JP2021518168A - 拮抗的抗原結合タンパク質 - Google Patents
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-
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Abstract
Description
(i)配列番号2におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号3におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(ii)配列番号11におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号12におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
と競合する、拮抗的抗原結合タンパク質を提供する。
(i)配列番号20におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号21におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(ii)配列番号29におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号30におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(iii)配列番号83におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号84におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(iv)配列番号92におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号93におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(v)配列番号101におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号102におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
と競合する、拮抗的抗原結合タンパク質に関する。
(i)配列番号38におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号39におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
(ii)配列番号47におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号48におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
(iii)配列番号56におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号57におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
(iv)配列番号65におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号66におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(v)配列番号74におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号75におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
と競合する、拮抗的抗原結合タンパク質に関する。
(i)以下の組み合わせ:
配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号2に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号12に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号11に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせ、
(ii)以下の組み合わせ:
配列番号8のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号9のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号17のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号18のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
の群から選択される重鎖の相補性決定領域3(CDRH3)及び軽鎖の相補性決定領域3(CDRL3)の組み合わせ、
のいずれかを含む、拮抗的抗原結合タンパク質に関する。
(i)以下の組み合わせ:
配列番号21に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号20に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号30に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号29に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号84に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号83に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号93に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号92に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号102に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号101に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせ、
(ii)以下の組み合わせ:
配列番号26のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号27のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号35のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号36のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号89のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号90のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号98のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号99のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号107のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号108のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
の群から選択される重鎖の相補性決定領域3(CDRH3)及び軽鎖の相補性決定領域3(CDRL3)の組み合わせ、
のいずれかを含む、拮抗的抗原結合タンパク質に関する。
(i)以下の組み合わせ:
配列番号39に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号38に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号48に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号47に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号57に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号56に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号66に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号65に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号75に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号74に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせ、
(ii)以下の組み合わせ:
配列番号44のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号45のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号53のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号54のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号62のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号63のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号71のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号72のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号80のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号81のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
の群から選択される重鎖の相補性決定領域3(CDRH3)及び軽鎖の相補性決定領域3(CDRL3)の組み合わせ、
のいずれかを含む、拮抗的抗原結合タンパク質に関する。
配列番号1 PD-1_Aのアミノ酸配列
配列番号2 PD-1_A;VHのアミノ酸配列
配列番号3 PD-1_A;VLのアミノ酸配列
配列番号4 PD-1_A;CDRH1のアミノ酸配列
配列番号5 PD-1_A;CDRL1のアミノ酸配列
配列番号6 PD-1_A;CDRH2のアミノ酸配列
配列番号7 PD-1_A;CDRL2のアミノ酸配列
配列番号8 PD-1_A;CDRH3のアミノ酸配列
配列番号9 PD-1_A;CDRL3のアミノ酸配列
配列番号10 PD-1_Bのアミノ酸配列
配列番号11 PD-1_B;VHのアミノ酸配列
配列番号12 PD-1_B;VLのアミノ酸配列
配列番号13 PD-1_B;CDRH1のアミノ酸配列
配列番号14 PD-1_B;CDRL1のアミノ酸配列
配列番号15 PD-1_B;CDRH2のアミノ酸配列
配列番号16 PD-1_B;CDRL2のアミノ酸配列
配列番号17 PD-1_B;CDRH3のアミノ酸配列
配列番号18 PD-1_B;CDRL3のアミノ酸配列
配列番号19 PD-L1_Aのアミノ酸配列
配列番号20 PD-L1_A;VHのアミノ酸配列
配列番号21 PD-L1_A;VLのアミノ酸配列
配列番号22 PD-L1_A;CDRH1のアミノ酸配列
配列番号23 PD-L1_A;CDRL1のアミノ酸配列
配列番号24 PD-L1_A;CDRH2のアミノ酸配列
配列番号25 PD-L1_A;CDRL2のアミノ酸配列
配列番号26 PD-L1_A;CDRH3のアミノ酸配列
配列番号27 PD-L1_A;CDRL3のアミノ酸配列
配列番号28 PD-L1_Bのアミノ酸配列
配列番号29 PD-L1_B;VHのアミノ酸配列
配列番号30 PD-L1_B;VLのアミノ酸配列
配列番号31 PD-L1_B;CDRH1のアミノ酸配列
配列番号32 PD-L1_B;CDRL1のアミノ酸配列
配列番号33 PD-L1_B;CDRH2のアミノ酸配列
配列番号34 PD-L1_B;CDRL2のアミノ酸配列
配列番号35 PD-L1_B;CDRH3のアミノ酸配列
配列番号36 PD-L1_B;CDRL3のアミノ酸配列
配列番号37 LAG-3_Aのアミノ酸配列
配列番号38 LAG-3_A;VHのアミノ酸配列
配列番号39 LAG-3_A;VLのアミノ酸配列
配列番号40 LAG-3_A;CDRH1のアミノ酸配列
配列番号41 LAG-3_A;CDRL1のアミノ酸配列
配列番号42 LAG-3_A;CDRH2のアミノ酸配列
配列番号43 LAG-3_A;CDRL2のアミノ酸配列
配列番号44 LAG-3_A;CDRH3のアミノ酸配列
配列番号45 LAG-3_A;CDRL3のアミノ酸配列
配列番号46 LAG-3_Cのアミノ酸配列
配列番号47 LAG-3_C;VHのアミノ酸配列
配列番号48 LAG-3_C;VLのアミノ酸配列
配列番号49 LAG-3_C;CDRH1のアミノ酸配列
配列番号50 LAG-3_C;CDRL1のアミノ酸配列
配列番号51 LAG-3_C;CDRH2のアミノ酸配列
配列番号52 LAG-3_C;CDRL2のアミノ酸配列
配列番号53 LAG-3_C;CDRH3のアミノ酸配列
配列番号54 LAG-3_C;CDRL3のアミノ酸配列
配列番号55 LAG-3_Dのアミノ酸配列
配列番号56 LAG-3_D;VHのアミノ酸配列
配列番号57 LAG-3_D;VLのアミノ酸配列
配列番号58 LAG-3_D;CDRH1のアミノ酸配列
配列番号59 LAG-3_D;CDRL1のアミノ酸配列
配列番号60 LAG-3_D;CDRH2のアミノ酸配列
配列番号61 LAG-3_D;CDRL2のアミノ酸配列
配列番号62 LAG-3_D;CDRH3のアミノ酸配列
配列番号63 LAG-3_D;CDRL3のアミノ酸配列
配列番号64 LAG-3_Bのアミノ酸配列
配列番号65 LAG-3_B;VHのアミノ酸配列
配列番号66 LAG-3_B;VLのアミノ酸配列
配列番号67 LAG-3_B;CDRH1のアミノ酸配列
配列番号68 LAG-3_B;CDRL1のアミノ酸配列
配列番号69 LAG-3_B;CDRH2のアミノ酸配列
配列番号70 LAG-3_B;CDRL2のアミノ酸配列
配列番号71 LAG-3_B;CDRH3のアミノ酸配列
配列番号72 LAG-3_B;CDRL3のアミノ酸配列
配列番号73 LAG-3_Eのアミノ酸配列
配列番号74 LAG-3_E;VHのアミノ酸配列
配列番号75 LAG-3_E;VLのアミノ酸配列
配列番号76 LAG-3_E;CDRH1のアミノ酸配列
配列番号77 LAG-3_E;CDRL1のアミノ酸配列
配列番号78 LAG-3_E;CDRH2のアミノ酸配列
配列番号79 LAG-3_E;CDRL2のアミノ酸配列
配列番号80 LAG-3_E;CDRH3のアミノ酸配列
配列番号81 LAG-3_E;CDRL3のアミノ酸配列
配列番号82 PD-L1_Cのアミノ酸配列
配列番号83 PD-L1_C;VHのアミノ酸配列
配列番号84 PD-L1_C;VLのアミノ酸配列
配列番号85 PD-L1_C;CDRH1のアミノ酸配列
配列番号86 PD-L1_C;CDRL1のアミノ酸配列
配列番号87 PD-L1_C;CDRH2のアミノ酸配列
配列番号88 PD-L1_C;CDRL2のアミノ酸配列
配列番号89 PD-L1_C;CDRH3のアミノ酸配列
配列番号90 PD-L1_C;CDRL3のアミノ酸配列
配列番号91 PD-L1_Dのアミノ酸配列
配列番号92 PD-L1_D;VHのアミノ酸配列
配列番号93 PD-L1_D;VLのアミノ酸配列
配列番号94 PD-L1_D;CDRH1のアミノ酸配列
配列番号95 PD-L1_D;CDRL1のアミノ酸配列
配列番号96 PD-L1_D;CDRH2のアミノ酸配列
配列番号97 PD-L1_D;CDRL2のアミノ酸配列
配列番号98 PD-L1_D;CDRH3のアミノ酸配列
配列番号99 PD-L1_D;CDRL3のアミノ酸配列
配列番号100 PD-L1_Eのアミノ酸配列
配列番号101 PD-L1_E;VHのアミノ酸配列
配列番号102 PD-L1_E;VLのアミノ酸配列
配列番号103 PD-L1_E;CDRH1のアミノ酸配列
配列番号104 PD-L1_E;CDRL1のアミノ酸配列
配列番号105 PD-L1_E;CDRH2のアミノ酸配列
配列番号106 PD-L1_E;CDRL2のアミノ酸配列
配列番号107 PD-L1_E;CDRH3のアミノ酸配列
配列番号108 PD-L1_E;CDRL3のアミノ酸配列
以下で、本明細書で頻繁に使用される用語の幾つかの定義を示す。これらの用語は、それらがそれぞれ使用される場合に、本明細書の残りの部分では、それぞれ定義される意味及び好ましい意味を有することとなる。
CDRグラフティングのプロトコルは典型的には、3つの意思決定点:(1)ドナー抗体の特異性を決定する領域、すなわちグラフティングの標的の規定、(2)FRドナーとして利用されるべきヒト配列の供給源の特定、及び(3)特異性を規定する領域の範囲外の残基の選択、すなわちヒト化抗体の親和性を回復させる又は改善するための復帰突然変異の標的であるアミノ酸位置を決定することを含む。
抗原と複合する非ヒト抗体の実験的構造は、抗原と接触する残基、したがってその特異性の決定の要因となる残基の詳細なマップを提供する。アラニンスキャニング変異導入及び/又はコンビナトリアル変異導入によって構造情報を補うことで、結合エネルギー又は機能的パラトープに最も寄与する残基を特定することができる。機能的パラトープは接触する残基のサブセットであるため、機能的パラトープのみをグラフティングすることによって、ヒト化産物における非ヒト残基の数は削減されることとなる。しかしながら、抗原−抗体複合体及び/又は機能的パラトープの実験的構造がヒト化プロトコルの開始時に利用可能である場合はまれにしかない。所与の抗体特異性の要因となる残基の正確な規定が存在しない場合に、特異性を規定する領域としてしばしばCDRが使用される。グラフティングのための標的としてCDR及びHVループの組み合わせを使用することも可能である。ヒトFRにグラフティングされるべき残基の数を減らすために、SDRグラフティング、すなわち特異性決定残基(SDR)のグラフティングが記載されている。
典型的なCDRグラフティングのプロトコルにおける第2工程は、ヒトFRドナーを特定することである。初期の研究では、非ヒト抗体に対するそれらの相同性にかかわらず、既知の構造のヒト抗体のFRが利用された。このアプローチは、「固定FR法」として知られている。後期の研究では、非ヒト抗体に対して最高の相同性を有するヒト配列が使用された。このアプローチは、「ベストフィット(Best Fit)」と呼ばれている。「ベストフィット」方略はより高い親和性を有する抗体をもたらす傾向がある一方で、ヒト化のためにFRを選択する場合に、低免疫原性及び生産収率等の他のパラメーターも考慮に入れる必要がある。したがって、「ベストフィット」及び「固定FR」の組み合わせも可能である。例えば、VL部分を固定FR法に従ってヒト化することができ、VH部分をベストフィット法に従ってヒト化することができ、又はその逆も可能である。
一般的に、非ヒトCDRとヒトFRとの間の不適合の結果として、CDRグラフティング後に親和性が減少する。したがって、典型的なCDRグラフティングのプロトコルにおける第3工程は、親和性喪失を回復させる又は防止する突然変異を規定することである。復帰突然変異は、ヒト化抗体の構造又はモデルに基づいて慎重に設計し、実験的に試験する必要がある。WAMと呼ばれる自動化抗体モデリングに関するウェブサイトは、URL:http://antibody.bath.ac.ukに見出すことができる。タンパク質構造モデリング用のソフトウェアは、http://salilab.org/modeller/modeller.html(Modeller)及びhttp://spdbv.vital-it.ch(Swiss PdbViewer)のサイトでダウンロードすることができる。
リサーフェイシングは、CDRグラフティングに類似しており、最初の2つの意思決定点を共有する。CDRグラフティングに対して、リサーフェイシングは、非ヒト抗体の非露出残基を保持する。非ヒト抗体における表面残基のみがヒト残基へと交換される。
CDRグラフティングは非ヒト配列とヒト配列との間のFRの比較によるが、超ヒト化はCDRの比較に基づくため、FRの相同性は無関係である。このアプローチは、非ヒト配列と機能的ヒト生殖系列遺伝子のレパートリーとの比較を含む。次いで、マウス配列と同じ又は密接に関連したカノニカル構造をコードするこれらの遺伝子を選択する。次に、非ヒト抗体とカノニカル構造を共有する遺伝子の範囲内で、CDR内に最高の相同性を有する遺伝子をFRドナーとして選択する。最後に、これらのFRへと非ヒトCDRをグラフティングする。
このアプローチは、ヒトストリングコンテント(HSC)と呼ばれる抗体の「ヒト性」の指標に基づくものである。簡潔には、このアプローチは、マウスの配列をヒト生殖系列遺伝子のレパートリーと比較する。差異がHSCとしてスコア化される。全体的な同一性の尺度を使用するのではなくそのHSCを最大化することによって標的配列をヒト化して、多数の多様なヒト化変異体を作製する。
FRライブラリーアプローチでは、残基変異体のコレクションをFR中の特定の位置に導入した後に、ライブラリーのパニングを行い、グラフティングされたCDRを最も良好に支持するFRを選択する。したがって、このアプローチはCDRグラフティングに似ているが、FR中に数個の復帰突然変異が生成される代わりに、典型的には100個を超える突然変異体のコンビナトリアルライブラリーが構築される。
このアプローチは、特定の抗原に特異的な所与の非ヒト抗体のVHドメイン又はVLドメインを、ヒトのVH及びVLのライブラリーと組み合わせることを含む。引き続き、対象となる抗原に対して特異的なヒトVドメインを選択する。例えば、最初に非ヒトVHをヒト軽鎖のライブラリーと組み合わせることによって、非ヒト抗体をヒト化することができる。次いで、ファージディスプレイによって標的抗原に対してライブラリーを選択し、選択されたVLをヒトVH鎖のライブラリーへとクローニングし、標的抗原に対して選択する。非ヒトVLをヒト重鎖のライブラリーと組み合わせることから始めることも可能である。次いで、このライブラリーを、ファージディスプレイによって標的抗原に対して選択し、選択されたVHをヒトVL鎖のライブラリーへとクローニングし、標的抗原に対して選択する。結果として、非ヒト抗体と同様の親和性を有する完全ヒト型抗体を単離することができる。エピトープドリフトの発生を避けるために、親抗体と同じエピトープを認識するクローンの選択を可能にする、いわゆる阻害ELISAを実行することが可能である。あるいは、CDR保持を適用して、エピトープドリフトを避けることができる。CDR保持においては、1つ以上の非ヒトCDR、好ましくは、抗原結合部位の中心にあるため重鎖CDR3が保持される。
FRシャッフリングアプローチでは、FR全体を非ヒトCDRと組み合わせる。FRシャッフリングを使用して、Dall'Acqua及び共同研究者らはマウス抗体をヒト化した。マウス抗体の6つの全てのCDRを、全てのヒト生殖系列遺伝子のFRを含むライブラリーへとクローニングした(Dall'Acqua et al., 2005)。該ライブラリーを、まずVLをヒト化した後にVHをヒト化する2工程の選択法で結合についてスクリーニングした。その後の研究では、1工程のFRシャッフリング法を使用することに成功した(Damschroder et al., 2007)。全ての既知のヒト生殖系列軽鎖(κ)フレームワークをコードするオリゴヌクレオチド配列は、Dall'Acqua et al., 2005に付録Aとして開示されている。全ての既知のヒト生殖系列重鎖フレームワークをコードするオリゴヌクレオチド配列は、Dall'Acqua et al., 2005に付録Bとして開示されている。
ヒューマニアリングは、ヒト生殖系列遺伝子抗体に対して91%〜96%相同である抗体の単離を可能にする。この方法は、必須の最小特異性決定基(MSD)の実験的な特定と、ヒトFRのライブラリーへの非ヒト断片の順次置き換え及び結合の評価とに基づく。この方法は、非ヒトVH鎖及びVL鎖のCDR3の領域から始まり、VH及びVLの両方のCDR1及びCDR2を含む非ヒト抗体の他の領域をヒトFRへと次第に置き換える。
(1)疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile、
(2)中性、親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
(3)酸性:Asp、Glu、
(4)塩基性:His、Lys、Arg、
(5)鎖の配向性に影響を及ぼす残基:Gly、Pro、及び、
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
本明細書中で使用する場合、「保存的置換」は、上で示される6つの標準的なアミノ酸群の同じ群内に列挙される別のアミノ酸による、或るアミノ酸の交換と定義される。例えば、GluによるAspの交換によって、そのように修飾されたポリペプチドにおける1つの負電荷は保持される。加えて、グリシン及びプロリンを、α−ヘリックスを破壊するその能力に基づき互いに置換することができる。上の6つの群内における幾つかの好ましい保存的置換は、以下の下位群内における交換である:(i)Ala、Val、Leu及びIle、(ii)Ser及びThr、(iii)Asn及びGln、(iv)Lys及びArg、並びに(v)Tyr及びPhe。既知の遺伝コード、並びに組換えDNA技法及び合成DNA技法を踏まえて、熟練した科学者は、保存的アミノ酸変異体をコードするDNAを容易に構築することができる。
以下の本発明の種々の態様をより詳細に規定する。そのように規定する各態様は、反対の内容が明示されない限り、任意の他の態様(単数又は複数)と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であるとして示した任意の特徴を、好ましい又は有利であるとして示した任意の他の特徴(単数又は複数)と組み合わせることができる。
(i)配列番号2におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号3におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(ii)配列番号11におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号12におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
と競合する、拮抗的抗原結合タンパク質を提供する。
(i)配列番号20におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号21におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(ii)配列番号29におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号30におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(iii)配列番号83におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号84におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(iv)配列番号92におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号93におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(v)配列番号101におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号102におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
と競合する、拮抗的抗原結合タンパク質を提供する。
(i)配列番号38におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号39におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
(ii)配列番号47におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号48におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
(iii)配列番号56におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号57におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
(iv)配列番号65におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号66におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(v)配列番号74におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号75におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
と競合する、拮抗的抗原結合タンパク質に関する。
(i)以下の組み合わせ:
配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号2に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号12に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号11に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせ、
(ii)以下の組み合わせ:
配列番号8のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号9のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号17のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号18のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
の群から選択される重鎖の相補性決定領域3(CDRH3)及び軽鎖の相補性決定領域3(CDRL3)の組み合わせ、
のいずれかを含む、拮抗的抗原結合タンパク質に関する。
配列番号3に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号2に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号12に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号11に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせを含む。
配列番号3に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号2に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号12に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号11に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせを含む。
配列番号8のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号9のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号17のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号18のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
の群から選択される重鎖の相補性決定領域3(CDRH3)及び軽鎖の相補性決定領域3(CDRL3)の組み合わせを含む。
配列番号8のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号9のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3、
配列番号4のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1及び配列番号5のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、
配列番号6のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号7のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2、
を含む。好ましくは、CDRH1、CDRL1、CDRH2又はCDRL2において1つのアミノ酸交換を含む、先で特定された拮抗的抗原結合タンパク質も本発明の範囲内である。
配列番号17のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号18のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3、
配列番号13のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1及び配列番号14のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、
配列番号15のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号16のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2、
を含む。好ましくは、CDRH1、CDRL1、CDRH2又はCDRL2において1つのアミノ酸交換を含む、先で特定された拮抗的抗原結合タンパク質も本発明の範囲内である。
(i)以下の組み合わせ:
配列番号21に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号20に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号30に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号29に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号84に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号83に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号93に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号92に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号102に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号101に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせ、
(ii)以下の組み合わせ:
配列番号26のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号27のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号35のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号36のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号89のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号90のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号98のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号99のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号107のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号108のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
の群から選択される重鎖の相補性決定領域3(CDRH3)及び軽鎖の相補性決定領域3(CDRL3)の組み合わせ、
のいずれかを含む、拮抗的抗原結合タンパク質に関する。
配列番号21に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号20に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号30に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号29に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号84に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号83に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号93に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号92に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号102に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号101に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせを含む。
配列番号21に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号20に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号30に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号29に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号84に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号83に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号93に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号92に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号102に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号101に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせを含む。
配列番号26のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号27のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号35のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号36のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号89のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号90のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号98のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号99のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号107のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号108のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
の群から選択される重鎖の相補性決定領域3(CDRH3)及び軽鎖の相補性決定領域3(CDRL3)の組み合わせを含む。
配列番号26のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号27のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3、
配列番号22のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1及び配列番号23のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、
配列番号24のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号25のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2、
を含む。好ましくは、CDRH1、CDRL1、CDRH2又はCDRL2において1つのアミノ酸交換を含む、先で特定された拮抗的抗原結合タンパク質も本発明の範囲内である。
配列番号35のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号36のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3、
配列番号31のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1及び配列番号32のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、
配列番号33のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号34のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2、
を含む。好ましくは、CDRH1、CDRL1、CDRH2又はCDRL2において1つのアミノ酸交換を含む、先で特定された拮抗的抗原結合タンパク質も本発明の範囲内である。
配列番号89のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号90のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3、
配列番号85のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1及び配列番号86のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、
配列番号87のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号88のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2、
を含む。好ましくは、CDRH1、CDRL1、CDRH2又はCDRL2において1つのアミノ酸交換を含む、先で特定された拮抗的抗原結合タンパク質も本発明の範囲内である。
配列番号98のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号99のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3、
配列番号94のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1及び配列番号95のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、
配列番号96のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号97のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2、
を含む。好ましくは、CDRH1、CDRL1、CDRH2又はCDRL2において1つのアミノ酸交換を含む、先で特定された拮抗的抗原結合タンパク質も本発明の範囲内である。
配列番号107のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号108のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3、
配列番号103のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1及び配列番号104のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、
配列番号105のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号106のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2、
を含む。好ましくは、CDRH1、CDRL1、CDRH2又はCDRL2において1つのアミノ酸交換を含む、先で特定された拮抗的抗原結合タンパク質も本発明の範囲内である。
(i)以下の組み合わせ:
配列番号39に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号38に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号48に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号47に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号57に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号56に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号66に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号65に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号75に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号74に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせ、
(ii)以下の組み合わせ:
配列番号44のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号45のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号53のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号54のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号62のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号63のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号71のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号72のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号80のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号81のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
の群から選択される重鎖の相補性決定領域3(CDRH3)及び軽鎖の相補性決定領域3(CDRL3)の組み合わせ、
のいずれかを含む、拮抗的抗原結合タンパク質に関する。
配列番号39に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号38に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号48に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号47に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号57に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号56に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号66に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号65に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号75に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号74に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせを含む。
配列番号39に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号38に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号48に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号47に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号57に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号56に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号66に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号65に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号75に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号74に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせを含む。
配列番号44のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号45のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号53のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号54のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号62のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号63のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号71のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号72のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号80のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号81のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
の群から選択される重鎖の相補性決定領域3(CDRH3)及び軽鎖の相補性決定領域3(CDRL3)の組み合わせを含む。
配列番号44のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号45のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3、
配列番号40のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1及び配列番号41のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、
配列番号42のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号43のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2、
を含む。好ましくは、CDRH1、CDRL1、CDRH2又はCDRL2において1つのアミノ酸交換を含む、先で特定された拮抗的抗原結合タンパク質も本発明の範囲内である。
配列番号53のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号54のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3、
配列番号49のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1及び配列番号50のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、
配列番号51のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号52のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2、
を含む。好ましくは、CDRH1、CDRL1、CDRH2又はCDRL2において1つのアミノ酸交換を含む、先で特定された拮抗的抗原結合タンパク質も本発明の範囲内である。
配列番号62のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号63のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3、
配列番号58のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1及び配列番号59のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、
配列番号60のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号61のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2、
を含む。好ましくは、CDRH1、CDRL1、CDRH2又はCDRL2において1つのアミノ酸交換を含む、先で特定された拮抗的抗原結合タンパク質も本発明の範囲内である。
配列番号71のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号72のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3、
配列番号67のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1及び配列番号68のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、
配列番号69のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号70のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2、
を含む。好ましくは、CDRH1、CDRL1、CDRH2又はCDRL2において1つのアミノ酸交換を含む、先で特定された拮抗的抗原結合タンパク質も本発明の範囲内である。
配列番号80のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号81のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3、
配列番号76のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1及び配列番号77のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、
配列番号78のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号79のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2、
を含む。好ましくは、CDRH1、CDRL1、CDRH2又はCDRL2において1つのアミノ酸交換を含む、先で特定された拮抗的抗原結合タンパク質も本発明の範囲内である。
(a)口唇、口腔及び咽頭の悪性新生物、及び/又は、
(b)消化器の悪性新生物、及び/又は、
(c)呼吸器及び胸腔内臓器の悪性新生物、及び/又は、
(d)骨及び関節軟骨の悪性新生物、及び/又は、
(e)黒色腫及び他の皮膚の悪性新生物、及び/又は、
(f)中皮組織及び軟部組織の悪性新生物、及び/又は、
(g)乳房の悪性新生物、及び/又は、
(h)女性生殖器の悪性新生物、及び/又は、
(i)男性生殖器の悪性新生物、及び/又は、
(j)尿路の悪性新生物、及び/又は、
(k)目、脳及び他の中枢神経系の部分の悪性新生物、及び/又は、
(l)甲状腺及び他の内分泌腺の悪性新生物、及び/又は、
(m)リンパ系、造血系及び関連組織の悪性新生物、
からなる群から選択される。
抗体及びヒト組換えタンパク質
以下の抗体を使用した:西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗Hisマウスモノクローナル抗体(Qiagen社、ドイツ、ヒルデン)、(HRP)結合抗M13マウスモノクローナル抗体(GE Healthcare社、英国、チャルフォント・セント・ジャイルズ)、抗ヒトLAG-3マウスモノクローナル抗体(R&D Systems社、米国、ミネアポリス)、抗ヒトPD-1ヒトモノクローナル抗体のニボルマブ(Opdivo(商標)、Bristol-Myers Squibb社、米国、ニュージャージー州、プリンストン)、抗ヒトPD-L1ヒトモノクローナル抗体(G&P Biosciences社、米国、カリフォルニア州、サンタクララ)、(HRP)結合抗ヒトIgG(Promega社、米国、ウィスコンシン州、マディソン)、PE/抗ヒトCD2マウスモノクローナル抗体(BioLegend Inc.社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ)、APC/抗ヒトCD3マウス抗体、PE/抗ヒトCD4マウスモノクローナル抗体、PerCP/抗ヒトCD8マウスモノクローナル抗体(全てBD Biosciences社製、米国、カリフォルニア州、サンノゼ)、(HRP)結合抗ヒトIgG(Fab’)2ヤギモノクローナル抗体(Abcam社、英国、ケンブリッジ)、APC/抗ヒトIgG Fcマウス抗体、APC/Cy7抗ヒトCD366(TIM3)マウス抗体、APC/抗ヒトCD272(BTLA)マウス抗体、APC/抗ヒトCD137(4-1BB)マウス抗体、PE/抗ヒトCD134(OX40)マウス抗体、Brilliant Violet 510(商標)/抗マウス/ラット/ヒトCD27ハムスター抗体、APC/抗ヒト/マウス/ラットCD278(ICOS)ハムスター抗体(全てBioLegend社製)、FITC/抗ヒトTIGITマウス抗体(Thermo Fisher Scientific社、米国、マサチューセッツ州、ウォルサム)。以下の組換えキメラタンパク質を使用した:ヒトLAG-3/Fc、ヒトPD-1/Fc、ヒトPD-L1/Fc、TIM3/Fc、BTLA/Fc、TIGIT/Fc、OX40/Fc、4-1BB/Fc、CD27/Fc及びICOS/Fc、ヒトIgG1-Fc(全てR&D Systems社製)。
MDA-MB-231細胞は、ダルベッコの改変イーグル培地(Gibco(商標)DMEM、Thermo Fisher Scientific社)中で培養した。MCF7細胞は、改変イーグル培地(Gibco(商標)MEM、Thermo Fisher Scientific社)中で培養した。10%(容量/容量)の熱不活化ウシ胎児血清(FBS、Sigma-Aldrich社、米国、ミズーリ州、セントルイス)、50 IU ml-1のペニシリン、50 μg ml-1のストレプトマイシン、2 nMのL-グルタミン(全てGibco(商標)、Thermo Fisher Scientific社)を培地に補充した。細胞系統は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)から購入し、5%のCO2を含む加湿雰囲気中にて37℃で培養した。
ヒト末梢血単核細胞(hPBMC)を、ACCUSPIN(商標)System-Histopaque(商標)-1077(Sigma-Aldrich社)を使用することによって製造業者の指示に従って、健康なドナーの血液から分離し、使用するまで90%のFBS及び10%のDMSOを含む溶液中で凍結させた。1%のL-グルタミン、1%のCTL-Wash(商標)(Cellular Technology Limited社、米国、オハイオ州、クリーブランド)及び100 U/mlのベンゾナーゼ(Merck Millipore社、米国、マサチューセッツ州、ビレリカ)を補充したRPMI 1640培地(Gibco(商標)、Thermo Fisher Scientific社)を使用することによって、凍結保存された細胞バイアルを静かに解凍した。次いで、収集したhPBMCを遠心分離により洗浄し、プレーティングし、10%の不活化ウシ胎児血清(FBS、Sigma-Aldrich社)、1%のL-グルタミン、50 U ml-1のペニシリン、50 μg ml-1のストレプトマイシン及び1%のHEPES(全てGibco(商標)、Thermo Fisher Scientific社)を補充したRPMI 1640(Gibco(商標)、Thermo Fisher Scientific社)からなるR10培地中にて37℃で一晩インキュベートした。一晩静置した後に、hPBMCをPBS中で収集し、Muse(商標)セルアナライザー(Merck Millipore社)を使用することによってカウントし、1×106個の細胞/mlの密度で再懸濁した。
レスキューされ、カウントされたヒト末梢血単核細胞(hPBMC)を、Dynabeads(商標)Human T-Activator CD3/CD28を用いて1×103個のビーズ/mlの濃度で活性化させた(Gibco(商標)、Thermo Fisher Scientific社)。活性化の24時間〜96時間後に、細胞を丸底の96ウェルプレートに播種し(1×106個の細胞/ウェル)、その後に1200 rpmで5分間遠心分離して、上清を除去した。非標識の抗LAG-3一次抗体、抗PD-1一次抗体(ニボルマブ)又は抗PD-L1一次抗体を10 μg/mlの濃度で各ウェルに加え、穏やかに振盪することによって室温で90分間インキュベートした。徹底的に洗浄した後に、穏やかに振盪することによって、FACS緩衝液(PBS、1%のFBS)中の100 μlのAPC/抗ヒトIgG Fc抗体及び10 μg/mlのPE/抗ヒトCD2抗体(BioLegend社)で細胞を室温で45分間染色した。標識された抗体APC/Cy7抗ヒトCD366(TIM3)、APC/抗ヒトCD272(BTLA)、APC/抗ヒトCD137(4-1BB)、PE/抗ヒトCD134(OX40)、Brilliant Violet 510(商標)/抗マウス/ラット/ヒトCD27、APC/抗ヒト/マウス/ラットCD278(ICOS)、FITC/抗ヒトTIGIT抗体を、各ウェルに10 μg/mlの濃度で加え、穏やかに振盪することによって室温で90分間インキュベートした。FACS緩衝液で2回洗浄した後に、細胞をPBS中に再懸濁し、5 ml容のポリスチレン製丸底チューブ(BD Biosciences社)に移して、CytoFLEXフローサイトメーター(Beckman Coulter社、米国、カリフォルニア州、ブレア)で分析した。
健康なドナーから分離されたヒト末梢血単核細胞(hPBMC)を、2 mMのL-グルタミン、10%(容量/容量)のCTL washサプリメント(CTL、米国、オハイオ州、シェーカーハイツ)、100 U/mlのベンゾナーゼ(Merck Millipore社、米国、マサチューセッツ州、バーリントン)を補充したRPMI 1640培地(Gibco社)中で解凍した。1200 rpmで10分間遠心分離した後に、これらを10%(容量/容量)の熱不活化ウシ胎児血清(FBS、Sigma社)、2 mMのL-グルタミン、100 U/mlのペニシリン及び100 μg/mlのストレプトマイシン(Gibco社)、HEPES(10 mM)(Gibco社)を補充した完全RPMI培地中に再懸濁した。5%のCO2を含む加湿雰囲気中にて37℃で16時間静置した後に、hPBMCをカウントし、完全RPMI培地(上記)中で106個の生細胞/mlの濃度で再懸濁し、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Gibco社)を用いて25 μlのビーズ/106個の生細胞で活性化した。活性化の24時間後に、細胞を遠心分離し、丸底を有する96ウェルプレートにおいてPBS中で4×105個の細胞/ウェルでプレーティングした。PBS中で1回洗浄した後に、これらを50 μlのLIVE/DEAD(商標)Fixable Violet Dead Cell Stain(Invitrogen社)と一緒に+4℃で30分間インキュベートし、もう一度洗浄した。48 pM及び9.6 pMの濃度で100 μlのPBS中に希釈したモノクローナル抗体を細胞に加え、穏やかに振盪しながら暗所にて室温で1時間30分インキュベートした。細胞を前述のように2回洗浄した後に、5 μlのPE結合抗ヒトCD2(BD Biosciences社)及びAPC結合抗ヒトIgG, Fcγ特異的抗体(Jackson immunoresearch社)(100 μlのFACS緩衝液(PBS(1×) 1%(容量/容量)FBS)中で1:2000希釈される)と一緒にインキュベートした。前述と同じ条件で45分インキュベートした後に、FACS緩衝液による2回の洗浄を行い、CytoFLEXフローサイトメーター(Beckman Coulter社)での取得のために、細胞を150 μlのPBS(1×)中に再懸濁した。
以前に記載されたように(De Lorenzo C, Clinical Cancer Research, 2002)、M13-K07ヘルパーファージ(Invitrogen、Thermo Fisher Scientific社)を使用することにより、ファージミド粒子をライブラリーから回収した。各選択ラウンドで、ファージ(1013 cfu)をPBS中の5%(重量/容量)のスキムミルク粉末(Fluka Analytical、Sigma-Aldrich社)でブロッキングした。最初の選択ラウンドでは、ブロッキングされたファージを活性化リンパ球(1×106個)と一緒に4℃で一晩回転させてインキュベートすることにより行われる1ラウンドの選択にかけた。PBSで徹底的に洗浄した後に、結合されたファージをPBS中の76 mMのクエン酸(pH 2.5)により活性化リンパ球から5分間溶出させ、その後に1 MのTris・HCl(pH 8.0)で中和した。E.コリTG1細胞に感染させることによって、回収されたファージを増幅して、精製キメラタンパク質に対する次の選択ラウンドのためのファージを調製した。このために、Nunc(商標)ポリプロピレンチューブ(Fisher Scientific、Thermo Fisher Scientific社)に、0.05 MのNaHCO3溶液中20 μg/mlの濃度の選択された組換えキメラタンパク質を4℃で72時間コーティングした。ブロッキングされたファージを、rhIgG1-Fcタンパク質でコーティングされたチューブ内にて4℃で2時間回転させてインキュベートすることによる後続の2ラウンドの負の選択にかけた。次いで、上清中に回収された未結合のファージを、正の選択のために上記のように作製されたコーティングされたチューブ内にて4℃で一晩回転させてインキュベートし、上記のように溶出させた。あるいは、溶出のためにトリプシンを使用した。簡潔には、PBSで徹底的に洗浄した後に、結合されたファージを1 mMのCaCl2を含む50 mMのTris・HCl(pH 8.0)緩衝液と一緒に4℃で1時間回転させてインキュベートし、その後にトリプシン(1 μg/ml)を用いて穏やかに振盪することによって25℃で更に15分間インキュベートしてキメラタンパク質から溶出させた。次いで、プロテアーゼ阻害剤(cOmplete(商標)EDTA不含のプロテアーゼ阻害剤カクテル、Sigma-Aldrich社)を使用することによって、反応を遮断した。その後に、ファージを収集して、使用するまで4℃で貯蔵した。
各サブライブラリーについて、Endo free Plasmid Maxi Kit(Qiagen社)を使用して、重複感染されたE.コリTG1細胞の培養物から、scFvを含むファージミド二本鎖DNAを精製した。全長scFvを制限酵素BamHI及びHindIII(New England Biolabs社)で切り出し、Wizard(商標)SV Gel及びPCR Clean-Up System(Promega社)を用いて1.2%アガロースゲルから精製した。NcoI及びXhoI(New England Biolabs社)を用いて2回目の酵素的切り出しを行い、以前に精製された材料からVHを単離した後に、1.4%アガロースゲルから抽出した。NGSのためのライブラリーの準備、シーケンシング及びデータの予備的なバイオインフォマティクス分析は、イタリア、ミラノのサン・ラッファエーレ病院のトランスレーショナルゲノミクス・バイオインフォマティクスセンター(Center for Translational Genomics and Bioinformatics)で行われた。サブライブラリーから抽出されたVHをTruSeq ChIPサンプル調製キット(Illumina社)によってバーコード化した。幾つかのサブサイクルのVH混合物の深く適切なシーケンシングを達成するために、バーコード化のための補完的なスキームを実行した。専用の実行で各標的のサブサイクル2及びサブサイクル3を混ぜた。より大きな複雑性を補うために、最初のユニバーサルサイクル1を個別にシーケンシングした。バーコード化された試料を最終濃度10 pMに希釈し、Illumina MiSeq装置で2×300 nt SBSキットv3を用いてシーケンシングした。
対象となるクローンを、対応する標的のサイクル3でサブライブラリーから分離した。高ランクのクローンには、QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies社)を使用して、以前に記載された手順(26)に従って、対応するHCDR3領域内で設計された重複するプライマーを用いてクローンのコピーを行った。簡潔には、伸長反応を次のように組成した:50 ng〜250 ngのテンプレート、2/5 μLのQuickSolution試薬、1 μLのPfu Ultra High Fidelity DNAポリメラーゼ(2.5 U/μL)、5 μLの10×反応バッファー、1 μLのdNTPmix、125 ngのフォワードプライマー、125 ngのリバースプライマー、H2Oで最終容量50 μLまで。テンプレートDNAは、キット供給元の提案の通りに、1 μLのDpnI酵素を用いた制限によって除去した。適切な量の反応を使用して、XL10-GOLDウルトラコンピテントセル(Agilent Technologies社)を形質転換した後に、100 μg/mlのアンピシリンを含むLB/寒天上にプレーティングした。幾つかのコロニーを採取し、二重消化及びシーケンシングによって評価した。低ランクのクローンでは、DNA試料を重複PCRによってサイクル3から分離した。簡潔には、Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific社)を使用して、対応するHCDR3領域内とVH及びVLの上流及び下流のプラスミドの定常領域とにおいて設計されたプライマーを使用して2つのPCR反応を実施して、VH断片及びVL断片を個別に得た。第2工程では、各クローンに対応するPCR断片を混合して伸長させることで、完全なscFvを取得した。この反応は以下のように組成した:VH断片及びVL断片の増幅用の150 ngのテンプレート並びに完全なscFvの増幅用の10 ngのテンプレート(VH断片及びVL断片)、0.5 μLのPhusion DNAポリメラーゼ(0.02 U/μl)、10 μLの5×Phusion HFバッファー、1 μLのdNTPミックス、0.5 μMのフォワードプライマー、0.5 μMのリバースプライマー、1.5 μlのDMSO、H2Oで最終容量50μlまで。
対応するVH及びVLのcDNAをそれぞれ抗体の定常重鎖及び定常軽鎖を発現するpEUベクター8.2VH及び4.2VL(Paciello R, J Gen Virol., 2016)にクローニングすることによって、対象となるscFvを全IgG4抗体に変換した。簡潔には、CloneAmp HiFi PCR Premixによって標準的な条件で特定のプライマーを用いて、VH及びVLを増幅し、Wizard(商標)SV Gel及びPCR Clean-Up System(Promega社)を用いて1.3%のアガロースゲルから精製した。In-Fusion HDクローニングキット(Clontech Laboratories社、米国、カリフォルニア州、マウンテンビュー)を使用して、BamHI及びBssHII(New England Biolabs社)で線状化されたpEU8.2VHベクターにVHをクローニングし、ApaLI及びAvrII(New England Biolabs社)で線状化されたpEU4.2VLベクターにVLをクローニングした。Stellarコンピテントセル(Clontech Laboratories, Inc社、米国、カリフォルニア州、マウンテンビュー)を、取得したベクターで形質転換し、コロニーを消化及び配列分析によりスクリーニングした。Lipofectamineトランスフェクション試薬(Life Technologies, Inc.社)を使用することによって、正しい調製物をHEK293-EBNAに同時トランスフェクションし、5 mlのL-グルタミン(L-glutamine)(200 mM)(Gibco、Life Technologies社)、5 mlのペニシリン−ストレプトマイシン(Streptomycin)(10000 U/mL-10 mg/mL)(Sigma-Aldirch社)を補充した既知組成のCD CHO培地(Gibco、Life Technologies, Inc.社)中で6ウェルプレート又は150mmのCorning(商標)組織培養処理培養ディッシュにおいて37℃で約10日間成長させた。馴化培地を収集し、Protein A HP SpinTrap(GE Healthcare Life Sciences社、米国、ニューヨーク州)を使用することによって抗体を精製した。SDS-PAGE NuPAGE(商標)4%〜12%のBis-Trisタンパク質ゲル、1.0 mm、10ウェル(Thermo Fisher Scientific社)によって、最終産物の純度を評価した後に、クーマシーブルー溶液(Biorad社)で20分間染色し、7%のCH3COOH及び20%のEt-OHで脱色した。
精製モノクローナル抗体の結合特異性を確認するために、キメラタンパク質(5 μg/mlでコーティング)、腫瘍細胞(PD-L1陽性乳癌MDA-MB-231細胞又はPD-L1陰性乳癌MCF7)及び未処理のhPBMC又は活性化hPBMCに対してELISAアッセイを実施した。Nunc(商標)平底96ウェルプレート(Fisher Scientific、Thermo Fisher Scientific社)を0.05 MのNaHCO3の溶液中の5 μg/mlのrhPD-1組換えタンパク質、rhPD-1組換えタンパク質及びrhLAG-3組換えタンパク質により37℃で72時間コーティングすることによって、コーティングされたキメラタンパク質に対するELISAアッセイを行った。コーティングされた96ウェルプレートを5%の脱脂粉乳を含むPBSにより37℃で1時間ブロッキングした後に、精製モノクローナル抗体を、2.5%の脱脂粉乳を含むPBS中にて漸増濃度(10 nM〜200 nM)で上記プレートに加え、穏やかに振盪することによって、室温で2時間インキュベートした。PBSで徹底的に洗浄した後に、該プレートを(HRP)結合抗ヒトIgG(Fab')2ヤギモノクローナル抗体(Abcam社、英国、ケンブリッジ)と一緒に1時間インキュベートし、再度洗浄し、TMB試薬と一緒に10分間インキュベートした後に、等容量の1 NのHClでクエンチした。
新規の抗PD-1モノクローナル抗体がニボルマブと異なるエピトープを認識するかどうかを確かめるために、コーティングされたPD-1/Fcキメラタンパク質(5 μg/ml)に対して競合ELISAアッセイを実施した。5%の脱脂粉乳を含むPBSでブロッキングした後に、コーティングされた96ウェルプレートを、2.5%の脱脂粉乳を含むPBS中の飽和濃度の各非標識モノクローナル抗体(400 nM)と一緒に撹拌しながら室温で2時間プレインキュベートした。PBSで徹底的に洗浄した後に、漸増濃度のビオチン化ニボルマブモノクローナル抗体を添加した。結合を検出するために、プレートをHRP結合ストレプトアビジン(Biorad社)と一緒に室温で撹拌しながら30分間インキュベートし、再度洗浄して、上記のように分析した。
ヒト末梢血単核細胞(hPBMC)を解凍の翌日にレスキューし、カウントした後に、Dynabeads(商標)Human T-Activator CD3/CD28を用いて1×103個のビーズ/mlの濃度で活性化させた(Gibco(商標)、Thermo Fisher Scientific社)。活性化の24時間〜96時間後に、細胞を丸底の96ウェルプレートに播種し(4×105個の細胞/ウェル)、その後に1200 rpm/分で5分間遠心分離して、上清を除去した。抗PD-L1モノクローナル抗体のPD-L1_A及びPD-L1_Cを10 μg/mlの濃度で加え、穏やかに振盪することによって室温で90分間インキュベートした。徹底的に洗浄した後に、穏やかに振盪することによって、FACS緩衝液(PBS、1%のFBS)中の100 μlのAPC/抗ヒトIgG Fc抗体及び10 μg/mlのPE/抗ヒトCD2抗体(BioLegend社)で細胞を室温で45分間染色した。FACS緩衝液で2回洗浄した後に、細胞をPBS中に再懸濁し、ポリスチレン製丸底チューブ(BD Biosciences社)へと移して、CytoFLEXフローサイトメーター(Beckman Coulter社)で分析した。
リンパ球増殖アッセイを、hPBMCを使用することにより実施し、上記のようにカウントし、予め温められた0.1%のBSA/PBS溶液中で2×106個の細胞/mlの密度で再懸濁した。染色のために、CFDA-SE(Vybrant(商標)Cell Tracer Kit、Invitrogen(商標)、Thermo Fisher Scientific社)を10 μMの濃度で含む予め温められた0.1%のBSA/PBS溶液を使用して、hPBMCを1×106個の細胞/mlの密度で再懸濁し、37℃で10分間インキュベートした。次いで、氷冷されたR10培地を使用して、氷上で更に5分間インキュベートすることによって細胞を透過処理した。次に、細胞をPBSで3回洗浄した。2回目の洗浄と3回目の洗浄との間に、細胞を37℃で5分間インキュベートして、過剰なCFDA-SEを完全に除去した。最後の洗浄及び1200 rpmでの10分間の遠心分離の後に、細胞をR10中に1×106個の細胞/mlの密度で再懸濁し、48ウェルプレートにプレーティングした(1×106個の細胞/ウェル)。選択された抗LAG-3モノクローナル抗体(10 μg/ml)の不存在下又は存在下で、プレーティングされたリンパ球を2.5 μg/mlのフィトヘマグルチニン-L(PHA-L、Roche社)と一緒にインキュベートすることによって、リンパ球増殖アッセイを実施した。次いで、プレートを37℃で5日間インキュベートした。処理が終わったら、各試料を回収し、100 μlのPBSに再懸濁し、丸底の96ウェルプレートに移した。最初に、細胞をバイオレットのLIVE/DEAD溶液(Thermo Fisher Scientific社)と一緒に4℃で30分間インキュベートした。数回洗浄した後に、試料を更に抗ヒトCD3(APC)抗体、抗CD4(PE)抗体及び抗CD8(PerCP)抗体(10 μl/試料)と一緒に4℃で1時間インキュベートした。最後に、細胞を徹底的に洗浄し、200 μlのPBS中に再懸濁させ、5 ml容のポリスチレン製丸底チューブ(BD Biosciences社)へと移して、CytoFLEXフローサイトメーター(Beckman Coulter社)でサイトメトリー取得を行った。
本発明者らの目標は、免疫チェックポイント(IC)に対するヒト抗体レパートリーの作製であった。多くのICはTリンパ球の表面に発現し、それらの発現はT細胞が抗原依存的又は抗原非依存的な刺激に曝されると増加するため、本発明者らは、未分画のヒト末梢血単核細胞(hPBMC)を使用してヒト一本鎖抗体断片(scFv)のライブラリーをスクリーニングすることを試みた。選択プロセスを最適化するために、抗CD3/CD28ビーズを用いたin vitro活性化後に、最初に10種の異なるIC(表1に示される)の動態及び発現レベルを評価した。表1に示されるように、フローサイトメトリー分析によって測定されたピーク発現は、種々の免疫モジュレーターの間で異なっていたが、それらの大部分は96時間の刺激後に最大レベルの提示に達した(表1を参照)。96時間の刺激後に、未処理のhPBMCと活性化hPBMCとの間で同じレベルの表面提示を維持したBTLA及びその発現レベルをわずかに増加させたTIGITを除いて、全てのICは、ゲーティングされた集団の50%超で十分に発現した。この分析に基づいて、ヒトscFvライブラリーの選択に使用されるべきリンパ球の活性化の時点として96時間を選択した。
ex vivo/in vitroを組み合わせたアプローチにより選択された個々のファージクローンを特定するために、MiSeq Illuminaプラットフォームでの大規模並列シーケンシング(詳細については、材料及び方法のセクションを参照)により、IC特異的なレパートリーのVH領域をシーケンシングした。イムノームライブラリー(サイクル1)から出発して、標的特異的なファージを効率的に濃縮するために、Fc融合組換えタンパク質に対する後続の2サイクルの選択(サイクル2及びサイクル3)を実施した。全体の選択のセットの配列分析により、サイクル2の後で既に濃縮が起こっていたが、3番目のサイクルの後に、より大幅に高いレベルの濃縮(すなわち、少なくとも10倍)が得られたことが判明した(図1)。並列シーケンシングデータの分析により、おそらく10種の生化学的ベイトに共通するFcバインダーの濃縮のため、全ての選択に共通するVH配列を除去することができた。同様に、scFvをコードする配列内に停止コドンを有する非特異的な生物学的に濃縮されたクローンを、潜在的なバインダーのリストから取り出した。各標的に最も関連性の高い特定のクローンを得るために、最終的に、種々の選択サイクル3のリストに100万あたり85カウントの閾値を設定した。このようにして、10種の標的のうち9種の標的に最良の潜在的なバインダーの詳細なスナップショットが取得された(図1に示される)。TIGITの選択は実際には分析から除外された。それというのも、TIGITの選択は、おそらく活性化hPBMCでのその発現が低いため、あまり配列の濃縮を示さなかったからである(表1を参照)。
最高ランクのLAG-3、PD-1及びPD-L1バインダーから作製されたヒトIgG4抗体は、活性化PBMC及び低ナノモル又はナノモル未満の親和性を有する組換えタンパク質を認識することが確認された(図2及びその中の表)。特に、幾つかの抗PD-1モノクローナル抗体(すなわち、PD-1_A及びPD-1_B)は、臨床的に検証されたニボルマブと比較して同等又はより良好な見かけの親和性を示した。ニボルマブを含むほとんどの抗PD-1抗体及び抗PD-L1抗体は、活性化hPBMCと比べて組換えタンパク質へのより強い結合を示したが、抗LAG3抗体では逆のことが当てはまった。抗PD-L1抗体は、癌細胞で発現されるPD-L1とT細胞によって提示されるPD-1との間の相互作用を遮断することによって臨床的便益をもたらすことが分かっているため、更に抗PD-L1抗体が癌細胞の表面上にあるそれらの標的を認識するかどうかを試験した。全ての抗PD-L1抗体は、乳房MDA-MB-231腫瘍細胞等のPD-L1を発現する腫瘍細胞にも高い親和性を示したが、腫瘍細胞への結合活性の階層は、活性化hPBMCで観察されたものとは異なっていた(図2中の表)。さらに、モノクローナル抗体のPD-L1_A及びPD-L1_Bは、競合ELISAアッセイにおいて、その2つの受容体PD-1及びB7.1によるPD-L1の認識を妨げることができることが示された。
以前の報告で、未分画のhPBMCにおけるCD3陽性初代休止細胞はブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)又はフィトヘマグルチニン(PHA)を使用することによってin vitroで増殖するように誘導することができること、そしてこの活性はCIによって調節されることが示された(Macon-Lemaitre L, Immunology, 2005、Wang C, Cancer Immunol Res., 2014、Selby MJ, Plos One, 2016)。したがって、上記のリンパ球増殖アッセイを使用して、LAG-3、PD-1又はPD-L1に対する選択された抗体が細胞分裂を増加させることができるかどうかを試験した。CFDA-SE染色されたリンパ球をPHAで刺激し、抗体の不存在下又は存在下でインキュベートして、抗原特異的なT細胞増殖を誘導した。このアッセイでは、ニボルマブは一貫して増殖活性の50%の増加をもたらし、抗PD-1抗体のPD-1_A及びPD-1_BはT細胞増殖を効果的に刺激することもでき、その際、PD-1_Aは、臨床的に活性なニボルマブよりも高い活性を示した(図3)。同様に、PD-L1に対する全ての3個の抗体及び3個のLAG-3抗体のうちの1個も様々な増殖の程度を誘導した。増殖を刺激する能力は結合力と常に相関するとは限らず、異なる抗体がそれらの標的との異なる相互作用様式を有し得ることを示唆している。
hPBMC(1×106個の細胞)を培養し、抗体の不存在下又は選択された抗LAG-3モノクローナル抗体、抗PD-L1モノクローナル抗体及び抗PD-1モノクローナル抗体(20 μg/mL)若しくはネガティブコントロールとして使用されるアイソタイプコントロール抗体の存在下で、2.5 μg/mLのPHA-L又は50 ng/mLのブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB、Sigma-Aldrich社)で18時間、42時間及び66時間刺激した。ニボルマブを、同じ条件で並行アッセイでのポジティブコントロールとして試験した。細胞培養上清中のIL-2又はIFNγのレベルを、ELISAアッセイ(DuoSet ELISA、R&D Systems社)によって製造業者の推奨に従って測定した。
6週齢の雌のBalBCマウス(Envigo社)をin vivo研究で使用した。マウスの右脇腹に2×105個の細胞を皮下移植し(0日目)、3日目、6日目、10日目に、200 μgのα-mPD-L1(BioXcell社、クローン10F.9G2)、α-mPD-1(BioXcell社、クローンRMP114)、PD-1_A又はPD-L1_Aで腹腔内処理した。腫瘍成長を、3日〜4日ごとにキャリパーにより式L×W2/2(Lは腫瘍の最大直径であり、Wは腫瘍の最小直径である)を使用して測定した。苦痛の兆候又は2000 mm3を超える腫瘍体積が生じたらすぐに動物を屠殺した。
本発明者らは、幾つかの異なるICを認識する抗体の多数のセットの迅速な特定が可能となるようにファージディスプレイ技術を調整した。このために、所与の受容体を特異的に認識するscFvを、組換えタンパク質又はペプチド又は他の標的特異的ベイトを使用する後続の親和性選択サイクルによって引き出すことができるICバインダーのバイアスのないライブラリー、すなわちイムノームライブラリーの作製のためのセレクターとして、生きた活性化hPBMCを選択した。選択プロセスの開始点としてhPBMCを使用する根拠は、生きたヒト細胞によって提示される正しい翻訳後修飾を有するネイティブな受容体を認識することができる抗体の選択を保証するためでもあった。この作業仮説と一致して、選択されたscFvを使用して作製されたヒトIgG4は、0.1 nMまでの低ナノモル範囲における見かけの親和性で細胞が提示する受容体を認識することができた。この結合親和性は、臨床的に有効なチェックポイント特異的抗体で示される結合親和性と同等又はそれ以上であり、多くの種類の癌の治療用に承認された抗PD-1モノクローナル抗体のニボルマブの親和性(Wang C, Cancer Immunol Res., 2014)より優れている。hPBMCでの選択の効率を改善するために、T細胞の抗CD3架橋によって標的ICの発現レベルを増加させた。
図1
Immunome universal cycle 1 イムノームユニバーサルサイクル1
Cycle 2 サイクル2
Cycle 3 サイクル3
図2
Absorbance 吸光度
Activated hPBMCs 活性化hPBMC
Untreated hPBMCs 未処理のhPBMC
MDA-MB-231 cells MDA-MB-231細胞
Nivolumab ニボルマブ
図3
Fold increase of CD3-T cell proliferation CD3-T細胞増殖の増加倍率
hIgG4 control hIgG4コントロール
Nivolumab ニボルマブ
図4
Fold increase 増加倍率
Nivolumab ニボルマブ
図5
hIgG4 control hIgG4コントロール
Nivolumab ニボルマブ
Time (hours) 時間(時)
図6
Tumor volume (mm3) 腫瘍体積(mm3)
untreated 未処理
図7
Binding to activated hPBMC 活性化hPBMCへの結合
IgG concentration IgG濃度
図8
hIgG4 control hIgG4コントロール
Nivolumab ニボルマブ
Time (hours) 時間(時)
Claims (15)
- PD-1に特異的に結合する拮抗的抗原結合タンパク質であって、該抗原結合タンパク質は、PD-1への結合について、
(i)配列番号2におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号3におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(ii)配列番号11におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号12におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
と競合する、拮抗的抗原結合タンパク質。 - PD-L1に特異的に結合する拮抗的抗原結合タンパク質であって、該抗原結合タンパク質は、PD-L1への結合について、
(i)配列番号20におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号21におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(ii)配列番号29におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号30におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(iii)配列番号83におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号84におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(iv)配列番号92におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号93におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(v)配列番号101におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号102におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
と競合する、拮抗的抗原結合タンパク質。 - LAG-3に特異的に結合する拮抗的抗原結合タンパク質であって、該抗原結合タンパク質は、LAG-3への結合について、
(i)配列番号38におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号39におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
(ii)配列番号47におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号48におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
(iii)配列番号56におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号57におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
(iv)配列番号65におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号66におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、又は、
(v)配列番号74におけるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号75におけるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含む抗体、
と競合する、拮抗的抗原結合タンパク質。 - PD-1に特異的に結合する拮抗的抗原結合タンパク質であって、該抗原結合タンパク質は、
(i)以下の組み合わせ:
配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号2に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号12に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号11に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせ、
(ii)以下の組み合わせ:
配列番号8のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号9のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号17のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号18のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
の群から選択される重鎖の相補性決定領域3(CDRH3)及び軽鎖の相補性決定領域3(CDRL3)の組み合わせ、
のいずれかを含み、好ましくは、配列番号4又は配列番号13のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号6又は配列番号15のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2、配列番号5又は配列番号14のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、及び配列番号7又は配列番号16のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2からなる群から選択される1つ以上を更に含む、拮抗的抗原結合タンパク質。 - PD-L1に特異的に結合する拮抗的抗原結合タンパク質であって、該抗原結合タンパク質は、
(i)以下の組み合わせ:
配列番号21に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号20に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号30に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号29に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号84に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号83に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号93に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号92に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号102に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号101に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせ、
(ii)以下の組み合わせ:
配列番号26のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号27のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号35のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号36のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号89のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号90のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号98のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号99のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号107のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号108のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
の群から選択される重鎖の相補性決定領域3(CDRH3)及び軽鎖の相補性決定領域3(CDRL3)の組み合わせ、
のいずれかを含み、好ましくは、配列番号22、配列番号31、配列番号85、配列番号94又は配列番号103のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号24、配列番号33、配列番号87、配列番号96又は配列番号105のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2、配列番号23、配列番号32、配列番号86、配列番号95又は配列番号104のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、及び配列番号25、配列番号34、配列番号88、配列番号97又は配列番号106のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2からなる群から選択される1つ以上を更に含む、拮抗的抗原結合タンパク質。 - LAG-3に特異的に結合する拮抗的抗原結合タンパク質であって、該抗原結合タンパク質は、
(i)以下の組み合わせ:
配列番号39に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号38に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号48に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号47に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号57に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号56に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号66に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号65に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
配列番号75に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号74に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメインからなる組み合わせ、
の群から選択される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組み合わせ、
(ii)以下の組み合わせ:
配列番号44のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号45のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号53のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号54のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号62のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号63のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号71のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号72のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
配列番号80のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH3及び配列番号81のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL3からなる組み合わせ、
の群から選択される重鎖の相補性決定領域3(CDRH3)及び軽鎖の相補性決定領域3(CDRL3)の組み合わせ、
のいずれかを含み、好ましくは、配列番号40、配列番号49、配列番号58、配列番号67又は配列番号76のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号42、配列番号51、配列番号60、配列番号69又は配列番号78のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRH2、配列番号41、配列番号50、配列番号59、配列番号68又は配列番号77のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL1、及び配列番号43、配列番号52、配列番号61、配列番号70又は配列番号79のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるCDRL2からなる群から選択される1つ以上を更に含む、拮抗的抗原結合タンパク質。 - (a)前記抗原結合タンパク質は、抗体、抗体様タンパク質又はそれらの断片であり、好ましくは、前記抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、組換え抗体、抗原結合性抗体断片、一本鎖抗体、一本鎖可変断片抗体、ダイアボディ、Fab断片、F(ab)2断片、抗体ミメティック、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体及びIgG4抗体からなる群から選択され、及び/又は、
(b)前記抗原結合タンパク質は、以下の特性:
(i)100 nM未満、50 nM未満、10 nM未満、1 nM未満、100 pM未満、10 pM未満又は5 pM未満のKdでPD-1、PD-L1又はLAG-3に結合する特性、
(ii)10 nM未満、1 nM未満又は200 pM未満のIC50でPD-1、PD-L1又はLAG-3へのリガンドの結合を遮断することができる特性、
(iii)T細胞増殖を刺激する特性、
(iv)リンパ球の増殖を誘導する特性、
(v)IL-2及び/又はIFNγの分泌を誘導する特性、及び/又は、
(vi)ベースライン値と比較して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%腫瘍体積を減少させる特性、
の少なくとも1つを有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の拮抗的抗原結合タンパク質。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の拮抗的抗原結合タンパク質をコードする核酸。
- 請求項8に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
- 請求項9に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の拮抗的抗原結合タンパク質を作製する方法であって、前記抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞から前記抗原結合タンパク質を調製する工程を含む、方法。
- 請求項10に記載の宿主細胞における組換えDNAの発現により産生される拮抗的抗原結合タンパク質。
- 少なくとも1つの請求項1〜7若しくは請求項12のいずれか一項に記載の拮抗的抗原結合タンパク質、請求項8に記載の核酸、又は請求項9に記載のベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物であって、好ましくは、少なくとも1種の更なる活性作用物質を含む、医薬組成物。
- 請求項13に記載の医薬組成物と、任意に少なくとも1種の更なる活性作用物質とを含むキット。
- 癌及び/又は慢性感染症の治療において使用される、請求項1〜7若しくは請求項12のいずれか一項に記載の拮抗的抗原結合タンパク質、請求項8に記載の核酸、請求項9に記載のベクター、又は請求項13に記載の医薬組成物であって、好ましくは、
(i)前記癌は、
(a)口唇、口腔及び咽頭の悪性新生物、及び/又は、
(b)消化器の悪性新生物、及び/又は、
(c)呼吸器及び胸腔内臓器の悪性新生物、及び/又は、
(d)骨及び関節軟骨の悪性新生物、及び/又は、
(e)黒色腫及び他の皮膚の悪性新生物、及び/又は、
(f)中皮組織及び軟部組織の悪性新生物、及び/又は、
(g)乳房の悪性新生物、及び/又は、
(h)女性生殖器の悪性新生物、及び/又は、
(i)男性生殖器の悪性新生物、及び/又は、
(j)尿路の悪性新生物、及び/又は、
(k)目、脳及び他の中枢神経系の部分の悪性新生物、及び/又は、
(l)甲状腺及び他の内分泌腺の悪性新生物、及び/又は、
(m)リンパ系、造血系及び関連組織の悪性新生物、
からなる群から選択され、及び/又は、
(ii)前記慢性感染症は、HBV、HCV、HIV、HSV、HPV、EBV、CMV及びクラミジアからなる群から選択され、及び/又は、
(iii)少なくとも1種の更なる活性作用物質は、それを必要とする被験体に投与され、好ましくは、前記少なくとも1種の更なる活性作用物質と、請求項1〜7若しくは請求項12のいずれか一項に記載の拮抗的抗原結合タンパク質、請求項8に記載の核酸、請求項9に記載のベクター、又は請求項13に記載の医薬組成物とは、同時若しくは順次のいずれかで又はそれらの組み合わせで投与される、拮抗的抗原結合タンパク質、核酸、ベクター、又は医薬組成物。
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