JP2015524404A - 高度に保存された標的に対するラクダ科動物由来の配列を含む抗体 - Google Patents

高度に保存された標的に対するラクダ科動物由来の配列を含む抗体 Download PDF

Info

Publication number
JP2015524404A
JP2015524404A JP2015522117A JP2015522117A JP2015524404A JP 2015524404 A JP2015524404 A JP 2015524404A JP 2015522117 A JP2015522117 A JP 2015522117A JP 2015522117 A JP2015522117 A JP 2015522117A JP 2015524404 A JP2015524404 A JP 2015524404A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antigen
domain
camelid
encoding
binding polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2015522117A
Other languages
English (en)
Inventor
ジョセプフ ウイルヘルムス デ ハアルド ジョハンネス
ジョセプフ ウイルヘルムス デ ハアルド ジョハンネス
フレデリク ジェロメ ブランチェトト クリストプヘ
フレデリク ジェロメ ブランチェトト クリストプヘ
Original Assignee
アルゲン−エックス エヌ．ブイ．
アルゲン−エックス エヌ．ブイ．
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アルゲン−エックス エヌ．ブイ．, アルゲン−エックス エヌ．ブイ． filed Critical アルゲン−エックス エヌ．ブイ．
Publication of JP2015524404A publication Critical patent/JP2015524404A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
    • B01D15/1864—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、自己抗原又は高度に保存された抗原のいずれかである標的抗原に特異的に結合する、抗原結合ポリペプチド、特にラクダ科動物種由来の通常型抗体に関する。本発明はまた、ラクダ科ファミリーの種から得られた抗体の可変領域を含む、標的抗原に結合する、抗イディオタイプ抗原結合ペプチドにも関する。【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、自己抗原又は高度に保存された抗原のいずれかである標的抗原に特異的に結合する、抗原結合ポリペプチド、特にラクダ科動物(camelid)種由来の通常型抗体に関する。
（発明の背景）
モノクローナル抗体は、研究道具として多くの用途を有し、及び治療薬又は診断薬としての用途が増えている。特に治療用抗体の開発は、製薬産業における最も速い成長分野の一つである。所与の治療的標的に対する高品質のモノクローナル抗体の作製は、治療的抗体医薬の開発が成功するには重要である。今日まで、治療的関心のある標的抗原に対する完全ヒト抗体又は「ヒト化」抗体を含む、モノクローナル抗体の作製を可能にしている数多くの様々な技術プラットフォームが、開発されている。これらの技術プラットフォームは、免疫化された動物の使用を基にしたインビボアプローチと、ファージディスプレイなどの技術を用い、抗体可変鎖cDNAライブラリーから、抗体配列が選択されるインビトロアプローチとに、大きく分けられる。
モノクローナル抗体開発のためのインビボ及びインビトロの両プラットフォームの利用可能性にもかかわらず、種を超えて「高度に保存された」抗原に結合特異性を持つ抗体の作製による、並びに「自己」抗原に対する抗体の産生による、格別な難点が依然生じている。Zhuoらの文献(PLoS ONE, 第4巻第6号、2009年6月)は、免疫寛容のために、マウス自己抗原又はマウスとヒトの間で高度に保存された抗原に対する抗体の産生における、動物(具体的にはマウス)の免疫化を基にした、通常型モノクローナル抗体アプローチを使用して生じる格別な難点を考察している。
自己抗原又は高度に保存された抗原に関連した免疫寛容を克服する先行する試みは、特異的ノックアウトマウスの使用又は免疫寛容が損なわれたマウス系統の使用を含んでいる。しかし、これらの各アプローチには欠点が存在し；各関心対象の保存された抗原に関するノックアウトマウスの作製は、費用がかかり、時間もかかるのに対し、寛容が損なわれたマウスの免疫化により生じた抗体は、品質が定まらず、すなわち、標的抗原に関する低親和性及び／又は低特異性を示すことがある。
別の文献で、ヒト抗原に対するヒト抗体は、非免疫性のヒトファージディスプレイライブラリーから単離することができることが報告されている(Griffithsらの文献、EMBO J. Vol. 12., 725-734, 1993)。このアプローチの可能性のある欠点は、合成ファージディスプレイライブラリーは、ヒト生殖系列に天然に存在する機能多様性に近づくのみであり、結果的にその多様性は幾分限定されることである。また非免疫性ライブラリーを用いて作製された抗体は、能動免疫化を介したCDRのインビボ選択に由来せず、典型的には、標的抗原への親和性を改善するために、親和性成熟が行われなければならない。親和性成熟は、抗体発見プロセスにかなりの時間をかける長期にわたるプロセスである。また親和性成熟のプロセスにおいて、得られる抗体の結合特異性又は製造可能性(例えば、発現レベル、溶解度、物理化学安定性など)に負に影響を及ぼし得るある種のアミノ酸残基は、変更され得る(Wuらの文献, J. Mol. Biol. 368: 652-65 (2007))。
（発明の概要）
当該技術分野において、先行技術の方法が遭遇した問題点(例えば、低親和性、低特異性、貧弱な多様性)に悩まされることのない、高度に保存された標的抗原に対する抗体を作製するための技術的に単純なプラットフォームの開発は、依然目的であり続けている。特に能動免疫化を介したCDRのインビボ選択を基に、高度に保存された標的抗原に対する抗体を産生し、これにより親和性成熟の必要性及び得られる抗体の「製造可能性」と関連した問題点を避けるためのプラットフォームを開発することは望ましいであろう。
ここで、自己抗原及び高度に保存された標的抗原に対する高親和性の免疫学的特異性抗体は、ラクダ科種の能動免疫化により作製され得ることが認められている。最も近いラクダ科動物ホモログと90％以上の、及び97％と高いアミノ酸配列同一性を示すヒトポリペプチドを使用したとしても、動物の単純な免疫化により、ノックアウトの作製又はそれ以外の動物の遺伝的背景若しくはその自然免疫機構の操作を必要とせずに、高特異性高親和性抗体を作製することは可能である。ラクダ科動物の単純な免疫化により、自己寛容の障壁を破壊する能力は、極めて驚くべきことであり、かつ公知のモノクローナル抗体プラットフォームの及ぶ範囲を超えるとこれまでは考えられている、治療的利用の可能性のある抗体、広範な高度に保存された標的に対する抗体を含む、有用な抗体を生じる機会を生じる。
従って第一の態様において、本発明は、VHドメイン及びVLドメインを含む単離された抗原結合ポリペプチドであって、ここでVHドメイン又はVLドメイン内の少なくとも1つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)は、ラクダ科ファミリー(family Camelidae)の種のVH又はVLドメインから得られ、この抗原結合ポリペプチドは、少なくとも抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原に特異的に結合することを特徴としている、前記単離された抗原結合ポリペプチドを提供する。
一実施態様において、この標的抗原は、抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む標的抗原の少なくとも一つのドメインを含む配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示す、ポリペプチド抗原である。
一実施態様において、この標的抗原は、標的抗原の完全長にわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である。
この標的抗原は、該ラクダ科ファミリーの種由来の比較用タンパク質中に存在するエピトープと、実質的に同一構造を有する少なくとも一つのエピトープを含むことができる。線状エピトープの場合、このエピトープを形成するアミノ酸の配列は、標的抗原と比較用ラクダ科動物のタンパク質の間で、100％保存されることができる。
一実施態様において、この標的抗原は、高度に保存された抗原であってよく、ここで該高度に保存された抗原は、少なくとも抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来の相同タンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示す該ラクダ科ファミリーの種以外の種に由来するポリペプチドである。
一実施態様において、この高度に保存された抗原は、抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む標的抗原の少なくとも一つのドメインを含む配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来の相同タンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である。
一実施態様において、この標的抗原は、標的抗原の完全長にわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来の相同タンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示す、高度に保存された抗原である。
前述の各実施態様において、高度に保存された抗原は、該ラクダ科ファミリーの種由来の比較用タンパク質に存在するエピトープと実質的に同一構造を有する少なくとも一つのエピトープを含むことができる。
好ましい実施態様において、この高度に保存された抗原は、先に規定したように、配列比較ウインドウにわたり、又は標的抗原の完全長にわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来の相同タンパク質と、少なくとも95％、96％、97％、98％又は少なくとも99％ものアミノ酸配列同一性を示す、該ラクダ科ファミリーの種以外の種由来のポリペプチドであることができる。
具体的実施態様において、この高度に保存された抗原は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ブタ、イヌ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウシ又はニワトリからなる群から選択される種由来のポリペプチドであることができる。特に好ましい実施態様において、高度に保存された抗原は、ヒトポリペプチドである。
具体的実施態様において、ラクダ科ファミリーの種は、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、ビクーニャ、グアナコ及びアルパカからなる群から選択される。好ましい実施態様において、ラクダ科ファミリーの種は、ラマ(ラマグラマ(Lama glama))である。
特に好ましい実施態様において、この高度に保存された抗原は、ヒトポリペプチドであり、ラクダ科ファミリーの種は、ラマ(ラマグラマ)である。この実施態様において、高度に保存された抗原(すなわち、ヒトポリペプチド)は、先に規定したように、配列比較ウインドウにわたり、相同ラマタンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、若しくは少なくとも99％ものアミノ酸配列同一性を示すことができる。
更なる実施態様において、この標的抗原は、少なくとも抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む配列比較ウインドウにわたり、ラクダ科自己抗原と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示す、ポリペプチド抗原である、ラクダ科ファミリーの種又はラクダ科動物-由来抗原由来の自己抗原であることができる。
一実施態様において、この標的抗原は、抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む、標的抗原の少なくとも一つのドメインを含む配列比較ウインドウにわたり、ラクダ科動物の自己抗原と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示す、ラクダ科動物-由来抗原である。
一実施態様において、この標的抗原は、標的抗原の完全長にわたり、ラクダ科動物の自己抗原と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示す、ラクダ科動物-由来抗原である。
このラクダ科動物-由来抗原は、これがそこから誘導されるラクダ科動物自己抗原のエピトープを保持することができるか、又はこの自己抗原に存在するエピトープと実質的に同一構造を有する少なくとも一つのエピトープを含むことができる。
一つの具体的実施態様において、標的抗原は、該ラクダ科ファミリーの種から得られた抗体の可変領域、又はそれと少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示す配列変種である。特定の実施態様において、この配列変種は、該ラクダ科ファミリーの種から得られた抗体の可変領域と、少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％のアミノ酸配列同一性を示すことができる。この変種の該ラクダ科ファミリーの種から得られた抗体の可変領域との配列比較のための比較ウインドウは、ラクダ科動物通常型抗体の場合、VHドメインの完全長及びVLドメインの完全長を含む。ラクダ科動物の重鎖のみの抗体がVHHドメインを含む場合、その配列比較ウインドウは、VHHドメインの完全長であることができる。配列変種は、変種がそこから誘導されるラクダ科動物の抗体可変ドメインのエピトープ(又はイディオタイプ)を保持することができる。
第二の態様において、本発明は、標的抗原に特異的に結合する組換え抗原結合ポリペプチドを調製するプロセスを提供し、該抗原結合ポリペプチドは、VHドメイン及びVLドメインを含み、ここでVHドメイン又はVLドメインにおける少なくとも一つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)は、ラクダ科ファミリーの種から得られ、該プロセスは：
(a)ラクダ科ファミリーの種を免疫化し、これにより該標的抗原に対する通常型抗体を生じる工程；
(b)該標的抗原と免疫反応性であるラクダ科通常型抗体のVH及び／又はVLドメインの少なくとも一つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)をコードしているラクダ科核酸を単離する工程；
(c)工程(a)において単離された核酸によりコードされた超可変ループ(複数)又は相補性決定領域(複数)と同一のアミノ酸配列を有する、超可変ループ(複数)又は相補性決定領域(複数)をコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを調製する工程であって、このポリヌクレオチドが、該標的抗原と免疫反応性である(又はこれに特異的に結合する)VHドメイン及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチドをコードしている、前記工程；並びに
(d)工程(c)の組換えポリヌクレオチドからの該抗原結合ポリペプチドを発現する工程であって、ここで該抗原結合ポリペプチドは、パート(b)のラクダ科通常型抗体とは同一ではなく、該標的抗原は、少なくとも抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原であることを特徴とする、前記工程：を含む。
一実施態様において、この標的抗原は、抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む、標的抗原の少なくとも一つのドメインを含む配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種のタンパク質と、少なくとも90％又は少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である。
一実施態様において、この標的抗原は、標的抗原の完全長にわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である。
このプロセスの好ましい実施態様において、工程(a)において、それに対し抗体が生じる標的抗原は、高度に保存された抗原であり、ここで該高度に保存された抗原は、先に規定したように、配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来の相同タンパク質と、少なくとも90％又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示す該ラクダ科ファミリーの種以外の種に由来するポリペプチドである。
本プロセスの更に好ましい実施態様において、この高度に保存された抗原は、先に規定したように、配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来の相同タンパク質と、少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％のアミノ酸配列同一性を示す、該ラクダ科ファミリーの種以外の種に由来するポリペプチドであることができる。
具体的実施態様において、この高度に保存された抗原は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ブタ、イヌ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウシ又はニワトリからなる群から選択される種由来のポリペプチドであることができる。特に好ましい実施態様において、この高度に保存された抗原は、ヒトポリペプチドである。
具体的実施態様において、標的抗原により免疫化されるラクダ科ファミリーの種は、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、ビクーニャ、グアナコ及びアルパカからなる群から選択される。好ましい実施態様において、ラクダ科ファミリーの種は、ラマ(ラマグラマ)である。
特に好ましい実施態様において、この高度に保存された抗原は、ヒトポリペプチドであり、かつ該高度に保存された抗原により免疫化されるラクダ科ファミリーの種は、ラマ(ラマグラマ)である。この実施態様において、高度に保存された抗原(すなわち、ヒトポリペプチド)は、先に規定したように、配列比較ウインドウにわたり、相同ラマタンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％、98％若しくは99％のアミノ酸配列同一性を示すであろう。
具体的で非限定的な実施態様において、この標的抗原は、該ラクダ科ファミリーの種から得られた抗体の可変領域、又は先に規定したように配列比較ウインドウにわたりそれと少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示す配列変種であることができる。特定の実施態様において、この配列変種は、先に規定したように、配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種から得た抗体の可変領域と、少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％のアミノ酸配列同一性を示すことができる。
（図面の簡単な説明）
図1は、HMGB1及びHMGB2 ELISAにより決定された、精製されたラマ-由来Fabの結合特性を図示している。 図2は、ELISAにより測定した、ラマ-由来Fab 2A1による、HMGB1／RAGE相互作用の阻害を図示している。 図3は、ELISAにより評価した、抗体のパネルによる、抗イディオタイプ抗体11E1のラマ-IgGバージョン(la11E1)の結合プロファイルを図示している。 図4は、カニクイザル血漿のバックグラウンド中の標的抗体68F2及び129D3を検出するための、抗イディオタイプ抗体11E1のラマ-IgGバージョン(la11E1)の能力を明らかにしている。 図5は、ELISAにより測定した、61H7(mAb)に結合する7C6(Fab)の対数(投与量)-反応曲線を示しており、これは620nmでの吸光度を、7C6 Fabの対数濃度に対してプロットし、EC50を算出することができる。 図6は、ELISAにより測定した、抗イディオタイプmAbの41D12(Fab)に対する結合を図示している。
（発明の詳細な説明）
本発明は、ラクダ科種の能動免疫化により、高度に保存された標的抗原に対する、更には自己抗原に対する、高親和性高特異性抗体を生じることが可能であるという驚くべき知見から生じている。従ってその最も広範な態様において、本発明は、ラクダ科動物の自身の抗原と配列及び／又は構造において高度に類似している標的抗原への特異的結合により特徴付けられる、ラクダ科動物-由来抗原結合ポリペプチド(すなわち、VHドメイン又はVLドメイン中の少なくとも一つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)は、ラクダ科ファミリーの種から得られる、VHドメイン及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチド)を提供する。本発明はまた、ラクダ科動物の自己抗原に特異的に結合するラクダ科動物-由来抗原結合ポリペプチドも提供する。
ラクダ科動物-由来の通常型抗体の全般的特徴は、本出願人自身の先行する刊行物WO 2010/001251及びWO 2011/080350において説明されており、これらの内容はそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。ラクダ科動物-由来の通常型抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメイン(ラクダ科動物の重鎖のみの抗体とは区別される)は、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域内の一次アミノ酸配列のレベル、並びに抗原結合部位に寄与するCDRの三次元立体構造の両方で、それらの群を抜いて高いヒト抗体との相同性により特徴付けられる(WO 2010/001251において広く詳細に考察される)。更にラクダ科動物通常型抗体の可変ドメインは、フレームワーク領域内の少数の選択されたアミノ酸が、ヒト生殖系列由来の相同アミノ酸により置換されるという、「生殖系列化」の簡単なプロセスにより、更によりヒト-様とすることができる(WO 2011/080350において広範に考察される)。
ここで、高親和性高特異性のラクダ科動物通常型抗体は、公知の抗体開発技術を用い、特に宿主動物の免疫化に頼る抗体プラットフォームを用い、標的化することが極めて困難であるとこれまでは考えられた標的抗原の群に対して生じることができることが認められた。これらの「標的化が困難な」抗原は、そこで標的抗体が生じるシステム(例えば、宿主ラクダ科動物)において自然に発現された抗原に類似しているそれらの非常に近い配列及び／又は構造により特徴付けられ、かつそこで抗体が生じるラクダ科動物の種由来の自己抗原、並びにまたそこで抗体が生じるラクダ科動物の同じ種由来の最も緊密にマッチしているラクダ科動物のポリペプチドと少なくとも90％のアミノ酸配列類似性を示すポリペプチド抗原の両方を含む。本明細書に提供される抗原結合ポリペプチドは、「標的化が困難な」抗原に対し高親和性の特異的結合を示すのみではなく、ラクダ科動物の通常型抗体の特別な利点、すなわちヒト抗体の可変ドメインとの極めて高い配列相同性及び構造相同性も維持する。
（定義）
用語「抗原結合ポリペプチド」とは、標的抗原と免疫反応性であり、これと特異的結合を示す、VHドメイン及びVLドメインを含む任意のポリペプチドをいう。抗原結合ポリペプチドの例は、本明細書の別所記載の、抗体及び免疫グロブリン、並びに同じく抗体断片を含む。
用語「標的抗原」とは、それに対し抗原結合ポリペプチドが免疫反応性である抗原をいう。
用語「標的抗原」又は「抗原性物質」は、関心対象の標的抗原と反応性である抗原結合ポリペプチドの製造時に、動物(例えば、ラクダ科動物)の免疫化において利用される物質を説明するために使用することもできる。この文脈において、用語「標的抗原」は、抗原の精製された型、並びに同じく抗原の粗調製品又は半精製された調製品、例えば、細胞、細胞溶解液又は上清、細胞分画、例えば細胞膜などに加え、好適な担体タンパク質と複合されたハプテン、又は標的抗原の切断型、例えば免疫原性エピトープを含む断片、又は「DNA免疫化」に使用されるであろう標的抗原をコードすることが可能なポリヌクレオチドさえも包含することができる。更にラクダ科動物の能動免疫化に使用される「標的抗原」又は「抗原性物質」の特徴は、本明細書の別所に記載され、かつ一般に当業者には公知であろう。
抗原結合ポリペプチドと標的抗原の間の「特異的結合」とは、免疫学的特異性をいう。抗原結合ポリペプチドが、他のエピトープに優先して標的抗原上のエピトープに結合する場合、抗原結合ポリペプチドは、その標的抗原と「特異的に」結合する。「特異的結合」は、類似の抗原エピトープを生じる他の抗原との交差反応性を排除するものではない。
「抗体」(Ab)及び「免疫グロブリン」(Ig)は、(標的)抗原に対し結合特異性を示す糖タンパク質である。
ラクダ科動物の種は、2つの異なる型の抗体を有することがわかっている：古典的又は「通常型」抗体及び同じく重鎖抗体。
本明細書において使用される用語「通常型抗体」とは、IgA、IgG、IgD、IgE又はIgMを含む、任意のアイソタイプの抗体をいう。未変性の又は天然の「通常型」ラクダ科動物の抗体は、通常、2本の同一軽(L)鎖及び2本の同一重(H)鎖からなる、ヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、1個の共有ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、このジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動する。重鎖及び軽鎖は各々、規則的に配置された鎖内ジスルフィド橋も有する。各重鎖は、一端(N-末端)に、可変ドメイン(VH)と、それに続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端(N-末端)に可変ドメイン(VL)を、及びその他端に定常ドメイン(CL)を有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと並置され、かつ軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並置されている。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン間の境界面を形成すると考えられる。
用語「重鎖抗体」とは、天然に軽鎖を欠いている、ラクダ科動物種において天然に生じることが分かっている第二の型の抗体をいう(Hamers-Castermanらの文献, Nature, 1993; 363; 446-8)。重鎖抗体(略号HCAb)は、共有ジスルフィド結合により連結された2本の重鎖で構成される。HCAb中の各重鎖は、その一端に可変ドメインを有する。HCAbの可変ドメインは、それらを「通常型」ラクダ科動物抗体の重鎖の可変ドメイン(VH)から区別するために、「VHH」と称される。VHHドメイン及びVHドメインは、完全に異質であり、かつラクダ科動物のゲノム中の異なる遺伝子セグメントによりコードされている。
本発明のポリペプチドのVLドメインは、Vラムダ型又はVカッパ型であってよい。従って用語「VLドメイン」は、ラクダ科由来のVカッパ及びVラムダの両アイソタイプ、並びにラクダ科VLドメインと比べ1個以上のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む操作されたそれらの変種をいう。
用語「VHドメイン」とは、γ、ε、δ、α、又はμアイソタイプを含む、ラクダ科のいずれか公知の重鎖アイソタイプのVHドメインに加え、ラクダ科VHドメインと比べ1個以上のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む操作されたそれらの変種をいう。用語「VHドメイン」とは、ラクダ科動物の通常型抗体のVHドメインのみをいい、かつラクダ科動物のVHHドメインは包含していない。
用語「可変」とは、可変ドメインVH及びVLのある部分は、抗体間で配列が大きく異なるという事実をいい、かつ特定の抗体の各々のその標的抗原に対する結合及び特異性において使用される。しかしその可変性は、抗体の可変ドメインを通じて均等には分散していない。これは、抗原結合部位の一部を形成しているVLドメイン及びVHドメインの各々において「超可変ループ」と称される3つのセグメントに集中している。Vλ軽鎖ドメインの第一、第二及び第三の超可変ループは、本明細書においてL1(λ)、L2(λ)及びL3(λ)と称され、かつVLドメインにおいて残基24-33(9、10又は11個のアミノ酸残基からなる、L1(λ))、49-53(3個の残基からなる、L2(λ))及び90-96(5個の残基からなる、L3(λ))を含むと定義され得る(Moreaらの文献、Methods, 20:267-279 (2000))。Vκ軽鎖ドメインの第一、第二及び第三の超可変ループは、本明細書において、L1(κ)、L2(κ)及びL3(κ)と称され、かつVLドメインにおいて残基25-33(6、7、8、11、12又は13個の残基からなる、L1(κ))、49-53(3個の残基からなる、L2(κ))及び90-97(6個の残基からなる、L3(κ))を含むと定義され得る(Moreaらの文献、Methods, 20:267-279 (2000))。VHドメインの第一、第二及び第三の超可変ループは、本明細書において、H1、H2及びH3と称され、かつVHドメインにおいて残基25-33(7、8又は9個の残基からなる、H1)、52-56(3又は4個の残基からなる、H2)及び91-105(長さが高度に変動する、H3)を含むと定義され得る(Moreaらの文献、Methods, 20: 267-279 (2000))。
用語L1、L2及びL3は、別に指摘しない限りは、各々、VLドメインの第一、第二及び第三の超可変ループを意味し、かつラクダ科由来のVκ及びVλ両アイソタイプから得られる超可変ループを包含している。用語H1、H2及びH3は、各々、VHドメインの第一、第二及び第三の超可変ループを意味し、かつγ、ε、δ、α又はμを含む、ラクダ科由来の公知の重鎖アイソタイプのいずれかから得られた超可変ループを包含している。
前述の超可変ループL1、L2、L3、H1、H2及びH3は、各々、「相補性決定領域」又は「CDR」の一部を含むことができる。超可変ループ(HV)は構造を基に規定されるのに対し、相補性決定領域(CDR)は配列可変性を基に規定されるので、用語「超可変ループ」と「相補性決定領域」は、厳密には同義語ではなく(Kabatらの文献、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」、第5版、Public Health Service、米国国立衛生研究所(NIH)、Bethesda、MD.、1983)、かつHVとCDRの境界は、一部のVHドメイン及びVLドメインにおいて異なることがあってよい。
前記VL及びVHドメインのCDRは、典型的には、下記のアミノ酸を含むと規定されることができる：軽鎖可変ドメイン中の残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)及び89-97(CDRL3)、並びに重鎖可変ドメイン中の残基31-35又は31-35b(CDRH1)、50-65(CDRH2)及び95-102(CDRH3)；(Kabatらの文献、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列」、第5版、Public Health Service、NIH、Bethesda、MD.、(1991))。従ってこれらのHVは、対応するCDR内に含まれることができ、かつ別に指摘しない限りは、本明細書におけるVH及びVLドメインの「超可変ループ」の言及は、対応するCDRも包含すると解釈されなければならず、その逆もまた同様である。
可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域(FR)と称される。未変性の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、3つの超可変ループにより接続された、β-シート立体配置を主として採用している4つのFR(各々、FR1、FR2、FR3及びFR4)を含む。各鎖内の超可変ループは、これらのFRにより密に近接して保持され、かつ他方の鎖由来の超可変ループと一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する。抗体の構造解析は、相補性決定領域により形成された結合部位の配列と形状の間の関係を明らかにした(Chothiaらの文献、J. Mol. Biol., 227: 799-817 (1992))；Tramontanoらの文献、J. Mol. Biol., 215: 175-182 (1990))。それらの高度な配列可変性にもかかわらず、これら6つのループの5つは、「カノニカル構造」と称される、主鎖高次構造の小さいレパトアのみを採用している。これらの高次構造は、まず第一にループの長さにより決定され、かつ第二に、それらのパッキング、水素結合又は通常でない主鎖高次構造を推定する能力を通じ、高次構造を決定するループ領域内及びフレームワーク領域内の特定位置での重要残基の存在により決定される。
定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)又は補体依存性細胞傷害作用(CDC)における抗体の参加など、様々なエフェクター機能を発揮する。
本発明の全ての態様及び実施態様において、ラクダ科(又はラクダ科動物)の種(それから本発明の抗原結合ポリペプチドの超可変ループ又はCDRが得られる)は、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、ビクーニャ、グアナコ又はアルパカ及び任意のそれらの交雑種であることができる。ラマ(ラマグラマ)及びアルパカ(ラマパコス(Lama pacos))は、本発明の全ての態様に関して、好ましいラクダ科ファミリーの種である。
抗原結合ポリペプチドは、ラクダ科ファミリーの種のVHドメイン又はVLドメインから得られる少なくとも一つの超可変ループ又は相補性決定領域を含む場合、これらは、「ラクダ科動物-由来」と考えられる。誤解を避けるために、用語「VHドメイン」、「VLドメイン」とは、ラクダ科動物の通常型抗体から誘導されたドメインをいう。この定義は、ラクダ科動物の重鎖のみのVHH抗体、及びラクダ科動物VHHドメインのHV又はCDRのみを含む組換え構築体を排除しており、これらは本発明の範囲内に包含されない。
「ラクダ科ファミリーの種のVHドメイン又はVLドメインから得られた超可変ループ又は相補性決定領域」は、その超可変ループ(HV)又はCDRは、ラクダ科免疫グロブリン遺伝子によりコードされた超可変ループ又はCDRのアミノ酸配列と、同一であるか、又は実質的に同一であるアミノ酸配列を有することを意味する。この文脈において、「免疫グロブリン遺伝子」は、生殖系列遺伝子、再編成を受けた免疫グロブリン遺伝子、及び同じく体細胞変異された遺伝子を含む。従ってラクダ科種のVH又はVLドメインから得られたHV又はCDRのアミノ酸配列は、成熟したラクダ科通常型抗体に存在するHV又はCDRのアミノ酸配列と同一であることができる。この文脈において、用語「から得られた」とは、本発明の抗原結合ポリペプチドのHV又はCDRは、ラクダ科免疫グロブリン遺伝子により当初コードされたアミノ酸配列(又はそれらのわずかな変種)を具体化するという意味での構造的関係を意味している。しかしこれは、本発明の抗原結合ポリペプチドの調製に使用される生成プロセスに関する特定の関係を必ずしも意味するものではない。以下に考察するように、ラクダ科免疫グロブリン遺伝子により当初コードされた配列と同一(又は実質的に同一)であるアミノ酸配列を伴うHV又はCDRを含む抗原結合ポリペプチドを調製するために使用することができるいくつかのプロセスが存在する。
用語「ラクダ科動物の通常型抗体のVHドメイン」及び「ラクダ科の種から得られたVHドメイン」は、同義に使用され、かつ合成の又は操作された組換え遺伝子(コドン-最適化された合成遺伝子を含む)の産物であるVHドメインを包含しており、このVHドメインは、ラクダ科免疫グロブリン遺伝子(生殖系列、再編成又は体細胞変異された)によりコードされたVHドメインのアミノ酸配列と同一(又は実質的に同一)のアミノ酸配列を有する。同様に、用語「ラクダ科動物の通常型抗体のVLドメイン」及び「ラクダ科の種から得られたVLドメイン」は、同義に使用され、かつ合成の又は操作された組換え遺伝子(コドン-最適化された合成遺伝子を含む)の産物であるVLドメインを包含しており、このVLドメインは、ラクダ科免疫グロブリン遺伝子(生殖系列、再編成又は体細胞変異された)によりコードされたVLドメインのアミノ酸配列と同一(又は実質的に同一)のアミノ酸配列を有する。
本明細書に提供される抗原結合ポリペプチドは典型的には、組換えにより発現されたポリペプチドであり、かつキメラポリペプチドであることができる。用語「キメラポリペプチド」とは、そうでなければ近接して生じることのない2つ以上のペプチド断片の並立により作製される、人工の(非天然の)ポリペプチドをいう。2種以上の種、例えばラクダ科動物とヒトなどによりコードされたペプチド断片の並立により作製された「種」キメラポリペプチドは、この定義に含まれる。
本明細書に提供される抗原結合は、ラクダ科動物由来の少なくとも一つの超可変ループ(又はCDR)を必要とするために、天然のヒト抗体、具体的にはヒト自己抗体ではない。「天然の」ヒト抗体は、ヒト対象において自然に発現されている抗体を意味する。その天然の抗体又は断片は、キメラではなく、かつアミノ酸配列における任意の操作された変化(体細胞変異を除く)には供されないが、天然のヒト抗体のアミノ酸配列と100％同一であるアミノ酸配列を有する抗原結合ポリペプチド、又はそれらの断片は、本発明の範囲から除外される。
本明細書に提供される抗原結合ポリペプチドは、重鎖可変(VH)ドメイン及び軽鎖可変(VL)ドメインの両方を含み、VHドメイン又はVLドメインのいずれかの中の少なくとも一つの超可変ループ又は相補性決定領域は、ラクダ科ファミリーの種から得られることを特徴としている。
代替の実施態様において、VHドメイン中のH1若しくはH2のいずれか、又はH1及びH2の両方は、ラクダ科ファミリーの種から得られ、かつこれとは独立してVLドメイン中のL1若しくはL2のいずれか、又はL1及びL2の両方は、ラクダ科ファミリーの種から得られる。更なる実施態様において、VHドメインのH3、又はVLドメインのL3も、ラクダ科ファミリーの種から得ることができる。前述のものの全ての可能性のある並べ替えが、可能である。一つの具体的実施態様において、VHドメイン及びVLドメインの両方における超可変ループH1、H2、H3、L1、L2及びL3の各々は、ラクダ科ファミリーの種から得ることができる。
一実施態様において、全VHドメイン及び／又は全VLドメインは、ラクダ科ファミリーの種から得ることができる。次にラクダ科VHドメイン及び／又はラクダ科VLドメインは、1個以上のアミノ酸置換、挿入又は欠失がラクダ科配列へ導入されるタンパク質操作に供される。これらの操作された変化は、ラクダ科配列に対するアミノ酸置換を含むことが好ましい。そのような変化は、ラクダ科動物-コードされたVH又はVLドメイン内の1個以上のアミノ酸残基が、相同ヒト-コードされたVH又はVLドメインに由来する同等の残基により置き換えられる、「ヒト化」又は「生殖系列化」を含む。
特定の実施態様において、ラクダ科超可変ループ(又はCDR)は、関心対象の所望の「標的抗原」と反応性である抗体を誘発することが可能である抗原性物質による、ラクダ科ファミリーの種の、能動免疫化により得ることができる。本明細書において詳細に考察及び例証するように、標的抗原と免疫反応性である抗体を誘発することが可能である抗原性物質による、ラクダ科(未変性の動物又はラクダ科動物種の免疫グロブリンレパトアを発現するように操作されたトランスジェニック動物のいずれか)の免疫化の後、所望の抗原に特異性を有するB細胞産生(通常型ラクダ科)抗体を同定することができ、かつそのような抗体のVH及びVLドメインをコードしているポリヌクレオチドを、公知の技術を使用し、単離することができる。
従って具体的実施態様において、本発明は、標的抗原と免疫反応性の組換え抗原結合ポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、VHドメイン及びVLドメインを含み、ここでVHドメイン又はVLドメイン内の少なくとも1つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)は、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られ、かつこの抗原結合ポリペプチドは、少なくとも抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原に特異的に結合することを特徴とし、この抗原結合ポリペプチドは、下記の工程を含むプロセスにより得られる：
(a)ラクダ科ファミリーの種を免疫化し、これにより該標的抗原に対する抗体を生じる工程；
(b)該標的抗原と免疫反応性のラクダ科通常型抗体のVH及び／又はVLドメインの少なくとも一つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)をコードしているヌクレオチド配列を決定する工程；並びに
(c)該標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドを発現する工程であって、該抗原結合ポリペプチドが、VH及びVLドメインを含み、ここでVHドメイン又はVLドメインの少なくとも一つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)は、パート(a)において決定されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を有する前記工程。
能動免疫化により得られた単離されたラクダ科VH及びVLドメインは、本発明の抗原結合ポリペプチドを操作するための基礎として使用することができる。無傷のラクダ科VH及びVLドメインからの出発し、出発のラクダ科配列から逸脱する1個以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を操作することが可能である。特定の実施態様において、そのような置換、挿入又は欠失は、VHドメイン及び／又はVLドメインのフレームワーク領域内に存在することができる。一次アミノ酸配列におけるそのような変化の目的は、恐らく好ましくない特性(例えば、ヒト宿主における免疫原性(いわゆるヒト化)、可能性のある生成物の不均一性及び／若しくは不安定性(グリコシル化、脱アミド化、異性化など)の部位を減少するか、又はその分子のいくつかの他の好ましい特性(例えば、溶解度、安定性、生物学的利用能など)を増強することである。他の実施態様において、一次アミノ酸配列における変化は、能動免疫化により得られた、ラクダ科VH及び／又はVLドメインの1以上の超可変ループ(又はCDR)において操作することができる。そのような変化は、抗原結合親和性及び／若しくは特異性を増強するために、又は例えばヒト宿主における免疫原性(いわゆるヒト化又は生殖系列化)、可能性のある生成物の不均一性若しくは不安定性、グリコシル化、脱アミド化、異性化の部位、メチオニンなどの硫黄-含有アミノ酸の除去などの、恐らく好ましくない特性を減少するため、又は例えば、溶解度、安定性、生物学的利用能、製造可能性など、その分子のいくつかの他の好ましい特性を増強するために、導入することができる。
従って一実施態様において、本発明は、抗原結合ポリペプチドが、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原へ特異的に結合することを特徴とする、ラクダ科ファミリーの種の標的抗原による能動免疫化により得られたラクダ科VH又はVLドメインとの比較において、VHドメイン又はVLドメインのいずれかの少なくとも一つのフレームワーク又はCDR領域内に、少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、組換え抗原結合ポリペプチドを提供する。この特定の実施態様は、能動免疫化により産生された未変性のラクダ科VH及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチドは除外している。
他の実施態様において、本発明は、ラクダ科(又はそれらの操作された変種)由来のVH及びVLドメイン、及び非-ラクダ科動物の抗体由来の1以上の定常ドメイン、例えばヒト-コードされた定常ドメイン(又はそれらの操作された変種)を含む、「キメラ」抗体分子を包含している。そのような実施態様において、VHドメイン及びVLドメインの両方が、ラクダ科動物の同じ種から得られることが好ましく、例えば、VH及びVLの両方はラマグラマ由来であるか、あるいはVH及びVLの両方はラマパコス由来である(操作されたアミノ酸配列変種の導入以前)。そのような実施態様において、VH及びVLの両ドメインは、単独の動物、特に能動免疫化された単独の動物から誘導することができる。また本発明は、VH又はVLドメインの一方がラクダ科動物-コードされ、かつ他方の可変ドメインが非-ラクダ科動物(例えばヒト)である、キメラ抗原結合ポリペプチド(例えば、抗体分子)にも及ぶ。
ラクダ科VH及び／又はVLドメインの一次アミノ酸配列の変化を操作する代わりとして、個々のラクダ科超可変ループ又はCDR又はそれらの組合せを、ラクダ科VH／VLドメインから単離し、代替の(すなわち、非-ラクダ科)のフレームワーク、例えばヒトVH／VLフレームワークへ、CDRグラフティングにより、移行することができる。
（高度に保存された抗原に結合する抗原結合ポリペプチド）
本発明の一つの好ましい実施態様において、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示す標的抗原は、「高度に保存された」抗原であることができる。ラクダ科動物種の能動免疫化により生じた抗原結合ポリペプチドの場合、標的抗原が、その中に抗原結合ポリペプチドが生じている／生じた同じラクダ科動物種の未変性抗原の配列及び／又は構造に極めて類似しているならば、この標的抗原は「高度に保存された」と考えられる。例えばラマ-由来である抗原結合ポリペプチドの場合、「高度に保存された」標的抗原は、未変性のラマ抗原に高度に類似しているラマ以外の種由来のポリペプチドである。
ポリペプチド抗原の場合、高度に保存された抗原と構造が最も密接に関連している未変性のラクダ科動物ポリペプチドとの間の類似性の程度は、アミノ酸配列の％類似性に関して表すことができる。従って好ましい実施態様において、高度に保存された抗原は、該ラクダ科ファミリーの種由来の相同タンパク質と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示す該ラクダ科ファミリーの種以外の種由来のポリペプチドである。更なる好ましい実施態様において、高度に保存された抗原は、該ラクダ科ファミリーの種由来の相同タンパク質と、少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％のアミノ酸配列同一性を示す、該ラクダ科ファミリーの種以外の種由来のポリペプチドであることができる。
本出願において、特に指定しない限りは、2つのアミノ酸配列間の％配列同一性は、最適な様式で並置され、かつそこで比較されるべきアミノ酸配列が、これら2つの配列間の最適なアラインメントのために参照配列に付加又は欠失を含むことができる、これら2つの配列を比較することにより決定することができる。同一性の割合は、アミノ酸残基が2つの配列間で同一である位置の数を決定し、この同一位置の数を選択された配列比較ウインドウ内の位置の総数で除算し、かつこれら2つの配列間の％同一性を得るために、得られた結果を100倍することにより算出される。例えば、これはBLASTプログラム"BLAST 2 Sequences"(Tatusovaらの文献、「Blast 2 sequences−タンパク質配列及びヌクレオチド配列比較のための新規ツール(Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences)」、FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)を使用し可能であり、このプログラムはサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上で入手可能であり、かつ使用したパラメータは、デフォルトで供されたものであり(特にパラメータは、"オープンギャップペナルティ"：5、及び"イクステンションギャップペナルティ"：2；選択したマトリックスは、例えば、本プログラムにより提唱されたマトリックス"BLOSUM 62"である)、比較されるべき2つの配列間の％同一性は、このプログラムにより直接算出される。
任意の所与の標的抗原に関して、当業者は、シングルクエリー配列としての標的抗原配列で、BLASTプログラムなどの公に入手可能な検索及びアラインメントのツールを使用することが可能であろう。回収された結果から、そのポリペプチド抗原は、関連するラクダ科種、すなわち、それから抗原結合ポリペプチドの超可変ループ又は相補性決定領域が誘導されるラクダ科種由来のタンパク質と、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％又は99％のアミノ酸配列同一性を示すかどうかを決定することは可能であろう。
本発明の全ての態様及び実施態様において、それにわたり標的抗原が比較用ラクダ科動物タンパク質と比較される「配列比較ウインドウ」は、少なくとも該抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む標的抗原の領域でなければならない。配列比較は、例えば、該抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む、標的タンパク質の少なくとも20個のアミノ酸、又は少なくとも30個のアミノ酸、又は少なくとも50個のアミノ酸、又は少なくとも100個のアミノ酸の連続する配列(contiguous stretch)であることができる。
特定の実施態様において、配列比較ウインドウは、該抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む、標的抗原の少なくとも一つのドメインを含むことができる。
更なる実施態様において、配列比較ウインドウは、エピトープの正確な同一性／位置は不明であっても、定義により抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む標的抗原の完全長であることができる。
前述の各実施態様において、本標的抗原は、該ラクダ科ファミリーの種由来の比較用タンパク質に存在するエピトープと実質的に同一構造を有するエピトープ(抗原結合ポリペプチドに関する)を含むことができる。線状エピトープの場合、エピトープを形成するアミノ酸の配列は、標的抗原と比較用ラクダ科動物タンパク質の間で100％保存され得る。
高度に保存された抗原は、非限定的に、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ブタ、イヌ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウシ又はニワトリを含む本質的に任意の種に由来するポリペプチドであることができる。しかし特に好ましい実施態様において、高度に保存された抗原は、ヒトポリペプチド、例えば治療用標的又はバイオマーカーであることができる。特に好ましい実施態様において、高度に保存された抗原は、治療又は診断に関連する標的抗原であることができる。ヒトポリペプチドの厳密な性質は、物的要素ではなく；本発明は、ヒトポリペプチドの厳密な同一性には関わりなく、「高度に保存された」ヒトポリペプチドに対する抗体を生じるプラットフォームを提供する。ヒトポリペプチド(それに対し本発明の抗原結合ポリペプチドが生じ得る)は、未変性のラクダ科動物の抗原に対するそれらの類似性の程度(アミノ酸配列における)を特徴としている。非限定的例により、それに対し抗体が生じ得る一つの「高度に保存された」ヒトポリペプチドは、高移動度タンパク質群1(HMGB1)タンパク質であり、これはヒトとマウスの間で99％保存され、かつヒトとラマの間で97％保存されている。
他の実施態様において、高度に保存された抗原は、非-ポリペプチド抗原、例えば、糖抗原(例えば、オリゴ糖若しくは多糖)、又はポリペプチド成分及び糖成分の両方を含有する抗原、例えば糖タンパク質抗原であることができる。糖タンパク質である標的抗原の場合、この糖タンパク質標的抗原は、相同なラクダ科動物のタンパク質のグリコシル化パターンと実質的に同一であるグリコシル化パターンを示すことができる。それに抗原-結合分子が結合する抗原決定基は、糖エピトープであるか、又はこれはポリペプチド決定因子(例えば、1個以上のアミノ酸残基)と糖決定因子(例えば、糖タンパク質のオリゴ糖／グリカン側鎖の1個以上の糖部分)の組合せにより形成されたエピトープであることができる。
（ラクダ科動物自己抗原及びラクダ科動物-由来抗原に結合する抗原結合ポリペプチド）
本発明の第二の好ましい実施態様において、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示す標的抗原は、ラクダ科動物の自己抗原又はラクダ科動物-由来抗原であることができる。ラクダ科動物種の能動免疫化により生じた抗原結合ポリペプチドの場合、用語「自己抗原」とは、未変性のラクダ科動物の抗原、すなわち同じラクダ科動物種において天然に生じた抗原をいう。例えばラマの能動免疫化により生じた抗原結合ポリペプチドの場合、用語「自己抗原」とは、未変性のラマ抗原、すなわちラマにおいて天然に生じる抗原をいう。
ラクダ科動物(例えばラマ)の自己抗原は、とりわけ、ポリペプチド、ペプチド、多糖、糖タンパク質、ポリヌクレオチド(例えばDNA)の抗原を含むことができ、ポリペプチド自己抗原が特に好ましい。「ポリペプチド自己抗原」は、天然のラクダ科動物のポリペプチド、及びラクダ科動物のポリペプチドの合成バージョン、例えば組換え発現されたポリペプチドも含むことができる。
用語「ラクダ科動物-由来抗原」とは、変種が構造／配列において、ラクダ科動物抗原に高度に類似している、未変性のラクダ科動物の抗原から誘導された変種、例えばラクダ科動物のポリペプチドの操作された配列変種である標的抗原をいうよう本明細書において使用される。ラクダ科動物-由来ポリペプチド抗原は、例えば、未変性のラクダ科動物のポリペプチドとの少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％、又は少なくとも99％もの同一性であるアミノ酸配列から誘導されるか／誘導された、未変性のラクダ科動物のタンパク質のアミノ酸配列に高度に類似しているアミノ酸配列を有することができる。
（抗イディオタイプ）
ひとつの特に重要な実施態様において、本抗原結合ポリペプチドは、ラクダ科ファミリーの種から得られた抗体の可変領域を含む標的抗原に結合する、抗イディオタイプ抗原結合ポリペプチド(例えば、抗イディオタイプ抗体又はそれらの抗原結合断片)であることができる。ラクダ科動物-由来抗体(それに抗イディオタイプが結合する)は、通常型のラクダ科動物抗体(すなわち、対合されたVHドメイン及びVLドメインを含むラクダ科動物抗体)又は重鎖のみの抗体(すなわちVHHドメインを含むラクダ科動物抗体)であることができる。抗イディオタイプ抗原結合ポリペプチドが生じるラクダ科動物種は、それから抗体可変領域が誘導される／誘導されたラクダ科動物種と同じであることができる。従って非限定的例として、ひとつの好ましい実施態様は、ラマ-由来抗体の可変領域内のエピトープ(標的抗原)に結合する、ラマ-由来抗イディオタイプ抗原結合ポリペプチド(例えばラマ抗イディオタイプ抗体)である。抗イディオタイプ抗体のための標的抗原を形成するラマ-由来抗体は、通常型ラマ抗体又は重鎖のみのラマ抗体であることができる。
抗イディオタイプ抗原結合ポリペプチドが結合するラクダ科動物-由来(例えばラマ-由来)抗体の可変領域内のエピトープは、ラクダ科動物-由来(例えばラマ-由来)通常型抗体のVHドメイン中、又はラクダ科動物-由来(例えばラマ-由来)通常型抗体のVL内に位置することができるか、あるいは、このエピトープは、ラクダ科動物-由来(例えばラマ-由来)通常型抗体のVHドメイン及びVLドメインの両方内のアミノ酸から形成されることができる。抗イディオタイプ抗原結合ポリペプチドに関する「エピトープ」は、最も典型的には、それが結合する抗体の可変領域のCDRから形成される。
抗イディオタイプ抗原結合ポリペプチドに関する標的抗原を形成するラクダ科動物-由来(例えばラマ-由来)通常型抗体の可変領域は、未変性のラクダ科動物(例えばラマ)通常型抗体、例えばラクダ科動物(例えばラマ)の関心対象の抗原による能動免疫化により生じた抗体から誘導することができるか、あるいは、これは実際には、未変性のラクダ科動物(例えばラマ)通常型抗体の合成又は操作された配列変種であることができる。従ってこの文脈において、「通常型ラクダ科動物-由来抗体の可変領域」とは、未変性のラクダ科動物通常型抗体の可変領域、すなわちラクダ科動物に生じた抗体と同一配列を有する可変領域を含むのみではなく、操作された変種、例えば、未変性のラクダ科動物配列と比べてフレームワーク領域及び／又はCDR内にアミノ酸置換を伴う変種も包含しており、但しここでこの操作された変種は、未変性のラクダ科動物-由来通常型抗体の可変ドメイン(VH及び／又はVL)と最低でも少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を依然保持しなければならないことを条件としている。そのような実施態様において、％アミノ酸配列同一性を評価するための配列比較ウインドウは、VHドメイン全体及びVLドメイン全体を含むことができる。
WO 2010/001251は、治療上関心対象のヒトポリペプチド標的を含む、広範な標的抗原に対する、通常の4本鎖抗体を生じるためのプラットフォームとしての、ラクダ科動物(及び、特にラマ)の使用を説明している。関心対象の標的抗原に対する通常型ラクダ科動物抗体を生じる数多くの技術が、そこに説明されている。一旦標的抗原への好適な結合特異性を持つ未変性のラクダ科動物(例えばラマ)通常型抗体が単離されると、これは典型的には、その特性を改善する目的で、例えばそれがヒト治療上の使用により適するようにするために、未変性のラクダ科動物抗体の可変ドメイン内の一次アミノ酸配列に1つ以上の変化が操作される。そのような変化は、VHドメイン及び／又はVLドメインのフレームワーク領域内のアミノ酸置換、及び同じく抗原結合部位に寄与するVH及び／又はVLドメイン内の1以上のCDR内のアミノ酸置換を含むことができる。前述のように、抗イディオタイプ抗原結合ポリペプチドの「エピトープ」は、最も典型的には、それが結合する抗体可変領域のCDRから形成される。従ってラクダ科動物種(例えばラマ)を同じ種由来の標的抗体の可変領域により能動免疫化(例えば、ラマFabによる免疫化)することにより生じた抗イディオタイプ抗原結合ポリペプチドはまた、それらの可変領域の生殖系列化された変種(例えば、ラマFabの生殖系列化されたバージョン)に結合すると予想され、特に「生殖系列化」を目的に導入されたアミノ酸置換がフレームワーク領域に限定される場合には、配列及び高次構造に関して本質的に未変化のCDRが残る。
本発明はここで、免疫寛容のために標的化することが困難であるラクダ科動物自己抗原であると考えられるにもかかわらず、通常型ラクダ科動物-由来抗体の可変領域に関して結合特異性を持つ、高特異性で高親和性の抗イディオタイプ抗原結合ポリペプチドを生じる手段を提供する。
本明細書に記載のように抗イディオタイプ抗原結合ポリペプチドの重要な実践的適用は、ヒト治療薬としての使用を意図したラクダ科動物-由来抗体の薬物動態研究の道具としてである。
（抗原結合ポリペプチドの構造）
本発明の抗原結合ポリペプチドは、VHドメイン及びVLドメインの両方が存在することを条件として、様々な異なる実施態様をとることができる。従って非限定的実施態様において、本抗原結合ポリペプチドは、免疫グロブリン、抗体又は抗体断片であることができる。本明細書において用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、かつそれらが標的抗原に対する好適な特異性を示す限りは、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)を包含するが、これらに限定されるものではない。本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわちその集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る可能性のある天然の変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異性があり、単独の抗原部位に対し向けられている。更に、抗原上の異なる決定基(エピトープ)に対し向けられた様々な抗体を典型的には含む通常型(ポリクローナル)抗体調製品とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単独の決定基又はエピトープに対して向けられている。
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般にそれらの抗原結合ドメイン又は可変ドメインを含む。抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab')2、二重特異性Fab'、及びFv断片、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、単鎖可変部断片(scFv)、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む(Holliger及びHudsonの文献、Nature Biotechnol., 23:1126-36 (2005)を参照することとし、その内容は引用により本明細書中に組み込まれている。)。
非限定的実施態様において、本発明の抗体及び抗体断片は、CH1ドメイン及び／又はCLドメインを含むことができ、それらのアミノ酸配列は、完全に又は実質的にヒトである。本発明の抗原結合ポリペプチドが、ヒト治療における使用が意図された抗体である場合、これは、その抗体の定常領域全体又は少なくともそれらの一部について典型的には、完全に又は実質的にヒトアミノ酸配列を有する。従って本発明の抗体は、その少なくとも一つはラクダ科由来の少なくとも一つの超可変ループを含む、VH及びVLドメインを含まなければならないが、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCLドメイン(並びに存在するならばCH4ドメイン)の1つ以上若しくは任意の組合せは、そのアミノ酸配列に関して完全に又は実質的にヒトであることができる。
有利なことに、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCLドメイン(並びに存在するならばCH4ドメイン)は全て、完全に又は実質的にヒトアミノ酸配列を有することができる。ヒト化又はキメラ抗体、又は抗体断片の定常領域の文脈において、用語「実質的にヒト」とは、ヒト定常領域と少なくとも90％、又は少なくとも95％、又は少なくとも97％、又は少なくとも99％のアミノ酸配列同一性をいう。この文脈において用語「ヒトアミノ酸配列」とは、生殖系列、再編成された及び体細胞変異された遺伝子を含む、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされたアミノ酸配列をいう。本発明はまた、ヒト配列に関して1つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換により変更されている「ヒト」配列の定常ドメインを含むポリペプチドも意図している。
本明細書の別所において考察するように、1つ以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失は、重鎖及び／又は軽鎖の定常領域内、特にFc領域内になされることが意図されている。アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の、異なる天然のアミノ酸との、又は非天然若しくは改変されたアミノ酸との置き換えを生じることができる。例えばグリコシル化パターンの変化(例えば、N-又はO-結合型グリコシル化部位の付加又は欠失による)などの、その他の構造上の改変も許される。抗体の意図された用途に応じて、Fc受容体へのその結合特性に関して本発明の抗体を改変すること、例えばエフェクター機能を調節することが望ましいことがある。例えば、システイン残基(複数)をFc領域に導入することができ、これによりこの領域内での鎖間ジスルフィド結合形成が可能になる。こうして作出されたホモ二量体型抗体は、改善されたインターナリゼーション能並びに／又は増強された補体媒介性細胞傷害作用及び抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)を有し得る。Caronらの文献、J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes B.の文献、J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。あるいは抗体は、二重Fc領域を有し、かつこれにより増強された補体溶解能及びADCC能を有するよう操作することができる。Stevensonらの文献、Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。本発明はまた、化学療法薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性がある毒素、又はそれらの断片)、又は放射性同位元素(すなわち、放射性複合体)などの、細胞毒性物質に複合された、本明細書に記載の抗体を含む免疫複合体も意図している。またFc領域を、半減期を延長するように操作することもできる。
本発明は、特定の実施態様において、該ラクダ科ファミリーの種由来の自己抗原、又は該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原に特異的に結合する、キメララクダ科／ヒト抗体を包含することができる。好ましい実施態様は、VH及びVLドメインが完全にラクダ科動物の配列(例えば、ラマ又はアルパカ)のものであり、かつその抗体の残りが完全にヒト配列のものであるキメラ抗体を含む。好ましい実施態様において、本発明は、VH及びVLドメインが、能動免疫化により得られたラクダ科VH及びVLドメインと比べ、そのフレームワーク領域内に1つ以上のアミノ酸置換を含む、「生殖系列化された」ラクダ科抗体、ラクダ科／ヒトキメラ抗体も包含している。「生殖系列化」のプロセス(引用により本明細書中に組み込まれている、WO 2010/001251及びWO 2011/080350に説明されたような)は、出発のラクダ科VH又はVLドメイン中のミスマッチしたアミノ酸残基を、ヒト生殖系列-コードされたVH又はVLドメイン中に認められた等価残基と置き換えることにより、ヒト生殖系列VH又はVLドメインとの％配列同一性を増大する。
本発明はまた更に、該ラクダ科ファミリーの種由来の自己抗原又は該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原に特異的に結合するラクダ科抗体から誘導された、例えば標的抗原による能動免疫化により生じたラクダ科抗体から誘導された、又はそうでなければラクダ科動物遺伝子によりコードされたCDR(又は超可変ループ)が、ヒトVH及びVLフレームワーク上にグラフティングされており、その抗体の残りも完全にヒト起源である、CDR-グラフティング抗体を包含している。
本発明の生殖系列化抗体、キメラ抗体及びCDR-グラフティング抗体、特に標的抗原によるラクダ科の能動免疫化から誘導された超可変ループを含む抗体は、関心対象のポリペプチドを生成するように操作され、かつ非限定的に細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞を含む、原核宿主細胞又は真核宿主細胞を使用し、通常の組換えDNA操作及び発現技術を用い、容易に産生することができ、それらの一部は本明細書に説明されかつ付随する実施例において例示されている。
本発明はまた更に、VHドメイン及び／又はVLドメインの超可変ループ(複数)又はCDR(複数)が、ラクダ科から得られるが、ここで該(ラクダ科動物-由来)超可変ループ又はCDRの少なくとも1つは、ラクダ科動物-コードされた配列と比べ1つ以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失を含むように操作されている抗原結合ポリペプチドに拡大される。そのような変化は、超可変ループ／CDRの「ヒト化」を含む。この方式で操作されているラクダ科動物-由来HV／CDRは、ラクダ科動物-コードされたHV／CDRのアミノ酸配列と「実質的に同一」であるアミノ酸配列を依然示すことができる。この文脈において、「実質的同一性」とは、ラクダ科動物-コードされたHV／CDRとの、1以下、又は2以下のアミノ酸配列ミスマッチを容認することができる。
該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原に特異的に結合する本発明の抗体は、任意のアイソタイプであることができる。ヒト治療上の使用が意図された抗体は、典型的にはIgA、IgD、IgE、IgG、IgM型であり、頻繁にはIgG型であり、その場合これらは4種のサブ-クラスIgG1、IgG2a及びb、IgG3又はIgG4のいずれかに属することができる。これらのサブ-クラスの各々において、そのFc部分内に1個以上のアミノ酸の置換、挿入若しくは欠失を生じるか、又は例えばFc-依存型機能性を増強若しくは低下させるために、他の構造上の改変を生じることが可能である。
該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原に特異的に結合する抗原結合ポリペプチドは、疾患の研究、並びに診断及び／又は治療の両方における、広範な適用において有用であることができる。天然のヒト抗体のVH及びVLドメインとの高度なアミノ酸配列同一性、並びに高度な構造的相同性(具体的にはヒト抗体において認められるようなカノニカルフォールドの正確な組合せ)のために、本発明の抗原結合ポリペプチドは、特にモノクローナル抗体の形で、ヒト治療薬として特に有用であることが認められるであろう。
（ポリヌクレオチド、ベクター及び組換え発現）
本発明はまた、本発明の抗原結合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド分子、宿主細胞又は無細胞発現システムにおける該抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする調節配列へ機能的に連結される本発明の抗原結合ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む発現ベクター、並びにこの発現ベクターを含む宿主細胞又は無細胞発現システムを提供する。
本発明の抗原結合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド分子は、例えば、組換えDNA分子を含む。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド分子」は、本明細書において互換的に使用され、かつ一本鎖又は二本鎖のいずれかの任意のDNA又はRNA分子を、一本鎖の場合はその相補配列の分子をいう。核酸分子の考察において、特定の核酸分子の配列又は構造は、5'から3'方向の配列を提供する通常の慣習に従い本明細書において説明することができる。本発明の一部の実施態様において、核酸又はポリヌクレオチドは、「単離」されている。この用語は、核酸分子に適用される場合は、それが起源としている生物の天然のゲノム内では直ぐ隣接している配列から分離されている核酸分子をいう。例えば「単離された核酸」は、プラスミド又はウイルスベクターなどのベクターへ挿入されたDNA分子、あるいは原核細胞又は真核細胞又は非ヒト宿主生物のゲノムDNAへ組み込まれたDNA分子を含むことができる。RNAへ適用する場合、用語「単離されたポリヌクレオチド」とは、主に先に規定したような単離されたDNA分子によりコードされたRNA分子をいう。あるいは、この用語は、その天然の状態で(すなわち、細胞又は組織内で)それが会合されている他の核酸から、精製された／分離されたRNA分子をいうことができる。単離されたポリヌクレオチド(DNA又はRNAのいずれか)は更に、生物学的手段又は合成手段により直接作製され、かつその作製時に存在する他の成分から分離された分子を表すことができる。
本発明の抗原結合ポリペプチドの組換え作製の標準技術は、WO 2010/001251及びWO 2011/080350に説明されており、これらの内容は引用により全体が本明細書中に組み込まれている。
用語「宿主細胞」は一般に、培養された細胞株を指すことは留意すべきである。本発明の抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターが導入されているヒト全体は、本発明の範囲から明白に除外される。
重要な態様において、本発明はまた、本組換え抗原結合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド(例えば発現ベクター)を含む宿主細胞(又は無細胞発現システム)を、該抗原結合ポリペプチドの発現が可能である条件下で培養すること、並びに発現された抗原結合ポリペプチドを回収することを含む、組換え抗原結合ポリペプチドを作製する方法を提供する。この組換え発現プロセスは、ヒト治療上の使用が意図されたモノクローナル抗体を含む、本発明の抗原結合ポリペプチドの大規模製造において使用することができる。インビボでの治療上の使用に適した組換え抗体の大規模製造に好適なベクター、細胞株及び製造プロセスは、一般に当該技術分野において入手可能であり、かつ当業者には周知であろう。
本発明の更なる態様は、本発明の抗原結合ポリペプチドを備える診断キットなどを含む、試験キット、並びにまた本発明の抗原結合ポリペプチドを含有する医薬製剤に関係している。
本抗原結合ポリペプチドが診断用途を意図される場合、例えば本抗原結合ポリペプチドが、病態又は疾患易罹患性のバイオマーカーである抗原に特異的である場合、試験キットの構成要素として本抗原結合ポリペプチドを供給することは都合が良い。診断試験は典型的には、ELISA、放射免疫測定、Elispotなどの標準の免疫学的検定の形をとる。そのような試験キットの構成要素は、試験又はアッセイの性質に応じて変動することができ、これは本発明の抗原結合ポリペプチドを使用し実行することが意図されているが、典型的には本発明の抗原結合ポリペプチドを使用する免疫学的検定を実行するのに必要とされる追加試薬を含む。診断薬としての使用のための抗原結合ポリペプチドは、例えば、蛍光部分、酵素標識、又は放射標識などの、顕在化する標識を保持することができる。
インビボにおける治療上の使用が意図された抗原結合ポリペプチドは、典型的には、1種以上の医薬として許容し得る希釈剤、担体又は賦形剤と一緒に、医薬剤形に製剤される(「レミントン薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」、第16版、Osol, A.編集、1980)。本発明の抗原結合ポリペプチドは、典型的には、それを必要とする哺乳動物対象へ、典型的にはヒト患者へ、静脈内に、又は筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、腫瘍内、経口、腫瘍周辺、皮下、関節滑液嚢内、髄腔内、局所、舌下又は吸入経路により投与されるべき、無菌の水溶液として製剤される。疾患の予防又は治療のための適量の抗原結合ポリペプチドは、治療される疾患の型、疾患の重症度及び臨床経過に加え、患者の年齢、体重及び病歴により左右され、かつ担当医の判断により決定されるであろう。
（抗原結合ポリペプチド作製プロセス）
本発明の重要な態様は、関心対象の標的抗原に対する高親和性抗原結合ポリペプチド、具体的にはモノクローナル抗体を作製するプロセスに関し、ここで該標的抗原は、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である。
従って本発明のプロセスは、標的抗原に特異的に結合する組換え抗原結合ポリペプチドを調製することであり、該抗原結合ポリペプチドは、VHドメイン及びVLドメインを含み、ここでVHドメイン又はVLドメインにおける少なくとも一つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)は、ラクダ科ファミリーの種から得られ、該プロセスは：
(a)ラクダ科ファミリーの種を(標的抗原により)免疫化し、これにより該標的抗原に対する通常型抗体を生じる工程；
(b)該標的抗原と免疫反応性であるラクダ科通常型抗体のVH及び／又はVLドメインの少なくとも一つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)をコードしているラクダ科核酸を単離する工程；
(c)工程(a)において単離された核酸によりコードされた超可変ループ(複数)又は相補性決定領域(複数)と同一のアミノ酸配列を有する、超可変ループ(複数)又は相補性決定領域(複数)をコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを調製する工程であって、このポリヌクレオチドが、該標的抗原と免疫反応性である(又はこれに特異的に結合する)VHドメイン及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチドをコードしている、前記工程；並びに
(d)工程(c)の組換えポリヌクレオチド由来の該抗原結合ポリペプチドを発現する工程であって、ここで該抗原結合ポリペプチドが、パート(b)のラクダ科通常型抗体とは同一ではなく、該標的抗原は、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原であることを特徴とする、前記工程：を含む。
このプロセスの第一工程は、標的抗原に対する免疫応答を誘発するために、ラクダ科ファミリーの種を能動免疫化し、これにより標的抗原と免疫反応性であるラクダ科動物の通常型抗体を生じることに関与している。ラクダ科動物の免疫化のプロトコールは、付随する実施例において説明されている。免疫化に使用される抗原性物質は、標的抗原の精製された型、例えば組換え発現されたポリペプチド、又はそれらの免疫原性断片であることができる。しかし標的抗原を発現又はコードしている単離された細胞若しくは組織の調製品、細胞溶解液、細胞上清若しくは細胞膜などの画分、又はそれらの表面上に抗原を含む脂肪粒子(lipoparticle)、ビーズ、ベシクル若しくは他の粒子などのような標的抗原の粗調製品により、あるいは標的抗原をコードしているポリヌクレオチド(DNA免疫化)により、免疫化することも可能である。本プロセスは典型的には、ラクダ科ファミリーの種の動物(非限定的に、ラマ及びアルパカを含む)の免疫化に関与し、かつ有利なことにこれらの動物は、完全に非近交系集団に属している。しかしラクダ科の通常Ig遺伝子座、又は少なくともそれらの一部を含むトランスジェニック動物(例えば、トランスジェニックマウス)を使用することも意図されている。
ラクダ科動物の能動免疫化を基にしたプロセスの重要な利点は、ラクダ科の全ての種は、個々の動物が異なる遺伝的背景を有する大きい非近交系集団で維持され得るという事実に端を発する。従って、そこから可能性のある抗原結合分子の多様なプールを得ることができる関心対象の抗原に対する強力かつ多様な免疫応答を誘発するために、能動免疫化を使用することが可能である。付随する実施例に例示するように、ラクダ科動物の能動免疫化は、高度な免疫多様性を持つ高度に保存された標的抗原(例えば、ラクダ科動物ポリペプチドと90％を超えるアミノ酸配列同一性を共有するポリペプチド抗原)に結合するFab断片を作製することができる。
標的抗原による能動免疫化後、末梢血リンパ球又はリンパ節若しくは脾臓の生検材料などの生検材料を、免疫化された動物から単離し、かつ標的抗原に対する通常型ラクダ科動物抗体の産生についてスクリーニングすることができる。パニング又はFACS選別を使用する濃厚化などの技術を、この段階で使用し、実施例に例示されたように、スクリーニングされるべきB細胞レパトアの複雑度を低下することができる。その後抗原-特異性B細胞が選択され、かつ総RNA抽出及び後続のcDNA合成に使用される。(標的抗原に特異的な)未変性のラクダ科動物のVH及びVLドメインをコードしている核酸は、PCRにより単離することができる。
ラクダ科動物のVH及びVLドメインをコードしている核酸は、本発明の抗原結合ポリペプチドの作製のために、発現ベクターへ直接クローニングすることができる。特にこれらの配列は、キメラ抗体を作製するために、同じくヒト抗体定常領域、又はその一部をコードしている発現ベクターへ、クローニングすることができる。しかし典型的には、ヒト定常領域配列のクローニング及び発現の前に、単離されたラクダ科動物VH及びVL配列に対し、更なる操作が実行される。
第一の工程として、候補ラクダ科動物VH及びVL配列(能動免疫化後に単離された)を使用し、ラクダ科動物のライブラリー(例えば、付随する実施例に記載されるようなFabライブラリー)を調製することができる。その後このライブラリーは、標的抗原への結合に関して(例えば、ファージディスプレイを使用し)スクリーニングすることができる。有望なリード候補は、例えば、Biacore又は好適なバイオアッセイを使用し、標的抗原結合に関して更に試験することができる。最後に、最も有望なリードのVH及びVLドメインをコードしている配列を、ヒト抗体定常領域をコードしている配列とのインフレーム融合としてクローニングすることができる。
(ラクダ科動物-由来)HV／CDRをコードするため(例えば、本発明の抗原結合ポリペプチドの組換え発現のため)に使用されるポリヌクレオチド配列は、ラクダ科動物のHV／CDRを天然にコードしている未変性のポリヌクレオチド配列と同一であることは必須ではない。従って本発明は、コードされたアミノ酸配列を変更しない、クローニング及び／又は発現に関連したポリヌクレオチド配列におけるコドン最適化及び他の変化を包含／可能にしている。
特定の実施態様において、「鎖シャッフリング」は、ライブラリーを作製するために、関心対象の抗原に結合することが分かっている特定の可変ドメインを、反対型の可変ドメインのセットの各々と対合するように(すなわち、VLライブラリーと対合されたVH、又は逆も同様)行われ、かつ得られたVH／VLの組合せは、抗原結合親和性及び／又は特異性について試験される。あるいは、VHドメインのライブラリーは、無作為に又は階層様式のいずれかで、VLドメインのライブラリーと対合され、かつ得られた組合せが試験される(Clacksonらの文献、Nature, Vol. 352. pp624-638, 1991を参照されたい)。このプロセスにおいて、ライブラリーは、関心対象の抗原に対し免疫性を提示しているラクダ科動物(能動免疫化された動物を含む)由来の再編成されたVH及びVL(Vκ又はVλ)のライブラリーであることができる。鎖シャッフリングプロセスは、免疫多様性を増大し、かつ著しく増強された親和性による対合を生じることができる。
本発明のプロセスにおいて、「未変性の」ラクダ科動物-由来VH及びVLドメインは、典型的にはフレームワーク領域内に、1個以上の選択的アミノ酸置換が導入されるタンパク質操作に供される。そのような置換を「野生型」ラクダ科動物配列へ導入する理由は、(i)フレームワーク領域のヒト化、(ii)安定性、生物学的利用能、生成物の均一性、組織透過性などの向上、又は(iii)標的抗原結合の最適化であることができる。
フレームワーク領域内の1個以上のアミノ酸残基の選択的置き換えによるラクダ科動物-由来VH及びVLドメインの「生殖系列化」は、良く確立された原理により実行することができる(その内容が具体的に引用により本明細書中に組み込まれている、WO 2010/001251及びWO 2011/080350に例示されたように)。いずれか所定のVHドメイン、VLドメイン又はそれらの組合せの許容し得る「生殖系列化」を実現するために行われたアミノ酸変化の正確な同一性は、場合毎に変動し、これは、ラクダ科由来のフレームワーク領域の配列、及びこれらのフレームワーク領域と最も近い並置されたヒト生殖系列(又は体細胞変異された)フレームワーク領域の間との出発の相同性により左右され、また抗原結合部位を形成する超可変ループの配列及び高次構造により左右される可能性もあるからであることは理解されるであろう。生殖系列化プロセスの全般的目的は、VH及びVLドメインが、ラクダ科によりコードされた親のVH及びVLドメイン(例えば、能動免疫化により得られたラクダ科動物のVH／VL)により形成される抗原結合部位の特異性及び親和性を維持しつつ、ヒト対象へ導入された場合に、最小の免疫原性を示す分子を作製することである。
（ライブラリー構築の方法）
関連した態様において、本発明はまた、ラクダ科通常型抗体のVH及びVLドメインをコードしている発現ベクターのライブラリーを作製するプロセスも包含しており、該方法は：
a)ラクダ科動物を能動免疫化し、これにより、標的抗原に対する通常型ラクダ科動物抗体を生じる工程；
b)該免疫化されたラクダ科動物由来のリンパ系組織(例えば、循環B細胞)を含有する試料から、cDNA又はゲノムDNAを調製する工程；
c)該cDNA又はゲノムDNAの領域を増幅し、増幅された遺伝子セグメントを得る工程であって、各遺伝子セグメントが、ラクダ科通常型抗体のVHドメインをコードしているヌクレオチドの配列又はVLドメインをコードしているヌクレオチドの配列を含む、前記工程；並びに
d)発現ベクターへc)において得られた遺伝子セグメントをクローニングし、その結果各発現ベクターが、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、並びに該VHドメイン及び該VLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示し、これにより発現ベクターのライブラリーが得られ、該標的抗原が、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原であることを特徴としている工程：を含む。
前記「ライブラリー構築」の方法はまた、前述の、本発明の抗原結合ポリペプチドの作製のための一般的プロセスの一部を成すこともできる。従って本発明のこの態様に関連して好ましい又は有利であると説明された特徴はまた、特に指定しない限りは、一般的プロセスに関連して好ましい又は有利であるとみなすことができ、逆もまた同様である。
一実施態様において、工程a)において増幅された核酸は、ラクダ科動物のリンパ系組織から調製された、cDNA又はゲノムDNAを含み、該リンパ系組織は、B細胞、リンパ節、脾細胞、骨髄細胞の1種以上、又はそれらの組合せを含む。循環B細胞が、特に好ましい。末梢血リンパ球(PBL)は、通常型ラクダ科動物抗体のVH及びVLドメインをコードしている核酸の給源として使用することができ、すなわち、PBL試料中に直接増幅することが可能であるのに十分な量の血漿細胞(抗体を発現している)が存在する。PBLは、動物(ラクダ科動物)から採取された全血試料から調製することができるので、このことは利点である。これは、組織生検標本(例えば、脾臓又はリンパ節から)を得るために侵襲的手順を使用する必要性がなく、かつこの試料採取手順は、動物への最低の影響で、必要に応じ頻繁に繰り返すことができることを意味する。例えば、ラクダ科動物を能動免疫化し、この動物から第一の血液試料を採取し、かつPBLを調製し、その後同じ動物を同じ抗原の「追加免疫」投与量又は異なる抗原のいずれかにより、2回目に免疫化し、次に第二の血液試料を採取しPBLを調製することは、可能である。
従ってこの方法の特定の実施態様は、以下に関与している：ラクダ科動物由来のPBLを含む試料調製すること、PBLからcDNA又はゲノムDNAを調製すること、及びこのcDNA又はゲノムDNAを、ラクダ科動物通常型抗体のVH又はVLドメインをコードしている遺伝子セグメントの増幅の鋳型として使用すること。一実施態様において、リンパ系組織(例えば、循環B細胞)は、本明細書において別所記載のように、能動免疫化されたラクダ科動物から得られる。好都合なことに、総RNA(又はmRNA)は、リンパ系組織試料(例えば、末梢血細胞又は組織生検標本)から調製され、かつ標準技術によりcDNAへ変換され得る。ゲノムDNAを出発材料として使用することも可能である。
本発明のこの態様は、多様なライブラリーアプローチ、及びライブラリー構築のためのB細胞選択アプローチの両方を包含している。多様なライブラリーアプローチにおいて、VH及びVL-コードしている遺伝子セグメントのレパトアは、予めB細胞選択を行わずに、リンパ系組織から調製された核酸から増幅することができる。B細胞選択アプローチにおいて、所望の抗原-結合特性を伴う抗体を展示しているB細胞は、核酸抽出並びにVH及びVL-コードしている遺伝子セグメントの増幅の前に選択することができる。
様々な従来の方法を使用し、所望の抗原-結合特性を伴う抗体を発現しているラクダ科動物B細胞を選択することができる。例えば、B細胞は、蛍光標識されたモノクローナル抗体(mAb、ラマ又は他のラクダ科動物由来の通常型抗体を特異的に認識する)により、及び別の蛍光色素により標識された標的抗原により、通常のIgGの細胞表面展示のために染色することができる。個々の二重陽性B細胞は次に、FACSにより単離され、かつ個々の細胞から総RNA(又はゲノムDNA)抽出される。あるいは細胞は、インビトロ増殖に供することができ、かつ分泌されたIgGを含む培養上清はスクリーニングされ、かつ総RNA(又はゲノムDNA)が陽性細胞から抽出され得る。より更なるアプローチにおいて、個々のB細胞は、特異的遺伝子により形質転換されるか、又は腫瘍細胞株と融合され、「自在に」成長することができる細胞株を作出し、引き続きこれらの細胞から、総RNA(又はゲノムDNA)が調製される。
FACSによる選別の代わりに、通常のIgGを発現している標的特異的B細胞を、(ラクダ科動物通常型抗体に向けられた)固定されたモノクローナル抗体において、引き続き固定された標的抗原において、「パニング」することができる。RNA(又はゲノムDNA)は、抗原特異的B細胞のプールから抽出することができるか、又はこれらのプールは、形質転換され、個別の細胞が、限定希釈又はFACSによりクローニングされ得る。
B細胞選択法は、陽性選択、又は陰性選択に関与している。いかなるB細胞選択も伴わない多様なライブラリーアプローチ又はB細胞選択アプローチのいずれを使用するかにかかわらず、個別のVHドメイン又はVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを増幅するために、リンパ系組織から調製された核酸(cDNA又はゲノムDNA)は、増幅工程に供される。
リンパ系組織(例えば、末梢B細胞又は組織生検標本)から抽出された総RNAは、ランダムプライミングされたcDNAへ変換できるか、又はオリゴdTプライマーは、cDNA合成に使用することができ、あるいはIg特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、cDNA合成に適用することができるか、又はmRNA(すなわちポリA RNA)は、cDNA合成の前に、オリゴdTセルロースにより、総RNAから精製することができる。B細胞から単離されたゲノムDNAは、PCRに使用することができる。
少なくともVH又はVLをコードしている重鎖及び軽鎖(カッパ及びラムダ)遺伝子セグメントのPCR増幅は、CH1又はCカッパ／Cラムダ領域の3’末端へのプライマーアニーリングと組合せ、可変領域の5’末端にアニーリングしているFR1プライマーにより行うことができ、これにはこれらの定常領域プライマーについて、各型にただ一つのプライマーが必要とされるという利点がある。このアプローチは、ラクダ科動物Fabがクローニングされることを可能にする。あるいは、可変領域の3’末端にアニーリングしているFR4プライマーのセットを使用し、再度Fab(ベクターにコードされた定常領域に融合された)又はscFv(単鎖Fv、その重鎖及び軽鎖可変領域が、柔軟なリンカー配列を介して連結されている)としてクローニングすることができ；あるいは、これらの可変領域は、発現ベクターにおいてクローニングされ、哺乳動物細胞上に展示された完全長IgG分子の産生を可能にする。
一般に、増幅は二工程で行われる：第一の工程においては、タグ付けしないプライマーにより、大量のcDNAを使用し(多様性を維持するため)、並びに第二の工程においては、アンプリコンは、クローニングのために5’側に導入された制限部位を伴う延長されたプライマーである、タグ付けしたプライマーによりわずかに数サイクルのみで再増幅される。第一の増幅工程(タグ付けしないプライマー)で作製されたアンプリコンを、第二の増幅工程の前に、過剰なプライマーを除去するために、ゲル精製してよい。あるいはプロモーター配列が導入され、これはリボソーム展示のためのRNAへの転写を可能にする。制限部位の代わりに、Cre-Lox部位又はTOPO部位のような、組換え部位を導入することができ、これは、好適なベクターへの位置指定挿入を可能にする。
ラクダ科動物の通常型VH及びVLドメインをコードしている増幅された遺伝子セグメントは次に、機能性抗原結合ポリペプチドとしてのVH／VL組合せの発現に適したベクターへと、クローニングすることができる。例として、B細胞のプール(又はB細胞選択に供されない他のリンパ系組織)由来の増幅されたVHCH1／VKCK／VLCL遺伝子セグメントは、最初に個々のライブラリー(一次ライブラリー)として個別にクローニングされ、次に第二の工程において、軽鎖断片を切断し、及びこれらを重鎖断片をコードしているベクターへ連結することにより、Fab又はscFVライブラリーを集成することができる。この二工程手順は、PCR産物のクローニングは、相対的に不充分であるので(制限酵素による適性の低い消化のため)、大きいライブラリーの作製を裏付けている。scFvをコードしているDNA断片は、アンプリコン内の配列における小さい重複を基にした、オーバーラップ伸長-スプライシング(SOE)PCRにより作製され；PCRにおいてVH及びVLをコードしているアンプリコンの、リンカーをコードしている小型のDNA断片との混合により、その重複する配列のために、単独のDNA断片が形成される。
VH及びVL-コードしている遺伝子セグメントを含むアンプリコンは、ファージベクター又はファージミドベクターにおいて、クローニングすることができ、これはファージディスプレイベースの選択法を使用することにより、標的特異的抗体断片の選択を可能にする。あるいは、アンプリコンは、酵母細胞上(Fab、scFv又は完全長IgGとして)又は哺乳動物細胞上(IgGとして)での展示を可能にする発現ベクターへクローニングすることができる。
他の実施態様において、T7(又は他の)プロモーター配列及びリボソーム結合部位が、増幅のためのプライマーに含まれているリボソームディスプレイのためのアンプリコンを使用し、クローニングを避けることができる。標的抗原への結合を選択した後、プールはクローニングされ、かつ個々のクローンが分析される。理論的に、ファージディスプレイライブラリーアプローチとは対照的に、このアプローチを使用すると、比較的大きい免疫レパトアを得ることができ、その理由は、ファージによるライブラリーのクローニング及び選択は、1010〜1012個のクローンに限定されるからである。
B細胞選別を適用する場合、個々の標的特異的B細胞のVH又はVL-コードしている遺伝子セグメントを含むアンプリコンは、抗体断片(scFV若しくはFab)又は更には完全長IgGの作製のために、細菌又は哺乳動物の発現ベクターへ、直接クローニングすることができる。
特に「ライブラリー構築」プロセスの非限定的実施態様において、本発明は、ラクダ科動物通常型抗体のVH及びVLドメインをコードしている発現ベクターのライブラリーを作製する方法を提供し、該方法は：
a)ラクダ科動物を能動免疫化し、これにより、標的抗原に対する通常型ラクダ科動物抗体を生じる工程；
b)該免疫化されたラクダ科動物(非限定的にラマ又はアルパカを含む)由来のリンパ系組織(例えば、循環B細胞)を含有する試料から、cDNA又はゲノムDNAを調製する工程；
c)該cDNA又はゲノムDNAの領域を増幅し、増幅された遺伝子セグメントを得る工程であって、各遺伝子セグメントが、ラクダ科動物の通常型抗体のVHドメインをコードしているヌクレオチドの配列又はVLドメインをコードしているヌクレオチドの配列を含む、前記工程；並びに
d)発現ベクターへc)において得られた遺伝子セグメントをクローニングし、その結果各発現ベクターが、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、並びに該VHドメイン及び該VLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示し、これにより、該抗原結合ポリペプチドが、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原に特異的に結合することを特徴としている発現ベクターのライブラリーが得られる工程：を含む。
前述の方法は、例えば、scFV、Fab又は完全長抗体の形で、機能的抗原-結合ポリペプチドとしての、VH／VL組合せの発現に適した、ラクダ科動物-コードされたVH及びVLドメイン(特にラマ及びアルパカのVH及びVLドメイン)のライブラリーを調製するために使用することができる。
前述のプロセスに従い調製され、ラクダ科動物(非限定的にラマ又はアルパカを含む)のVH及びVLドメインをコードしている発現ベクターのライブラリーはまた、本発明の主題の一部を形成している。
特定の実施態様において、本発明は、Fab又はscFV分子をコードしているファージベクターのライブラリーを提供し、ここでこのライブラリーにおいてコードされたFab又はscFVの各々は、ラクダ科動物通常型抗体のVHドメイン及びラクダ科動物通常型抗体のVLドメインを含む。
一実施態様において、このライブラリーは、ライブラリー内のクローンの大半は、独自のアミノ酸配列のVHドメインか、及び／又は独自のアミノ酸配列のVLドメインをコードしている、「多様な」ライブラリーであり、これはラクダ科動物VHドメイン及びラクダ科動物VLドメインの多様なライブラリーを含んでいる。従って、多様なライブラリー中のクローンの大部分(例えば＞90％)は、VHドメイン及び／又はVLドメインのアミノ酸配列に関して、同じライブラリー中にコードされたいずれの他のVH／VL対合とも異なる、VH／VL対合をコードしている。
本発明はまた、ラクダ科動物(例えば、ラマ又はアルパカ)の単独の選択されたB細胞から単離された、VH及びVL-コードしている遺伝子セグメントを含む発現ベクターを包含している。
更なる態様において、本発明はまた、標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する方法を提供し、この方法は：
i)発現ベクターのライブラリーを提供する工程であって、ここで該ライブラリー内の各ベクターは、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、ここで該VHドメイン又は該VLドメインの少なくとも一つは、ラクダ科動物通常型抗体に由来し、かつ該ライブラリー内の各ベクターは、該VHドメイン及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示する、前記工程；
ii)該標的抗原との免疫反応性に関して該ライブラリーによりコードされた抗原結合ポリペプチドをスクリーニングし、これにより該標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程であって、抗原結合ポリペプチドが、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原へ特異的に結合することを特徴としている、前記工程：を含む。
本発明のこの方法は、標的抗原と免疫反応性であるクローンのスクリーニング／選択を包含し、その標的抗原は、VH／VL対合をコードしているクローンのライブラリーからの、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である。この方法はまた、前述のライブラリー構築法を用いて実行することができる、ライブラリー構築も包含している。任意の下流のプロセッシング／最適化工程は、以下に説明するように、選択されたクローンについて行うことができる。この選択及びスクリーニング方法はまた、前述のような、本発明の抗原結合ポリペプチドの作製の一般的プロセスの一部を成すことができる。従って本発明のこの態様に関連して好ましい又は有利であると説明された特徴はまた、特に指定しない限りは、一般的プロセスに関連して好ましい又は有利であるとみなすことができ、逆もまた同様である。
（標的抗原と免疫反応性のクローンのスクリーニング及び選択）
スクリーニング／選択は典型的には、ライブラリー中のクローンによりコードされた発現産物(すなわち、抗原結合ポリペプチドの形のVH／VL対合、例えば、Fab、scFV又は抗体)の、標的抗原との接触、並びに所望の抗原結合の特徴、すなわち該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原への結合の特徴を示すVH／VL対合をコードしている1以上のクローンの選択が関与している。
ファージディスプレイライブラリーは、固定された標的抗原上で又は可溶性(多くはビオチン化された)標的抗原上で選択することができる。Fabフォーマットは、そのモノマー性の出現及びファージ上のその一価の展示のために、親和性に駆動された選択が可能であるが、これは、scFv(凝集及びファージ上の多価ディスプレイの結果として)及びIgG(二価のフォーマット)については可能ではない。標的特異的結合物質(binder)の十分な濃厚化を得るために、典型的には2〜3回の選択ラウンドが必要とされる。
親和性に駆動される選択は、選択の次のラウンドにおいて標的抗原の量を減少することにより実行することができるのに対し、ビオチン化されない標的による延長された洗浄は、極めて良好な親和性を持つ結合物質の同定を可能にする。
この選択手順は、使用者が、あるエピトープを目指すことを可能にし；固定された標的からファージクローンを溶離する古典的方法は、抗体断片及び／又は標的を変性するpHショックを基にしているのに対し、標的抗原又は可溶性受容体又はサイトカインに対する参照mAbとの競合は、該標的の関連エピトープへ結合する抗体断片を展示しているファージの溶離につながる(これは当然、B細胞選択法を含む、更なる他の展示システムに適用可能である)。
選択の結果から採取された個別のクローンを、細胞から、又はそれらへと細胞から該断片が「漏出した」培養上清から調製されたペリプラズム画分を使用する、抗原-結合ポリペプチド(例えば抗体断片)の小規模製造に使用することができる。発現は、誘導性プロモーター(例えば、lacプロモーター)により駆動され、これは誘導物質(IPTG)の添加時に、該断片の生成が開始されることを意味する。リーダー配列は、該断片のペリプラズムへの輸送を確実にし、そこでこれは適切に折り畳まれ、分子内ジスルフィド橋が形成される。
得られる粗タンパク質画分は、ELISAなどの、標的結合アッセイにおいて使用することができる。結合試験に関して、個々のクローンから調製されたファージを使用し、概して非常に低い結合シグナルを生じる、低い発現収量のFabを回避することができる。これらのタンパク質画分はまた、拮抗性抗体を同定するための、インビトロにおける受容体−リガンド結合アッセイを用い、スクリーニングすることができ；ELISAベースの受容体−リガンド結合アッセイを使用することができ、またAlphascreenのようなハイスループットアッセイが可能である。スクリーニングは、受容体を過剰発現している細胞株の膜画分が固定されている、放射標識されたリガンド結合アッセイにおいて行うことができ；このアッセイは、わずかにピコモル量の放射性サイトカインが必要とされるので、極めて感度が良く、このことは粗タンパク質画分中に存在する微量の拮抗性Fabが、正の測定値を生じることを意味している。あるいは、FACSは、蛍光標識されたサイトカインの細胞上に発現されたその受容体への結合を阻害する抗体のスクリーニングに適用することができる一方、FMATは、このハイスループット改変型である。
ペリプラズム画分中に存在するFab、又はそのヘキサヒスチジンタグ上のIMACによるか若しくはプロテインG(FabのCH1ドメインへ結合することがわかっている)により部分的に精製されたFabは、細菌の不純物に対し感受性がない細胞を使用するバイオアッセイにおいて直接使用することができ；あるいは、個別の大腸菌細胞由来のFabは、Fab又はIgGの発現のために、哺乳動物システムにおいて再クローニングし、引き続きバイオアッセイにおいてスクリーニングすることができる。
陽性発現ベクタークローン、すなわち所望の標的抗原へ結合する機能性VH／VL組合せをコードしているクローンの同定後、可変領域のヌクレオチド配列を決定し、コードされたVH及びVLドメインのアミノ酸配列を推定することは、慣習的方式である。
望ましいならば、Fab(又はscFV)コード領域を、代替の発現プラットフォーム、例えば、細菌の発現ベクター(ファージディスプレイに必要なgene 3を持たない以外は、ファージミドベクターと同じ)へ再クローニングし、これは、大量のコードされた断片が生成されかつ精製されることを可能にする。
標的結合の親和性は、精製されたFab(又はscFV)について、表面プラズモン共鳴(例えば、Biacore)によるか又は他の方法を介して決定し、中和効力は、インビトロ受容体−リガンド結合アッセイ及び細胞ベースのアッセイを用いて試験することができる。
抗原-結合のファミリー、及び特に拮抗性Fab(又はscFV)は、配列解析(主にVH、特にVHドメインのCDR3の長さ及びアミノ酸配列)を基に同定され得る。
(効力最適化)
所望の標的抗原に対する親和性を伴うVH／VL組合せをコードしているものとして、スクリーニング／選択により同定されたクローンは、望ましい場合は、親和性及び／又は中和効力が最適化される下流の工程に供することができる。
各VHファミリーの最も性能の良いメンバーの効力最適化は、軽鎖シャッフリング、重鎖シャッフリング又はそれらの組合せを介して実現し、これにより動物において天然に生じる親和性変種を選択することができる。これは、同じ免疫化された動物から調製された当初のライブラリーを使用し、鎖シャッフリングを実行し、これにより同じ免疫化された動物において生じた親和性変種をスクリーニングすることは可能であるので、当初のラクダ科動物VH／VLドメインが、能動免疫化されたラクダ科動物から選択される実施態様において特に有利である。
軽鎖シャッフリングに関して、望ましい抗原結合特性(例えば、拮抗性Fab)を伴うVH／VL対合のVH領域(又はVHCH1)をコードしている遺伝子セグメントを使用し、この単独のVH-コードしている遺伝子セグメントが、クローンが当初選択されたライブラリーの軽鎖レパトアと組合せられるライブラリーを構築することができる。例えば、VH-コードしているセグメントが、標的抗原に対する免疫応答を惹起するために、能動免疫化されたラクダ科動物から調製されたライブラリー(例えば、Fabライブラリー)から選択された場合は、その「鎖シャッフリング」ライブラリーは、このVH-コードしているセグメントを、同じ免疫化されたラクダ科動物の軽鎖(VL)レパトアと組合せることにより構築することができる。得られるライブラリーは、次に、標的抗原の選択に供されるが、ストリンジェント条件下で(低濃度の標的、溶液中のビオチン化されない標的による過度の洗浄)、最良の親和性変種の単離を確実にする。ペリプラズム画分の解離速度(off-rate)スクリーニングもまた、改善されたクローンの同定を補助することができる。配列解析及び細菌性産生ベクターへの再クローニングの後、精製され選択されたFabは、親和性(例えば、表面プラズモン共鳴により)及び効力(例えば、バイオアッセイにより)について試験することができる。
重鎖シャッフリングは、軽鎖シャッフリング後に選択されたクローンの軽鎖(VL)をコードしている遺伝子セグメントの、同じ動物由来の当初の重鎖ライブラリー(それから当初のVH／VL-コードしているクローンが選択された)への戻しクローニングにより実行することができる。あるいは、CDR3特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、VH領域のファミリーの増幅に使用することができ、これは、拮抗性Fabの軽鎖と組合せたレパトアとしてクローニングすることができる。親和性に駆動される選択及び解離速度スクリーニングは次に、該ファミリー内で最良の性能を発揮するVHの同定を可能にする。
軽鎖シャッフリング工程及び重鎖シャッフリング工程は、実際に、いずれかの順番で行われる、すなわち、軽鎖シャッフリングが最初に行われ、それに重鎖シャッフリングが続くか、又は重鎖シャッフリングが最初に行われ、それに軽鎖シャッフリングが続くことは、理解されるであろう。両方の可能性が、本発明の範囲に包含されている。他の状況において、軽鎖シャッフリング及び重鎖シャッフリングの両方を行うことは、必要とはされず、軽鎖シャッフリングのみ又は重鎖シャッフリングのみ関与するそのようなプロセスも、包含されている。
改善された親和性及び効力を持つVH／VL対合(例えばFab)の軽鎖又は重鎖から、特にCDRの配列を使用し、個々のFabの変異が組合せられている操作された変種を作製することができる。変異は、付加によることが多いことが知られており、このことはこれらの変異の組合せは、更により増大した親和性に繋がり得ることを意味する。
（ヒト治療上の使用のための生殖系列化及びフォーマット化）
望ましい抗原-結合特性を示すVH／VL対合をコードしている選択された発現クローンのVH及びVL-コードしている遺伝子セグメント(例えば、scFV又はFabをコードしているファージクローン)を、下流のプロセッシング工程に供し、かつヒト治療上の使用に適した抗原結合ポリペプチドフォーマット(例えば、完全ヒト定常ドメインを伴う完全長抗体)をコードしているベクターなどの、代替の発現プラットフォームへ再クローニングすることができる。
有望な「リード」選択クローンは、VHドメイン及び／又はVLドメインをコードしているヌクレオチド配列へ、1つ以上の変化を導入するように、操作されることができ、この変化は、VHドメイン及び／又はVLドメインのコードされたアミノ酸配列を変更しても変更しなくてもよい。VH又はVLドメインの配列中のそのような変化は、生殖系列化又はヒト化、コドン最適化、増強された安定性、最適親和性などを含む、本明細書の別所に記載されたいずれかの目的のために操作することができる。
本明細書に記載の生殖系列化の一般的原理は、本発明のこの実施態様において同等に適用される。例として、ラクダ科動物-コードされたVH及びVLドメインを含むリード選択クローンは、ライブラリーアプローチを適用することにより、それらのフレームワーク領域(FR)内で生殖系列化されることができる。最も近いヒト生殖系列(VH及びVLについて)及びCDR1及びCDR2の同一のカノニカルフォールドを伴う他のヒト生殖系列とアラインメントした後、FR中の変更されるべき残基が確定され、かつWO 2010/001251及びWO 2011/080350に説明されたように、好ましいヒト残基が選択される。生殖系列化は、ラクダ科動物-コードされた残基の、最もマッチしているヒト生殖系列由来の同等の残基による置き換えに関連しているが、これは必須ではなく、かつ他のヒト生殖系列由来の残基を使用することもできる。
一旦リードVH及びVLドメインのアミノ酸配列(適切には、効力最適化後)がわかったならば、VH及びVLの合成遺伝子を設計することができ、ここでヒト生殖系列から逸脱した残基は、好ましいヒト残基により交換される(最も良くマッチしているヒト生殖系列由来の、又は他のヒト生殖系列に生じる残基により、更にはラクダ科動物野生型残基により)。この段階において、可変ドメインをコードしている遺伝子セグメントは、遺伝子合成時又は好適な展示ベクターにおけるクローニングのいずれかにより、Fabのヒト定常領域へと融合されている発現ベクターへと再クローニングされ得る。
得られるVH及びVL合成遺伝子は、Fabライブラリーへと組換えることができるか、又は生殖系列化されたVHは、野生型VLにより組換えられることができる(並びに、その逆も同様で、これは「ハイブリッド」ライブラリーと称される)。親和性に駆動された選択は、最良に機能する生殖系列化されたバージョンの単離を可能にし、「ハイブリッド」ライブラリーの場合、最良に機能する生殖系列化VHは、最良に機能する生殖系列化VLと組換えることができる。
生殖系列化されたFabに関するアミノ酸及びヌクレオチドの配列情報は、好ましいアイソタイプ(ADCC及びCDCに関してIgG1、限定されたエフェクター機能に関してIgG2、IgG2に関して一価の結合が必要とされる場合はIgG4)の完全長ヒトIgGの作製のために、コドン-最適化された合成遺伝子を作製するために使用することができる。加えて長期でない適用及び急性適応のために、更に細菌の又は哺乳動物の細胞が産生したヒトFabを作製することができる。
前述のプロセスの工程を組合せて、特に非限定的実施態様において、本発明は、標的抗原と免疫反応性であるキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製する方法を提供し、該方法は：
a)ラクダ科動物(非限定的にラマ又はアルパカを含む)を能動免疫化し、これにより、標的抗原に対する通常型ラクダ科動物抗体を生じる工程；
b)該免疫化されたラクダ科動物由来のリンパ系組織(例えば、循環B細胞)を含有する試料から、cDNA又はゲノムDNAを調製する工程；
c)該cDNA又はゲノムDNAの領域を増幅し、増幅された遺伝子セグメントを得る工程であって、各遺伝子セグメントが、ラクダ科動物の通常型抗体のVHドメインをコードしているヌクレオチドの配列又はVLドメインをコードしているヌクレオチドの配列を含む前記工程；
d)発現ベクターへc)において得られた遺伝子セグメントをクローニングし、その結果各発現ベクターが、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、並びに該VHドメイン及び該VLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示し、これにより発現ベクターのライブラリーを作製する工程；
e)該標的抗原との免疫反応性について、工程d)で得られたライブラリーによりコードされた抗原結合ポリペプチドをスクリーニングし、これにより該標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程；
f)軽鎖シャッフリング工程及び／又は重鎖シャッフリング工程を任意に実行し、該標的抗原と免疫反応性である効力-最適化された抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程；
g)工程e)若しくは工程f)において選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及び／又は工程e)若しくは工程f)において選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを、生殖系列化及び／又はコドン最適化に任意に供する工程；並びに
h)パートe)若しくはf)において選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント、又は工程g)において生成された生殖系列化及び／若しくはコドン最適化されたVH遺伝子セグメント、並びにパートe)若しくはf)において選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメント、又は工程g)において生成された生殖系列化及び／若しくはコドン最適化されたVL遺伝子セグメントを、ヒト抗体の1以上の定常ドメインをコードしているヌクレオチドの配列と機能的に連結されるよう、更なる発現ベクターへクローニングし、これによりヒト抗体の1以上の定常ドメインに融合されたVH及びVLドメインを含むキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製し、抗原結合ポリペプチドは、該標的抗原が、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原に特異的に結合することを特徴としている工程：を含む
本発明はまた、前述のプロセスに従い調製された発現ベクター、及び標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドを作製する方法に及び、該方法は：
a)前述の方法を使用し、標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを調製する工程；
b)該発現ベクターを、宿主細胞又は無細胞発現システムへと、コードされた抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、導入する工程；並びに
c)再度抗原結合ポリペプチドが、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％、又は少なくとも95％、96％、97％若しくは98％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原に特異的に結合することを特徴とする、発現された抗原結合ポリペプチドを回収する工程：を含む。
一実施態様において、前記プロセスは、組換え発現による、本発明の抗原-結合ポリペプチドのバルク生産規模の製造、特に医薬用活性物質として使用することを意図した治療用抗体のバルク規模の製造を包含している。そのような実施態様において、工程a)において調製された発現ベクター、及び工程b)において使用される宿主細胞／発現システムは、ヒト患者への投与が意図される組換え抗体の大規模製造に適するように選択される。この目的のための好適なベクター及び発現システムの一般的な特徴は、当該技術分野において周知である。
本発明は、以下の非限定的な実験的実施例を参照し、更に理解されるであろう。
（実験的実施例）
（実施例1−HMGB1に対する抗体）
（1.1 標的抗原）
この実施例の標的抗原は、ほぼ全ての細胞型の核及び細胞質に存在する、高度に保存された偏在性タンパク質である、高移動度群タンパク質ボックス1(HMGB1)であった。ヒト及びマウスのHMGB1は、アミノ酸長が215個であり、かつその配列は97％同一である。HMGB1は、非ヒストンクロマチン結合タンパク質であり、かつ遺伝子機能の調節因子であるが、これはまたアラルモン(alarmin)としても作用する。
HMGB1は、敗血症、SLE及びRAなどの、炎症状態と関連付けられ、また様々な癌とも関連付けられている。
この標的に取り組む理由の一つは、これは極めて保存された標的であり、かつ免疫系による抗自己抗体の除去のために、能動免疫化により抗体を生じることが難しいからである。HMGB1は、ヒトタンパク質とマウス／ラットタンパク質との間に、アミノ酸配列の97％同一性が存在するという事実により例証されるように、高度に保存されている。ヒトとラマのHMGB1ホモログの間の保存度を評価するために、ラマパコスの全ゲノムショットガン配列データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/206581138)上で、ヒトHMGB1配列について、BLAST検索を行った。これらの検索は、3つのゲノム配列を同定し、その一つは、最初の2つのエクソンを含み(配列ID：ABRR01273630.1)を含み、他のものは第四及び最後のエクソンをコードする(配列ID：ABRR01273631.1)のに対し、この遺伝子の中央部分は、別のヒットによりコードされ(配列ID：ABRR01227803.1)、これはラマHMGB1遺伝子の編成は、ヒト遺伝子の編成と同一であることを指摘している。ヒトとラマのHMGB1の間の全体の配列同一性は、96％であるが、全ゲノムショットガン配列データベース由来の配列は、完全に信頼できるものではなく、配列誤差を含み得ることは、強調されるべきである。
（1.2 ラマの免疫化）
4頭のラマを、組換えHMGB1(HMGBiotech社、HM114)により、フロイントの不完全アジュバントを使用し、免疫化した。最初の注射時に標的タンパク質80μgを投与し、引き続き標的タンパク質40μgの注射を隔週4回投与した。最後の注射後3日目に、PBL精製のために、血液400mlを採取した。
（1.3 Fabライブラリーの構築）
フロイントの不完全アジュバント中のHMGB1抗原により免疫化された4頭のラマから単離したPBLを、De Haard Hらの文献(J. Biol. Chem. 274, 1999)に説明された二段階クローニング戦略を使用し、ファージミド(pCB3)中のFabのRNA抽出、RT-PCR及びPCR-クローニングに使用した。抗体レパトアの増幅のために、WO 2010/001251に記載された増幅プライマーを適用した。
独立したVλCλ及びVκCκライブラリーを、タグ付けしないプライマーによる25サイクル、引き続きこれらのプライマーのタグ付け型(レパトアクローニングのための制限部位を含む)を用い10サイクルを行う、2段階PCRを用いて構築した。VHCH1ライブラリーを、同じ手法を用い、並行して作製した。VH、Vλ及びVκ遺伝子の増幅に使用したプライマーのセットは、WO 2010/001251に認めることができる。一次重鎖及び軽鎖ライブラリーは、pCB3において作製し、これらのライブラリーのサイズは、1×107〜3×108 コロニーの範囲であった。
次に、一次VλCλ及びVκCκライブラリー由来の挿入断片をコードしている軽鎖を、VHCH1-発現ベクターにおいて個別に再クローニングし、各々、「ラムダ」及び「カッパ」Fab-ライブラリーを作製した。完全長Fab挿入断片含有クローンの割合の分析によるこれらのライブラリーの品質管理は、PCRを用いて慣習的に行った。得られたFabライブラリーは、巨大であり、サイズが2〜9×108 コロニーであった。各ライブラリーから無作為に試験した多数のクローンは、完全長Fab配列を含み、このことは、これらのライブラリーが高品質であることを指摘している。
（1.4 HMGB1特異性Fabの選択）
ファージディスプレイを使用し、直接コーティングされたHMGB1へ結合しているラマFabの多様なパネルを動員した。4回の選択後、トリプシンによる溶離時に、良好な濃縮物が得られた。
これらの選択に起源する個別のクローンを、96-深型ウェルプレート(1ml発現)において増殖し、かつファージを調製し、かつファージ結合ELISAにおいて試験した。簡単に述べると、個別のクローンに由来するファージを、HMGB1(100ng／100μl、Genway社(10-663-46237))及びカゼインでコーティングされたウェル上でインキュベーションし、HMGB1への特異的結合をアッセイした。ファージ結合は、抗-M13-HRP抗体(GE Healthcare社、27-9421-01)を用いて検出した。
HMGB1に特異的に結合したクローンの配列多様性を試験するために、フィンガープリント分析を行った。従って、これらのクローンのFab-コードしている挿入断片を、標準PCR技術により増幅した。これらのPCR断片を、制限酵素HaeIII及びAluIにより消化し、これらの消化された試料を、2.5％アガロースゲル上を泳動した。一部のクローン／フィンガープリントは、複数回現れた(結果は示さず)が、全般的に多様性が高かった。
独自のフィンガープリントを有するクローンは再度、96-深型ウェルプレート(1ml発現)において増殖し、ファージ及びペリプラズム抽出物の両方を調製し、これらは各々、HMGB1結合に関して、ファージELISA及びFab ELISAにおいて再度試験した(データは示さず)。両方の場合において、ほとんどのクローンは再度、HMGB1結合に関して陽性とスコア付けされた。
VH、及びVλ又はVκ断片の両方の配列を、各クローンについて決定した。6種の異なるVHファミリーの合計を、HCDR3配列を基に入手し、これらは、VH及びVλ親和性変種を含み、すなわち体細胞変異を含む。Vλ又はVκ軽鎖を含む両方のクローンが認められた。
表1. 全てのHMGB1結合クローンに関する最も近いヒト生殖系列並びに％ヒト同一性及び％ヒト相同性
Figure 2015524404
（1.5 解離速度及びHMGB1特異性）
ペリプラズム抽出物を、独自の配列を有する全てのHMGB1結合クローンについて20mlスケールで調製した。これらのペリプラズム抽出物を、解離速度(off rate)に関して、HMGB1でコーティングされたCM5チップ上で、Biacoreにより試験した(表2、第2列参照)。
大規模発現(350mlスケール)を、選択されたクローンについて開始し、それからFabを、TALONビーズを使用するIMACにより精製した。精製したFabを再度、解離速度に関して、Biacoreにより試験した(表2第3列)。HMGB1と配列相同性が81％であるHMGB2により、同じチップをコーティングした。ペリプラズム抽出物及び精製したFabの両方のHMGB2に関する解離速度値も、表2に示している。
表2. ペリプラズム抽出物(periとコード化)及び精製した(pur)Fabに関するHMGB1／HMGB2によりコーティングされたCM5チップ上のBiacoreで決定した解離速度値
Figure 2015524404
（1.6 HMGB1及びHMGB2に対する反応性）
クローン2A1及び3F11の精製したFabを、結合ELISAにおいて試験し、Biacoreにより観察された異なるHMGB1／HMGB2結合特性を確認した(表2参照)。従って、HMGB1、HMGB2又はカゼインを、マイクロタイタープレート上に直接コーティングした。Fab結合を、抗-myc-HRP抗体(Imtec Diagnostics社、A190-105P)を用いて検出した。結果を、図1に示す。このELISAデータは、Biacoreにおいて観察されたように、HMGB2のSIMPLE抗体3F11との交差反応性プロファイル及びSIMPLE抗体2A1との交差反応性の欠如を確認している。
（1.7 抗-HMGB1抗体の拮抗特性）
精製したFab 2A1及び3F11を、HMGB1の結合について、そのリガンドRAGEと競合するそれらの能力について試験した。従って、HMGB1がコーティングされ、かつこの標的とRAGE-Fc融合体(R&D systems社、1145-RG)を相互作用させる、ELISAベースの結合アッセイを開発した。結合したRAGEは、HRP複合した抗-Fc抗体(Jackson ImmunoResearch社、109-035-008)により検出した。
クローン2A1及び3F11のFab及び無関係のFab(5μg／ml)を、HMGB1によりコーティングしたウェル中で、1時間インキュベーションし、その後RAGE-Fcを添加した(最終濃度200ng／ml)。図2に認められるように、HMGB1特異的Fab 2A1は、無試料又は無関係のFabを添加した場合よりも、はるかに低いシグナルを生じた。対照的に、HMGB2交差反応性Fab 3F11は、試料が添加されない対照ウェルに匹敵するシグナルを生じた。
Fab 2A1は、HMGB1のRAGEへの結合を拮抗するのに対し、Fab 3F11は、この相互作用に影響を及ぼさないと結論付けることができる。
（実施例2−ヒトサイトカイン抗原に結合するラマFabに対する抗イディオタイプ抗体）
（2.1 標的抗原）
この実施例の標的抗原は、サイトカインであるヒト標的タンパク質に特異的に結合する2種のラマ-由来モノクローナル抗体である。これらのモノクローナル抗体は、ヒト抗体の定常領域(Fc)によりフォーマットされたラマ-由来Fab領域(129D3／68F2及び111A7／61H7と記される)を含む。
Fab 129D3は、68F2と記されるラマ-起源のFabの生殖系列化変種である。このラマ-由来Fab 68F2はそれ自身、標的抗原(ヒトサイトカイン)による、完全に異種交配されたラマの免疫化により生じた。Fab 129D3は、最も近いヒト生殖系列との全体の配列同一性を最大95.2％まで増大するために、フレームワーク領域内に13個のアミノ酸置換を導入することにより、68F2から誘導された変種である。129D3及び68F2は、標的ヒト抗原に同じ結合特異性を示すが、Fab 129D3は、特に完全ヒトFc領域を伴うモノクローナル抗体としてフォーマットされた場合に、そのより高度なヒトFR配列同一性のために、ヒト治療薬としての使用により適している。129D3と68F2(VH及びVLの両方の全域で)の間の総アミノ酸配列同一性は、94％である。
第二のラマ-由来Fab 111A7は、61H7と記されるラマ-起源のFabの生殖系列化変種である。Fab 61H7も同じく、標的抗原(ヒトサイトカイン)による、完全に異種交配されたラマの免疫化により生じた。Fab 111A7は、最も近いヒト生殖系列との全体の配列同一性を最大96.3％まで増大するために、フレームワーク領域内に13個のアミノ酸置換を導入することにより、61H7から誘導された変種である。111A7及び61H7は、標的ヒト抗原に同じ結合特異性及び親和性／効力を示す。111A7と61H7(VH及びVLの両方の全域で)の間の総アミノ酸配列同一性は、93％である。
Fab 103A1は、61H7と同じヒトサイトカインに対し特異的である61H7の配列変種である。
特にFab 129D3又はFab 111A7を含むmAbの臨床試験時に必要とされる薬物動態(PK)試験を促進するために、Fab 129D3(すなわち、68F2の生殖系列化変種)及びFab 111A7(すなわち、61H7の生殖系列化変種)へ特異的に結合する、抗イディオタイプFab(又はmAb)の開発は、商業的に興味深い。
（2.2 ラマの免疫化）
モノクローナル抗体68F2及び61H7に対する抗イディオタイプ抗体の作製を最適化するために、抗体を最初に、ヒト定常領域をラマIgG1、すなわちラマの通常型抗体型の定常領域により置き換えるように操作した。この技術的特徴は、V領域に対する免疫応答は駆動するが、ラマFcに対しては駆動せず、このことは、ラマの免疫応答は、68F2及び61H7の特異的CDR(イディオタイプ)に対して集中されており、この抗体の定常領域に対してではないことを確証している。加えてラマIgG1のFcを含むモノクローナル抗体は、免疫化後にラマにおいて長い半減期を示し、このことはこの免疫原が、免疫系が反応をしかける(mount)ことを長期間補助することを意味する。ラマIgG1(重鎖)及びラマCカッパ及びCラムダの配列は、PCT公報WO 2011/001251に示されている。
標的モノクローナル抗体による能動免疫化のために、2頭のラマを使用した。ラマは、抗原(標的mAb)を、6週間にわたり、週1回を基本とする、頸部への筋肉内注射により受け取った。抗原は、1頭のラマについて毎週の注射のための500μl画分にアリコートとした。500μlは、最初の2週間について、抗原100μgを含んだ。残りの4週間の各注射は、50μg抗原／500μlを含んだ。この抗原は、PBS(リン酸緩衝食塩水)中に緩衝した。抗原は、mAb L68F2、L61H7及びL103A1の比2：1：1からなった。注射の前に、抗原を、フロイントの不完全アジュバント(IFA)と混合した。IFAは、パラフィン及びモノオレイン酸マンニドからなる。これは、抗原の寿命を延長し、かつ免疫系の重要な部位への輸送を増強する。これは、免疫応答を増幅する。
0日目、血清をラマから収集し、かつ40日目(最終免疫化の5日後)に、末梢血リンパ球(PBL)を含有する免疫血液400mlを収集した。末梢血リンパ球は、フィコール-パク勾配法での遠心分離により精製し、総RNA抽出のために使用した。
（2.3 ライブラリーの構築）
総RNAを、逆転写酵素を使用し、ランダムプライムされたcDNAへ変換し、かつ重鎖(VHCH1)及び2つの型の軽鎖(VκCκ及びVλCλ)をコードしている遺伝子配列を、このcDNAを鋳型として使用するPCRにより増幅した。2、3の中間体クローニング工程を使用し、pCB3ベクターにおいて、全ての異なるVHCH1アンプリコンが、全ての異なる軽鎖アンプリコンと組み合わされている、コンビナトリアルFabライブラリーを作製した。これは、κ-型軽鎖及びλ-型軽鎖の両方について行った。結果的に、これは、各ラマについて、2種のFabライブラリーを生じた：κ-ライブラリー及びλ-ライブラリー。
このライブラリーの好ましいサイズは、可能な限り包括的に完全抗体レパトアを対象とし、かつ当初のVH-VL組合せが存在する機会を生じるよう、75％を上回る正確な挿入比(correct-insert ratio)で、＞1×109 CFUであった。
（2.4 選択及びスクリーニング）
これらのFabライブラリー(プラスミド)を、細菌において形質転換し、これを引き続きVCSM13ヘルパーファージにより感染した。結果的に、大腸菌細胞は、感染した細菌に存在するファージミドゲノムによりコードされたFab断片の単独コピーを展示しているファージを産生しかつ分泌した。これらのファージは、細菌から、PEG精製法を用い、精製した。これらのファージを、選択に使用した。
（選択方法1：ヒト血清を使用する対抗選択を基にした方法：）
ヒト血清に対する対抗選択は、ヒト抗体上の共通エピトープを認識するライブラリーからFabを取り除くことを意図している。このライブラリーから調製されかつPEG沈殿により精製されたファージを、20％正常ヒト血清(IgG1およそ3mg／ml含有)／PBS中に10倍希釈し、かつヘッドオーバーヘッド式(head-over-head)回転装置において30分間インキュベーションし、その後この混合物100μlを、L68F2又はL61H7によりコーティングされたウェルへ移した。
選択方法1は、免疫化したラマ1頭に由来するκ及びλライブラリーについて行い、61H7(103A1)に対する、κ-ライブラリーからの8D6／8H7、及びλ-ライブラリーからの7C6／7B4／7C12に対する5種のFabを同定した。これら5種のFabを、特別な発現ベクター(pCB4)へ再クローニングし、更なる特徴決定のために適量のFabタンパク質を生成した。加えて、Fab 8H7及び7C6の可変ドメインを、ラマ及びヒトIgG1の定常ドメインに融合した。
（選択方法2：ヒト血清及び無関係のアイソタイプのヒトモノクローナル抗体(36C4)を使用する対抗選択を基にした方法：）
この対抗選択もまた、ヒト抗体上の共通エピトープを認識するライブラリーからFabを取り除くことを意図している。ファージを、20％正常ヒト血清中に10倍希釈し、ただ今回はヒトmAbを、濃度500μg／mlで添加した。
選択方法2は、68F2に対する1種のFabである11E1の同定を生じた。11E1 Fabの重鎖及び軽鎖可変ドメインを、ヒト及びラマIgG1の重鎖及び軽鎖定常ドメインへ融合した。hu11E1と称されるヒトIgG1フォーマット及びla11E1と称されるラマIgG1を両方共、HEK293細胞において発現させ、かつ特徴決定に十分なタンパク質を提供した。
（2.5 抗イディオタイプ抗体の特徴決定）
（2.5.1 68F2に対する抗イディオタイプ抗体11E1の特徴決定）
一旦11E1の抗イディオタイプヒト及びラマIgGバージョンを、異なる実験から入手し、より良いこの分子の特徴決定を行った：
・hu11E1(11E1のヒトIgGバージョン)の親和性及び解離速度を規定するために、表面プラズモン共鳴分析、
・該分子の特異性を決定する目的で、異なるmAbに対するla11E1(11E1のラマIgGバージョン)の結合プロファイルを決定するために、ELISA、
・la11E1は、薬物動態試験の信頼できるツールとして使用することができることを証明するために、薬物動態実験。
（2.5.1.1：抗イディオタイプmAb hu11E1とイディオタイプmAb 68F2の間の相互作用の解離定数(KD)及び解離速度(koff)の決定）
ペリプラズム画分から抽出された68F2に特異的な抗イディオタイプFabの結合を、SPRを使用し、イディオタイプへの結合についてスクリーニングした。これは、Biacore 3000 (Biacore AB／GE Healthcare社)を用いて行った。68F2は、リガンドとして働き、かつ密度3000反応単位[RU]でCM5チップ(Biacore AB) のフローセル2中に固定した。バックグラウンド対照として、PBSをフローセル1中に「固定した」。ペリプラズム画分を、流動緩衝液HBS-EP(10mM HEPES、3mM EDTA、150mM NaCl、0.005％Tween-20)中に、8倍希釈した。流れは、30μl／分に設定し、かつ被検体注入は、被検体60μlからなった。更に、解離時間3分を設定し、キネティックを測定した。使用した手順は全て、製造業者の推奨に従い行い、かつデータは、BiaEvaluation 4.1(Biacore AB)ソフトウェアを用いて解析した。hu11E1は、68F2についてKD 36pM及びkoff 4.83×10-5 s-1を有した。61H7への結合、又は同じヒト標的抗原に結合する市販のmAbへの結合は、存在しなかった。従って、11E1の結合は、68F2に特異的である。
（2.5.1.2：68F2へのla11E1の特異性を証明するための異なる抗体に対するla11E1の結合のプロファイリング）
la11E1の特異性を決定するために、ELISAを設定した。関連のあるモノクローナル抗体のパネルを、濃度2μg／mlで、4℃で一晩コーティングした。コーティング後、ELISAプレートを、1％カゼインを含有するPBSにより、室温で2時間ブロックした。次にこのブロッキング液を、濃度10μg／mlから始め、濃度14ng／mlに到達するまで、3倍で連続希釈した、la11E1(ラマIgG)100μlにより、置き換えた。結合の検出は、マウス抗-ラマIgG1(27E10)モノクローナル抗体の添加により置き換え、引き続きHRPに複合したロバ抗-マウスIgG抗体を添加した。
特異性プロファイリングに関して、試験した抗体のパネルは、68F2及び61H7に加え、同じヒト標的抗原に結合する市販の抗体、及びアイソタイプ対照として無関係のヒト標的抗原に結合する無関係のラマ-由来抗体(36C4)を含んだ。同じく、無関係のラマ-由来VH又はVLとミスマッチした68F2も含んだ。VH68VL48は、68F2のVHを含むが、VLは含まず、並びにVH48VL68は、その逆であった。
la11E1は、この抗体パネルにおいて、68F2に関して高度の特異的結合を示した(図3)。特に重要なことは、対照抗体36C4では認められなかったことである。これは、68F2と同じ技術で単離された、アイソタイプ対照(同じFc変種)抗体である。36C4が認められない場合、68F2は、巨大な抗体プール(ヒト血漿として)中で非常に特異的に結合され得るという機会が高度に存在する。これは実際に、更なる実験により確認された(以下参照)。
興味深いことに、68F2の重鎖は、68F2の重鎖、しかし無関係の抗体の軽鎖を含むミスマッチしたmAb VH68VL48においても認められた。この結合は、完全68F2抗体に対して、このミスマッチVH68VL48では約100分の1であった。このことは、68F2上の結合エピトープの主要部分は、その可変重鎖部分に局在化しているが、その可変軽鎖配列はまた、la11E1の結合に寄与していることを示唆している。
（2.5.1.3：129D3による薬物動態試験のためのla11E1の利用可能性の証明）
129D3は、68F2の生殖系列化された誘導体であり、フレームワーク領域の68F2のわずかなアミノ酸が異なるのみである。
最初に、la11E1は、血漿中に存在する129D3への特異的結合を明らかにすることが必要であった。陽性対照として、68F2を使用した。
Maxisorpプレートを、la11E1ラマフォーマット3μg／mlにより、4℃で一晩コーティングした。翌日、このプレートを、1％カゼインを含有するPBSにより、室温で2時間ブロックした。それと同時に、使用した3匹のカニクイザル由来のプールした0日目の血漿を、129D3又は68F2の濃度50μg／mlでスパイクした。0日目は、サルがまだいずれのmAb型による処置も受けていないことを意味する。このスパイクしプールした血漿の1％を、ブロッキング後のELISAプレートに添加した(最終濃度500ng／ml)。隣接するウェルに、各ウェル毎に2倍希釈で、連続希釈を行った。希釈は、1％プールした血漿を含有するPBS中で行い、各ウェルに均等にこのマトリクスを保持した。バックグラウンドシグナルを観察するために、最後のウェルを、モノクローナル抗体非添加の1％血漿に使用した。
68F2又は129D3は、室温で2時間、プレートのコーティングに結合させた。2時間後、サルの枯渇したHRP複合した抗-ヒトFcポリクローナル抗体(Bethyl-ロット番号A80-319P-14)で、イディオタイプ(ヒトFc部分を含む、68F2又は129D3)の、抗イディオタイプ(ラマFc部分を含む、la11E1)への結合を1時間検出した。その後これを、s(HS)-TMB(SDT-Reagents社)により呈色し、10分後、呈色反応を停止した。
11E1のラマIgGバージョン(la11E1)は、同じ様式でプールしたカニクイザル血漿のバックグラウンド中の68F2及び129D3の両方を検出することができた(図4)。これは、la11E1は実際に、129D3の検出に使用することができることを指摘している。そのバックグラウンドシグナルは、非常に低かった。
（2.5.2：61H7抗イディオタイプ抗体の特徴決定）
ファージミドベクターpCB3中に存在するクローン7B4、7C6、7C12、8D6及び8H7の挿入断片を、大規模Fab作製のために、pCB4発現ベクターに再クローニングした。これらの生成物を、最初の特徴決定に使用した。これは、ヒト及びラマIgG1フォーマットが特徴付けられた11E1とは異なることに留意されたい。
（2.5.2.1：選択されたFab 7B4、7C6、7C12、8D6及び8H7のその標的61H7に対する結合の検証のための結合特異性の評価）
96ウェルプレートを、ヒト61H7標的抗体によりコーティングした。精製したFab 7B4、7C6、7C12、8D6及び8H7を、3倍の連続希釈(800nM、267nM、89nM、30nM、10nM及び3.3nM)で、ウェルに添加した。検出は、抗-MYC HRPにより行った。この実験は、異なる2日に2回行った。第一の実験において、下記の陰性対照を含んだ：同じヒト標的抗原に結合する市販の抗体、68F2及び36C4(無関係のヒト標的抗原に対するアイソタイプ対照ラマ-由来抗体)。これらの陰性対照分子で、プレート上をコーティングし、かつ前述のFab 200nMと共にインキュベーションした。第二の実験において、陰性対照は、同じヒト標的タンパク質に対する市販の抗体ラマ68F2及びヒト68F2であった。加えて、ラマ61H7及び103A1(61H7のわずかな配列変種)を、これらの61H7バージョンも、前述のFabにより認識されることを検証するために含んだ。
このアッセイの結果は、下記を明らかにしている：
・7C6 Fabは、その標的61H7へ明らかに特異的に結合する
・7C6 Fabは、イディオタイプmAbヒト61H7へ結合し、EC50はおよそ1.13×10-7Mである(図5)
・7C6は、陰性対照ヒト68F2、ラマ68F2、同じ標的に対する市販の抗体、及び36C4には結合しない
・ラマ61H7及びラマ103A1(61H7に類似)は、7C6により認識される。
（実施例3−ヒトTNF-リガンドファミリー抗原に結合するラマFabに対する抗イディオタイプ抗体）
（3.1 標的抗原）
本実施例の標的抗原は、TNF-リガンドファミリーの一員であるヒト標的タンパク質に特異的に結合するラマ-由来モノクローナル抗体であった。このモノクローナル抗体は、Cラムダ領域に連結されたラマ-由来可変Vラムダ領域(41D12と記される)、及びヒトIgG1のCH1-ヒンジ-CH2CH3へ連結されたラマ-由来VHからなる。
Fab 41D12は、27B3と記されるラマ-起源のFabの生殖系列化変種である。ラマ-由来Fab 27Bはそれ自身、完全に異種交配されたラマの、標的抗原(ヒトTNF-リガンドファミリーメンバー)を発現している細胞による免疫化により生じる。Fab 41D12は、最も近いヒト生殖系列との全体の配列同一性を最大95.7％まで増大するために、フレームワーク領域内の15個のアミノ酸置換の導入により、27B3から誘導された変種である。41D12及び27B3は、標的ヒト抗原と同じ結合特異性及び親和性を示すが、Fab 41D12は、特に完全ヒトFc領域を伴うモノクローナル抗体としてフォーマットされた場合に、ヒト治療薬としての使用により適している。
特にFab 41D12を含むmAbの臨床試験時に必要とされる薬物動態(PK)試験を促進するための、Fab 41D12(すなわち、27B3の生殖系列化変種)に特異的に結合する、抗イディオタイプFab(又はmAb)の開発は、商業的に興味深い。
（3.4 ラマの免疫化）
2頭のラマを、27B3-ラマ-Fcにより免疫化した。27B3は、41D12の非-生殖系列化バージョンであり、すなわち、VH及びVLドメインの両方のフレームワーク領域は、「完全ラマ」配列を有する。ラマの免疫化に関して、生殖系列化変種41D12よりもむしろ、ラマ-起源のFab 27B3を使用することは、ラマの免疫応答が、生殖系列化変種41D12のフレームワーク領域に導入されたアミノ酸置換により作出された任意のエピトープではなく、Fabの抗原-結合領域(抗イディオタイプ)に対するものであることを確実にする。同様に、Fc部分に対する免疫応答を避けるために、ラマ-Fcを免疫化に使用した。
41D12に対して生じた免疫応答の強度を評価するために、ラマ由来の予備免疫及び免疫した血清を、ELISAにおいて、直接コーティングされた41D12上で、41D12特異性抗体の存在について試験した。検出は、抗-ラマIgG1を使用し行った。得られた結果(示さず)は、免疫化されたラマの1頭から良好な免疫応答が、二頭目のラマからより弱い反応が得られたことを明らかにした。
（3.5 ライブラリー構築）
免疫化されたラマから単離したPBLを、De Haard Hらの文献(J. Biol. Chem. 274, 1999)に説明された戦略を使用し、巨大なライブラリーを得るために、WO 2010/001251に記載されたプライマーによる、ファージミド(pCB3)中のFab-コードしている遺伝子セグメントのRNA抽出、RT-PCR及びクローニングに使用した。
独立したVλCλ及びVκCκライブラリーを、タグ付けしないプライマーによる25サイクル、引き続きこれらのプライマーのタグ付け型を用い10サイクルを行う、2段階PCRを用いて構築した。VHCH1ライブラリーを、同じ手法を用い、並行して作製した。サブライブラリーを、pCB3において作製した。これらのライブラリーのサイズは、108 〜109 cfuであった。
次に、前記VλCλ及びVκCκライブラリー由来の軽鎖を、VHCH1-含有ベクターにおいて個別に再クローニングし、各々、「ラムダ」及び「カッパ」ラマFab-ライブラリーを作製した。これらのライブラリーの品質管理は、PCRを用いて慣習的に行った。これらのライブラリーのサイズは、109 〜 1010 cfuであった。
（3.6 選択及びスクリーニング）
ファージディスプレイを使用し、41D12へ結合しているラマFabの多様なパネルを動員した。選択を、直接コーティングされた41D12に対して行い、対抗選択を、20％ヒト血清を添加することにより行った。
各選択に関して、24種の個別のクローンを、96-深型ウェルプレート(1ml発現)において増殖し、ペリプラズム画分を調製し、結合ELISAにおいて試験した。結合は、27B3-ラマ-Fcについて、41D12について、及び57A10と記される陰性対照mAb(異なる無関係のヒトタンパク質に結合するラマ-由来Fabを含むmAb)について測定した。検出は、抗-c-myc-HRP mAbを用いて行った。
結果(示さず)は、全てのライブラリーにおいて、41D12には特異的に結合するが、57A10には結合しないFabが認められたことを明らかにした。
ペリプラズム抽出物を、解離速度に関して、41D12及び57A10でコーティングされたCM5チップ上で、Biacoreにより試験した。一部のクローンに関する結果を、表3に示した。イディオタイプ抗体41D12への高い親和性及び特異性の結合を、明らかにすることができる。
表3−Biacoreで測定したイディオタイプmAb及び陰性対照mAbへのラマ-由来抗イディオタイプFabを含むペリプラズム画分の結合
Figure 2015524404
（3.7 ELISAによるヒト血漿中でスパイクされたイディオタイプmAbに対するラマ-由来 抗イディオタイプmAbの結合）
このELISAの目的は、41D12は、抗イディオタイプmAbを使用し、ヒト血漿中で特異的に検出され得るかどうかを決定することであり、これは、抗イディオタイプmAbの、ヒトPKアッセイの開発のためのツールとしての有用性を明らかにしている。
抗-イディオタイプmAb 66E8、66E3、66A9及び67H3、並びに無関係のmAb(同じくラマFcを伴う66G3)を、Nunc 96-ウェルマイクロタイタープレート中5μg／mlで、4℃で一晩コーティングした。洗浄後、プレートを、2％BSAにより2時間ブロックし、その後41D12を、1％ヒト血漿中で、10μg／mlから始め、3倍希釈する連続希釈を適用した。これらの試料を、室温で2時間インキュベーションした。洗浄後、41D12を、5000倍希釈で、抗-ヒトFc HRP(Jackson社、109-035-008)を用いて検出した。プレートを洗浄し、かつTMB基質を染色に使用し、ODをOD620nmで測定した。結果を、図6に示す。
結果は、41D12は、ヒト血漿中で、高感度で検出することができる(検出限界はおよそ5ng／ml)ことを明らかにしている。しかしこのアッセイにおけるバックグラウンドは、非常に高い。その理由は、抗-ヒトFc HRP(Jackson社、109-035-008)はまた、コーティングしたmAbのラマ-Fcも検出するからである。これに関して、先に使用した検出抗体(Bethyl社からのサルIgG枯渇したHRPに複合された抗-ヒトFcポリクローナル抗体)が好ましく、その理由は、ラマIgGと交差反応しないからである(実施例2.5.1.3参照)。
本発明は、本明細書に記載の具体的実施態様により範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載されたものに加え、本発明の様々な改変が、前述の説明及び添付された図面から、当業者には明らかになるであろう。そのような改変は、添付された請求の範囲に含まれることが意図される。更に、本明細書に記載の本発明の態様及び実施態様は全て、必要に応じ本発明の他の態様から得られるもの(単離を含む)を含む、任意の及び全ての他の一致する実施態様と、広範に適用可能及び組合せ可能であると考えられる。
様々な刊行物が本明細書に引用されており、それらの開示はそれらの全体が参照により組み入れられる。

Claims (34)

  1. VHドメイン及びVLドメインを含む単離された抗原結合ポリペプチドであって、ここでVHドメイン又はVLドメイン内の少なくとも1つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)が、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られ、この抗原結合ポリペプチドは、少なくとも抗原結合ポリペプチドのエピトープを含むか、又は抗原結合ポリペプチドのエピトープを含む標的抗原の少なくとも一つのドメイン若しくは標的抗原の完全長を含む配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原である標的抗原に特異的に結合することを特徴としている、前記単離された抗原結合ポリペプチド。
  2. 前記標的抗原が、高度に保存された抗原であり、ここで該高度に保存された抗原が、配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来の相同タンパク質と、少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示す該ラクダ科ファミリーの種以外の種に由来するポリペプチドである、請求項１記載の単離された抗原結合ポリペプチド。
  3. 前記高度に保存された抗原が、配列比較ウインドウにわたり、該ラクダ科ファミリーの種由来の相同タンパク質と、少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を示す、請求項2記載の単離された抗原結合ポリペプチド。
  4. 前記高度に保存された抗原が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ブタ、イヌ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウシ又はニワトリからなる群から選択される種に由来するポリペプチドである、請求項2又は3記載の単離された抗原結合ポリペプチド。
  5. 前記高度に保存された抗原が、ヒトポリペプチドである、請求項2〜4のいずれか一項記載の単離された抗原結合ポリペプチド。
  6. 前記標的抗原が、該ラクダ科ファミリーの種由来の自己抗原、又は配列比較ウインドウにわたり該ラクダ科自己抗原と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すラクダ科動物-由来の抗原である、請求項１記載の単離された抗原結合ポリペプチド。
  7. 前記標的抗原が、該抗体の全可変領域を含む配列比較ウインドウにわたり該ラクダ科ファミリーの種から得られた抗体の可変領域と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示す、該ラクダ科ファミリーの種から得られた抗体の可変領域又は変種である、請求項1記載の単離された抗原結合ポリペプチド。
  8. 前記ラクダ科ファミリーの種が、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、ビクーニャ、グアナコ及びアルパカからなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載の単離された抗原結合ポリペプチド。
  9. 前記ラクダ科ファミリーの種が、ラマ(ラマグラマ)である、請求項8記載の単離された抗原結合ポリペプチド。
  10. 前記VHドメイン及びVLドメインの両方の超可変ループ又は相補性決定領域の各々が、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られる、請求項1〜9のいずれか一項記載の単離された抗原結合ポリペプチド。
  11. ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされたアミノ酸配列、若しくはそれらと少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも一つの定常ドメインを含むか、又はヒト抗体の完全定常領域を含む、キメラポリペプチドである、請求項1〜10のいずれか一項記載の単離された抗原結合ポリペプチド。
  12. 前記標的抗原に特異的に結合するキメララマ-ヒト抗体であり、該抗原結合ポリペプチドが、対合されたVH及びVLドメインを含み、ここで該VHドメイン及び該VLドメインは、ヒト抗体の1種以上のIgG定常ドメインに各々対合され、かつここでVH及びVLドメインは、該ラマ種の該標的抗原による能動免疫化により得られた通常型抗体に由来した超可変ループを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の単離された抗原結合ポリペプチド。
  13. 請求項1〜12のいずれか一項記載の抗原結合ポリペプチドをコードしているか、又は該抗原結合ポリペプチドの断片をコードしているポリヌクレオチド分子であって、その断片が、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られた少なくとも一つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)を含む、前記ポリヌクレオチド分子。
  14. 宿主細胞又は無細胞発現システムにおける抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする、調節配列に機能的に連結された請求項13記載のポリヌクレオチド分子を含む、発現ベクター。
  15. 請求項14記載の発現ベクターを含む、前記宿主細胞又は無細胞発現システム。
  16. 請求項15記載の宿主細胞又は無細胞発現システムを、抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養すること、及び発現された抗原結合ポリペプチドを回収することを含む、組換え抗原結合ポリペプチドの製造方法。
  17. 請求項1〜12のいずれか一項記載の抗原結合ポリペプチド、及び少なくとも一種の医薬として許容し得る希釈剤、賦形剤又は担体を含有する、医薬製剤。
  18. 標的抗原に特異的に結合する組換え抗原結合ポリペプチドを調製する方法であって、該抗原結合ポリペプチドが、VHドメイン及びVLドメインを含み、ここでVHドメイン又はVLドメイン内の少なくとも一つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)が、ラクダ科ファミリーの種から得られ、該方法が：
    (a)ラクダ科ファミリーの種を免疫化し、これにより該標的抗原に対する通常型抗体を生じる工程；
    (b)該標的抗原と免疫反応性であるラクダ科通常型抗体のVH及び／又はVLドメインの少なくとも一つの超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)をコードしているラクダ科核酸を単離する工程；
    (c)工程(a)において単離された核酸によりコードされた超可変ループ(複数可)又は相補性決定領域(複数可)と同一のアミノ酸配列を有する、超可変ループ(複数可)又は相補性決定領域(複数可)をコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを調製する工程であって、このポリヌクレオチドが、該標的抗原と免疫反応性である(又はこれに特異的に結合する)VHドメイン及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチドをコードしている、前記工程；並びに
    (d)工程(c)の組換えポリヌクレオチドから該抗原結合ポリペプチドを発現する工程であって、ここで該抗原結合ポリペプチドが、パート(b)のラクダ科通常型抗体とは同一ではなく、該標的抗原は、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と少なくとも90％アミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原であることを特徴とする、前記工程：を含む、前記方法。
  19. 工程(b)が、該抗体のVHドメイン及び／又はVLドメインをコードしているラクダ科核酸を単離すること、並びに該核酸が、1以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を伴うVHドメイン及び／又はVLドメインをコードするよう、核酸の配列を変更することを含む、請求項18記載の方法。
  20. 前記工程(c)で調製された組換えポリヌクレオチドが、追加的に、ヒト抗体の1以上の定常ドメインをコードしているヌクレオチド配列を含む、請求項18又は19記載の方法。
  21. 前記ラクダ科ファミリーの種が、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、ビクーニャ、グアナコ又はアルパカである、請求項18〜20のいずれか一項記載の方法。
  22. ラクダ科通常型抗体のVH及びVLドメインをコードしている発現ベクターのライブラリーを作製する方法であって、該方法が：
    a)ラクダ科動物を能動免疫化し、これにより、標的抗原に対する通常型ラクダ科動物抗体を生じる工程；
    b)該免疫化されたラクダ科動物由来のリンパ系組織(例えば、循環B細胞)を含有する試料から、cDNA又はゲノムDNAを調製する工程；
    c)該cDNA又はゲノムDNAの領域を増幅し、増幅された遺伝子セグメントを得る工程であって、各遺伝子セグメントが、ラクダ科通常型抗体のVHドメインをコードしているヌクレオチドの配列又はVLドメインをコードしているヌクレオチドの配列を含む、前記工程；並びに
    d)発現ベクターへc)において得られた遺伝子セグメントをクローニングし、その結果各発現ベクターが、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、並びに該VHドメイン及び該VLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示し、これにより発現ベクターのライブラリーが得られ、該標的抗原が、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原であることを特徴としている、前記工程：を含む、前記方法。
  23. 標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを調製する方法であって、該方法が：
    i)請求項22記載の方法を用い、発現ベクターのライブラリーを調製する工程；
    ii)該標的抗原との免疫反応性に関して該ライブラリーによりコードされた抗原結合ポリペプチドをスクリーニングし、これにより該標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程であって、該標的抗原が、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原であることを特徴としている、前記工程：を含む、前記方法。
  24. iii)パート(ii)において選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びパート(ii)において選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを、ヒト抗体の1以上の定常ドメインをコードしているヌクレオチドの配列と機能的に連結されるよう、更なる発現ベクターへクローニングし、これによりヒト抗体の1以上の定常ドメインに融合された、工程ii)において選択されたVH及びVLドメインを含むキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製する工程：を更に含む、請求項23記載の方法。
  25. パート(ii)において選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント、及び／又はパート(ii)において選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントが、更なる発現ベクターへのクローニングの前に、該VH及び／又は該VLドメインをコードしているヌクレオチド配列において1以上の変化を導入するように操作されている、請求項24記載の方法。
  26. iii)発現ベクターの第二のライブラリーを調製する工程であって、ここでライブラリーの各ベクターが、工程ii)において選択された発現ベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含む、前記工程；
    iv)該標的抗原との免疫反応性に関して、該第二のライブラリーによりコードされた抗原結合ポリペプチドをスクリーニングし、これにより該標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程：を含む、軽鎖シャッフリングプロセスを更に含む、請求項23記載の方法。
  27. v)パート(iv)において選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びパート(iv)において選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを、ヒト抗体の1以上の定常ドメインをコードしているヌクレオチドの配列と機能的に連結されるよう、更なる発現ベクターへクローニングし、これによりヒト抗体の1以上の定常ドメインに融合された、工程iv)において選択されたVH及びVLドメインを含むキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製する更なる工程：を含む、請求項26記載の方法。
  28. パート(iv)において選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及び／又はパート(iv)において選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントが、更なる発現ベクターへのクローニングの前に、該VH及び／又は該VLドメインをコードしているヌクレオチド配列に1以上の変化を導入するように操作されている、請求項27記載の方法。
  29. v)発現ベクターの第三のライブラリーを調製する工程であって、ここでライブラリーの各ベクターが、工程iv)において選択された発現ベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVHドメインをコードしている遺伝子セグメントを含む、前記工程；
    vi)該標的抗原との免疫反応性に関して該第三のライブラリーによりコードされた抗原結合ポリペプチドをスクリーニングし、これにより該標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程：を含む、重鎖シャッフリングプロセスを更に含む、請求項26記載の方法。
  30. vii)パート(vi)において選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びパート(vi)において選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを、ヒト抗体の1以上の定常ドメインをコードしているヌクレオチドの配列と機能的に連結されるよう、更なる発現ベクターへクローニングし、これによりヒト抗体の1以上の定常ドメインに融合された、工程vi)において選択されたベクターのVH及びVLドメインを含むキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製する更なる工程：を含む、請求項29記載の方法。
  31. パート(vi)において選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及び／又はパート(vi)において選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントが、更なる発現ベクターへのクローニングの前に、該VH及び／又は該VLドメインをコードしているヌクレオチド配列に1以上の変化を導入するように操作されている、請求項30記載の方法。
  32. 標的抗原と免疫反応性であるキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製する方法であって、該方法が：
    a)ラクダ科動物(ラマ又はアルパカ)を能動免疫化し、これにより、標的抗原に対する通常型ラクダ科動物抗体を生じる工程；
    b)該免疫化されたラクダ科動物由来のリンパ系組織(例えば、循環B細胞)を含有する試料から、cDNA又はゲノムDNAを調製する工程；
    c)該cDNA又はゲノムDNAの領域を増幅し、増幅された遺伝子セグメントを得る工程であって、各遺伝子セグメントが、ラクダ科動物の通常型抗体のVHドメインをコードしているヌクレオチドの配列又はVLドメインをコードしているヌクレオチドの配列を含む、前記工程；
    d)発現ベクターへc)において得られた遺伝子セグメントをクローニングし、その結果各発現ベクターが、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、並びに該VHドメイン及び該VLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示し、これにより発現ベクターのライブラリーを作製する工程；
    e)該標的抗原との免疫反応性に関して、工程d)で得られたライブラリーによりコードされた抗原結合ポリペプチドをスクリーニングし、これにより該標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程；
    f)軽鎖シャッフリング工程及び／又は重鎖シャッフリング工程を任意に実行し、該標的抗原と免疫反応性である効力-最適化された抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程；
    g)工程e)若しくは工程f)において選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及び／又は工程e)若しくは工程f)において選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを、生殖系列化及び／又はコドン最適化に任意に供する工程；並びに
    h)パートe)若しくはf)において選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント、又は工程g)において作製された生殖系列化及び／若しくはコドン最適化されたVH遺伝子セグメント、並びにパートe)若しくはf)において選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメント、又は工程g)において作製された生殖系列化及び／若しくはコドン最適化されたVL遺伝子セグメントを、ヒト抗体の1以上の定常ドメインをコードしているヌクレオチドの配列と機能的に連結されるよう、更なる発現ベクターへクローニングし、これによりヒト抗体の1以上の定常ドメインに融合されたVH及びVLドメインを含むキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製し、該標的抗原が、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原であることを特徴としている工程：を含む、前記方法。
  33. 標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドを作製する方法であって、該方法が：
    a)請求項23〜32のいずれか一項記載の方法を使用し、標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを調製する工程；
    b)該発現ベクターを、コードされた抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、宿主細胞又は無細胞発現システムへと導入する工程；並びに
    c)該標的抗原が、該ラクダ科ファミリーの種由来のタンパク質と、少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド抗原であることを特徴とする、発現された抗原結合ポリペプチドを回収する工程：を含む、前記方法。
  34. 前記標的抗原が、請求項1〜7のいずれか一項において規定されている、請求項18〜33のいずれか一項記載の方法。
JP2015522117A 2012-07-20 2013-07-19 高度に保存された標的に対するラクダ科動物由来の配列を含む抗体 Pending JP2015524404A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1212940.9A GB2504139B (en) 2012-07-20 2012-07-20 Antibodies to highly conserved targets produced by the immunisation of Camelidae species
GB1212940.9 2012-07-20
PCT/EP2013/065350 WO2014013075A2 (en) 2012-07-20 2013-07-19 Antibodies to highly conserved targets

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2015524404A true JP2015524404A (ja) 2015-08-24

Family

ID=46881721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015522117A Pending JP2015524404A (ja) 2012-07-20 2013-07-19 高度に保存された標的に対するラクダ科動物由来の配列を含む抗体

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20150191548A1 (ja)
EP (1) EP2875048A2 (ja)
JP (1) JP2015524404A (ja)
CN (1) CN104520317A (ja)
AU (1) AU2013291937A1 (ja)
CA (1) CA2877446A1 (ja)
GB (1) GB2504139B (ja)
IL (1) IL236525A0 (ja)
IN (1) IN2015DN00091A (ja)
WO (2) WO2013064701A2 (ja)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
US10881084B2 (en) 2010-07-26 2021-01-05 Trianni, Inc Transgenic animals and methods of use
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
ES2670874T3 (es) * 2011-03-16 2018-06-01 Argenx Bvba Anticuerpos contra CD70
EP3049439B1 (en) * 2013-09-26 2019-12-25 Ablynx N.V. Bispecific nanobodies
GB201414823D0 (en) 2014-08-20 2014-10-01 Argen X Bv Multispecific antibodies
KR20170136536A (ko) 2015-03-16 2017-12-11 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. 항-met 항체 및 그 사용 방법
DK3277719T3 (da) 2015-03-31 2022-05-02 Sorriso Pharmaceuticals Inc Polypeptider
WO2016156474A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin a
EP3277706A1 (en) 2015-03-31 2018-02-07 VHsquared Limited Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin b
PL3294775T3 (pl) * 2015-05-12 2021-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Oznaczanie czystości białka multimerycznego
WO2017095939A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Trianni, Inc. Enhanced immunoglobulin diversity
AU2017213633B2 (en) 2016-02-04 2023-08-03 Trianni, Inc. Enhanced production of immunoglobulins
GB201612337D0 (en) * 2016-07-15 2016-08-31 Argen-X N V Ant-il-22r antibodies
EP3519438A1 (en) 2016-09-30 2019-08-07 VHsquared Limited Compositions
TWI782930B (zh) * 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
CN110139952B (zh) * 2016-12-09 2022-11-25 深圳华大生命科学研究院 骆驼科抗体可变区免疫组库构建的引物组合及应用
CN111448217A (zh) 2017-12-22 2020-07-24 阿根思公司 双特异性抗原结合构建体
GB201802487D0 (en) 2018-02-15 2018-04-04 Argenx Bvba Cytokine combination therapy
EP3986931A1 (en) 2019-06-21 2022-04-27 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
AU2020294980A1 (en) 2019-06-21 2022-02-17 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
JP2022547274A (ja) 2019-09-16 2022-11-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 免疫ｐｅｔ撮像のための放射標識されたｍｅｔ結合タンパク質
US20240068004A1 (en) * 2022-08-15 2024-02-29 Mbrace Therapeutics, Inc. Cell-free methods of producing antibodies to intracellular targets
WO2024086852A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 Diagonal Therapeutics Inc. Heteromeric agonistic antibodies to il-18 receptor
WO2024211807A1 (en) 2023-04-07 2024-10-10 Diagonal Therapeutics Inc. Hinge-modified bispecific antibodies
WO2024211796A1 (en) 2023-04-07 2024-10-10 Diagonal Therapeutics Inc. Bispecific agonistic antibodies to activin a receptor like type 1 (alk1)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000511764A (ja) * 1995-12-20 2000-09-12 ザ ユニバーシティ オブ ケンタッキー リサーチ ファウンデーション マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体１１ｄ１０およびその使用方法
JP2007527406A (ja) * 2003-09-11 2007-09-27 クリティカル セラピューティクス，インコーポレイテッド Ｈｍｇｂ１に対するモノクローナル抗体
JP2008520552A (ja) * 2004-10-22 2008-06-19 メディミューン，インコーポレーテッド Ｈｍｇｂ１に対する高親和性の抗体およびその使用法
JP2011526493A (ja) * 2008-07-02 2011-10-13 アルゲン−エックス ビー．ブイ． ラクダ科動物由来の抗原結合ポリペプチド

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
IL198545A0 (en) 2008-05-14 2011-07-31 Metheresis Translational Res Sa High affinity binding site of hgfr and methods for identification of antagonists thereof
US8444976B2 (en) * 2008-07-02 2013-05-21 Argen-X B.V. Antigen binding polypeptides
JP5612663B2 (ja) 2009-04-07 2014-10-22 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ＥｒｂＢ−１／抗ｃ−Ｍｅｔ抗体
MX2013002046A (es) * 2010-08-20 2013-04-03 Novartis Ag Anticuerpos para el receptor del factor de crecimiento epidermico 3 (her3).

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000511764A (ja) * 1995-12-20 2000-09-12 ザ ユニバーシティ オブ ケンタッキー リサーチ ファウンデーション マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体１１ｄ１０およびその使用方法
JP2007527406A (ja) * 2003-09-11 2007-09-27 クリティカル セラピューティクス，インコーポレイテッド Ｈｍｇｂ１に対するモノクローナル抗体
JP2008520552A (ja) * 2004-10-22 2008-06-19 メディミューン，インコーポレーテッド Ｈｍｇｂ１に対する高親和性の抗体およびその使用法
JP2011526493A (ja) * 2008-07-02 2011-10-13 アルゲン−エックス ビー．ブイ． ラクダ科動物由来の抗原結合ポリペプチド

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHOU, H., ET AL.: "Generation of Monoclonal Antibodies against Highly Conserved Antigens", PLOSONE, vol. 4（6）, JPN6016032891, 2009, pages 6087, ISSN: 0003389813 *
影下登志郎 他: "抗イディオタイプモノクローナル抗体による抗抗イディオタイプ抗体の産生", 医学のあゆみ, vol. 146, no. 11, JPN6016032890, 10 September 1988 (1988-09-10), pages 819 - 820, ISSN: 0003389814 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20180016351A1 (en) 2018-01-18
AU2013291937A1 (en) 2015-01-22
WO2014013075A3 (en) 2014-12-18
IN2015DN00091A (ja) 2015-05-29
GB201212940D0 (en) 2012-09-05
WO2013064701A3 (en) 2013-07-18
EP2875048A2 (en) 2015-05-27
IL236525A0 (en) 2015-02-26
US20150191548A1 (en) 2015-07-09
GB2504139A (en) 2014-01-22
WO2013064701A2 (en) 2013-05-10
WO2014013075A2 (en) 2014-01-23
GB2504139B (en) 2014-12-31
CA2877446A1 (en) 2014-01-23
CN104520317A (zh) 2015-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20180016351A1 (en) Antibodies comprising sequences from camelidae to highly conserved targets
TWI830774B (zh) 抗cd47抗體及其應用
DK2310413T3 (en) Camelide-derived antigen-binding polypeptides
US9221918B2 (en) Antigen binding polypeptides
US20200255516A1 (en) Tigit antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof
CA2784767C (en) Camelid antibody platform for generating humanized antibodies
KR20190134614A (ko) B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도
US20220073649A1 (en) Mixed binding domains
JP2018064561A (ja) ラクダ科動物由来の抗原結合ポリペプチド
WO2023161448A1 (en) Human-like target-binding proteins
TW202214705A (zh) 抗tigit抗體及雙抗體和它們的應用
CN118667003A (zh) 特异性结合Claudin18.2的抗体及其制法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20151007

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20160818

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160906

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20180206