JP2011526493A - ラクダ科動物由来の抗原結合ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、ヒト抗体の可変ドメインと高度の配列相同性及び構造相同性を共有する、モノクローナル抗体を含む、抗原結合ポリペプチドを作製するための新規プラットフォームに関する。
モノクローナル抗体は、研究ツールとしての、及び次第に治療用又は診断用の物質としての多くの適用を有する。現在20種を超える様々なモノクローナル抗体が、癌、炎症、自己免疫障害、感染症、喘息、心臓血管疾患及び移植拒絶反応を含む多種多様な疾患を治療するために、規制当局の認可を受けており、かつ開発ライン上にあるモノクローナル抗体医薬の数は、対前年比で増加しつつある。
本発明者らは、先行技術のヒト化された又は完全にヒトの抗体プラットフォームにより認められる短所の一部又は全てを避け、かつヒト宿主における免疫原性を最小化する一方で、治療上重要な広範な標的抗原に対し高度に特異性及び親和性の抗体を産生することが可能である、「ヒト化された」モノクローナル抗体(抗原結合ポリペプチド)プラットフォームの必要性を認めている。
非限定的実施態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、キメラポリペプチドであることができる。
非限定的実施態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、組換えにより発現されたキメラモノクローナル抗体であることができる。
非限定的実施態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、ラクダ科ファミリーの種の能動免疫化により得られた超可変ループ又は相補性決定領域を含むことができる。
(a)該標的抗原と免疫反応性であるラクダ科通常型抗体のVH及び/又はVLドメインの少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)をコードしているヌクレオチド配列を決定すること;並びに
(b)該標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドを発現することであり、該抗原結合ポリペプチドが、VH及びVLドメインを含み、ここでこのVHドメイン又はVLドメインの少なくとも1個の超可変ループ若しくは相補性決定領域(CDR)は、パート(a)において決定されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を有すること:を含む。
(a)該標的抗原と免疫反応性のラクダ科通常型抗体のVH及び/又はVLドメインの少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)をコードしているラクダ科核酸を単離する工程;
(b)工程(a)において単離された核酸によりコードされた超可変ループ又は相補性決定領域と同一のアミノ酸配列を有する超可変ループ又は相補性決定領域をコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを調製する工程であり、このポリヌクレオチドが、該標的抗原と免疫反応性である(又は特異的に結合する)VHドメイン及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチドをコードしている、前記工程;並びに
(c)工程(b)の組換えポリヌクレオチドから該抗原結合ポリペプチドを発現する工程:を含む。
工程(b)において調製されたポリヌクレオチドは、好ましくは組換え体である。
本発明は、ラクダ科ファミリーの種の通常型抗体レパトアを基にした所望の標的抗原に対する特異性を有する抗原結合ポリペプチドを作製するための新規プラットフォーム技術、及びこの技術プラットフォームを使用し得られた抗原結合ポリペプチドに関する。
用語「抗原結合ポリペプチド」とは、標的抗原と免疫反応性であり、標的抗原と特異的結合を示す、VHドメイン及びVLドメインを含む任意のポリペプチドをいう。例証的抗原結合ポリペプチドは、本明細書の別所において考察されたような、抗体及び免疫グロブリン、並びに抗体断片も含む。
「抗体」(Ab)及び「免疫グロブリン」(Ig)は、(標的)抗原に対する結合特異性を示す糖タンパク質である。
本明細書において使用される用語「通常型抗体」とは、IgA、IgG、IgD、IgE又はIgMを含むいずれかのアイソタイプの抗体をいう。未変性の又は天然の「通常型」ラクダ科動物の抗体は、通常、2本の同一の軽(L)鎖及び2本の同一の重(H)鎖で構成される、ヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、1個の共有ジスルフィド結合により、重鎖に連結されているが、このジスルフィド連結の数は、様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動する。各重鎖及び軽鎖は、規則的に配置された鎖内ジスルフィド橋も有する。各重鎖は、一端(N-末端)に可変ドメイン(VH)を、それに続きいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端(N-末端)に可変ドメイン(VL)及びその他端に定常ドメイン(CL)を有し;軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと並置され、かつ軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並置されている。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン間の境界面を形成すると考えられる。
(a)ラクダ科ファミリーの種を、標的抗原又は該標的抗原をコードしているポリヌクレオチドにより、免疫化し、該標的抗原に対する抗体を作出する工程;
(b)該標的抗原と免疫反応性のラクダ科通常型抗体のVH及び/又はVLドメインの少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)をコードしているヌクレオチド配列を決定する工程;並びに
(c)該標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドを発現する工程であって、該抗原結合ポリペプチドが、VH及びVLドメインを含み、ここでVHドメイン又はVLドメインの少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)は、パート(a)において決定されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を有する工程。
本発明者らは、ラクダ科ファミリーの種由来の通常型抗体のVH及びVLドメインの両方をコードしているラクダ科生殖系列及び体細胞変異されたDNA配列は、フレームワーク領域について、ヒト抗体のVH及びVLドメインをコードしているヒト生殖系列DNA配列と高度の配列同一性/配列相同性を示すことを認めた。
従って本発明の抗原結合ポリペプチドは、これらがヒト抗体のVH及びVLドメインと、高度のアミノ酸配列相同性を示すことで特徴づけられる。
好ましい実施態様は、以下に詳細に考察するように、更にヒト又はヒト様カノニカルフォールドを有するラクダ科動物の超可変ループ又はCDRを使用することである。
従って一実施態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドのVHドメイン又はVLドメインのいずれかの中の少なくとも1個の超可変ループ又はCDRは、ラクダ科の種から得られたVHドメイン又はVLドメインから得られ、その上ヒト抗体において生じるカノニカルフォールド構造と実質的に同一である予測された又は実際のカノニカルフォールド構造を示す。
1.残基の数により決定された、最も近いマッチングのヒトカノニカル構造クラスと、同一の長さ、
2.対応するヒトH1及びH2のカノニカル構造クラスに関して説明された重要なアミノ酸残基との、少なくとも33%の同一性、好ましくは少なくとも50%の同一性。
(前述の解析目的のために、H1及びH2ループは、個別に処理され、かつ各々その最も近いマッチングのヒトカノニカル構造クラスに対し比較されることに留意されたい)。
1.残基の数により決定された、最も近いマッチングのヒトの構造クラスと、同一の長さ、
2.Vλ又はVκレパトアのいずれかからの、対応するヒトL1又はL2のカノニカル構造クラスに関して説明された重要なアミノ酸残基との、少なくとも33%同一性、好ましくは少なくとも50%同一性。
(前述の解析目的のために、L1及びL2ループは、個別に処理され、かつ各々その最も近いマッチングのヒトカノニカル構造クラスに対し比較されることに留意されたい)。
本発明の抗原結合ポリペプチドのVLドメインは、ヒトVLと高い配列同一性/配列相同性の両方を示すこと、及び同じくVLドメイン内の超可変ループは、ヒトVLと構造相同性を示すことが好ましい。
本発明の抗原結合ポリペプチドは、VHドメイン及びVLドメインの両方が存在することを条件として、様々な異なる実施態様をとることができる。従って非限定的実施態様において、本抗原結合ポリペプチドは、免疫グロブリン、抗体又は抗体断片であることができる。本明細書において用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、かつそれらが標的抗原に対し好適な特異性を示す限りは、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)を包含するが、これらに限定されるものではない。本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわちその集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る可能性のある天然の変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異性であり、単独の抗原部位に対し示されている。更に、抗原上の異なる決定基(エピトープ)に対し示された様々な抗体を典型的には含む通常型(ポリクローナル)抗体調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単独の決定基又はエピトープに対して示される。
VHドメイン又はVLドメイン中の少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)が、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られる、VHドメイン及びVLドメインを含むキメラ抗原結合ポリペプチド。特定の実施態様において、VHドメイン及びVLドメインの両方は、リャマ(ラマ・グラマ)から得られる。
VHドメイン又はVLドメイン中の少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)が、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られる、VHドメイン及びVLドメインを含む組換えにより発現された抗原結合ポリペプチド。特定の実施態様において、VHドメイン及びVLドメインの両方は、リャマ(ラマ・グラマ)から得られる。
VHドメイン又はVLドメイン中の少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)が、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られる、VHドメイン及びVLドメインを含むモノクローナル抗体。特定の実施態様において、VHドメイン及びVLドメインの両方は、リャマ(ラマ・グラマ)から得られる。
VHドメイン又はVLドメイン中の少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)が、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られ、かつ該抗原結合ポリペプチドが、治療上又は診断上重要な標的抗原と免疫反応性である、VHドメイン及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチド。特定の実施態様において、VHドメイン及びVLドメインの両方は、リャマ(ラマ・グラマ)から得られる。
ラクダ科動物(特にリャマ又はアルパカ)の通常型抗体のVHドメイン、ラクダ科動物(特にリャマ又はアルパカ)の通常型抗体のVLドメイン及び1個以上のヒト抗体定常ドメインを含む、キメラ抗原結合ポリペプチド。特定の実施態様において、VHドメイン及びVLドメインの両方は、リャマ(ラマ・グラマ)から得られる。
抗原結合ポリペプチドが、ラクダ科動物(特にリャマ又はアルパカ)の通常型抗体のVHドメイン、ラクダ科動物(特にリャマ又はアルパカ)の通常型抗体のVLドメイン及び1個以上のヒト抗体定常ドメインを含むか又はこれらからなる、治療上又は診断上重要な標的抗原と免疫反応性である、キメラ抗原結合ポリペプチド。特定の実施態様において、VHドメイン及びVLドメインの両方は、リャマ(ラマ・グラマ)から得られる。
ラクダ科動物(特にリャマ又はアルパカ)の通常型抗体のVHドメイン、ラクダ科動物(特にリャマ又はアルパカ)の通常型抗体のVLドメイン、並びにIgG、IgM、IgD、IgE及びIgAからなる群から選択されるアイソタイプのヒト抗体の定常ドメインを含むか又はこれらからなる、キメラ抗体。特定の実施態様において、VHドメイン及びVLドメインの両方は、リャマ(ラマ・グラマ)から得られる。
抗原結合ポリペプチドが、ラクダ科動物(特にリャマ又はアルパカ)の通常型抗体のVHドメイン、ラクダ科動物(特にリャマ又はアルパカ)の通常型抗体のVLドメイン、並びにIgG、IgM、IgD、IgE、IgAからなる群から選択されるアイソタイプのヒト抗体の定常ドメインを含むか又はこれらからなる、治療上又は診断上重要な標的抗原と免疫反応性である、キメラ抗原結合ポリペプチド。特定の実施態様において、VHドメイン及びVLドメインの両方は、リャマ(ラマ・グラマ)から得られる。
本発明は、本発明の抗原結合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド分子、宿主細胞又は無細胞発現システムにおいて本抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする調節配列に機能的に連結された本発明の抗原結合ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む発現ベクター、並びにこの発現ベクターを含む宿主細胞又は無細胞発現システムも提供する。
本発明の抗原結合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド分子は、例えば組換えDNA分子を含む。
本発明の重要な態様は、関心対象の標的抗原に対する高親和性抗原結合ポリペプチド、具体的にはモノクローナル抗体の作製方法に関する。
従って本発明は、標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドを調製する方法を提供し、該方法は:
(a)該標的抗原と免疫反応性であるラクダ科通常型抗体のVH及び/又はVLドメインの少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)をコードしているヌクレオチド配列を決定すること;並びに
(b)該標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドを発現することであり、該抗原結合ポリペプチドが、VH及びVLドメインを含み、ここでこのVHドメイン又はVLドメインの少なくとも1個の超可変ループ若しくは相補性決定領域(CDR)は、パート(a)において決定されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を有すること:を含む。
一実施態様において、パート(b)において発現された抗原結合ポリペプチドは、パート(a)のラクダ科通常型抗体と同一ではない。
(a)該標的抗原と免疫反応性のラクダ科通常型抗体のVH及び/又はVLドメインの少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)をコードしているラクダ科核酸を単離する工程;
(b)工程(a)において単離された核酸によりコードされた超可変ループ又は相補性決定領域と同一のアミノ酸配列を有する超可変ループ又は相補性決定領域をコードしているヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドを調製する工程であり、この組換えポリヌクレオチドが、該標的抗原と免疫反応性である(又は特異的に結合する)VHドメイン及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチドをコードしている、前記工程;並びに
(c)工程(b)の組換えポリヌクレオチドから該抗原結合ポリペプチドを発現する工程:を含む。
一実施態様において、パート(c)において発現された抗原結合ポリペプチドは、パート(a)のラクダ科通常型抗体と同一ではない。
いずれかの方法の第一の工程は、標的抗原に対する免疫応答を誘起するための、ラクダ科ファミリーの種の能動免疫化、これによる該標的抗原に対し免疫反応性のラクダ科動物の通常型抗体の発生に関与し得る。ラクダ科動物の免疫化に関するプロトコールは、付随する実施例において説明される。免疫化に使用される抗原調製品は、標的抗原、例えば組換えにより発現されたポリペプチド、又はそれらの免疫原性断片の精製型であることができる。しかし、該標的抗原を発現若しくはコードしている単離された細胞又は組織調製品、細胞溶解液、細胞上清若しくは細胞膜などの画分などのような抗原の粗調製品によるか、又は該標的抗原をコードしているポリヌクレオチドにより(DNA免疫化)、免疫化することも可能である。
関連した態様において、本発明は、ラクダ科動物の通常型抗体のVH及び/又はVLドメインをコードしている発現ベクターのライブラリーを作製する方法も包含しており、該方法は:
a)増幅された遺伝子セグメントを得るために、ラクダ科動物の通常型抗体のVH及び/又はVLドメインをコードしている核酸分子の領域を増幅する工程であって、各遺伝子セグメントが、ラクダ科動物の通常型抗体のVHドメインをコードしているヌクレオチド配列又はVLドメインをコードしているヌクレオチド配列を含む、工程、並びに
b)各発現ベクターが、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及び/又はVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを少なくとも含むように、工程a)において得られた遺伝子セグメントを発現ベクターにクローニングし、これにより発現ベクターのライブラリーが得られる工程:を含む。
B細胞選択方法は、陽性選択、又は陰性選択に関与することができる。
a)ラクダ科動物を能動免疫化し、これにより標的抗原に対する通常のラクダ科動物の抗体を産生する工程;
b)該免疫化されたラクダ科動物(リャマ又はアルパカを含むが、これらに限定されるものではない)由来のリンパ系組織(例えば循環B細胞)を含む試料から、cDNA又はゲノムDNAを調製する工程;
c)該cDNA又はゲノムDNAの領域を増幅し、増幅された遺伝子セグメントを得、各遺伝子セグメントが、ラクダ科動物の通常型抗体のVHドメインをコードしているヌクレオチド配列又はVLドメインをコードしているヌクレオチド配列を含む工程;並びに
d)各発現ベクターが、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、かつ該VHドメイン及び該VLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示するように、c)において得られた遺伝子セグメントを発現ベクターへクローニングし、これにより発現ベクターのライブラリーが得られる工程:を含む。
i)発現ベクターのライブラリーを提供する工程であり、ここで該ライブラリー中の各ベクターが、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、ここで該VHドメイン又は該VLドメインの少なくとも1つがラクダ科動物通常型抗体に由来し、かつここで該ライブラリーの各ベクターが該VHドメイン及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示する、前記工程;
ii)該標的抗原と免疫反応性である該ライブラリーによりコードされた抗原結合ポリペプチドをスクリーニングし、かつこれにより該標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程:を含む。
スクリーニング/選択は典型的には、ライブラリーのクローンによりコードされた発現産物(すなわち、抗原結合ポリペプチドの形のVH/VL対合、例えばFab、scFV又は抗体)を、標的抗原と接触すること、並びに所望の抗原結合特性を示しているVH/VL対合をコードしている1つ以上のクローンを選択することが関与している。
所望の標的抗原に対する親和性を持つVH/VL組合せをコードするものとしてスクリーニング/選択により同定されたクローンは、望ましいならば、親和性及び/又は中和化効力が最適化される下流工程に供されることができる。
望ましい抗原-結合特性を示しているVH/VL対合をコードしている選択された発現クローンのVH及びVL-コードしている遺伝子セグメント(例えばscFV又はFabをコードしているファージクローン)は、下流のプロセッシング工程に供され、かつヒト治療的用途に適した抗原結合ポリペプチドフォーマット(例えば完全にヒト定常ドメインを伴う完全長抗体)をコードしているベクターなどの、代替の発現プラットフォームに再クローニングされることができる。
a)ラクダ科動物(リャマ又はアルパカを含むが、これらに限定されるものではない)を能動免疫化し、これにより標的抗原に対する通常型ラクダ科動物抗体を生じる工程;
b)該免疫化されたラクダ科動物由来のリンパ系組織(例えば循環B細胞)を含有する試料からcDNA又はゲノムDNAを調製する工程;
c)該cDNA又はゲノムDNAの領域を増幅し、増幅された遺伝子セグメントを得、各遺伝子セグメントがラクダ科動物の通常型抗体のVHドメインをコードしているヌクレオチド配列及びVLドメインをコードしているヌクレオチド配列を含む工程;
d)工程c)で得られた遺伝子セグメントを、発現ベクターへクローニングし、その結果各発現ベクターがVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、かつ該VHドメイン及び該VLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示し、これにより発現ベクターのライブラリーを作製する工程;
e)該標的抗原との免疫反応性について、工程d)で得られたライブラリーによりコードされた抗原結合ポリペプチドをスクリーニングし、これにより該標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程;
f)軽鎖シャッフリング工程及び/又は重鎖シャッフリング工程を任意に実行し、該標的抗原と免疫反応性の効力最適化された抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程;
g)工程e)若しくは工程f)で選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及び/又は工程e)若しくは工程f)で選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを、生殖系列化及び/又はコドン最適化に任意に供する工程;並びに
h)パートe)又はf)で選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント又は工程g)において作製された生殖系列化及び/若しくはコドン最適化されたVH遺伝子セグメント及びパートe)又はf)で選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメント又は工程g)において作製された生殖系列化及び/若しくはコドン最適化されたVL遺伝子セグメントを、ヒト抗体の1個以上の定常ドメインをコードしているヌクレオチド配列と機能的に連結している更なる発現ベクターへクローニングし、これによりヒト抗体の1個以上の定常ドメインに融合されたVH及びVLドメインを含むキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製する工程:を含む。
a)先に説明された方法を使用し、標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを調製する工程;
b)該発現ベクターを、コードされた抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、宿主細胞又は無細胞発現システムへ導入する工程;並びに
c)発現された抗原結合ポリペプチドを回収する工程:を含む。
実施例1から9は、リャマの免疫化から始まる、「サイトカインx」と示された例としての抗原に対する抗体が生じる方法を例示している。同じ一般的プロトコールは、任意のラクダ科動物種における任意の標的抗原に適応されることができ、従って「サイトカインx」の正確なアイデンティティは実質ではない。本方法は、IL-1βに結合するFabの調製についても例証される(前方の実施例15)。
様々な刊行物が、前述の説明において及び以下の実施例を通じて引用されており、その各々は、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている。
(実施例1:リャマの免疫化)
リャマ(ラマ・グラマ)の免疫化及び末梢血リンパ球の収集に加え、引き続きのRNA抽出及び抗体遺伝子断片の増幅を、De Haardとその同僚により説明されたように行った(De Haardらの論文、J. Bact. 187:4531-4541 (2005))。1頭のリャマを、フロイント完全アジュバント又は好適な動物に優しいアジュバントStimune(Cedi Diagnostics BV社、オランダ)を使用し、組換えヒトサイトカインxにより筋肉内へ免疫化した。サイトカインx(操作されたヒト細胞株中において組換えにより発現された)は購入した。免疫化の前に、凍結乾燥されたサイトカインxを、PBS(Dulbecco社)中、濃度250μg/mlに再構成した。リャマは、隔週で6回の注射を受け、最初の2回の注射は、1回の注射につきサイトカイン100μg、最後の4回の注射は1回の追加免疫につき50μgであった。最後の免疫化後4日目に、血液試料(PBL1)150mlを該動物から採取し、かつ血清を調製した。最終免疫化後10日目に、第二の血液試料(PBL2)150mlを採取し、かつ血清を調製した。リャマ免疫グロブリンの遺伝子給源としての末梢血リンパ球(PBL)は、フィコール-パク勾配法(Amersham Biosciences社)を用い、これらの血液試料から単離し、1〜5×108個PBLを収集した。抗体の最大多様性は、試料採取されたBリンパ球の数と等しいと予想され、これはPBL数(1〜5×107)の約10%(9.2〜23.2%(De Genstらの論文、Dev. Comp. Immunol. 30:187-98 (2006))である。リャマ血清中の通常型抗体の画分は、総免疫グロブリンの最大80%であり、これは通常型抗体を産生するBリンパ球の類似の画分に外挿されることができる。従って血液試料150ml中の通常型抗体の最大多様性は、0.8〜4×107の異なる分子と計算される。総RNAは、Chomczynskiらの論文の方法(Anal. Biochem.162:156-159 (1987))に従い、PBLから単離した。
組換えFabファージディスプレイライブラリーの効果的クローニングを可能にする試料採取されたB細胞レパトアの複雑性を低下するために、抗原反応性B細胞を、蛍光標識された抗原及び特異的にラクダ科動物の通常型抗体を認識するmAb(B細胞マーカーとして)を用いるFACS選別によるか(Weitkampらの論文、J. Immunol. Meth., 275:223-237 (2003))、又は固定された抗原に対するパニング手法により(Lightwoodらの論文、J. Immunol. Meth. 316:133-143 (2006))、濃厚化した。
ランダムプライミングされたcDNAは、RT-PCRのためのSuperscript IIIファーストストランド合成システム(Invitrogen社)を用い、PBL RNA 80μgから調製した。RNAは、反応液20μlの8種の独立した反応において、2.5μMランダムヘキサヌクレオチドプライマー及び500μM dNTP類の存在下で、65℃で5分間熱変性した。引き続き、供給業者の指示に従い、緩衝液及びジチオスレイトールを添加し、更に最終総容積8×40μl中で、640ユニットのRNasOUT(40ユニット/μl、Invitrogen社)、及び3200ユニットのSuperscriptIII逆転写酵素(200ユニット/μl;Invitrogen社)を添加した。50℃で50分間、85℃で5分間、及び1℃で1分間の後、RNAse Hを添加し(〜4ユニット)、かつ37℃で20分間インキュベーションした。プールされたcDNAを、QIAquick PCR精製キットを供給業者の推奨に従い用いて浄化し、PCRに使用した。
一次重鎖レパトア及びふたつの一次軽鎖レパトアの構築のために、制限部位が添えられたPCR産物を、ゲル精製し、その後消化し、かつ様々なVH、VK及びVLファミリーを3群にまとめた。VHCH1断片を、SfiI及びNotIにより消化し、かつVKCK及びVLCL断片を、ApaLI及びAscIにより消化し、かつファージミドベクターpCB3(適用させた複数のクローニングサイトを伴うベクターpCES1に類似)へクローニングした。消化された断片(1〜2μg)は、消化されかつ精製されたpCB3(2〜4μg)へ、T4-DNAリガーゼ(Fermentas社)を用い、室温で数時間、その後37℃で1〜2時間ライゲーションした。軽鎖又は重鎖プールに関する脱塩されたライゲーション混合液を、大腸菌株TG1の電気穿孔に使用し、1本鎖ライブラリーを作製した。
出発接種材料中の各クローン由来の少なくとも10種の細菌の存在を確実にするために、ヘルパーファージM13-KO7又はVCSM-13によるファージミド粒子のレスキューを、接種のためのライブラリー由来の細菌の代表的数を用い、2Lスケールで実行した。選択に関して、1013個のコロニー-形成単位が、イムノチューブ(Maxisorpチューブ、Nunc社)又は96ウェルマイクロタイタープレート(Maxisorp、Nunc社)内に固定された抗原と共に、又は可溶性ビオチン化された抗原と共に使用した。固定された抗原の量は、ラウンド1では10μg/mlで出発し、引き続きの選択ラウンドの間に10〜100倍減少された。抗原は、供給業者の推奨に従い、抗原1分子につきNHS-ビオチン(Pierce社)3〜10分子の比でビオチン化し、かつバイオアッセイにおいてそれらの生物活性について試験した。別に言及されない限りは、これらの抗原は、ラウンド1の間10nMの濃度で、引き続きのラウンドの間には10pM〜1nMで、選択のために使用した。
可溶性Fabは、Marksらの論文に説明されたように個別のクローンから(Marksらの論文、J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991))、しかし好ましくは感度を高める(boost)ためにモノクローナルファージとして(Leeらの論文、Blood、108:3103-3111 (2006))作製した。可溶性Fab又はFabディスプレイファージを含有する培養上清を、直接コーティングされた抗原によるELISAにおいて試験するか、又は固定されたストレプトアビジンを介して捕獲した。組換えヒトサイトカインx及びストレプトアビジンは、0.1M NaHCO3(pH9.6)中10μg/mlで、4℃で16時間コーティングした。PBS、0.1%(v/v)Tween 20で3回洗浄した後、ビオチン化された抗原を、濃度0.5μg/mlで、30〜60分にわたり室温で添加した。これらのプレートを、PBS中の2%(w/v)半-脱脂粉乳(Marvel)又は1%カゼイン溶液(PBS中)により、室温で30分間かけてブロックした。この培養上清を、2%(w/v)Marvel/PBS中で1倍又は5倍希釈し、かつ2時間インキュベーションし;結合したFabを、重Fd鎖のカルボキシル端でmyc-ペプチドタグを認識する抗-myc抗体9E10(5μg/ml)、及びウサギ抗-マウス-HRP複合体(Dako社)により検出した。最後のインキュベーション後、基質としてテトラメチルベンジジン及びH2O2により染色を行い、0.5容量の1M H2SO4の添加により停止し;光学密度を、450nmで測定した。ELISAにおいて陽性シグナル(バックグラウンドの2倍を上回る)を生じるクローンを、オリゴヌクレオチドプライマーM13-リバース及びgeneIII-フォワード(4)による増幅により得られたPCR産物の、又は個別のFd及びVKCK又はVLCLアンプリコンの、BstNI又はHinfIフィンガープリントにより解析した。
3〜6種の異なるリード由来のFab挿入断片を、Fdのカルボキシ端に融合されたヘキサヒスチジン及びC-MYCタグを含むが、バクテリオファージM13gene3を欠いている、pCB3と同一の発現ベクター(pCB5とコード)において、ApaLI-NotIにより再クローニングした。平行して、それらのV領域を、制限酵素の好適な組合せにより再クローニングし、引き続きキメラFabの発現のためにヒトCH1及びCK又はCLを含むgene3欠失ベクターにおいてクローニングした。フィンガープリント解析後、再クローニング後に得た個別のクローンを、50ml又は250mlスケールで増殖し、かつペリプラズム画分を先に説明したように調製した。Fab断片を、IMAC精製し、かつ正確に形成されたFabは、Superdex 75HRカラム(Amersham Pharmacia Biotech社)を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。細胞ベースのアッセイに応じて、エンドトキシンを、1M NaOH中で一晩増感し、引き続きD-PBS中で平衡化した陰イオン交換カラム(Source30Q、GE Healthcare社)上の通過により除去した。この収量は、Fabに関してモル吸光計数13を使用し、280nmで光学密度を測定することにより決定した。
本実施例において、サイトカインxに対するリャマ由来のリードFabを、フレームワーク残基の小さいセットを標的化するソフトランダム化手順を用い、かつ親和性ベースの選択により高親和性フレームワーク配列を同定するための、線維状ファージの表面に得られたFabライブラリーの一価ディスプレイ(US2003/0190317 A1、引用により本明細書中に組み込まれている)により、ヒト化した。例えばヒトコブラクダ由来の生殖系列VH(IGHV1S20)に関して、野生型残基の70%を維持している、位置5(Val、Leu)、55(Gly、Ala)、83(Ala、Ser)、95(Lys、Arg)、96(Ser、Ala)及び101(Met、Val)の小さいライブラリーが作製された(IMGT番号付け)。超可変ループ中のアミノ酸は、同様の方法で位置づけすることができる。
個々のリードは、選択された後、親和性及び効力について試験し、かつヒトFab/IgGへの再フォーマットのための最良のリードを選択した。
ヒト化VH及びVL領域から出発する、ヒト化Fabの発現を、Rauchenbergerらの論文(J. Biol. Chem. 278:38194-204 (2003))に説明されたように行った。ヒトモノクローナル抗体の発現のために、ひとつは軽鎖及びひとつは重鎖の構築のための2つの個別の発現ベクターを、pcDNA3.1ベクターを基に構築した。軽鎖のための発現ベクターは、CMVプロモーターの下流にヒトCκ又はヒトCλ配列のいずれか、更にはCMVプロモーターの下流及び軽鎖定常ドメインとインフレームのKPN1 BsmB1断片のような、軽鎖構築体のクローニングを可能にする制限部位を含んだ。次に重鎖のための発現ベクターは、CMVプロモーターの下流にヒトCH1-ヒンジ-CH2-CH3配列、更にはCMVプロモーターの下流及び重鎖定常ドメインとインフレームのKPN1 BsmB1断片のような、VH構築体のクローニングを可能にする制限部位を含んだ。
モノクローナル抗体又はFabは、受容体結合アッセイ及びバイオアッセイにおいて試験し、かつ最良のリードを更なる開発のために選択した。
(方法論)
FR4をコードしている生殖系列リャマ及びヒトコブラクダのJ領域の配列を、ヒト配列と比較し、かつこれらは完全に同一であり(10残基中10がマッチ);唯一の例外は、FR4の位置6にグルタミン(ロイシン又はメチオニンの代わり)を含むIGHJ4であった(アラインメントは以下に示される)。体細胞変異されたVλに関して、ヒトコブラクダ由来のFR4の10残基中9は、マッチしており(相同性90%)、その理由は入手可能な配列のほとんどは、位置6にリジン又はグルタミン酸又はグルタミンの代わりにヒスチジンを有するからである(アラインメントは以下に示される)。最後に、6種の入手可能な体細胞変異されたヒトコブラクダVκ配列のセットのFR4中に再度90%同一性(10残基中9)が存在し、その理由は位置3の残基セリンは、ヒト生殖系列JKセグメントにおいて認められるものとは異なる、すなわちグルタミン、プロリン及びグリシンであるからである(アラインメントは以下に示される)。
揃わないが、同じ生殖系列の別のファミリーメンバー(又はサブクラス)に見られる残基は、それらを該最も近いヒト生殖系列配列に復帰変異することが実行可能であるという仮定を基に、相同であるとみなされる。
http://www.bioinf.org.uk/abs/chothia/html、及びhttp://www.bioc.unizh.ch/ antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.html。カノニカルフォールドアルゴリズムと厳密にはフィットしない解析されたラクダ科動物の抗体(又は他の種由来の)残基は、カノニカルフォールドの同じ組合せとマッチしているヒト生殖系列ファミリーのメンバーの配列中のそれらの出現についてチェックされるか、又は言及されたフォールドが可能である残基は、解析される抗体が属するラクダ科動物の抗体ファミリー内のそれらの出現についてチェックされる。
10.1−ヒトコブラクダVH
10.2−ラマ・グラマVH
10.3−VL1-40
10.4−VL2-18
10.5−VL3-1
10.6−VL3-12
10.7−Vκ2-40
10.8−リャマとヒトのJ(H)領域比較
10.9−軽鎖J領域の比較
10.10−ラマ・パコスVH生殖系列相同性
10.11−ラマ・グラマ由来のVH相同性解析
10.12−ラマ・グラマ由来のVL解析
抗体の構造解析は、配列と相補性決定領域により形成された結合部位の形状の間の関係を明らかにした(Chothia及びLeskの論文、J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987);Tramontanoらの論文、J. Mol. Biol. 215:175-82 (1990))。それらの高度な配列可変性にもかかわらず、6つのループ中の5つは、「カノニカル構造」と称される、主鎖コンホメーションの小さいレパトアのみを採用する。これらのコンホメーションは、まず第一にループの長さにより決定され、かつ第二にそれらのパッキング、水素結合又は一般的でない主鎖コンホメーションを推定する能力を通じたコンホメーションを決定するループ内及びフレームワーク領域内のある位置での重要残基の存在により全て決定される。
同じく予測されたL1及びL2のカノニカル構造を、ループの長さ及びカノニカルフォールドに関連した重要残基の存在をベースにして、体細胞変異されたヒトコブラクダVλセグメントについて解析した。この比較は、カノニカルフォールドの同じ組合せ及び全体の配列の相同性を持つ、最も近いマッチングのヒト生殖系列に生じる重要残基で行った(表3)。L1に関してフォールド11(L1:11)及びL2に関してフォールド7(L2:7)を伴う体細胞変異されたヒトコブラクダVLファミリーVL3-1(Camvl8、18、19、20及び23)、並びにL1に関してフォールド11(L1:11)及びL2に関してフォールド7(L2:7)を伴う体細胞変異されたヒトコブラクダVLファミリーVL3-12/32(Camvl11)、並びにL1に関してフォールド14(L1:14)及びL2に関してフォールド7(L2:7)を伴う体細胞変異されたヒトコブラクダVL1-40(Camvl44)、並びにL1に関してフォールド14(L1:14)及びL2に関してフォールド7(L2:7)を伴う体細胞変異されたヒトコブラクダVL2-18(Camvl5、17、30-33、36、52、57、59、60及び65)について、L1のカノニカルフォールドに関連した重要残基2、25、29、30、33及び71が、同じカノニカルフォールドの組合せを伴う類似のヒト生殖系列ファミリー由来のものと一緒に示されている(表3上側部分)。L1に関してフォールド11(L1:11)及びL2に関してフォールド7(L2:7)を伴う体細胞変異されたヒトコブラクダVLファミリーVL3-1(Camvl8、18、19、20及び23)、並びにL1に関してフォールド11(L1:11)及びL2に関してフォールド7(L2:7)を伴う体細胞変異されたヒトコブラクダVLファミリーVL3-12/32(Camvl11)、並びにL1に関してフォールド14(L1:14)及びL2に関してフォールド7(L2:7)を伴う体細胞変異されたヒトコブラクダVL1-40(Camvl44)、並びにL1に関してフォールド14(L1:14)及びL2に関してフォールド7(L2:7)を伴う体細胞変異されたヒトコブラクダVL2-18(Camvl5、17、30-33、36、52、57、59、60及び65)について、L2のカノニカルフォールドに大切な重要残基48及び64が、同じカノニカルフォールドの組合せを有する類似のヒト生殖系列ファミリー由来の重要残基と一緒に示されている(表3下側部分)。
予測されたL1(κ)及びL2(κ)のカノニカル構造を、ループの長さ及び重要残基の存在をベースにして、体細胞変異されたヒトコブラクダVκセグメントについて解析した。前述のように、この比較は、カノニカルフォールドの同じ組合せ及び全体の配列の相同性を持つ、最も近いマッチングのヒト生殖系列に生じる重要残基で行った(表5)。L1に関してフォールド3(L1:3)及びL2に関してフォールド1(L2:1)を伴う体細胞変異されたヒトコブラクダVKファミリーVK2-40(Kp1、3、6、7、10、20及び48)について、L1のカノニカルフォールドに関連した重要残基2、25、29、30e、33及び71が、同じカノニカルフォールドの組合せを伴う類似のヒトVκ生殖系列ファミリー2由来のものと一緒に示されている。加えて、Moreaらにより提唱されたような対応するカノニカルフォールドと同等な重要残基は、一番下の列に印されている。重要残基2、25、33及び71に関して完全なマッチが、並びに残基29に関してある程度のマッチが存在する。ヒトコブラクダVκの残基30eは、グリシンの代わりにグルタミンであるが、Moreaとその同僚は、この残基はL1に関するフォールド3と完全に同等であることを示唆している(Moreaらの論文、Methods, 20:267-279 (2000))。
このラクダ科動物のVH及びVL配列の解析は、カノニカルフォールドを規定するヒトの重要残基と、更には超可変ループにおいて認められた残基それら自身と同一でない場合の、非常に高度の相同性を実証している。このことは、圧倒的多数のラクダ科動物の免疫グロブリン配列は、個々の超可変ループについてのみならず、更にはヒトVH及びVLにおいて認められるカノニカルフォールドの組合せについても、ヒト生殖系列において認められるようなカノニカルフォールドを採用することを示唆している。
先に説明されたように、4頭のリャマ末梢血から、リンパ球を単離し、RNAを抽出し、かつランダムプライミングしたcDNAを合成した(de Haardらの論文、JBC 1999)。VHCH1、VLCL及びVKCKの増幅を行い、これらのアンプリコンを、ベクターpCB3においてクローニングし、重鎖又は軽鎖のライブラリーを得た。抗体ドメイン挿入断片の存在をチェックするためのクローンのPCRによるスクリーニングを行った後、個々のクローンを増殖し、かつプラスミドDNAを配列解析のために精製した。
別に指定しない限りは、以下の試験に使用した材料及びプロトコールは、実施例1-9において使用したものと類似していた。
(リャマはIL-1βによりうまく免疫化された)
2頭のリャマ(ラマ・グラマ)を、標準プロトコールに従い(実施例1に説明されたように)、ヒトIL-1βにより免疫化した。
両方のリャマ由来の血清を、免疫化の前(0日目)及び後(28日目)にELISAにより、IL-1βに対する抗体の存在について試験した。図1に示されたように、IL-1βに対する特異的シグナルは、免疫化後にELISAにおいて認められ、血清を10,000倍希釈した後であっても認められた。この高い抗体力価は、特異的かつ好適な免疫応答を示す。
両方の免疫化されたリャマから単離されたPBLは、Haardらの論文(JBC 1999)に説明された戦略をする、ファージミドにおけるFabのRNA抽出、RT-PCR及びPCR-クローニングに使用し、良好な多様性を伴う多様なライブラリー(2〜5×108)を得た。
下記のプライマーを使用した:
VHCH1ライブラリーを、平行して、2工程PCR(タグなしプライマーで25サイクル(工程1)、それに続くタグ付きプライマーで10サイクル(工程2))を用いて構築した。
これらの試験したクローンの最大93%は、完全長Fab配列を無作為に含み、このことはこれらのライブラリーの高い品質を示している。
ファージディスプレイを使用し、ビオチン化されたIL-1βに結合するリャマFabの大きい多様性を同定した。ビオチン化されたIL-1ベータを捕獲するために使用し、タンパク質の活性のあるコンホメーションを保存した。2ラウンドの選択の後、対照に比べ優れた濃厚化が認められた。ファージELISAは、サイトカイン特異的Fabを発現しているクローンの存在を明らかにした(データは示さず)。
94種の単独クローンを増殖し、モノクローナルファージを作製するために使用した。これらのファージは、ファージELISAにおいて使用した。多くのファージは、ビオチン化されたIL-1β上での2ラウンドの選択の後、biot-IL-1βに良好に結合することを示した。
標的特異的VH及びVλドメインは、そのような一般的ヒト生殖系列とマッチし、このことは同一のCDR1及びCDR2長並びに対応するカノニカルフォールドを示している。引き続き最も近いヒト生殖系列を、それらのフレームワーク領域における配列相同性を基に選択した。マッチングしないアミノ酸残基は、他の関連のあるヒト生殖系列中のそれらの存在についてチェックした。マッチングが存在しない場合、これらの残基は、外来(foreign)とカウントした:
・合計14種の標的特異的VHファミリー、9種の標的特異的Vλファミリー及び3種のVκファミリーは、このまず第一の選択を基に同定した。
・14種の抗-IL-1βWT VH及び12種の抗-IL-1βWT VLの最初のパネルは、ヒト生殖系列と驚くほど高い配列相同性を示した。
・これらのVHドメインの33%は、ヒト状況に対し95%以上の出発相同性を有し、かつVLドメインの約44%は、ヒト状況に対し95%以上の出発相同性を有し、更なるヒト化の必要性を排除している。
・VHドメイン2D8は、VH1C2のヒト化型であり、その理由はこれは、最も近いヒト生殖系列と比べより少ない1個の逸脱しているアミノ酸残基を有するからである。その対応するVLドメイン(VL2D8)は、最も近いヒト生殖系列に対し95%の出発相同性を有し、これは更に1つの復帰変異(VL 2G7)により96%に増大された。
・先に説明された方法を用いて評価した場合に、VH及びVLドメインは全て、1つの例外もなく、ヒト3-D結合部位構造を示した(すなわち、マッチングするヒト生殖系列セグメントにおいて生じるようなCDR1及びCDR2と同一のカノニカルフォールドの組合せ)(データは示さず)。
ヒト化は、1E2及び1F2とコードされた2つのIL-1β特異的Fabに行った。最も近いヒト生殖系列に対するアラインメントを基に、それらのVH及びVλフレームワーク領域における変異を提唱した(図2)。ヒトVH3ファミリーへマッチングするVHの生殖系列化には、多くの残基がかかわることが多く、これらは既に公知のラマ・グラマ、ラマ・パコス又はカメールス・ドロメダリウス由来の生殖系列配列において逸脱している。例えば、位置71のアラニン(Kabat番号付け)及び83のリジン及び84のプロリンは、各々、セリン(しかしあるヒト生殖系列VH3メンバーにおいてアラニンが存在する)、アルギニン(しかし多くのヒトVH3生殖系列により、リジンが使用される)及びアラニンに変更されることができる。軽鎖可変配列に関して、ラクダ科動物について生殖系列配列は入手可能ではないが、恐らくリード抗体の大半において変更される、ヒト生殖系列由来のFRにおいて多くの変異が存在する。完全にヒト化された(hum)及び野生型(wt)V領域に加え、残存するわずかに3個の野生型残基を伴う「安全な(safe)変異型」も提唱された。
・1E2のVHドメインの部分的ヒト化(wt Vλ/safe VH)及び完全にヒト化(wt Vλ/hum VH)は、機能的Fabを作出した。
・wt 1F2及びwt 1E2(ヒトCλ及びCH1に融合されたリャマVλ及びVH)
・safe変異型1F2及びsafe変異型1E2(ヒトCλ及びCH1に融合された部分的ヒト化されたVλ)
・hum 1F2及びhum 1E2(ヒトCλ及びCH1に融合された完全にヒト化されたVλ及びVH)
・最も近いヒト生殖系列への1F2 VL及びVHドメインのフレームワーク領域内の復帰変異は、抗原特異性を維持している、部分的(safe)及び完全に(hum)ヒト化された変異型をうまく生じる。
IL-1β特異的クローン1E2のVL及びVH可変ドメインは、ヒトCλ及びCH1定常ドメインへうまく融合され、産生されかつ精製された「キメラ」Fabを生じた。
このキメラ1E2 Fabは、pCB5ファージミド(Δgene3)から、37℃で4時間(o/d)又は28℃で16時間(o/n)の誘導を行うことにより作製した。この野生型リャマ1E2 Fabを、pCB3(gene3含むファージミド)から30℃で16時間の誘導を行うことにより作製した。精製後、これらのFabを、DTT含有(還元型)又は非含有(非還元型)SDS-PAGE上に装荷した。クマーシー染色を行い、予想された分子量バンド(示さず)に、これらのFab又はそれらを構成する軽鎖及び重鎖の存在を巧く示した。
下記表は、以下のELISA実験から生じたOD値を示している。ウェルは、IL1-βのその受容体との結合を阻害することがわかっているマウスモノクローナル抗体(Diaclone SAS社により提供)によりコートした。
陽性対照は、大量の競合するマウスモノクローナル中でスパイクすることにより、ウェルG12中に含まれた(表10においてウェル12G)。
下記実施例は、確立されたマウスモノクローナル抗体アプローチと比較して、本発明により達成され得る機能的多様性を実証している。
10匹のBALB/cマウスを、小さい分子量の組換え生成されたサイトカインにより免疫化した。この免疫化プロトコールの完了後、動物を屠殺し、それらの脾細胞の不死化によりハイブリドーマを作出した。得られたハイブリドーマの上清を、サイトカイン結合ELISAにおいて、引き続き好適なバイオアッセイにおいて試験した。1つの高度に強力なアンタゴニスト及び1つの弱いアンタゴニストを同定することができた。
以下の表は、アルパカ(ラマ・パコス)の生殖系列VHドメインと、最も近いマッチングのヒト生殖系列VHドメインの間のアミノ酸配列相同性比較の結果をまとめている。%相同性は、ラマ・グラマに関して本明細書において説明されたものと同じアルゴリズムを用いて算出した。ラマ・パコスに関する生のVH配列データは示していない:
Claims (86)
- VHドメイン又はVLドメイン中の少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)が、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られる、VHドメイン及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメイン中の超可変ループH1若しくは超可変ループH2のいずれか、又は超可変ループH1及び超可変ループH2の両方が、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られる、請求項1記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VLドメイン中の超可変ループL1若しくは超可変ループL2のいずれか、又は超可変ループL1及び超可変ループL2の両方が、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られる、請求項1又は2記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメイン中の超可変ループH3、又はVLドメイン中の超可変ループL3又は両方が、同じくラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られる、請求項2又は3記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメイン及びVLドメインの両方の中の超可変ループ又は相補性決定領域の各々が、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られる、請求項1記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られた超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)が、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVL遺伝子によりコードされているアミノ酸配列を有する、請求項1〜5のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られた超可変ループ又は相補性決定領域 (CDR)が、ラクダ科ファミリーの種の能動免疫化により得られた通常型抗体の超可変ループ又は相補性決定領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する、請求項1〜5のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記ラクダ科ファミリーの種の能動免疫化により得られたラクダ科VH若しくはVLドメインと比較して、又はラクダ科ファミリーの種のVH若しくはVL遺伝子によりコードされたVH若しくはVLドメインと比較して、VHドメイン又はVLドメインのいずれかの少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域内に少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記ラクダ科ファミリーの種の能動免疫化により得られたラクダ科VH若しくはVLドメインと比較して、又はラクダ科ファミリーの種のVH若しくはVL遺伝子によりコードされたVH若しくはVLドメインと比較して、VHドメイン又はVLドメインのいずれかの少なくとも1個のフレームワーク領域内に少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1〜8のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメインが、ヒト生殖系列又は体細胞変異されたVH遺伝子によりコードされたVHドメインと比較して、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり少なくとも1つのアミノ酸配列ミスマッチを含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VLドメインが、ヒト生殖系列又は体細胞変異されたVL遺伝子によりコードされたVLドメインと比較して、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり少なくとも1つのアミノ酸配列ミスマッチを含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメインが、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり1つ以上のヒトVHドメインと、80%以上、好ましくは85%以上の配列同一性を示す、VHドメインを含む請求項1〜11のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメインが、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり1つ以上のヒトVHドメインと、90%以上の配列同一性を示す、請求項12記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメインが、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり1つ以上のヒトVHドメインと、95%以上の配列同一性を示す、請求項13記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメインが、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり1つ以上のヒトVHドメインと、97%以上の配列同一性を示す、請求項14記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VLドメインが、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり1つ以上のヒトVLドメインと、80%以上、好ましくは85%以上の配列同一性を示す、VLドメインを含む請求項1〜15のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VLドメインが、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり1つ以上のヒトVLドメインと、90%以上の配列同一性を示す、請求項16記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VLドメインが、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり1つ以上のヒトVLドメインと、95%以上の配列同一性を示す、請求項17記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VLドメインが、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり1つ以上のヒトVLドメインと、97%以上の配列同一性を示す、請求項18記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメイン又はVLドメインのいずれかの中の少なくとも1個の超可変ループが、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られ、かつヒト抗体において生じるカノニカルフォールド構造と実質的に同一である予測された又は実際のカノニカルフォールド構造を示す、請求項1〜19のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメイン中の超可変ループH1及び超可変ループH2が、各々、ラクダ科ファミリーの種のVHドメインから得られ、かつ各々、ヒト抗体において生じるカノニカルフォールド構造と実質的に同一である予測された又は実際のカノニカルフォールド構造を示す、請求項20記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメイン中の超可変ループH1及び超可変ループH2が、ヒト生殖系列VHドメインにおいて生じることがわかっているカノニカルフォールド構造の組合せと同一である予測された又は実際のカノニカルフォールド構造の組合せを形成する、請求項21記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメイン中の超可変ループH1及び超可変ループH2が、1-1、1-2、1-3、1-4、1-6、2-1、3-1及び3-5からなる群から選択されるカノニカルフォールド組合せを形成する、請求項22記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたりヒトVHドメインと80%以上配列同一性を示し、かつ超可変ループH1及び超可変ループH2が、同じヒトVHドメインにおいて天然に生じることがわかっているカノニカルフォールド組合せと同じである予測された又は実際のカノニカルフォールド構造の組合せを形成する、請求項22又は23記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VLドメイン中の超可変ループL1及び超可変ループL2が、各々、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVLドメインから得られ、かつ各々、ヒト抗体において生じるカノニカルフォールド構造と実質的に同一である予測された又は実際のカノニカルフォールド構造を示す、請求項21〜24のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VLドメイン中の超可変ループL1及び超可変ループL2が、ヒト生殖系列VLドメインにおいて生じることがわかっているカノニカルフォールド構造の組合せと同一である予測された又は実際のカノニカルフォールド構造の組合せを形成する、請求項25記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VLドメイン中の超可変ループL1及び超可変ループL2が、11-7、13-7(A,B,C)、14-7(A,B)、12-11、14-11、12-12、2-1、3-1、4-1及び6-1のカノニカルフォールド組合せのひとつを形成する、請求項26記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記VHドメイン及び/又はVLドメインが、ラクダ科ファミリーの種のVH又はVL遺伝子によりコードされているアミノ酸配列を有する、請求項1記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記ラクダ科ファミリーの種が、フタコブラクダ、リャマ、ヒトコブラクダ、ヴィクーニャ、グアナコ及びアルパカからなる群から選択される、請求項1〜28のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 標的抗原と免疫反応性である、請求項1〜29のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 標的抗原と特異的に結合する、請求項1〜30のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記標的抗原が、非ラクダ科動物の抗原である、請求項30又は31記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記標的抗原が、ヒト抗原である、請求項32記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記標的抗原が、ウイルス抗原又は細菌抗原である、請求項32記載の抗原結合ポリペプチド。
- 前記標的抗原が、治療上又は診断上重要な標的である、請求項30〜34のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- キメラポリペプチドである、請求項1〜35のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 組換えにより発現されたポリペプチドである、請求項1〜36のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 抗体である、請求項1〜37のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされているアミノ酸配列、又はそれと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する少なくとも1個の定常ドメインを含む、請求項1〜38のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- ヒト抗体の完全定常領域を含む、請求項39記載の抗原結合ポリペプチド。
- Fab、Fab'、F(ab')2、二重特異性Fab'、Fv断片、ダイアボディ、線状抗体、単鎖可変部断片(scFv)又は抗体断片から形成された多重特異性抗体である、請求項1〜37のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド。
- 請求項1〜41のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチドをコードしているか、又は断片がラクダ科ファミリーの種のVH若しくはVLドメインから得られた少なくとも1個の超可変ループ若しくは相補性決定領域(CDR)を含む、該抗原結合ポリペプチドの断片をコードしている、ポリヌクレオチド分子。
- 宿主細胞又は無細胞発現システムにおける前記抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする調節配列に機能的に連結されている、請求項42記載のポリヌクレオチド分子を含む、発現ベクター。
- 請求項43記載の発現ベクターを含む、宿主細胞又は無細胞発現システム。
- 前記抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項44記載の宿主細胞又は無細胞発現システムを培養すること、並びに発現された抗原結合ポリペプチドを回収することを含む、組換え抗原結合ポリペプチドを作製する方法。
- 標的抗原と免疫反応性である抗原結合ポリペプチドを調製する方法であって、該方法が:
(a)前記標的抗原と免疫反応性であるラクダ科の通常型抗体のVH及び/又はVLドメインの少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)をコードしているヌクレオチド配列を決定すること;並びに
(b)該標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドを発現することであり、該抗原結合ポリペプチドが、VH及びVLドメインを含み、ここでこのVHドメイン又はVLドメインの少なくとも1個の超可変ループ若しくは相補性決定領域(CDR)は、パート(a)において決定されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を有すること:を含む、前記方法。 - 前記パート(a)のラクダ科通常型抗体が、ラクダ科ファミリーの種の免疫化、それによる該標的抗原と免疫反応性である通常型抗体の産生により得られる、請求項46記載の方法。
- 前記工程(a)が、該標的抗原と免疫反応性のラクダ科通常型抗体のVH及び/又はVLドメインをコードしているヌクレオチド配列を決定することを含み;並びに、工程(b)が、該標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドを発現することを含み、該抗原結合ポリペプチドが、VH及びVLドメインを含み、ここでVHドメイン又はVLドメインの少なくとも1つは、パート(a)において決定されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を有する、請求項46又は47記載の方法。
- 前記工程(b)において発現された抗原結合ポリペプチドが、非ラクダ科動物の抗体、好ましくはヒト抗体の少なくとも1個の定常ドメインを含む、請求項46〜48のいずれか1項記載の方法。
- 標的抗原と免疫反応性である(又は特異的に結合する)組換え抗原結合ポリペプチドを調製する方法であって、該抗原結合ポリペプチドが、VHドメイン及びVLドメインを含み、ここでこのVHドメイン又はVLドメイン中の少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)が、ラクダ科ファミリーの種から得られ、該方法が:
(a)該標的抗原と免疫反応性のラクダ科通常型抗体のVH及び/又はVLドメインの少なくとも1個の超可変ループ又は相補性決定領域(CDR)をコードしているラクダ科核酸を単離する工程;
(b)工程(a)において単離された核酸によりコードされた超可変ループ又は相補性決定領域と同一のアミノ酸配列を有する超可変ループ又は相補性決定領域をコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを調製する工程であり、このポリヌクレオチドが、該標的抗原と免疫反応性である(又は特異的に結合する)VHドメイン及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチドをコードしている、工程;並びに
(c)工程(b)の組換えポリヌクレオチドから該抗原結合ポリペプチドを発現する工程であり、ここで該抗原結合ポリペプチドは、パート(a)のラクダ科の通常型抗体と同一ではない、工程:を含む、前記方法。 - 前記工程(a)が、該抗体のVHドメイン及び/又はVLドメインをコードしているラクダ科核酸を単離すること、並びに該核酸が、1個以上のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を伴うVHドメイン及び/又はVLドメインをコードするように、該核酸の配列を変更することを含む、請求項50記載の方法。
- 前記工程(b)において調製された組換えポリヌクレオチドが、非ラクダ科動物の抗体、好ましくはヒト抗体の1個以上の定常ドメインをコードしているヌクレオチド配列を追加的に含む、請求項50又は51記載の方法。
- 前記工程(a)のラクダ科の通常型抗体が、ラクダ科ファミリーの種の免疫化、それによる該標的抗原に対する通常型抗体の産生により得られる、請求項50〜52のいずれか1項記載の方法。
- 前記ラクダ科ファミリーの種が、フタコブラクダ、リャマ、ヒトコブラクダ、ヴィクーニャ、グアナコ又はアルパカである、請求項53記載の方法。
- 前記標的抗原が、ヒト抗原、ウイルス抗原、細菌抗原及び治療上又は診断上重要な標的抗原からなる群から選択される、請求項53又は54記載の方法。
- 前記方法により調製された抗原結合ポリペプチドが、パート(a)のラクダ科の通常型抗体と同一ではない、請求項46〜55のいずれか1項記載の方法。
- 請求項46〜56のいずれか1項記載の方法により入手可能である、請求項1記載の抗原結合ポリペプチド。
- 請求項1〜41のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチドを備える、試験キット。
- 前記試験キットが、該抗原結合ポリペプチドを使用するイムノアッセイを実行するために必要とされる少なくとも1種の追加試薬を備える、請求項58記載の試験キット。
- 請求項1〜41のいずれか1項記載の抗原結合ポリペプチド、及び少なくとも1種の医薬として許容し得る希釈剤、賦形剤又は担体を含有する、医薬製剤。
- ラクダ科の通常型抗体のVH及び/又はVLドメインをコードしている発現ベクターのライブラリーを作製する方法であって、該方法が:
a)増幅された遺伝子セグメントを得るために、ラクダ科の通常型抗体のVH及び/又はVLドメインをコードしている核酸分子の領域を増幅する工程であって、各遺伝子セグメントが、ラクダ科の通常型抗体のVHドメインをコードしているヌクレオチド配列又はVLドメインをコードしているヌクレオチド配列を含む、工程;並びに
b)各発現ベクターが、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及び/又はVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを少なくとも含むように、工程a)において得られた遺伝子セグメントを発現ベクターにクローニングし、これにより発現ベクターのライブラリーが得られる工程:を含む、前記方法。 - 前記工程a)において増幅された核酸が、ラクダ科動物のリンパ系組織から調製されたcDNA又はゲノムDNAを含み、該リンパ系組織が、B細胞、リンパ節、脾細胞、骨髄細胞の1種以上、又はそれらの組合せを含む、請求項61記載の方法。
- 前記リンパ系組織が、能動免疫化されたラクダ科動物から得られる、請求項62記載の方法。
- 前記リンパ系組織が、所望の抗原結合特性を伴うラクダ科動物の通常型抗体の発現のために選択された1種以上のB細胞を含む、請求項62又は63記載の方法。
- 前記標的抗原が、ヒト抗原、ウイルス抗原、細菌抗原及び治療上又は診断上重要な標的抗原からなる群から選択される、請求項64記載の方法。
- 前記工程b)が、VH及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを発現ベクターへクローニングし、発現ベクターのライブラリーを作製することを含み、ここで該ライブラリー中の各発現ベクターが、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、かつ該VHドメイン及び該VLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示する、請求項61〜65のいずれか1項記載の方法。
- 前記ライブラリー中の発現ベクターが、ファージベクター、ファージミドベクター、酵母、哺乳類の発現ベクター及び細菌発現ベクターからなる群から選択される、請求項61〜66のいずれか1項記載の方法。
- ラクダ科の通常型抗体のVH及びVLドメインをコードしている発現ベクターのライブラリーを作製する方法であって、該方法が:
a)ラクダ科動物を能動免疫化し、これにより標的抗原に対する通常型のラクダ科動物の抗体を産生する工程;
b)該免疫化されたラクダ科動物由来のリンパ系組織(例えば循環B細胞)を含有する試料から、cDNA又はゲノムDNAを調製する工程;
c)該cDNA又はゲノムDNAの領域を増幅し、増幅された遺伝子セグメントを得、各遺伝子セグメントが、ラクダ科の通常型抗体のVHドメインをコードしているヌクレオチド配列又はVLドメインをコードしているヌクレオチド配列を含む工程;並びに
d)各発現ベクターが、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、かつ該VHドメイン及び該VLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示するように、工程c)において得られた遺伝子セグメントを発現ベクターへクローニングし、これにより発現ベクターのライブラリーが得られる工程:を含む、前記方法。 - 前記工程d)において得られた発現ベクターが、scFV、Fab及び抗体からなる群から選択される抗原結合ポリペプチドの形での該VHドメイン及び該VLドメインの発現を指示する、請求項68記載の方法。
- 前記ラクダ科動物が、リャマ又はアルパカである、請求項61〜69のいずれか1項記載の方法。
- 請求項61〜70のいずれか1項記載の方法により作製された発現ベクターのライブラリー。
- 標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを調製する方法であって、該方法が:
i)発現ベクターのライブラリーを調製する工程であり、ここで該ライブラリー中の各ベクターが、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、ここで該VHドメイン又は該VLドメインの少なくとも1つは、ラクダ科動物の通常型抗体に由来し、かつここで該ライブラリー中の各ベクターは、該VHドメイン及びVLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示する工程;
ii)該標的抗原と免疫反応性である該ライブラリーによりコードされた抗原結合ポリペプチドをスクリーニングし、かつこれにより該標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程:を含む、前記方法。 - 前記VHドメイン及び該VLドメインの両方が、ラクダ科動物の通常型抗体に由来する、請求項72記載の方法。
- 前記工程i)のライブラリーが、請求項66〜69、72又は73のいずれか1項記載の方法により調製される、請求項73記載の方法。
- iii)前述のパート(ii)で選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びパート(ii)で選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを、ヒト抗体の1個以上の定常ドメインをコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結されている更なる発現ベクターへクローニングし、これによりヒト抗体の1個以上の定常ドメインに融合された工程ii)において選択されたVH及びVLドメインを含むキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製する更なる工程を含む、請求項72〜74のいずれか1項記載の方法。
- 前記パート(ii)で選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及び/又はパート(ii)で選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントが、更なる発現ベクターへクローニングされる前に、該VH及び/又は該VLドメインをコードしているヌクレオチド配列に1つ以上の変更を導入するように操作される、請求項75記載の方法。
- iii)発現ベクターの第二のライブラリーを調製する工程であり、ここで該ライブラリー中の各ベクターが、工程ii)で選択された発現ベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含む工程;
iv)該標的抗原との免疫反応性について、該第二のライブラリーによりコードされた抗原結合ポリペプチドをスクリーニングし、これにより該標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程:を含む、軽鎖シャッフリングプロセスを更に含む、請求項72〜74のいずれか1項記載の方法。 - v)前記パート(iv)で選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びパート(iv)で選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを、ヒト抗体の1個以上の定常ドメインをコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結されている更なる発現ベクターへクローニングし、これによりヒト抗体の1個以上の定常ドメインに融合された工程iv)において選択されたVH及びVLドメインを含むキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製する更なる工程:を含む、請求項77記載の方法。
- 前記パート(iv)で選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及び/又はパート(iv)で選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントが、更なる発現ベクターへクローニングされる前に、該VH及び/又は該VLドメインをコードしているヌクレオチド配列において1つ以上の変更を導入するように操作される、請求項78記載の方法。
- v)発現ベクターの第三のライブラリーを調製し、ここで該ライブラリーの各ベクターが、工程iv)で選択された発現ベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVHドメインをコードしている遺伝子セグメントを含む工程;
vi)該標的抗原との免疫反応性について、該第三のライブラリーによりコードされた抗原結合ポリペプチドをスクリーニングし、これにより該標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程:を含む、重鎖シャッフリングプロセスを更に含む、請求項77記載の方法。 - vii)前記パート(vi)で選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びパート(vi)で選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを、ヒト抗体の1個以上の定常ドメインをコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結されている更なる発現ベクターへクローニングし、これによりヒト抗体の1個以上の定常ドメインと融合された工程vi)において選択されたベクターのVH及びVLドメインを含むキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製する更なる工程:を含む、請求項80記載の方法。
- 前記パート(vi)で選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及び/又はパート(vi)で選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントが、更なる発現ベクターへクローニングされる前に、該VH及び/又は該VLドメインをコードしているヌクレオチド配列に1つ以上の変更を導入するように操作される、請求項81記載の方法。
- 請求項72〜82のいずれか1項記載の方法により調製された発現ベクター。
- 標的抗原と免疫反応性のキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製する方法であって、該方法が:
a)ラクダ科動物(リャマ又はアルパカ)を能動免疫化し、これにより標的抗原に対する通常型のラクダ科動物の抗体を産生する工程;
b)該免疫化されたラクダ科動物由来のリンパ系組織(例えば循環B細胞)を含有する試料からcDNA又はゲノムDNAを調製する工程;
c)該cDNA又はゲノムDNAの領域を増幅し、増幅された遺伝子セグメントを得る工程であって、各遺伝子セグメントは、ラクダ科動物の通常型抗体のVHドメインをコードしているヌクレオチド配列又はVLドメインをコードしているヌクレオチド配列を含む工程;
d)前記工程c)で得られた遺伝子セグメントを、発現ベクターへクローニングし、その結果各発現ベクターは、VHドメインをコードしている遺伝子セグメント及びVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを含み、かつ該VHドメイン及び該VLドメインを含む抗原結合ポリペプチドの発現を指示し、これにより発現ベクターのライブラリーを作製する工程;
e)該標的抗原との免疫反応性について、工程d)で得られたライブラリーによりコードされた抗原結合ポリペプチドをスクリーニングし、これにより該標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程;
f)軽鎖シャッフリング工程及び/又は重鎖シャッフリング工程を任意に実行し、該標的抗原と免疫反応性の効力最適化された抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを選択する工程;
g)工程e)若しくは工程f)で選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント及び/又は工程e)若しくは工程f)で選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメントを、任意に生殖系列化及び/又はコドン最適化に供する工程;並びに
h)前記パートe)若しくはf)で選択されたベクターのVHドメインをコードしている遺伝子セグメント又は工程g)において作製された生殖系列化及び/若しくはコドン最適化されたVH遺伝子セグメント、並びにパートe)若しくはf)で選択されたベクターのVLドメインをコードしている遺伝子セグメント、又は工程g)において作製された生殖系列化及び/若しくはコドン最適化されたVL遺伝子セグメントを、ヒト抗体の1個以上の定常ドメインをコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結されている更なる発現ベクターへクローニングし、これによりヒト抗体の1個以上の定常ドメインに融合されたVH及びVLドメインを含むキメラ抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを作製する工程:を含む、前記方法。 - 請求項84記載の方法により調製された発現ベクター。
- 標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドを作製する方法であって、該方法が:
a)請求項72〜82のいずれか1項記載の方法又は請求項84記載の方法を使用し、標的抗原と免疫反応性の抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターを調製する工程;
b)該発現ベクターを、コードされた抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、宿主細胞又は無細胞発現システムへ導入する工程;並びに
c)発現された抗原結合ポリペプチドを回収する工程:を含む、前記方法。
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