KR102282691B1 - 개변된 헬퍼 파지를 사용하여 항원 결합 분자를 제작하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항원 결합 분자를 제시하는 박테리오파지를 제작하는 방법으로, 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지를 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아에 접촉시키는 공정을 포함하며, 당해 제1 폴리펩티드와 당해 제2 폴리펩티드가 회합하여 당해 항원 결합 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.

Description

개변된 헬퍼 파지를 사용하여 항원 결합 분자를 제작하는 방법{Method for producing antigen-binding molecule using modified helper phage}
[관련출원]
본 특허출원은 2013년 9월 30일에 출원된 일본국 특허출원 제2013-203528호에 기초하는 우선권 주장을 수반하는 것으로, 이러한 선특허출원에서의 모든 개시 내용은 채용함으로써 본 명세서의 일부로 한다.
본 발명은 일태양에 있어서, 항원 결합 분자를 제시하는 박테리오파지를 제작하는 방법 등에 관한 것이다.
항체는 혈장 중에서의 안정성이 높고, 부작용도 적은 점에서 의약품으로서 주목받고 있다. 그 중에서도 IgG형의 항체 의약은 다수 시판되고 있으며, 현재도 수많은 항체 의약이 개발되고 있다(비특허문헌 1 및 비특허문헌 2). 한편, 제2세대의 항체 의약에 적용 가능한 기술로서 다양한 기술이 개발되어 있고 이펙터 기능, 항원 결합능, 약물동태 또는 안정성을 향상시키거나 또는 면역원성 리스크를 저감시키는 기술 등이 보고되고 있다(비특허문헌 3).
항체를 고기능화시키는 방법의 하나로서, 이중특이성 항체(바이스페시픽 항체, bispecific antibody; BsAb) 등의 다중특이성 항체가 근래 주목을 모으고 있다. BsAb는 1개의 분자 내에 2개의 다른 항원 결정기(에피토프)에 결합 가능한 부위를 가짐으로써 2종류의 항원과 결합할 수 있는 다가 항체의 일종이다.
BsAb에는 통상 2종류의 H쇄와 2종류의 L쇄가 포함되나, BsAb를 제조할 때의 문제점으로, 그들 H쇄와 L쇄를 하나의 세포에 도입하여 발현시킨 경우, 면역 글로불린의 H쇄 및 L쇄가 무작위로 조합되기 때문에 10종류의 다른 항체 분자가 생산될 가능성이 있다(비특허문헌 4, 특허문헌 1). 생산된 10종류의 항체 중 목적하는 이중특이성을 갖는 항체는 바른 H쇄와 L쇄가 조합되고 또한 결합 특이성이 다른 2조의 H쇄 및 L쇄 쌍이 조합함으로써 구성된 1종류의 항체뿐이다.
이와 같은 과제를 해결하기 위한 방법으로 생산된 H쇄를 효율적으로 헤테로다이머화하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면 2개의 CH3 도메인에 서로 입체적으로 상보적인 구조를 도입하는 방법(비특허문헌 5, 특허문헌 2)；IgG와 IgA의 CH3 도메인이 서로 결합하지 않는다는 성질을 이용하여 2개의 CH3 도메인을 IgG 유래의 서열과 IgA 유래의 서열로 번갈아 치환함으로써 목적하는 조합만을 제작하는 방법(SEEDbodies: 비특허문헌 6)；CH3 도메인에 변이를 도입함으로써 2개의 H쇄의 전하적 상호작용을 이용하여 헤테로다이머화를 촉진하는 방법(특허문헌 3) 등이 알려져 있다.
그러나, 이들 방법으로 제조된 H쇄도 여전히 잘못된 L쇄와 쌍을 형성할 수 있다. 이에 H쇄의 헤테로다이머화를 촉진하면서 공통의 L쇄를 갖는 다중특이성 항체를 제조하는 방법이 보고되고 있다. 공통의 L쇄를 취득하는 방법으로, L쇄의 라이브러리를 제작하고 그것을 2개의 항체의 H쇄와 연속적으로 조합하여 각각의 항원에 결합 가능한 항체를 스크리닝함으로써 공통 L쇄를 취득하는 방법(특허문헌 4)；L쇄의 레퍼토리가 제한된 항체 라이브러리로부터 다른 항원에 결합하는 항체를 취득하고 그들 중에서 동일한 L쇄를 갖는 항체를 선택하는 방법(비특허문헌 7, 특허문헌 1)；2종류의 항체 L쇄의 CDR을 셔플링한 키메라 L쇄를 제작하여 양쪽 항원에 결합 가능한 공통 L쇄를 스크리닝하는 방법(비특허문헌 8)；특정의 L쇄 유전자가 도입된 형질전환 마우스에 면역하여 L쇄가 공통인 항체를 취득하는 방법(특허문헌 5, 특허문헌 6)；특정의 L쇄 유전자가 도입되고 H쇄만이 다양성을 갖는 항체 라이브러리로부터 다른 항원에 결합하는 항체를 취득하여 L쇄가 공통인 항체를 취득하는 방법(비특허문헌 14) 등이 알려져 있다.
또한 다른 방법으로, H쇄와 L쇄의 불변영역을 개변함으로써 선택적인 헤테로다이머화를 촉진하는 방법(특허문헌 3)；H쇄 가변영역/L쇄 가변영역(VH/VL) 또는 H쇄 불변영역 CH1/L쇄 불변영역(CH1/CL)을 교체함으로써 목적하는 헤테로다이머만을 제작하는 방법(Crossmab: 특허문헌 7)；2종류의 항체를 조제한 후, 인 비트로(in vitro)에서 디설피드 결합을 이성화시킴으로써 이중특이성 항체를 제작하는 방법(DuoBody: 특허문헌 8) 등도 알려져 있다.
또한 공통의 H쇄를 취득하는 방법에 관련하여 공통 H쇄 라이브러리 및 L쇄 라이브러리를 사용하여 다양한 항원에 대한 항체를 취득 후에 공통 H쇄와 2종류의 L쇄(κ쇄, λ쇄)에 의해 이중특이성 항체를 제작하는 방법이 알려져 있다(Kappa-Lambda Body：특허문헌 11).
또한 동일 항원에 대해 다른 에피토프를 인식하는 항체를 취득하여 바이스페시픽 항체(특히 바이파라토픽 항체, biparatopic antibody)로서의 이용도 생각할 수 있다. 항원에 바이파라토픽 항체가 결합함으로써, 항원이 단체여도 바이파라토픽 항체에 의해 가교되어 면역 복합체(Immune complex; IC)를 형성시킬 수 있다. 생체내에서 면역 복합체를 형성시킴으로써, 당해 면역 복합체의 혈중으로부터의 신속한 클리어런스가 기대된다(특허문헌 9).
한편, 항원 결합 분자를 취득하는 방법의 하나로서 파지 제시(파지 디스플레이) 기술이 널리 채용되고 있다. 파지 제시 기술은, 예를 들면 항체의 H쇄 가변영역 및 L쇄 가변영역을 박테리오파지의 입자 상에 제시하는 기술이다. 본 기술을 사용하여 서열이 다른 항체를 제시하는 다수의 박테리오파지의 집단(파지 항체 라이브러리)을 제작하고, 그들 중에서 임의의 항원에 결합하는 항체를 선택(선별)함으로써 목적하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 취득할 수 있다.
파지 제시 기술에 사용되는 대표적인 파지는 섬유상 파지 M13이다. 파지 입자 상으로의 항체의 제시는 통상 g3p 등의 파지의 코트 단백질을 코드하는 유전자에 항체의 H쇄 가변영역의 유전자 및 L쇄 가변영역의 유전자가 연결된 것을 파지미드 벡터에 삽입하여 그것을 대장균에 도입하고, 거기에 헬퍼 파지를 감염시킴으로써 행할 수 있다. 파지 항체 라이브러리로부터의 항체의 스크리닝은 고정화한 항원과 항체 라이브러리를 혼합하여 결합, 세정, 용출의 조작(패닝, panning)을 행함으로써 항원에 결합 가능한 항체를 제시한 파지를 선택(선별)할 수 있다. 회수한 파지는 숙주인 대장균 등에 감염시켜 증폭시키는 것이 가능하며, 그와 같이 하여 증폭된 파지를 사용하여 패닝을 반복해서 행함으로써 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 비율을 높여갈 수 있다(비특허문헌 9).
파지 디스플레이의 방법으로 항체 단편을 취득할 때는 통상, Fab 또는 단일 사슬 Fv(scFv)와 파지 코트 단백질의 융합 단백질의 형태로 항체 라이브러리를 제작한다. 당초는 박테리오파지의 모든 유전자 정보를 포함하는 파지 벡터가 사용되었지만, 현재는 파지미드 벡터를 사용한 방법이 일반적이 되었다. 파지미드 벡터는 파지 벡터에 비해 사이즈가 작은 플라스미드 벡터이다. 제시하고자 하는 단백질을 코드하는 유전자를 gene 3나 gene 8 등의 파지 코트 단백질을 코드하는 유전자의 N말단측에 연결한 유전자가 파지미드 벡터에 삽입된다. 파지 디스플레이의 방법에 있어서는 제시되는 단백질을 코드하는 유전자가 파지 입자 내에 패키징될 필요가 있기 때문에 파지미드 벡터 상에는 파지의 패키징 시그널이 필요하다. 또한 파지미드 벡터를 포함하는 대장균으로부터 파지를 생산시키기 위해서는 파지의 구조 단백질 등을 공급하는 M13KO7이나 VCSM13 등의 헬퍼 파지를 감염시킬 필요가 있다.
이와 같이 제작한 파지 항체 라이브러리를 사용하여, 대상으로 하는 항원에 고친화성의 항체 단편을 동정하는 방법으로 사슬 셔플링이 사용되어도 된다. 이 방법에서는, 예를 들면 항체의 항원 결합 부위(예를 들면 L쇄 가변영역)를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이 생성에 의해 다양화되는 한편, 항체의 다른 항원 결합 부위(예를 들면 H쇄 가변영역)를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 고정된다. 이는 예를 들면 대상으로 하는 항원에 결합하는 항체의 H쇄 가변영역을 코드하는 야생형의 폴리뉴클레오티드를, 다양화된 L쇄 가변영역의 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 갖는 파지 디스플레이 벡터계에 클로닝하고, 이어서 항원에 대해 고친화성으로 결합하는 것을 스크리닝함으로써 달성할 수 있다. 전형적으로는, 맨 먼저 H쇄 가변영역을 고정하면서 L쇄 가변영역을 셔플링한다. 이와 같은 L쇄 셔플링을 이용한 항체의 친화성 성숙(affinity maturation)의 방법으로는, pLf1T-3(L쇄) 파지미드 벡터와 pHg3A-3(H쇄-gene 3) 플라스미드의 세트로 이루어지는 dual-vector system-Ⅲ(DVS-Ⅲ)를 사용하는 수법(비특허문헌 15)；H쇄 가변영역의 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 항원에 대해 패닝 조작을 행한 후, 패닝 조작에 의해 농축한 H쇄 가변영역에 대해 라이브러리화한 VL 유전자를 조합하여 재차 패닝 조작을 행하는 수법(비특허문헌 16)을 들 수 있다.
또한 파지 디스플레이법은 대상으로 하는 항원에 결합하는 비인간 동물 유래 항체를 인간화하기 위한 수단으로서도 사용되고 있다. 예를 들면 마우스에 면역하여 얻어진 항체의 H쇄를 고정하여 인간 나이브 유래 L쇄 항체 라이브러리와 조합하고 항원에 대해 패닝 조작을 행함으로써 얻어진 인간 유래 항체 L쇄를 얻고, 이어서 L쇄를 고정하여 인간 나이브 유래 H쇄 항체 라이브러리와 조합하고 항원에 대해 재차 패닝 조작을 행함으로써 추가로 인간 유래 항체 H쇄를 취득할 수 있다. 이와 같이 순차적으로 인간 항체 라이브러리와 치환함으로써 비인간 동물 유래 항체를 기반으로 인간 항체를 취득하는 것이 가능하다(비특허문헌 17).
헬퍼 파지의 유전자를 개변하여 파지 디스플레이를 개량한 예에 대해서는 몇 가지의 보고가 있다. 예를 들면 Hyper phage(비특허문헌 10), CT helper phage(비특허문헌 11), Ex-phage(비특허문헌 12) 등이 알려져 있다. 또한 박테리오파지의 게놈에 외래 유전자를 도입한 예로서 약제 내성 유전자를 저해하는 물질을 코드하는 유전자를 도입한 예가 보고되어 있다(비특허문헌 13, 특허문헌 10). 그러나, 헬퍼 파지를 개변하여 L쇄 또는 H쇄가 공통인 항체를 취득하는 데 적합한 새로운 파지 디스플레이법을 구축하였다고 하는 보고는 현재까지 없다.
WO98/50431 A2 WO96/27011 A1 WO2006/106905 A1 WO2004/065611 A1 WO2011/097603 A1 US2010/0146647 A1 WO2009/080251 A1 WO2008/119353 A1 WO2013/081143 A1 WO2009/108406 A2 WO 2012023053 A2
Nat Biotechnol(2005) 23, 1073-1078 Eur J Pharm Biopharm(2005) 59, 389-396 Mol Cells(2005) 20, 17-29 Methods Enzymol(1986) 121, 210-228 Protein Eng(1996) 9, 617-621 Protein Eng Des Sel(2010) 23, 195-202 Nat Biotechnol(1998) 16, 677-681 PLoS One(2013) 8, e57479 Methods Enzymol(1993) 217, 228-257 Nat Biotechnol(2001) 19, 75-78 Nucleic Acids Res(2003) 31, e59 Nucleic Acids Res(2002) 30, e18 Proc Natl Acad Sci U S A(2009) 106, 4629-4634 J Biol Chem. 2010 Jul 2;285(27):20850-9 Immunol Lett. 2010 Aug 16;132(1-2):24-30 Protein Eng Des Sel. 2011 Sep;24(9):691-700 J Mol Biol. 2000 Feb 25;296(3):833-49
본 발명은 이와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 일태양에 있어서 2개의 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 분자에 있어서 한쪽 폴리펩티드(제1 폴리펩티드)가 공통이고, 다른 쪽 폴리펩티드(제2 폴리펩티드)가 다른 복수의 항원 결합 분자를 효율적으로 취득하는 신규한 방법을 제공한다.
본 발명자는 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 복수의 항원 결합 분자를 효율적으로 제작하는 방법에 대해서 예의 연구를 행한 결과, 놀랍게도 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지 및 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아를 제작하여 당해 헬퍼 파지를 당해 박테리아에 감염시킴으로써, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드로부터 형성되는 항원 결합 분자를 제시하는 박테리오파지를 제작할 수 있음을 발견하였다. 이때, 아미노산 서열이 다른 복수의 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아 집단을 제작하여 그들에 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지를 감염시킴으로써, 제1 폴리펩티드는 아미노산 서열이 공통이고, 제2 폴리펩티드는 아미노산 서열이 다른 항원 결합 분자를 제시하는 박테리오파지의 집단(항원 결합 분자 제시 라이브러리)을 제작할 수 있음을 발견하였다. 또한 그와 같이 하여 제작된 항원 결합 분자 제시 라이브러리로부터 목적하는 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 취득할 수 있음을 발견하였다. 당해 항원 결합 분자 제시 라이브러리로부터 복수의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 각각 취득함으로써, 당해 복수의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 다중특이성 항원 결합 분자로, 제1 폴리펩티드가 각 항원 결합 분자에 있어서 공통되는 다중특이성 항원 결합 분자를 제작할 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 이와 같은 지견(知見)을 토대로 완성시킨 것으로, 구체적인 태양에 있어서, 예를 들면 아래의 발명에 관한 것이다.
〔1〕항원 결합 분자를 제시하는 박테리오파지를 제작하는 방법으로, 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지를 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아에 접촉시키는 공정을 포함하고, 당해 제1 폴리펩티드와 당해 제2 폴리펩티드가 회합(association)하여 당해 항원 결합 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
〔2〕헬퍼 파지의 게놈 중에 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는,〔1〕에 기재된 방법.
〔3〕제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는,〔1〕또는〔2〕에 기재된 방법.
〔4〕제1 폴리펩티드가 파지의 코트 단백질과 융합되어 있는,〔1〕내지〔3〕중 어느 한 항에 기재된 방법.
〔5〕헬퍼 파지가 M13KO7인, 〔1〕내지〔4〕중 어느 한 항에 기재된 방법.
〔6〕박테리아가 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는,〔1〕내지〔5〕중 어느 한 항에 기재된 방법.
〔7〕제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 파지미드 벡터에 삽입되어 있는,〔1〕내지〔6〕중 어느 한 항에 기재된 방법.
〔8〕제2 폴리펩티드가 파지의 코트 단백질과 융합되어 있는,〔1〕내지〔7〕중 어느 한 항에 기재된 방법.
〔9〕항원 결합 분자가 항체 가변영역인,〔1〕내지〔8〕중 어느 한 항에 기재된 방법.
〔10〕제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 L쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드 및 H쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 각각 선택되고, 또한 서로 다른,〔9〕에 기재된 방법.
〔11〕L쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드가 추가로 L쇄 불변영역을 포함하는 폴리펩티드이고, 또한/또는 H쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드가 추가로 H쇄 불변영역을 포함하는 폴리펩티드인,〔10〕에 기재된 방법.
〔12〕공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작하는 방법으로, 아래의 공정을 포함하는 방법：
(a)〔1〕내지〔11〕중 어느 한 항에 기재된 방법을 복수회 행하는 공정으로, 당해 공정에 있어서 사용되는 복수의 박테리아는 아미노산 서열이 다른 복수의 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아 집단이고, 또한 당해 공정에 있어서 사용되는 헬퍼 파지는 같은 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지인 공정, 및
(b) 공정(a)에서 제작된 항원 결합 분자를 제시하는 복수의 박테리오파지를 회수하는 공정.
〔13〕〔12〕에 기재된 방법으로 제작된 항원 결합 분자 제시 라이브러리.
〔14〕소정의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 취득하는 방법으로, 아래의 공정을 포함하는 방법：
(a)〔13〕에 기재된 항원 결합 분자 제시 라이브러리에 항원을 접촉시키는 공정, 및
(b) 당해 항원 결합 분자 제시 라이브러리 중에서 당해 항원에 결합하는 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
〔15〕공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 다중특이성 항원 결합 분자를 제작하는 방법으로, 아래의 공정을 포함하는 방법：
(a)〔14〕에 기재된 방법을 복수의 항원에 대해 행하는 공정, 및
(b) 공정(a)에서 취득된 복수의 항원 결합 분자에 포함되는, 복수의 같은 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드 및 복수의 다른 아미노산 서열의 제2 폴리펩티드를 사용하여 다중특이성 항원 결합 분자를 제작하는 공정으로, 당해 복수의 제2 폴리펩티드 각각에 당해 제1 폴리펩티드가 회합하여, 당해 복수의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 당해 복수의 항원 결합 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는 공정.
〔16〕공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 다중특이성 항원 결합 분자를 제작하는 방법으로, 아래의 공정을 포함하는 방법：
(a)〔14〕에 기재된 방법을 복수의 항원에 대해 행하는 공정,
(b) 공정(a)에서 취득된 복수의 항원 결합 분자에 포함되는, 복수의 같은 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드 및 복수의 다른 아미노산 서열의 제2 폴리펩티드에 대해서, 당해 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 당해 복수의 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 각각 조제하는 공정,
(c) 공정(b)에서 조제된 각 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입하는 공정, 및
(d) 공정(c)의 숙주세포를 배양하여 다중특이성 항원 결합 분자를 회수하는 공정으로, 당해 복수의 제2 폴리펩티드 각각에 당해 제1 폴리펩티드가 회합하여, 당해 복수의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 당해 복수의 항원 결합 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는 공정.
〔17〕다중특이성 항원 결합 분자가 이중특이성 항원 결합 분자인, 〔15〕또는〔16〕에 기재된 방법.
〔18〕항원 결합 분자의 제조방법으로, 아래의 공정을 포함하는 방법：
(a) 소정의 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 회합된 참조가 되는 항원 결합 분자(부모 항원 결합 분자)의 제1 폴리펩티드와 같은 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지를, 부모 항원 결합 분자의 제2 폴리펩티드와 다른 아미노산 서열의 제2 폴리펩티드를 각각 발현 가능한 박테리아 집단에 접촉시켜서, 공통된 제1 폴리펩티드와 아미노산 서열이 다른 제2 폴리펩티드가 각각 회합된, 항원 결합 분자(자식 항원 결합 분자)를 제시하는 복수의 박테리오파지를 포함하는 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작하는 공정, 및
　(b) 공정(a)에서 제작된 항원 결합 분자 제시 라이브러리에 상기 항원을 접촉시켜서 상기 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 자식 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
〔19〕〔18〕에 기재된 방법으로, 아래의 공정을 추가로 포함하는 방법：
　(d)〔18〕에 기재된 공정(b)에서 얻어진 자식 항원 결합 분자의 제2 폴리펩티드와 같은 아미노산 서열의 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지를, 자식 항원 결합 분자의 제1 폴리펩티드와 다른 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드를 각각 발현 가능한 박테리아 집단에 접촉시켜서, 공통된 제2 폴리펩티드와 아미노산 서열이 다른 제1 폴리펩티드가 각각 회합된, 항원 결합 분자(손자 항원 결합 분자)를 제시하는 복수의 박테리오파지를 포함하는 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작하는 공정, 및
　(e) 공정(d)에서 제작된 항원 결합 분자 제시 라이브러리에 상기 항원을 접촉시켜서 상기 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 손자 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
〔20〕개변된 헬퍼 파지 및 당해 헬퍼 파지가 감염 가능한 박테리아의 조합으로, 당해 헬퍼 파지는 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지이고, 또한 당해 박테리아는 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아이며, 당해 제1 폴리펩티드와 당해 제2 폴리펩티드가 회합하여 항원 결합 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는 조합.
〔21〕어떤 폴리펩티드를 발현 가능한 개변된 헬퍼 파지로, 당해 폴리펩티드가 회합하여 항원 결합 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드 중 어느 한쪽인 헬퍼 파지.
〔22〕상기에 기재된 1 또는 복수의 태양을 임의로 조합한 것도 당업자의 기술상식에 기초하여 기술적으로 모순되지 않는 한, 본 발명에 포함되는 것이 당업자에게는 당연히 이해된다.
도 1은 헬퍼 파지 M13KO7TC 게놈의 모식도이다. 도 중의 SacI 사이트에 L쇄 발현 유닛이 삽입되었다.
도 2는 H쇄(PF1H) 발현 파지미드 벡터와 L쇄(PF1L) 발현 헬퍼 파지의 조합에 의해 생산된 파지에 대해서 항인간 κ쇄 항체에 대한 ELISA를 행한 결과의 도면이다. L쇄 발현 헬퍼 파지(M13KO7TC-PF1L)를 사용한 경우는 파지 상에 Fab가 제시되어 있는 것이 확인되었다. 한편, 음성 대조의 헬퍼 파지(M13KO7TC)를 사용한 경우는 파지 상으로의 Fab의 제시는 확인되지 않았다.
도 3은 H쇄(PF1H) 발현 파지미드 벡터와 L쇄(PF1L) 발현 헬퍼 파지의 조합에 의해 생산된 파지에 대해서 항원인 인간 IL-6R에 대한 ELISA를 행한 결과의 도면이다. L쇄 발현 헬퍼 파지(M13KO7TC-PF1L)를 사용한 경우는 Fab 제시 파지가 항원에 대해 결합능을 갖고 있는 것이 확인되었다. 한편, 음성 대조의 헬퍼 파지(M13KO7TC)를 사용한 경우는 항원으로의 결합은 관찰되지 않았다.
도 4는 취득한 항체：6RNH-2_02(도 4(a)), 6RNH-2_37(도 4(b)), 6RNH-3(2)_32(도 4(c)), 6RNH-2_42(도 4(d))의 가용형 인간 IL-6R에 대한 결합활성을 Octet RED384(forteBIO)를 사용하여 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 취득한 항체：PANH-2_52(도 5(a)), PANH-2_68(도 5(b)), PANH-3_10(도 5(c)) 및 PF1 항체(도 5(d))의 가용형 인간 PlexinA1, 가용형 인간 IL-6R에 대한 결합활성을 Octet RED384(forteBIO)를 사용하여 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 취득한 항체：mIANH-2_27(도 6(a)), mIANH-3_79(도 6(b)) 및 PF1 항체(도 6(c))의 마우스 IgA, 가용형 인간 IL-6R에 대한 결합활성을 Octet RED384(forteBIO)를 사용하여 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 취득한 항체：6RPAB3_03(도 7(a)) 및 항PlexinA1 항체 hPANKB2-3#135(도 7(b))의 가용형 인간 IL-6R, 가용형 인간 PlexinA1에 대한 결합활성을 Octet RED384(forteBIO)를 사용하여 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 취득한 항체：6RmIAB3(2)_02(도 8(a)), 6RmIAB3(2)_06(도 8(b)), 6RmIAB3(2)_16(도 8(c)) 및 항마우스 IgA 항체 mIANMIgL_095(도 8(d))의 가용형 인간 IL-6R 및 마우스 IgA에 대한 결합활성을 Octet RED384(forteBIO)를 사용하여 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 취득한 항체：6RhCEB3(2)_10(도 9(a)) 및 항CD3 항체 hCE115HA/L0000(도 9(b))의 가용형 인간 IL-6R 및 인간 CD3e에 대한 결합활성을 Octet RED384(forteBIO)를 사용하여 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 L쇄(PF1L) 발현 파지미드 벡터와 H쇄(PF1H) 발현 헬퍼 파지의 조합에 의해 생산된 파지에 대해서 항인간 κ쇄 항체에 대한 ELISA를 행한 결과의 도면이다. H쇄 발현 헬퍼 파지(M13KO7AG-PF1H)를 사용한 경우는 파지 상에 Fab가 제시되어 있는 것이 확인되었다. 한편, 음성 대조의 헬퍼 파지(M13KO7TC)를 사용한 경우는 파지 상으로의 Fab의 제시는 확인되지 않았다.
도 11은 L쇄(PF1L) 발현 파지미드 벡터와 H쇄(PF1H) 발현 헬퍼 파지의 조합에 의해 생산된 파지에 대해서 항원인 인간 IL-6R에 대한 ELISA를 행한 결과의 도면이다. H쇄 발현 헬퍼 파지(M13KO7AG-PF1H)를 사용한 경우는 Fab 제시 파지가 항원에 대해 결합능을 갖고 있는 것이 확인되었다. 한편, 음성 대조의 헬퍼 파지(M13KO7TC)를 사용한 경우는 항원으로의 결합은 관찰되지 않았다.
아래에 본 발명의 바람직한 실시태양을 설명한다.
본 발명은 일태양에 있어서 항원 결합 분자를 제시하는 박테리오파지를 제작하는 방법으로, 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지를 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아에 접촉시키는 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서의 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 서로 회합하여 하나의 항원 결합 분자를 형성하는 것을 특징으로 한다. 헬퍼 파지를 박테리아에 접촉시킨 결과로서는 당해 헬퍼 파지가 당해 박테리아를 감염시키는 것이 바람직하다.
헬퍼 파지란, 박테리오파지(간단히 파지라고도 한다)의 일종으로, 다른 박테리오파지가 복제하는 것을 보조하는 기능을 갖는 박테리오파지를 가리킨다. 통상, 야생형의 박테리오파지가 숙주세포를 감염시키고 그 게놈이 숙주세포 내에 존재하는 경우, 그 곳에서 박테리오파지의 복제에 필요한 단백질을 전부 생산할 수 있기 때문에, 숙주세포 내에서 박테리오파지의 파지 입자(비리온)가 구축되고, 추가로 그 파지 입자 내에 당해 게놈이 패키징됨으로써 박테리오파지가 재구성되어, 그것이 최종적으로 세포 밖으로 방출된다. 그러나, 박테리오파지의 게놈 유래의 DNA로, 게놈의 일부가 결실 또는 불활성되거나 하여 박테리오파지의 복제에 필요한 단백질을 전부 생산할 수 없는 불완전한 파지 DNA의 경우, 그러한 DNA가 숙주세포 내에 존재하고 있다고 해도 그 자신은 박테리오파지를 재구성할 수 없다. 그러한 숙주세포에 헬퍼 파지를 감염시킨 경우, 헬퍼 파지의 게놈에 유래하는 단백질과 합쳐서 박테리오파지의 복제에 필요한 단백질을 전부 생산할 수 있게 되기 때문에, 숙주세포 내에서 파지 입자가 구축되어 박테리오파지를 재구성하는 것이 가능해진다. 이때, 헬퍼 파지의 특징으로 헬퍼 파지의 게놈은 게놈의 복제 기점 또는 패키징 시그널에 결함을 갖고 있기 때문에, 야생형의 박테리오파지의 게놈에 비해 파지 입자 내에 패키징되는 능력이 낮다(Methods Enzymol(1987) 153, 3-11). 그렇기 때문에 상기와 같은 불완전한 파지 DNA여도, 통상의 패키징능을 갖고 있는 DNA(예를 들면 파지미드 벡터 등)라면 파지 입자 내에는 헬퍼 파지의 게놈이 아닌 당해 불완전한 파지 DNA 쪽이 우선적으로 패키징되게 된다. 결과로서, 그 자신은 박테리오파지를 재구성할 수 없는 파지 DNA여도, 그것을 내부에 포함하는 형태로 박테리오파지를 재구성하는 것이 가능해진다.
통상 사용되는 헬퍼 파지는 그람 음성 박테리아를 감염시키는 섬유상 파지에 속하고, 그 중에서도 F인자를 갖는 대장균을 감염시키는 Ff 파지(f1, fd, M13 등)가 널리 사용되고 있다. Ff 파지의 게놈은 환상의 단일 가닥 DNA로 이루어지고 11의 단백질을 코드하는 것이 알려져 있다. 그들은 파지 입자의 구조 단백질(g3p(gene 3 protein 또는 pⅢ라고도 불린다, 이하 동일), g6p, g7p, g8p, g9p), 파지 DNA의 복제에 관여하는 단백질(g2p, g5p, g10p), 파지 입자의 구축과 분비에 관여하는 단백질(g1p, g4p, g11p)로 분류되며, 파지의 증식에는 이들이 전부 필요시 되고 있다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 헬퍼 파지의 게놈에는 야생형과 같이 변이가 없는 11의 단백질이 코드되어 있어도 되고, 그들 중에 어떤 변이가 도입되어 있어도 된다. 그들의 변이는 통상, 후술하는 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작할 때의 제시 효율을 높이는 목적이나, 항원 결합 분자 제시 라이브러리로부터 목적하는 항원 결합 분자를 선택(선별)할 때의 선택 효율을 높이는 목적으로 도입된다. 그러한 변이로서, 예를 들면 g3p를 코드하는 유전자(gene 3 또는 Ⅲ)의 일부 또는 전부의 결실, gene 3로의 앰버 변이의 도입, gene 3로의 레어 코돈의 도입, gene 3의 리보솜 결합 부위로의 변이의 도입, g9p를 코드하는 유전자(gene9 또는 Ⅸ)로의 앰버 변이의 도입, g3p로의 프로테아제(예를 들면 트립신) 절단 부위의 도입 등을 들 수 있다.
일태양에 있어서, 본 발명에 사용되는 헬퍼 파지로는 M13KO7, R408, VCSM13, KM13(Res Microbiol(2001) 152, 187-191), M13MDD3.2(FEMS Microbiol Lett(1995) 125, 317-321), R408d3(Gene(1997) 198, 99-103), VCSM13d3(Gene(1997) 198, 99-103), Hyperphage(Nat Biotechnol(2001) 19, 75-78), CT helper phage(Nucleic Acids Res(2003) 31, e59), Ex-phage(Nucleic Acids Res(2002) 30, e18), Phaberge(J Immunol Methods(2003) 274, 233-244), XP5(J Immunol Methods(2012) 376, 46-54), DeltaPhage(Nucleic Acids Res(2012) 40, e120) 등을 들 수 있다. 일반적으로 M13계의 헬퍼 파지가 바람직하고, 특히 바람직한 예로는 M13KO7을 들 수 있다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 박테리아는 헬퍼 파지가 감염될 수 있는 세포라면 특별히 한정되지 않으나, 통상은 그람 음성 박테리아이고, 바람직하게는 대장균(예를 들면 TG1, XL1-Blue, XL1-Blue MRF', ER2738 등)이다. F인자를 갖는 대장균이라면 Ff 파지(M13계의 헬퍼 파지를 포함한다)는 모두 감염 가능하다.
일태양에 있어서, 본 발명에서 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지 또는 박테리아란, 그들 폴리펩티드를 어떤 조건하에 있어서 발현하는 능력을 갖고 있는 헬퍼 파지 또는 박테리아를 의미한다. 예를 들면 헬퍼 파지의 경우, 박테리아에 감염되었을 때에 그들 폴리펩티드를 발현하는 능력을 갖고 있으면 되고, 헬퍼 파지 단독으로 존재할 때에 그들 폴리펩티드를 반드시 발현하고 있지 않아도 된다. 또한 박테리아의 경우, 그들 폴리펩티드를 상시 발현하고 있어도 되고, 또는 어떤 종의 발현 유도 물질이 존재하는 조건하에서 그들 폴리펩티드를 발현하는 능력을 갖고 있다면 발현 유도 물질이 존재하지 않는 통상의 생육 조건하에서는 그들 폴리펩티드를 발현하고 있지 않아도 된다.
제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지가 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아에 감염된 결과, 각각에 포함되는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 박테리아 내에서 발현하고, 서로 회합하여 항원 결합 분자를 형성하며 동시에 헬퍼 파지로부터 파지 입자가 재구성될 때에 당해 항원 결합 분자가 삽입됨으로써, 최종적으로 항원 결합 분자가 제시된 박테리오파지가 생산되게 된다. 이때, 재구성되는 파지 입자 내에는 박테리아 유래의 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 패키징되어 제2 폴리펩티드에 관한 유전자 정보가 새로 생산되는 박테리오파지에 탑재되는 것이 바람직하다. 그러기 위해서는 한정되지는 않지만, 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 파지미드 벡터에 삽입되거나 하여 헬퍼 파지의 게놈보다도 효율적으로 파지 입자 내에 패키징되는 성질을 갖고 있는 것이 바람직하다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 헬퍼 파지는 그 게놈 중에 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 것이 바람직하다.
제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 헬퍼 파지의 게놈 중에 삽입되는 위치는 특별히 한정되지 않으나, 헬퍼 파지 본래의 기능에 영향을 미치지 않도록 파지 단백질을 코드하지 않는 게놈의 비번역영역에 삽입되는 것이 바람직하다. 그러한 바람직한 위치의 구체예로 헬퍼 파지가 M13KO7인 경우, 카나마이신 내성 유전자와 p15A ori 사이에 위치하고 있는 SacI 사이트나 p15A ori와 M13 ori 사이에 위치하고 있는 SacII 사이트 등을 들 수 있다. 또는 후술하는 바와 같이 제1 폴리펩티드가 파지의 코트 단백질과 융합되어 있는 경우에는 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 게놈 중의 파지의 코트 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 리딩프레임이 합쳐지는 형태로 연결되는 위치에 삽입되어도 된다.
일태양에 있어서, 본 발명에서 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 프로모터란, 세포 중에서 RNA 폴리머라제를 결합하여 하류(3'방향) 서열의 전사를 개시시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 본 명세서에 있어서 프로모터에 기능적으로 연결되어 있다는 것은, 프로모터가 어떤 특정의 서열에 대해 적절한 위치에 배치됨으로써 당해 서열의 전사가 제어 가능한 상태가 되어 있는 것을 의미해도 되고, 프로모터의 당해 위치는 당해 서열과는 물리적으로 떨어진 장소에 배치되어 있어도 된다. 본 발명에 있어서 사용되는 프로모터는 구성적 프로모터여도 되고 유도성 프로모터여도 되며, 광범위한 각종 프로모터를 사용할 수 있다. 원핵 세포에 적합한 프로모터로는 β-락타마아제(bla) 프로모터, 락토오스(lac) 프로모터, 트립토판(trp) 프로모터, tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터；테트라사이클린(tet) 프로모터, 아라비노오스 프로모터, λ파지 프로모터, T7 파지 프로모터, T5 파지 프로모터 등을 들 수 있다.
일태양에 있어서, 본 발명에서 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno; SD) 서열 등의 리보솜 결합 부위(RBS)에 연결되어 있는 것이 바람직하다. 리보솜 결합 부위가 적절한 위치에 배치됨으로써 그 하류에 위치하는 폴리뉴클레오티드의 번역이 촉진된다. 리보솜 결합 부위는 프로모터와 그에 의해 제어되는 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 배치되면 된다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 제1 폴리펩티드는 시그널 서열에 연결되어 있는 것이 바람직하다. 시그널 서열이란, 단백질이 세포 내에서 발현된 후에 그 국재화에 관여하는 펩티드 사슬을 나타낸다. 시그널 서열은 단백질을 코드하는 서열에 인접하여 배치되면 된다. 본 발명에 있어서 사용되는 시그널 서열은 숙주가 되는 박테리아의 주변 세포질 공간(periplasimic space)에 단백질을 국재화시키는 것인 것이 바람직하다. 그러한 시그널 서열의 예로서 pelB 시그널 서열, geneⅢ 시그널 서열, OmpA 시그널 서열, phoA 시그널 서열, malE 시그널 서열, dsbA 시그널 서열, 대장균 내열성 엔테로톡신 시그널 서열, 베타 락타마아제 시그널 서열 등을 들 수 있다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 제1 폴리펩티드는 파지의 코트 단백질과 융합되어 있어도 된다. 제1 폴리펩티드와 파지의 코트 단백질의 융합은 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 파지의 코트 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 리딩프레임이 합쳐지는 형태로 연결시킴으로써 행할 수 있다. 파지의 코트 단백질로는 g3p, g6p, g7p, g8p, g9p 등의 구조 단백질이어도 된다. 본 발명에 있어서 제1 폴리펩티드가 융합되는 코트 단백질로서 바람직한 것은 g3p 또는 g8p이고, 보다 바람직한 것은 g3p이다.
코트 단백질로의 융합은 제1 폴리펩티드를 파지 입자의 표면에 제시할 목적으로 행하여지기 때문에 코트 단백질의 N말단 또는 C말단에서 행하여지는 것이 바람직하다. 코트 단백질은 전장의 것이어도 되고, N말단이나 C말단 등의 일부가 결실되어 있는 것이어도 된다. 또한 융합은 직접 행하여져도 되고, 임의의 링커 펩티드를 매개로 행하여져도 된다. 여기서, 링커 펩티드에 6xHis 태그나 Myc 태그, FLAG 태그 등의 태그 서열을 포함시킬 수 있고, 또는 트립신, 키모트립신 등의 프로테아제에 대한 프로테아제 인식 서열을 포함시키는 것도 가능하다. 태그 서열은 당해 융합 단백질의 검출 등에 유용하다. 프로테아제 인식 서열은 당해 융합 단백질을 프로테아제로 소화시킴으로써, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드가 회합하여 형성된 항원 결합 분자를 파지의 코트 단백질로부터 분리하여 회수할 수 있는 점에 있어서 유용하다.
일태양에 있어서, 본 발명에서 헬퍼 파지가 발현 가능한 제1 폴리펩티드의 수나 종류는 특별히 한정되지는 않으나, 통상은 한 종류뿐이어도 되고, 경우에 따라서는 아미노산 서열이 다른 두 종류 이상의 제1 폴리펩티드를 발현할 수 있어도 된다. 또한 본 발명의 헬퍼 파지가 발현 가능한 것은 통상은 항원 결합 분자의 한쪽(제1 폴리펩티드)뿐이지만, 경우에 따라서는 다른 한쪽(제2 폴리펩티드)을 함께 발현할 수 있어도 된다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 박테리아는 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다. 여기서, 박테리아가 폴리뉴클레오티드를 포함한다는 것은 당해 박테리아가 당해 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되어 있는 것이 바람직하다. 그리고, 당해 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 프로모터로는 구성적 프로모터여도 되고 유도성 프로모터여도 되며, 광범위한 각종 프로모터를 사용할 수 있다. 원핵 세포에 적합한 프로모터로는 β-락타마아제(bla) 프로모터, 락토오스(lac) 프로모터, 트립토판(trp) 프로모터, tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터；테트라사이클린(tet) 프로모터, 아라비노오스 프로모터, λ파지 프로모터, T7 파지 프로모터, T5 파지 프로모터 등을 들 수 있다. 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결되는 프로모터와 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결되는 프로모터를 다른 종류의 것으로 함으로써, 예를 들면 한쪽 발현을 촉진하고, 다른 한쪽 발현을 억제하는 등 양자의 전사를 다른 양식으로 제어하는 것도 가능하다.
일태양에 있어서, 본 발명에서 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 샤인-달가르노(SD) 서열 등의 리보솜 결합 부위(RBS)에 연결되어 있는 것이 바람직하다. 리보솜 결합 부위가 적절한 위치에 배치됨으로써 그 하류에 위치하는 폴리뉴클레오티드의 번역이 촉진된다. 리보솜 결합 부위는 프로모터와 그에 의해 제어되는 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 배치되면 된다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 제2 폴리펩티드는 시그널 서열에 연결되어 있는 것이 바람직하다. 시그널 서열은 단백질을 코드하는 서열에 인접하여 배치되면 된다. 본 발명에 있어서 사용되는 시그널 서열은 숙주가 되는 박테리아의 주변 세포질 공간(periplasimic space)에 단백질을 국재화시키는 것인 것이 바람직하다. 그러한 시그널 서열의 예로서, pelB 시그널 서열, geneⅢ 시그널 서열, OmpA 시그널 서열, phoA 시그널 서열, malE 시그널 서열, dsbA 시그널 서열, 대장균 내열성 엔테로톡신 시그널 서열, 베타 락타마아제 시그널 서열 등을 들 수 있다.
일태양에 있어서, 본 발명에서 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 파지미드 벡터에 삽입되어 있는 것이 바람직하다. 파지미드 벡터란, 파지 게놈의 일부를 포함하도록 하여 제작된 플라스미드 벡터로, 박테리아에서의 복제 기점(예를 들면 ColE1 등) 및 박테리오파지(예를 들면 M13, f1, fd 등)의 게놈에 유래하는 복제 기점이 포함되어 있다. 파지미드 벡터는 플라스미드 벡터와 같이 숙주의 박테리아 내에서 증폭되는 성질을 갖는 동시에 박테리오파지의 파지 입자 내에 패키징되는 성질도 갖는다. 따라서, 파지미드 벡터로 형질전환된 박테리아에 헬퍼 파지가 감염된 경우, 재구성된 파지 입자 내에는 헬퍼 파지 본래의 게놈보다도 파지미드 벡터 쪽이 우선적으로 패키징되게 된다. 파지미드 벡터로는 pHEN1, pComb3, pCANTAB5E, pCES1 등을 들 수 있다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 제2 폴리펩티드는 파지의 코트 단백질과 융합되어 있어도 된다. 제2 폴리펩티드와 파지의 코트 단백질의 융합은 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 파지의 코트 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 리딩프레임이 합쳐지는 형태로 연결시킴으로써 행할 수 있다. 파지의 코트 단백질로는 g3p, g6p, g7p, g8p, g9p 등의 구조 단백질이면 된다. 본 발명에 있어서 제2 폴리펩티드가 융합되는 코트 단백질로서 바람직한 것은 g3p 또는 g8p이고, 보다 바람직한 것은 g3p이다.
코트 단백질로의 융합은 제2 폴리펩티드를 파지 입자의 표면에 제시할 목적으로 행하여지기 때문에 코트 단백질의 N말단 또는 C말단에서 행하여지는 것이 바람직하다. 코트 단백질은 전장의 것이어도 되고, N말단이나 C말단 등의 일부가 결실되어 있는 것이어도 된다. 또한 융합은 직접 행하여져도 되고, 임의의 링커 펩티드를 매개로 행하여져도 된다. 여기서, 링커 펩티드에 6xHis 태그나 Myc 태그 등의 태그 서열을 포함시킬 수 있고, 또는 트립신, 키모트립신 등의 프로테아제에 대한 프로테아제 인식 서열을 포함시키는 것도 가능하다. 태그 서열은 당해 융합 단백질의 검출 등에 유용하다. 프로테아제 인식 서열은 당해 융합 단백질을 프로테아제로 소화시킴으로써, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드가 회합하여 형성된 항원 결합 분자를 파지의 코트 단백질로부터 분리하여 회수할 수 있는 점에 있어서 유용하다.
제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드로 형성되는 항원 결합 분자가 박테리오파지 상에 제시되기 위해서는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드의 적어도 한쪽이 파지의 코트 단백질과 융합되어 있는 것이 바람직하다. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 양자가 파지의 코트 단백질과 융합되어 있는 경우는 당해 코트 단백질은 같은 종류의 것(예를 들면 g3p, g6p, g7p, g8p, g9p 등)에서 선택되는 것이 바람직하다.
파지의 코트 단백질의 삽입 위치에 관하여 일태양에 있어서, 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 g3p나 g8p 등의 파지 코트 단백질을 코드하는 유전자의 N말단 또는 C말단 측에 연결한 유전자를 헬퍼 파지에 삽입하고, 또한 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 파지 코트 단백질에 연결하지 않고 파지미드 벡터에 삽입하거나；또는 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 파지 코트 단백질에 연결하지 않고 헬퍼 파지에 삽입하고, 또한 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 g3p나 g8p 등의 파지 코트 단백질을 코드하는 유전자의 N말단 또는 C말단 측에 연결한 유전자를 파지미드 벡터에 삽입해도 된다.
본 발명에 있어서 「X를 Y에 제시한다」는 것은 X를, X가 본래 갖는 기능을 유지한 상태로 Y의 표면에 결합시키는 것을 의미한다. 예를 들면 항원 결합 분자를 박테리오파지에 제시한다는 것은, 항원 결합 분자를 그 항원 결합능을 유지한 상태로 박테리오파지 입자의 표면에 결합시키는 것을 의미한다. 결합은 공유 결합에 의해 행하여져도 되고, 비공유 결합에 의해 행하여져도 된다. X와 Y가 모두 폴리펩티드인 경우는 X와 Y의 융합 단백질을 제작함으로써 바람직하게 X와 Y를 결합시킬 수 있다. 본 발명에 있어서는, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드의 적어도 한쪽이 파지의 코트 단백질과 융합되어 있는 것이 바람직하다. 또는 디설피드 결합을 매개로 항원 결합 분자를 박테리오파지에 제시하는 방법도 알려져 있어(WO01/005950), 그러한 방법을 사용하여 제시가 행하여져도 된다.
일태양에 있어서, 본 발명에서 박테리아가 발현 가능한 제2 폴리펩티드의 수나 종류는 특별히 한정되지 않으나, 후술하는 바와 같이 본 발명은 제1 폴리펩티드가 공통이고, 제2 폴리펩티드가 다른 항원 결합 분자를 다수 포함하는 항원 결합 분자 제시 라이브러리에 관한 것이기 때문에, 그러한 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작하기 위해서는 다른 종류의 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 복수의 박테리아가 필요해진다. 즉, 본 발명에 있어서 사용되는 개개의 박테리아는 아미노산 서열이 서로 다른 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아로서, 전체로 봤을 때, 다양성이 풍부한 복수의 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아 집단인 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 박테리아는 통상은 항원 결합 분자의 한쪽(제2 폴리펩티드)만 발현 가능하나, 경우에 따라서는 다른 한쪽(제1 폴리펩티드)을 함께 발현할 수 있어도 된다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 항원 결합 분자란, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 2개의 폴리펩티드를 포함하는 형태로 형성되고, 어떤 항원에 대해 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 분자라면 특별히 한정되지 않는다. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 아미노산 서열이 서로 다른 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 항원 결합 분자의 바람직한 예로는 항체, Fab, F(ab')2, diabody(Nature Nanotechnology(2007) 2, pp. 751-760), 항체 가변영역, 항체 가변영역을 포함하는 항체 단편, 수용체 단백질, Fc 단백질, Fc 단백질을 포함하는 항체 단편, Fc 융합 단백질, 또는 이들의 기능적인 단편(항원 결합 부위를 갖고, 이들의 기능을 갖는 단편) 또는 이들의 기능적인 균등물(이들의 당쇄 수식체 등의 항원 결합 부위를 갖고, 이들의 기능을 갖는 균등물) 등을 들 수 있다.
본 명세서에서의 항원 결합 분자는 어떠한 동물종(예를 들면 인간；또는 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 게잡이원숭이, 빨간털원숭이, 망토비비, 침팬지, 염소, 양, 개, 소, 낙타 등의 비인간 동물)이나 어떠한 조류에 유래해도 된다.
본 명세서에서의 항원 결합 분자가 항체(면역 글로불린)이거나 그것에 유래하는 분자인 경우에는, 어떠한 아이소타입(예를 들면 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 등) 및 서브클래스(예를 들면 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, 마우스IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 등)이거나 그들에 유래해도 된다. 항체 또는 그것에 유래하는 분자의 H쇄는, 예를 들면 γ쇄, μ쇄, α쇄, δ쇄, ε쇄 등의 어느 것이거나 그들에 유래해도 되고, 또한 항체 또는 그것에 유래하는 분자의 L쇄는, 예를 들면 κ쇄, λ쇄 등의 어느 것이거나 그들에 유래해도 된다. 항체 또는 그것에 유래하는 분자는, 예를 들면 키메라 항체, 인간화 항체, 친화성 성숙 항체 등의 개변 항체 또는 그것에 유래하는 분자여도 된다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 항원 결합 분자가 항체인 경우, 제1 폴리펩티드는 L쇄를 포함하는(또는, L쇄로 이루어지는) 동일한 2개의 폴리펩티드이며, 또한 제2 폴리펩티드는 H쇄를 포함하는(또는, H쇄로 이루어지는) 동일한 2개의 폴리펩티드이다；또는 제1 폴리펩티드는 H쇄를 포함하는(또는, H쇄로 이루어지는) 동일한 2개의 폴리펩티드이며, 또한 제2 폴리펩티드는 L쇄를 포함하는(또는, L쇄로 이루어지는) 동일한 2개의 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 즉, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 L쇄를 포함하는(또는, L쇄로 이루어지는) 2개의 폴리펩티드 및 H쇄를 포함하는(또는, H쇄로 이루어지는) 2개의 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 각각 선택되고, 또한 서로 다른 것이 바람직하다. 그러한 항체를 사용한 파지 라이브러리(IgG phage display)는, 예를 들면 FEBS J. 2010 May;277(10):2291-303이나 WO2011062859에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있어, 본 발명의 항원 결합 분자로서 항체를 사용할 수 있는 것이 당업자에게는 당연히 이해된다.
F(ab')2는 IgG 항체를 펩신 소화시킴으로써 제작될 수 있는 항원 결합 분자로 알려진다. F(ab')2는 2분자의 Fab'가 2개의 디설피드 결합에 의해 연결되고, 항체로부터 Fc영역을 제거한 구조를 갖는(2분자의 Fab'＋힌지영역), 2개의 항원 결합 부위를 갖는 2가의 분자이다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 항원 결합 분자가 F(ab')2인 경우, 제1 폴리펩티드는 L쇄 가변영역을 포함하는 동일한 2개의 폴리펩티드이며, 또한 제2 폴리펩티드는 H쇄 가변영역을 포함하는 동일한 2개의 폴리펩티드이다；또는 제1 폴리펩티드는 H쇄 가변영역을 포함하는 동일한 2개의 폴리펩티드이며, 또한 제2 폴리펩티드는 L쇄 가변영역을 포함하는 동일한 2개의 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 즉, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 L쇄 가변영역을 포함하는 2개의 폴리펩티드 및 H쇄 가변영역을 포함하는 2개의 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 각각 선택되고, 또한 서로 다른 것이 바람직하다. 그러한 F(ab')2를 사용한 파지 라이브러리는, 예를 들면 J Immunol Methods. 2004 Jan;284(1-2):119-32에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있어, 본 발명의 항원 결합 분자로서 F(ab')2를 사용할 수 있는 것이 당업자에게는 당연히 이해된다. 당해 문헌에서는 Fab와 M13 박테리오파지의 g3p(gene 3 protein) 사이에 IgG1 힌지영역과 호모 이량체화한 류신 지퍼(leucine zipper)로 이루어지는 이량화 도메인을 삽입한 「Fab'-zip-」를 파지 상에 제시시킴으로써 파지 상에서 F(ab')2를 형성시켜(「Fab'-zip-phage」), IgG 항체와 유사한 결합력이 높은 2가의 Fab를 제시하는 파지 라이브러리를 구축하고 있다.
디아바디(diabody)는 가변영역과 가변영역을 링커 등으로 결합한 프래그먼트(예를 들면 단일 사슬 항체(scFv) 등)(이하, diabody를 구성하는 프래그먼트)를 2개 결합시켜 이량체화시킨 것으로, 통상 2개의 H쇄 가변영역과 2개의 L쇄 가변영역을 포함하고, 2개의 항원 결합 부위를 갖는다(P.Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448(1993), EP404097호, WO93/11161호, Johnson et al., Method in Enzymology, 203, 88-98,(1991), Holliger et al., Protein Engineering, 9, 299-305,(1996), Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226,(1994), John et al., Protein Engineering, 12(7), 597-604,(1999), Holliger et al,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90, 6444-6448,(1993), Atwell et al., Mol.Immunol. 33, 1301-1312,(1996)).
디아바디(diabody)를 구성하는 프래그먼트는 H쇄 가변영역(또는 그의 단편)과 L쇄 가변영역(또는 그의 단편)을 결합한 것이 바람직하다. 디아바디(diabody)를 구성하는 프래그먼트 중에 있어서 가변영역과 가변영역을 결합하는 링커는 특별히 제한되지 않으나, 동일 프래그먼트 중의 가변영역 사이에서 비공유 결합이 일어나지 않을 정도로 짧은 링커를 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 링커의 길이는 당업자가 적절히 결정할 수 있고, 통상 2~14 아미노산, 바람직하게는 3~9 아미노산, 특히 바람직하게는 4~6 아미노산이다. 이 경우, 동일 프래그먼트 상에 코드되는 H쇄 가변영역(또는 그의 단편)과 L쇄 가변영역(또는 그의 단편)은 그 사이의 링커가 짧기 때문에, 동일 사슬 상의 H쇄 가변영역(또는 그의 단편)과 L쇄 가변영역(또는 그의 단편) 사이에서 비공유 결합이 일어나지 않고, 단일 사슬 V영역 프래그먼트가 형성되지 않기 때문에 다른 프래그먼트와의 이량체를 형성할 수 있다. 이량체를 형성할 때, 디아바디(diabody)를 구성하는 프래그먼트 간의 결합은 비공유 결합(예를 들면 수소 결합, 정전적 상호작용 또는 반데르발스 힘), 공유 결합(예를 들면 디설피드 결합), 또는 공유 결합과 비공유 결합의 양쪽이어도 된다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 항원 결합 분자가 디아바디(diabody)인 경우, 제1 폴리펩티드는 H쇄 가변영역(또는 그의 단편)과 L쇄 가변영역(또는 그의 단편)을 링커로 결합한 것이며, 제2 폴리펩티드는 L쇄 가변영역(또는 그의 단편)과 H쇄 가변영역(또는 그의 단편)을 링커로 결합한 것이다；또는 제1 폴리펩티드는 L쇄 가변영역(또는 그의 단편)과 H쇄 가변영역(또는 그의 단편)을 링커로 결합한 것이며, 제2 폴리펩티드는 H쇄 가변영역(또는 그의 단편)과 L쇄 가변영역(또는 그의 단편)을 링커로 결합한 것인 것이 바람직하다. 즉, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 H쇄 가변영역(또는 그의 단편)과 L쇄 가변영역(또는 그의 단편)을 링커로 결합한 것, 및 L쇄 가변영역(또는 그의 단편)과 H쇄 가변영역(또는 그의 단편)을 링커로 결합한 것으로 이루어진 군으로부터 각각 선택되고, 또한 서로 다른 것이 바람직하다. 그러한 디아바디(diabody)를 사용한 파지 라이브러리는, 예를 들면 Nat Biotechnol. 1996 Sep;14(9):1149-54；US20070036789에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있어, 본 발명의 항원 결합 분자로서 디아바디(diabody)를 사용할 수 있는 것이 당업자에게는 당연히 이해된다.
일태양에 있어서, 2개의 폴리펩티드를 포함하는 형태로 형성되어 어떤 리간드에 대해 특이적으로 결합하는 수용체 단백질도 본 발명의 항원 결합 분자에 포함할 수 있다. 이 경우, 수용체 단백질은 2개의 아미노산 서열이 서로 다른 폴리펩티드로 형성되는 헤테로 수용체 단백질인 것이 바람직하다. 수용체 단백질은 수용체 단백질의 세포외영역, 수용체 단백질의 리간드 결합영역, 또는 그들과 항체 Fc영역의 융합 단백질 등이어도 된다. 항원 결합 분자가 수용체 단백질인 경우, 항원은 수용체 단백질의 리간드를 가리킨다. 헤테로 수용체의 예로는 IL-2 수용체, IL-3 수용체, IL-4 수용체, IL-5 수용체, IL-6 수용체, IL-7 수용체, IL-9 수용체, IL-10 수용체, IL-11 수용체, IL-12 수용체, IL-13 수용체, IL-15 수용체, IL-17 수용체, IL-23 수용체, IL-31 수용체, GM-CSF 수용체, IFN-α 수용체, IFN-β 수용체, IFN-γ 수용체, CNTF 수용체, LIF 수용체, OSM 수용체, CT-1 수용체 등을 들 수 있다.
일태양에 있어서, 2개의 폴리펩티드를 포함하는 형태로 형성되어 어떤 Fc 수용체에 대해 특이적으로 결합하는 Fc 단백질도 본 발명의 항원 결합 분자에 포함할 수 있다. Fc 단백질이란, 항체 분자에서의 힌지부 또는 그의 일부, CH2, CH3 도메인으로 이루어지는 영역을 나타내고, 일반적으로 EU 넘버링 226번째부터 C말단까지, 또는 230번째부터 C말단까지의 아미노산 서열을 가리킨다. 또는 CH2 도메인 및 CH3 도메인, 또는 CH3 도메인만이어도 된다. 이 경우의 Fc 단백질은 천연형의 Fc 단백질에 어떠한 아미노산 변이가 가해진 개변형의 Fc 단백질인 것이 바람직하고, 2개의 아미노산 서열이 서로 다른 폴리펩티드로 형성되는 것이 바람직하다. 그러한 헤테로 Fc 단백질의 예로는 WO98/50431, WO2006/106905, WO2007/114325, WO2011/078332, WO2013/002362 등에 기재된 Fc 단백질을 들 수 있다. 특히 WO98/50431에는 헤테로 Fc 단백질을 구성하는 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열을 고정하고, 다른 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열을 개변함으로써, 다양한 서열 중에서 가장 서로 적합한 2개의 폴리펩티드의 조합을 선택(선별) 가능한 것이 기재되어 있다. 항원 결합 분자가 Fc 단백질인 경우, 항원은 각종 Fc 수용체(예를 들면 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRⅢ 또는 FcRn 등)를 가리킨다. 예를 들면 항체의 Fc영역의 아미노산을 개변시켜 pH 중성 조건하에서의 FcRn(Neonatal Fc Receptor)으로의 결합을 증강시키거나(WO2011/122011), pH 중성 조건하에서의 Fcγ 수용체로의 결합을 증강시킴으로써(WO2013/047752) 혈중으로부터 항원을 신속하게 제거할 수 있는 것이 보고되어 있다.
다른 태양에 있어서, 상기 Fc 단백질에 단백질(예를 들면 사이토카인 또는 수용체 세포외 도메인)이나 펩티드를 융합시킨 Fc 융합 단백질도 본 발명의 항원 결합 분자에 포함할 수 있다. Fc 융합 단백질은 항체 힌지영역 및/또는 링커를 포함해도 된다. 가용성 Fc 융합 단백질은 in vitro, in vivo 실험에서 널리 사용되고 있으며, 비융합 단백질에 비해 많은 장점을 가질 수 있다(Meg L et al., Methods in Molecular Biology 378:33-52, 2007). 또한 가용성 Fc 융합 단백질은 인간 항체 제제의 생산에 있어서 항원 특이성을 유지하면서 많은 면역학적인 문제를 배제할 수 있다. 대표적인 가용성 Fc 융합 인간 항체 제제로서 자기면역질환 치료제인 Etanercept(A㎎en)을 들 수 있고, 이것은 가용성 TNF 수용체 2에 인간 IgG1의 Fc를 융합시켜 제조되었다. 당업자는 예를 들면 WO2009/136568, WO2007/048122, WO2011/115323에 기재된 것과 같은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 적절히 Fc 융합 단백질을 제조하여 파지 라이브러리에 사용할 수 있는 것이 이해된다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 항원 결합 분자가 항체 가변영역인 경우, 제1 폴리펩티드는 L쇄 가변영역을 포함하는(또는, L쇄로 이루어지는) 폴리펩티드이며, 또한 제2 폴리펩티드는 H쇄 가변영역을 포함하는(또는, H쇄로 이루어지는) 폴리펩티드이다；또는 제1 폴리펩티드는 H쇄 가변영역을 포함하는(또는, H쇄로 이루어지는) 폴리펩티드이며, 또한 제2 폴리펩티드는 L쇄 가변영역을 포함하는(또는, L쇄로 이루어지는) 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 즉, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 L쇄 가변영역을 포함하는(또는, L쇄로 이루어지는) 폴리펩티드 및 H쇄 가변영역을 포함하는(또는, H쇄로 이루어지는) 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 각각 선택되고, 또한 서로 다른 것이 바람직하다.
일태양에 있어서, 본 발명의 목적의 하나는 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 복수의 항원 결합 분자를 제작하는데 적합한 헬퍼 파지 및 당해 헬퍼 파지가 감염 가능한 박테리아의 조합을 제공하는 것에 있다. 그러한 제1 폴리펩티드는 항원 결합 분자를 구성하는 폴리펩티드의 한쪽이라면 임의의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 선택할 수 있다. 예를 들면 항원 결합 분자가 항체 가변영역이고, 제1 폴리펩티드가 L쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 H쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드인 경우, 당해 L쇄 가변영역 또는 H쇄 가변영역은 임의의 아미노산 서열을 갖는 L쇄 가변영역 또는 H쇄 가변영역 중에서 선택할 수 있다. 즉, 어떠한 아미노산 서열의 L쇄 가변영역 또는 H쇄 가변영역을 선택하여도 그것을 공통된 제1 폴리펩티드로서 포함하는 복수의 항원 결합 분자(여기서는 항체 가변영역)를 제작할 수 있다. L쇄 가변영역 또는 H쇄 가변영역은 특정의 항원에 결합하는 항체에 포함되는 L쇄 가변영역 또는 H쇄 가변영역 중에서 선택해도 되고, 또는 특정의 항원으로 면역되기 전의 나이브 항체(naive antibody)에 포함되는 L쇄 가변영역 또는 H쇄 가변영역 중에서 선택해도 된다.
특정의 항원에 결합하는 항체는 당업자에게 공지된 하이브리도마법(Nature(1975) 256, 495)이나 파지 항체 라이브러리법(Nature(1991) 352, 624-628, J Mol Biol(1991) 222, 581-597)으로 제작할 수 있다. 제작된 항체의 L쇄 가변영역이나 H쇄 가변영역의 아미노산 서열은 하이브리도마법이라면, 당해 항체를 생산하는 하이브리도마에 포함되는 L쇄나 H쇄를 코드하는 유전자를 항체 유전자에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR법으로 증폭시키고, 그의 서열 해석을 행함으로써 동정할 수 있다(J Mol Biol(1991) 222, 581-597, Mol Immunol(1992) 29, 193-203). 또한 파지 항체 라이브러리법이라면, 당해 항체를 제시하는 파지 내에 포함되는 벡터를 단리하고, 거기에 삽입되어 있는 L쇄나 H쇄를 코드하는 유전자의 서열 해석을 행함으로써 동정할 수 있다.
특정의 항원으로 면역되기 전의 나이브 항체에 포함되는 L쇄 가변영역 또는 H쇄 가변영역의 아미노산 서열은 그러한 항체를 생산하는 말초혈 단핵구나 골수 세포, 또는 비장 세포 등을 인간이나 그 외의 동물 등으로부터 조제하고, 그들 세포에 포함되는 L쇄나 H쇄를 코드하는 유전자를 항체 유전자에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR법으로 증폭시키고 그의 서열 해석을 행함으로써 다수 동정할 수 있기 때문에, 그들 중에서 임의의 것을 선택하여 사용할 수 있다(J Mol Biol(1991) 222, 581-597, Mol Immunol(1992) 29, 193-203).
일태양에 있어서, 본 발명에서의 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드가 L쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드나 H쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드인 경우, 그들은 추가로 L쇄 불변영역이나 H쇄 불변영역을 포함하고 있어도 된다. 제1 폴리펩티드에 불변영역이 포함되어 있지 않은 경우는 제2 폴리펩티드에도 불변영역이 포함되어 있지 않은 것이 바람직하고, 제1 폴리펩티드에 불변영역이 포함되어 있는 경우는 제2 폴리펩티드에도 불변영역이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 또한 H쇄 불변영역은 특히 H쇄 불변영역 CH1 도메인인 것이 바람직하다. 여기서, H쇄 불변영역 CH1 도메인이란, H쇄 불변영역의 맨 처음부터 힌지영역 직전까지의 영역을 나타내며, 일반적으로 EU 넘버링 118번째부터 225번째까지의 아미노산 서열을 가리킨다. 통상, 이들 불변영역은 가변영역의 직후에 연결되는 형태로 포함된다. L쇄 불변영역은 κ쇄 또는 λ쇄 중 어느 하나에 유래하는 불변영역이어도 되고, 또한 H쇄 불변영역은 γ쇄, μ쇄, α쇄, δ쇄, ε쇄 중 어느 하나에 유래하는 불변영역이어도 된다. 또한 이들 불변영역은 전장이어도 되고, 일부가 결실된 것이어도 된다. 또한 일부의 아미노산이 치환, 결실, 삽입되거나 하여 개변된 것이어도 된다. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드에 불변영역이 포함되어 있는 경우의 바람직한 항원 결합 분자의 예는 Fab이다.
또한 다른 태양에 있어서, 본 발명은 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작하는 방법으로, 아래의 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다：
(a) 항원 결합 분자를 제시하는 박테리오파지를 제작하는 본 발명의 방법을 복수회 행하는 공정으로, 당해 공정에 있어서 사용되는 복수의 박테리아는 아미노산 서열이 다른 복수의 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아 집단이고, 또한 당해 공정에 있어서 사용되는 헬퍼 파지는 같은 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지인 공정, 및
(b) 공정(a)에서 제작된 항원 결합 분자를 제시하는 복수의 박테리오파지를 회수하는 공정.
복수의 박테리아는 개개의 박테리아가 아미노산 서열이 서로 다른 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아로, 전체로 봤을 때, 다양성이 풍부한 복수의 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아 집단인 것이 바람직하다. 그러한 복수의 박테리아 각각에 같은 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지를 감염시킴으로써 항원 결합 분자를 제시하는 복수의 박테리오파지를 제작할 수 있고, 그들의 항원 결합 분자의 전체에 공통의 제1 폴리펩티드와 서로 다른 제2 폴리펩티드가 포함되어 있다. 그와 같이 하여 제작된 항원 결합 분자를 제시하는 복수의 박테리오파지를 회수하여 혼합함으로써, 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작할 수 있다.
본 명세서에 있어서 라이브러리란, 다양한 레퍼토리를 갖는 복수의 구성 요소의 집합체를 의미한다. 본 발명에 있어서는, 주로 복수의 박테리오파지가 집합하여 생긴 박테리오파지 라이브러리(파지 라이브러리)를 나타낸다. 항원 결합 분자 제시 라이브러리란, 표면에 항원 결합 분자가 제시된 박테리오파지를 구성 요소로 하는 라이브러리를 의미하며, 거기에 포함되는 항원 결합 분자는 다양한 레퍼토리를 갖고 있는 것이 바람직하다. 라이브러리의 구성 요소의 수(라이브러리의 사이즈)는 클수록 바람직하고, 예를 들면 106 이상, 107 이상, 108 이상, 109 이상, 1010 이상, 1011 이상, 1012 이상, 1013 이상, 1014 이상 등인 것이 바람직하다. 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작하는 본 발명의 방법에 있어서는 그 공정에서 사용되는 복수의 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아의 수가 그대로 라이브러리의 구성 요소의 수가 되기 때문에, 당해 공정에 있어서 사용되는 박테리아 집단으로는, 예를 들면 106 이상, 107 이상, 108 이상, 109 이상, 1010 이상, 1011 이상, 1012 이상, 1013 이상, 1014 이상의 박테리아인 것이 바람직하다.
통상, 상기와 같은 복수회의 감염을 행하려면 복수의 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아 집단이 혼합된 상태로 배양되어 있는 곳에 같은 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 복수의 헬퍼 파지를 총괄하여 감염시키면 된다. 또는 1개 이상의 박테리아를 포함하는 소규모의 박테리아 집단에 대해 헬퍼 파지를 개별적으로 감염시켜도 된다. 제작된 박테리오파지는 통상 박테리아의 배양상청 중으로 방출되기 때문에, 박테리오파지의 회수는 헬퍼 파지 감염 후의 박테리아의 배양액을 원심분리하거나 하여 배양상청을 분리하기만 해도 되고, 또한 거기에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 첨가하여 박테리오파지를 침전시키는 방법(PEG 침전법)을 행하거나 하여 박테리오파지를 단리 정제하는 공정을 추가해도 된다.
항원 결합 분자가 항체 가변영역에서, 제2 폴리펩티드가 L쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 H쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드인 경우, 아미노산 서열이 서로 다른 복수의 L쇄 가변영역이나 H쇄 가변영역을 코드하는 유전자는 생체내 등의 천연으로 존재하는 다수의 항체 유전자를 단리하거나 하여 얻을 수 있다. 예를 들면 인간이나 그 외의 동물 등으로부터 말초혈 단핵구나 골수 세포, 비장 세포 등의 항체 생산 세포를 조제하여 그들 세포에서 얻어진 RNA를 기반으로 L쇄 가변영역이나 H쇄 가변영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 행함으로써 L쇄 가변영역이나 H쇄 가변영역을 코드하는 유전자를 증폭시킬 수 있다. 그 경우, 높은 다양성을 얻는다고 하는 관점에서, 특정의 항원으로 면역되기 전의 나이브 항체 생산 세포를 사용하는 것이 바람직하나, 경우에 따라서는 특정의 항원으로 면역된 후의 바이어스된 항체 생산 세포를 사용해도 된다. 또는 어떤 L쇄 가변영역이나 H쇄 가변영역을 코드하는 유전자에 인공적으로 변이를 가하거나 하여 다양성을 높인 다수의 유전자를 합성함으로써도 얻을 수 있다. 그러한 유전자는, 예를 들면 Error prone PCR 등의 수법을 사용하여 인공적으로 변이를 유발함으로써 제작하는 것도 가능하고, 또는 목적하는 다양성을 갖는 형태로 서열 설계된 유전자를 모두 합성함으로써도 제작할 수 있다.
다른 태양에 있어서, 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작하는 본 발명의 방법으로 제작된 항원 결합 분자 제시 라이브러리도 또한 본 발명에 포함된다.
다른 태양에 있어서, 본 발명은 소정의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 취득하는 방법으로, 아래의 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다：
(a) 본 발명의 항원 결합 분자 제시 라이브러리에 항원을 접촉시키는 공정, 및
(b) 당해 항원 결합 분자 제시 라이브러리 중에서 당해 항원에 결합하는 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
일태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자 제시 라이브러리는 서로 서열이 달라 다양성이 풍부한 복수의 항원 결합 분자를 포함하고 있기 때문에, 전체로 봤을 때, 다양한 종류의 항원에 대해 결합 가능한 항원 결합 분자의 집단이 되어 있다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 분자 제시 라이브러리 중에서 스크리닝에 의해, 목적하는 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 선택(선별)할 수 있다. 즉, 본 발명의 항원 결합 분자 제시 라이브러리에 항원을 접촉시킴으로써, 그 중에 포함되는 당해 항원에 대해 특이적으로 결합 가능한 항원 결합 분자와 당해 항원이 결합하여 복합체가 형성된다. 그리고, 당해 라이브러리에 포함되는 복수의 항원 결합 분자 중에서 항원과 복합체를 형성하고 있는 항원 결합 분자와 항원에 결합하고 있지 않은 항원 결합 분자를 당업자에게 공지된 어떠한 방법으로 분리함으로써 당해 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자만을 선택(선별)할 수 있다. 항원과 복합체를 형성하고 있는 항원 결합 분자를 분리하는 방법으로는, 예를 들면 사전에 비오틴으로 표지한 항원을 항원 결합 분자 제시 라이브러리에 접촉시킨 후, 당해 비오틴 표지된 항원을 비드나 플레이트 등의 담체 상에 고정화된 아비딘 또는 스트렙토아비딘에 결합시킴으로써 당해 항원과 복합체를 형성하고 있는 항원 결합 분자만을 비드나 플레이트 상에 회수할 수 있다. 그리고, 당해 비드나 플레이트를 세정하여 항원 결합 분자 제시 라이브러리 중에서 항원에 결합하고 있지 않은 항원 결합 분자를 제거함으로써, 항원과 복합체를 형성하고 있는 항원 결합 분자와 항원에 결합하고 있지 않은 항원 결합 분자를 분리할 수 있다.
항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 선별하는 상기의 조작은 복수회 반복 행하여져도 된다. 즉, 한차례의 선별 조작에 의해 분리된 항원 결합 분자 군 중에는 항원으로의 결합능이 약한 항원 결합 분자와 강한 항원 결합 분자가 혼재하여 있는 것으로 생각되기 때문에, 상기 선별 조작을 반복함으로써 항원으로의 결합능이 강한 항원 결합 분자의 존재비율을 서서히 높여갈 수 있다. 일 실시태양에 있어서, 한차례의 선별 조작에 의해 분리된 항원 결합 분자를 제시하는 박테리오파지를 숙주인 박테리아에 일단 감염시킨 후, 당해 박테리아를 배양하여 증식시킨다. 본 발명에 있어서 제작된 박테리오파지 내에는 통상 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 패키징되어 있기 때문에, 상기 박테리오파지가 감염된 박테리아 내에는 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 존재하게 된다. 즉, 이 상태의 박테리아는 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아이기 때문에, 당해 박테리아에 최초의 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작할 때에 사용한 것과 같은 헬퍼 파지(즉, 같은 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지)를 감염시킴으로써, 한차례의 선택 조작으로 분리된 것과 같은 항원 결합 분자를 제시하는 박테리오파지를 수가 증폭된 상태로 재생산할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 항원 결합 분자를 제시하는 박테리오파지를 다시 출발 재료로 하여 상기의 선택 조작을 반복 행함으로써, 항원으로의 결합능이 강한 항원 결합 분자만이 많이 포함되는 항원 결합 분자의 집단을 형성하는 것이 가능해진다.
항원 결합 분자 제시 라이브러리에 포함되는 항원 결합 분자는 박테리오파지 상에 제시된 상태로 존재하고 있으나, 어떠한 방법으로 항원 결합 분자만을 취득하는 것도 가능하다. 예를 들면 항원 결합 분자와 파지의 코트 단백질이 융합되어 있고, 그 사이에 프로테아제(예를 들면 트립신)의 절단 부위가 도입되어 있는 경우, 항원 결합 분자가 제시된 박테리오파지에 프로테아제를 반응시킴으로써 항원 결합 분자와 박테리오파지가 분리되어 항원 결합 분자만을 단리할 수 있다. 또한 본 발명의 방법으로 제작된 박테리오파지의 파지 입자 중에 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 패키징되어 있는 경우, 본 발명의 헬퍼 파지에 포함되는 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 합쳐서 당해 항원 결합 분자의 서열정보를 동정할 수 있어, 유전자 공학적 수법으로 당해 항원 결합 분자를 별도 제작할 수 있다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 항원은 항원 결정기(에피토프)가 될 수 있는 구조를 포함하는 화합물이라면 특별히 한정되지 않고, 저분자 화합물이어도 되고, 고분자 화합물이어도 된다. 일반적인 항원의 예로는, 폴리펩티드나 폴리뉴클레오티드, 당쇄, 지질, 또는 그들이 조합되어 생성된 분자 등을 들 수 있다. 그들은 천연으로 존재하는 재료로부터 단리함으로써 조제하는 것도 가능하고, 인공적으로 합성함으로써 조제하는 것도 가능하다. 예를 들면 항원이 폴리펩티드인 경우, 유전자 공학적인 수법으로 조제할 수 있다. 즉, 당해 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 유전자 클로닝법이나 핵산 합성법 등 당업자에게 공지된 수법으로 조제하고, 그것을 공지된 발현 벡터 등에 삽입하여 적당한 숙주세포에 도입함으로써 당해 폴리펩티드를 조제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드는 통상의 이온 크로마토그래피나 친화성 크로마토그래피 등의 방법으로 정제할 수 있다.
본 명세서에 있어서 항원 결합 분자가 항원에 특이적으로 결합한다는 것은, 어떤 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합활성이 그 이외의 항원에 대한 결합활성과 비교하여, 예를 들면 바람직하게는 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 더욱 바람직하게는 50배 이상, 100배 이상 높은 것을 의미한다. 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합활성은 ELISA나 FACS, Biacore 등의 당업자에게 공지된 방법으로 측정 및 비교할 수 있다. 상기 정의에서의 항원은 에피토프라고 바꿔 말해도 된다. 즉, 항원 결합 분자가 항원에 특이적으로 결합한다는 것은 항원 결합 분자의 어떤 에피토프에 대한 결합활성이 그 이외의 에피토프에 대한 결합활성과 비교하여, 예를 들면 바람직하게는 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 더욱 바람직하게는 50배 이상, 100배 이상 높은 것을 의미한다.
다른 태양에 있어서, 본 발명은 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 다중특이성 항원 결합 분자를 제작하는 방법으로, 아래의 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다：
(a) 소정의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 취득하는 본 발명의 방법을 복수의 항원에 대해 행하는 공정, 및
(b) 공정(a)에서 취득된 복수의 항원 결합 분자에 포함되는, 복수의 같은 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드 및 복수의 다른 아미노산 서열의 제2 폴리펩티드를 사용하여 다중특이성 항원 결합 분자를 제작하는 공정으로, 당해 복수의 제2 폴리펩티드 각각에 당해 제1 폴리펩티드가 회합하여, 당해 복수의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 당해 복수의 항원 결합 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는 공정.
또는 상기 발명은 추가적인 다른 태양에 있어서, 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 다중특이성 항원 결합 분자를 제작하는 방법으로, 아래의 공정을 포함하는 방법이어도 된다：
(a) 소정의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 취득하는 본 발명의 방법을 복수의 항원에 대해 행하는 공정,
(b) 공정(a)에서 취득된 복수의 항원 결합 분자에 포함되는, 복수의 같은 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드 및 복수의 다른 아미노산 서열의 제2 폴리펩티드에 대해서, 당해 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 당해 복수의 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 각각 조제하는 공정,
(c) 공정(b)에서 조제된 각 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입하는 공정, 및
(d) 공정(c)의 숙주세포를 배양하여 다중특이성 항원 결합 분자를 회수하는 공정으로, 당해 복수의 제2 폴리펩티드 각각에 당해 제1 폴리펩티드가 회합하여, 당해 복수의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 당해 복수의 항원 결합 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는 공정.
소정의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 취득하는 본 발명의 방법으로 취득된 항원 결합 분자에는 반드시 제1 폴리펩티드가 포함되어 있기 때문에, 복수의 항원에 대해 당해 방법을 행한 결과 취득되는 복수의 항원 결합 분자에는 공통된 제1 폴리펩티드 및 서로 다른 제2 폴리펩티드가 모두 포함되어 있게 된다. 그와 같이 하여 얻어진 제1 폴리펩티드 및 복수의 제2 폴리펩티드를 조합함으로써 복수의 제2 폴리펩티드 각각은 제1 폴리펩티드와 회합하여 복수의 항원 결합 분자를 형성하기 때문에, 그들 복수의 항원 결합 분자끼리를 연결하여 하나의 분자를 형성하도록 재구성하면 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 다중특이성 항원 결합 분자를 용이하게 제작할 수 있다. 이때, 유전자 공학적 수법을 사용하여 다중특이성 항원 결합 분자를 제작해도 된다. 즉, 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 복수의 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 각각 조제하고, 그들을 숙주세포에 도입하여 당해 폴리뉴클레오티드가 발현 가능한 조건에서 당해 숙주세포를 배양한다. 당해 폴리뉴클레오티드로부터 발현한 복수의 제2 폴리펩티드 각각은 제1 폴리펩티드와 회합하여 복수의 항원 결합 분자를 형성하기 때문에, 그들 복수의 항원 결합 분자끼리를 연결하여 하나의 분자를 형성하도록 재구성하면 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 다중특이성 항원 결합 분자를 용이하게 발현시킬 수 있다. 숙주세포 밖에 발현한 다중특이성 항원 결합 분자의 회수는 숙주세포의 배양액으로부터 배양상청을 원심분리함으로써 행할 수 있고, 또는 숙주세포의 세포 추출액을 조제함으로써 행할 수 있다. 또한 거기로부터 다중특이성 항원 결합 분자를 단리하여 정제하는 공정을 추가해도 된다(Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81.).
제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드나 복수의 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 어떠한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 바람직하다. 각 폴리뉴클레오티드가 개별의 발현 벡터에 삽입되어 있어도 되고, 그들이 총괄하여 같은 발현 벡터에 삽입되어 있어도 된다. 발현 벡터의 예로는, 대장균용이면 pET, 포유동물 세포용이면 pcDNA3 등을 들 수 있다.
제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드나 복수의 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 도입되는 숙주세포의 예로는, 대장균이라면 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등을, 포유동물 세포라면 CHO, COS, HEK293 등을 들 수 있다.
숙주세포로의 폴리뉴클레오티드의 도입은 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 전기천공법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법 등 당업자에게 공지된 수법을 사용하여 행할 수 있다.
숙주세포로부터 회수된 다중특이성 항원 결합 분자는, 예를 들면 원심분리, 황산암모늄 분획, 염석, 투석, 한외 여과, 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 공지된 방법으로 단리 정제되어도 된다.
일태양에 있어서 본 발명에서의 다중특이성 항원 결합 분자란, 하나의 분자 내에 복수의 항원에 대해 각각 특이적으로 결합하는 복수의 항원 결합 분자를 포함하는 분자를 의미한다. 항원 결합 분자끼리가 어떠한 형태로 서로 연결되어 하나의 분자를 형성하고 있으면 되며, 이때의 연결은 공유 결합(예를 들면 펩티드 결합이나 디설피드 결합 등)에 의해 행하여져도 되고, 비공유 결합에 의해 행하여져도 된다. 항원 결합 분자끼리의 결합은 직접 행하여져도 되고, 링커 펩티드와 같은 링커 분자를 매개로 행하여져도 된다. 다중특이성 항원 결합 분자의 예로는, 항원 결합 분자가 항체 가변영역인 경우, 복수의 H쇄 가변영역 및 L쇄 가변영역이 직접 또는 링커 펩티드를 매개로 펩티드 결합으로 연결되고, 또한 분자 내에서 H쇄 가변영역과 L쇄 가변영역이 적절히 회합하여 복수의 항체 가변영역을 형성하는 분자(예를 들면 diabody, triabody, single-chain diabody 등)를 들 수 있다. 또한 다른 예로는, H쇄 가변영역과 H쇄 불변영역 및 L쇄 가변영역과 L쇄 불변영역이 각각 펩티드 결합으로 연결됨과 동시에 H쇄 불변영역끼리가 디설피드 결합 등으로 연결되고, 또한 분자 내에서 H쇄 가변영역과 L쇄 가변영역이 적절히 회합하여 복수의 항체 가변영역을 형성하는 분자(예를 들면 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 등의 항체(면역 글로불린)분자)를 들 수 있다. 다중특이성 항원 결합 분자에 포함되는 각 항원 결합 분자는, 서로 다른 항원에 결합하는 항원 결합 분자여도 되고, 같은 항원에 포함되는 다른 항원 결정기(에피토프)에 결합하는 항원 결합 분자여도 된다. 경우에 따라서는 같은 항원의 같은 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자여도 된다. 다중특이성 항원 결합 분자에 포함되는 항원 결합 분자의 수를 2개, 3개, 4개 등으로 증가시킴으로써 이중특이성 항원 결합 분자, 삼중특이성 항원 결합 분자, 사중특이성 항원 결합 분자 등을 각각 제작할 수 있다. 본 발명에 있어서 바람직한 다중특이성 항원 결합 분자는 이중특이성 항원 결합 분자(예를 들면 이중특이성 항체)이다.
다중특이성 항원 결합 분자는 여러 가지 목적으로 사용할 수 있으나, 그 중 하나로, 의약 조성물의 유효 성분으로서 질환 치료에 사용할 수 있는 것이 이미 알려져 있다. 예를 들면 암의 치료에 있어서 종양 항원에 결합하는 항원 결합 분자 및 세포상해활성을 일으키는 분자에 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자는, 종양 세포에 대해 특이적으로 세포상해를 일으킬 수 있는 분자로서 유용하다. 종양 항원으로는, 예를 들면 CD15, p185(HER2), p97, OVCAR-3, L-D1, EGFR, CAMA1, CD19, MoV18, NCAM, FBP, AMOC-31, Id-1, CD22, CD7, CD38, CEA, CD30 등을 들 수 있다. 또한 세포상해활성을 일으키는 분자로는, 예를 들면 FcγRI, FcγRⅢ(CD16), CD3 등을 들 수 있다. 또한 감염성 질환 치료에 있어서 바이러스에 결합하는 항원 결합 분자 및 세포상해활성을 일으키는 분자에 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자는, 바이러스 감염 세포에 대해 특이적으로 세포상해를 일으킬 수 있는 분자로서 유용하다. 바이러스로는, 예를 들면 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 인플루엔자 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 등을 들 수 있다. 이외에는, 피브린에 결합하는 항원 결합 분자 및 플라스미노겐 활성화 인자에 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자는 혈전을 용해시키는 의약으로서 유용하다. 플라스미노겐 활성화 인자로는, 예를 들면 조직형 플라스미노겐 활성화 인자(tPA), 우로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자(uPA) 등을 들 수 있다. 또한 사이토카인의 헤테로 수용체를 구성하는 각 폴리펩티드 사슬에 대해 각각 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자 중에서 당해 사이토카인의 아고니스트 분자를 취득할 수 있다(WO2004/060919). 헤테로 수용체를 갖는 사이토카인으로는, 예를 들면 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-23, IL-31, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, CNTF, LIF, OSM, CT-1 등을 들 수 있다. 또한 효소에 결합하는 항원 결합 분자 및 당해 효소의 기질에 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자 중에서 당해 효소 반응을 증강시키는 보조 인자의 작용을 대체 가능한 기능성 분자를 취득할 수 있다(WO2005/035754). 그러한 효소-기질-보조 인자의 조합으로, 예를 들면 혈액 응고 제Ⅸ인자(FⅨa)-혈액 응고 제Ⅹ인자(FX)-혈액 응고 제Ⅷ인자(FVⅢ/FVⅢa)의 조합, 프로테인 Z 의존성 단백질 억제제(ZPI)-혈액 응고 제Ⅹ인자(FX/FXa)-프로테인 Z(PZ)의 조합, 트롬빈-트롬빈 활성화 섬유소 분해 억제제(TAFI)-트롬보모듈린(TM)의 조합 등을 들 수 있다.
또한 상기 이외에도, 진균치료(일본국 특허공개 평5-199894), 면역응답유도(일본국 특허공표 평10-511085), 면역화학(R.R. Suresh et al.(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7989-7993, C. Milstein and A.C. Cuello(1983) Nature 305: 537-540) 등에 다중특이성 항원 결합 분자가 사용될 수 있는 것이 보고되고 있다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 다중특이성 항원 결합 분자가 이중특이성 항체(예를 들면 IgG 등)에서 L쇄가 공통인 경우는 2종류의 H쇄의 헤테로다이머화를 촉진시키기 위한 각종 개변 등을 추가하는 것이 바람직하다. 그러한 개변으로는, 2종류의 H쇄의 CH3 도메인에 서로 입체적으로 상보적인 구조를 도입하는 개변(Ridgway et al.(1996) Protein Eng. 9: 617-21, WO96/27011), 2종류의 H쇄의 CH3 도메인을 IgG 유래의 서열과 IgA 유래의 서열로 번갈아 치환하는 개변(SEEDbodies: Protein Eng Des Sel. 2010 Apr; 23(4):195-202), 2종류의 H쇄의 CH3 도메인에 전하적 상호작용이 발생하는 변이를 도입하는 개변(WO2006/106905) 등이 이미 알려져 있다.
다른 태양에 있어서, 본 발명은 항원 결합 분자의 제조방법으로, 아래의 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다：
(a) 소정의 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 회합된 참조가 되는 항원 결합 분자(부모 항원 결합 분자)의 제1 폴리펩티드와 같은 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지를, 부모 항원 결합 분자의 제2 폴리펩티드와 다른 아미노산 서열의 제2 폴리펩티드를 각각 발현 가능한 박테리아 집단에 접촉시켜서, 공통된 제1 폴리펩티드와 아미노산 서열이 다른 제2 폴리펩티드가 각각 회합된, 항원 결합 분자(자식 항원 결합 분자)를 제시하는 복수의 박테리오파지를 포함하는 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작하는 공정, 및
(b) 공정(a)에서 제작된 항원 결합 분자 제시 라이브러리에 상기 항원을 접촉시켜서 상기 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 자식 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
당해 방법은, 추가로 아래의 공정을 포함해도 된다.
(c) 공정(b)에서 선택한 자식 항원 결합 분자 중에서 부모 항원 결합 분자와 비교하여 다른 물성을 갖는 자식 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
추가적인 태양에 있어서, 당해 항원 결합 분자의 제조방법은 아래의 공정을 추가로 포함하는 방법에 관한 것이어도 된다：
(d) 상기 공정(b)에서 선택되었거나 또는 상기 공정(c)에서 취득된 자식 항원 결합 분자의 제2 폴리펩티드와 같은 아미노산 서열의 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지를, 자식 항원 결합 분자의 제1 폴리펩티드와 다른 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드를 각각 발현 가능한 박테리아 집단에 접촉시켜서, 공통된 제2 폴리펩티드와 아미노산 서열이 다른 제1 폴리펩티드가 각각 회합된, 항원 결합 분자(손자 항원 결합 분자)를 제시하는 복수의 박테리오파지를 포함하는 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작하는 공정, 및
(e) 공정(d)에서 제작된 항원 결합 분자 제시 라이브러리에 상기 항원을 접촉시켜서 상기 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 손자 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
당해 방법은, 추가로 아래의 공정을 포함해도 된다.
(f) 공정(e)에서 선택한 손자 항원 결합 분자 중에서 자식 항원 결합 분자와 비교하여 다른 물성을 갖는 손자 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
여기서, 상기 공정(c) 또는 상기 공정(f)에서의 상기 물성은 한정되지는 않으나, 예를 들면 등전점, 열안정성, 화학적 안정성, 용해도, 점도, 당쇄 부가 상황, 항원 결합 분자 자신의 균일성, 면역원성 및/또는 상기 항원에 대한 친화성 또는 결합 특이성(J Biol Chem 2005; 280:24880-7)을 의미해도 된다.
일 실시태양에 있어서, 당해 항원 결합 분자의 제조방법으로, 참조가 되는 항원 결합 분자와 비교하여 항원에 대한 친화성 또는 결합 특이성이 우수한 항원 결합 분자；열안정성 또는 화학적 안정성이 우수한 항원 결합 분자；용해도가 향상된 항원 결합 분자；당쇄 부가 아미노산 서열이 포함되지 않는 항원 결합 분자；항원 결합 분자 자신의 균일성이 향상된 분자；면역원성(의 리스크)이 저하된 항원 결합 분자； 및/또는 등전점 또는 점도가 변경된 항원 결합 분자가 제공된다. 당해 항원 결합 분자의 제조방법이 항원에 대한 친화성이 우수한 항원 결합 분자를 제공하는 경우에는, 당해 방법은 항원 결합 분자를 친화성 성숙하는 방법에 관한 것이다.
　또한 당해 방법으로 물성이 뒤떨어진 항체가 얻어진 경우이더라도, 예를 들면 비인간 동물 유래 항체의 인간화 등에 사용할 수 있기 때문에 유리하다(J Mol Biol. 2000 Feb 25;296(3):833-49.). 예를 들면 비인간 동물 유래의 제1 폴리펩티드를 고정하고 인간 유래의 제2 폴리펩티드의 라이브러리와 조합하여 항원에 대해 패닝 조작을 행함으로써 인간 유래의 제2 폴리펩티드를 취득할 수 있다. 계속해서, 제2 폴리펩티드를 고정하고 인간 유래의 제1 폴리펩티드의 라이브러리와 조합하여 항원에 대해 패닝 조작을 행함으로써 인간 유래의 제1 폴리펩티드를 취득할 수 있다. 이와 같이 순차적으로 인간 항체 라이브러리와 치환함으로써 비인간 동물 유래 항체를 기반으로 인간 항체를 취득하는 것이 가능하다.
예를 들면 항체의 가변영역의 아미노산 잔기 중 표면에 노출할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하여 전하(pI：등전점)를 바꿈으로써 항체의 혈중반감기, 평균 혈중 체류시간을 연장 또는 단축하거나, 또는 혈중 클리어런스를 저하 또는 향상시킬 수 있는 것이 보고되고 있다(WO2007/114319；WO2009/041643).
예를 들면 항체의 H쇄 가변영역과 L쇄 가변영역의 계면에 있는 아미노산 잔기를 바꿈으로써 열안정성을 향상시킬 수 있는 것이 보고되고 있다(J Mol Biol. 2003 Jan 17;325(3):531-53).
예를 들면 항체 가변영역의 글루타민 잔기를 글루타민산 잔기로 치환함으로써 화학적 안정성을 향상시킬 수 있는 것이 보고되고 있다(Anticancer Drugs. 2010 Nov;21(10):907-16).
예를 들면 항체 가변영역의 소수성 잔기를 소수성이 낮은 잔기로 치환함으로써 용해도를 향상시킬 수 있는 것이 보고되고 있다(Protein Sci. 2010 May;19(5):954-66).
또한 항체 가변영역으로부터 N형 당쇄 부가 서열을 제거함으로써 생산되는 항체의 불균일성을 저감시킬 수 있는 것이 보고되고 있다(J Mol Biol. 2011 Oct 14;413(1):261-78).
따라서, 당업자는 목적에 따라 당해 항원 결합 분자의 제조방법으로 항체의 안정성이나 등전점 등을 바꿈으로써, 예를 들면 항체의 혈중반감기, 평균 혈중체류시간을 연장 또는 단축하거나, 또는 혈중 클리어런스를 저하 또는 향상시킬 수 있는 것을 이해한다.
상기 공정(c) 또는 상기 공정(f)를 실시하는 경우에 있어서, 항원 결합 분자를 취득하는 방법으로는, 당업자에게 공지된 방법이면 특별히 한정되지 않는다.
예를 들면 항원과 접촉시켜서 당해 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 선택한 후에, 목적하는 물성을 갖는 항원 결합 분자군에 대해서 패닝 조작을 행하지 않고 당해 물성을 평가(예를 들면 측정 또는 예측)해도 된다(MAbs. 2011 May-Jun;3(3):243-52). 또는 패닝 조작을 행하여 후보가 되는 항원 결합 분자를 선발한(좁힌) 후에 당해 물성을 평가해도 된다.
예를 들면 상기 「다른 물성」이 항원에 대한 친화성인 경우에는 ELISA, FACS, 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 Biacore, 또는 본 실시예에서 사용한 Octet system과 같은 바이오레이어 간섭법(BioLayer Interferometry: BLI)을 이용해도 된다.
예를 들면 상기 「다른 물성」이 등전점인 경우에는 얻어진 항원 결합 분자의 아미노산 서열에 기초하여, Getetyx 등의 당업자에게 공지된 시판의 소프트웨어를 사용하여 등전점을 계산(예측)하는 것이 가능하다. 일 실시태양에 있어서, 항원에 대해 충분한 특이적 결합능을 갖는 항원 결합 분자의 아미노산 서열에 대해서 등전점 예측을 행하여 목적하는 등전점을 갖는 분자를 선택해도 된다. 또는 등전점 전기영동(IEF) 등을 사용하여 실제로 등전점을 측정해도 된다(Protein Eng Des Sel. 2010 May;23(5):385-92).
예를 들면 상기 「다른 물성」이 열안정성 또는 화학적 안정성인 경우에는 패닝 조작 전에 항원 결합 분자에 열을 가한 후, 또는 항원 결합 분자를 변성시킨 후에 항원에 대해 패닝 조작을 행해도 된다(Methods Mol Biol. 2012;907:123-44).
다른 태양에 있어서, 본 발명은 개변된 헬퍼 파지 및 당해 헬퍼 파지가 감염 가능한 박테리아의 조합으로, 당해 헬퍼 파지는 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지이고, 또한 당해 박테리아는 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아인 조합에 관한 것이다.
본 발명에서의 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 서로 회합하여 하나의 항원 결합 분자를 형성하는 것을 특징으로 한다.
일태양에 있어서, 본 발명에서의 헬퍼 파지 및 박테리아의 조합이란, 당해 박테리아에 당해 헬퍼 파지를 감염시키는 것을 전제로 양자를 구성요건으로 포함하는 것 전반을 가리킨다. 양자가 혼합되기 전의 서로 별개의 것으로, 아직 양자가 감염 가능한 상태가 되어 있지 않은 것도 본 발명에 포함되며, 양자가 혼합된 후의 혼합물로, 이미 양자가 감염 가능한 상태가 되어 있는 것도 본 발명에 포함된다.
다른 태양에 있어서, 본 발명의 개변된 헬퍼 파지 및 당해 헬퍼 파지가 감염 가능한 박테리아의 조합을 제조하는 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 개변된 헬퍼 파지는 헬퍼 파지의 게놈 DNA에 제한 효소 절단 부위를 이용하여 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하고, 그와 같이 하여 제작된 개변 헬퍼 파지의 게놈 DNA를 숙주인 박테리아에 도입함으로써 제작할 수 있다. 헬퍼 파지가 M13KO7인 경우의 바람직한 제한 효소 절단 부위로는, 카나마이신 내성 유전자와 p15A ori 사이에 위치하고 있는 SacI 사이트나, p15A ori와 M13 ori 사이에 위치하고 있는 SacII 사이트 등을 들 수 있다. 상기와 같이 하여 개변된 헬퍼 파지의 게놈 DNA가 도입된 박테리아 내에서는 파지 입자가 생산되고, 또한 그 중에 당해 개변된 헬퍼 파지의 게놈 DNA가 패키징됨으로써 개변된 헬퍼 파지가 재구성된다. 또한 당해 헬퍼 파지가 감염 가능한 박테리아는 박테리아에 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 제작할 수 있다.
다른 태양에 있어서, 본 발명의 개변된 헬퍼 파지 및 당해 헬퍼 파지가 감염 가능한 박테리아의 조합에 있어서, 거기에 포함되는 개변된 헬퍼 파지도 또한 본 발명에 포함된다. 즉, 본 발명은 어떤 폴리펩티드를 발현 가능한 개변된 헬퍼 파지로, 당해 폴리펩티드가 회합하여 항원 결합 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드 중 어느 한쪽인 헬퍼 파지에 관한 것이다. 또는 본 발명은 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 개변된 헬퍼 파지로, 당해 제1 폴리펩티드가 다른 제2 폴리펩티드와 회합하여 하나의 항원 결합 분자를 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 헬퍼 파지에 관한 것이다.
다른 태양에 있어서, 본 발명의 개변된 헬퍼 파지를 포함하는 키트도 본 발명에 포함된다. 즉, 본 발명은 어떤 폴리펩티드를 발현 가능한 개변된 헬퍼 파지로, 당해 폴리펩티드가 회합하여 항원 결합 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드 중 어느 한쪽인 헬퍼 파지를 포함하는 키트에 관한 것이다. 또는 본 발명은 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 개변된 헬퍼 파지로, 당해 제1 폴리펩티드가 다른 제2 폴리펩티드와 회합하여 하나의 항원 결합 분자를 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 헬퍼 파지를 포함하는 키트에 관한 것이다. 그들은 항원 결합 분자를 제시하는 박테리오파지를 제작하기 위한 키트, 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작하기 위한 키트, 소정의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 취득하기 위한 키트, 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 다중특이성 항원 결합 분자를 제작하기 위한 키트, 또는 참조가 되는 항원 결합 분자와는 다른 물성을 갖는 항원 결합 분자를 제조하기 위한 키트일 수 있다. 본 발명의 키트는 당해 헬퍼 파지가 감염 가능한 박테리아로, 항원 결합 분자를 형성하는 상기 2개의 폴리펩티드 중 나머지 한쪽 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아, 또는 당해 헬퍼 파지가 감염 가능한 박테리아로, 상기 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아를 추가로 포함하고 있어도 된다.
본 명세서에 기재된 1 또는 복수의 태양을 임의로 조합한 것도 당업자의 기술상식에 기초하여 기술적으로 모순되지 않는 한, 본 발명에 포함되는 것이 당업자에게는 당연히 이해된다.
본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.
제1, 제2 등의 용어가 각종 요소를 표현하기 위하여 사용되나, 이들 요소는 그들의 용어에 의해 한정되어야 하는 것이 아니라는 것이 이해된다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되고 있으며, 예를 들면 제1 요소를 제2 요소로 기재하고, 동일하게 제2 요소를 제1 요소로 기재하는 것은, 본 발명의 범위를 일탈하는 일 없이 가능하다고 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 특정의 실시태양을 설명하기 위하여 사용되며, 발명을 한정하는 의도로 이해되어서는 안 된다. 다른 정의가 명시되어 있지 않은 한, 본 명세서에서 사용되는 용어(기술용어 및 과학용어를 포함한다.)는, 본 발명이 속하는 기술분야에 있어서 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 같은 의미를 갖는 것으로 해석되며, 또한 이상화되거나 또는 과도하게 형식적인 의미에 있어서 해석되어야 하는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 「포함한다」는, 문맥상 명확히 다른 이해를 해야하는 경우를 제외하고, 기술된 사항(부재, 공정, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것이며, 그 이외의 사항(부재, 공정, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.
본 발명의 실시태양은 모식도를 참조하면서 설명되는 경우가 있으나, 설명을 명확히 하기 위하여 과장되게 표현되는 경우가 있다.
본 명세서에 기재된 수치는 문맥에 반하지 않는 한, 당업자의 기술상식에 따라 일정의 폭을 갖는 값으로 이해된다. 예를 들면 「1 ㎎」의 기재는「약 1 ㎎」으로 기재된 것으로 이해되어, 일정의 변동량을 포함하는 것으로 이해된다. 또한 본 명세서에 있어서 예를 들면 「1~5개」라고 기재되어 있는 경우, 문맥에 반하지 않는 한, 「1개, 2개, 3개, 4개, 5개」로 각각의 값이 개별 구체적으로 기재되어 있는 것으로 이해된다.
실시예
본 발명은 아래의 실시예에 의해 추가적으로 예시되나, 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] H쇄 발현 파지미드 벡터와 L쇄 발현 헬퍼 파지의 조합에 의한 Fab 제시 파지 생산법의 확립
(1-1) L쇄 발현 유닛을 삽입한 L쇄 발현 헬퍼 파지의 구축
헬퍼 파지의 게놈에 프로모터, 시그널 서열, 항체 L쇄 유전자 등을 삽입함으로써 L쇄 발현 헬퍼 파지의 구축을 행하였다. 본 헬퍼 파지가 감염된 대장균으로부터는 항체 L쇄의 발현이 가능해진다.
구체적으로는, 헬퍼 파지(M13KO7: Invitrogen)를 대장균주 XL1-Blue에 감염시켜 하룻밤 진탕배양을 행한 후, 헬퍼 파지로부터의 게놈 추출을 행하였다(QIAprep Spin Miniprep Kit : QIAGEN). 헬퍼 파지 게놈에 포함되는 gene 3 유전자의 N2 도메인에 BamHI 사이트, gene 1에 PacI 사이트가 있다. 얻어진 헬퍼 파지 게놈을 BamHI, PacI로 절단한 후, 0.6% 아가로오스겔로 전기영동을 행하여 겔 추출 정제(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system: Promega)를 행함으로써 gene 3~gene 1 부분의 DNA 단편 및 나머지 게놈 측의 DNA 단편을 각각 조제하였다. 조제된 gene 3~gene 1 부분의 DNA 단편을 주형으로 PCR을 행하여, gene 3의 N2 도메인과 CT 도메인 사이에 트립신 절단 서열을 코드하는 DNA가 삽입된 DNA 단편을 새롭게 제작하였다. 개변 전의 gene 3의 아미노산 서열을 서열번호：1에, 개변된 gene 3의 아미노산 서열을 서열번호：2에 나타낸다. 이 DNA 단편을 앞서 조제한 나머지 게놈 측의 DNA 단편과 다시 연결시킴으로써, 헬퍼 파지의 pⅢ 단백질의 N2 도메인과 CT 도메인 사이에 트립신 절단 서열을 삽입한 헬퍼 파지 M13KO7TC가 구축되었다(일본국 특허공표 제2002-514413을 참조).
헬퍼 파지 M13KO7TC를 대장균주 ER2738에 감염시켜 하룻밤 진탕배양을 행한 후, 감염 대장균으로부터 헬퍼 파지 M13KO7TC의 게놈 추출을 행하였다(NucleoBond Xtra Midi PlUS). L쇄 발현 유닛을 삽입하는 장소로, 카나마이신 내성 유전자와 p15A ori 사이에 위치하고 있는 SacI 사이트를 선택하였다(도 1). 이 장소에 한정되지 않고, p15A ori와 M13 ori 사이에 위치하고 있는 SacII 사이트 등으로의 삽입이어도 문제 없을 것으로 생각된다. 상기 방법으로 정제한 헬퍼 파지 M13KO7TC 게놈을 SacI으로 절단한 후, 0.6% 아가로오스겔로 전기영동을 행하여, 겔 추출 정제(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system: Promega)를 행함으로써 목적의 DNA 단편(M13KO7TC/SacI)을 얻었다.
도입하는 항체 L쇄(VL 및 CL)로서 항인간 IL-6R 항체인 PF1의 L쇄를 사용하였다. 이때, L쇄 불변영역의 C말단에 있는 Cys의 Ala로의 치환이 대장균에서의 Fab 발현에 유리한 것이 알려져 있기 때문에(J Biol Chem. 2003 Oct 3; 278(40): 38194-38205) 그러한 서열을 사용하였다. lac 프로모터-pelB 시그널 서열-PF1 L쇄 유전자를 in-fusion법(In-Fusion HD Cloning Kit: Clontech)으로 M13KO7TC/SacI에 삽입하고, 대장균주 ER2738에 전기천공법으로 도입하였다. lac 프로모터의 핵산 서열을 서열번호：3에, pelB 시그널 서열의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 서열번호：4 및 서열번호：5에, PF1 L쇄의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 서열번호：6 및 서열번호：7에 각각 나타낸다.
얻어진 대장균을 배양하고, 배양상청에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 PEG 침전법으로 헬퍼 파지를 정제하였다. 얻어진 헬퍼 파지 M13KO7TC-PF1L의 타이터를 일반적인 플라크 형성법으로 확인하였다.
(1-2) H쇄 발현 파지미드 벡터의 구축
파지 표면 상에 항체 H쇄를 발현하기 위한 파지미드 벡터를 구축하였다. 파지미드 벡터는 플라스미드 벡터에 파지 입자로의 패키징 시그널, 프로모터, 시그널 서열, 항체 H쇄 유전자, 링커 유전자, gene 3 유전자 등을 각각 기능적으로 삽입함으로써 제작하였다. 항체 H쇄는 링커 펩티드를 매개로 gene 3 단백질(g3p)과 융합되어 있다. 도입하는 항체 H쇄(VH 및 CH1으로 이루어지는 Fd)로서 항인간 IL-6R 항체인 PF1의 H쇄를 사용하였다. PF1 H쇄의 아미노산 서열을 서열번호：8에 나타낸다. 구축한 파지미드 벡터를 대장균주 ER2738에 전기천공법으로 도입하여, PF1 H쇄 발현 파지미드 벡터를 보유하는 대장균 ER2738/pAG-PF1H를 구축하였다.
(1-3) H쇄 발현 파지미드 벡터와 L쇄 발현 헬퍼 파지의 조합에 의한 Fab 제시 파지의 생산
대장균 ER2738/pAG-PF1H를 OD 0.5 부근까지 배양한 후, 헬퍼 파지 M13KO7TC-PF1L 또는 M13KO7TC를 감염시켰다. 배지교환을 실시 후, 30℃에서 하룻밤 배양하여 배양상청을 회수하였다. 파지가 생산된 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 파지를 침전시키고 그것을 TBS로 용해하여 파지액을 취득하였다. 얻어진 파지의 타이터를 일반적인 콜로니 형성법으로 확인하였다.
(1-4) 파지 ELISA법에 의한 파지로의 Fab 제시의 확인
파지 ELISA법으로 생산된 파지의 Fab 제시의 확인 및 항원으로의 결합능의 확인을 행하였다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)에 Goat anti-Human Kappa Biotin 항체(EY LABORATORIES), 또는 비오틴 표지 인간 IL-6R을 포함하는 100 μL의 PBS를 첨가하여 플레이트를 코팅하였다. 당해 플레이트의 각 웰을 0.1×TBST(0.1% Tween20을 포함하는 0.1×TBS)로 세정함으로써 항원을 제거한 후, 당해 웰에 0.02% Skim Milk-0.1×TBS(0.02% Skim Milk를 포함하는 0.1×TBS) 250 μL를 첨가하여 1시간 이상 블로킹하였다. 0.02% Skim Milk-0.1×TBS를 제거한 후, 각 웰에 0.02% Skim Milk-0.1×TBS로 희석된 파지액을 첨가하여 37℃에서 1시간 정치함으로써 파지 상에 제시된 항체를 Goat anti-Human Kappa Biotin 항체 또는 비오틴화 인간 IL-6R에 결합시켰다. 0.1×TBST로 세정된 후, 각 웰에 0.1×TBST로 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)를 첨가하여 1시간 인큐베이션하였다. 0.1×TBST로 세정 후, 각 웰에 TMB single 용액(ZYMED)을 첨가하고, 추가로 황산을 첨가하여 용액의 발색반응을 정지시킨 후, 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, H쇄 발현 파지미드 벡터와 L쇄 발현 헬퍼 파지 M13KO7TC-PF1L을 조합하여 파지를 생산시킨 경우에만 파지 상에 Fab가 제시되고(도 2), 또한 파지 상에 제시된 Fab가 항원 결합능을 유지하고 있는 것이 확인되었다(도 3).
[실시예 2] 나이브 H쇄(naive H chains)를 포함하는 파지미드 라이브러리의 구축과 나이브 H쇄 및 PF1 L쇄를 포함하는 Fab 파지 라이브러리의 생산
인간 말초혈 단핵구(PBMC)로부터 조제한 폴리A RNA나 시판되고 있는 인간 폴리A RNA 등을 주형으로 PCR법으로 나이브 H쇄 가변영역 유전자가 증폭되었다. 이들을 파지미드 벡터에 삽입하고 구축된 파지미드 벡터를 대장균주 ER2738에 전기천공법으로 도입하였더니 1.1×1010 정도의 콜로니가 얻어졌다.
이들 대장균에 실시예 1에서 구축한 헬퍼 파지 M13KO7TC-PF1L을 감염시켜 배양함으로써 나이브 H쇄와 PF1 L쇄를 포함하는 Fab를 제시하는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리(NH-PF1L 라이브러리)를 구축하였다.
[실시예 3] PF1 L쇄를 갖고, 또한 각종 항원에 결합 가능한 Fab의 취득
(3-1) 비오틴 표지 인간 PlexinA1의 조제
단회 막관통 단백질인 인간 플렉신A1(hPlexinA1)의 세포외영역을 아래와 같이 조제하였다. NCBI Reference Sequence NP_115618(서열번호：9)의 아미노산 서열을 기반으로 합성된 hPlexinA1 유전자로부터 막관통영역으로 예상되는 1245번째의 알라닌 이후를 제거하고, 그 대신에 FLAG 태그 서열(서열번호：13)을 부가하였다. 또한 1-26번째까지의 시그널 펩티드(서열번호：14)를 인공 시그널 펩티드 HMM+38(서열번호：15)로 치환하였다. 제작된 hPlexinA1(서열번호：10)을 코드하는 유전자를 동물 세포용 발현 벡터에 삽입하고, 293Fectin(Invitorgen)을 사용하여 FreeStyle293 세포(Invitorgen)에 도입하였다. 이때, 목적 유전자의 발현 효율 향상을 위해 EBNA1(서열번호：17)을 발현하는 유전자를 동시에 도입하였다. 전술한 순서에 따라 유전자 도입된 세포를 37℃, 8% CO2에서 6일간 배양하여 목적의 단백질을 배양상청 중에 분비시켰다.
목적의 hPlexinA1을 포함하는 세포 배양액을 0.22 ㎛ 바틀탑 필터로 여과하여 배양상청을 얻었다. D-PBS(-)(와코 순약)로 평형화된 항FLAG 항체 M2 아가로오스(Sigma-Aldrich)에 배양상청을 적용한 후, FLAG 펩티드를 용해한 D-PBS를 첨가함으로써 목적의 hPlexinA1을 용출시켰다. 다음으로 D-PBS(-)로 평형화된 Superdex 200(GE 헬스케어)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피에 의해 hPlexinA1을 포함하는 분획을 분취하였다.
전술한 바와 같이 제작된 hPlexinA1에 대해 EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo SCIENTIFIC)을 사용함으로써 비오틴 표지 hPlexinA1이 조제되었다.
(3-2) 비오틴 표지 마우스 IgA-Fc영역의 조제
마우스 IgA-Fc영역(mIgA-Fc：마우스 IgA의 CH2 및 CH3 도메인, 서열번호：11)의 C말단에 비오틴을 부가할 목적으로, mIgA-Fc를 코드하는 유전자 단편의 하류에 비오틴 리가아제에 의해 비오틴이 부가되는 특이적인 서열(AviTag 서열, 서열번호：16)을 코드하는 유전자 단편을 링커를 매개로 연결시켰다. mIgA-Fc와 AviTag 서열이 연결된 단백질(mIgA_CH2-CH3-Avitag(서열번호：12))을 코드하는 유전자 단편을 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하고, 구축된 플라스미드 벡터를 293Fectin(Invitrogen)을 사용하여 FreeStyle293 세포(Invitrogen)에 도입하였다. 이때 EBNA1(서열번호：17)을 발현하는 유전자 및 비오틴 리가아제(BirA, 서열번호：18)를 발현하는 유전자를 동시에 도입하고, 추가로 mIgA-Fc를 비오틴 표지할 목적으로 비오틴을 첨가하였다. 전술한 순서에 따라 유전자가 도입된 세포를 37℃, 8% CO2에서 6일간 배양하여 목적의 단백질을 배양상청 중에 분비시켰다.
목적의 mIgA-Fc를 포함하는 세포 배양액을 0.22 ㎛ 바틀탑 필터로 여과하여 배양상청을 얻었다. 20 mM Tris-HCl, pH 7.4로 평형화된 HiTrap Q HP(GE 헬스케어)에 같은 용액으로 희석된 배양상청을 적용하여 NaCl의 농도 구배로 목적의 mIgA-Fc를 용출시켰다. 다음으로 50 mM Tris-HCl, pH 8.0으로 평형화된 SoftLink Avidin 칼럼(Promega)에 같은 용액으로 희석된 상기 HiTrap Q HP 용출액을 적용하여 5 mM 비오틴, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0으로 목적의 mIgA-Fc를 용출시켰다. 그 후, Superdex200(GE 헬스케어)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피에 의해 목적 외의 불순물인 mIgA-Fc 회합체를 제거하여 버퍼가 20 mM Histidine-HCl, 150 mM NaCl, pH 6.0으로 치환된 정제 mIgA-Fc를 얻었다.
(3-3) 비오틴 표지 인간 IL-6R의 조제
가용형 인간 IL-6R(hIL-6R, 서열번호：19)의 C말단에 비오틴을 부가할 목적으로, 가용형 hIL-6R을 코드하는 유전자 단편의 하류에 비오틴 리가아제에 의해 비오틴이 부가되는 특이적인 서열(AviTag 서열, 서열번호：16)을 코드하는 유전자 단편을 링커를 매개로 연결시켰다. 가용형 hIL-6R과 AviTag 서열이 연결된 단백질(shIL6R-Avitag, 서열번호：20)을 코드하는 유전자 단편을 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하고, 구축된 플라스미드 벡터를 293Fectin(Invitrogen)을 사용하여 FreeStyle293 세포(Invitrogen)에 도입하였다. 이때 EBNA1(서열번호：17)을 발현하는 유전자 및 비오틴 리가아제(BirA, 서열번호：18)를 발현하는 유전자를 동시에 도입하고, 추가로 가용형 hIL-6R을 비오틴 표지할 목적으로 비오틴을 첨가하였다. 전술한 순서에 따라 유전자가 도입된 세포를 37℃, 8% CO2에서 배양하여 목적의 단백질을 배양상청 중에 분비시켰다.
목적의 가용형 hIL-6R을 포함하는 세포 배양액으로부터 (3-2)와 동일한 방법으로 정제를 행하여 비오틴 표지 hIL-6R을 얻었다.
(3-4) NH-PF1L 라이브러리로부터의 각종 항원(인간 PlexinA1, 마우스 IgA-Fc, 인간 IL-6R)에 결합하는 항체 단편의 취득
실시예 2에서 구축된 PF1 L쇄를 포함하는 항체 라이브러리(NH-PF1L 라이브러리)로부터 각종 항원(hPlexinA1, mIgA-Fc, hIL-6R)에 결합하는 항체 단편의 선발을, 각 항원으로의 결합능을 지표로 실시하였다.
인간 나이브 H쇄 유전자가 삽입된 파지미드 벡터를 보유하는 대장균에 헬퍼 파지 M13KO7TC-PF1L을 감염시켜 배양함으로써, 인간 항체 H쇄와 PF1 L쇄를 포함하는 Fab를 제시하는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리(NH-PF1L 라이브러리)가 구축되었다. 파지가 생산된 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 파지를 침전시키고, 그것을 TBS로 희석시킴으로써 파지 라이브러리액을 얻었다. 다음으로 파지 라이브러리액에 종농도 4%가 되도록 BSA를 첨가하여 파지 라이브러리액을 블로킹하였다. 패닝방법으로 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화된 항원을 사용하는 패닝방법이 참조되었다(J. Immunol. Methods.(2008) 332(1-2), 2-9, J. Immunol. Methods.(2001) 247(1-2), 191-203, Biotechnol. Prog.(2002) 18(2), 212-220, Mol. Cell Proteomics(2003) 2(2), 61-69). 자기 비드로서 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다. 구체적으로는, 조제된 파지 라이브러리액에 비오틴 표지 항원(비오틴 표지 hPlexinA1, 비오틴 표지 mIgA-Fc, 비오틴 표지 hIL-6R)을 첨가하여 파지 라이브러리액과 항원을 실온에서 60분간 접촉시켰다. 첫번째 패닝에서는 250 pmol, 두번째 패닝에서는 40 pmol, 세번째 패닝에서는 10 pmol의 비오틴 표지 항원이 각각 사용되었다. 거기에 BSA용액으로 블로킹된 자기 비드를 첨가하여 항원-파지 복합체와 자기 비드를 실온에서 15분간 결합시켰다. 회수된 비드는 1 mL의 TBST(0.1% Tween20을 포함하는 TBS)와 1 mL의 TBS로 세정되었다. 그 후, 비드에 1 ㎎/mL의 트립신용액 0.5 mL를 첨가하여 실온에서 15분간 현탁시킨 후, 즉각 자기 스탠드를 사용하여 비드를 분리하고 상청의 파지용액을 회수하였다. 회수된 파지용액을 대수증식기(OD600=0.4-0.7)까지 배양된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가하여 37℃에서 1시간 완만하게 교반배양함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염된 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균을 회수하여 배양한 후, 헬퍼 파지 M13KO7TC-PF1L을 감염시켜 배양함으로써 PF1 L쇄를 포함하는 Fab를 제시하는 파지를 생산시켰다. 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다. 이것을 1회의 패닝으로하여, 합계 3회의 패닝이 반복되었다.
(3-5) 각종 항원(인간 PlexinA1, 마우스 IgA-Fc, 인간 IL-6R)에 결합하는 항체의 파지 ELISA법에 의한 스크리닝
(3-4)에서 실시된 패닝이 2회 또는 3회 종료된 후에 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol.(2002) 178, 133-145)에 따라 파지의 생산을 행하고 파지 함유 배양상청을 회수하였다. 이때, 헬퍼 파지에는 M13KO7TC-PF1L을 사용하였다. 배양상청은 아래의 순서로 ELISA에 제공되었다.
비오틴 표지 항원(hPlexinA1, mIgA-Fc, hIL-6R)을 포함하거나 또는 포함하지 않는 100 μL의 PBS로 StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)를 하룻밤 코팅하였다. 당해 플레이트의 각 웰을 0.1×TBST(0.1% Tween20을 포함하는 0.1×TBS)로 세정함으로써 항원을 제거한 후, 각 웰을 250 μL의 0.02% SkimMilk-0.1×TBS(0.02% SkimMilk를 포함하는 0.1×TBS)로 1시간 이상 블로킹하였다. 0.02% SkimMilk-0.1×TBS를 제거한 후, 각 웰에 파지 배양상청을 첨가하여 플레이트를 37℃에서 1시간 정치함으로써, 파지 상에 제시된 항체를 각 웰에 존재하는 비오틴 표지 항원에 결합시켰다. 각 웰을 0.1×TBST로 세정한 후, 0.1×TBST에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)를 첨가하여 플레이트를 1시간 인큐베이션하였다. 각 웰을 TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)을 첨가하고, 추가로 용액의 발색반응을 황산의 첨가에 의해 정지시킨 후, 각 웰의 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다.
상기의 파지 ELISA의 결과, 항원을 코팅하지 않은 플레이트에 대한 항원을 코팅한 플레이트의 발색비가 2배 이상이고, 또한 항원을 코팅한 플레이트에서의 발색이 0.2 이상인 것을 항원 특이적으로 결합하는 클론으로 판단하였다. 또한 항원 특이적으로 결합하는 것으로 판단된 클론에 대해 항체 단편 유전자의 염기서열 해석이 행하여졌다.
파지 ELISA의 결과를 표 1에 나타낸다. 표 중에서의 R2는 패닝 2회 종료 후의 클론, R3는 패닝 3회 종료 후의 클론을 각각 나타낸다. 그 결과, hPlexinA1, mIgA-Fc, hIL-6R의 각 항원에 대해 특이적으로 결합하고, 또한 서열이 다른 복수의 클론이 얻어졌다.
Figure 112016037223402-pct00001
[실시예 4] PF1 L쇄를 갖는 각종 항원 결합 항체의 IgG에서의 결합능 평가
(4-1) 취득된 PF1 L쇄를 갖는 각종 항원(인간 PlexinA1, 마우스 IgA-Fc, 인간 IL-6R) 결합 항체의 발현 및 정제
실시예 3에 있어서 인간 IL-6R에 대한 결합 항체로서 취득된 항체 중 6RNH-2_02(중쇄, 서열번호：21), 6RNH-2_37(중쇄, 서열번호：22), 6RNH-3(2)_32(중쇄, 서열번호：23), 6RNH-2_42(중쇄, 서열번호：24)의 4항체를, 인간 PlexinA1에 대한 결합 항체로서 취득된 항체 중 PANH-2_52(중쇄, 서열번호：25), PANH-2_68(중쇄, 서열번호：26), PANH-3_10(중쇄, 서열번호：27)의 3항체를, 마우스 IgA-Fc에 대한 결합 항체로서 취득된 항체 중 mIANH-2_27(중쇄, 서열번호：28), mIANH-3_79(중쇄, 서열번호：29)의 2항체를 아래의 방법을 사용하여 발현시켜 당해 항체의 정제가 행하여졌다. 이들 모든 항체는 경쇄로서 PF1의 L쇄(경쇄, 서열번호：67)를 갖는 항체이다. 또한 비교 대상으로서 항IL-6R 항체인 PF1 항체(중쇄, 서열번호：68；경쇄, 서열번호：67)에 대해서도 아래의 방법을 사용하여 발현시켜 당해 항체의 정제가 행하여졌다. FreeStyle 293 Expression Medium 배지(Invitrogen)에 현탁된 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 1.33×106 세포/mL의 세포 밀도로 6웰 플레이트의 각 웰에 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법으로 세포에 도입되었다. CO2 인큐베이터(37도, 8% CO2, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행하여졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 ㎚에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법으로 산출된 흡광 계수를 사용함으로써 얻어진 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science(1995) 4, 2411-2423).
(4-2) 취득된 항체의 가용형 인간 IL-6R에 대한 결합능의 평가
Octet RED384(forteBIO)를 사용하여 (4-1)에서 취득된 항체(6RNH-2_02, 6RNH-2_37, 6RNH-3(2)_32, 6RNH-2_42)의 가용형 인간 IL-6R에 대한 결합활성이 평가되었다. 버퍼로서 HBS-EP+ Buffer(GE Healthcare)를 사용하여 결합 평가가 행하여졌다.
Protein G Biosensors(forteBIO)에 항체를 결합시킨 후, 가용형 인간 IL-6R과 120초 접촉시켜서 바이오센서 상의 항체와 상호작용시키고, 계속해서 버퍼에 120초 접촉시켜서 항체·항원의 상호작용을 측정하였다. 그 후, 10 mmol/L Glycin-HCl, pH 1.5와 접촉시켜서 바이오센서가 재생되었다. 측정은 30℃에서 행하여졌다. 얻어진 센서그램을 도 4에 나타내었다. 6RNH-2_02, 6RNH-2_37, 6RNH-3(2)_32, 6RNH-2_42의 모든 항체가 가용형 인간 IL-6R과 결합하는 것이 나타내어졌다.
(4-3) 취득된 항체의 가용형 인간 PlexinA1에 대한 결합능의 평가
Octet RED384(forteBIO)를 사용하여 (4-1)에서 취득된 항체(PANH-2_52, PANH-2_68, PANH-3_10) 및 항인간 IL-6R 항체인 PF1 항체의 가용형 인간 PlexinA1, 가용형 인간 IL-6R에 대한 결합활성이 평가되었다. 버퍼로서 HBS-EP+ Buffer(GE Healthcare)를 사용하여 결합 평가가 행하여졌다.
Protein G Biosensors(forteBIO)에 항체를 결합시킨 후, 가용형 인간 PlexinA1 또는 가용형 인간 IL-6R과 120초 접촉시켜서 바이오센서 상의 항체와 상호작용시키고, 계속해서 버퍼에 120초 접촉시켜서 항체·항원의 상호작용을 측정하였다. 그 후, 10 mmol/L Glycin-HCl, pH 1.5와 접촉시켜서 바이오센서가 재생되었다. 측정은 30℃에서 행하여졌다. 얻어진 센서그램을 도 5에 나타내었다. PANH-2_52, PANH-2_68, PANH-3_10의 모든 항체가 가용형 인간 IL-6R과 결합하지 않고, 가용형 인간 PlexinA1에 결합하는 것이 나타내어졌다.
(4-4) 취득된 항체의 마우스 IgA에 대한 결합능의 평가
Octet RED384(forteBIO)를 사용하여 (4-1)에서 취득된 항체(mIANH-2_27, mIANH-3_79) 및 PF1 항체의 마우스 IgA, 가용형 인간 IL-6R에 대한 결합활성이 평가되었다. 버퍼로서 HBS-EP+ Buffer(GE Healthcare)를 사용하여 결합 평가가 행하여졌다.
Protein G Biosensors(forteBIO)에 항체를 결합시킨 후, 마우스 IgA 또는 가용형 인간 IL-6R과 120초 접촉시켜서 바이오센서 상의 항체와 상호작용시키고, 계속해서 버퍼에 120초 접촉시켜서 항체·항원의 상호작용을 측정하였다. 그 후, 10 mmol/L Glycin-HCl, pH 1.5와 접촉시켜서 바이오센서가 재생되었다. 측정은 30℃에서 행하여졌다. 얻어진 센서그램을 도 6에 나타내었다. mIANH-2_27, mIANH-3_79의 모든 항체가 가용형 인간 IL-6R과 결합하지 않고, 마우스 IgA에 결합하는 것이 나타내어졌다.
[실시예 5] 고정 L쇄를 갖는, IL-6R에 결합 가능한 Fab의 취득
(5-1) 고정 L쇄(같은 아미노산 서열의 L쇄)를 갖는 Fab 파지 라이브러리의 생산
실시예 1에 기재된 방법으로, 항인간 PlexinA1 항체 hPANKB2-3#135의 L쇄(서열번호：30)를 발현하는 헬퍼 파지로서 M13KO7TC-PAL, 항마우스 IgA 항체 mIA㎚IgL_095의 L쇄(서열번호：31)를 발현하는 헬퍼 파지로서 M13KO7TC-IAL 및 항인간 CD3 항체 인간화 CE115의 L쇄인 L0000(서열번호：32)을 발현하는 헬퍼 파지로서 M13KO7TC-CEL을 구축하였다.
실시예 2에 기재된 나이브 H쇄를 포함하는 파지미드 라이브러리를 도입한 대장균에 상기 헬퍼 파지를 감염시킴으로써, 나이브 H쇄와 항PlexinA1 항체 L쇄를 포함하는 Fab를 제시하는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리(NH-PAL 라이브러리), 나이브 H쇄와 항마우스 IgA 항체 L쇄를 포함하는 Fab를 제시하는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리(NH-IAL 라이브러리), 나이브 H쇄와 항CD3 항체 L쇄를 포함하는 Fab를 제시하는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리(NH-CEL 라이브러리)를 구축하였다. 파지가 생산된 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 파지를 침전시키고, 그것을 TBS로 희석시킴으로써 파지 라이브러리액을 얻었다.
(5-2) 고정 L쇄 항체 라이브러리(NH-PAL 라이브러리, NH-IAL 라이브러리, NH-CEL 라이브러리)로부터의 IL-6R에 결합하는 항체 단편의 취득
(5-1)에서 구축된 고정 L쇄 항체 라이브러리(NH-PAL 라이브러리, NH-IAL 라이브러리, NH-CEL 라이브러리)의 파지 라이브러리액으로부터 인간 IL-6R에 결합하는 항체 단편의 선발을 인간 IL-6R로의 결합능을 지표로 실시하였다.
각각의 파지 라이브러리액에 종농도 4%가 되도록 BSA를 첨가하여 파지 라이브러리액을 블로킹하였다. 패닝방법으로 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화된 항원을 사용하는 패닝방법이 참조되었다(J. Immunol. Methods.(2008) 332(1-2), 2-9, J. Immunol. Methods.(2001) 247(1-2), 191-203, Biotechnol. Prog.(2002) 18(2), 212-220, Mol. Cell Proteomics(2003) 2(2), 61-69). 자기 비드로서 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다. 구체적으로는, 조제된 파지 라이브러리액에 비오틴 표지 항원(비오틴 표지 hIL-6R)을 첨가하여 파지 라이브러리액과 항원을 실온에서 60분간 접촉시켰다. 첫번째 패닝에서는 250 pmol, 두번째 패닝에서는 40 pmol, 세번째 패닝에서는 10 pmol의 비오틴 표지 항원이 각각 사용되었다. 거기에 BSA용액으로 블로킹된 자기 비드를 첨가하여 항원-파지 복합체와 자기 비드를 실온에서 15분간 결합시켰다. 회수된 비드는 1 mL의 TBST(0.1% Tween20을 포함하는 TBS)와 1 mL의 TBS로 세정되었다. 그 후, 비드에 1 ㎎/mL의 트립신용액 0.5 mL를 첨가하여 실온에서 15분간 현탁시킨 후, 즉각 자기 스탠드를 사용하여 비드를 분리하고 상청의 파지용액을 회수하였다. 회수된 파지용액을 대수증식기(OD600=0.4-0.7)까지 배양된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가하여 37℃에서 1시간 완만하게 교반배양함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염된 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균을 회수하여 배양한 후, 헬퍼 파지(M13KO7TC-PAL, M13KO7TC-IAL 또는 M13KO7TC-CEL)를 감염시켜 배양함으로써 항PlexinA1 항체 L쇄, 항마우스 IgA 항체 L쇄, 또는 항CD3 항체 L쇄를 포함하는 Fab를 제시하는 파지를 생산시켰다. 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다. 이것을 1회의 패닝으로 하여 합계 3회의 패닝이 반복되었다.
(5-3) 항원(인간 IL-6R)에 결합하는 항체의 파지 ELISA법에 의한 스크리닝
(5-2)에서 실시된 패닝이 2회 또는 3회 종료된 후에 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol.(2002) 178, 133-145)에 따라 파지의 생산을 행하고 파지 함유 배양상청을 회수하였다. 이때, 헬퍼 파지에는 사용한 파지 라이브러리에 따라 M13KO7TC-PAL, M13KO7TC-IAL 또는 M13KO7TC-CEL을 사용하였다. 배양상청은 아래의 순서로 ELISA에 제공되었다.
비오틴 표지 항원(비오틴 표지 hIL-6R)을 포함하거나 또는 포함하지 않는 100 μL의 PBS로, StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)를 하룻밤 코팅하였다. 당해 플레이트의 각 웰을 0.1×TBST(0.1% Tween20을 포함하는 0.1×TBS)로 세정함으로써 항원을 제거한 후, 각 웰을 250 μL의 0.02% SkimMilk-0.1×TBS(0.02% SkimMilk를 포함하는 0.1×TBS)로 1시간 이상 블로킹하였다. 0.02% SkimMilk-0.1×TBS를 제거한 후, 각 웰에 파지 배양상청을 첨가하여 1시간 정치함으로써, 파지 상에 제시된 항체를 각 웰에 존재하는 비오틴 표지 항원에 결합시켰다. 각 웰을 0.1×TBST로 세정한 후, 0.1×TBST에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)를 첨가하여 플레이트를 1시간 인큐베이션하였다. 각 웰을 TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)을 첨가하고 추가로 용액의 발색반응을 황산의 첨가에 의해 정지시킨 후, 각 웰의 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다.
상기의 파지 ELISA의 결과, 항원을 코팅하지 않은 플레이트에 대한 항원을 코팅한 플레이트의 발색비가 2배 이상이고, 또한 항원을 코팅한 플레이트에서의 발색이 0.2 이상인 것을 항원 특이적으로 결합하는 클론으로 판단하였다. 또한 항원 특이적으로 결합하는 것으로 판단된 클론에 대해 항체 단편 유전자의 염기서열 해석이 행하여졌다.
파지 ELISA의 결과를 표 2에 나타낸다. 표 중에서의 R2는 패닝 2회 종료 후의 클론, R3는 패닝 3회 종료 후의 클론을 각각 나타낸다. 그 결과, 각각의 파지 라이브러리로부터 hIL-6R에 대해 특이적으로 결합하고, 또한 서열이 다른 복수의 클론이 얻어졌다.
Figure 112016037223402-pct00002
[실시예 6] 고정 L쇄에서의 인간 IL-6R에 결합 가능한 항체의 IgG에서의 결합능 평가
(6-1) 인간 CD3e(hCD3e)의 조제
인간 CD3e(hCD3e)의 세포외영역을 아래와 같이 조제하였다. NCBI Reference Sequence NP_000724(서열번호：33)의 아미노산 서열을 기반으로 합성된 hCD3e 유전자로부터 막관통영역으로 예상되는 130번째의 발린 이후를 제거하고, 그 대신에FLAG 태그 서열(서열번호：13)을 부가하였다. 제작된 hCD3e(서열번호：34)를 코드하는 유전자가 삽입된 발현 벡터가 제작되었다.
제작된 발현 벡터가 FreeStyle293-F 세포(Invitrogen사)에 도입되어 일과성으로 hCD3e가 발현되었다. 얻어진 배양상청이 20 mM Tris-HCl, pH 7.4에 의해 평형화된 Q Sepharose FF 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후 염화나트륨의 농도 구배에 의한 용출이 실시되었다. hCD3e를 포함하는 분획이 10 mM 인산나트륨 완충액 pH 7.4에 의해 평형화된 macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type-I, 20 ㎛ 칼럼(Bio-Rad사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후 인산나트륨 완충액의 농도 구배에 의한 용출이 실시되었다. hCD3e를 포함하는 분획이 한외여과막에서 농축된 후, 농축액이 D-PBS(-)에 의해 평형화된 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되었다. 그 용출액의 hCD3e 분획만을 회수함으로써 정제 hCD3e가 얻어졌다.
(6-2) 취득된 각종 고정 L쇄를 갖는 인간 IL-6R 결합 항체의 발현 및 정제
실시예 5에 있어서 항마우스 IgA 항체 mIA㎚IgL_095의 L쇄를 갖는 인간 IL-6R에 대한 결합 항체로서 취득된 항체 중 6RmIAB3(2)_02(중쇄, 서열번호：35；경쇄, 서열번호：65), 6RmIAB3(2)_06(중쇄, 서열번호：36；경쇄, 서열번호：65), 6RmIAB3(2)_16(중쇄, 서열번호：37；경쇄, 서열번호：65)의 3항체를, 아래의 방법을 사용하여 발현시켜 배양상청이 회수되었다. FreeStyle 293 Expression Medium 배지(Invitrogen)에 현탁된 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 8.0×105 세포/mL의 세포 밀도로 96 웰 딥 웰 플레이트(deep well plate)의 각 웰에 0.4 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법으로 세포에 도입되었다. CO2 인큐베이터(37도, 8% CO2, 450 rpm) 중에서 4일간 배양이 행하여졌다.
실시예 5에 있어서 항PlexinA1 항체 hPANKB2-3#135의 L쇄를 갖는 인간 IL-6R에 대한 결합 항체로서 취득된 항체 중 6RPAB3_03(중쇄, 서열번호：38；경쇄, 서열번호：64)의 1항체를, 항CD3 항체 인간화 CE115의 L쇄를 갖는 인간 IL-6R에 대한 결합 항체로서 취득된 항체 중 6RhCEB3(2)_10(중쇄, 서열번호：39；경쇄, 서열번호：66)의 1항체를, 아래의 방법을 사용하여 발현시켜 당해 항체의 정제가 행하여졌다. FreeStyle 293 Expression Medium 배지(Invitrogen)에 현탁된 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 1.33×106 세포/mL의 세포 밀도로 6웰 플레이트의 각 웰에 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법으로 세포에 도입되었다. CO2 인큐베이터(37도, 8% CO2, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행하여졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 ㎚에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법으로 산출된 흡광 계수를 사용함으로써 얻어진 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science(1995) 4, 2411-2423).
(6-3) 취득된 항PlexinA1 항체 L쇄를 갖는 항체의 인간 IL-6R에 대한 결합능의 평가
Octet RED384(forteBIO)를 사용하여 (6-2)에서 취득된 항체(6RPAB3_03) 및 항PlexinA1 항체 hPANKB2-3#135(중쇄, 서열번호：40； 경쇄, 서열번호：64)의 가용형 인간 IL-6R 및 가용형 인간 PlexinA1에 대한 결합활성이 평가되었다. 버퍼로서 HBS-EP+ Buffer(GE Healthcare)를 사용하여 결합 평가가 행하여졌다.
Protein G Biosensors(forteBIO)에 항체를 결합시킨 후, 가용형 인간 IL-6R 및 가용형 인간 PlexinA1과 120초 접촉시켜서 바이오센서 상의 항체와 상호작용시키고, 계속해서 버퍼에 120초 접촉시켜서 항체·항원의 상호작용을 측정하였다. 그 후, 10 mmol/L Glycin-HCl, pH 1.5와 접촉시켜서 바이오센서가 재생되었다. 측정은 30℃에서 행하여졌다. 얻어진 센서그램을 도 7에 나타내었다.
6RPAB3_03 항체가 가용형 인간 PlexinA1과 결합하지 않고, 가용형 인간 IL-6R에 결합하는 것이 나타내어졌다.
(6-4) 취득된 항마우스 IgA 항체 L쇄를 갖는 항체의 인간 IL-6R에 대한 결합능의 평가
Octet RED384(forteBIO)를 사용하여 (6-2)에서 취득된 항체(6RmIAB3(2)_02, 6RmIAB3(2)_06, 6RmIAB3(2)_16) 및 항마우스 IgA 항체 mIA㎚IgL_095(중쇄, 서열번호：41； 경쇄, 서열번호：65)의 가용형 인간 IL-6R 및 마우스 IgA에 대한 결합활성이 평가되었다. 버퍼로서 HBS-EP+ Buffer(GE Healthcare)를 사용하여 결합 평가가 행하여졌다.
Protein G Biosensors(forteBIO)에 항체를 결합시킨 후, 가용형 인간 IL-6R 및 마우스 IgA와 120초 접촉시켜서 바이오센서 상의 항체와 상호작용시키고, 계속해서 버퍼에 120초 접촉시켜서 항체·항원의 상호작용을 측정하였다. 그 후, 10 mmol/L Glycin-HCl, pH 1.5와 접촉시켜서 바이오센서가 재생되었다. 측정은 30℃에서 행하여졌다. 얻어진 센서그램을 도 8에 나타내었다.
6RmIAB3(2)_02, 6RmIAB3(2)_06, 6RmIAB3(2)_16의 모든 항체가 마우스 IgA와 결합하지 않고, 가용형 인간 IL-6R에 결합하는 것이 나타내어졌다.
(6-5) 취득된 항CD3 항체 L쇄를 갖는 항체의 인간 IL-6R에 대한 결합능의 평가
Octet RED384(forteBIO)를 사용하여 (6-2)에서 취득된 항체(6RhCEB3(2)_10) 및 항CD3 항체 hCE115HA/L0000(중쇄, 서열번호：42；경쇄, 서열번호：66)의 가용형 인간 IL-6R 및 인간 CD3e(hCD3e)에 대한 결합활성이 평가되었다. 버퍼로서 HBS-EP+ Buffer(GE Healthcare)를 사용하여 결합 평가가 행하여졌다.
Protein G Biosensors(forteBIO)에 항체를 결합시킨 후, 가용형 인간 IL-6R 및 인간 CD3e와 120초 접촉시켜서 바이오센서 상의 항체와 상호작용시키고, 계속해서 버퍼에 120초 접촉시켜서 항체·항원의 상호작용을 측정하였다. 그 후, 10 mmol/L Glycin-HCl, pH 1.5와 접촉시켜서 바이오센서가 재생되었다. 측정은 30℃에서 행하여졌다. 얻어진 센서그램을 도 9에 나타내었다.
6RhCEB3(2)_10 항체가 인간 CD3e와 결합하지 않고, 가용형 인간 IL-6R에 결합하는 것이 나타내어졌다.
[실시예 7] L쇄 발현 파지미드 벡터와 H쇄 발현 헬퍼 파지의 조합에 의한 Fab 제시 파지 생산법의 확립
(7-1) H쇄-gene 3 융합체 발현 유닛을 삽입한 H쇄 발현 헬퍼 파지의 구축
헬퍼 파지의 게놈에 프로모터, 시그널 서열, 항체 H쇄 유전자, phage gene 3 유전자 등을 삽입함으로써, H쇄(VH 및 CH1으로 이루어지는 Fd)-gene 3 발현 헬퍼 파지의 구축을 행하였다. 본 헬퍼 파지가 감염된 대장균으로부터는 항체 H쇄(VH 및 CH1으로 이루어지는 Fd)-gene 3의 발현이 가능해진다.
구체적으로는, 헬퍼 파지 M13KO7TC를 대장균주 ER2738에 감염시켜 하룻밤 진탕배양을 행한 후, 감염 대장균으로부터 헬퍼 파지 M13KO7TC의 게놈 추출을 행하였다(NucleoBond Xtra Midi PlUS). H쇄-gene 3 발현 유닛을 삽입하는 장소로, 카나마이신 내성 유전자(KanR)와 p15A ori 사이에 위치하고 있는 SacI 사이트를 선택하였다(도 1). 이 장소에 한정되지 않고, p15A ori와 M13 ori 사이에 위치하고 있는 SacII 사이트 등으로의 삽입이어도 문제 없을 것으로 생각된다. 상기 방법으로 정제한 헬퍼 파지 M13KO7TC 게놈을 SacI으로 절단한 후, 0.6% 아가로오스겔로 전기영동을 행하고, 겔 추출 정제(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system: Promega)를 행함으로써 목적의 DNA 단편(M13KO7TC/SacI)을 얻었다.
도입하는 항체 H쇄(VH 및 CH1으로 이루어지는 Fd)로서 항인간 IL-6R 항체인 PF1의 H쇄를 사용하였다. PF1의 H쇄의 아미노산 서열을 서열번호 8에, 염기서열을 서열번호 43에 각각 나타낸다. 항체 H쇄(VH 및 CH1으로 이루어지는 Fd)는 링커 펩티드를 매개로 gene 3 단백질(g3p)과 융합되어 있다. araC 리프레서-araBAD 개변프로모터-malE 시그널 서열-PF1 H쇄 유전자-gene 3 유전자를 in-fusion법(In-Fusion HD Cloning Kit: Clontech)으로, M13KO7TC/SacI에 삽입하고 대장균주 ER2738에 전기천공법으로 도입하였다. araC 리프레서의 핵산 서열을 서열번호：44에, araBAD 개변프로모터의 핵산 서열을 서열번호：45에, malE 시그널 서열의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 서열번호：46 및 서열번호：47에 각각 나타낸다. Gene3 유전자로서는 헬퍼 파지에 존재하는 gene 3 유전자와 다른 핵산 서열(서열번호 48)의 것을 사용하였다.
얻어진 대장균을 배양하고, 배양상청에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 PEG 침전법으로 헬퍼 파지를 정제하였다. 얻어진 헬퍼 파지 M13KO7AG-PF1H의 타이터를 일반적인 플라크 형성법으로 확인하였다.
(7-2) L쇄 발현 파지미드 벡터의 구축
항체 L쇄를 발현하기 위한 파지미드 벡터를 구축하였다. 파지미드 벡터는 플라스미드 벡터에 파지 입자로의 패키징 시그널, 프로모터, 시그널 서열, 항체 L쇄 유전자 등을 각각 기능적으로 삽입함으로써 제작하였다. 이때, L쇄 불변영역의 C말단에 있는 Cys의 Ala로의 치환이 대장균에서의 Fab 발현에 유리한 것이 알려져 있기 때문에(J Biol Chem. 2003 Oct 3; 278(40): 38194-38205) 그러한 서열을 사용하였다. 구축한 파지미드 벡터를 대장균주 ER2738에 전기천공법으로 도입하여 PF1 L쇄 발현 파지미드 벡터를 보유하는 대장균 ER2738/pL-PF1L을 구축하였다.
(7-3) L쇄 발현 파지미드 벡터와 H쇄 발현 헬퍼 파지의 조합에 의한 Fab 제시 파지의 생산
대장균 ER2738/pL-PF1L을 OD 0.5 부근까지 배양한 후, 헬퍼 파지 M13KO7AG-PF1H 또는 M13KO7TC를 감염시켰다. IPTG 25 uM, Arabinose 0.2%를 포함하는 배지로 배지교환을 실시 후, 30℃에서 하룻밤 배양하여 배양상청을 회수하였다. 파지가 생산된 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 파지를 침전시키고, 그것을 TBS로 용해하여 파지액을 취득하였다. 얻어진 파지의 타이터를 일반적인 콜로니 형성법으로 확인하였다.
(7-4) 파지 ELISA법에 의한 파지로의 Fab 제시의 확인
파지 ELISA법으로 생산된 파지의 Fab 제시의 확인 및 항원으로의 결합능의 확인을 행하였다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)에 Goat anti-Human Kappa Biotin 항체(EY LABORATORIES) 또는 비오틴 표지 인간 IL-6R을 포함하는 100 μL의 PBS를 첨가하여 플레이트를 코팅하였다. 당해 플레이트의 각 웰을 0.1×TBST(0.1% Tween20을 포함하는 0.1×TBS)로 세정함으로써 항원을 제거한 후, 당해 웰에 0.02% Skim Milk-0.1×TBS(0.02% Skim Milk를 포함하는 0.1×TBS) 250 μL를 첨가하여 1시간 이상 블로킹하였다. 0.02% Skim Milk-0.1×TBS를 제거한 후, 각 웰에 0.02% Skim Milk-0.1×TBS로 희석된 파지액을 첨가하여 1시간 정치함으로써, 파지 상에 제시된 항체를 Goat anti-Human Kappa Biotin 항체 또는 비오틴 표지 인간 IL-6R에 결합시켰다. 0.1×TBST로 세정된 후, 각 웰에 0.1×TBST로 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)를 첨가하여 1시간 인큐베이션하였다. 0.1×TBST로 세정 후, 각 웰에 TMB single 용액(ZYMED)을 첨가하고, 추가로 황산을 첨가하여 용액의 발색반응을 정지시킨 후, 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, L쇄 발현 파지미드 벡터와 H쇄 발현 헬퍼 파지 M13KO7AG-PF1H를 조합하여 파지를 생산시킨 경우에만 파지 상에 Fab가 제시되고(도 10), 또한 파지 상에 제시된 Fab가 항원 결합능을 유지하고 있는 것이 확인되었다(도 11).
[실시예 8] 나이브 L쇄를 포함하는 파지미드 라이브러리의 구축과 나이브 L쇄 및 항PlexinA1 항체 H쇄를 포함하는 Fab 파지 라이브러리의 생산
(8-1) 나이브 L쇄를 포함하는 파지미드 라이브러리의 구축
인간 말초혈 단핵구(PBMC)로부터 조제한 폴리A RNA나 시판되고 있는 인간 폴리A RNA 등을 주형으로 PCR법으로 나이브 L쇄 유전자가 증폭되었다. 이들을 파지미드 벡터에 삽입하고 구축된 파지미드 벡터를 대장균주 ER2738에 전기천공법으로 도입하여 6.5×106 정도의 콜로니가 얻어졌다.
(8-2) 나이브 L쇄 및 항PlexinA1 항체 H쇄를 포함하는 Fab 파지 라이브러리의 생산
실시예 7에 기재된 방법으로 항PlexinA1 항체 hPANLB2-3_264의 H쇄(서열번호：49), 항PlexinA1 항체 hPANLB2-3_342의 H쇄(서열번호：50) 및 항PlexinA1 항체 hPANLB2-3_359의 H쇄(서열번호：51)를 발현하는 헬퍼 파지(M13KO7AG-hPNL264H, M13KO7AG-hPNL342H, M13KO7AG-hPNL359H)를 각각 구축하였다.
(8-1)에 기재된 나이브 L쇄를 포함하는 파지미드 라이브러리를 도입한 대장균에 상기 헬퍼 파지(M13KO7AG-hPNL264H, M13KO7AG-hPNL342H, M13KO7AG-hPNL359H)를 각각 감염시킴으로써, 나이브 L쇄와 각종 항PlexinA1 항체 H쇄를 포함하는 Fab를 제시하는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리(264H-NL 라이브러리, 342H-NL 라이브러리, 359H-NL 라이브러리)를 구축하였다. 파지가 생산된 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 파지를 침전시키고, 그것을 TBS로 희석시킴으로써 파지 라이브러리액을 얻었다.
[실시예 9] 항PlexinA1 항체의 항원 결합능이 증강된 Fab의 취득
(9-1) 고정 H쇄 항체 라이브러리를 사용한 인간 PlexinA1에 강하게 결합하는 항체 단편의 취득
실시예 8에서 구축된 고정 H쇄 항체 라이브러리(264H-NL 라이브러리, 342H-NL 라이브러리, 359H-NL 라이브러리)의 파지 라이브러리액으로부터 인간 PlexinA1에 결합하는 항체 단편의 선택을, 인간 PlexinA1으로의 결합능을 지표로 실시하였다.
각각의 파지 라이브러리액에 종농도 4%가 되도록 BSA를 첨가하여 파지 라이브러리액을 블로킹하였다. 패닝방법으로, 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화된 항원을 사용하는 패닝방법이 참조되었다(J. Immunol. Methods.(2008) 332(1-2), 2-9, J. Immunol. Methods.(2001) 247(1-2), 191-203, Biotechnol. Prog.(2002) 18(2), 212-220, Mol. Cell Proteomics(2003) 2(2), 61-69). 자기 비드로서 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다. 구체적으로는, 조제된 파지 라이브러리액에 비오틴 표지 항원(비오틴 표지 hPlexinA1)을 첨가하여 파지 라이브러리액과 항원을 실온에서 60분간 접촉시켰다. 첫번째 패닝에서는 10 pmol, 재차째 이후의 패닝에서는 1 pmol의 비오틴 표지 항원이 각각 사용되었다. 그 후, 사용한 비오틴 표지 항원의 100배량의 미표지 항원(가용형 인간 PlexinA1)을 첨가하여 110분간 경합시켰다. 거기에 BSA용액으로 블로킹된 자기 비드를 첨가하여 항원-파지 복합체와 자기 비드를 실온에서 15분간 결합시켰다. 회수된 비드는 1 mL의 TBST(0.1% Tween20을 포함하는 TBS)와 1 mL의 TBS로 세정되었다. 그 후, 비드에 1 ㎎/mL의 트립신용액 0.5 mL를 첨가하여 실온에서 15분간 현탁시킨 후, 즉각 자기 스탠드를 사용하여 비드를 분리하고 상청의 파지용액을 회수하였다. 회수된 파지용액을 대수증식기(OD600=0.4-0.7)까지 배양된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가하여 37℃에서 1시간 완만하게 교반배양함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염된 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균을 회수하여 배양한 후, (8-2)에서 구축된 항PlexinA1 항체 H쇄 유전자가 도입된 헬퍼 파지를 당해 대장균에 감염시켜 배양함으로써 각종 항PlexinA1 항체 H쇄를 포함하는 Fab를 제시하는 파지를 생산시켰다. 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다. 이것을 1회의 패닝으로 하여, 합계 4회의 패닝이 반복되었다.
(9-2) 항원(인간 PlexinA1)에 결합하는 항체의 파지 ELISA법에 의한 스크리닝
(9-1)에서 실시된 패닝이 2회, 3회 또는 4회 종료된 후에 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol.(2002) 178, 133-145)에 따라 파지의 생산을 행하고 파지 함유 배양상청을 회수하였다. 이때, 헬퍼 파지에는 사용한 파지 라이브러리에 따라 M13KO7AG-hPNL264H, M13KO7AG-hPNL342H 또는 M13KO7AG-hPNL359H를 사용하였다. 배양상청은 아래의 순서로 ELISA에 제공되었다.
비오틴 표지 항원(비오틴 표지 hPlexinA1)을 포함하거나 또는 포함하지 않는 100 μL의 PBS로, StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)를 하룻밤 코팅하였다. 당해 플레이트의 각 웰을 0.1×TBST(0.1% Tween20을 포함하는 0.1×TBS)로 세정함으로써 항원을 제거한 후, 각 웰을 250 μL의 0.02% SkimMilk-0.1×TBS(0.02% SkimMilk를 포함하는 0.1×TBS)로 1시간 이상 블로킹하였다. 0.02% SkimMilk-0.1×TBS를 제거한 후, 각 웰에 파지 배양상청을 첨가하여 플레이트를 1시간 정치함으로써, 파지 상에 제시된 항체를 각 웰에 존재하는 비오틴 표지 항원에 결합시켰다. 각 웰을 0.1×TBST로 세정한 후, 0.1×TBST에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)를 첨가하여 플레이트를 1시간 인큐베이션하였다. 각 웰을 TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)을 첨가하고, 추가로 용액의 발색반응을 황산의 첨가에 의해 정지시킨 후, 각 웰의 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다.
상기의 파지 ELISA의 결과, 항원을 코팅하지 않은 플레이트에 대한 항원을 코팅한 플레이트의 발색비가 2배 이상이고, 또한 항원을 코팅한 플레이트에서의 발색이 0.2 이상인 것을 항원 특이적으로 결합하는 클론으로 판단하였다. 또한 항원 특이적으로 결합하는 것으로 판단된 클론에 대해 항체 단편 유전자의 염기서열 해석이 행하여졌다.
파지 ELISA의 결과를 표 3에 나타낸다. 표 중에서의 R2는 패닝 2회 종료 후의 클론, R3는 패닝 3회 종료 후의 클론, R4는 패닝 4회 종료 후의 클론을 각각 나타낸다. 그 결과, 각각의 파지 라이브러리(264H-NL 라이브러리, 342H-NL 라이브러리, 359H-NL 라이브러리)로부터 hPlexinA1에 대해 특이적으로 결합하고, 또한 서열이 다른 복수의 클론이 얻어졌다.
Figure 112016037223402-pct00003
[실시예 10] 항PlexinA1 항체의 친화성 성숙(affinity maturation) 산물의 IgG에서의 결합능 평가
(10-1) 취득된 인간 PlexinA1 결합 항체의 발현 및 정제
실시예 9에 있어서, 264H-NL 라이브러리로부터 인간 PlexinA1에 대한 결합 항체로서 취득된 항체 중 PLR2H264#002(중쇄, 서열번호：58；경쇄, 서열번호：52), PLR4H264#061(중쇄, 서열번호：58；경쇄, 서열번호：53), PLR3H264#022(중쇄, 서열번호：58；경쇄, 서열번호：54)의 3항체를, 342H-NL 라이브러리로부터 인간 PlexinA1에 대한 결합 항체로서 취득된 항체 중 PLR2H342#009(중쇄, 서열번호：59；경쇄, 서열번호：55)의 1항체를, 359H-NL 라이브러리로부터 인간 PlexinA1에 대한 결합 항체로서 취득된 항체 중 PLR2H359#087(중쇄, 서열번호：60；경쇄, 서열번호：56), PLR2H359#062(중쇄, 서열번호：60；경쇄, 서열번호：57)의 2항체를, 아래의 방법을 사용하여 발현시켜 당해 항체의 정제가 행하여졌다. 또한 비교 대상으로서 부모 항체인 hPANLB2-3_264(중쇄, 서열번호：58, 경쇄, 서열번호：61), hPANLB2-3_342(중쇄, 서열번호：59, 경쇄, 서열번호：62), hPANLB2-3_359(중쇄, 서열번호：60, 경쇄, 서열번호：63)에 대해서도 아래의 방법을 사용하여 발현시켜 당해 항체의 정제가 행하여졌다. FreeStyle 293 Expression Medium 배지(Invitrogen)에 현탁된 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 1.33×106 세포/mL의 세포 밀도로 6웰 플레이트의 각 웰에 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는, 리포펙션법으로 세포에 도입되었다. CO2 인큐베이터(37도, 8% CO2, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행하여졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 ㎚에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법으로 산출된 흡광 계수를 사용함으로써 얻어진 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science(1995) 4, 2411-2423).
(10-2) 취득된 항PlexinA1 항체의 결합능 평가
(10-1)에서 얻어진 항체의 항원에 대한 결합성을 표면 플라즈몬 공명(SPR) 해석에 의해 평가하였다.
SPR 해석에 있어서는 BiacoreT200(GE 헬스케어 재팬사)을 사용하여 해석을 행하였다. Sensor Chip CM4의 표면에 재조합형 ProteinA/G(사모사이엔티픽사)와 Amine Coupling Kit(GE 헬스케어 재팬사)를 사용하여 항인간 PlexinA1 항체를 고상화하였다. 항원은 단백질의 C말단 측에 FLAG 태그를 부가한 인간 PlexinA1 단백질의 세마 도메인(28번째 글루타민산-514번째 세린)을 사용하였다. 항원의 조제는 아래와 같다. 인간 PlexinA1의 세마 도메인에 대응하는 cDNA를 삽입한 발현 벡터를 FreeStyle293 세포에 도입하여 배양 후, 얻어진 배양액을 항FLAG-M2 항체를 고상화한 친화성 칼럼을 통과시켜서 FALG 펩티드로 용출된 분획을 겔 여과 정제하였다. 얻어진 항원을 20 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.05% 폴리소르베이트 20, 1.2 mM CaCl2, pH 7.4로 단계 희석하고 유속 30 μL/min로 첨가하였다. 이 측정 시스템으로 인간 PlexinA1 단백질과 항인간 PlexinA1 항체의 해리상수(KD)를 테이터 해석 소프트웨어(BIA T200 Evaluation software ver.2)를 사용하여 계산하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
L쇄를 재선택하기 전의 항체와 비교하여 결합능이 증강된 항체를 취득할 수 있었다.
또한 이 방법의 다른 이용법으로, 결합능이 증강되지 않은 항체이더라도 비인간 동물 유래 항체의 인간화에 사용하는 것이 가능하다(J Mol Biol. 2000 Feb 25;296(3):833-49.). 비인간 동물 유래 항체의 H쇄를 고정하고 인간 나이브 유래 L쇄 항체 라이브러리와 조합하여 항원에 대해 패닝 조작을 행함으로써 인간 유래 항체 L쇄를 취득할 수 있다. 계속해서, L쇄를 고정하고 인간 나이브 유래 H쇄 항체 라이브러리와 조합하여 항원에 대해 패닝 조작을 행함으로써 인간 유래 항체 H쇄를 취득할 수 있다. 이와 같이 순차적으로 인간 항체 라이브러리와 치환함으로써 비인간 동물 유래 항체를 기반으로 인간 항체를 취득할 수 있는 것이 당업자에게는 이해될 것이다.
Figure 112016037223402-pct00004
표 4 중, Relative KD improvement는 부모 항체와 비교하여 KD값으로 몇 배 결합능이 증강하였는가를 나타낸 값이다. 각각의 부모 항체에 대해 친화성이 증강된 항체가 얻어졌다.
일태양에 있어서 본 발명에 의해 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 복수의 항원 결합 분자를 효율적으로 제작하는 방법이 제공된다.
종래의 파지 디스플레이 기술로도 제1 폴리펩티드의 서열이 고정된 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작하는 것은 가능하였으나, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 양쪽을 동시에 발현 가능한 박테리아의 라이브러리를 제작하는 것으로부터, 한번 제작된 라이브러리 중의 제1 폴리펩티드의 서열을 나중에 변경하는 것은 매우 곤란하며, 또한 항원 결합 분자 제시 라이브러리의 제작에는 통상 다대한 시간과 노력을 필요로 하는 것이기 때문에, 제1 폴리펩티드의 서열이 고정된 라이브러리를 복수 제작하는 것은 매우 곤란하였다.
한편, 본 발명에 있어서는 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아의 라이브러리를 한번 제작하면, 헬퍼 파지에 포함되는 제1 폴리펩티드만을 변경함으로써 제1 폴리펩티드의 서열이 고정된 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 계속해서 간편하게 제작할 수 있기 때문에 작업 효율을 비약적으로 높이는 것이 가능해진다. 본 발명은 신규한 파지 디스플레이 기술로서 매우 유용하다. 본 발명을 응용한 일례로서, 공통된 L쇄 또는 H쇄를 포함하는 다중특이성 항체의 창출 등을 들 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> METHOD FOR PRODUCING ANTIGEN-BINDING MOLECULE USING MODIFIED HELPER PHAGE <130> C1-A1308P <140> PCT/JP2014/076001 <141> 2014-09-30 <150> JP 2013-203528 <151> 2013-09-30 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 423 <212> PRT <213> Enterobacteria phage M13 <400> 1 Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser 1 5 10 15 His Ser Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu 20 25 30 Asn Ser Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr 35 40 45 Ala Asn Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys 50 55 60 Thr Gly Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu 65 70 75 80 Ala Ile Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp 100 105 110 Thr Pro Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr 115 120 125 Pro Pro Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu 130 135 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Arg Ala Ile Lys Glu Lys 355 360 365 Ile Lys Glu Arg Ile Gln Ser Cys Tyr Arg Gly Glu Gly Lys Leu Ser 370 375 380 Leu Pro Trp Leu Leu Asn Lys Glu Leu Gly Cys Ile Asn Ser Pro Leu 385 390 395 400 Gln Ile Asp Asp Asp Phe Cys Gly Gln Asp Phe Asn Gln Pro Leu Gly 405 410 415 Gly Thr Val Thr Ile Glu Gly Thr Pro Leu Phe Val Asp Lys Asp Asp 420 425 430 Gly Leu Thr Ala Val Ala Ala Tyr Asp Tyr Arg Gly Arg Thr Val Val 435 440 445 Phe Ala Gly Thr Arg Ser Gly Arg Ile Arg Lys Ile Leu Val Asp Leu 450 455 460 Ser Asn Pro Gly Gly Arg Pro Ala Leu Ala Tyr Glu Ser Val Val Ala 465 470 475 480 Gln Glu Gly Ser Pro Ile Leu Arg Asp Leu Val Leu Ser Pro Asn His 485 490 495 Gln Tyr Leu Tyr Ala Met Thr Glu Lys Gln Val Thr Arg Val Pro Val 500 505 510 Glu Ser Cys Val Gln Tyr Thr Ser Cys Glu Leu Cys Leu Gly Ser Arg 515 520 525 Asp Pro His Cys Gly Trp Cys Val Leu His Ser Ile Cys Ser Arg Arg 530 535 540 Asp Ala Cys Glu Arg Ala Asp Glu Pro Gln Arg Phe Ala Ala Asp Leu 545 550 555 560 Leu Gln Cys Val Gln Leu Thr Val Gln Pro 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Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 68 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of PF1 heavy chain <400> 68 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Leu Ala Arg Ile Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445

Claims (21)

  1. 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 복수의 다중특이성 항원 결합 분자를 제작하는 방법으로, 아래의 공정(a) 및 (b)를 포함하는 방법：
    (a) 소정의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 취득하는 방법으로, 아래의 공정(a-1) 및 (a-2)를 포함하는 방법을 복수의 항원에 대해 행하는 공정:
    (a-1) 공통된 제1 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 분자 제시 라이브러리를 제작하는 방법으로, 아래의 공정(1)과 (2)를 포함하는 방법에 의해 제작된 항원 결합 분자 제시 라이브러리에 항원을 접촉시키는 공정:
    (1) 항원 결합 분자를 제시하는 박테리오파지를 제작하는 방법으로, 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지를 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아에 접촉시키는 공정을 포함하고, 당해 제1 폴리펩티드와 당해 제2 폴리펩티드가 회합하여 당해 항원 결합 분자를 형성하는 방법을 복수회 행하는 공정으로, 당해 공정에 있어서 사용되는 복수의 박테리아는 아미노산 서열이 다른 복수의 제2 폴리펩티드를 발현 가능한 박테리아 집단이고, 또한 당해 공정에 있어서 사용되는 헬퍼 파지는 같은 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드를 발현 가능한 헬퍼 파지인 공정과
    (2) 공정(1)에서 제작된, 항원 결합 분자를 제시하는 복수의 박테리오파지를 회수하는 공정, 및
    (a-2) 당해 항원 결합 분자 제시 라이브러리 중에서 당해 항원에 결합하는 항원 결합 분자를 선택하는 공정; 및
    (b) 공정(a)에서 취득된 복수의 항원 결합 분자에 포함되는, 복수의 같은 아미노산 서열의 제1 폴리펩티드 및 복수의 다른 아미노산 서열의 제2 폴리펩티드를 사용하여 다중특이성 항원 결합 분자를 제작하는 공정으로, 당해 복수의 제2 폴리펩티드 각각에 당해 제1 폴리펩티드가 회합하여, 당해 복수의 항원에 대해 특이적으로 결합하는 복수의 항원 결합 부위를 형성하는 것을 특징으로 하는 공정.
  2. 제1항에 있어서,
    다중특이성 항원 결합 분자가 이중특이성 항원 결합 분자인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    헬퍼 파지의 게놈 중에 제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 폴리펩티드가 파지의 코트 단백질과 융합되어 있는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    헬퍼 파지가 M13KO7인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    박테리아가 제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제2 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 파지미드 벡터에 삽입되어 있는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제2 폴리펩티드가 파지의 코트 단백질과 융합되어 있는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    항원 결합 분자가 항체 가변영역인 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 L쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드 및 H쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 각각 선택되고, 또한 서로 다른 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    L쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드가 추가로 L쇄 불변영역을 포함하는 폴리펩티드이고, 또한/또는 H쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드가 추가로 H쇄 불변영역을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
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