WO2004065611A1 - 抗体の軽鎖スクリーニング方法 - Google Patents

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WO2004065611A1
WO2004065611A1 PCT/JP2004/000496 JP2004000496W WO2004065611A1 WO 2004065611 A1 WO2004065611 A1 WO 2004065611A1 JP 2004000496 W JP2004000496 W JP 2004000496W WO 2004065611 A1 WO2004065611 A1 WO 2004065611A1
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antibody
light chain
heavy chain
host
phage
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PCT/JP2004/000496
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Inventor
Tetsuo Kojima
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening for a common light chain that exhibits high affinity corresponding to heavy chains having different specificities of a multispecific antibody.
  • a bispecific antibody is sometimes called a bifunctional antibody, and it can react with two types of antigens that have specific binding sites for two antigenic determinants. It is a multivalent antibody that can be obtained.
  • BsAb can be produced using a hybrid of two different types of monoclonal antibody-producing cells, called hybrid hybridomas, or quadromas (U.S. Pat. No. 4,474,893; Bos and W. Nieuwenhuitzen (1992) Hybridoma 11 (1): 41-51).
  • hybrid hybridomas or quadromas
  • Fab antigen-binding fragments
  • Fab fragments of the two types of monoclonal antibodies are ligated chemically (M. Brennan et al.
  • Immunol Methods 201: 57-66 As a method of solving such problems and obtaining a BsAb with a higher yield, for example, a Fab'-thionitrobenzoic acid (TNB) derivative and an antibody fragment such as Fab'-thiol (SH) are chemically linked. Methods are known (Brennan et al. (1985) Science 229: 81). Furthermore, as a method for more easily obtaining a Fab'-SH fragment that can be chemically ligated, a method of producing a Fab'-SH fragment from a host such as Escherichia coli by a gene recombination technique is known (Shalaby et al. (1992) ) J. Exp. Med.
  • Diapodes are two types of fragments that are linked by a linker that is so short that the light chain variable region (VL) and heavy chain variable region (VH) constructed by gene fusion cannot bind to each other.
  • VL light chain variable region
  • VH heavy chain variable region
  • Patent Document 1 describes a method for producing a multispecific antibody having a common light chain bound to a heteromeric polypeptide having an antibody binding domain.
  • BsAbs having specific binding ability to two different antigens are useful as targeting agents in clinical fields such as immunodiagnosis, therapy and immunoassay in vitro and in vivo.
  • one arm of BsAb so as to bind to an epitope that does not inhibit the enzyme reaction on the enzyme used for the enzyme immunoassay, and to bind the other arm to a carrier for immobilization. It can be used as a medium for binding an enzyme on a carrier (Hammerling et al. (1968) J. Exp. Med. 128: 1461-73).
  • Other examples include antibody-targeted thrombolytic therapy. As the therapy, it has been studied to use an antibody such as perokinase, streptokinase, tissue plasminogen activator, or properokinase, or a protein such as its precursor or the like, which specifically transports in a fibrin contained in a thrombus. (T.
  • an antibody specific to a specific antigen can be produced by genetic engineering (J. Xiang et al. (1990) Mol. Immunol. 27: 809; CR, Bebbington et al. (1992) Bio / Technology 10: 169).
  • a method for obtaining antigen-specific heavy and light chains a method using phage or phagemid using E. coli as a host is known (WD Huse et al. (1989) Science 246: 1275; J. McCafferty). et al, (1990) Nature 348: 552; AS Kang et al. (1991) Proc.
  • an antibody library is produced by producing Fab to form an antibody library, or by producing a fusion protein of Fab or single-chain Fv and a phage coat protein. Finally, antigen-specific antibodies and their genes are selected from those antibody libraries by examining the antigen-binding properties.
  • Patent Document 1 Japanese Translation of PCT Application No. 2000-01-5230971 Disclosure of the Invention
  • bispecific IgG In the production of bispecific IgG, two antibodies against different antigens are selected, and the two heavy chain genes and two light chain genes are introduced into a cell. As mentioned, there are 10 ways.
  • Patent Document 1 a method for preferentially expressing a heavy chain combination by introducing an amino acid substitution into the CH3 portion of IgG was developed, and the light chain was further shared. It has been proposed that efficient expression of bispecific IgG can be achieved by this. However, if you select two arbitrary antibodies, they are unlikely to contain the same light chain, making it difficult to implement the above idea. The present invention is any different? A method for screening a common light chain corresponding to a heavy chain and exhibiting a high affinity is provided.
  • the present inventors have developed a common light chain corresponding to different heavy chains that can be used for the production of BsAb and exhibiting high affinity for an antigen, (1) antibody A against antigen A, and antibody B against antigen B.
  • An expression vector for a gene encoding the heavy chain of the antibody preferably the Fd portion, ie, a region containing VH and CH1 is introduced, and a secretory strain of each heavy chain Ha (antibody A) (secreting the heavy chain of A) and Hb (secreting the heavy chain of antibody B)), and (3) separately constructing a library in which the light chain is expressed as a fusion protein with the phage surface protein.
  • the light chain library was introduced into Escherichia coli Ha to obtain a phage library in which an antibody consisting of the heavy chain of antibody A and various light chains (Fab when the heavy chain was Fd) was displayed on the surface.
  • Secretion (Fig. 1), (5) enriching the clones from the library by panning with antigen A, (6) infecting the resulting clones with Escherichia coli Hb, By obtaining a phage library displaying an antibody consisting of a light chain (Fab when the heavy chain is the Fd portion) on the surface, (7) repeating the step of enriching clones by baning the library with antigen B (Fig. 2) Was.
  • the present invention relates to the following inventions.
  • a method for screening a common light chain comprising the following steps.
  • step (b) introducing the antibody light chain library into the host of step (a) to secrete a phage library displaying an antibody composed of the heavy chain and the light chain
  • step (d) introducing the phage library selected in step (c) into a host that secretes a heavy chain of an antibody that binds to a desired antigen different from the antigen in step (a); For secreting a phage library displaying an antibody composed of a light chain and a light chain
  • step (b) introducing the antibody light chain library into the host of step (a), wherein the heavy chain and the light chain For secreting a phage library displaying an antibody composed of
  • step (d) introducing the phage library selected in step (c) into a host secreting a heavy chain having an amino acid sequence different from that of the heavy chain in step (a), comprising the heavy chain and the light chain; For secreting a phage library displaying the antibody to be expressed
  • step (f) introducing the phage library selected in step (e) into a host that secretes a heavy chain of an antibody that binds to a desired antigen different from the antigen in step (a) and ( Secreting a phage library displaying antibodies composed of heavy and light chains
  • step (f) introducing the phage library selected in step (e) into a host that secretes a heavy chain having an amino acid sequence different from the heavy chain in steps (a) and (d), Secretion of phage library expressing antibodies composed of light chains
  • step (g) presenting an antibody that specifically binds to the antigen recognized by the heavy chain described in step (f) A phage library to be selected
  • Escherichia coli that is infected with a phage capable of displaying a light chain and has a vector capable of expressing a heavy chain.
  • the present invention provides (a) a step of producing a host that secretes a heavy chain of an antibody that binds to a desired antigen; (b) introducing an antibody light chain library into the host of step (a); And producing a library that presents an antibody composed of the light chain; (c) selecting a library that presents an antibody that specifically binds to the desired antigen according to step (a); (D) introducing the library selected in step (c) into a host secreting a heavy chain of an antibody that binds to a desired antigen different from the antigen in step (a); And (e) selecting a library that presents an antibody that specifically binds to a desired antigen according to step (d).
  • the present invention relates to a method for screening for a common light chain containing the same.
  • the method of the present invention can be used to select a common light chain that corresponds specifically to the different heavy chains available for the production of BsAbs and exhibits high affinity for antigen.
  • steps (b) and (c;) By repeating (b) to (e) using a host that secretes a different type of heavy chain and its corresponding antigen, multispecificity that shows specificity not only for BsAb but also for three or more types of antigens It is possible to screen for a common light chain that corresponds to more heavy chains and has a high affinity for an antigen, which can be used for producing antibodies.
  • the multispecific antibodies described herein are antibodies that can specifically bind to at least two different antigens.
  • Preferred multispecific antibodies include BsAbs that can specifically bind to two antigens.
  • the “different antigen” does not necessarily have to be different from the antigen itself, and the case where the antigenic determinant is different is included in the “different antigen” of the present invention. Therefore, for example, different antigenic determinants in a single molecule are also included in the different antigens of the present invention, and two antibodies that respectively recognize such different antigenic determinants in a single molecule are different in the present invention. Treated as an antibody that recognizes the antigen.
  • the “common light chain” is a light chain that can associate with two or more different heavy chains and exhibit binding ability to each antigen.
  • “different heavy chains” preferably refers to heavy chains of antibodies to different antigens, but is not limited thereto, and means heavy chains having different amino acid sequences from each other. Accordingly, the present invention provides a method for producing a host that secretes a heavy chain of an antibody that binds to a desired antigen; (b) introducing an antibody light chain library into the host of step (a); Producing a library that presents an antibody composed of a light chain and the light chain; and (c) selecting a library that presents an antibody that specifically binds to the desired antigen described in step (a).
  • step (D) introducing the library selected in step (c) into a host secreting a heavy chain having an amino acid sequence different from that of the heavy chain in step (a), and comprising the heavy chain and the light chain; Secreting a phage library displaying the antibody to be expressed, and (e) selecting a phage library that presents an antibody that specifically binds to the antigen recognized by the heavy chain described in step (d);
  • a host secreting a heavy chain having an amino acid sequence different from that of the heavy chain in step (a), and comprising the heavy chain and the light chain Secreting a phage library displaying the antibody to be expressed, and (e) selecting a phage library that presents an antibody that specifically binds to the antigen recognized by the heavy chain described in step (d);
  • For common light chains including Also relates to a method.
  • the present invention relates to heavy chains of two or more different antibodies and has a high affinity for the antigen.
  • the present invention relates to a method of screening for a common light chain indicating a tee.
  • the screening method of the present invention first, it is necessary to obtain a host that secretes a heavy chain of an antibody that binds to a desired antigen.
  • a host that secretes a heavy chain of an antibody that binds to a desired antigen For example, in the case of producing BsAb, two types of hosts that secrete heavy chains corresponding to each of the two desired antigens are required. Four specific antibodies are required.
  • the description will focus on a method for screening a common heavy chain in BsAb, for example.
  • antibodies to two antigens are selected, and cells producing them are obtained. I do.
  • an antibody against antigen A is referred to as antibody A
  • an antibody against antigen B is referred to as antibody B.
  • These antibody-producing cells can be obtained by immunizing an animal with an appropriate sensitizing antigen.
  • antibody-producing lymphocytes can be immunized in iro to produce antibody-producing cells.
  • mammals to be immunized various mammals can be used, but rodents, ephedra, and primates are generally used.
  • mice such as mice, rats, and hamsters
  • primates such as egrets
  • primates such as monkeys such as cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, baboons, and chimpanzees.
  • transgenic animals having a repertoire of human antibody genes are known, and human antibodies can be obtained by using such animals (W096 / 34096; Mendez et al. (1997) t. Genet. 15: 146-56).
  • the sensitizing antigen is appropriately diluted and suspended in Phosphate-Buffered Saline (PBS) or physiological saline, etc., mixed with an adjuvant if necessary, and emulsified, and then intraperitoneally or subcutaneously in animals. This is done by injection. Thereafter, the sensitizing antigen mixed with Freund's incomplete adjuvant is preferably administered several times every 4 to 21 days. Confirmation of antibody production can be performed by measuring the antibody titer of interest in animal serum by a conventional method.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline physiological saline
  • Antigens that immunize animals include immunogenic whole antibodies and immunogenic Either of the incomplete antigens (including haptens) can be utilized.
  • substances consisting of proteins, polypeptides, polysaccharides, nucleic acids, lipids, etc. can be used as antigens.
  • an immunogen used to immunize animals if necessary, an antigen molecule is conjugated to another molecule (for example, keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, dicycloglobulin, soybean trypsin inhibitor, etc.) This can be used as a soluble antigen. Further, in some cases, the fragment of the soluble antigen may be used as an immunogen.
  • transmembrane molecule such as a receptor
  • these fragments are preferably used.
  • a cell that expresses a transmembrane molecule on the cell surface may be used as an immunogen.
  • Such cells include cells derived from nature (tumor cell lines and the like), but cells expressing transmembrane molecules may be prepared by gene recombination techniques.
  • the method for selecting a common light chain of the present invention is applicable to producing Bs Abs for various antigens.
  • the BsAb is intended for use in cancer therapy, for example, one arm of the antibody may be prepared to recognize a tumor cell antigen and the other arm may contain a molecule that induces cytotoxicity. Can be designed to recognize.
  • tumor cell antigens examples include 1D10 (malignant B cells), AM0C-1 (pan carcinoma asso ciated antigen), CAMA1, CD7, CD15, CD19, CD22, CD38, CEA, EGF receptor, Id-1, L- Dl (colorectal cancer), MoV18, p97, pl85 HER2 , OVCAR-3., Neural cell adhesion molecule (NCAM), renal cell carcinoma, melanocyte stimulating hormone analog, folate binding protein (FBP), etc. No. Examples of molecules that induce cytotoxicity include CD3, CD16, and FCT / RI.
  • BsAbs can also be designed to bind to toxins such as IFN-CK, saponin, pinning alloid, and ricin A chain.
  • a BsAb such that sAbs can be used as agonist antibodies that can mimic receptor dimerization by ligands.
  • BsAb which binds to CD30 and alkaline phosphatase and interacts with enzymes that aid in the conversion of chemical substances, such as converting mitomycin phosphate to mitomycin alcohol
  • fibrinolytic agents can be used as, fibrin, tPA, BsAb which binds to uPA or the like
  • LDL ⁇ Pi Fc receptor FC T / RI, Fc RI ⁇ or Fc 7 RIII bound immune complexes cell surface receptors, etc.
  • BsAb that can be used for infectious diseases that recognize antigens on T cells such as CD3 and antigens of pathogenic bacteria such as HCV, influenza and HIV and (5) Can be used for tumor detection BsAb that binds to tumor antigens and detectable substances such as E0TUBE, DPTA, hapten, etc., and (6) BsAb that can be used as a vaccine adjuvant (Fanger et al. (1992) Crit. Rev. Immunol. 12: (See 101-24), and (7) Can be used in diagnosis.
  • Detectable substances such as heron IgG, horseradish peroxidase (HRP), FIT (:, j3-galactosidase), and BsAb with antigens such as hormones, ferritin, somatostatin, substance P, CEA, etc.
  • HRP horseradish peroxidase
  • FIT :, j3-galactosidase
  • BsAb with antigens such as hormones, ferritin, somatostatin, substance P, CEA, etc.
  • the method for selecting a common light chain of the present invention is known from the production of various multispecific antibodies containing these known BsAbs (see W089 / 02922 pamphlet, EP314, 317, US5116964). ) Can be used.
  • an antibody-producing cell obtained from an animal or lymphocyte immunized with the desired antigen is fused with myeloma cells using a conventional fusion agent (eg, polyethylene glycol) to produce a hybridoma.
  • a conventional fusion agent eg, polyethylene glycol
  • the hybridoma producing the antibody whose specificity, affinity or activity of interest has been measured can be subcloned by a technique such as limiting dilution.
  • the genes encoding the heavy chains of the selected antibodies A and B can be obtained from hybridomas or antibody-producing cells (such as sensitized lymphocytes) by a probe capable of specifically binding to the heavy chains (for example, Using an oligonucleotide complementary to the sequence coding for the antibody constant region). It is also possible to clone from mRNA by RT-PCR.
  • Immunoglobulins fall into five different classes: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM.
  • these classes are several subclasses (isotypes) (for example, IgG-1, IgG-2, IgG-3, and IgG-4; I g A- 1 ⁇ Pi IgA - 2, etc.) is divided into.
  • the antibody heavy chain used in the present invention may belong to any of these classes and subclasses, and is not particularly limited. IgG is particularly preferred.
  • a gene encoding the desired antibody or antibody fragment can also be obtained from the antibody library using the binding property to the desired antigen instead of the above-described hybridoma.
  • the construction of antibody libraries is well known and can be created and used by various methods. For example, for antibody phage libraries, see Clackson et al.
  • the gene encoding the heavy chain can be modified by genetic engineering techniques. Genetically engineered monoclonal antibody derived from non-human mammals (mouse, rat, hamster, etc.) was replaced by a human immunoglobulin-derived variable region framework structural region other than the CDR (complementarity determining region). Techniques for making "antibodies” are known (eg, Jones et al. (1986) Nature 321: 522-5; Reich band et al. (198 8) Nature 332: 323-9; Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-6).
  • the humanized antibody may include any CDRs or framework sequences introduced into the recipient antibody. It may contain an amino acid residue that is not included in both. Usually, such introduction of an amino acid residue is carried out in order to more accurately optimize the antigen recognition and / or binding ability of the antibody.
  • the heavy chain used for screening in the method of the present invention may be modified such as humanized.
  • modifications may be made to improve the biological properties of the antibody, such as, for example, antigen binding.
  • modification can be performed by a ⁇ method such as site-specific mutagenesis (see, for example, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488), PCR mutation, cassette mutation, and the like. .
  • site-specific mutagenesis see, for example, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488), PCR mutation, cassette mutation, and the like.
  • more than 70%, more preferably more than 80%, even more preferably more than 90% (eg, more than 95%, 97%, 98%, 99%, etc.) of antibody variants with improved biological properties The amino acid sequence homology and / or similarity to the amino acid sequence of the variable region of the antibody heavy chain.
  • the homology and / or similarity of the sequence is determined by homology with the original antibody residue after aligning the sequence as necessary so as to maximize the sequence homology and introducing a gap. It is defined as the percentage of amino acid residues that are (same residues) or similar (amino acid residues classified into the same group based on the properties of the general amino acid side chain).
  • natural amino acid residues are based on the properties of their side chains: (1) hydrophobicity: alanine, isoleucine, nonoleucine, valine, methionine, and leucine; (3) acidity: aspartic acid and glutamic acid; (4) basicity: arginine, histidine and perricin; (5) residues that influence chain orientation: glycine and proline '; and (6) aromatic Gender: Classified into tyrosine, tributan and fenilalanine.
  • the host cell that secretes the antibody heavy chain used in the method of the present invention may be one that secretes the entire length of the antibody heavy chain or one that secretes a partial fragment of the heavy chain. Therefore, the heavy chain of the present invention includes the full length of the antibody heavy chain, and fragments of the heavy chain.
  • the heavy chain fragment is not particularly limited, but is preferably a fragment containing a heavy chain variable region. And preferably a fragment containing the Fd portion (the variable region (VH) and the constant region (CH1) of the heavy chain).
  • VH variable region
  • CH1 constant region
  • the present invention is not particularly limited to this, and a configuration that secretes only the variable region of the heavy chain, a part of the variable region, or a part of the constant region containing other regions (CH2 and 3) may be used. .
  • the gene portion encoding the desired antibody heavy chain is introduced into an expression vector suitable for expression in a suitable host cell.
  • the host cell that secretes the heavy chain is not particularly limited, but a bacterium capable of infecting a phage, particularly a Gram-negative bacterium, is preferable. preferable.
  • Escherichia coli expressing factor F include XL1-Blue.
  • a vector for expressing a heavy chain in Escherichia coli which is particularly preferred in the method of the present invention, needs to contain units such as a promoter and a terminator for controlling the transcription and translation of genetic information.
  • a promoter for example, pBR and pUC-based plasmids can be used as plasmid vectors.
  • promoters derived from lac, trp, tac, ⁇ phage PL, PR and the like can be used.
  • the terminator those derived from trpA, phage, and rrnB liposomal RNA can be used.
  • the constructed expression vector is introduced into a host cell to obtain a strain that secretes the heavy chain of each antibody.
  • Expression vectors include a method using calcium ions (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110 (1972)), a protoplast method (JP-A-63-24829), and an electoration method (Gene 17: 107 ( 1982); Molecular & General Genetics 168: 111 (1979)) and the like.
  • the pool of antibody light chains to be screened is preferably in the form of a phage library when bacteria are selected as hosts that secrete heavy chains.
  • the light chain-encoding gene is obtained by amplifying RA from human or other animal peripheral blood mononuclear cells, bone marrow, or spleen preparations by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), etc. Genes, synthetic DNA, etc. Can be used.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Genes, synthetic DNA, etc. Can be used.
  • a method of increasing the diversity of the antibody library by inducing mutation in the CDR region of the antibody is also known (Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-504970).
  • the antibody light chain gene library of which diversity has been enhanced by such a method can also be used as a pool of genes encoding light chains in the screening method of the present invention.
  • the light chain of the present invention includes the full length of the light chain and a fragment of the light chain.
  • the light chain fragment is not particularly limited, but is preferably a fragment containing the light chain variable region (VL).
  • DNA encoding a light chain is usually converted into an appropriate phage vector so that the light chain is displayed on the outer surface of the phage as a fusion protein with an outer surface protein or a display anchor protein.
  • the phage vector is not particularly limited, but is usually a vector derived from phage genome modification, including a replication origin (ori) for pacteriophage.
  • the phage vector preferably encodes (1) the light chain, and (2) the phage membrane anchor main (all or part of the outer surface protein or display anchor protein) in the direction from N-terminal to C-terminal. are doing.
  • the protein encoded by the above (1) and (2) encodes a prokaryotic secretory signal domain that enables the protein to be secreted out of the host bacterium and taken up by the Bataterio phage. It has a sequence before the sequence encoding the light chain of (1).
  • the phage membrane anchor domain which allows the light chain to be displayed on the surface of the phage particle, has an outer surface protein or display anchor protein that can bind to the outer membrane of the filamentous phage particle and thereby take up the fusion protein. All or part.
  • An outer surface protein or a display anchor protein is a protein that coats mature phage particles, such as cpVIII, a major coat protein of phage particles, and other minor coat proteins, cpVI, cpVII, and c. pIX, or cpIII protein, which is an infection-adsorbing protein, can be mentioned. In particular, expression as a fusion protein with the cpIII or cpVIII protein is preferable.
  • the membrane anchor domain contains a part of the C-terminal region of the protein that coats these mature phage particles, a region of hydrophobic amino acid residues for penetrating the lipid bilayer membrane, and a region of the cytoplasmic region. It is a region of charged amino acid residues.
  • the secretion signal may be a leader peptide sequence that enables secretion of the fusion protein from the host cell, and may be exemplified by the pellB secretion signal (Better et al. (1988) Science 240: 1041-3; Sastry et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728).
  • helper phage is generally required.
  • Helper phage is infected to cells containing a defective phage or phage vector and has a function of complementing the defective phage or phage vector.
  • the phage particles constituting the phage library are not particularly limited.For example, Charon4A, Charon30, fl, f2, fd, G4, Ifl, IkeM13, MS2, Pl, P2, P4, Pfl, P f3, T4, Known phages such as T7, Xf, ⁇ , IB, ⁇ gWES, ⁇ , and ⁇ 174 can be used, but filamentous phages such as fd, fl, and M13 are preferred.
  • Each phage particle of the library thus prepared contains a copy of the corresponding phagemid encoding the light chain fusion protein displayed on the particle surface.
  • the heavy chain of antibody A is brought into contact with the light chain-displaying phage library, and the light chain fusion protein displayed on the phage particle is associated with the heavy chain by the ability of the phage particle to bind to antigen A.
  • the gene encoding the light chain capable of binding to the antigen A by associating with the heavy chain of the antibody A can be obtained by separating the A.
  • a library that expresses as a fusion protein the gene 3 protein (minor coat protein) of fl phage.
  • This light chain library is introduced into an Escherichia coli host expressing the heavy chain (for example, Fd) of the antibody A described above, and infected with helper phage to form a heavy chain of the antibody A as a fusion protein with the gene3 protein.
  • An E. coli phage library that displays antibodies consisting of E. coli and various light chains (Fab when the heavy chain is Fd and the light chain contains VL and CL) can be secreted from E. coli (Fig. 1). .
  • an antibody eukaryotic cell library that presents an antibody on the cell surface can be used instead of a bacterial host such as Escherichia coli. That is, a gene encoding a desired heavy chain (for example, Fd) is linked to a promoter suitable for expression of the gene and an expression vector in which the heavy chain is secreted downstream of a signal sequence capable of secreting the heavy chain. To be introduced.
  • a desired heavy chain for example, Fd
  • the gene encoding the light chain is linked to a sequence encoding the transmembrane region so that it is displayed on the cell surface when the light chain is expressed, and is inserted downstream of an appropriate promoter. Construct an expression vector.
  • the transmembrane region is added to the C-terminus of the expressed light chain.
  • the type of host cell to be used is not particularly limited, but for the purpose of screening based on the correct antigen specificity of the antibody, eukaryotic cells, particularly animal cells, are preferred, and mammalian cells are more preferred.
  • eukaryotic cells particularly animal cells
  • mammalian cells are more preferred.
  • 3T3, BHK, Bowes melanoma, C127, CH0 J. Exp. Med. 108: 945 (1995); Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968)
  • COS thigh Hela
  • KJM Namalwa
  • Vectors for expressing heavy and light chains May be any suitable for expression in the selected host, and can be constructed using pUC18 or the like.
  • the gene encoding the heavy chain can be integrated into the genome by a well-known technique.
  • Expression vectors include electroporation (Chu et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 1311-26), cationic ribosome method, direct injection method (microinjection method), and electroporation method (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 9.1-9.9), Lipofection method (Derijard (1994) Cell 7: 11025-37), Calcium phosphate method (Chen and Okayaraa (1987) Mol. Cell. Biol.
  • host cells presenting the antibody produced as described above are selected based on their binding to antigen A.
  • the gene encoding the light chain is a phage library
  • the antibody is secreted from the host cell as a phage library. Therefore, clones that bind to antigen A by antigen A against antibody A can be enriched from a phage library secreted from host cells.
  • the concentrated desired phage library can be directly used for infection of host cells in the next step, which is particularly convenient.
  • the expression vector encoding the light chain constituting the antibody is recovered from the cells displaying the desired antibody, If necessary, it is purified by known means and used in the next step.
  • the clones enriched as described above or the recovered light chain expression vector are infected or introduced into host cells secreting antibody B (for example, Fd).
  • B for example, Fd
  • the host cell is re-infected with helper phage to re-infect the host cell to obtain an antibody (Fd, VL and CL) comprising the heavy chain (for example, Fd) of antibody B and various light chains.
  • Fd heavy chain
  • a phage library displaying Fab is secreted.
  • an antibody consisting of a heavy chain (for example, Fd) and a light chain of antibody B (eg, a light chain containing Fd and VL and CL) on the cell surface is used.
  • a heavy chain for example, Fd
  • a light chain of antibody B eg, a light chain containing Fd and VL and CL
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a Fab Lch library.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the flow of a method for screening a common light chain corresponding to different heavy chains and exhibiting high affinity according to the present invention.

Abstract

本発明は、(a) 所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程、(b) 抗体軽鎖ライブラリーを工程(a)の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するライブラリーを製造する工程、(c) 工程(a)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するライブラリーを選択する工程、(d) 工程(c)において選択されたライブラリーを工程(a)の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するライブラリーを製造する工程、及び(e) 工程(d)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するライブラリーを選択する工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法に関する。

Description

抗体の軽鎖スクリ一二ング方法 技術分野
本発明は、 多重特異性抗体の異なる特異性を有する重鎖に対応して高いァフィ 二ティーを示す共通軽鎖をスクリーニングする方法に関する。 背景技術
二重特異性抗体（bispecific antibody ;BsAb)は、 二機能性抗体（bifunctional antibody)と呼ばれることもあり、 2つの抗原決定基に特異的な結合部位を有する、 2種類の抗原と反応することができる多価抗体である。 BsAbは、 ハイブリッドハ イブリ ドーマ、 即ちクアドローマ（quadroma)と呼ばれる 2種類の異なるモノクロ ーナル抗体産生細胞の融合体を用いて産生することができる（米国特許第 4， 474, 8 93号公報； R. Bos and W. Nieuwenhuitzen (1992) Hybridoma 11 (1)： 41-51)。 また、 2種類のモノクローナル抗体の Fab (抗原結合性)断片、 または Fab， 断片を 化学的 (M. Brennan et al. (1985) Science 229 (1708)： 81-3) 、 または遺伝子 操作により結合して作製することもできる。 さらに、 2つの完全なモノクローナ ル抗体を共有結合することにより作製することもできる（B. Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160 (6) : 1686-701)。 '
BsAb製造方法における問題点として、 免疫グロプリンの重鎖及び軽鎖が無作為 に組み合わさるため、 10種類の異なる抗体分子が産生される可能性がある点が挙 げられる（M. R. Suresh et al. (1986) Methods Enzymol. 121： 210-28)。 クアド ローマにより産生される 10種類の抗体のうち、 所望の二特異性を有する抗体は、 正しい軽鎖と重鎖が組合されており、 且つ、 異なる結合特性を有する 2組の軽 鎖 '重鎖ペアにより構成された 1種類の抗体のみである。 そこで、 クアドローマ により産生される 10種類の抗体から所望の二重特異性を有する抗体を選択的に精 製する必要がある。 精製は、 一般にァフィ二ティークロマトグラフィーを利用し て行われるが、 余計な手数を要し、 またその収量も少なくなつてしまうという問 題点がある（Y. S. Massimo et al. (1997) J. Immunol. Methods 201： 57-66)。 このような問題点を解消し、 より大きな収量で BsAbを得る方法として、 例えば、 Fab' -チォニトロ安息香酸 (TNB)誘導体と Fab' -チオール（SH)等の抗体断片を化 学的に連結する方法が知られている（Brennan et al. (1985) Science 229： 81)。 さらに、 化学的に連結させることができる Fab' -SH断片をより簡便に得るための 方法として、 大腸菌等の宿主から遺伝子組換技術により産生する方法が知られて いる (Shalaby et al. (1992) J. Exp. Med. 175： 217-25) 。 遺伝子組換技術を 用いることにより、 ヒト化抗体断片より構成される BsAbを得ることもできる。 ま た、 ダイアポディ（Db)は、 遺伝子融合により構築された軽鎖可変領域 (VL)と重鎖 可変領域 (VH)が互いに結合できないくらいに短いリンカ一によつて結合されてい る 2種類の断片からなる BsAbである（P. Hoi liner et al. (1993) Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 90： 6444-8 ; EP404, 097号； W093/11161号)。 このような Dbをさらに 改良したものとして単鎖（single chain) Dbを挙げることができる (特願 2002-1123 69号公報）。 しかしながら、 抗体断片は、 完^:長の抗体に比べ血清半減期が短く、 完全抗体のようにエフヱクタ一機能も有していない。 そのため、 完全長の抗体の 方が、 より診断や治療に適している場合があると考えられている。
産生された抗体重鎖をへテロダイマーとして効率的に結合するだめの方法とし て、 抗体重鎖のマルチマー化ドメィンの CH3 (定常領域の一部）ドメィンに立体的 に相補的な変異を導入する方法が知られている（Ridgway et al. (1996) Protein Eng. 9： 617-21)。 この方法により製造された重鎖も、 依然として誤った軽鎖と 対形成し得る。 そこで、 特許文献 1には、 抗体結合ドメインを有するヘテロマー 性ポリべプチドと結合した共通の軽鎖を有する多重特異性抗体を製造する方法が 記載されている。 2つの異なる抗原に対する特異的結合能を有する BsAbは、 in vitrolUin vivo における免疫診断、 治療及び免疫学的検定等の臨床分野において標的化薬剤とし て有用である。 例えば、 BsAbの一方の腕を酵素免疫分析に使用する酵素上の酵素 反応を阻害しない部分のェピトープと結合するように、 そして他方の腕を固定ィ匕 用担体に結合するように設計してやることで、 担体上に酵素を結合する媒体とし て使用することができる（Hammerling et al. (1968) J. Exp. Med. 128： 1461 - 7 3)。 その他、 例えば、 抗体ターグティング化血栓溶解療法を挙げることができる。 該療法として、 ゥロキナーゼ、 ストレプトキナーゼ、 組織プラスミノーゲンァク チベータ一、 プロゥロキナーゼ等の酵素またはその前駆体等の蛋白を、 血栓に含 まれるフイブリン特異的に運搬する抗体を用いることが検討されている（T. Kuro kawa et al. (1989) Bio/Technology 7 : 1163 ; 特開平 5-304992号公報）。 さらに、 癌ターグティングに応用可能なマウス · ヒト ·キメラ二重特異性抗体 (特開平 2-1 45187号公報）、 種々の腫瘍を対象とした癌治療及び診断 (例えば、 特開平 5- 21377 5号公報；特開平 10- 165184号公報；特開平 11- 71288号公報；特表 2002- 518041号公 報；特表平 11-506310号公報； Link et al. (1993) Blood 81： 3343； T. Nitta et al. (1990) Lancet 335： 368 - 71 ; L. deLeij et al. (1990) Foundation Natio na丄 e de Transfusion Sanguine, Les Ulis France 249—53 ; Le Doussa丄 et al. (1993) J. Nucl. Med. 34： 1662-71 ; Stickney et al. (1991) Cancer Res. 51： 6650- 5参照）、 真菌治療 （特開平 5-199894号公報）、 免疫応答誘導 (特表平 10- 511 085号公報； Weiner et al. (1993) Cancer Res. 53： 94-100)、 T細胞殺細胞作用 の誘導（Kroesen et al. (1994) Br. J. Cancer 70 : 652 - 61 ; Weiner et al. (19 94) J. Immunol. 152： 2385)、 免疫分析 (Μ· R. Suresh et al. (1986) Proc, Na tl. Acad. Sci. USA 83： 7989- 93 ;特開平 5- 184383号公報）、 免疫組織化学 ( Mil stein and A. C. Cuello (1983) Nature 305： 537)等に BsAbを使用することが報告 されている。
抗体の抗原特異性を決定する重鎖及び軽鎖の可変領域塩基配列を取得すること により、 特定の抗原に特異的な抗体を遺伝子工学的に作製することができる（J. Xiang et al. (1990) Mol. Immunol. 27： 809 ; C. R, Bebbington et al. (1992) Bio/Technology 10： 169)。 抗原特異的な重鎖及ぴ軽鎖を取得する方法として、 大腸菌を宿主とし、 ファージまたはファージミ ドを利用した方法が公知である（W. D. Huse et al. (1989) Science 246： 1275； J. McCafferty et al, (1990) Nat ure 348： 552； A. S. Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88： 436 3)。 これらの方法では Fabを産生させて抗体ライブラリーとする力 または、 Fab 若しくは一本鎖 Fvとファージコート蛋白質との融合蛋白質を産生させて抗体ライ ブラリーとする。 最終的に、 抗原との結合性を調べることにより、 それらの抗体 ライブラリーから抗原特異的抗体及びその遺伝子を選択する。
〔特許文献 1〕 特表 2 0 0 1— 5 2 3 9 7 1号公報 発明の開示
二重特異性 IgGの作製では、 異なる抗原に対する 2つの抗体を選択し、 その 2つ の重鎖遺伝子、 2つの軽鎖遺伝子を細胞に導入することになるが、 その組み合わ せは上記従来技術においても述べたように 10通りにものぼる。 そして特許文献 1 では、 IgGの CH3部分にァミノ酸置換を導入することで重鎖のへテ口な組合せのも のを優先的に発現する方法を開発し、 さらに軽鎖を共通のものにすることで効率 良く二特異性 IgGの発現を行うことが提案されている。 しかし任意の抗体を 2つ選 んだ場合、 同じ軽鎖を含む可能性は低く、 上記アイデアを実行する'ことは困難で ある。 本発明は、 任意の異な？重鎖に対応し高いァフィ二ティーを示す共通軽鎖 をスクリーニングする方法を提供する。
本発明者らは、 BsAbの作成に利用可能な異なる重鎖に対応し、 抗原に対し高い ァフィ二ティーを示す共通軽鎖を、 （1)抗原 Aに対する抗体 A、 及び抗原 Bに対する 抗体 Bをそれぞれ選択し、 （2)該抗体の重鎖 (好ましくは Fd部分、 即ち VH及び CH1を 含む領域）をコードする遺伝子の発現ベクターを導入して各重鎖の分泌株 Ha (抗体 Aの重鎖を分泌)及び Hb (抗体 Bの重鎖を分泌)）を用意し、 （3)別に、 軽鎖がファー ジの表面蛋白との融合蛋白質として発現されるライブラリーを構築し、 （4)該軽 鎖ライブラリーを前記大腸菌 Haに導入して抗体 Aの重鎖と様々な軽鎖から成る抗 体（重鎖が Fd部分の場合は Fab)を表面に提示したファージライプラリーを分泌さ せ（図 1)、 （5)該ライブラリーから、 抗原 Aによるバニングにてクローンを濃縮し、 (6)得られたクローンをさらに大腸菌 Hbに感染させ、 抗体 Bの重鎖と様々な軽鎖か ら成る抗体 (重鎖が Fd部分の場合は Fab)を表面に提示したファージライブラリー を得、 （7)該ライブラリーを抗原 Bによるバニングによってクローンを濃縮すると いう工程を繰り返すことによって（図 2)得ることができることに想到し、 本発明 を完成した。
より詳細には、 本発明は、 下記発明に関するものである。
(1)以下の工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法。
(a)所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程
(b)抗体軽鎖ライプラリ一を工程 (a)の宿主に導入し、 前記重鎖及び前記軽鎖 により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
(c)工程 (a)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファ ージライブラリーを選択する工程
(d)工程 (c)において選択されたファージライプラリーを、 工程 (a)の抗原とは 異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導 入し、 該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラ リーを分泌させる工程
(e)工程 (d)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファ ージライブラリーを選択する工程
(2)以下の工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法。
( 所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程
(b)抗体軽鎖ライプラリーを工程 (a)の宿主に導入し、 前記重鎖及び前記軽鎖 により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
(c)工程 (a)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファ ージライブラリーを選択する工程
(d)工程 (c)において選択されたファージライブラリーを、 工程 (a)の重鎖とは 異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入し、 該重鎖 及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌さ せる工程
(e)工程 (d)記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示 するファージライブラリーを選択する工程
(3)抗体重鎖が Fdであり、 重鎮及び軽鎖により構成される抗体が Fabである、 上記 (1)または (2)記載の方法。
(4)宿主が大腸菌である、 上記（1)または（2)記載の方法。
(5)工程 (b)から（e)を 2回以上繰り返す、 上記（1)または（2)記載の方法。
(6)以下の工程をさらに含む、 上記（1)記載の方法。 .
(f)工程 (e)において選択されたファージライプラリーを、 工程 (a)及び（ の 抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に 対して導入し、 該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージ ライブラリーを分泌させる工程
(g)工程 (f)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファ —ジライプラリーを選択する工程 '
(7)以下の工程をさらに含む、 上記 (2)記載の方法。
(f)工程 (e)において選択されたファージライブラリーを、 工程 (a)及び (d)の 重鎖とは異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入し、 該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライプラリーを 分泌させる工程
(g)工程 (f)記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示 するファージライブラリーを選択する工程
(8)上記（1)〜（7)のいずれかの方法により得られた軽鎖。
(9)上記 (S)記載の軽鎖を含む抗体。
(10)以下の工程を含む抗体の軽鎖の製造方法。
(a)上記（1)〜（7)のいずれかに記載のスクリーニング方法により抗体の軽鎖 を選択する工程
(b)選択された軽鎖の遺伝子配列を基に、 該軽鎖を発現可能なベクターを作 製する工程
(c)該ベクターを宿主細胞に導入する工程
(d)該宿主細胞を培養する工程
(11)軽鎖を提示可能なファージが感染し、 かつ重鎖を発現可能なべクターを有す る宿主。
(12)軽鎖を提示可能なファージが感染し、 かつ重鎖を発現可能なベクターを有す る大腸菌。
本発明は、 （a) 所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造 する工程、 （b) 抗体軽鎖ライブラリーを工程 (a)の宿主に導入し、 前記重鎖及び 前記軽鎖により構成される抗体を提示するライプラリーを製造する工程、 （c) ェ 程 (a)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するライブラリー を選択する工程、 （d) 工程（c)において選択されたライプラリーを工程（a)の抗原 とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入 し、 該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するライブラリーを製造するェ 程、 及び (e) 工程 (d)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示す るライブラリーを選択する工程、 を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法に関 する。 本発明の方法は、 特に BsAbの作成に利用可能な異なる重鎖に対応し、 抗原 に対し高いァフィ二ティーを示す共通軽鎖を選択するために利用することができ る。 しかしながら、 上記本発明の方法において、 工程 (b)及び (c；)、 または工程 (b)から（e)をさらに異なる種類の重鎖を分泌する宿主及びそれに対応した抗原を 用いて繰り返すことにより、 BsAbのみならず、 3種類以上の抗原に対して特異性 を示す多重特異性抗体の作成に利用できる、 より多くの重鎖に対応し、 抗原に対 して高いァフィ二ティーを示す共通軽鎖をスクリーニングしてくることができる。 本明細書中に記載される多重特異性抗体とは、 少なくとも 2種類の異なる抗原に 対して特異的に結合することができる抗体である。 好ましい多重特異性抗体とし て 2つの抗原に対して特異的に結合することができる BsAbを挙げることができる。 本発明において、 「異なる抗原」 とは必ずしも抗原自体が異なる必要はなく、 抗原決定基が異なる場合等も本発明の 「異なる抗原」 に含まれる。 従って、 例え ば、 単一分子内の異なる抗原決定基も本発明の異なる抗原に含まれ、 このような 単一分子内の異なる抗原決定基を各々認識する 2つの抗体は、 本発明において異 なる抗原を認識する抗体として扱われる。 また、 本発明において 「共通軽鎖」 と は、 異なる 2種以上の重鎖と会合し、 それぞれの抗原に対して結合能を示し得る 軽鎖である。 ここで、 「異なる重鎖」 とは、 好ましくは異なる抗原に対する抗体 の重鎖を指すが、 それに限定されず、 アミノ酸配列が互いに異なっている重鎖を 意味する。 従って、 本発明は、 （ 所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分 泌する宿主を製造する工程、 （b) 抗体軽鎖ライブラリーを工程 (a)の宿主に導入 し、 前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するライブラリ一を製造 する工程、 （c) 工程 (a)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示 するライブラリーを選択する工程、 （d) 工程 (c)において選択されたライブラリ 一を工程 (a)の重鎖とは異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対し て導入し、 該重鎖及ぴ軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリ 一を分泌させる工程、 並びに（e)工程 (d)記載の重鎖が認識する抗原に対して特異 的に結合する抗体を提示するファージライプラリーを選択する工程、 を含む共通 軽鎖をスクリーニングする方法にも関する。
本発明は、 2種類以上の異なる抗体の重鎖に対応し、 抗原に対し高いァフィ二 ティーを示す共通軽鎖をスクリーニングする方法に関するものである。 本発明の スクリーニング方法では、 まず、 所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌 する宿主を得る必要がある。 該宿主は、 例えば、 BsAbを作成する場合には、 所望 の 2種類の抗原の各々に対応する重鎖を分泌する 2種類の宿主が必要であり、 3特 異性抗体であれば 3種類、 4特異性抗体であれば 4種類必要となる。 以下、 例示的 に BsAbにおける共通重鎖をスクリーユングするための方法を中心として説明する。 本発明のスクリーニングに必要な抗体重鎖を分泌する宿主を得るため、 まず、 2種類の抗原（便宜的に、 抗原 A及び抗原 Bとする）に対する抗体を選択し、 それら を産生する細胞を取得する。 以後の説明において抗原 Aに対する抗体を抗体 A、 抗 原 Bに対する抗体を抗体 Bと呼ぶ。 これらの抗体産生細胞は、 適当な感作抗原を用 いて動物を免疫化することにより得ることができる。 または、 抗体を産生し得る リンパ球を in iroで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。 免疫化する 動物としては、 各種哺乳動物を使用できるが、 ゲッ歯目、 ゥサギ目、 霊長目の動 物が一般的に用いられる。 マウス、 ラット、 ハムスター等のゲッ歯目、 ゥサギ等 のゥサギ目、 力二クイザル、 ァカゲザル、 マントヒヒ、 チンパンジー等のサル等 の霊長目の動物を例示することができる。 その他、 ヒ ト抗体遺伝子のレパートリ 一を有するトランスジエニック動物も知られており、 このような動物を使用する ことによりヒト抗体を得ることもできる（W096/34096 ; Mendez et al. (1997) Na t. Genet. 15 : 146- 56参照）。
動物の免疫化は、 感作抗原を Phosphate- Buffered Saline (PBS)または生理食塩 水等で適宜希釈、 懸濁し、 必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、 動 物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。 その後、 好ましくは、 フ ロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を 4〜21日毎に数回投与する。 抗体の産生の確認は、 動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測 定することにより行われ得る。
動物を免疫化する抗原としては、 免疫原性を有する完全抗体と、 免疫原性を有 さない不完全抗原 (ハプテンを含む）のどちらかを利用することができる。 例えば、 蛋白質、 ポリペプチド、 多糖類、 核酸、 脂質等からなる物質を抗原として使用す ることができる。 動物を免疫するのに用いる免疫原としては、 必要に応じ、 抗原 となる分子を他の分子（例えば、 キーホルリンペットへモシァニン、 血清アルプ ミン、 ゥシサイクログロプリン、 ダイズトリプシン阻害剤等）に結合させて可溶 性抗原とすることもできる。 さらに、 場合により、 該可溶性抗原の断片を免疫原 として利用してもよい。 受容体等の膜貫通分子を抗原として用いる場合には、 好 ましくは、 これらの断片 (例えば、 受容体の細胞外領域）を使用する。 また、 膜貫 通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原としてもよい。 このような細胞とし ては、 天然 (腫瘍セルライン等）由来の細胞も存在するが、 遺伝子組換技術により 膜貫通分子を発現する細胞を調製してもよい。
本発明の共通軽鎖を選択する方法は、 多様な抗原に対する Bs Abを製造するのに 適用できるものである。 例えば、 BsAbを癌治療において使用することを目的とす る場合には、 例えば、 抗体の一方の腕は腫瘍細胞抗原を認識するように調製し、 他方の腕は細胞傷害性を誘起する分子を認識するように設計することができる。 腫瘍細胞抗原としては、 例えば、 1D10 (悪性 B細胞）、 AM0C-1 (pan carcinoma asso ciated antigen) , CAMA1、 CD7、 CD15、 CD19、 CD22、 CD38、 CEA、 EGF受容体、 Id - 1、 L- Dl (大腸癌) 、 MoV18、 p97、 pl85HER2、 OVCAR - 3.、 神経細胞接着分子（neural cell adhesion molecule ; NCAM)、 腎細胞癌、 メラノサイト刺激ホルモンアナ口 グ、 葉酸結合蛋白質 (FBP)等が挙げられる。 また、 細胞傷害性を誘起する分子と しては、 CD3、 CD16、 FC T/ RIが例示される。 その他、 IFN- CK、 サポニン、 ピン力 アル力ロイド、 リシンの A鎖等の毒素と結合できるよう BsAbを設計することもで きる。
また、 ヘテロ二量体を形成し、 リガンドとの結合によりその鎖間の距離または 角度等が変化することにより細胞内にシグナルを伝達する受容体 (例えば、 多く のサイトカイン受容体）に対して結合するように BsAbを構築することにより、 該 B sAbはリガンドによる受容体の二量体化を模倣できるァゴニスト抗体として利用 することができる。
その他にも、 （1) CD30及ぴアルカリホスファターゼに結合し、 リン酸マイトマ イシンをマイトマイシンアルコールに変換する等の、 化学物質の変換を助ける酵 素と相互作用する BsAb、 （2)繊維素溶解剤として使用できる、 フイブリン、 tPA、 uPA等に結合する BsAb、 （3) LDL及ぴ Fc受容体（FC T/ RI、 Fc RI^ または Fc 7 RIII) 等に結合し免疫複合体を細胞表面受容体へ誘導する BsAb、 （4) CD3等の T細胞上の 抗原と、 HCV、 インフルエンザ、 HIV等の病原菌の抗原を認識する感染性の疾患に 使用できる BsAb、 （5)腫瘍の検出に使用し得る腫瘍抗原と、 E0TUBE、 DPTA、 ハプ テン等の検出可能な物質に結合性を有する BsAb、 （6)ワクチンアジュバントとし て使用し得る BsAb (Fanger et al. (1992) Crit. Rev. Immunol. 12： 101- 24参 照）、 並びに（7)診断において使用し得るゥサギ IgG、 西洋ヮサビペルォキシダー ゼ（HRP)、 FIT (：、 j3 -ガラクトシダーゼ等の検出可能な物質と、 .ホルモン、 フェリ チン、 ソマトスタチン、 サブスタンス P、 CEA等を抗原とする BsAb等が知られてい る。 本発明の共通軽鎖を選択する方法は、 これらの公知の BsAbを含む多様な多重 特異性抗体の製造 (W089/02922号パンフレッ ト、 EP314、 317号公報、 US5116964 号公報参照）において利用することができる。
次に、 所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞 を、 慣用の融合剤（例えば、 ポリエチレングリコール）を使用してミエ口一マ細胞 と融合してハイブリ ドーマを作成する（Goding (1986) Monoclonal 'Antibodies : Principles and Practice, Academic Press, 59 - 103)。 必要に応じノヽィプリ.ドー マ細胞を培養 ·増殖し、 免疫沈降、 放射免疫分析 (RIA)、 酵素結合免疫吸着分析 (ELISA)等の公知の分析法により該ハイプリ ドーマより産生される抗体の結合特 異性を測定する。 その後、.必要に応じ、 目的とする特異性、 親和性または活性が 測定された抗体を産生するハイプリ ドーマを限界希釈法等の手法によりサブクロ 一ユングすることもできる。 続いて、 選択された抗体 A及び抗体 Bの重鎖をコードする遺伝子をハイプリ ドー マまたは抗体産生細胞 (感作リンパ球等）から、 重鎖に特異的に結合し得るプロ一 ブ (例えば、 抗体定常領域をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等）を 用いてクローニングする。 また、 mRNAから RT - PCRによりクローニングすることも 可能である。 免疫グロブリンは、 IgA、 IgD、 IgE、 IgG及び IgMの 5つの異なるクラ スに分類される。 さらに、 これらのクラスは幾つかのサブクラス（アイソタイプ） (例えば、 IgG- 1、 IgG- 2、 IgG- 3、 及び IgG-4; IgA- 1及ぴ IgA - 2等）に分けられる。 本発明において使用する抗体重鎖は、 これらいずれのクラス及びサブクラスに属 するものであってもよく、 特に限定されないが、 IgGは特に好ましいものである。 上述のハイプリ ドーマに代えて抗体ライブラリーから所望の抗原との結合性を 利用して、 目的とする抗体または抗体断片をコードする遺伝子を取得することも できる。 抗体ライプラリーの構築は周知であり、 様々な方法により作成し、 利用 することができる。 例えば、 抗体ファージライブラリーについては、 Clackson e t al. (1991) Nature 352： 624-8、 Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222： 5 81-97、 Waterhouses et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21： 2265-6、 Griffith s et al. (1994) EMBO J. 13： 3245-60、 Vaughan et al. (1996) Nature Biotec hnology 14： 309-14、 及び特表平 10— 504970号公報等の文献を参照することがで きる。 その他、 真核細胞をライブラリーとする方法 (W095/15393号パンフレッ ト） やリボソーム提示法などの公知の方法を用いることが可能である。
ここで、 重鎖をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも可 能である.。 遺伝子工学的に非ヒト哺乳動物（マウス、 ラット、 ハムスター等）由来 のモノクローナル抗体の CDR (相補性決定領域）以外の部分をヒト免疫グロブリン 由来の可変領域の枠組構造配列に置換し、 「ヒト化抗体」 とする技術が公知であ る（例えば、 Jones et al. (1986) Nature 321： 522 - 5 ; Reich匪 n et al. (198 8) Nature 332： 323-9 ; Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2： 593- 6参 照）。 ヒト化抗体は、 レシピエント抗体に導入された CDRまたは枠組構造配列のど ちらにも含まれないアミノ酸残基を含んでいてもよい。 通常、 このようなァミノ 酸残基の導入は、 抗体の抗原認識及び/または結合能力をより正確に至適化する ために行われる。 本発明の方法のスクリーニングに使用する重鎖は、 このような ヒト化等の改変されたものであってもよい。
上述のヒト化以外に、 例えば、 抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善 するために改変を行うことも考えられる。 このような改変は、 部位特異的突然変 異（例えば、 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82： 488参照）、 PCR変 異、 カセット変異等の^^法により行うことができる。 一般に、 生物学的特性の改 善された抗体変異体は 70%以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 9 0%以上 (例えば、 95%以上、 97%、 98%、 99%等）のアミノ酸配列相同性及び/ま たは類似性を元となった抗体重鎖の可変領域のアミノ酸配列に対して有する。 本 明細書において、 配列の相同性及び/または類似性は、 配列相同性が最大の値を 取るように必要に応じ配列を整列化、 及びギャップ導入した後、 元となった抗体 残基と相同（同じ残基）または類似（一般的なァミノ酸の側鎖の特性に基き同じグ ループに分類されるァミノ酸残基)するアミノ酸残基の割合として定義される。 通常、 天然のアミノ酸残基は、 その側鎖の性質に基いて（1)疎水性：ァラニン、 イソロイシン、 ノノレロイシン、 バリン、 メチォニン及びロイシン ； （2)中性親水 性：ァスパラギン、 グルタミン、 システィン、 スレオニン及びセリン； （3)酸 性： ァスパラギン酸及びグルタミン酸； （4)塩基性：アルギニン、 ヒスチジン及 ぴリシン； （5)鎖の配向に影響する残基：グリシンおよびプロリン'；ならびに（6) 芳香族性：チロシン、 トリブトフアン及ぴフエ二ルァラニンのグループに分類さ れる。
本発明の方法において用いる抗体重鎖を分泌する宿主細胞は、 抗体の重鎖の全 長を分泌するものでも、 重鎖の一部の断片を分泌するものであってもよい。 従つ て、 本発明の重鎖とは、 抗体重鎖の全長、 及び重鎖の断片が含まれる。 重鎖の断 片は、 特に限定されないが、 重鎖可変領域を含む断片であることが好ましく、 特 に好ましくは Fd部分 (重鎖の可変領域 (VH)及び定常領域 (CH1) )を含む断片である。 しかしながら、 特にこれに限定されるものではなく、 重鎖の可変領域のみ、 可変 領域の一部、 または定常領域のその他の領域 (CH2及び 3)を含む部分を分泌する構 成としてもよレ、。
所望の抗体重鎖をコードする遺伝子部分を、 適当な宿主細胞における発現に適 した発現ベクターに導入する。 本発明の方法では、 重鎖を分泌する宿主細胞は特 に限定されるものではないが、 ファージを感染させることができる細菌、 特にグ ラム陰性細菌が好ましく、 中でも、 F因子を発現する大腸菌が好ましい。 F因子を 発現する大腸菌としては、 例えば、 XL1 - Blueを挙げることができる。
本発明の方法において特に好ましい、 重鎖を大腸菌で発現させるためのベクタ 一は、 遺伝子情報の転写及び翻訳を制御するプロモーター、 ターミネータ一等の ュニットを含む必要がある。 例えば、 プラスミドベクターとして、 pBR、 pUC系プ ラスミ ドを利用することができる。 プロモーターとしは、 lac、 trp、 tac、 λフ ァージ PL、 PR等に由来するプロモーターが利用可能である。 ターミネータ一とし ては、 trpA、 ファージ、 rrnBリポソ一マル RNA由来のものを使用することができ る。
構築した発現ベクターは宿主細胞へ導入し、 各抗体の重鎖を分泌する株を取得 する。 発現ベクターは、 カルシウムイオンを用いた方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69： 2110 (1972) )、 プロトプラスト法（特開昭 63- 24829号公報）、 エレクト ポーレシヨン法（Gene 17 : 107 (1982) ; Molecular&General Genetics 168： 111 (1979) )等の方法により宿主細胞へ導入され得る。
本発明のスクリーユング方法においてスクリーユングの対象となる抗体軽鎖の プールは、 重鎖を分泌する宿主として細菌を選択した場合には、 ファージライブ ラリーの形態とするのが好ましい。 軽鎖をコードする遺伝子としては、 ヒトまた はその他の動物の末梢血単核球、 骨髄、 または脾臓調製物由来の R Aを逆転写ポ リメラーゼ連鎖反応 (RT - PCR)等により増幅して得られた遺伝子群、 合成 DNA等を 利用することができる。 その他、 抗体の CDR領域内に変異を誘発して抗体ライブ ラリーの多様性を高める方法も知られている（特表平 10- 504970号公報)。 このよ うな方法により多様性を高められた抗体軽鎖遺伝子ライブラリ一を本発明のスク リーニング方法における軽鎖をコードする遺伝子のプールとして使用することも できる。 本発明の軽鎖には、 軽鎖の全長、 及ぴ軽鎖の一部の断片が含まれる。 軽 鎖の断片とは、 特に限定されないが、 軽鎖可変領域 (VL)を含む断片であることが 好ましい。
ファージライブラリーを作製するため、 通常、 軽鎖をコードする DNAを、 該軽 鎖が外表面蛋白質またはディスプレイアンカー蛋白質との融合蛋白質としてファ ージ外表面へ提示されるように適当なファージベクターに組込む。 ここで、 ファ ージベクターは特に限定されないが、 通常、 パクテリオファージ用の複製開始点 (ori)を含む、 ファージゲノムの修飾により誘導されるベクターである。 ファー ジベクターは、 好ましくは、 N末から C末の方向で（1)軽鎖、 及ぴ (2)ファージ膜ァ ンカードメイン (外表面蛋白質またはディスプレイアンカー蛋白質の全部若しく は一部）をコードしている。 また、 必要に応じ、 上記（1)及び (2)によりコードさ れる蛋白質が、 宿主細菌の細胞外へ分泌されバタテリオファージに取込まれるこ とを可能とする原核細胞分泌シグナルドメインをコードする配列を（1)の軽鎖を コードする配列の前に有している。
軽鎖をファージ粒子表面上に提示させるためのファージ膜アンカードメインは、 糸状ファージ粒子の外膜と結合することができ、 それにより融合蛋白質を取り込 ませることができる外表面蛋白質またはディスプレイアンカー蛋白質の全部また は一部である。 外表面蛋白質またはディスプレイアンカー蛋白質とは、 成熟ファ ージ粒子をコートする蛋白質であり、 例えば、 ファージ粒子のメジャーコート蛋 白質である cpVIIIや、 それ以外のマイナーなコート蛋白質である cpVI、 cpVII、 c pIX、 あるいは感染吸着蛋白質である cpIII蛋白質を挙げることができる。 特に、 cpIIIまたは cpVIII蛋白質との融合蛋白質として発現させるのが好ましく、 中で も cpIII蛋白質との融合蛋白質の発現はよく研究されている（Smith (1985) Scien ce 228： 1315-7； de la Cruz et al. (1988) J. Biol. Chem. 263： 4318- 22参 照）。 膜アンカードメインは、 これらの成熟ファージ粒子をコートする蛋白質の C 末領域の一部を含むものであり、 脂質二重層膜を貫通するための疎水性ァミノ酸 残基の領域、 及び、 細胞質領域の荷電したアミノ酸残基の領域である。
分泌シグナルは、 宿主細胞からの融合蛋白質の分泌を可能にするリーダーぺプ チド配列であればよく、 pellB分泌シグナルを例示することができる（Better et al. (1988) Science 240： 1041 - 3; Sastry et al. (1989) Proc. Natl. Acad. S ci. USA 86： 5728参照）。
上述のようなファージベクターでは、 通常、 ファージ粒子の産生に必要なファ ージゲノム配列が除去または不活性化されている。 そこで、 該ファージベクター を宿主細菌に感染させてファージ粒子を産生させるために、 一般的には、 ヘルパ 一ファージが必要とされる。 ヘルパーファージは、 欠損ファージまたはファージ ベクターを含む細胞に対して感染され、 該欠損ファージまたはファージベクター を補足する機能を有する。
ファージライブラリーを構成するファージ粒子は特に限定されず、 例えば、 Ch aron4A、 Charon30、 fl、 f2、 fd、 G4、 Ifl、 Ikeゝ M13、 MS2、 Pl、 P2、 P4、 Pfl、 P f3、 T4、 T7、 Xf、 λ、 I B, λ gWES, ΦΚ、 ΦΧ174等の公知のファージを利用する ことができるが、 好ましくは fd、 fl、 M13などの糸状ファージである。 このよう にして作製されたライブラリーの個々のファージ粒子は、 粒子表面上に提示され る軽鎖融合蛋白質をコードする対応ファージミドのコピーを含む。 従って、 軽鎖 提示ファージライブラリーに対して抗体 Aの重鎖を接触させ、 ファージ粒子上に 提示される軽鎖融合蛋白質に該重鎖が会合したものを抗原 Aに対する結合能によ りファージ粒子を分離してくることにより抗体 Aの重鎖と会合し、 抗原 Aに対する 結合能を有する軽鎖をコードする遺伝子を得ることができる。
例えば、 flファ^"ジの oriを含んだベクターを用いて、 軽鎖（例えば、 VL及ぴ CL を含むもの）が flファージの gene3蛋白（マイナーコート蛋白質）と融合蛋白として 発現するライブラリ一を構築する。 この軽鎖ライブラリ一を先に述べた抗体 Aの 重鎖 （例えば、 Fd) を発現する大腸菌宿主に導入し、 ヘルパーファージを感染さ せることにより、 gene3蛋白との融合蛋白として抗体 Aの重鎖と様々な軽鎖から成 る抗体 (重鎖が Fdであり、 軽鎖が VL及び CLを含む場合には Fab)を表面に提示する ファージライブラリ一を大腸菌から分泌させることができる（図 1)。
W095/15393号パンフレツトには、 抗体本来の抗原結合能をスクリーニング段階 力 らより正確に調べることを可能にする抗体真核細胞ライブラリーの構築も提案 されている。 そこで、 本発明の方法において、 大腸菌等の細菌宿主に代えて、 抗 体を細胞表面上に提示する抗体真核細胞ライブラリ一を採用することもできる。 即ち、 所望の重鎖 (例えば、 Fd)をコードする遺伝子を、 該遺伝子の発現に適した プロモーター及ぴ該重鎖を分泌可能なシグナル配列の下流に連結した発現べクタ 一を真核細胞宿主に導入する。 そして、 軽鎖をコードする遺伝子は、 該軽鎖が発 現された場合に細胞表面上に提示されるように細胞膜貫通領域をコードする配列 と連結して、 適当なプロモーターの下流へ挿入し、 発現ベクターを構築する。 好 ましくは、 該細胞膜貫通領域は、 発現された軽鎖の C末端に付加される。 該軽鎖 発現ベクターを前記重鎖分泌宿主細胞へ導入することにより、 所望の抗原に対し て結合する抗体 (重鎖として Fdを、 そして軽鎖として VL及び CLを含むものを使用 した場合には、 提示される抗体は Fab断片となる）を細胞表面上に発現している宿 主細胞を選択することもできる。 '
使用する宿主細胞の種類は特に限定されないが、 抗体の正しい抗原特異性に基 いたスクリーニングを目的とする場合には、 真核生物細胞、 特に動物細胞が好ま しく、 さらに哺乳動物細胞が好ましい。 例えば、 3T3、 BHK、 Bowesメラノーマ、 C 127、 CH0 (J. Exp. Med. 108 : 945 (1995) ; Proc. Natl. Acad. Sci. 77： 4216 (1980)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) )、 COSゝ 腿、 Hela、 KJM、 Namalwa, ミエローマ細胞等を例示することができる。 重鎖及び軽鎖を発現させるベクター は、 選択した宿主における発現に適したものであればよく、 pUC18等を利用して 構築することができる。 重鎖をコードする遺伝子は、 周知の技術によりゲノム上 に組込むことも可能である。 発現ベクターは、 エレクトロポレーシヨン法（Chu e t al. (1987) Nucleic Acids Res. 15： 1311—26)、 カチォニックリボソーム法、 直接注入法（マイクロインジェクション法）、 電気穿孔法（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons (1987) Section 9. 1—9. 9)、 リポフエクシ ヨン法（Derijard (1994) Cell 7： 11025-37)、 リン酸カルシウム法（Chen and Ok ayaraa (1987) Mol. Cell. Biol. 7： 2745-52)、 DEAEデキス トラン法（Lopata et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12： 5707-17 ; Sussmann and Milman (1985) Mo 1. Cell. Biol. 4 : 1642- 3)等の慣用の方法により宿主細胞へ導入する。
次に、 本発明のスクリーニング法では、 上述のようにして作製された抗体を提 示する宿主細胞を抗原 Aに対する結合性により選択する。 宿主として細菌細胞を 選択し、 軽鎖をコードする遺伝子をファージライプラリーとした場合には、 抗体 はファージライブラリ一として宿主細胞より分泌される。 従って、 抗体 Aに対す る抗原 Aによるバニングにて抗原 Aに結合するクローンを宿主細胞より分泌された ファージライブラリーから濃縮することができる。 この場合、 濃縮された所望の ファージライブラリーをそのまま次の工程における宿主細胞の感染に使用するこ とができ、 特に都合がよい。 ファージライブラリーの分泌ではなく、 宿主細胞表 面に抗体が提示される形態とした場合には、 所望の抗体を提示する細胞から該抗 体を構成する軽鎖をコードする発現ベクターを回収し、 必要に応じ公知の手段に より精製して次の工程に用いる。
続いて、 本発明のスクリーニング法では、 上述のようにして濃縮されたクロー ン、 または回収された軽鎖発現ベクターを、 抗体 Bの抗体（例えば、 Fd)を分泌す る宿主細胞に感染または導入する。 ファージライブラリーを用いる場合には、 該 宿主細胞に対してヘルパーファージを再び重感染させることにより、 抗体 Bの重 鎖 (例えば、 Fd)と様々な軽鎖から成る抗体 (Fd並びに VL及び CLを含む軽鎖を使用 した場合には Fab)を表面に提示したファージライブラリーが分泌される。 ファー ジベクター以外の発現ベクターを用いた場合には、 細胞表面上に抗体 Bの重鎖 (例 えば Fd)と軽鎖から成る抗体 (Fd並びに VL及ぴ CLを含む軽鎖を使用した場合には Fa b)を表面に提示した様々な細胞が得られる。
次に、 抗原 Aに対する選択と同様に、 ファージライブラリーを用いた場合には、 該ライブラリーに対する抗原 Bによるバニングによって、 宿主細胞より分泌され たファージライブラリーから抗原 Bに結合するクローンを濃縮する。 また、 宿主 細胞表面に抗体が提示される形態とした場合には、 所望の抗体を提示する細胞か ら該抗体を構成する軽鎖をコードする発現ベクターを回収し、 必要に応じ公知の 手段により精製する。 以上のようにして、 抗原 A及び抗原 Bに対する軽鎖のスクリ 一二ングを行うことによって、 異なる重鎖に対応し、 種々の抗原に対して高いァ フィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングすることができる（図 2)。
さらに、 必要に応じ、 抗原 A及び抗原 Bに対する抗体 (例えば Fd)を分泌する宿主 への感染 ·導入、 抗体（または Fab等の使用した軽鎖及び重鎖に応じた抗体断片） の分泌 ·提示、 並びにバニング ·選択を繰り返すことによってより選択性の高い 共通軽鎖をスクリーニングすることができる。 また、 スクリーニングする抗原の 種類を増やすことによって、 より多くの重鎖に対応し、 種々の抗原に対して高い ァフィ二ティーを示す共通軽鎖をスクリーニングすることも可能である。 このよ うにして選択された軽鎖、 及び軽鎖をコードする遺伝子は、 様々な診断及び治療 方法において有用な BsAbを含む多重特異性抗体の製造に利用するごとができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 Fab Lchライプラリーの模式図である。
図 2は、 本発明の異なる重鎖に対応し、 高いァフィ二ティーを示す共通軽鎖の スクリーニング方法の流れを示す模式図である。 産業上の利用の可能性
本発明の方法により、 異なる重鎖に'対応し、 高いァフィ二ティーを示す共通軽 鎖をスクリ一二ングすることが可能となった。 本発明の方法を利用することによ り、 効率の良く多重特異性抗体の発現を行うことができる。

Claims

請求の範囲
1 . 以下の工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法。
(a)所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程 (b)抗体軽鎖ライブラリーを工程 (a)の宿主に導入し、 前記重鎖及び前記軽鎖 により構成される抗体を提示するファージライプラリーを分泌させるェ 程
(c)工程 (a)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファ ージライブラリーを選択する工程
(d)工程 (c)において選択されたファージライブラリーを、 工程 (a)の抗原と
■ は異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対し て導入し、 該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージラ イブラリーを分泌させる工程
(e)工程 (d)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファ —ジライプラリーを選択する工程
2 . 以下の工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法。
(a)所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程
(b)抗体軽鎖ライブラリーを工程 (a)の宿主に導入し、 前記重鎖及び前記軽鎖 により構成される抗体を提示するファージライプラリーを分泌させるェ 程 '
(c)工程 (a)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファ ージライブラリーを選択する工程
(d)工程 (c)において選択されたファージライプラリーを、 工程 (a)の重鎖と は異なるァミノ酸配列を有す §重鎖を分泌する宿主に対して導入し、 該 重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライプラリーを 分泌させる工程 (e)工程 (d)記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示 するファージライブラリーを選択する工程
3 . 抗体重鎖が Fdであり、 重鎖及び軽鎖により構成される抗体が Fabである、 請求項 1または 2記載の方法。
4 . 宿主が大腸菌である、 請求項 1または 2記載の方法。
5 . 工程 (b)から（e)を 2回以上繰り返す、 請求項 1または 2記載の方法。
6 . 以下の工程をさらに含む、 請求項 1記載の方法。
(f)工程 (e)において選択されたファージライブラリーを、 工程 (a)及ぴ (d)の 抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主 に対して導入し、 該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファ ージライブラリーを分泌させる工程
(g)工程 (f)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファ ージライプラリーを選択する工程
7 . 以下の工程をさらに含む、 請求項 2記載の方法。
(f)工程（e)において選択されたファージライブラリ一を、 工程 (a)及ぴ ( の 重鎖とは異なるァミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入 し、 該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラ リーを分泌させる工程
(g)工程 (f)記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示 するファージライブラリーを選択する工程 '
8 . 請求項 1〜7のいずれかの方法により得られた軽鎖。
9 . 請求項 8記載の軽鎖を含む抗体。
1 0 . 以下の工程を含む抗体の軽鎖の製造方法。
(a)請求項 1〜7のいずれかに記載のスクリーニング方法により抗体の軽鎖 を選択する工程
(b)選択された軽鎖の遺伝子配列を基に、 該軽鎖を発現可能なベクターを 作製する工程
(c)該ベクターを宿主細胞に導入する工程
(d)該宿主細胞を培養する工程
軽鎖を提示可能なファージが感染し、 かつ重鎖を発現可能なベクターを 有する宿主。
軽鎖を提示可能なファージが感染し、 かつ重鎖を発現可能なベクターを 有する大腸菌。
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