DE60132075T2

DE60132075T2 - Wnt-1 verwandte polypeptide und dafür kodierende nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60132075T2
Application number: DE60132075T
Authority: DE
Inventors: Luca K. Guilford RASTELLI; Diane Burlingame Pennica
Original assignee: Genentech Inc; CuraGen Corp
Current assignee: Genentech Inc; CuraGen Corp
Priority date: 2000-03-22
Filing date: 2001-03-22
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2021-03-23
Also published as: WO2001070775A2; DE60132075D1; EP1265914A2; AU2001247781C1; ATE382055T1; EP1265914B1; AU2001247781B2; US20050159373A1; US20080206252A1; ES2298226T3; US20020098540A1; DK1265914T3; JP2003527849A; PT1265914E; CA2404216A1; AU4778101A; WO2001070775A3

Description

Wnt-Familienmitglieder sind Cystein-reiche, glycosylierte Signalproteine, welche verschiedene Entwicklungsprozesse wie die Kontrolle der Zellproliferation, Adhäsion, Zellpolarität und die Etablierung von vorbestimmten Zelleigenschaften vermitteln. Komponenten des Wnt-Signalweges wurden mit der Tumorgenese von familiär gehäuft und sporadisch auftretenden Darmkarzinomen, Brustkrebs und Melanomen in Verbindung gebracht. Versuche schlagen vor, dass das familiäre Polypose-(APC)-Tumorsuppressorgen auch eine wichtige Rolle bei der Wnt-Signalgebung durch Regulieren von beta-Catenin-Levels spielt. APC wird durch GSK-3b phosphoryliert, bindet an beta-Catenin und ermöglicht seine Degradation. Mutationen in entweder APC oder beta-Catenin wurden mit Darmkarzinomen und Melanomen in Verbindung gebracht, wobei vorgeschlagen wird, dass diese Mutationen zur Entwicklung dieser Krebstypen beitragen, wobei der Wnt-Weg mit Tumorgenese in Verbindung gebracht wird.
Obwohl viel über den Wnt-Signalweg während der vergangenen mehreren Jahre gelernt wurde, wurden nur einige der bei der Transkription aktivierten nachgelagerten Komponenten, welche durch Wnt aktiviert werden, charakterisiert. Jene, welche beschrieben wurden, können nicht für alle unterschiedlichen Funktionen, welche der Wnt-Signalgebung zugeschrieben werden, verantwortlich sein.
EMBL-EBI ID:AK027111 listet die Nukleinsäuresequenz einer Homo sapiens-cDNA (Klon HS107327), welche von Kawakami, T. et al. (29.09.00) hinterlegt wurde, auf.
EP 1 354 950 (und WO 02/053737 ) und JP 2000-402288 beschreiben ein NF-KB-aktivierendes Gen, kloniert von einer cDNA-Bibliothek, welche von humanen Lungenfibroblasten hergestellt wurde, und Verwendungen davon zur Identifizierung eines NF-KB-Aktivierungsinhibitors oder -Promotors.
EBI-Datenbankabstrakt AAB56802 (und WO 00/55174 ) beschreiben eine mit humanem Prostatakrebs in Verbindung stehende Proteinsequenz.
Die Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung von neuen Nukleinsäuresequenzen, welche neue Polypeptide kodieren. Nukleinsäuren, welche die Polypeptide kodieren, die in der Erfindung offenbart werden, werden hier nachstehend gemeinsam als „WUP"-(Wnt1 nach oben regulierte)-Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen bezeichnet.
Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf die Patentansprüche der vorliegenden Beschreibung definiert.
Obwohl Verfahren und Materialien, welche ähnlich oder äquivalent zu jenen sind, die hier beschrieben werden, in der Praxis oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden geeignete Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben. Zusätzlich sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur veranschaulichend und es ist nicht beabsichtigt, dass sie einschränkend sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Proteindomänenanalyse.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Zur Identifizierung von zusätzlichen nachgelagerten Genen im Wnt-Signalweg, welche für den transformierten Zellphänotyp relevant sind, suchten die Erfinder in der Genexpression von Wnt-1-exprimierenden C57MG-Mausbrustepithelzellen im Vergleich zum Genexpressionsmuster, welches bei normalen C57MG- und bei Wnt-4-exprimierenden C57MG-Zellen gefunden wird. Wnt-4 ist nicht zur Induzierung von Tumoren und autokriner zellulärer Transformation in der Lage, wie dies bei Wnt-1 der Fall ist. Die Erfinder haben Gene und Polypeptide, welche in der Wnt-1-exprimierenden C57MG-Zelle nach oben reguliert sind (WUP), und ihre humanen Orthologen identifziert.
Gene, welche in Wnt-1-exprimierenden Zellen nach oben reguliert sind, stellen attraktive Ziele zur Behandlung von Erkrankungen wie Krebs dar. Ein solches Gen, WUP, wird in der vorliegenden Erfindung beschrieben. Ein Protein, welches wahrscheinlich in den/die mitochondrialen oder endoplasmatisches Reticulum-Proteintransport und -Verarbeitung einbezogen ist, WUP, ist in Zellen mit hohen metabolischen Anforderungen, wie Krebszellen, welche einer schnellen Proliferation unterliegen, nach oben reguliert.
Definitionen
Wenn nicht anderweitig definiert, weisen alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die selbe Bedeutung auf, wie allgemein von einem Fachmann, welchen diese Erfindung betrifft, verstanden wird. Die Definitionen nachstehend sind zur Klarheit bereitgestellt.
Die Empfehlungen von (Demerec et al., 1966), soweit diese für Genetik relevant sind, wurden hier übernommen. Zur Unterscheidung zwischen Genen (und verwandten Nukleinsäuren) und den Proteinen, welche sie kodieren, sind die Abkürzungen für Gene durch kursiven (oder unterstrichenen) Text gezeigt, wogegen Abkürzungen für die Proteine mit einem Großbuchstaben beginnen und nicht kursiv geschrieben sind. So betrifft WUP oder WUP die Nukleotidsequenz, welche WUP kodiert.
„Isoliert", wenn es ein Molekül bezeichnet, betrifft ein Molekül, welches identifiziert und von einer Komponente seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigungskomponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, welche diagnostische oder therapeutische Verwendung beeinflussen.
„Behälter" wird in einem breiten Sinn verwendet, wobei es jedwedes Gefäß zum Aufnehmen von Material oder Reagenz bedeutet. Behälter können aus Glas, Kunststoff Metall oder jedwedem anderen Material, welches Reagenzien aufnehmen kann, hergestellt sein. Verträgliche Materialien werden sich nicht nachteilig mit den Inhalten umsetzen.
1. Nukleinsäure-betreffende Definitionen
(a) Kontrollsequenzen
Kontrollsequenzen sind DNA-Sequenzen, welche die Expression einer operativ verbundenen Kodiersequenz in einem besonderen Wirtorganismus ermöglichen. Prokaryotische Kontrollsequenzen schließen Promotoren, Operatorsequenzen und Ribosombindungsstellen ein. Eukaryotische Zellen verwenden Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer.
(b) operativ verbunden
Eine Nukleinsäure ist operativ verbunden, wenn sie in einer funktionellen Beziehung mit einer anderen Nukleinsäuresequenz platziert ist. Zum Beispiel ist ein Promotor oder Enhancer operativ mit einer Kodiersequenz verbunden, wenn sie die Transkription der Sequenz beeinflussen, oder eine Ribosombindungsstelle ist operativ mit einer Kodiersequenz verbunden, wenn sie derart positioniert ist, dass Translation ermöglicht wird. Im Allgemeinen bedeutet „operativ verbunden", dass die DNA-Sequenzen, welche verbunden sind, benachbart sind und im Falle eines sekretorischen Leaders benachbart und in der Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht benachbart sein. Das Verbinden wird durch herkömmliche rekombinante DNA-Verfahren erreicht.
(c) isolierte Nukleinsäuren
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül wird aus der Umgebung, in welcher es in der Natur gefunden wird, aufgereinigt und wird von mindestens einem verunreinigenden Nukleinsäuremolekül abgetrennt. Isolierte WUP-Moleküle werden von dem speziellen WUP-Molekül, wie es in Zellen vorliegt, unterschieden. Jedoch schließt ein isoliertes WUP-Molekül WUP-Moleküle, welche in Zellen enthalten sind, die in einfacher Weise das WUP exprimieren, ein, wobei zum Beispiel das Nukleinsäuremolekül an einer Chromosomenlokation vorliegt, welche unterschiedlich von der von natürlichen Zellen ist.
2. Protein-betreffende Definitionen
(a) gereinigtes Polypeptid
Wenn das Molekül ein gereinigtes Polypeptid ist, wird das Polypeptid gereinigt, (1) um mindestens 15 Reste einer N-terminalen oder inneren Aminosäuresequenz unter Verwendung einer Sequenziervorrichtung zu erhalten, oder (2) zur Homogenität durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie blue- oder Silber-Anfärbung. Isolierte Polypeptide schließen jene ein, welche heterolog in gentechnisch gestalteten Zellen exprimiert werden oder in vitro exprimiert werden, da mindestens eine Komponente der natürlichen WUP-Umgebung nicht vorhanden sein wird. Gewöhnlich werden isolierte Polypeptide durch mindestens einen Reinigungsschritt hergestellt.
(b) aktives Polypeptid
Ein aktives WUP oder WUP-Fragment erhält eine biologische und/oder eine immunologische Aktivität des nativen oder natürlich vorkommenden WUP. Immunologische Aktivität betrifft die Fähigkeit zur Induzierung der Herstellung eines Antikörpers gegen ein Antigenepitop, welches ein natives WUP aufweist; biologische Aktivität betrifft eine Funktion, entweder inhibitorisch oder stimulatorisch, welche durch ein natives WUP verursacht wird, das immunologische Aktivität ausschließt. Eine biologische Aktivität von WUP schließt zum Beispiel sein nach oben Regulieren in Wnt1-exprimierenden Zellen ein.
(c) Abs
Antikörper kann einzelne monoklonale anti-WUP-Abs (einschließlich Agonist, Antagonist und neutralisierende Abs), anti-WUP-Antikörperzusammensetzungen mit Polyepitopspezifität, einkettige anti-WUP-Abs und Fragmente von anti-WUP-Abs sein. Ein „monoklonaler Antikörper" betrifft einen Antikörper, der von einer Population von im Wesentlichen homogenen Abs erhalten wird, d. h. die einzelnen Abs, welche die Population umfasst, sind identisch, außer natürlich vorkommende Mutationen, welche in geringem Umfang vorhanden sein können.
(d) Epitopmarkierungen
Ein Epitop-markiertes Polypeptid betrifft ein chimäres Polypeptid, fusioniert an ein „Markierungs-Polypeptid". Solche Markierungen stellen Epitope bereit, gegen welche Abs hergestellt werden können oder verfügbar sind, welche aber nicht die Polypeptidaktivität beeinflussen. Um die anti-Markierung-Antikörper ektivität mit endogenen Epitopen zu verringern, ist das Markierungspolypeptid bevorzugt einzigartig. Geeignete Markierungspolypeptide weisen im Allgemeinen mindestens sechs Aminosäurereste und normalerweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste, bevorzugt zwischen 8 und 20 Aminosäurereste, auf. Beispiele von Epitopmarkierungssequenzen schließen HA von Influenza A-Virus und FLAG ein.
Das neue WUP der Erfindung schließt die Nukleinsäuren, deren Sequenzen in den Tabellen 5 und 7 bereitgestellt sind, ein. Die Erfindung schließt auch eine WUP-Mutante oder -Variante mit der Sequenzidentität wie in den Patentansprüchen definiert ein, wobei jede der Basen von der entsprechenden in den Tabellen 5 und 7 gezeigten Base verändert werden kann, während noch ein Protein kodiert wird, das die Aktivitäten und physiologischen Funktionen des WUP-Fragments beibehält. Die Erfindung schließt ferner Nukleinsäuren ein, deren Sequenzen zu jenen gerade beschriebenen komplementär sind. Die Erfindung schließt zusätzlich Nukleinsäuren mit der Sequenzidentität wie in den Patentansprüchen definiert oder Komplemente dazu, deren Strukturen chemische Modifizierungen einschließen, ein. Solche Modifizierungen schließen durch nicht-einschränkendes Beispiel modifizierte Basen und Nukleinsäuren, deren Zuckerphosphatgerüste modifiziert oder derivatisiert sind, ein. Diese Modifizierungen werden mindestens teilweise zur Steigerung der chemischen Stabilität der modifizierten Nukleinsäure durchgeführt, so dass sie zum Beispiel als bindende Antisense-Nukleinsäuren in therapeutischen Verwendungen bei einem Empfänger verwendet werden können.
Die Erfindung schließt Polypeptide, umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, bevorzugt mindestens 98% Sequenzidentität zu SEQ ID Nr. 6 oder 8, wobei das Polypeptid ein aktives WUP-Polypeptid ist, sowie Nukleotide, welche jedwedes dieser Polypeptide kodieren, und Komplemente von jedweden von diesen Nukleotiden ein.
Das neue WUP der Erfindung schließt das Proteinfragment ein, welches aus den Aminosäuresequenzen, die in den Tabellen 6 und 8 bereitgestellt sind (SEQ ID Nr. 39), besteht. Die Erfindung schließt auch eine WUP-Protein-Mutante oder -Variante mit der Sequenzidentität wie in den Patentansprüchen definiert ein, wobei jedweder von ihren Resten von dem entsprechenden in SEQ ID Nr. 6 oder 8 gezeigten Rest verändert werden kann, während noch ein Protein kodiert wird, das seine nativen Aktivitäten und physiologischen Funktionen beibehält. Die Erfindung umfasst ferner Abs und Antikörperfragemente, wie F_ab oder (F_ab)₂, welche immunspezifisch an jedwedes der WUP der Erfindung binden.
Das humane Orthologe der Maussequenz ist in Tabelle 5 gezeigt; wobei die Start- und Stoppcodons in Fettschrift und durch Unterstreichen gezeigt sind.
Tabelle 5 hWUP1-Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 5)
Die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 umfasst teilweise eine Sequenz, von welcher man annahm, dass sie ein Peptid der Nukleotide 670 bis 791 kodiert; jedoch bestimmten die Erfinder, dass in Wirklichkeit das passende Peptid, bezogen auf Homologie, durch die Nukleotide 3 bis 380 kodiert wird, was den passenden Translationsstart als MVCI ergibt (SEQ ID Nr. 39; Tabelle 6).
Tabelle 6 hWUP1-Polypeptidsequenz (SEQ ID Nr. 39)
Eine sehr ähnliche humane Sequenz wurde auch identifiziert (SEQ ID Nr. 7).
Tabelle 7 hWUP2-Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 7)
Ein Polypeptid, welches durch SEQ ID Nr. 7 kodiert wird, ist in Tabelle 8 dargestellt (SEQ ID Nr. 39).
Tabelle 8 hWUP2-Polypeptidsequenz (SEQ ID Nr. 39)
Tabelle 10 zeigt die neuen Proteine, zusammen ausgerichtet mit anderen vermeintlichen Peptiden, welche durch Extension der Ratten-EST-Extension (SEQ ID Nr. 9) kodiert werden, einem Kaninchen-EST (GenBank C86606; SEQ ID Nr. 10), einem Fisch-EST (GenBank AU036392, SEQ ID Nr. 11) und einem vermeintlichen Drosophila-Protein (GenBank 097172; SEQ ID Nr. 12). In Tabelle 10 wird SEQ ID Nr. 2 als „cgrry0c0261_11202- 243_EXT_REV" bezeichnet, SEQ ID Nr. 4 ist „ss.Cura16.3p.contig.full.991216_REVCOMP", SEQ ID Nr. 6 ist „V34238patented_rev" und SEQ ID Nr. 8 ist „87769892".
Tabelle 10
Diese Ausrichtung zeigt, dass SEQ ID Nr. 9 ein hoch konserviertes Protein ist, und zeigt, dass das Met in MVCI (Reste 1 bis 4 von SEQ ID Nr. 9) ein Kozak-Met zeigt, welches die Translationsstartstelle ist. Weitere Analysen zeigen, dass dieses Protein zu Signalpeptidase I-Serin-Proteinen homolog ist. In E. coli sind diese Proteine zur Spaltung der N-terminalen Leadersequenzen von sekretierten oder Periplasmaproteinen verantwortlich. Prodom zeigt eine sehr gute Homologie zum Protein ATP Synthase Hydrogen Ion Transport der Mitochondrienmembran.
Die Homologie zum Transmembranprotein passt gut zu dem hydrophoben Profil. Blocks-Analyse, welche in 1 gezeigt ist, enthüllt auch eine Homologie zu Serinproteasen.
PSORT (Nakai und Horton, 1999) sagt voraus, dass alle Orthologen an der endoplasmatischen Retikulummembran lokalisiert sind, aber die Homologie mit bakteriellen und Mitochondrienproteinen zeigt, dass WUP wahrscheinlich an der Membran des Mitochondriums lokalisiert ist. Wegen seiner Homologie mit den E. coli-Signalpeptidase I- Serin-Proteinen ist WUP wahrscheinlich in den Mitochondrienimport und das Verarbeiten von Mitochondrienproteinen einbezogen.
Die Nukleinsäuren und Proteine der Erfindung sind zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krebs, einschließlich Darmkrebs, Brustkrebs und Melanome, nützlich. Jedoch ist keine medizinische Verwendung Teil dieser Erfindung wie beansprucht. Zum Beispiel kann ein cDNA-kodierendes WUP in Gentherapie nützlich sein und ein WUP-Protein kann nützlich sein, wenn es an einen Empfänger, der dessen bedarf, verabreicht wird. Die neue Nukleinsäure, welche WUP kodiert, und das WUP-Protein der Erfindung können ferner in diagnostischen in vitro-Verwendungen nützlich sein, wobei das Vorhandensein oder die Menge der Nukleinsäure oder des Proteins abgeschätzt werden: Diese Materialien sind ferner bei der Erzeugung von Abs, welche immunspezifisch an die neuen Substanzen der Erfindung binden, zur Verwendung in therapeutischen oder diagnostischen Verfahren nützlich.
WUP-Polynukleotide
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche WUP wie in den anhängigen Patentansprüchen definiert kodieren. Nukleinsäurefragmente davon können als Hybridisierungssonden zur Identifizierung von WUP-kodierenden Nukleinsäuren (z. B. WUP-mRNAs) und zur Verwendung als Polymerasekettenreaktion-(PCR)-Primer zur Amplifizierung und/oder Mutation von WUP-Molekülen nützlich sein. Ein „Nukleinsäuremolekül" schließt DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder Genom-DNA), RNA-Moleküle (z. B. mRNA), Analoga der DNA oder RNA, welche unter Verwendung von Nukleotidanaloga, -derivaten und -homologen erzeugt werden, ein, wobei die Moleküle die Sequenzidentität wie in den Patentansprüchen definiert aufweisen. Das Nukleinsäuremolekül kann einsträngig oder doppelsträngig sein, umfasst aber bevorzugt doppelsträngige DNA.
Die volle Länge oder eine Teillänge der nativen WUP-Sequenz kann zum „Herausfinden" von ähnlichen (homologen) Sequenzen (Ausubel et al., 1987; Sambrook, 1989) verwendet werden, wie: (1) die volle Länge oder Fragmente von WUP-cDNA von einer cDNA-Bibliothek von jedweden Spezies (z. B. Mensch, Maus, Katze, Hund, Bakterium, Virus, Retrovirus, Hefe), (2) von Zellen oder Geweben, (3) Varianten innerhalb einer Spezies, und (4) Homologe und Varianten von anderen Spezies. Um verwandte Sequenzen zu finden, welche verwandte Gene kodieren können, kann die Sonde derart designed werden, dass sie einzigartige Sequenzen kodiert oder Sequenzen degeneriert. Sequenzen können auch Genomsequenzen, einschließlich Promotoren, Enhancerelemente und Introns der nativen WUP-Sequenz, sein.
Zum Beispiel kann die WUP-Kodierregion in einer anderen Spezies unter Verwendung von solchen Sonden isoliert werden. Eine Sonde mit etwa 40 Basen wird, bezogen auf WUP, designed und hergestellt. Zum Nachweisen von Hybridisierungen werden Sonden unter Verwendung von zum Beispiel Radionukliden wie ³²P oder ³⁵S oder enzymatischen Markierungen wie alkalische Phosphatase, gekuppelt an die Sonde über Avidin-Biotin-Systeme, markiert. Markierte Sonden werden zum Nachweisen von Nukleinsäuren mit einer komplementären Sequenz zu der von WUP in Bibliotheken von cDNA, Genom-DNA oder mRNA einer gewünschten Spezies verwendet.
Solche Sonden können als ein Teil eines diagnostischen Testkits zur Identifizierung von Zellen oder Geweben, welche ein WUP fehlerbehaftet exprimieren, wie durch Messen eines Levels eines WUP in einer Probe von Zellen von einem Spender, z. B. durch Nachweisen von WUP-mRNA-Levels oder Bestimmen, ob ein Genom-WUP mutiert oder deletiert wurde, verwendet werden.
2. isolierte Nukleinsäure
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen, welche in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorhanden sind, abgetrennt. Bevorzugt ist eine isolierte Nukleinsäure frei von Sequenzen, welche in natürlicher Weise die Nukleinsäure (d. h. Sequenzen, welche an den 5'- und 3'-Termini der Nukleinsäure lokalisiert sind) in der Genom-DNA des Organismus, von welchem die Nukleinsäure abgeleitet ist, flankieren. Zum Beispiel können in verschiedenen Ausführungsformen isolierte WUP-Moleküle weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb von Nukleotidsequenzen, welche in natürlicher Weise das Nukleinsäuremolekül in der Genom-DNA de(r/s) Zelle/Gewebes, von welchen die Nukleinsäure abgeleitet ist (z. B. Gehirn, Herz, Leber, Milz, usw.), flankieren, enthalten. Darüber hinaus kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, im Wesentlichen frei von anderem Zellmaterial oder Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird, sein.
Ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung, z. B. ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 6 oder 8, oder ein Komplement dieser vorstehend erwähnten Nukleotidsequenz können unter Verwendung von Molekularbiologie-Standardtechniken und der bereitgestellten Sequenzinformationen isoliert werden. Unter Verwendung der gesamten oder eines Teils der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 6 oder 8 als eine Hybridisierungssonde können WUP-Moleküle unter Verwendung von Hybridisierungs- und Klonierungs-Standardtechniken (Ausubel et al., 1987; Sambrook, 1989) isoliert werden.
PCR-Amplifizierungstechniken können zur Amplifizierung von WUP unter Verwendung von cDNA, mRNA oder alternativ Genom-DNA als ein Templat und geeigneten Oligonukleotidprimern verwendet werden. Solche Nukleinsäuren können in einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Darüber hinaus können Oligonukleotide, welche WUP-Sequenzen entsprechen, durch synthetische Standardtechniken, z. B. eine automatisierte DNA-Synthesevorrichtung, hergestellt werden.
3. Oligonukleotid
Ein Oligonukleotid umfasst eine Reihe von verbundenen Nukleotidresten, wobei das Oligonukleotid eine ausreichende Anzahl von Nukleotidbasen aufweist, damit es in einer PCR-Reaktion oder anderen Verwendung verwendet werden kann. Eine kurze Oligonukleotidsequenz kann auf einer Genom- oder cDNA-Sequenz basieren oder dafür designed sein und wird zur Amplifizierung, Bestätigung oder Enthüllung der Gegenwart einer identischen, ähnlichen oder komplementären DNA oder RNA in einer besonderen Zelle oder Gewebe verwendet. Oligonukleotide umfassen Teile einer Nukleinsäuresequenz mit etwa 10 nt, 50 nt oder 100 nt in der Länge, bevorzugt etwa 15 nt bis 30 nt in der Länge. Ein Oligonukleotid, welches ein Nukleinsäuremolekül mit weniger als 100 nt in der Länge umfasst, kann ferner mindestens 6 benachbarte Nukleotide von SEQ ID Nr. 5 oder 7 oder ein Komplement davon umfassen. Oligonukleotide können chemisch synthetisiert werden und können auch als Sonden verwendet werden.
4. komplementäre Nukleinsäuresequenzen; Binden
In einer anderen Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Komplement der Nukleotidsequenz, welche in SEQ ID Nr. 5 oder 7 gezeigt ist, ist. Ein Teil dieser Nukleotidsequenz (z. B. ein Fragment kann als eine Sonde oder Primer oder ein Fragment, welches einen biologisch aktiven Teil eines WUP kodiert, verwendet werden). Ein Nukleinsäuremolekül, welches zu der in SEQ ID Nr. 5 oder 7 gezeigten Nukleotidsequenz komplementär ist, ist eines, welches zu der in SEQ ID Nr. 5 oder 7 gezeigten Nukleotidsequenz ausreichend komplementär ist, damit es mit wenigen oder keinen Fehlpaarungen an die in SEQ ID Nr. 5 oder 7 gezeigte Nukleotidsequenz wasserstoffbinden kann, wobei ein stabiler Duplex gebildet wird.
„Komplementär" betrifft Watson-Crick- oder Hoogsteen-Basenpaarung zwischen Nukleotideinheiten eines Nukleinsäuremoleküls und der Ausdruck „Binden" bedeutet die physikalische oder chemische Wechselwirkung zwischen zwei Polypeptiden oder Verbindungen oder in Zusammenhang stehenden Polypeptiden oder Verbindungen oder Kombinationen davon. Binden schließt ionische, nicht-ionische, van der Waals-, hydrophobe Wechselwirkungen und dergleichen ein. Eine physikalische Wechselwirkung kann entweder direkt oder indirekt sein. Indirekte Wechselwirkungen können durch die oder aufgrund der Wirkungen eine(s/r) anderen Polypeptids oder Verbindung stattfinden. Direktes Binden betrifft Wechselwirkungen, welche nicht durch die oder aufgrund der Wirkung eine(s/r) anderen Polypeptids oder Verbindung stattfinden, sondern anstatt ohne andere wesentliche chemische Zwischenverbindungen stattfinden.
Nukleinsäurefragmente sind mindestens 6 (benachbarte) Nukleinsäuren oder mindestens 4 (benachbarte) Aminosäuren, eine Länge, welche ausreichend ist, eine spezifische Hybridisierung im Falle von Nukleinsäuren beziehungsweise eine spezifische Erkennung eines Epitops im Falle von Aminosäuren zu ermöglichen und sie sind höchstens ein Teil, der kürzer als die voll Länge einer Sequenz ist. Fragmente können von jedwedem benachbartem Teil einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz der Wahl abgeleitet sein.
5. Derivate und Analoga
Derivate sind Nukleinsäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen, welche aus den nativen Verbindungen entweder direkt oder durch Modifizierung oder teilweise Substitution gebildet werden. Analoga sind Nukleinsäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen, welche eine Struktur aufweisen, die ähnlich aber nicht identisch zur nativen Verbindung ist, aber sich davon bezüglich bestimmter Komponenten oder Seitenketten unterscheidet. Analoga können synthetisch sein oder von einem unterschiedlichen Evolutionsursprung und können eine ähnliche oder gegenteilige metabolische Aktivität im Vergleich zum Wildtyp aufweisen. Homologe sind Nukleinsäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen eines besonderen Gens, welche von unterschiedlichen Spezies abgeleitet sind.
Derivate und Analoga können die volle Länge oder verschieden von der vollen Länge sein, wenn das Derivat oder Analogon eine modifizierte Nukleinsäure oder Aminosäure enthält, wie nachstehend beschrieben. Derivate oder Analoga der Nukleinsäuren oder Proteine schließen Moleküle, welche Regionen umfassen, die im Wesentlichen homolog zu Nukleinsäuren oder Proteinen in verschiedenen Ausführungsformen sind, mit mindestens etwa 70%, 80% oder 95% Identität (mit einer bevorzugten Identität von 80 bis 95%) zu einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz identischer Größe, oder wenn mit einer ausgerichteten Sequenz verglichen wird, wobei die Ausrichtung durch ein auf dem Fachgebiet bekanntes Homologie-Computerprogramm durchgeführt wird, oder deren kodierende Nukleinsäure zum Hybridiseren an das Komplement einer Sequenz, welche die vorstehend erwähnten Proteine kodiert, unter strengen, moderat-strengen oder niedrig-strengen Bedingungen in der Lage ist (Ausubel et al., 1987), ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
6. Homologie
Eine „homologe Nukleinsäuresequenz" oder „homologe Aminosäuresequenz" oder Variationen davon betreffen Sequenzen, welche durch eine Homologie auf dem Nukleotidlevel oder Aminosäurelevel wie vorstehend erörtert gekennzeichnet sind. Homologe Nukleotidsequenzen kodieren jene Sequenzen, welche Isoformen von WUP kodieren. Isoformen können in unterschiedlichen Geweben des selben Organismus als ein Ergebnis von zum Beispiel alternativem Splicing von RNA exprimiert werden. Alternativ können unterschiedliche Gene Isoformen kodieren. In der Erfindung schließen homologe Nukleotidsequenzen Nukleotidsequenzen ein, welche ein WUP von Spezies, welche verschieden von Menschen sind, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf: Wirbeltiere, und welche so z. B. Frosch, Maus, Ratte, Kaninchen, Hund, Katze, Rind, Pferd und andere Organismen einschließen können, insoweit diese unter die Patentansprüche fallen, kodieren.
Homologe Nukleotidsequenzen schließen auch natürlich vorkommende Allelvariationen und Mutationen der hier dargelegten Nukleotidsequenzen ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Eine homologe Nukleotidsequenz schließt jedoch nicht die exakte Nukleotidsequenz, welche humanes WUP kodiert, ein. Homologe Nukleinsäuresequenzen schließen jene Nukleinsäuresequenzen ein, welche konservative Aminosäuresubstitutionen (siehe nachstehend) in SEQ ID Nr. 6 oder 8 sowie ein Polypeptid, welches biologische WUP-Aktivität aufweist, kodieren. Verschiedene biologische Aktivitäten des WUP werden nachstehend beschrieben.
7. offene Leserahmen
Der offene Leserahmen (ORF) eines WUP-Gens kodiert WUP. Ein ORF ist eine Nukleotidsequenz, welche ein Startcodon (ATG) aufweist und mit einem der drei „Stopp"-Codons (TAA, TAG oder TGA) abbricht. In dieser Erfindung kann ein ORF jedoch jedweder Teil einer Kodiersequenz, welcher ein Startcodon und ein Stoppcodon umfassen kann oder nicht, sein. Um eine einzigartige Sequenz zu erreichen, kodieren bevorzugte WUP-ORFs mindestens 50 Aminosäuren.
WUP-Polypeptide
1. reif
Ein WUP kann ein reifes WUP kodieren. Eine „reife" Form eines Polypeptids oder Proteins, welche in der vorliegenden Erfindung offenbart werden, ist das Produkt eine(s/r) natürlich vorkommenden Polypeptids oder Vorläuferform oder Proprotein. Das/Der natürlich vorkommende Polypeptid, Vorläufer oder Proprotein schließen durch nicht-einschränkendes Beispiel die volle Länge des Genprodukts, welches durch das entsprechende Gen kodiert wird, ein. Alternativ kann sie als das Polypeptid, der Vorläufer oder das Proprotein, welche durch einen hier beschriebenen offenen Leserahmen kodiert werden, definiert sein. Die „reife" Form des Produkts tritt wieder durch nicht-einschränkendes Beispiel als ein Ergebnis von einem oder mehr natürlich vorkommenden Verarbeitungsschritten, wie sie in der Zelle oder Wirtzelle stattfinden können, in welchen das Genprodukt auftritt, auf. Beispiele von solchen Verarbeitungsschritten, welche zu einer „reifen" Form eines Polypeptids oder Proteins fuhren, schließen die Spaltung des N-terminalen Methioninrests, welcher durch das Initiierungscodon eines offenen Leserahmens kodiert wird, oder die proteolytische Spaltung einer Signalpeptid- oder Leadersequenz ein. So wird eine reife Form, welche von einem Vorläuferpolypeptid oder -Protein auftritt, welche Reste 1 bis N aufweisen, wobei der Rest 1 das N-terminale Methionin ist, Reste 2 bis N aufweisen, welche nach der Entfernung des N-terminalen Methionins verbleiben. Alternativ wird eine reife Form, welche von einem Vorläuferpolypeptid oder -Protein mit Resten 1 bis N auftritt, wobei eine N-terminale Signalsequenz von Rest 1 bis Rest M gespalten wird, die Reste von Rest M + 1 bis Rest N bleibend aufweisen. Ferner, wie hier verwendet, kann eine „reife" Form eines Polypeptids oder Proteins bei einem Modifizierungsschritt nach einer Translation, welcher verschieden von einem proteolytischen Spaltungsereignis ist, auftreten. Solche zusätzlichen Prozesse schließen durch nicht-einschränkendes Beispiel Glycosylierung, Myristoylierung oder Phosphorylierung ein. Im Allgemeinen kann ein reifes Polypeptid oder Protein aus der Durchführung nur eines dieser Prozesse oder einer Kombination von jedwedem von ihnen resultieren.
2. aktiv
Ein aktives WUP-Polypeptid erhält eine biologische und/oder eine immunologische Aktivität, welche ähnlich aber nicht notwendigerweise identisch zu einer Aktivität eines natürlich vorkommenden (Wildtyp) WUP-Polypeptids der Erfindung, einschließlich reifer Formen, ist. Ein besonderer biologischer Test mit oder ohne Dosisabhängigkeit kann zur Bestimmung von WUP-Aktivität verwendet werden. Immunologische Aktivität betrifft die Fähigkeit zur Induzierung der Herstellung eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop, welches ein natives WUP aufweist; biologische Aktivität betrifft eine Funktion, entweder inhibitorisch oder stimulatorisch, welche durch ein natives WUP verursacht wird und immunologische Aktivität ausschließt.
WUP-Nukleinsäurevarianten und Hybridisierung
1. Polynukleotid, Gen und rekombinante Genvarianten
Die Erfindung umfasst ferner Nukleinsäuremoleküle mit der Sequenzidentität wie in den Patentansprüchen definiert, welche sich von den in SEQ ID Nr. 5 oder 7 gezeigten Nukleotidsequenzen aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheiden und so das gleiche WUP kodieren wie das, welches durch die in SEQ ID Nr. 5 oder 7 gezeigten Nukleotidsequenzen kodiert wird. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung weist eine Nukleotidsequenz, welche ein Protein mit einer in SEQ ID Nr. 6 oder 8 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert, auf.
Zusätzlich zu den in SEQ ID Nr. 5 oder 7 gezeigten WUP-Sequenzen kann innerhalb einer Population DNA-Sequenzpolymorphismus, der die Aminosäuresequenzen des WUP verändert, vorliegen. Zum Beispiel wird Allelvariation unter Individuen genetischen Polymorphismus bei WUP aufweisen. Die Ausdrücke „Gen" und „rekombinantes Gen" betreffen Nukleinsäuremoleküle, welche einen offenen Leserahmen (ORF) umfassen, der WUP, bevorzugt ein Wirbeltier-WUP, kodiert. Solche natürliche Allelvariationen können typischerweise in 1 bis 5% Varianz in WUP resultieren. Jedwede und alle solche Nukleotidvariationen und der resultierende Aminosäurepolymorphismus in dem WUP, welche das Ergebnis von natürlicher Allelvariation sind und welche die funktionelle Aktivität des WUP nicht verändern, liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Darüber hinaus werden WUP von anderen Spezies, welche eine Nukleotidsequenz aufweisen, die sich von der Sequenz SEQ ID Nr. 5 oder 7 unterscheidet, wie in den Patentansprüchen definiert in Betracht gezogen. Nukleinsäuremoleküle, welche natürlichen Allelvarianten und Homologen der WUP-cDNAs entsprechen, können basierend auf ihrer Homologie zu dem WUP von SEQ ID Nr. 5 oder 7 unter Verwendung von von cDNA abgeleiteten Sonden zur Hybridisierung mit homologen WUP-Sequenzen unter strengen Bedingungen isoliert werden.
„WUP-Polynukleotidvariante" oder „WUP-Nukleinsäuresequenzvariante" bedeuten ein Nukleinsäuremolekül, welches ein aktives WUP-Polypeptid wie in den Patentansprüchen definiert kodiert und (1) mindestens 80% Nukleinsäuresequenzidentität mit SEQ ID Nr. 7 oder mindestens 90% Identität mit SEQ ID Nr. 5, (2) die volle Länge eines nativen WUP ohne das Signalpeptid aufweist. Gewöhnlich wird eine WUP-Polynukleotidvariante mindestens 80% Nukleinsäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 7 oder mindestens 90% Nukleinsäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 5 und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 98% Nukleinsäuresequenzidentität zur Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 5 oder 7 aufweisen. Eine WUP-Polynukleotidvariante kann die volle Länge eines nativen WUP ohne das Signalpeptid kodieren. Varianten umfassen die native Nukleotidsequenz nicht.
„Prozente (%) der Nukleinsäuresequenzidentität" in Bezug auf die hier identifizierten WUP-kodierenden Nukleinsäuresequenzen ist als der Prozentsatz der Nukleotide in einer Versuchssequenz definiert, der mit den Nukleotiden in der WUP-Sequenz von Interesse identisch ist, nach dem Ausrichten der Sequenzen und Einbringen von Lücken, falls notwendig, um die maximalen Prozente der Sequenzidentität zu erreichen. Die Ausrichtung für die Zwecke der Bestimmung der % der Nukleinsäuresequenzidentität kann in verschiedenen Weisen, welche innerhalb des Standes der Technik liegen, zum Beispiel unter Verwendung von öffentlich zugänglicher Computersoftware wie BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign-(DNASTAR)-Software erreicht werden. Der Fachmann kann geeignete Parameter zum Messen der Ausrichtung, einschließlich jedwede Algorithmen, welche gebraucht werden, um eine maximale Ausrichtung über die volle Länge der Sequenzen, welche verglichen werden, zu erreichen, bestimmen.
Wenn Nukleotidsequenzen ausgerichtet werden, können die % der Nukleinsäuresequenzidentität einer gegebenen Nukleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine gegebene Nukleinsäuresequenz D (welche alternativ als eine gegebene Nukleinsäuresequenz C umschrieben werden kann, die bestimmte % einer Nukleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine gegebene Nukleinsäuresequenz D aufweist oder umfasst) wie folgt berechnet werden: % der Nukleinsäuresequenzidentität = W/Z·100wobei
W die Anzahl der Nukleotide ist, welche als identische Übereinstimmungen durch die Ausrichtung von C und D des Sequenzausrichtungsprogramms oder Algorithmus eingestuft werden
und
Z die Gesamtanzahl der Nukleotide in D ist.
Wenn die Länge der Nukleinsäuresequenz C nicht gleich der Länge der Nukleinsäuresequenz D ist, werden die % der Nukleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht gleich den % der Nukleinsäuresequenzidentität von D zu C sein.
2. Strenge
Homologe (d. h. Nukleinsäuren, welche WUP kodieren, die von Spezies abgeleitet sind, welche unterschiedlich zu Mensch sind) oder andere verwandte Sequenzen (z. B. Paraloge) können durch Hybridisierung mit niedriger, moderater oder hoher Strenge mit der gesamten oder einem Teil der besonderen humanen Sequenz als eine Sonde unter Verwendung von Verfahren, welche auf dem Fachgebiet für Nukleinsäurehybridisierung und Klonierung bekannt sind, erhalten werden.
Die Spezifität einer einsträngigen DNA bei der Hybridisierung mit komplementären Fragmenten wird durch die „Strenge" der Reaktionsbedingungen bestimmt. Die Hybridisierungsstrenge steigt an, wie die Neigung zur Bildung von DNA-Duplexen abnimmt. Bei Nukleinsäurehybridisierungsreaktionen kann die Strenge derart gewählt werden, dass jedwede spezielle Hybridisierungen begünstigt werden (hohe Strenge), welche zur Identifizierung von zum Beispiel der vollen Länge von Klonen aus einer Bibliothek verwendet werden können. Weniger spezielle Hybridisierungen (niedrige Strenge) können zur Identifizierung von verwandten aber nicht exakten DNA-Molekülen (homolog, aber nicht identisch) oder Segmenten verwendet werden.
DNA-Duplexe werden stabilisiert durch: (1) die Anzahl von komplementären Basenpaaren, (2) den Typ der Basenpaare, (3) die Salzkonzentration (Ionenstärke) des Reaktionsgemisches, (4) die Temperatur der Umsetzung, und (5) das Vorhandensein von bestimmten organischen Lösungsmitteln, wie Formamid, welches DNA-Duplex-Stabilität verringert. Im Allgemeinen, je länger die Sonde, desto höher die Temperatur, welche zum passenden Annealing erforderlich ist. Eine allgemeine Vorgehensweise ist, die Temperatur zu variieren: höhere relative Temperaturen resultieren in strengeren Reaktionsbedingungen. (Ausubel et al., 1987) stellen eine ausgezeichnete Erklärung für die Strenge von Hybridisierungsreaktionen bereit.
Unter „strengen Bedingungen" zu hybridisieren, beschreibt Hybridisierungsprotokolle, bei welchen Nukleotidsequenzen, welche mindestens 60% homolog zueinander sind, hybridisiert bleiben. Im Allgemeinen werden strenge Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezielle Sequenz bei eine(r/m) definierten Ionenstärke und pH-Wert liegen. Der Tm ist die Temperatur (unter definierte(r/m) Ionenstärke, pH-Wert und Nukleinsäurekonzentration), bei welcher 50% der Sonden, welche zur Zielsequenz komplementär sind, im Gleichgewicht mit der Zielsequenz hybridisieren. Da die Zielsequenzen im Allgemeinen im Überschuss vorhanden sind, sind beim Tm 50% der Sonden im Gleichgewicht besetzt.
(a) hohe Strenge
„Strenge Hybridisierungsbedingungen" sind Bedingungen, welche ermöglichen, dass eine Sonde, ein Primer oder ein Oligonukleotid nur mit ihrer Zielsequenz hybridisieren. Strenge Bedingungen sind Sequenz-abhängig und werden sich unterscheiden. Strenge Bedingungen umfassen: (1) Waschungen mit niedriger Ionenstärke und hoher Temperatur (z. B. 15 mM Natriumchlorid, 1,5 mM Natriumcitrat, 0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C); (2) ein Denaturierungsmittel während der Hybridisierung (z. B. 50% (v/v) Formamid, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert 6,5; 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C); oder (3) 50% Formamid. Waschungen umfassen typischerweise auch 5 × SSC (0,75 M NaCl, 75 mM Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH-Wert 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, ultraschallbehandelte Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C, mit Waschungen bei 42°C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt von einer Waschung mit hoher Strenge, welche aus 0,1 × SSC, enthaltend EDTA, besteht, bei 55°C. Bevorzugt sind die Bedingungen derart, dass Sequenzen, welche mindestens etwa 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% homolog zueinander sind, typischerweise aneinander hybridisiert bleiben. Diese Bedingungen sind als Beispiele bereitgestellt und mit ihnen ist nicht beabsichtigt, einschränkend zu sein.
(b) moderate Strenge
„Moderat-strenge Bedingungen" verwenden Waschlösungen und Hybridisierungsbedingungen, welche weniger streng sind (Sambrook, 1989), so dass ein Polynukleotid an die vollständigen Derivate oder Analoga von SEQ ID Nr. 5 oder 7 hybridisiert. Ein Beispiel umfasst eine Hybridisierung in 6 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung, 0,5% SDS und 100 mg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA bei 55°C, gefolgt von einer oder mehr Waschungen in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 37°C. Die Temperatur, Ionenstärke, usw. können eingestellt werden, um an experimentelle Faktoren wie Sondenlänge anzupassen. Andere moderat-strenge Bedingungen werden in (Ausubel et al., 1987; Kriegler, 1990) beschrieben.
(c) niedrige Strenge
„Niedrig-strenge Bedingungen" verwenden Waschlösungen und Hybridisierungsbedingungen, welche weniger streng als jene für moderate Strenge sind (Sambrook, 1989), so dass ein Polynukleotid an die gesamten Derivate oder Analoga von SEQ ID Nr. 5 oder 7 hybridisiert. Ein nicht-einschränkendes Beispiel von Hybridisierungsbedingungen mit niedriger Strenge sind Hybridisierung in 35% Formamid, 5 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 5 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 mg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA, 10% (Gew./Vol.) Dextransulfat bei 40°C, gefolgt von einer oder mehr Waschungen in 2 × SSC, 25 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 5 mM EDTA und 0,1% SDS bei 50°C. Andere Bedingungen von niedriger Strenge, wie jene für Spezieskreuzhybridisierungen werden in (Ausubel et al., 1987; Kriegler, 1990; Shilo und Weinberg, 1981) beschrieben.
3. konservative Mutationen
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Allelvarianten von WUP können durch Mutation in SEQ ID Nr. 5 oder 7 Änderungen eingebracht werden, welche Veränderungen in den Aminosäuresequenzen der kodierten WUP verursachen, die die WUP-Funktion nicht verändern. Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen, welche zu Aminosäuresubstitutionen an „nicht wesentlichen" Aminosäureresten führen, in der Sequenz SEQ ID Nr. 6 oder 8 durchgeführt werden. Ein „nicht wesentlicher" Aminosäurerest ist ein Rest, der in den Wildtyp-Sequenzen der WUP verändert werden kann, ohne ihre biologische Aktivität zu verändern, wogegen ein „wesentlicher" Aminosäurerest für eine solche biologische Aktivität erforderlich ist. Zum Beispiel wird für Aminosäurereste, welche unter den WUP der Erfindung konserviert sind, vorhergesagt, dass sie insbesondere für Veränderung nicht geeignet sind. Aminosäuren, für welche konservative Substitutionen durchgeführt werden können, sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Nützliche konservative Substitutionen sind in Tabelle A, „Bevorzugte Substitutionen", gezeigt. Konservative Substitutionen, wobei eine Aminosäure einer Klasse mit einer anderen Aminosäure desselben Typs ersetzt wird, fallen in den Umfang des erfindungsgemäßen Gegenstandes, solange die Substitution nicht physikalisch die biologische Aktivität der Verbindung verändert. Falls solche Substitutionen in einer Änderung der biologischen Aktivität resultieren, werden dann stärker wesentliche Änderungen, welche in Tabelle B als beispielhaft angegeben sind, eingebracht und die Produkte werden auf biologische WUP-Polypeptid-Aktivität gescreent. Tabelle A Bevorzugte Lösungen

Ursprünglicher Rest	Beispielhafte Substituionen	Bevorzugte Substitutionen
Ala (A)	Val, Leu, Ile	Val
Arg (R)	Lys, Gln, Asn	Lys
Asn (N)	Gln, His, Lys, Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro, Ala	Ala
His (H)	Asn, Gln, Lys, Arg	Arg
Ile (I)	Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucin	Leu
Leu (L)	Norleucin Ile, Val, Met, Ala, Phe	Ile
Lys (K)	Arg, Gln, Asn	Arg
Met (M)	Leu, Phe, Ile	Leu
Phe (F)	Leu, Val, Ile, Tyr	Leu
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr, Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val (V)	Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Norleucin	Leu

Nicht-konservative Substitutionen, welche auf (1) die Struktur des Polypeptidgerüsts, wie ein β-Faltblatt oder α-helikale Konformation, (2) die Ladung oder (3) Hydrophobie oder (4) den Hauptteil der Seitenkette der Zielstelle einwirken, können die Polypeptidfunktion oder immunologische Identität von WUP modifizieren. Reste werden in Gruppen bezogen auf allgemeine Seitenketteneigenschaften, wie in Tabelle B angegeben, eingeteilt. Nicht-konservative Substitutionen bedingen das Austauschen eines Mitglieds einer dieser Klassen mit einer anderen Klasse. Substitutionen können in konservative Substitutionsstellen oder stärker bevorzugt in nicht-konservative Stellen eingebracht werden. Tabelle B Aminosäureklassen

Klasse	Aminosäuren
hydrophob	Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile
neutral hydrophil	Cys, Ser, Thr
sauer	Asp, Glu
basisch	Asn, Gln, His, Lys, Arg
unterbricht Kettenkonformation	Gly, Pro
aromatisch	Trp, Tyr, Phe

Die Polypeptidvarianten können unter Verwendung von Verfahren, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie Oligonukleotid-vermittelte (auf eine Stelle ausgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scan und PCR-Mutagenese, hergestellt werden. Auf eine Stelle ausgerichtete Mutagenese (Carter, 1986; Zoller und Smith, 1987), Kassettenmutagenese, Restriktionsselektionsmutagenese (Wells et al., 1985) oder andere bekannte Techniken können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um die WUP-DNA-Variante herzustellen (Ausubel et al., 1987; Sambrook, 1989).
In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, welche ein Protein kodiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 80%, 90% und am stärksten bevorzugt etwa 95% homolog zu SEQ ID Nr. 6 oder 8 ist, umfasst.
4. Antisense Nukleinsäuren
Verwendung von Antisense- und Sense-WUP-Oligonukleotiden kann WUP-Polypeptidexpression verhindern. Diese Oligonukleotide binden an Zielaminosäuresequenzen, wobei Duplexe gebildet werden, die die Transkription oder Translation der Zielsequenz durch Steigern der Degradation der Duplexe, vorzeitig Abbrechen der Transkription oder Translation oder durch andere Mittel blockieren.
Antisense- oder Sense-Oligonukleotide sind einsträngige Nukleinsäuren, entweder RNA oder DNA, welche Ziel-WUP-mRNA-(Sense) oder -WUP-DNA-(Antisense)-Sequenzen binden können. Antisense-Nukleinsäuren können gemäß den Basenpaarungsregeln von Watson und Crick oder Hoogsteen designed werden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zur gesamten Kodierregion der WUP-mRNA, aber stärker bevorzugt zu nur einem Teil der Kodier- oder Nicht-Kodierregion der WUP-mRNA, komplementär sein. Zum Beispiel kann das Antisense-Oligonukleotid zur Region, welche die Translationsstartstelle der WUP-mRNA umgibt, komplementär sein. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide können ein Fragment der WUP-DNA-Kodierregion mit mindestens etwa 14 Nukleotiden, bevorzugt etwa 14 bis 30 Nukleotiden, umfassen. Im Allgemeinen können Antisense-RNA- oder -DNA-Moleküle mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 Basen in der Länge oder mehr umfassen. Unter anderen beschreiben (Stein und Cohen, 1988; van der Krol et al., 1988b) Verfahren zum Ableiten von Antisense- oder Sense-Oligonukleotiden von einer gegebenen cDNA-Sequenz.
Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, schließen ein: 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Alternativ kann die Antisense-Nukleinsäure biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors, in welchen eine Nukleinsäure in einer Antisense-Orientierung subkloniert wurde, so dass die transkribierte RNA zur Zielnukleinsäure von Interesse komplementär sein wird, hergestellt werden.
Zur Einbringung von Antisense- oder Sense-Oligonukleotiden in Zielzellen (Zellen, welche die Zielnukleinsäuresequenz enthalten) kann jedwedes Gentransferverfahren verwendet werden. Beispiele von Gentransferverfahren schließen (1) biologische, wie Gentransfervektoren wie Epstein-Barr-Virus oder Konjugieren der exogenen DNA an ein Ligandbindungsmolekül, (2) physikalische, wie Elektroporation und Injektion, und (3) chemische, wie CaPO₄-Präzipitation und Oligonukleotid-Lipid-Komplexe, ein.
Ein Antisense- oder Sense-Oligonukleotid wird in einen geeigneten Gentransferretrovirusvektor eingebracht. Eine Zelle, welche die Zielnukleinsäuresequenz enthält, wird mit dem rekombinanten Retrovirusvektor, entweder in vivo oder ex vivo, in Kontakt gebracht. Beispiele von geeigneten Retrovirusvektoren schließen jene, welche von dem Mausretrovirus M-MuLV, N2 (ein Retrovirus, der von M-MuLV abgeleitet ist) abgeleitet sind, oder die Doppelkopievektoren, welche als DCT5A, DCT5B und DCT5C ( WO 90/13641 , 1990) bezeichnet werden, ein. Um eine ausreichende Nukleinsäuremolekültranskription zu erreichen, sind Vektorkonstrukte, in welchen die Transkription des Antisense-Nukleinsäuremoleküls durch einen starken polII- oder polIII-Promotor kontrolliert wird, bevorzugt.
Um Zielzellen in einem Zellpopulationsgemisch zu spezifizieren, können Zelloberflächenrezeptoren, welche für die Zielzellen spezifisch sind, genutzt werden. Antisense- und Sense-Oligonukleotide werden an ein Ligandbindungsmolekül konjugiert, wie in ( WO 91/04753 , 1991) beschrieben. Liganden für Rezeptoren, welche für die Zielzellen spezifisch sind, werden ausgewählt. Beispiele von geeigneten Ligandbindungsmolekülen schließen Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, Zytokine oder andere Liganden, welche an Zelloberflächenrezeptoren oder -molekülen binden, ein. Bevorzugt beeinflusst die Konjugation des Ligandbindungsmoleküls nicht wesentlich die Fähigkeit der Rezeptoren oder des Moleküls, das Ligandbindungsmolekülkonjugat zu binden oder den Eintritt des Sense- oder Antisense-Oligonukleotids oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren.
Liposomen transferieren ein Sense- oder Antisense-Oligonukleotid wirksam zu Zellen ( WO 90/10448 , 1990). Der Sense- oder Antisense-Oligonukleotid-Lipid-Komplex wird in der Zelle bevorzugt durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Das Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung kann ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül sein. Ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezielle doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, worin im Gegensatz zu den normalen α-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987a) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al., 1987b) umfassen.
Eine Antisense-Nukleinsäure der Erfindung kann ein Ribozym sein. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, welche zum Spalten einer einsträngigen Nukleinsäure, wie einer mRNA, zu welcher sie eine komplementäre Region aufweisen, in der Lage sind. So können Ribozyme, wie Hammerhai-Ribozyme, (Haseloff und Gerlach, 1988) zur katalytischen Spaltung von WUP-mRNA-Transkripten und so zur Inhibierung der Translation verwendet werden. Ein Ribozym, welches für eine WUP-kodierende Nukleinsäure spezifisch ist, kann basierend auf der Nukleotidsequenz einer WUP-cDNA (d. h. SEQ ID Nr. 5 oder 7) designed werden. Zum Beispiel kann ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS-RNA aufgebaut werden, wobei die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zur Nukleotidsequenz ist, welche in einer WUP-kodierenden mRNA gespalten werden soll (Cech et al., U.S. Patent Nr. 5,116,742 , 1992; Cech et al., U.S. Patent Nr. 4,987,071 , 1991). WUP-mRNA kann auch zum Auswählen einer katalytischen RNA mit einer speziellen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen verwendet werden (Bartel und Szostak, 1993).
Alternativ kann WUP-Expression durch komplementäres Zielrichten von Nukleotidsequenzen auf die regulatorische Region des WUP (z. B. den WUP-Promotor oder die Enhancer), wobei Tripelhelixstrukturen gebildet werden, welche eine Transkription des WUP in Zielzellen verhindern, inhibiert werden (Helene, 1991; Helene et al., 1992; Maher, 1992).
Modifizierungen von Antisense- und Sense-Oligonukleotiden können ihre Wirksamkeit verstärken. Modifizierte Zucker-Phosphodiester-Bindungen oder andere Zucker-Bindungen ( WO 91/06629 , 1991) erhöhen die in vivo-Stabilität durch Verleihen von Resistenz gegen endogene Nukleasen ohne die Bindungsspezifität für Zielsequenzen zu zerstören. Andere Modifizierungen können die Affinitäten der Oligonukleotide für ihre Ziele, wie kovalent gebundene organische Einheiten ( WO 90/10448 , 1990) oder Poly-(L)-lysin, erhöhen. Andere Anbringungen modifizieren die Bindungsspezifitäten der Oligonukleotide für ihre Ziele, einschließlich Metallkomplexe oder interkalierende (z. B. Ellipticin) und alkylierende Mittel.
Zum Beispiel kann das Deoxyribosephosphatgerüst der Nukleinsäuren modifiziert werden, um Peptidnukleinsäuren zu erzeugen (Hyrup und Nielsen, 1996). „Peptidnukleinsäuren" oder „PNAs" betreffen Nukleinsäuremimetika (z. B. DNA-Mimetika), in welchen das Deoxyribosephosphatgerüst durch ein Pseudopeptidgerüst ersetzt ist und nur die vier natürlichen Nukleobasen beibehalten wurden. Das neutrale Gerüst von PNAs ermöglicht eine spezifische Hybridisierung an DNA und RNA unter Bedingungen von niedriger Ionenstärke. Die Synthese von PNA-Oligomeren kann unter Verwendung von Festphasenpeptidsynthese-Standardprotokollen durchgeführt werden (Hyrup und Nielsen, 1996; Perry-O'Keefe et al., 1996).
PNAs von WUP können in therapeutischen und diagnostischen Verwendungen verwendet werden. Zum Beispiel können PNAs als Antisense- oder Antigen-Mittel für eine Sequenzspezifische Modulation der Genexpression durch Induzieren eines Transkription- oder Translationsstopps oder Inhibieren der Replikation verwendet werden. WUP-PNAs können auch in der Analyse von einzelnen Basenpaarmutationen (z. B. PNA-ausgerichtetes PCR-Clamping; als künstliche Restriktionsenzyme, wenn in Kombination mit anderen Enzymen verwendet, z. B. S₁-Nukleasen (Hyrup und Nielsen, 1996); oder als Sonden oder Primer für DNA-Sequenz und Hybridisierung (Hyrup und Nielsen, 1996; Perry-O'Keefe et al., 1996) verwendet werden.
PNAs von WUP können modifiziert werden, um ihre Stabilität oder zelluläre Aufnahme zu steigern. Lipophile oder andere Helferreste können an PNAs angefügt werden, PNA-DNA-Dimmer können gebildet werden oder die Verwendung von Liposomen oder anderen Arzneistoffbereitstellungstechniken. Zum Beispiel können PNA-DNA-Chimären erzeugt werden, welche die vorteilhaften Eigenschaften von PNA und DNA kombinieren können. Solche Chimären ermöglichen DNA-Erkennungsenzymen (z. B. RNase H und DNA-Polymerasen), mit dem DNA-Teil wechselzuwirken, während der PNA-Teil hohe Bindungsaffinität und -spezifität bereitstellt. PNA-DNA-Chimäre können unter Verwendung von Linker mit geeigneten Längen, welche bezogen auf das Basenstapeln, die Anzahl der Bindungen zwischen den Nukleobasen und die Orientierung ausgewählt werden, verbunden werden (Hyrup und Nielsen, 1996). Die Synthese von PNA-DNA-Chimären kann durchgeführt werden (Finn et al., 1996; Hyrup und Nielsen, 1996). Zum Beispiel kann eine DNA-Kette auf einem festen Träger unter Verwendung von Phosphoramidit-Kupplungsstandardchemie synthetisiert werden und modifizierte Nukleosidanaloga, z. B. 5'-(4-Methoxytrityl)amino-5'-deoxythymidinphosphoramidit, können zwischen der PNA und dem 5'-Ende der DNA verwendet werden (Finn et al., 1996; Hyrup und Nielsen, 1996). PNA-Monomere werden dann in einer schrittweisen Art gekuppelt, wobei ein chimäres Molekül mit einem 5'-PNA-Segment und einem 3'-DNA-Segment hergestellt wird (Finn et al., 1996).
Alternativ können chimäre Moleküle mit einem 5'-DNA-Segment und einem 3'-PNA-Segment synthetisiert werden (Petersen et al., 1976).
Das Oligonukleotid kann andere anhängende Reste wie Peptide (z. B. zum Zielrichten von Wirtzellrezeptoren in vivo) oder Mittel, welche den Transport durch die Zellmembran (Lemaitre et al., 1987; Letsinger et al., 1989 oder PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/09810 ) oder die Blut-Hirn-Schranke (z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/10134 ) ermöglichen, einschließen. Zusätzlich können Oligonukleotide mit Hybridisierung-einleitenden Spaltungsmitteln (van der Krol et al., 1988a) oder interkalierenden Mitteln (Zon, 1988) modifiziert werden. Das Oligonukleotid kann an ein anderes Molekül, z. B. ein Peptid, ein Hybridisierung-einleitendes Vernetzungsmittel, ein Transportmittel, ein Hybridisierungeinleitendes Spaltungsmittel, und dergleichen, konjugiert werden.
WUP-Polypeptide
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft isolierte WUP, Polypeptide wie in den abhängigen Patentansprüchen definiert. Diese Polypeptide sind zur Verwendung als Immungene zur Erzeugung von anti-WUP-Abs geeignet. In einer Ausführungsform können native WUP von Zellen oder Gewebequellen durch ein geeignetes Reinigungsschema unter Verwendung von Proteinreinigungs-Standardtechniken isoliert werden. In einer anderen Ausführungsform werden WUP durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Alternativ zu rekombinanter Expression können ein WUP oder Polypeptid chemisch unter Verwendung von Peptidsynthese-Standardtechniken synthetisiert werden.
1. Polypeptide
Ein WUP-Polypeptid schließt die Aminosäuresequenz von WUP, dessen Sequenzen in SEQ ID Nr. 6 oder 8 bereitgestellt sind, ein. Die Erfindung schließt auch eine Proteinmutante oder -variante (mit der in den Patentansprüchen definierten Sequenzidentität) ein, wobei jedweder von ihren Resten von den entsprechenden Resten, welche in SEQ ID Nr. 6 oder 8 gezeigt sind, verändert werden kann, wobei noch ein Protein kodiert wird, das seine WUP-Aktivitäten und physiologischen Funktionen beibehält, wobei das Polypeptid ein aktives WUP-Polypeptid ist.
2. WUP-Polypeptidvarianten
Im Allgemeinen ist eine WUP-Variante ein Polypeptid, welches eine WUP-ähnliche Funktion bewahrt, und schließt jedwede Variante ein, wobei Reste an einer besonderen Position in der Sequenz durch andere Aminosäuren substituiert wurden, und schließt ferner die Möglichkeit der Einbringung eines zusätzlichen Rests oder Resten zwischen zwei Resten des Ausgangsproteins sowie die Möglichkeit der Deletion von einem oder mehr Resten von der Ausgangssequenz ein. Jedwede Aminosäuresubstitution, -insertion oder -deletion wird von der Erfindung umfasst. In vorteilhaften Umständen ist die Substitution eine konservative Substitution wie vorstehend definiert.
„WUP-Polypeptidvariante" bedeutet ein aktives WUP-Polypeptid mit mindestens: (1) 80% Aminosäuresequenzidentität mit SEQ ID Nr. 6 oder 8 oder (2) eine WUP-Polypeptidsequenz, welche aus einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 39 besteht. Zum Beispiel schließen WUP-Polypeptidvarianten WUP-Polypeptide ein, wobei ein oder mehr Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der vollen Länge der nativen Aminosäuresequenz hinzugefügt oder deletiert sind. Eine WUP-Polypeptidvariante wird mindestens etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, bevorzugt mindestens etwa 81% Aminosäuresequenzidentität, stärker bevorzugt mindestens etwa 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% Aminosäuresequenzidentität und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 99% Aminosäuresequenzidentität zur Sequenz SEQ ID Nr. 6 oder 8 aufweisen, wobei das Polypeptid ein aktives WUP-Polypeptid ist. Eine WUP-Polypeptidvariante kann eine Sequenz ohne das Signalpeptid aufweisen. Gewöhnlich weisen WUP-Polypeptidvarianten mindestens 100, 150, 200 oder 300 Aminosäuren in der Länge oder mehr auf.
„Prozente (%) der Aminosäuresequenzidentität" ist als der Prozentsatz von Aminosäureresten definiert, der mit den Aminosäureresten in der offenbarten WUP-Polypeptidsequenz in einer Versuchssequenz identisch ist, wenn die zwei Sequenzen ausgerichtet werden. Zur Bestimmung der % der Aminosäureidentität werden Sequenzen ausgerichtet und, falls notwendig, werden Lücken eingebracht, um die maximalen % der Sequenzidentität zu erreichen; wobei konservative Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität angesehen werden. Aminsäuresequenzausrichtungsverfahren zur Bestimmung der Prozente der Identität sind dem Fachmann bekannt. Oft öffentlich zugängliche Computersoftware wie BLAST-, BLAST2-, ALIGN2- oder Megalign-(DNASTAR)-Software wird zum Ausrichten von Peptidsequenzen verwendet. Der Fachmann kann geeignete Parameter zum Messen der Ausrichtung, einschließlich jedwede Algorithmen, welche gebraucht werden, um eine maximale Ausrichtung über die volle Länge der Sequenzen, welche verglichen werden, zu erreichen, bestimmen.
Wenn Aminosäuresequenzen ausgerichtet werden, können die % der Aminosäuresequenzidentität einer gegebenen Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine gegebene Aminosäuresequenz B (welche alternativ als eine gegebene Aminosäuresequenz A umschrieben werden kann, die bestimmte % einer Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine gegebene Nukleinsäuresequenz B aufweist oder umfasst) wie folgt berechnet werden: % der Aminosäuresequenzidentität = X/Y·100wobei
X die Anzahl der Aminosäurereste ist, welche als identische Übereinstimmungen durch die Ausrichtung von A und B des Sequenzausrichtungsprogramms oder Algorithmus eingestuft werden
und
Y die Gesamtanzahl der Aminosäurereste in B ist.
Wenn die Länge der Aminosäuresequenz A nicht gleich der Länge der Aminosäuresequenz B ist, werden die % der Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich den % der Aminosäuresequenzidentität von B zu A sein.
3. isolierte/gereinigte Polypeptide
Ein „isoliertes" oder „gereinigtes" Polypeptid, Protein oder biologisch aktives Fragment wird von einer Komponente aus ihrer natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder gewonnen. Verunreinigungskomponenten schließen Materialien ein, welche typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid beeinflussen, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige Materialien einschließen. Bevorzugt wird das Polypeptid bis zu einem Grad aufgereinigt, der ausreichend ist, um mindestens 15 Reste einer N-terminalen oder inneren Aminosäuresequenz zu erhalten. Um im Wesentlichen isoliert zu sein, weisen Zubereitungen weniger als 30% verunreinigendes Nicht-WUP-Material (Verunreinigungen), stärker bevorzugt weniger als 20%, 10% und am stärksten bevorzugt weniger als 5% Verunreinigungen, bezogen auf das Trockengewicht, auf. Ein isoliertes, in rekombinanter Weise hergestelltes WUP oder ein biologisch aktiver Teil sind bevorzugt im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d. h. das Kulturmedium stellt weniger als etwa 20%, stärker bevorzugt weniger als etwa 10% und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% der WUP-Zubereitung, bezogen auf das Volumen, dar. Beispiele von Verunreinigungen schließen Zelltrümmer, Kulturmedien und Substanzen, welche während der in vitro-Synthese von WUP verwendet und hergestellt werden, ein.
4. biologisch aktiv
Biologisch aktive Teile von WUP schließen Peptide ein, welche Aminosäuresequenzen umfassen, die ausreichend homolog sind zu oder abgeleitet sind von den Aminosäuresequenzen des WUP (SEQ ID Nr. 6 oder 8), welche weniger Aminosäuren als die volle Länge des WUP einschließen und mindestens eine Aktivität eines WUP aufweisen. Biologisch aktive Teile umfassen eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität von nativem WUP. Ein biologisch aktiver Teil eines WUP kann ein Polypeptid sein, das heißt zum Beispiel 10, 25, 50, 100 oder mehr Aminosäurereste in der Länge. Andere biologisch aktive Teile, in welchen andere Regionen des Proteins deletiert sind, können durch rekombinante Techniken hergestellt und für eine oder mehr der funktionellen Aktivitäten eines nativen WUP bewertet werden.
Biologisch aktive Teile von WUP können eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche in SEQ ID Nr. 6 oder 8 gezeigt ist oder im Wesentlichen zu SEQ ID Nr. 6 oder 8 homolog ist, und die funktionelle Aktivität des Proteins von SEQ ID Nr. 6 oder 8 beibehalten, obwohl sie sich in der Aminosäuresequenz aufgrund von Allelvariation oder Mutagenese unterscheiden.
5. Bestimmen der Homologie zwischen zwei oder mehr Sequenzen
„WUP-Variante" bedeutet ein aktives WUP mit der in den Patentansprüchen definierten Sequenzidentität und mit mindestens: (1) 80% Aminosäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 6 oder 8, (2) einer WUP-Sequenz ohne das Signalpeptid. Zum Beispiel schließen WUP-Varianten WUP, wobei ein oder mehr Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der vollen Länge einer nativen Aminosäuresequenz addiert oder deletiert sind, ein. Eine WUP-Variante wird mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität, bevorzugt mindestens etwa 81% Aminosäuresequenzidentität, stärker bevorzugt mindestens etwa 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% Aminosäuresequenzidentität und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 99% Aminosäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 6 oder 8 aufweisen. Eine WUP-Variante kann eine Sequenz ohne das Signalpeptid aufweisen. Gewöhnlich weisen die WUP-Polypeptidvarianten mindestens etwa 80, 90, 100, 150, 200 oder 300 Aminosäuren in der Länge oder mehr auf.
„Prozente (%) der Aminosäuresequenzidentität" ist als der Prozentsatz von Aminosäureresten definiert, die mit den Aminosäureresten in der offenbarten WUP-Sequenz in einer Versuchssequenz identisch sind, wenn die zwei Sequenzen ausgerichtet werden. Zur Bestimmung der % der Aminosäureidentität werden Sequenzen ausgerichtet und, falls notwendig, werden Lücken eingebracht, um die maximalen % der Sequenzidentität zu erreichen; wobei konservative Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität angesehen werden. Aminsäuresequenzausrichtungsverfahren zur Bestimmung der Prozente der Identität sind dem Fachmann bekannt. Oft öffentlich zugängliche Computersoftware wie BLAST-, BLAST2-, ALIGN2- oder Megalign-(DNASTAR)-Software wird zum Ausrichten von Peptidsequenzen verwendet. Der Fachmann kann geeignete Parameter zum Messen der Ausrichtung, einschließlich jedwede Algorithmen, welche gebraucht werden, um eine maximale Ausrichtung über die volle Länge der Sequenzen, welche verglichen werden, zu erreichen, bestimmen.
Wenn Aminosäuresequenzen ausgerichtet werden, können die % der Aminosäuresequenzidentität einer gegebenen Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine gegebene Aminosäuresequenz B (welche alternativ als eine gegebene Aminosäuresequenz A umschrieben werden kann, die bestimmte % einer Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine gegebene Aminosäuresequenz B aufweist oder umfasst) wie folgt berechnet werden: % der Aminosäuresequenzidentität = X/Y·100wobei
X die Anzahl der Aminosäurereste ist, welche als identische Übereinstimmungen durch die Ausrichtung von A und B des Sequenzausrichtungsprogramms oder Algorithmus eingestuft werden
und
Y die Gesamtanzahl der Aminosäurereste in B ist.
Wenn die Länge der Aminosäuresequenz A nicht gleich der Länge der Aminosäuresequenz B ist, werden die % der Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich den % der Aminosäuresequenzidentität von B zu A sein.
6. Chimäre und Fusionsproteine
Fusionspolypeptide sind bei Expressionsuntersuchungen, Zelllokalisierung, Biotests und WUP-Reinigung nützlich. Ein WUP-„chimäres Protein” oder -„Fusionsprotein” umfassen WUP, fusioniert an ein Nicht-WUP-Polypeptid. Ein Nicht-WUP-Polypeptid ist im Wesentlichen nicht homolog zu WUP (SEQ ID Nr. 6 oder 8). Ein WUP-Fusionsprotein kann eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zur Sequenz SEQ ID Nr. 6 oder 8, einschließlich jedwede Anzahl der biologisch aktiven Teile, einschließen. WUP kann an den C-Terminus der GST-(Glutathion-S-transferase)-Sequenzen fusioniert werden. Solche Fusionsproteine ermöglichen die Reinigung von rekombinanten WUP. In bestimmten Wirtzellen (z. B. Säuger) können Fusionen von heterologen Signalsequenzen die WUP-Expression und/oder -Sekretion verbessern. Zusätzliche beispielhafte Fusionen sind in Tabelle C bereitgestellt.
Andere Fusionspartner können WUP therapeutisch anpassen. Fusionen mit Bestandteilen der Immunglobulin-(Ig)-Proteinfamilie sind bei Therapien, welche WUP-Ligand- oder -Substrat-Wechselwirkungen inhibieren, folglich die WUP-vermittelte Signaltransduktion in vivo supprimieren, nützlich. WUP-Ig-Fusionspolypeptide können auch als Immungene zur Herstellung von anti-WUP-Abs in einem Empfänger, zur Reinigung von WUP-Liganden und zum Screenen von Molekülen, welche Wechselwirkungen von WUP mit anderen Molekülen inhibieren, verwendet werden.

Fusionsproteine können einfach unter Verwendung von rekombinanten Verfahren erzeugt werden. Eine Nukleinsäure, welche WUP kodiert, kann im Rahmen mit einer Nicht-WUP- kodierenden Nukleinsäure an den WUP-NH₂- oder -COO- -Terminus oder innen fusioniert werden. Fusionsgene können auch durch herkömmliche Techniken, einschließlich automatisierte DNA-Synthesevorrichtungen, synthetisiert werden. PCR-Amplifikation unter Verwendung von Ankerprimern, welche komplementäre Übergänge zwischen zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten erzeugen, welche anschließend Annealing und erneutem Amplifizieren unterworfen werden können, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen (Ausubel et al., 1987), ist auch nützlich. Viele Vektoren, welche das Subklonieren von WUP im Rahmen an eine Fusionseinheit ermöglichen, sind kommerziell erhältlich. Tabelle C Nützliche Nicht-WUP-Fusionspolypeptide

Reporter	in vitro	in vivo	Anmerkungen	Druckschrift
Humanes Wachstumshormon (hGH)	Radioimmunotest	nichts	teuer, unempfindlich, enger linearer Bereich	(Selden et al., 1986)
β-Glucuronidase (GUS)	kolorimetrisch, fluoreszent oder chemilumineszent	kolorimetrisch (histochemische Anfärbung mit X-gluc)	empfindlich, breiter linearer Bereich, nicht-iostopisch	(Gallagher, 1992)
Grünfluoreszentes Protein (GFP) und verwandte Moleküle (RFP, BFP, WUP, usw.)	fluoreszent	fluoreszent	kann in lebenden Zellen verwendet werden; widersteht Fotobleichen	(Chalfie et al., 1994)
Luziferase (Leuchtkäfer)	biolumineszent	biolumineszent	Protein ist instabil, schwierig zu reproduzieren, Signal ist kurz	(de Wet et al., 1987)
Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)	Chromatographie, selektive Extraktion, fluoreszent oder Immuntest	nichts	teuere radioaktive Substanzen, zeitaufwändig, unempfindlich, enger linearer Bereich	(Gorman et al., 1982)
β-Galactosidase	kolorimetrisch, Fluoreszenz, Chemilumineszenz	kolorimetrisch (histochemische Anfärbung mit X-gal), biolumineszent in lebenden Zellen	empfindlich, breiter linearer Bereich; einige Zellen weisen eine hohe endogene Aktivität auf	(Alam und Cook, 1990)
Sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP)	kolorimetrisch, biolumineszent, chemilumineszent	nichts	Chemilumineszenztest ist empfindlich und weist einen breiten linearen Bereich auf; einige Zellen weisen endogene alkalische Phosphataseaktivität auf	(Berger et al., 1988)

Therapeutische Verwendungen von WUP
1. Agonisten und Antagonisten
„Antagonist" schließt jedwedes Molekül ein, welches eine biologische Aktivität von endogenem WUP teilweise oder vollständig blockiert, inhibiert oder neutralisiert. In ähnlicher Weise schließt „Agonist" jedwedes Molekül ein, welches eine biologische Aktivität von endogenem WUP nachahmt. Moleküle, welche als Agonisten oder Antagonisten wirken können, schließen Abs oder Antikörperfragmente, Fragmente oder Varianten von endogenem WUP, Peptide, Antisense-Oligonukleotide, kleine organische Moleküle, usw. ein.
2. Identifizierung von Antagonisten und Agonisten
Um Antagonisten zu testen, wird WUP zu einer Zelle gegeben oder darin exprimiert, zusammen mit der Verbindung, welche auf eine besondere Aktivität gescreent werden soll.
Wenn die Verbindung die Aktivität von Interesse in der Gegenwart des WUP inhibiert, ist die Verbindung ein Antagonist zu dem WUP; wenn die WUP-Aktivität erhöht ist, ist die Verbindung ein Agonist.
(a) Spezielle Beispiele von potentiellen Antagonisten und Agonisten
Jedwedes Molekül, welches die zellulären Wirkungen von WUP verändert, ist ein möglicher Antagonist oder Agonist. Screeningtechniken, welche dem Fachmann bekannt sind, können diese Moleküle identifizieren. Beispiele von Antagonisten und Agonisten schließen ein: (1) kleine organische und anorganische Verbindungen, (2) kleine Peptide, (3) Abs und Derivate, (4) Polypeptide, welche eng mit WUP verwandt sind, (5) Antisense-DNA und -RNA, (6) Ribozyme, (7) DNA-Tripelhelices und (8) Nukleinsäureaptamere.
Kleine Moleküle, welche an die aktive Stelle von WUP oder einen anderen relevanten Teil des Polypeptids binden und die biologische Aktivität des WUP inhibieren, sind Antagonisten. Beispiele von kleines Molekül-Antagonisten schließen kleine Peptide, peptidähnliche Moleküle, bevorzugt lösliche und synthetische organische oder anorganische Nicht-Peptidylverbindungen ein. Die gleichen Moleküle, wenn sie WUP-Aktivität steigern, sind Beispiele von Agonisten.
Fast jeder Antikörper, der eine Funktion von WUP beeinflusst, ist ein möglicher Antagonist und gegebenenfalls Agonist. Beispiele von Antikörperantagonisten schließen polyklonale, monoklonale, einkettige, anti-idiotypische, chimäre Abs oder humanisierte Versionen von solchen Abs oder Fragmente ein. Abs können von jedweder Spezies stammen, in welcher eine Immunantwort erzeugt werden kann. Humanisierte Abs werden auch in Betracht gezogen.
Alternativ kann ein potentieller Antagonist oder Agonist ein eng verwandtes Protein sein, zum Beispiel eine mutierte Form des WUP, welche ein WUP-Wechselwirkungsprotein erkennt, aber keine Wirkung verleiht, wobei kompetitiv die WUP-Wirkung inhibiert wird. Alternativ kann ein mutiertes WUP konstitutiv aktiviert werden und kann als ein Agonist wirken.
Antisense-RNA- oder -DNA-Konstrukte können wirksame Antagonisten sein. Antisense-RNA- oder -DNA-Moleküle blockieren eine Funktion durch Inhibieren der Translation durch Hybridisieren an zielgerichtete mRNA. Die Antisense-Technologie kann zur Kontrolle der Genexpression durch Tripelhelixbildung oder Antisense-DNA oder -RNA, welche beide von der Polynukleotidbindung an DNA oder RNA abhängen, verwendet werden. Zum Beispiel wird der 5'-Kodierteil der WUP-Sequenz zum Designen eines Antisense-RNA-Oligonukleotids mit etwa 10 bis 40 Basenpaaren in der Länge verwendet. Ein DNA- Oligonukleotid wird derart designed, dass es zu einer Region des Gens, welche in die Transkription (Tripelhelix) (Real und Dervan, 1991; Cooney et al., 1988; Lee et al., 1979) einbezogen ist, wobei die Transkription und die Herstellung des WUP verhindert wird, komplementär ist. Das Antisense-RNA-Oligonukleotid hybridisiert mit der mRNA in vivo und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in das WUP (Antisense) (Cohen, 1989; Okano et al., 1991). Diese Oligonukleotide können auch in Zellen bereitgestellt werden, so dass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden können, wobei die Herstellung des WUP inhibiert wird. Wenn Antisense-DNA verwendet wird, sind Oligodeoxyribonukleotide, welche von der Translationsinitiationsstelle abgeleitet sind, z. B. zwischen etwa –10 und +10 Positionen der Zielgennukleotidsequenz, bevorzugt.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, welche zum Katalysieren der speziellen Spaltung von RNA in der Lage sind. Ribozyme wirken durch Sequenz-spezifische Hybridisierung an die komplementäre Ziel-RNA, gefolgt von endonukleolytischer Spaltung. Spezielle Ribozymspaltungsstellen in einer poteniellen Ziel-RNA können durch bekannte Techniken ( WO 97/33551 , 1997; Rossi, 1994) identifiziert werden.
Zur Inhibierung von Transkription sind Tripelhelix-Nukleinsäuren, welche einsträngig sind und Deoxynukleotide umfassen, nützliche Antagonisten. Diese Oligonukleotide sind derart designed, dass Tripelhelix-Bildung über Basenpaarungsregeln nach Hoogsteen gefördert wird, was im Allgemeinen Streckungen (eng. stretches) von Purinen oder Pyrimidinen erfordert ( WO 97/33551 , 1997).
Aptamere sind kurze Oligonukleotidsequenzen, welche zum Erkennen und spezifischen Binden von nahezu jedem Molekül verwendet werden können. Die systematische Entwicklung von Liganden durch ein exponentielles Anreichungs-(SELEX)-Verfahren (Ausubel et al., 1987; Ellington und Szostak, 1990; Tuerk und Gold, 1990) ist leistungsfähig und kann zum Auffinden von solchen Aptameren verwendet werden. Aptamere haben viele diagnostische und klinische Verwendungen; wobei nahezu in jedweder Verwendung, in welcher ein Antikörper klinisch oder diagnostisch verwendet wird, auch Aptamere verwendet werden können. Zusätzlich sind sie kostengünstiger in der Herstellung, nachdem sie identifiziert wurden, und können einfach in einer Vielzahl von Formaten, einschließlich Verabreichung in Arzneimitteln, in Biotests und diagnostischen Tests verwendet werden (Jayasena, 1999).
Anti-WUP-Abs
Die Erfindung umfasst Abs und Antikörperfragmente, wie F_ab oder (F_ab)₂, welche immunspezifisch an jedwede WUP-Epitope binden, wie in den Patentansprüchen definiert.
„Antikörper" (Ab) umfasst einzelne Abs, welche gegen WUP gerichtet sind (anti-WUP-Ab; einschließlich Agonist-, Antagonist- und neutralisierende Abs), anti-WUP-Ab-Zusammensetzungen mit Polyepitopspezifität, einkettige anti-WUP-Abs und Fragmente von anti-WUP-Abs. Ein „monoklonaler Antikörper" wird von einer Population von im Wesentlichen homogenen Abs erhalten, d. h. die einzelnen Abs, welche die Population umfasst, sind identisch, außer in Bezug auf mögliche natürlich vorkommende Mutationen, welche in kleinerem Umfang vorhanden sein können. Beispielhafte Abs schließen polyklonale (pAb), monoklonale (mAb), humanisierte, bispezifische (bsAb) und Heterokonjugat-Abs ein.
1. Polyklonale Abs (pAbs)
Polyklonale Abs können in einem Säugerwirt, zum Beispiel durch eine oder mehr Injektionen eines Immungens und, falls gewünscht, eines Hilfsmittels, erzeugt werden. Typischerweise werden das Immungen und/oder Hilfsmittel in den Säuger durch mehrfache subkutane oder intraperitoneale Injektionen injiziert. Das Immungen kann WUP oder ein Fusionsprotein einschließen. Beispiele von Hilfsmitteln schließen komplettes Freund-Reagenz und synthetisches Monophosphoryl-Lipid A-Trehalosedicorynomycolat (MPL-TDM) ein. Zur Verbesserung der Immunantwort kann ein Immungen an ein Protein, welches in dem Wirt immunogen ist, wie Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH), Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnentrypsininhibitor, konjugiert werden. Protokolle für Antikörperherstellung werden von (Ausubel et al., 1987; Harlow und Lane, 1988) beschrieben. Alternativ können pAbs in Hühnchen hergestellt werden, wobei IgY-Moleküle hergestellt werden (Schade et al., 1996).
2. Monoklonale Abs (mAbs)
Anti-WUP-mAbs können unter Verwendung von Hybridomverfahren (Milstein und Cuello, 1983) hergestellt werden. Hybridomverfahren umfassen mindestens vier Schritte: (1) Immunisieren eines Wirts oder von Lymphozyten von einem Wirt, (2) Ernten der mAb-sekretierenden (oder möglicherweise sekretierenden) Lymphozyten, (3) Fusionieren der Lymphozyten mit immortalisierten Zellen, und (4) Selektieren von jenen Zellen, welche den gewünschten (anti-WUP)-mAb sekretieren.
Eine Maus, eine Ratte, ein Meerschweinchen, ein Hamster oder ein anderer geeigneter Wirt werden immunisiert, um hervorzurufen, dass Lymphozyten Abs, welche spezifisch an das Immungen binden, herstellen oder zur Herstellung davon in der Lage sind. Alternativ können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Wenn humane Zellen gewünscht sind, werden im Allgemeinen periphere Blutlymphozyten (PBLs) verwendet; obwohl Milzzellen oder Lymphozyten von anderen Säugerquellen bevorzugt sind. Das Immungen schließt typischerweise WUP oder ein Fusionsprotein ein.
Die Lymphozyten werden dann mit einer immortalisierten Zelllinie fusioniert, um Hybridomzellen zu bilden, was mit einem Fusionierungsmittel wie Polyethylenglykol ermöglicht wird (Goding, 1996). Nager-, Rind- oder humane Myelomzellen, welche durch Transformation immortalisiert wurden, oder Ratten- oder Mäuse-Myelomzelllinien können verwendet werden. Da reine Populationen von Hybridomzellen und nicht nicht-fusionierte immortalisierte Zellen bevorzugt sind, lasst man die Zellen nach der Fusion in einem geeigneten Medium wachsen, welches eine oder mehr Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben von nicht-fusionierten, immortalisierten Zellen inhibieren. Eine allgemeine Technik verwendet parenterale Zellen, welche das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) nicht aufweisen. In diesem Fall werden Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin zu dem Medium (HAT-Medium) gegeben, um das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen zu verhindern, während ermöglicht wird, dass die Hybridoma wachsen.
Bevorzugte immortalisierte Zellen fusionieren wirksam; können aus Populationsgemischen durch Selektieren in einem Medium wie HAT isoliert werden; und unterstützen eine stabile Expression des Antikörpers in einem hohen Level nach der Fusion. Bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind Mäusemyelomlinien, welche von der American Type Culture Collection (Manassas, VA) erhältlich sind. Humane Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden auch zur Herstellung von humanen mAbs beschrieben (Kozbor et al., 1984; Schook, 1987).
Da Hybridomzellen einen Antikörper extrazellulär sekretieren, können die Kulturmedien auf die Gegenwart von mAbs, welche gegen WUP gerichtet sind, (anti-WUP-mAbs) getestet werden. Immunopräzipitation oder in vitro-Bindungstests, wie Radioimmunotest (RIA) oder Enzym-gekoppelter Immunabsorptionstest (ELISA), messen die Bindungsspezifität von mAbs (Harlow und Lane, 1988; Harlow und Lane, 1999), einschließlich Scatchard-Analyse (Munson und Rodbard, 1980).
Anti-WUP-mAb-sekretierende Hybridomzellen können als einzelne Klone durch einschränkende Verdünnungsverfahren isoliert und subkultiviert werden (Goding, 1996). Geeignete Kulturmedien schließen Dulbecco's Modified Eagle's Medium, RPMI-1640 oder, falls gewünscht, ein proteinfreies oder -reduziertes oder serumfreies Medium (z. B. Ultra DOMA PF oder HL-1; Biowhittaker; Walkersville, MD) ein. Die Hybridomzellen kann man auch in vivo als Ascites wachsen lassen.
Die mAbs können aus dem Kulturmedium oder der Ascitesflüssigkeit durch herkömmliche Ig-Reinigungsverfahren wie Protein A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse, Ammoniumsulfat-Präzipitation oder Affinitätschromatographie (Harlow und Lane, 1988; Harlow und Lane, 1999) isoliert oder aufgereinigt werden.
Die mAbs können auch durch rekombinante Verfahren ( U.S. Patent Nr. 4,166,452 , 1979) hergestellt werden. DNA-kodierende anti-WUP-mAbs können leicht unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren isoliert und sequenziert werden, z. B. unter Verwendung von Oligonukleotidsonden, welche spezifisch an schwere und leichte Ketten von Mäuseantikörpergenen binden, um bevorzugt DNA zu sondieren, welche von anti-WUP-sekretierenden mAb-Hybridomzelllinien isoliert wird. Nachdem sie isoliert wurde, werden die isolierten DNA-Fragmente in Expressionsvektoren subkloniert, welche dann in Wirtzellen wie Affen-COS-7-Zellen, chinesische Hamsterovarien-(CHO)-Zellen oder Myelomzellen, welche ansonsten kein Ig-Protein herstellen, transfiziert werden, um mAbs zu exprimieren. Die isolierten DNA-Fragmente können zum Beispiel durch Substituieren der Kodiersequenz für schwere und leichte Ketten von humanen konstanten Domänen anstelle der homologen Mäusesequenzen ( U.S. Patent Nr. 4,816,567 , 1989; Morrison et al., 1987) oder durch Fusionieren der Ig-Kodiersequenz an die gesamte oder einen Teil der Kodiersequenz für ein Nicht-Ig-Polypeptid modifiziert werden. Ein solches Nicht-Ig-Polypeptid kann für die konstanten Domänen eines Antikörpers substituiert werden oder kann für die variablen Domänen einer Antigen-kombinierenden Stelle substituiert werden, um einen chimären bivalenten Antikörper zu erzeugen.
3. Monovalente Abs
Die Abs können monovalente Abs sein, welche folglich nicht miteinander vernetzen. Zum Beispiel bezieht ein Verfahren die rekombinante Expression der leichten Kette und der modifizierten schweren Kette von Ig ein. Trunkierungen von schweren Ketten an im Allgemeinen jedem Punkt in der Fe-Region werden ein Vernetzen von schweren Ketten verhindern. Alternativ werden die relevanten Cysteinreste mit einem anderen Aminosäurerest substituiert oder deletiert, wobei Vernetzen verhindert wird. In vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung von monovalenten Abs geeignet. Abs können verdaut werden, wobei Fragmente, wie F_ab-Fragmente, hergestellt werden (Harlow und Lane, 1988; Harlow und Lane, 1999).
4. Humanisierte und humane Abs
Anti-WUP-Abs können ferner humanisierte oder humane Abs umfassen. Humanisierte Formen von nicht-humanen Abs sind chimäre Igs, Ig-Ketten oder -Fragmente (wie F_V, F_ab, F_ab', F_(ab')2 oder andere Antigenbindungssequenzen von Abs), welche eine minimale Sequenz, die von nicht-humanem Ig abgeleitet ist, enthalten.
Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehr Aminosäurereste, welche von einer nicht-humanen Quelle eingebracht werden, auf. Diese nicht-humanen Aminosäurereste werden oft als „Import"-Reste bezeichnet, welche typischerweise von einer variablen „Import"-Domäne genommen werden. Humanisierung wird durch Substituieren von Nager-CDRs oder CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines humanen Antikörpers erreicht (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; Verhoeyen et al., 1988). Solche „humanisierten" Abs sind chimäre Abs ( U.S. Patent Nr. 4,816,567 , 1989), wobei im Wesentlichen weniger als eine intakte humane variable Domäne durch die entsprechende Sequenz von einer nicht-humanen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Abs typischerweise humane Abs, in welchen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste von analogen Stellen in Nager-Abs ersetzt sind. Humanisierte Abs schließen humane Igs (Empfängerantikörper), in welchen Reste von einer komplementären bestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste von einer CDR einer nicht-humanen Spezies (Spenderantikörper) wie Maus, Ratte oder Kaninchen mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind, ein. In einigen Fällen ersetzen entsprechende nicht-humane Reste F_V-Rahmenreste des humanen Ig. Humanisierte Abs können Reste umfassen, welche weder im Empfängerantikörper noch in den importierten CDR- oder Rahmensequenzen gefunden werden. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von mindestens einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in welchen die meisten, wenn nicht alle, CDR-Regionen jenen eines nicht-humanen Ig entsprechen und die meisten, wenn nicht alle, FR-Regionen jene einer humanen Ig-Consensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst auch in optimaler Weise mindestens einen Teil einer konstanten Ig-Region (F_c), typischerweise die eines humanen Ig (Jones et al., 1986; Presta, 1992; Riechmann et al., 1988).
Humane Abs können unter Verwendung von verschiedenen Techniken, einschließlich Phage-Schaubibliotheken (Hoogenboom et al., 1991; Marks et al., 1991) und die Herstellung von humanen mAbs (Boerner et al., 1991; Reisfeld und Sell, 1985), hergestellt werden. In ähnlicher Weise kann die Einbringung von humanen Ig-Genen in transgene Tiere, in welchen die endogenen Ig-Gene teilweise oder vollständig inaktiviert wurden, zur Synthese von humanen Abs genutzt werden. Über Reizung wird die humaner Antikörper-Herstellung beobachtet, welche stark derjenigen, die bei Menschen gesehen wird, in allen Bereichen ähnelt, einschließlich Genanordnung, Aufbau und Antikörperrepertoire ( U.S. Patent Nr. 5,545,807 , 1996; U.S. Patent Nr. 5,545,806 , 1996; U.S. Patent Nr. 5,569,825 , 1996; U.S. Patent Nr. 5,633,425 , 1997; U.S. Patent Nr. 5,661,016 , 1997; U.S. Patent Nr. 5,625,126, 1997 ; Fishwild et al., 1996; Lonberg und Huszar, 1995; Lonberg et al., 1994; Marks et al., 1992).
5. Bispezifische mAbs
Bispezifische Abs sind monoklonal, bevorzugt human oder humanisiert, welche Bindungsspezifitäten für mindestens zwei unterschiedliche Antigene aufweisen. Zum Beispiel ist eine Bindungsspezifität WUP; die andere ist für jedwedes Antigen der Wahl, bevorzugt ein(e/n) Zelloberflächenprotein oder -rezeptor oder -rezeptoruntereinheit.
Traditionell basiert die rekombinante Herstellung von bispezifischen Abs auf der Coexpression von zwei Ig-schwere Kette/leichte Kette-Paaren, wobei die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Milstein und Cuello, 1983). Wegen der statistischen Auswahl der schweren und leichten Ig-Ketten stellen die resultierenden Hybridoma (Quadroma) ein mögliches Gemisch von zehn unterschiedlichen Antikörpermolekülen, von welchen nur eines die gewünschte bispezifische Struktur aufweist, her. Der gewünschte Antikörper kann unter Verwendung von Affinitätschromatographie oder anderen Techniken gereinigt werden ( WO 93/08829 , 1993; Traunecker et al., 1991).
Zur Herstellung eines bispezifischen Antikörpers (Suresh et al., 1986) werden variable Domänen mit den gewünschten Antikörper-Antigen-kombinierenden Stellen an konstante Ig-Domänensequenzen fusioniert. Die Fusion findet bevorzugt mit einer schweren Kette einer konstanten Ig-Domäne, welche mindestens einen Teil der Hinge-, CH2- und CH3-Regionen umfasst, statt. Bevorzugt ist die schwere Kette der ersten konstanten Region (CH1), welche die Stelle enthält, die zum Binden einer leichten Kette notwendig ist, in mindestens einer der Fusionen vorhanden. DNAs, welche die Ig-schwere Kette-Fusionen kodieren und, falls gewünscht, die Ig-leichte Kette, werden in getrennte Expressionsvektoren eingesetzt und werden in einen geeigneten Wirtorganismus cotransfiziert.
Die Schnittstelle zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen kann technisch gestaltet werden, um den Prozentsatz von Heterodimeren, der von einer rekombinanten Zellkultur gewonnen wird, zu maximieren ( WO 96/27011 , 1996). Die bevorzugte Schnittstelle umfasst mindestens einen Teil der CH3-Region einer konstanten Antikörperdomäne. Bei diesem Verfahren werden eine oder mehr kleine Aminosäureseitenketten von der Schnittstelle des ersten Antikörpermoleküls mit größeren Seitenketten (z. B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensierende „Hohlräume" mit identischer oder ähnlicher Größe zu de(r/n) großen Seitenkette(n) werden an der Schnittstelle des zweiten Antikörpermoleküls durch Ersetzen von großen Aminosäureseitenketten mit kleineren (z. B. Alanin oder Threonin) erzeugt. Dieser Mechanismus erhöht die Ausbeute des Heterodimers gegenüber nicht gewollten Endprodukten wie Homodimeren.
Bispezifische Abs können als volle Länge von Abs oder Antikörperfragmente (z. B. F_(ab')2 bispezifische Abs) hergestellt werden. Eine Technik zur Erzeugung von bispezifischen Abs nutzt chemische Bindung. Intakte Abs können proteolytisch gespalten werden, um F_(ab')2- Fragmente zu erzeugen (Brennan et al., 1985). Fragmente können mit einem Dithiol-Komplexierungsmittel, wie Natriumarsenit, reduziert werden, um vicinale Dithiole zu stabilisieren und intermolekulare Disulfid-Bildung zu verhindern. Die erzeugten F_ab'-Fragmente werden dann in Thionitrobenzoat-(TNB)-Derivate umgewandelt. Eines der F_ab'-TNB-Derivate wird dann in das F_ab'-Thiol durch Reduktion mit Mercaptoethylamin umgewandelt und mit einer äquimolaren Menge des anderen F_ab'-TNB-Derivats gemischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die hergestellten bispezifischen Abs können als Mittel zur selektiven Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
F_ab'-Fragmente können direkt aus E. coli gewonnen und chemisch gekuppelt werden, um bispezifische Abs zu bilden. Zum Beispiel können vollständig humanisierte bispezifische F_(ab')2-Abs hergestellt werden (Shalaby et al., 1992). Jedes F_ab'-Fragment wird getrennt von E. coli sekretiert und direkt chemisch in vitro gekuppelt, wobei der bispezifische Antikörper gebildet wird.
Verschiedene Techniken zur Herstellung und Isolierung von bispezifischen Antikörperfragmenten direkt aus einer rekombinanten Zellkultur wurden auch beschrieben. Zum Beispiel können Leucin-Reißverschlussmotive genutzt werden (Kostelny et al., 1992). Peptide der Fos- und Jun-Proteine werden an die F_ab'-Teile von zwei unterschiedlichen Abs durch Genfusion gebunden. Die Antikörperhomodimere werden an der Hinge-Region reduziert, um Monomere zu bilden, und dann wieder oxidiert, um Antikörperheterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch Antikörperhomodimere herstellen. Die „Diakörper"-Technologie (Holliger et al., 1993) stellt ein alternatives Verfahren zur Erzeugung von bispezifischen Antikörperfragmenten bereit. Die Fragmente umfassen die schwere Kette einer variablen Domäne (V_H), verbunden mit der leichten Kette einer variablen Domäne (V_L) durch einen Linker, der zu kurz ist, um zu ermöglichen, dass zwischen den zwei Domänen an der selben Kette Paare gebildet werden. Die V_H- und V_L-Domänen eines Fragments werden zur Paarung mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments gezwungen, wobei zwei Antigenbindungsstellen gebildet werden. Eine andere Strategie zur Herstellung von bispezifischen Antikörperfragmenten ist die Verwendung von einkettigen F_V-(sF_V)-Dimeren (Gruber et al., 1994). Abs mit mehr als zwei Valenzen werden auch in Betracht gezogen, wie trispezifische Abs (Tuff et al., 1991).
Beispielhafte bispezifische Abs können an zwei unterschiedliche Epitope an einem gegebenen WUP binden. Alternativ können Zellverteidigungsmechanismen auf eine besondere Zelle, welche das besondere WUP exprimiert, eingeschränkt werden: ein anti-WUP-Arm kann mit einem Arm kombiniert werden, der an ein Leukozyten-reizendes Molekül bindet, wie ein T-Zellen-Rezeptormolekül (z. B. CD2, CD3, CD28 oder B7) oder an F_C-Rezeptoren für IgG (F_CγR), wie F_CγRI (CD64), F_CγRII (CD32) und F_CγRIII (CD16). Bispezifische Abs können auch zum Zielrichten von zytotoxischen Mitteln auf Zellen, welche ein besonderes WUP exprimieren, verwendet werden. Diese Abs weisen einen WUP-Bindungsarm und einen Arm, der ein zytotoxisches Mittel oder einen Radionuklidchelatbildner bindet, auf.
6. Heterokonjugat Abs
Heterokonjugat-Abs, welche aus zwei kovalent gebundenen Abs bestehen, wurden zum Zielrichten von Immunsystemzellen auf ungewollte Zellen (4,676,980, 1987) und zur Behandlung von humanes T-Zell-Leukämie-Virus III-(HIV)-Infektion ( WO 91/00360 , 1991; WO 92/20373 , 1992) vorgeschlagen. Abs, welche in vitro unter Verwendung von chemischen Proteinsyntheseverfahren hergestellt werden, einschließlich jenen, welche Vernetzungsmittel einbeziehen, werden in Betracht gezogen. Zum Beispiel können Immuntoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bilden einer Thioetherbindung aufgebaut werden. Beispiele von geeigneten Reagenzien schließen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat (4,676,980, 1987) ein.
7. Immunokonjugate
Immunokonjugate können einen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel wie ein Chemotherapeutikum, Toxin (z. B. ein enzymatisch aktives Toxin oder Fragment mit bakteriellem, Pilz-, Pflanzen- oder Tierursprung) oder ein radioaktives Isotop (d. h. ein Radiokonjugat) konjugiert ist.
Nützliche enzymatisch aktive Toxine und Fragmente schließen Diphtherie A-Kette, nichtbindende aktive Fragmente des Diphtherietoxins, Exotoxin A-Kette von Pseudomonas aeruginosa, Ricin A-Kette, Abrin A-Kette, Modeccin A-Kette, α-Sarcin, Aleurites fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca americana-Proteine, Momordica charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene ein. Eine Vielzahl von Radionukliden ist für die Herstellung von radiokonjugierten Abs verfügbar, wie ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re.
Konjugate des Antikörpers und des zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung einer Vielzahl von bifunktionellen Proteinkupplungsmitteln, wie N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionelle Derivate von Imidoestern (wie Dimethyladipimidat-HCl), aktive Ester (wie Disuccinimidylsuberat), Aldehyde (wie Glutaraldehyd), Bis-azido-Verbindungen (wie Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bis-diazonium-Derivate (wie Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanate (wie Tolyen-2,6-diisocyanat) und aktive Bis-fluor-Verbindungen (wie 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzen), hergestellt. Zum Beispiel kann ein Ricin-Immunotoxin hergestellt werden (Vitetta et al., 1987). ¹⁴C-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhaftes Chelatbildungsmittel zur Konjugation eines Radionuklids an einen Antikörper ( WO 94/11026 , 1994).
Der Antikörper kann an einen „Rezeptor" (wie Streptavidin) zur Verwendung beim vorgeschalteten Tumorzielrichten konjugiert werden, wobei das Antikörper-Rezeptor-Konjugat an den Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung von ungebundenem Konjugat aus dem Kreislauf unter Verwendung eines Klärmittels und dann Verabreichen eines Streptavidin-„Liganden” (z. B. Biotin), welcher an ein zytotoxisches Mittel (z. B. ein Radionuklid) konjugiert ist.
8. Technische Gestaltung der Effektorfunktion
Der Antikörper kann modifiziert werden, um seine Wirksamkeit bei der Behandlung einer Erkrankung, wie Krebs, zu steigern. Zum Beispiel können Cysteinrest(e) in die F_C-Region eingebracht werden, wobei Disulfidbindungsbildung zwischen Ketten in dieser Region ermöglicht wird. Solche homodimeren Abs können ein verbessertes Internalisierungsvermögen und/oder erhöhtes Komplement-vermitteltes Zellabtöten und Antikörper-abhängige Zellzytotoxizität (ADCC) aufweisen (Caron et al., 1992; Shopes, 1992). Homodimere Abs mit gesteigerter Antitumoraktivität können unter Verwendung von heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln hergestellt werden (Wolff et al., 1993). Alternativ kann ein Antikörper, welcher mit dualen F_C-Regionen technisch gestaltet ist, gesteigerte Komplementlyse aufweisen (Stevenson et al., 1989).
9. Immunoliposome
Liposome, welche den Antikörper enthalten, können auch formuliert werden ( U.S. Patent Nr. 4,485,045 , 1984; U.S. Patent Nr. 4,544,545 , 1985; U.S. Patent Nr. 5,013,556 , 1991; Eppstein et al., 1985; Hwang et al., 1980). Nützliche Liposome können durch ein Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung, welche Phosphatidylcholin, Cholesterol und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, erzeugt werden. Solche Zubereitungen werden durch Filter mit definierter Porengröße extrudiert, wobei Liposome mit einem gewünschten Durchmesser erhalten werden. F-Fragmente des Antikörpers können an die Liposome (Martin und Papahadjopoulos, 1982) über eine Disulfid-Austauschreaktion konjugiert werden. Ein Chemotherapeutikum, wie Doxorubicin, kann auch in dem Liposom enthalten sein (Gabizon et al., 1989). Andere nützliche Liposome mit unterschiedlichen Zusammensetzungen werden in Betracht gezogen.
10. Diagnostische Verwendungen von Abs, welche gegen WUP gerichtet sind
Anti-WUP-Abs können zur Lokalisierung und/oder Quantifizierung von WUP verwendet werden (z. B. zur Verwendung beim Messen von Levels von WUP innerhalb von Gewebeproben oder zur Verwendung in diagnostischen Verfahren, usw.). Anti-WUP-Epitop-Abs können als pharmakologisch aktive Verbindungen verwendet werden.
Anti-WUP-Abs können zur Isolierung von WUP durch Standardtechniken, wie Immunoaffinitätschromatographie oder Immunopräzipitation, verwendet werden. Diese Vorgehensweisen ermöglichen eine Aufreinigung von endogenen WUP-Antigen-enthaltenden Polypeptiden aus Zellen und Geweben. Diese Vorgehensweisen sowie andere können zum Nachweisen von WUP in einer Probe verwendet werden, um die Häufigkeit und das Muster der Expression des antigenen Proteins zu bewerten. Anti-WUP-Abs können zum Überwachen der Proteinlevel in Geweben als Teil eines klinischen Testverfahrens verwendet werden; zum Beispiel zur Bestimmung der Wirksamkeit eines gegebenen Behandlungsschemas. Das Kuppeln des Antikörpers an eine nachweisbare Substanz (Markierung) ermöglicht den Nachweis von Ab-Antigen-Komplexen. Klassen von Markierungen schließen fluoreszente, lumineszente, biolumineszente und radioaktive Materialien, Enzyme und pro sthetische Gruppen ein. Nützliche Markierungen schließen Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Acetylcholinesterase, Streptavidin/Biotin, Avidin/Biotin, Umbelliferon, Fluoreszein, Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluoreszein, Dansylchlorid, Phycoerythrin, Luminol, Luziferase, Luziferin, Aequorin und ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S oder ³H ein.
11. Antikörpertherapeutika
Abs der Erfindung, einschließlich polyklonale, monoklonale, humanisierte und vollständig humane Abs, können therapeutisch verwendet werden. Solche Mittel werden im Allgemeinen zur Behandlung oder Vorbeugung einer Erkrankung oder Pathologie in einem Empfänger verwendet. Eine Antikörperzubereitung, bevorzugt eine mit hoher Antigenspezifität und -affinität, vermittelt im Allgemeinen eine Wirkung durch Binden de(s/r) Zielepitop(s/e). Im Allgemeinen kann die Verabreichung von solchen Abs eine von zwei Wirkungen vermitteln: (1) der Antikörper kann Ligandbindung, Beseitigung von endogener Ligandbindung und anschließende Signaltransduktion verhindern, oder (2) der Antikörper löst ein physiologisches Ergebnis durch Binden einer Effektorstelle an dem Zielmolekül, was Signaltransduktion initiiert, aus.
Eine therapeutisch wirksame Menge eines Antikörpers betrifft im Allgemeinen die Menge, welche gebraucht wird, um ein therapeutisches Ziel, Epitopbindungsaffinität, Verabreichungsrate und Depletionsrate des Antikörpers von einem Empfänger zu erreichen. Allgemeine Bereiche für therapeutisch wirksame Dosen können als ein nicht-einschränkendes Beispiel etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht bis etwa 50 mg/kg Körpergewicht sein. Dosierungshäufigkeiten können zum Beispiel im Bereich von zweimal täglich bis einmal pro Woche liegen.
12. Arzneimittel von Abs
Anti-WUP-Abs sowie andere WUP-Wechselwirkungsmoleküle (wie Aptamere), welche in anderen Tests identifiziert werden, können in Arzneimitteln zur Behandlung von verschiedenen Störungen verabreicht werden. Prinzipien und Erwägungen, welche in die Herstellung von solchen Zusammensetzungen einbezogen sind, sowie eine Anleitung bei der Auswahl von Komponenten können in (de Boer, 1994; Gennaro, 2000; Lee, 1990) gefunden werden.
Abs, welche internalisiert werden, sind bevorzugt, wenn ganze Abs als Inhibitoren verwendet werden. Liposome können auch als ein Bereitstellungsvehikel für intrazelluläre Einbringung verwendet werden. Wo Antikörperfragmente verwendet werden, ist das kleinste inhibitorische Fragment, welches spezifisch an das Epitop bindet, bevorzugt. Zum Beispiel können Peptidmoleküle designed werden, welche bezogen auf die Sequenzen der variablen Region eines nützlichen Antikörpers ein bevorzugtes Epitop binden. Solche Peptide können chemisch synthetisiert werden und/oder durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden (Marasco et al., 1993). Formulierungen können auch mehr als eine aktive Verbindung für eine besondere Behandlung enthalten, bevorzugt jene mit Aktivitäten, welche sich gegenseitig nicht nachteilig beeinflussen. Die Zusammensetzung kann ein Mittel, welches eine Funktion steigert, wie ein zytotoxisches Mittel, Zytokin, Chemotherapeutikum oder Wachstuminhibierendes Mittel, umfassen.
Die Wirkstoffe können auch in Mikrokapseln eingeschlossen werden, welche durch Koazervierungstechniken oder durch Grenzschichtpolymerisation hergestellt werden; zum Beispiel Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln beziehungsweise Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln in kolloidalen Arzneistoff-Bereitstellungssystemen (zum Beispiel Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen.
Es ist stark bevorzugt, dass die Formulierungen, welche für in vivo-Verabreichung verwendet werden, steril sind. Dies wird einfach durch Filtration durch Sterilfiltrationsmembrane oder jedwede einer Anzahl von Techniken erreicht.
Zubereitungen mit verlängerter Freisetzung können auch hergestellt werden, wie semi-permeable Matrices aus festen hydrophoben Polymeren, welche den Antikörper enthalten, wobei die Matrices in der Form von Formgegenständen, z. B. Folien, oder Mikrokapseln sind. Beispiele von Matrices mit verlängerter Freisetzung schließen Polyester, Hydrogele (zum Beispiel Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylaktide (Boswell und Scribner, U.S. Patent Nr. 3,773,919 , 1973), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht-abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glycolsäure-Copolymere wie injizierbare Mikrokügelchen, welche aus Milchsäure-Glycolsäure-Copolymer aufgebaut sind, und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ein. Während Polymere wie Ethylen-Vinylacetat und Milchsäure-Glycolsäure eine Freisetzung von Molekülen für über 100 Tage ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine in kürzeren Zeiträumen frei und können bevorzugt sein.
Rekombinante WUP-Expressionsvektoren und Wirtzellen
Vektoren sind Werkzeuge, welche zum Schleusen von DNA zwischen Wirtzellen oder als ein Mittel zur Expression einer Nukleotidsequenz verwendet werden. Einige Vektoren arbeiten nur in Prokaryoten, während andere in sowohl Prokaryoten als auch Eukaryoten arbeiten, was eine DNA-Herstellung von Prokaryoten im Großmaßstab zur Expression in Eukaryoten ermöglicht. Das Einsetzen der DNA von Interesse, wie WUP Nukleotidsequenz oder ein Fragment, wird durch Ligierungstechniken und/oder Paarungsprotokolle, welche dem Fachmann bekannt sind, erreicht. Eine solche DNA wird derart eingesetzt, dass ihre Integration nicht irgendwelche notwendigen Komponenten des Vektors unterbricht. Im Falle von Vektoren, welche zur Expression des eingesetzten DNA-Proteins verwendet werden, ist die eingebrachte DNA mit den Vektorelementen, welche ihre Transkription und Translation leiten, operativ verbunden.
Vektoren können in zwei allgemeine Klassen eingeteilt werden: Klonierungsvektoren sind replizierendes Plasmid oder Phage mit Regionen, welche zur Vermehrung in einer geeigneten Wirtzelle nicht wesentlich sind und in welche fremde DNA eingesetzt werden kann; wobei die fremde DNA repliziert und vermehrt wird, sobald sie eine Komponente des Vektors ist. Ein Expressionsvektor (wie ein Plasmid, Hefe- oder Tiervirusgenom) wird zur Einbringung von fremdem genetischem Material in eine Wirtzelle oder Gewebe verwendet, um die fremde DNA zu transkribieren und translatieren. In Expressionsvektoren ist die eingebrachte DNA mit Elementen, wie Promotoren, welche Signale für die Wirtzelle zur Transkription der eingesetzten DNA bereitstellen, operativ verbunden. Einige Promotoren sind außergewöhnlich nützlich, wie induzierbare Promotoren, welche Gentranskription in Antwort auf spezielle Faktoren kontrollieren. Operatives Verbinden von WUP oder einem Antisense-Konstrukt mit einem induzierbaren Promotor kann die Expression von WUP oder Fragmenten oder Antisense-Konstrukten kontrollieren. Beispiele von klassischen induzierbaren Promotoren schließen jene ein, welche auf α-Interferon, Hitzeschock, Schwermetallionen und Steroide wie Glucocorticoide (Kaufman, 1990) und Tetracyclin antworten. Andere wünschenswerte induzierbare Promotoren schließen jene ein, welche in den Zellen, in welche das Konstrukt eingebracht wird, nicht endogen ist, aber auf welche jedoch in jenen Zellen geantwortet wird, wenn das Induzierungsmittel exogen bereitgestellt wird.
Vektoren weisen viele unterschiedliche Erscheinungsformen auf. Ein „Plasmid" ist ein kreisförmiges doppelsträngiges DNA-Molekül, in welches zusätzliche DNA-Segmente eingebracht werden können. Virale Vektoren können zusätzliche DNA-Segmente in dem Virusgenom akzeptieren. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtzelle in der Lage (z. B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Relikationsursprung und episomale Säugervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säugervektoren) werden in das Genom einer Wirtzelle durch Einbringung in die Wirtzelle integriert und dabei zusammen mit dem Wirtgenom repliziert. Im Allgemeinen sind nützliche Expressionsvektoren oft Plasmide. Jedoch werden andere Formen von Expressionsvektoren, wie virale Vektoren (z. B. Replikation-gestörte Retroviren, Adenviren und Adeno-assoziierte Viren) in Betracht gezogen.
Rekombinante Expressionsvektoren, welche WUP (oder Fragmente) umfassen, regulieren die WUP-Transkription unter Nutzung von einer oder mehr Wirtzell-antwortenden (oder welche in vitro manipuliert werden können) regulatorischen Sequenzen, welche operativ mit WUP verbunden sind. „Operativ verbunden" zeigt an, dass eine Nukleotidsequenz von Interesse mit den regulatorischen Sequenzen derart verbunden ist, dass eine Expression der Nukleotidsequenz erreicht wird.

Vektoren können in eine Vielzahl von Organismen und/oder Zellen eingebracht werden (Tabelle D). Alternativ können die Vektoren in vitro transkribiert und translatiert werden, zum Beispiel unter Verwendung von regulatorischen T7-Promotor-Sequenzen und T7-Polymerase. Tabelle D Beispiele von Wirten für Klonierung oder Expression

Organismus	Beispiele	Quellen und Bezugnahmen*
Prokaryoten
	E. coli
	K 12-Stamm MM294 X1776 W3110 K5 772	ATCC 31,446 ATCC 31,537 ATCC 27,325 ATCC 53,635
Enterobakterien	Enterobacter
	Erwinia
	Klebsiella
	Proteus
	Salmonella (S. typhimurium)
	Serratia (S. marcescans)
	Shigella
	Bacilli (B. subtilis und B. licheniformis)
	Pseudomonas (P. aeruginosa)
	Streptomyces
Eukaryoten
Hefen	Saccharomyces cerevisiae
	Schizosaccharomyces pombe
	Kluyveromyces	(Fleer et al., 1991)
	K. lactis MW98-8C, CBS683, CBS4574	(de Louvencourt et al., 1983)
	K. fragilis	ATCC 12,424
	K. bulgaricus	ATCC 16,045
	K. wickeramii	ATCC 24,178
	K. waltii	ATCC 56,500
	K. drosophilarum	ATCC 36,906
	K. thermotolerans
	K. marxianus; yarrowia	( EPO 402226 , 1990)
	Pichia pastoris	(Sreekrishna et al., 1988)
	Candida
	Trichoderma reesia
	Neurospora crassa	(Case et al., 1979)
	Torulopsis
	Rhodotorula
	Schwanniomyces (S. occidentalis)
Filamentartige Pilze	Neurospora
	Penicillium
	Tolypocladium	( WO 91/00357 , 1991)
	Aspergillus (A. nidulans und A. niger)	(Kelly und Hynes, 1985; Tilburn et al., 1983; Yelton et al., 1984)
Nicht-Wirbeltierzellen	Drosophila S2
Nicht-Wirbeltierzellen	Spodoptera Sf9
Wirbeltierzellen	Chinesische Hamsterovarien (CHO)
	Affen-COS COS-7	ATCC CRL 1651
	HEK 293

* Zellen ohne Angaben sind im Allgemeinen von American Type Culture Collection (Manassas, VA) erhältlich.

Die Wahl des Vektors wird durch den Organismus oder die Zellen, welche verwendet werden, und die gewünschten vorbestimmten Eigenschaften des Vektors bestimmt. Vektoren können, wenn sie in den Zielzellen sind, replizieren oder können „Suizid"-Vektoren sein. Im Allgemeinen umfassen Vektoren Signalsequenzen, Replikationsursprunge, Markergene, Enhancerelemente, Promotoren und Transkriptionsterminationssequenzen. Die Wahl dieser Elemente hängt von den Organismen, in welchen der Vektor verwendet wird, ab und sie werden einfach bestimmt. Einige dieser Elemente können von Bedingungen abhängen, wie ein induzierbarer oder von Bedingungen abhängiger Promotor, welcher „an"-geschaltet wird, wenn die Bedingungen geeignet sind. Beispiele von induzierbaren Promotoren schließen jene ein, welche gewebespezifisch sind, die Expression auf bestimmte Zelltypen herabstufen, auf Steroid antworten oder Hitzeschock-reaktiv sind. Einige bakterielle Repressionssysteme, wie das lac-Operon, wurden in Säugerzellen und transgenen Tieren genutzt (Fieck et al., 1992; Wyborski et al., 1996; Wyborski und Short, 1991). Vektoren verwenden oft einen selektierbaren Marker, um die Identifizierung jener Zellen, welche den Vektor eingebracht aufweisen, zu ermöglichen. Viele selektierbare Marker sind auf dem Fachgebiet für die Verwendung mit Prokaryoten bekannt, normalerweise Antibiotika-resistente Gene oder die Verwendung von Autotrophie- und Auxotrophiemutanten.
Die Verwendung von Antisense- und Sense-WUP-Oligonukleotiden kann eine WUP-Polypeptidexpression verhindern. Diese Oligonukleotide binden an Zielnukleinsäuresequenzen, wobei Duplexe gebildet werden, welche die Transkription oder Translation der Zielsequenz durch Steigern der Degradation der Duplexe, vorzeitiges Abbrechen der Transkription oder Translation oder durch andere Mittel blockieren.
Antisense- oder Sense-Oligonukleotide sind einsträngige Nukleinsäuren, entweder RNA oder DNA, welche an Ziel-WUP-mRNA-(Sense) oder -WUP-DNA-(Antisense)-Sequenzen binden können. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide können ein Fragment der WUP-DNA-Kodierregion mit mindestens etwa 14 Nukleotiden, bevorzugt etwa 14 bis 30 Nukleotiden, umfassen. Im Allgemeinen können Antisense-RNA- oder -DNA-Moleküle mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 Basen in der Länge oder mehr umfassen. Unter anderen beschreiben (Stein und Cohen, 1988; van der Krol et al., 1988b) Verfahren zum Ableiten von Antisense- oder Sense-Oligonukleotiden von einer gegebenen cDNA-Sequenz.
Modifizierungen von Antisense- und Sense-Oligonukleotiden können ihre Wirksamkeit verstärken. Modifizierte Zucker-Phosphodiester-Bindungen oder andere Zucker-Bindungen ( WO 91/06629 , 1991) erhöhen die in vivo-Stabilität durch Verleihen von Resistenz gegen endogene Nukleasen ohne die Bindungsspezifität für Zielsequenzen zu zerstören. Andere Modifizierungen können die Affinitäten der Oligonukleotide für ihre Ziele, wie kovalent gebundene organische Einheiten ( WO 90/10448 , 1990) oder Poly-(L)-lysin, erhöhen. Andere Anbringungen modifizieren die Bindungsspezifitäten der Oligonukleotide für ihre Ziele, einschließlich Metallkomplexe oder interkalierende (z. B. Ellipticin) und alkylierende Mittel.
Zur Einbringung von Antisense- oder Sense-Oligonukleotiden in Zielzellen (Zellen, welche die Zielnukleinsäuresequenz enthalten) kann jedwedes Gentransferverfahren verwendet werden und diese sind dem Fachmann bekannt. Beispiele von Gentransferverfahren schließen 1) biologische, wie Gentransfervektoren wie Epstein-Barr-Virus oder Konjugieren der exogenen DNA an ein Ligandbindungsmolekül ( WO 91/04753 , 1991), 2) physikalische, wie Elektroporation, und 3) chemische, wie CaPO₄-Präzipitation und Oligonukleotid-Lipid-Komplexe ( WO 90/10448 , 1990) ein.
Die Ausdrücke „Wirtzelle" und „rekombinante Wirtzelle" werden austauschbar verwendet. Solche Ausdrücke betreffen nicht nur eine besondere Empfängerzelle sondern auch den Abkömmling oder potentiellen Abkömmling einer solchen Zelle. Da in nachfolgenden Generationen aufgrund von entweder Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifizierungen auftreten können, kann es sein, dass ein solcher Abkömmling in Wirklichkeit nicht identisch mit der Mutterzelle ist, aber noch innerhalb des Umfangs des Ausdrucks eingeschlossen ist.

Verfahren von eukaryotischer Zelltransfektion und prokaryotischer Zelltransformation sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die Wahl der Wirtzelle wird die bevorzugte Technik für das Einbringen der Nukleinsäure von Interesse bestimmen. Tabelle E fasst viele der bekannten Techniken auf dem Fachgebiet zusammen, was aber keine Einschränkung bedeuten soll. Die Einbringung von Nukleinsäuren in einen Organismus kann auch mit ex vivo-Techniken, welche ein in vitro-Transfektionsverfahren verwenden, sowie etablierten genetischen Techniken, falls vorhanden, für den besonderen Organismus durchgeführt werden. Tabelle E Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in Zellen

Zellen	Verfahren	Bezugnahmen	Anmerkungen
Prokaryoten (Bakterien)	Calciumchlorid	(Cohen et al., 1972; Hanahan, 1983; Mandel und Higa, 1970)
Prokaryoten (Bakterien)	Elektroporation	(Shigekawa und Dower, 1988)
Eukaroyten		N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)-
Säugerzellen	Calciumphosphattransfektion	(HEPES)-gepufferte Salzlösung (Chen und Okayama, 1988; Graham und van der Eb, 1973; Wigler et al., 1978) BES-(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure)gepufferte Lösung (Ishiura et al., 1982)	Zellen können mit Glycerol oder Dimethylsulfoxid (DMSO) „geschockt" werden, um die Transfektionswirksamkeit zu erhöhen (Ausubel et al., 1987).
	Diethylaminoethyl(DEAE)-DextranTransfektion	(Fujita et al., 1986; Lopata et al., 1984; Selden et al., 1986)	Am stärksten nützlich für transiente, aber nicht stabile Transfektionen. Chloroquin kann zur Erhöhung der Wirksamkeit verwendet werden.
	Elektroporation	(Neumann et al., 1982; Potter, 1988; Potter et al., 1984; Wong und Neumann, 1982)	Besonders nützlich für schwer zu transfizierende Lymphozyten.
	Kationisches Lipidreagenz-Transfektion	(Elroy-Stein und Moss, 1990; Felgner et al., 1987; Rose et al., 1991; Whitt et al., 1990)	Verwendbar bei sowohl in vivo- als auch in vitro-Transfektionen.
	Retroviral	Herstellung beispielhaft beschrieben von (Cepko et al., 1984; Miller und Buttimore, 1986; Pear et al., 1993) Infektion in vitro und in vivo: (Austin und Cepko, 1990; Bodine et al., 1991; Fekete und Cepko, 1993; Lemischka et al., 1986; Turner et al., 1990; Williams et al., 1984)	Langwieriges Verfahren, viele Packungslinien bei ATCC erhältlich. Verwendbar für sowohl in vivo- als auch in vitro-Transfektion.
	Polybren	(Chaney et al., 1986; Kawai und Nishizawa, 1984)
	Mikroinjektion	(Capecchi, 1980)	Kann zur Etablierung von Zelllinien verwendet werden, welche integrierte Kopien von WUP-DNA-Sequenzen tragen.
	Protoplastenfusion	(Rassoulzadegan et al., 1982; Sandri-Goldin et al., 1981; Schaffner, 1980)
Insektenzellen (in vitro)	Baculovirussysteme	(Luckow, 1991; Miller, 1988; O'Reilly et al., 1992)	Nützlich für in vitro-Herstellung von Proteinen mit eukaryotischen Modifizierungen.
Hefe	Elektroporation	(Becker und Guarente, 1991)
	Lithiumacetat	(Gietz et al., 1998; Ito et al., 1983)
	Spheroplastfusion	(Beggs, 1978; Hinnen et al., 1978)	Arbeitsaufwändig, kann Aneuploide erzeugen.
Pflanzenzellen (allgemeine Druckschrift: (Hansen und Wright, 1999))	Agrobakterium-Transformation	(Bechtold und Pelletier, 1998; Escudero und Hohn, 1997; Hansen und Chilton, 1999; Touraev et al., 1997)
	Biolistika (Mikroprojektile)	(Finer et al., 1999; Hansen und Chilton, 1999; Shillito, 1999)
	Elektroporation (Protoplasten)	(Fromm et al., 1985; Ou-Lee et al., 1986; Rhodes et al., 1988; Saunders et al., 1989) Kann mit Liposomen kombiniert werden (Trick et al., 1997)
	Polyethylenglykol(PEG)-Behandlung	(Shillito, 1999)
	Liposome	Kann mit Elektroporation kombiniert werden (Trick et al., 1997)
	in planta-Mikroinjektion	(Leduc et al., 1996; Zhou et al., 1983)
	Samenimbibition	(Trick et al., 1997)
	Laserstrahl	(Hoffman, 1996)
	Siliciumcarbid-Whisker	(Thompson et al., 1995)

Vektoren verwenden oft einen selektierbaren Marker, um das Identifizieren jener Zellen zu ermöglichen, welche den Vektor eingebracht aufweisen. Viele selektierbare Marker sind auf dem Fachgebiet für die Verwendung mit Prokaryoten bekannt, normalerweise Antibiotikaresistente Gene oder die Verwendung von Autotrophie- und Auxotrophiemutanten. Tabelle F listet oft verwendete selektierbare Marker für Säugerzelltransfektion auf. Tabelle F Nützliche selektierbare Marker für eukaryotische Zelltransfektion

Selektierbarer Marker	Selektion	Wirkung	Druckschrift
Adenosindeaminase (ADA)	Medien schließen 9-β-D-Xylofuranosyladenin (Xyl-A) ein	Umwandlung von Xyl-A in Xyl-ATP, welches in Nukleinsäuren aufgenommen wird, wobei Zellen abgetötet werden. ADA detoxifiziert.	(Kaufman et al., 1986)
Dihydrofolatreductase (DHFR)	Methotrexat (MTX) und dialysiertes Serum (Purin-freie Medien)	Kompetitiver MTX-Inhibitor von DHFR. In Abwesenheit von exogenen Purinen benötigen Zellen DHFR, ein notwendiges Enzym in der Purinbiosynthese.	(Simonsen und Levinson, 1983)
Aminoglycosidphosphotransferase („APH", „neo", „G418")	G418	G418, ein Aminoglycosid, detoxifiziert durch APH, beeinflusst die ribosomale Funktion und folglich die Translation.	(Southern und Berg, 1982)
Hygromycin-B-phosphotransferase (HPH)	Hygromycin-B	Hygromycin-B, ein Aminocyclitol, detoxifiziert durch HPH, unterbricht Proteintranslokation und fördert fehlerbehaftete Translation.	(Palmer et al., 1987)
Thymidinkinase (TK)	Vorwärts-Selektion (TK+): Medien (HAT) umfassen Aminopterin. Umkehr-Selektion (TK-): Medien umfassen 5-Bromdeoxyuridin (BrdU).	Vorwärts: Aminopterin zwingt Zellen zur Synthese von dTTP aus Thymidin, ein Weg, der TK erfordert. Umkehr: TK phosphoryliert BrdU, welches in Nukleinsäuren aufgenommen wird, wobei Zellen abgetötet werden.	(Littlefield, 1964)

Eine Wirtzelle der Erfindung, wie eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtzelle in Kultur, kann zur Herstellung von WUP verwendet werden. Demgemäß stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung von WUP unter Verwendung der Wirtzellen der Erfindung bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kultivieren der Wirtzelle der Erfindung (in welche ein rekombinanter Expressionsvektor, der WUP kodiert, eingebracht wurde) in einem geeigneten Medium, so dass WUP hergestellt wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Isolieren von WUP aus dem Medium oder der Wirtzelle.
Transgene WUP-Tiere
Transgene Tiere sind zur Untersuchung der Funktion und/oder Aktivität von WUP und zur Identifizierung und/oder Bewertung von Modulatoren der WUP-Aktivität nützlich. „Transgene Tiere" sind nicht-humane Tiere, bevorzugt Säuger, stärker bevorzugt Nager wie Ratten oder Mäuse, in welchen eine oder mehr der Zellen ein Transgen einschließen. Andere transgene Tiere schließen Primaten, Schaf, Hunde, Rinder, Ziegen, Hühnchen, Amphibien, usw. ein. Ein „Transgen" ist exogene DNA, welche in das Genom einer Zelle integriert ist, aus welcher sich ein transgenes Tier entwickelt, und welche in dem Genom des ausgereiften Tiers verbleibt. Transgene leiten bevorzugt die Expression eines kodierten Genprodukts in einem oder mehr Zelltypen oder -geweben des transgenen Tiers mit dem Zweck, die Expression eines natürlich kodierten Genprodukts in einem oder mehr Zelltypen oder -geweben (ein transgenes „Knockout"-Tier) zu verhindern oder als ein Marker oder Indikator einer Integration, Chromosomenlokation oder Region von Rekombination zu dienen (z. B. cre/loxP-Mäuse). Ein „homologes rekombinantes Tier" ist ein nicht-humanes Tier, wie ein Nager, in welchem endogenes WUP durch ein exogenes DNA-Molekül verändert wurde, welches homolog mit endogenem WUP in einer (z. B. embryonalen) Zelle vor der Entwicklung des Tiers rekombiniert. Wirtzellen mit exogenem WUP können zur Herstellung von nicht-humanen transgenen Tieren verwendet werden, wie fertilisierte Oozyten oder embryonale Stammzellen, in welche WUP-kodierende Sequenzen eingebracht wurden. Solche Wirtzellen können dann zur Erzeugung von nicht-humanen transgenen Tieren oder homologen rekombinanten Tieren verwendet werden.
1. Vorgehensweisen bei der Herstellung von transgenen Tieren
Ein transgenes Tier kann erzeugt werden durch Einbringung von WUP in die männlichen Pronuklei einer fertilisierten Oozyte (z. B. durch Mikroinjektion, Retrovirusinfektion) und Ermöglichen, dass sich die Oozyte zu einem pseudoschwangeren weiblichen Pflegetier (pffa) entwickelt. Die WUP-cDNA-Sequenzen (SEQ ID Nr. 5) können als ein Transgen in das Genom eines nicht-humanen Tiers eingebracht werden. Alternativ kann ein Homologes von WUP, wie die natürlich vorkommende Variante von WUP (SEQ ID Nr. 7), als ein Transgen verwendet werden. Intron-Sequenzen und Polyadenylierungssignale können auch in das Transgen aufgenommen werden, um die Transgenexpression zu erhöhen. Gewebe-spezifische regulatorische Sequenzen können operativ mit dem WUP-Transgen verbunden sein, um die Expression von WUP auf besondere Zellen zu richten. Verfahren zur Erzeugung von transgenen Tieren über Embryomanipulation und Mikroinjektion, insbesondere von Tieren wie Mäusen, wurden auf dem Fachgebiet üblich, z. B. (Evans et al., U.S. Patent Nr. 4,870,009 , 1989; Hogan, 0879693843, 1994; Leder und Stewart, U.S. Patent Nr. 4,736,866 , 1988; Wagner und Hoppe, US Patent Nr. 4,873,191 , 1989). Andere transgene Tiere, welche von Mäusen verschieden sind, können durch ähnliche Verfahren hergestellt werden. Ein transgenes Stammtier, welches zum Züchten von zusätzlichen transgenen Tieren verwendet werden kann, kann basierend auf der Gegenwart des Transgen in seinem Genom und/oder der Expression der Transgen-mRNA in Geweben oder Zellen der Tiere identifiziert werden. Transgen (z. B. WUP) Tiere können zu anderen transgenen Tieren, welche andere Transgen tragen, gezüchtet werden.
2. Vektoren für die Herstellung von transgenen Tieren
Zur Erzeugung eines homologen rekombinanten Tiers enthält ein Vektor mindestens einen Teil von WUP, in welchem eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht wurde, um dabei WUP zu verändern, z. B. funktionell zu unterbrechen. In einer Vorgehensweise unterbricht ein Knockout-Vektor funktionell das endogene WUP-Gen über homologe Rekombination, und so wird ein nicht-funktionelles WUP-Protein, falls überhaupt, exprimiert.
Alternativ kann der Vektor durch homologe Rekombination derart designed werden, dass das endogene WUP mutiert oder anderweitig verändert ist, aber noch funktionelles Protein kodiert (z. B. kann die nachgelagerte regulatorische Region so verändert werden, dass die Expression von endogenem WUP verändert wird). In diesem Typ von homologem Rekombinationsvektor wird der veränderte Teil des WUP an seinen 5'- und 3'-Termini durch eine zusätzliche Nukleinsäure des WUP flankiert, um zu ermöglichen, dass homologe Rekombination zwischen dem exogenen WUP, welches von dem Vektor getragen wird, und einem endogenen WUP in einer embryonalen Stammzelle stattfindet. Die zusätzliche flankierende WUP-Nukleinsäure ist ausreichend, um homologe Rekombination mit endogenem WUP zu erzeugen. Typischerweise werden mehrere Kilobasen von flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch 3'-Termini) in den Vektor aufgenommen (Thomas und Capecchi, 1987). Der Vektor wird dann in eine embryonale Stammzelllinie eingebracht (z. B. durch Elektroporation), und Zellen, in welchen das eingebrachte WUP homolog mit dem endogenen WUP rekombiniert, werden selektiert (Li et al., 1992).
3. Einbringung von WUP-transgenen Zellen während der Entwicklung
Selektierte Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tiers (z. B. einer Maus) injiziert, um Aggregationschimäre zu bilden (Bradley, 1987). Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes pffa implantiert und der Embryo ausgetragen werden. Ein Abkömmling, der die homolog rekombinierte DNA in seinen Keimzellen trägt, kann zum Züchten von Tieren verwendet werden, in welchen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA durch Keimbahntransmission des Transgens enthalten. Verfahren zum Aufbau von homologen Rekombinationsvektoren und homologen rekombinanten Tieren werden beschrieben (Berns et al., WO 93/04169 , 1993; Bradley, 1991; Kucherlapati et al., WO 91/01140 , 1991; Le Mouellic und Brullet, WO 90/11354 , 1990).
Alternativ können transgene Tiere, welche ausgewählte Systeme enthalten, die eine regulierte Expression des Transgens ermöglichen, hergestellt werden. Ein Beispiel eines solchen Systems ist das cre/loxP-Rekombinasesystem von Bakteriophage P1 (Lakso et al., 1992). Ein anderes Rekombinasesystem ist das FLP-Rekombinasesystem von Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al., 1991). Wenn ein cre/loxP-Rekombinasesystem zur Regulierung der Expression des Transgens verwendet wird, sind Tiere, welche Transgen enthalten, die sowohl die Cre-Rekombinase als auch ein ausgewähltes Protein kodieren, erforderlich. Solche Tiere können als „doppelt"-transgene Tiere durch Paaren eines Tiers, welches ein Transgen enthält, das ein ausgewähltes Protein kodiert, mit einem anderen, welches ein Transgen enthält, das eine Rekombinase kodiert, hergestellt werden.
Klone von transgenen Tieren können auch hergestellt werden (Wilmut et al., 1997). Kurz, eine Zelle von einem transgenen Tier kann isoliert und zum Ausstieg aus dem Wachstumszyklus und zum Eintritt in die G₀-Phase induziert werden. Die ruhende Zelle kann dann mit einer kernlosen Oozyte von einem Tier der selben Spezies, von welcher die ruhende Zelle isoliert wurde, fusioniert werden. Die aufgebaute Oozyte wird dann kultiviert, um sie zu einer Morula oder Blastozyste zu entwickeln, und wird dann in ein pffa transferiert. Der Nachwuchs, der von diesem weiblichem Pflegetier geboren wird, wird ein Klon des transgenen „Mutter"-Tiers sein.
Arzneimittel
Die WUP-Nukleinsäuremoleküle, WUP-Polypeptide und anti-WUP-Abs (aktiven Verbindungen) der Erfindung und Derivate, Analoga und Homologen davon können in Arzneimittel eingebracht werden. Solche Zusammensetzungen umfassen typischerweise das Nukleinsäuremolekül, das Protein oder den Antikörper und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Ein „pharmazeutisch verträglicher Träger" schließt jedwedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakteriellen und Antipilzmittel, isotonischen und absorptionsverzögernden Mittel und dergleichen, welche mit pharmazeutischer Verabreichung kompatibel sind, ein (Gennaro, 2000). Bevorzugte Beispiele von solchen Trägern oder Verdünnungsmitteln schließen Wasser, Salzlösung, Finger-Lösungen, Dextroselösung und 5% humanes Serumalbumin ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Liposome und nicht-wässrige Vehikel wie fette Öle können auch verwendet werden. Außer wenn ein herkömmliches Medium oder Mittel mit einem Wirkstoff nicht kompatibel ist, wird die Verwendung dieser Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Ergänzende Wirkstoffe können auch in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
1. Allgemeine Erwägungen
Ein Arzneimittel wird derart formuliert, dass es mit seinem beabsichtigten Verabreichungsweg, einschließlich intravenöser, intradermaler, subkutaner, oraler (z. B. Inhalation), transdermaler (d. h. topischer), transmukosaler und rektaler Verabreichung, kompatibel ist. Lösungen oder Suspensionen, welche für parenterale, intradermale oder subkutane Verwendung verwendet werden, können einschließen: ein steriles Verdünnungsmittel wie Wasser für Injektion, Salzlösung, fette Öle, Polyethylenglykole, Glycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidanzien wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; chelatbildende Mittel wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); Puffer wie Acetate, Citrate oder Phosphate, und Mittel zur Einstellung der Tonizität wie Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH-Wert kann mit Säuren oder Basen, wie Salzsäure oder Natriumhydroxid, eingestellt werden. Die parenterale Zubereitung kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Fläschchen für mehrere Dosen, welche aus Glas oder Kunststoff hergestellt sind, eingeschlossen werden.
2. Injizierbare Formulierungen
Arzneimittel, welche für Injektion geeignet sind, schließen sterile wässrige Lösungen (wo wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver für die improvisierte Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder einer Dispersion ein. Für intravenöse Verabreichung schließen geeignete Träger physiologische Salzlösung, bakteriostatisches Wasser, CREMOPHOR EL^TM (BASF, Parsippany, N.J.) oder Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) ein. In allen Fallen muss die Zusammensetzung steril sein und sollte fluid sein, für eine Verabreichung unter Verwendung einer Spritze. Solche Zusammensetzungen sollten während der Herstellung und Lagerung stabil sein und müssen gegen Verunreinigung durch Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze geschützt werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel- oder Dispersionsmedium sein, welches zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (wie Glycerol, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol) und geeignete Gemische enthält. Eine geeignete Fluidität kann zum Beispiel unter Verwendung eines geeigneten Überzugs wie Lecithin, durch Aufrechterhalten der erforderlichen Teilchengröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung von grenzflächenaktiven Mitteln aufrechterhalten werden. Verschiedene antibakterielle und Antipilzmittel, zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure und Thimerosal, können Mikroorganismus-Verunreinigung enthalten. Isotonische Mittel, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole wie Mannitol, Sorbitol und Natriumchlorid, können in die Zusammensetzung aufgenommen werden. Zusammensetzungen, welche die Absorption verzögern können, schließen Mittel wie Aluminiummonostearat und Gelatine ein.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Einbringen des Wirkstoffes (z. B. eines WUP oder anti-WUP-Antikörpers) in der erforderlichen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination von Bestandteilen, wie erforderlich, gefolgt von Sterilisation hergestellt werden. Im Allgemeinen werden die Dispersionen durch Einbringen des Wirkstoffes in ein steriles Vehikel, welches ein Dispersionsgrundmedium und die anderen erforderlichen Bestandteile wie erörtert enthält, hergestellt. Sterile Pulver zur Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen, Verfahren zur Herstellung schließen Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen ein, was ein Pulver ergibt, das den Wirkstoff und jedweden gewünschten Bestandteil einer sterilen Lösung enthält.
3. Orale Zusammensetzungen
Orale Zusammensetzungen schließen im Allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel und einen essbaren Träger ein. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder zu Tabletten gepresst werden. Für den Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann der Wirkstoff mit Exzipienten eingebracht werden und in der Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können auch unter Verwendung eines Fluidträgers zur Verwendung als eine Mundspülung hergestellt werden, wobei die Verbindung in dem Fluidträger oral verwendet wird. Pharmazeutisch kompatible Bindemittel und/oder Hilfsmittelmaterialien können aufgenommen werden. Tabellen, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können jedweden der folgenden Bestandteile oder Verbindungen ähnlicher Natur enthalten: ein Bindemittel wie mikrokristalline Cellulose, Tragant oder Gelatine; einen Exzipienten wie Stärke oder Laktose; ein Sprengmittel wie Alginsäure, PRIMOGEL oder Maisstärke; ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat oder STEROTES; ein Fließfähigkeitsverbesserungsmittel wie kolloidales Siliciumdioxid; ein Süßungsmittel wie Saccharose oder Saccharin; oder ein Aromamittel wie Pfefferminz-, Methylsalicylat- oder Orangen-Aroma.
4. Zusammensetzungen für Inhalation
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen als ein Aerosolspray aus einem Zerstäuber oder einem unter Druck stehenden Behälter, der ein geeignetes Treibmittel, z. B. ein Gas wie Kohlendioxid, enthält, bereitgestellt.
5. Systemische Verabreichung
Systemische Verabreichung kann auch transmukosal oder transdermal sein. Für transmukosale oder transdermale Verabreichung werden Penetriermittel, welche die Zielbarriere(n) permeieren können, ausgewählt. Transmukosale Penetriermittel schließen Detergenzien, Salze der Gallensäure und Fusidinsäurederivate ein. Nasensprays oder Zäpfchen können für transmukosale Verabreichung verwendet werden. Für transdermale Verabreichung werden die Wirkstoffe in Salben, Unguentums, Gelen oder Cremes formuliert.
Die Verbindungen können auch in der Form von Zäpfchen (z. B. mit Grundlagen wie Kakaobutter und andere Glyceride) oder Retentionseinläufen für rektale Bereitstellung hergestellt werden.
6. Träger
Die Wirkstoffe können mit Trägern zubereitet werden, welche die Verbindung gegen eine schnelle Eliminierung aus dem Körper schützen, wie eine Formulierung mit kontrollierter Freisetzung, einschließlich Implantate und Mikrokapsel-Bereitstellungssysteme. Bioabbaubare, biokompatible Polymere können verwendet werden, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Solche Materialien können kommerziell von ALZA Corporation (Mountain View, CA) und NOVA Pharmaceuticals, Inc. (Lake Elsinore, CA) erhalten werden oder durch den Fachmann hergestellt werden. Liposomale Suspensionen können auch als pharmazeutisch verträgliche Träger verwendet werden. Diese können gemäß Verfahren, welche dem Fachmann bekannt sind, wie in (Eppstein et al., US Patent Nr. 4,522,811 , 1985) hergestellt werden.
7. Dosierungseinheit
Orale Formulierungen oder parenterale Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsform können erzeugt werden, um eine Verabreichungs- und Dosierungseinheitlichkeit zu ermöglichen. Dosierungseinheitsform betrifft physikalisch getrennte Einheiten, welche als einzelne Dosierungen für den Empfänger, der behandelt wird, geeignet sind, wobei sie eine therapeutisch wirksame Menge des Wirkstoffes zusammen mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger enthalten. Die Spezifizierung für die Dosierungseinheitsformen der Erfindung wird durch die einzigartigen Charakteristika des Wirkstoffes und die besondere gewünschte therapeutische Wirkung und die inhärenten Einschränkungen beim Kompoundieren des Wirkstoffes bestimmt und ist davon direkt abhängig.
8. Gentherapiezusammensetzungen
Nukleinsäuremoleküle können in Vektoren zur Verwendung als Gentherapievektoren eingesetzt werden. Gentherapievektoren können zur Bereitstellung in einem Empfänger durch zum Beispiel intravenöse Injektion, lokale Verabreichung (Nabel und Nabel, US Patent Nr. 5,328,470 , 1994) oder durch stereotaktische Injektion (Chen et al., 1994) geeignet sein. Die pharmazeutische Zubereitung eines Gentherapievektors kann ein verträgliches Verdünnungsmittel einschließen oder kann eine Matrix für langsame Freisetzung, in welcher das Genbereitstellungsvehikel eingebettet ist, umfassen. Wo der vollständige Genbereitstellungsvektor intakt aus rekombinanten Zellen hergestellt werden kann, z. B. Retrovirusvektoren, kann die pharmazeutische Zubereitung alternativ eine oder mehr Zellen, welche das Genbereitstellungssystem herstellen, einschließen.
9. Dosierung
Arzneimittel und pharmazeutische Verfahren können ferner andere therapeutisch aktive Verbindungen wie hier angegeben, welche normalerweise bei der Behandlung der vorstehend erwähnten pathologischen Zustände verwendet werden, umfassen.
In der Verwendung zur Behandlung oder Vorbeugung der Zustände, welche eine WUP-Modulierung erfordern, wird ein geeigneter Dosierungslevel im Allgemeinen etwa 0,01 bis 500 mg pro kg Patientenkörpergewicht pro Tag, welche in einer einzelnen oder mehrfachen Dosen verabreicht werden können, sein. Bevorzugt wird der Dosierungslevel etwa 0,1 bis etwa 250 mg/kg pro Tag; stärker bevorzugt etwa 0,5 bis etwa 100 mg/kg pro Tag sein. Ein geeigneter Dosierungslevel kann etwa 0,01 bis 250 mg/kg pro Tag, etwa 0,05 bis 100 mg/kg pro Tag oder etwa 0,1 bis 50 mg/kg pro Tag sein. Innerhalb diesem Bereich kann die Dosierung 0,05 bis 0,5, 0,5 bis 5 oder 5 bis 50 mg/kg pro Tag sein. Für orale Verabreichung werden die Zusammensetzungen bevorzugt in der Form von Tabletten, welche 1,0 bis 1000 Milligramm des Wirkstoffes enthalten, insbesondere 1,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 50,0, 75,0, 100,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 400,0, 500,0, 600,0, 750,0, 800,0, 900,0 und 1000,0 Milligramm des Wirkstoffes für die symptombezogene Einstellung der Dosierung auf den Patienten, der behandelt wird, bereitgestellt. Die Verbindungen können für Verabreichung in einem Schema von 1 bis 4 Mal pro Tag, bevorzugt einmal oder zweimal pro Tag geeignet sein.
Es gilt jedoch als selbstverständlich, dass der spezielle Dosierungslevel und die Häufigkeit der Dosierung für jedweden besonderen Patienten variiert werden kann und von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich der Aktivität der speziellen verwendeten Verbindung, der metabolischen Stabilität und Länge der Wirkung der Verbindung, dem Alter, dem Körpergewicht, der allgemeinen Gesundheit, dem Geschlecht, der Ernährung, der Verabreichungsweise und -zeit, der Ausscheidungsrate, der Arzneistoffkombination, der Schwere des besonderen Zustandes und dem Wirt, der die Therapie absolviert, abhängen wird.
10. Kits für Arzneimittel
Die Arzneimittel können in einem Kit, einem Behälter, einer Packung oder einem Spender zusammen mit Anweisungen zur Verabreichung enthalten sein. Wenn sie als ein Kit bereitgestellt werden, können die unterschiedlichen Komponenten der Zusammensetzung in getrennten Behältern abgepackt und unmittelbar vor der Verwendung gemischt werden. Ein solches getrenntes Abpacken der Komponenten kann eine Langzeitlagerung ohne einen Verlust an Wirkungen der Wirkstoffe ermöglichen.
Kits können auch Reagenzien in getrennten Behältern enthalten, was die Durchführung eines speziellen Tests, wie diagnostische Tests oder Gewebetypisierung, ermöglicht. Zum Beispiel können WUP-DNA-Template und geeignete Primer für interne Kontrollen bereitgestellt werden.
(a) Behälter oder Gefäße
Die Reagenzien, welche in den Kits enthalten sind, können in Behältern jedweder Art bereitgestellt werden, so dass die Haltbarkeit der unterschiedlichen Komponenten bewahrt wird und sie nicht durch die Materialien des Behälters adsorbiert oder verändert werden. Zum Beispiel können versiegelte Glasampullen lyophilisierte Luziferase oder Puffer, welche unter einem neutralen, sich nicht umsetzenden Gas, wie Stickstoff, abgepackt wurden, enthalten. Ampullen können aus jedwedem geeignetem Material, wie Glas, organischen Polymeren, wie Polycarbonat, Polystyrol, usw., Keramik, Metall oder jedwedem anderen Material, welches typischerweise zum Aufnehmen von Reagenzien verwendet wird, bestehen. Andere Beispiele von geeigneten Behältern schließen einfache Flaschen, welche aus ähnlichen Substanzen wie Ampullen hergestellt werden können, und Tütchen, welche aus mit Folie ausgekleidetem Innenbereich, wie Aluminium oder eine Legierung, bestehen können, ein. Andere Behälter schließen Teströhrchen, Phiolen, Kolben, Flaschen, Spritzen oder dergleichen ein. Behälter können eine sterile Zugangsöffnung aufweisen, wie eine Flasche mit einem Stopfen, der mit einer Injektionsnadel durchstochen werden kann. Andere Behälter können zwei Teile aufweisen, welche durch eine leicht entfernbare Membran getrennt sind, wobei durch Entfernung das Mischen der Komponenten ermöglicht wird. Entfernbare Membrane können Glas, Kunststoff, Gummi, usw. sein.
(b) Anweisungsmaterialien
Kits können auch mit Anweisungsmaterialien bereitgestellt werden. Anweisungen können auf Papier oder einem anderen Substrat aufgedruckt sein und/oder können als ein elektronischlesbares Medium, wie eine Diskette, CD-ROM, DVD-ROM, Zip-Diskette, Videoband, Audioband, usw., bereitgestellt werden. Detaillierte Anweisungen müssen physikalisch nicht mit dem Kit in Verbindung stehen; anstelle kann ein Verwender auf eine Internetseite, spezifiziert durch den Hersteller oder Vertreiber des Kits, verwiesen werden, oder sie können als elektronische Mail bereitgestellt werden.
Screening- und Nachweisverfahren
Isolierte Nukleinsäuremoleküle können zur Expression von WUP (z. B. über einen rekombinanten Expressionsvektor in einer Wirtzelle in Gentherapieverwendungen), zum Nachweisen von WUP-mRNA (z. B. in einer biologischen Probe) oder einer genetischen Läsion in einem WUP und zum Modulieren von WUP-Aktivität, wie nachstehend beschrieben, verwendet werden. Zusätzlich können WUP-Polypeptide zum Screenen von Arzneistoffen oder Verbindungen, welche die WUP-Aktivität oder -Expression modulieren, sowie zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Störungen, welche durch nicht ausreichende oder übermäßige Herstellung von WUP oder Herstellung von WUP-Formen, welche erniedrigte oder abweichende Aktivität im Vergleich zum WUP-Wildtyp-Protein aufweisen, gekennzeichnet sind, oder zur Modulierung einer biologischen Funktion, welche WUP einbezieht, verwendet werden. Zusätzlich können anti-WUP-Abs zum Nachweisen und Isolieren von WUP und zum Modulieren von WUP-Aktivität verwendet werden.
1. Screeningtests
Screeningtests können Ausführungsarten, d. h. Versuchs- oder Testverbindungen oder Mittel (z. B. Peptide, Peptidomimetika, kleine Moleküle oder andere Arzneistoffe), Nahrungsmittel, Kombinationen davon, usw., welche auf WUP einwirken, eine stimulatorische oder inhibitorische Wirkung, einschließlich Translation, Transkription, Aktivität oder Kopien des Gens in Zellen, identifizieren.
Das Testen auf Verbindungen, welche die WUP-Aktivität erhöhen oder erniedrigen, ist wünschenswert. Eine Verbindung kann die WUP-Aktivität modulieren durch Beeinflussung: (1) der Anzahl von Kopien des Gens in der Zelle (Amplifizierungsmittel und Deamplifizierungsmittel); (2) des Anstiegs oder der Abnahme der Transkription des WUP (Mittel zur Regulierung der Transkription nach oben und Mittel zur Regulierung der Transkription nach unten); (3) durch Erhöhen oder Erniedrigen der Translation von WUP-mRNA in Protein (Mittel zur Regulierung der Translation nach oben und Mittel zur Regulierung der Translation nach unten); oder (4) durch Erhöhen oder Erniedrigen der Aktivität von WUP selbst (Agonisten und Antagonisten).
(a) Wirkungen von Verbindungen
Zur Identifizierung von Verbindungen, welche WUP auf den DNA-, RNA- und Proteinlevels beeinflussen, werden Zellen oder Organismen mit einer Versuchsverbindung in Kontakt gebracht und die entsprechende Änderung bei WUP-DNA, -RNA oder -Protein wird abgeschätzt (Ausubel et al., 1987). Für DNA-Amplifizierungsmittel und -Deamplifizierungsmittel wird die Menge an WUP-DNA gemessen, für jene Verbindungen, welche Mittel zur Regulierung der Transkription nach oben und Mittel zur Regulierung der Transkription nach unten sind, wird die Menge an WUP-mRNA bestimmt; für Mittel zur Regulierung der Translation nach oben und Mittel zur Regulierung der Translation nach unten wird die Menge an WUP-Polypeptiden gemessen. Verbindungen, welche Agonisten oder Antagonisten sind, können durch Inkontaktbringen von Zellen oder Organismen mit der Verbindung identifiziert werden.
In einer Ausführungsform sind viele Tests zum Screenen von Versuchs- oder Testverbindungen, welche an WUP oder Polypeptid oder einen biologisch aktiven Teil binden oder die Aktivität davon modulieren, verfügbar. Testverbindungen können unter Verwendung von jedweder der zahlreichen Vorgehensweisen bei kombinatorischen Bibliothekverfahren, einschließlich biologischen Bibliotheken; räumlich adressierbaren parallelen Festphasen- oder Lösungsphasen-Bibliotheken; synthetischen Bibliothekverfahren, welche Dekonvolution erfordern; dem „ein Bead-eine Verbindung"-Bibliothekverfahren; und synthetischen Bibliothekverfahren unter Verwendung von Affinitätschromatographieselektion, erhalten werden. Die Vorgehensweise der biologischen Bibliothek ist auf Peptide eingeschränkt, wogegen die anderen vier Vorgehensweisen Peptid-, Nicht-Peptidoligomer- oder kleines Molekül-Bibliotheken von Verbindungen umfassen (Lam, 1997).
(b) kleine Moleküle
Ein „kleines Molekül" betrifft eine Zusammensetzung, welche ein Molekulargewicht von niedriger als etwa 5 kD und stärker bevorzugt niedriger als etwa 4 kD und am stärksten bevorzugt niedriger als 0,6 kD aufweist. Kleine Moleküle können Nukleinsäuren, Peptide, Polypeptide, Peptidomimetika, Kohlenhydrate, Lipide oder andere organische oder anorganische Moleküle sein. Bibliotheken von chemischen und/oder biologischen Gemischen, wie Pilz-, Bakterien- oder Algenextrakte, sind auf dem Fachgebiet bekannt und können mit jedwedem der Tests der Erfindung gescreent werden. Beispiele von Verfahren für die Synthese von Molekülbibliotheken können gefunden werden in: (Carell et al., 1994a; Carell et al., 1994b; Cho et al., 1993; DeWitt et al., 1993; Gallop et al., 1994; Zuckermann et al., 1994).
Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung (Houghten et al., 1992) oder an Beads (Lam et al., 1991), an Chips (Fodor et al., 1993), Bakterien, Sporen (Ladner et al., US Patent Nr. 5,223,409 , 1993), Plasmiden (Cull et al., 1992) oder an Phage (Cwirla et al., 1990; Devlin et al., 1990; Felici et al., 1991; Ladner et al., US Patent Nr. 5,223,409 , 1993; Scott und Smith, 1990) bereitgestellt werden. Ein zellfreier Test umfasst das Inkontaktbringen von WUP oder einem biologisch aktiven Fragment mit einer bekannten Verbindung, welche an WUP bindet, um ein Testgemisch zu bilden, das Inkontaktbringen des Testgemisches mit einer Testverbindung und das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, mit WUP wechselzuwirken, wobei das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, mit WUP wechselzuwirken, das Bestimmen der Fähigkeit des WUP, bevorzugt an ein WUP-Zielmolekül zu binden oder die Aktivität davon zu modulieren, umfasst.
(c) zellfreie Tests
Die zellfreien Tests der Erfindung können mit sowohl löslichen als auch membrangebundenen Formen von WUP verwendet werden. Im Falle von zellfreien Tests, welche die membrangebundene Form umfassen, gibt es ein löslichmachendes Mittel, um WUP in Lösung zu halten. Beispiele von solchen löslichmachenden Mitteln schließen nicht-ionische Detergenzien wie n-Octylglucosid, n-Dodecylglucosid, n-Dodecylmaltosid, Octanoyl-N-methylglucamid, Decanoyl-N-methylglucamid, TRITON^® X-100 und andere der TRITON^®-Reihe, THESIT^®, Isotridecypoly(ethylenglykolether)n, N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, 3-(3-Cholamidopropyl)dimethylamminiol-1-propansulfonat (CHAPS) oder 3-(3-Cholamidopropyl)dimethylamminiol-2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO) ein.
(d) Immobilisierung von Zielmolekülen, um ein Screenen zu ermöglichen
In mehr als einer Ausführungsform der Testverfahren kann das Immobilisieren von entweder WUP oder seinen Partnermolekülen eine Abtrennung von komplexierten von nicht komplexierten Formen von einem oder beiden Proteinen sowie die Anpassung an Tests mit großem Durchsatz ermöglichen. Das Binden einer Testverbindung an WUP oder die Wechselwirkung von WUP mit einem Zielmolekül in der Gegenwart und Abwesenheit einer Versuchsverbindung können in jedwedem Gefäß, welches zum Enthalten der Reaktanden geeignet ist, wie Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen, erreicht werden. Ein Fusionsprotein kann bereitgestellt werden, welches eine Domäne addiert, die ermöglicht, dass eines oder beide Proteine an eine Matrix gebunden werden. Zum Beispiel können GST-WUP-Fusionsproteine oder GST-Zielfusionsproteine auf Glutathionsepharose-Beads (SIGMA Chemical, St. Louis, MO) oder Glutathion-derivatisierten Mikrotiterplatten adsorbiert werden, welche dann mit der Testverbindung oder der Testverbindung und entweder dem nicht-adsorbierten Zielprotein oder WUP kombiniert werden, und das Gemisch wird unter Bedingungen, welche für Komplexbildung förderlich sind (z. B. bei physiologischen Bedingungen für Salz und pH-Wert), inkubiert. Nach der Inkubation werden die Beads oder Mikrotiterplattenvertiefungen gewaschen, um jedwede nicht gebundenen Komponenten zu entfernen, die Matrix wird im Falle von Beads immobilisiert, der Komplex wird entweder direkt oder indirekt, zum Beispiel wie beschrieben, bestimmt.
Alternativ können die Komplexe von der Matrix abdissoziiert und der Level der WUP-Bindung oder -Aktivität unter Verwendung von Standardtechniken bestimmt werden.
Andere Techniken zur Immobilisierung von Proteinen an Matrices können auch in Screeningtests verwendet werden. Entweder WUP oder sein Zielmolekül können unter Verwendung von Biotin-Avidin- oder Biotin-Streptavidin-Systemen immobilisiert werden. Biotinylierung kann unter Verwendung von vielen Reagenzien, wie Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid; PIERCE Chemicals, Rockford, IL), erreicht werden und kann in Vertiefungen von mit Streptavidin überzogenen Platten mit 96 Vertiefungen (PIERCE Chemical) immobilisiert werden. Alternativ können Abs, welche mit WUP oder Zielmolekülen reaktiv sind, welche aber nicht die Bindung des WUP an sein Zielmolekül beeinflussen, an den Vertiefungen der Platte derivatisiert werden, und nicht gebundenes Ziel oder WUP können durch Antikörperkonjugation in den Vertiefungen eingefangen werden. Verfahren zum Nachweisen von solchen Komplexen, zusätzlich zu jenen, welche für die GST-immobilisierten Komplexe beschrieben wurden, schließen Immunnachweis von Komplexen unter Verwendung von Abs, welche mit WUP oder seinem Ziel reaktiv sind, sowie Enzym-gekoppelte Tests, welche auf dem Nachweis von enzymatischer Aktivität, die mit dem WUP oder Zielmolekül in Verbindung steht, beruhen, ein.
(e) Screens zur Identifizierung von Modulatoren
Modulatoren der WUP-Expression können in einem Verfahren, wobei eine Zelle mit einer Versuchsverbindung in Kontakt gebracht wird und die Expression von WUP-mRNA oder -Protein in der Zelle bestimmt wird, identifiziert werden. Der Expressionslevel de(r/s) WUP-mRNA oder -Proteins in der Gegenwart der Versuchsverbindung wird mit den WUP-mRNA- oder -Proteinlevels in der Abwesenheit der Versuchsverbindung verglichen. Die Versuchsverbindung kann dann als ein Modulator der WUP-mRNA- oder -Proteinexpression bezogen auf diesen Vergleich identifiziert werden. Wenn zum Beispiel die Expression von WUP-mRNA oder -Protein in der Gegenwart der Versuchsverbindung höher (d. h. statistisch signifikant) als in ihrer Abwesenheit ist, wird die Versuchsverbindung als ein Stimulator der WUP-mRNA- oder -Proteinexpression identifiziert. Alternativ, wenn die Expression von WUP-mRNA oder -Protein in der Gegenwart der Versuchsverbindung niedriger (statistisch signifikant) als in ihrer Abwesenheit ist, wird die Versuchsverbindung als ein Inhibitor der WUP-mRNA- oder -Proteinexpression identifiziert. Der Level der WUP-mRNA- oder -Proteinexpression in den Zellen kann durch Verfahren, welche zum Nachweisen von WUP-mRNA oder -Protein beschrieben wurden, bestimmt werden.
(i) Hybridtests
WUP kann als „Köder" in Zwei-Hybrid- oder Drei-Hybrid-Tests (Bartel et al., 1993; Brent et al., WO 94/10300 , 1994; Iwabuchi et al., 1993; Madura et al., 1993; Saifer et al., US Patent Nr. 5,283,317 , 1994; Zervos et al., 1993) zur Identifizierung von anderen Proteinen, welche an WUP binden oder damit Wechselwirken und die WUP-Aktivität modulieren, verwendet werden. Es ist auch wahrscheinlich, dass solche WUP-bps in die Vermehrung von Signalen durch das WUP als zum Beispiel nachgelagerte oder vorgelagerte Elemente eines WUP-Weges einbezogen sind.
Das Zwei-Hybrid-System basiert auf der modularen Natur der meisten Transkriptionsfaktoren, welche aus trennbaren DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomänen bestehen. Kurz, der Test verwendet zwei unterschiedliche DNA-Konstrukte. In einem Konstrukt wird das Gen, welches für WUP kodiert, an ein Gen fusioniert, welches die DNA-Bindungsdomäne eines bekannten Transkriptionsfaktors (z. B. GAL4) kodiert. Das andere Konstrukt, eine DNA-Sequenz einer Bibliothek von DNA-Sequenzen, welche ein nicht identifiziertes Protein („Beute” oder „Probe") kodiert, wird an ein Gen fusioniert, welches die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors kodiert. Wenn die „Köder"- und die „Beute"-Proteine in vivo zu Wechselwirkung fähig sind, wobei ein WUP-abhängiger Komplex gebildet wird, werden die DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomänen des Transkriptionsfaktors in enge Nähe gebracht. Diese Nähe ermöglicht die Transkription eines Reportergens (z. B. LacZ), welches mit einer regulatorischen Transkriptionsstelle operativ verbunden ist, die auf den Transkriptionsfaktor antwortet. Die Expression des Reportergens kann nachgewiesen werden und Zellkolonien, welche den funktionellen Transkriptionsfaktor enthalten, können isoliert und zum Erhalten des klonierten Gens, welches das WUP-Wechselwirkungsprotein kodiert, verwendet werden.
Neue Mittel können durch die vorstehend erwähnten Screeningtests identifiziert und für Behandlungen wie hier beschrieben verwendet werden.
2. Nachweistests
Teile oder Fragmente von hier identifizierten WUP-cDNA-Sequenzen (und die vollständigen WUP-Gensequenzen) sind selbst nützlich. Nach nicht-einschränkendem Beispiel können diese Sequenzen verwendet werden zum (1) Identifizieren eines Individuums durch eine kleine biologische Probe (Gewebetypisierung); und (2) Unterstützen der forensischen Identifizierung einer biologischen Probe.
(a) Gewebetypisierung
Die WUP-Sequenzen der Erfindung können zur Identifizierung von Individuen durch kleine biologische Proben verwendet werden. In dieser Technik wird eine Genom-DNA eines Individuums mit einem oder mehr Restriktionsenzymen verdaut und bei einem Southern-Blot als Sonde verwendet, wobei einzigartige Banden erhalten werden. Die Sequenzen der Erfindung sind als zusätzliche DNA-Marker für „Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen" (RFLP; (Smulson et al., US Patent Nr. 5,272,057 , 1993)) nützlich.
Darüber hinaus können die WUP-Sequenzen zur Bestimmung der wirklichen Basenabfolge einer DNA-Sequenz von zielgerichteten Teilen eines Genoms eines Individuums verwendet werden. WUP-Sequenzen können zur Herstellung von zwei PCR-Primern von den 5'- und 3'-Termini der Sequenzen verwendet werden, welche dann zur Amplifizierung der entsprechenden Sequenzen eines Genoms eines Individuums und dann zur Sequenzierung des amplifizierten Fragments verwendet werden können.
Felder von entsprechenden DNA-Sequenzen von Individuen können einzigartige individuelle Identifizierungen bereitstellen, da jedes Individuum einen einzigartigen Satz von solchen DNA-Sequenzen aufgrund von Allelunterschieden aufweisen wird. Die Sequenzen der Erfindung können zum Erhalten von solchen Identifizierungssequenzen von Individuen und von Gewebe verwendet werden. Die WUP-Sequenzen der Erfindung stellen in einzigartiger Weise Teile eines Genoms eines Individuums dar. Allelvariation tritt in einem gewissen Ausmaß in den Kodierregionen dieser Sequenzen und in einem höheren Ausmaß in den nicht-kodierenden Regionen auf. Die Allelvariation zwischen einzelnen Menschen tritt mit einer Häufigkeit von etwa einmal pro 500 Basen auf. Ein Großteil der Allelvariation findet aufgrund von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs), welche RFLPs einschließen, statt.
Jede der hier beschriebenen Sequenzen kann bis zu einem bestimmten Grad als ein Standard verwendet werden, mit welchem DNA von einem Individuum für Identifizierungszwecke verglichen werden kann. Da höhere Anzahlen von Polymorphismen in nicht-kodierenden Regionen auftreten, sind weniger Sequenzen zur Unterscheidung von Individuen notwendig. Nicht-kodierende Sequenzen können Individuen mit einem Feld von 10 bis 1.000 Primern, wobei jeder eine nicht-kodierende amplifizierte Sequenz von 100 Basen ergibt, positiv identifizieren. Wenn vorhergesagte Kodiersequenzen, wie jene in SEQ ID Nr. 5 oder 7, verwendet werden, wäre eine passendere Anzahl von Primern für eine positive Identifizierung eines Individuums 500 bis 2.000.
Vorhersagende Medizin
Die Erfindung betrifft auch das Gebiet der vorhersagenden Medizin, wobei diagnostische Tests, prognostische Tests, Pharmakogenomtests und klinische beobachtende Studien für prognostische (vorhersagende) Zwecke verwendet werden, um ein Individuum prophylaktisch zu behandeln. Demgemäß betrifft eine Ausführungsform der Erfindung diagnostische Tests zur Bestimmung von WUP und/oder -Nukleinsäureexpression sowie WUP-Aktivität im Kontext einer biologischen Probe (z. B. Blut, Serum, Zellen, Gewebe), um zu bestimmen, ob ein Individuum das Gebrechen einer Erkrankung oder Störung aufweist oder das Risiko zur Entwicklung einer Störung, welche mit abweichender WUP-Expression oder -Aktivität in Zusammenhang steht, einschließlich Krebs, aufweist. Die Erfindung stellt auch prognostische (oder vorhersagende) Tests zur Bestimmung, ob ein Individuum ein Risiko zur Entwicklung einer Störung, welche mit WUP, -Nukleinsäureexpression oder -Aktivität in Zusammenhang steht, aufweist, bereit. Zum Beispiel kann auf Mutationen in WUP in einer biologischen Probe getestet werden. Solche Tests können für einen prognostischen oder vorhersagenden Zweck zur prophylaktischen Behandlung eines Individuums vor dem Einsetzen einer Störung, welche gekennzeichnet ist durch oder in Verbindung steht mit WUP, -Nukleinsäureexpression oder biologischer Aktivität davon, verwendet werden.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt Verfahren zur Bestimmung von WUP-Aktivität oder -Nukleinsäureexpression in einem Individuum zur Auswahl von geeigneten therapeutischen oder prophylaktischen Mitteln für das Individuum bereit (hier als „Pharmakogenomtests" bezeichnet). Pharmakogenomtests ermöglichen die Auswahl von Ausführungsarten (z. B. Arzneistoffen, Nahrungsmitteln) für therapeutische oder prophylaktische Behandlung eines Individuums, bezogen auf den Gentyp des Individuums (z. B. der Gentyp des Individuums, um das Vermögen des Individuums, auf ein besonderes Mittel zu antworten, zu bestimmen). Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft das Überwachen des Einflusses von Ausführungsarten (z. B. Arzneistoffen, Nahrungsmitteln) auf die Expression oder Aktivität von WUP in klinischen Studien.
1. Diagnostische Tests
Ein beispielhaftes Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit von WUP in einer biologischen Probe bezieht das Erhalten einer biologischen Probe von einem Spender und das Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einer Verbindung oder einem Mittel, welches zum Nachweisen von WUP oder WUP-Nukleinsäure (z. B. mRNA, Genom-DNA) in der Lage ist, so dass die Gegenwart von WUP in der Probe bestätigt wird, ein. Ein Mittel zum Nachweisen von WUP-mRNA oder -Genom-DNA ist eine markierte Nukleinsäuresonde, welche an WUP-mRNA oder -Genom-DNA hybridisieren kann. Die Nukleinsäuresonde kann zum Beispiel eine volle Länge einer WUP-Nukleinsäure, wie die Nukleinsäure von SEQ ID Nr. 5 oder 7, oder ein Teil davon, wie ein Oligonukleotid mit mindestens 15, 30, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotiden in der Länge und welches ausreichend ist, um unter strengen Bedingungen spezifisch an WUP-mRNA oder -Genom-DNA zu hybridisieren, sein.
Ein Mittel zum Nachweisen von WUP-Polypeptid ist ein Antikörper, der zum Binden an WUP wie in den Patentansprüchen definiert in der Lage ist, bevorzugt ein Antikörper mit einer nachweisbaren Markierung. Abs können polyklonal oder stärker bevorzugt monoklonal sein. Ein intakter Antikörper oder ein Fragment (z. B. F_ab oder F(ab')₂) können verwendet werden. Ein(e) markierte(r) Sonde oder Antikörper werden an eine nachweisbare Substanz gekuppelt (d. h. physikalisch gebunden), sowie der indirekte Nachweis der Sonde oder des Antikörpers durch die Reaktivität mit einem anderen Reagenz, welches direkt markiert ist. Beispiele von indirektem Markieren schließen den Nachweis eines primären Antikörpers unter Verwendung eines fluoreszent markierten sekundären Antikörpers und Endmarkieren einer DNA-Sonde mit Biotin, so dass sie mit fluoreszent markiertem Streptavidin nachgewiesen werden kann, ein. Der Ausdruck „biologische Probe" schließt Gewebe, Zellen und biologische Fluide, welche von einem Spender/Empfänger isoliert werden, sowie Gewebe, Zellen und Fluide, welche in einem Spender/Empfänger vorhanden sind, ein. Das Nachweisverfahren kann zum Nachweisen von WUP-mRNA, -Protein oder -Genom-DNA in einer biologischen Probe in vitro sowie in vivo verwendet werden. Zum Beispiel schließen in vitro-Techniken zum Nachweisen von WUP-mRNA Northern-Hybridisierungen und in situ-Hybridisierungen ein. In vitro-Techniken zum Nachweis von WUP-Polypeptid schließen Enzym-gekoppelte Immunabsorptionstests (ELISAs), Western-Blots, Immunopräzipitationen und Immunfluoreszenz ein. In vitro-Techniken zum Nachweis von WUP-Genom-DNA schließen Southern-Hybridisierungen und Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ein. Darüber hinaus schließen in vivo-Techniken zum Nachweis von WUP das Einbringen eines markierten anti-WUP-Antikörpers in einen Empfänger ein. Zum Beispiel kann der Antikörper mit einem radioaktiven Marker markiert sein, dessen Gegenwart oder Lokation in einem Empfänger durch Bildgebungs-Standardtechniken nachgewiesen werden können.
Die biologische Probe von einem Spender kann Proteinmoleküle und/oder mRNA-Moleküle und/oder DNA-Moleküle enthalten. Eine bevorzugte biologische Probe ist Blut.
Die Verfahren können ferner das Erhalten einer biologischen Probe von einem Spender, um eine Kontrolle bereit zu stellen, das Inkontaktbringen der Probe mit einer Verbindung oder einem Mittel, um WUP, -mRNA oder -Genom-DNA nachzuweisen, und das Vergleichen der Gegenwart von WUP, -mRNA oder -Genom-DNA in der Kontrollprobe mit der Gegenwart von WUP, -mRNA oder -Genom-DNA in der Testprobe einbeziehen.
Die Erfindung umfasst auch Kits, wie in den Patentansprüchen definiert, zum Nachweisen von WUP in einer biologischen Probe. Zum Beispiel kann der Kit umfassen: ein(e) markierte(s) Verbindung oder Mittel, welche zum Nachweisen von WUP oder WUP-mRNA in einer Probe in der Lage sind; ein Reagenz und/oder eine Ausrüstung zur Bestimmung der Menge an WUP in der Probe; und ein Reagenz und/oder eine Ausrüstung zum Vergleichen der Menge an WUP in der Probe mit einem Standard. Die Verbindung oder das Mittel können in einem geeigneten Behälter abpackt sein. Der Kit kann ferner Anweisungen zur Verwendung des Kits zum Nachweis von WUP oder -Nukleinsäure umfassen.
2. Prognostische Tests
Die hier beschriebenen diagnostischen Verfahren können darüber hinaus zum Identifizieren von Spendern/Empfängern mit oder mit einem Risiko für die Entwicklung einer Erkrankung oder Störung, welche mit abweichender WUP-Expression oder -Aktivität in Zusammenhang stehen, verwendet werden. Zum Beispiel können die hier beschriebenen Tests zur Identifizierung eines Spenders/Empfängers mit oder mit einem Risiko für die Entwicklung einer Störung, welche mit WUP, Nukleinsäureexpression oder -Aktivität in Zusammenhang steht, verwendet werden. Alternativ können die prognostischen Tests zur Identifizierung eines Spenders/Empfängers mit oder mit einem Risiko für die Entwicklung einer Erkrankung oder Störung, welche mit abweichender WUP-Expression oder -Aktivität in Zusammenhang stehen, verwendet werden, wobei eine Testprobe von einem Spender erhalten wird und WUP oder -Nukleinsäure (z. B. mRNA, Genom-DNA) nachgewiesen werden. Eine Testprobe ist eine biologische Probe, welche von einem Spender erhalten wird. Zum Beispiel kann eine Testprobe ein biologisches Fluid (z. B. Serum), eine Zellprobe oder ein Gewebe sein.
Prognostische Tests können verwendet werden, um zu bestimmen, ob an einen Empfänger eine Ausführungsart (z. B. ein Agonist, Antagonist, Peptidomimetikum, Protein, Peptid, Nukleinsäure, kleines Molekül, Nahrungsmittel, usw.) verabreicht werden kann, um eine Erkrankung oder Störung, welche mit abweichender WUP-Expression oder -Aktivität in Zusammenhang stehen, zu behandeln. Solche Verfahren können verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Empfänger wirksam mit einem Mittel gegen eine Störung behandelt werden kann. Verfahren können bestimmen, ob ein Empfänger wirksam mit einem Mittel gegen eine Störung, welche mit abweichender WUP-Expression oder -Aktivität in Zusammenhang steht, behandelt werden kann, wobei eine Testprobe erhalten wird und WUP oder -Nukleinsäure nachgewiesen werden (z. B. wo die Gegenwart von WUP oder -Nukleinsäure für einen Emfpänger, an welchen ein Mittel zur Behandlung einer Störung, welche mit abweichender WUP-Expression oder -Aktivität in Zusammenhang steht, verabreicht werden kann, diagnostisch ist).
Verfahren können auch zum Nachweisen von genetischen Läsionen in einem WUP verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Spender/Empfänger mit der genetischen Läsion ein Risiko für eine Störung aufweist. Verfahren schließen das Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit einer genetischen Läsion, welche durch eine Veränderung, die die Integrität eines Gens, welches ein WUP-Polypeptid kodiert, beeinflusst, oder die fehlerbehaftete Expression von WUP gekennzeichnet ist, ein. Solche genetische Läsionen können nachgewiesen werden durch Ermitteln: (1) einer Deletion von einer oder mehr Nukleotiden von WUP; (2) einer Addition von einer oder mehr Nukleotiden an WUP; (3) einer Substitution von einer oder mehr Nukleotiden in WUP, (4) einer Chromosomenumlagerung eines WUP-Gens; (5) einer Veränderung beim Level von WUP-mRNA-Transkripten; (6) einer abweichenden Modifizierung eines WUP, wie eine Veränderung einer Genom-DNA-Methylierung; (7) der Gegenwart eines Nicht-Wildtyp-Splicing-Musters eines WUP-mRNA-Transkripts; (8) eines Nicht-Wildtyp-Levels von WUP; (9) eines Allelverlusts von WUP; und/oder (10) einer ungeeigneten Modifizierung des WUP-Polypeptids nach der Translation. Es gibt eine große Anzahl von bekannten Testtechniken, welche zum Nachweisen von Läsionen in WUP verwendet werden können. Jedwede biologische Probe, welche kernhaltige Zellen enthält, kann verwendet werden.
Ein Läsionsnachweis kann eine(n) Sonde/Primer in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) (z. B. (Mullis, US Patent Nr. 4,683,202 , 1987; Mullis et al., US Patent Nr. 4,683,195 , 1987), wie Anker-PCR oder schnelle Amplifizierung von cDNA-Enden (RACE)-PCR oder alternativ in einer Ligierungskettenreaktion (LCR) (z. B. (Landegren et al., 1988; Nakazawa et al., 1994), wobei Letztere besonders zum Nachweis von Punktmutationen in WUP-Genen nützlich ist (Abravaya et al., 1995), verwenden. Dieses Verfahren kann das Sammeln einer Probe von einem Patienten, das Isolieren von Nukleinsäuren aus der Probe, das Inkontaktbringen der Nukleinsäuren mit einem oder mehr Primern, welche spezifisch an WUP hybridisieren, unter Bedingungen, so dass Hybridisierung und Amplifizierung des WUP (falls vorhanden) stattfindet, und das Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit eines Amplifizierungsprodukts oder Nachweisen der Größe des Amplifizierungsprodukts und Vergleichen der Länge mit einer Kontrollprobe einschließen. Es wird angenommen, dass PCR und/oder LCR zur Verwendung als ein vorbereitender Amplifizierungsschritt in Konjugation mit jedweder der Techniken, welche zum Nachweisen von hier beschriebenen Mutationen verwendet werden, wünschenswert sein können.
Alternative Amplifizierungsverfahren schließen ein: selbstverlängerte Sequenzreplikation (Guatelli et al., 1990), Transkriptionsamplifizierungssystem (Kwoh et al., 1989); Qβ-Replikase (Lizardi et al., 1988) oder jedwedes andere Nukleinsäureamplifizierungsverfahren, gefolgt vom Nachweis der amplifizierten Moleküle unter Verwendung von Techniken, welche dem Fachmann bekannt sind. Diese Nachweisschemata sind besonders zum Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, welche in geringer Häufigkeit vorhanden sind, nützlich.
Mutationen in WUP von einer Probe können durch Veränderungen in den Restriktionsenzymspaltungsmustern identifiziert werden. Zum Beispiel werden Probe- und Kontroll-DNA isoliert, amplifiziert (gegebenenfalls), mit einer oder mehr Restriktionsendonukleasen verdaut und die Fragmentlängengrößen werden durch Gelelektrophorese bestimmt und verglichen. Unterschiede bei Fragmentlängengrößen zwischen Probe- und Kontroll-DNA zeigen Mutationen in der Proben-DNA. Darüber hinaus kann die Verwendung von speziellen Ribozymsequenzen verwendet werden, um die Gegenwart von speziellen Mutationen durch Entwicklung oder Verlust einer Ribozymspaltungsstelle abzuschätzen.
Das Hybridisieren von Probe- und Kontrollnukleinsäuren, z. B. DNA oder RNA, an Arrays mit hoher Dichte, welche Hunderte oder Tausende von Oligonukleotidsonden enthalten, kann genetische Mutationen in WUP identifizieren (Cronin et al., 1996; Kozal et al., 1996). Zum Beispiel können genetische Mutationen in WUP in zweidimensionalen Arrays, welche leicht erzeugte DNA-Sonden enthalten, wie in Cronin, et al., vorstehend beschrieben, identifiziert werden. Kurz, ein erster Hybridisierungsarray von Sonden kann zum Scannen durch lange DNA-Abschnitte (engl. stretches of DNA) in einer Probe und Kontrolle zum Identifizieren von Basenveränderungen zwischen den Sequenzen durch Anfertigen von linearen Arrays von aufeinanderfolgenden überlappenden Sonden verwendet werden. Dieser Schritt ermöglicht die Identifizierung von Punktmutationen. Diesem folgt ein zweiter Hybridisierungsarray, der die Charakterisierung von speziellen Mutationen unter Verwendung von kleineren, spezialisierten Sondenarrays, welche komplementär zu allen nachgewiesenen Varianten oder Mutationen sind, ermöglicht. Jeder Mutationsarray ist aus parallelen Sondensätzen zusammengesetzt, wobei einer komplementär zum Wildtyp-Gen ist und der andere komplementär zum Mutant-Gen ist.
In noch einer anderen Ausführungsform kann jedwede einer Vielzahl von Sequenzierungsreaktionen, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, zur direkten Sequenzierung des WUP und zum Nachweisen von Mutationen durch Vergleichen der Sequenz des Probe-WUP mit der entsprechenden Wildtyp-(Kontroll)-Sequenz verwendet werden. Beispiele von Sequenzierungsreaktionen schließen jene, welche auf klassischen Techniken basieren, (Maxam und Gilbert, 1977; Sanger et al., 1977) ein. Jedwedes einer Vielzahl von automatisierten Sequenzierungsverfahren kann verwendet werden, wenn diagnostische Tests durchgeführt werden, (Naeve et al., 1995) einschließlich Sequenzieren durch Massenspektrometrie (Cohen et al., 1996; Griffin und Griffin, 1993; Koster, WO 94/16101 , 1994).
Andere Verfahren zum Nachweisen von Mutationen in dem WUP schließen jene ein, in welchen der Schutz vor Spaltungsmitteln zum Nachweisen von fehlerbehafteten Basenpaarungen in RNA/RNA- oder RNA/DNA-Heteroduplexen verwendet wird (Myers et al., 1985). Im Allgemeinen startet die Technik der „Spaltung der fehlerbehafteten Basenpaarung" durch Bereitstellen von Heteroduplexen, welche durch Hybridisieren von (markierter) RNA oder DNA, welche die Wildtyp-WUP-Sequenz enthalten, mit möglicherweise mutanter RNA oder DNA, welche von einer Probe erhalten wurden, gebildet werden. Die doppelsträngigen Duplexe werden mit einem Mittel behandelt, welches die einsträngigen Regionen des Duplexes, wie jene, welche durch fehlerbehaftete Basenpaarungen zwischen den Kontroll- und Probesträngen erzeugt werden, spaltet. Zum Beispiel können RNA/DNA-Duplexe mit RNase behandelt werden und DNA/DNA-Hybride können mit S₁-Nuklease behandelt werden, um die fehlerbehaftet gepaarten Regionen enzymatisch zu verdauen. In anderen Ausführungsformen können entweder DNA/DNA- oder RNA/DNA-Duplexe mit Hydroxylamin oder Osmiumtetroxid und mit Piperidin behandelt werden, um fehlerbehaftet gepaarte Regionen zu verdauen. Das verdaute Material wird dann nach Größe auf denaturierenden Polyacrylamidgelen aufgetrennt, um die Mutationsstelle zu bestimmen (Grompe et al., 1989; Saleeba und Cotton, 1993). Die Kontroll-DNA oder -RNA können für Nachweis markiert werden.
Spaltungsreaktionen von fehlerbehafteten Paarungen können ein oder mehr Proteine, welche fehlerbehaftet gepaarte Basenpaare in doppelsträngiger DNA (Reparatur von fehlerbehaftet gepaarter DNA) erkennen, in definierten Systemen zum Nachweisen von und Aufbauen einer Karte für Punktmutationen in WUP-cDNAs, welche von Zellproben erhalten wurden, verwendet werden. Zum Beispiel spaltete das mutY-Enzym von E. coli A bei G/A-Fehlpaarungen und die Thymidin-DNA-Glycosylase von HeLa-Zellen spaltet T bei G/T-Fehlpaarungen (Hsu et al., 1994). Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform wird eine Sonde, welche auf einer Wildtyp- WUP-Sequenz basiert, mit einer cDNA oder einem anderen DNA-Produkt von einer Testzelle(n) hybridisiert. Der Duplex wird mit DNA-Fehlpaarung-Reparaturenzym behandelt und die Spaltungsprodukte, falls vorhanden, können durch Elektrophoreseprotokolle oder dergleichen nachgewiesen werden (Modrich et al., US Patent Nr. 5,459,039 , 1995).
Elektrophoretische Mobilitätsveränderungen können zur Identifizierung von Mutationen in WUP verwendet werden. Zum Beispiel kann Einzelstrangkonformationspolymorphismus (SSCP) zum Nachweisen von Unterschieden in der elektrophoretischen Mobilität zwischen mutanten und Wildtyp-Nukleinsäuren verwendet werden (Cotton, 1993; Hayashi, 1992; Orita et al., 1989). Einsträngige DNA-Fragmente der Proben- und Kontroll-WUP-Nukleinsäuren werden denaturiert und dann wieder naturiert. Die Sekundärstruktur von einsträngigen Nukleinsäuren variiert gemäß der Sequenz; wobei die resultierende Veränderung in der elektrophoretischen Mobilität einen Nachweis von sogar einer Veränderung einer einzelnen Base ermöglicht. Die DNA-Fragmente können mit markierten Sonden markiert oder nachgewiesen werden. Die Empfindlichkeit des Tests kann durch Verwendung von RNA (statt DNA), wo die Sekundärstruktur für Sequenzveränderungen empfindlicher ist, gesteigert werden. Das betrachtete Verfahren kann Heteroduplexanalyse zur Auftrennung von doppelsträngigen Heteroduplexmolekülen auf der Grundlage der Veränderungen in der elektrophoretischen Mobilität verwenden (Keen et al., 1991).
Die Migration der mutanten oder Wildtyp-Fragmente kann unter Verwendung von denaturierender Gradientengelelektrophorese (DGGE; (Myers et al., 1985) getestet werden. Bei DGGE wird DNA modifiziert, um eine vollständige Denaturierung zu verhindern, zum Beispiel durch Zugeben einer GC-Klammer mit ungefähr 40 bp von hoch-schmelzender GC-reicher DNA, durch PCR. Ein Temperaturgradient kann auch anstelle eines denaturierenden Gradienten zur Identifizierung von Unterschieden in der Mobilität von Kontroll- und Probe-DNA verwendet werden (Rossiter und Caskey, 1990).
Beispiele von anderen Techniken zum Nachweisen von Punktmutationen schließen selektive Oligonukleotidhybridisierung, selektive Amplifizierung oder selektive Primerextension ein. Zum Beispiel können Oligonukleotidprimer hergestellt werden, bei welchen die bekannte Mutation zentral platziert ist, und dann an Ziel-DNA unter Bedingungen, welche eine Hybridisierung nur ermöglichen, wenn eine perfekte Paarung gefunden wird, hybridisiert werden (Saiki et al., 1986; Saiki et al., 1989). Solche Allel-spezifischen Oligonukleotide werden an PCR-amplifizierte Ziel-DNA oder eine Anzahl von unterschiedlichen Mutationen hybridisiert, wenn die Oligonukleotide an die hybridisierende Membran angefügt werden und mit markierter Ziel-DNA hybridisiert werden.
Alternativ kann eine Allel-spezifische Amplifizierungstechnologie, welche von selektiver PCR-Amplifizierung abhängt, verwendet werden. Oligonukleotidprimer für spezielle Amplifizierungen können die Mutation von Interesse im Zentrum des Moleküls (so dass die Amplifizierung von unterschiedlicher Hybridisierung abhängt (Gibbs et al., 1989)) oder am äußersten 3'-Terminus von einem Primer tragen, wo unter geeigneten Bedingungen eine fehlerbehaftete Paarung Polymeraseextension verhindern oder verringern kann (Prosser, 1993). Eine neue Restriktionsstelle in der Region der Mutation kann eingebracht werden, um einen auf Spaltung basierenden Nachweis zu erzeugen (Gasparini et al., 1992). Eine bestimmte Amplifizierung kann auch unter Verwendung von Taq-Ligase für Amplifizierung durchgeführt werden (Barany, 1991). In solchen Fällen tritt Ligierung nur auf, wenn eine perfekte Paarung am 3'-Terminus der 5'-Sequenz vorhanden ist, wodurch ein Nachweis einer bekannten Mutation durch Abschätzung von Amplifizierung möglich ist.
Die beschriebenen Verfahren können zum Beispiel unter Verwendung von vorher abgepackten Kits durchgeführt werden, welche eine Sonde (Nukleinsäure oder Antikörper) umfassen, die praktischerweise zum Beispiel in klinischen Situationen zur Diagnose von Patienten, welche Symptome oder eine Familienkrankengeschichte einer Erkrankung oder Krankheit aufweisen, welche WUP einbeziehen, verwendet werden kann.
Darüber hinaus kann jedweder Zelltyp oder Gewebe, in welchen WUP exprimiert wird, in den hier beschriebenen prognostischen Tests verwendet werden.
3. Pharmakogenomtests
Mittel oder Modulatoren, welche eine stimulierende oder inhibierende Wirkung auf die WUP-Aktivität oder -Expression aufweisen, wie durch einen Screeningtest identifiziert, können an Individuen zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Störungen verabreicht werden. Im Zusammenhang mit einer solchen Behandlung können die Pharmakogenomtests (d. h. die Untersuchung der Beziehung zwischen einem Gentyp eines Empfängers und der Antwort eines Empfängers auf eine fremde Ausführungsart, wie ein Nahrungsmittel, eine Verbindung oder ein Arzneistoff) in Betracht gezogen werden. Metabolische Unterschiede von Therapeutika können zu schwerer Toxizität oder therapeutischem Fehlschlagen durch Verändern der Beziehung zwischen der Dosis und der Blutkonzentration des pharmakologisch aktiven Arzneistoffes führen. So ermöglichen die Pharmakogenomtests an dem Individuum die Auswahl von wirksamen Mitteln (z. B. Arzneistoffen) für prophylaktische oder therapeutische Behandlungen, bezogen auf eine Berücksichtigung des Gentyps eines Individuums. Pharmakogenomtests können ferner zur Bestimmung von geeigneten Dosierungen und therapeutischen Schemata verwendet werden. Demgemäß können die Aktivität von WUP, Expression von WUP-Nukleinsäure oder WUP-Mutation(en) in einem Individuum bestimmt werden, um die Auswahl von geeigneten Mittel(n) für therapeutische oder prophylaktische Behandlung zu leiten.
Pharmakogenomtests beruhen auf klinisch signifikanten angeborenen Variationen in der Antwort auf Ausführungsarten aufgrund von veränderter Ausführungsartdisposition und abnormer Wirkung bei betroffenen Personen (Eichelbaum und Evert, 1996; Linder et al., 1997). Im Allgemeinen können zwei pharmakogenetische Bedingungen unterschieden werden: (1) genetische Bedingungen, welche als ein einzelner Faktor übertragen werden, wobei die Wechselwirkung einer Ausführungsart mit dem Körper verändert wird (veränderte Arzneistoffwirkung) oder (2) genetische Bedingungen, welche als einzelne Faktoren übertragen werden, wobei die Weise, in welcher der Körper auf eine Ausführungsart reagiert (veränderter Arzneistoffmetabolismus), verändert wird. Diese pharmakogenetischen Bedingungen können entweder als seltene Fehler oder als Nukleinsäurepolymorphismen auftreten. Zum Beispiel ist Glucose-6-phosphatdehydrogenase-(G6PD)-Defizienz eine allgemeine ererbte Enzymopathie, wobei die klinische Hauptkomplikation Hämolyse nach Aufnahme von Oxidanz-Arzneistoffen (Antimalariamittel, Sulfonamide, Analgetika, Nitrofurane) und Verzehr von Puffbohnen ist.
Als eine veranschaulichende Ausführungsform ist die Aktivität von Arzneistoffmetabolisierenden Enzymen eine Hauptdeterminante für sowohl die Intensität als auch die Dauer von Arzneistoffwirkung. Die Entdeckung von genetischen Polymorphismen von Arzneistoff-metabolisierenden Enzymen (z. B. N-Acetyltransferase 2 (NAT 2) und die Cytochrom P450-Enzyme CYP2D6 und CYP2C19) erklärt das Phänomen bei einigen Patienten, welche eine übermäßige Arzneistoffantwort und/oder ernsthafte Toxizität nach der Aufnahme der Standard- und sicheren Dosis eines Arzneistoffes zeigen. Diese Polymorphismen drücken sich als zwei Phänotypen in der Bevölkerung aus, den starken Metabolisierer (EM) und schwachen Metabolisierer (PM). Die Verbreitung des PM ist unter verschiedenen Bevölkerungen unterschiedlich. Zum Beispiel ist das CYP2D6-Gen hoch polymorph und mehrere Mutationen wurden bei PM identifiziert, welche alle zur Abwesenheit eines funktionellen CYP2D6 führen. Schwache Metabolisierer aufgrund von CYP2D6- und CYP2C19-Mutanten erfahren häufig übermäßige Arzneistoffantworten und Nebenwirkungen, wenn sie Standarddosen erhalten. Wenn ein Metabolit die aktive therapeutische Einheit ist, zeigt ein PM keine therapeutische Antwort, wie für die analgetische Wirkung von Codein gezeigt, welche durch ihren CYP2D6-gebildeten Metaboliten Morphin vermittelt wird. Das andere Extrem sind die so genannten Ultra-schnellen Metabolisierer, welche auf Standarddosen keine Antwort zeigen. Kürzlich wurde identifiziert, dass die molekulare Basis von ultra-schnellem Metabolismus auf CYP2D6-Genamplifizierung beruht.
Die Aktivität von WUP, die Expression von WUP-Nukleinsäure oder der Mutationsgehalt von WUP in einem Individuum können bestimmt werden, um (ein) geeignete(s) Mittel für eine therapeutische oder prophylaktische Behandlung des Individuums auszuwählen. Zusätzlich können pharmakogenetische Untersuchungen unter Verwendung von Gentypisierung von polymorphen Allelen, welche Arzneistoff-metabolisierende Enzyme kodieren, zur Identifizierung eines Arzneistoffantwortphänotyps eines Individuums verwendet werden. Dieses Wissen, wenn für Dosierungs- und Arzneistoffauswahl verwendet, kann Nebenwirkungen oder therapeutisches Fehlschlagen vermeiden und so die therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit steigern, wenn ein Empfänger mit einem WUP-Modulator, wie einem Modulator, der durch einen der beschriebenen beispielhaften Screeningtests identifiziert wurde, behandelt wird.
4. Überwachen von Wirkungen während klinischen Studien
Das Überwachen des Einflusses von Mitteln (z. B. Arzneistoffen, Verbindungen) auf die Expression oder Aktivität von WUP kann nicht nur beim grundlegenden Arzneistoffscreening, sondern auch bei klinischen Studien verwendet werden. Zum Beispiel kann die Wirksamkeit eines Mittels, welche durch einen Screeningtest bestimmt wurde, zur Erhöhung der WUP-Expression, -Proteinlevels oder zur Regulierung der WUP-Aktivität nach oben in klinischen Studien an Empfängern, welche erniedrigte WUP-Expression, -Proteinlevels oder Regulierung der WUP-Aktivität nach unten aufweisen, überwacht werden. Alternativ kann die Wirksamkeit eines Mittels, welche bestimmt wurde, zur Erniedrigung der WUP-Expression, -Proteinlevels oder zur Regulierung der WUP-Aktivität nach unten in klinischen Studien an Empfängern, welche erhöhte WUP-Expression, -Proteinlevels oder Regulierung der WUP-Aktivität nach unten aufweisen, überwacht werden. In solchen klinischen Studien kann die Expression oder Aktivität von WUP und bevorzugt anderen Genen, welche mit zum Beispiel Krebs in Verbindung gebracht werden, als eine „Anzeige" oder Marker für eine besondere Antwortfähigkeit einer Zelle verwendet werden.
Zum Beispiel können Gene, einschließlich WUP, welche in Zellen durch Behandlung mit einer Ausführungsart (z. B. Nahrungsmittel, Verbindung, Arzneistoff oder kleines Molekül) moduliert werden, identifiziert werden. Zur Untersuchung der Wirkung von Mitteln auf Krebs, zum Beispiel in einer klinischen Studie, können Zellen isoliert werden und RNA kann hergestellt und auf die Levels von Expression von WUP und anderen Genen, welche mit der Störung in Verbindung gebracht werden, analysiert werden. Das Genexpressionsmuster kann durch Northern-Blot-Analyse, Kernuntersuchung oder RT-PCR-Experimente oder durch Messen der Menge an Protein oder durch Messen des Aktivitätslevels von WUP oder anderen Genprodukten quantifiziert werden. In dieser Weise kann das Genexpressionsmuster selbst als ein Marker, welcher die physiologische Zellantwort auf das Mittel zeigt, dienen. Demgemäß kann dieser Antwortzustand vor und zu verschiedenen Zeitpunkten während der Behandlung des Individuums mit dem Mittel bestimmt werden.
Die Wirksamkeit einer Behandlung eines Empfängers mit einem Mittel (z. B. einem Agonisten, Antagonisten, Protein, Peptid, Piptidomimetikum, Nukleinsäure, kleinen Molekül, Nahrungsmittel oder anderem Versuchsarzneistoff, welcher durch die hier beschriebenen Screeningtests identifiziert wurde) kann überwacht werden durch die Schritte von (1) Erhalten einer Probe von einem Emfpänger vor der Verabreichung; (2) Bestimmen des Levels der Expression eines WUP, einer mRNA oder Genom-DNA in der Probe vor der Verabreichung; (3) Erhalten von einer oder mehr Proben von dem Empfänger nach der Verabreichung; (4) Bestimmen des Levels der Expression oder der Aktivität des WUP, der mRNA oder Genom-DNA in den Proben nach der Verabreichung; (5) Vergleichen des Levels der Expression oder Aktivität des WUP, der mRNA oder Genom-DNA in der Probe vor der Verabreichung mit dem von WUP, mRNA oder Genom-DNA in der Probe oder den Proben nach der Verabreichung; und (6) demgemäß Verändern der Abreichung des Mittels an den Empfänger. Zum Beispiel kann eine erhöhte Verabreichung des Mittels zur Erhöhung der Expression oder Aktivität von WUP auf höhere Levels, welche dann bestimmt werden, d. h. zur Erhöhung der Wirksamkeit des Mittels, wünschenswert sein. Alternativ kann eine erniedrigte Verabreichung des Mittels zur Erniedrigung der Expression oder Aktivität von WUP auf niedrigere Levels, welche dann bestimmt werden, d. h. zur Erniedrigung der Wirksamkeit des Mittels, wünschenswert sein.
5. Verwendungen für Behandlung
Prophylaktische und therapeutische Verwendungen können einen Empfänger mit einem Risiko für (oder Empfindlichkeit für) eine Störung oder mit einer Störung, welche mit abweichender WUP-Expression oder -Aktivität in Zusammenhang steht, behandeln. Beispiele schließen Störungen ein, bei welchen Zell-metabolische Anforderungen (und folglich Anforderungen an Mitochondrien und endoplasmatisches Reticulum) hoch sind, wie während schnellem Zellwachstum. Beispiele von solchen Störungen und Erkrankungen schließen Krebs, wie Melanome, Brustkrebs oder Darmkrebs, ein.
6. Erkrankung und Störungen
Erkrankungen und Störungen, welche durch erhöhte Levels oder biologische Aktivität von WUP gekennzeichnet sind, können mit Therapeutika behandelt werden, welche Aktivität antagonisieren (d. h. verringern oder inhibieren). Antagonisten können in einer therapeutischen oder prophylaktischen Weise verabreicht werden. Therapeutika, welche verwendet werden können, schließen ein: (1) WUP-Peptide oder Analoga, Derivate, Fragmente oder Homologe davon; (2) Abs zu einem WUP-Peptid; (3) WUP-Nukleinsäuren; (4) Verabreichung von Antisense-Nukleinsäure und -Nukleinsäuren, welche „dysfunktionell" sind (d. h. aufgrund einer heterologen Insertion in den Kodiersequenzen), welche zur Beseitigung von endogener Funktion durch homologe Rekombination verwendet werden (Capecchi, 1989); oder (5) Modulatoren (d. h. Inhibitoren, Agonisten und Antagonisten, einschließlich ein zusätzliches Peptidmimetikum oder Abs, welche spezifisch für WUP sind), welche die Wechselwirkung zwischen WUP und seinem Bindungspartner verändern.
Erkrankungen und Störungen, welche durch erniedrigte Levels oder biologische Aktivität von WUP gekennzeichnet sind, können mit Therapeutika, welche die Aktivität erhöhen (d. h. Agonisten sind), behandelt werden. Therapeutika, welche die Aktivität nach oben regulieren, können therapeutisch oder prophylaktisch verabreicht werden. Therapeutika, welche verwendet werden können, schließen Peptide oder Analoga, Derivate, Fragmente oder Homologe davon; oder einen Agonisten, der die Bioverfügbarkeit erhöht, ein.
Erhöhte oder erniedrigte Levels können leicht durch Quantifizieren von Peptid und/oder RNA durch Erhalten einer Patientengewebeprobe (z. B. von Biopsiegewebe) und Testen in vitro auf RNA- oder Peptidlevels, Struktur und/oder Aktivität der exprimierten Peptide (oder WUP-mRNAs) nachgewiesen werden. Verfahren schließen Immuntests (z. B. durch Western-Blot-Analyse, Immunopräzipitation, gefolgt von Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Immunocytochemie, usw.) und/oder Hybridisierungstests, um Expression von mRNAs nachzuweisen (z. B. Northern-Tests, Dot-Blots, in situ-Hybridisierung und dergleichen) ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
7. Prophylaktische Verfahren
Empfänger mit einem Risiko für eine Erkrankung, welche durch abweichende WUP-Expression oder -Aktivität verursacht wird oder zu welcher dadurch beigetragen wird, können durch zum Beispiel jedweden oder eine Kombination von diagnostischen oder prognostischen Tests identifiziert werden. Eine Verabreichung eines prophylaktischen Mittels kann vor dem Auftreten von Symptomen, welche für die WUP-Abweichung charakteristisch sind, stattfinden, so dass eine Erkrankung oder Störung verhindert oder alternativ in seinem Fortschreiten verzögert wird. Abhängig vom Typ der WUP-Abweichung kann zum Beispiel ein WUP-Agonist oder WUP-Antagonist zur Behandlung des Empfängers verwendet werden. Das geeignete Mittel kann basierend auf Screeningtests bestimmt werden.
8. Therapeutische Verfahren
Eine andere Ausfürungsform der Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren von WUP-Expression oder -Aktivität für therapeutische Zwecke. Ein Mittel, welches WUP-Aktivität moduliert, kann eine Nukleinsäure oder ein Protein, ein natürlich vorkommender verwandter Ligand von WUP, ein Peptid, ein WUP-Peptidomimetikum oder ein anderes kleines Molekül sein. Das Mittel kann die WUP-Aktivität stimulieren. Beispiele von solchen stimulierenden Mitteln schließen aktives WUP und ein WUP- Nukleinsäuremolekül, welches in die Zelle eingebracht wurde, ein. In einer anderen Ausführungsform inhibiert das Mittel die WUP-Aktivität. Beispiele von inhibierenden Mitteln schließen Antisense-WUP-Nukleinsäuren und anti-WUP-Abs ein. Modulatorische Verfahren können in vitro (z. B. durch Kultivieren der Zelle mit dem Mittel) oder alternativ in vivo (z. B. durch Verabreichen des Mittels an einen Empfänger) durchgeführt werden. So stellt die Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Mitteln, welche zur Behandlung eines Individuums geeignet sind, das das Gebrechen einer Erkrankung oder Störung aufweist, welche durch abweichende Expression oder Aktivität eines WUP oder -Nukleinsäuremoleküls gekennzeichnet sind, bereit. In dieser Hinsicht kann ein Mittel (z. B. ein Mittel, welches durch einen Screeningtest identifiziert wird) oder eine Kombination von Mitteln, welche WUP-Expression oder -Aktivität modulieren (z. B. nach oben regulieren oder nach unten regulieren), verwendet werden. Alternativ kann ein WUP oder -Nukleinsäuremolekül als Therapie zur Kompensierung von verringerter oder abweichender WUP-Expression oder -Aktivität verwendet werden.
Stimulation von WUP-Aktivität ist in Situationen wünschenswert, in welchen WUP anomal nach unten reguliert ist und/oder in welchen wahrscheinlich ist, dass eine erhöhte WUP-Aktivität eine vorteilhafte Wirkung hat.
9. Bestimmung der biologischen Wirkung des Therapeutikums
Geeignete in vitro- oder in vivo-Tests können zur Bestimmung der Wirkung eines speziellen Therapeutikums und, ob seine Verabreichung zur Behandlung des beeinflussten Gewebes angezeigt ist, durchgeführt werden.
In verschiedenen speziellen Ausführungsformen können in vitro-Tests mit repräsentativen Zellen de(s/r) Typ(s/en), welche in die Störung des Patienten einbezogen sind, durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob ein gegebenes Therapeutikum die gewünschte Wirkung auf den/die Zelltyp(en) ausübt. Ausführungsarten zur Verwendung in der Therapie können in geeigneten Tiermodellsystemen, welche Ratten, Mäuse, Hühnchen, Rinder, Affen, Kaninchen und dergleichen einschließen, aber nicht darauf eingeschränkt sind, vor dem Testen in humanen Empfängern getestet werden.
10. Prophylaktische und therapeutische Verwendungen der Zusammensetzungen der Erfindung
WUP-Nukleinsäuren und -Proteine sind in potentiellen prophylaktischen und therapeutischen Verwendungen, welche mit einer Vielzahl von Störungen in Verbindung gebracht werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf Krebs, nützlich.
Als ein Beispiel kann eine cDNA, welche WUP kodiert, bei Gentherapie nützlich sein, und das Protein kann nützlich sein, wenn es an einen Empfänger, der dessen bedarf, verabreicht wird. Als nicht-einschränkendes Beispiel werden die Zusammensetzungen der Erfindung Wirksamkeit bei der Behandlung von Patienten, welche an Krebs leiden, haben.
WUP-Nukleinsäuren oder Fragmente davon können auch in diagnostischen Verwendungen nützlich sein, wobei die Gegenwart oder Menge der Nukleinsäure oder des Proteins abgeschätzt werden. Eine weitere Verwendung kann als ein antibakterielles Molekül sein (d. h. es wurden einige Peptide gefunden, welche antibakterielle Eigenschaften aufweisen). Diese Materialien sind ferner zur Erzeugung von Abs, welche immunspezifisch an die neuen Substanzen der Erfindung binden, zur Verwendung in therapeutischen oder diagnostischen Verfahren nützlich.
BEISPIEL
Die folgenden experimentellen Details des Beispiels können in (Pennica et al., 1998) gefunden werden.
Wnt-Proteine vermitteln diverse Entwicklungsprozesse wie die Kontrolle der Zellproliferation, Adhäsion, Zellpolarität und die Etablierung von vorbestimmten Zelleigenschaften. Obwohl Wnt-1 nicht in der normalen Brustdrüse exprimiert wird, kann eine Expression von Wnt-1 in transgenen Mäusen Brusttumore verursachen.
Eine auf PCR basierende cDNA-Subtraktionsstrategie, subtraktive Suppressionshybridisierung (SSH), (Diatchenko et al., 1996) verwendet RNA, welche von C57MG-Mäusebrustepithelzellen isoliert wurde, und C57MG-Zellen, welche stabil mit einem Wnt-1-Retrovirus transformiert wurden. Überexpression von Wnt-1 in dieser Zelllinie ist ausreichend, um einen teilweise transformierten Phänotyp zu induzieren, der durch längliche und refraktile Zellen gekennzeichnet ist, welche Kontaktinhibierung verlieren und einen mehrschichtigen Array bilden (Brown et al., 1986; Wong et al., 1994). Es ist wahrscheinlich, dass Gene, welche unterschiedlich in diesen zwei Zelllinien exprimiert werden, zu dem transformierten Phänotyp beitragen.
1. Verfahren
SSH. SSH wurde unter Verwendung des PCR-Select cDNA Subtraction Kit (CLONTECH) durchgeführt. Doppelsträngige Tester-cDNA wurde aus 2 μg poly(A)⁺-RNA, isoliert aus der C57MG/Wnt-1-Zelllinie, synthetisiert und Driver-cDNA aus 2 μg poly(A)⁺-RNA aus den C57MG-Mutterzellen. Die Subtraktion-cDNA-Bibliothek wurde in einen pGEM-T-Vektor für weitere Analyse subkloniert.
Expression von humaner WUP-RNA. PCR-Amplifizierung von Erststrang-cDNA wurde mit humanen Multiple Tissue cDNA-Feldern (CLONTECH) und 300 μM von jeweils dNTP bei 94°C für 1 sec, 62°C für 30 sec, 72°C für 1 min für 22 bis 32 Zyklen durchgeführt.
Genamplifizierung und RNA-Expressionsanalyse. Relative Genamplifizierung und RNA-Expression von WUP und c-myc in den Zelllinien wurden durch quantitative PCR bestimmt. Gen-spezifische Primer und fluorogene Sonden wurden designed und zur Amplifizierung und Quantifizierung der Gene verwendet. Das Verfahren wurde zur Berechnung der SE der RNA-Expressionslevels verwendet. Das WUP-spezifische Signal wurde auf das des Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Haushaltsgens normalisiert. Alle TaqMan-Testreagenzien wurden von Perkin-Elmer Applied Biosystems erhalten.
2. Ergebnisse
Zur Identifizierung von Wnt-1-induzierbaren Genen wurde die SSH-Technik unter Verwendung der Mäusebrustepithelzelllinie C57MG und C57MG-Zellen, welche stabil Wnt-1 und Wnt-4 exprimieren, verwendet. Versuchsverbindungen, welche unterschiedlich cDNAs (insgesamt 1.384) exprimierten, wurden sequenziert. Neununddreißig Prozent der Sequenzen stimmten mit bekannten Genen oder Homologen überein, 32% stimmten mit exprimierten Markierungssequenzen überein und für 29% gab es keine Übereinstimmung. Um zu bestätigen, dass das Transkript unterschiedlich exprimiert wurde, wurde halbquantitative Umkehrtranskription-PCR-Analyse unter Verwendung von mRNA von den C57MG- und C57MG/Wnt-1-Zellen durchgeführt.
Die SSH-Technik bestätigte, dass WUP in Wnt-1-exprimierenden Zellen im Vergleich zur Expression in Wildtyp- oder Wnt-4-exprimierenden C57MG-Zellen 2,3-fach nach oben reguliert war. Quantitative PCR-Analyse (TaqMan) bestätigte die Regulierung nach oben, was einen 1,4-fachen Anstieg bei Wnt-1-exprimierenden Zellen im Gegensatz zu Wildtyp- oder Wnt-4-exprimierenden Zellen ergibt.
DRUCKSCHRIFTEN

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Claims

Isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zur Sequenz SEQ ID Nr. 6 oder 8, wobei das Polypeptid ein aktives WUP-(Wnt1 nach oben reguliertes)-Polypeptid ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz mindestens 90% Sequenzidentität zur Sequenz SEQ ID Nr. 6 oder 8 aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz mindestens 98% Sequenzidentität zur Sequenz SEQ ID Nr. 6 oder 8 aufweist.
Isoliertes Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von Tabelle 6 (SEQ ID Nr. 39), welche den Aminosäuren 51 bis 126 von SEQ ID Nr. 6 entspricht.
Isoliertes chimäres Polypeptid, umfassend ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, welches mindestens 80% Sequenzidentität zur Sequenz SEQ ID Nr. 6 oder 8 aufweist, fusioniert an ein Nicht-WUP-Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Glutathion-S-transferase, Immunglobulinprotein oder Fragmenten davon, humanem Wachstumshormon, β-Glucuronidase, grünem fluoreszenztem Protein, Luziferase, Chloramphenicolacetyltransferase, β-Galactosidase und sekretierter alkalischer Phosphatase besteht.
Isoliertes Polynukleotid, kodierend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, oder ein Komplement des Polynukleotid.
Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz mit mindestens 90% Sequenzidentität zur Sequenz SEQ ID Nr. 5 oder mindestens 80% Sequenzidentität zur Sequenz SEQ ID Nr. 7, oder ein Komplement des Polynukleotids.
Polynukleotid nach Anspruch 7, wobei die Nukleotidsequenz mindestens 98% Sequenzidentität zur Sequenz SEQ ID Nr. 5 oder 7 aufweist, oder ein Komplement des Polynukleotids.
Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bindet.
Verfahren zur Bestimmung, ob eine Verbindung die Transkription eines Gens, welches SEQ ID Nr. 5 oder 7 umfasst, nach oben reguliert oder nach unten reguliert, umfassend: das Inkontaktbringen der Verbindung mit einer Zusammensetzung, welche eine RNA-Polymerase und das Gen umfasst, und das Messen der Menge des Polynukleotids, welches einer mRNA von SEQ ID Nr. 5 oder 7 entspricht, und das Messen des Umfangs der Gentranskription.
Verfahren zur Bestimmung, ob eine Verbindung die Translation von SEQ ID Nr. 5 oder 7 nach oben reguliert oder nach unten reguliert, umfassend: das Inkontaktbringen der Verbindung mit einer Zusammensetzung, umfassend ein Ribosom und ein Polynukleotid, welches einer mRNA von SEQ ID Nr. 5 oder 7 entspricht, und das Messen des Umfangs der Gentranslation.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Zusammensetzung in einer Zelle ist.
Vektor, umfassend eines der Polynukleotide nach den Ansprüchen 6 bis 8.
Zelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 13.
Verfahren zum Screenen einer Gewebeprobe auf ein die Tumorgenese förderndes Potential, umfassend: das Messen der Expression eines Polynukleotids, umfassend SEQ ID Nr. 5 oder 7, in der Gewebeprobe.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Messen das Messen einer Menge von mRNA, welche ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 6 oder 8 umfasst, ist.
Transgenes nicht-humanes Tier mit mindestens einem unterbrochenen WUP-Gen, umfassend SEQ ID Nr. 5 oder 7.
Transgenes nicht-humanes Tier nach Anspruch 17, wobei das nicht-humane Tier eine Maus ist.
Transgenes nicht-humanes Tier, umfassend ein exogenes Polynukleotid mit mindestens 80% Sequenzidentität zur Sequenz SEQ ID Nr. 5 oder 7 oder ein Komplement des Polynukleotids.
Transgenes nicht-humanes Tier nach Anspruch 19, wobei das exogene Polynukleotid mindestens 90% Sequenzidentität zur Sequenz SEQ ID Nr. 5 oder 7 aufweist, oder ein Komplement des Polynukleotids, bevorzugt mindestens 98% Sequenzidentität zur Sequenz SEQ ID Nr. 5 oder 7 aufweist, oder ein Komplement des Polynukleotids.
In vitro-Verfahren zum Screenen einer Probe auf eine WUP-Genmutation, umfassend: das Nachweisen der Expression einer WUP-Polynukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 8; und das Vergleichen einer WUP-Polynukleotidsequenz in der Probe mit einer Polynukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 oder 7, um eine WUP-Genmutation zu identifizieren.
Verfahren zum Bestimmen des klinischen Tumorstadiums, umfassend das Vergleichen der Expression eines WUP-Polynukleotids nach einem der Ansprüche 6 bis 8 in einer Probe mit der Expression von SEQ ID Nr. 5 oder 7 in Kontrollproben.
Verfahren zum Nachweisen eines Wnt-1 nach oben regulierten Polypeptids in einer biologischen Probe, umfassend: a) das Nachweisen der Expression des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 6 bis 8 in einer biologischen Probe; und b) das Vergleichen der Expression des Polynukleotids mit der einer Kontrollprobe, um zu bestimmen, ob die Expression des Polynukleotids nach oben reguliert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Expression des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 6 bis 8 durch eine Nukleinsäuresonde, welche an das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 6 bis 8 unter stringenten Bedingungen bindet, nachgewiesen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Expression des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 6 bis 8 durch mindestens ein Oligonukleotid, welches das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 6 bis 8 amplifizieren kann, nachgewiesen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 23, wobei die Expression des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 6 bis 8 durch einen Antikörper nach Anspruch 9 nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Antikörper nachweisbar markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Markierung eine radioaktive Einheit oder eine fluoreszente Einheit ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 28, wobei die Probe von einem Tumor stammt.
Kit zum Nachweisen der Regulation nach oben von einem Wnt-1 nach oben regulierten Polypeptid, umfassend ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 oder ein Komplement davon oder einen Antikörper gemäß Anspruch 9, zum Nachweisen der Expression des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 6 bis 8 in einer biologischen Probe.
Kit nach Anspruch 30, wobei das Polynukleotid oder ein Komplement davon als ein Primer zum Amplifizieren des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 6 bis 8 dienen kann.
Kit nach Anspruch 30, wobei der Antikörper nachweisbar markiert ist.
Kit nach Anspruch 32, wobei der Antikörper mit einer radioaktiven oder fluoreszenten Einheit markiert ist.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 6 oder 8.