3 de ratón.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que rescata la fertilidad se coloca dentro de una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas humanas (por ejemplo, entre segmentos génicos Vh1-2 y Vh1-6 humanos) en un ratón que tiene un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (mVH, mDH y itiJh) con uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulinas humanas (hVH, hDH, y hJH) y el ratón comprende además un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón (mVK, mJK) con uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulinas humanas (hVK y hJK). En una realización, la secuencia de nucleótidos se coloca entre un segmento génico Vh1-2 humano y un segmento génico Vh1-6 humano en un ratón humanizado VELOCIMMUNE® (documento US 6.596.541 y documento US 7.105.348). En una realización, el ratón humanizado VELOCIMMUNE® modificado de este modo comprende un reemplazo con la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulinas humanas (todos los hVH, hDH y hJH) y la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulinas humanas (hVk y hJk).

En un aspecto, se puede colocar un locus ADAM6 de ratón funcional (o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional del mismo) en medio de segmentos génicos Vh humanos que reemplazan segmentos génicos Vh de ratones endógenos. En una realización, se eliminan la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh de ratón y se reemplazan con uno o más segmentos génicos V^hhumanos, y el locus ADAM6 de ratón se coloca inmediatamente adyacente al extremo 3' de los segmentos génicos Vh humanos, o entre dos segmentos génicos Vh humanos. En una realización específica, el locus ADAM6 de ratón se coloca entre dos segmentos génicos V^hcerca del término 3' de los segmentos génicos Vh humanos insertados. En una realización específica, el reemplazo incluye segmentos génicos V^h1-2 y V^h6-1 de V^hhumano, y el locus ADAM6 de ratón se coloca cadena abajo del segmento génico V^h1-2 y cadena arriba del segmento génico Vh6-1. En una realización específica, La disposición de los segmentos génicos Vh humanos es entonces la siguiente (de cadena arriba a cadena abajo con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos génicos V^hhumanos): V^h1-2 humano - locus ADAM6 de ratón - V^h6-1 humano. En una realización específica, el pseudogén ADAM6 entre V^h1-2 humano y V^h6-1 humano se reemplaza con el locus ADAM6 de ratón. En una realización, la orientación de uno o más de ADAM6a de ratón y ADAM6b de ratón del locus ADAM6 de ratón es opuesta con respecto a la dirección de transcripción en comparación con la orientación de los segmentos génicos V^hhumanos. Alternativamente, el locus ADAM6 de ratón se puede colocar en la región intergénica entre el segmento génico Vh humano más 3' y el segmento génico Dh más 5'. Este puede ser el caso, si el segmento Dh más 5' es de ratón o humano.

De forma similar, un ratón modificado con uno o más segmentos génicos Vl humanos (p. ej., segmentos Vk o VA) que reemplaza la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh de ratón endógenos se puede modificar para mantener el locus ADAM6 de ratón endógeno, como se describe anteriormente, por ejemplo, empleando un vector de direccionamiento que tiene un brazo de homología cadena abajo que incluye un locus ADAM6 de ratón o un fragmento funcional del mismo, o para reemplazar un locus ADAM6 de ratón dañado con una secuencia ectópica posicionada entre dos segmentos génicos Vl humanos o entre los segmentos génicos Vl humanos y un segmento génico Dh (ya sea humano o de ratón, por ejemplo, VA m/hDH), o un segmento génico J (ya sea humano o de ratón, por ejemplo, Vk Jh). En una realización, el reemplazo incluye dos o más segmentos génicos Vl humanos, y el locus ADAM6 de ratón o un fragmento funcional del mismo se coloca entre los dos segmentos génicos V^lmás 3'. En una realización específica, la disposición de los segmentos génicos Vl humanos es entonces la siguiente (de cadena arriba a cadena abajo con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos génicos humanos): Vl3'-1 humano -locus ADAM6 de ratón- V^l3' humano. En una realización, la orientación de uno o más de ADAM6a de ratón y ADAM6b de ratón del locus ADAM6 de ratón es opuesta con respecto a la dirección de transcripción en comparación con la orientación de los segmentos génicos V^lhumanos. Alternativamente, el locus ADAM6 de ratón se puede colocar en la región intergénica entre el segmento génico Vl humano más 3' y el segmento génico Dh más 5'. Este puede ser el caso, si el segmento Dh más 5' es de ratón o humano.

En un aspecto, se describe un ratón con un reemplazo de uno o más segmentos génicos Vh de ratón endógenos, y que comprende al menos un segmento génico Dh de ratón endógeno. En dicho un ratón, la modificación de los segmentos génicos Vh de ratón endógenos puede comprender una modificación de uno o más de los segmentos génicos Vh más 3', pero no del segmento génico Dh más 5', donde se tiene cuidado para que la modificación del uno o más segmentos génicos V^hmás 3' no interrumpa o haga que el locus ADAM6 de ratón endógeno no sea funcional. Por ejemplo, en un caso, el ratón comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh de ratón endógenos con uno o más segmentos génicos Vh humanos, y el ratón comprende uno o más segmentos génicos D^hendógenos y un locus ADAM6 de ratón endógeno funcional.

[Eliminado]

El empleo de ratones que contienen una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo o un homólogo o un homólogo funcional de la misma es útil cuando las modificaciones interrumpen la función de ADAM6 de ratón endógeno. La probabilidad de interrumpir la función de ADAM6 endógena de ratón es alta cuando se realizan modificaciones en los locus de inmunoglobulinas de ratón, en particular cuando se modifican las regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulinas de ratón y las secuencias circundantes. Por lo tanto, tales ratones proporcionan un beneficio particular cuando se producen ratones con locus de cadenas pesadas de inmunoglobulinas que se suprimen en su totalidad o en parte, se humanizan en su totalidad o en parte, o se reemplazan (por ejemplo, con secuencias Vk o VA) en su totalidad o en parte. Los expertos en la técnica conocen los métodos para producir las modificaciones genéticas descritas para los ratones descritos a continuación.

Los ratones que contienen una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón, o una proteína sustancialmente idéntica o similar que confiere los beneficios de fertilidad de una proteína ADAM6 de ratón, son particularmente útiles junto con modificaciones de un locus del gen de región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas de ratón que interrumpe o suprime la secuencia ADAM6 de ratón endógena. Aunque se describe principalmente en relación con ratones que expresan anticuerpos con regiones variables humanas y regiones constantes de ratón, tales ratones son útiles en conexión con cualquier modificación genética que interrumpa el gen ADAM6 de ratón endógeno. Los expertos reconocerán que esto abarca una amplia variedad de ratones genéticamente modificados que contienen modificaciones del locus del gen de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas de ratón. Estos incluyen, por ejemplo, ratones con una deleción o un reemplazo de la totalidad o una parte de los segmentos del gen de cadena pesada de inmunoglobulinas de ratón, independientemente de otras modificaciones.

Se describen ratones modificados genéticamente que comprenden un gen ADAM6 de ratón, de roedor u otro ectópico (o un ortólogo o un homólogo o un fragmento) funcional en un ratón, y uno o más segmentos de genes de región variable y/o constante de inmunoglobulinas humanas.

Se describe un ratón que comprende una secuencia ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional, un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh de ratón con uno o más segmentos génicos Vh humanos; un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Dh de ratón con uno o más segmentos génicos Dh humanos; y un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Jh de ratón con uno o más segmentos génicos Jh humanos.

En un caso, el ratón comprende además un reemplazo de una secuencia de nucleótidos de Ch1 de ratón con una secuencia de nucleótidos de Ch1 humano. En una realización, el ratón comprende además un reemplazo de una secuencia de nucleótidos de bisagra de ratón con una secuencia de nucleótidos de bisagra humana. En un caso, el ratón comprende además un reemplazo de un locus variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl y Jl) con un locus variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En un caso, el ratón comprende además un reemplazo de una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón con una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En un caso específico, la Vl, Jl y Cl son secuencias de cadena ligera k de inmunoglobulina. En un caso específico, el ratón comprende una secuencia de región constante de inmunoglobulina Ch2 de ratón y Ch3 de ratón fusionadas con una bisagra humana y una secuencia Ch1 humana, de modo que los locus de inmunoglobulinas de ratón se reordenan para formar un gen que codifica una proteína de unión que comprende (a) una cadena pesada que tiene una región variable humana, una región Ch1 humana, una región bisagra humana y una región Ch2 de ratón y una región Ch3 de ratón; y (b) un gen que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio variable humano y una región constante humana.

Se describe un ratón que comprende una secuencia ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional, un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh de ratón con uno o más segmentos génicos Vl humanos, y opcionalmente un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Dh y/o segmentos génicos Jh con uno o más segmentos génicos Dh humanos y/o segmentos génicos Jh humanos, u opcionalmente un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Dh y segmentos génicos JH con uno o más segmentos génicos JL humanos.

Se describe un ratón que comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh, Dh y Jh de ratón con uno o más segmentos génicos Vl, uno o más Dh y uno o más J (por ejemplo, Jk o JA), en donde los segmentos génicos están operativamente unidos a una región bisagra de ratón endógena, en donde el ratón forma un gen de cadena de inmunoglobulina reordenado que contiene, de 5 'a 3' en la dirección de la transcripción, Vl humanos- Dh humano o de ratón -J humano o de ratón - bisagra de ratón -Ch2 de ratón - Ch3 de ratón. En un caso, la región J es una región Jk humana. En un caso, la región J es una región JH humana. En un caso, la región J es una región JA humana. En un caso, la región VL humana se selecciona de una región VA humana y una región Vk humana.

En casos específicos, el ratón expresa un anticuerpo de dominio variable único que tiene una región constante de ratón o humana y una región variable derivada de una Vk humana, una Dh humana y una Jk humana; una Vk humana, una Dh humana y una Jh humana; una VA humana, una Dh humana y una JA humana; una VA humana, una Dh humana y una Jh humana; una Vk humana, una Dh humana y una JA humana; una VA humana, una Dh humana y una Jk humana. En un caso específico, las secuencias de reconocimiento de recombinación se modifican para permitir que se produzcan reordenamientos productivos entre segmentos génicos V, D y J enumerados o entre segmentos génicos V y J enumerados.

En un aspecto, el ratón proporcionado comprende una secuencia ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional (o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional de la misma), un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh de ratón con uno o más segmentos génicos Vl humanos, un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Dh y segmentos génicos Jh de ratón con segmentos génicos Jl humanos; en donde el ratón carece de un Ch1 y/o región bisagra.

En una realización, el ratón carece de una secuencia que codifique un dominio Ch1. En una realización, el ratón carece de una secuencia que codifique una región bisagra. En una realización, el ratón carece de una secuencia que codifique un dominio Ch1 y una región bisagra.

En una realización específica, el ratón expresa una proteína de unión que comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana (A o k) fusionado a un dominio Ch2 de ratón que está unido a un dominio Ch3 de ratón.

En un aspecto, el ratón proporcionado comprende una secuencia ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional (o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional de la misma), un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh de ratón con uno o más segmentos génicos Vl humanos, un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Dh y Jh de ratón con segmentos génicos Jl humanos.

En una realización, el ratón comprende una deleción de una secuencia génica de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que codifica una región Ch1, una región bisagra, una región Ch1 y una bisagra, o una región Ch1 y una región bisagra y una región Ch2.

En una realización, el ratón produce una proteína de unión a un dominio variable único que comprende un homodímero seleccionado entre los siguientes: (a) Vl humana- Ch1 de ratón - Ch2 de ratón - Ch3 de ratón; (b) Vl humana -bisagra de ratón - Ch2 de ratón- Ch3 de ratón; (c) Vl humana- Ch2 de ratón- Ch3 de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón con un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno desactivado, que comprende un locus ADAM6 de ratón endógeno desactivado o suprimido, en donde el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que expresa un anticuerpo humano o de ratón o humano/de ratón u otro anticuerpo quimérico. En una realización, la secuencia de ácido nucleico está presente en un transgén integrado que se integra aleatoriamente en el genoma del ratón. En una realización, la secuencia de ácido nucleico está en un episoma (por ejemplo, un cromosoma) que no se encuentra en un ratón de tipo silvestre.

Cadena Ligera Común o Universal

Los esfuerzos previos para producir proteínas de unión a epítopos multiespecíficas útiles, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, se han visto obstaculizados por una variedad de problemas que frecuentemente comparten un paradigma común: la selección o manipulación in vitro de secuencias para modificar por ingeniería racionalmente, o para modificar por ingeniería mediante ensayo y error, un formato adecuado para emparejar una inmunoglobulina humana biespecífica heterodimérica. Desafortunadamente, la mayoría, si no todos, los enfoques de ingeniería in vitro proporcionan soluciones en gran medida ad hoc que son adecuadas, si es que lo son, para moléculas individuales. Por otro lado, no se han realizado métodos in vivo para emplear organismos complejos para seleccionar emparejamientos apropiados que sean capaces de conducir a agentes terapéuticos humanos.

Generalmente, las secuencias de ratón naturales con frecuencia no son una buena fuente de secuencias de agentes terapéuticos humanos. Al menos por esa razón, la generación de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulinas de ratón que se emparejan con una cadena ligera humana común es de utilidad práctica limitada. Se realizarían más esfuerzos de ingeniería in vitro en un proceso de prueba y error para tratar de humanizar las secuencias variables de cadena pesada de ratón mientras se espera conservar la especificidad y afinidad del epítopo, manteniendo la capacidad de acoplarse con la cadena ligera humana común, con resultados inciertos. Al final de dicho proceso, el producto final puede mantener algo de la especificidad y afinidad, y asociarse con la cadena ligera común, pero en última instancia, la inmunogenicidad en un ser humano probablemente seguiría siendo un riesgo profundo.

Por lo tanto, un ratón adecuado para elaborar agentes terapéuticos humanos incluiría un repertorio adecuadamente grande de segmentos génicos de región variable de cadena pesada humana en lugar de segmentos génicos de región variable de cadena pesada de ratón endógenos. Los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada humana deberían poder reordenarse y recombinarse con un dominio constante de cadena pesada de ratón endógeno para formar una cadena pesada quimérica inversa (es decir, una cadena pesada que comprende un dominio variable humano y una región constante de ratón). La cadena pesada debe ser capaz de cambiar de clase y de hipermutación somática de modo que un repertorio grande de dominios variables de cadena pesada adecuado esté disponible para que el ratón seleccione uno que pueda asociarse con el repertorio limitado de regiones variables de cadena ligera humana.

Un ratón que selecciona una cadena ligera común para una pluralidad de cadenas pesadas tiene una utilidad práctica. En diversas realizaciones, los anticuerpos que expresan en un ratón que solo puede expresar una cadena ligera común tendrán cadenas pesadas que pueden asociarse y expresarse con una cadena ligera idéntica o sustancialmente idéntica. Esto es particularmente útil en la producción de anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, dicho un ratón de este tipo puede inmunizarse con un primer inmunógeno para generar un linfocito B que expresa un anticuerpo que se une específicamente a un primer epítopo. El ratón (o un ratón genéticamente igual) se puede inmunizar con un segundo inmunógeno para generar un linfocito B que expresa un anticuerpo que se une específicamente al segundo epítopo. Las regiones variables de cadena pesada pueden clonarse a partir de linfocitos B y expresarse con la misma región constante de cadena pesada y la misma cadena ligera y expresarse en una célula para producir un anticuerpo biespecífico, en donde el componente de cadena ligera del anticuerpo biespecífico ha sido seleccionado mediante un ratón para asociarse y expresarse con el mismo componente de cadena ligera.

Los presentes inventores han modificado por ingeniería un ratón para generar cadenas ligeras de inmunoglobulina que se emparejarán adecuadamente con una familia bastante diversa de cadenas pesadas, incluidas las cadenas pesadas cuyas regiones variables se separan de las secuencias de la línea germinal, por ejemplo, las regiones variables maduradas por afinidad o mutadas somáticamente. En diversas realizaciones, el ratón está ideado para emparejar dominios variables de cadena ligera humana con dominios variables de cadena pesada humana que comprenden mutaciones somáticas, permitiendo así una ruta a proteínas de unión de alta afinidad adecuadas para su uso como agentes terapéuticos humanos.

El ratón modificado por ingeniería genética, a través del largo y complejo proceso de selección de anticuerpos dentro de un organismo, toma decisiones biológicamente apropiadas al emparejar una colección diversa de dominios variables de cadena pesada humana con un número limitado de opciones de cadena ligera humana. Con el fin de lograr esto, el ratón se modifica por ingeniería para presentar un número limitado de opciones de dominio variable de cadena ligera humana junto con una amplia variedad de opciones de dominio variable de cadena pesada humana. Ante la exposición con un antígeno, el ratón maximiza el número de soluciones en su repertorio para desarrollar un anticuerpo para el antígeno, limitado en gran parte o únicamente por el número o las opciones de cadena ligera en su repertorio. En diversas realizaciones, esto incluye permitir que el ratón logre mutaciones somáticas adecuadas y compatibles del dominio variable de cadena ligera que, sin embargo, serán compatibles con una variedad relativamente grande de dominios variables de cadena pesada humana, incluidos en particular dominios variables de cadena pesada humana mutados somáticamente.

Para lograr un repertorio limitado de opciones de cadenas ligeras, se modifica por ingeniería el ratón para hacer no funcional o sustancialmente no funcional su capacidad de producir o reordenar, un dominio variable de cadena ligera de ratón natural. Esto puede lograrse, por ejemplo, suprimiendo los segmentos génicos de la región variable de cadena ligera del ratón. El locus del ratón endógeno puede modificarse después mediante segmentos génicos de la región variable de cadena ligera humana exógenos adecuados, operativamente unidos al dominio constante de cadena ligera de ratón endógeno, de manera tal que los segmentos génicos de la región variable humana exógenos se puedan combinar con el gen de la región constante de la cadena ligera de ratón exógeno y formar un gen de cadena ligera quimérico inverso reordenado (variable humana, constante de ratón). En diversas realizaciones, la región variable de la cadena ligera es capaz de ser mutada somáticamente. En diversas realizaciones, para maximizar la capacidad de la región variable de la cadena ligera para adquirir mutaciones somáticas, se conservan en el ratón los potenciadores apropiados. Por ejemplo, al modificar un locus de cadena ligera k de ratón para reemplazar segmentos génicos de cadena ligera k de ratón endógenos con segmentos génicos de cadena ligera k humana, el potenciador intrónico k de ratón y el potenciador 3' k de ratón se mantienen, o no se interrumpen funcionalmente.

El ratón modificado por ingeniería genética puede expresar un repertorio limitado de cadenas ligeras quiméricas inversas (variable humana, constante de ratón) asociadas con una diversidad de cadenas pesadas quiméricas inversas (variable humana, constante de ratón). En diversas realizaciones, los segmentos génicos de cadena ligera k de ratón endógenos se suprimen y se reemplazan con una sola (o dos) región o regiones de cadena ligera humana reordenada, unida operativamente al gen Ck de ratón endógeno. En realizaciones para maximizar la hipermutación somática de la región de la cadena ligera humana reordenada, se mantienen el potenciador intrónico k de ratón y el potenciador 3' k de ratón. En diversas realizaciones, el ratón también comprende un locus de cadena ligera A no funcional, o una deleción del mismo o una deleción que hace que el locus sea incapaz de producir una cadena ligera A.

El ratón modificado por ingeniería genética proporcionado puede comprender, en diversas realizaciones, un locus de región variable de cadena ligera que carece de segmentos génicos Vl y Jl de cadena ligera de ratón endógenos y que comprende una región variable de cadena ligera humana reordenada, en una realización, una secuencia Vl/Jl humana reordenada, unida operativamente a una región constante de ratón, en donde el locus es capaz de experimentar hipermutación somática, y en donde el locus expresa una cadena ligera que comprende la secuencia Vl/Jl humana unida a una región constante de ratón. Por lo tanto, en diversas realizaciones, el locus comprende un potenciador 3' k de ratón, que se correlaciona con un nivel normal o de tipo silvestre de hipermutación somática.

El ratón modificado por ingeniería genética en diversas realizaciones cuando se inmuniza con un antígeno de interés genera linfocitos B que muestran una diversidad de reordenamientos de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se expresan y funcionan con una o dos cadenas ligeras reordenadas, incluidas las realizaciones donde la una o las dos cadenas ligeras comprenden regiones variables de cadena ligera humana que comprenden, por ejemplo, 1 a 5 mutaciones somáticas. En diversas realizaciones, las cadenas ligeras humanas así expresadas son capaces de asociarse y expresarse con cualquier región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana expresada en el ratón.

Proteínas de Unión a Epítopos que se Unen a Más de Un Epítopo

Las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden usarse para producir proteínas de unión que se unan a más de un epítopo con alta afinidad, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos. Las ventajas de la invención incluyen la capacidad de seleccionar adecuadamente cadenas de inmunoglobulinas de cadena pesada de unión elevada (por ejemplo, maduradas por afinidad), cada una de las cuales se asociará con una única cadena ligera.

La síntesis y expresión de proteínas de unión biespecíficas ha sido problemática, en parte debido a problemas asociados con la identificación de una cadena ligera adecuada que puede asociarse y expresarse con dos cadenas pesadas diferentes, y en parte debido a problemas de aislamiento. Los métodos y composiciones descritos en el presente documento permiten que un ratón genéticamente modificado seleccione, mediante procesos naturales, una cadena ligera adecuada que pueda asociarse y expresarse con más de una cadena pesada, incluyendo cadenas pesadas que están mutadas somáticamente (por ejemplo, maduradas por afinidad). Las secuencias de Vl y Vh humanas de linfocitos B adecuados de ratones inmunizados como se describe en el presente documento que expresan anticuerpos madurados por afinidad que tienen cadenas pesadas quiméricas inversas (es decir, variable humana y constante de ratón) se pueden identificar y clonar en marco en un vector de expresión con una secuencia génica de la región constante humana adecuada (por ejemplo, una IgG1 humana). Se pueden preparar dos construcciones de este tipo, en donde cada construcción codifica un dominio variable de cadena pesada humana que se une a un epítopo diferente. Una de las Vl humanas (por ejemplo, Vk1-39Jk5 humana o Vk3-20Jk1 humana), en secuencia de línea germinal o de un linfocito B en donde la secuencia ha mutado somáticamente, puede fusionarse en marco a un gen de región constante humano adecuado (por ejemplo, un gen constante k humano). Estas tres construcciones pesadas y ligeras completamente humanas pueden colocarse en una célula adecuada para la expresión. La célula expresará dos especies principales: una cadena pesada homodimérica con la cadena ligera idéntica, y una cadena pesada heterodimérica con la cadena ligera idéntica. Para permitir una separación fácil de estas especies principales, una de las cadenas pesadas se modifica para omitir un determinante de unión a la proteína A, lo que da como resultado una afinidad diferencial de una proteína de unión homodimérica a partir de una proteína de unión heterodimérica. Las composiciones y los métodos que abordan este problema se describen en el documento USSN 12/832.838, presentado el 25 de junio de 2010, titulado "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format," publicado como US 2010/0331527A1.

Se describe una proteína de unión a epítopo, en donde las secuencias de Vl y Vh humanas derivan de ratones descritos en el presente documento que se han inmunizado con un antígeno que comprende un epítopo de interés.

Se describe una proteína de unión a epítopo que comprende un primer y un segundo polipéptido, comprendiendo el primer polipéptido, desde el extremo N al extremo C, una primera región de unión a epítopo que se une selectivamente a un primer epítopo, seguida de una región constante que comprende una primera región Ch3 de una IgG humana seleccionada entre IgG1, IgG2, IgG4 y una combinación de las mismas; y, un segundo polipéptido que comprende, desde el extremo N al extremo C, una segunda región de unión a epítopo que se une selectivamente a un segundo epítopo, seguida de una región constante que comprende una segunda región Ch3 de una IgG humana seleccionada de IgG1, IgG2, IgG4 y una combinación de las mismas, en donde la segunda región Ch3 comprende una modificación que reduce o elimina la unión del segundo dominio CH3 a la proteína A.

En un caso, la segunda región Ch3 comprende una modificación H95R (por numeración de exón IMGT; H435R por numeración EU). En otra realización, la segunda región Ch3 comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU).

En un caso, la segunda región Ch3 procede de una IgG1 humana modificada y comprende además una modificación seleccionada del grupo que consiste en D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I según EU).

En un caso, la segunda región Ch3 procede de una IgG2 humana modificada y comprende además una modificación seleccionada del grupo que consiste en N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, k 392N y V422I según EU).

En un caso, la segunda región Ch3 procede de una IgG4 humana modificada y comprende además una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I según EU).

Un método para producir una proteína de unión a epítopo que se une a más de un epítopo es inmunizar a un primer ratón de acuerdo con la invención con un antígeno que comprende un primer epítopo de interés, en donde el ratón comprende un locus de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno que no contiene una Vk de ratón endógena que es capaz de reordenar y formar una cadena ligera, en donde el locus de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón endógeno es una única región Vk humana reordenada operativamente unida al gen de la región constante de cadena ligera de ratón endógeno, y la región Vl humana reordenada se selecciona de una Vk1-39Jk5 humana y una Vk3-20Jk1 humana, y los segmentos génicos Vh de ratón endógenos se han reemplazado total o parcialmente con segmentos génicos Vh humanos, de modo que las cadenas pesadas de inmunoglobulina producidas por el ratón son única o sustancialmente cadenas pesadas que comprenden dominios variables humanos y dominios constantes de ratón. Cuando se inmunice, dicho ratón producirá un anticuerpo quimérico inverso, que comprenderá solo uno de los dos dominios variables de cadena ligera humana (por ejemplo, uno de Vk1-39Jk5 humana o Vk3-20Jk1 humana). Una vez que se identifica un linfocito B que codifica una VH que se une al epítopo de interés, la secuencia de nucleótidos de la VH (y, opcionalmente, la VL) puede recuperarse (por ejemplo, por PCR) y clonarse en una construcción de expresión en marco con un dominio constante de inmunoglobulina humana adecuado. Este proceso puede repetirse para identificar un segundo dominio VH que se une a un segundo epítopo, y puede recuperarse y clonarse una segunda secuencia génica VH en un vector de expresión en marco con un segundo dominio constante de inmunoglobulina adecuado. El primer y el segundo dominio constante de inmunoglobulina pueden ser el mismo isotipo o uno diferente, y uno de los dominios constantes de inmunoglobulina (pero no el otro) puede modificarse como se describe en el presente documento o en el documento US 2010/0331527A1, y la proteína de unión a epítopo puede expresarse en una célula adecuada y aislarse en función de su afinidad diferencial por la proteína A en comparación con una proteína de unión a epítopo homodimérica, por ejemplo, como se describe en el documento US 2010/0331527A1.

Se describe un método para producir una proteína de unión a antígeno biespecífica, que comprende identificar una primera secuencia de nucleótidos de Vh humana (Vh1) madurada por afinidad (por ejemplo, que comprende una o más hipermutaciones somáticas) de un ratón como se describe en el presente documento, identificar una segunda secuencia de nucleótidos de Vh humana (Vh2) madurada por afinidad (por ejemplo, que comprende una o más hipermutaciones somáticas) de un ratón como se describe en el presente documento, clonar Vh1 en el marco con una cadena pesada humana que carece de una modificación determinante de la proteína A como se describe en el documento US 2010/0331527A1 para formar la cadena pesada 1 (HC1), clonar Vh2 en el marco con una cadena pesada humana que comprende un determinante de la proteína A como se describe en el documento US 2010/0331527A1 para formar la cadena pesada 2 (HC2), introducir un vector de expresión que comprende HC1 y el mismo o diferente vector de expresión que comprende HC2 en una célula, en donde la célula también expresa una cadena ligera de inmunoglobulina humana que comprende una Vk1-39 humana/JK5 humana o una Vk3-20 humana/JKl humana fusionada a un dominio constante de la cadena ligera humana, permitir que la célula exprese una proteína de unión a epítopo biespecífica que comprende un dominio Vh codificado por Vh1 y un dominio de Vh codificado por Vh2, y aislar la proteína de unión a epítopo biespecífica en función de su capacidad diferencial para unirse a la proteína A en comparación con una proteína de unión a epítopo homodimérica monoespecífica. En una realización específica, HC1 es una IgG1, y HC2 es una IgG1 que comprende la modificación H95R (IMGT; H435R por EU) y comprende además la modificación Y96F (IMGT; Y436F por EU). En una realización, el dominio Vh codificado por V^h1, el dominio V^hcodificado por V^h2 , o ambos, están mutados somáticamente.

Genes de V^hHumana que se Expresan con una V^lHumana Común

Una variedad de regiones variables humanas de anticuerpos maduros por afinidad generados contra cuatro antígenos diferentes se expresó con su cadena ligera afín, o al menos una de una cadena ligera humana seleccionada de Vk1-39Jk5 humana, Vk3-20Jk1 humana, o VpreBJA,5 humana (véase el Ejemplo 10). Para los anticuerpos contra cada uno de los antígenos, las cadenas pesadas de alta afinidad mutadas somáticamente de diferentes familias génicas se emparejaron con éxito con regiones Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 de la línea germinal humana reordenadas y se secretaron de las células que expresan las cadenas pesadas y ligeras. Para Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1, los dominios Vh derivados de las siguientes familias génicas Vh humanas se expresaron favorablemente: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11,3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31,4-39, 4-59, 5-51, y 6-1. Por lo tanto, un ratón modificado por ingeniería para expresar un repertorio limitado de dominios Vl humanos de uno o ambos de Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 generará una población diversa de dominios Vh humanos mutados somáticamente a partir de un locus Vh modificado para reemplazar segmentos génicos VH de ratón con segmentos génicos VH humanos.

Los ratones modificados por ingeniería genética para expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina quimérica inversa (variable humana, constante de ratón) asociadas con una sola cadena ligera reordenada (por ejemplo, una Vk1-39/J o una Vk3-20/J), cuando se inmunizaron con un antígeno de interés, generaron linfocitos B que comprendían una diversidad de reordenamientos de Vh humanas y expresaron una diversidad de anticuerpos específicos de antígeno de alta afinidad con diversas propiedades con respecto a su capacidad para bloquear la unión del antígeno a su ligando, y con respecto a su capacidad para unirse a variantes del antígeno (véanse los Ejemplos 14 a 15).

Por lo tanto, los ratones y los métodos descritos en el presente documento son útiles para producir y seleccionar dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana, incluidos dominios variables de cadena pesada humana mutados somáticamente, que son el resultado de una diversidad de reordenamientos, que muestran una amplia variedad de afinidades (que incluyen una Kd de aproximadamente uno nanomolar o menos), una amplia variedad de especificidades (que incluyen la unión a diferentes epítopos del mismo antígeno), y que se asocian y expresan con la misma o sustancialmente la misma región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana.

Un primer ratón que comprende un locus de región variable de cadena pesada humanizada puede aparearse con un segundo ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un locus de cadena ligera común o universal como se describe en el presente documento. El primer o el segundo ratón puede comprender una secuencia de ácido nucleico ectópico que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional de la misma. La progenie se cría para obtener ratones homocigotos para un locus de cadena pesada humanizada, y homocigotos para el locus de cadena ligera universal. El primer ratón o el segundo ratón pueden comprender una modificación de un locus de cadena ligera de ratón endógeno para hacer que el locus de cadena ligera de ratón endógeno no sea funcional (por ejemplo, una deleción o una supresión génica de, por ejemplo, un locus endógeno A y/o k). El primer ratón puede comprender un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos V, D y J de ratón endógenos funcionales con uno o más segmentos de génicos V, D y J humanos no reordenados (por ejemplo, la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos V, D y J humanos funcionales); y el ratón comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos de génicos V y J de cadena ligera funcionales con no más de una o no más de dos secuencias V/J de cadena ligera reordenadas. El primer ratón comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico ectópico que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional de la misma. En un caso, la secuencia de ácido nucleico ectópico está en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada.

En un caso, los ratones que comprenden la secuencia ectópica y que son homocigotos para el locus de cadena ligera universal y para el locus de cadena pesada humanizado se inmunizan con un antígeno de interés para generar anticuerpos que comprenden una pluralidad de dominios variables humanos mutados somáticamente que se asocian y expresan con una cadena ligera universal. En un caso, las secuencias de ácido nucleico de dominio variable de la cadena pesada humana identificadas en el ratón se emplean en un sistema de expresión para producir un anticuerpo completamente humano que comprende el dominio variable de cadena pesada humana y una cadena ligera que comprende una secuencia de cadena ligera universal de ratón.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la materia cómo hacer y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los presentes inventores consideran su invención. Se ha intentado garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura se indica en grados Celsius y la presión es la atmosférica o casi atmosférica.

Ejemplos

Ejemplo I

Humanización de Genes de Inmunoglobulina de Ratón

Se usaron cromosomas artificiales bacterianos (BAC, por sus siglas en inglés) humanos y de ratón para modificar por ingeniería 13 vectores de direccionamiento BAC diferentes (BACvec) para la humanización de los locus de cadena pesada y de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón. Las tablas 1 y 2 exponen descripciones detalladas de las etapas realizadas para la construcción de todos los BACvec empleados para la humanización los locus de cadena pesada y de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón, respectivamente.

Identificación de BAC humanos y de ratón.

Los BAC de ratón que abarcan los extremos 5' y 3' de los locus de cadena pesada y de cadena ligera k de inmunoglobulina, se identificaron mediante hibridación de filtros manchados con biblioteca de BAC o mediante PCR que explora los grupos de ADN de la biblioteca de BAC de ratón. Los filtros se hibridaron en condiciones convencionales usando sondas que correspondían a las regiones de interés. Los grupos de la biblioteca se exploraron por PCR usando pares de cebadores únicos que flanquean la región diana de interés. Se realizó una PCR adicional usando los mismos cebadores para desconvolucionar un pocillo dado y aislar el BAC de interés correspondiente. Tanto los filtros BAC como los grupos de la biblioteca se generaron a partir de células ES de ratón 129 SvJ (Incyte Genomics/lnvitrogen). Los BAC humanos que cubren todos los locus de cadena pesada y de cadena ligera k de inmunoglobulina se identificaron por hibridación de filtros manchados con la biblioteca de BAC (bibliotecas Caltech B, C o D y biblioteca RPCI-11, Research Genetics/lnvitrogen) a través de la exploración de los grupos de la biblioteca de BAC humana (biblioteca Caltech, Invitrogen) mediante un método basado en PCR o utilizando una base de datos de secuencia final BAC (biblioteca Caltech D, TIGR).

Construcción de BACvec (Tablas 1 y 2).

La recombinación homóloga bacteriana (BHR, por sus silgas en inglés) se realizó como se describe (Valenzuela et al., 2003; Zhang, Y., et al. (1998). A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat Genet 20, 123-128). En la mayoría de los casos, se generaron fragmentos lineales uniendo cajas de homología derivadas de PCR a casetes clonados, seguido de aislamiento en gel de productos de unión y electroporación en bacterias competentes para BHR que albergan el BAC diana. Después de la selección sobre las placas de Petri antibióticas apropiadas, se identificaron los BAC correctamente recombinados por PCR a través de ambas nuevas uniones, seguido de un análisis de restricción sobre geles de campo pulsado (Schwartz, D.C., and Cantor, C.R. (1984) Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell 37, 67-75) y verificación de manchas por PCR usando cebadores distribuidos a través de las secuencias humanas.

Se construyó un 3hVH BACvec usando tres etapas de BHR secuenciales para la etapa inicial de humanización del locus de cadena pesada de inmunoglobulina (FlG. 4A y Tabla 1 ). En la primera etapa (Etapa 1 ), se introdujo un casete en un BAC precursor humano cadena arriba del segmento génico Vh1-3 humano que contiene una región de homología con el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (HB1), un gen que confiere resistencia a la kanamicina en bacterias y resistencia a G418 en células animales (kanR) y un sitio de recombinación específico del sitio (p. ej., loxP). En la segunda etapa (Etapa 2), se introdujo un segundo casete justo cadena abajo del último segmento Jh que contiene una segunda región de homología con el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (HB2) y un gen que confiere resistencia a espectomicina en bacterias (specR). Esta segunda etapa incluyó la deleción de secuencias de locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana cadena abajo de J^h6 y el gen de resistencia a cloranfenicol del vector BAC (cmR). En la tercera etapa (Etapa 3), el BAC humano doblemente modificado (B1) se linealizó usando sitios I-Ceul que se habían agregado durante las dos primeras etapas y e integrado en un BAC (B2) de ratón mediante BHR a través de las dos regiones de homología (HB1 y h B2). Las selecciones de fármacos para la primera (cm/kan), segunda (spec/kan) y tercera (cm/kan) etapa se diseñaron para ser específicos para los productos deseados. Los clones BAC modificados se analizaron mediante electroforesis en gel pulsado (PFGE) después de la digestión con enzimas de restricción para determinar la construcción apropiada (FIG. 4B).

De forma similar, se modificaron por ingeniería 12 BACvec adicionales para la humanización de los locus de cadena pesada y de cadena ligera k. En algunos casos, se realizó unión de BAC en lugar de BHR para unir conjuntamente dos BAC grandes mediante la introducción de sitios de restricción raros en ambos BACvec precursores por BHR junto con la colocación cuidadosa de marcadores seleccionables. Esto permitió la supervivencia del producto de unión deseado tras la selección con combinaciones específicas de marcadores de fármacos. Los bAc recombinantes obtenidos por unión después de la digestión con enzimas de restricción raras se identificaron y exploraron de manera similar a los obtenidos por BHR (como se describe anteriormente).

Tabla 1

continuación

Tabla 2

continuación

Modificación de células madre embrionarias (ES por sus siglas en inglés) y generación de ratones.

El direccionamiento de células ES (F1H4) se realizó utilizando el método de ingeniería genética VELOCIGENE® como se describe (Valenzuela et al., 2003). La obtención de ratones a partir de células ES modificadas por blastocisto (Valenzuela et al., 2003) o por inyección de 8cell (Poueymirou et al., 2007) fue como se describe. Las células ES y los ratones dirigidos se confirmaron mediante la exploración de ADN de células ES o ratones con conjuntos únicos de sondas y cebadores en un ensayo basado en p Cr (por ejemplo, FIG. 3A, 3B y 3C). Todos los estudios en ratones se supervisaron y aprobaron por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Regeneron (IACUC por sus siglas en inglés).

Análisis de Cariotipo e Hibridación in situ fluorescente (FISH).

El análisis de cariotipo se realizó mediante Repositorios de Células de Coriell (Instituto Coriell de Investigación Médica, Camden, NJ). La FISH se realizó en células ES dirigidas como se describe (Valenzuela et al., 2003). Las sondas correspondientes al ADN de BAC de ratón o al ADN de BAC humano se marcaron mediante traslación de muesca (Invitrogen) con el espectro naranja o el espectro verde de nucleótidos dUTP marcados con fluorescencia (Vysis).

Locus de Genes Variables de Cadena Pesada de Inmunoglobulina.

La humanización de la región variable del locus de cadena pesada se logró en nueve etapas secuenciales mediante el reemplazo directo de aproximadamente tres millones de pares de bases (Mb) de secuencia genómica de ratón contigua que contiene todos los segmentos génicos Vh, Dh y Jh con aproximadamente una Mb de secuencia genómica humana contigua que contiene los segmentos génicos equivalentes humanos (FIG. 1A y Tabla 1) usando la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. 6.586.251 y Valenzuela et al., 2003).

El intrón entre segmentos génicos Jh y genes de región constante (el intrón J-C) contiene un potenciador transcripcional (Neuberger, M.S. (1983) Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into lymphoid cells. EMBO J 2, 1373-1378) seguido de una región de repeticiones simples necesarias para la recombinación durante el cambio de isotipo (Kataoka, T. et al. (1980) Rearrangement of immunoglobulin gamma 1-chain gene and mechanism for heavy-chain class switch. Proc Natl Acad Sci U S A 77, 919-923). La unión entre la región humana Vh-Dh-Jh y la región Ch de ratón (la unión proximal) se eligió para mantener el potenciador intrónico de cadena pesada de ratón y cambiar el dominio para preservar tanto la expresión eficaz como el cambio de clase del locus de la cadena pesada humanizada dentro del ratón. La posición exacta de nucleótidos de esta y las uniones posteriores en todos los reemplazos fue posible mediante el uso del método de ingeniería genética VELOCIGENE® (supra), que empleó recombinación homóloga bacteriana activada por oligonucleótidos sintetizados. Por lo tanto, la unión proximal se colocó a unos 200 pb cadena abajo del último segmento génico Jh y la unión distal se colocó a varios cientos cadena arriba del segmento génico Vh más 5' del locus humano y aproximadamente 9 kb cadena abajo del segmento génico Vh1-86 de ratón, también conocido como J558.55. El segmento génico Vh1-86 (J558.55) de ratón es el segmento de gen variable de cadena pesada más distal, se informa que es un pseudogén en ratones C57BL/6, pero potencialmente activo, aunque con una secuencia RSS deficiente, en el alelo 129 dirigido. Según se informa, el extremo distal del locus de cadena pesada de ratón puede contener elementos de control que regulan la expresión y/o el reordenamiento del locus (Pawlitzky et al., 2006).

Se logró una primera inserción de la secuencia de ADN de inmunoglobulina humana en el ratón usando 144 kb del extremo proximal del locus de cadena pesada humana que contiene 3 segmentos génicos Vh, los 27 Dh y 9 Jh humanos insertados en el extremo proximal del locus de IgH de ratón, con una deleción concomitante de 16,6 kb de secuencia genómica de ratón, usando aproximadamente 75 kb de brazos de homología de ratón (Etapa A, FIG. 2A; Tablas 1 y 3, 3hVH). Esta inserción grande de 144 kb y la deleción de 16,6 kb que se acompaña se realizó en una única etapa (Etapa A) que se produjo con una frecuencia de un 0,2 % (Tabla 3). Las células ES dirigidas correctamente se puntuaron mediante un ensayo de pérdida de alelo natural (LONA) (Valenzuela et al., 2003) utilizando sondas dentro y flanqueando la secuencia de ratón suprimida y dentro de la secuencia humana insertada, y se verificó la integridad del inserto grande humano utilizando múltiples sondas que abarcan toda la inserción (FIG. 3A, 3B y 3C). Debido a que se anticiparon muchas rondas de direccionamiento secuencial de células ES, los clones de células ES dirigidos a esto, y todas las etapas posteriores, se sometieron a análisis de cariotipo (supra) y solo se utilizaron para etapas posteriores aquellos clones que mostraban cariotipos normales en al menos 17 de 20 extensiones.

Las células ES dirigidas de la Etapa A se volvieron a dirigir con un BACvec que produjo una deleción de 19 kb en el extremo distal del locus de cadena pesada (Etapa B, FIG. 2A). El BACvec de la Etapa B contenía un gen de resistencia a higromicina (hig) a diferencia del gen de resistencia a neomicina (neo) contenido en el BACvec de la etapa A. Los genes de resistencia de los dos BACvec se diseñaron de tal manera que, después de un redireccionamiento exitoso al mismo cromosoma, aproximadamente tres Mb del locus del gen variable de cadena pesada de ratón que contiene todos los segmentos génicos Vh de ratón diferentes a Vh1-86 y todos los segmentos génicos Dh diferentes a DQ52, así como los dos genes de resistencia, estaban flanqueados por sitios loxP; DQ52 y todos los segmentos del gen de la cadena Jh de ratón se suprimieron en la Etapa A. Los clones de células ES doblemente dirigidos sobre el mismo cromosoma se identificaron conduciendo el casete proximal 3hVH a la homocigosidad en G418 alta (Mortensen, R.M. et al. (1992) Production of homozygous mutant ES cells with a single targeting construct. Mol Cell Biol 12:2391-2395) y siguiendo el destino del casete hyg distal. Los segmentos de ratón de hasta cuatro Mb de tamaño, que se han modificado de manera que estén flanqueados por sitios loxP, se han suprimido con éxito en las células ES mediante la expresión transitoria de recombinasa CRE con altas eficacias (hasta “ 11 %) incluso en ausencia de selección de fármacos (Zheng, B., et al. (2000). Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications. Mol Cell Biol 20:648-655). De una manera similar, los presentes inventores lograron una deleción de tres Mb en el 8% de los clones de células ES después de la expresión transitoria de Cre (Etapa C, FIG. 2A; Tabla 3). La deleción se puntuó mediante el ensayo LONA utilizando sondas en cada extremo de la secuencia de ratón suprimida, así como la pérdida de neo e hyg y la aparición de un producto de PCR a través del punto de deleción que contiene el único sitio loxP restante. Adicionalmente, la deleción se confirmó por hibridación in situ fluorescente (datos no mostrados).

El resto de la región variable de cadena pesada humana se añadió al alelo 3hVH en una serie de 5 etapas utilizando el método de ingeniería genética VELOCIGENE® (Etapas EH, FIG. 2B), y cada paso implica la inserción precisa de hasta 210 kb de secuencias de genes humanos. Para cada etapa, el extremo proximal de cada nuevo BACvec se diseñó para solapar las secuencias humanas más distales de la etapa anterior y el extremo distal de cada nuevo BACvec contenía la misma región de homología de ratón distal que se usó en la Etapa A. Los BACvec de las etapas D, F y H contenían casetes de selección neo, mientras que los de las etapas E y G contenían casetes de selección hyg, por lo que las selecciones se alternaron entre G418 e higromicina. El direccionamiento en la etapa D se ensayó mediante la pérdida del producto de PCR único a través del sitio loxP distal del Alelo Híbrido 3hVH. El direccionamiento de las etapas E a I se analizó por pérdida del casete de selección previo. En la etapa final (Etapa I, FIG. 2B), el casete de selección neo, flanqueado por sitios Frt (McLeod, M. et al. (1986) Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2 microns circle. Mol Cell Biol 6, 3357-3367), se eliminó mediante la expresión transitoria de FLPe (Buchholz, F. et al. (1998). Improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis. Nat Biotechnol 16, 657-662). Las secuencias humanas de los BACvec para las etapas D, E y G derivaron de dos BAC precursores humanos cada una, mientras que aquellas de las etapas F y H derivaron de bAc únicos. La retención de secuencias humanas se confirmó en cada etapa utilizando múltiples sondas que abarcan las secuencias humanas insertadas (como se describe anteriormente, por ejemplo, la FIG. 3A, 3B y 3C). Solo se llevaron a cabo en cada etapa aquellos clones con cariotipo normal y potencial de línea germinal. Las células ES de la etapa final todavía pudieron contribuir a la línea germinal después de nueve manipulaciones secuenciales (Tabla 3). Los ratones homocigotos para cada uno de los alelos de cadena pesada fueron viables, parecían sanos y demostraron un sistema inmunitario humoral esencialmente de tipo silvestre (véase el Ejemplo 3).

Tabla 3

Locus de Genes Variables de Cadena Ligera K de Inmunoglobulina.

La región variable de la cadena ligera k se humanizó en ocho etapas secuenciales mediante el reemplazo directo de aproximadamente tres Mb de secuencia de ratón que contenía todos los segmentos génicos Vk y Jk con aproximadamente 0,5 Mb de secuencia humana que contenía los segmentos génicos Vk y Jk proximales humanos de manera similar a la de la cadena pesada (FIG.1B; Tablas 2 y 4).

La región variable del locus de la cadena ligera k humana contiene dos repeticiones casi idénticas de 400 kb separadas por un espaciador de 800 kb (Weichhold, G.M. et al. (1993) e human immunoglobulin kappa locus consists of two copies that are organized in opposite polarity, Genomics 16:503-511). Debido a que las repeticiones son muy similares, casi toda la diversidad de locus puede reproducirse en ratones usando la repetición proximal. Adicionalmente, se ha informado de un alelo humano natural del locus de la cadena ligera k que le falta la repetición distal (Schaible, G. et al. (1993) The immunoglobulin kappa locus: polymorphism and haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoid individuals, Hum Genet 91:261-267). Aproximadamente tres Mb de secuencia de gen variable de cadena ligera k de ratón se reemplazaron con aproximadamente 0,5 Mb de secuencia de gen variable de cadena ligera k humana para reemplazar eficazmente todos los segmentos génicos Vk y Jk de ratón con la Vk humana proximal y todos los segmentos génicos Jk humanos (FIG. 2C y 2D; Tablas 2 y 4). A diferencia del método descrito en el Ejemplo 1 para el locus de la cadena pesada, la región del gen Vk de ratón completa, que contiene todos los segmentos génicos Vk y Jk, se suprimió en un proceso de tres etapas antes de que se agregara cualquier secuencia humana. En primer lugar, se introdujo un casete neo en el extremo proximal de la región variable (Etapa A, FIG. 2C). A continuación, se insertó un casete hyg en el extremo distal del locus k (Etapa B, FIG. 2C). Los sitios LoxP se ubicaron nuevamente dentro de cada casete de selección de modo que el tratamiento con Cre indujo la deleción de las 3 Mb restantes de la región Vk de ratón junto con ambos genes de resistencia (Etapa C, FIG. 2C).

Se insertó un fragmento genómico humano de aproximadamente 480 kb de tamaño que contenía la región variable de la cadena ligera k de inmunoglobulina completa en cuatro etapas secuenciales (FIG. 2D; Tablas 2 y 4), con hasta 150 kb de secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina humana insertada en una única etapa, utilizando métodos similares a los empleados para la cadena pesada (véase el Ejemplo 1). El gen de resistencia a higromicina final se eliminó mediante expresión transitoria de FLPe. Al igual que con la cadena pesada, los clones de células ES dirigidos se evaluaron para determinar la integridad de todo el inserto humano, el cariotipo normal y el potencial de la línea germinal después de cada etapa. Se generaron ratones homocigotos para cada uno de los alelos de la cadena ligera k y se encontró que eran sanos y de apariencia normal.

Tabla 4

Ejemplo II

Generación de Ratones Completamente Humanizados mediante la Combinación de Múltiples Alelos de Inmunoglobulina Humanizada

En varios puntos, las células ES que llevan una porción de los repertorios variables de cadena pesada o de cadena ligera k de inmunoglobulina humana como se describe en el Ejemplo 1 se microinyectaron y los ratones resultantes se aparearon para crear múltiples versiones de ratones humanizados v El OCIMMUNE® con fracciones progresivamente más grandes de los repertorios de inmunoglobulinas de línea germinal humana (Tabla 5; FIG. 5A y 5B). Los ratones humanizados VELOCIMMUNE® 1 (V1) poseen 18 segmentos génicos Vh humanos y todos los segmentos génicos Dh y Jh humanos combinados con 16 segmentos génicos Vk humanos y todos los segmentos génicos Jk humanos. Los ratones humanizados VELOCIMMUNE® 2 (V2) y los ratones humanizados VELOCIMMUNE® (V3) han aumentado los repertorios variables que llevan un total de 39 Vh y 30 Vk, y 80 Vh y 40 Vk, respectivamente. Debido a que las regiones genómicas que codifican los segmentos génicos Vh, Dh y Jh de ratón, y los segmentos génicos Vk y Jk, se han reemplazado completamente, los anticuerpos producidos por cualquier versión de ratones humanizados VELOCIMMUNE® contienen regiones variables humanas unidas a regiones constantes de ratón. Los locus de cadena ligera A de ratón permanecen intactos en todas las versiones de ratones humanizados VELOCIMMUNE® y sirven como un comparador para la eficacia de la expresión de los diversos locus de cadena ligera k VELOCIMMUNE® humanizados.

Se generaron ratones doblemente homocigotos tanto para la humanización de la cadena pesada como de la cadena ligera k de inmunoglobulina a partir de un subconjunto de los alelos descritos en el Ejemplo 1. Todos los genotipos observados durante el curso de la reproducción para generar los ratones doblemente homocigotos se produjeron en aproximadamente proporciones Mendelianas. La progenie masculina homocigota para cada uno de los alelos de cadena pesada humana mostró una fertilidad reducida. La fertilidad reducida fue el resultado de la pérdida de la actividad ADAM6 de ratón. El locus del gen variable de cadena pesada del ratón contiene dos genes ADAM6 funcionales embebidos (ADAM6a y ADAM6b). Durante la humanización del locus de gen variable de cadena pesada de ratón, la secuencia genómica humana insertada contenía un pseudogén ADAM6. La ADAM6 de ratón puede ser necesaria para la fertilidad y, por lo tanto, la falta de genes de ADAM6 de ratón en locus de genes variables de cadena pesada humanizados podría conducir a una fertilidad reducida en estos ratones a pesar de la presencia del pseudogén humano. Los Ejemplos 7-9 describen el reemplazo preciso de los genes ADAM6 de ratón suprimidos en un locus de genes variables de cadena pesada humanizado, y la restauración de un nivel de fertilidad de tipo silvestre en ratones con un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada.

Tabla 5

Ejemplo III

Poblaciones de Linfocitos en Ratones con Genes de Inmunoglobulinas Humanizadas

Las poblaciones de linfocitos B maduros en las tres versiones diferentes de ratones VELOCIMMUNE® se evaluaron por citometría de flujo.

En resumen, se realizaron suspensiones celulares de médula ósea, bazo y timo utilizando métodos convencionales. Las células se resuspendieron a 5x105 células/ml en tampón de tinción BD Pharmingen FACS, se bloquearon con anti-CD16/32 de ratón (BD Pharmingen), se tiñeron con el cóctel apropiado de anticuerpos y se fijaron con BD CYTOFIX™, todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los sedimentos celulares finales se resuspendieron en 0,5 ml de tampón de tinción y se analizaron usando el software BD FACSCALIBUR™ y BD CELLQUEST PRO™. Todos los anticuerpos (BD Pharmingen) se prepararon en una dilución en masa/cóctel y se añadieron a una concentración final de 0,5 mg/105 células. Los cócteles de anticuerpos para la tinción de médula ósea (A-D) fueron los siguientes: A: anti-IgMb de ratón-FITC, anti-IgMa de ratón-PE, anti-CD45R(B220) de ratón-APC; B: anti-CD43(S7) de ratón-PE, anti-CD45R(B220) de ratón-APC; C: anti-CD24(HSA) de ratón-PE; anti-CD45R(B220) de ratón-APC; D: anti-BP-1 de ratón-PE, anti-CD45R(B220) de ratón-APC. Los cócteles de anticuerpos para la tinción del bazo y los ganglios linfáticos inguinales (E-H) fueron los siguientes: E: anti-IgMb de ratón-FITC, anti-IgMa de ratón-PE, anti-CD45R(B220) de ratón-APC; F: anti-Ig de ratón, cadena ligera A1, A2, A3- FITC, anti cadena ligera IgK de ratón-PE, anti-CD45R(B220) de ratón-APC; G: anti-Ly6G/C de ratón-FITC, anti-CD49b(DX5) de ratón-PE, anti-CD11b de ratón-APC; H: anti-CD4(L3T4) de ratón-FITC, anti-CD45R(B220) de ratón-PE, anti-CD8a de ratón-APC. Los resultados se muestran en la FIG. 6.

Los linfocitos aislados del bazo o ganglio linfático de ratones humanizados VELOCIMMUNE® homocigotos se tiñeron para la expresión en la superficie de los marcadores B220 e IgM y se analizaron usando citometría de flujo (FIG. 6). Los tamaños de las poblaciones de linfocitos B maduros B220+ IgM+ en todas las versiones de ratones humanizados VELOCIMMUNE® probados fueron prácticamente idénticos a los de los ratones de tipo silvestre, independientemente del número de segmentos génicos Vh que contenían. Además, los ratones que contenían locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada híbrido homocigoto, incluso aquellos con solo 3 segmentos génicos Vh, pero locus de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón normal o los ratones que contenían locus de cadena ligera k humanizada híbrido homocigoto con locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón normal, también tenían números normales de linfocitos B220+ IgM+ en sus compartimentos periféricos (no mostrado). Estos resultados indican que los locus quiméricos con segmentos de genes variables humanos y regiones constantes de ratón pueden poblar completamente el compartimento de linfocitos B maduros. Adicionalmente, el número de segmentos de genes variables en los locus de cadena pesada o de cadena ligera k, y por lo tanto la diversidad teórica del repertorio de anticuerpos, no se correlaciona con la capacidad de generar poblaciones de linfocitos B maduros de tipo silvestre. Por el contrario, los ratones con transgenes de inmunoglobulinas humanas totalmente integrados al azar y locus de inmunoglobulinas de ratón inactivados tienen un número reducido de linfocitos B en estos compartimentos, y la gravedad del déficit depende del número de segmentos de genes variables incluidos en el transgén (Green, L.L., y Jakobovits, A. (1998) Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes, J Exp Med 188:483-495). Esto demuestra que la estrategia de "humanización genética in situ" da como resultado un resultado funcional fundamentalmente diferente que los transgenes integrados aleatoriamente logrados en el enfoque de "supresión génica más transgénica".

Exclusión Alélica y Elección de Locus.

Se examinó la capacidad de mantener la exclusión alélica en ratones heterocigotos para diferentes versiones del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada.

La hum anización de los locus de inm unoglobulinas se realizó en una línea F 1 E S (F 1H 4 (V alenzuela e t al., 2003)), derivada de em briones heterocigotos 129 S 6 /S v E v T a c y C 57 B L /6 N T a c . Las se cu en cias de genes variab les de la línea germinal de la cadena pesada hum ana están dirigidas al alelo 129 S 6 , que porta el haplotipo IgMa, m ientras que el alelo C 576 B L /6 N de ratón no modificado lleva el haplotipo IgMb. E stas form as a lé licas de IgM se pueden distinguir por citometría de flujo utilizando anticuerpos específicos para los polimorfismos encontrados en los alelos IgMa o IgMb. Com o se muestra en la F IG . 6 (fila inferior), los linfocitos B identificados en ratones heterocigotos para cada versión del locus de cadena pesada hum anizada solo expresan un único alelo, ya se a IgMa (el alelo hum anizado) o IgMb (el alelo de tipo silvestre). Esto dem uestra que los m ecanism os im plicados en la exclusión alélica están intactos en ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® . A dem ás, el número relativo de linfocitos B positivos para el alelo hum anizado (IgMa) es aproxim adam ente proporcional al número de segm entos génicos V h presentes. El locus de inm unoglobulina hum anizada se expresa en aproxim adam ente el 30 % de los linfocitos B en ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® 1 heterocigotos, que tienen 18 segm entos génicos V h hum anos, y en el 50 % de los linfocitos B en ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® 2 y 3 heterocigotos (no se muestra), con 39 y 80 segm entos génicos V h hum anos, respectivam ente. De forma notable, la proporción de célu las que expresan el alelo de ratón hum anizado frente al de tipo silvestre (0,5 para ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® 1 y 0,9 para los ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® 2) es m ayor que la proporción del número de segm entos de genes variables contenidos en los locus hum anizados frente a los silvestre (0,2 para ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® 1 y 0,4 para ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® 2). Esto puede indicar que la probabilidad de elección de alelo es intermedia entre una elección aleatoria de uno u otro crom osom a y una elección aleatoria de cualquier R S S (secuencia de señal de recom binación, por su s sig las en inglés) de segm ento V particular. Adicionalm ente, puede haber una fracción de linfocitos B, pero no en todos, en donde un alelo se vuelve accesib le para la recom binación, completa el proceso y cierra la recom binación antes de que el otro alelo se vuelva accesible. A dem ás, la distribución uniforme de las célu las que tienen IgM de superficie (slgM) derivadas del locus de cadena pesada hum anizada híbrido o del locus de cadena pesada de ratón de tipo silvestre es evidencia de que el locus híbrido está operando a un nivel normal. Por el contrario, los transgenes de inm unoglobulinas hum anas integrados al azar compiten débilmente con los locus de inm unoglobulinas de ratón de tipo silvestre (Bruggem ann, M., e t al. (1989) A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice. P n A S 86, 6709 -6713 ; Green e t al. (1994); Tuaillon, N. e t al. (1993) Hum an immunoglobulin heavy-chain m inilocus recombination in transgenic mice: gene-segm ent use in mu and gam m a transcripts, Proc Natl A cad S c i U S A 90 :3720 -3724 ). Esto dem uestra adem ás que las inm unoglobulinas producidas por los ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® son funcionalm ente diferentes de las producidas por transgenes integrados aleatoriam ente en ratones producidos mediante enfoques de "supresión génica m ás transgénica".

Los polimorfismos de las regiones C k no están disponibles en 129 S 6 o C 57 B L /6 N para exam inar la exclusión alélica de locus de cadena ligera k hum anizada frente a no hum anizada. S in embargo, todos los ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® poseen locus de cadena ligera A de ratón de tipo silvestre, por lo tanto, es posible observar si el reordenamiento y la expresión de los locus de cadena ligera k hum anizada pueden prevenir la expresión de cadena ligera A de ratón. La proporción del número de célu las que expresan la cadena ligera k hum anizada con respecto al número de célu las que expresan la cadena ligera A de ratón no cam bió relativamente en los ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® en com paración con los ratones de tipo silvestre, independientem ente del número de segm entos génicos V k hum anos insertados en el locus de la cadena ligera k (F IG . 6, tercera fila desde arriba). A dem ás, no hubo aumento en el número de célu las dobles positivas (k m ás A), lo que indica que la recom binación productiva en los locus de la cadena ligera k híbrida da como resultado la supresión apropiada de la recom binación de los locus de la cadena ligera A de ratón. Por el contrario, ratones que contienen transgenes de cadena ligera k integrados aleatoriam ente con locus de cadena ligera k de ratón inactivados, pero con locus de cadena ligera A de ratón de tipo silvestre exhiben proporciones A/k aum entadas drásticam ente (Jakobovits, 1998), lo que implica que los transgenes de cadena ligera k introducidos no funcionan bien en tales ratones. Esto dem uestra aún m ás los diferentes resultados funcionales observados en inm unoglobulinas producidas por ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® en com paración con las producidas por ratones "nuligénicos m ás transgénicos".

Desarrollo de Linfocitos B.

Debido a que las poblaciones de linfocitos B m aduros en ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® se parecen a las de los ratones de tipo silvestre (descritos anteriormente), es posible que los defectos en la diferenciación tem prana de linfocitos B se com pensen con la expansión de las poblaciones de linfocitos B maduros. La s d iversas etapas de la diferenciación de linfocitos B se exam inaron mediante a nális is de poblaciones de linfocitos B utilizando citometría de flujo. La Ta b la 6 expone la proporción de la fracción de célu las en cada linaje de linfocitos B definidos por F A C , usando m arcadores específicos de la superficie celular, en ratones hum anizados V E L O C IM M U N E ® en com paración con los com pañeros de cam ada de tipo silvestre.

El desarrollo temprano de linfocitos B se produce en la médula ósea, y las diferentes etapas de la diferenciación de linfocitos B se caracterizan por cam bios en los tipos y cantidades de expresión de m arcadores de superficie celular. E stas diferencias en la expresión de la superficie se correlacionan con los cam bios m oleculares que se producen en los locus de inm unoglobulinas dentro de la célula. La transición de linfocitos pro-B a pre-B requiere el reordenamiento y la expresión exitosos de la proteína de cadena pesada funcional, m ientras que la transición de la etapa pre B a la etapa B m adura se rige por el reordenamiento y la expresión correctos de una cadena ligera k o A. Por lo tanto, la transición ineficaz entre las etapas de diferenciación de linfocitos B puede detectarse mediante cam bios en las poblaciones relativas de linfocitos B en una etapa dada.

Tabla 6

No se observaron defectos importantes en la diferenciación de linfocitos B en ninguno de los ratones humanizados VELOCIMMUNE®. La introducción de segmentos de genes de cadena pesada humana no parece afectar la transición pro-B a pre-B, y la introducción de segmentos de genes de cadena ligera k humana no afecta la transición de pre-B a B en ratones humanizados VELOCIMMUNE®. Esto demuestra que las moléculas de inmunoglobulinas "quiméricas inversas" que poseen regiones variables humanas y constantes de ratón funcionan normalmente en el contexto de la señalización de linfocitos B y de las moléculas de correceptoras que conducen a la diferenciación de linfocitos B apropiada en un entorno de ratón. Por el contrario, el equilibrio entre las diferentes poblaciones durante la diferenciación de linfocitos B se altera en diferentes grados en ratones que contienen transgenes de inmunoglobulinas integrados aleatoriamente y locus de cadena pesada o cadena ligera k endógenos inactivados (Green y Jakobovits (1998)).

Ejemplo IV

Repertorio de Genes Variables en Ratones con Inmunoglobulinas Humanizadas

El uso de segmentos de genes variables humanos en el repertorio de anticuerpos humanizados de ratones humanizados VELOCIMMUNE® se analizó por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) de regiones variables humanas de múltiples fuentes, incluyendo esplenocitos y células de hibridoma. Se determinaron la secuencia de la región variable, el uso del segmento génico, la hipermutación somática y la diversidad de unión de los segmentos génicos de la región variable reordenados.

En resumen, el ARN total se extrajo de 1 x 107-2 x 107 esplenocitos o aproximadamente 104-105 células de hibridoma usando TRIZOL™ (Invitrogen) o el kit Qiagen RNEASY™ Mini (Qiagen) y se cebó con cebadores específicos de región constante de ratón usando el sistema de RT-PCR en una etapa SUPERSCRIPT™ III (Invitrogen). Las reacciones se llevaron a cabo con 2-5 pl de ARN de cada muestra usando los cebadores específicos constantes 3' mencionados anteriormente emparejados con cebadores líderes agrupados para cada familia de regiones variables humanas tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera k, por separado. Los volúmenes de reactivos y cebadores, y las condiciones de RT-PCR/PCR se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los cebadores se basaron en múltiples fuentes (Wang, X. and Stollar, B.D. (2000) Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR, J Immunol Methods 244:217-225; Ig-primer sets, Novagen). Cuando sea adecuado, las reacciones de PCR secundarias anidadas se llevaron a cabo con cebadores de regiones marco conservadas específicos de familia agrupados y el mismo cebador específico constante de inmunoglobulina de ratón 3' usado en la reacción primaria. Las alícuotas (5 pl) de cada reacción se analizaron por electroforesis en agarosa y los productos de reacción se purificaron a partir de agarosa usando un kit de extracción en gel MONTAGE™ (Millipore). Los productos purificados se clonaron utilizando el sistema de clonación TOPO™ TA (Invitrogen) y se transformaron en células DH10p de E. coli por electroporación. Se seleccionaron clones individuales de cada reacción de transformación y se cultivaron en cultivos de caldo LB de 2 ml con selección de antibióticos durante la noche a 37 °C. El ADN plasmídico se purificó de cultivos bacterianos mediante un enfoque basado en un kit (Qiagen).

Uso de Genes Variables de Inmunoglobulinas.

El ADN plasmídico de los clones tanto de cadena pesada como de cadena ligera k se secuenciaron con cebadores inversos T7 o M13 en el analizador genético ABI 3100 (Applied Biosystems). Los datos de secuencia sin procesar se importaron a SEQUENCHER™ (v4.5, Gene Codes). Cada secuencia se ensambló en contigs y se alineó con secuencias de inmunoglobulinas humanas usando la función de búsqueda IMGT V-Quest (Brochet, X. et al. (2008) IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic Acids Res 36:W503-508) para identificar el uso segmentos humanos Vh, Dh, Jh y Vk, Jk. Las secuencias se compararon con las secuencias de la línea germinal para el análisis de hipermutación somática y unión de recombinación.

Se generaron ratones a partir de células ES que contenían la modificación inicial de la cadena pesada (alelo híbrido 3hVH-CRE, parte inferior de la figura 2A) mediante complementación con RAG (Chen, J. et al. (1993) RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development, Proc Natl Acad Sci USA 90:45284532) y el ADNc se preparó a partir de ARN de esplenocitos. El ADNc se amplificó usando conjuntos de cebadores (descritos anteriormente) específicos para el ARNm predicho de la cadena pesada quimérica que surgiría por recombinación V(D)J dentro de los segmentos de genes humanos insertados y el posterior corte y empalme a dominios constantes de IgM o IgG de ratón. Las secuencias derivadas de estos clones de ADNc (no mostrado) demostraron que se había producido una recombinación V(D)J adecuada dentro de las secuencias de genes variables humanos, que los segmentos génicos V(D)J humanos reordenados se cortaron y empalmaron adecuadamente en marco a dominios constantes de ratón y que se había producido recombinación de cambio de clase. Se realizó un análisis de secuencia adicional de productos de ARNm de locus de inmunoglobulinas híbridos posteriores.

En un experimento similar, los linfocitos B de ratones no inmunizados de tipo silvestre y VELOCIMMUNE® humanizados se separaron por citometría de flujo basándose en la expresión superficial de B220 e IgM o IgG. Las células B220+ IgM+ o IgG+ (slgG+) de superficie se agruparon y se obtuvieron las secuencias Vh y Vk después de la amplificación por RT-PCR y clonación (descrita anteriormente). Se registró el uso representativo de genes en un conjunto de ADNc amplificados por RT-PCR de ratones humanizados VELOCIMMUNE® 1(Tabla 7) y ratones humanizados VELOCIMMUNE® 3 (Tabla 8) sin inmunizar (* RSS defectuosa; f ausente o pseudogén).

Tabla 7

V ^hObservada D^hObservada V k Observada

V ^hObservada D^hObservada V k Observada

(continuación)

V ^hObservada D^hObservada V k Observada

Como se muestra en las Tablas 7 y 8, se utilizan casi todos los segmentos génicos Vh, Dh, Jh, Vk y Jk humanos funcionales. De los segmentos de genes variables funcionales descritos pero no detectados en los ratones VELOCIMMUNE® humanizados de este experimento, se ha informado que varios poseen secuencias de señal de recombinación defectuosas (RSS) y, por lo tanto, no se espera que se expresen (Feeney, AJ. (2000) Factors that influence formation of B cell repertoire. Immunol Res 21:195-202). El análisis de varios conjuntos diferentes de secuencias de inmunoglobulinas de varios ratones VELOCIMMUNE® humanizados, aislados de repertorios tanto no tratados como inmunizados, ha mostrado el uso de estos segmentos génicos, aunque a frecuencias más bajas (datos no mostrados). Los datos agregados de uso de genes han demostrado que todos los segmentos génicos VH, DH, JH, Vk y Jk humanos funcionales contenidos en ratones VELOCIMMUNE® humanizados se han observado en varios repertorios no tratados e inmunizados (datos no mostrados). Aunque el segmento génico Vh7-81 humano se ha identificado en el análisis de las secuencias del locus de cadena pesada humana (Matsuda, F. et al. (1998) The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus, J Exp Med 188:2151-2162), no está presente en los ratones VELOCIMMUNE® humanizados como se confirma mediante la resecuenciación de todo el genoma de ratón VELOCIMMUNE® 3 humanizado.

Se sabe que las secuencias de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos muestran una variabilidad excepcional, especialmente en segmentos de polipéptidos cortos dentro del dominio variable reordenado. Estas regiones, conocidas como regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR) crean el sitio de unión para el antígeno en la estructura de la molécula de anticuerpo. Las secuencias polipeptídicas intermedias se denominan regiones marco conservadas (FR). Existen tres CDR (CDR1, CDR2, CDR3) y 4 FR (FR1, FR2, FR3, FR4) tanto en las cadenas pesadas como en las ligeras. Una CDR, CDR3, es única porque esta CDR se crea mediante la recombinación de los segmentos génicos tanto Vh, Dh y Jh como Vk y Jk y genera una cantidad significativa de diversidad de repertorio antes de encontrar el antígeno. Esta unión es imprecisa debido tanto a las deleciones de nucleótidos a través de la actividad de exonucleasas como a las adiciones no codificadas por plantilla a través de la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y, por lo tanto, permite que surjan secuencias nuevas del proceso de recombinación. Aunque las FR pueden mostrar una mutación somática sustancial debido a la alta mutabilidad de la región variable en su conjunto, la variabilidad, sin embargo, no se distribuye uniformemente a través de la región variable. Las CDR son regiones concentradas y localizadas de alta variabilidad en la superficie de la molécula de anticuerpo que permiten la unión al antígeno. Las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos seleccionados de ratones VELOCIMMUNE® humanizados alrededor de la unión CDR3 que demuestran diversidad de unión se muestran en la FIG. 7A y 7B, respectivamente.

Como se muestra en la FIG: 7A, se observan adiciones de nucleótidos no codificados por plantilla (adiciones N) en la unión Vh-Dh y Dh-Jh en anticuerpos de ratones VELOCIMMUNE® humanizados, lo que indica la función adecuada de TdT con los segmentos humanos. Los criterios de valoración de los segmentos Vh, Dh y Jh en relación con sus homólogos de la línea germinal indican que también se ha producido actividad exonucleasa. A diferencia del locus de cadena pesada, los reordenamientos de la cadena ligera k humana muestran poca o ninguna adición de TdT en CDR3, que se forma por la recombinación de los segmentos Vk y Jk (FIG. 7B). Esto se espera debido a la falta de expresión de TdT en ratones durante los reordenamientos de la cadena ligera en la transición de linfocitos preB a B. La diversidad observada en la CDR3 de las regiones Vk humanas reordenadas se introduce predominantemente a través de la actividad exonucleasa durante el evento de recombinación.

Hipermutación somática.

Se añade diversidad adicional a las regiones variables de los genes de inmunoglobulina reordenados durante la reacción del centro germinal mediante un proceso denominado hipermutación somática. Los linfocitos B que expresan regiones variables mutadas somáticamente compiten con otros linfocitos B por el acceso al antígeno presentado por las células dendríticas foliculares. Esos linfocitos B con mayor afinidad por el antígeno se expandirán aún más y experimentarán un cambio de clase antes de salir a la periferia. Por lo tanto, los linfocitos B que expresan isotipos cambiados generalmente han encontrado antígeno y han experimentado reacciones en el centro germinal y tendrán un mayor número de mutaciones en relación con los linfocitos B no tratados. Adicionalmente, se esperaría que las secuencias de región variable de linfocitos B slgM+ predominantemente sin tratar tuvieran relativamente menos mutaciones que las secuencias variables de linfocitos B slgG+ que han experimentado selección por antígeno.

Las secuencias de clones Vh o Vk aleatorios de linfocitos B slgM+ o slgG+ de ratones VELOCIMMUNE® humanizados no inmunizados o de linfocitos B slgG+ de ratones inmunizados se compararon con sus segmentos de genes variables de la línea germinal y se anotaron los cambios relativos a la secuencia de la línea germinal. Las secuencias de nucleótidos resultantes se tradujeron in silico y también se anotaron mutaciones que conducen a cambios de aminoácidos. Los datos se recopilaron de todas las regiones variables y se calculó el cambio porcentual en una posición dada (FIG. 8).

Tal como se muestra en la FIG. 8, las regiones variables de cadena pesada humana derivadas de linfocitos B slgG+ de ratones VELOCIMMUNE® humanizados no inmunizados muestran muchos más nucleótidos en relación con los linfocitos B slgM+ de los mismos grupos de esplenocitos, y las regiones variables de cadena pesada derivadas de ratones inmunizados muestran aún más cambios. El número de cambios aumenta en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en relación con las regiones marco conservadas, lo que indica la selección por antígeno. Las secuencias de aminoácidos correspondientes de las regiones variables de cadena pesada humana también muestran un número significativamente mayor de mutaciones en IgG frente a IgM e incluso más en IgG inmunizada. Estas mutaciones nuevamente parecen ser más frecuentes en las CDR en comparación con las secuencias marco conservadas, lo que sugiere que los anticuerpos se seleccionaron con antígeno in vivo. Se observa un aumento similar en el número de mutaciones de nucleótidos y aminoácidos en las secuencias Vk derivadas de linfocitos B IgG+ de ratones inmunizados.

El uso de genes y la hipermutación somática observada en ratones VELOCIMMUNE® humanizados demuestran que esencialmente todos los segmentos génicos presentes son capaces de reordenarse para formar anticuerpos quiméricos inversos completamente funcionales en estos ratones. Adicionalmente, los anticuerpos derivados de ratones VELOCIMMUNE® humanizados participan plenamente en el sistema inmunitario del ratón para someterse a selección y maduración por afinidad para crear anticuerpos humanos completamente maduros que pueden neutralizar eficazmente su antígeno diana. Los ratones VELOCIMMUNE® humanizados pueden generar respuestas inmunitarias fuertes a múltiples clases de antígenos que dan como resultado el uso de una amplia gama de anticuerpos humanos que son tanto de alta afinidad como adecuados para uso terapéutico (datos no mostrados).

Ejemplo V

Análisis de la Estructura Linfoide y de los Isotipos Séricos

Las estructuras macroscópicas del bazo, los ganglios linfáticos inguinales, las placas de Peyer y el timo de muestras de tejido de ratones de tipo silvestre o VELOCIMMUNE® humanizados teñidos con H&E (hematoxilina y eosina) se examinaron mediante microscopía óptica. Los niveles de isotipos de inmunoglobulinas en suero recogidos de ratones de tipo silvestre y VELOCIMMUNE® humanizados se analizaron usando la tecnología LUMINEX™.

Estructura de los Órganos Linfoides.

La estructura y la función de los tejidos linfoides dependen en parte del desarrollo adecuado de las células hematopoyéticas. Un defecto en el desarrollo o la función de los linfocitos B puede mostrarse como una alteración en la estructura de los tejidos linfoides. Tras el análisis de las secciones de tejido teñidas, no se identificaron diferencias significativas en la apariencia de los órganos linfoides secundarios entre ratones de tipo silvestre y VELOCIMMUNE® humanizados (datos no mostrados).

Niveles de Inmunoglobulinas Séricas.

El nivel de expresión de cada isotipo es similar en ratones de tipo silvestre y VELOCIMMUNE® humanizados (FIG.

9A, 9B y 9C). Esto demuestra que la humanización de los segmentos de genes variables no tuvo ningún efecto adverso aparente sobre el cambio de clase o la expresión y secreción de inmunoglobulinas y, por lo tanto, aparentemente mantiene todas las secuencias endógenas de ratón necesarias para estas funciones.

Ejemplo VI

Inmunización y Producción de Anticuerpos en Ratones con Inmunoglobulinas Humanizadas

Se inmunizaron diferentes versiones de ratones VELOCIMMUNE® humanizados con antígeno para examinar la respuesta humoral a la exposición con antígeno extraño.

Inmunización y Desarrollo de Hibridoma.

Los ratones VELOCIMMUNE® humanizados y de tipo silvestre pueden inmunizarse con un antígeno en forma de proteína, ADN, una combinación de ADN y proteína, o células que expresan el antígeno. Los animales generalmente se refuerzan cada tres semanas por un total de dos o tres veces. Después de cada refuerzo con antígeno, se recogen muestras de suero de cada animal y se analizan para determinar las respuestas de anticuerpos específicos de antígeno mediante determinación del título sérico. Antes de la fusión, los ratones recibieron un refuerzo final previo a la fusión de 5 |jg de proteína o ADN, según se desee, mediante inyecciones intraperitoneales y/o intravenosas. Los esplenocitos se recogen y fusionan a células de mieloma Ag8.653 en una cámara de electrofusión de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante (Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Bumie, MD). Diez días después del cultivo, los hibridomas se seleccionan para determinar la especificidad del antígeno usando un ensayo ELISA (Harlow, E. y Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Press, Nueva York). Alternativamente, los linfocitos B específicos de antígeno se aíslan directamente de ratones VELOCIMMUNE® humanizados inmunizados y se exploran utilizando técnicas convencionales, incluidas las descritas en el presente documento, para obtener anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés.

Determinación de Títulos Séricos.

Para controlar la respuesta del antígeno anti suero en animales, se recogen muestras de suero aproximadamente 10 días después de cada refuerzo y se determinan los títulos usando ELISA específico de antígeno. En resumen, las placas Nunc MAXISORP™ de 96 pocillos se recubren con antígeno 2 jg/m l durante la noche a 4 °C y se bloquean con albúmina de suero bovino (Sigma, St. Louis, MO). Se permite que las muestras de suero en diluciones en serie de 3 veces se unan a las placas durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan después con PBS que contiene Tween-20 al 0,05% y la IgG unida se detecta usando anti-Fc de ratón de cabra conjugado con HRP (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA) para el título de IgG total, o anticuerpos policlonales específicos de isotipo o de cadena ligera marcados con biotina (SouthernBiotech Inc.) para títulos específicos de isotipo, respectivamente. Para los anticuerpos marcados con biotina, después del lavado de la placa, se añade estreptavidina conjugada con HRP (Pierce, Rockford, IL). Todas las placas se desarrollan utilizando sustratos colorimétricos como BD OPTEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Después de detener la reacción con ácido fosfórico 1 M, se registran las absorciones ópticas a 450 nm y los datos se analizan utilizando el software PRISM™ de Graph Pad. Las diluciones requeridas para obtener dos veces la señal de fondo se definen como título.

En un experimento, los ratones VELOCIMMUNE® humanizados se inmunizaron con el receptor de interleucina-6 humano (hIL-6R). Un conjunto representativo de títulos séricos para ratones VELOCIMMUNE® y de tipo silvestre inmunizados con hIL-6R se muestra en las FIG. 10A y 10B.

Los ratones VELOCIMMUNE® humanizados y de tipo silvestre montaron respuestas fuertes hacia la IL-6R con intervalos de títulos similares (FIG. 10A). Varios ratones de las cohortes de VELOCIMMUNE® humanizados y de tipo silvestre alcanzaron una respuesta máxima después de un único refuerzo con antígeno. Estos resultados indican que la fuerza de respuesta inmunitaria y la cinética de este antígeno fueron similares en los ratones VELOCIMMUNE® humanizados y de tipo silvestre. Estas respuestas de anticuerpos específicos de antígeno se analizaron adicionalmente para examinar los isotipos particulares de los anticuerpos específicos de antígeno encontrados en los sueros. Ambos grupos VELOCIMMUNE® humanizados y de tipo silvestre provocaron predominantemente una respuesta a IgG1 (FIG. 10B), lo que sugiere que el cambio de clase durante la respuesta humoral es similar en ratones de cada tipo.

Determinación de la Afinidad de Unión del Anticuerpo al Antígeno en Solución.

Un ensayo de competencia en solución basado en ELISA está diseñado generalmente para determinar la afinidad de unión a antígeno del anticuerpo.

En resumen, los anticuerpos en medio acondicionado se mezclan previamente con diluciones en serie de proteína antigénica que varían de 0 a 10 mg/ml. Las soluciones de la mezcla de anticuerpo y antígeno se incuban después durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente para alcanzar los equilibrios de unión. Las cantidades de anticuerpo libre en las mezclas se miden después usando un ELISA sándwich cuantitativo. Las placas MAXISORB™ de noventa y seis pocillos (VWR, West Chester, PA) se recubren con 1 pg/ml de proteína antigénica en solución de PBS durante la noche a 4 °C seguido de un bloqueo inespecífico con BSA. Las soluciones de la mezcla de anticuerpo antígeno se transfieren a estas placas seguido de una incubación de una hora. Las placas se lavan después con tampón de lavado y los anticuerpos unidos a la placa se detectaron con un reactivo de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Jackson Immuno Research Lab) y se desarrollaron usando sustratos colorimétricos tal como BD OPTEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Después de detener la reacción con ácido fosfórico 1 M, se registran las absorciones ópticas a 450 nm y los datos se analizan utilizando el software PRISM™ de Graph Pad. La dependencia de las señales de las concentraciones de antígeno en solución se analiza con un análisis de ajuste de 4 parámetros y se informa como CI^{5 0}, la concentración de antígeno requerida para lograr una reducción del 50% de la señal de las muestras de anticuerpos sin la presencia de antígeno en solución.

En un experimento, los ratones VELOCIMMUNE® humanizados se inmunizaron con hIL-6R (como se describe anteriormente). Las FIG. 11A y 11B muestran un conjunto representativo de mediciones de afinidad para anticuerpos anti-hIL6R de ratones VELOCIMMUNE® humanizados y de tipo silvestre.

Después de que los ratones inmunizados reciban un tercer refuerzo de antígeno, los títulos séricos se determinan mediante ELISA. Los esplenocitos se aíslan de cohortes de ratones de tipo silvestre y VELOCIMMUNE® humanizados seleccionados y se fusionan con células de mieloma Ag8.653 para formar hibridomas y se cultivan bajo selección (como se describe anteriormente). De un total de 671 hibridomas anti-IL-6R producidos, se descubrió que 236 expresaban anticuerpos específicos de antígeno. El medio recolectado de los pocillos positivos para antígeno se usó para determinar la afinidad del anticuerpo de unión al antígeno usando un ELISA de competencia en solución. Los anticuerpos derivados de ratones VELOCIMMUNE® humanizados muestran una amplia gama de afinidad en la unión al antígeno en solución (FIG. 11A). Asimismo, se encontró que 49 de los 236 hibridomas anti-IL-6R bloqueaban la unión de IL-6 al receptor en un bioensayo in vitro (datos no mostrados). Adicionalmente, estos 49 anticuerpos de bloqueo anti-IL-6R mostraron una gama de afinidades en solución altas similares a las de los anticuerpos de bloqueo derivados de la inmunización paralela de ratones de tipo silvestre (FIG. 11B).

Ejemplo VII

Construcción de un Vector de Direccionamiento de ADAM6 de Ratón

Se construyó un vector de direccionamiento para la inserción de genes ADAM6a y ADAM6b de ratón en un locus de cadena pesada humanizado usando la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (supra) para modificar un Cromosoma Bacteriano Artificial (BAC) 929d24 obtenido del Dr. Fred Alt (Universidad de Havard). Se modificó por ingeniería el ADN de BAC 929d24 para contener fragmentos genómicos que contienen los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón y un casete de higromicina para la deleción dirigida de un pseudogén ADAM6 humano (hADAM6^) ubicado entre los segmentos génicos Vh1-2 y Vh6-1 humanos de un locus de cadena pesada humanizado (FIG. 12).

En primer lugar, un fragmento genómico que contiene el gen ADAM6b de ratón, 800 pb de secuencia cadena arriba (5 ') y 4800 pb de secuencia cadena abajo (3') se subclonó a partir del clon 929d24 BAC. Un segundo fragmento genómico que contiene el gen ADAM6a de ratón, 300 pb de secuencia cadena arriba (5 ') y 3400 pb de secuencia cadena abajo (3'), se subclonó por separado a partir del clon 929d24 BAC. Los dos fragmentos genómicos que contienen los genes ADAM6b y ADAM6a de ratón se unieron a un casete de higromicina flanqueado por sitios de recombinación Frt para crear el vector de direccionamiento (Vector de Direccionamiento de ADAM6 de ratón, FIG. 20; SEQ ID NO: 3). Se modificaron por ingeniería diferentes sitios de enzimas de restricción en el extremo 5' del vector de direccionamiento siguiendo el gen ADAM6b de ratón y en el extremo 3' siguiendo el gen ADAM6a de ratón (parte inferior de la FIG. 12) para la unión al locus de cadena pesada humanizado.

Se realizó una modificación por separado en un clon BAC que contenía un reemplazo del locus de cadena pesada de ratón con el locus de cadena pesada humana, incluido el pseudogén ADAM6 humano ubicado entre los segmentos génicos Vh1-2 y Vh6-1 humanos del locus humanizado para la unión posterior del vector de direccionamiento de ADAM6 de ratón (FIG. 13).

En resumen, se modificó por ingeniería un casete de neomicina flanqueado por sitios de recombinación loxP para contener brazos de homología que contengan secuencia genómica humana en las posiciones 3' del segmento génico Vh1-2 humano (5' con respecto a hADAM6^) y 5' del segmento génico Vh6-1 humano (3' con respecto a hADAM6^; véase en el medio de la FIG. 13). La ubicación del sitio de inserción de esta construcción de direccionamiento fue de aproximadamente 1,3 kb 5' y 350 pb 3' del pseudogén ADAM6 humano. La construcción de direccionamiento también incluyó los mismos sitios de restricción que el vector de direccionamiento ADAM6 de ratón para permitir la unión de BAC posterior entre el clon BAC modificado que contiene la deleción del pseudogén ADAM6 humano y el vector de direccionamiento de ADAM6 de ratón.

Después de la digestión del ADN de BAC derivado de ambas construcciones, los fragmentos genómicos se unieron para construir un clon BAC modificado por ingeniería que contiene un locus de cadena pesada humanizado que contiene una secuencia genómica colocada ectópicamente que comprende secuencias de nucleótidos ADAM6a y ADAM6b de ratón. La construcción de direccionamiento final para la deleción de un gen ADAM6 humano dentro de un locus de cadena pesada humanizado y la inserción de secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón en células ES contenidas, de 5' a 3', un fragmento genómico 5' que contenía 13 kb de secuencia genómica humana 3' del segmento génico Vh1-2 humano, 800 pb de secuencia genómica de ratón cadena abajo del gen ADAM6b de ratón, el gen ADAM6b de ratón, 4800 pb de secuencia genómica cadena arriba del gen ADAM6b de ratón, un sitio 5 ' Frt, un casete de higromicina, un sitio 3 ' Frt, 300 pb de secuencia genómica de ratón cadena abajo del gen ADAM6a de ratón, el gen ADAM6a de ratón, 3400 pb de secuencia genómica de ratón cadena arriba del gen ADAM6a del ratón, y un fragmento genómico 3' que contiene 30 kb de secuencia genómica humana 5' del segmento del gen Vh6-1 humano (parte inferior de la FIG. 13).

El clon BAC modificado por ingeniería (descrito anteriormente) se usó para electroporar células ES de ratón que contenían un locus de cadena pesada humanizado para crear células ES modificadas que comprenden una secuencia genómica de ratón colocada ectópicamente que comprende secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón dentro de un locus de cadena pesada humanizado. Las células ES positivas que contienen el fragmento genómico ectópico de ratón dentro del locus de la cadena pesada humanizada se identificaron mediante un ensayo de PCR cuantitativa utilizando sondas TAQMAN™ (Lie, Y.S. y Petropoulos, C.J. (1998) Advances in quantitative PCR technology: 5'nuclease assays. Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48). Las regiones cadena arriba y cadena abajo fuera de la porción modificada del locus de la cadena pesada humanizada se confirmaron mediante PCR usando cebadores y sondas ubicadas dentro de la región modificada para confirmar la presencia de la secuencia genómica ectópica de ratón dentro del locus de la cadena pesada humanizada, así como el casete de higromicina. La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción cadena arriba incluyó lo siguiente, que indica la secuencia genómica de cadena pesada humana cadena arriba del punto de inserción y un sitio de restricción I-Ceu I (contenido entre paréntesis a continuación) enlazado contiguamente a la secuencia genómica de ratón presente en el punto de inserción: (CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G) GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG (SEQ ID NO: 4). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción cadena abajo en el extremo 3' de la región diana incluía lo siguiente, que indica la secuencia genómica de ratón y un sitio de restricción Pl-Sce I (contenido dentro de los paréntesis a continuación) enlazado contiguamente con la secuencia genómica de cadena pesada humana cadena abajo del punto de inserción: (AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA AAGAAGCGGG CATCTGCTGA CATGAGGGCC GAAGTCAGGC TCCAGGCAGC GGGAGCTCCA CCGCGGTGGC GCCATTTCAT TACCTCTTTC TCCGCACCCG ACATAGATAAAGCTT) ATCCCCCACC AAGCAAATCC CCCTACCTGG GGCCGAGCTT CCCGTATGTG GGAAAATGAA TCCCTGAGGT CGATTGCTGC ATGCAATGAA ATTCAACTAG (SEQ ID NO: 5).

Las células ES dirigidas anteriormente descritas se utilizaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la fase de 8 células mediante el método de ingeniería VELOCIMOUSE® (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos número 7.6598.442, 7.576.259, 7.294.754). Los ratones que llevan un locus de cadena pesada humanizado que contiene una secuencia genómica ectópica de ratón que comprende secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón se identificaron mediante genotipificación usando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., 2003) que detectó la presencia de los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón dentro de locus de cadena pesada humanizado.

Los ratones que llevan un locus de cadena pesada humanizado que contiene genes ADAM6a y ADAM6b de ratón se reproducen con una cepa de ratón supresora de FLPe (véase, por ejemplo, Rodríguez, C.I. et al. (2000) High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics 25:139-140) para eliminar cualquier casete de higromicina flanqueado por FRT introducido por el vector de direccionamiento que no se elimina, por ejemplo, en la fase de célula ES o en el embrión. Opcionalmente, el casete de higromicina se conserva en los ratones.

Las crías se genotipifican y se selecciona una cría heterocigota para un locus de cadena pesada humanizado que contiene un fragmento genómico ectópico de ratón que comprende secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón para caracterizar la expresión génica de ADAM6 de ratón y la fertilidad.

Ejemplo VIII

Caracterización de Ratones de Rescate de ADAM6

Citometría de Flujo.

T res ratones de 25 semanas de edad homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y ligera k humana (H/k) y tres ratones de 18-20 semanas de edad homocigotos para la cadena pesada humana y ligera k humana que tiene el fragmento genómico ectópico de ratón que codifica los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón dentro de ambos alelos del locus de cadena pesada humana (H/k-A6) se sacrificaron para la identificación y análisis de poblaciones de células linfocitarias por FAC sobre el sistema BD LSR II (Bd Bioscience). Los linfocitos se seleccionaron por linajes celulares específicos y se analizaron para la progresión a través de varias etapas de desarrollo de linfocitos B. Los tejidos recogidos de los animales incluyeron sangre, bazo y médula ósea. Se recogió sangre en tubos de BD microtainer con EDTA (BD Biosciences). Se extrajo médula ósea de fémures mediante un lavado abundante con medio RPMI completo suplementado con suero de ternera fetal, piruvato de sodio, HEPES, 2-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales y gentamicina. Los glóbulos rojos de las preparaciones de sangre, bazo y médula ósea se lisaron con un tampón de lisis basado en cloruro de amonio (por ejemplo, tampón de lisis ACK), seguido de lavado con medio RPMI completo.

Para la tinción de las poblaciones celulares, se incubaron 1 x 106 células de diversas fuentes de tejido con anti-CD16/CD32 de ratón (2.4G2, BD Biosciences) en hielo durante 10 minutos, seguido de marcado con uno o una combinación de los siguientes cócteles de anticuerpos durante 30 min en hielo.

Médula ósea: anti-FITC-CD43 (1B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience), A700-CD19 (1D3, BD Biosciences) de ratón.

Sangre periférica y bazo: anti-FITC-K (187.1, BD Biosciences), PE-A (RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-CD3 (145-2C11, BD), A700-CD19 (1D3, BD), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience) de ratón. Después de la incubación con los anticuerpos marcados, las células se lavaron y se fijaron en formaldehído al 2%. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo LSRII y se analizó con FlowJo. Los resultados de un ratón H/k y H/K-A6 representativos se muestran en las Fig. 14-18.

Los resultados demuestran que los linfocitos B de los ratones H/K-A6 progresan a través de las etapas de desarrollo de los linfocitos B de manera similar a los ratones H/k en la médula ósea y los compartimentos periféricos, y muestran patrones normales de maduración una vez que entran en la periferia. Los ratones H/K-A6 demostraron un aumento de la población de células CD43intCD19+ en comparación con los ratones H/k (FIG. 16B). Esto puede indicar una expresión acelerada de IgM a partir del locus de cadena pesada humanizado que contiene un fragmento genómico de ratón ectópico que comprende las secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón en ratones H/K-A6. En la periferia, las poblaciones de linfocitos B y T de ratones H/K-A6 parecen normales y similares a las de ratones H/k.

Morfología Testicular y Caracterización de Espermatozoides.

Para determinar si la infertilidad en ratones que tienen locus variables de cadena pesada de inmunoglobulinas humanizadas se debe a defectos en testículos y/o en la producción de espermatozoides, se examinó la morfología de los testículos y el contenido de espermatozoides del epidídimo.

En resumen, se diseccionaron y pesaron los testículos de dos grupos de cinco ratones por grupo (Grupo 1: ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada y ligera K humana, mADAM6'/_; Grupo 2: ratones heterocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada y ligera K humana, mADAM6'/') con el epidídimo intacto. Las muestras se fijaron después, se embebieron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con tinte hematoxilina y eosina (HE). Se examinaron secciones de los testículos (2 testículos por ratón, para un total de 20) en busca de defectos en la morfología y evidencia de producción de espermatozoides, mientras que las secciones del epidídimo se examinaron para detectar la presencia de espermatozoides.

En este experimento, no se observaron diferencias en el peso o la morfología de los testículos entre los ratones mADAM6-/- y los ratones mADAM6+/-. Se observaron espermatozoide en todos los genotipos, tanto en los testículos como en el epidídimo. Estos resultados establecen que la ausencia de genes ADAM6a y ADAM6b de ratón no conduce a cambios detectables en la morfología de los testículos, y que se produce espermatozoides en ratones en presencia y ausencia de estos dos genes. Por lo tanto, no es probable que los defectos en la fertilidad de los ratones ADAM6-/-machos se deban a la baja producción de espermatozoides.

Motilidad y Migración de Espermática.

Los ratones que carecen de otros miembros de la familia de genes ADAM son infértiles debido a defectos en la motilidad o migración de los espermatozoides. La migración de espermatozoides se define como la capacidad de los espermatozoides de pasar del útero al oviducto, y normalmente es necesaria para la fertilización en ratones. Para determinar si la deleción de ADAM6a y ADAM6b de ratón afecta este proceso, se evaluó la migración espermática en ratones mADAM6-/-. También se evaluó la motilidad espermática.

En resumen, se obtuvieron espermatozoides de testículos de (1) ratones heterocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y homocigotos para locus de genes variables de cadena ligera k humana (ADAM6+/-); (2) ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y homocigotos para locus de genes variables de cadena ligera k humana (ADAM6-/-); (3) ratones homocigotos para locus de genes variables de cadena pesada humana y homocigotos para cadena ligera k de tipo silvestre (ADAM6-/- im); y, (4) ratones C57 BL/6 de tipo silvestre (TS). No se observaron anomalías significativas en el recuento de espermatozoides ni en la motilidad general de los espermatozoides mediante inspección. Para todos los ratones, se observó dispersión del cúmulo, lo que indica que cada muestra de espermatozoides pudo penetrar las células del cúmulo y unirse a la zona pelúcida in vitro. Estos resultados establecen que los ratones ADAM6-/- tienen espermatozoides capaces de penetrar el cúmulo y unirse a la zona pelúcida.

La fertilización de los óvulos de ratón in vitro (FIV) se realizó utilizando espermatozoides de ratones como se describe anteriormente. Un número ligeramente menor de embriones escindidos estaban presentes para ADAM6-/- el día siguiente a la FIV, así como un número reducido de espermatozoides unidos a los óvulos. Estos resultados establecen que los espermatozoides de los ratones ADAM6-/-, una vez expuestos a un óvulo, son capaces de penetrar el cúmulo y unirse a la zona pelúcida.

En otro experimento, la capacidad de los espermatozoides de los ratones ADAM6-/- para migrar desde el útero y a través del oviducto se determinó en un ensayo de migración de espermatozoides.

En resumen, se estableció un primer grupo de cinco ratones hembra superovuladas con cinco machos ADAM6-/-. Se estableció un segundo grupo de cinco ratones hembra superovuladas con cinco machos ADAM6+/-. Los pares de apareamiento se observaron para la copulación, y cinco a seis horas después de la copulación, se retiraron el útero y el oviducto adherido de todas las hembras y se lavaron abundantemente para su análisis. Las soluciones de lavado se verificaron en busca de óvulos para verificar la ovulación y obtener un recuento de espermatozoides. La migración de espermatozoides se evaluó de dos maneras diferentes. En primer lugar, ambos oviductos se retiraron del útero, se lavaron abundantemente con solución salina y se contó cualquier espermatozoide identificado. La presencia de óvulos también se observó como evidencia de la ovulación. En segundo lugar, los oviductos se dejaron unidos al útero y se fijaron ambos tejidos, se embebieron en parafina, se seccionaron y se tiñeron (como se describe anteriormente). Se examinaron las secciones para detectar la presencia de espermatozoides, tanto en el útero como en ambos oviductos.

Para las cinco hembras apareadas con los cinco machos ADAM6-/-, se encontró muy pocos espermatozoides en la solución de lavado del oviducto. Las soluciones de lavado de los oviductos de las cinco hembras apareadas con los cinco machos ADAM6+/- mostraron un nivel de espermatozoides de 25 a 30 veces mayor (promedio, n = 10 oviductos) que el presente en las soluciones de lavado de los oviductos de las cinco hembras apareadas con los cinco machos ADAM6-/-.

Se prepararon secciones histológicas de útero y oviducto. Se examinaron las secciones para detectar la presencia de espermatozoides en el útero y el oviducto (el colliculus tubarius). La inspección de las secciones histológicas del oviducto y el útero reveló que en ratones hembra apareadas con ratones ADAM6-/-, se encontraron espermatozoides en el útero pero no en el oviducto. Adicionalmente, secciones de hembras apareadas con ratones ADAM6-/- revelaron que no se encontraron espermatozoides en la unión uterotubal (UTJ por sus siglas en inglés). En secciones de hembras apareadas con ratones ADAM6+/-, se identificaron espermatozoides en la UTJ y en el oviducto.

Estos resultados establecen que los ratones que carecen de los genes ADAM6a y ADAM6b producen espermatozoides que muestran un defecto de migración in vivo. En todos los casos, se observaron espermatozoides dentro del útero, lo que indica que la cópula y la liberación de espermatozoides aparentemente se producen normalmente, pero se observaron pocos o ningún espermatozoide dentro de los oviductos después de la cópula, medido por el recuento de espermatozoides o la observación histológica. Estos resultados establecen que los ratones que carecen de los genes ADAM6a y ADAM6b producen espermatozoides que exhiben una incapacidad para migrar del útero al oviducto. Aparentemente, este defecto conduce a la infertilidad porque los espermatozoides no pueden cruzar la unión uterotubal hacia el oviducto, donde se fertilizan los óvulos. Tomados en conjunto, todos estos resultados convergen para respaldar la hipótesis de que los genes ADAM6 de ratón ayudan a dirigir los espermatozoides con motilidad normal para migrar fuera del útero, a través de la unión uterotubal y el oviducto, y así acercarse a un óvulo para lograr el evento de fertilización. El mecanismo por el cual ADAM6 logra esto puede ser directamente por acción de las proteínas ADAM6, o mediante la expresión coordinada con otras proteínas, por ejemplo, otras proteínas ADAM, en el espermatozoide, como se describe a continuación.

Expresión de la Familia de Genes ADAM.

Se sabe que un complejo de proteínas ADAM está presente como un complejo en la superficie de los espermatozoides en maduración. Los ratones que carecen de otros miembros de la familia de genes ADAM pierden este complejo a medida que los espermatozoides maduran y muestran una reducción de múltiples proteínas ADAM en los espermatozoides maduros. Para determinar si la falta de genes ADAM6a y ADAM6b afecta a otras proteínas ADAM de manera similar, se analizaron transferencias Western de extractos de proteínas de testículos (espermatozoides inmaduros) y epidídimo (espermatozoides maduros) para determinar los niveles de expresión de otros miembros de la familia de genes ADAM.

En este experimento, se analizaron extractos de proteínas de cuatro ratones ADAM6-/- y cuatro ADAM6+/-. Los resultados mostraron que la expresión de ADAM2 y ADAM3 no se vio afectada en los extractos de testículos. Sin embargo, ADAM2 y ADAM3 se redujeron drásticamente en extractos de epidídimo. Esto demuestra que la ausencia de ADAM6a y ADAM6b en los espermatozoides de los ratones ADAM6-/- puede tener un efecto directo en la expresión y quizás en la función de otras proteínas ADAM a medida que los espermatozoides maduran (por ejemplo, ADAM2 y ADAM3). Esto sugiere que ADAM6a y ADAM6b son parte de un complejo de proteínas ADAM en la superficie de los espermatozoides, lo que podría ser crítico para la migración adecuada de los espermatozoides.

Ejemplo IX

Uso de Genes Variables de Cadena Pesada Humana en Ratones de Rescate de ADAM6

El uso de genes variables de la cadena pesada humana seleccionada se determinó para ratones homocigotos para los locus de genes variables de cadena pesada y ligera k humana que carecen de los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón (mADAM6-/-) o que contienen un fragmento genómico ectópico que codifica los genes ADAM6a y ADAM6b del ratón (ADAM6+/+; véase el Ejemplo 1) mediante un ensayo de PCR cuantitativa usando sondas TAQMAn ™ (como se describe anteriormente).

En resumen, Los linfocitos B CD19+ se purificaron del bazo de ratones mADAM6-/- y ADAM6+/+ usando microperlas CD19 de ratón (Miltenyi Biotec) y el ARN total se purificó usando el Mini kit RNEASY ™ (Qiagen). El ARN genómico se eliminó usando un tratamiento en columna con DNasa sin RNasa (Qiagen). Aproximadamente 200 ng de ARNm se transcribieron inversamente en ADNc usando el kit de Síntesis de ADNc First Stand (Invitrogen) y después se amplificaron con la Mezcla Maestra Universal de PCR TAQMAN™ (Applied Biosystems) usando el Sistema de Detección de Secuencias ABI 7900 (Applied Biosystems). La expresión relativa de cada gen se normalizó a la constante k de ratón (mCK). La Tabla 9 expone las combinaciones de sondas en sentido/antisentido/TAQMAN™ MGB utilizadas en este experimento.

Tabla 9

(continuación)

En este experimento, se observó la expresión de los cuatro genes Vh humanos en las muestras analizadas. Adicionalmente, los niveles de expresión fueron comparables entre los ratones mADAM6-/- y ADAM6+/+. Estos resultados demuestran que los genes Vh humanos que eran distales al sitio de modificación (Vh3-23 y Vh1-69) y proximales al sitio de modificación (Vh1-2 y Vh6-1) fueron capaces de recombinarse para formar una cadena pesada humana expresada funcionalmente. Estos resultados demuestran que el fragmento genómico ectópico que comprende las secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón insertadas en una secuencia genómica de cadena pesada humana no afectó la recombinación V(D)J de segmentos génicos de cadena pesada humana dentro del locus, y estos ratones son capaces de recombinar segmentos génicos de cadena pesada humana de manera normal para producir proteínas funcionales de cadena pesada de inmunoglobulina.

Ejemplo X

Identificación de Regiones Variables de Cadena Pesada Humana que se Asocian con Regiones Variables de Cadena Ligera Humana Seleccionadas

Se construyó un sistema de expresión in vitro para determinar si una sola cadena ligera de línea germinal humana reordenada podría expresarse conjuntamente con cadenas pesadas humanas a partir de anticuerpos humanos específicos de antígeno.

Se conocen métodos para generar anticuerpos humanos en ratones genéticamente modificados (véase, por ejemplo, el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE® humanized mouse). La tecnología de ratón VELOCIMMUNE® humanizado implica la generación de un ratón genéticamente modificado que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humanas operativamente unidas a locus de región constante de ratón endógenos de modo que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos producidos a partir de un ratón VELOCIMMUNE® humanizado es completamente humano. Inicialmente, los anticuerpos quiméricos de alta afinidad se aíslan teniendo una región variable humana y una región constante de ratón. Como se describe a continuación, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, entre las que se incluyen la afinidad, la selectividad, el epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar un anticuerpo completamente humano que contiene un isotipo no IgM, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre o modificadas. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.

Se inmunizó un ratón VELOCIMMUNE® humanizado con un factor de crecimiento que promueve la angiogénesis (Antígeno C) y se aislaron y secuenciaron anticuerpos humanos específicos de antígeno para el uso del gen V usando técnicas convencionales reconocidas en la técnica. Los anticuerpos seleccionados se clonaron en regiones constantes de cadena pesada y ligera humana y se seleccionaron 69 cadenas pesadas para emparejar con una de tres cadenas ligeras humanas: (1) la cadena ligera k afín unida a una región constante k humana, (2) una Vk1-39Jk5 de la línea germinal humana reordenada unida a una región constante k humana, o (3) una Vk3-20Jk1 de la línea germinal humana reordenada unida a una región constante k humana. Cada par de cadena pesada y cadena ligera se cotransfectó en células CHO-K1 usando técnicas convencionales. La presencia de anticuerpos en el sobrenadante se detectó mediante anti-IgG humana en un ensayo ELISA. El título de anticuerpos (ng/ml) se determinó para cada par de cadena pesada/cadena ligera y los títulos con las diferentes cadenas ligeras de la línea germinal reordenadas se compararon con los títulos obtenidos con la molécula de anticuerpo precursora (es decir, cadena pesada emparejada con cadena ligera afín) y se calculó porcentaje del título natural (Tabla 10). Vh: Gen variable de cadena pesada. ND: expresión no detectada en las condiciones experimentales actuales.

_______________________________Tabla 10_______________________________

Título de Anticuer os n /ml Porcenta e de Título Natural

(continuación)

(continuación)

En un experimento similar, Los ratones VELOCIMMUNE® humanizados se inmunizaron con varios antígenos diferentes y se evaluó la capacidad de las cadenas pesadas seleccionadas de anticuerpos humanos específicos de antígeno para emparejarse con diferentes cadenas ligeras de línea germinal humana reordenadas (como se describe anteriormente). Los antígenos utilizados en este experimento incluyeron una enzima implicada en la homeostasis del colesterol (Antígeno A), una hormona sérica implicada en la regulación de la homeostasis de la glucosa (Antígeno B), un factor de crecimiento que promueve la angiogénesis (Antígeno C) y un receptor de la superficie celular (Antígeno D). Se aislaron anticuerpos específicos de antígeno de ratones de cada grupo de inmunización y se clonaron y secuenciaron las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera. A partir de la secuencia de las cadenas pesadas y ligeras, se determinó el uso del gen V y las cadenas pesadas seleccionadas se emparejaron con su cadena ligera afín o una región Vk1-39Jk5 de la línea germinal humana reordenada. Cada par de cadena pesada/ligera se cotransfectó en células CHO-K1 y la presencia de anticuerpo en el sobrenadante se detectó mediante anti-IgG humana en un ensayo ELISA. El título de anticuerpos (pg/ml) se determinó para cada emparejamiento de cadena pesada/cadena ligera y los títulos con las diferentes cadenas ligeras de la línea germinal humanas reordenadas se compararon con los títulos obtenidos con la molécula de anticuerpo precursora (es decir, cadena pesada emparejada con cadena ligera afín) y se calculó porcentaje del título natural (Tabla 11). Vh: Gen variable de cadena pesada. Vk: gen variable de la cadena ligera k. ND: expresión no detectada en las condiciones experimentales actuales.

Tabla 11

(continuación)

Los resultados obtenidos de estos experimentos demuestran que las cadenas pesadas de alta afinidad con mutaciones somáticas de diferentes familias de genes pueden emparejarse con las regiones Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 reordenadas de la línea germinal humana y secretarse de la célula como una molécula de anticuerpo normal. Tal como se muestra en la Tabla 10, el título de anticuerpos se incrementó en aproximadamente el 61 % (42 de 69) de las cadenas pesadas cuando se emparejó con la cadena ligera Vk1-39Jk5 humana reordenada y aproximadamente el 29 % (20 de 69) de las cadenas pesadas cuando se emparejó con la cadena ligera Vk3-20Jk1 humana reordenada en comparación con la cadena ligera afín del anticuerpo precursor. Para aproximadamente el 20 % (14 de 69) de las cadenas pesadas, ambas cadenas ligeras de la línea germinal humana reordenadas confieren un aumento en la expresión en comparación con la cadena ligera afín del anticuerpo precursor. Tal como se muestra en la Tabla 11, la región Vk1-39Jk5 de la línea germinal humana reordenada confirió un aumento en la expresión de varias cadenas pesadas específicas para una gama de diferentes clases de antígenos en comparación con la cadena ligera afín para los anticuerpos precursores. El título de anticuerpos aumentó más de dos veces en aproximadamente el 35 % (15/43) de las cadenas pesadas en comparación con la cadena ligera afín de los anticuerpos precursores. Para dos cadenas pesadas (315 y 316), el aumento fue mayor de diez veces en comparación con el anticuerpo precursor. Dentro de todas las cadenas pesadas que mostraron un aumento de la expresión en relación con la cadena ligera afín del anticuerpo precursor, las cadenas pesadas de la familia tres (Vh3) están sobre representadas en comparación con otras familias de genes de la región variable de cadena pesada. Esto demuestra una relación favorable de las cadenas pesadas Vh3 humanas para emparejarse con las cadenas ligeras Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 de la línea germinal humana reordenadas.

Ejemplo XI

Generación de un Locus de Cadena Ligera de la Línea Germinal Humana Reordenada

Se produjeron varios vectores de direccionamiento de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada utilizando la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. N.° 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659) para modificar los clones 302 g12 y 254m04 del Cromosoma Artificial Bacteriano genómico de ratón (BAC) (Invitrogen). Usando estos dos clones BAC, las construcciones genómicas se modificaron por ingeniería para contener una única región de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada y se insertaron en un locus de cadena ligera k endógeno que se modificó previamente para suprimir los segmentos génicos variables de k endógena y de unión.

Construcción de Vectores de Direccionamiento de Cadena Ligera de la Línea Germina1Humana Reordenada.

Se realizaron tres regiones diferentes de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada utilizando técnicas convencionales de biología molecular reconocidas en la técnica. Los segmentos de genes variables humanos utilizados para construir estas tres regiones incluyeron la secuencia Vk1-39Jk5 humana reordenada, una secuencia Vk3-20Jk1 humana reordenada y una secuencia VpreBJA5 reordenada.

Se realizó un segmento de ADN que contiene el exón 1 (que codifica el péptido líder) y el intrón 1 del gen Vk3-7 de ratón mediante síntesis de ADN de novo (Integrated DNA Technologies). Se incluyó parte de la región 5' no traducida hasta un sitio de enzima de restricción Blpl de origen natural. Los exones de los genes Vk1-39 y Vk3-20 humanos se amplificaron por PCR a partir de bibliotecas BAC genómicas humanas. Los cebadores directos tenían una extensión 5' que contenía el sitio aceptor de corte y empalme del intrón 1 del gen Vk3-7 de ratón. El cebador inverso usado para la PCR de la secuencia Vk1-39 humana incluyó una extensión que codifica Jk5 humana, mientras que el cebador inverso usado para la PCR de la secuencia Vk3-20 humana incluyó una extensión que codifica Jk1 humana. La secuencia humana VpreBJA,5 se realizó mediante síntesis de ADN de novo (Tecnologías de ADN integradas). Una porción del intrón humano Jk-Ck que incluye el sitio donante de corte empalme se amplificó por PCR a partir del plásmido pBS-296-HA18-PISceI. El cebador de PCR directo incluía una parte que codifica la extensión de una secuencia Jk5, Jk1 o JA5 humana. El cebador inverso incluía un sitio Pl-Scel, que fue previamente modificar por ingeniería en el intrón.

El exón1/intrón 1 de Vk3-7 de ratón, los exones de cadena ligera variable humana y los fragmentos de intrón Jk-Ck humanos se acoplaron juntos mediante PCR de extensión solapada, se digirieron con Blpl y Pl-Scel, y se unieron en el plásmido pBS-296-HA18-PIScel, que contenía el promotor del segmento de gen variable Vk3-15 humano. Un casete de higromicina con lox dentro del plásmido pBS-296-HA18-PIScel se reemplazó con un casete de higromicina FRT flanqueado por los sitios Notl y Ascl. El fragmento Notl/PI-Scel de este plásmido se unió a BAC 254m04 de ratón modificado, que contenía parte del intrón Jk-Ck de ratón, el exón Ck de ratón y aproximadamente 75 kb de secuencia genómica cadena abajo del locus k de ratón que proporcionó un brazo de homología 3' para recombinación homóloga en células ES de ratón. El fragmento Notl/Ascl de este BAC se unió después a BAC 302 g12 de ratón modificado, que contenía un casete de neomicina FRT flanqueado y aproximadamente 23 kb de secuencia genómica cadena arriba del locus k endógeno para la recombinación homóloga en células ES de ratón.

Vector de Direccionamiento de V k1-39Jk5 de la Línea Germinal Humana Reordenada (FIG. 19).

Se introdujeron sitios de enzimas de restricción en los extremos 5' y 3 ' de un inserto de cadena ligera modificado por ingeniería para clonar en un vector de direccionamiento: un sitio Ascl en el extremo 5' y un sitio Pl-Scel en el extremo 3'. Dentro del sitio 5'Ascl y el sitio 3' Pl-Scel, la construcción de direccionamiento de 5' a 3' incluía un brazo de homología 5' que contiene la secuencia 5' al locus de cadena ligera k de ratón endógeno obtenido del clon 302 g12 BAC de ratón, un gen de resistencia a la neomicina FRT flanqueado, una secuencia genómica incluyendo el promotor Vk3-15 humano, una secuencia líder del segmento de gen variable Vk3-7 de ratón, una secuencia intrónica del segmento de gen variable Vk3-7 de ratón, un marco de lectura abierto de una región Vk1-39Jk5 de la línea germinal humana reordenada, una secuencia genómica que contiene una porción del intrón Jk-Ck humano, y un brazo de homología 3' que contiene la secuencia 3' del segmento del gen Jk5 de ratón endógeno obtenido del clon BAC 254m04 de ratón (Figura 19, centro). Los genes y/o secuencias cadena arriba del locus de la cadena ligera k de ratón endógeno y cadena abajo del segmento del gen Jk más 3 ' (p. ej., el potenciador 3' endógeno) no se modificaron mediante la construcción de direccionamiento (véase Figura 19). La secuencia del locus Vk1-39Jk5 humano modificado por ingeniería se muestra en la SEQ ID NO: 59.

La inserción dirigida de la región Vk1-39Jk5 de la línea germinal humana reordenada en el ADN de BAC se confirmó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores ubicados en secuencias dentro de la región de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada. En resumen, la secuencia intrónica 3' a la secuencia líder Vk3-7 de ratón se confirmó con los cebadores ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEQ lD NO:60) y ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATAGTGATCA; SEQ lD NO:61). El marco de lectura abierto de la región Vk1-39Jk5 de la línea germinal humana reordenada se confirmó con los cebadores 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; SEQ lD NO:62) y 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; SEQ lD NO:63). El casete de neomicina se confirmó con cebadores neoF (ggtggagagg ctattcggc; SEQ lD NO:64) y neoR (gaacacggcg gcatcag; SEQ lD NO:65). Después se usó ADN de BAC dirigido para someter a electroporación células ES de ratón para crear células ES modificadas para generar ratones quiméricos que expresan una región Vk1-39Jk5 de la línea germinal humana reordenada.

Los clones positivos de células ES se confirmaron mediante exploración y cariotipificación Taqman™ usando sondas específicas para la región Vk1-39Jk5 de la cadena ligera modificada por ingeniería insertada en el locus endógeno. En resumen, la sonda neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEQ lD NO:66) que se une dentro del gen marcador de neomicina, sonda ULC-m1P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC; SEQ lD NO:67) que se une dentro de la secuencia intrónica 3' a la secuencia líder Vk3-7 de ratón, y la sonda 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEQ lD NO:68) que se une dentro del marco de lectura abierto de Vk1-39Jk5 de la línea germinal humana reordenada. Después se usaron clones de células ES positivas para implantar en ratones hembra para dar lugar a una camada de cachorros que expresaban la región Vk1-39Jk5 de cadena ligera de la línea germinal.

Alternativamente, las células ES que llevan la región Vk1-39Jk5 de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada se transfectan con una construcción que expresa FLP para eliminar el casete de neomicina FRT flanqueado introducido por la construcción de direccionamiento. Opcionalmente, el casete de neomicina se elimina cruzando con ratones que expresan FLP recombinasa (por ejemplo, el documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina se conserva en los ratones.

Vector de Direccionamiento de Vk3-20Jk1 de la Línea Germinal Humana Reordenada (FIG. 20).

De manera similar, se realizó un locus de cadena ligera modificado por ingeniería que expresa una región Vk3-20Jk1 de la línea germinal humana reordenada utilizando una construcción de direccionamiento incluyendo, de 5' a 3', un brazo de homología 5 ' que contiene la secuencia 5' al locus de cadena ligera k de ratón endógeno obtenido del clon BAC 302 g12 de ratón, un gen de resistencia a la neomicina FRT flanqueado, una secuencia genómica incluyendo el promotor Vk3-15 humano, una secuencia líder del segmento de gen variable Vk3-7 de ratón, una secuencia intrónica del segmento de gen variable Vk3-7 de ratón, un marco de lectura abierto de una región Vk3-20Jk1 de la línea germinal humana reordenada, una secuencia genómica que contiene una porción del intrón Jk-Ck humano, y un brazo de homología 3' que contiene la secuencia 3' del segmento del gen Jk5 de ratón endógeno obtenido del clon 254m04 BAC de ratón (Figura 20, centro). La secuencia del locus Vk3-20Jk1 humano modificado por ingeniería se muestra en la SEQ ID NO: 69.

La inserción dirigida de la región Vk3-20Jk1 de la línea germinal humana reordenada en el ADN de BAC se confirmó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores ubicados en secuencias dentro de la región VK3-20JKlde cadena ligera de la línea germinal humana reordenada. En resumen, la secuencia intrónica 3' a la secuencia líder Vk3-7 de ratón se confirmó con los cebadores ULC-m1F (SEQ ID NO: 60) y ULC-m1R (SEQ ID NO: 61). El marco de lectura abierto de la región Vk3-20Jk1 de la línea germinal humana reordenada se confirmó con los cebadores 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEQ ID NO: 70) y 1635-h2R (AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; SEQ ID n O: 71). El casete de neomicina se confirmó con los cebadores neoF (SEQ ID NO: 64) y neoR (SEQ ID NO: 65). Después se usó ADN de BAC dirigido para someter a electroporación células ES de ratón para crear células ES modificadas para generar ratones quiméricos que expresan la cadena ligera Vk3-20Jk1 de la línea germinal humana reordenada.

Los clones positivos de células ES se confirmaron mediante exploración y cariotipificación Taqman™ usando sondas específicas para la región Vk3-20Jk1 de la cadena ligera modificada por ingeniería insertada en el locus de cadena ligera k endógeno. En resumen, sonda neoP (SEQ lD NO:66) que se une dentro del gen marcador de neomicina, sonda ULC-m1P (SEQ ID NO: 67) que se une dentro de la secuencia líder Vk3-7 de ratón y sonda 1635h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEQ ID NO: 72) que se une dentro del marco de lectura abierto de Vk3-20Jk1 humana. Los clones positivos de células ES se usaron para implantar ratones hembra. Una camada de cachorros que expresan la región Vk3-20Jk1 de la cadena ligera de la línea germinal humana.

Alternativamente, las células ES que llevan la región Vk3-20Jk1 de cadena ligera de la línea germinal humana se pueden transfectar con una construcción que expresa FLP para eliminar el casete de neomicina FRT flanqueado introducido por la construcción de direccionamiento. Opcionalmente, el casete de neomicina puede eliminarse cruzando con ratones que expresan FLP recombinasa (por ejemplo, el documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina se conserva en los ratones.

Vector de Direccionamiento de VpreBJA5 de la Línea Germinal Humana Reordenada (FIG. 21).

De forma similar, se realizó un locus de cadena ligera modificado por ingeniería que expresa una región VpreBJA5 de la línea germinal humana reordenada utilizando una construcción de direccionamiento incluyendo, de 5' a 3', un brazo de homología 5 ' que contiene la secuencia 5' al locus de cadena ligera k de ratón endógeno obtenido del clon BAC 302 g12 de ratón, un gen de resistencia a la neomicina FRT flanqueado, una secuencia genómica incluyendo el promotor Vk3-15 humano, una secuen cia líder del segm ento de gen variable Vk3-7 de ratón, una secu en cia intrónica del segmento de gen variable Vk3-7 de ratón, un marco de lectura abierto de una región VpreBJA5 de la línea germinal hum ana reordenada, una secu en cia genóm ica que contiene una porción del intrón Jk-Ck humano, y un brazo de homología 3' que contiene la secu en cia 3' del segm ento del gen Jk5 de ratón endógeno obtenido del clon 254m 04 B A C de ratón (Figura 21, centro). La secuencia del locus VpreBJA 5 hum ano modificado por ingeniería se muestra en la S E Q ID NO: 73.

La inserción dirigida de la región VpreBJA 5 de la línea germ inal hum ana reordenada en el A D N de B A C se confirmó mediante reacción en cadena de la polim erasa (P C R ) usando cebadores ubicados en se cu e n cias dentro de la región VpreBJA5 de cadena ligera de la línea germinal hum ana reordenada. En resumen, la secu en cia intrónica 3' a la secuencia líder Vk3-7 de ratón se confirmó con los cebadores U L C -m 1F (S E Q ID NO: 60) y U L C -m 1R (S E Q ID NO: 61). El marco de lectura abierto de la región VpreBJA,5 de la línea germinal hum ana reordenada se confirmó con los cebadores 1616 -h 1 F ( T G T C C T C G G C C C T T G G A ; S E Q ID NO: 74) y 1616 -h 1 R ( C C G A T G T C A T G G T C G T T C C T ; S E Q ID NO: 75). El casete de neom icina se confirmó con los cebadores neoF (S E Q ID NO: 64) y neoR (S E Q ID NO: 65). D esp ués se usó A D N de B A C dirigido para som eter a electroporación célu las E S de ratón para crear célu las E S m odificadas para generar ratones quim éricos que expresan la cadena ligera VpreBJA,5 de la línea germ inal hum ana reordenada.

Los clones positivos de célu las E S se confirmaron mediante exploración y cariotipificación T a q m a n ™ usando sondas esp ecíficas para la región VpreBJA ,5 de la cadena ligera modificada por ingeniería insertada en el locus de cadena ligera k endógeno. En resum en, sonda neoP (S E Q lD NO:66) que se une dentro del gen m arcador de neom icina, sonda U L C -m 1P (S E Q ID NO: 67) que se une dentro de la secuen cia líder IgVK3-7 de ratón, y sonda 1616 h 1 P ( A C A A T C C G C C T C A C C T G C A C c Ct ; S E Q ID NO: 76) que se une dentro del marco de lectura abierto de VpreBJA,5 hum ana. D esp u és se usaron clones de célu las E S positivas para implantar en ratones hembra para dar lugar a una cam ada de cachorros que expresaban la región de cadena ligera de la línea germinal.

Alternativamente, las célu las E S que llevan la región VpreBJA ,5 de cadena ligera de la línea germinal hum ana reordenada se transfectan con una construcción que expresa F L P para elim inar el casete de neom icina F R T flanqueado introducido por la construcción de direccionam iento. Opcionalm ente, el casete de neom icina se elim ina cruzando con ratones que expresan F L P recom binasa (por ejemplo, el documento U S 6.774.279 ). Opcionalm ente, el casete de neom icina se conserva en los ratones.

Ejemplo XII

Generación de Ratones que expresan una única cadena ligera humana reordenada

Las célu las E S dirigidas anteriormente descritas se utilizaron como célu las E S donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la fase de 8 célu las mediante el método V E L O C IM O U S E ® (véase, por ejemplo, la patente de los E E .U U . n.° 7.294.754 y Poueym irou y col. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor genetargeted E S cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25 (1):91-99. S e identifican ratones V E L O C IM IC E ® que llevan independientem ente una región Vk1-39Jk5 de cadena ligera, una región Vk3-20Jk1 de cadena ligera o una región VpreBJA5 de cadena ligera de la línea germinal hum ana m odificadas por ingeniería mediante genotipificación utilizando una m odificación del ensayo de alelo (Valenzuela e t al., sup ra ) que detecta la presencia de la única región de la cadena ligera de la línea germ inal hum ana reordenada.

La s cría s se genotipifican y se seleccio na una cría heterocigota u hom ocigótica para la región de cadena ligera de línea germ inal hum ana reordenada única para caracterizar la expresión de la región de cadena ligera de línea germinal hum ana reordenada.

Citometría de Flujo.

La expresión de la región de la cadena ligera hum ana reordenada en el repertorio de anticuerpos norm ales de ratones con cadena ligera común se validó mediante a ná lis is de la expresión de inm unoglobulina k y A en esplenocitos y sangre periférica de ratones con cadena ligera común. S e realizaron susp ensio nes de célu las de bazos co sechad o s y sangre periférica de ratones tipo silvestre (n = 5), heterocigotos de cadena ligera Vk1-39Jk5 común (n = 3), homocigotos de cadena ligera Vk1-39Jk5 común (n = 3), heterocigotos de cadena ligera Vk3-20Jk1 común (n = 2) y homocigotos de cadena ligera Vk3-20Jk1 común (n = 2) usando métodos convencionales y se tiñeron con C D 19 , IgA+ y Ig^Kusando anticuerpos m arcados con fluorescencia (BD Pharm igen).

En resum en, se incubaron 1 x 106 célu las con a n t i-C D 16 /C D 32 de ratón (clon 2.4 G 2 , BD Pharm igen) en hielo durante 10 minutos, seguido de m arcado con el siguiente cóctel de anticuerpos durante 30 minutos en hielo: a n t i-C D 19 de ratón conjugado con A P C (clon 1D 3 , BD Pharm igen), a n ti-C D 3 de ratón conjugado con P e rC P -C y 5.5 (clon 17 A 2 , BioLegend), anti-IgK de ratón conjugado con F IT C (clon 187.1, BD Pharm igen), anti-IgA de ratón conjugado con P E (clon R M L-42, BioLegend). D esp ués de la tinción, las célu las se lavaron y se fijaron en form aldehído al 2 % . La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo L S R II y se analizó con F lo w Jo ™ . Selección: linfocitos B totales (C D 19 C D 3 '), linfocitos B Ig^K+ (Ig^K+IgA 'CD 19+CD 3‘), linfocitos B IgA+ (IgK'IgA CD19+CD3‘). Los datos recopilados de muestras de sangre y esplenocitos demostraron resultados similares. La Tabla 12 expone el porcentaje de linfocitos B CD19+ positivos de sangre periférica de un ratón representativo de cada grupo que son IgA+, IgK+, o IgA+IgK+. El porcentaje de linfocitos B CD19+ en sangre periférica de ratones de tipo silvestre (TS) y homocigotos para la cadena ligera común Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1 se muestra en la FIG. 22.

Tabla 12

Expresión de la Cadena Ligera Común.

La expresión de cada cadena ligera común (Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1) se analizó en ratones heterocigotos y homocigotos utilizando un ensayo de PCR cuantitativa (por ejemplo, Taqman™).

En resumen, los linfocitos B CD19+ se purificaron de los bazos de los ratones de tipo silvestre, homocigotos para un reemplazo de los locus de región variable de cadena pesada y cadena ligera k de ratón con locus de región variable de cadena pesada y cadena ligera k humanos correspondientes (Hk), así como de ratones homocigotos y heterocigotos para cada región de cadena ligera humana reordenada (Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1) usando microperlas CD19 de ratón (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El ARN total se purificó a partir de linfocitos B CD19+ usando el mini kit RNeasy™ (Qiagen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante y el ARN genómico se eliminó usando un tratamiento en columna con DNasa sin RNasa (Qiagen). Se transcribieron inversamente 200 ng de ARNm en ADNc usando el kit de síntesis de ADNc First Stand (Invitrogen) y el ADNc resultante se amplificó con la Mezcla Maestra Universal de PCR Taqman™ (Applied Biosystems). Todas las reacciones se realizaron usando el Sistema de Detección de Secuencias ABI 7900 (Applied Biosystems) usando cebadores y sondas Taqman™ MGB que abarcan (1) la unión Vk-Jk para ambas cadenas ligeras comunes, (2) el gen Vk solo (es decir, Vk1-39 y Vk3-20) y (3) la región Ck de ratón. La Tabla 13 expone las secuencias de los cebadores y las sondas empleadas para este ensayo. La expresión relativa se normalizó a la expresión de la región Ck de ratón. Los resultados se muestran en las FIG. 23a , 23B y 23C.

Tabla 13

Anticuerpos de Cadena Ligera Común Específicos de Antígeno.

Los ratones con cadena ligera común que portaban una cadena ligera común Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1 en el locus de cadena ligera k de ratón endógeno se inmunizaron con p-galactosidasa y se midió el título de anticuerpos.

En resumen, la p-galactosidasa (Sigma) se emulsionó en adyuvante TITERMAX™ (Sigma), según las instrucciones del fabricante. Los ratones de tipo silvestre (n = 7), los homocigotos de cadena ligera común Vk1-39Jk5 (n = 2) y los homocigotos de cadena ligera común Vk3-20Jk1 (n = 5) se inmunizaron mediante inyección subcutánea con 100 |jg de p-galactosidasa/TITERMAX™. Los ratones se sometieron a refuerzo mediante inyección subcutánea dos veces, con 3 semanas de diferencia, con 50 jg de p-galactosidasa/TITERMAX™. Después del segundo refuerzo, se recogió sangre de ratones anestesiados usando una hemorragia retroorbital en tubos separadores de suero (BD Biosciences) según las instrucciones del fabricante. Para medir los anticuerpos IgM o IgG anti-p-galactosidasa, las placas ELISA (Nunc) se revistieron con 1 |jg/ml de p-galactosidasa durante la noche a 4 °C. El exceso de antígeno se lavó antes de bloquear con PBS con BSA al 1% durante una hora a temperatura ambiente. Se añadieron diluciones en serie de suero a las placas y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente antes del lavado. Las placas se incubaron después con anti-IgM (Southern Biotech) o anti-IgG (Southern Biotech) conjugada con HRP durante una hora a temperatura ambiente. Después de otro lavado, las placas se desarrollaron con sustrato TMB (BD Biosciences). Las reacciones se detuvieron con ácido sulfúrico 1 N y se leyó la DO450 usando un lector de placas Victor X5 (Perkin Elmer). Los datos se analizaron con GRAPHPAD™ Prism y la señal se calculó como la dilución del suero que está dos veces por encima del fondo. Los resultados se muestran en las FIG. 24A y 24B.

Como se muestra en este Ejemplo, la proporción de linfocitos B k/A tanto en los compartimientos esplénicos como periféricos de los ratones con cadena ligera común Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 demostró un patrón de tipo casi silvestre (Tabla 12 y FIG. 22). Sin embargo, los ratones con cadena ligera común VpreBJA5 demostraron menos linfocitos B periféricos, de los cuales aproximadamente el 1-2 % expresan la región de la cadena ligera humana modificada por ingeniería (datos no mostrados). Los niveles de expresión de las regiones Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 de la cadena ligera humana reordenada a partir del locus de la cadena ligera k endógeno se elevaron en comparación con un locus de la cadena ligera k endógeno que contiene un reemplazo completo de segmentos de génicos Vk y Jk de ratón con segmentos génicos Vk y Jk humanos (FIG. 23A, 23B y 23C). Los niveles de expresión de la región VpreBJA5 de cadena ligera humana reordenada demostraron una alta expresión similar a la del locus de la cadena ligera k endógeno tanto en ratones heterocigotos como homocigotos (datos no mostrados). Esto demuestra que en competencia directa con los locus endógenos de cadena ligera A, k, o ambos, una única secuencia Vl/Jl humana reordenada puede producir mejor que la expresión a nivel de tipo silvestre a partir del locus de cadena ligera □ endógeno y dar lugar la frecuencia normal de linfocitos B esplénicas y en sangre. Adicionalmente, la presencia de un locus de cadena ligera k modificada por ingeniería que tiene una secuencia Vk1-39Jk5 humana o Vk3-20Jk1 humana fue bien tolerada por los ratones y parece funcionar de forma de tipo silvestre al representar una porción sustancial del repertorio de cadena ligera en el componente humoral de la respuesta inmunitaria (FIG. 24A y 24B).

Ejemplo XIII

Reproducción de Ratones que Expresan una Única Cadena Ligera de la Línea Germina1Humana Reordenada

Este ejemplo describe varias otras cepas de ratones modificados genéticamente que pueden reproducirse con cualquiera de los ratones con cadena ligera común descritos en el presente documento para crear múltiples cepas de ratones modificados genéticamente que albergan múltiples locus de inmunoglobulinas modificados genéticamente.

Supresión génica (KO) de IgA endógena.

Para optimizar el uso del locus de cadena ligera modificado por ingeniería, los ratones que llevan una de las regiones de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada se cruzan con otro ratón que contiene una deleción en el locus de la cadena ligera A endógeno. De esta manera, la progenie obtenida expresará, como su única cadena ligera, la región de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada como se describe en el Ejemplo 11. El cruce se realiza mediante técnicas convencionales reconocidas en la técnica y, como alternativa, por un criador comercial (por ejemplo, The Jackson Laboratory). Las cepas de ratón que llevan un locus de cadena ligera modificado por ingeniería y una deleción del locus de la cadena ligera A endógeno se exploran para detectar la presencia de la región de cadena ligera única y la ausencia de cadenas ligeras A de ratón endógenas.

Locus de Cadena Pesada Endógena Humanizada.

Los ratones que soportan un locus de cadena ligera de la línea germinal humana modificado por ingeniería se cruzan con ratones que contienen un reemplazo del locus del gen variable de cadena pesada de ratón endógeno con el locus del gen variable de cadena pesada humana (véase el documento US 6.596.541; the VELOCIMMUNE® humanized mouse, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). El ratón VELOCIMMUNE® humanizado comprende un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada humana unidas operativamente a locus de región constante de ratón endógenos, de modo que el ratón produce anticuerpos que comprenden una región variable de cadena pesada humana y una región constante de cadena pesada de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas de los anticuerpos se aísla y se une operativamente al ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada humana. Después, el ADN se expresa en una célula capaz de expresar la cadena pesada completamente humana del anticuerpo.

Se obtienen ratones que llevan un reemplazo del locus Vh de ratón endógeno con el locus Vh humano y una única región Vl de línea germinal humana reordenada en el locus de cadena ligera k endógeno. Los anticuerpos quiméricos inversos que contienen cadenas pesadas mutadas somáticamente (Vh humana y Ch de ratón) con una única cadena ligera humana (Vl humana y Cl de ratón) se obtienen tras la inmunización con un antígeno de interés. Se identifican las secuencias de nucleótidos de Vh y Vl de linfocitos B que expresan los anticuerpos y se producen anticuerpos completamente humanos mediante fusión de las secuencias de nucleótidos de Vh y Vl a secuencias de nucleótidos de Ch y Cl humanas en un sistema de expresión adecuado.

Ejemplo XIV

Generación de Anticuerpos a partir de Ratones que Expresan Cadenas Pesadas Humanas y una Región de Cadena Ligera de Línea Germinal Humana Reordenada

Después de cruzar ratones que contienen la región de cadena ligera humana modificada por ingeniería con diversas cepas deseadas que contienen modificaciones y deleciones de otros locus de Ig endógenos (como se describe en el Ejemplo 12), los ratones seleccionados pueden inmunizarse con un antígeno de interés.

Generalmente, un ratón VELOCIMMUNE® humanizado que contiene una de las regiones de la cadena ligera de la línea germinal humana reordenada se expone con un antígeno, y se recuperan las células linfáticas (tal como los linfocitos B) del suero de los animales. Las células linfáticas se fusionan con una línea celular de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y dichas líneas celulares de hibridoma se exploran y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos que contienen regiones variables de cadena pesada humana y cadenas ligeras de línea germinal humana reordenadas que son específicas del antígeno utilizado para la inmunización. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y la cadena ligera se aíslan y se unen a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Debido a la presencia de secuencias endógenas de ratón y cualquier elemento adicional de acción en cis presente en el locus endógeno, la única cadena ligera de cada anticuerpo puede estar somáticamente mutada. Esto añade diversidad adicional al repertorio específico de antígeno que comprende una única cadena ligera y diversas secuencias de cadena pesada. Las secuencias de anticuerpos clonadas resultantes se expresan posteriormente en una célula, tal como una célula CHO. Alternativamente, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligera y pesada se identifican directamente a partir de linfocitos específicos de antígeno.

Inicialmente, los anticuerpos quiméricos de alta afinidad se aíslan teniendo una región variable humana y una región constante de ratón. Como se describe anteriormente, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, entre las que se incluyen la afinidad, la selectividad, el epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano que contiene una cadena pesada humana mutada somáticamente y una cadena ligera única derivada de una región de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada de la invención. Las regiones constantes humanas adecuadas incluyen, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada.

Se inmunizaron cohortes separadas de ratones VELOCIMMUNE® humanizados que contienen un reemplazo del locus de cadena pesada de ratón endógeno con segmentos génicos humanos Vh, Dh, y Jh humanos y un reemplazo del locus de cadena ligera k de ratón endógeno con la región Vk1-39Jk5 de cadena ligera de la línea germinal humana modificada por ingeniería o con la región Vk3-20Jk1 de cadena ligera de la línea germinal humana modificada por ingeniería (descrita anteriormente) con una proteína de receptor de superficie celular humano (Antígeno E). El antígeno E se administra directamente en la almohadilla de la pata trasera de los ratones con seis inyecciones consecutivas cada 3-4 días. Se mezclan de dos a tres microgramos de Antígeno E con 10 |jg de oligonucleótido CpG (Número de Cat. oligonucleótido tlrl-modn-ODN1826; InVivogen, San Diego, CA) y 25 jg de Adju-Phos (adyuvante de gel de fosfato de aluminio, número de Cat. H-71639 -250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Dinamarca) antes de la inyección. Se administran un total de seis inyecciones antes del recuerdo con antígeno final, que se administra 3-5 días antes del sacrificio. Las hemorragias después de la cuarta y sexta inyección se recogen y la respuesta inmunitaria del anticuerpo se controla mediante un inmunoensayo convencional específico de antígeno.

Cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se exploran y seleccionan para identificar líneas celulares que producen anticuerpos de cadena ligera común específicos de Antígeno E. Usando esta técnica, se obtienen varios anticuerpos de cadena ligera común anti Antígeno E específicos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables de cadena pesada humana, el mismo dominio variable de cadena ligera humana y dominios constantes de ratón).

Alternativamente, los anticuerpos anti antígeno E de cadena ligera común se aíslan directamente de los linfocitos B positivos para antígeno sin fusión a las células de mieloma, como se describe en el documento U.S. 2007/0280945A1. Usando este método, Se obtuvieron varios anticuerpos de cadena ligera común anti Antígeno E completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables de cadena pesada humana, ya sea una región Vk1-39Jk5 de cadena ligera humana modificada por ingeniería o una región Vk3-20Jk1 de cadena ligera humana modificada por ingeniería, y dominios constantes humanos).

Las propiedades biológicas de los ejemplos de anticuerpos de cadena ligera común anti Antígeno E generados de acuerdo con los métodos de este Ejemplo se describen en detalle a continuación.

Ejemplo XV

Uso de Segmentos Génicos de Cadena Pesada en Anticuerpos de Cadena Ligera Común Específicos de Antígeno

Para analizar la estructura de los anticuerpos de cadena ligera humana anti Antígeno E producidos, se clonaron y secuenciaron ácidos nucleicos que codifican regiones variables de anticuerpos de cadena pesada. A partir de las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias de aminoácidos predichas de los anticuerpos, se identificó el uso de genes para la región variable de la cadena pesada (HCVR por sus siglas en inglés) de anticuerpos de cadena ligera común seleccionados obtenidos de ratones VELOCIMMUNE® humanizados inmunizados que contienen la región Vk1-39Jk5 de cadena ligera humana modificada por ingeniería o la región Vk3-20Jk1 de cadena ligera humana modificada por ingeniería. Los resultados se muestran en las Tablas 14 y 15, que demuestran que los ratones de acuerdo con la invención generan anticuerpos de cadena ligera común específicos de antígeno a partir de una variedad de segmentos génicos de cadena pesada humana, debido a una variedad de reordenamientos, cuando emplean un ratón que expresa una cadena ligera únicamente de una cadena ligera derivada de Vk1-39 humana o de Vk3-20. Los segmentos del gen Vh humano de las familias 2, 3, 4 y 5 se reordenaron con una variedad de segmentos Dh humanos y segmentos Jh humanos para producir anticuerpos específicos de antígeno.

Tabla 14

(continuación)

Tabla 15

Ejemplo XVI

Determinación de la Capacidad de Bloqueo de Anticuerpos de Cadena Ligera Común Específicos de Antígeno Mediante Ensayo LUMINEX™

Noventa y ocho anticuerpos de cadena ligera común humana producidos contra el Antígeno E se analizaron para determinar su capacidad para bloquear la unión del ligando natural del Antígeno E (Ligando Y) al Antígeno E en un ensayo basado en perlas.

El dominio extracelular (ECD por sus siglas en inglés) del antígeno E se conjugó con dos etiquetas de epítopo myc y una etiqueta de histidina 6X (antígeno E-mmH) y se acopló con amina a microesferas carboxiladas a una concentración de 20 |jg/ml en tampón MES. La mezcla se incubó durante dos horas a temperatura ambiente seguido de la desactivación de las perlas con Tris 1 M pH 8,0 seguido de lavado en PBS con Tween-20 al 0,05 % (v/v). Después se bloquearon las perlas con PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contenía BSA al 2 % (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). En una placa de filtro de 96 pocillos, los sobrenadantes que contenían anticuerpos de cadena ligera común específicos de Antígeno E, se diluyeron 1:15 en tampón. Se preparó un control negativo que contenía un sobrenadante simulado con los mismos componentes de medios que para el sobrenadante de anticuerpo. Se añadieron perlas marcadas con Antígeno E a los sobrenadantes y se incubaron durante la noche a 4 °C. La proteína de ligando Y biotinilado se añadió a una concentración final de 0,06 nM y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente. Se determinó la detección de ligando Y biotinilado unido a perlas marcadas con antígeno E-myc-myc-6HIS con R-ficoeritrina conjugada con Estreptavidina (Moss Inc, Pasadena, MD) seguido de medición en un analizador basado en citometría de flujo LUMINEX™. Se restó la Intensidad de Fluorescencia Media de Fondo (MFI por sus siglas en inglés) de una muestra sin Ligando Y de todas las muestras. El porcentaje de bloqueo se calculó dividiendo la MFI restada del fondo de cada muestra por entre el valor de control negativo ajustado, multiplicando por 100 y restando el valor resultante de 100.

En un experimento similar, los mismos 98 anticuerpos de cadena ligera común humana producidos contra el Antígeno E se analizaron para determinar su capacidad para bloquear la unión del Antígeno E a las perlas marcadas con ligando Y.

En resumen, el ligando Y se acopló con amina a microesferas carboxiladas a una concentración de 20 pg/ml diluidos en tampón MES. La mezcla se incubó dos horas a temperatura ambiente seguido de la desactivación de las perlas con Tris 1 M pH 8 y después se lavó en PBS con Tween-20 al 0,05 % (v/v). Después se bloquearon las perlas con PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contenía BSA al 2 % (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). Los sobrenadantes que contenían anticuerpos de cadena ligera común específicos de Antígeno E se diluyeron 1:15 en tampón, en una placa de filtro de 96 pocillos. Se preparó un control negativo que contenía un sobrenadante simulado con los mismos componentes de medios que para el sobrenadante de anticuerpo. Se añadió un antígeno E-mmH biotinilado a una concentración final de 0,42 nM y se incubó durante la noche a 4 °C. Las perlas marcadas con Ligando Y se añadieron luego a la mezcla de anticuerpo/Antígeno E y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. La detección de antígeno E-mmH biotinilado unido a perlas con Ligando Y se determinó con R-ficoeritrina conjugada con Estreptavidina (Moss Inc, Pasadena, MD) seguido de medición en un analizador basado en citometría de flujo LUMINEX™. Se restó la Intensidad de Fluorescencia Media de Fondo (MFI por sus siglas en inglés) de una muestra sin Antígeno E por ejemplo de todas las muestras. El porcentaje de bloqueo se calculó dividiendo la MFI restada del fondo de cada muestra por entre el valor de control negativo ajustado, multiplicando por 100 y restando el valor resultante de 100.

Las tablas 16 y 17 muestran el porcentaje de bloqueo para los 98 anticuerpos de cadena ligera común anti Antígeno E probados en ambos ensayos LUMINEX™. ND: no determinado en las condiciones experimentales actuales.

Tabla 16

(continuación)

(continuación)

Tabla 17

En el primer experimento LUMINEX™ descrito anteriormente, se probaron 80 anticuerpos de cadena ligera común que contienen la cadena ligera Vk1-39Jk5 modificada por ingeniería para determinar su capacidad para bloquear la unión del Ligando Y a las perlas marcadas con Antígeno E. De estos 80 anticuerpos de cadena ligera común, 68 demostraron> 50 % de bloqueo, mientras que 12 demostraron <50 % de bloqueo (6 de 25-50 % de bloqueo y 6 de <25 % de bloqueo). Para los 18 anticuerpos de cadena ligera común que contienen la cadena ligera Vk3-20Jk1 modificada por ingeniería, 12 demostraron> 50 % de bloqueo, mientras que 6 demostraron <50 % de bloqueo (3 de 25-50 % de bloqueo y 3 de <25 % de bloqueo) de la unión del Ligando Y a perlas marcadas con Antígeno E.

En el segundo experimento LUMINEX™ descrito anteriormente, se probaron los mismos 80 anticuerpos de cadena ligera común que contienen la cadena ligera Vk1-39Jk5 modificada por ingeniería para determinar su capacidad para bloquear la unión del Antígeno E a las perlas marcadas con Ligando Y. De estos 80 anticuerpos de cadena ligera común, 36 demostraron> 50 % de bloqueo, mientras que 44 demostraron <50 % de bloqueo (27 de 25-50 % de bloqueo y 17 de <25 % de bloqueo). Para los 18 anticuerpos de cadena ligera común que contienen la cadena ligera Vk3-20Jk1 modificada por ingeniería, 1 demostraron> 50 % de bloqueo, mientras que 17 demostraron <50 % de bloqueo (5 de 25-50 % de bloqueo y 12 de <25 % de bloqueo) de la unión del Antígeno E a las perlas marcadas con Ligando Y.

Los datos de las Tablas 16 y 17 establecen que los reordenamientos descritos en las Tablas 14 y 15 generaron anticuerpos de cadena ligera común específicos de Antígeno E que bloquearon la unión del Ligando Y a su receptor afín Antígeno E con diversos grados de eficacia, lo cual es consistente con los anticuerpos de cadena ligera común anti Antígeno E de las T a b la s 14 y 15 que comprenden anticuerpos con especificidad de epítopo solapante y no solapante con respecto al Antígeno E.

Ejemplo XVII

Determinación de la Capacidad de Bloqueo de Anticuerpos de Cadena Ligera Común Específicos de Antígeno Mediante ELISA

Los anticuerpos de cadena ligera hum ana común producidos contra el Antígeno E se analizaron para determinar su capacidad para bloquear la unión del Antígeno E a una superficie recubierta con Ligando Y en un ensayo E L IS A .

El ligando Y se recubrió sobre p lacas de 96 pocillos a una concentración de 2 pg/ml diluido en P B S y se incubó durante la noche seguido de lavado cuatro v e ce s en P B S con Tw een -20 al 0,05 % . D esp ués se bloqueó la placa con P B S (Irvine Scientific, Santa Ana, C A ) que contenía B S A al 0,5 % (p/v) (Sigm a-A ldrich Corp., St. Louis, MO) durante una hora a temperatura ambiente. En una placa separada, los sobrenadantes que contenían anticuerpos de cadena ligera común anti Antígeno E se diluyeron 1 :10 en tampón. S e usó un sobrenadante sim ulado con los m ism os com ponentes de los anticuerpos como control negativo. El antígeno E-m m H (descrito anteriormente) se añadió a una concentración final de 0 ,150 nM y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. La m ezcla de anticuerpo/Antígeno E-m m H se añadió después a la placa que contenía el Ligando Y y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. La detección del antígeno E-m m H unido al Ligando Y se determinó con Peroxidasa de Rábano Picante (H R P ) conjugada con el anticuerpo anti-Penta-H is (Q iagen, Valen cia, C A ) y se desarrolló por respuesta colorimétrica convencional usando sustrato de tetram etilbencidina (TM B) (BD B iosciences, S an Jo sé, C A ) neutralizado por ácido sulfúrico. La absorbancia se leyó a D O 450 durante 0,1 segundos. S e restó absorbancia de fondo de una muestra sin Antígeno E de todas las m uestras. El porcentaje de bloqueo se calculó dividiendo la MFI restada del fondo de cada muestra por entre el valor de control negativo ajustado, multiplicando por 100 y restando el valor resultante de 100.

Las tablas 18 y 19 muestran el porcentaje de bloqueo para los 98 anticuerpos de cadena ligera común anti Antígeno E probados en el ensayo E L IS A . ND: no determinado en las condiciones experim entales actuales.

Tabla 18

(continuación)

Tabla 19

Com o se describe en este Ejem plo, de los 80 anticuerpos de cadena ligera común que contienen la cadena ligera V k 1 -39 J k5 modificada por ingeniería probados para determ inar su capacidad para bloquear la unión del antígeno E a una superficie recubierta de Ligando Y, 22 demostraron > 50 % de bloqueo, m ientras que 58 demostraron <50 % de bloqueo (20 de 25 -50 % de bloqueo y 38 de < 25 % de bloqueo). Para los 18 anticuerpos de cadena ligera común que contienen la cadena ligera V k3 -20 J k 1 modificada por ingeniería, uno demostró > 50 % de bloqueo, m ientras que 17 demostraron <50 % de bloqueo (5 de 25 -50 % de bloqueo y 12 de < 25 % de bloqueo) de la unión del Antígeno E a superficie recubierta con Ligando Y.

Estos resultados también son consistentes con el conjunto de anticuerpos de cadena ligera común específicos de Antígeno E que com prende anticuerpos con especificidad de epítopo solapante y no solapante con respecto al Antígeno E.

Ejemplo XVIII

Determinación de la Afinidad con BIACORE™ para Anticuerpos con Cadena Ligera Común Específicos de Antígeno

La s constantes de disociación en equilibrio (K d) para sobrenadantes de anticuerpos seleccio nados se determinaron mediante S P R (R eso nancia de Plasm ón Superficial) usando un instrumento B IA C O R E ™ T 100 (G E Healthcare). Todos los datos se obtuvieron utilizando H B S -E P (10 mM H E P E S , N aC l 150 mM, E D T A 0,3 mM, tensioactivo P 20 al 0,05 % , pH 7,4) como tam pones tanto de muestra como de ejecución, a 25 °C . Los anticuerpos se capturaron a partir de m uestras de sobrenadante en bruto en una superficie de chip sen so r C M 5 previam ente derivatizada con una alta densidad de anticuerpos a nti-Fc humano usando quím ica de acoplam iento de am ina natural. Durante la etapa de captura, se inyectaron sobrenadantes a través de la superficie de a nti-Fc humano a un caudal de 3 pl/min, durante un total de 3 minutos. La etapa de captura se siguió por una inyección de tampón de ejecución o analito a una concentración de 100 nM durante 2 minutos a un caudal de 35 pl/min. La disociación del antígeno del anticuerpo capturado se controló durante 6 minutos. El anticuerpo capturado se eliminó mediante una breve inyección de glicina 10 mM, pH 1,5. To dos los sensorgram as se referenciaron dos v e ce s restando los sensorgram as de las inyecciones de tampón de los sensorgram as de analito, elim inando a s í los artefactos ca usad o s por la disociación del anticuerpo de la superficie de captura. Los datos de unión para cada anticuerpo se ajustaron a un modelo de unión 1 :1 con transporte de m asa usando el software de evaluación B IA C O R E ™ T 100 v 2.1. Los resultados se muestran en las T a b la s 20 y 21.

Tabla 20

(continuación)

Tabla 21

La s afinidades de unión de los anticuerpos de cadena ligera común que com prenden los reordenam ientos mostrados en las T a b la s 14 y 15 varían, y casi todos muestran una K d en el intervalo nanomolar. Los datos de afinidad son consistentes con los anticuerpos de cadena ligera común que son el resultado de la asociación combinatoria de dom inios variab les reordenados descritos en las T a b la s 14 y 15 que son de alta afinidad, seleccio nados clonalm ente y mutados som áticam ente. Junto con los datos mostrados anteriormente, los anticuerpos de cadena ligera común descritos en las T a b la s 14 y 15 comprenden una colección de anticuerpos d iversos de alta afinidad que muestran especificidad para uno o m ás epítopos en el Antígeno E.

Ejemplo XIX

Determinación de las Especificidades de unión de Anticuerpos de Cadena Ligera Común Específicos de Antígeno Mediante Ensayo LUMINEX™

S e evaluó la capacidad de los anticuerpos seleccio nados de cadena ligera común anti Antígeno E para unirse al E C D de las variantes de E C D del Antígeno E y del Antígeno E, incluido el ortólogo de mono cinomolgo (Antígeno E Mf), que difiere de la proteína hum ana en aproxim adam ente el 10 % de su s restos de am inoácidos; un mutante por deleción de Antígeno E que carece de los últimos 10 am inoácidos del extremo C-term inal del E C D (Antígeno E -A C T ); y dos mutantes que contienen una sustitución de alanina en lugares so sp echo so s de interacción con el Ligando Y (Antígeno E -A la 1 y Antígeno E -A la2). La s proteínas del Antígeno E se produjeron en célu las C H O y cada una contenía una etiqueta de C-term inal m yc-m yc-H is.

P ara los estudios de unión, la proteína del E C D del Antígeno E o la proteína variante (descrita anteriormente) de 1 ml de medio de cultivo se capturó por incubación durante 2 horas a temperatura ambiente con 1 x 106 m icroesferas (Lum inex ™ ) recubiertas de forma covalente con un anticuerpo monoclonal anti-m yc (MAb 9 E 10 , línea celular de hibridoma C R L -1729 ™ ; A T C C , M anassas, VA). La s perlas se lavaron con P B S antes de su uso. Los sobrenadantes que contenían anticuerpos de cadena ligera común anti Antígeno E se diluyeron 1:4 en tampón y se añadieron a placas de filtro de 96 pocillos. S e usó un sobrenadante sim ulado sin anticuerpos como control negativo. La s perlas que contienen las proteínas del Antígeno E capturadas se añadieron d esp ués a las m uestras de anticuerpos (3000 perlas por pocillo) y se incubaron durante la noche a 4 °C . Al día siguiente, se lavaron las perlas de muestra y se detectó el anticuerpo de cadena ligera común unido con un anticuerpo anti-IgG hum ana conjugado con R-ficoeritrina. La intensidad de fluorescencia de las perlas (aproxim adam ente 100 perlas contadas para cada muestra de anticuerpo que se une a cada proteína de Antígeno E) se midió con un analizador basado en citometría de flujo Lu m in ex™ , y se registró la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) para al menos 100 perlas contadas por interacción perla/anticuerpo. Los resultados se muestran en las Tablas 22 y 23.

Tabla 22

(continuación)

Tabla 23

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ratón cuyo genom a comprende:

(a) al m enos un segm ento génico V h hum ano no reordenado, al m enos un segmento génico D h humano no reordenado y al m enos un segm ento génico J h humano no reordenado unidos operativamente a un gen de región constante de cadena pesada endógeno en un locus de cadena pesada endógeno;

(b) no m ás de una, o no m ás de dos, se cu e n cias V k /J k hum anas reordenadas unidas operativamente a un gen de región constante de cadena ligera k endógeno en un locus de cadena ligera k endógeno; y

(c) una secu en cia de ácido nucleico ectópico que codifica una proteína A D A M 6a de ratón funcional o un ortólogo funcional, un homólogo funcional o un fragmento funcional de la m ism a y una secu en cia de ácido nucleico ectópico que codifica una proteína ADAM 6b de ratón funcional o un ortólogo funcional, un homólogo funcional o un fragmento funcional de la mism a, en donde las proteínas, ortólogos, homólogos o fragmentos de A DA M 6 son funcionales en un ratón macho, en donde dicha función está aso ciad a con la fertilidad del ratón macho, en donde el genom a del ratón carece de:

un gen A DA M 6 endógeno funcional en el locus A DA M 6 endógeno,

un segm ento génico V k de inm unoglobulina endógeno funcional, y

un segm ento génico J k de inm unoglobulina endógeno funcional.

2. El ratón de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las se cu e n cias de ácido nucleico ectópico están en una posición que no está dentro de un locus de cadena pesada de inm unoglobulina endógeno.

3. El ratón de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el genom a del ratón com prende no m ás de dos se cu en cias V k /Jk hum anas reordenadas.

4. El ratón de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las no m ás de dos se cu e n cias V k /Jk hum anas reordenadas se seleccionan del grupo que consiste en una secuen cia V k 1 -39 /J k hum ana reordenada y una secu en cia V k 3 -20 /J k hum ana reordenada.

5. El ratón de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el genom a del ratón com prende no m ás de una secuen cia V k /Jk hum ana reordenada.

6. El ratón de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la no m ás de una secu en cia V k /J k hum ana reordenada se seleccio na del grupo que consiste en una secu en cia V k 1 -39 /J k hum ana reordenada y una secu en cia V k 3 -20 /J k hum ana reordenada.

7. El ratón de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la secu en cia V k 1 -39 /J k hum ana reordenada es una secuencia V k 1 -39 /J k 5 hum ana reordenada.

8. El ratón de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la secu en cia V k 1 -39 /J k hum ana reordenada es una secuencia V k 3 -20 /J k 1 hum ana reordenada.

9. Un método de fabricación de un anticuerpo que comprende:

(a) inm unizar un ratón de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;

(b) expresar en una célula:

(i) una secuen cia de nucleótidos de cadena pesada hum ana que com prende una secu en cia de región variable de cadena pesada hum ana aislad a de dicho ratón, unida operativam ente a una secu en cia génica de región constante de cadena pesada humana;

(ii) una secu en cia de nucleótidos de cadena ligera hum ana que com prende una secu en cia de región variable de cadena ligera k hum ana aislad a de dicho ratón, unida operativamente a una secu en cia génica de región constante de cadena ligera hum ana; y

(c) mantener la célula en condiciones suficientes para expresar un anticuerpo com pletam ente humano, y (d) a isla r el anticuerpo.

10. El método de fabricación de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la secu en cia de nucleótidos de cadena pesada hum ana de 9(b)(i) es una primera secuencia de nucleótidos de cadena pesada hum ana, y el método com prende adem ás:

(e) inm unizar un ratón de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;

(d) expresar en la célula:

(i) una segunda secu en cia de nucleótidos de cadena pesada hum ana que com prende una segunda secuencia de región variable de cadena pesada hum ana aislad a de dicho ratón, unida operativamente a una secuencia génica de región constante de cadena pesada hum ana.

11. Una célula de ratón cuyo genom a comprende:

(c) una secu en cia de ácido nucleico ectópico que codifica una proteína A D A M 6a de ratón funcional o un ortólogo funcional, un homólogo funcional o un fragmento funcional de la m ism a y una secu en cia de ácido nucleico ectópico que codifica una proteína ADAM 6b de ratón funcional o un ortólogo funcional, un homólogo funcional o un fragmento funcional de la mism a, en donde las proteínas, ortólogos, homólogos o fragmentos de A DA M 6 son funcionales en un ratón macho, en donde dicha función está aso ciad a con la fertilidad del ratón macho, en donde el genom a de la célula de ratón carece de:

un gen A DA M 6 endógeno funcional en el locus A DA M 6 endógeno,

un segm ento génico V k de inm unoglobulina endógeno funcional, y

un segm ento génico J k de inm unoglobulina endógeno funcional.

12. La célula de ratón de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la célula es una célula E S .

13. La célula de ratón de acuerdo con la reivindicación 11, en donde las se cu e n cias de ácidos nucleicos ectópicos están en una posición que no está dentro de un locus de cadena pesada de inm unoglobulina endógeno.

14. La célula de ratón de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el genom a de la célula de ratón com prende no m ás de dos se cu e n cias V k /Jk hum anas reordenadas.

15. La célula de ratón de acuerdo con la reivindicación 14, en donde las no m ás de dos se cu en cias V k /J k hum anas reordenadas se seleccionan del grupo que consiste en una secu en cia V k 1 -39 /J k hum ana reordenada y una secuencia V k 3 -20 /J k hum ana reordenada.

16. La célula de ratón de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el genom a de la célula de ratón com prende no m ás de una secu en cia V k /Jk hum ana reordenada.

17. La célula de ratón de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la no m ás de una secuencia V k /J k hum ana reordenada se seleccio na del grupo que consiste en una secuen cia V k 1 -39 /J k hum ana reordenada y una secuen cia V k 3 -20 /J k hum ana reordenada.

18. La célula de ratón de acuerdo con la reivindicación 17 , en donde:

(a) la secuen cia V k 1 -39 /J k hum ana reordenada es una secu en cia V k 1 -39 /J k 5 hum ana reordenada; o

(b) la secuen cia V k 1 -39 /J k hum ana reordenada es una secu en cia V k 3 -20 /J k 1 hum ana reordenada.