JP2008520552A - Ｈｍｇｂ１に対する高親和性の抗体およびその使用法 - Google Patents

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Abstract

脊椎動物の細胞から炎症促進性サイトカインの放出を阻害するための、および患者における炎症性サイトカインカスケードを阻害するための組成物および方法を開示する。前記組成物は、例えば、ＨＭＧ１に特異的に結合する高親和性抗体、およびその抗原性フラグメントを含む。本発明の高親和性抗体、およびそれを含む薬剤組成物は、多くの目的で、例えば、敗血症（Ｓｅｐｓｉｓ）、関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再潅流傷害、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素性ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節炎、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再潅流傷害、および同種移植片拒絶反応など、広範囲の炎症性疾患および障害に対する治療法として有用である。さらに本発明の高親和性抗体は、診断用の抗体として有用である。

Description
炎症は、しばしば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、および他の化合物などの炎症促進性サイトカインなどにより誘発される。これらの炎症促進性サイトカインは、いくつかの異なる細胞型、最も重要なものとして免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、および好中球）により産生されるが、繊維芽細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、およびニューロンなどの非免疫細胞によっても産生される。これらの炎症促進性サイトカインは、炎症性サイトカインカスケードの初期段階の間の様々な障害の一因となっている。
炎症性サイトカインカスケードは、炎症およびアポトーシスを含む、多数の障害の有害な特性の一因となっている。限定するものではないが、胃腸管ならびに関連組織に関する疾患（虫垂炎、消化性、胃、および十二指腸の潰瘍、腹膜炎、膵臓炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、セリアック病、肝炎、クローン病、腸炎、ならびにホイップル病など）、全身性または局所の炎症性疾患ならびに状態（喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血、再潅流傷害、臓器壊死、枯草熱、敗血症（Ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素性ショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、およびサルコイドーシスなど）、尿生殖器系および関連組織に関する疾患（感染流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、および尿道炎など）、呼吸器系および関連組織に関する疾患（気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性繊維症、肺炎、ＣＯＰＤ、成人呼吸窮迫症候群、肺限外顕微鏡的間質性肺炎、歯槽骨炎（ａｌｖｅａｌｉｔｉｓ）、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、および副鼻腔炎など）;様々なウイルスによる感染に起因する疾患（インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびヘルペスなど）、細菌による感染に起因する疾患（散在性細菌、デング熱など）、真菌による感染に起因する疾患（カンジダ症など）、ならびに原虫および多細胞寄生動物による感染に起因する疾患（マラリア、フィラリア症、アメーバ症、および包虫嚢胞など）、皮膚科の疾患および皮膚の状態（乾癬、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹いぼ、および膨疹など）、心臓血管系および関連組織に関する疾患（ヴァスリティス（ｖａｓｕｌｉｔｉｓ）、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化、血栓性静脈炎、心膜炎、うっ血性心不全、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、再狭窄、およびリウマチ熱など）、中枢神経系または末梢神経系および関連組織に関する疾患（アルツハイマー病、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、およびぶどう膜炎など）、骨、関節、筋肉、および結合組織の疾患（様々な関節炎症および関節痛、骨膜炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、および滑膜炎など）、他の自己免疫障害および炎症性障害（重症筋無力症、スリオイディティス（ｔｈｒｙｏｉｄｉｔｉｓ）、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ’ｓ）病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ’ｓ）病、およびライター症候群など）、ならびに様々な癌、腫瘍、および増殖性疾患（ホジキン病など）、ならびに、いずれの場合もあらゆる一次疾患に対する炎症性のまたは免疫性の宿主の反応を含めた、局所および全身性の反応の両方を特徴とする慢性および急性の疾患が含まれる。
初期の炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１など）は、炎症を媒介し、かつ、血清に蓄積し、遅延性の致死性および早期の炎症促進性サイトカインのさらなる誘発を媒介する、高移動度タンパク質１（ＨＭＧ１）（ＨＭＧ−１、ＨＭＧ１、およびＨＭＧＢ１としても知られる）の遅発性の放出を誘発する。
ＨＭＧ１は、ＤＮＡの構造および安定性に決定的である高移動度（ＨＭＧ）と呼ばれるＤＮＡ結合性タンパク質のファミリーの設立メンバーとして最初に同定された。これは、約４０年前に、ＤＮＡの二重らせんに配列の特異性なしに結合する、偏在的に発現される核タンパク質として同定された。
ＨＭＧ１の結合は、ＤＮＡを折り曲げて、例えばグルココルチコイド受容体とＲＡＧリコンビナーゼとの遺伝子の転写を促進する核タンパク質複合体の形成および安定性を促進する。ＨＭＧ１分子には、３つのドメインがあり、ＨＭＧＡおよびＨＭＧＢボックスと呼ばれる２つのＤＮＡ結合性モチーフ、ならびに酸性のカルボキシル末端である。２つのＨＭＧボックスは、高度に保存された８０個のアミノ酸の、Ｌ型のドメインである。ＨＭＧボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写因子ヒト上流結合因子、およびリンパ球特異性因子を含む他の転写因子でも発現される。
最近、ＨＭＧＡボックスはＨＭＧ炎症促進性作用の競合的阻害物質として働き、ＨＭＧＢボックスは優勢なＨＭＧの炎症促進性作用を有することが見出されている（例えば、US20040005316を参照されたい）。ＨＭＧ１は、炎症を誘発するアポトーシス細胞に対抗して、壊死細胞が受動的に放出する長い間探求されていた核の危険シグナルであることが実証されている。ＨＭＧ１は、核から分泌性のリソソームへのトランスロケーションを可能にし、アセチル化された形態のＨＭＧ１の分泌をもたらす、分子のアセチル化を必要とする過程において、刺激されたマクロファージまたは単球が能動的に分泌することができることも示されている。PCT/IB2003/005718を参照されたい。したがって、壊死細胞から受動的に放出されるＨＭＧ１と、炎症細胞から能動的に分泌されるＨＭＧＢ１とは、分子上異なる。
さらに、ＨＭＧ１は、内毒素血症における遅延性の致死性のサイトカインメディエータとして意味づけられている。例えば、米国特許第6,468,533号および第6,448,223号を参照されたい。より詳しくは、細菌の内毒素（リポ多糖（ＬＰＳ））は、単球／マクロファージを活性化して、活性化に対する遅延反応としてＨＭＧ１を放出させ、毒性である血清ＨＭＧ１レベルの上昇をもたらすことが実証されている。ＨＭＧ１に対する抗体は、初期のサイトカインの反応後まで抗体の投与が遅くなった場合でも、内毒素の致死性を予防することが示されている。他の炎症促進性サイトカイン同様、ＨＭＧ１は単球の有力な活性化物質である。ＨＭＧ１を気管内適用すると、急性肺傷害を引き起こし、抗ＨＭＧ１抗体が、内毒素誘発性の肺の浮腫に対抗して保護する。さらに、敗血症または出血性ショックの重篤な患者では血清ＨＭＧ１レベルは上昇し、生存者に比べて非生存者ではレベルが著しく高い。
細胞外のＨＭＧ１は、糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）経由の、およびトール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのメンバー経由のシグナリングによる炎症カスケードの強力なメディエータとして働く。例えば、米国特許公開US20040053841号を参照されたい。
高移動度タンパク質２（ＨＭＧ２）（ＨＭＧＢ２およびＨＭＧ−２としても知られる）は、ＨＭＧ１の近縁(close relative)であり、遺伝子の複製を起源とするようである。これは、多くの細胞型に存在し、ＨＭＧ１と、すべてではないにしても多くの生化学的特質を共有している（Bustin、1999年、Mol.Cell.Biol.、19巻、5237〜46頁、およびThomasら、2001年、Trends Biochem.Sci、26巻、167〜74頁）。ＨＭＧ２はあまり豊富ではなく、成年マウスの組織ではＨＭＧ１よりも分布が限定されているが、ＨＭＧ２が炎症のメディエータとして役割を果たすこともあるリンパ器官、精巣、および肺では比較的豊富である。ＨＭＧ１同様、ＨＭＧ２は、全身性リウマチ疾患（Uesugiら、1998年、J Rheumatol.、25巻、703〜9頁）、潰瘍性大腸炎（Sobajimaら、1998年、Clin Exp Immunol.、111巻、402〜7頁）、および若年性特発性関節炎（Wittermannら、1990年、Arthritis Rheum.、33巻、1378〜83頁；Rosenbergら、2000年、J Rheumatol.、27巻、2489〜93頁）を含む数々の自己免疫疾患における、自己抗体（例えば、核周囲の抗好中球細胞質抗体）の重要な標的抗原でもある。
ＨＭＧ１およびそのポリペプチドフラグメント（例えば、ＨＭＧＡおよびＨＭＧＢボックス）に結合する抗体はＨＭＧ１の活性（例えば、炎症促進性の活性）をモデュレートすることが示されている事実、ならびにヒトでＨＭＧ１活性をモデュレートすると多くの疾患および障害で意義深い治療用の使用があり得るという事実を考慮すると、当技術分野では、ＨＭＧ１およびそのポリペプチドフラグメントに特異的に結合し、ＨＭＧ１に対する親和性が高く、免疫原性が低い抗体を同定することが必要とされている。同様に、ＨＭＧ２の活性をモデュレートする分子（例えば、ＨＭＧ２およびポリペプチドフラグメントに特異的に結合する抗体）も、数々の疾患および障害に対する治療に有用であり得る。
本発明は、ＨＭＧ１（本明細書では「ＨＭＧＢ１」とも呼ぶ）およびその抗原性フラグメントに特異的に結合する高親和性抗体の発見に一部基づくものである。本発明の高親和性抗体、およびそれを含む薬剤組成物は、多くの目的で、例えば、敗血症、関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再潅流傷害、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素性ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再潅流傷害、脊髄損傷、および同種移植片拒絶反応など、広範囲の炎症性の疾患および障害に対する治療として有用である。さらに、本発明の高親和性の抗体は、診断上の適用にも有用である。
本発明の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、ヒトまたは他の動物、例えば、哺乳動物および無脊椎動物のＨＭＧ１ポリペプチドを含み、あるいはそれから成る（またはそれから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。特定の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、ヒトＨＭＧ１ポリペプチド（配列番号１または配列番号２）を含み、あるいはそれから成るポリペプチドに特異的に結合する。ヒトおよび他の動物の全長のＨＭＧ１ポリペプチドは、当技術分野ではよく知られている（例えば、US20040005316、第6,468,533号、および第6,448,223号を参照されたい）。
ヒトＨＭＧＢ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１１９）
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWK
TMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIP PKGETKKKFKDPNAPKRPPS
AFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAK
LKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEE
EDEEDEDEEE DDDDE（配列番号１）
ヒトＨＭＧＢ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６４９７０）
MGKGDPKKPTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWK
TMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRLPS
AFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAK
LKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEE
EDEEDEEDEE DDDDE（配列番号２）
本発明の別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、ヒトまたは他の動物、例えば哺乳動物および無脊椎動物のＨＭＧ２（本明細書では「ＨＭＧＢ２」とも呼ぶ）ポリペプチドを含み、あるいはそれから成る（またはそれから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。さらに別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、ヒトＨＭＧ２ポリペプチド（配列番号２１）を含み、あるいはそれから成るポリペプチドに特異的に結合する。ヒトおよび他の動物の全長のＨＭＧ２ポリペプチドは、当技術分野ではよく知られている。例えば、Majumdarら、1991年、Nucleic Acids Res.、19巻、6643頁；Shirakawaら、1992年、J Biol Chem、267巻、6641〜6645頁を参照されたい。
ヒトＨＭＧＢ２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５８６５９）
MGKGDPNKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDSSVNFAEFSKKCSERWKTMSAK
EKSKFEDMAKSDKARYDREMKNYVPPKGDKKGKKKDPNAPKRPPSAFFLFCSEHRP
KIKSEHPGLSIGDTAKKLGEMWSEQSAKDKQPYEQKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGK
SEAGKKGPGRPTGSKKKNEPEDEEEEEEEEDEDEEEEDEDEE（配列番号２１）
本発明の別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、哺乳動物（または他の動物）のＨＭＧ１ＡボックスまたはＨＭＧ１Ｂボックスのいずれか、好ましくはヒトＨＭＧ１ポリペプチドを含み、あるいはそれから成る（またはそれから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。ヒトおよび他の動物のＨＭＧ１ＡボックスおよびＨＭＧ１Ｂボックスポリペプチドのアミノ酸配列は、高度に保存されており、当技術分野ではよく知られている（例えば、US20040005316、第6,468,533号、第6,448,223号、およびUS20040053841を参照されたい）。
ヒトＨＭＧＢ１Ａボックス（配列番号３）
PTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMA
KADKARYEREMKTYIPPKGET
ヒトＨＭＧＢ１Ｂボックス（配列番号４）
FKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEM
WNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAY
本発明のさらに別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、哺乳動物（または他の動物）の、好ましくはヒトＨＭＧ２ポリペプチドの、ＨＭＧ２ＡボックスまたはＨＭＧ２Ｂボックスのいずれかを含み、あるいはそれから成る（またはそれから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。ヒトおよび他の動物のＨＭＧボックスのポリペプチドのアミノ酸配列は、高度に保存されており、当技術分野ではよく知られている。例えば、Jantzenら、1990年、Nature、344巻、830〜6頁；Kolodrubetz、1990年、Nucleic Acids Res.、18巻、5565頁；Laudetら、1993年、Nucleic Acids Res.、21巻、2493〜501頁、およびThomasら、2001年、Trends Biochem Sci.、26巻、167〜74頁を参照されたい。
ヒトＨＭＧＢ２Ａボックス（配列番号２２）
PRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDSSVNFAEFSKKCSERWKTMSAKEKSKFEDMA
KSDKARYDREMKNYVPPKGDK
ヒトＨＭＧＢ２Ｂボックス（配列番号２３）
KKKDPNAPKRPPSAFFLFCSEHRPKIKSEHPGLSIGDTAKKLGEMWSEQSAKDKQPY
EQKAAKLKEKYEKDIAAY
また、本発明には、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２のＡボックスおよびＢボックスの両方に由来するアミノ酸残基を含む、あるいはそれから成る（またはそれから本質的に成る）エピトープに特異的に結合する抗体が包含される。ＡボックスＢボックスの両方に由来するアミノ酸残基に由来するエピトープは、ＡおよびＢボックスの接合部に由来する直線状のポリペプチドであることもあり、またはＡおよびＢボックスの両方からのアミノ酸残基を含むポリペプチドの３次元立体配座に起因することもある。
本発明の別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、ヒトＨＭＧＢ１（または他の動物）のポリペプチドフラグメントを含み、あるいはそれから成る（またはそれから本質的に成る）抗原のＨＭＧＢ１ポリペプチドフラグメントに特異的に結合する。
本発明の別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、ヒトＨＭＧＢ２（または他の動物）のポリペプチドフラグメントを含み、あるいはそれから成る（またはそれから本質的に成る）抗原のＨＭＧＢ２ポリペプチドフラグメントに特異的に結合する。
本発明の高親和性抗体は、アセチル化されたおよび／または非アセチル化のＨＭＧ１、ならびにその抗原性フラグメントに特異的に結合することができることが、特に企図される。本発明の高親和性抗体は、２つの形態の間を区別できることがあることも、特に企図される。本発明の高親和性抗体は、アセチル化されたおよび／または非アセチル化のＨＭＧ２、ならびにその抗原性フラグメントに特異的に結合することができることも企図される。本発明の高親和性抗体は、２つの形態の間を区別できることがあることも、特に企図される。
本発明の特定の一実施形態では、ＨＭＧ１およびその抗原性フラグメントに特異的に結合する抗体は、ヒト化の、またはヒトの抗体である。本発明の別の特定の実施形態では、ＨＭＧ２およびその抗原性フラグメントに特異的に結合する抗体は、ヒト化の、またはヒトの抗体である。
本発明の別の一実施形態は、１０−５Ｍ未満の、または１０−６Ｍ未満の、または１０−７Ｍ未満の、または１０−８Ｍ未満の、または１０−９Ｍ未満の、または１０−１０Ｍ未満の、または１０−１１Ｍ未満の、または１０−１２Ｍ未満の、または１０−１３Ｍ未満の解離定数即ちＫｄ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）でＨＭＧ１およびその抗原性フラグメントに特異的に結合する抗体である。
本発明のなお別の一実施形態は、１０−５Ｍ未満の、または１０−６Ｍ未満の、または１０−７Ｍ未満の、または１０−８Ｍ未満の、または１０−９Ｍ未満の、または１０−１０Ｍ未満の、または１０−１１Ｍ未満の、または１０−１２Ｍ未満の、または１０−１３Ｍ未満の解離定数即ちＫｄ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）でＨＭＧ２およびその抗原性フラグメントに特異的に結合する抗体である。
別の一実施形態では、本発明の抗体は、１×１０−３ｓ−１未満の、または３×１０−３ｓ−１未満のＫｏｆｆで、ＨＭＧ１および／またはその抗原性フラグメントに結合する。他の実施形態では、抗体は、１０−３ｓ−１未満の、５×１０−３ｓ−１未満の、１０−４ｓ−１未満の、５×１０−４ｓ−１未満の、１０−５ｓ−１未満の、５×１０−５ｓ−１未満の、１０−６ｓ−１未満の、５×１０−６ｓ−１未満の、１０−７ｓ−１未満の、５×１０−７ｓ−１未満の、１０−８ｓ−１未満の、５×１０−８ｓ−１未満の、１０−９ｓ−１未満の、５×１０−９ｓ−１未満の、または１０−１０ｓ−１未満のＫｏｆｆでＨＭＧ１およびその抗原性フラグメントに結合する。
さらに別の一実施形態では、本発明の抗体は、１×１０−３ｓ−１未満の、または３×１０−３ｓ−１未満のＫｏｆｆでＨＭＧ２および／またはその抗原性フラグメントに結合する。他の実施形態では、抗体は、１０−３ｓ−１未満の、５×１０−３ｓ−１未満の、１０−４ｓ−１未満の、５×１０−４ｓ−１未満の、１０−５ｓ−１未満の、５×１０−５ｓ−１未満の、１０−６ｓ−１未満の、５×１０−６ｓ−１未満の、１０−７ｓ−１未満の、５×１０−７ｓ−１未満の、１０−８ｓ−１未満の、５×１０−８ｓ−１未満の、１０−９ｓ−１未満の、５×１０−９ｓ−１未満の、または１０−１０ｓ−１未満のＫｏｆｆでＨＭＧ２およびその抗原性フラグメントに結合する。
別の一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０９Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数即ちｋｏｎ速度でＨＭＧ１および／またはその抗原性フラグメントに結合する。
別の一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０９Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数即ちｋｏｎ速度でＨＭＧ２および／またはその抗原性フラグメントに結合する。
本発明の高親和性抗体は、ＨＭＧ１に特異的に結合することができＨＭＧ２に結合することができない、またはＨＭＧ２に特異的に結合することができＨＭＧ１に結合することができないことが企図される。本発明の高親和性抗体は、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２の両方に特異的に結合することができることがさらに企図される（例えば、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２の両方に存在するエピトープを特異的に認識する抗体）。本発明の高親和性抗体は、ＨＭＧ１またはＨＭＧ２のいずれかに特異的に結合することができ、それぞれＨＭＧ２またはＨＭＧ１と交差反応性があることが企図される。本発明の高親和性抗体は、同一の、または異なる結合親和性で、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２に結合することがさらに企図される。
本発明の高親和性抗体には、限定するものではないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換えで生成された抗体、細胞内抗体、多特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）（二重特異的なｓｄＦｖｓを含む）、および抗イディオタイプの（抗Ｉｄ）抗体、ならびに上記のあらゆるもののエピトープ結合性フラグメントが含まれる。
本発明の追加の非排他的な一実施形態は、特定の等電点（ｐＩ）または融点（Ｔｍ）などの、ある種の好ましい生化学的特性を有する本発明の高親和性抗体を含む。
一実施形態では、本発明の高親和性抗体のｐＩは５．５から９．５までの範囲である。
一実施形態では、本発明の高親和性抗体のＴｍは約６５℃から約１２０℃までの範囲である。
本発明の特定の実施形態は、高い親和性でＨＭＧ１に特異的に結合する特定の抗体（およびそのフラグメント）も含み、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９）に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６１４２（２００４年８月４日に寄託）、ＰＴＡ−６１４３（２００４年８月４日に寄託）、ＰＴＡ−６２５９（２００４年１０月１９日に寄託）、およびＰＴＡ−６２５８（２００４年１０月１９日に寄託）（本明細書では、それぞれ「Ｓ２」、「Ｓ６」、「Ｓ１６」、および「Ｇ４」とも呼ぶ）が割り当てられている。これらの寄託は、特許手続きの目的でＢｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに従って維持される。言及する株は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙの条項に従って維持されているので、特許局のＢｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙへの調印で入手可能になるであろう。
本発明の他の特定の実施形態は、高い親和性でＨＭＧ１に特異的に結合し、本明細書に開示した可変領域の少なくとも１つを含む特定の抗体（およびそのフラグメント）も含む（例えば、図２Ａ〜Ｊおよび配列番号５〜２０、２４〜２７、および３０〜７３を参照されたい）。本発明の特定の実施形態は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の抗体のＣＤＲを有する、本明細書に開示される抗体である（例えば、図２Ａ〜Ｊの下線を引いたＣＤＲ、および配列番号７４〜１０３を参照されたい）。本発明の特定の実施形態は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または６個すべての寄託された抗体のＣＤＲを有する抗体である。これらの抗体（およびそのフラグメント）をコードする単離されたポリヌクレオチドも、本発明の実施形態として企図される。
さらに、本明細書に開示する抗ＨＭＧ１抗体と同じエピトープ（例えば、ＨＭＧ１ペプチド９１〜１６９または１５０〜１８３内のエピトープ）に特異的に結合するあらゆる抗体が、本発明の範囲内に含まれる。特定の一実施形態では、寄託された抗体と同じエピトープに特異的に結合する抗体が、本発明の範囲内に含まれる。これらの抗体が、少なくとも等しい親和性で、またはより優れた親和性で、またはより劣る親和性で寄託された抗体と同じエピトープに結合することが、特に企図される。これらの抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド（およびそのフラグメント）も、本発明の特定の実施形態である。
本発明のあらゆる高親和性抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドが、本発明の実施形態として含まれる。
他の実施形態では、本発明は、組成物、例えば、薬学的に許容できる賦形剤に本発明の高親和性抗体を含む薬剤組成物を目的としている。
特定の一実施形態では、組成物は、ＨＭＧ１のＡボックス（例えば、配列番号３内にあるエピトープ）に特異的に結合する本発明の高親和性抗体を含む。別の一実施形態では、組成物は、ＨＭＧ１のＢボックス（例えば、配列番号４、２８、２９内にあるエピトープ）に特異的に結合する本発明の高親和性抗体を含む。なお別の特定の一実施形態では、組成物は、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２のＡボックスおよびＢボックスの両方に由来するエピトープに特異的に結合する、本発明の高親和性抗体を含む。本発明の組成物は、本発明の高親和性抗体の組合せ、例えば、Ａボックスに特異的に結合する抗体とＢボックスに特異的に結合する抗体との組合せを含むことができることも企図される。
本発明の組成物は、本発明の高親和性抗体を単独で、あるいはステロイドなどの他の活性の治療用分子、および／またはアジュバント、他の抗炎症分子、または他の抗体治療法と組み合わせて含むことができる。より詳しくは、本発明の組成物は、初期敗血症メディエータの拮抗物質を含むことができる。一実施形態では、初期敗血症メディエータの拮抗物質は、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＭＩＦ、およびＩＬ−６から成る群から選択されるサイトカインの拮抗物質である。
本発明の別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、急性および慢性両方の炎症状態を含む炎症性サイトカインカスケードの活性化により媒介され、またはそれを特徴とする状態を阻害することができる。
本発明のなお別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、動物ＣＬＰ敗血症モデル（例えば、マウスまたは仔ブタのＣＬＰモデル）において、コントロールの組成物よりも（少なくとも１０％または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。
本発明のさらに別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、動物関節炎モデル（例えば、ラットＡＩＡ、マウス受動的または能動的ＣＩＡモデル）において、コントロールの組成物よりも（少なくとも１０％または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。
本発明のなお別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、動物関節炎モデル（例えば、ラットＡＩＡ、マウス受身または能動ＣＩＡモデル）において、コントロールの組成物よりも（少なくとも１０％または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）骨の損失および／または軟骨の損傷を減少させる。
本発明のさらに別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、ヒトにおいて、コントロールの組成物よりも（少なくとも１０％または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）骨の損失および／または軟骨の損傷を減少させる。
本発明の別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、齧歯動物関節炎モデルにおいて、Ｒｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（メトトレキセートを含むもの、または含まないもの）よりも（少なくとも１０％または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。
本発明のなお別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、ヒトにおいて、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（メトトレキセートを含むもの、または含まないもの）よりも（少なくとも１０％または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。
本発明のさらに別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、マウス腹膜炎モデルにおいて、コントロールの組成物よりも（少なくとも１０％または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。
本発明に企図される他の実施形態は、本明細書に記載する抗体組成物を投与することを含む、関節炎、例えば、関節リウマチ、破骨細胞が媒介する疾患、または関節の他の炎症性疾患を処置し、または予防する方法を含む。
別の一実施形態では、本発明は、抗体の結合親和性に関わらずＨＭＧ１またはその抗原性フラグメント（例えば、ＨＭＧＢボックス）に特異的に結合するあらゆる抗体（または抗体組成物）を投与することを含む、関節炎、例えば、関節リウマチ、破骨細胞が媒介する疾患、または他の炎症性疾患を処置し、または予防する方法を含む。
別の一実施形態では、本発明は、抗体の結合親和性に関わらずＨＭＧ２またはその抗原性フラグメント（例えば、ＨＭＧＢボックス）に特異的に結合するあらゆる抗体（または抗体組成物）を投与することを含む、関節炎、例えば、関節リウマチ、破骨細胞が媒介する疾患、または他の炎症性疾患を処置し、または予防する方法を含む。
別の一実施形態では、本発明は、抗体の結合親和性に関わらずＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２あるいそれらの抗原性フラグメント（例えば、ＨＭＧＢボックス）に特異的に結合する抗体（または抗体組成物）の組合せを投与することを含む、関節炎、例えば、関節リウマチ、破骨細胞が媒介する疾患、または他の炎症性疾患を処置し、または予防する方法を含む。
本発明の、なお別の一実施形態では、本明細書に記載する組成物は、ヒトまたは齧歯動物の脊髄損傷（ＳＣＩ）モデルにおいて、コントロールの組成物よりも（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）ＳＣＩの重症度を改善する。
他の特定の実施形態では、本発明は、虫垂炎、消化性、胃、および十二指腸の潰瘍、腹膜炎、膵臓炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血、再潅流傷害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素性ショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、感染流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性繊維症、肺炎、肺限外顕微鏡的間質性肺炎、アルベアリティス（ａｌｖｅａｌｉｔｉｓ）、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染症、ヘルペス感染症、ＨＩＶ感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、散在性細菌、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、いぼ、膨疹、ヴァスリティス（ｖａｓｕｌｉｔｉｓ）、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、再狭窄、ＣＯＰＤ、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ぶどう膜炎、関節炎、関節痛、骨膜炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、スリオイディティス（ｔｈｒｙｏｉｄｉｔｉｓ）、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ’ｓ）病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ’ｓ）病、ライター症候群およびホジキン病などの、慢性および急性両方の状態を含む、広範囲の炎症性状態を処置し、予防するために、本発明の組成物、および抗体を投与し、使用する方法を目的とするものである。
本発明は、哺乳動物の細胞からの炎症促進性サイトカインの放出を阻害する方法も目的としている。この方法は、細胞から炎症促進性サイトカインの放出を阻害するのに十分な量の本発明の抗体または抗体組成物で細胞を処置することを含む。これらの実施形態では、細胞は、限定するものではないが、末梢血の単球およびマクロファージを含む炎症促進性サイトカインを放出することができるあらゆる細胞である。さらに、炎症促進性サイトカインは、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＭＩＦ、およびＩＬ−６から成る群から選択することができる。特定の一実施形態では、細胞はマクロファージであり、炎症促進性サイトカインは、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＭＩＦ、およびＩＬ−６から成る群から選択される。一実施形態では、この方法を、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする状態に罹患し、またはその危険性がある患者における細胞を処置するのに用いる。特定の状態は、本明細書に列挙してある。
関連の実施形態では、本発明は、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする患者における状態を処置する方法を目的とする。この方法は、本発明の抗体または抗体組成物を患者に投与することを含む。特定の状態は、すでに列挙してある。
表の簡単な説明
表１−抗体の特徴および寄託情報
表２−保存的アミノ酸置換のファミリー
表３−配列表の説明
表４−受動的ＣＩＡマウスモデルの処置のプロトコールの説明
表５−ＡＩＡラットモデルの処置のプロトコールの説明
表６−腹膜炎モデルの処置プロトコールの説明
本発明は、ＨＭＧ１に特異的に結合する抗体（本明細書では、「ＨＭＧＢ１」とも呼ぶ）、ならびにある種の生化学的な、結合の、および機能上の特性を表すその抗原性フラグメントの発見に、一部基づくものである。ＨＭＧ１に特異的に結合する抗体は、本明細書では「本発明の高親和性抗体」、「高親和性抗体」と特に呼ばれ、「本発明の抗体」、「抗ＨＭＧ１抗体」、および単に「ＨＭＧ抗体」および同様の語より拡張的な語によっても包含される。本発明は、また、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２の両方に結合する抗体の発見に一部基づくものである。
本発明の抗体の生化学的特性には、限定するものではないが、等電点（ｐＩ）および融点（Ｔｍ）が含まれる。本発明の抗体の結合の特性には、限定するものではないが、結合特異性、解離定数（Ｋｄ）、エピトープ、ＨＭＧ１の様々な形態および／または調製物（例えば、組換え、天然、アセチル化）の間を区別する能力、ならびに可溶性の抗原および／または固定化した抗原に結合する能力が含まれる。本発明の抗体の機能上の特性には、限定するものではないが、ＨＭＧ１誘発性サイトカインの放出の阻害、１つまたは複数の受容体へのＨＭＧ１の結合の阻害、細胞表面へのＨＭＧ１の結合の阻害、ならびに１つまたは複数の炎症性疾患（例えば、敗血症、関節炎、急性肺傷害、腹膜炎）のモデルにおける保護が含まれる。
本発明の抗体およびそれを含む組成物は、多くの目的で、例えば、限定するものではないが、敗血症、関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再潅流傷害、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素性ショック、嚢胞性繊維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再潅流傷害、脊髄損傷、および同種移植片拒絶を含む、広範囲の慢性および急性の炎症性疾患および障害に対する治療として有用である。
さらに、本発明の高親和性抗体は、診断の適用に有用である。本発明の抗体を、例えば、限定するものではないが、本発明のＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２ポリペプチドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ両方の診断および治療の方法を含めて、精製し、検出し、および標的にするために用いることができる。例えば、抗体を、生物学的サンプルにおける本発明のＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２ポリペプチドのレベルの定性的および定量的な測定のための免疫アッセイで使用する。例えば、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual、（Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988年）を参照されたい。
５．１ 本発明の抗体
本明細書で用いる「ＨＭＧ１およびその抗原性フラグメントに特異的に結合する」高親和性抗体またはそのフラグメントは、例えば、ＨＭＧ１ポリペプチド、またはＨＭＧ１ポリペプチドのフラグメント（例えば、ＨＭＧ１ＡボックスおよびＨＭＧ１Ｂボックス）、またはＨＭＧ１ポリペプチドのエピトープに特異的に結合し（特定の抗体−抗原結合をアッセイするために当技術分野でよく知られている免疫アッセイにより決定して）、他のポリペプチドに特異的に結合しない高親和性抗体、またはそのフラグメントを意味する。一実施形態では、ＨＭＧ１ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する高親和性抗体またはフラグメントは、他の抗原と非特異的に交差反応をしない（例えば、結合は、ＢＳＡなどの非−ＨＭＧ１タンパク質と競合して除かれることができない）。本発明は、ＨＭＧ２ポリペプチドまたはＨＭＧ２ポリペプチドのフラグメント（例えば、ＨＭＧ２ＡボックスおよびＨＭＧ２Ｂボックス）、またはＨＭＧ２ポリペプチドの抗原性フラグメントと特異的に結合する高親和性抗体またはそのフラグメントも包含する。
ＨＭＧ１およびＨＭＧ２は別々のタンパク質でありながら、相同性の領域を有することを、当業者であれば理解されよう（図１を参照されたい）。したがって、高親和性抗体またはそのフラグメントは、ＨＭＧ１およびその抗原性フラグメントに特異的に結合することができ、ＨＭＧ２またはその抗原性フラグメントには結合することができないことが企図される。高親和性抗体またはそのフラグメントは、ＨＭＧ２およびその抗原性フラグメントに特異的に結合することができ、ＨＭＧ１またはその抗原性フラグメントには結合することができないことがさらに企図される。本発明の高親和性抗体は、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２の両方に共通であるエピトープに特異的に結合することができることがさらに企図される。共通のエピトープは、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２の両方に同一であってよく、そのような場合はエピトープを含むアミノ酸配列はＨＭＧ１およびＨＭＧ２に同一である。したがって、本発明の高親和性抗体は、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２の両方に特異的に結合することができる（例えば、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２の両方に存在する同一のエピトープを特異的に認識した抗体）。あるいは、共通のエピトープは、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２の両方に類似であってよい。例えば、類似のエピトープは、かなりの相同性（例えば、６０％〜９９％の同一性）を有することができ、かつ／または本発明の高親和性抗体が共有されたエピトープと交差反応するようにＨＭＧ１とＨＭＧ２との間に類似の３次元の立体配座を適用することができる。したがって、本発明の高親和性抗体は、ＨＭＧ１またはＨＭＧ２のいずれかと特異的に結合し、それぞれＨＭＧ２またはＨＭＧ１と交差反応することができる。本発明の高親和性抗体は、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２上に存在する類似のエピトープに対して異なる親和性を有することができる。したがって、本発明の高親和性抗体は、同一の、または異なる結合親和性のいずれかで、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２に結合することがさらに企図される。特定の一実施形態では、高親和性抗体またはそのフラグメントは、他の抗原よりもＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に特異的に結合する。
一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、ＨＭＧ１のＡボックスおよび／またはＨＭＧ２（例えば、それぞれ配列番号３、および２２）を含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。
別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、ＨＭＧ１のＢボックスおよび／またはＨＭＧ２（例えば、それぞれ配列番号４、および２３）を含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。
ＨＭＧ１のＡボックスおよびＢボックスの両方、ならびに／またはＨＭＧ２に由来するアミノ酸残基を含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）エピトープに特異的に結合する抗体も本発明に包含される。ＡボックスＢボックスの両方に由来するアミノ酸残基に由来するエピトープは、ＡボックスとＢボックスの連結部に由来する直線状ポリペプチドであってもよく、またはＡボックスおよびＢボックスの両方からのアミノ酸残基を含む３次元立体配座のポリペプチドに由来してもよい。
本発明には、複数の特異性を有する抗体も、特に包含される（例えば、２つまたはそれを超える別々の抗原に対する特異性を有する抗体（Caoら、2003年、Adv Drug Deliv Rev、55巻、171頁；Hudsonら、2003年、Nat Med、1巻、129頁に総説がある））。例えば、二重特異性抗体は、融合した２つの異なる結合特異性を含んでいる。最も単純な場合では、二重特異性抗体は、単一の標的の抗原上の２つの隣接するエピトープに結合し、そのような抗体は他の抗原と交差反応しない（上記に記載した通り）。あるいは、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原に結合することができ、そのような抗体は、２つの異なる分子（例えば、ＨＭＧ１とＨＭＧ２と）に特異的に結合するが、他の非関連の分子（例えば、ＢＳＡ）に結合しない。さらに、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に特異的に結合する抗体は、関連するＨＭＧタンパク質と交差反応してもよい。
本明細書に記載するＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２の「フラグメント」という用語は、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２ポリペプチド（例えば、ヒトＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２）のアミノ酸配列の、少なくとも５個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも１０個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも１５個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも２０個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも２５個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも４０個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも５０個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも６０個の近接するアミノ残基の、少なくとも７０個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも近接する８０個のアミノ酸残基の、少なくとも近接する９０個のアミノ酸残基の、少なくとも近接する１００個のアミノ酸残基の、少なくとも近接する１２５個のアミノ酸残基の、少なくとも近接する１５０個のアミノ酸残基の、少なくとも近接する１７５個のアミノ酸残基の、少なくとも近接する２００個のアミノ酸残基の、または少なくとも近接する２５０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含み、あるいはそれらから成る（または、それらから本質的に成る）ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２のペプチド、またはポリペプチドを含む。
本明細書に記載されるＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２の「フラグメント」という用語は、また、ＨＭＧＡ（例えば、ヒトＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２Ａボックス）ボックス、あるいはＨＭＧＢ（例えば、ヒトＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２Ｂボックス）ボックスの、少なくとも５個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも１０個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも１５個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも２０個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも２５個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも４０個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも５０個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも６０個の近接するアミノ酸残基の、少なくとも７０個の近接するアミノ酸残基の、または少なくとも近接する８０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含み、あるいはそれらから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドを特に含む。
本発明の「高親和性抗体」（本明細書では、「本発明の高親和性抗体」「高親和性抗体」とも呼ばれ、より拡張された語である「本発明の抗体」および単に「ＨＭＧ抗体」も包含する）には、限定するものではないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換えで生成された抗体、細胞内抗体、多特異性の抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）（二重特異性のｓｄＦｖｓを含む）、および抗イディオタイプの（抗Ｉｄ）抗体、および上記の任意のもののエピトープ結合性フラグメントが含まれる。本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれを超えた多特異性であってもよい。多特異性の抗体は、本発明のポリペプチドの様々なエピトープに特異的であってもよく、または本発明のポリペプチドに対しても、異種性のポリペプチドまたは固体の支持材料などの異種性のエピトープに対しても特異的であってもよい。例えば、ＰＣＴ出願WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360、WO92/05793；Tuttら、J.Immunol.、147巻、60〜69頁（1991年）；米国特許第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号、第5,601,819号；Kostelnyら、J.Immunol.、148巻、1547〜1553頁（1992年）を参照されたい。
多特異性の抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。そのような分子は、通常２つの抗原に結合するにすぎないが（即ち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ）、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体が本発明に包含される。ＢｓＡｂｓの例には、制限なく、一方のウデがＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２エピトープに対して向けられており、他方のウデが任意の他の抗原に対して向けられているものが含まれる。二重特異性抗原を作成する方法は、当技術分野では知られている。全長の二重特異性抗体の伝統的な生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の対の同時発現に基づくもので、この場合２本の鎖の特異性は異なる（Millsteinら、1983年、Nature、305巻、537〜539頁）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の分類はランダムであるため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、異なる抗体分子の可能性のある混合物を生成し、その中でたった１つだけが正しい二重特異的構造を有する。正しい分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィーの段階により行われるが、少々面倒であり、生成物の収量は低い。類似の手順が、WO93/08829、およびTrauneckerら、1991年、EMBO J.、10巻、3655〜3659頁に公開されている。より方向性のある取組みは、４価の二重特異性抗体であるジ−ディアボディの産生である。ジ−ディアボディを生成するための方法は、当技術分野では知られている（例えば、Luら、2003年、J Immunol Methods、279巻、219〜32頁、Marvinら、2005年、Acta Pharmacolical Sinica、26巻、649頁を参照されたい）。
様々な取組みにより、望ましい結合特異性を有する抗体の可変領域（抗体−抗原結合部位）を、免疫グロブリンの定常領域の配列に融合させる。この融合は、好ましくは、少なくともヒンジの部分、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む、免疫グロブリンの重鎖の定常領域との融合である。少なくとも１つの融合物に存在する軽鎖の結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリンの重鎖の融合物、および、所望により免疫グロブリンの軽鎖の融合物をコードするＤＮＡを別々の発現ベクター内に挿入し、適切な宿主生物体中に同時形質移入する。これにより、構築物に用いられている３つのポリペプチド鎖が同じ割合でないとき最適の収量がもたらされる場合に、実施形態における３つのポリペプチドフラグメント相互の割合調節における柔軟性は大きくなる。しかし、同じ割合の少なくとも２本のポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらす場合、または割合が特に重要ではない場合は、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖に対するコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
本取組みの一実施形態では、二重特異性抗体は、一方のウデに第１の結合特異性があるハイブリッドの免疫グロブリン重鎖（例えば、Ａ−ボックス、Ｂ−ボックスなどのＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２エピトープ）、ならびに他方のウデにハイブリッドの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）から構成される。二重特異性分子の半分だけに免疫グロブリン軽鎖が存在することで容易な分離方法がもたらされるので、この非対称性の構造により望ましい二重特異性の化合物の、不要な免疫グロブリン鎖の組合せからの分離が促進されることが見出された。この取組みは、WO94/04690に開示されている。二重特異性抗体を産生するさらなる詳細については、例えば、Sureshら、1986年、Methods in Enzymology、121巻、210頁を参照されたい。WO96/27011に開示されている別の一取組みによると、１対の抗体分子を操作して、組換えの細胞培養物から回収したヘテロ２量体のパーセント値を最大にすることができる。好ましい接合点は、抗体の定常領域のＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法では、第１の抗体分子の接合点からの小型アミノ酸側鎖の１つまたは複数を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大型のアミノ酸側鎖をより小型の側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることにより、大型の側鎖に同一のまたは類似の大きさの代償的な「空洞」が、第２の抗体分子の接合点上に作られる。これにより、ホモ２量体などの他の不要な最終産物よりもヘテロ２量体の収量を増大するためのメカニズムがわかる。
二重特異性抗体には、架橋結合した、または「ヘテロ接合」の抗体が含まれる。例えば、ヘテロ接合における抗体の一方はアビジンと、他方はビオチンと連結することができる。例えば、このような抗体は、ＨＩＶ感染の処置のために（WO91/00360、WO92/200373、およびEP03089）免疫系細胞を望ましくない細胞を標的としてそこに送り込む（米国特許第4,676,980号）ことが提案されている。あらゆる便利な架橋結合の方法を用いて、ヘテロ接合抗体を作成することができる。適切な架橋結合物質は当技術分野ではよく知られており、米国特許第4,676,980号に、数々の架橋結合の技術とともに開示されている。
少なくとも１個の本発明のヒンジ修飾を組み入れている２価を超える抗体が企図される。例えば、三重特異的抗体を調製することができる。例えば、Tuttら、J.Immunol.、147巻、60頁（1991年）を参照されたい。
特に企図される他の抗体は、「オリゴクローナル」抗体である。本明細書で用いる「オリゴクローナル抗体」という用語は、別々のモノクローナル抗体の予め決定された混合物を意味する。オリゴクローナル抗体を産生するための方法は、当技術分野では知られている。例えば、ＰＣＴ公開WO95/20401「実施例セクション」の実施例１、米国特許第5,789,208号および第6,335,163号を参照されたい。ある実施形態では、１つまたは複数のエピトープに対する抗体の予め決定された混合物から成るオリゴクローナル抗体は、単一の細胞で産生される。他の実施形態では、オリゴクローナル抗体は、通常の軽鎖と対を成して複数の特異性を有する抗体を産生することができる複数の重鎖を含む（例えば、ＰＣＴ公開、WO04/009618）。オリゴクローナル抗体は、単一の標的分子（例えば、ＨＭＧ１）上の複数のエピトープを標的にすることが望ましい場合に、特に有用である。当業者であれば、意図された目的および望まれた必要性に、どのような型の抗体または抗体の混合物が適用可能であるかを知っており、または決定することができる。特に、本発明の抗体は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、ＨＭＧ１抗原に特異的に結合する抗原結合性部位（例えば、抗ＨＭＧ１抗体の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む分子を含んでいる。本発明の抗体は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、ＨＭＧ２抗原に特異的に結合する抗原結合性部位を含む分子（例えば、抗ＨＭＧ２抗体の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ））を含んでいることも特に企図される。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のあらゆるタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであってもよい。免疫グロブリンは重鎖および軽鎖の両方を有することができる。一並びのＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹの重鎖は、カッパまたはラムダ型の軽鎖と対になることができる。
本発明の抗体は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、即ち抗原結合性部位を含む分子も包含し、これらのフラグメントは、限定するものではないが、Ｆｃ領域またはそのフラグメントを含む別の免疫グロブリンドメインに融合してもよく、またはしなくてもよい。本明細書で強調するように、「抗体」および「抗体類」という用語は、本明細書に記載するＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２、全長の抗体、ならびに、免疫グロブリンの免疫学的に活性なフラグメントもしくは本明細書に記載する他のタンパク質に融合している、本明細書に記載する少なくとも１個の新規なアミノ酸残基を含む、Ｆｃ領域またはそのフラグメントを含む、そのＦｃ変異体に特異的に結合する抗体を含む。このような変異体のＦｃ融合物には、限定するものではないが、ｓｃＦｖ−Ｆｖ融合物、可変領域（例えば、ＶＬおよびＶＨ）−Ｆｃ融合物、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合物が含まれる。免疫グロブリン分子は、あらゆるタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであってもよい。
本発明の抗体は、また、哺乳動物（例えば、ヒト）において、半減期（例えば、血清半減期）が、５日を超える、１０日を超える、１５日を超える、２０日を超える、２５日を超える、３０日を超える、３５日を超える、４０日を超える、４５日を超える、２カ月を超える、３カ月を超える、４カ月を超える、または５カ月を超える抗体を包含する。哺乳動物（例えば、ヒト）における本発明の抗体の半減期が増大することで、哺乳動物における前記抗体または抗体フラグメントの血清の力価の上昇がもたらされ、したがって、前記抗体または抗体フラグメントの投与頻度は減少し、かつ／または投与する前記抗体または抗体フラグメントの濃度は低下する。ｉｎ ｖｉｖｏの半減期が増大した抗体は、当業者には周知の技術により産生することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの半減期の増大した抗体を、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与すると確認されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失、または付加）することにより産生することができる（例えば、国際公開WO97/34631、WO04/029207、US6,737,056、および米国特許公開第2003/0190311号、ならびに以下により詳しく論じるものを参照されたい）。
一実施形態では、本発明の抗体は、例えば、Ghetieら、1997年、Nat Biotech.、15巻、637〜40頁；Duncanら、1988年、Nature、332巻、563〜564頁；Lundら、1991年、J.Immunol、147巻、2657〜2662頁；Lundら、1992年、Mol Immunol、29巻、53〜59頁；Alegreら、1994年、Transplantation、57巻、1537〜1543頁；Hutchinsら、1995年、Proc Natl.Acad Sci U S A、92巻、11980〜11984頁；Jefferisら、1995年、Immunol Lett.、44巻、111〜117頁；Lundら、1995年、Faseb J、9巻、115〜119頁；Jefferisら、1996年、Immunol Lett、54巻、101〜104頁；Lundら、1996年、J Immunol、157巻、4963〜4969頁；Armourら、1999年、Eur J Immunol、29巻、2613〜2624頁；Idusogieら、2000年、J Immunol、164巻、4178〜4184頁；Reddyら、2000年、J Immunol、164巻、1925〜1933頁；Xuら、2000年、Cell Immunol、200巻、16〜26頁；Idusogieら、2001年、J Immunol、166巻、2571〜2575頁；Shieldsら、2001年、J Biol Chem、276巻、6591〜6604頁；Jefferisら、2002年、Immunol Lett、82巻、57〜65頁；Prestaら、2002年、Biochem Soc Trans、30巻、487〜490頁；米国特許第5,624,821号、第5,885,573号、第5,677,425号、第6,165,745号、第6,277,375号、第5,869,046号、第6,121,022号、第5,624,821号、第5,648,260号、第6,194,551号、第6,737,056号、第6,821,505号、第6,277,375号、米国特許出願第10/370,749号、およびＰＣＴ出願WO94/2935、WO99/58572、WO00/42072、WO02/060919、WO04/029207に公開されたものなど、それらのＦｃドメイン内に、修飾／置換、および／または新規なアミノ酸を含むことができる。Ｆｃドメインの他の修飾／置換は、当業者であれば直ちに明白となるであろう。
それらのＦｃ領域に、修飾／置換、および／または新規なアミノ酸残基を含む本発明の抗体は、当業者であればよく知っている数々の方法により産生することができる。非制限的な例として、抗体コード領域（例えば、ハイブリドーマからの）の単離、および単離された抗体コード領域のＦｃ領域における１つまたは複数の望ましい置換の作成が含まれる。あるいは、本発明の抗体の可変領域を、１つまたは複数の修飾／置換、および／または新規なアミノ酸残基を含むＦｃ領域をコードするベクター中にサブクローニングすることができる。
本発明の抗体を修飾してグリコシル化を変化させ、さらに抗体の１つまたは複数の機能上の特性を変化させることもできる。
一実施形態では、本発明の抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、アグリコシル化の抗体（即ち、グリコシル化を欠く抗体）を作成することができる。グリコシル化を変化させて、例えば、標的の抗原に対する抗体の親和性を増大させることができる。このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化の部位を変更することにより行うことができる。例えば、１つまたは複数の可変領域のフレームワークのグリコシル化部位の除去をもたらす１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができ、したがってその部位におけるグリコシル化を除去することができる。このようなアグリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性を増大することができる。このような取組みは、米国特許第5,714,350号および第6,350,861号にさらに詳しく記載されている。
さらに、または、あるいは、フコシル化された残基の量が減少した低フコシル化の抗体、または２分するＧｌｃＮＡｃ構造が増大した抗体などの、変更されたタイプのグリコシル化を有する、本発明の抗体を作成することができる。このような変更されたグリコシル化のパターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大することが実証されている。このような炭水化物の修飾は、例えば、グリコシル化の機構の変更された宿主細胞において抗体を発現させることにより行うことができる。グリコシル化の機構の変更された細胞は当技術分野において記載されており、本発明の組換えの抗体を発現してそれによりグリコシル化の変更した抗体を生成する宿主細胞として用いることができる。例えば、Shields,R.L.ら、（2002年）J.Biol.Chem.、277巻、26733〜26740頁、Umanaら、（1999年）Nat.Biotech.、17巻、176〜1頁、および欧州特許EP1,176,195、ＰＣＴ公開WO03/035835、WO99/54342を参照されたい。
以下でより詳しく論じるように、本発明の抗体は、単独で、または他の組成物と組み合わせて用いることができる。抗体をＮ−もしくはＣ−末端で異種性のポリペプチドにさらに組換えで融合して、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）することができる。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識、および異種性のポリペプチド、薬物、放射性核種、もしくは毒素などのエフェクター分子として有用な分子に、組換えで融合し、または結合することができる。例えば、ＰＣＴ公開WO92/08495、WO91/14438、WO89/12624、米国特許第5,314,995号、およびEP396,387を参照されたい。
本発明の抗体には、即ち、抗体が、ＨＭＧ１および／もしくはＨＭＧ２ポリペプチド、またはそれらのフラグメントへ結合するのを妨げないように、かつ／あるいは望ましい反応を産生するのを妨げないように、あらゆるタイプの分子の抗体への共有結合性の付着により修飾されている誘導体が含まれる。例えば、制限しようとするものではないが、抗原の誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、周知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性の切断、細胞のリガンドもしくは他のタンパク質への連結などにより修飾されている抗体が含まれる。多くの化学的修飾の任意のものを、限定するものではないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝性の合成などを含む周知の技術により行うことができる。さらに、誘導体は、１つまたは複数の非古典的なアミノ酸を含むことができる。以下の、「抗体の誘導体および複合体」というタイトルのセクション５．５を参照されたい。
本発明の抗体は、その交差反応性に関して記載し、または特定することもできる。本発明のポリペプチドの、あらゆる他の類似体、オーソログ、またはホモログに結合しない抗体が含まれる。本発明のヒトＨＭＧ１ポリペプチド（例えば、ヒトＨＭＧ１ＡボックスまたはＢボックス）に少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性（当技術分野では周知の方法、および本明細書に記載した方法を用いて計算して）でポリペプチド（および、ポリペプチドのフラグメント）に結合する抗体も本発明に含まれる。特定の実施形態では、本発明の抗体は、ネズミ科動物、ラット、および／またはウサギのヒトＨＭＧ１タンパク質のホモログ、ならびにその対応するエピトープと交差反応する。ヒトＨＭＧ２ポリペプチド（例えば、ヒトＨＭＧ２ＡボックスまたはＢボックス）に少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性（当技術分野では周知の方法、および本明細書に記載した方法を用いて計算して）でポリペプチド（およびポリペプチドフラグメント）に結合する抗体も、本発明に包含される。ヒトＨＭＧ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する抗体は、ネズミ科動物、ラット、および／またはウサギのヒトＨＭＧ１タンパク質のホモログ、ならびにその対応するエピトープと交差反応することができることがさらに企図される。
本発明のＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２ポリペプチドに９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性（当技術分野では周知の方法、および本明細書に記載した方法を用いて計算して）で、ポリペプチドに結合しない抗体も、本発明に含まれる。
一実施形態では、ＨＭＧ１ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、以下の１つまたは複数を妨げる／拮抗する／阻害する：ＲＡＧＥに対するＨＭＧＢ１の結合、１つまたは複数のトール様受容体（例えば、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４）へのＨＭＧＢ１の結合、細胞表面（例えば、ＴＨＰ−１細胞）へのＨＭＧＢ１の結合、炎症促進性サイトカインのＨＭＧ１が媒介する放出、ＨＭＧ１が媒介する炎症、ＨＭＧ１が媒介する敗血症、ＨＭＧ１が媒介する炎症（例えば、関節の）、ならびにＨＭＧ１が媒介する関節炎。これらの活性は、当技術分野では周知の１つまたは多くの方法によりアッセイすることができる。例えば、US20040005316、第6,468,533号、および第6,448,223号、ならびに下記「実施例」というタイトルのセクション６を参照されたい。
「５０％阻害濃度」（「ＩＣ５０」と略される）という用語は、阻害物質が標的にする分子（例えば、ＨＭＧ１）の所与の活性を５０％阻害するのに必要とされる阻害物質（例えば、本発明の抗体）の濃度を表す。当業者であれば、ＩＣ５０値が低いほど、より有力な阻害物質に相当することを理解するであろう。一実施形態では、本発明の抗体は、５０００ｎｇ／ｍｌ未満の、または４０００ｎｇ／ｍｌ未満の、または３０００ｎｇ／ｍｌ未満の、または２０００ｎｇ／ｍｌ未満の、または１０００ｎｇ／ｍｌ未満の、または５００ｎｇ／ｍｌ未満の、または２５０ｎｇ／ｍｌ未満の、または１００ｎｇ／ｍｌ未満の、または５０ｎｇ／ｍｌ未満の、または１０ｎｇ／ｍｌ未満の、または５ｎｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で、ＨＭＧ１が媒介する炎症促進性サイトカインの放出を阻害する。別の一実施形態では、本発明の抗体は、１０００ｎＭ未満の、または５００ｎＭ未満の、または２５０ｎＭ未満の、または１００ｎＭ未満の、または５０ｎＭ未満の、または２５Ｍ未満の、または１０ｎＭ未満の、または５ｎＭ未満の、０．２５ｎＭ未満の、または０．１ｎＭ未満の、または０．０１ｎＭ未満のＩＣ５０で、ＨＭＧ１が媒介する炎症促進性サイトカインの放出を阻害する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＲＡＧＥに対するＨＭＧ１の結合を妨げる／拮抗する／阻害するが、１つまたは複数のトール様受容体（例えば、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４）に対するＨＭＧＢ１の結合には、本質的に影響を及ぼさない。別の一実施形態では、本発明の抗体は、１つまたは複数のトール様受容体（例えば、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４）に対するＨＭＧ１の結合を妨げる／拮抗する／阻害するが、ＲＡＧＥに対するＨＭＧ１の結合には本質的に影響を及ぼさない。なお別の一実施形態では、本発明の抗体は、ＲＡＧＥに対するＨＭＧ１の結合を妨げ／拮抗し／阻害し、かつ、１つまたは複数のトール様受容体（例えば、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４）に対するＨＭＧ１の結合を阻害する。これらの活性は、当技術分野では周知の１つまたは多くの方法によりアッセイすることができる。例えば、US20040005316、第6,468,533号、および第6,448,223号、ならびに以下「実施例」というタイトルのセクション６を参照されたい。
特定の実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または約１００％、ＲＡＧＥに対するＨＭＧ１の結合を阻害する。別の特定の一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％、１つまたは複数のトール様受容体（例えば、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４）に対するＨＭＧ１の結合を阻害する。別の特定の一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％、ＲＡＧＥに対するＨＭＧ１の結合を阻害する。別の特定の一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％、１つまたは複数のトール様受容体（例えば、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４）に対するＨＭＧ１の結合を阻害する。
本明細書で実証するように、抗体は、様々な供給源から単離された同じポリペプチドの間を識別することができる。いかなる特定の理論に拘泥しようとするものではないが、異なる供給源から単離されたアミノ酸配列が類似の、または同一のポリペプチドは、限定するものではないが、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、アセチル化、メチル化、グリコシル化など）、全体の構造の変更（例えば、ジスルフィド結合および／またはフォールディングにおける変更）、ならびにポリペプチドが結合することができるあらゆる他の分子（例えば、塩、ポリヌクレオチドおよび／または他のポリペプチドなどのさらなるサブユニット）における相違を含む、数々の相違により区別することができる。一実施形態では、本発明の抗体は、天然のＨＭＧ１（例えば、哺乳動物の細胞または組織から単離されたもの）と同じ、またはそれより高い親和性で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で組換えで生成されたＨＭＧ１に特異的に結合する。別の一実施形態では、本発明の抗体は、大腸菌で生成された組換えのＨＭＧ１と同じ、またはそれより高い親和性で、天然のＨＭＧ１（例えば、哺乳動物の細胞または組織から単離されたもの）に結合する。なお別の一実施形態では、本発明の抗体は、限定するものではないが、核のＨＭＧ１（例えば、凍結解凍により細胞から単離されたもの）、放出されたＨＭＧ１（例えば、壊死細胞の上清から単離されたもの）、および活性化されたＨＭＧ１（例えば、ＬＰＳ刺激した細胞など、刺激した細胞から単離されたもの）を含む、１つまたは複数の形態の天然のＨＭＧ１に結合する。さらに別の一実施形態では、本発明の抗体は、限定するものではないが、核のＨＭＧ１（例えば、凍結解凍により細胞から単離されたもの）、放出されたＨＭＧ１（例えば、壊死細胞の上清から単離されたもの）、および活性化されたＨＭＧ１（例えば、ＬＰＳ刺激した細胞など、刺激した細胞から単離されたもの）を含む１つまたは複数の形態の天然のＨＭＧ１に結合しない。天然の、および組換えのＨＭＧ１を得るための特定の方法は、本明細書に開示してある（以下、実施例２を参照されたい）。
一実施形態では、本発明の抗体は、可溶性のＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に特異的に結合する。別の一実施形態では、本発明の抗体は、固定化したＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に特異的に結合する。なお別の一実施形態では、本発明の抗体は、可溶性の、および不溶性両方のＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に特異的に結合する。
上記に記載したように、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２は、既知のポリヌクレオチド（即ち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）結合性タンパク質である。一実施形態では、本発明の抗体は、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２がポリヌクレオチド分子に結合している前記ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に結合する。別の一実施形態では、本発明の抗体は、以下の１つまたは複数を妨げる／拮抗する／阻害する：ＲＡＧＥへのＨＭＧＢ１の結合、１つまたは複数のトール様受容体（例えば、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４）へのＨＭＧＢ１の結合、細胞表面（例えば、ＴＨＰ−１細胞）へのＨＭＧＢ１の結合、炎症促進性サイトカインのＨＭＧ１が媒介する放出、ＨＭＧ１が媒介する炎症、ＨＭＧ１が媒介する敗血症、ＨＭＧ１が媒介する炎症（例えば、関節の）、およびＨＭＧ１が媒介する関節炎であって、これらの場合、前記ＨＭＧ１はポリヌクレオチドに結合している。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、炎症反応を促進するものである（例えば、微生物または壊死細胞に由来するポリヌクレオチド）。
特定の一実施形態では、本発明の抗体はアセチル化されたＨＭＧ１に、非アセチル化のＨＭＧ１よりも高い親和性で結合する。別の特定の一実施形態では、本発明の抗体は、非アセチル化のＨＭＧ１にアセチル化されたＨＭＧ１よりも高い親和性で結合する。なお別の一実施形態では、本発明の抗体は、アセチル化されたＨＭＧ１および非アセチル化のＨＭＧ１の両方に、本質的に同じ親和性で結合するのを妨げる。
別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、ヒトまたは他の動物の、例えば、哺乳動物および無脊椎動物の、ＨＭＧ１ポリペプチドまたはその抗原性フラグメントを含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。特定の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、ヒトＨＭＧ１ポリペプチド（配列番号１または２）を含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。ヒトおよび他の動物のＨＭＧ１ポリペプチドは、当技術分野ではよく知られている（例えば、US20040005316、第6,468,533号、および第6,448,223号を参照されたい）。
一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、配列番号１または２のヒトＨＭＧ１ポリペプチドに、少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、または少なくとも少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するＨＭＧ１ポリペプチドを含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。
別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、配列番号３のヒトＨＭＧ１Ａボックスポリペプチドに、少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも８５％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。
さらに別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、配列番号４、および／または配列番号２８、および／または配列番号２９のヒトＨＭＧ１Ｂボックスポリペプチドに、少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも８５％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。
別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、ヒトまたは他の動物の、例えば、哺乳動物および無脊椎動物の、ＨＭＧ２ポリペプチドまたはその抗原性フラグメントを含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。特定の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、ヒトＨＭＧ２ポリペプチド（配列番号２１）を含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。ヒトおよび他の動物のＨＭＧ２ポリペプチドは、当技術分野ではよく知られている（例えば、Jantzenら、1990年、Nature、344巻、830〜6頁；Kolodrubetz、1990年、Nucleic Acids Res.、18巻、5565頁；Laudetら、1993年、Nucleic Acids Res.、21巻、2493〜501頁、およびThomasら、2001年、Trends Biochem Sci.、26巻、167〜74頁を参照されたい）。
一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、配列番号２１のヒトＨＭＧ２ポリペプチドに、少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、または少なくとも少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するＨＭＧ２ポリペプチドを含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。
別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、配列番号２２のヒトＨＭＧ２Ａボックスポリペプチドに、少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも８５％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。
さらに別の一実施形態では、本発明の高親和性抗体は、配列番号２３のヒトＨＭＧ２Ｂボックスポリペプチドに、少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも８５％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、あるいはそれから成る（または、それから本質的に成る）ポリペプチドに特異的に結合する。
２つのアミノ酸配列（または２つの核酸配列）の同一性パーセントは、例えば、最適の比較の目的で配列をアラインすることにより決定することができる（例えば、第１の配列の配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応する位置のアミノ酸またはヌクレオチドを比較し、２配列間の同一性パーセントは、配列が共有する同一の位置の数の関数である（即ち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列の実際の比較は、よく知られた方法により、例えば、数学のアルゴリズムを用いて実行することができる。このような数学のアルゴリズムの、特定の、非限定的な例は、Karlinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90巻、5873〜5877頁（1993年）に記載されている。このようなアルゴリズムは、Schafferら、Nucleic Acids Res.、29巻、2994〜3005頁（2001年）に記載されているように、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（バージョン２．２）中に組み入れられている。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータを使用することができる。２００２年４月１０日に入手可能なものとして、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。一実施形態では、検索されたデータベースは非重複性の（ＮＲ）データベースであり、配列を比較するためのパラメータは、フィルターなし、期待値１０、ワードサイズ３、ＭａｔｒｉｘはＢＬＯＳＵＭ６２、およびＧａｐ Ｃｏｓｔは１１のＥｘｉｓｔｅｎｃｅを有しＥｘｔｅｎｓｉｏｎは１に設定することができる。
配列の比較に利用される数学アルゴリズムの、別の非限定的な例には、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムである、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９年）がある。このようなアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み入れられており、ＡＬＩＧＮプログラムは、ＧＣＧ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部分である。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合には、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを用いることができる。配列を分析するためのさらなるアルゴリズムが、当技術分野では知られており、TorellisおよびRobotti、Comput.Appl.Biosci.、10巻、3〜5頁（1994年）に記載されているＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ、ならびにPearsonおよびLipman、Proc.Natl.Acad.Sci USA、85巻、2444〜8頁（1988年）に記載されているＦＡＳＴＡが含まれる。
別の一実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラム（２００１年８月３１日、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍで入手可能）を用いて、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６３マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１２、１０、８、６、または４というギャップ重量、および２、３、または４という長さ重量を用いて実行することができる。さらに別の一実施形態では、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケ−ジにおけるＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｃ．ｃｏｍで入手可能）を用いて、５０というギャップ重量、および３という長さ重量を用いて実行することができる。
本発明の別の一実施形態は、１０−５Ｍ未満の、または１０−６Ｍ未満の、または１０−７Ｍ未満の、または１０−８Ｍ未満の、または１０−９Ｍ未満の、または１０−１０Ｍ未満の、または１０−１１Ｍ未満の、または１０−１２Ｍ未満の、または１０−１３Ｍ未満の、または５×１０−１３Ｍ未満の、または１０−１４Ｍ未満の、または５×１０−１４Ｍ未満の、または１０−１５Ｍ未満の、または５×１０−１５Ｍ未満の解離定数、即ちＫｄ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）で、ＨＭＧ１およびその抗原性フラグメントに特異的に結合する抗体である。なお別の一実施形態では、ＨＭＧ１およびその抗原性フラグメントに特異的に結合する本発明の抗体は、約１０−７Ｍと約１０−８Ｍの間の、約１０−８Ｍと約１０−９Ｍの間の、約１０−９Ｍと約１０−１０Ｍの間の、約１０−１０Ｍと約１０−１１Ｍの間の、約１０−１１Ｍと約１０−１２Ｍの間の、約１０−１２Ｍと約１０−１３Ｍの間の、約１０−１３Ｍと約１０−１４Ｍの間の解離定数、即ちＫｄ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）を有する。なお別の一実施形態では、ＨＭＧ１およびその抗原性フラグメントに特異的に結合する本発明の抗体は、１０−７Ｍと１０−８Ｍの間の、１０−８Ｍと１０−９Ｍの間の、１０−９Ｍと１０−１０Ｍの間の、１０−１０Ｍと１０−１１Ｍの間の、１０−１１Ｍと１０−１２Ｍの間の、１０−１２Ｍと１０−１３Ｍの間の、１０−１３Ｍと１０−１４Ｍの間の解離定数、即ちＫｄ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）を有する。
本発明の別の一実施形態は、１０−５Ｍ未満の、または１０−６Ｍ未満の、または１０−７Ｍ未満の、または１０−８Ｍ未満の、または１０−９Ｍ未満の、または１０−１０Ｍ未満の、または１０−１１Ｍ未満の、または１０−１２Ｍ未満の、または１０−１３Ｍ未満の、または５×１０−１３Ｍ未満の、または１０−１４Ｍ未満の、５×１０−１４Ｍ未満の、または１０−１５Ｍ未満の、または５×１０−１５Ｍ未満の解離定数、即ちＫｄ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）で、ＨＭＧ２およびその抗原性フラグメントに特異的に結合する抗体である。なお別の一実施形態では、ＨＭＧ２およびその抗原性フラグメントに特異的に結合する本発明の抗体は、約１０−７Ｍと約１０−８Ｍの間の、約１０−８Ｍと約１０−９Ｍの間の、約１０−９Ｍと約１０−１０Ｍの間の、約１０−１０Ｍと約１０−１１Ｍの間の、約１０−１１Ｍと約１０−１２Ｍの間の、約１０−１２Ｍと約１０−１３Ｍの間の、約１０−１３Ｍと約１０−１４Ｍの間の解離定数、即ちＫｄ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）を有する。なお別の一実施形態では、ＨＭＧ２およびその抗原性フラグメントに特異的に結合する本発明の抗体は、１０−７Ｍと１０−８Ｍの間の、１０−８Ｍと１０−９Ｍの間の、１０−９Ｍと１０−１０Ｍの間の、１０−１０Ｍと１０−１１Ｍの間の、１０−１１Ｍと１０−１２Ｍの間の、１０−１２Ｍと１０−１３Ｍの間の、１０−１３Ｍと１０−１４Ｍの間の解離定数、即ちＫｄ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）を有する。
平衡解離定数（Ｋｄ）がＫｏｆｆ／Ｋｏｎと定義されることは、当技術分野ではよく知られている。Ｋｄが低い（即ち、高親和性の）結合性分子（例えば、および抗体）は、Ｋｄが高い（即ち、低親和性の）結合性分子（例えば、および抗体）よりも好ましいことは、一般的に理解されている。しかし、いくつかの場合では、ＫｏｎまたはＫｏｆｆの値は、Ｋｄ値よりも妥当であることがある。所与の抗体を適用するにはどの動態学的パラメータが最も重要であるかは、当業者であれば決定することができる。ある実施形態では、本発明の抗体は、他の抗原に対するよりある抗原に対してより低いＫｄを有する。
別の一実施形態では、抗体はＨＭＧ１およびその抗原性フラグメントに、１×１０−３ｓ−１未満の、または３×１０−３ｓ−１未満のＫｏｆｆで結合する。他の実施形態では、抗体はＨＭＧ１およびその抗原性フラグメントに、１０−３ｓ−１未満の、５×１０−３ｓ−１未満の、１０−４ｓ−１未満の、５×１０−４ｓ−１未満の、１０−５ｓ−１未満の、５×１０−５ｓ−１未満の、１０−６ｓ−１未満の、５×１０−６ｓ−１未満の、１０−７ｓ−１未満の、５×１０−７ｓ−１未満の、１０−８ｓ−１未満の、５×１０−８ｓ−１未満の、１０−９ｓ−１未満の、５×１０−９ｓ−１未満の、または１０−１０ｓ−１未満のＫｏｆｆで結合する。
別の一実施形態では、抗体はＨＭＧ２およびその抗原性フラグメントに、１×１０−３ｓ−１未満の、または３×１０−３ｓ−１未満のＫｏｆｆで結合する。他の実施形態では、抗体はＨＭＧ２およびその抗原性フラグメントに、１０−３ｓ−１未満の、５×１０−３ｓ−１未満の、１０−４ｓ−１未満の、５×１０−４ｓ−１未満の、１０−５ｓ−１未満の、５×１０−５ｓ−１未満の、１０−６ｓ−１未満の、５×１０−６ｓ−１未満の、１０−７ｓ−１未満の、５×１０−７ｓ−１未満の、１０−８ｓ−１未満の、５×１０−８ｓ−１未満の、１０−９ｓ−１未満の、５×１０−９ｓ−１未満の、または１０−１０ｓ−１未満のＫｏｆｆで結合する。
別の一実施形態では、本発明の抗体は、ＨＭＧ１および／またはその抗原性フラグメントに、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０９Ｍ−１ｓ−１の解離速度定数、即ちＫｏｎ速度で結合する。
別の一実施形態では、本発明の抗体は、ＨＭＧ２および／またはその抗原性フラグメントに、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０９Ｍ−１ｓ−１の解離速度定数、即ちＫｏｎ速度で結合する。
すべてのポリペプチドのような抗体は等電点（ｐＩ）を有し、等電点はポリペプチドが実効電荷をもたないｐＨと一般的に定義される。溶液のｐＨがタンパク質の等電点（ｐＩ）に等しいときにタンパク質の溶解性が通常最も低くなることは、当技術分野では知られている。本明細書で用いられるｐＩ値は、優勢な荷電形態のｐＩと定義される。タンパク質のｐＩは、限定するものではないが、等電点電気泳動、および様々なコンピュータアルゴリズムを含む様々な方法により決定することができる（例えば、Bjellqvistら、1993年、Electrophoresis、14巻、1023頁を参照されたい）。さらに、抗体のＦａｂドメインの熱融点（Ｔｍ）は、抗体の熱安定性の優れた指標であってもよく、有効期間の指標をさらに提供することができる。Ｔｍが低いほど凝集する／安定性が劣ることを示し、一方ではＴｍが高いほど凝集が少ない／安定性がよいことを示す。したがって、ある実施形態では、Ｔｍのより高い抗体が好ましい。タンパク質ドメイン（例えば、Ｆａｂドメイン）のＴｍは、当技術分野では周知のあらゆる標準の方法を用いて、例えば、示差走査熱量測定により測定することができる（例えば、Vermeerら、2000年、Biophys.J.、78巻、394〜404頁；Vermeerら、2000年、Biophys.J.、79巻、2150〜2154頁を参照されたい）。
したがって、本発明のさらなる非排他的な実施形態は、特定の等電点（ｐＩ）または融解温度（Ｔｍ）などのある種の好ましい生化学的特徴を有する、本発明の高親和性抗体を含む。
より詳しくは、一実施形態では、本発明の高親和性抗体のｐＩは５．５から９．５の範囲である。なお別の特定の一実施形態では、本発明の高親和性抗体のｐＩは、約５．５から約６．０、または約６．０から約６．５、または約６．５から約７．０、または約７．０から約７．５、または約７．５から約８．０、または約８．０から約８．５、または約８．５から約９．０、または約９．０から約９．５の範囲である。他の詳しい実施形態では、本発明の高親和性抗体のｐＩは、５．５〜６．０、または６．０から６．５、または６．５から７．０、または７．０〜７．５、または７．５〜８．０、または８．０〜８．５、または８．５〜９．０、または９．０〜９．５の範囲である。さらにより詳しくは、本発明の高親和性抗体のｐＩは、少なくとも５．５、または少なくとも６．０、または少なくとも６．３、または少なくとも６．５、または少なくとも６．７、または少なくとも６．９、または少なくとも７．１、または少なくとも７．３、または少なくとも７．５、または少なくとも７．７、または少なくとも７．９、または少なくとも８．１、または少なくとも８．３、または少なくとも８．５、または少なくとも８．７、または少なくとも８．９、または少なくとも９．１、または少なくとも９．３、または少なくとも９．５である。他の特定の実施形態では、本発明の高親和性抗体のｐＩは、少なくとも約５．５、または少なくとも約６．０、または少なくとも約６．３、または少なくとも約６．５、または少なくとも約６．７、または少なくとも約６．９、または少なくとも約７．１、または少なくとも約７．３、または少なくとも約７．５、または少なくとも約７．７、または少なくとも約７．９、または少なくとも約８．１、または少なくとも約８．３、または少なくとも約８．５、または少なくとも約８．７、または少なくとも約８．９、または少なくとも約９．１、または少なくとも約９．３、または少なくとも約９．５である。
抗体におけるイオン化可能な残基の数および位置を変更することにより、溶解性を最適化して、ｐＩを調節することが可能である。例えば、ポリペプチドのｐＩは、好適なアミノ酸置換を行うことにより（例えば、リジンなどの電荷を帯びたアミノ酸を、アラニンなどの非電荷の残基に置換することにより）操作することができる。いかなる特定の理論によって拘泥しようとするものではないが、前記抗体のｐＩの変化をもたらす抗体のアミノ酸の置換により、抗体の溶解性および／または安定性が改善することがある。当業者であれば、望ましいｐＩを達成するために、どのアミノ酸置換が特定の抗体に最も好適であるかわかるであろう。一実施形態では、ｐＩを変更するために、本発明の抗体に置換を導入する。ＦｃγＲに対する結合の変更をもたらすＦｃ領域の置換（上記に記載）も、ｐＩにおける変化をもたらすことができることが、特に企図される。別の一実施形態では、ＦｃγＲ結合における望ましい変更、およびｐＩにおけるあらゆる望ましい変化の両方をもたらすために、Ｆｃ領域の置換が特に選択される。
一実施形態では、本発明の高親和性抗体のＴｍは６５℃から１２０℃の範囲である。特定の実施形態では、本発明の高親和性抗体のＴｍは、約７５℃から約１２０℃、または約７５℃から約８５℃、または約８５℃から約９５℃、または約９５℃から約１０５℃、または約１０５℃から約１１５℃、または約１１５℃から約１２０℃の範囲である。他の特定の実施形態では、本発明の高親和性抗体のＴｍは、７５℃から１２０℃、または７５℃から８５℃、または８５℃から９５℃、または９５℃から１０５℃、または１０５℃から１１５℃、または１１５℃から１２０℃の範囲である。さらに他の特定の実施形態では、本発明の高親和性抗体のＴｍは、少なくとも約６５℃、または少なくとも約７０℃、または少なくとも約７５℃、または少なくとも約８０℃、または少なくとも約８５℃、または少なくとも約９０℃、または少なくとも約９５℃、または少なくとも約１００℃、または少なくとも約１０５℃、または少なくとも約１１０℃、または少なくとも約１１５℃、または少なくとも約１２０℃である。さらに他の特定の実施形態では、本発明の高親和性抗体のＴｍは、少なくとも６５℃、または少なくとも７０℃、または少なくとも７５℃、または少なくとも８０℃、または少なくとも８５℃、または少なくとも９０℃、または少なくとも９５℃、または少なくとも１００℃、または少なくとも１０５℃、または少なくとも１１０℃、または少なくとも１１５℃、または少なくとも１２０℃である。
特定の一実施形態では、本発明の高親和性抗体またはそのフラグメントは、ヒト抗体またはヒト化抗体である。
一実施形態では、本発明は、ＨＭＧ１に高親和性で特異的に結合する特定の抗体（およびそのフラグメント）も含む。特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ ２０１１０−２２０９）に寄託され、それぞれＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６１４２、ＰＴＡ−６１４３、ＰＴＡ−６２５９、およびＰＴＡ−６２５８が割り当てられている、本明細書で「Ｓ２」、「Ｓ４」、「Ｓ１６」、および「Ｇ４」と呼ぶ抗ＨＭＧ１抗体である。これらの寄託は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｏｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの条項に従って維持される。言及する株は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙの条項に従って維持されるので、特許局のＢｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙへの調印で入手可能になるであろう。
別の一実施形態では、本発明は、本明細書に開示されている１つまたは複数の可変領域を含むＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に特異的に結合する抗体を含む（図２Ａ〜Ｊ、配列番号５〜２０、２４〜２７、および３０〜７３を参照されたい）。
本発明は、軽鎖可変（ＶＬ）領域、および／または重鎖可変（ＶＨ）領域における１つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含む、Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１６、Ｇ２０、Ｇ３４、Ｇ３５、Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ１７、およびＥ１１の変異体も包含する（図２Ａ〜Ｊ、配列番号５〜２０、２４〜２７、および３０〜７３を参照されたい）。本発明は、１つもしくは複数のＶＬＣＤＲ、および／または１つまたは複数のＶＨＣＤＲにおいて１つまたは複数のさらなるアミノ酸残基が置換した、Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１６、Ｇ２０、Ｇ３４、Ｇ３５、Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ１７、およびＥ１１の変異体も包含する（図２Ａ〜Ｊ、配列番号５〜２０、２４〜２７、および３０〜７３を参照されたい）。Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１６、Ｇ２０、Ｇ３４、Ｇ３５、Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ１７、およびＥ１１（図２Ａ〜Ｊ、配列番号５〜２０、２４〜２７、および３０〜７３を参照されたい）のＶＨドメイン、ＶＨＣＤＲ、ＶＬドメイン、および／またはＶＬＣＤＲに、置換が導入されたことにより生成された抗体を、例えば、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に対して結合するその能力について（例えば、限定するものではないが、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅを含む免疫アッセイにより）、あるいはＨＭＧ１誘発性サイトカインの放出を阻害し、炎症性疾患または１つもしくは複数のその症状を予防し、処置し、管理し、または改善するその能力について、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。
本明細書で言及する相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基の数は、Ｋａｂａｔらのものであることが理解されよう（1991年、NIH Publication91-3242、National Technical Information Serviece、Springfield、VA）特に、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６５（ＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＣＤＲ３）である。ＣＤＲは抗体によって大きく変化することに留意されたい（および、定義上Ｋａｂａｔのコンセンサス配列に相同性を示さない）。フレームワーク残基の最大アラインメントでは、Ｆｖ領域に使用するために、番号方式における「スペーサー」残基の挿入を必要とすることが多い。本明細書で言及するＣＤＲは、上記のＫａｂａｔらのものであることが理解されよう。さらに、あらゆる所与のＫａｂａｔ部位の番号におけるある個々の残基の同一性は、種間、または対立遺伝子の相違のため抗体の鎖ごとに異なることがある。
他の実施形態では、本発明は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの本明細書に開示したＣＤＲを有する抗体を含む（例えば、図２Ａ〜Ｊ、下線で示したＣＤＲを参照されたい）。なお他の実施形態では、本発明は、表３に列挙するあらゆるＶＨＣＤＲのアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ、および／または表３に列挙するあらゆる抗体の重鎖可変領域の重鎖可変領域に由来するＶＨＣＤＲを含む、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に特異的に結合する抗体を包含する。別の特定の一実施形態では、本発明は、表３に列挙したあらゆるＶＬＣＤＲのアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ、および／または表３に列挙するあらゆる抗体の軽鎖可変領域の軽鎖可変領域に由来するＶＬＣＤＲを含む、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に特異的に結合する抗体を包含する。
本発明は、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に特異的に結合する、本明細書に記載したＶＨドメイン、ＶＨＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬＣＤＲの誘導体を含む、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に特異的に結合する抗体を包含する。当業者には周知の標準の技術を用いて、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列に変異（例えば、付加、欠失、および／または置換）を導入することができ、例えば、アミノ酸置換を産生するのに日常的に用いられている、部位特異的変異誘発、およびＰＣＲが媒介する変異誘発が含まれる。一実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ誘導体は、もとのＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲに比べて、２５個より少ないアミノ酸の置換、２０個より少ないアミノ酸の置換、１５個より少ないアミノ酸の置換、１０個より少ないアミノ酸の置換、５個より少ないアミノ酸の置換、４個より少ないアミノ酸の置換、３個より少ないアミノ酸の置換、または２個より少ないアミノ酸の置換を含む。別の一実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ誘導体は、１つまたは複数の予想された非必須アミノ酸残基（即ち、抗体がＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２に特異的に結合するのに決定的に重要ではないアミノ酸残基）でなされた保存的アミノ酸置換（例えば、上記）を有する。あるいは、変異を、飽和突然変異誘発などによって、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲコード配列のすべてまたは部分に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を生物学的活性に関してスクリーニングして活性を保持する変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードした抗体を発現させることができ、抗体の活性を決定することができる。
本発明は、ＨＭＧ１および／もしくはＨＭＧ２、またはそれらのフラグメントに特異的に結合する抗体も包含し、前記抗体は、Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１６、Ｇ２０、Ｇ３４、Ｇ３５、Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ１７、およびＥ１１（図２Ａ〜Ｊ、配列番号５〜２０、２４〜２７、および３０〜７３を参照されたい）の可変の重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％同一である、可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む。本発明は、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２、あるいはそれらのフラグメントに特異的に結合する抗体も包含し、前記抗体は、Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１６、Ｇ２０、Ｇ３４、Ｇ３５、Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ１７、およびＥ１１（図２Ａ〜Ｊ、配列番号５〜２０、２４〜２７、および３０〜７３を参照されたい）の可変の重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一である、可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む。
本発明は、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２、あるいはそれらのフラグメントに特異的に結合する抗体をさらに包含し、前記抗体または抗体フラグメントは、Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１６、Ｇ２０、Ｇ３４、Ｇ３５、Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ１７、およびＥ１１（図２Ａ〜Ｊ、配列番号５〜２０、２４〜２７、および３０〜７３を参照されたい）の１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列に、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％同一である、１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列を含む。本発明は、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２、あるいはそれらのフラグメントに特異的に結合する抗体をさらに包含し、前記抗体または抗体フラグメントは、Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１６、Ｇ２０、Ｇ３４、Ｇ３５、Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ１７、およびＥ１１（図２Ａ〜Ｊ、配列番号５〜２０、２４〜２７、および３０〜７３を参照されたい）の１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列に、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％同一である、１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列を含む。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を含む、当業者には周知のあらゆる方法により決定することができる。
本発明は、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２、あるいはそれらのフラグメントに特異的に結合する抗体も包含し、前記抗体は、Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１６、Ｇ２０、Ｇ３４、Ｇ３５、Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ１７、およびＥ１１（図２Ａ〜Ｊ、配列番号５〜２０、２４〜２７、および３０〜７３を参照されたい）のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている。別の一実施形態では、本発明は、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２、あるいはそれらのフラグメントに特異的に結合する抗体を包含し、前記抗体は、Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１６、Ｇ２０、Ｇ３４、Ｇ３５、Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ１７、およびＥ１１（図２Ａ〜Ｊ、配列番号５〜２０、２４〜２７、および３０〜７３を参照されたい）の１つまたは複数のＣＤＲのヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている１つまたは複数のＣＤＲを含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、限定するものではないが、約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）においてフィルターに結合したＤＮＡにハイブリダイズさせ、その後約５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１または複数回洗浄することが含まれ、約４５℃で、６×ＳＳＣにおいてフィルターに結合したＤＮＡにハイブリダイズさせ、その後約６０℃で０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで１または複数回洗浄するような高度にストリンジェントな条件、またはあらゆる他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者には知られている（例えば、Ausubel,F.M.ら編集、1989年、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、Green Publishing Associates,Inc.およびJohn Wiley and Sons,Inc.、NY、6.3.1から6.3.6頁、および2.10.3頁を参照されたい）。
本発明の特定の実施形態は、寄託した抗体のＣＤＲの、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つすべてを有する抗体である。本発明の特定の実施形態は、また、これらの抗体（および、それらのフラグメント）をコードする単離されたポリヌクレオチドである。「Ｓ２」、「Ｓ４」、「Ｓ１６」、および「Ｇ４」、ならびにいくつかの他の特異的な本発明の抗ＨＭＧ１抗体に対する、結合の、および機能上の特性を、表１に列挙する。
Figure 2008520552
Figure 2008520552
本発明の別の一実施形態には、上記に記載した対象の抗ＨＭＧ１抗体のあらゆる部分における保存的アミノ酸置換の導入が含まれる（表１を参照されたい）。「保存的アミノ酸置換」は、機能上同等のアミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味することは、当技術分野ではよく知られている。保存的アミノ酸変化は、得られたペプチドのアミノ酸配列におけるサイレントな変化をもたらす。例えば、極性の類似する１つまたは複数のアミノ酸は、機能上同等物として働き、ペプチドのアミノ酸配列内でサイレントな変更をもたらす。電荷が中性である置換、および、残基をより小型の残基と置き換える置換も、残基が異なる群にあっても（例えば、フェニルアラニンの、より小型のイソロイシンとの置換）「保存的置換」とみなされる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーも、当技術分野では規定されている。保存的アミノ酸置換のいくつかのファミリーを、表２に示す。
Figure 2008520552
「保存的アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸の類似体または誘導体の使用も意味する。表現型がサイレントであるアミノ酸置換を行う方法についてのガイダンスは、Bowieら、「Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions」（1990年、Science、247巻、1306〜1310頁）に提供されている。
５．２ 本発明の抗体を産生し、スクリーニングする方法
ＨＭＧ１ポリペプチドに特異的に結合する高親和性抗体またはフラグメントは、例えば、免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、または当業者には周知の他の技術により同定することができる。
本発明の抗体は、当技術分野では周知のあらゆる適切な方法により産生することができる。対象の抗原に対するポリクローナル抗体を、当技術分野ではよく知られている様々な手順により作成することができる。例えば、本発明のＨＭＧ１ポリペプチドを、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む様々な宿主動物に投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の生成を誘発することができる。宿主の種に応じて、免疫反応を増大させるために様々なアジュバントを使用することができ、様々なアジュバントには、限定するものではないが、フロイントの（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物性のゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）およびコリネバクテリウムパルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトのアジュバントが含まれる。このようなアジュバントは、当技術分野では、やはりよく知られている。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せの使用を含む、当技術分野では周知の広範囲の技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野では周知のものを含むハイブリドーマ技術を用いて生成することができ、例えば、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual、（Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988年）に、Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas、563〜681頁（Elsevier、N.Y.、1981年）に教示されている。本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により生成される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、あらゆる真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を意味するものであり、それによりそれが生成される方法を意味するものではない。
「モノクローナル抗体」は、２つのタンパク質、即ち重鎖および軽鎖を含み、あるいはそれらから成ることができる。
ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体を生成し、スクリーニングするための方法は、日常的であり、当技術分野ではよく知られている。非限定的な例では、マウスを、本発明のポリペプチド、またはそのようなペプチドを発現する細胞で免疫化することができる。免疫反応が検出されたら、例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清で検出されたら、マウスの脾臓を収集し、脾細胞を単離する。次いで、脾細胞を、よく知られた技術により、あらゆる適切なミエローマ細胞、例えば、ＡＴＣＣから入手可能である細胞系ＳＰ２０からの細胞に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈法によりクローン化する。次いで、ハイブリドーマのクローンを、当技術分野では周知の方法により、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌する細胞に対してアッセイする。一般に高レベルの抗体を含んでいる腹水を、ポジティブのハイブリドーマクローンでマウスを免疫化することにより産生することができる。
したがって、本発明は、モノクローナル抗体を産生する方法を、ならびに本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法により生成される抗体を提供し、この場合、本発明の抗原で免疫化したマウスから単離された脾細胞をミエローマ細胞と融合し、次いで、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンに対する融合物から得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより、ハイブリドーマを産生するのが好ましい。
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを、周知の技術により産生することができる。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するために）、またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するために）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子を、タンパク質分解性の切断をすることにより生成することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
本発明の抗体は、当技術分野では知られている様々なファージディスプレイ方法を用いて産生することもできる。ファージディスプレイ方法では、機能上の抗体のドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特定の一実施形態では、そのようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアルの抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはネズミ科動物）から発現された抗原結合性ドメインにディスプレイすることができる。対象の抗原に結合する抗原結合性ドメインを発現するファージを選択し、あるいは、例えば、標識した抗原、または固体表面もしくはビーズに結合し、もしくは捕獲された抗原を用いて、抗原と同定することができる。これらの方法で用いられるファージは、典型的には、Ｆａｂを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合性ドメイン、Ｆｖ、または、ファージ遺伝子ＩＩＩもしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えで融合しているジスルフィド安定化したＦｖ抗体ドメインを含むフィラメント状のファージである。本発明の抗体を作成するのに用いることができるファージディスプレイ方法の例には、Brinkmanら、J.Immunol.Methods、182巻、41〜50頁（1995年）；Amesら、J.Immunol.Methods、184巻、177〜186頁（1995年）；Kettleboroughら、Eur.J.Immunol.、24巻、952〜958頁（1994年）；Persicら、Gene、187巻、9〜18頁（1997年）；Burtonら、Advances in Immunology、57巻、191〜280頁（1994年）；PCT出願PCT/GB91/01134、PCT公開WO90/02809、WO91/10737、WO92/01047、WO92/18619、WO93/11236、WO95/15982、WO95/20401、ならびに米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号、および第5,969,108号に開示されているものが含まれる。
上記の参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離し、ヒト抗体、またはあらゆる他の望ましい抗原結合性フラグメントを含む抗体全体を産生するために使用することができ、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌、および細菌、例えば、以下に詳しく記載するものを含むあらゆる望ましい宿主で発現することができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換えで生成するための技術は、ＰＣＴ公開WO92/22324、Mullinaxら、BioTechniques、12巻(6)、864〜869頁（1992年）、およびSawaiら、AJRI、34巻、26〜34頁（1995年）、およびBetterら、Science、240巻、1041〜1043頁（1988年）に開示されているものなどの、当技術分野では周知の方法を用いて使用することもできる。
単鎖Ｆｖｓおよび抗体を生成するのに用いることができる技術の例には、米国特許第4,946,778号、および第5,258,498号；Hustonら、Methods in Enzymology、203巻、46〜88頁（1991年）；Shuら、PNAS、90巻、7995〜7999頁（1993年）、およびSkerraら、Science、240巻、1038〜1040頁（1988年）に記載されているものが含まれる。
ヒトにおける抗体のｉｎ ｖｉｖｏの使用、およびｉｎ ｖｉｔｒｏの検出アッセイを含むいくつかの使用に対しては、キメラ、ヒト化の、またはヒトの抗体を使用することが好ましいことがある。キメラ抗体は、ネズミ科動物のモノクローナル抗体とヒト免疫グロブリンの定常領域に由来する可変領域とを有する抗体など、抗体の様々な部分が様々な動物種に由来する分子である。キメラ抗体を生成するための方法は当技術分野では知られている。例えば、Morrison、Science、229巻、1202頁（1985年）；Oiら、BioTechniques、4巻、214頁（1986年）；Gilliesら、（1989年）J.Immunol.Methods、125巻191〜202頁；米国特許第5,807,715号、第4,816,567号、および第4,816,397号を参照されたい。ヒト化抗体は、ヒト以外の種からの相補性決定領域（ＣＤＲ）を１つまたは複数を有する望ましい抗原とヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域とを結合している、ヒト以外の種の抗体からの抗体分子である。しばしば、ヒトのフレームワーク領域におけるフレームワーク残基を、ＣＤＲドナーの抗体からの対応する残基で置換して、抗原の結合性を変更し、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野ではよく知られている方法により同定され、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデリングして、抗原の結合に、および特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列の比較に重要なフレームワーク残基を同定する。（例えば、Queenら、米国特許第5,585,089号；Riechmannら、Nature、332巻、323頁（1988年）を参照されたい）。抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（EP239,400、ＰＣＴ公開WO91/09967、米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号）ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（EP592,106、EP519,596；Padlan、Molecular Immunology、28巻(4/5)、489〜498頁（1991年）；Studnickaら、Protein Engineering、7巻(6)、805〜814頁（1994年）；Roguskaら、PNAS、91巻、969〜973頁（1994年））、およびチェーンシャフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第5,565,332号）を含む、当技術分野では周知の様々な技術を用いてヒト化することができる。
ヒト患者の治療的処置には、完全なヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いて、上記に記載したファージディスプレイ法を含む、当技術分野では周知の様々な方法により作成することができる。米国特許第4,444,887号、および第4,716,111号、ならびにＰＣＴ公開WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735、およびWO91/10741を参照されたい。
機能性の内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて、ヒト抗体を生成することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をマウス胎児性幹細胞中に、ランダムに、または相同的組換えにより導入することができる。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胎児性幹細胞中に導入することができる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、別々に、または相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と同時に非機能性になされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合型の欠失により、内因性の抗体生成が妨げられる。修飾された胎児性幹細胞を増大させ、胚盤胞中に微量注入してキメラマウスを生成する。次いで、キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合型の子孫を生成する。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドのすべてまたは一部分で、通常の様式で免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体を、従来のハイブリドーマ技術を用いて、免疫化したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが内部に持っていたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞の分化の間に再編成し、引き続きクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。したがって、このような技術を用いると、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を生成するのが可能である。ヒト抗体を生成するためのこれらの技術の概要については、LonbergおよびHuszar、Int.Rev.Immunol、13巻、65〜93頁（1995年）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技術の詳しい考察、ならびにこのような抗体を生成するためのプロトコールについては、例えば、ＰＣＴ公開WO98/24893、WO92/01047、WO96/34096、WO96/33735、欧州特許第0598877号、米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、第5,885,793号、第5,916,771号、および第5,939,598号を参照されたい。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、カリフォルニア州）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）などの企業が、上記に記載したのと同様の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体を提供するよう従事することができる。
選択されたエピトープを認識する、完全なヒト抗体は、「誘導された選択」と呼ばれる技術を用いて産生することができる。この取組みでは、選択された非ヒトのモノクローナル抗体、例えば、マウスの抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を誘導する（Jespersら、Bio/technology、12巻、899〜903頁（1988年））。
さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体を次に利用して、当業者にはよく知られている技術を用いて本発明のポリペプチドを「模擬する」抗イディオタイプの抗体を産生することができる（例えば、GreenspanおよびBona、FASEB J.、7巻(5)、437〜444頁（1989年）、およびNissinoff、J.Immunol.、147巻(8)、2429〜2438頁（1991年）を参照されたい）。例えば、結合し、ポリペプチドの多量体形成、および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体を使用して、ポリペプチドの多量体化、および／または結合性領域を「模擬し」、結果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、中和する抗イディオタイプを産生することができる。このような中和性の抗イディオタイプ、またはこのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントを、ポリペプチドリガンドを中和するための治療レジメンで用いることができる。例えば、このような抗イディオタイプの抗体を用いて、本発明のポリペプチドを結合し、かつ／またはそのリガンド／受容体を結合することができ、したがってその生物学的活性を阻止することができる。
抗体をｉｎ ｖｉｖｏの適用で治療的に使用する場合は、個体における免疫原性を低下させるために抗体を修飾することが好ましい。例えば、個体がヒトの場合、抗体は「ヒト化」されていることが好ましく、この場合、抗体の相補性決定領域がヒト抗体中に移植されている（例えば、Jonesら、Nature、321巻、522〜525頁、1986年、およびTempestら、Biotechnology、9巻、266〜273頁、（1991年）に記載されている通り）。
ファージディスプレイ技術も、また、抗Ｂボックス抗体を所有することに対してスクリーニングしたヒトからのリンパ球のｖ−遺伝子をＰＣＲ増幅したレパートリー、または未処理のライブラリーのいずれかからのポリペプチドに対する結合活性のある抗体遺伝子を選択するのに利用することができる（McCaffertyら、Nature、348巻、552〜554頁、1990年、およびMarksら、Biotechnology、10巻、779〜783頁、1992年）。これらの抗体の親和性は、チェーンシャフリングによっても改善することができる（Clacksonら、Nature、352巻624〜628頁、1991年）。
産生のために用いるポリペプチドの選択は、当業者であれば容易に決定することができる。産生された抗体が、ＨＭＧタンパク質ファミリーの別のメンバーと著しく交差反応せず、または特異的に結合しないように、ポリペプチドを選択することができる。あるいは、ＨＭＧタンパク質ファミリーの２つまたはそれを超えるメンバー間の相同性を大きな程度で共有するポリペプチドを、ＨＭＧタンパク質ファミリーの多数のメンバー（例えば、ＨＭＧ１およびＨＭＧ２）と特異的に結合（即ち、交差反応）することができる抗体を産生するために使用することができる。
５．３ 抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明の高親和性抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをさらに提供する。本発明は、例えば下記に定義するような、ストリンジェントな、またはストリンジェンシーのより低いハイブリダイゼーション条件下で、本発明のＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２ポリペプチド（例えば、配列番号１もしくは２、またはそれらのフラグメント）に特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１または２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体をコードしている。別の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードしている。別の好ましい一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードしている。別の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体をコードしている。なお別の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体をコードしている。さらに別の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体をコードしている。なお他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２８および／または２９のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体をコードしている。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５倍デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０．ｍｕ．ｇ／ｍｌの変性し、せん断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液で４２℃で一晩インキュベートし、その後、約６５℃でフィルターを０．１倍ＳＳＣで洗浄することとされている。
当技術分野では周知のあらゆる方法により、ポリヌクレオチドを得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知の場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成したオリゴヌクレオチドから組み立てることができるが（例えば、Kutmeierら、BioTechniques、17巻242頁（1994年）に記載されているように）、これは、簡潔にに述べると、抗体をコードする配列の部分を含む重複するオリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオチドをアニールし、連結し、次いで連結したオリゴヌクレオチドをＰＣＲにより増幅することを含んでいる。
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドを、適切な供給源由来の核酸から産生することができる。特定の抗体をコードしている核酸を含むクローンが入手できないが、抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸を、化学的に合成し、あるいは適切な供給源（例えば、抗体のｃＤＮＡライブラリー、もしくは、本発明の抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞など、抗体を発現するあらゆる組織もしくは細胞から産生されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成のプライマーを用いてＰＣＲ増幅により、または、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを区別する、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングにより得ることができる。ＰＣＲにより産生された増幅した核酸を、次いで、当技術分野ではよく知られているあらゆる方法を用いて、複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる。
抗体のヌクレオチド配列、および対応するアミノ酸配列が決定したら、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど、ヌクレオチド配列を操作するために当技術分野ではよく知られている方法を用いて、抗体のヌクレオチド配列を操作して（例えば、Sambrookら、1990年、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク州、およびAusubelら編集、1998年、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨーク州に記載されている技術を参照されたい）、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入をつくりだすために、異なるアミノ酸配列を有する抗体を産生することができる。
特定の一実施形態では、本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を検査して、例えば、他の重鎖および軽鎖の可変領域の既知のアミノ酸配列と比較して配列の超可変性の領域を決定するなど、当技術分野ではよく知られている方法により、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定することができる。日常の組換えＤＮＡ技術を用いて、上記に記載したように、１つまたは複数のＣＤＲをフレームワーク領域内に、例えば、非ヒト抗体をヒト化するためのヒトフレームワーク領域内に挿入することができる。フレームワーク領域は、天然に存在していてもよく、またはコンセンサスフレームワーク領域でもよく、好ましくはヒトフレームワーク領域であってよい（ヒトフレームワーク領域の列挙については、例えば、Chothiaら、J.Mol.Biol.、278巻、457〜479頁（1998年）を参照されたい）。フレームワーク領域およびＣＤＲの組合せにより産生されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードしていることが好ましい。
好ましくは、上記で論じたように、フレームワーク領域内に１つまたは複数のアミノ酸置換がなされることがあり、好ましくはアミノ酸置換は、その抗原に対する抗体の結合性を改善する。さらに、このような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与している可変領域の１つまたは複数のシステイン残基のアミノ酸置換または欠失を作成して、１つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を産生することができる。ポリヌクレオチドに対する他の変更は、本発明に包含され、当技術分野の範囲内である。
さらに、好適な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、好適な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライスすることにより、「キメラ抗体」を生成するために開発された技術（Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.、81巻851〜855頁、（1984年）、Neubergerら、Nature、312巻、604〜608頁（1984年）、Takedaら、Nature、314巻、452〜454頁（1985年）を用いることができる。上記に記載したように、キメラ抗体は、ネズミ科動物ｍＡｂに由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒト化抗体を有するもののような、様々な部分が様々な動物種に由来する分子である。
あるいは、単鎖抗体を生成するために記載されている技術（米国特許第4,946,778号、Bird、Science、242巻、423〜42頁（1988年）；Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85巻、5879〜5883頁（1988年）、およびWardら、Nature、334巻、544〜54頁（1989年））を適応させて、単鎖抗体を生成することができる。単鎖抗体は、アミノ酸架橋によりＦｖ領域の重鎖および軽鎖のフラグメントを連結することによって形成され、単鎖ポリペプチドが生じる。大腸菌で機能上のＦｖフラグメントを組み立てるための技術も、用いることができる（Skerraら、Science、242巻、1038〜1041頁（1988年））。
５．４ 抗体を生成する方法
本発明の抗体は、抗体を合成するための当技術分野では周知のあらゆる方法により、特に化学合成により、または好ましくは組換え体の発現技術により生成することができる。
本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは類似体（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体）の組換え体の発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要とされる。本発明の抗体分子、または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその部分（重鎖もしくは軽鎖の可変領域を含むのが好ましい）をコードするポリヌクレオチドを得たら、抗体分子を生成するためのベクターを、当技術分野ではよく知られている技術を用いて組換えＤＮＡ技術により生成することができる。このようにヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドを発現することによりタンパク質を調製するための方法を、本明細書に記載する。当業者にはよく知られている方法を使用して、抗体をコードする配列、ならびに好適な転写および翻訳の制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはプロモーターに操作可能に連結している重鎖もしくは軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供するものである。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、ＰＣＴ公開WO86/05807、ＰＣＴ公開WO89/01036、および米国特許第5,122,464号を参照されたい）、抗体の可変領域を、重鎖または軽鎖全体を発現させるためにそのようなベクター内にクローニングすることができる。
発現ベクターを従来の技術により宿主細胞中に移し、次いで、形質移入された細胞を従来の技術により培養して本発明の抗体を生成させる。したがって、本発明は、異種性のプロモーターに操作可能に連結している本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体をコードしているポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。２本鎖の抗体を発現させるための好ましい実施形態では、下記に詳しく述べるように、免疫グロブリン分子全体を発現させるために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞で同時発現させることができる。
様々な宿主発現のベクターシステムを利用して、本発明の抗体分子を発現させることができる。このような宿主発現のシステムは、それによって対象のコード配列が生成され引き続き精製され得るビヒクルを表すが、好適なヌクレオチドコード配列で形質転換され、または形質移入された場合にｉｎ ｓｉｔｕで本発明の抗体分子を発現することができる細胞も表す。これらには、限定するものではないが、抗体をコードする配列を含む組換え体のバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；抗体をコードする配列を含む組換え体の酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌（ｙｅａｓｔ）（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））などの微生物；抗体をコードする配列を含む組換えのウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ））で感染させた昆虫の細胞系；組換えのウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させた、または抗体をコードする配列を含む組換えのプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルスの７．５Ｋプロモーター）を含む組換えの発現構築物を内部に持つ哺乳動物の細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、３Ｔ３、ＰｅｒＣ６細胞）が含まれる。好ましくは大腸菌などの細菌の細胞、より好ましくは特に組換えの抗体分子全体を発現させるための真核生物の細胞を、組換えの抗体分子を発現させるために用いる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物の細胞は、ヒトサイトメガロウイルスからの主要な中間体の初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせて、抗体に対する効果的な発現システムとなっている（Foeckingら、Gene、45巻101頁（1986年）、Cockettら、Bio/Technology、8巻、2頁（1990年））。また、例えば、米国特許第5,827,739号、第5,879,936号、第5,981,216号、および第5,658,759号も参照されたい。
細菌系では、発現される抗体分子に意図される使用に応じて、数々の発現ベクターを選択するのが有利であり得る。例えば、大量のこのようなタンパク質を生成しようとする場合、抗体分子の薬剤組成物を産生するために、精製の容易な融合タンパク質生成物を高レベルで発現することを目的としたベクターが、望ましいことがある。このようなベクターには、限定するものではないが、大腸菌の発現ベクターｐＵＲ２７８（Rutherら、EMBO J.、2巻、1791頁（1983年））（このベクターでは、抗体をコードする配列がｌａｃＺコード領域のあるフレームにおけるベクター内に個々に連結することがあり、その結果融合タンパク質が生成する）、ｐＩＮベクター（InouyeおよびInouye、Nucleic Acids Res.、13巻、3101〜3109頁（1985年）；Van HeekeおよびSchuster、J.Biol.Chem.、24巻、5503〜5509頁（1989年））などが含まれる。グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来のポリペプチドを発現させるのに、ｐＧＥＸベクターも用いることができる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスのグルタチオン−アガロースビーズへ吸着させ、結合させ、その後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはファクターＸａのプロテアーゼ切断部位を含むようにデザインされており、その結果クローニングされた標的の遺伝子生成物をＧＳＴ部分から放出することができる。
昆虫のシステムでは、外来の遺伝子を発現するためのベクターとして、オートグラファカリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を用いる。このウイルスは、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞内で成長する。抗体をコードする配列を、ウイルスの非必須の領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）内に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下におくことができる
哺乳動物の宿主細胞では、数々のウイルスベースの発現システムを利用することができる。アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）を発現ベクターとして用いる場合は、抗体をコードする対象の配列を、アデノウイルスの転写／翻訳の制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび３分裂のリーダー配列に連結することができる。このキメラ遺伝子を、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの組換えによりアデノウイルスのゲノムに挿入することができる。ウイルスのゲノムの必須ではない領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）における挿入により、生存可能で、感染した宿主に抗体分子を発現することができる組換えウイルスがもたらされる（例えば、LoganおよびShenk、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81巻、355〜359頁（1984年）を参照されたい）。挿入された抗体をコードする配列を効果的に翻訳するために、特定の開始シグナルも必要とされることがある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接の配列が含まれる。さらに、挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは、望ましいコード配列の読み枠と相が合ってなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンの起源は、天然および合成両方の様々であり得る。発現の有効性は、好適な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むことにより増強され得る（Bittnerら、Methods in Enzymol.、153巻、51〜544頁（1987年）を参照されたい）。
さらに、挿入された配列の発現をモデュレートし、または望ましい特定の様式で遺伝子生成物を修飾し、加工する宿主細胞の系統を選択することができる。このような、タンパク質生成物の修飾（例えば、グリコシル化）および加工（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要であり得る。タンパク質および遺伝子生成物の翻訳後の加工および修飾に関して、様々な宿主細胞が、特徴的かつ特異的な機序を有している。発現された外来のタンパク質の正確な修飾および加工を確実にするために、好適な細胞系または宿主のシステムを選択することができる。この目的のために、主要な転写物の適切な加工、グリコシル化、および遺伝子生成物のリン酸化のための細胞の機構を有する真核生物の宿主細胞を用いることができる。このような哺乳動物の宿主細胞には、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＮＳ０、Ｐｅｒ．Ｃ６、ならびに、特に、乳癌細胞系（例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、およびＴ４７Ｄ）、および正常の乳腺細胞系（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔ）が含まれる。
組換え体のタンパク質を、長期間、高収率で生成するために、安定した発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞系を設計することができる。ウイルス起源の複製を含む発現ベクターを用いるよりも、むしろ、宿主細胞を、好適な発現制御因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、および選択可能なマーカーにより制御されているＤＮＡで形質転換することができる。外来のＤＮＡを導入した後、設計した細胞を、増殖培地で１〜２日間増殖させてもよく、次いで、選択培地に切り替える。組換え体のプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択に対する抵抗性を与え、細胞に安定にプラスミドをその染色体内に組み込ませ、増殖して病巣を形成させ、今度はその病巣をクローニングして細胞系内に拡張することができる。この方法を用いて、抗体分子を発現する細胞系を設計すると有利であり得る。このように設計された細胞系は、抗体分子と直接的にまたは間接的に相互作用する化合物をスクリーニングし、評価するのに、特に有用であり得る。
限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、Cell、11巻、223頁（1977年））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska およびSzybalski、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、48巻、202頁（1992年）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、Cell、22巻、817頁（1980年）を含む数々の選択システムを使用することができ、遺伝子を、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞でそれぞれ使用することができる。また、以下の遺伝子を選択する基準として、代謝拮抗物質耐性を用いることができる：メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wiglerら、Proc Natl.Acad.Sci.USA、77巻、357頁（1980年）、O'Hareら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78巻、1527頁（1981年））、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（MulliganおよびBerg、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78巻、2072頁（1981年））、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Clinical Pharmacy、12巻、488〜505頁；WuおよびWu、Biotherapy、3巻、87〜95頁（1991年）；Tolstoshev、Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.、32巻、573〜596頁（1993年）；Mulligan、Science、260巻、926〜932頁（1993年）、ならびにMorganおよびAnderson、Ann.Rev.Biochem.、62巻、191〜217頁（1993年）1993年5月、TIB TECH、11巻(5)、155〜215頁）、ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerreら、Gene、30巻、147頁（1984年））。組換えＤＮＡの技術分野では一般的に知られている方法を日常的に適用して、望ましい組換えのクローンを選択することができ、そのような技術は、例えば、Ausubelら（編集）、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨーク州（1993年）；Kriegler、Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual、Stockton Press、ニューヨーク州（1990年）；および第１２章および第１３章、Dracopoliら（編集）、Current Protocols in Human Genetics、John Wiley & Sons、 ニューヨーク州（1994年）、Colberre-Garapinら、J.Mol.Biol.、150巻、1頁（1981年）に記載されている。
ベクターの増幅により、抗体分子の発現レベルを増大することができる（再考には、BebbingtonおよびHentschel、「The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning」、第3巻（Academic Press、ニューヨーク、1987年を参照されたい）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能な場合には、宿主細胞の培養物に存在する阻害物質のレベルが増大すると、マーカー遺伝子のコピー数が増大する。増幅した領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の生成も増大する（Crouseら、Mol.Cell.Biol.、3巻、257頁（1983年））。
宿主細胞を、第１のベクターが重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターが軽鎖由来のポリペプチドをコードする、本発明の２つの発現ベクターと同時形質移入することができる。２つのベクターは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含むことができる。あるいは、重鎖および軽鎖両方のポリペプチドをコードし、発現することができる単一のベクターを使用することができる。そのような場合には、毒性の遊離の重鎖が過剰になるのを防ぐために、軽鎖を重鎖の前に配置すべきである（Proudfoot、Nature、322巻、562頁、（1986年）、Kohler、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77巻、2197頁（1980年））。重鎖および軽鎖に対するコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡを含むことができる。
本発明の抗体分子が動物によって生成され、化学的に合成され、または組換えで発現されたら、免疫グロブリン分子の精製の技術分野で周知のあらゆる方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にタンパク質Ａの後の特異的な抗原に対するアフィニティーにより、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解性の差、またはタンパク質を精製するためのあらゆる他の標準の技術により精製することができる。さらに、本発明の抗体、またはそのフラグメントを、本明細書に記載され、またはさもなければ当技術分野では知られている異種性のポリペプチド配列に融合して、精製を促進することができる。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を促進するために、ペプチドなどのマーカー配列に融合することができる。ある実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．、９１３１１）で提供されるタグなどの、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、数ある中でその多くが市販されている。例えば、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86巻、821〜824頁（1989年）に記載されているように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグには、限定するものではないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Wilsonら、Cell、37巻、767頁（1984年））、および「ｆｌａｇ」タグが含まれる。
５．５ 抗体複合体および誘導体
本発明の抗体には、修飾された（例えば、あらゆるタイプの分子の抗体への共有結合により）誘導体が含まれる。例えば、限定的なものではないが、抗体の誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、周知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性の切断、細胞のリガンドまたは他のタンパク質への連結などにより修飾されている抗体が含まれる。限定するものではないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含む周知の技術により、あらゆる数々の化学的修飾が行われ得る。さらに、誘導体は、１つまたは複数の非古典的なアミノ酸を含むことができる。
前記抗体または抗体フラグメントを、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー分子に付着させることにより、ｉｎ ｖｉｖｏの半減期の長い抗体またはそのフラグメントを産生することができる。ＰＥＧは、前記抗体または抗体フラグメントのＮ−またはＣ−末端へのＰＥＧの部位特異的な複合により、あるいはリジン残基上に存在するε−アミノ基により、多機能性のリンカーで、またはそれなしで、前記抗体または抗体フラグメントに付着することができる。生物学的活性の最小の損失をもたらす直鎖または分枝ポリマー誘導体化が使用される。複合の程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により厳密にモニターして、確実にＰＥＧ分子が抗体へ適切に複合するようにする。非反応のＰＥＧを、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧ複合体から分離することができる。
さらに、抗体または抗体フラグメントを、ｉｎ ｖｉｖｏでより安定にするために、またはｉｎ ｖｉｖｏの半減期を長くするために、抗体をアルブミンに複合させることができる。その技術は、当技術分野ではよく知られており、例えば、国際公開WO93/15199、WO93/15200、およびWO01/77137、ならびに欧州特許EP413,622を参照されたい。本発明は、限定するものではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、擬似物質、合成の薬物、無機分子、および有機分子を含む、１つまたは複数の部分に複合し、または融合している抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。
一実施形態では、本発明は、融合タンパク質を産生するために異種性のタンパク質またはポリペプチド（またはそれらのフラグメント、特に、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、または少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチド）に、組換えで融合し、または化学的に複合している（共有結合および非共有結合の両方を含む）抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。別の一実施形態では、本発明は、融合タンパク質を産生するために異種性のタンパク質またはポリペプチド（またはそれらのフラグメント、特に、少なくとも約１０個、少なくとも約２０個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個、または少なくとも約１００個のアミノ酸のポリペプチド）に、組換えで融合し、または化学的に複合している（共有結合および非共有結合の両方を含む）抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。融合は、必ずしも直接である必要はないが、リンカー配列を介して生じることができる。例えば、抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、抗体を特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合し、または複合することにより、異種性のポリペプチドを特定の細胞型に標的にするのに用いられることがある。異種性のポリペプチドに融合し、または複合した抗体は、当技術分野では周知の方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏの免疫アッセイおよび精製方法で使用することもできる。例えば、国際公開WO93/21232、欧州特許EP439,095；Naramuraら、1994年、Immunol.Lett.、39巻、91〜99頁；米国特許第5,474,981号；Gilliesら、1992年、PNAS、89巻、1428〜1432頁、およびFellら、1991年、J.Immunol.、146巻、2446〜2452頁を参照されたい。
本発明は、抗体フラグメントに融合し、または複合している異種性のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを含む製剤をさらに含む。例えば、異種性のポリペプチドは、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＨＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ、またはそれらのフラグメントに融合し、または複合することができる。ポリペプチドを抗体の部分に融合し、または複合するための方法は、当技術分野ではよく知られている。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、および第5,112,946号、欧州特許EP307,434、および367,166、国際公開WO96/04388、およびWO91/06570；Ashkenaziら、1991年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88巻、10535〜10539頁、Zhengら、1995年、J.Immunol.、154巻、5590〜5600頁、およびVilら、1992年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89巻、11337〜11341頁を参照されたい。
さらなる融合タンパク質、例えば、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２、あるいはそれらのフラグメント（例えば、上述）に特異的に結合する抗体を、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（集合的に「ＤＮＡシャフリング」と呼ばれる）の技術により産生することができる。ＤＮＡシャフリングを使用して、本発明の抗体またはそのフラグメントの活性を変更することができる（例えば、親和性がより高く、解離速度のより低い抗体またはそのフラグメント）。一般的には、米国特許第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号、および第5,837,458号、ならびにPattenら、1997年、Curr.Opinion Biotechnol.、8巻、724〜33頁；Harayama、1998年、Trends Biotechnol.、16巻(2)、76〜82頁；Hanssonら、1999年、J.Mol.Biol.、287巻、265〜76頁、ならびにLorenzoおよびBlasco、1998年、Biotechniques、24巻(2)、308〜313頁を参照されたい。抗体もしくはそのフラグメント、またはコードされた抗体もしくはそのフラグメントは、組換えの前に、誤りがちなＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、またはその他の方法を受けさせることにより、変更することができる。抗体または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドの１つまたは複数の部分を、Ｃ／ＣＬＰに特異的に結合し、１つまたは複数の異種性の分子の、１つまたは複数の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えてもよい。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントを、精製を促進するために、ペプチドなどのマーカー配列に融合することができる。ある実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ．、９１３１１）で提供されるタグなどの、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、数ある中でその多くが市販されている。例えば、Gentzら、1989年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86巻、821〜824頁に記載されているように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグには、限定するものではないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（Wilsonら、1984年、Cell、37巻、767頁）、および「ｆｌａｇ」タグが含まれる。
本発明は、診断用の、または治療用の物質と複合している抗体またはそのフラグメントをさらに包含する。例えば、所与の処置レジメンの有効性を決定するために、臨床試験手順の一部分として、例えば、腫瘍の発症または進行をモニターするために、抗体を診断的に使用することができる。検出は、抗体を検出可能な物質に連結することにより促進され得る。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、様々なポジトロン放出断層撮影法を用いたポジトロン放出性金属、および非放射性の常磁性の金属イオンが含まれる。検出可能な物質は、抗体（もしくはそのフラグメント）に直接、または間接的に、中間体（例えば、当技術分野では周知のリンカーなど）を介して当技術分野では周知の技術を用いて連結し、または複合することができる。例えば、本発明による診断として使用するための抗体に複合することができる金属イオンについての、米国特許第4,741,900号を参照されたい。適切な酵素の例には、西洋わさびのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンが含まれ、適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリトリンが含まれ、蛍光材料の例にはルミノールが含まれ、生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ、適切な放射性材料の例には、限定するものではないが、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９Ｔｃが含まれ、さらに様々なポジトロン放出断層撮影法を用いたポジトロン放出性金属、非放射性の常磁性の金属イオン、および放射標識された、または特定の放射性同位元素と複合した分子を、本発明の抗体と複合することができる。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、細胞毒、例えば、細胞分裂停止の、もしくは細胞破壊的な物質；治療用物質；または放射活性の金属イオン、例えば、２１３Ｂｉなどのα放射体などの治療用部分と複合することができる。細胞毒、または細胞毒性物質には、細胞に有害であるあらゆる物質が含まれる。例として、パクリタキソール（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体またはホモログが含まれる。治療用物質には、限定するものではないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれる。治療用部分のより広範な列挙は、ＰＣＴ公開WO03/075957に見ることができる。
本発明の複合体を、所与の生物学的反応を修飾するために用いることができ、治療用物質または薬物部分は、古典的な化学療法物質に限定されると解釈してはならない。例えば、薬物部分は、望ましい生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナスの外毒素、またはジフテリア毒素などの毒；腫瘍壊死因子、αインターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来の成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス物質、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭＩ（国際公開WO97/33899を参照されたい）、ＡＩＭＩＩ（国際公開WO97/34911を参照されたい）、Ｆａｓリガンド（Takahashiら、Int.Immunol.、6巻1567〜1574頁（1994年））、ＶＥＧＩ（国際公開WO99/23105を参照されたい）、ＣＤ４０リガンド、血栓性の物質、または抗血管形成物質、例えば、アンジオスタチン、またはエンドスタチンなどのタンパク質、あるいは、生物学的応答調節物質、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の成長因子が含まれ得る。
抗体は、また、固体の支持体に付着していてもよく、これは、免疫アッセイ、または標的の抗原の精製に特に有用である。このような固体の支持体には、限定するものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが含まれる。
このような治療用部分を抗体に複合させるための技術はよく知られており、例えば、Amonら、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapyの、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Reisfeldら（編集）、243〜56頁（Alan R.Liss,Inc.、1985年）；Hellstromら、Controlled Drug Delivery（第2版）の「Antibodies For Drug Delivery」Robinsonら（編集）、623〜53頁（Marcel Dekker,Inc.、1987年）；Thorpe、Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applicationsの、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review」、Pincheraら（編集）、475〜506頁（1985年）；Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapyの、「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy」、Baldwinら（編集）、303〜16頁（Academic Press、1985年）、ならびにThorpe ら、「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」、Immunol.Rev.、62巻、119〜58頁（1982年）を参照されたい。
本発明の抗体は、他のポリペプチドと複合することができる。抗体をポリペプチド部分に融合し、または複合するための方法は当技術分野では知られている。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、および第5,112,946号、欧州特許EP307,434、EP367,166、ＰＣＴ公開WO96/04388、およびWO91/06570；Ashkenaziら、1991年、PNAS USA、88巻10535頁；Zhengら、1995年、J Immunol 154巻、5590頁、ならびにVilら、1992年、PNAS USA、89巻、11337頁を参照されたい。抗体の部分への融合は、必ずしも直接である必要はないが、リンカー配列を介して生じることができる。このようなリンカー分子は、当技術分野では一般的に知られており、Denardoら、1998年、Clin Cancer Res、4巻、2483頁；Petersonら、1999年、Bioconjug Chem、10巻、553頁；Zimmermanら、1999年、Nucl Med Biol、26巻、943頁；Garnett、2002年、Adv Drug Deliv Rev、53巻171頁に記載されている。
あるいは、抗体は、Segalにより米国特許第4,676,980号に記載されているように、第２の抗体と複合して抗体のヘテロ複合体を形成することができる。
抗体は、それに複合している治療用部分があってもなくても、単独で投与し、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて治療用として用いることができる。
５．６ 抗体結合性および活性に対するアッセイ
本発明の抗体は、当技術分野では周知のあらゆる方法により、特異的な（即ち、免疫特異的な）結合に対してアッセイすることができる。用いることができる免疫アッセイには、いくつかを挙げると、限定するものではないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光免疫アッセイ、タンパク質Ａ免疫アッセイなどの技術を用いた競合的および非競合的のアッセイ系が含まれる。これらのアッセイは日常的であり、当技術分野ではよく知られている（例えば、Ausubelら編集、1994年、Current Protocols in Molecular Biology第1巻、John Wiley & Sons,Inc、ニューヨークを参照されたい）。例示の免疫アッセイを、以下に簡潔に記載する（が、限定的なものを意図するものではない）。
免疫沈降法のプロトコールは、細胞の集団を、タンパク質のホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害物質（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補ったＲＩＰＡバッファー（１％ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）などの溶解バッファーに溶解し、対象の抗体を細胞可溶化物に加え、ある期間（例えば、１〜４時間）４℃でインキュベートし、細胞可溶化物にタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇセファロースビーズを加え、４℃で約１時間またはそれを超えてインキュベートし、溶解バッファー中でビーズを洗浄し、ビーズをＳＤＳ／サンプルバッファーに再懸濁することを一般的に含む。対象の抗体が特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えば、ウェスタンブロット分析により評価することができる。当業者であれば、抗体の抗原に対する結合を増大するように修飾し、バックグラウンドを低減する（例えば、セファロースビーズで細胞可溶化物を予洗浄する）ために修飾することができるパラメータに関して知っている。免疫沈降法のプロトコールに関するさらなる検討については、例えば、Ausubelら編集、1994年、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons,Inc.ニューヨークの、10.16.1を参照されたい。
ウェスタンブロット分析は、タンパク質サンプルを調製し、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて、８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でタンパク質サンプルを電気泳動し、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはナイロンなどの膜に移し、ブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡまたは無脂肪ミルクを含むＰＢＳ）で膜をブロックし、洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）で膜を洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した１次抗体（対象の抗体）で膜をブロックし、洗浄バッファーで膜を洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した酵素基質（例えば、西洋わさびのペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に複合させた２次抗体（１次抗体、例えば、抗ヒト抗体を認識する）で膜をブロックし、膜を洗浄バッファーで洗浄し、抗原の存在を検出することを一般的に含む。当業者であれば、検出されたシグナルを増大し、バックグラウンドのノイズを低減するように修飾することができるパラメータに関して知っている。ウェスタンブロットプロトコールに関するさらなる考察については、Ausubelら編集、1994年、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons,Inc.、ニューヨークの、10.8.1を参照されたい。
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製し、抗原で９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルをコーティングし、酵素基質などの検出可能な化合物（例えば、西洋わさびのペルオキシダーゼ、またはアルカリホスファターゼ）に複合している対象の抗体をウェルに加え、ある期間インキュベートし、抗原の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡでは、対象の抗体は、検出可能な化合物に複合している必要はなく、その代わりに検出可能な化合物に複合している第２の抗体（対象の抗体を認識する）をウェルに加えることができる。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体でウェルをコーティングしてもよい。この場合には、検出可能な化合物に複合している第２の抗体を、コーティングしたウェルに対象の抗原を加えた後に加えることができる。当業者であれば、当技術分野で周知のＥＬＩＳＡの他の変形同様、検出されたシグナルを増大するために修飾することができるパラメータに関して知っている。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ausubelら編集、1994年、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons,Inc.、ニューヨークの、11.2.1を参照されたい。
抗体の抗原に対する結合親和性および他の結合の特性（例えば、抗体−抗原相互作用の解離速度）を、例えば、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ；もしくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または動態学（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析）、およびその他の方法、例えば、間接結合アッセイ、競合的結合アッセイ蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動、およびクロマトグラフィー（例えば、ゲルろ過）を含めた、当技術分野ではよく知られている様々なｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイ方法により決定することができる。これらの、および他の方法は、試験される成分の１つまたは複数の上の標識を利用することができ、かつ／または限定するものではないが、色素生産性、蛍光、発光、または同位体の標識を含む様々な検出方法を使用することができる。結合親和性および動態学の詳しい記載は、抗体−免疫原相互作用に焦点を当てたPaul,W.E.編集、Fundamental Immunology第4版、Lippincott-Raven、Philadelphia（1999年）に見ることができる。競合的結合アッセイの一例に、増大する量の非標識の抗原の存在下で標識した抗原を対象の抗体とインキュベートし、標識した抗原に結合した抗体を検出することを含むラジオイムノアッセイがある。対象の抗体の特定の抗原に対する親和性、および結合の解離速度は、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定することができる。第２の抗体との競合は、また、ラジオイムノアッセイを用いて決定することができる。この場合は、量の増大する非標識の第２の抗体の存在下で、標識した化合物と複合した対象の抗体と抗原をインキュベートする。他の特定の方法が本明細書に開示してあり、下記実施例２〜４を参照されたい。
本発明の抗体は、当技術分野では周知のあらゆる方法により生物学的活性をアッセイすることができる。
本発明のプロトコールおよび製剤は、ヒトで使用する前に、望ましい治療上のまたは予防上の活性について、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、次いでｉｎ ｖｉｖｏで試験するのが好ましい。例えば、特定の治療用のプロトコールの製剤の投与、または本発明の組合せ治療のどちらを指摘するかを決定するのに用いることができるｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイには、患者の組織サンプルを培養液中で増殖させ、本発明の製剤に曝露し、またはさもなければ接触させ、そのような製剤の組織サンプルに対する効果を観察するｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養アッセイが含まれる。組織サンプルは、患者から生検により得ることができる。この試験により、各個人の患者に治療上最も有効な予防用または治療用の物質を同定することが可能になる。様々な特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイを、自己免疫障害、炎症性障害、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２の異常な発現、および／または活性に付随する障害に関与する細胞型の代表的な細胞で行って、本発明の製剤が、そのような細胞型に対して望ましい効果を有するか否かを決定することができる。例えば、ＨＭＧ１および／もしくはＨＭＧ２、ならびに／または接触した細胞が生成する炎症促進性サイトカインのレベルが低いほど、本発明の組成物が、患者における状態を処置するのに有効であり得ることを示している。あるいは、患者からの細胞を培養する代わりに、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ＴＨＰ−１細胞、またはマクロファージ（Ｍφ）などの、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２により刺激され得る細胞を用いて本発明の製剤をスクリーニングすることができる。ＥＬＩＳＡアッセイ、リアルタイムＰＣＲ、および当技術分野ではよく知られている他の方法を含む、当技術分野では標準の多くのアッセイを用いて、サイトカインの生成を評価することができる。特定の方法を、また、本明細書に開示する（下記実施例２および６を参照されたい）。
予防用または治療用の物質を、ヒトで試験する前に、限定するものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどを含む適切な動物モデルシステムで試験することができる。
当技術分野で知られており、広く使われている主要な動物モデルは、上記に記載したように当技術分野では周知であり、記載されている。さらに、敗血症（実施例５を参照されたい）、腹膜炎（実施例１０を参照されたい）、および関節炎（実施例７〜９を参照されたい）に対する特定の動物モデルを、本明細書に開示する。
さらに、当業者には周知のあらゆるアッセイを用いて、炎症性疾患の処置または予防のために本明細書に開示する組合せ療法の予防的および／または治療的有用性を評価することができる。
５．７ 本発明の抗体、抗体組成物、ならびにその治療的および／または予防的投与
本発明は、本明細書に記載する抗ＨＭＧ１抗体を包含し、本明細書で「本発明の抗体組成物」、「本発明の組成物」、または、より簡単に「組成物」と呼ぶ抗体組成物も目的としている。ある実施形態では、本発明の組成物は、本発明の抗体を、薬学的に許容できる賦形剤中に含む。本明細書で用いる「薬学的に許容できる担体」という用語は、本発明の抗体をそれと組み合わせることができ、組み合わせた後、対象に本発明の抗体を投与するのに用いることができる化学組成物を意味する。これらの抗体組成物は、本明細書では、「薬剤組成物」とも呼ぶ。他の実施形態では、本発明の組成物である。
本発明は、本発明の抗体または薬剤組成物の治療上有効な量を投与することを含む、急性および慢性両方の炎症状態を含む、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする状態を処置するための方法をさらに含む。慢性の炎症状態は、しばしば永久である組織の損傷をもたらす、長期間の、即ち、数週間、数カ月、または無期限の炎症反応を特徴とする。慢性の炎症状態には、限定するものではないが、関節炎（例えば、関節リウマチ）、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、およびクローン病）、胆嚢炎が含まれる。急性の炎症状態は、通常、血管透過性の増大、浮腫、しばしば組織の壊死をもたらし、死をもたらすことがある全身性の熱を含む症状の急激な発症を特徴とする。急性の炎症状態には、限定するものではないが、敗血症（例えば、微生物の感染による）、過敏性反応、組織壊死、および虫垂炎が含まれる。この状態は、炎症性サイトカインカスケードが、内毒素性ショックなどとともに全身性の反応を引き起こすものであり得る。あるいは、この状態は、関節リウマチにおけるように、局在性の炎症性サイトカインカスケードが媒介することがある。
一実施形態では、本発明の組成物は、ＨＭＧ１のＡボックス（例えば、配列番号４、２８、２９内のエピトープ）に特異的に結合する高親和性抗体を含む。別の一実施形態では、組成物は、ＨＭＧ１のＢボックス（例えば、配列番号４内のエピトープ）に特異的に結合する本発明の高親和性抗体を含む。なお別の一実施形態では、本発明の組成物は、ＨＭＧ２のＡボックス（例えば、配列番号２２内のエピトープ）に特異的に結合する高親和性抗体を含む。別の一実施形態では、組成物は、ＨＭＧ２のＢボックス（例えば、配列番号２３内のエピトープ）に特異的に結合する本発明の高親和性抗体を含む。
上記に記載したように、ＨＭＧ１シグナリングは、ＲＡＧＥにより、およびＴＬＲファミリーのタンパク質のメンバーにより、少なくとも部分的に媒介される。ＡボックスおよびＢボックスの両方とも、受容体の結合およびシグナリングで役割を果たしている様子である。あらゆる特定の理論によって拘泥しようとするものではないが、したがって、Ａボックスに特異的に結合する抗体（または他の拮抗物質）と、Ｂボックスに特異的に結合する抗体（または他の拮抗物質）との組合せは、ＨＭＧ１がＲＡＧＥおよび／またはＴＬＲタンパク質に結合するのを効果的に阻止することが企図される。したがって、本発明の組成物は、本発明の高親和性抗体（または他のＨＭＧＢ１抗体もしくは拮抗物質）の組合せ、例えば、限定するものではないが、ＨＭＧ１Ａボックスに特異的に結合する抗体と、ＨＭＧ１Ｂボックスに特異的に結合する抗体との組合せ、またはＨＭＧ２Ａボックスに特異的に結合する抗体と、ＨＭＧ２Ｂボックスに特異的に結合する抗体との組合せを含むことができる。特定の一実施形態では、組成物は、ＨＭＧ１のＡボックスおよびＢボックスの両方に由来するエピトープ（例えば、ＡボックスとＢボックスとの間の接合にまたがるエピトープ）に特異的に結合する本発明の高親和性抗体を含む。
本発明の組成物は、本発明の高親和性抗体を単独で、あるいは他の活性の治療用分子、および／またはステロイド、他の抗炎症性分子、もしくは他の抗体の治療法などの補助薬と組み合わせて含むことができる。より詳しくは、本発明の組成物は、初期敗血症メディエータの拮抗物質を含むことができる。初期敗血症メディエータの拮抗物質は、一実施形態では、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＭＩＦ、およびＩＬ−６から成る群から選択されるサイトカインの拮抗物質である。特定の一実施形態では、初期敗血症メディエータの拮抗物質は、ＴＮＦもしくはＭＩＦに対する抗体、またはＩＬ−１受容体拮抗物質である。
一実施形態では、本発明の薬剤組成物は、本質的に内毒素および／または関連する発熱性物質のないパイロジェンフリーの製剤である。内毒素は、微生物の内側に閉じ込められている毒素を含み、微生物が分解しまたは死滅した場合にのみ放出される。発熱性物質は、また、細菌および他の微生物の外膜からの、発熱を誘発する、熱安定性の物質（糖タンパク質）を含む。これらの物質は両方とも、ヒトに投与した場合に、発熱、血圧低下、およびショックを引き起こし得る。潜在的に有害な効果があるので、少量の内毒素でも、静脈内投与する薬剤の薬物溶液から取り除かなければならない。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内への薬物適用に対して、１回１時間に１キログラム体重あたり１投与量につき、５内毒素単位（ＥＵ）の上限を設定している（The United States Pharmacopeial Convention,Pharmacopeial Forum、26巻(1)、223頁（2000年））。１キログラム体重あたり数百または数千ミリグラムの量の治療用タンパク質を投与する場合、モノクローナル抗体の場合と同じであり得るように、痕跡量であっても有害かつ危険な内毒素は除去しなければならない。ある特定の実施形態では、組成物における内毒素および発熱性物質のレベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
ｉｎ ｖｉｖｏで投与するために用いる場合は、本明細書に記載した組成物は滅菌でなければならない。これは、例えば、滅菌のろ過膜を通したろ過により、または当技術分野ではよく知られている他の手段により、容易に遂行することができる。注射用の滅菌組成物は、Remington's Pharmaceutical Sciences（180' ed、Mack Publishing Company、Easton、ペンシルベニア州、1990年）に記載されている慣例の製薬上の実践に従って調合することができる。本明細書に開示されているものなどの抗体を含む組成物は、通常、凍結乾燥した形態で、または溶液で貯蔵される。本発明の抗体を含む滅菌の組成物は、滅菌のアクセスポート（ａｃｃｅｓｓ ｐｏｒｔ）、例えば、皮下注射針により貫通することができるストッパーなど、製剤の回収を可能にするアダプターを有する静脈内の溶液バッグまたはバイアルを有する容器中に配置されることが企図される。
本発明の一実施形態では、本明細書に記載する組成物は、急性および慢性両方の炎症状態を含めた、炎症性サイトカインカスケードの活性化により媒介され、またはそれを特徴とする状態を阻害することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載する組成物は、急性の炎症状態（例えば、敗血症）の処置に有用である。別の特定の一実施形態では、本明細書に記載する組成物は、慢性の炎症状態（例えば、関節リウマチ）の処置に有用である。さらに別の一実施形態では、本明細書に記載する組成物は、急性および慢性両方の炎症状態の処置に有用である。
本発明の組成物は、炎症性サイトカインカスケードの活性化により媒介され、またはそれを特徴とする炎症状態を有する対象に投与した場合に保護的であることが企図される。本発明の組成物により付与される保護は、当技術分野でよく知られている方法により測定することができる。本発明の組成物がどのくらい保護的であるかを決定するために用いる方法は、処置され、かつ／または予防される状態、ならびに試験される測定に応じて様々である。例えば、齧歯動物の関節炎モデルにおいて、本発明の組成物で処置した動物の、好適なコントロールの組成物で処置した動物との足の炎症スコア比較を用いて、本発明の組成物がどのくらい保護的であるかを決定することができる。敗血症のＣＬＰモデルでは、本発明の組成物で処置した動物と、好適なコントロールの組成物で処置した動物との生存の比較を用いて、抗体処置により付与された保護を決定することができる。一般的に、本発明の組成物での処置を、あるコントロールの処置と比較する。例えば、コントロールの処置は、コントロールの抗体を含むこともあり、賦形剤だけを含むこともある。いくつかの場合では、コントロールは、例えば、関節炎の処置に対するメトトレキセートまたは抗ＴＮＦ（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ、Ｈｕｍｉｒａ）のように、疾患の処置の標準の手当て（または好適な代用分子）であってもよい。いくつかの場合では、コントロールは陰性コントロール（例えば、ＰＢＳ）であってもよい。コントロールが標準の手当てを意味する場合、本発明の組成物を、単独で、または標準の手当ての処置、および比較される各群に対する保護のレベルと組み合わせて投与することができる。コントロールの選択は、処置および／または予防される状態、ならびに試験される測定を含む要因に依存し、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の組成物が付与する保護を決定するための方法の特定の例を、本明細書に提供する（下記、実施例７〜１１を参照されたい）。
本発明の別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、動物のＣＬＰ敗血症モデルにおいて、コントロールの組成物よりも、（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。特定の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、マウスＣＬＰモデル、および仔ブタＣＬＰモデルを含む群から選択される動物ＣＬＰ敗血症モデルにおいて、コントロールの組成物よりも、（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。別の特定の一実施形態では、動物ＣＬＰモデルはマウスＣＬＰモデルである。
本発明のなお別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルにおいて、コントロールの組成物よりも、（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。特定の一実施形態では、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルは、受動的コラーゲン誘発性関節炎モデルである。別の特定の一実施形態では、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルは、能動的コラーゲン誘発性関節炎モデルである。
本発明のさらに別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルにおいて、Ｒｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（メトトレキセートを含むものまたは含まないもの）よりも、（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。特定の一実施形態では、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルは、受動的コラーゲン誘発性関節炎モデルである。別の特定の一実施形態では、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルは、能動的コラーゲン誘発性関節炎モデルである。
本発明のなお別の一実施形態では、本明細書に記載する組成物は、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルにおいて、コントロールの組成物よりも、（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）骨の損失および／または軟骨の損傷を減少させる。特定の一実施形態では、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルは、受動的コラーゲン誘発性関節炎モデルである。別の特定の一実施形態では、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルは、能動的コラーゲン誘発性関節炎モデルである。
他の実施形態では、本明細書に記載した組成物は、ラットアジュバント誘発性関節炎モデルにおいて、コントロールの組成物よりも、（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。
本発明のなお他の実施形態では、本明細書に記載した組成物は、ラットアジュバント誘発性関節炎モデルにおいて、Ｒｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（メトトレキセートを含むものまたは含まないもの）よりも、（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。
本発明のさらに他の実施形態では、本明細書に記載した組成物は、ラットアジュバント誘発性関節炎モデルにおいて、コントロールの組成物よりも、（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）骨の損失および／または軟骨の損傷を減少させる。
本発明の別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、ヒトにおいてＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（メトトレキセートを含むものまたは含まないもの）よりも、（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。
本発明のさらに別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、マウス腹膜炎モデルにおいて、コントロールの組成物よりも、（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）保護的である。
本発明のなお別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、ヒトにおいて、または齧歯動物ＳＣＩモデルにおいて、コントロールの組成物よりも、（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）脊髄損傷（ＳＣＩ）の重症度を改善する。
本発明のなお別の一実施形態では、本明細書に記載した組成物は、ヒトにおいて、または齧歯動物ＡＬＩモデルにおいて、コントロールの組成物よりも、（少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）急性肺傷害（ＡＬＩ）の重症度を改善する。
本発明は、また、哺乳動物の細胞からの炎症促進性サイトカインの放出を阻害する方法を目的とする。この方法は、細胞から炎症促進性サイトカインの放出を阻害するのに十分な量の、本発明の抗体または抗体組成物で細胞を処置することを含む。これらの実施形態では、細胞はマクロファージであるのが好ましい。ある実施形態では、炎症促進性サイトカインは、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＭＩＦ、およびＩＬ−６から成る群から選択される。他の実施形態では、細胞はマクロファージであり、炎症促進性サイトカインは、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＭＩＦ、およびＩＬ−６から成る群から選択される。なお他の実施形態では、細胞はＰＢＭＣであり、炎症促進性サイトカインは、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＭＩＦ、およびＩＬ−６から成る群から選択される。一実施形態では、この方法は、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする状態に罹患し、またはその危険性のある患者における細胞を処置するものである。特定の状態は、本明細書に列挙してある。
本発明は、また、哺乳動物の細胞からＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２の放出を阻害する方法を目的とする。この方法は、細胞からＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２の放出を阻害するのに十分な量の本発明の抗体または抗体組成物で、細胞を処置することを含む。この方法は、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする状態に罹患し、またはその危険性のある患者における細胞を処置することが好ましい。好ましい状態は、本明細書に列挙してある。
サイトカイン、ＨＭＧ１、および／またはＨＭＧ２の放出の阻害を決定する方法は、上記に記載し、本明細書に開示してあるものなど、当技術分野ではよく知られている多くの方法により決定することができる（下記、実施例２〜１１を参照されたい）。
本明細書で用いられる「治療上有効な量」、「十分な量」などの語は、ＨＭＧ１および／またはＨＭＧ２が媒介する疾患または障害を処置し、または管理するのに十分な、本発明のＨＭＧ１抗体組成物などの治療用物質の量を意味する。治療上有効な量は、疾患の発症を遅らせ、または最小化するのに、例えば、疾患の重症度を遅らせ、または最小化するのに十分な治療用物質の量を意味することができる。治療上有効な量は、炎症性疾患の処置または管理において治療上の利点を提供する治療用物質の量も意味することができる。さらに、本発明の薬剤組成物に関して治療上有効な量は、炎症性疾患などの疾患の処置または管理において治療上の利点を提供する、単独の、または他の治療と組み合わせた治療用物質の量を意味する。
本発明は、炎症性疾患、または１つもしくは複数のその症状を予防し、管理し、処置し、または改善する方法をさらに提供し、前記方法は、本発明の抗体組成物および／または１つもしくは複数の治療を、それを必要とする患者に投与することを含む。有用であることが知られているあらゆる物質または治療法、あるいは炎症性疾患、または１つもしくは複数のその症状を予防し、管理し、処置し、または改善するために用いられていた、または現在用いられているあらゆる物質または治療法を、本発明の抗体組成物と組み合わせて用いることができる。そのような物質の例には、限定するものではないが、免疫調節性の物質、血管新生阻害剤、抗炎症物質、およびＴＮＦ−α拮抗物質が含まれる。
抗体組成物、即ち本発明の薬剤組成物を用いて有用に処置することができる状態の非限定的な例には、本明細書の背景のセクションおよび以下に列挙するこれらの状態が含まれる。好ましくは、状態は、虫垂炎、消化性、胃、もしくは十二指腸の潰瘍、腹膜炎、膵臓炎、潰瘍性、偽膜性、急性もしくは虚血性の腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血、再潅流傷害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素性ショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、感染流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、ＣＯＰＤ、鼻炎、嚢胞性繊維症、肺炎、肺限外顕微鏡的間質性肺炎、アルベアリティス（ａｌｖｅａｌｉｔｉｓ）、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染症、ヘルペス感染症、ＨＩＶ感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、散在性細菌、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、いぼ、膨疹、ヴァスリティス（ｖａｓｕｌｉｔｉｓ）、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化、再狭窄、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ぶどう膜炎、関節炎症、関節痛、骨膜炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、スリオイディティス（ｔｈｒｙｏｉｄｉｔｉｓ）、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ’ｓ）病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ライター症候群、またはホジキン病である。より好ましい実施形態では、状態は、虫垂炎、消化性、胃、もしくは十二指腸の潰瘍、腹膜炎、膵臓炎、潰瘍性、偽膜性、急性もしくは虚血性の腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再潅流傷害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素性ショック、悪液質、感染流産、散在性細菌、熱傷、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄損傷、麻痺、同種移植片拒絶反応、または移植片対宿主病である。
好ましい一実施形態では、本発明は、虫垂炎、消化性、胃、および十二指腸の潰瘍、腹膜炎、膵臓炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の腸炎、肝炎、クローン病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、関節リウマチ、臓器虚血、再潅流傷害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素性ショック、悪液質、感染流産、散在性細菌、熱傷、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄損傷、麻痺、同種移植片拒絶反応、または移植片対宿主病から成る群から選択される状態を処置および／または予防するための、本発明の組成物および抗体を投与し、用いる方法を目的とする。最も好ましい実施形態では、状態は内毒素性ショック、または同種移植片拒絶反応である。状態が同種移植片拒絶反応である場合は、組成物には、シクロスポリンなど、同種移植片拒絶反応を阻害するのに用いられる免疫抑制薬も含まれると有利であり得る。
本発明の特定の好ましい一実施形態は、敗血症および関節炎（例えば、ＲＡ、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ）を処置および／または予防するために、本発明の組成物および抗体を投与し、用いる方法を目的とする。さらに、本発明の特定の好ましい一実施形態は、乾癬および強直性脊椎炎を処置および予防するために、本発明の組成物および抗体を投与し、用いる方法を目的とする。
本発明の別の特定の好ましい一実施形態は、再狭窄、血管疾患、および心臓血管疾患を処置および予防するために、本発明の組成物および抗体を投与し、用いる方法を目的とする。
本発明のさらに別の特定の好ましい一実施形態は、組織の損傷を処置および予防するために、かつ組織の修復および再生を促進するために、本発明の組成物および抗体を投与し、用いる方法を目的とする。
上記で論じたように、炎症性疾患、または１つもしくは複数のその症状を予防し、管理し、処置し、または改善するのに有用であることが知られている、または用いられていた、もしくは現在用いられているあらゆる物質または治療を、本発明の抗体組成物と組み合わせて用いることができる。炎症性障害を有する対象に本発明の抗体組成物と組み合わせて投与することができる免疫調節物質の詳しい例には、限定するものではないが、メトトレキセート、レフルノミド、シクロホスファミド、サイトキサン、イムラン、シクロスポリンＡ、ミノサイクリン、アザチオプリン、抗生物質（例えば、ＦＫ５０６（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナール（ｂｒｅｑｕｉｎａｒ）、マロノニトリロアミンデス（ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｏａｍｉｎｄｅｓ）（例えば、レフルナミド（ｌｅｆｌｕｎａｍｉｄｅ））、抗Ｔ細胞受容体抗体（例えば、抗ＣＤ４抗体（例えば、ｃＭ−Ｔ４１２（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）、ＩＤＥＣ−ＣＥ９．１．ＲＴＭ（ＩＤＥＣおよびＳＫＢ）、ｍＡＢ４１６２Ｗ９４、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ、およびＯＫＴｃｄｒ４ａ（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ））、抗ＣＤ３抗体（例えば、Ｎｕｖｉｏｎ（Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）、ＯＫＴ３（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）抗ＣＤ２０抗体（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（ＩＤＥＣ ＆ Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、米国および国際特許公開US2004/0202658、WO00/67796）ならびにそれらの誘導体、ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０（ＧｅｎＭａｂおよびＭｅｄａｒｅｘ、米国特許公開第2004/0167319号）、抗ＣＤ１９抗体（例えば、米国および国際特許公開US20020041847、US20030133930、およびWO05/012493を参照されたい）、抗ＣＤ５抗体（例えば、抗ＣＤ５リシン連結免疫複合体）、抗ＣＤ７抗体（例えば、ＣＨＨ−３８０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４０リガンドモノクローナル抗体（例えば、ＩＤＥＣ−１３１（ＩＤＥＣ））、抗ＣＤ５２抗体（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ１Ｈ（Ｉｌｅｘ））、抗ＣＤ２抗体（例えば、ＭＥＤＩ−５０７（ＭＥｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、国際公開WO02/098370、およびWO02/069904）、抗ＣＤ１１ａ抗体（例えば、Ｘａｎｅｌｉｍ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））、ならびに抗Ｂ７抗体（例えば、ＩＤＥＣ−１１４）（ＩＤＥＣ））；抗サイトカイン受容体抗体（例えば、抗ＩＦＮ受容体抗体、抗ＩＬ−２受容体抗体（例えば、Ｚｅｎａｐａｘ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ））、抗ＩＬ−４受容体抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体、抗ＩＬ−１０受容体抗体、および抗ＩＬ−１２受容体抗体）、抗サイトカイン抗体（例えば、抗ＩＦＮ抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＩＬ−β抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−８抗体（例えば、ＡＢＸ−ＩＬ−８（Ａｂｇｅｎｉｘ））、および抗ＩＬ−１２抗体））；抗ＣＤ２２抗体（例えば、Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）などの非リガンドの阻止抗体、およびリガンドの阻止抗体（例えば、米国特許公開第2004/0001828号、および第2003/0202975号））；ＣＴＬＡ４−免疫グロブリン；ＬＦＡ−３ＴＩＰ（Ｂｉｏｇｅｎ、国際公開WO93/08656、および米国特許第6,162,432号）；可溶性サイトカイン受容体（例えば、ＴＮＦ−α受容体の細胞外ドメインまたはそのフラグメント、ＩＬ−１β受容体の細胞外ドメインまたはそのフラグメント、およびＩＬ−６受容体の細胞外ドメインまたはそのフラグメント）；サイトカインまたはそのフラグメント（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに抗サイトカイン抗体（例えば、抗ＩＬ−２抗体、抗ＩＬ−４抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−１０抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１５抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、および抗ＩＦＮ−γ抗体）が含まれる。
炎症性障害を有する対象に本発明の抗体組成物と組み合わせて投与することができる、血管新生阻害剤の非制限的な例には、Ｖｉｔａｘｉｎ（登録商標）（Ｍｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ）または他の抗αｖβ３抗体（例えば、ＣＮＴ０９５（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ））、エンドスタチン、アンジオスタチン、アポミグレン（ａｐｏｍｉｇｒｅｎ）、血管新生阻害の抗トロンビンＩＩＩ、フィブロネクチンの２９ｋＤａのＮ−末端および４０ｋＤａのＣ−末端のタンパク質分解性フラグメント、ｕＰＡ受容体拮抗物質、プロラクチンの１６ｋＤａのタンパク質分解性フラグメント、血小板第４因子の７．８ｋＤａのタンパク質分解性フラグメント、血小板第４因子の血管新生阻害のアミノ酸２４個のフラグメント、１３．４０と呼ばれる血管新生阻害因子、トロンボスポンジンＩの血管新生阻害のアミノ酸２２個のペプチドフラグメント、ＳＰＡＲＣの血管新生阻害のアミノ酸２０個のペプチドフラグメント、ＲＧＤおよびＮＧＲ含有ペプチド、ラミニンの小型血管新生阻害ペプチド、フィブロネクチン、プロコラーゲンおよびＥＧＦ、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）拮抗物質、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）拮抗物質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）拮抗物質、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）拮抗物質（例えば、抗ＶＥＧＦＲ抗体）、ならびにＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）が含まれる。
炎症性障害を有する対象に、本発明の抗体組成物と組み合わせて投与することができるＴＮＦ−α拮抗薬の非制限的な例には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、ＴＮＦ−αに免疫特異的に結合する抗体などの抗体（例えば、ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、Ｆｖｓ、ＳｃＦｖｓ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、およびそれらの抗原結合性フラグメント）、核酸分子（例えば、アンチセンス分子、または三重らせん）、有機分子、無機分子、ならびにＴＮＦ−αの機能、活性、および／または発現を阻止し、低減し、阻害し、または中和する小分子が含まれる。様々な実施形態では、ＴＮＦ−α拮抗物質は、ＴＮＦ−αの機能、活性および／または発現を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などのコントロールに比べて、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減させる。ＴＮＦ−αに免疫特異的に結合する抗体の例には、限定するものではないが、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）、Ｃｅｎｔａｃｏｒ）、Ｄ２Ｅ７（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／Ｋｎｏｌｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ．、Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ、ニュージャージー州）、ＨＵＭＩＣＡＤＥ（商標）としても知られているＣＤＰ５７１、およびＣＤＰ−８７０（両方ともＣｅｌｌｔｅｃｈ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｌｏｕｇｈ、英国）、ならびにＴＮ３−１９．１２（Williamsら、1994年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91巻、2762〜2766頁；Thorbeckeら、1992年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89巻、7375〜7379頁）が含まれる。本発明は、本発明の組成物および方法における、以下の米国特許に開示されているＴＮＦ−αに免疫特異的に結合する抗体の使用も包含する：米国特許第5,136,021号、第5,147,638号、第5,223,395号、第5,231,024号、第5,334,380号、第5,360,716号、第5,426,181号、第5,436,154号、第5,610,279号、第5,644,034号、第5,656,272号、第5,658,746号、第5,698,195号、第5,736,138号、第5,741,488号、第5,808,029号、第5,919,452号、第5,958,412号、第5,959,087号、第5,968,741号、第5,994,510号、第6,036,978号、第6,114,517号、および第6,171,787号。可溶性のＴＮＦ−α受容体の例には、限定するものではないが、ｓＴＮＦ−Ｒ１（Ａｍｇｅｎ）、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標）；Ｉｍｍｕｎｅｘ）、およびそのラット類似体であるＲＥＮＢＲＥＬ（商標）、ＴＮＦｒＩ、ＴＮＦｒＩＩに由来するＴＮＦ−αの可溶性の阻害物質（Kohnoら、1990年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87巻、8331〜8335頁）、ならびにＴＮＦ−αＩｎｈ（Seckingerら、1990年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87巻、5188〜5192頁）が含まれる。
本発明が包含する他のＴＮＦ−α拮抗物質には、限定するものではないが、インターフェロンγが活性化するマクロファージによりＴＮＦ−αの生成を阻止することが知られているＩＬ−１０（Oswaldら、1992年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89巻、8676〜8680頁）、ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（Ashkenaziら、1991年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88巻、10535〜10539頁）、ネズミ科動物生成物ＴＢＰ−１（Ｓｅｒｏｎｏ／Ｙｅｄａ）、ワクチンＣｙｔｏＴＡｂ（Ｐｒｏｔｈｅｒｉｃｓ）、アンチセンス分子１０４８３８（ＩＳＩＳ）、ペプチドＲＤＰ−５８（ＳａｎｇＳｔａｔ）、サリドマイド（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＣＤＣ−８０１（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＤＰＣ−３３３（Ｄｕｐｏｎｔ）、ＶＸ−７４５（Ｖｅｒｔｅｘ）、ＡＧＩＸ−４２０７（ＡｔｈｅｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＩＴＦ−２３５７（Ｉｔａｌｆａｒｍａｃｏ）、ＮＰＩ−１３０２１−３１（Ｎｅｒｅｕｓ）、ＳＣＩＯ−４６９（Ｓｃｉｏｓ）、ＴＡＣＥｔａｒｇｅｔｅｒ（Ｉｍｍｕｎｉｘ／ＡＨＰ）、ＣＬＸ−１２０５００（Ｃａｌｙｘ）、Ｔｈｉａｚｏｌｏｐｙｒｉｍ（Ｄｙｎａｖａｘ）、オーラノフィン（Ｒｉｄａｕｒａ）（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、キナクリン（メパクリンジクロロヒドレート）、テニダップ（Ｅｎａｂｌｅｘ）、Ｍｅｌａｎｉｎ（Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、およびＵｒｉａｃｈによる抗ｐ３８ＭＡＰＫ物質が含まれる。
炎症性障害を有する対象に、本発明の抗体組成物と組み合わせて投与することができる抗炎症物質の非制限的な例には、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド性抗炎症薬、β−作用薬、抗コリン薬、およびメチルキサンチンが含まれる。ＮＳＡＩＤの例には、限定するものではないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標））、ジクロフェナク（ＶＯＬＴＡＥＲＥＮ（商標））、エトドラク（ＬＯＤＩＮＥ（商標））、フェノプロフェン（ＮＡＬＦＯＮ（商標））、インドメタシン（ＩＮＤＯＣＩＮ（商標））、ケトララック（ｋｅｔｏｒａｌａｃ）（ＴＯＲＡＤＯＬ（商標））、オキサプロジン（ＤＡＹＰＲＯ（商標））、ナブメントン（ｎａｂｕｍｅｎｔｏｎｅ）（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標））、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（商標））、トルメンチン（ｔｏｌｍｅｎｔｉｎ）（ＴＯＬＥＣＴＩＮ（商標））、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ（商標））、ナプロキセン（ＡＬＥＶＥ（商標）、ＮＡＰＲＯＳＹＮ（商標））、ケトプロフェン（ＡＣＴＲＯＮ（商標））、およびナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標））が含まれる。このようなＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、ＣＯＸ−１および／またはＣＯＸ−２）を阻害することにより機能する。ステロイド性抗炎症薬の例には、限定するものではないが、グルココルチコイド、デキサメタゾン（ＤＥＣＡＤＲＯＮ（商標））、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標））、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アズルフィジン、ならびに、プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエンなどのエイコサノイドが含まれる。
特定の実施形態では、骨関節炎の患者には、本発明の抗体組成物の予防上または治療上有効な量を、限定するものではないが、鎮痛薬（非限定的な例として、４０００ｍｇ／ｄまでの投与量のアセトアミノフェン；フェナセチン；および２００から３００ｍｇの範囲の毎日投与量のトラマドール）、ＮＳＡＩＤ（非限定的な例として、限定するものではないが、アスピリン、ジフルニサル、ジクロフェナク、エトドラク、フェナメート、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、サリチル酸メチル、ネブメトン（ｎｅｂｕｍｅｔｏｎｅ）、ナプロキシン（ｎａｐｒｏｘｉｎ）、オキサプラジン（ｏｘａｐｒａｚｉｎ）、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、およびトルメチンを含む）を含む、骨関節炎の予防、処置、管理、または改善に有用な他の物質または治療法と組み合わせて投与する。低投与量のＮＳＡＩＤ、例えば、１２００ｍｇ／ｄのイブプロフェン、５００ｍｇ／ｄのナプロキセンが好ましい。胃保護薬、例えば、ミソプロストール、ファモチジン、またはオメプラゾールが、ＮＳＡＩＤと同時に使用するのに好ましい；限定するものではないがサルサレートを含む非アセチル化のサリチル酸；限定するものではないが、セレコキシブおよびロフェコキシブを含むシクロオキシゲナーゼ（Ｃｏｘ）−２−特異的阻害薬（ＣＳＩ）；持効性のグルココルチコイド調製物の関節内または関節周囲の注射、ヒアルロン酸の関節内注射、カプサイシンクリーム、フィブリン、軟骨破片、および他の細片を流し去るための骨関節炎の膝の大量の潅注、ならびに関節置換の外科手術。本発明の抗体組成物を、限定するものではないが、関節の負荷の低減（非限定的な例として、悪い姿勢の矯正、腰椎の過剰な負荷の支持、関連する関節の過剰な負荷の回避、長時間の起立、ひざまずく姿勢、およびしゃがんだ姿勢の回避）、冒されている関節への温熱の適用、エアロビクス運動、ならびにその他の理学療法を含む骨関節炎の予防、処置、管理、および改善における他の非薬理学的手段と組み合わせて用いることもできる。
特定の実施形態では、関節リウマチの患者には、本発明の抗体組成物の予防上または治療上有効な量を、限定するものではないが、ＮＳＡＩＤ（非限定的な例には、限定するものではないが、アスピリン、ジフルニサル、ジクロフェナク、エトドラク、フェナメート、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、サリチル酸メチル、ネブメトン（ｎｅｂｕｍｅｔｏｎｅ）、ナプロキシン（ｎａｐｒｏｘｉｎ）、オキサプラジン（ｏｘａｐｒａｚｉｎ）、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、およびトルメチンが含まれる）、鎮痛薬（非限定的な例として、アセトアミノフェン、フェナセチン、およびトラマドールがある）；限定するものではないが、セレコキシブおよびロフェコキシブを含むＣＳＩ；グルココルチコイド（好ましくは低投与量の経口グルココルチコイド、例えば、＜７．５ｍｇ／ｄのプレドニゾン、または高投与量のグルココルチコイドの１カ月毎のパルス投与、または関節内のグルココルチコイド）；限定するものではないが、メトトレキセート（好ましくは断続的に低投与量を投与、例えば１週間に１回７．５〜３０ｍｇ）、金化合物（例えば、金塩）、Ｄ−ペニシラミン、抗マラリア薬（例えば、クロロキン）およびスルファサラジンを含む疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）；限定するものではないがエタネルセプトおよびインフリキシマブを含むＴＮＦ−α中和薬；免疫抑制薬および細胞毒性物質（例として、限定するものではないが、アザチオプリン、レフルノミド、シクロスポリン、およびシクロホスファミドが含まれる）、ならびに外科手術（例として、限定するものではないが、関節形成術、全関節置換、手の再建手術、オープンの、もしくは関節鏡検査の滑膜切除術、および手首の初期の腱鞘切除術）を含む、関節リウマチを予防し、処置し、管理し、および改善するのに有用な他の物質または治療と組み合わせて投与する。本発明の抗体組成物は、また、限定するものではないが、安静、炎症を起こした関節の不必要な動きを低減するための副木、運動、様々な矯正器具および補助器具の使用、ならびに他の理学療法を含む、関節リウマチを予防し、処置し、管理し、および改善する他の手段と組み合わせて用いることもできる。本発明の抗体組成物は、また、限定するものではないが、食事（例えば、ある種の魚油に見られるエイコサペンタエン酸などのω−３脂肪酸を、肉に見られる食事のω−６必須脂肪酸の代用にする）、ワクチン、ホルモン、および局所用調製物を含む関節リウマチを予防し、処置し、管理し、および改善するいくつかの非伝統的な取組みと組み合わせて用いることもできる。
特定の実施形態では、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の患者に、予防上または治療上有効な量の本発明の抗体組成物を、単独で、または、限定するものではないが；限定するものではないが、短時間および長時間作用性のβ２−アドレナリン作用薬（短時間作用性β２−作用薬の例には、限定するものではないが、アルブテロール、ピルブテロール、テルブタリン、およびメタプロテレノールが含まれる；長時間作用性β２−作用薬の例には、限定するものではないが、経口の徐放性アルブテロール、および吸入のサルメテロールが含まれる））、抗コリン薬（例として、限定するものではないが、臭化イプラトロピウムが含まれる）、ならびにテオフィリンおよびその誘導体（テオフィリンの治療範囲は、好ましくは１０〜２０μｇ／ｍＬである）を含む、気管支拡張薬；グルココルチコイド；外来性のα１ＡＴ（例えば、１週間に６０ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内に投与した、プールしたヒト血漿に由来するα１ＡＴ）、酸素；肺移植；肺容積を低減する外科手術；気管内挿管、補助換気、毎年のインフルエンザワクチンおよび２３価肺炎球菌多糖類のワクチン接種；運動；ならびに喫煙の中止を含む、ＣＯＰＤを予防し、処置し、管理し、および改善するのに有用な他の物質または治療法と組み合わせて投与することができる。
特定の実施形態では、肺線維症の患者に、本発明の抗体組成物の予防上または治療上有効な量を、単独で、または、限定するものではないが、酸素、コルチコステロイド（非限定的な例として、プレドニゾンを１〜１．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ（最高１００ｍｇ／ｄ）で始めて６週間毎日投与し、３〜６カ月かけて徐々に、最小維持投与量の０．２５ｍｇ／ｋｇ／ｄに漸減する）、細胞毒性薬物（非限定的な例として、１日１回１００〜１２０ｍｇのシクロホスファミドを経口投与、および１日１回３ｍｇ／ｋｇから最高２００ｍｇのアザチオプリンを経口投与）、気管支拡張薬（非限定的な例として、短時間および長時間作用性のβ２−アドレナリン作用薬、抗コリン薬、ならびにテオフィリンおよびその誘導体）、ならびに抗ヒスタミン薬（非限定的な例としてジフェンヒドラミンおよびドキシラミン）を含む肺線維症の治療に有用な１つまたは複数の他の物質の有効量と組み合わせて投与する。
特定の実施形態では、ＳＣＩの患者に、本発明の抗体組成物の予防上または治療上有効な量を、単独で、または、限定するものではないが、グルココルチコイドステロイド（非限定的な例として、メチルプレドニゾロン３０ｍｇ／ｋｇのボーラスを１５分かけて投与し、５．４ｍｇ／ｋｇ／ｈのメチルプレドニゾロンの２３時間注入をボーラスの４５分後に開始する）、神経保護薬（例えば、ミノサイクリン）、再生療法（例えば、幹細胞処置、ヒドロゲル）、弱い電場（例えば、脊髄外振動磁場刺激装置埋め込み可能の医療機器）を含む、ＳＣＩの治療に有用な１つまたは複数の他の物質の有効量と組み合わせて投与する。
特定の実施形態では、喘息の患者に、本発明の抗体組成物の予防上または治療上有効な量を、単独で、あるいは、限定するものではないが、アドレナリン作動性刺激薬（例として、限定するものではないが、カテコールアミン（例えば、エピネフリン、イソプロテレノール、およびイソエタリン）、レゾルシノール（例えば、メタプロテレノール、テルブタリン、およびフェノテロール）；ならびにサリゲニン、例えばサルブタモールを含む。アドレナリン作動性刺激薬を投与するには、吸入が好ましい経路である。；限定するものではないがテオフィリンおよびその様々な塩を含むメチルキサンチン；限定するものではないが硫酸アトロピン、硝酸メチルアトロピン、および臭化イプラトロピウムを含む抗コリン作用薬;グルココルチコイド（例として、限定するものではないが、全身性または経口ステロイド、および吸入のグルココルチコイドを含む）、肥満細胞安定化薬（例として、限定するものではないが、クロモグリク酸ナトリウム、およびネドクロミルナトリウムを含む）、ロイコトリエン修飾物質（例として、限定するものではないが、ジロートン、ザフィルルカスト、およびモンテルカストを含む）；免疫抑制薬（例として、限定するものではないが、メトトレキセートおよび金塩を含む）、ならびに粘液溶解薬（例として、限定するものではないが、アセチルシステインを含む）を含む、喘息の治療に有用な１つまたは複数の他の物質の有効量と組み合わせて投与する。
本発明は、本発明の化合物または薬剤組成物、好ましくは本発明の抗体の有効量を対象に投与することにより、処置、阻害、および予防する方法をもたらすものである。好ましい一実施形態では、化合物は本質的に精製されている（例えば、その効力を制限し、または望ましくない副作用を生成する物質が本質的にない）。対象は、好ましくは、限定するものではないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物を含む動物であり、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用することができる投与の製剤および方法は、上記に記載してある。さらなる好適な製剤および投与経路は、本明細書の以下に記載したものの中から選択することができる。
様々な送達システムが知られており、本発明の化合物を投与するのに用いることができ、例えば、リポソームにおけるカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組換え体の細胞、受容体が媒介するエンドサイトーシス（例えば、WuおよびWu、J.Biol.Chem.、262巻、4429〜4432頁（1987年）を参照されたい）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などがある。導入の方法には、限定するものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口の経路が含まれる。化合物または組成物は、あらゆる便利な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚の内層（例えば、経口粘膜、直腸および腸の粘膜など）を通した吸収により投与することができ、他の生物学的に活性な物質と一緒に投与することができる。投与は、全身的でも局所的でもよい。さらに、本発明の薬剤化合物または組成物を、脳室内およびくも膜下腔内注射を含めた、あらゆる適切な経路により中枢神経系中に導入することが望ましいことがあり、脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａ貯留槽などの貯留槽に付着している脳室内カテーテルにより促進され得る。肺投与も、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化物質との製剤を用いることにより、使用することができる。
特定の実施形態では、本発明の薬剤化合物または組成物を、処置を必要とする領域に局所的に投与するのが望ましいことがあり、これは、例えば、限定的なものではないが、外科手術中の局所注入、局所適用、例えば、外科手術後に傷の包帯と組み合わせて、注射により、カテーテルにより、座剤により、埋め込みにより実現することができ、前記埋め込みは、シラスチックの膜、または線維などの膜を含む、多孔性の、非多孔性の、またはゼラチン状の材料である。好ましくは、本発明の抗体を含めたタンパク質を投与する場合には、それにタンパク質が吸収されない材料を使用するように注意を払わなければならない。
別の一実施形態では、化合物または組成物を、ビヒクルで、特にリポソームで送達することができる（Langer、Science、249巻、1527〜1533頁（1990年）；Treatら、「Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer」、Lopez-BeresteinおよびFidler（編集）、Liss、ニューヨーク、353〜365頁（1989年）；Lopez-Berestein、同書、317〜327頁を参照されたい；一般的には同書を参照されたい）。
さらに別の一実施形態では、化合物または組成物を、徐放システムで送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Langer、上述；Sefton、1987年、CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.、14巻、201頁；Buchwaldら、1980年、Surgery、88巻、507頁；Saudekら、1989年、N.Engl.J.Med.、321巻、574頁を参照されたい）。別の一実施形態では、ポリマー材料を用いることができる（Medical Applications of Controlled Release、LangerおよびWise（編集）、CRC Press、Boca Raton、フロリダ州（1974年）；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance、SmolenおよびBall（編集）、Wiley、ニューヨーク（1984年）；RangerおよびPeppas,J.、1983年、Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.、23巻、61頁を参照されたい； Levyら、1985年、Science、228巻、190頁；Duringら、1989年、Ann.Neurol.、25巻、351頁；Howardら、1989年、J.Neurosurg.、71巻105頁も参照されたい）。さらに別の一実施形態では、徐放システムを治療の標的の近く、即ち脳に配置することができ、したがって全身の投与量のほんの小部分しか必要としない（例えば、Goodson、「Medical Applications of Controlled Release」、上述、第2巻、115〜138頁（1984年）を参照されたい）。他の徐放システムは、Langer（1990年、Science、249巻、1527〜1533頁）らによる再考で論じられている。
本発明の化合物がタンパク質をコードしている核酸である特定の一実施形態では、それを好適な核酸発現ベクターの部分として構築し、それが細胞内になるように投与することにより、例えば、レトロウイルスのベクターを使用することにより（米国特許第4,980,286号を参照されたい）、または直接注射することにより、または微粒子銃（例えば、遺伝子銃、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）を使用することにより、または脂質、もしくは細胞表面受容体、もしくは形質移入する物質でコーティングすることにより、または核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連結してそれを投与することによる（例えば、Joliotら、1991年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88巻、1864〜1868頁を参照されたい）など、核酸をｉｎ ｖｉｖｏで投与して、そのコードされたタンパク質の発現を促進することができる。あるいは、相同の組換えにより、核酸を細胞内に導入し、発現させるために、宿主細胞のＤＮＡ内に組み入れることができる。
本発明は、薬剤組成物も提供する。このような組成物は、治療上有効な量の化合物、および薬学的に許容できる担体を含む。特定の一実施形態では、「薬学的に許容できる」という用語は、連邦または州政府の監督機関により認可されており、あるいは米国薬局方またはその他の一般に認められている薬局方に、動物、より詳しくはヒトで使用するために列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはそれとともに治療物質を投与するビヒクルを意味する。このような製剤上の担体は、水および油などの滅菌の液体であってよく、石油の、動物性の、植物性の、または合成の起源のもの、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などが含まれる。薬剤組成物を静脈内に投与する場合には、水が好ましい担体である。食塩水、およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も、また、特に注射可能な溶液に対して、液体の担体として使用することができる。適切な製剤上の賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望により、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含むことができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、徐放製剤などの形態をとることができる。組成物を、トリグリセリドなどの伝統的な結合剤および担体とともに、座剤として調合することができる。経口の製剤は、製剤用グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を含むことができる。適切な薬剤上の担体の例は、E.W.Martinの「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、患者に適切に投与するための形態を提供するために、治療上有効な量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切な量の担体とともに含む。製剤は、投与の様式に適合しなければならない。
好ましい一実施形態では、組成物を、ヒトに静脈内投与するために適合した薬剤組成物として日常の手順に従って調合する。典型的には、静脈内投与するための組成物は、滅菌の等張の緩衝水溶液である。必要な場合には、組成物は、可溶化剤、および注射部位の痛みを緩和するためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含むこともできる。一般的には、成分を、別々に、または単位投与量形態に一緒に混合して、例えば、有効物質の量を示すアンプルまたはサシェなどの気密容器入りの、乾燥した凍結乾燥粉末もしくは水分のない濃縮物として供給する。組成物を注入により投与しようとする場合には、滅菌の製剤用グレードの水または食塩水を含む注入ボトルで調剤することができる。組成物を注射により投与する場合には、投与の前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。
本発明の化合物を、中性の、または塩の形態で調合することができる。薬学的に許容できる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなど、陰イオンで形成されたもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、三価鉄水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなど、陽イオンで形成されたものが含まれる。
本発明のポリペプチドの異常な発現、および／または活性化に関連する疾患または障害の処置、阻害、および予防に有効な本発明の化合物の量は、標準の臨床技術により決定することができる。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイを任意選択で使用して、最適の投与量範囲を同定するのを助けることができる。製剤で使用するべき正確な投与量は、また、投与経路、および疾患または障害の重症度に依存し、医師の判断および各患者の状況に従って決定すべきである。有効な投与量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデルの試験システムから導かれる用量反応曲線から推定することができる。
抗体に関して、患者に投与する投与量は、典型的には患者の体重１ｋｇあたり、０．１ｍｇから１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与する投与量は、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇから１０ｍｇである。一般的に、外来のポリペプチドに対する免疫反応のため、ヒト抗体は、他の種からの抗体よりもヒトの体内での半減期が長い。したがって、ヒト抗体では、より低い投与量、およびあまり頻繁でない投与が、しばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投与量および頻度は、例えば脂質化などの修飾により、抗体の取り込みおよび組織浸透性（例えば、脳内への）を増強することにより、低減することができる。
本発明は、本発明の薬剤組成物の１つまたは複数の成分で満たした１つまたは複数の容器を含む、薬剤の包装またはキットも提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を統括する政府機関により処方された形態の通知が、このような容器と場合により関連づけられることがあるが、この通知はヒトに投与するために、製造、使用、または販売の機関による認可を反映するものである。
これらの組成物にポリペプチドとともに含まれる賦形剤は、治療の適用において、期待される組成物の投与経路に基づいて選択される。組成物の投与経路は、処置する状態に依存する。例えば、内毒素性ショックなどの全身性障害の処置には静脈内注射が好ましいことがあり、胃潰瘍などの胃腸障害を処置するには経口投与が好ましいことがある。投与経路、および投与する組成物の投与量は、当業者であれば、過度の実験を行わずに、標準の用量反応試験と組み合わせて決定することができる。これらの決定を行う上で考慮される関連する状況には、処置する状態または状態（複数形）、投与する組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、および反応、ならびに患者の症状の重症度が含まれる。したがって、状態に応じて、患者に抗体組成物を経口で、非経口で、鼻腔内に、膣に、直腸に、舌側に、舌下に、頬側に、頬内に、および経皮に投与することができる。
したがって、経口、舌側、舌下、頬側、および頬内に投与するためにデザインされた組成物を、過度の実験を行わずに、当技術分野ではよく知られている手段により、例えば、不活性の希釈剤とともに、または食用可能な担体とともに作成することができる。組成物を、ゼラチンカプセル中に封入し、または錠剤に圧縮することができる。経口投与治療の目的では、本発明の薬剤組成物を、賦形剤とともに組み入れ、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシール剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー、チューイングガムなどの形態で用いることができる。
錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、また、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、および香味料を含むことができる。結合剤のいくつかの例として、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンが含まれる。賦形剤の例として、デンプンまたはラクトースが含まれる。崩壊剤のいくつかの例として、アルギン酸、コーンスターチなどが含まれる。滑沢剤の例として、ステアリン酸マグネシウム、またはステアリン酸カリウムが含まれる。流動促進剤の例は、コロイド性の二酸化ケイ素である。甘味剤のいくつかの例として、ショ糖、サッカリンなどが含まれる。香味料の例として、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料などが含まれる。これらの様々な組成物を調製するのに用いる材料は、製薬上純粋であり、用いる量において非毒性でなければならない。
本発明の組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、または皮下の注射により、容易に非経口投与することができる。非経口投与は、本発明の抗体組成物を溶液または懸濁液中に組み入れることにより遂行することができる。このような溶液または懸濁液は、また、注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤などの滅菌の希釈液も含むことができる。非経口の製剤は、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート化剤も含むことができる。酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど張性を調節するための物質も、加えることができる。非経口の調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数投与量バイアルに封入することができる。
直腸投与は、薬剤組成物を直腸または大腸内に投与することを含む。これは、座剤または浣腸を用いて遂行することができる。座剤の製剤は、当技術分野では知られている方法により容易に作成することができる。例えば、座剤の製剤は、グリセリンを約１２０Ｃに加熱し、抗体組成物をグリセリンに溶解し、加熱したグリセリンを混合し、その後精製水を加えてもよく、熱い混合物を座剤型中に注ぐことにより調製することができる。
経皮投与には、皮膚を通した組成物の経皮の吸収が含まれる。経皮の製剤には、パッチ剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、膏薬などが含まれる。
本明細書に記載されている抗体組成物には、また、初期敗血症メディエータの拮抗物質が含まれていてもよい。本明細書で用いられる初期敗血症メディエータは、炎症性サイトカインカスケードの誘発（例えば、ＬＰＳへの曝露）後すぐに（即ち、３０〜６０分以内に）細胞から放出される炎症促進性サイトカインである。これらのサイトカインの非限定的な例として、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＡＦ、およびＭＩＦがある。初期敗血症メディエータとして、これらのサイトカインに対する受容体（例えば、腫瘍壊死因子受容体タイプ１）、およびこれらのサイトカインを生成するのに必要とされる酵素、例えばインターロイキン−１β転換酵素も含まれる。現在知られており、または後になって発見された、あらゆる初期敗血症メディエータの拮抗物質は、炎症性サイトカインカスケードをさらに阻害することにより、これらの実施形態に有用であり得る。
初期敗血症メディエータの拮抗物質の非限定的な例として、初期敗血症メディエータのｍＲＮＡに結合しその発現を妨げるアンチセンスの化合物（例えば、Ojwangら、1997年、Biochemistry、36巻、6033〜6045頁；Pampferら、1995年、Biol.Reprod.、52巻、1316〜1326頁；米国特許第6,228,642号；Yahataら、1996年、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、6巻、55〜61頁、ならびにTaylorら、1998年、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、8巻、199〜205頁を参照されたい）、初期敗血症メディエータのｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイム（例えば、Leavittら、2000年、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、10巻、409〜414頁；Kisichら、1999年、およびHendrixら、1996年、Biochem.J.、314巻、655〜661頁を参照されたい）、ならびに初期敗血症メディエータに結合しその活性を阻害する抗体（例えば、KamおよびTargan、2000年、Expert Opin.Pharmacother.、1巻、615〜622頁；Nagahiraら、1999年、J.Immunol.Methods、222巻、83〜92頁；Lavineら、1998年、J.Cereb.Blood Flow Metab.、18巻、52〜58頁、ならびにHolmesら、2000年、Hybridoma、19巻、363〜367頁を参照されたい）がある。現在知られている、または後に発見された、初期敗血症メディエータのあらゆる拮抗物質は、本発明の範囲内であることが想定される。当業者であれば、過度の実験を行わずに日常の用量反応試験であらゆる特定の炎症性サイトカインカスケードを阻害するためのこれらの組成物において使用する初期敗血症メディエータの量を決定することができる。
５．８ 診断および画像化
対象のポリペプチドに特異的に結合する、標識した抗体、ならびにその誘導体および類似体を、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出し、診断し、またはモニターする診断の目的に用いることができる。本発明は、（ａ）対象のポリペプチドに特異的な１つまたは複数の抗体を用いて、個体の細胞または体液における対象のポリペプチドの発現をアッセイすること、および（ｂ）遺伝子発現のレベルを標準の遺伝子発現レベルと比較することを含む、対象のポリペプチドの異常な発現の検出を提供するものであり、それによって標準の発現レベルと比較して、アッセイしたポリペプチドの遺伝子発現レベルの増大または低減は異常な発現を示している。
本発明は、（ａ）対象のポリペプチドに特異的な１つまたは複数の抗体を用いて、個体の細胞または体液における対象のポリペプチドの発現をアッセイすること、および（ｂ）遺伝子発現のレベルを、標準の遺伝子発現レベルと比較することを含む、障害を診断するための診断用のアッセイを提供するものであり、それによって標準の発現レベルと比較して、アッセイしたポリペプチドの遺伝子発現レベルの増大または低減は特定の障害を示している。
当業者には知られている古典的な免疫組織学的方法を用いて、生物学的サンプルにおけるタンパク質のレベルをアッセイするために、本発明の抗体を用いることができる（例えば、Jalkanenら、1985年、J.Cell.Biol.、101巻、976〜985頁；Jalkanenら、1987年、J.Cell.Biol.、105巻、3087〜3096頁を参照されたい）。タンパク質の遺伝子発現を検出するのに有用な、他の抗体ベースの方法には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの免疫アッセイが含まれる。
当技術分野で知られている技術を、本発明の抗体を標識するのに適用することができる。このような技術には、限定するものではないが、２官能性の複合性物質の使用が含まれる（例えば、米国特許第5,756,065号、第5,714,631号、第5,696,239号、第5,652,361号、第5,505,931号、第5,489,425号、第5,435,990号、第5,428,139号、第5,342,604号、第5,274,119号、第4,994,560号、および第5,808,003号を参照されたい）。
本発明の一実施形態は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける対象のポリペプチドの異常な発現に関連する疾患または障害の検出および診断である。一実施形態では、診断は、（ａ）対象のポリペプチドに特異的に結合する有効量の標識した分子を対象に投与（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）すること、（ｂ）ポリペプチドが発現される対象における部位で、標識した分子を優先的に濃縮させるために（かつ、非結合の標識した分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）、投与後ある時間間隔の間待機すること、（ｃ）バックグラウンドレベルを決定すること、および（ｄ）対象において標識した分子を検出することを含み、したがって、バックグラウンドレベルを超えて標識した分子が検出されることは、対象が、対象のポリペプチドの異常な発現に関連する特定の疾患または障害を有することを示している。バックグラウンドレベルは、検出された標識した分子の量を、特定のシステムに対して以前に決定したスタンダード値と比較することを含む、様々な方法により決定することができる。
また、本明細書に記載するように、本発明の抗体は、敗血症、関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再潅流傷害、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素性ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節炎、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再潅流傷害、および同種移植片拒絶反応を有する個体を処置し、診断し、または予知するのに用いることができる。
当技術分野では、対象のサイズ、および用いる画像システムが、診断用の画像を生成するのに必要とされる画像部分の量を決定することが理解されよう。放射性同位元素部分の場合、ヒト対象に対して、注射する放射能の量は、通常、約５から２０ミリキュリーの９９Ｔｃである。次いで、標識した抗体または抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積する。ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍画像については、S.W.Burchielら、「Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments」（第13章、「Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer」、S.W.BurchielおよびB.A.Rhodes編集、Masson Publishing Inc.（1982）に記載されている。
用いられる標識のタイプおよび投与様式を含むいくつかの変数に応じて、標識した分子を対象における部位に優先的に濃縮させ、非結合の標識した分子をバックグラウンドレベルまで除去する、投与後の時間間隔は、６から４８時間、または６から２４時間、または６から１２時間である。別の一実施形態では、投与後の時間間隔は、５から２０日、または５から１０日である。
一実施形態では、疾患または障害のモニターは、疾患または障害を診断するための方法を、例えば、最初の診断の１カ月後に、最初の診断の６ヵ月後に、最初の診断の１年後などに、繰り返すことにより実行される。
標識した分子の存在を、ｉｎ ｖｉｖｏのスキャニングについて当技術分野では周知の方法を用いて、患者において検出することができる。これらの方法は、用いられる標識のタイプに依存する。当業者であれば、特定のレベルを検出するための好適な方法を決定することができる。本発明の診断方法で用いることができる方法および装置には、限定するものではないが、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像法、（ＭＲＩ）、および超音波検査などの身体全体のスキャンが含まれる。
特定の一実施形態では、分子を放射性同位体で標識し、放射線反応性外科用器具を用いて患者において検出する（Thurstonら、米国特許第5,441,050号）。別の一実施形態では、分子を蛍光化合物で標識し、蛍光反応性のスキャン装置を用いて患者において検出する。別の一実施形態では、分子をポジトロン放出性の金属で標識し、ポジトロン放出断層撮影を用いて患者において検出する。さらに別の一実施形態では、分子を常磁性の標識で標識し、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて患者において検出する。
Figure 2008520552
６．実施例
次に、本発明を、以下の実施例を参考にして記載する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供するものであり、本発明は、決してこれらの実施例に制限されるものと解釈してはならないが、むしろ本明細書に提供する教示の結果として明らかになる、あらゆる、かつすべての変形例を包含すると解釈すべきである。
６．１ 実施例１
ヒト抗ＨＭＧ１抗体の開発および物理的特徴付け
大パネルのヒト抗ＨＭＧ１抗体を、ナイーブのヒトＦａｂファージディスプレイライブラリーから、ヒトＨＭＧ１（配列番号１および２、図１も参照されたい）に対して数ラウンドパニングすることにより単離した。次いで、クローンを配列決定して重複のクローンを排除し、全長のＩｇＧを生成するためにＦａｂフラグメントを発現ベクター中にサブクローニングした。いくつかの抗体のクローン（Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１６、Ｇ２０、Ｇ３４、Ｇ３５、Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ１７、およびＥ１１）の軽鎖および重鎖の可変領域のヌクレオチド、および対応するアミノ酸配列を、配列表（特定の配列番号に関して、表３を参照されたい）に提供する。図２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（寄託番号は、それぞれＰＴＡ−６１４２、ＰＴＡ−６１４３、ＰＴＡ−６２５９、およびＰＴＡ−６２５８）に寄託されているいくつかの抗体のクローン（Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１６、およびＧ４）の重鎖および軽鎖の可変領域を表す。また、図２には、抗ＨＭＧ１抗体Ｅ１１の重鎖および軽鎖の可変領域を示す。図２に示した各抗体のＣＤＲに下線をつけ、配列表に提供する（特定の配列番号に関して、表３を参照されたい）。得られた全長の抗体を精製し、それらの物理的特徴を、以下に記載するように決定した。表１にまとめたように、これらの分析により、開発したヒト抗ＨＭＧ１抗体は広範囲の特徴を表すことが示されている。
６．１．１ 材料と方法
ヒト抗ＨＭＧ１抗体の単離
ヒトＦａｂファージディスプレイライブラリー（Ｄｙａｘ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マサチューセッツ州）を、以下のように３ラウンドのパニングによりスクリーニングした：１日目、Ｉ）イムノチューブを全長のＨＭＧＢ−１の０．１Ｍ炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）溶液２０μｇ／ｍｌでコーティングする。それを４℃で一晩放置する。２日目、Ｉ）ライブラリーサイズとして１００倍のファージを用いる。ＰＥＧ６０００の１／５容積を加える（２０％）。氷上に１時間放置する。１４０００ｒｐｍで１０分間回転させる。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁してファージライブラリーを沈殿させる。ＩＩ）抗原でコーティングしたイムノチューブおよびファージの両方を、２％ミルク／ＰＢＳでブロックする。次いでイムノチューブを２×ＰＢＳですすぎ、ファージをイムノチューブへ移し、３０分間回転させることにより混合し、次いでさらなる１．５時間静止してインキュベートする。ＩＩＩ）イムノチューブをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０〜２０回、次いでＰＢＳで１０〜２０回洗浄し、ファージを１００ｍＭトリエチルアミン１ｍｌで溶出させる。溶出したファージを１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．５ｍｌで中和し、溶出した中和したファージの１容積を、５容積の対数期のＴＧ１および４容積の２ＹＴと混合する。３７℃で３０分間インキュベートする（水浴）。感染した細胞を遠心分離により回収し、２ＹＴに再懸濁し、カルベニシリンおよび２％グルコースを含む２ＹＴ寒天培地上に塗抹する。
ヒト抗ＨＭＧ１オリゴクローナル抗体およびモノクローナル抗体の発現
第３ラウンドのパニングの後、いくつかの細菌のプールからプラスミドを抽出した。次いで、Ｆａｂ遺伝子のフラグメントをプラスミドから切り取り、ＣＭＶプロモーターの制御下でＩｇＧ発現ベクター内に挿入した。Ｆａｂフラグメントを有するＩｇＧ発現ベクターのプラスミドを、２９３Ｈ細胞内に一過性にトランスフェクトし、オリゴクローナル抗体を、タンパク質Ａカラムを通過させることにより増殖培地から精製した。オリゴクローナル抗体の各プールを、ＨＭＧ１に対する反応性について試験した。試験陽性のこれらのプールを、さらにスクリーニングして、個々の陽性のクローンを同定した。
等電点ゲル電気泳動
多重温度３冷却水浴再循環ユニットおよびＥＰＳ３５０１ＸＬ電源装置付きＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ２電気泳動システムを用いて、等電点を決定した。成型前のアンフォラインゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＩ範囲２．５〜１０）に、タンパク質５μｇを添加した。広範囲のｐＩマーカースタンダード（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ｐＩ範囲３〜１０、８μＬ）を用いて、Ｍａｂに対する相対的なｐＩを決定した。電気泳動を１５００Ｖ、５０ｍＡで１０５分間行った。精製水で１×に希釈したＳｉｇｍａ固定溶液（５×）を用いて、ゲルを固定した。染色は、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ染色液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて室温で一晩行った。脱染は、２５％エタノール、８％酢酸、および６７％精製水から成る溶液で行った。等電点は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒを用いて、スタンダードの検量線と比べて決定した。
示差走査熱量測定
ＶＰ−ＤＳＣ（ＭｉｃｒｏＣａｌ、ＬＬＣ）で、スキャン速度１．０℃／分、および温度範囲２５〜１２０℃を用いて、熱融解温度（Ｔｍ）を測定した。８秒のフィルターピリオドを、５分のプレスキャンの恒温化とともに使用した。サンプルを、Ｐｉｅｒｃｅ透析カップ（３．５ｋＤ）を用いて、２５ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ６中に透析することにより調製した。Ｍａｂの平均濃度は、Ａ２８０で判定して５０μｇ／ｍＬであった。融解温度を、システムとともに供給されたＯｒｉｇｉｎソフトウェアを用いて、製造元の手順に従って決定した。簡潔に述べると、熱平衡を確立するために、サンプル、および基準の細胞の両方で、バッファーで複数のベースラインを作動させた。サンプルの温度記録からベースラインを差し引いた後、データを濃度規準化し逆重畳積分関数を用いて適合させた。
６．１．２ 結果
単一のファージディスプレイライブラリーから３５個を超える個々のＦａｂクローンを単離し、その１８個を全長のＩｇＧ１に変換し、一過性トランスフェクタントから精製した。これらのクローンを引き続き分析することで、これらが広範囲の特徴を有することを実証した。例えば、これらは、約３３０ｎＭという高さから、まさに２２ｎＭという低さの間の解離定数（Ｋｄ）を表す（表１にまとめてある）。安定性の指標を与え得るＴｍ値は、まさに約７０℃という低さから約９０℃という高さの範囲である（図３Ｂおよび３Ｃ）。抗体の溶解性の指標を与え得るｐＩ値も広い範囲を示し、７．８〜９．０のｐＩ値を有する抗体があった（図３Ａおよび３Ｃ）。様々な特徴を有する抗体を、数々のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの試験（下記を参照されたい）でスクリーニングして、最も望ましい特徴の組合せを決定した。さらに、多数の他のクローンが、さらなるスクリーニングに利用可能である。
６．２ 実施例２
ヒト抗ＨＭＧ１抗体の動態学的分析
様々な技術を用いて、いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体の結合の動態学および特異性を試験した。さらに、エピトープマッピング試験では、いくつかのペプチドを使用した。表１にまとめたように、ヒト抗ＨＭＧ１抗体は様々な結合の動態学および特異性を有することが、これらの分析は示している。さらに、抗ＨＭＧ１抗体はＨＭＧ１Ｂ−ボックスおよびＡ−ボックスを含む様々なエピトープに結合することを、データは指摘している。
６．２．１ 材料と方法
組換えのＨＭＧ１の生成／単離
組換えのＨＭＧ１を、カルモジュリン結合性タンパク質（ＣＢＰ）融合タンパク質（ＣＢＰがＨＭＧＢ１のＮ−末端終末に融合している）として、大腸菌から精製する。ＣＢＰ−ＨＭＧ１を発現する大腸菌を２〜３時間誘発すると、タンパク質は顕微溶液化により２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０に放出される。溶解した細胞を、１２５０００×ｇで１時間遠心分離し、ろ過した上清をＣａＣｌ２の存在下でカルモジュリンカラムに適用する。カラムを２〜２．５カラム容積の溶解バッファーで洗浄し、次いで、リニアグラジエントで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０の５カラム容積にし、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０でタンパク質を溶離する。ＴｒｉｔｏｎＸ１１４抽出を用いて内毒素を除去する。最終濃度２％のＴＸ−１１４を用い、４℃で３０分間インキュベートし、３０分間３７℃に移し、遠心分離して相を分離する。タンパク質を２回抽出する。
３つの形態の天然ＨＭＧ１の調製
核のＨＭＧ１を、ＡＴＣＣからのプロトコールに従って、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した２９３Ｈ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３、ヒト腎臓、上皮）細胞から調製する。ＲＴで１分未満Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを添加することにより、細胞を８０％のコンフルエンスで収集した。穏やかにフラスコを流し、その後１１００ｒｐｍで３分間遠心分離することにより、細胞を直ちにＰＢＳに回収した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中約２から５×１０７／ｍｌの最終濃度で２ｍｌエッペンドルフチューブに移し、次いで液体窒素で２分間凍結させ、その後ＲＴで水浴中５〜１０分解凍した。凍結解凍のプロセスを、さらに２回繰り返した。溶解した細胞を１３０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を新しい滅菌管に移し、−７０から−８０℃で貯蔵した。用いた上清の量は、凍結解凍前の上清の細胞濃度に基づくものである。
放出されたＨＭＧ１を、壊死性の２９３Ｈ細胞の条件培地から調製する。２９３Ｈ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で、培地を交換しないで１０日間増殖させた。培地をフラスコから収集し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次いで上清を０．２ｕｍフィルターを通過させ、透析バッグ中に配置し、濃縮溶液（ＰＩＥＲＣＥ）に対して透析した。培地の体積が約１０倍減少するまで、濃縮溶液を必要に応じ交換した。濃縮した培地を、次いで、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して透析した。濃縮したサンプルに存在するＨＭＧＢ１の濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡ（下記を参照されたい）により、スタンダードとして精製したＨＭＧＢ１を用いて決定した。
活性化したＨＭＧ１を、ＡＴＣＣからのプロトコールに従って、１０％ＦＢＳ、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０（カタログ＃０３−００７８ＤＪ）で増殖させたＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−２０２、ヒト単球）細胞から調製する。細胞が約４×１０５細胞／ｍｌに達したら、最終濃度０．５ｕｇ／ｍｌのＬＰＳで一晩（１４から１６時間）処置した。細胞を１１００ｒｐｍ×３分の遠心分離により採取し、ＰＢＳで３回洗浄してＬＰＳを含む培地を完全に除去し、最終濃度約２から５×１０７／ｍｌのＰＢＳ溶液で２ｍｌエッペンドルフチューブに移し、次いで、液体窒素で２分間凍結し、その後ＲＴで水浴中５〜１０分解凍した。凍結解凍のプロセスを、あと２回繰り返した。溶解した細胞を１３０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を新しい滅菌管に移し、−７０から−８０℃で貯蔵した。用いた上清の量は、凍結解凍前の上清の細胞濃度に基づくものである。
ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるＨＭＧ１結合親和性
実験はすべて、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置上（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）で行った。簡潔に述べると、各ｍＡｂを、標準のアミンカップリング化学を用いて、ＣＭ５センサーチップに固定化した。別々に、基準の（コントロールの）フローセルも調製した。ＨＭＧ１の機器用バッファー中の２倍の段階希釈を、個々のｍＡｂおよび基準のフローセル表面上に、遅い流量で経時的に注射した。ＨＭＧ１の結合および解離の後、ｍＡｂの表面を１Ｍ ＮａＣｌ−５０ｍＭ ＮａＯＨの短時間のパルス投与で再生した。各実験の終わりに、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）が供給するＢＩＡ評価用ソフトウェアにより入手可能な定常状態のモデルを用いて、結合曲線を評価した。これらの試験から決定したＫｄ値を表１に列挙する。
直接ＥＬＩＳＡ（固定化したＨＭＧ１）
９６ウェルのイムノプレート（ＥＩＡ／ＲＩＡプレート、Ｈｉｇｈ ｂｉｎｄｉｎｇ、Ｃｏｓｔａｒ）の個々のウェルを、ＨＭＧＢ−１の５μｇ／ｍｌ ＰＢＳ溶液で、４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを、ＰＢＳに溶解した４％ミルク粉末で３７℃で１時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、様々な濃度のヒト抗ＨＭＧ１抗体で置換した（図４を参照されたい）。次いでプレートを洗浄し（ＥＬＸ−４０５プレートウオッシャー、ＢＩＯ−ＴＥＫ）、最終濃度１：１２５０００の２次抗体（抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ、ＰＩＥＲＣＥ）を３７℃で１時間加えた。ＨＲＰ活性を、ＳｕｒｅｂｌｕｅＨＲＰ基質（ＫＰＬ）で検出した。プレートを、Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍで読んだ。データを表１にまとめ、代表的な結合曲線を図４ＡおよびＤに示す。
サンドイッチＥＬＩＳＡ（可溶性ＨＭＧ１）
イムノプレート（ＥＩＡ／ＲＩＡプレート、Ｈｉｇｈ ｂｉｎｄｉｎｇ、Ｃｏｓｔａｒ）を、抗ヒトＩｇＧＦｃの１０μｇ／ｍｌ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。コーティング試薬を除去し、プレートをＰＢＳで簡単にすすいだ。次いで、プレートを４％ミルクで３７℃で１時間ブロックし、ＰＢＳですすいだ。抗ＨＭＧ１抗体を、４％ミルクで希釈した。段階希釈するために、抗体を出発濃度２０μｇ／ｍｌで用いた。次いで、希釈した抗ＨＭＧ１抗体をプレート中に加え、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％ｔｗｅｅｎ２０）で１０回洗浄し、抗原（ＨＭＧＢ１、２μｇ／ｍｌ、または天然のＨＭＧＢ１では０．７μｇ／ｍｌ）の４％ミルク溶液で３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを１０回洗浄し、マウス抗ＨＭＧＢ１の１μｇ／ｍｌの４％ミルク溶液で、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを１０回洗浄し、１：１０００の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰで、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、展開した。ＳｕｒｅｂｌｕｅＨＲＰ基質（ＫＰＬ）でＨＲＰ活性を検出した。プレートを、Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４５０ｎｍで読んだ。データを表１にまとめ、代表的な結合曲線を図４Ｂ〜Ｄに示す。
ＢＩＡｃｏｒｅ分析による抗体ＨＭＧ１結合の競合
実験はすべて、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）上で行った。ＨＭＧＢ−１タンパク質を、標準のアミンの連結化学プロトコールを用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）に記載されている通りに、ＣＭ５センサー上に固定化した。簡潔に述べると、ＣＭ５表面に、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化を受けさせた。活性化後、ＨＭＧＢ−１を、１００ｎＭまたは２００ｎＭの濃度で（１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４中）、１１００および１２００ＲＵの間の表面密度に表面上に注射した。この後、センサーチップ上の非反応の部位を、１Ｍエタノールアミンの注射で「キャップ」した。参考の目的で、ＨＭＧＢ−１を固定化するのに用いたのと同じ手順を利用したが、いかなるリガンドも用いずにブランクのフローセルも調製した。
１ｕＭおよび２ｕＭのＭａｂ Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｓ６、およびＳｙｎａｇｉｓを調製した。ｍＡｂ溶液はすべて、ＨＢＳ−ＥＰバッファーで（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）調製した。各サイクルは、１μＭで注射した第１のｍＡｂの１００μＬの注射で開始し、その後、混合物における各成分のｍＡｂの最終濃度が第１の注射と等しくなるように、２つの２×濃度のｍＡｂの１：１混合物の、第２の１００μＬの注射を行った。各注射サイクルの後、ＨＭＧＢ−１表面を、１０ｍＭ ＨＣｌの１分のパルス投与で再生した。
全セットを収集した後、注射の各サイクル後の各ｍＡｂに対する最大のＲＵ反応を記録した。次いで、これらを用いて、各ｍＡｂの反応レベルの平均を計算した。次いで、この結合性の反応の平均を用いて、第１のｍＡｂで飽和した後にＨＭＧＢ−１表面に結合している各ｍＡｂのパーセントを計算した。まとめると、これらの結合／阻止のパターンを用いて、ＨＭＧＢ−１上の非関連の、または関連の部位にｍＡｂが結合しているか否かを決定した。これらのデータを表１にまとめてある。
ＨＭＧ１への結合対ＨＭＧ２への結合
超高結合性ＥＬＩＳＡプレート（ＴｈｅｒｍｏＬａｂ ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３８５５）を、１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２で希釈した５ｕｇ／ｍＬ仔ウシ胸腺ＨＭＧＢ１またはＨＭＧＢ２のいずれかでコーティングし、４度で一晩インキュベートした。プレートを、ＣａおよびＭｇを含まないＰＢＳで２回洗浄し、１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．２＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で最終濃度１０ｕｇ／ｍＬに希釈した抗ＨＭＧＢ１抗体１００μｌを各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。ウェルを、１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２で３回洗浄した。ＨＲＰ標識した、ヤギ抗ヒトＩｇＧκ鎖（ＫＰＬ、＃１４−１０−１０）および、ヤギ抗ヒトＩｇＧλ鎖（ＫＰＬ、＃１４−１０−１１）を、１０ｍＭＰＢＳ＋１％ＢＳＡ１：１０００で希釈し、１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳ１００μｌ、ｐＨ７．２で３回洗浄した。ＯＰＤ基質（Ｐｉｅｒｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙ、＃３４００６）を製造元の指示に従って調製し、調製した基質１００μｌを各ウェルに加え、プレートを暗所、室温で２０〜３０分間インキュベートした。２Ｍ Ｈ２ＳＯ４１００μｌを加えて反応を停止させ、プレートリーダーで波長４９０ｎｍでプレートを読んだ。数々の抗体に対するＯＤ値を図４Ｅに示し、表１にまとめてある。
ＨＭＧ１Ｂボックスペプチドのマッピング
９６ウェルイムノプレート（ＥＩＡ／ＲＩＡプレート、高結合性、Ｃｏｓｔａｒ）の個々のウェルを、ＨＭＧ１Ｂボックスペプチドのアミノ酸９１〜１６９（図５Ａ）またはアミノ酸１５０〜１８３（図５Ｂ）の１０μｇ／ｍｌ ＰＢＳ溶液で、４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートをＰＢＳに溶解した４％ミルク粉末で、３７℃で１時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、様々な濃度のヒト抗ＨＭＧ１抗体で置換した（図５Ａ〜Ｂを参照されたい）。次いで、プレートを洗浄し（ＥＬＸ−４０５プレートウオッシャー、ＢＩＯ−ＴＥＫ）、２次抗体（抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ、ＰＩＥＲＣＥ）を最終濃度１：１２５０００で、３７℃で１時間加えた。ＳｕｒｅｂｌｕｅＨＲＰ基質（ＫＰＬ）で、ＨＲＰ活性を検出した。Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４５０ｎｍでプレートを読んだ。
６．２．２ 結果
試験した抗体のほとんどは、固定化したｒＨＭＧ１に結合することを、ＥＬＩＳＡ試験は実証した（図４Ａ）。このアッセイでは、ｒＨＭＧ１、Ｅ１１、Ｇ３４、およびＧ２０の固定化したもの、および可溶性のものの両方に結合したほとんどの抗体は、可溶性のｒＨＭＧ１に対してより良好に結合することが分かり、Ｓ１０、Ｓ１２、Ｓ１６、およびＧ１６は固定化したｒＨＭＧ１にわずかにより良好に結合することが分かった（図４Ｄ、およびデータは示さず）。試験した抗体の多くは、ｒＨＭＧ１、または１つもしくは複数の形態の天然のＨＭＧ１のいずれかに結合する、いくらかの優先性を示す（表１にまとめてあり、また、図４Ｂ〜Ｃを参照されたい）。例えば、Ｓ１６は組換えのＨＭＧ１および天然のＨＭＧ１の両方に結合し、Ｇ４は天然の核のＨＭＧ１により良好に結合し、Ｓ２、Ｓ６、およびＳ１０はすべて、ｒＨＭＧ１により良好な結合性を示す（図４Ｂ）。興味深いことに、Ｓ６はいかなる天然の形態のＨＭＧ１にも良好に結合しないが、その結合は放出されたＨＭＧ１にいくらかの結合性を示す（図４Ｃ、左上）。Ｓ１６およびＧ４は、様々な天然型のＨＭＧ１に対する結合性において相違をほとんど示さない（図４Ｃ、右上および左下）。さらに、抗体を、高度に関連するＨＭＧ２タンパク質に対する交差反応性について試験した。Ｅ１１、Ｓ１２、およびＳ１６はすべて、ＨＭＧ２に対していくらかの結合性を示した。興味深いことに、Ｅ１１は、ここで用いた条件である、抗原を固定化した場合に、ＨＭＧ１に対するよりもＨＭＧ２に対してより良好に結合する様子である。
ほとんどすべての抗体のＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて、組換えのＨＭＧ１（ｒＨＭＧ１、表１を参照されたい）に対する各抗体のＫｄを決定した。ＢＩＡｃｏｒｅ競合アッセイによるいくつかの抗体（Ｇ４、Ｇ９、Ｓ２、およびＳ６）の分析では、これらの抗ＨＭＧＢ１抗体は、同じ部位、またはおそらくは重なりに高度に関連している部位のいずれかに結合する様子であることが示された。
ＨＭＧ１Ｂボックスに対する結合性を試験するために、いくつかの抗ＨＭＧ１抗体（Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｓ１２、およびＳ１６）について、ペプチドマッピング試験を行った。図９Ａ〜Ｂに示すように、Ｇ４、Ｓ１２、およびＳ１６はＨＭＧ１ペプチドの９１〜１６９に結合し（図５Ａ）、Ｓ１２だけはＨＭＧ１ペプチドの１５０〜１８３に結合する（図５Ｂ）。さらに、Ｅ１１はＨＭＧ１Ａボックスを認識することが見出された（データは示さず）。
要約すると、単離されたヒト抗ＨＭＧ１抗体は、広範囲の結合性の特徴を示し、いくつかの結合性の全形態のＨＭＧ１（例えば、Ｓ１６）およびその他は、組換えの形態と、天然の形態（例えば、Ｓ１０とＳ２）の間を識別する。これらは、ＡボックスおよびＢボックスを含む数々の様々なエピトープにも結合する。いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの実験で数々の添加に使用するために選択した（以下を参照されたい）。
６．３ 実施例３
抗ＨＭＧＢ１抗体はヒトＰＢＭＣからのサイトカインの放出を阻害する
ヒト抗ＨＭＧ１抗体のパネルが、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＨＭＧ１誘発性サイトカインの放出を阻害する能力を決定した。以下のサイトカイン、即ち、ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６に対する効果を試験した。数々の抗ＨＭＧ１抗体が、ＨＭＧ１が誘発する１つまたは複数のこれらのサイトカインの放出を阻害することができる。さらに、ＨＭＧ１は、ＮＯの放出を刺激することができ、ＨＭＧ１に対する抗体はこの放出を阻害することができると判定された。いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体が、マウスマクロファージにおいてＨＭＧ１誘発性サイトカイン遺伝子の発現を低減する能力も実証した。
６．３．１ 材料と方法
サイトカインの放出の阻害
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常志願者の末梢血から、密度勾配遠心分離により単離した。採血してすぐの、ヘパリン処置した全血を、２容積のＰＢＳと混合した。希釈した血液を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の表面上に穏やかに層積し、ＲＴで３０分間、４００×ｇで遠心した。血漿と密度勾配溶液の間の界面から、ＰＢＭＣを収集した。３×ＰＢＳで洗浄した後、精製したＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および５０μＭβ−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に再懸濁した。９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、１×１０５個の細胞を加えた。
ＰＢＭＣを３７℃で２時間、５％ＣＯ２とともにインキュベートした。４μｇ／ｍｌの組換えのＨＭＧ１、または２．４×１０５ＬＰＳ刺激したＴＨＰ−１細胞からの天然の活性化したＨＭＧ１、および様々な濃度のヒト抗ＨＭＧＢ−１モノクローナル抗体、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質、またはＨＭＧ１Ａ−ボックス−Ｆｃ融合タンパク質を、各ウェル中に加えた。培地に８Ｕ／ｍｌ（１μｇ／ｍｌ）ポリミキシンＢ硫酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補って、潜在する内毒素を阻害した。ＨＭＧ１で刺激しなかった同じドナーからのＰＢＭＣを、コントロールとして用いた。無細胞の培地を１４時間後に回収し、−２０℃で貯蔵した。
培地を、ＵｐｓｔａｔｅからのＢｅａｄｌｙｔｅヒトマルチサイトカインフレックスキットを用いて、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ）により、炎症性サイトカインについて分析した。炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１２（ｐ４０）を、組換えのＨＭＧ１で刺激した細胞について測定した。さらに、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、およびＩＬ−８を、天然の活性化したＨＭＧ１で刺激した細胞について測定した。
サイトカイン放出データを、３回の平均値±標準偏差として表す。抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体に対するＩＣ５０を、ＨＭＧＢ１が刺激したＰＢＭＣからのサイトカインの放出の最大の阻害の半分を生じるのに必要とされた抗体の濃度と定義する。これは、ＰＲＩＳＭプログラムで計算した。
ＮＯ放出の阻害
ＮＯアッセイに使用したマクロファージには、ＲＡＷ細胞（マウスマクロファージ細胞系）、およびＣ５７ＢＬ／６マウスから得た骨髄由来のマクロファージ（ｍＢＭＭｆ）が含まれていた。ｍＢＭＭｆは、Ｍ−ＣＳＦの存在下で３日間培養下で成熟させた後、使用した（「新鮮ｍＢＭＭｆ」））。細胞を、９６ウェルプレート中に１０５細胞／ウェルで接種し、無血清ａ−培地１００μｌで一晩、ＨＭＧ１で刺激した。ＨＭＧＢ−１（５μｇ／ｍｌ）およびＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を陽性コントロールとして用いて様々な濃度でマクロファージによるＮＯの生成を刺激し、これらの刺激で用量依存性の反応が観察された。抗体を、ＨＭＧ１に対するモル比４：１で試験した。翌日、プレートを１５００ｒｐｍで５分間回転し、上清を回収する。別の９６ウェルプレートに、以下の成分、即ち、刺激した上清およびスタンダード（ａ−培地で希釈したもの）５０μｌ、ＮＡＤＨ２５μｌ、硝酸還元酵素２５μｌ、Ｇｒｉｅｓｓ試薬Ｉ ５０μｌを混合し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、５０μｌのＧｒｉｅｓｓ試薬ＩＩを各ウェルに加え、プレートを室温で１０分間インキュベートする。各ウェルの吸光度を５４０ｎｍで読み、硝酸塩の値を検量線に対して計算する。
ＨＭＧ１で刺激したマウスマクロファージ（ｍＭφ）のＴａｑｍａｎ分析
正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨をすすぐことにより、マウス骨髄を回収した。次いで、単離した骨髄細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦを補ったダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２４時間培養し、非接着性の細胞を採集し、Ｔ−７５フラスコで、１０％ＦＢＳおよび５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦを補った（１×１０７細胞／１５ｍｌ／フラスコ）完全ＤＭＥＭで６日間増殖させた。６日目に接着性の細胞を収集し、９６ウェルプレート中、１０％ＦＢＳを含む５ｎｇ／ｍｌ ＭＣＳＦのα−ＭＥＭ溶液に一晩再接種した（１×１０５細胞／２００μｌ／ウェル）。
培地をα−ＭＥＭで置き換え、２時間インキュベートし、その後飢餓細胞を刺激した。ＨＭＧＢ１（１０μｇ／ｍｌの大腸菌から産生された組換えのＣＢＰ−ＨＭＧＢ１融合タンパク質）、マウス−ＲＡＧＥ−Ｆｃ、またはヒト−ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を、ＲＴで２０分間、様々なブロッキング試薬の１００μｇ／ｍｌ α−ＭＥＭ溶液と予め混合し、次いで細胞に１００μｌの混合物を加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、上清を除去し、ＡｍｂｉｏｎのＭａｇＭＡＸ（商標）−９６Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏ Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出した。回収したＲＮＡすべてを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ、およびｃＤＮＡを合成するためのオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との逆転写酵素（ＲＴ）反応で使用した。得られたｃＤＮＡの１μｌまたは２μｌを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００または７０００を用いてリアルタイム定量ＰＣＲ分析（ＴａｑＭａｎ）をするために用いた。
６．３．２ 結果
いくつかの抗体に対する、代表的なＨＭＧ１誘発性のサイトカイン放出滴定曲線を図６Ａ〜Ｂに示す。試験した各抗体について、ＩＣ５０値を計算した（表１を参照されたい）。少数の抗体を、天然の活性化したＨＭＧ１（ＬＰＳが刺激するＴＨＰ−１細胞由来、上記を参照されたい）を阻止するその能力についても試験した。Ｅ１１、Ｓ１６、およびＳ１７は、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質とともに天然の活性化したＨＭＧ１誘発性ＩＬ−６の放出を阻止することができたが、Ｓ６、Ｓ１３、Ｇ４、およびＧ９はそれほど効果的ではなかった（図６Ｃ）。これらの試験、および多くの他の試験の結果について、データは示していないが、表１にまとめてある。いくつかの抗体は、低い抗体濃度でサイトカインの放出を阻害することができることは明らかである。これまで試験した抗体の中では、Ｓ６が、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＮＯ放出の最良の阻害物質であり、Ｇ４がＩＬ−１２の最良の阻害物質である。すべてのサイトカインの放出を阻害する能力について、抗体すべてを試験したわけではないことに留意されたい。少数の抗体を、また、単離したマウスのマクロファージ（ｍＭφ）で、ｒＨＭＧ１誘発性のサイトカイン遺伝子発現を阻害するその能力について試験した。Ｅ１１、Ｇ２、およびＧ４は、ＨＭＧ１誘発性のＩＬ−１ｂ遺伝子の発現を大幅に低減することができた（図７左、および表１）。Ｇ２も、ＨＭＧ１誘発性のＴＮＦ−α遺伝子の発現を大幅に低減することができた（図７右、および表１）。ＨＭＧ１の細胞表面受容体への結合に及ぼすその効果を決定するためのさらなる分析に、いくつかの抗体を選択した。
６．４ 実施例４
抗ＨＭＧ１抗体は細胞表面受容体へのＨＭＧ１の結合を阻止する
ＲＡＧＥおよびＴＬＲ４の両方が、ＨＭＧ１に対する推定上の受容体として同定されている。ヒト抗ＨＭＧ１抗体が、１つまたは複数のこれらの推定上の受容体とＨＭＧ１の相互作用を阻止することができることを実証するために、いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体を、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合物へのＨＭＧ１の結合を阻止するその能力についてＥＬＩＳＡアッセイでアッセイし（図８）、かつ／または細胞レポーター系でＴＬＲ４のＨＭＧ１誘発性の活性化を阻止するその能力についてアッセイした（図９）。さらに、ヒト抗ＨＭＧ１抗体が、ＴＨＰ−１細胞の細胞表面へのＨＭＧ１の結合を特異的に阻止する能力も実証した（図１０）。
６．４．１ 材料と方法
ＴＨＰ−１細胞に対するＨＭＧ１結合
組換えのラットＨＭＧＢ−１を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからのＥｕ−ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔを用いて標識した。ＨＭＧＢ−１対Ｅｕのモル比は、１：５である。ＴＨＰ−１を、ＡＴＣＣからのプロトコール通りに培養した。細胞を収集し、１×ＤＥＬＦＩＡＬ＊Ｒ結合バッファー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、５０％のＤＥＬＦＩＡ安定化剤（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、および０．０５％のアジ化ナトリウムを含むアッセイバッファーに１×１０６／ｍｌの濃度で懸濁した。９６ウェル細胞培養プレートのウェル中に、細胞１００μｌ（１×１０５個）を加えた。プレートを４℃で１時間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。様々な濃度（３３３、１６６．５、８３．２５、４１．６、２０．８、１０．４、および５．２ｎＭ）のヒト抗ＨＭＧＢ１抗体Ｅ１１もしくはＧ２、または可溶性のヒトＲＡＧＥ−Ｆｃと混合したユーロピウムで標識したＨＭＧＢ−１ ２ｎＭを含むアッセイバッファー１００μｌを、それぞれ、各ウェル中に加えた。４℃で１時間穏やかに振盪しながらインキュベートした後、細胞を１×Ｌ＊Ｒ洗浄バッファー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で４回、１２００ｒｐｍ×５分間遠心分離することにより洗浄した。各ウェル中に増強溶液２００μｌを加えて解離させ、６１５ｎｍでＥｕの蛍光を増強した。蛍光はＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒで測定した。アッセイを３回行い、ヒト抗体Ｒ３−４７を陰性のイソ型コントロールに用いた。
ＥＬＩＳＡによるＨＭＧ１のＲＡＧＥ−Ｉｇへの結合
ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の５μｇ／ｍｌ ＰＢＳ溶液を、５０μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、５％ミルク２００μｌで、３７℃で１時間ブロックし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３×洗浄した。希釈したＨＭＧＢ１溶液５０μｌ／ウェルであった。用量曲線では、ＨＭＧＢ１濃度は、４ｕｇ／ｍｌ ＰＢＳ溶液で開始した。抗体を阻止するために、ＨＭＧＢ１を別のプレートで、ヒト抗ＨＭＧ１抗体またはバッファーとともにプレインキュベートし、次いでＲＡＧＥでコーティングしたプレートに移した。次いで、プレートを室温で２時間インキュベートし、３×洗浄した。固定化したＲＡＧＥ−Ｆｃに結合しているあらゆるＨＭＧ１を検出するために、各１ｕｇ／ｍｌのビオチン化マウス抗ＨＭＧ１ｍＡｂ（１０Ｄ４、４Ｈ１１、３Ｅ１０、および５Ｃ１２）全Ａｂ：４ｕｇ／ｍｌの混合物を各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＰＲを各ウェルに加え、１５分間インキュベートした。次いで、プレートを３×洗浄し、吸収乾燥させた。ＴＭＢ発色剤１００μｌを加え、プレートを６５０ｎｍで読んだ。値を、０％阻害に等しいＨＭＧ１単独での阻害のパーセントとして計算した。図９におけるデータおよび表１にまとめたものは、２つの別々の実験の平均を表している。
ＴＬＲ４活性化アッセイ
ＨｕＴＬＲ４およびＣＤ１４を安定して発現した２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、９６ウェルプレートに、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ１００μｌ中、１ウェルあたり２×１０４個を接種し、一晩置いた。次いで、細胞に、キットが示すように、ＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ルシフェラーゼレポーター構築物をトランスフェクトし、２４時間置いた。ＨＭＧＢ１と抗ＨＭＧＢ１の混合物を１００μｌ／ウェルで、細胞に加え、一晩置いた。次いで、ＴＬＲ４活性化を反映するためにルシフェラーゼ活性を測定した（Ｐｒｏｍｅｇａ）。
６．４．２．結果
試験した抗体のいくつかは、ＨＭＧ１のＲＡＧＥへの結合を少なくとも３５％（例えば、Ｇ２、Ｇ４、Ｓ１０、Ｓ１６、Ｓ２、およびＳ６）阻害し、試験した抗体のうちＧ２およびＧ４の２つは試験した条件下でほぼ７５％結合を阻害したことを、これらの試験は実証している（図８および表２）。いくつかの抗体は、ＲＡＧＥの結合を阻害しなかった（例えば、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１６、Ｓ１４など、表１を参照されたい）。Ｅ１１およびＧ２０は、ＴＬＲ４のＨＭＧ１活性化を阻害することができた（図９および表１）。さらに、Ｅ１１およびＧ２ヒト抗ＨＭＧ１抗体は両方とも、ＨＭＧ１のＴＨＰ−１細胞への結合を阻止する（図１０および表１）。両方のアッセイで今までに試験した抗体のうち、ＲＡＧＥの結合性およびＴＬＲ４活性化の両方を阻止する能力を示したものはなかった。しかし、Ｅ１１は、ＴＬＲ４活性化、およびＨＭＧ１のＴＨＰ−１細胞への結合を阻止することができた。いくつかの抗体を、ｉｎ ｖｉｖｏでの炎症反応に対するその効果を実証するためのさらなる分析に選択した（下記を参照されたい）。
実施例５
抗ＨＭＧ１抗体は、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）モデルで敗血症を阻害する
ヒト抗ＨＭＧ１抗体は、敗血症における死亡率を阻害することができることを実証するために、我々は、マウスに敗血症を確立し、いくつかの抗体処置プロトコールについて生存率をモニターした。マウスを、多微生物性の腹膜炎および敗血症をまねく、外科的に作られた盲腸の憩室症を穿孔することにより引き起こされた敗血症の特徴がはっきりしたモデルである、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）を受けさせた（FinkおよびHeard、上述；Wichmannら、上述；ならびにRemickら、上述）。いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体で処置したマウスに対する生存率を、イソ型のコントロール抗体で処置したマウスと比べた。Ｇ４、Ｓ６、およびＳ１６を含む、いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体は、ＣＬＰモデルで著しい保護を実証した（図１１Ａ〜Ｄ、および表１）。
６．４．３ 材料と方法
敗血症における抗ＨＭＧＢ１
生の腹腔内感染および敗血症を確立するために、以前に記載されているように、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１群あたり９〜１１匹）にＣＬＰ手順を受けさせた（FinkおよびHeard、1990年、J Surg Res、49巻、186〜196頁；Wichmannら、1996年、J Surg Res、65巻、109〜114頁）。ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ、アイオワ州）およびキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）の筋肉内注射で麻酔後、１５ｍｍの正中線切開術を行って盲腸を露出した。先端部から５．０ｍｍ結紮した後、盲腸基部を２２ゲージの針で１回穿刺し、少量の糞便（長さ１ｍｍ）を押し出した。盲腸を、その正常の腹腔内位置内にもどし、２層の連続縫合で傷を閉じた。手術３０分後に、すべての動物に、食塩水（０．９％ｓ．ｃ．、２０ｍｌ／ｋｇ体重）の蘇生、および単回投与量の抗生物質を（マウス１匹あたりイミペネム０．５ｍｇの２００μｌ滅菌食塩水溶液をｓ．ｃ．注射）（Ｐｒｉｍａｘｉｎ、Ｍｅｒｃｋ）与えた。
抗ＨＭＧ１抗体、またはイソ型のコントロール抗体（５０μｇ／マウスを２００μｌの体積で）を、手術２４および４８時間後に腹腔内投与した。ある追跡実験では、抗ＨＭＧ１抗体またはイソ型のコントロール抗体（８ｍｇ／ｋｇ）を、手術２４時間後に腹腔内投与した（図１１Ｃ〜Ｄ）。これらの実験は盲検法であり、医師はケージを無作為化し、他の研究者がコード化した抗体を投与した。マウスの生存を、全１４日間、１日２回モニターした。２４および４８時間にマウス１匹あたり５０μｇの抗体を送達したいくつかの代表的な実験に対する生存曲線を、図１１Ａおよび１１Ｂに示す。手術２４時間後８ｍｇ／ｋｇの抗体を送達したいくつかの代表的な実験を組み合わせることにより生成した生存曲線を、図１１Ｃに示す。いくつかのさらなる抗体、およびオリゴクローナル抗体のプールを８ｍｇ／ｋｇで、手術２４時間後に投与して試験した（図１１Ｄ）。
６．４．４ 結果
これらの試験は、重篤な敗血症マウスをヒト抗ＨＭＧ１抗体で受動免疫すると保護的であったことを実証している。特に、ヒト抗ＨＭＧ１抗体Ｓ６、Ｓ１６、Ｅ１１、およびＧ４は、ＣＬＰモデルで保護的であった（図１１Ａ〜Ｄを参照されたい）。いくつかの試験では、９日目の生存率は、１４日目における生存率よりも良好であった（図１１Ｂ）。長期の生存率におけるこの違いは、マウスのシステムにおいてヒト抗体の半減期が低減することによるものと思われる。しかし、ヒト抗ＨＭＧ１抗体で処置した動物の大多数は、単に死亡が遅れただけではなく、むしろ致死的である敗血症に対し完全な保護が付与されていた。抗ＨＭＧ１抗体Ｓ６は、このモデルで最も広範に研究されており、多くの実験で少なくとも３０％の保護が再現性よくもたらされていた（代表的な累積のデータを図１１Ｃに示す）。
６．５ 実施例６
ＨＭＧ１はいくつかの炎症性状態の動物モデルで上方制御される
血清ＨＭＧ１レベルは、ヒトでは、敗血症／敗血症ショックの間に上昇することが示されている。我々は、炎症性疾患の、いくつかの関節炎モデル、急性肺傷害、および腹膜炎を含む、数々の異なる炎症性疾患の動物モデルにおけるＨＭＧ１タンパク質および／または遺伝子発現のレベルを試験した。今までに試験したすべてモデルで、疾患の進行とともにＨＭＧ１レベルが上昇することを我々は見出した。さらに、いくつかのサイトカインレベルおよび／または推定上のＨＭＧ１受容体分子も上昇することを見出した。
６．５．１ 材料と方法
炎症性疾患の誘発
各疾患モデルを誘発するために用いた方法について、以下の詳しい記載を参照されたい。ＨＭＧ１および様々なサイトカインのレベルを、疾患を誘発した非処置の動物で試験し、正常動物と比較した。
受動的ＣＩＡマウスにおけるＨＭＧ１レベル
正常、または受動的ＣＩＡマウスの前足を１０日目に採取し、液体窒素で瞬間凍結し、アッセイするまで−８０℃で貯蔵した。関節のサンプルおよび溶解バッファーを、特定化した溶解マトリックスＡ粒子（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を予め満たした耐衝撃性の２ｍｌチューブに加えた。関節をＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）ホモジナイザーでホモジナイズし、次いで遠心分離した。上清を採取し、ＨＭＧ１レベルをＥＬＩＳＡにより、メソスケール（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ）技術（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて判定した。図１２Ａに示したデータは、各群における５本の足の平均である。
能動的ＣＩＡマウスのＴａｑｍａｎ分析
正常および能動的ＣＩＡマウスの前足および後ろ足を３５日目に採取し、液体窒素で瞬間凍結し、アッセイするまで−８０℃で貯蔵した。関節のサンプルおよび溶解バッファーを、特定化した溶解マトリックスＡ粒子（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を予め満たした耐衝撃性の２ｍｌチューブに加えた。関節をＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）ホモジナイザーでホモジナイズし、ＲＮＡを、製造元の指示に従ってＱｉａｇｅｎのＲＮＡｓｅミニキットまたはＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０を用いてホモジネートから調製した。ｃＤＮＡを合成するために、回収したＲＮＡすべてをＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩおよびオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での逆酵素反応で使用した。ｃＤＮＡ１μｌまたは２μｌを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００または７０００を用いたリアルタイム定量ＰＣＲ分析（ＴａｑＭａｎ）に用いた。ＨＭＧＢ１、およびいくつかの推定上の受容体分子であるＲＡＧＥ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ９の相対的な遺伝子の発現を、後ろ足および前足の両方で別々に試験した（図１２Ｂ）。ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−ａの、いくつかのサイトカインの相対的な遺伝子の発現も、後ろ足および前足の両方で別々に試験した（図１２Ｃ）。正常なマウスにおける各分子の遺伝子の発現を１に設定し、各分子の相対的な遺伝子の発現をプロットしてある。各分子の下の番号が値を示している。
ＡＩＡラットにおけるＨＭＧ１レベル
ＡＩＡラットの後ろ足を、０、５、１０、１５、および２０日目に収集し、液体窒素で瞬間凍結し、アッセイするまで−８０℃で貯蔵した。ＡＩＡの関節を処理加工し、上記の受動的ＣＩＡマウスに用いたのと同じプロトコールを用いてアッセイした。関節ホモジネートに存在するＨＭＧ１のレベルを、図１２Ｄで、経時的にプロットしてある（右上のグラフ）。疾患の進行の２つの主要な指標である、関節の炎症および体重の減少も、プロットしてある（それぞれ、上左および下左のグラフ）。
黄色ブドウ球菌曝露後のマウス血清におけるＨＭＧ１およびサイトカインのレベル
黄色ブドウ球菌に曝露したマウスからの血清を、曝露２、８、および１２時間後に採取した。ＨＭＧ１、ＩＬ−１ｂ、およびＴＮＦ−ａのレベルを、ＥＬＩＳＡにより、メソスケール技術（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて判定した。ＨＭＧ１、ＩＬ−１ｂ、およびＴＮＦ−ａのレベルを、経時的にプロットする（図１２Ｅ）。ＨＭＧ１およびサイトカインに対して（それぞれ右および左の軸）、それぞれ異なるスケールを用いていることに留意されたい。ガラクトサミン単独に曝露したマウス、または曝露を受けないマウスは、ＨＭＧ１またはサイトカインにおけるのと類似の上昇を示さなかった（データは示さず）。
ＡＬＩマウスのＢＡＬ液におけるＨＭＧ１レベル
ＰＢＳ（コントロール）またはＬＰＳ（肺傷害）のどちらかに曝露したマウスからのＢＡＬ液を、曝露後の示された時間に収集し、ＨＭＧ１のレベルをメソスケールＥＬＩＳＡにより決定した。ＨＭＧ１のレベルを、経時的にプロットしてある（図１２Ｆ、左のプロット）。存在する全細胞の計数は、疾患の進行の指標であり、やはり経時的にプロットしてある（図１２Ｆ、右のプロット）。
処置後のＡＩＡラットにおけるＨＭＧ１レベル
ＡＩＡラットの後ろ足を、処置後（下記、実施例９を参照されたい）、上記のように処理加工し、ＨＭＧ１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−ａのレベルを、メソスケールＥＬＩＳＡにより判定した。
ＭｅｓｏＳｃａｌｅＥＬＩＳＡ
簡潔に述べると、プレートをＨＭＧＢ１またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−６など）に対するキャプチャー抗体で予めコーティングし、ＭＳＤブロッカーバッファー（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ９３ＡＡ−１）で１時間ブロックした。スタンダード（好適なサンプルバッファーに希釈した、例えば、正常マウスＢＡＬ液、血清、または関節ホモジネート）、およびサンプルを、２０ｕｌの体積でプレートに加えた。１次抗体および検出抗体の混合物２０ｕｌを各ウェルに加え、４時間振盪しながら室温でインキュベートした。次いでプレートを洗浄し、リードバッファー（ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ）（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ９２ＴＤ−２）を加え、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ６０００上で読んだ。ＨＭＧ１を検出するために、１次抗体はＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｒａｂｂｉｔ抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５６５２８）であり、検出抗体はヤギ抗ウサギＭＳＤ検出抗体（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ３２ＡＢ−１）であった。
６．５．２ 結果
３つの関節炎モデルを試験した。各モデルで、関節におけるＨＭＧ１レベルは、疾患の進行と同時に上昇することが分かった。受動的ＣＩＡマウスでは、広範囲の関節の炎症が見られた場合（下記および図１３Ａを参照されたい）、ＨＭＧ１のレベルは１０日目までに約１０倍上昇した（図１２Ａ）。能動的ＣＩＡマウスでは、炎症性疾患に関与することが知られているＨＭＧ１、いくつかのサイトカイン、およびいくつかの受容体のレベルは、やはり、疾患の進行と同時に上昇が見られた（図１２Ｂ〜Ｃ、および１５Ａ）。ＲＡＧＥ受容体は、前足および後ろ足の両方で約２倍の上昇を示し、ＴＬＲ２受容体およびＴＬＲ４受容体は、前足では中程度の、それぞれ２倍および３倍の上昇を、後ろ足では、それぞれ１９倍および１７倍の劇的な上昇を示した。ＴＬＲ９のレベルは、後ろ足で上昇したにすぎなかった（７倍）。サイトカインＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−ａの発現レベルは、前足では、それぞれ３９倍、１４５倍、および７倍の、後ろ足では、それぞれより劇的な２４７倍、３６１倍、および７６倍の同じ傾向の上昇を示した。ＡＩＡラットモデルでは、関節ホモジネートにおけるＨＭＧ１レベルは、関節の炎症が最も重症であった場合に、１５日目までに検出不可能なレベルから２００ｎｇ／ｍｌを超えるレベルに上昇した（図１２Ｄ、左と右のグラフを比較されたい）。約２０日目に炎症が低減したとき、ＨＭＧ１レベルにおける対応する低減も見られた。
２つの他の疾患モデルも試験した。図１２Ｅは、黄色ブドウ球菌の腹膜炎モデルにおいて曝露約２時間後に始まった、経時のＨＭＧ１レベルにおける一貫した上昇を示している。ＴＮＦ−ａおよびＩＬ−６のレベルは曝露後直ちに鋭く上昇し、ＴＮＦ−ａのレベルは２時間でピークに達し、低下し、次いで曝露約９時間後に再び上昇した。ＩＬ−６レベルは、約２時間でピークに達し、次いで一般に安定を保ち、その後わずかに上昇するにすぎない。急性肺傷害のマウスモデルでは、ＢＡＬ液におけるＨＭＧ１レベルは、ＬＰＳ曝露４８時間後までに、検出不能のレベルから１５００ｎｇ／ｍｌを超えるレベルにその後上昇した（図１２Ｆ、左のグラフ）。ＨＭＧ１レベルにおけるこの上昇は、ＬＰＳ曝露したマウスからのＢＡＬ液に存在する細胞浸潤物（全細胞数）における上昇と相関している（図１２Ｆの左と右のグラフを比較されたい）。ＨＭＧレベルは、ＰＢＳバッファーに曝露したマウスからのＢＡＬ液では検出不可能であった（図１２Ｆ、左のグラフ）。これらの試験は、ＨＭＧ１のレベルは、３つの関節炎モデル、急性肺傷害モデル、および腹膜炎モデルを含む数々の炎症性疾患モデルにおける疾患の進行とともに上昇することを指摘している。抗ＨＭＧ１抗体はＨＭＧ１レベルの上昇と関連する他の炎症性疾患に有用であることを実証するためのこれらのモデルにおけるさらなる試験に、いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体を選択した。
我々は、ＰＢＳ、ヒトイソ型コントロール（ＨｕＩｇＧ）、Ｇ４、Ａ−ボックス−Ｆｃ融合物、およびメトトレキセート（ＭＴＸ）を、ＨｕＩｇＧまたはＲｅｎｂｒｅｌまたはＧ４のいずれかと組み合わせて処置した後の、ＡＩＡラットの関節におけるＨＭＧ１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−ａレベルも試験した。図１２Ｇは、各処置後のＨＭＧ１（左上）、およびＩＬ−６（左下）のレベルを示している。ＨｕＩｇＧまたはＡ−ボックス−Ｆｃでの処置は、ＨＭＧ１またはＩＬ−６のレベルは大幅に低下させなかった。しかし、Ｇ４単独、およびＭＴＸをＨｕＩｇＧまたはＲｅｎｂｒｅｌのいずれかと組み合わせたものは、ＨＭＧ１およびＩＬ−６のレベルにおいて同様の低下を示し、ＭＴＸとＧ４の組合せはレベルを正常まで低下させた。Ｇ４は、やはりＴＮＦ−ａのレベルを大幅に低下させたが、ＭＴＸ＋ＨｕＩｇＧは、このサイトカインに対してむしろ低下を示した（図１２Ｇ、右上）。
６．６ 実施例７
抗ＨＭＧ１抗体は、受動的コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルにおける疾患の進行の重症度を阻害する
ＨＭＧ１に対するヒト抗体は治療に有用であることを実証するために、我々はヒト抗ＨＭＧ１抗体のパネルを試験して、受動的マウスモデルにおけるコラーゲン誘発性関節炎を処置した。この一連の実験では、我々は、臨床上の関節炎が発症する前に処置を始める、予防モデルを利用した。この試験では、我々は、抗ＨＭＧ１抗体の有効性を、既知の処置プロトコールであるＲｅｎｂｒｅｌ（齧歯動物モデル系で使用するための、認可されているＥｎｂｒｅｌ（商標）の代用分子）単独、またはＲｅｎｂｒｅｌ（商標）とメチルトレキセート（ｍｅｔｈｙｌｔｒｅｘａｔｅ）（ＭＴＸ）の組合せのいずれかの有効性と直接比較した。
我々はここで初めて、ＨＭＧ１に対する抗体が受動的ＣＩＡマウスＲＡモデルにおける予防に有効性を示したことを実証している。実際、足の炎症を低減する上で、ならびに骨の損失および軟骨の損傷を低減する上で、抗ＨＭＧ１抗体Ｇ４はＲｅｎｂｒｅｌ単独よりも有効であることが示され、抗ＨＭＧ１抗体Ｓ６はＭＴＸ／Ｒｅｎｂｒｅｌ治療よりも有効であった。
６．６．１ 材料と方法
受動的コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）の誘発
関節炎モデルを確立するために、６〜８週齢のオスＤＢＡ／１Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、メイン州）を用いた。一般に、１群あたり５〜８匹のマウスを用いる。０日目、マウスを、１匹あたり２ｍｇの抗コラーゲンｍＡｂカクテル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ＃ＥＣＭ１１００、１０ｍｇ／ｍｌ）で尾部静脈内ｉ．ｖ．で免疫化した。３日目に、引き続き、１匹あたり５０μｇのＬＰＳをマウスにｉ．ｐ．注射した。各実験には、以下のようないくつかの動物群があった：実験１では群Ａ〜Ｅ、実験２では群Ｇ〜Ｊ、および群Ｌ〜Ｎ。さらなる群のマウス（群Ｆ、Ｋ、およびＯ）は正常コントロールとして非処置であった。表４に示すように、下記の処置を投与した。
Figure 2008520552
疾患のモニタリング
０日目に始めて、すべての動物を毎日観察して、動物の足における疾患の状態を評価し、これはそれぞれの足の定性的な臨床スコアを評価することにより行った。毎日、各動物は、その臨床上の疾患の状態に従って４本の足にスコア付けをされる。スコア付けは、２人の観察者が行い、その少なくとも１人はブラインドである。さらに、各々のマウスの体重を測って体重の変化を追跡し、同時に足にスコア付けをする（図６Ａおよび６Ｄを参照されたい）。
足首／手首／中足部／前足部に対する等級付けスケールは以下の通りである。
０＝正常 ２＝重症の腫脹
１＝明確な腫脹 ３＝最大限に重症の腫脹および体重増加なし
各々の足の４本の外側の指に対する等級付けスケールは、関与するか、または関与しないか、即ち、１または０で等級付ける。例えば、最大限に関与する左後ろ足は、足首＝３、中足部＝３、指＝４（臨床スコア＝１０単位）とスコア付けられる。我々は、これをそれぞれの足に対して繰り返し、スコアを加算する。１４日目、または総計の臨床スコアが４０に達し関節の組織学的評価を行った場合にはそれより早く、マウスを安楽死させる。
組織学
各動物からの後肢の脛距関節を評価し、Badgerら、2001年、Arthritis & Rheumatism、44巻、128〜37頁に記載されているように組織学的変化について評価し、スコア付けをした。簡潔に述べると、３２日目に動物を屠殺し、後ろ足をホルマリンで固定しＣａｌ−Ｒｉｔｅ（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ミシガン州）で脱灰した。次いで、足を、遠位の脛骨の骨幹で脚から取り除いた。ルーチンの処理加工後、サンプルを包埋し、冠状切片を平面の中ほどで脛距関節および距骨関節を介して切断した。切片をサフラニンＯで染色し、ファーストグリーン（ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎ）で対比染色した（データは示さず）。
骨、および関節の軟骨／関節周囲の軟部組織の組織学的特徴を、ブラインドの観察者が別々にスコア付けした（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。骨を以下のように等級付けた：０＝正常、１＝骨膜の繊維性骨の形成を伴う骨膜下の線維症、２＝髄の炎症、骨内膜の、および骨梁骨の再吸収、３＝広範囲の炎症、４＝肉芽組織による髄の置換、小さな骨梁骨の残存、皮質の輪郭の広範囲の閉塞。軟骨／滑膜を以下のように等級付けた：０＝正常、１＝滑膜および周囲の組織に軽症のリンパ球性の炎症、２＝滑膜の線維化および浮腫、関節隙に部分的なリンパ球の浸潤、軽度の軟骨のパンヌスの侵食、３＝関節隙の広範囲の浸潤、周辺性のおよび肋軟骨下の軟骨の侵食、局所的な壊死性の液化を伴う軟部組織の広範囲の線維化。
６．６．２ 結果
ＨＭＧ１抗体での処置が、受動的ＣＩＡマウスモデルにおいて疾患の重症度を予防し、または低減することができることを実証するためにいくつかの実験を行った。実験１では、マウスにＬＰＳを注射した３日後に開始して、抗ＨＭＧ１抗体Ｓ６またはＧ１６（０．２ｍｇ／マウス）でマウスを処置した。１３日間にわたって、マウスに全６投与量を与えた。同時にコントロールのマウスに、ヒトｍＡｂ（０．２ｍｇ／マウス）を与えた。最後の群には、ＭＴＸ（０．２ｍｇ／マウス、１２日間にわたって４投与量）およびＲｅｎｂｒｅｌ（０．２ｍｇ／マウス、１０日間にわたって２投与量）の組合せ治療を与えた。関節炎の進行を、最初の処置後、毎日評価した。図１３Ａのグラフは、試験の経過にわたる、各処置群に対する足の炎症スコアを示している。図１３Ｂは、ＣＩＡの予防モデルに対する、骨、軟骨、および炎症に対する全体の組織学的スコアを示している。このモデルでは、後ろ足は一定しないで冒されている可能性があるので、前足が疾患状態のより予測可能な指標であることに留意することが重要である。図１３Ｃは、前足単独に対する、骨、軟骨、および炎症の組織学的スコアである。ヒトＩｇＧを投与しても、関節炎の発症には効果を及ぼさなかった。しかし、抗ＨＭＧ１ Ｓ６抗体処置した動物は、コントロールの動物に比べて、骨、軟骨、および全体の炎症スコアが大幅に低下していた。著しいことは、抗ＨＭＧ１ Ｓ６抗体で処置した動物は、ＭＴＸ／Ｒｅｎｂｒｅｌ組合せ治療で処置したものよりも、著しく良好であった（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。
疾患の進行の別の臨床上の特徴は体重の減少である。コントロールの動物に対する相対的な体重スコアは、試験の経過の間、正味の低下を示している。抗ＨＭＧ１ Ｓ６抗体で処置したマウスに対する臨床スコアは著しい保護を示していたが、この群の動物は体重において正味の減少も示していた。しかし、抗ＨＭＧ１ Ｓ６抗体処置した動物は、コントロール群ほど大きく減少しなかった。ＭＴＸ／Ｒｅｎｂｒｅｌ処置動物も、試験の初期には体重の正味の減少を示したが、最後には非処置の動物に追いついた（図１３Ｄ）。これらの結果は、抗ＨＭＧ１抗体は、疾患の発症前に投与した場合、関節の損傷および他の症状に対して効果的に保護することができることを実証している。特に、これらの結果は、抗ＨＭＧ１ Ｓ６抗体処置はＣＩＡマウスにおける疾患の重症度を低減するのに著明な効果があることを示している。この実験は、関節炎モデルにおけるＳ６の保護的効果を代表しないことがあることに留意すべきである。抗ＨＭＧ１ Ｓ６抗体処置は、マウスＣＬＰ敗血症モデルにおいて優れた保護を繰り返し示していたが（上記実施例５を参照されたい）、関節炎モデルでは結果はより変動的であった。この変動は、抗体調製物、動物モデル、抗体の薬物動態学、および他の類似のパラメータにおける相違を反映している可能性がある。
実験２および３では、マウスにＬＰＳを注射して３日後に開始して、マウスを抗ＨＭＧ１抗体Ｇ４（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。実験２では、マウスに１３日間にわたり全６投与量を与え、実験３では同期間にわたり全４投与量を与えた。同時に、コントロールのマウスに、ヒトｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳのいずれかを与えた。実験２では、最後の群にＲｅｎｂｒｅｌ（投与量はＧ４と同じ）を与えた。関節炎の発症を、最初の処置後毎日評価した。図１４Ａ〜Ｂにおけるグラフは、試験の経過にわたる足の炎症スコアを示している。実験２より（図１４Ａ）、抗ＨＭＢ１抗体Ｇ４はＲｅｎｂｒｅｌ単独よりも、足の炎症を低減する上で有効であることが明らかである（パネル右）。実験３からのデータは（図１４Ｂ）、抗ＨＭＢ１抗体Ｇ４は、足の炎症よりなお少ない頻度で投与することができることを示している。Ｇ４抗体は、これ、および他のいくつかの関節炎モデルで、著しい保護を繰り返しもたらした（下記、実施例８および９を参照されたい）。
６．７ 実施例８
抗ＨＭＧ１抗体は、能動的コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルにおいて疾患の進行の重症度を阻害する
ＨＭＧ１に対するヒト抗体は有用な治療であることを実証するために、我々は、マウスモデルにおける能動的コラーゲン誘発性関節炎を処置するための抗ＨＭＧ１抗体のパネルを試験した。この一連の実験では、我々は、臨床上の関節炎が発症する前に処置を開始する予防モデルを利用した。この試験では、我々は、抗ＨＭＧ１抗体の有効性をＲｅｎｂｒｅｌの有効性と比較した。
我々はここで初めて、ＨＭＧ１に対する抗体が能動的ＣＩＡマウスＲＡモデルにおいて足の炎症および体重の減少を低減する上で有効性を示したことを実証している。実際、足の炎症を低減する上で、抗ＨＭＧ１抗体Ｇ４はＲｅｎｂｒｅｌ単独よりも有効であることが示された。
６．７．１ 材料と方法
能動的コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）の導入
６〜８週齢のオスＤＢＡ／１Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、メイン州）を用いた。０日目に、イソフルランで麻酔した動物の尾部の基部に、０．１Ｎ酢酸５０μｌに溶解し、等容量の完全フロイントアジュバント（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ワシントン州）で乳化したウシＴｙｐｅＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）２００μｇを皮内注射した。３週間後、２１日目に、０．１Ｎ酢酸２５μｌに溶解し等容量の不完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ミシガン州）で乳化したＣＩＩ １００μｇの第２の類似の皮内注射を与えた。
疾患のモニタリング
１４日目に開始して、すべての動物を毎日観察して、その足における疾患の状態を評価したが、これはそれぞれの足の定性的な臨床スコアを評価することにより行った。毎日、各動物は、その臨床上の疾患の状態に従って、４本の足にスコア付けをされる。スコア付けは、２人の観察者が行い、その少なくとも１人はブラインドである。さらに、各々のマウスの体重を測って体重の変化を追跡し、同時に足にスコア付けをする。
足首／手首／中足部／前足部に対する等級付けスケールは以下の通りである。
０＝正常 ２＝重症の腫脹
１＝明確な腫脹 ３＝最大限に重症の腫脹および体重増加なし
各々の足の４本の外側の指に対する等級付けスケールは、関与するか、または関与しないか、即ち、１または０で等級付ける。例えば、最大限に関与する左後ろ足は、足首＝３、中足部＝３、指＝４（臨床スコア＝１０単位）とスコア付けられる。我々は、これをそれぞれの足に対して繰り返し、スコアを加算する。３６日目、または総計の臨床スコアが４０に達し関節の組織学的評価を行った場合にはそれより早く、マウスを安楽死させる。
６．７．２ 結果
我々は、ヒト抗ＨＭＧ１抗体での処置が、能動的ＣＩＡモデルにおいてＣＩＡの疾患重症度を予防し、または低減することができるか否かを試験した。マウスを、抗ＨＭＧ１抗体Ｇ４、イソ型のコントロール抗体、または１０ｍｇ／ｋｇのＲｅｎｂｒｅｌのいずれかで、２１日目に開始して３日毎に処置した。関節炎の発症を毎日評価した。図１５Ａのグラフは、試験の経過にわたる、各処置群の足の炎症スコアを示している。ヒトＩｇＧを投与しても関節炎の発症には効果がなかった。しかし、抗ＨＭＧ１ Ｇ４抗体で処置した動物は、コントロールの動物に比べて炎症スコアが大きく低下している。顕著なことに、抗ＨＭＧ１Ｇ４抗体で処置した動物は、Ｒｅｎｂｒｅｌ治療で処置したものよりも、著しく良好であった（図１５、左および右のパネルを比較されたい）。
このモデルにおける疾患の進行の臨床上の別の特徴は体重の減少である。コントロールの動物に対する相対的な体重スコアは、試験の経過の間、正味の減少を示している。抗ＨＭＧ１ Ｇ４抗体処置したマウスに対する臨床スコアは著しい保護を示したが、この群の動物は体重において正味の減少も示していた。しかし、抗ＨＭＧ１ Ｇ４抗体処置した動物は、コントロール群ほど大きく減少しなかった。これらの結果は、抗ＨＭＧ１抗体は、疾患の発症前に投与した場合、関節の損傷および他の症状に対して効果的に保護することができることを実証している。特に、これらの結果は、抗ＨＭＧ１ Ｇ４抗体処置は、ＣＩＡマウスモデルにおける疾患の重症度を低減するのに、著明な効果があったことを示している。
６．８ 実施例９
抗ＨＭＧ１抗体は、アジュバント誘発性関節炎（ＡＩＡ）ラットモデルにおける疾患の進行の重症度を阻害する
我々は、アジュバント誘発性関節炎（ＡＩＡ）ラットモデルで、ヒト抗ＨＭＧ１抗体Ｇ４をさらに試験した。この一連の実験では、我々は、臨床上の関節炎が発症する前に処置を開始する予防モデルを利用した。この試験では、我々は、抗ＨＭＧ１抗体の有効性を、Ｒｅｎｂｒｅｌの有効性と比較した。
我々はここで初めて、ＨＭＧ１に対する抗体（Ｇ４）が、ＡＩＡラットＲＡモデルにおける足の炎症を低減するのに有効性を示したことを実証している。実際、足の炎症を低減する上で、抗ＨＭＧ１抗体Ｇ４はＲｅｎｂｒｅｌ単独よりも有効であることが示された。抗ＨＭＧ１ Ｇ４動物では、臨床スコアに約３４％の低下が見られたが、Ｒｅｎｂｒｅｌ処置動物では約１１％の低下しか見られなかった。さらに、我々は、メトトレキセートとＧ４の組合せが、メトトレキセートとＲｅｎｂｒｅｌの組合せよりも足の炎症スコアを低下させるのにより効果的であったことを実証している。
６．８．１ 材料と方法
アジュバント誘発性関節炎（ＡＩＡ）の誘発
６〜８週齢のメスＤＡラット（Ｈａｒｌｅｎ）を使用した。０日目に、イソフルランで麻酔した動物の尾部の基部に、不完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ミシガン州）１００μｌと混合したミコバクテリウムブチリカム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（Ｄｉｆｃｏ＃０６４０−３３−７）０．７５ｍｇを皮内注射した。表５に示すように、以下の処置を投与した。
Figure 2008520552
ヒト抗ＨＭＧ１抗体Ｇ４、Ａ−ボックス−Ｆｃ融合物、およびｈｕＩｇＧイソ型コントロールを１０ｍｇ／ｋｇで、０〜１５日に３日毎に投与した。メトトレキセート０．８ｍｇ／ｋｇを０〜１５日に６日毎に投与し、Ｒｅｎｂｒｅｌを、処置群５では２．５ｍｇ／ｋｇを０〜１５日に２日毎に、処置群６では４ｍｇ／ｋｇを０〜１５日に３日毎に投与した。
疾患のモニタリング
６日目に開始して、すべての動物を毎日観察して、その足における疾患の状態を評価したが、これはそれぞれの足の定性的な臨床スコアを評価することにより行った。毎日、各動物は、その臨床上の疾患の状態に従って４本の足にスコア付けをされる。スコア付けは、２人の観察者が行い、その少なくとも１人はブラインドである。さらに、各々のマウスの体重を測って体重の変化を追跡し、同時に足のスコア付けをする。
足首／手首／中足部／前足部に対する等級付けスケールは以下の通りである。
０＝正常 １＝かろうじて認められる腫脹
２＝明確な腫脹であるが重症ではない ３＝重症の腫脹
４＝最大限に重症の腫脹および体重増加なし
各々の足の４本の外側の指の関節は、関与するか、または関与しないか、即ち、１または０で等級付ける。例えば、最大限に関与する左後ろ足は、足首＝４、中足部＝４、ＭＴＰ＝４、ＰＩＰ＝４、ＤＩＰ＝４（２０単位）とスコア付けられる。我々は、これをそれぞれの足に対して繰り返し、スコアを加算する。２１日目、または総計の臨床スコアが８０に達し関節の組織学的評価を行った場合にはそれより早く、ラットを安楽死させる。
６．８．２ 結果
我々は、ヒト抗ＨＭＧ１抗体Ｇ４が、ラットにおけるＡＩＡの重症度を予防し、または低減することができると判定した。ＡＩＡラットを、２１日目に開始して、３日毎の、ＰＢＳ、抗ＨＭＧ１抗体Ｇ４、イソ型のコントロール抗体（ＨｕＩｇＧ）１０ｍｇ／ｋｇで、または２日毎の２．５ｍｇ／ｋｇのＲｅｎｂｒｅｌのいずれかで処置した。さらに、ＡＩＡラットを、Ｒｅｎｂｒｅｌ、Ｇ４、またはＨｕＩｇＧを含むいくつかの他の治療と組み合わせたメトトレキセートで処置した。ＡＩＡラットは、また、ＨＭＧ１Ａ−ボックス−Ｆｃ融合タンパク質でも処置した。関節炎の発症を毎日評価した。図１６Ａにおけるグラフは、試験の経過にわたる、抗体またはＲｅｎｂｒｅｌ単独の処置群、ならびにＰＢＳおよび通常のコントロール群の各々に対する足の炎症スコアを示す。ヒトＩｇＧを投与しても関節炎の発症には効果はなかった。しかし、抗ＨＭＧ１ Ｇ４抗体で処置した動物は、コントロールの動物に比べて炎症スコアが大きく低下していた。顕著なことに、抗ＨＭＧ１Ｇ４抗体で処置した動物は、Ｒｅｎｂｒｅｌ治療単独で処置したものよりも、著しく良好であった（図１６Ａ、左および右のパネルを比較されたい）。抗ＨＭＧ１ Ｇ４動物では臨床スコアに約３０％の低下が見られ、Ｒｅｎｂｒｅｌ処置動物では約２５％の低下しか見られなかった。
図１６Ｂにおけるグラフは、抗体単独と比べた、組合せ療法処置群に対する経時の足の炎症スコアを示しており、ＨＭＧ１Ａ−ボックス−Ｆｃ融合タンパク質処置群も含まれている。ＨＭＧ１Ａ−ボックス−Ｆｃ融合タンパク質単独で炎症スコアを低下させるが、Ｇ４単独ほど効果的ではない。Ｒｅｎｂｒｅｌと組み合わせると、Ｇ４単独に比べて炎症スコアを低下させた。ＭＴＸは、ＭＴＸの組合せとして抗体の低下に最も貢献している様子であり、ＨｕＩｇＧコントロール抗体は、ＭＴＸ／Ｒｅｎｂｒｅｌの組合せと類似した炎症の低減を示した。しかし、ＭＴＸとＧ４の組合せは、ＭＴＸ／Ｒｅｎｂｒｅｌの組合せよりも効果的であり、炎症スコアをほぼ正常に低下させた。様々な処置群に対して見られた足の炎症スコアの低下は、ＡＩＡラットの関節に見られたＨＭＧ１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−ａのレベルの低下と相関していた（図１２Ｇを参照されたい）。
６．９ 実施例１０
抗ＨＭＧ１抗体は、腹膜炎の黄色ブドウ球菌マウスモデルにおける生存を改善する
我々は、血清ＨＭＧ１レベルの上昇が見られる重症マウス腹膜炎モデルで、いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体も試験した（上記を参照されたい）。ここでは、我々は、ヒト抗ＨＭＧ１抗体での処置がコントロールよりもほぼ３０％生存を向上させることを実証している。
６．９．１ 材料と方法
腹膜炎の導入
４〜６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。熱不活性化した黄色ブドウ球菌をガラクトサミンと予め混合したものをｉ．ｐ．で曝露したマウスで行った最初の試験では、ＬＤ１００は１×１０７細胞と１×１０９細胞の間であったことが実証された（データは示さず）。ＨＭＧ１のレベルを決定するために、０日目に、約１０９個の熱不活性化した黄色ブドウ球菌（８３２５−４系統）細胞をガラクトサミン２０ｍｇと予め混合したもの、またはガラクトサミン単独の、体積２００μｌのＰＢＳ溶液をｉ．ｐ．投与した。第３群の動物は曝露しなかった。動物を曝露２、８、および１２時間後に、ＣＯ２吸入により安楽死させ、心臓穿刺により血液を採取した。抗体処置試験では、０日目に、ガラクトサミン２０ｍｇと予め混合した約１０９個の熱不活性化した黄色ブドウ球菌（８３２５−４系統）細胞を体積２００μｌでｉ．ｐ．投与し、表６に示すように、曝露３０分前に以下の処置を体積１００μｌでｉ．ｐ．投与した。
Figure 2008520552
疾患のモニタリング
１日目に開始して、１４日間を通して継続して、毎日、病的状態の徴候（移動性の著しい低下、毛の逆立て、および／または最高体重の＞２０％の減少）、ならびに死亡率について動物を観察した。また、動物を週毎に２×体重測定した。著しい病的状態の徴候を示した動物は安楽死させた。１５日目、生存している動物すべてを安楽死させた（著しい病的状態が観察された場合は、それより早く安楽死させた）。
６．９．２ 結果
マウスを致死量の熱不活性化した黄色ブドウ球菌に曝した、グラム陽性細菌誘発性の重篤な敗血症モデルにおいて、ヒト抗ＨＭＧ１抗体も試験した。このモデルでは、ＰＢＳまたは抗体のイソ型コントロール（Ｒ３４７）のいずれかで処置したマウスは、どれも生存しなかった。それとは対照的に、ＨＭＧ１ Ｇ４に対するヒト抗体で処置したマウスの２７％が生存し（図１７）、Ｅ１１で処置したマウスの８％が生存した（データは示さず）。致死率における相違は、処置２４時間後という早さで見られ、試験の経過にわたって継続した。これらのデータはＣＬＰ試験（上記を参照されたい）を支持するものであり、ヒト抗ＨＭＧ１抗体は、広範囲の病原性生物が誘発する敗血症の処置に有用であることを示している。
６．１０ 実施例１１
抗ＨＭＧ１抗体は、急性肺傷害に関連する細胞の浸潤を低減する
２つのヒト抗ＨＭＧ１抗体を、リポ多糖（ＬＰＳ）誘発性急性肺傷害（ＡＬＩ）マウスモデルで試験した。ここでは、我々は初めて、ヒト抗ＨＭＧ１抗体での処置が、コントロールに比べて約４０％、全細胞の浸潤を低減することを実証している（図１８）。
６．１０．１ 材料と方法
ＬＰＳ誘発性ＡＬＩの誘発
１日目に、ＬＰＳ（大腸菌０１１１：Ｂ４系統、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を、イソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、イリノイ州）で麻酔した成年ＢＡＬＢ／ｃマウスに、マウス１匹あたり５〜１０ｕｇの投与量の５０〜１００μｌ溶液を鼻腔内投与した。ＨＭＧ１のレベルを決定するために、ＬＰＳ投与４、８、２４、３２、および４８時間後、ＣＯ２の窒息により動物を安楽死させ、タンパク質分析および組織病理学検査用に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）のサンプルおよび他のサンプルを採取した。処置プロトコールでは、ＬＰＳ投与２４時間後、抗ＨＭＧＢ１抗体、ＨＭＧ１Ａ−ボックス−Ｆｃ融合物、またはコントロールを、１０ｍｇ／ｋｇの投与量を１００ｕｌ体積で腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。３日目（ＬＰＳ投与４８時間後）、ＣＯ２窒息により動物を安楽死させ、サンプル（ＢＡＬ、血液、および肺）を分析用に採取した。
ＢＡＬサンプル採取
肺を、カテーテル管付きシリンジを用いて、〜０．８ｍｌリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、ＧＩＢＣＯ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州）で３回洗い流した。採取したＢＡＬサンプルを、４℃、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取し、タンパク質（例えば、ＨＭＧＢ１）定量用に−８０℃で貯蔵し、ペレット状の細胞を再懸濁しサイトスライド（ｃｙｔｏｓｌｉｄｅ）に移し、固定し、ギムザ染色し、顕微鏡の助けでＢＡＬの細胞性を肉眼的に判定した。
６．１０．２ 結果
ヒト抗ＨＭＧ１抗体を、ＬＰＳの鼻腔内投与が誘発する急性肺傷害モデルで試験した。このモデルでは、ＨＭＧの炎症促進性作用の既知の競合的阻害物質であるＨＭＧ１Ａ−ボックスは、コントロールに比べて約２３％浸潤を低減したにすぎなかった。それとは対照的に、Ｇ４およびＥ１１は、ＢＡＬ液に存在する全細胞浸潤物をコントロールに比べて３７％〜４０％低減したことが分かり、抗ＨＭＧ１抗体は、急性肺傷害の処置に有用であることが実証された。
６．１１ 実施例１２
多発性硬化症（ＭＳ）プラークにおけるＨＭＧＢ１染色パターン
ＨＭＧＢ染色パターンを、ヒト脳組織からのＭＳプラークで、Ｇ１６ヒト抗ＨＭＧＢ抗体を用いて試験した。脱髄し多くの活性化したミクログリアを有するプラーク、および優勢に脱髄し、活性化したミクログリアはほとんどなく、リンパ球が多いプラークを試験した。図１９Ａは、イソ型のコントロール抗体を用いた、脱髄し多くの活性化したミクログリアを有するプラークにおける低レベルのバックグラウンド染色を示している。ＨＭＧＢ１は、ＭＳ患者からのヒト脳組織において、ヒトｍＡｂＧ１６によるミクログリアの細胞質で検出された。脱髄し多くの活性化したミクログリアを有するプラークは、ミクログリアの細胞質、および脱髄の間隙における広範囲の染色を示す（図１９Ｂ）。それとは対照的に、優勢に脱髄しているプラークでは、活性化したミクログリアはほとんどなく、多くのリンパ球があることから、ヒトｍＡｂＧ１６で調査した場合、ほとんど、またはまったく染色されないことが示される（図１９Ｃ）。これらの結果は、炎症の細胞外モジュレーターとしてのＨＭＧＢ１の重要な役割を強調し、ＨＭＧＢ１はＭＳの炎症過程に関与している様子であることを指摘するものである。
前述の発明を明確さおよび理解を目的としていくらか詳しく記載してきたが、この開示を読めば、本発明の真の範囲から逸脱することなしに、形態および詳細における様々な変更を行うことができることは、当業者であれば明らかである。例えば、上記に記載した技術および装置はすべて、様々な組合せで用いることができる。この出願に引用した出版物、特許、特許出願、または他の文書はすべて、それぞれの個々の出版物、特許、特許出願、または他の文書がすべての目的のために参照として組み入れられることが個々に示されるように、同程度にすべての目的に対して、その全文が参照として組み入れられる。さらに、２００４年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第60/620,726号、２００５年２月１０日に出願された第60/651,512号、２００５年３月７日に出願された第60/658,572号、２００５年３月１８日に出願された第60/662,944号、および２００５年９月６日に出願された第60/713,712号は、すべての目的でその全文が参照として組み入れられる。
ヒトＨＭＧ１およびＨＭＧ２のアラインメントを示す図である。Ａボックスを実線の下線で、Ｂボックスを破線の下線で示す。 本発明のヒト抗ＨＭＧ１抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の、ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸の配列を示す図である。下線を引いたもの：ＣＤＲ（Ｋａｂａｔの定義）。Ａ）Ｓ２ＶＬ（配列番号５〜６）。配列番号は、アミノ酸およびヌクレオチドの配列を意味する。より詳細については表３を参照されたい。 Ｂ）Ｓ２ＶＨ（配列番号７〜８） Ｃ）Ｓ６ＶＬ（配列番号９〜１０） Ｄ）Ｓ６ＶＨ（配列番号１１〜１２） Ｅ）Ｓ１６ＶＬ（配列番号１３〜１４） Ｆ）Ｓ１６ＶＨ（配列番号１５〜１６） Ｇ）Ｇ４ＶＬ（配列番号１７〜１８） Ｈ）Ｇ４ＶＨ（配列番号１９〜２０） Ｉ）Ｅ１１ＶＬ（配列番号２４〜２５） Ｊ）Ｅ１１ＶＨ（配列番号２６〜２７） ヒト抗ＨＭＢ１抗体の物理的特徴を示す図である。Ａ）ヒト抗ＨＭＢ１抗体のパネルの等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析により、様々なヒト抗ＨＭＧ１抗体に対して、広範囲のｐＩ値（例えば、〜７．７７から〜９．２４）が存在することが示される。 Ｂ）ヒト抗ＨＭＧ１抗体のパネルの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析により、様々なヒト抗ＨＭＧ１抗体に対して、広範囲のＴｍ値（例えば、〜６６℃から〜９０℃）が存在することが示される。 Ｃ）ＩＥＦおよびＤＳＣ分析のグラフ表示により、ｐＩ値とＴｍ値の間には直接の相関が存在しないことが示される。 ヒト抗ＨＭＧ１抗体の結合の動態学および特異性を示す図である。パネルＡ）いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体に対するＨＭＧ１捕獲ＥＬＩＳＡからの結合曲線は、大腸菌が生成する組換えのＨＭＧ１に対する抗体の親和性は様々であることを実証している。 パネルＢ）組換えのＨＭＧ１（左）および天然の核のＨＭＧ１（右）の捕獲を比較する、いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体に対するＨＭＧ１捕獲ＥＬＩＳＡからの結合曲線は、Ｓ１６およびＧ４はＨＭＧ１の両方の形態に結合し、Ｓ２、Ｓ６、およびＳ１０は天然の核のＨＭＧ１よりも組換えのＨＭＧ１に良好に結合することを示している。 パネルＣ）天然の核のＨＭＧ１、壊死性のＨＭＧ１、および活性化したＨＭＧ１の捕獲を比較する、いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体に対するＨＭＧ１捕獲ＥＬＩＳＡからの結合曲線は、Ｓ６、およびより低い程度でＧ４は様々な形態に様々な親和性で結合するが、Ｓ１６はそうでないことを示している。 パネルＤ）２つの異なる捕獲の様式、固定化した抗体（四角）、および固定化したＨＭＧ１（三角）を比較する、いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体について行った捕獲ＥＬＩＳＡアッセイからの結合曲線は、Ｅ１１、およびより低い程度でＳ１７は可溶性のＨＭＧ１に対してより高い親和性を有し、Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、およびＧ１２は、固定化したＨＭＧ１、または可溶性のＨＭＧ１に結合するのにほとんど違いを示さなかったことを示している。 パネルＥ）ＨＭＧ１およびＨＭＧ２に対するいくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体の相対的な結合親和性を示すＥＬＩＳＡのデータは、試験したほとんどの抗体（Ｇ２、Ｇ４、Ｇ９、Ｇ１２、Ｓ３、Ｇ２０、Ｇ３４、Ｇ３５、Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｓ１４、およびＳ１７）はＨＭＧ１に特異的であり、Ｓ１２およびＳ１６はＨＭＧ１およびＨＭＧ２の両方にいくらかの結合性を示し、Ｅ１１はこのアッセイではＨＭＧ２に対して結合親和性がより高かった様子であることを示している。これらのアッセイ、および示していないその他からのデータを、表１にまとめてある。 ＨＭＧ１Ｂボックスエピトープマッピング試験を示す図である。いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体に対する、ＨＭＧ１ＢボックスペプチドＥＬＩＳＡからの結合曲線を示す。曲線は、Ｓ１２、Ｓ１６、およびＧ４はＨＭＧ１ペプチド９１〜１６９に結合することを示している（パネルＡ）。 Ｓ１２は、ＨＭＧ１ペプチド１５０〜１８３に結合する（パネルＢ）。試験した残りの抗体（Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１０、Ｇ２、およびＧ９）は、このアッセイで試験したＨＭＧ１Ｂボックスのいずれのペプチドにも結合しない。 多くのヒト抗ＨＭＧ１抗体は、ＨＭＧ１が刺激するヒトＰＢＭＣからのサイトカインの放出を阻害することを示す図である。いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体（Ｇ９、Ｓ１４、Ｇ２０、Ｓ２、Ｓ６、およびＳ１７）に対して、組換えのＨＭＧ１が刺激するＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−ａの放出阻害活性の代表的な用量反応曲線をパネルＡに示す。結果は、放出されたサイトカインのｐｇ／ｍｌ（上のグラフ）として、および阻害パーセント（下のグラフ）としての両方でプロットした。 いくつかのさらなるヒト抗ＨＭＧ１抗体（Ｇ４、Ｓ６、Ｓ１６、およびＳ６＋Ｓ１６）に対して、ならびにＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質に対して、組換えのＨＭＧ１が刺激するＩＬ−６放出の阻害の用量反応曲線をパネルＢに示す。 Ｅ１１、Ｓ１３、Ｓ１６、Ｓ１７、Ｇ４、Ｇ９、Ｓ６、ＲＡＧＥ−Ｆｃ、およびＡボックス融合タンパク質ついて、天然の活性化したＨＭＧ１が刺激する、ＩＬ−６サイトカインの放出阻害の用量反応曲線をパネルＣに示す。これらのデータ、および示していない他のデータから計算したＩＣ５０値を、表１にまとめてある。 いくつかのヒト抗ＨＭＧ１抗体は、ＨＭＧ１が刺激するマウスのマクロファージ（ｍＭφ）におけるサイトカイン遺伝子の発現を阻害することを示す図である。ＩＬ−１β（左）またはＴＮＦ−α（右）の相対的な遺伝子の発現を、バッファー、組換えのＨＭＧ１（Ｅ−ＨＭＧＢ１）単独、およびＥ−ＨＭＧＢ１プラスヒトイソ型コントロール（ＨｕＩｇＧ）の組合せ、ヒト抗ＨＭＧ１抗体（Ｅ１１、Ｇ２、Ｇ４、Ｓ６、およびオリゴクローナル）、ならびにマウスおよびヒトのＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質で処置したマウスマクロファージについて示してある。Ｅ１１、Ｇ２、Ｇ４、およびオリゴクローナル、ならびに両方のＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ−１β発現を強力に阻害した。Ｇ２およびマウスＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＮＦ−ａの発現を強力に阻害した。これらのデータ、および示していない他のデータを、表１にまとめてある。 ヒト抗ＨＭＧ１抗体のサブセットは、組換えのＨＭＧ１のＲＡＧＥへの結合を阻止することを示す図である。ＥＬＩＳＡベースの結合アッセイを用いて、ＨＭＧ１のＲＡＧＥ−Ｉｇ融合物への結合を測定した。数々のヒト抗ＨＭＧ１抗体の阻害パーセントを示す。Ｇ２、Ｇ４、Ｓ１０、Ｓ１６、Ｓ２、およびＳ６は、ＨＭＧ１のＲＡＧＥへの結合を阻害する顕著な能力を示し、Ｅ１１、Ｇ１２、Ｇ１６、Ｇ２０、Ｇ３４、Ｇ９、オリゴクローナル、Ｓ１２、Ｓ１４、およびＳ１７は示さない。これらのデータ、および示していない他のデータを、表１にまとめてある。 ＴＬＲ４の活性化はＥ１１により部分的に阻止されることを示す図である。ＨＭＧ１誘発性ＴＬＲ４の活性化を、細胞ベースのルシフェラーゼレポーター系を用いて測定した。培地単独、組換えのＨＭＧ１（ｒＨＭＧＢ）単独、およびｒＨＭＧＢプラスＳ２、Ｅ１１、Ｓ６、Ｇ４、Ｓ１４、またはポリクローナル抗体の組合せで処置した細胞に対する全ルシフェラーゼ活性を示す。Ｅ１１は、ＨＭＧ１誘発性ＴＬＲ４の活性化を阻止する顕著な能力を示した。これらのデータ、および示していない他のデータを、表１にまとめてある。 組換えのＨＭＧ１のＴｈｐ−１細胞に対する阻害を示す図である。Ｅ１１、Ｇ２、およびＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質による、組換えのＨＭＧ１の、Ｔｈｐ−１細胞への結合の阻害を示す代表的な用量反応曲線を示す。これらのデータ、および示していない他のデータから計算したＩＣ５０値を、表１にまとめてある。 ヒト抗ＨＭＧ１抗体は、マウスＣＬＰ敗血症モデルにおいて保護的であることを示す図である。ヒト抗ＨＭＧ１抗体またはヒトイソ型コントロール抗体（Ｒ３〜４７）のいずれかとの処置を比較した、マウスＣＬＰ敗血症モデルからの代表的な生存曲線を示す。Ｇ４（パネルＡおよびＢ）、Ｓ１６（パネルＡおよびＤ）、Ｓ６（パネルＣ）、Ｅ１１、およびオリゴクローナル（両方ともパネルＤ）抗ＨＭＧ１抗体は、６０％まで生存を向上することができる。 パネルＢ パネルＣ パネルＤ ＨＭＧ１レベルは、炎症性疾患のいくつかのモデルにおいて上方制御されることを示す図である。非処置の受動的ＣＩＡマウスから１０日目に収集した前足に存在するＨＭＧ１のレベルは、通常のマウスに存在する少なくとも１０倍を超えた上昇が見られた（パネルＡ）。ＨＭＧＢ１、ＲＡＧＥ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ９の相対的な遺伝子発現レベルは、後ろ足で上昇が見られ（右）、非処置の能動的ＣＩＡマウスからの前足の関節ではＨＭＧＢ１、ＲＡＧＥ、およびＴＬＲ２だけに上昇が見られた（左）（両方ともパネルＢ）。ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−ａの相対的な遺伝子発現のレベルは、非処置の能動的ＣＩＡマウスからの後ろ足（プロット）および前足（プロット）の関節の両方で上昇が見られた（両方ともパネルＣ）。ＡＩＡラットの足首関節におけるＨＭＧＢ１レベルの上昇は（右上）、足の炎症スコア（左上）の上昇、および相対的な体重の減少（左下）に相関している（すべてパネルＤ）。黄色ブドウ球菌に曝露した動物の血清に存在するＨＭＢＧ１、ＩＬ−１Ｂ、およびＴＮＦ−ａのレベルは、曝露２時間後からＨＭＧＢ１レベルが一定して上昇するのとともに上昇するのが見られ（パネルＥ）、ＴＮＦ−ａは２時間で早期のピークを示し、これは約７時間までにベースライン付近に低下し、第２のピークは約１２時間であるが、ＩＬ−６は約２時間でピークに達し、その後徐々に上昇する。ＡＬＩマウスからのＢＡＬ液におけるＨＭＧＢ１レベルは、ＬＰＳ投与後５０時間以内に１６ｎｇ／ｍｌを超えて上昇し、約２６時間後に最も劇的な上昇が始まり（左）、ＢＡＬ液に見られる全細胞数の最大の上昇と相関する（右）（両方ともパネルＦ）。ＰＢＳ、ヒトイソ型コントロール（ＨｕＩｇＧ）、抗ＨＭＧ１抗体Ｇ４、ＨＭＧ１Ａボックス−Ｆｃ融合タンパク質、メチルトレキセート（Ｍｅｔｈｙｌｔｒｅｘａｔｅ）（ＭＴＸ）、ＭＴＸ＋ＨｕＩｇＧ、ＭＴＸ＋Ｒｅｎｂｒｅｌ、およびＭＴＸ＋Ｇ４での処置後にＡＩＡラットの足首の関節に存在するＨＭＢＧ１（左上）およびＩＬ−６（左下）のレベル。ＨｕＩｇＧ、Ｇ４、またはＭＴＸ＋ＨｕＩｇＧで処置後のＡＩＡラットの足首関節に存在するＴＮＦ−ａのレベル（右上）も示す。Ｇ４単独、およびＭＴＸ＋ＨｕＩｇＧ、またはＭＴＸ＋Ｒｅｎｂｒｅｌ両方は、ＨＭＧ１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−ａのレベルにおける低下を示すが、ＭＴＸ＋Ｇ４の組合せが最も著しい低下を示している。これらのデータは、様々な処置に対する足の炎症スコアに見られる低下と相関している（図１６Ｂを参照されたい）。 パネルＢ パネルＣ パネルＤ パネルＥ パネルＦ パネルＧ ヒト抗ＨＭＧ１抗体は受動的ＣＩＡマウス関節炎モデルにおいて保護的であることを示す図である。パネルＡは、ＭＴＸおよびＲｅｎｂｒｅｌ（左上）、ヒト抗ＨＭＧ１抗体Ｓ６（右上）、およびＧ１６（左下、およびＨＭＧ１ＡボックスＦｃ−融合タンパク質（右下）で処置した受動的ＣＩＡマウスに対する経時の足の炎症スコアを示す。 ＭＴＸ／Ｒｅｎｂｒｅｌの組合せ、およびＳ６抗体の両方ともＳ６の臨床スコアを低下させ、このモデルでより劇的な効果があった。前足および後ろ足の両方に対する組織学的試験により得られた（パネルＢ）。 前足単独に対して得られた（パネルＣ）骨（左上）、軟骨（右上）および炎症（左下）のスコアのプロットを示す。 パネルＤは、ＭＴＸおよびＲｅｎｂｒｅｌ（左上）、ヒト抗ＨＭＧ１抗体Ｓ６（右上）、およびＧ１６（左下）、およびＨＭＧ１Ａボックス−Ｆｃ融合タンパク質（右下）で処置したマウスに対する経時の体重の指標を示す。臨床スコアで見られたように、ＭＴＸ／Ｒｅｎｂｒｅｌの組合せおよびＳ６の両方とも保護を示し、Ｓ６はより良好な有効性を示した。 ヒト抗ＨＭＧ１抗体は、受動的ＣＩＡマウス関節炎モデルにおいて保護的であることを示す図である。実験２（パネルＡ）、ＰＢＳ、ＲｅｎｂｒｅｌまたはＧ４で処置した受動的ＣＩＡマウスに対する（右）、およびＰＢＳ、Ｇ４、またはイソ型のコントロール抗体での処置に対する（左）経時の足の炎症スコア。 実験３（パネルＢ）、ＰＢＳ、Ｇ４、またはイソ型のコントロール抗体で処置した受動的ＣＩＡマウスに対する経時の足の炎症スコア。通常のマウスに対する臨床スコアも、両試験に対して追跡し、プロットした。両方の実験とも、Ｇ４ヒト抗ＨＭＧ１抗体は、このモデルにおいて炎症に対して保護することができることを実証している。実験２では、Ｇ４はＲｅｎｂｒｅｌよりも有効性が良好であることが実証された。 ヒト抗ＨＭＧ１抗体は能動的ＣＩＡマウス関節炎モデルにおいて保護的であることを示す図である。ＰＢＳ、イソ型のコントロール抗体、またはＧ４で処置した能動的ＣＩＡマウスに対する経時の足の炎症スコア（左のグラフ）、およびＰＢＳまたはＲｅｎｂｒｅｌで処置した能動的ＣＩＡマウスに対する経時の足の炎症スコア（右のグラフ）をパネルＡに示す。 イソ型コントロールおよびＧ４抗体処置群に対し、経時的にプロットした相対的な体重を、パネルＢに示す。すべてのパネル上に、ＰＢＳ処置および正常マウスに対するスコアもプロットした。Ｇ４ヒト抗ＨＭＧ１抗体は、このモデルにおいて、炎症および体重減少の両方に対して、Ｒｅｎｂｒｅｌよりも良好な保護を示した。 ヒト抗ＨＭＧ１抗体は、ＡＩＡラット関節炎モデルにおいて保護的であることを示す図である。ＰＢＳ、イソ型のコントロール抗体、またはＧ４で処置したＡＩＡラットに対する（左）、およびＰＢＳまたはＲｅｎｂｒｅｌで処置したＣＩＡマウスに対する（右）経時の足の炎症スコアをプロットし（パネルＡの両方、パネルＢも参照されたい）、このモデルでは、Ｇ４抗ＨＭＧ１抗体は、ＰＢＳコントロールよりも約３５％足の炎症スコアを低下させ、Ｒｅｎｂｒｅｌ単独だけがＰＢＳコントロールよりも２５％足の炎症スコアを低下させた（パネルＡ）ことが実証された。 足の炎症スコアを、メトトレキセートおよび第２の試薬（イソ型のコントロール、Ｇ４、またはＲｅｎｂｒｅｌ）の組合せで処置したＡＩＡラットに対する経時の足の炎症スコアをプロットし（パネル１６Ｂ）、ＭＴＸとＧ４の組合せは、Ｇ４単独、およびＭＴＸ／Ｒｅｎｂｒｅｌの組合せの両方よりも効果的であることが実証された。ＭＴＸおよびＧ４での処置により、足の炎症スコアは正常付近まで低下した（パネルＢ）。ＨＭＧ１Ａ−ボックス−Ｆｃ融合タンパク質での処置に対する足の炎症スコアも示してあるが、これはＧ４単独よりも効果的ではなかった。 ヒト抗ＨＭＧ１抗体は、マウス腹膜炎モデルにおいて保護的であることを示す図である。腹膜炎を誘発するために熱不活性化した黄色ブドウ球菌に曝露したマウスにおける、９６時間経過にわたる生存パーセントは、Ｇ４は、ＰＢＳまたはイソ型のコントロール（Ｒ３４７）のいずれかで処置したマウスよりもほぼ３０％生存を向上することを示していた（パネルＡ）。時間０分（三角）に黄色ブドウ球菌曝露を投与した−３０分（星印）に、抗体を投与した。 ヒト抗ＨＭＧ１抗体は、マウス急性肺傷害（ＡＬＩ）モデルにおいて保護的であることを示す図である。Ｇ４またはＥ１１のいずれかで処置したＡＬＩマウスからのＢＡＬ液において回収した全細胞は、イソ型のコントロール抗体（Ｒ３４７）のいずれかで処置したマウスに比べてほぼ４０％減少していた。ＨＭＧ１Ａ−ボックス−Ｆｃ融合タンパク質の処置は、回収した全細胞を２３％低下させたにすぎなかった。 多発性硬化症（ＭＳ）のヒト脳組織検体におけるＨＭＧ１染色パターンを示す図であり、Ａ）１μｇ／ｍｌのイソ型のコントロールを用いた、活性化したミクログリアを有するＭＳプラークのバックグラウンド染色、 Ｂ）１μｇ／ｍｌのＧ１６を用いた、活性化したミクログリアを有する、ミクログリアの細胞質、およびＭＳプラークの間質の、特異的なＨＭＧＢ１染色 Ｃ）１μｇ／ｍｌのＧ１６を用いて、脱髄したＭＳプラーク、少数の活性化されたミクログリアおよび多数のリンパ球における染色の低減が見られる。

Claims (23)

  1. 抗体がヒトＨＭＧＢ１ポリペプチドまたはその抗原性フラグメントに３９ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）で結合する、ヒトＨＭＧＢ１ポリペプチドまたはその抗原性フラグメントに特異的に結合する単離された抗体。
  2. 前記抗体が、前記ヒトＨＭＧＢ１ポリペプチドまたはその抗原性フラグメントに２２ｎＭ〜３９ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で結合する、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体が、ヒトＨＭＧＢ１ Ｂボックスを含むポリペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
  4. 前記抗体が、ヒトＨＭＧＢ１ Ｂボックスから成るポリペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
  5. 前記ヒトＨＭＧＢ１ Ｂボックスが、配列番号３、配列番号２８、および配列番号２９から成る群から選択される、請求項３に記載の抗体。
  6. 前記抗体が、配列番号４のヒトＨＭＧＢ１ Ａボックスから本質的に成るポリペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
  7. 前記抗体が、配列番号４のヒトＨＭＧＢ１ Ａボックスから成るポリペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
  8. 前記抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、細胞内抗体、および合成抗体から成る群から選択される、請求項１に記載の抗体。
  9. 前記抗体が、ヒト抗体、またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１、２、３、４、５、６、７、または８に記載の抗体。
  10. 前記抗体のｐＩが６．５〜９．５である、請求項１に記載の抗体。
  11. 前記抗体のＴｍが６５℃〜９５℃である、請求項１に記載の抗体。
  12. 前記抗体が、高移動度（ＨＭＧ）タンパク質で処置した脊椎動物の細胞からの炎症促進性サイトカインの放出を阻害するものである、請求項９に記載の抗体。
  13. 前記抗体をマウスに投与した場合に、マウスＣＬＰ敗血症モデルで少なくとも３０％保護的である、請求項１に記載の抗体。
  14. 前記抗体を齧歯動物に投与した場合に、少なくとも１つの齧歯動物関節症モデルで少なくとも３０％保護的である、請求項１に記載の抗体。
  15. 齧歯動物関節症モデルが、マウス受動的コラーゲン誘発性関節炎モデル、マウス能動的コラーゲン誘発性関節炎モデル、およびラットアジュバント誘発性関節炎モデルから成る群から選択される、請求項１４に記載の抗体。
  16. 前記抗体をマウスに投与した場合に、マウス腹膜炎モデルで少なくとも３０％保護的である、請求項１に記載の抗体。
  17. 請求項１に記載の抗体を生成する方法。
  18. 請求項１に記載の抗体を含む抗体組成物。
  19. 少なくとも１つの請求項１に記載の抗体の治療上有効な量を投与することを含む、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする状態を処置するための方法。
  20. 少なくとも１つの請求項９に記載の抗体の治療上有効な量を投与することを含む、関節リウマチを処置するための方法。
  21. ａ）好適な抗体−ＨＭＧＢ結合の条件下で、生物学的サンプルを請求項１に記載の抗体と接触させること、およびｂ）前記生物学的サンプルにおいて結合したＨＭＧＢを検出することを含む、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする状態に対する治療の有効性を、診断し、予知し、またはモニターする方法。
  22. Ｓ２、Ｓ６、Ｓ１６、およびＧ４から成る寄託された抗体の群から選択される抗体。
  23. 請求項２２に記載の寄託された抗体が、ＨＭＧ１ポリペプチドと同等、またはそれを超える親和性を有する、寄託された抗体と同じエピトープに結合する抗体。
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