TWI756187B - 抗ｌａｇ３抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供結合至T細胞共抑制分子淋巴球活化基因3(LAG3)蛋白的抗體及使用方法。在本發明的各種具體例中，該等抗體為特異地結合至LAG3的完全人類抗體。在一些具體例中，本發明抗體可用於抑制或中和LAG3活性，因而提供一種治療諸如癌症或病毒感染之疾病或病症的方法。

Description

抗LAG3抗體及其用途
本發明是有關於特異地結合至免疫調節性受體淋巴球活化基因-3(LAG3)的抗體及抗體之抗原結合片段，以及使用彼等抗體的治療和診斷方法。
T細胞共刺激性和共抑制性分子(統稱為共信號傳遞分子)在調節T細胞活化、子集分化，效應子功能和存活扮演關鍵角色(Chen et al 2013,Nature Rev.Immunol.13：227-242)。在T細胞受體辨識抗原呈遞細胞上之同源肽-MHC複合體之後，共信號傳遞受體和T細胞受體在免疫突觸處共定位，在該處它們與TCR信號傳遞協同以促進或抑制T細胞活化和功能(Flies et al 2011,Yale J.Biol.Med.84：409-421)。最終的免疫反應是受到共刺激性信號與共抑制性信號之間的平衡所調節(「免疫檢查點」)-(Pardoll 2012,Nature Reviews Cancer 12：252-264。在介導周邊T細胞耐受性時，淋巴球活化基因-3(LAG3)作為一個這樣的「免疫檢查點」。
LAG3(也稱為CD223)是一個具有503個胺基酸的跨膜蛋白受體，表現在活化的CD4和CD8 T細胞、γδ T細胞、自然殺手T細胞、B細胞、自然殺手細胞、漿細胞樣樹突狀細胞和調節性T細胞上。LAG3是免疫球蛋白(Ig)超家族的一個成員。LAG3的主要功能是減弱免疫反應。結合至第二 型MHC分子的LAG3遞送負信號給LAG3表現細胞，並且下調抗原依賴性CD4和CD8 T細胞反應。LAG3負向地調節T細胞增生、產生細胞介素和溶解目標細胞的能力，稱為「耗盡」T細胞。還報導LAG3在增強T調節性(Treg)細胞功能中扮演角色(Pardoll 2012,Nature Reviews Cancer 12：252-264)。
因為LAG3在腫瘤免疫和傳染性免疫中扮演重要角色，它是免疫療法的一個理想標的。在治療癌症和慢性病毒感染時，已研究使用拮抗劑(包括單株抗體)阻斷LAG3(Turnis et al 2015,Eur.J.Immunol.45：1892-1905)。
針對LAG3的單株抗體在本領域中是已知的，並且已經描述於例如美國專利/公開案第5976877號、第6143273號、第6197524號、第8551481號、第20110070238號、第20110150892號、第20130095114號、第20140093511號、第20140127226號、第20140286935號，和在WO95/30750、WO97/03695、WO98/58059、WO2004/078928、WO2008/132601、WO2010/019570、WO2014/008218、EP0510079B1、EP0758383B1、EP0843557B1、EP0977856B1、EP1897548B2、EP2142210A1與EP2320940B1中。
在開發用於治療人類的免疫療法時，需要表現出諸如低免疫原性、適當結合動力學參數、對猴目標有交叉反應性，適當活體外活性及/或適當活體內活性的抗體。
本發明提供結合LAG3的抗體或其抗原結合片段。本發明抗體尤其可用於靶向表現LAG3的免疫細胞，並且用於調節LAG3活性。在某些具體例中，本發明抗體可用於抑制或中和LAG3活性及/或用於刺激T細胞活化，例如在T細胞媒介之殺滅是有益的或有需要的情況下。在某些具體例 中，抗體可用於抑制調節性T細胞功能及/或用於倒轉已耗竭T細胞的活動力缺失狀態。本發明抗LAG3抗體或其抗原結合部分可被納入作為一個多特異性抗原結合分子的一部分，例如用來調節免疫反應及/或將抗體靶定至特定細胞類型(例如腫瘤細胞，或受病毒感染的細胞)。這些抗體可用於治療疾病或病症(諸如癌症和病毒感染)。
本發明抗體可以是全長的(例如，IgG1或IgG4抗體)或可以僅包括抗原結合部分(例如，是Fab、F(ab’)2或scFv片段)，並可經修飾以影響功能，例如消除殘餘效應子功能(Reddy et al.,2000,J.Immunol.164：1925-1933)。在某些具體例中，抗體可以是雙特異性。
在第一個態樣中，本發明提供特異地結合至LAG3的經單離重組型單株抗體或其抗原結合片段。在某些具體例中，抗體是完全人類抗體。
本發明的例示性抗LAG3抗體列於本文表1-3中。表1列出了例示性抗LAG3抗體的重鏈可變區(HCVR)、輕鏈可變區(LCVR)、重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的胺基酸序列識別符號。表2列出了例示性抗LAG3抗體的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1，LCDR2和LCDR3的胺基酸序列識別符號。表3列出了例示性抗LAG3抗體的重鏈與輕鏈序列的胺基酸序列識別符號。
本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含含有選自表1中所列任一HCVR胺基酸序列，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列一致性之實質相似序列的胺基酸序列。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包含含有選自表1中所列任一LCVR胺基酸序列，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列一致性之實質相似序列的胺基酸序列。
本發明亦提供了包含HCVR和LCVR胺基酸序列對(HCVR/LCVR)的抗體或其抗原結合片段，該胺基酸序列對包含表1所列的任一HCVR胺基酸序列與表1所列的任一LCVR胺基酸序列配對。根據某些具體例，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含在表1中列出的任一例示性抗LAG3抗體中所包含之HCVR/LCVR胺基酸序列對。在某些具體例中，HCVR/LCVR胺基酸序列對選自下列SEQ ID NO組成之群：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386/394、402/410、418/426、434/442、450/522、458/522、466/522、474/522、482/522、490/522、498/530、506/530、514/530、538/546，以及554/562。在某些具體例中，HCVR/LCVR胺基酸序列對選自下列SEQ ID NO中的任一者：386/394(例如H4sH15479P)、418/426(例如H4sH15482P)或538/546(例如H4sH14813N)。 在某些具體例中，本發明提供包含HCVR以及LCVR的抗LAG3抗體或其抗原結合片段，該HCVR包含具有不超過五個胺基酸置換之表1中所列的胺基酸序列，而該LCVR包含具有不超過五個胺基酸置換之表1中所列的胺基酸序列。例如，本發明提供了包含HCVR和LCVR的抗LAG3抗體或其抗原結合片段，該HCVR包含具有不超過五個胺基酸置換的SEQ ID NO：418的胺基酸序列，且該LCVR包含具有不超過五個胺基酸置換的SEQ ID NO：426的胺基酸序列。在另一個例示性具體例中，本發明提供包含HCVR和LCVR的抗LAG3抗體或其抗原結合片段，該HCVR包含具有至少一個胺基酸置換的SEQ ID NO：418的胺基酸序列，且該LCVR包含具有一個胺基酸置換的SEQ ID NO：426的胺基酸序列。
本發明亦提供包含重鏈CDR1(HCDR1)的抗體或其抗原結合片段，該HCDR1包含選自表1中所列任一HCDR1胺基酸序列，或具有至 少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列的胺基酸序列。
本發明亦提供了包含重鏈CDR2(HCDR2)的抗體或其抗原結合片段，該HCDR2包含選自表1中所列任一HCDR2胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列的胺基酸序列。
本發明亦提供了包含重鏈CDR3(HCDR3)的抗體或其抗原結合片段，該HCDR3包含選自表1中所列任一HCDR3胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列的胺基酸序列。
本發明亦提供了包含輕鏈CDR1(LCDR1)的抗體或其抗原結合片段，該LCDR1包含選自表1中所列任一LCDR1胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列的胺基酸序列。
本發明亦提供了包含輕鏈CDR2(LCDR2)的抗體或其抗原結合片段，該LCDR2包含選自表1中所列任一LCDR2胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列的胺基酸序列。
本發明亦提供了包含輕鏈CDR3(LCDR3)的抗體或其抗原結合片段，該LCDR3包含選自表1中所列任一LCDR3胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列的胺基酸序列。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包含含有表1中所列HCDR3胺基酸序列任一者與表1中所列LCDR3胺基酸序列任一者配對的HCDR3及LCDR3胺基酸序列對(HCDR3/LCDR3)。依據某些具體例，本發明 提供抗體或其抗原結合片段，其包含含括在表1中所列例示性抗LAG3抗體任一者中的HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。在某些具體例中，HCDR3/LCDR3胺基酸序列對選自下列SEQ ID NO組成之群：392/400(例如H4sH15479P)、424/432(例如H4sH15482P)以及544/552(例如H4sH14813N)。
本發明亦提供包含HCVR和LCVR的抗體或其抗原結合片段，該HCVR包含含有一個與表1中所列胺基酸序列有1個胺基酸不同的胺基酸序列之HCDR1、含有一個與表1中所列胺基酸序列有1個胺基酸不同的胺基酸序列之HCDR2，以及含有一個與表1中所列胺基酸序列有1個胺基酸不同的胺基酸序列之HCDR3。在某些具體例中，本發明提供包含HCVR和LCVR的抗體或其抗原結合片段，該LCVR包含含有一個與表1中所列胺基酸序列有1個胺基酸不同的胺基酸序列之LCDR1、含有一個與表1中所列胺基酸序列有1個胺基酸不同的胺基酸序列之LCDR2，以及含有一個與表1中所列胺基酸序列有1個胺基酸不同的胺基酸序列之LCDR3。例如，本發明提供包含HCVR和LCVR的抗LAG3抗體或其抗原結合片段，該HCVR包含含有SEQ ID NO：420的胺基酸序列或與SEQ ID NO：420有1個胺基酸不同的胺基酸序列之HCDR1、含有SEQ ID NO：422的胺基酸序列或與SEQ ID NO：422有1個胺基酸不同的胺基酸序列之HCDR2，以及含有SEQ ID NO：424的胺基酸序列或與SEQ ID NO：424有1個胺基酸不同的胺基酸序列之HCDR3。在另一個例示性具體例中，本發明提供包含HCVR和LCVR的抗體或其抗原結合片段，該LCVR包含含有SEQ ID NO：428的胺基酸序列或與SEQ ID NO：428有1個胺基酸不同的胺基酸序列之LCDR1、含有SEQ ID NO：430的胺基酸序列或與SEQ ID NO：430有1個胺基酸不同的胺基酸序列之LCDR2，以及含有SEQ ID NO：432的胺基酸序列或與SEQ ID NO：432有1個胺基酸不同的胺基酸序列之LCDR3。
本發明提供包含重鏈的抗體或其抗原結合片段，該重鏈包 含選自表3中所列任一HC胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列的胺基酸序列。
本發明亦提供包含輕鏈的抗體或其抗原結合片段，該輕鏈包含選自表3中所列任一LC胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列的胺基酸序列。
本發明亦提供包含含有表3中所列HC胺基酸序列任一者與表3中所列LC胺基酸序列任一者配對的HC及LC胺基酸序列對(HC/LC)的抗體或其抗原結合片段。依據某些具體例，本發明提供包含表3中所列任一例示性抗LAG3抗體中所含HC/LC胺基酸序列對的抗體或其抗原結合片段。在某些具體例中，HC/LC胺基酸序列對選自下列SEQ ID NO組成之群：577/578、579/578以及580/581。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包含一組六個CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，含括在表1中所列例示性抗LAG3抗體任一者中。在某些具體例中，該HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組是選自下列SEQ ID NO組成之群：388-390-392-396-398-400(例如H4sH15479P)、420-422-424-428-430-432(例如H4sH15482P)以及540-542-544-548-550-552(例如H4sH14813N)。
在一個相關具體例中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含一組六個CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，含括在表1中所列例示性抗LAG3抗體任一者所界定之HCVR/LCVR胺基酸序列對中。例如，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含含括在選自下列SEQ ID NO組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組：386/394(例 如H4sH15479P)、418/426(例如H4sH15482P)以及538/546(例如H4sH14813N)。用於鑑定HCVR與LCVR胺基酸序列中的CDR的方法及技術為技藝中充分熟知的，且可用於鑑定本文揭示之指定HCVR及/或LCVR胺基酸序列中的CDR。可用於鑑定CDR邊界的例示性習知技術包括，例如Kabat界定法、Chothia界定法以及AbM界定法。在一般性術語中，Kabat界定法是以序列變異性為基礎，Chothia界定法是以結構環區的位置為基礎，而AbM界定法是一種介於Kabat法與Chothia法之間的折衷方法。參見，例如Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；以及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。公開資料庫亦可用來鑑定抗體內的CDR序列。
本發明包括具有經修飾糖基化型態的抗LAG3抗體。在一些具體例中，移除非所欲糖基化位點的修飾可能是有用的，或例如缺乏存在於寡醣鏈上的岩藻糖部分會例如增加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)功能的抗體(參見Shield et al.(2002)JBC 277：26733)。在其他應用中，可以進行半乳糖基化修飾以修飾補體依賴性細胞毒性(CDC)。
本發明亦包括包含Fc域的抗LAG3抗體，其中Fc域包含如本文他處所述的IgG1或IgG4同型。在某些具體例，Fc域包含選自由下列SEQ ID NO組成之群的胺基酸序列：569、570、571，572和573。
本發明亦提供與含有HCVR之CDR和LCVR之CDR之抗體或其抗原結合片段競爭特異結合至LAG3的抗體及其抗原結合片段，其中HCVR與LCVR各自具有選自表1中所列HCVR和LCVR序列的胺基酸序列。
本發明亦提供阻斷LAG3結合至第二型MHC的抗體及其抗原結合片段。在一些具體例中，阻斷LAG3結合的抗體或其抗原結合片段可結合至LAG3上與第二型MHC相同的表位或者結合至LAG3上與第二型 MHC不同的表位。
本發明亦提供特異地結合至人類或其他物種之LAG3的抗體及其抗原結合片段。在某些具體例中，該等抗體可結合至人類LAG3及/或猴LAG3。
本發明亦提供與參考抗體或其抗原結合片段交叉競爭結合至LAG3的抗體及其抗原結合片段，該參考抗體或其抗原結合片包含HCVR之CDR及LCVR之CDR，其中該HCVR及LCVR各自具有選自表1中所列HCVR與LCVR序列的胺基酸序列。
本發明亦提供與參考抗體或其抗原結合片段結合至相同表位的抗體及其抗原結合片段，該參考抗體或其抗原結合片包含HCVR之CDR及LCVR之CDR，其中該HCVR及LCVR各自具有選自表1中所列HCVR與LCVR序列的胺基酸序列。在某些具體例中，本發明提供與參考抗體或其抗原結合片段結合至相同表位的抗體及其抗原結合片段，該參考抗體或其抗原結合片包含HCVR之CDR及LCVR之CDR，其中HCVR/LCVR胺基酸序列對具有SEQ ID NO：418/426。
本發明亦包括與人類LAG3的胞外域(SEQ ID NO：588)中所包含的一個或多個胺基酸交互作用的抗LAG3抗體。在某些具體例中，本發明提供抗LAG3抗體及其抗原結合片段，其與選自下列組成之群的胺基酸序列交互作用：(a)SEQ ID NO：588的胺基酸28至69；(b)SEQ ID NO：588的胺基酸28至71；(c)SEQ ID NO：588的胺基酸31至52；以及(d)SEQ ID NO：588的胺基酸32至69。在某些具體例中，本發明提供抗LAG3抗體及其抗原結合片段，其與SEQ ID NO：589中所含的一個或多個胺基酸交互作用，例如，本發明提供抗LAG3抗體及其抗原結合片段，其與SEQ ID NO：589中所含的至少5個胺基酸、至少10個胺基酸或至少20個胺基酸交互作用。在某些具體例中，本發明提供與SEQ ID NO：589的胺基酸序列(對應於SEQ ID NO：588的胺基酸28至71)交互作用的抗LAG3抗體及其抗原結合片段。
在一個具體例中，本發明提供具有一或多個下列特徵的重組型人類單株抗體或抗原結合片段：(1)特異地結合至人類LAG3及/或石蟹獼猴LAG3；(B)阻斷LAG3結合至第二型MHC；(c)阻斷LAG3誘導的T細胞下調並且挽救T細胞信號傳導；以及(d)抑制腫瘤生長，並增加患有癌症之個體的存活率。
在一些具體例中，抗體或其抗原結合片段可呈促效劑的方式特異地結合至LAG3，也就是說，它可以提高或刺激LAG3結合及/或活性；在其他具體例中，抗體可呈拮抗劑的方式特異性地結合至LAG3，也就是說，它可以阻斷LAG3結合至其配體。
在某些具體例中，本發明抗體或抗原結合片段是雙特異性的，其包含針對LAG3的第一結合特異性以及針對第二目標表位的第二結合特異性。第二目標表位可以是在LAG3上或在不同蛋白質上的另一個表位。在某些具體例中，第二目標表位可以在不同的細胞上，包括不同的T細胞、B細胞、腫瘤細胞或遭病毒感染的細胞。
在第二個態樣中，本發明提供編碼抗LAG3抗體或其部分的核酸分子。例如，本發明提供編碼表1中所列的HCVR胺基酸序列任一者的核酸分子；在某些具體例中，核酸分子包含選自表2中所列的HCVR核酸序列任一者的多核苷酸序列，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的實質相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列的LCVR胺基酸序列任一者的核酸分子；在某些具體例中，核酸分子包含選自表2中所列的LCVR核酸序列任一者的多核苷酸序列，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的實質相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列的HCDR1胺基酸序列任一者 的核酸分子；在某些具體例中，核酸分子包含選自表2中所列的HCDR1核酸序列任一者的多核苷酸序列，或與其具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性的實質相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列的HCDR2胺基酸序列任一者的核酸分子；在某些具體例中，核酸分子包含選自表2中所列的HCDR2核酸序列任一者的多核苷酸序列，或與其具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性的實質相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列的HCDR3胺基酸序列任一者的核酸分子；在某些具體例中，核酸分子包含選自表2中所列的HCDR3核酸序列任一者的多核苷酸序列，或與其具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性的實質相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列的LCDR1胺基酸序列任一者的核酸分子；在某些具體例中，核酸分子包含選自表2中所列的LCDR1核酸序列任一者的多核苷酸序列，或與其具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性的實質相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列的LCDR2胺基酸序列任一者的核酸分子；在某些具體例中，核酸分子包含選自表2中所列的LCDR2核酸序列任一者的多核苷酸序列，或與其具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性的實質相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列的LCDR3胺基酸序列任一者的核酸分子；在某些具體例中，核酸分子包含選自表2中所列的LCDR3核酸序列任一者的多核苷酸序列，或與其具有至少90%、至少95%，至少98%或至少99%序列一致性的實質相似序列。
本發明亦提供編碼HCVR的核酸分子，其中該HCVR包含一組三個CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中該 HCDR1-HCDR2-HCDR3胺基酸序列組是由表1中所列例示性抗LAG3抗體任一者所定義。
本發明亦提供編碼LCVR的核酸分子，其中該LCVR包含一組三個CDR(亦即LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中該LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組是由表1中所列例示性抗LAG3抗體任一者所定義。
本發明亦提供編碼HCVR以及LCVR兩者的核酸分子，其中HCVR包含表1中所列HCVR胺基酸序列任一者的胺基酸序列，而其中LCVR包含表1中所列LCVR胺基酸序列任一者的胺基酸序列。在某些具體例中，該核酸分子包含選自表2中所列HCVR核酸序列任一者的多核苷酸序列或其與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列，以及選自表2中所列LCVR核酸序列任一者的多核苷酸序列或其與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列。在依據本發明此態樣的某些具體例中，該核酸分子編碼HCVR以及LCVR，其中HCVR以及LCVR均衍生自表1中所列的相同抗LAG3抗體。
本發明提供編碼表3中所列重鏈胺基酸序列任一者的核酸分子。本發明亦提供編碼表3中所列輕鏈胺基酸序列任一者的核酸分子。
本發明亦提供編碼重鏈(HC)以及輕鏈(LC)兩者的核酸分子，其中HC包含表3中所列HC胺基酸序列任一者的胺基酸序列，且其中LC包含表3中所列LC胺基酸序列任一者的胺基酸序列。
在一個相關態樣中，本發明提供能夠表現包含抗LAG3抗體之重鏈或輕鏈可變區之多肽的重組型表現載體。例如，本發明包括含有上述核酸分子任一者的重組型表現載體，核酸分子亦即編碼如表1中所列HCVR、LCVR，及/或CDR序列任一者的核酸分子。本發明亦提供能夠表現包含抗LAG3抗體之重鏈或輕鏈的多肽的重組型表現載體。例如，本發明包括包含上述核酸分子任一者之重組型表現載體，該核酸分子亦即編碼如表3 中所列重鏈或輕鏈序列任一者的核酸分子。已引入該等載體的宿主細胞，還有藉由在容許生產抗體或抗體片段的條件下培養宿主細胞而生產抗體或其部分，以及回收所生產之抗體及抗體片段的方法亦含括在本發明範疇內。
在第三個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含特異地結合LAG3的重組型人類抗體或其片段，以及醫藥學上可接受的載劑。在一個相關的態樣中，本發明特徵為一種組合物，其為抗LAG3抗體及第二治療劑的組合。在一個具體例中，該第二治療劑是可與抗LAG3抗體有利組合的任一種藥劑。可與抗LAG3抗體有利組合的例示性藥劑包括，不限於結合及/或調控LAG3信號傳遞的其他藥劑(包括其他抗體或其抗原結合片段等)及/或不直接結合LAG3但以其他方式調控免疫細胞活化的藥劑。涉及本發明抗LAG3抗體的其他組合療法與共調配物揭示於本文他處。
在第四個態樣中，本發明提供在個體中調控免疫反應的方法，該方法包含向有需要的個體投予治療有效量的本發明抗-LAG3抗體或其抗原結合片段。在某些具體例中，本發明提供在個體中提高免疫反應的方法，該等方法包含向個體投予有效量之結合LAG3的本發明抗體或其片段。在一個具體例中，本發明提供在個體中刺激或提高T細胞活化的方法。在某些具體例中，本發明提供挽救T細胞活性的方法，包含使T細胞與有效量的本發明抗體接觸，使得T細胞活性得以挽救。在一個具體例中，本發明提供在個體中抑制調節性T(Treg)細胞的方法，該等方法包含向有需要的個體投予治療有效量之本發明抗體或其抗原結合片段。在某些具體例中，有需要的個體可能罹患疾病或病症，諸如癌症或病毒感染。在某些具體例中，本發明提供挽救LAG3媒介抑制之T細胞活性的方法，包含使T細胞與有效量之本發明抗體接觸。
在第五個態樣中，本發明提供用於在個體中使用本發明抗LAG3抗體或抗體之抗原結合部分治療疾病或病症(諸如癌症或病毒感染)的 治療方法，其中治療方法包含對有需要的個體投予治療有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含本發明抗體或抗體片段。待治療病症為任何一種疾病或病況，其透過刺激或抑制LAG3活性或信號傳遞而受到增進、改善、抑制或預防。在某些具體例中，本發明抗體或其抗原結合片段與第二治療劑組合被投予給有需要的個體。第二治療劑可選自下列組成的群組：針對另一種T細胞共抑制分子的抗體、針對腫瘤細胞抗原的抗體、針對T細胞受體的抗體、針對遭病毒感染之細胞上表位的抗體、細胞毒性劑、抗癌藥物、抗病毒藥物、消炎藥(例如皮質類固醇)、化療劑、放射線療法、免疫抑止劑與技藝中熟知的任何其他藥物或療法。在某些具體例中，要是會發生與本發明抗體或其抗原結合片段相關之可能副作用的話，則第二治療劑可以是有助於對抗或減少任何可能副作用的藥劑。
在某些具體例中，本發明提供抑制腫瘤生長的方法。例如，本發明提供抑制因為原發性腫瘤或轉移性腫瘤在個體中的腫瘤生長。在某些具體例中，本發明提供提高罹癌個體之存活(例如無進展存活或整體存活)的方法。癌症的實例包括，但不限於原發及/或復發癌症，包括血癌(例如血液學惡性病，諸如淋巴瘤、骨髓瘤或白血病)、腦癌(例如多形性神經膠質母細胞瘤)、肺癌(例如非小細胞肺癌)、頭部和頸部的鱗狀細胞癌、肝細胞癌、腎細胞癌、黑色素瘤、間皮瘤、卵巢癌、膀胱癌、乳癌、骨癌、結腸直腸癌，前列腺癌和結腸癌。在某些具體例中，本發明提供抑制或抑止已生成腫瘤之生長的方法。該等方法包括向有需要的個體投予醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量的本發明抗LAG3抗體。在某些具體例中，抗體與選自下列組成之群中的第二治療劑組合投予：程式化死亡-1(PD-1)抑制劑(例如抗PD-1抗體，諸如納武單抗(nivolumab)或REGN2810)、程式化死亡配體1(PD-L1)抑制劑(例如抗PD-L1抗體)、血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑(例如阿柏西普(aflibercept)、貝伐單抗(bevacizumab))、血管生成素-2(Ang2) 抑制劑(例如抗Ang2抗體，諸如耐斯伐庫單抗(nesvacumab))、細胞毒性T淋巴球抗原4(CTLA-4)抑制劑(例如易普利單抗(ipilimumab))、CD20xCD3雙特異性抗體、細胞毒素、化療劑，以及放射線療法。可與本發明抗LAG3抗體組合使用於治療癌症的額外療法/治療劑的其他實例描述在本文他處。
抗體或其片段可經皮下、靜脈內、皮內、腹膜內、經口、肌肉內或顱內被投予。抗體或其片段可呈約0.1mg/kg個體體重至約100mg/kg個體體重的劑量投予。
本發明亦包括本發明抗LAG3抗體或其抗原結合片段於製造用以治療可能會受益於阻斷LAG3結合及/或信號傳導之疾病或病症(諸如癌症)之藥劑的用途。
其他具體例將因為檢閱下面詳細說明而變得清楚。
圖1是本文實例8中所述之基於螢光素酶之LAG3生物分析的概圖。(A)區：「Bispec」模式：不活化Jurkat細胞受到T細胞受體(TCR)簇集經由CD3xCD20雙特異性抗體所活化。(B)區：「肽」模式：在這個模式中，不活化Jurkat細胞受到特異性MHC/肽複合體(Ob2F3 TCR雜二聚體與MHC II蛋白、HLA-DR2AB，與MBP85-99肽複合)所活化。結合至DR2的LAG3減弱活化Jurkat細胞中的反應。阻斷LAG3抗體在活化Jurkat細胞中挽救反應。
圖2歸納抗小鼠LAG3抗體單獨和與抗小鼠PD-1抗體組合對抗已建立Colon 26腫瘤的活體內效力結果(實例10中所述)。圖2A於腫瘤植入後在多個時間點測量每個治療組中的平均腫瘤體積(mm3±SEM)。當平均腫瘤體積達到50mm3，在第14天開始治療。治療天數由箭頭指示。所有抗體以10mg/kg經腹膜內(i.p.)投藥。圖2B在植入後第35天測量每個治療組中 的個別腫瘤體積。統計顯著性是透過單因子ANOVA與Dunnett氏多重比較事後檢定來決定(*p<0.05)。圖2A-B治療組：同型對照大鼠IgG2a+小鼠IgG1對照抗體(●)；抗小鼠PD-1抗體+小鼠IgG1對照(▲)；抗小鼠LAG3抗體+大鼠IgG2a對照(■)；抗小鼠PD-1抗體+抗小鼠LAG3抗體(▼)。
圖3歸納抗小鼠LAG3抗體鼠單獨和與抗小鼠PD-1抗體組合對抗已建立之MC38腫瘤的活體內效力結果(實例11中所述)。圖3A於腫瘤植入後在多個時間點測量每個治療組中的平均腫瘤體積(mm3±SEM)。當平均腫瘤體積達到45mm3，在第8天開始治療。治療天數由箭頭指示。圖3B在植入後第23天測量每個治療組中的個別腫瘤體積。統計顯著性是透過單因子ANOVA與Dunnett氏多重比較事後檢定來決定(****p<0.0001)。圖3A-B治療組：同型對照大鼠IgG2a+小鼠IgG1(●)，抗小鼠PD-1抗體+mIgG1對照(▲)，抗小鼠LAG3抗體+大鼠IgG2a對照(■)，以及抗小鼠PD-1+抗小鼠LAG3抗體(▼)。
圖4顯示，於實驗結束時從荷瘤小鼠收集的引流淋巴結(DLN)(A)和脾臟(B)中，鼠類IFNγ和CD8b基因的表現位準(經鼠類親環素B表現予以常規化)，如透過Taqman分析檢驗(實例11中所述)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
圖5歸納抗人類LAG3抗體(「mAb1」)和抗人類PD-1抗體(REGN2810)對抗MC38腫瘤的活體內效力(實例12中所述)。圖5A於腫瘤植入後在多個時間點，每個治療組中的平均腫瘤體積(mm3±SEM)。治療天數由箭頭指示。圖5B監測每組的個別腫瘤體積歷時24天。顯示在第24天時每組中的無腫瘤小鼠數目。圖5A-B治療組：25mg/kg的mAb1(抗hLAG3)(■)；10mg/kg的REGN2810(抗hPD-1)(▲)，以及25mg/kg的人類同型對照抗體(●)。
圖6歸納抗人類LAG3抗體(「mAb1」)單獨和與抗人類PD-1 抗體(REGN2810)組合對抗MC38腫瘤的活體內效力(實例13中所述)。圖6A於腫瘤植入後在多個時間點，每個治療組中的平均腫瘤體積(mm3±SEM)。治療天數由箭頭指示。圖6B在植入後第22天測量每個治療組中的個別腫瘤體積。統計顯著性是透過單因子ANOVA與Tukey氏多重比較事後檢定來決定(*p<0.05；**p<0.01)圖6A-B治療組：25mg/kg的mAb1(抗hLAG3)(◆)；10mg/kg的REGN2810(抗hPD-1)(■)；25mg/kg的mAb1(抗hLAG3)與10mg/kg的REGN2810(抗hPD-1)組合(▲)；25mg/kg的人類同型對照(●)。圖6C經治療小鼠的無腫瘤存活百分率。統計顯著性是藉由對數秩(曼特爾-考克斯)檢定決定(****p<0.0001)。治療組：25mg/kg的mAb1(抗hLAG3)(◆)；10mg/kg的REGN2810(抗hPD-1)(▼)；25mg/kg的mAb1(抗hLAG3)與10mg/kg的REGN2810(抗hPD-1)組合(▲)；25mg/kg的人類同型對照(●)。
圖7歸納抗人類LAG3抗體(「mAb1」)單獨和與抗人類PD-1抗體(REGN2810)組合對抗MC38腫瘤在第一個實驗中的活體內效力(實例14中所述)。圖7A於腫瘤植入後在多個時間點，每個治療組中的平均腫瘤體積(mm3±SEM)。治療天數由箭頭指示。圖7B在植入後第22天測量每個治療組中的個別腫瘤體積。統計顯著性是透過單因子ANOVA與Tukey氏多重比較事後檢定來決定(*p<0.05)。圖7C經治療小鼠中的無腫瘤存活百分率。統計顯著性是藉由對數秩(曼特爾-考克斯)檢定決定(*p<0.0197)。治療組：25mg/kg的mAb1(抗hLAG3)(◆)；10mg/kg的REGN2810(抗hPD-1)；1mg/kg的REGN2810(抗hPD-1)(▲)；25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)和10mg/kg的REGN2810(抗hPD-1)組合(■)；25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)和1mg/kg的REGN2810(抗hPD-1)組合(▼)；以及25mg/kg的人類同型對照(●)。
圖8歸納抗人類LAG3抗體(「mAb1」)單獨和與抗人類PD-1抗體(REGN2810)組合對抗MC38腫瘤在第二個實驗中的活體內效力(實例14中所述)。圖8A於腫瘤植入後在多個時間點，每個治療組中的平均腫瘤體 積(mm3±SEM)。治療天數由箭頭指示。統計顯著性是透過雙因子ANOVA與Dunnett氏多重比較檢定來決定(*p<0.05)。圖8B在植入後第23天測量每個治療組中的個別腫瘤體積。統計顯著性是透過單因子ANOVA與Dunnett氏多重比較檢定來決定(**p<0.01)。圖8C經治療小鼠中的無腫瘤存活百分率。統計顯著性是透過對數秩(曼特爾-考克斯)檢定，加上用於多重比較的Bonferroni校正來決定(***p<0.001，**p<0.01)。治療組：25mg/kg的mAb1(抗hLAG3)(◆)；5mg/kg的mAb1(抗hLAG3)(
Figure 105132298-A0202-12-0018-719
)；10mg/kg的REGN2810(抗hPD-1)(▲)；25mg/kg的mAb1(抗hLAG3)與10mg/kg的REGN2810(抗hPD-1)組合(■)；5mg/kg的mAb1(抗hLAG3)和10mg/kg的REGN2810(抗hLAG3)組合(▼)；以及25mg/kg的人類同型對照(●)。
圖9顯示於腫瘤植入後在多個時間點，每個治療組中的平均腫瘤體積(mm3±SEM)，以評估抗人類LAG3抗體(「mAb1」)單獨和與抗人類PD-1抗體(REGN2810)組合對抗已建立MC38腫瘤的效力(本文實例15中所述)。治療天數由箭頭指示。
圖10顯示在實例15中所述的實驗中，於植入後第22天測量之每個治療組中的個別腫瘤體積。統計顯著性是透過單因子ANOVA與Dunnett氏多重比較檢定來決定。
圖11顯示在本文實例15中所述的實驗中，經治療小鼠的無腫瘤存活百分率。統計顯著性是透過對數秩(曼特爾-考克斯)檢定，與用於多重比較的Bonferroni校正來決定(**p<0.01)。
圖12顯示在雌石蟹獼猴單次靜脈內輸注mAb1之後，血清中的平均功能性mAb1濃度(+SD)相對於時間的圖。
在說明本發明方法之前，應理解本發明不限於所述特定方 法以及實驗條件，因為這些方法以及條件可能會改變。亦應理解本文中所用術語僅供說明特定具體例之用，而不希望具有限制性的，因為本發明範疇將僅會受到隨附申請專利範圍所限制。
除非另有定義，否則所有本文使用的技術性以及科學性術語具有與本發明所屬技藝中具有通常技藝者普遍理解的相同意思。儘管任何類似或等同於本文所述者的方法以及材料可用於實施或測試本發明，現將說明較佳的方法以及材料。本文提及的全部公開資料以其整體併入本文做為參考資料。
術語「LAG3」意指淋巴球活化基因-3蛋白，一種免疫檢查點受體或T細胞共抑制分子，也稱為CD223。全長LAG3的胺基酸序列於GenBank中提供為登錄號NP_002277.4，並且在本文中也稱為SEQ ID NO：582。術語「LAG3」還包括LAG3的蛋白質變異體，具有SEQ ID NO：574、575或576的胺基酸序列。術語「LAG3」包括重組型LAG3或其片段。該術語也含括偶合至例如組胺酸標誌、小鼠或人類Fc，或諸如ROR1的信號序列的LAG3或其片段。例如，該術語包括由SEQ ID NO：575例舉的序列，其包含一個在C端的小鼠Fc(mIgG2a)，偶合至全長LAG3的胺基酸殘基29-450。如由SEQ ID NO：574例舉的蛋白質變異體包含一個在C端處的組胺酸標誌，其偶合至全長LAG3的胺基酸殘基29-450。除非指定為來自非人類物種，否則術語「LAG3」是指人類LAG3。
LAG3是免疫球蛋白(Ig)超家族的一個成員。LAG3是一個具有503個胺基酸的第1型跨膜蛋白，具有四個胞外Ig樣域D1至D4，並且表現在活化T細胞、自然殺手細胞、B細胞、漿細胞樣樹突狀細胞，和調節性T細胞上。LAG3受體結合至存在抗原呈遞細胞(APC)上的第II型MHC分子。
如本文所用，術語「T細胞共抑制分子」意指一個配體及/或受體，其經由T細胞活化或抑止來調控免疫反應。術語「T細胞共抑制分 子」也被稱為為T細胞共信號傳遞分子，包括但不限於程式化死亡-1(PD-1)、細胞毒性T淋巴球抗原-4(CTLA-4)，B和T淋巴球弱化因子(BTLA)、CD-28、2B4、LY108、T細胞免疫球蛋白和黏蛋白3(TIM3)、具有免疫球蛋白和ITIM的T細胞免疫受體(TIGIT；也稱為VSIG9)、白血球相關免疫球蛋白樣受體1(LAIR1；也稱為CD305)、誘導性T細胞共刺激分子(ICOS；也稱為CD278)、T細胞活化的V域Ig抑止因子(VISTA)和CD160。
術語「抗體」，如本文所用，欲意指免疫球蛋白分子，其含有四個多肽鏈，藉由雙硫鍵交互連結的兩條重(H)鏈以及兩條輕(L)鏈(亦即「完全抗體分子」)，以及其集合體(例如IgM)或其抗原-結合片段。各個重鏈含有一個重鏈可變區(「HCVR」或「VH」)以及一個重鏈恆定區(含有結構域CH1、CH2以及CH3)。各個輕鏈含有一個輕鏈可變區(「LCVR」或「VL」)以及一個輕鏈恆定區(CL)。VH與VL區可進一步分成具有超變異性的區域(命名為互補決定區(CDR))，其間散佈有較為守恆的區域(命名為骨架區(FR))。各個VH與VL由三個CDR以及四個FR所構成，按下列順序從胺基端往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明的某些具體例中，抗體(或其抗原結合片段)的FR可能與人類生殖系序列相同，或可以經天然或人工修飾。胺基酸一致序列可以依據並行分析兩個或多個CDR來定義。
置換一或多個CDR殘基或省略一或多個CDR也是可行的。在科學文獻中已描述就結合而言可省去一或多個CDR的抗體。Padlan等人(1995 FASEB J.9：133-139)依據已公開的結晶結構分析抗體與其抗原之間的接觸區域，並推論只有約五分之一至三分之一的CDR殘基實際接觸到抗原。Padlan也發現許多其中一或兩個CDR沒有胺基酸與抗原接觸的抗體(亦參見Vajdos et al.2002 J Mol Biol 320：415-428)。
可依據先前研究從Chothia CDR以外的Kabat CDR區域中， 藉由分子建模及/或依據經驗鑑別出不與抗原接觸的CDR殘基(例如CDRH2中的殘基H60-H65通常是不需要的)。若省略CDR或其殘基，通常以另一個人類抗體序列或此等序列的一致序列中佔據對應位置的胺基酸予以置換。CDR中供置換用的位置以及要置換的胺基酸也可以依據經驗來選定。按照經驗的置換可以是守恆或非守恆置換。
相較於對應生殖系序列，本文揭示的完全人類抗LAG3單株抗體可在重鏈及輕鏈可變域之骨架及/或CDR區中含有一或多個胺基酸置換、插入及/或刪除。此等突變可透過將本文所揭示之胺基酸序列與可得自例如公用抗體序列資料庫的生殖系序列相比對而輕易確認。本發明包括抗體及其抗原-結合片段，其等是衍生自本文所揭示的任一胺基酸序列，其中一或多個骨架及/或CDR區中的一或多個胺基酸突變成抗體衍生而來之生殖系序列的對應殘基，或突變成另一個人類生殖系序列的對應殘基，或突變成對應生殖系殘基的守恆性胺基酸置換(此等序列改變在本文中統稱為「生殖系突變」)。從本文揭示的重鏈與輕鏈可變區序列開始，本技藝中具有通常技術者可輕易製造出許多含有一或多個個別生殖系突變或其組合的抗體及抗原-結合片段。在某些具體例中，VH及/或VL域中的所有骨架及/或CDR殘基突變回復成抗體衍生而來之原有生殖系序列中發現的殘基。在其他具體例中，僅有某些殘基突變回復成原有生殖系序列，例如僅有在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中所發現的突變殘基，或僅有在CDR1、CDR2或CDR3中所發現的突變殘基。在其他具體例中，骨架及/或CDR殘基中的一或多者突變成不同生殖系序列(亦即不同於抗體原先衍生而來之生殖系序列的生殖系序列)的對應殘基。此外，本發明抗體可含有兩個或更多個骨架及/或CDR區中之生殖系突變的任何組合，例如其中某些個別殘基突變成特定生殖系序列的對應殘基，而不同於原有生殖系序列的某些其他殘基維持不變或突變成不同生殖系序列的對應殘基。在得到後，含有一或多個 生殖系突變的抗體及抗原-結合片段可針對一或多種所要特性(諸如結合特異性增進、結合親和力增加、拮抗或促效生物特性增進或提高(視情況而定)、免疫原性降低等)來進行簡易測試。以此一般方式所得到的抗體及抗原-結合片段含括在本發明中。
本發明亦包括完全人類抗LAG3單株抗體，其包含具有一或多個守恆性置換之本文揭示HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列任一者的變異體。例如，本發明包括具有HCVR、LCVR，及/或CDR胺基酸序列相對於本文揭示之HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列任一者有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少個等守恆性胺基酸置換的抗LAG3抗體。
術語「人類抗體」，如本文所用，欲包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類mAb可包括不被人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或定位突變或藉由活體內體突變所引入的突變)，例如在CDR以及尤其在CDR3中。但是，術語「人類抗體」，如本文所用，不意欲要包括已被移植至人類FR序列上之衍生自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列的mAb。本術語包括在非人類哺乳動物中，或在非人類哺乳動物的細胞中以重組方式生產的抗體。本術語不意欲包括自人類個體單離或在人類個體中產生的抗體。
術語「重組型」，如本文所用，意指藉由技藝中已知為重組型DNA技術的技術或方法所創造、表現、單離或獲得的本發明抗體或其抗原結合片段，重組型DNA技術包括例如DNA剪接與基因轉殖表現。本術語意指在非人類哺乳動物(例如基因轉殖非人類哺乳動物，例如基因轉殖小鼠)或細胞(例如CHO細胞)表現系統中表現，或由重組型組合型人類抗體庫分離的抗體。
術語「多特異性抗原結合分子」，如本文所用意指雙特異 性，三特異性或多特異性的抗原結合分子，及其抗原結合片段。多特異性抗原結合分子對一個目標多肽的不同表位具有特異性，或者可以包含對超過一個目標多肽之表位具有特異性的抗原結合域。多特異性抗原結合分子可以是單個多功能多肽，或者它可以是兩個或更多個多肽的多聚體複合體，這些多肽共價或非共價地彼此締合。術語「多特異性抗原結合分子」包括可以被連接另一個功能性分子或與另一功能性分子一起表現的本發明抗體，另一個功能性分子為例如另一種肽或蛋白。例如，抗體或其片段可功能性地連接(例如透過化學偶合、基因融合，非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體，例如蛋白質或其片段以產生具有第二結合特異性的雙特異性或者多特異性抗原結合分子。根據本發明，術語「多特異性抗原結合分子」還包括雙特異性，三特異性或多特異性抗體或其抗原結合片段。在某些具體例中，本發明的抗體功能性地連接到另一個抗體或其抗原結合片段，以產生具有第二結合特異性的雙特異性抗體。在本文別處描述本發明的雙特異性和多特異性抗體。
術語「特異地結合」或「特異地結合至」或類似用語表示抗體或其抗原-結合片段與抗原在生理條件下形成相對穩定的複合體。特異性結合的特徵可以是平衡解離常數為至少約1x10-8M或更低(例如較小的KD表示結合更為緊密)。用於測定兩個分子是否特異地結合的方法為本技藝中所熟知，且包括例如平衡透析、表面電漿共振及類似方法。如本文所述，抗體已藉由表面電漿共振(例如BIACORETM)進行鑑別，該抗體特異地結合至LAG3。此外，如本文所用，結合至LAG3的一個結構域及一或多種其他抗原的多特異性抗體或結合至LAG3的兩個不同區域的雙特異性抗體也被視為「特異地結合」的抗體。
術語「高親和力」抗體意指那些當藉由表面電漿共振(例如BIACORETM)或溶液親和力ELISA來測量時，對LAG3具有至少10-8M；較佳 10-9M；更佳10-10M，又更佳10-11M，又更佳10-12M的結合親和力(表示為KD)的mAb。
依據術語「緩慢的解離速率」、「Koff」或「kd」表示當藉由表面電漿共振(例如BIACORETM)測量時，以1 x 10-3s-1或更低，較佳1 x 10-4s-1或更低的速率常數自LAG3解離的抗體。
術語抗體之「抗原-結合部分」、抗體之「抗原-結合片段」及類似用語，如本文所用，包括任一種天然存在的、經酶促所得到的、合成的或經遺傳工程改造的多肽或醣蛋白，其特異地結合抗原而形成複合體。術語抗體之「抗原-結合片段」或「抗體片段」，如本文所用，意指一或多個維持能結合至LAG3的抗體片段。
在特定具體例中，本發明抗體或抗體片段可接合至一個部分(諸如配體或治療部分(「免疫接合物」)，諸如細胞毒素、第二抗-LAG3抗體、針對腫瘤特異性抗原的抗體、抗癌藥物，或任何其他用於治療疾病或病況(包括癌症或病毒感染，包括慢性病毒感染)的治療部分。
「經單離抗體」，如本文所用，欲意指一種實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體(Ab)的抗體(例如特異地結合LAG3的經單離抗體或其片段實質上不含特異地結合LAG3以外之抗原的Ab)。
「阻斷抗體」或「中和抗體」(或「中和LAG3活性之抗體」或「拮抗劑抗體」)，如本文所用，欲意指其結合至LAG3而抑制LAG3的至少一種生物活性的抗體。例如，本發明抗體可預防或阻斷LAG3結合至第II型MHC。
「活化抗體」或「增強抗體」，如本文所用(或「激動劑抗體」)欲意指其結合至LAG3會增加或刺激LAG3的至少一種生物活性的抗體。例如，本發明抗體可以增加LAG3結合至第II型MHC。
術語「表面電漿共振」如本文所用，意指容許藉由偵測生 物感測器基質中的蛋白質濃度變化來分析即時生物分子交互作用的光學現象，例如使用BLACORETM系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)。
術語「KD」，如本文所用，欲意指特定抗體-抗原交互作用的平衡解離常數。
術語「表位」意指一個與已知為抗原決定簇(paratope)之抗體分子的可變區中特定抗原結合位點交互作用的抗原決定基。單獨一個抗原可能有超過一個表位。因此，不同抗體可結合至一個抗原的不同區域且可能具有不同的生物效用。術語「表位」也意指B細胞及/或T細胞所反應的抗原上的一個位點。其亦意指為被抗體所結合之抗原區域。表位可按結構性或功能性來定義。功能性表位通常是結構性表位的一個子集且具有直接貢獻交互作用親和力的殘基。表位可以是構像性，亦即由非線性胺基酸所構成。在某些具體例中，表位可包括決定基，其為分子的化學活性表面基團(諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些具體例中可具有特定三維結構特性，及/或特定電荷特性。
術語「交叉競爭」如本文所用，表示結合至抗原並抑制或阻斷另一個抗體或其抗原結合片段結合的抗體或其抗原結合片段。該術語也包括呈兩種位向的兩個抗體之間的競爭，亦即第一抗體結合並阻斷第二抗體的結合且反之亦然。在某些具體例中，第一抗體與第二抗體可結合至相同表位。或者，第一抗體與第二抗體可結合至不同但重疊的表位，以使得一者的結合會抑制或阻斷第二個抗體的結合(例如經由位阻)。抗體之間的交叉競爭可透過技藝中已知的方法來測量，例如藉由即時無標記生物層干涉法分析。兩個抗體之間的交叉競爭可以表示為第二抗體比背景信號還少的結合(因為自體-自體結合)(其中第一抗體與第二抗體是相同抗體)。2個抗體之間的交叉競爭可表示為例如比基線自體-自體背景結合還少的第二抗體 的結合%(其中第一抗體與第二抗體是相同抗體)。
當意指核酸或其片段時，術語「實質一致性」或「實質上相同」表示當藉由任何序列一致性的已知演算法(如下文所述)來測量時，在有適當核苷酸插入或刪除的情況下與另一核酸(或其互補股)最佳排列時，至少約90%、且更佳至少約95%、96%、97%、98%或99%核苷酸鹼基中有核苷酸序列一致性。在某些情況下，與參考核酸分子具有實質一致性的核酸分子編碼具有與參考核酸分子所編碼之多肽相同或實質相似胺基酸序列的多肽。
序列一致性可使用演算法來計算，例如用於整體比對的尼德曼溫許(Needleman Wunsch)演算法(Needleman and Wunsch 1970,J.Mol.Biol.48：443-453)，或者用於局部比對的史密斯瓦特曼(Smith Waterman)演算法(Smith and Waterman 1981,J.Mol.Biol.147：195-197)。另一個較佳演算法是由杜佛尼等人在2002年於Nature Biotechnology in 2002(vol.20,pp.1269-71)中所述，並且使用於軟體GenePAST(GQ Life Sciences,Inc.Boston,MA)中。
當應用於多肽時，術語「實質相似性」或「實質上相似」表示當兩個肽序列最佳地排列時(諸如按照程式GAP或BESTFIT使用內定空位權重)，共有至少90%序列一致性，甚至更佳至少95%、98%或99%序列一致性。較佳地，不相同的殘基位置因為守恆性胺基酸置換而有所差異。「守恆性胺基酸置換」是一種胺基酸殘基置換成另一種帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈(R基團)的胺基酸殘基。一般來說，守恆性胺基酸置換大體上不會改變蛋白質的功能性質。在兩個或更多個胺基酸序列因為守恆性置換而彼此不同的情況下，相似性百分率或程度可以向上調整而校正置換的守恆性質。用來做這個調整的方法對於習於該技藝者來說是熟知的。參見，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，其併入本文做為 參考資料。帶有具類似化學性質的側鏈之胺基酸的群組實例包括1)脂肪族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸與異白胺酸；2)脂肪族-羥基側鏈：絲胺酸與蘇胺酸；3)含醯胺的側鏈：天門冬醯胺酸與麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸與色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸與組胺酸；6)酸性側鏈：天門冬胺酸與麩胺酸；以及7)含硫側鏈：半胱胺酸與甲硫胺酸。較佳的守恆性胺基酸置換基團為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、天門冬胺酸-麩胺酸，以及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。或者，守恆性取代可以是任何在Gonnet et al.(1992)Science 256：1443 45(併入本文做為參考資料)中揭示的PAM250對數-相似性矩陣中具有正值的變化。「中度守恆」取代是任何在PAM250對數-相似性矩陣中具有非負值的變化。
關於多肽的序列相似性，典型是使用序列分析軟體來測量。蛋白質分析軟體使用分派給各種置換、刪除以及其他修飾(包括守恆性胺基酸置換)的相似性測量值來配對相似序列。例如，GCG軟體含有諸如GAP與BESTFIT的程式，它們可以與內定參數一起用來決定關係相近之多肽(諸如來自於不同物種之生物的同源性多肽)或野生型蛋白質與其突變蛋白質之間的序列同源性或序列一致性。參見，例如GCG第6.1版。多肽序列也可以使用採內定或建議參數的FASTA(一種在GCG第6.1版中的程式)來比對。FASTA(例如FASTA2與FASTA3)提供查詢以及研究序列之間最佳重疊區域的排列以及百分率序列一致性(Pearson(2000)上文)。當要將本發明的序列與含有大量來自不同生物之序列的資料庫比對時，另一個較佳的演算法是電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN，使用內定參數。參見，例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402，其各自併入本文做為參考資料。
依據片語「治療有效量」表示對其所投予的對象產生需要 效用的數量。確切數量將隨著治療目的而定，且由習於技藝者使用已知技術來確定(參見，例如Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。
如本文所用，術語「個體」意指需要改善、預防及/或治療諸如病毒感染或癌症之疾病或病症的動物，較佳為哺乳動物。該術語包括罹患癌症、轉移性癌症或病毒感染或處於罹患癌症、轉移性癌症或病毒感染風險下的人類個體。
如本文所用，「抗癌藥」表示任何可用於治療或改善或抑制癌症的藥劑，包括但不限於細胞毒素和藥劑，諸如抗代謝物、烷化劑、蒽環類、抗生素、抗有絲分裂劑、丙卡巴肼(procarbazine)、羥基脲、天門冬醯胺酶、皮質類固醇、環磷醯胺、米托坦(mytotane)(O,P’-(DDD))、生物製劑(例如抗體和干擾素)和放射性藥劑。如本文所用，「細胞毒素或細胞毒性劑」也意指化療劑並表示著對細胞有害的任何藥劑。實例包括Taxol®(太平洋紫杉醇)、替莫唑胺(temozolamide)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、短桿菌素D(gramicidin D)、溴乙錠(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、順鉑、絲裂黴素、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、多柔比星(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D、1-去氫睪甾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)與嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。
如本文所用，術語「抗病毒藥物」意指任何藥物或治療，用於在宿主個體中治療，預防或改善病毒感染。術語「抗病毒藥物」包括但不限於齊多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韋(abacavir)、 利巴韋林(ribavirin)、洛匹那韋(lopinavir)、依非韋倫(efavirenz)、科比司他(cobicistat)、替諾福韋(tenofovir)、利匹韋霖(rilpivirine)，止痛劑和皮質類固醇。在本發明的上下文中，病毒感染包括由病毒引起的長期或慢性感染，包括但不限於人類免疫缺乏病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)，淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)和猿免疫缺乏病毒(SIV)。
如本文所用，術語「增強免疫反應」意指增加如T細胞或NK細胞之免疫細胞對抗腫瘤細胞或受病毒感染細胞的活性。在本發明的上下文中，該術語包括阻斷LAG3媒介之T細胞活性抑制，或挽救或反轉T細胞耗竭狀態。還包括調節性T細胞活性的抑制。增強的免疫反應，如在本發明的上下文中所用，導致殺滅腫瘤細胞及/或抑制腫瘤生長。
本發明抗體及抗原結合片段特異地結合至LAG3並增強T細胞活化。抗LAG3抗體可以高親和力或低親和力結合至LAG3。在某些具體例中，本發明抗體可以是阻斷抗體，其中抗體可結合至LAG3並抑制LAG3信號傳遞。在一些具體例中，本發明抗體阻斷LAG3結合至II型MHC及/或刺激或增強T細胞活化。在一些具體例中，抗體結合至LAG3並反轉耗竭T的活動力缺失狀態。在某些具體例中，抗體結合至LAG3並抑制調節性T細胞活性。在一些具體利中，抗體可用於刺激或增強免疫反應及/或用於治療罹患癌症或病毒感染的個體。當抗體被投予給有需要的個體時可在個體中降低由病毒所致的慢性感染，病毒為諸如HIV、LCMV或HBV。它們可用於在個體體內抑制腫瘤細胞生長。它們可以單獨使用或作為輔助療法與技藝中已知用於治療癌症或病毒感染的其他治療部分或形式一起使用。
在某些具體例中，抗LAG3抗體可以是多特異性抗原結合分子，其中它們包含針對LAG3的第一結合特異性以及針對選自另一個T細胞共抑制分子以及LAG3之不同表位組成之群之抗原的第二結合特異性。
包含以下中任一者的免疫原可用於產生針對LAG3的抗體。在某些具體例中，本發明抗體是由經全長、天然LAG3(參見NCBI登錄號NP_002277.4)(SEQ ID NO：582)，或用重組型LAG3肽免疫的小鼠獲得。或者，LAG3或其片段可以使用標準生化技術生產並經修飾(SEQ ID NO：574-576)且用作為免疫原。
在某些具體例中，免疫原是LAG3的一個或多個胞外域。在本發明的一個具體例中，免疫原是LAG3的一個片段，其範圍從SEQ ID NO：582的約胺基酸殘基29-450。
在某些具體例中，免疫原可以是在大腸桿菌中或在任何其他真核或哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)中表現的重組型LAG3肽。
在某些具體例中，特異地結合至LAG3的抗體可使用上述區域的片段，或從本文所述區域的N端或C端或兩者延伸超出指定區域約5個至約20個胺基酸殘基的肽片段來製備。在某些具體例中，上述區域或其片段的任何組合可用於製備LAG3特異性抗體。
肽可經修飾而納入某些殘基的添加或置換以供標示或接合至載體分子(諸如KLH)。例如，可在肽的N端或C端末端添加半胱胺酸，或可添加連接子序列以製備用於接合至例如KLH的肽以供進行免疫。
本發明的某些抗LAG3抗體能夠結合至LAG3並中和LAG3活性，如藉由活體外或活體內分析所測量。可使用習於技藝者熟知的任一種標準方法(如本文所述包括結合分析或活性分析)來測量本發明抗體結合至LAG3並且中和LAG3活性的能力。
用於測量結合活性的非限制性例示性活體外分析列舉於本文實例中。在實例3中，人類抗LAG3抗體對於人類LAG3的結合親和力與動力學常數是藉由表面電漿共振來測定並且在Biacore 4000或T200儀器上進 行測量。在實例4中，使用阻斷分析來測定抗LAG3抗體之間的交叉競爭。實例5與6說明抗體對過度表現LAG3之細胞的結合。在實例7中，使用結合分析來決定抗LAG3抗體在活體外阻斷LAG3之第II型MHC結合能力的能力。在實例8中，使用螢光素酶分析來決定抗LAG3抗體在T細胞中拮抗LAG信號傳遞的能力。在實例9中，使用螢光分析來決定抗LAG3抗體結合至活化猴CD4+與CD8+ T細胞的能力。
在某些具體例中，本發明抗體能夠在活體外，在帶有癌症的個體中或在感染病毒(諸如LCMV)的個體中增強或刺激T細胞活性。在某些具體例中，本發明抗體與第二治療劑(例如針對第二T細胞共抑制分子)組合使用，以在個體中增強免疫反應並抑制腫瘤生長。
對LAG3具有特異性的抗體可不含有額外標記或部分，或它們可含有N端或C端標記或部分。在一個具體例中，標記或部分為生物素。在結合分析中，標記(若有的話)的位置可決定肽在結合之後肽相對於表面的位向。例如，若表面包覆卵白素，則含有N端生物素的肽將被定位以使得該肽的C端部分與表面遠離。在一個具體例中，標記可為放射性核種、螢光染料或MRI可偵測標誌。在某些具體例中，此等經標記抗體可用於診斷分析中，包括成像分析。
本發明的例示性具體例
在某些具體例中，本發明提供特異地結合至人類淋巴球活化基因3(LAG3)蛋白質之經單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有選自下列組成之群的特性：(a)以小於約10nM的結合解離平衡常數(KD)結合單體人類LAG3，如在25℃下於表面電漿共振分析中所測量；(b)以小於約8nM的KD結合單體人類LAG3，如在37℃下於表面電漿共振分析中所測量；(c)以小於約1.1nM的KD結合二聚體人類LAG3，如在25℃下於表面電漿共振分析中所測量；(d)以小於約1nM的KD結合二聚體人類 LAG3，如在37℃下於表面電漿共振分析中所測量；(e)以小於約8nM的EC50結合至hLAG3-表現細胞，如流式細胞測量分析中所測量；(f)以小於約2.3nM的EC50結合至mfLAG3-表現細胞，如流式細胞測量分析中所測量；(g)以小於約32nM的IC50阻斷hLAG3結合至人類第II型MHC，如細胞附著分析所測量；(h)以少於約30nM的IC50阻斷hLAG3結合至小鼠第II型MHC，如細胞附著分析所測量；(i)阻斷hLAG3結合至第II型MHC達超過90%，如細胞附著分析所測量；(j)以少於約9nM的EC50挽救LAG3媒介的T細胞活性抑制，如螢光素酶報導子分析中所測定；以及(k)以少於約1.2nM的EC50結合至活化CD4+和CD8+ T細胞，如在螢光分析中所測定。
在某些具體例中，本發明之經單離抗體或其抗原結合片段包含三個重鏈互補決定區(CDR)(HCDR1，HCDR2和HCDR3)，其包含在表1中所列重鏈可變區(HCVR)序列的任一者中；以及三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2與LCDR3)，其包含在表1中所列輕鏈可變區(LCVR)序列的任一者中。在某些具體例中，經單離抗體或其抗原結合片段包含具有選自由表1中所列HCVR序列組成之群的胺基酸序列的HCVR。在某些具體例中，經單離抗體或其抗原結合片段包含具有選自由表1中所列LCVR序列組成之群的胺基酸序列的LCVR。
在某些具體例中，經單離抗體或其抗原結合片段包含：(a)HCDR1域，具有選自由SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、388、404、420、436、452、460、468、476、484、492、500、508、516、540與556組成之群的胺基酸序列；(b)HCDR2域，具有選自由SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、390、406、422、438、454、462、470、478、486、494、502、510、518、54與 558組成之群的胺基酸序列；(c)HCDR3域，具有選自由SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、392、408、424、440、456、464、472、480、488、496、504、512、520、544與560組成之群的胺基酸序列；(d)LCDR1域，具有選自由SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、396、412、428、444、524、532、548與564組成之群的胺基酸序列；(e)LCDR2域，具有選自由SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、398、414、430、446、526、534、550與566組成之群的胺基酸序列；以及(f) LCDR3域，具有選自由SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、400、416、432、448、528、536、552與568組成之群的胺基酸序列在某些具體例中，本發明經單離抗體或抗原結合片段包含選自由下列SEQ ID NO組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386/394、402/410、418/426、434/442、450/522、458/522、466/522、474/522、482/522、490/522、498/530、506/530、514/530、538/546以及554/562。
在某些具體例中，如請求項7之經單離抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由SEQ ID NO：386/394、418/426以及538/546組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對。
在某些具體例中，本發明提供阻斷LAG3結合至第II型MHC 之經單離抗體或其抗原結合片段，其包含HCVR的三個CDR與LCVR的三個CDR，其中該HCVR具有選自由下列SEQ ID NO組成之群的胺基酸序列：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、402、418、434、450、458、466、474、482、490、498、506、514、538與554；其中該LCVR具有選自由下列SEQ ID NO組成之群的胺基酸序列：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、394、410、426、442、522、530、546與562。
在某些具體例中，經單離抗體或抗原結合片段包含選自由SEQ ID NO：386/394、418/426以及538/546組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對。
在某些具體例中，本發明提供與包含選自由下列SEQ ID NO組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對的抗體或其抗原結合片段競爭結合的抗體或其抗原結合片段：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386/394、402/410、418/426、434/442、450/522、458/522、466/522、474/522、482/522、490/522、498/530、506/530、514/530、538/546以及554/562。
在某些具體例中，本發明提供與包含選自由下列SEQ ID NO組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對的抗體或其抗原結合片段結合至相同表位的抗體或其抗原結合片段：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386/394、402/410、418/426、434/442、450/522、458/522、 466/522、474/522、482/522、490/522、498/530、506/530、514/530、538/546以及554/562。
在某些具體例中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。該抗體或其抗原結合片段例如可以是IgG1抗體或IgG4抗體，諸如例如人類IgG1或IgG4抗體。彼等抗體的恆定區可對應於野生型恆定區，或對應於已引入突變的恆定區。
在某些具體例中，本發明提供包含重鏈和輕鏈的經單離抗體，其中該重鏈包含選自下列SEQ ID NO組成之群的胺基酸序列：577，579及580。在某些具體例中，本發明提供包含重鏈和輕鏈的經單離抗體，其中該輕鏈包含選自下列SEQ ID NO組成之群的胺基酸序列：578和581。在某些具體例中，本發明提供經單離抗體或其抗原結合片段，其包含選自下列SEQ ID NO組成之群的重鏈/輕鏈胺基酸序列對：577/578、579/578及580/581。
在一個態樣中，本發明提供多特異性抗原結合分子，其包含特異地結合LAG3的第一抗原結合特異性以及特異地結合至第二目標表位的第二抗原結合特異性。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含上述具體例中任一項之抗LAG3抗體或其抗原結合片段以及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。
在一個態樣中，本發明提供包含本文揭示之抗體或其抗原結合片段的多核苷酸序列的經單離多核苷酸分子以及載體。在某些具體例中，包含本發明提供一種經單離多核苷酸分子及/或載體，其包含編碼如本文所述的抗體的HCVR的多核苷酸序列。在某些具體例中，本發明提供一種經單離多核苷酸分子及/或載體，其包含編碼如本文所述抗體之LCVR的多核苷酸序列。
在一個態樣中，本發明提供在個體中提高免疫反應的方 法，該方法包含投予醫藥組合物，該醫藥組合物包含如本文揭示之經單離抗LAG3抗體或其抗原結合片段。在某些具體例中，本發明提供在個體中抑制調節性T(Treg)細胞的方法，包含投予醫藥組合物，該醫藥組合物包含如本文揭示之經單離抗LAG3抗體或其抗原結合片段。在某些具體例中，本發明提供在個體中提高T細胞活化的方法，該方法包含投予醫藥組合物，該醫藥組合物包含如本文揭示之經單離抗LAG3抗體或其抗原結合片段。在某些具體例中，該個體具有選自下列組成之群的疾病或病症：血癌、腦癌、腎細胞癌(例如透明細胞腎癌)、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌(例如三陰性乳癌)、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌，頭部和頸部的鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤、淋巴瘤(例如B細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤)以及黑色素瘤。在某些具體例中，該個體具有由選自下列組成之群的病毒引起的慢性病毒感染：人類免疫缺乏病毒(HIV)、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)，淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)和猿免疫缺乏病毒(SIV)。在某些具體例中，抗LAG3抗體與選自下列組成之群的第二治療劑組合投予給個體：PD-1抑制劑、CTLA抑制劑、針對腫瘤特異性抗原的抗體、針對遭病毒感染之細胞抗原的抗體、PD-L1抑制劑、CD20抑制劑、對抗CD20與CD3的雙特異性抗體、諸如抗氧化劑的膳食補充劑、VEGF拮抗劑、化療劑、細胞毒性劑、放射線、NSAID、皮質類固醇，以及可用於改善與該疾病或病症有關的至少一個症狀的任何其他療法。
在一個態樣中，本發明提供在個體中抑制腫瘤或腫瘤細胞生長的方法，該方法包含向有需要的個體投予治療有效量之如本文揭示的抗LAG3抗體或其抗原結合片段。在某些具體例中，腫瘤為原發的或復發的。在某些具體例中，腫瘤為已長成的腫瘤。在某些具體例中，該個體具有轉移性疾病及/或已經先前療法治療。在某些具體例中，腫瘤存在於患有 選自下列組成之群的疾病或病症的個體中：血癌、腦癌、腎細胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭部和頸部的鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤、淋巴瘤以及黑色素瘤。在某些具體例中，抗LAG3抗體或其抗原結合片段作為一或多個劑量投予，其中每個劑量就在前一個劑量之後1至4週投予。在某些具體例中，抗LAG3抗體或其抗原結合片段以約0.1mg/kg個體體重至約100mg/kg個體體重的劑量投予。在某些具體例中，抗LAG3抗體與選自下列組成之群的第二治療劑組合投予給個體：PD-1抑制劑、CTLA抑制劑、針對腫瘤特異性抗原的抗體、PD-L1抑制劑、CD20抑制劑、對抗CD20與CD3的雙特異性抗體、諸如抗氧化劑的膳食補充劑、VEGF拮抗劑、化療劑、細胞毒性劑、放射線、NSAID、皮質類固醇，以及可用於改善與該疾病或病症有關的至少一個症狀的任何其他療法。在一個具體例中，第二治療劑為PD-1抑制劑，其中PD-1抑制劑是特異地結合至PD-1的抗體或其抗原結合片段。在一個具體例中，PD-1抑制劑為REGN2810。在某些具體例中，經皮下、靜脈內、皮內、腹膜內、經口、肌肉內或顱內投予抗LAG3抗體或其抗原結合片段。
在一個態樣中，本發明提供挽救LAG3媒介之T細胞活性抑制的方法，包含使T細胞與本文揭示之抗LAG3抗體或其抗原結合片段接觸。在一個具體例中，T細胞接觸本發明抗LAG3抗體以及抗PD-1抗體(例如REGN2810)的組合。
抗體的抗原-結合片段
除非他處另有指明，否則術語「抗體」，如本文所用，應理解為含括包含兩條免疫球蛋白重鏈以及兩條免疫球蛋白輕鏈的抗體分子(亦即「完全抗體分子」)及其抗原-結合片段。術語抗體的「抗原-結合部分」、抗體的「抗原-結合片段」及類似用語如本文所用包括所有天然存在的、以酶促所得到的、合成的或經遺傳工程改造的多肽或糖蛋白，其特異地結合 抗原而形成複合體。術語抗體的「抗原-結合片段」或「抗體片段」如本文所用意指抗體維持能特異地結合至LAG3的一或多個片段。抗體片段可包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR或經單離CDR的片段。在某些具體例中，術語「抗原結合片段」意指多特異性抗原結合分子的一個多肽片段。在此等具體例中，術語「抗原結合片段」包括例如特異地結合至LAG3的第II型MHC分子。抗體的抗原結合片段可以使用任何適當的標準技術(諸如蛋白水解消化或涉及操作並表現編碼抗體可變及(視情況)恆定域的DNA之重組遺傳工程技術)而衍生自例如完全抗體分子。此DNA為已知及/或容易由例如商業來源、DNA庫(包括，例如噬菌體-抗體庫)取得或可合成。DNA可以被定序並且以化學方式或藉由使用分子生物學技術操作，例如將一或多個可變域及/或恆定域排成適當構形，或引入密碼子、產生半胱胺酸殘基、修飾、添加或刪除胺基酸等。
抗原結合片段的非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；與(vii)由模擬抗體的超變異區之胺基酸殘基所構成的最小辨識單元(例如經單離的互補決定區(CDR)，諸如CDR3肽)，或限制型FR3-CDR3-FR4肽。其他經工程改造的分子(諸如域特異性抗體、單域抗體、域刪除抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小調節分子免疫藥物(SMIP)及鯊魚可變IgNAR域)亦含括在如本文所用詞句「抗原結合片段」中。
抗體的抗原結合片段典型含有至少一個可變域。可變域可以是任何大小與胺基酸組成，且通常含有至少一個鄰近一或多個骨架序列或在一或多個骨架序列框中的CDR。在帶有與VL域締合之VH域的抗原結合片段中，VH以及VL域可相對另一者以任一種適當排列定位。舉例而言，可變區是二聚體且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。或者，抗體的抗原結 合片段可含有單體VH或VL域。
在某些具體例中，抗體的抗原結合片段可含有至少一個共價連結至少一個恆定域的可變域。可以在本發明抗體的抗原結合片段中發現到的可變域與恆定域的非限制性例示性構形包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可變域與恆定域的任一種構形中(包括上面列示的任一種例示性構形)，可變域與恆定域可以是彼此直接連結或藉由完整或部分樞紐或連接子區域而連結。樞紐區是由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所構成，它在單一多肽分子中的相鄰可變域及/或恆定域間產生彈性或半彈性鍵聯。此外，本發明抗體的抗原結合片段可包含上列可變域與恆定域構形的任一者及/或與一或多個單體VH或VL域以非共價締合(例藉由雙硫鍵(等))所形成的同型二聚體或異型二聚體(或其他集合體)。
就完全抗體分子而言，抗原結合片段可以是單特異性或多特異性(例如雙特異性)。抗體的多特異性抗原結合片段典型包含至少兩個不同可變域，其中各個可變域能夠特異地結合至個別抗原或相同抗原上的不同表位。任一種多特異性抗體形式，包括本文揭示的例示性雙特異性抗體形式，可使用該技藝中可取得之慣用技術改造成使用於本發明抗體的抗原結合片段中。
人類抗體的製備
用於在基因轉殖小鼠中產生人類抗體的方法為技藝中已知的。任何此等已知方法可用於本發明上下文中以製造特異地結合至LAG3的人類抗體。
使用VELOCIMMUNETM技術(參見例如US 6,596,541， Regeneron Pharmaceuticals，VELOCIMMUNE®)或任何其他用於生成單株抗體的已知方法，首先分離出帶有人類可變區以及小鼠恆定區之對LAG3具高度親和力的嵌合抗體。VELOCIMMUNETM技術涉及生成基因轉殖小鼠，其具有包含人類重鏈與輕鏈可變區可操作地連結至內源性小鼠恆定區基因座以使得小鼠對抗原刺激反應而生產包含人類可變區與小鼠恆定區之抗體的基因組。單離編碼抗體重鏈與輕鏈之可變區的DNA並可操作地連結至編碼人類重鏈與輕鏈恆定區的DNA。接著在能夠表現完全人類抗體的細胞中表現該DNA。
一般來說，以感興趣抗原對VELOCIMMUNE®小鼠進行攻毒，並從表現抗體的小鼠回收淋巴球(諸如B細胞)。淋巴細胞可與骨髓瘤細胞株融合以製備不朽融合瘤細胞株，且篩選並選出此等融合瘤細胞株以鑑定出生產對感興趣抗原具特異性之抗體的融合瘤細胞株。可分離編碼重鏈及輕鏈可變區的DNA並連接至合意的重鏈與輕鏈之同型恆定區。此一抗體蛋白可以在細胞中(諸如CHO細胞中)生產。或者，可直接從抗原特異性淋巴球分離出編碼抗原特異性嵌合抗體或輕鏈與重鏈之可變域的DNA。
一開始分離出具有人類可變區及小鼠恆定區的高親和力嵌合抗體。如同在下面實驗段落中，對該等抗體進行特徵鑑定並針對合意特徵(包括親和力、選擇性、表位等)進行來選定。小鼠恆定區以合意人類恆定區予以取代以產生本發明之完全人類抗體，例如野生型或經修飾IgG1或IgG4。雖然選擇的恆定區可能會依據特定用途而改變，但高親和力抗原結合以及目標特異性特徵存在於可變區中。
生物等效性
本發明抗LAG3抗體及抗體片段含括帶有由那些所述抗體變化而來，但仍保有結合LAG3能力之胺基酸序列的蛋白質。當與親代序列相比較，此等變異體抗體以及抗體片段包含一或多個胺基酸添加、刪除或 置換，但仍展現出基本上與所述抗體相同的生物活性。同樣地，當與所揭示的序列相比較，本發明之抗體編碼DNA序列含括具有一或多個核苷酸添加、刪除或置換，但仍編碼與本發明抗體或抗體片段基本上生物等效的抗體或抗體片段的序列。
舉例而言，若兩個抗原-結合蛋白或抗體是醫藥學等效物或醫藥學代用品，當它們以相同莫耳劑量在類似實驗條件下投予時的吸收速率與程度未顯示出顯著差異(不論是單劑量或多劑量)，則它們被視為生物等效的。若一些抗體在它們的吸收程度上相等但在它們的吸收速率上不同，則它們將會被視為等效物或醫藥學代用品但還不被視為生物等效，因為這些在吸收速率上的差異是有目的並且在歸類時被反映，對於在例如長期使用上維持有效生體藥物濃度來說不是必要的，並且就所研究的特定藥物產品來說被視為在醫學上沒有差異。
在一個具體例中，若兩個抗原-結合蛋白就其安全性、純度或效力而言在臨床上並無有意義的差異，它們是生物等效的。
在一個具體例中，若患者在參考產品與生物產品之間可以改變一或多次而沒有預期提高不良反應的風險(包括與連續療法而沒有這樣改變的情況下相比，在免疫原性上的臨床顯著變化，或減低有效性)時，則它們是生物等效的。
在一個具體例中，若兩個抗原-結合蛋白就條件或使用條件來說均是藉由共同的機制或作用機制發揮作用達致此等機制已知的程度，則它們是生物等效的。
生物等效性可以藉由活體內及/或活體外方法證實。生物等效性測量法包括，例如(a)在人類或其他哺乳動物體內的活體內測試，其中隨著時間函數測量抗體或其代謝物在血液、血漿、血清或其他生物液中的濃度；(b)已使用人類活體內生物可利用性數據校正並且可合理預測用於人 類的活體外測試；(c)在人類或其他哺乳動物體內的活體內測試，其中隨著時間函數測量抗體(或其目標)之適當急性藥理學效用；以及(d)在已建立抗體的安全性、效力或生物可利用性或生物等效性的充分控制臨床試驗中。
本發明抗體的生物等效變異體可以藉由例如，製造各種殘基或序列置換，或刪除不是生物活性所必需的末端或內部殘基或序列而建構。舉例而言，對於生物活性來說不是必要的半胱胺酸殘基可以被刪除或取代為其他會在再復性之後預防形成不必要或不正確分子內雙硫橋的胺基酸。在其他上下文中，生物等效性抗體可包括抗體變異體，其含有會修飾抗體之糖基化特徵的胺基酸變化，例如消除或移除糖基化的突變。
包含Fc變異體的抗LAG3抗體
依據本發明的某些具體例，提供抗LAG3抗體，其包含含有一或多個突變的Fc域，該一或多個突變提高或減少抗體結合至FcRn受體，例如在與中性pH相比更酸的pH下。舉例而言，本發明包括抗LAG3抗體，其在Fc域的CH2或CH3區中含有突變，其中該(等)突變在酸性環境(例如在胞內體中，pH範圍為約5.5至約6.0)下增加Fc域對FcRn的親和力。當被投予給動物時，此等突變可使得抗體的血清半衰期增加。此等Fc修飾的非限制性實例包括，例如在下列位置處的修飾：250(例如，E或Q)；250與428(例如，L或F)；252(例如，L/Y/F/W或T)、254(例如，S或T)，及256(例如，S/R/Q/E/D或T)；或在位置428及/或433處的修飾(例如，H/L/R/S/P/Q或K)及/或434的修飾(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])；或在位置250及/或428處的修飾；或在位置307或308處的修飾(例如，308F、V308F)，以及434。在一個具體例中，修飾包含428L(例如M428L)以及434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)，以及308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)以及434(例如434Y)修飾；252、254，以及256(例如252Y、254T，及256E)修飾；250Q及428L修飾(例如T250Q及M428L)；與307 及/或308修飾(例如308F或308P)。在又另一個具體例中，修飾包含265A(例如D265A)及/或297A(例如N297A)修飾。
舉例而言，本發明包括含有Fc域的抗LAG3抗體，其包含一或多對或一或多群選自下列組成之群的突變：250Q與248L(例如，T250Q與M248L)；252Y、254T與256E(例如，M252Y、S254T與T256E)；428L與434S(例如，M428L與N434S)；257I與311I(例如，P257I與Q311I)；257I與434H(例如，P257I與N434H)；376V與434H(例如，D376V與N434H)；307A、380A與434A(例如T307A、E380A與N434A)；以及433K與434F(例如，H433K與N434F)。在一個具體例中，本發明包括抗LAG3抗體，其包含在IgG4的樞紐區中含有一個S108P突變的Fc域，以促進二聚體穩定。前述Fc域突變以及本文揭示抗體可變域內其他突變的所有可能組合為本發明範圍內所能預想。
本發明亦包括包含嵌合重鏈恆定(CH)區的抗LAG3抗體，其中該嵌合CH區包含衍生自超過一個免疫球蛋白同型之CH區的節段。例如，本發明抗體可包含含有衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之部分或全部CH2域，組合衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之部分或全部CH3域的嵌合CH區。依據某些具體例，本發明抗體包含具有嵌合樞紐區的嵌合CH區。例如，嵌合樞紐可包含衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4樞紐區之「上樞紐」胺基酸序列(依據EU編號自位置216至227的胺基酸殘基)組合衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4樞紐區之「下樞紐」序列(依據EU編號位置228至236的胺基酸殘基)。依據某些具體例，嵌合樞紐區包含衍生自人類IgG1或人類IgG4上樞紐的胺基酸殘基以及衍生自人類IgG2下樞紐的胺基酸殘基。包含如本文所述嵌合CH區的抗體在某些具體例中可表現經修飾的Fc效應子功能而不會不利地影響抗體的治療或藥動學特性(參見例如美國專利公開案第20140243504號，以其整體併入本文做為參考資料)。在某些具體例中，Fc區包含選自由SEQ ID NO：569、570、571、572及573組成 之群的序列。
抗體的生物特徵
大體上，本發明抗體藉由結合至LAG3來發揮功能。本發明包括以高親和力結合可溶性單體或二聚體LAG3分子的抗LAG3抗體及其抗原結合片段。例如，如藉由表面電漿共振所測量(例如使用本文實例3中所定義的分析形式)，本發明包括以少於約10nM的KD結合單體LAG3的抗體及抗體之抗原結合片段(例如在25℃下或在37℃下)。在某些具體例中，抗體或其抗原結合片段以少於約5nM、少於約2nM、少於約1nM、少於約0.5nM、少於約0.1nM、少於約0.05nM或少於約0.04nM的KD結合單體LAG3，如藉由表面電漿共振所測定，例如使用如本文實例3中定義的分析形式或實質相似的分析。
本發明亦包括抗體及其抗原結合片段，其以少於約1.1nM的KD結合二聚體LAG3(例如在25℃或37℃下)，如藉由表面電漿共振所測定，例如使用如本文實例3中定義的分析形式。在某些具體例中，抗體或其抗原結合片段以少於約0.5nM、少於約0.25nM、少於約0.1nM、少於約0.05nM或少於約0.01M的KD結合二聚體LAG3，如藉由表面電漿共振所測定，例如使用如本文實例3中定義的分析形式或實質相似的分析。
本發明亦包括抗體及其抗原結合片段，其以大於約1.6分鐘的解離半衰期(t1/2)結合LAG3，如在25℃或37℃下藉由表面電漿共振所測定，例如使用如本文實例3中定義的分析形式或實質相似的分析。在某些具體例中，本發明抗體或抗原結合片段以大於約5分鐘、大於約10分鐘、大於約30分鐘、大於約50分鐘、大於約60分鐘、大於約70分鐘、大於約80分鐘、大於約90分鐘、大於約100分鐘、大於約200分鐘、大於約300分鐘、大於約400分鐘、大於約500分鐘、大於約600分鐘、大於約700分鐘、大於約800分鐘、大於約900分鐘、大於約1000分鐘，或大於約1100分鐘的t1/2結合LAG3， 如在25℃或37℃下藉由表面電漿共振所測定，例如使用如本文實例3中定義的分析形式(例如mAb-捕獲或抗原捕獲形式)或實質相似的分析。
本發明亦包括以少於約8nM的EC50結合至人類LAG3-表現細胞的抗體或其抗原結合片段，如使用流動式細胞測量分析所測量，例如實例5中所定義或實質相似的分析。在某些具體例中，抗體或其抗原結合片段以少於約5nM、少於約2nM、少於約1nM或少於約0.5nM的EC50結合至hLAG3-表現細胞，如使用流動式細胞測量分析所測量，例如使用實例5中之分析形式或實質相似的分析。
本發明亦包括以少於約2.5nM的EC50結合至石蟹獼猴LAG3-表現細胞的抗體或其抗原結合片段，如使用流動式細胞測量分析所測量，例如本文實例5中所示或實質相似的分析。在某些具體例中，抗體或其抗原結合片段以少於約2nM或少於約1nM的EC50結合至mfLAG3-表現細胞，如使用流動式細胞測量分析所測量，例如使用實例5中定義之分析形式或實質相似的分析。
本發明亦包括以少於約32nM的IC50阻斷LAG3結合至第II型MHC(人類HLA-DR2)的抗體或其抗原結合片段，如使用細胞附著分析所測定，例如實例7中所示或實質相似的分析。在某些具體例中，抗體或其抗原結合片段以少於約25nM、少於約20nM、少於約10nM或少於約5nM的IC50阻斷LAG3結合至人類第II型MHC，如藉由細胞附著分析所測定，例如使用本文實例7中所定義之分析形式或實質相似的分析。
本發明亦包括以少於約30nM的IC50阻斷LAG3結合至第II型MHC(小鼠HLA-DR2)的抗體或其抗原結合片段，如使用細胞附著分析所測定，例如實例7中所示或實質相似的分析。在某些具體例中，抗體或其抗原結合片段以少於約25nM、少於約20nM、少於約10nM或少於約5nM的IC50阻斷LAG3結合至人類第II型MHC，如藉由細胞附著分析所測定，例如 使用本文實例7中所定義之分析形式或實質相似的分析。
本發明亦包括阻斷LAG3結合至人類或小鼠第II型MHC超過90%的抗體或其抗原結合片段，如使用細胞附著分析所測定，如本文實例7中所定義或實質相似的分析。
本發明亦包括以少於9nM的EC50阻斷LAG誘導之T細胞下調的抗體或其抗原結合片段，如藉由T細胞/APC螢光素酶報導子分析所測量，如本文實例8中所定義或實質相似的分析。在某些具體例中，抗體或其抗原結合片段以少於約5nM、少於約1nM、少於約0.5nM或少於約0.1nM的EC50阻斷LAG誘導之T細胞下調，如藉由T細胞/APC螢光素酶報導子分析所測定，例如使用本文實例8中所定義之分析形式或實質相似的分析。
本發明亦包括以少於約1.2nM的EC50結合石蟹獼猴活化CD4+與CD8+ T細胞的抗體或其抗原結合片段，如藉由螢光分析所測定，例如本文實例9中所定義或實質相似的分析。在某些具體例中，抗體或其抗原結合片段以少於約1.1nM、少於約1nM、少於約0.5nM，少於約0.2nM或少於約0.1nM的EC50結合石蟹獼猴活化CD4+與CD8+ T細胞，如藉由螢光分析所測定，例如使用本文實例9中所定義之分析形式或實質相似的分析。
在某些具體例中，本發明抗體可透過結合至全長蛋白的任何其他區域或片段來阻斷或抑制與LAG3有關的第II型MHC結合活性而發揮作用，其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：582中。
在某些具體例中，本發明抗體當預防性地被投予給有需要的個體時可用於抑制腫瘤生長或延緩腫瘤進展，並且可增加個體的存活。例如，投予本發明抗體可能導致原發性腫瘤萎縮，並且可以防止轉移或繼發性腫瘤的長成。在某些具體例中，本發明抗體當治療性地被投予給有需要的個體時可用於抑制腫瘤生長並且增加個體的存活。例如，對個體投予治療有效量的本發明抗體可導致個體中已長成的腫瘤萎縮與消失。
在一個具體例中，本發明提供結合至LAG3之經單離重組型單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段表現出一或多個下列特徵：(i)包含具有選自下列SEQ ID NO組成之群之胺基酸序列的HCVR：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、402、418、434、450、458、466、474、482、490、498、506、514、538與554，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列；(ii)包含具有選自下列SEQ ID NO組成之群之胺基酸序列的LCVR：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、394、410、426、442、522、530、546與562，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列；(iii)包含具有選自下列SEQ ID NO組成之群之胺基酸序列的HCDR3域：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、392、408、424、440、456、464、472、480、488、496、504、512、520、544與560，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列；以及具有選自下列SEQ ID NO組成之群之胺基酸序列的LCDR3域：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、400、416、432、448、528、536、552與568，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列；(iv)包含具有選自下列SEQ ID NO組成之群之胺基酸序列的HCDR1域：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、388、404、420、436、452、460、468、476、484、492、500、508、516、540與556，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質相 似序列；具有選自下列SEQ ID NO組成之群之胺基酸序列的HCDR2域：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、390、406、422、438、454、462、470、478、486、494、502、510、518、542與558，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列；具有選自下列SEQ ID NO組成之群之胺基酸序列的LCDR1域：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、396、412、428、444、524、532、548與564，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列；以及具有選自下列SEQ ID NO組成之群之胺基酸序列的LCDR2域：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、398、414、430、446、526、534、550與566，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質相似序列；(v)以少於約10nM的結合解離平衡常數(KD)結合單體人類LAG3，如在25℃於表面電漿共振分析中測量；(vi)以少於約8nM的KD結合單體人類LAG3，如在37℃於表面電漿共振分析中測量；(vii)以少於約1.1nM的KD結合二聚體人類LAG3，如在25℃於表面電漿共振分析中測量；(viii)以少於約1nM的KD結合二聚體人類LAG3，如在37℃於表面電漿共振分析中測量；(ix)以少於約8nM的EC50結合至hLAG3-表現細胞，如在流動式細胞測量分析中所測量；(x)以少於約2.3nM的EC50結合至mfLAG3-表現細胞，如在流動式細胞測量分析中所測量；(xi)以少於約32nM的IC50阻斷hLAG3結合至人類第II型MHC，如藉由細胞附著分析所測量；(xii)以少於約30nM的IC50阻斷hLAG3結合至小鼠第II型MHCC，如藉由細胞附著分析所測量；(xiii)阻斷hLAG3結合至第二型MHC達超過90%，如藉由細胞附著分析所測量；(xiv)以少於約9nM的EC50挽救LAG3媒介之T細胞活性 抑制，如在螢光素酶報導子分析中所測量；(xv)以少於約1.2nM的EC50結合至活化CD4+與CD8+ T細胞，如在螢光分析中所測量；(xvi)抑止腫瘤生長並且增加癌症個體的存活，以及(xvii)為完全人類抗體。
本發明抗體可具有前述生物特徵的一或多者，或其任何組合。本發明抗體的其他生物特徵對於習於技藝者來說從檢視本揭示內容(包括本文的工作實例在內)將變得清楚。
物種選擇性以及物種交叉反應性
依據本發明的某些具體例，抗LAG3抗體結合至人類LAG3而不會結合至其他物種的LAG3。或者，本發明抗LAG3抗體在某些具體例中結合至人類LAG3以及一或多個非人類物種的LAG3。舉例而言，本發明的抗LAG3抗體可以結合至人類LAG3並且視情況可能結合或不結合至小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、石蟹獼猴、狨猿、恆河猴或黑猩猩LAG3的一或多者。在某些具體例中，本發明的抗LAG3抗體可以相同親和力或以不同親和力結合至人類與石蟹獼猴LAG3，但不結合至大鼠與小鼠LAG3。
表位定位(mapping)以及相關技術
本發明包括與LAG3分子之一或多個結構域(例如胞外域D1至D4、跨膜域以及胞內域)中發現的一或多個胺基酸交互作用的抗LAG3抗體。抗體結合的表位可由座落於LAG3分子中任一前述結構域內的3或更多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個)胺基酸單一連續序列組成(例如結構域中的一個線性表位)。或者，表位可由座落於LAG3分子中前述結構域的一者或兩者的數個非連續胺基酸(或胺基酸序列)組成(例如構形表位)。
可使用技藝中具有通常技術者所熟知的各種技術來決定一個抗體是否會與多肽或蛋白質中的「一或多個胺基酸交互作用」。例示性 技術包括例如慣用交叉-阻斷分析，諸如Harlow與Lane在「Antibodies」中所述者(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)。其他方法包括丙胺酸掃描突變分析、肽墨點分析(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)、肽切割分析晶體學研究與NMR分析。此外，可以採用諸如表位切除、表位抽出以及化學修飾抗原的方法(Tomer(2000)Prot.Sci.9：487-496)。另一種可用於鑑別抗體所交互作用之多肽中的胺基酸的方法為透過質譜偵測氫/氘交換。在一般性術語中，氫/氘交換法涉及將感興趣的蛋白質標記氘，然後將抗體結合至經氘標記的蛋白質。接下來，蛋白質/抗體複合體被轉移至水中且胺基酸內受抗體複合體保護的可交換質子以比胺基酸內並非界面一部分的可交換質子還慢的速率歷經氘至氫回復交換。因此，形成蛋白質/抗體界面一部分的胺基酸可保留氘並因而相對於不在此界面內的胺基酸表現相對較高的質量。在抗體解離後，目標蛋白質進行蛋白酶切割與質譜分析，從而揭開經氘標記的殘基，其對應於抗體所交互作用的特定胺基酸。參見，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。
術語「表位」意指B細胞及/或T細胞所反應的抗原上的一個位點。B細胞表位可由因為蛋白質三級摺疊而相鄰的連續胺基酸或不連續胺基酸所形成。由連續胺基酸所形成的表位通常維持暴露於變性溶劑，而由三級摺疊所形成的表位通常在以變性溶劑處理後喪失。表位於特有空間構形內通常包括至少3個，且一般更包括至少5個或8-10個胺基酸。
修飾-輔助分析(MAP)，亦已知為以抗原結構為基礎的抗體分析(ASAP)是一種將針對相同抗原的大量單株抗體(mAb)依據各個抗體對經化學或酶促修飾之抗原表面的結合概況相似性予以分類的方法(US 2004/0101920，以其整體具體特定地併入本文做為參考資料)。每一個分類可反映獨特的表位是與另一類所代表的表位完全不同或部分重疊。這個技 術允許快速過濾出在遺傳學上相同的抗體，以使得特徵鑑定能夠著重在遺傳學上有所差異的抗體。當應用在融合瘤篩選時，MAP可加快鑑定出生產帶有所要特徵之mAb的罕見融合瘤株。MAP可用於將本發明抗體分選成結合不同表位的抗體群。
在某些具體例中，抗LAG3抗體或其抗原結合片段結合例示於LAG3之一或多個區域中任一者內的表位或其片段，不論是呈天然形式(如SEQ ID NO：582中所例示)或經重組生產(如SEQ ID NO：574中所例示)。在一些具體例中，本發明抗體結合至胞外區，其包含選自由LAG3之胺基酸殘基49-450組成之群的一或多個胺基酸。在一些具體例中，本發明抗體結合至胞外區，其包含選自由石蟹獼猴LAG3之胺基酸殘基1-533組成之群的一或多個胺基酸，如SEQ ID NO：576所例示。
在某些具體例中，本發明包括抗LAG3抗體及其抗原結合片段，其與LAG3之胞外區(SEQ ID NO：588)內的一或多個表位交互作用。該(等)表位可由一或多個座落於LAG3之胞外區內的3或更多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個)胺基酸單一連續序列組成。或者，表位可由數個座落於LAG3之胞外區內的非連續胺基酸(或胺基酸序列)組成。如本文實例18中所示，本發明例示性抗體H4sH15482P所交互作用的LAG3表位是由胺基酸序列LRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY(SEQ ID NO：589)所界定，其對應於SEQ ID NO：588的胺基酸28至71。因此，本發明包括與SEQ ID NO：588之胺基酸28至71組成之區(亦即序列LRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY[SEQ ID NO：589])內所含的一或多個胺基酸交互作用的抗LAG3抗體。
本發明包括結合至相同表位或表位之一部分的抗LAG3抗體，如表1中本文所述的任一特異性例示性抗體，或具有表1中所述例示性 抗體任一者之CDR序列的抗體。同樣地，本發明也包括與表1中本文所述任一特異性例示性抗體競爭結合至LAG3或LAG3片段的抗LAG3抗體，或具有表1中所述任一例示性抗體之CDR序列的抗體。例如，本發明包括與本文實例4中所定義的一或多個抗體(例如H4sH15482P、H4sH15479P、H4sH14813N、H4H14813N、H4H15479P、H4H15482P、H4H15483P、H4sH15498P、H4H15498P、H4H17828P2、H4H17819P與H4H17823P)交叉競爭結合至LAG3的抗LAG3抗體。
吾人可容易地藉由使用技藝中已知的慣常方法決定一個抗體是否會與參考抗LAG3抗體結合至相同的表位，或與參考抗LAG3抗體競爭結合。例如，為決定一個測試抗體是否會與本發明參考抗LAG3抗體結合至相同的表位，容許該參考抗體在飽合條件下結合至LAG3蛋白或肽。接著，評估測試抗體結合至LAG3分子的能力。若測試抗體能夠在參考抗LAG3抗體飽合結合之後結合至LAG3蛋白，則可推論該測試抗體結合至與參考抗LAG3抗體不同的表位。另一方面，若測試抗體無法在參考抗LAG3抗體飽合結合之後結合至LAG3蛋白，則該測試抗體可能結合至與本發明參考抗LAG3抗體所結合之表位相同的表位。
為決定一個抗體是否與參考抗LAG3抗體競爭結合，以兩個方面來進行上述結合方法學：在第一個方面，容許參考抗體在飽和條件下結合至LAG3蛋白，繼而評估測試抗體對LAG3分子的結合。在第二個方面，容許測試抗體在飽和條件下結合至LAG3分子，繼而評估參考抗體對LAG3分子的結合。若在兩個方面中，僅有第一(飽和)抗體能夠結合至LAG3分子，則推斷測試抗體與參考抗體競爭結合至LAG3。如技藝中具有通常技術者所了解，與參考抗體競爭結合之抗體不必然會結合至與參考抗體相同的表位，但可能會在空間上藉由結合重疊或相鄰表位來阻斷參考抗體的結合。
若兩個抗體競爭性地抑制(阻斷)另一者結合至抗原，則它們 結合至相同或重疊表位。亦即，如在一個競爭性結合分析中測量一個過量1-、5-、10-、20-或100-倍的抗體抑制另一個抗體結合達至少50%，但較佳75%、90%或甚至99%(參見，例如Junghans et al.,Cancer Res.1990：50：1495-1502)。或者，若基本上在抗原中會減少或消除某個抗體結合的所有胺基酸突變也會減少或消除另一個抗體結合，則兩個抗體具有相同表位。若會減少或消除抗體結合的一些胺基酸突變也會減少或消除另一個抗體結合，則兩個抗體被視為具有重疊的表位。
接而可進行其他慣常實驗(例如肽突變與結合分析)以確認觀察測試抗體沒有觀察到結合實際上是因為結合至與參考抗體相同的表位，或若沒有觀察到結合是因為其空間阻礙(或另一現象)。這類實驗可使用ELISA、RIA、表面電漿共振、流式細胞測量分析或技藝中可供使用的其他任何定量或定性抗體-結合分析來進行。
免疫接合物
本發明含括接合至一治療部分(「免疫接合物」)(諸如治療癌症的細胞毒素或化療劑)的人類抗LAG3單株抗體。如本文所用，術語「免疫接合物」意指在化學或生物學上連接至細胞毒素、放射活性劑、細胞介素、干擾素、目標或報導子部分、酶、毒素、肽或蛋白質或治療劑的抗體。抗體可在沿著分子的任一個位置連結至細胞毒素、放射活性劑、細胞介素、干擾素、目標或報導子部分、酶、毒素、肽或治療劑，只要能夠結合至其目標即可。免疫接合物的實例包括抗體藥物接合物與抗體-毒素融合蛋白。在一個具體例中，藥劑可為針對LAG3的第二種不同抗體。在某些具體例中，抗體可接合至對遭病毒感染細胞具特異性的藥劑。可接合至抗LAG3抗體的治療部類型要考量待治療病況與所要達到的治療效果。用以形成免疫接合物的適當藥劑的實例為技藝中已知的；參見例如WO 05/103081。
多特異性抗體
本發明的抗體可以是單特異性、雙特異性或多特異性。多特異性抗體可以是對一個目標多肽的不同表位具特異性或者可能含有對超過一個目標多肽具特異性的抗原-結合域。參見例如Tutt et al.,1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer et al.,2004,Trends Biotechnol.22：238-244。
在一個態樣中，本發明包括多特異性抗原結合分子或其抗原結合片段，其中免疫球蛋白的一個特異性是對LAG3的胞外域或其片段具有特異性，而免疫球蛋白的另一個特異性是對LAG胞外域以外的結合，或第二治療目標具有特異性，或接合至一個治療部分。
本發明多特異性抗原結合分子或其變異體的任一者可使用標準分子生物學技術(例如重組DNA與蛋白質表現技術)，以及技藝中具有通常知識人士熟知者來建構。
在一些具體例中，LAG3特異性抗體以雙特異性形式(「雙特異性」)生成，其中結合至LAG3的個別結構域的可變區連結在一起以在單一結合分子中賦予雙重結構域特異性。透過增加特異性及結合性，經適當設計的雙特異性可增強整體LAG3抑制效力。對個別結構域(例如N端結構域的節段)具特異性之可變區或可結合至一個結構域中不同區域的可變區可在容許每一區域同時結合至個別表位或一個結構域中不同區域之結構骨架上配對。在雙特異性的一個實例中，對一個結構域具特異性之連結子的重鏈可變區(VH)與對第二結構域具特異性之一系列連結子之輕鏈可變區(VL)經重組以鑑別出可與原有VH配對卻不會破壞VH原有特異性的非同源VL夥伴。以這個方式，單一VL節段(例如VL1)可與兩個不同VH域(例如VH1與VH2)組合而產生具有兩個結合「臂」(VH1-VL1和VH2-VL1)的雙特異性。使用單一VL節段會降低系統複雜度並從而簡化與增加用來產生雙特異性之選殖、表現與純化程序的效率(參見，例如USSN13/022759和US2010/0331527)。
或者，結合超過一個結構域以及第二目標(諸如，但不限於 例如第二個不同的抗LAG3抗體)的抗體可呈雙特異性形式使用本文所述技術，或習於技藝者熟知的其他技術來製備。結合至特定區域之抗體可變區可與結合至例如LAG3胞外域上的相關位點之可變區域連結在一起，以在單一結合分子中賦予雙重抗原特異性。具有這個性質之經適當設計的雙特異性充作雙重功能。對胞外域具特異性的可變區與對胞外域以外具特異性的可變區組合在一起並且在容許各個可變區結合至個別抗原的結構骨架上配對。
可以使用於本發明上下文的例示性雙特異性抗體形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3域以及第二Ig CH3域，其中第一與第二Ig CH3域因為至少一個胺基酸而彼此不同，以及其中與缺少該胺基酸差異的雙特異性抗體相較之下，至少一個胺基酸差異會減少該雙特異性抗體結合至蛋白質A。在一個具體例中，該第一Ig CH3域結合蛋白質A而該第二Ig CH3域含有一個會減低或消除蛋白質A結合的突變，諸如H95R修飾(按照IMGT外顯子編號；按照EU編號為H435R)。該第二CH3可進一步包含有Y96F修飾(按照IMGT；按照EU為Y436F)。可以在第二CH3中發現到的更多修飾包括：在IgG1抗體的情況下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(按照IMGT；按照EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I)；在IgG2抗體的情況下，N44S、K52N以及V82I(IMGT；按照EU為N384S、K392N以及V422I)；以及在IgG4抗體的情況下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(按照IMGT；按照EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。上述雙特異性抗體形式的變異在本發明範圍中是可預想的。
可用於本發明上下文中的其他例示性雙特異性形式包括，但不限於例如，以scFv為基礎或雙抗體雙特異性形式、IgG-scFv融合物、雙重可變域(DVD)-Ig、四價體瘤、洞中紐、共用輕鏈(例如帶有洞中鈕的共有 輕鏈等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)體、白胺酸拉鍊、Duobody、IgG1/IgG2、雙重作用Fab(DAF)-IgG，以及Mab2雙特異性形式(關於前面形式的回顧參見，例如Klein et al.2012,mAbs 4：6,1-11與其中引用的參考文獻)。雙特異性抗體也可以使用肽/核酸接合來建構，例如其中帶有直角化學反應性的非天然胺基酸被用來生成位點特異性抗體-寡核苷酸接合物，其之後自我組裝成具有限定組成、價數與幾何學的多聚體複合體(參見，例如Kazane et al.,J.Am.Chem.Soc.[Epub：Dec.4,2012])。
治療性投藥以及調配物
本發明提供包含有本發明之抗LAG3抗體或其抗原結合片段的治療組合物。本發明的治療組合物可與適當載劑、賦形劑以及其他併入調配物中以提供改善輸送、遞送、耐受性以及類似者的藥劑一起投予。可以在對於藥學化學家來說為熟悉的處方書中找到大量適當調配物：Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。這些調配物包括，例如粉末、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含有囊泡的脂質(陽離子性或陰離子性)(諸如LIPOFECTINTM)、DNA接合物、無水吸收糊劑、水包油與油包水乳劑、乳劑卡波蠟(具有各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠以及含有卡波蠟的半固體混合物。亦參見Powell et al.”Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
抗體劑量可以視待投予個體的年齡與身材、目標疾病、病況、投藥途徑以及類似因素而改變。當本發明的抗體用於在成人患者體內治療疾病或病症，或用於預防此一疾病時，通常以約0.1至約60mg/kg體重、更佳約5至約60、約20至約50、約10至約50、約1至約10或約0.8至11mg/kg體重的單一劑量投予本發明抗體是有益的。可以視病況的嚴重性調整治療頻率以及持續時間。在某些具體例中，本發明抗體或其抗原結合片段可以 至少約0.1mg至約800mg、約1至約500mg、約5至約300mg，或約10至約200mg、至約100mg，或至約50mg的起始劑量投予。在某些具體例中，起始劑量接著投予第二或數個數量可大約相同或少於起始劑量之後續劑量的抗體或其抗原結合片段，其中後續劑量間隔達至少1天至3天；至少一週、至少2週；至少3週；至少4週；至少5週；至少6週；至少7週；至少8週；至少9週；至少10週；至少12週；或至少14週。
已知有各種不同的遞送系統並且可用於投予本發明的醫藥組合物，例如封裝在脂質體、微粒、微膠囊內、能夠表現突變病毒的重組型細胞、受體媒介的胞吞作用(參見，例如Wu et al.,1987,J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入的方法包括，但不限於皮內、穿皮、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上以及經口途徑。組合物可以藉由任何習知途徑來投予，例如藉由輸注或團注、藉由透過上皮或黏膜內襯(例如口腔黏膜、直腸以及小腸黏膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起投予。投藥可以是全身性或局部的。醫藥組合物亦可在囊泡中被遞送，尤其是在脂質體中(參見，例如Langer(1990)Science 249：1527-1533)。
在本文中亦預期使用奈米顆粒遞送本發明抗體。接合抗體的奈米顆粒可用於治療及診斷用途。接合抗體的奈米顆粒及製備與使用方法詳細描述於Arruebo,M.,et al.2009(”Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications”in J.Nanomat.Volume 2009,Article ID 439389,24 pages,doi：10.1155/2009/439389)中，其併入本文做為參考資料。可生成奈米顆粒並接合至包含於醫藥組合物中的抗體以靶定腫瘤細胞或自體免疫組織或遭病毒感染的細胞。用於藥物投遞的奈米顆粒也已描述於例如US 8257740或US 8246995中，各自以其整體併入本文。
在某些情況下，醫藥組合物可以控制釋放系統的方式被投遞。在一個具體例中，可使用泵。在另一具體例中，可使用聚合材料。在 又另一個具體例中，控制釋放系統可被置放在鄰近組合物之目標處，因此僅需要全身性劑量的一部分。
可注射製品可包括用於靜脈內、皮下、皮內、顱內、腹膜內及肌肉內注射、點滴輸注等的劑型。此等可注射製品可依照公知方法製備。例如，可注射製品可例如，藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於習知用於注射的無菌水性介質或油性介質中來製備。有關用於注射的水性介質，例如有生理食鹽水、含有葡萄糖與其他助劑的等張溶液等，其可與適當助溶劑(諸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性界面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化菎麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等組合使用。有關油性介質，採用例如芝麻油、大豆油等，其可與助溶劑(諸如安息酸苯甲酯、苯甲醇等)組合使用。由此製備的注射劑較佳地被填充於適當安瓿中。
本發明的醫藥組合物可以使用標準注射針與注射器來皮下或靜脈內遞送。此外，關於皮下遞送，筆型遞送裝置很容易應用於遞送本發明的醫藥組合物。這樣的一種筆型遞送裝置可以是重複使用型或拋棄型。重複使用型筆型遞送裝置通常使用含有醫藥組合物的可換式藥匣。在藥匣內的所有醫藥組合物被投藥且藥匣空了之後，空藥匣可輕易丟棄並且取代為含有醫藥組合物的新藥匣。那麼就可以重複使用筆型遞送裝置。就拋棄式筆型遞送裝置來說，沒有可換式藥匣。更確切地來說，拋棄式筆型遞送裝置在裝置的貯器內預先填充醫藥組合物供選購。一旦貯器沒有了醫藥組合物，就丟棄整個裝置。
許多可重複使用的筆型以及自動注射遞送裝置在皮下遞送本發明之醫藥組合物方面有實用性。實例包括，但絕對不限定於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN 70/30TM筆(Eli Lilly and Co.,Indianapois,IN)、NOVOPENTM I、II與III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(Sanofi-Avetis,Frankfurt,Germany)，僅舉幾個為例。在皮下投遞本發明之醫藥組合物方面有實用性的拋棄式筆型遞送裝置的實例包括，但絕對不限於SOLOSTARTM筆(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)以及HUMIRATM筆(Abbott Labs,Abbott Park IL)，僅舉幾個為例。
有利地，上述供口服或非經腸使用的醫藥組合物被製備為呈適於活性成分投藥之單位劑量的劑型。此等呈單位劑量之劑型包括，例如錠劑、丸劑、囊劑、注射劑(安瓿)、栓劑等。在1個單位劑量中，所含抗體量通常為每劑型約5至約500mg；尤其是呈注射劑形式，就其他劑型而言較佳含有約5至約100mg以及約10至約250mg抗體。
抗體的治療用途
本發明抗體尤其可用於治療、預防及/或改善任何與LAG3表現、信號傳遞或活性有關、或受到LAG3表現、信號傳遞或活性所媒介，或可透過阻斷LAG3與LAG3配體第II型MHC之間交互作用或以其他方式抑制LAG3活性及/或信號傳導而治療的疾病或病症。例如，本發明提供透過向有需要治療的患者投予如本文所述LAG3抗體(或包含抗LAG3抗體之醫藥組合物)用以治療癌症(腫瘤生長抑制)及/或病毒感染的方法，以及用於治療癌症(腫瘤生長抑制)及/或病毒感染的抗LAG3抗體(或包含抗LAG3抗體之醫藥組合物)。本發明抗體可用於治療、預防及/或改善諸如癌症或病毒感染之 疾病或病症，及/或用於改善與此疾病、病症或病況有關的至少一個症狀。在本文所述治療方法的上下文中，抗LAG3抗體可以作為單一療法(亦即作為唯一的治療劑)或與一或多種額外治療劑組合(其實例描述於本文他處)投予。
在本發明的一些具體例中，本文所述抗體可用於治療罹患原發性或復發性癌症的個體，癌症包括但不限於，血癌、腦癌(例如多形性神經膠質母細胞瘤)、腎細胞癌(例如腎透明細胞癌)、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌(例如三陰性乳癌)、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌，頭部和頸部的鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤與黑色素瘤。
如本文所用，術語「血癌」包括血液惡性病，其影響血液、骨髓、淋巴或淋巴系統。正因如此，該術語包括來自淋巴樣與骨髓樣細胞譜系之細胞的惡性病。骨髓樣細胞株通常產生顆粒球、紅血球、巨噬細胞和肥大細胞；淋巴樣細胞株產生B細胞、T細胞，NK細胞和漿細胞。因此，該術語包括上述細胞的惡性病，即淋巴瘤、骨髓瘤、淋巴性白血病和骨髓性白血病。實例包括，但不限於急性淋巴母細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、急性單核球白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(例如B細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤)，和骨髓瘤(包括多發性骨髓瘤)。
可以使用抗體來治療癌症的早期或晚期症狀。在一個具體例中，本發明抗體或其片段可用來治療晚期或轉移性癌症。該等抗體可用於減少或抑制或縮減實體瘤和血癌的腫瘤生長。在某些具體例中，使用本發明抗體或其抗原結合片段治療會在個體的腫瘤中導致超過40%的消退、超過50%的消退、超過60%的消退、超過70%的消退、超過80%的消退。在某些具體例中，該等抗體可用於防止腫瘤復發。在某些具體例中，抗體可用於在癌症個體中延長無進展存活或整體存活。在一些具體例中，抗體可用 於在罹患癌症的患者中降低因為化學療法或放射線療法所引起的毒性，同時維持長期存活。
在某些具體例中，個體是罹患癌症的患者，且其：‧先前未曾接受過使用抗PD-1/PD-L1的療法，但為接受基於抗PD-1療法的適當候選者；及/或‧先前已接受過基於抗PD-1/PD-L1的療法，且對抗PD-1/PD-L1療法治療具有經確認的目標反應(CR或PR)或SD歷時至少3個月但之後持續療法，或具有SD或PR為最佳反應且之後反應穩定歷時6個月；及/或‧不是標準療法的候選者，或對他們來說，預期沒有可用的療法來傳達臨床益處，且適合mAb1單一療法；及/或‧正遭受抗PD-1/PD-L1未經歷IIIB期或第IV期NSCLC，沒有針對轉移性疾病的先前療法或在一次含鉑方案之後有疾病進展/復發；及/或‧正遭受抗PD-1/PD-L1經歷的第IIIB期或第IV期NSCLC，其中對轉移性疾病來說沒有超過2次的先前療法；及/或‧正遭受抗PD-1/PD-L1未經歷晚期或轉移性ccRCC，具有透明細胞組成，其先前已接受1至2次抗血管生成療法方案；及/或‧正遭受抗PD-1/PD-L1經歷*晚期或轉移性ccRCC，具有透明細胞組成，其先前已接受1至2次抗血管生成療法方案；及/或‧正遭受抗PD-1/PD-L1未經歷轉移性TNBC(雌激素、孕酮，和人類表皮生長因子受體2陰性)，其先前已接受過5次或更少次療法；及/或 ‧正遭受抗PD-1/PD-1未經歷晚期或轉移性黑色素瘤，其就轉移性疾病接受過不超過2次的先前方案；及/或‧正遭受抗PD-1/PD-L1經歷晚期或轉移性黑色素瘤，其就轉移性疾病接受過不超過2次的先前方案；及/或‧正遭受抗PD-1/PD-L1未經歷復發性/難治性DLBCL，其之後有所進展或不能作為自體幹細胞移植的候選者；及/或‧正遭受抗PD-1/PD-L1經歷*復發性/難治性DLBCL，其之後有所進展或不能作為自體幹細胞移植的候選者。
在某些具體例中，本發明抗體可用於治療患有慢性病毒感染的個體。在一些具體例中，本發明抗體可用於在宿主體內降低病毒滴度及/或挽救耗盡的T細胞。在某些具體例中，本發明抗體或其片段可用來治療由淋巴球脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)引起的慢性病毒感染。在一些具體例中，本發明抗體或其抗原結合片段可呈某個治療劑量投予給具有由人類免疫缺乏病毒(HIV)或人類乳頭狀瘤病毒(HPV)或B/C型肝炎病毒(HBV/HCV)引起之感染的患者。在一個相關具體例中，本發明抗體或其抗原結合片段可透過猿免疫缺乏病毒(SIV)在猿個體(諸如石蟹獼猴)中治療感染。
在某些具體例中，本發明阻斷抗體可呈治療有效量投予給罹患癌症或病毒感染的個體。
可投予本發明的一或多個抗體以緩解或防止或減少疾病或病症之一種或多種症狀或病況的嚴重性。
在此還預期，對處於長成疾病或病症(諸如癌症與病毒感染)風險下的患者預防性地使用本發明的一或多種抗體。
在本發明的又一個具體例中，本發明抗體可用於製備醫藥組合物以供治療罹患癌症或病毒感染的患者。在本發明的另一個具體例中，本發明抗體作輔助療法與本技藝中具有通常技術者已知用於治療癌症 或病毒感染的任何其他藥劑或任何其他療法一起使用。
組合療法以及調配物
組合療法可包括本發明抗LAG3抗體及可與本發明抗體或與本發明抗體的生物活性片段有利組合的任一種額外治療劑。
本發明抗體可與一或多種用來治療或抑制癌症的抗癌藥物或療法協同組合，癌症包括例如血癌、腦癌(例如多形性神經膠質母細胞瘤)、腎細胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭部和頸部的鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤與黑色素瘤。本文預期，使用本發明的抗LAG3抗體組合免疫刺激性及/或免疫支持性療法來抑制腫瘤生長，及/或提高患者的存活。免疫刺激性療法包括直接免疫刺激性療法，透過對受壓抑的免疫細胞「鬆開煞車」或「踩油門」來活化免疫反應以放大疫細胞活性。實例包括靶定其他檢查點受體、疫苗接種和佐劑。免疫支持性措施可透過促進免疫原性細胞死亡、發炎或促進抗腫瘤免疫反應的其他間接效用來增加抗原性。實例包括放射線、化療、抗血管生成劑，和外科手術。
在各種具體例中，一或多個本發明抗體可組合下列來使用：PD-1抑制劑(例如抗PD-1抗體，諸如納武單抗、派姆單抗(pembrolizumab)、匹地珠單抗(pidilizumab)、BGB-A317或REGN2810)、PD-L1抑制劑(例如抗PD-L1抗體，諸如阿維如單抗(avelumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、MDX-1105，或REGN3504)、CTLA-4抑制劑(例如易普利單抗)、TIM3抑制劑、BTLA抑制劑、TIGIT抑制劑、CD47抑制劑、GITR抑制劑、另一個T細胞共抑制分子或配體的拮抗劑(例如針對CD-28、2B4、LY108、LAIR1、ICOS、CD160或VISTA的抗體)、吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑、血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑[例如「VEGF-Trap」，如阿柏西普或如US 7,087,411中所述的其他的VEGF抑制 融合蛋白，或抗VEGF體或其抗原結合片段(例如貝伐珠單抗(bevacizumab)或蘭尼單抗(ranibizumab))或VEGF受體的小分子激酶抑制劑(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib)]、Ang2抑制劑(例如耐斯伐庫單抗(nesvacumab))、轉形生長因子β(TGFβ)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑(例如埃羅替尼(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab))、CD20抑制劑(例如抗CD20抗體，諸如利妥昔單抗(rituximab))、腫瘤特異性抗原的抗體[抗原為例如CA9、CA125、黑色素瘤相關抗原3(MAGE3)、癌胚抗原(CEA)、波形蛋白、腫瘤M2-PK、前列腺特異性抗原(PSA)、黏蛋白-1、MART-1，和CA19-9]、疫苗(例如卡介苗、癌症疫苗)，增加抗原呈遞的佐劑(例如顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子)、雙特異性抗體(例如CD3xCD20雙特異性抗體，或PSMAxCD3雙特異性抗體)、細胞毒素、化學治療劑(例如達卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺、環磷醯胺、多西紫杉醇、多柔比星、道諾黴素、順鉑、卡鉑、吉西他濱、甲胺蝶呤、米托蒽醌、奧沙利鉑，太平洋紫杉醇和長春新鹼)、環磷醯胺、放射線療法、IL-6R抑制劑(例如撒立魯單抗(sarilumab))、IL-4R抑制劑(例如杜匹單抗(dupilumab))、IL-10抑制劑、細胞介素(諸如IL-2、IL-7、IL-21，和IL-15)、抗體-藥物接合物(ADC)(例如抗CD19-DM4 ADC，和抗DS6-DM4 ADC)、消炎藥(例如皮質類固醇和非類固醇消炎藥)、膳食補充劑(諸如抗氧化劑或任何其他療法照護以治療癌症)。在某些具體例中，本發明抗LAG3抗體可與癌症疫苗(包括樹突狀細胞疫苗、溶瘤病毒、腫瘤細胞等)組合使用以放大抗腫瘤反應。可與本發明抗LAG3抗體組合使用的癌症疫苗的實例包括黑色素瘤與膀胱癌用的MAGE3疫苗、乳癌用的MUC1疫苗、腦癌(包括多形性神經膠質母細胞瘤)用的EGFRv3(例如林多沛姆(Rindopepimut))，或ALVAC-CEA(用於CEA+癌症)。
在某些具體例中，本發明抗LAG3抗體可在方法中組合放射線療法一起投予，以產生長期耐久的抗腫瘤反應及/或提高癌症患者的存 活。在一些具體例中，本發明抗LAG3抗體可以在施用放射線療法之前，同時或之後被投予給癌症患者。例如，放射線療法可呈一或多個劑量被投予至腫瘤病灶，然後投予一或多個劑量的本發明抗LAG3抗體。在一些具體例中，放射線療法可以局部施加至腫瘤病灶，以提高患者腫瘤的局部免疫原性(輔助性放射線)及/或殺死腫瘤細胞(消融放射線)，接著全身性投予本發明抗LAG3抗體。例如，顱內放射線可施加至腦癌患者(例如多形性神經膠質母細胞瘤)組合全身性投予本發明抗LAG3抗體。在某些具體例中，本發明抗LAG3抗體可與放射線療法及化學治療劑(例如替莫唑胺)或VEGF拮抗劑(例如阿柏西普)組合投予。
在某些具體例中，本發明抗LAG3抗體可組合一或多種抗病毒藥物一起投予，以治療由LCMV、HIV、HPV、HBV或HCV所引起的慢性病毒感染。抗病毒藥物的實例包括，但不限於於齊多夫定、拉米夫定、阿巴卡韋、利巴韋林、洛匹那韋、依非韋倫、科比司他、替諾福韋、利匹韋林和皮質類固醇。
額外治療活性劑/組分可在投予本發明抗LAG3抗體之前、同時或之後被投予。為本揭示內容之目的，此等投予方案被視為是抗LAG3抗體與第二治療活性組分組合投予。
額外治療活性組分可在投予本發明抗LAG3抗體之前被投予給個體。例如，若第一組分在投予第二組分1週前、72小時前、60小時前、48小時前、36小時前、24小時前、12小時前、6小時前、5小時前、4小時前、3小時前、2小時前、1小時前、30分鐘前、15分鐘前、10分鐘前、5分鐘前或少於1分鐘前被投予，則第一組分被視為是在第二組分「之前」投予。在其他具體例中，額外治療活性組分可在投予本發明抗LAG3抗體之後被投予給個體。例如，若第一組分在投予第二組分1分鐘後、5分鐘後、10分鐘後、15分鐘後、30分鐘後、1小時後、2小時後、3小時後、4小時後、5小時後、 6小時後、12小時後、24小時後、36小時後、48小時後、60小時後、72小時後被投予，則第一組分被視為是在第二組分「之後」投予。在又其他具體例中，額外治療活性組分可與本發明抗LAG3抗體同時被投予給個體。為本發明之目的，「同時」投予包括例如以單一劑型(例如共調配)或彼此在約30分鐘或更少時間內以個別劑型向個體投予抗LAG3抗體及額外治療活性組分，若以個別劑型投予時，每一劑型可經由相同路徑投予(例如抗LAG3抗體與額外治療活性組分可靜脈內、皮下等被投予)；或者，各個劑型可經由不同路徑投予(例如抗LAG3抗體可經靜脈內投予，而額外治療活性組分可經皮下投予)。在任一種情況下，為本揭示內容之目的，呈單一劑型、呈個別劑型以相同路徑，或呈個別劑型以不同路徑投予組分被認為是「同時投予」。為本揭示內容之目的，在投予額外治療活性成分「之前」、「同時」或「之後」(如同上文所定義的彼等術語)投予抗LAG3抗體被視為抗LAG3抗體與額外治療活性組分「組合」投予。
本發明包括醫藥組合物，其中本發明抗LAG3抗體與一或多種本文他處所述之額外治療活性組分使用各種劑量組合共調配。
在本發明抗LAG3抗體與PD-1抑制劑(例如抗PD-1抗體，如US 2015/0203579中所揭示，以其整體併入本文做為參考資料)組合投予的例示性具體例(包括投予包含抗LAG3抗體與PD-1抑制劑之共調配物)中，個別組分可使用不同劑量組合被投予給個體及/或共調配。因此，本發明包括(i)本發明抗LAG3抗體，以及(ii)PD-1抑制劑(例如抗PD-1抗體，如US 2015/0203579中所揭示，以其整體併入本文做為參考資料)的組合，用於同時、分開及/或依序用來治療癌症或病毒感染。例如，抗LAG3抗體與PD-1抑制劑(例如抗PD-1抗體)各自可呈選自下列組成之群的數量被投予給個體及/或被包含在一個共調配物中：0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、 0.9mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg與10.0mg。該等組合/共調配物可依據本文他處揭示之任一種投予方案被投予給個體，包括例如一週兩次、每週一次、每2週一次、每3週一次、每月一次、每2個月一次、每3個月一次、每4個月一次、每5個月一次、每6個月一次等。舉例而言，本發明抗LAG3抗體可呈約0.8至約11、約1至約10、約3至約10、約3或約10mg/kg與呈3至5，或約3.0mg/kg劑量的PD-1抑制劑(例如抗PD-1抗體，如US 2015/0203579中所揭示)同時投予。同時投予可能例如每14天、每21天或每28天發生。
在本發明抗LAG3抗體與VEGF拮抗劑(例如VEGF trap，諸如阿柏西普)組合投予的例示性具體例(包括投予包含抗LAG3抗體與VEGF拮抗劑之共調配物)中，個別組分可使用不同劑量組合被投予給個體及/或共調配。例如，抗-PD-1抗體可呈選自下列組成之群的數量被投予給個體及/或被包含在一個共調配物中：0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg與10.0mg；而VEGF拮抗劑(例如VEGF trap，諸如阿柏西普)可呈選自下列組成之群的數量被投予給個體及/或被包含在一個共調配物中：0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg與3.0mg。該等組合/共調配物可依據本文他處揭示之任一種投予方案被投予給個體，包括例如一週兩次、每週一次、每2週一次、每3週一次、每月一次、每2個月一次、每3個月一次、每4個月一次、每5個月一次、每6個月一次等。
投藥方案
依據本發明的某些具體例，多劑量之抗LAG3抗體(或包含抗LAG3抗體與本文所提及任一額外治療活性劑之組合的醫藥組合物)可在一段限定時間裡被投予給個體。依據本發明此態樣的方法包含依序將多劑量之本發明抗LAG3抗體投予給個體。如本文所用，「依序投予」表示各劑量的抗LAG3抗體在不同時間點被投予給個體，例如在由預定間隔(例如數小時、數天、數週或數月)所分開的不同天。本發明包括含有將單一起始劑量之抗LAG3抗體，接而為一或多個第二劑量的抗LAG3抗體，以及視情況一或多個第三劑量的抗LAG3抗體依序投予給患者的方法。抗LAG3抗體可以介於0.1mg/kg至100mg/kg個體體重的劑量投予。
術語「起始劑量」、「第二劑量」及「第三劑量」意指投予本發明抗LAG3抗體的時間順序。因此，「起始劑量」是在治療方案開始時被投予的劑量(亦意指為「基線劑量」)；「第二劑量」是在起始劑量之後被投予的劑量；而「第三劑量」是在第二劑量之後被投予的劑量。起始劑量、第二劑量與第三劑量可全都含有相同數量之抗LAG3抗體，但通常會在投予頻率彼此有所不同。但是，在某些具體例中，起始劑量、第二劑量及/或第三劑量中所含有之抗LAG3抗體數量將會在治療過程期間彼此改變(例如調高或調低，若需要的話)。在某些具體例中，兩個或更多個(例如2、3、4或5個)劑量在治療方案開始時被投予作為「加載劑量」，接著以較不頻繁的方式投予後續劑量(例如「維持劑量」)。
在某些具體例中，初始劑量、第二劑量及/或第三劑量中所含的抗LAG3抗體數量可能是次佳或次治療性的。如本文所用，術語「次治療性」或「次佳」意指投予位準低到無法產生治療效用或低於治療疾病(諸如癌症)所需位準的抗體劑量。
在本發明的某些例示性具體例中，各個第二劑量及/或第三劑量在緊接先前劑量之後1至26(例如1、1½、2、2½、3、3½、4、4½、5、 5½、6、6½、7、7½、8、8½、9、9½、10、10½、11、11½、12、12½、13、13½、14、14½、15、15½、16、16½、17、17½、18、18½、19、19½、20、20½、21、21½、22、22½、23、23½、24、24½、25、25½、26、26½或更多)週被投予。片語「緊接先前劑量」，如本文所用，表示以多次投予的順序，抗LAG3抗體劑量在順序上於下一個劑量投予之前被投予給患者且沒有任何其間的劑量。
依據本發明此態樣的方法可含有將任一數目的第二劑量及/或第三劑量抗LAG3抗體投予給患者。例如，在某些具體例中，僅有單一第二劑量被投予給患者。在其他具體例中，兩個或更多個(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多個)第二劑量被投予給患者。同樣地，在某些具體例中，僅有單一第三劑量被投予給患者。在其他具體例中，兩個或更多個(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多個)第三劑量被投予給患者。
在涉及多個第二劑量的具體例中，各個第二劑量可以與其他第二劑量相同的頻率被投予。例如，各個第二劑量可在緊接先前劑量之後1至2週或1至2個月被投予給患者。同樣地，在涉及多個第三劑量的具體例中，各個第三劑量可以與其他第三劑量相同的頻率被投予。例如，各個第三劑量可在緊接先前劑量之後2至12週被投予給患者。在本發明的某些具體例中，第二劑量及/或第三劑量投予給患者的頻率可能隨著治療方案過程而改變。投予頻率也可在治療過程期間由臨床醫師按照臨床檢驗依據個別患者的需要來予以調整。
抗體的診斷用途
本發明的抗LAG3抗體可用來偵測及/或測量樣品中的LAG3，例如供診斷目的。一些具體例預期於分析中使用一或多個本發明抗體來偵測諸如癌症、自體免疫疾病或病毒感染的疾病或病症。有關LAG3的例示性診斷分析可包含，例如使得自於某一位個體(例如患者)的樣品與本發 明之抗LAG3抗體接觸，其中抗LAG3抗體標定有可偵測標誌或報導子分子，或者用作為從個體樣品中選擇性分離LAG3的捕獲配體。或者，未標定的抗LAG3抗體可以組合本身可被偵測到標誌之二級抗體一起使用於診斷應用。可偵測到的標誌或報導子分子可以是放射性同位素，諸如3H、14C、32P、35S或125I；螢光或化學發光部分，諸如螢光素異氰酸酯或玫瑰紅；或諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶，或螢光素酶的酶。可用來偵測或測量樣品中的LAG3的特定例示性分析包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)以及螢光-活化細胞分選(FACS)。
依據本發明，可用於LAG3診斷分析中的樣品包括任何可得自於個體的組織或體液樣品，其在正常或病理學狀態下含有可偵測數量的LAG3蛋白或其片段。一般來說，測量LAG3在自健康患者(例如未罹患癌症或自體免疫疾病的患者)所得到之特定樣品中的含量以在開始時建立基線，或標準LAG3位準。LAG3的這個基線位準接而可以與得自被懷疑帶有癌症相關之病況、或與此病況相關之症狀的個體的樣品中所測得的LAG3位準來進行比對。
對LAG3具特異性的抗體可不含有額外標誌或部分，或它們可含有N端或C端標誌或部分。在一個具體例中，標誌或部分為生物素。在結合分析中，標誌(若有的話)的位置可決定肽在結合之後肽相對於表面的位向。例如，若表面包覆卵白素，則含有N端生物素的肽將被定向以使得該肽的C端部分與表面遠離。
本發明的態樣是有關於所揭示抗體做為在患者中預測癌症或病毒感染預後之標記的用途。本發明抗體可用於診斷分析中，以供在患者中評估癌症預後並且預測存活。
實例
提出以下實例，以便將如何製造與使用本發明方法和組合物之完整揭示內容以及說明提供給技藝中具有通常技術者，且不欲限制發明人就其發明所視為的範疇。已盡力確保所用數字(例如數量、溫度等)的準確度，但可能產生某些實驗誤差與偏差。除非另有指明，否則份為重量份，分子量為平均分子量，溫度為攝氏度，室溫為約25℃，而壓力為大氣壓或近大氣壓。
實例1：生成針對LAG3的人類抗體
使用偶合至小鼠Fc區的LAG3片段(GenBank登錄NP_002277.4範圍從約胺基酸29-450(SEQ ID NO：582))，生成針對LAG3的人類抗體。將免疫原與佐劑一起直接投予給VELOCIMMUNE®小鼠(亦即含有編碼人類免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈可變區之DNA的經改造小鼠)(如美國8502018 B2所述)，或者投予給人類化通用輕鏈(ULC)VelocImmune®小鼠(如WO 2013022782中所述)來刺激免疫反應。透過LAG3特異性免疫分析監控該抗體免疫反應。當達到所期望的免疫反應時，收取脾細胞並與小鼠骨髓瘤細胞融合以保持它們的生存力且形成融合瘤細胞株。融合瘤細胞株進行篩選和選擇，以鑑定出會生產LAG3特異性抗體的細胞株。使用這種技術以及上述使免疫原，得到數個抗LAG3嵌合抗體(亦即，具有人類可變域和小鼠恆定域的抗體)；以此方式從VELOCIMMUNE®小鼠生成的例示性抗體命名為H1M14985N、H1M14987N、H2M14811N、H2M14885N、H2M14926N、H2M14927N、H2M14931N、H2M18336N、H2M18337N以及H4H14813N。
如美國專利7,582,298(其整體內容併入本文做為參考資料)中所述，亦在不融合至骨髓瘤細胞的情況下直接由抗原-陽性小鼠B細胞(或是從經免疫小鼠)分離抗LAG3抗體。使用這個方法，得到數個完全人類抗LAG3抗體(亦即具有人類可變域與人類恆定域的抗體)；以此方式所生成的例示性抗體命名為：H4H15477P、H4H15483P、H4H15484P、H4H15491P、 H4H17823P、H4H17826P2、H4H17828P2、H4sH15460P、H4sH15462P、H4sH15463P、H4sH15464P、H4sH15466P、H4sH15467P、H4sH15470P、H4sH15475P、H4sH15479P、H4sH15480P、H4sH15482P、H4sH15488P、H4sH15496P2、H4sH15498P2、H4sH15505P2、H4sH15518P2、H4sH15523P2、H4sH15530P2、H4sH15555P2、H4sH15558P2、H4sH15567P2與H4H17819P。
從ULC Velocimmune®小鼠的B細胞產生例示性抗體H4sH15496P2、H4sH15498P2、H4sH15505P2、H4sH15518P2、H4sH15523P2、H4sH15530P2、H4sH15555P2、H4sH15558P2與H4sH15567P2。
依據本實例方法所生成的例示性抗體的生物特性詳細描述於下面的實例中。
實例2：重鏈與輕鏈可變區胺基酸序列以及核苷酸序列
表1列示選定之本發明抗LAG3抗體的重鏈與輕鏈可變區與CDR的胺基酸序列識別符號。對應核酸序列識別符號列於表2中。
Figure 105132298-A0202-12-0072-1
Figure 105132298-A0202-12-0073-2
Figure 105132298-A0202-12-0073-3
Figure 105132298-A0202-12-0074-4
Figure 105132298-A0202-12-0075-5
抗體在本文中通常以下列命名法來參照：Fc前綴(例如「H1M」、「H4sH」、「H4H」等)，接著是數字識別符號(例如表1中所示的「14813」、「17828」等)，然後為「P」、「P2」、或「N」字尾。因此，依據這個命名法，抗體在本文可參照為例如「H4sH14813N」、「H4H17819P」、「H4H17828P2」等。本文所用抗體命名的H4sH及H4H前綴指明抗體的特定Fc區同型。例如，「H4sH」抗體具有人類IgG4 Fc，有如US20140243504(以其整體併入本文)中所揭示之2個或更多個胺基酸變化，「H4H」抗體具有人類IgG4 Fc，其中樞紐區的絲胺酸突變成脯胺酸(S108P)，「H1M」抗體具有小鼠IgG1 Fc，而「H2M」抗體具有小鼠IgG2 Fc(所有可變區如抗體命名中的第一個「H」表示為完全人類)。如同技藝中具有通常技術者所理解，具有特定Fc同型的抗體可轉換成具有不同Fc同型的抗體(例如具有小鼠IgG1 Fc的抗體可轉換成具有人類IgG4的抗體等)，但在任何情況下，由表1中所示數字識別符號所指之可變域(包括CDR)維持相同，且對抗原的結合特性預期相同或實質上類似，而與Fc域特性無關。
在某些具體例中，具有小鼠IgG1 Fc的選定抗體轉換成具有人類IgG4 Fc的抗體。在某些具體例中，抗體包含人類IgG4 Fc，具有如US20100331527(以其整體併入本文)中所揭示之2個或更多個胺基酸變化。在一個具體例中，IgG4 Fc域在樞紐區中包含絲胺酸至脯胺酸突變(S108P)以促使二聚體穩定。在某些具體例中，本發明抗體的Fc區包含SEQ ID NO：569、570、571、572或573的胺基酸序列。表3列示具有人類IgG4 Fc之選定抗LAG3抗體的重鏈與輕鏈序列之胺基酸序列識別符號。
Figure 105132298-A0202-12-0075-6
Figure 105132298-A0202-12-0076-7
表3中的各個重鏈序列包含一個可變區(VH或HCVR；包含HCDR1、HCDR2與HCDR3)以及一個恆定區(包含CH1、CH2與CH3結構域)。表3中的各個輕鏈序列包含一個可變區(VL或LCVR；包含LCDR1、LCDR2與LCDR3)以及一個恆定區(CL)。SEQ ID NO：577包含含有胺基酸1-123的HCVR以及含有胺基酸124-449的恆定區。SEQ ID NO：578包含含有胺基酸1-107的LCVR以及含有胺基酸108-214的恆定區。SEQ ID NO：579包含含有胺基酸1-123的HCVR以及含有胺基酸124-450的恆定區。SEQ ID NO：580包含含有胺基酸1-119的HCVR以及含有胺基酸120-445的恆定區。SEQ ID NO：581包含含有胺基酸1-107的LCVR以及含有胺基酸108-214的恆定區。
在以下實例中使用的對照建構物
在下面實驗中納入兩個對照建構物(抗LAG3抗體)供比較用：「比較物1」，一個對抗LAG3的人類單株抗體，其具有如WO2010/019570之抗體「25F7」的VH/VL序列；以及「比較物2」，一個對抗LAG3的人類單株抗體，其具有如WO2014/0093511之抗體「v3.5」的VH/VL序列。
實例3：如藉由表面電漿共振測量之抗體對至LAG3的結合
抗原結合至經純化抗LAG3抗體的結合締合速率常數與解離速率常數(分別為k a與k d)、平衡解離常數與解離半衰期(分別為K D與t1/2)是使用即時表面電漿共振生物感測器分析於BiaCore 4000或BiaCore T200儀器上進行測定。以多株兔抗小鼠抗體(GE,# BR-1008-38)或以單株小鼠抗人類Fc抗體(GE,# BR-1008-39)衍生化的BiaCore感測器表面以捕獲約50-85RU 的抗LAG3單株抗體，其分別以小鼠Fc或人類Fc表現。針對結合至抗LAG3抗體所測試的LAG3試劑包括表現帶有C端myc-myc-六組胺酸標誌的重組型人類LAG3(hLAG3-mmh；SEQ ID：574)以及表現帶有C端小鼠IgG2a mFc標誌的重組型人類LAG3(hLAG3-mFc；SEQ ID：575)。在BiaCore T200上以50μL/min的流速注射不同濃度(50、25、12.5與6.25nM)的LAG3試劑通過抗LAG3單株抗體捕獲表面。監控LAG3試劑與經捕獲單株抗體的結合歷時4分鐘，同時在HBST運行緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20)中監控其自抗體解離歷時8分鐘。實驗在25℃與37℃下進行。動力學締合(k a)與解離(k d)速率常數是藉由使用Scrubber 2.0曲線擬合軟體處理並將數據擬合至1：1結合模型而被確定。接著由如下的動力學速率常數計算結合解離平衡常數(K D)與解離半衰期(t 1/2)：K D(M)=k d/k a；且t1/2(min)=[ln2/(60*k d )]。
在25℃與37℃下，不同抗LAG3單株抗體結合至單體LAG3試劑(標誌有mmH)或二聚體LAG3試劑(標誌有mFc)的結合動力學參數表列於表4-7中。
Figure 105132298-A0202-12-0077-8
Figure 105132298-A0202-12-0078-9
 *NB表示在實驗條件下，LAG3試劑不結合至經捕獲抗LAG3單株抗體
表4顯示在25℃下，所有本發明抗LAG3抗體以49pM至10nM的K D 值結合至hLAG3-mmh，而比較物以0.58nM與0.8nM的K D 值結合。
Figure 105132298-A0202-12-0078-10
 *NB表示在實驗條件下，LAG3試劑不結合至經捕獲抗LAG3單株抗體。
表5顯示在37℃下，所有本發明抗LAG3抗體以32pM至7.66nM的K D 值結合至hLAG3-mmh，而比較物以2.1nM與3.0nM的K D 值範圍結合。
表4與5中的數據指出，所有抗LAG3抗體在25℃與37℃下以非常相似的親和力結合至單體hLAG3-mmh。
Figure 105132298-A0202-12-0079-11
 *NB表示在實驗條件下，LAG3試劑不結合至經捕獲抗LAG3單株抗體。
表6顯示在25℃下，所有本發明抗LAG3抗體以4.3pM至1.0nM的K D 值範圍結合至hLAG3二聚體蛋白，而比較物以97nM與0.16nM的K D 值結合。
Figure 105132298-A0202-12-0080-12
 *NB表示在實驗條件下，LAG3試劑不結合至經捕獲抗LAG3單株抗體。
表7顯示在37℃下，所有本發明抗LAG3抗體以4.0pM至0.9nM的K D 值範圍結合至hLAG3二聚體蛋白，而比較物以0.26nM與0.45nM的K D 值結合。
表6與7中的數據指出，所有抗LAG3抗體在25℃與37℃下以非常相似的親和力結合至hLAG3二聚體試劑。
實例4：抗LAG3抗體之間的Octet交叉競爭
為了評估兩個抗體彼此是否會競爭結合至單體人類LAG3(hLAG3.mmh)，使用即時無標記生物層干擾計分析在Octet RED384生物感 測器(Pall ForteBio Corp.)上測定抗LAG3單株抗體之間的結合競爭。交叉結合實驗是在25℃下以1000rpm的盤震盪速度於0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.05% v/v Surfactant Tween-20、1mg/mL BSA(Octet HBS-P緩衝液)中進行。測試的所有抗LAG3抗體與hLAG3溶液調配於Octet HBS-P緩衝液中。為了評估2個抗體能否彼此競爭結合至hLAG3，先將約~0.6至0.85nm hLAG3.mmh捕獲於含有5μg/mL hLAG3之孔的經抗-His塗覆Octet生物感測器間湍上歷時75秒。hLAG3捕獲的Octet生物感測器尖端是藉由沒入至含有50μg/mL第一種抗LAG3單株抗體(稱為mAb-1)的孔中歷時5分鐘予以飽和，之後沒入含有第二種抗LAG3單株抗體(稱為mAb-2)的孔中。在每個步驟之間，於HBS-P緩衝液中洗滌Octet生物感測器尖端歷時30秒。
在實驗過程期間監測即時結合反應並且在每個步驟結束時紀錄結合反應。依據背景結合校正結合至mAb-1然後阻斷mAb之hLAG3的反應，進行比較並且決定不同抗Lag單株抗體之間的競爭性/非競爭性行為。
表8例示定義以兩個方向競爭的抗體關係，與結合順序無關。
Figure 105132298-A0202-12-0081-13
Figure 105132298-A0202-12-0082-28
 (*未列出自身競爭mAb2)
實例5：如藉由流式細胞儀測定之結合至過度表現LAG3之細胞的抗體
開發出表現重組型hLAG3(NCBI登錄號NP_002277.4)或猴LAG3(mfLAG3)[基於恆河猴序列NCBI登錄號XP_001108923.1(SEQ ID NO：576)，進一步修改石蟹獼猴序列NCBI登錄號XP_005570011.1，將胺基酸位置74處的「X」置換成脯胺酸]的HEK293細胞(HEK293；ATCC，#CRL-1573)穩定細胞株，並藉著流式細胞儀分析來測定本發明抗LAG3單株抗體的結合特異性。
如下評估抗LAG3抗體的結合：表現hLAG3或mfLAG3的穩定HEK293細胞用D-PBS(Irvine Scientific Cat# 9240)洗滌1x、用胰蛋白酶(Specialty Media Cat# SM-2004-C)處理，並且用HEK293細胞培養基(DME+10% FBS+P/S/G+非必需胺基酸)予以阻斷。離心後，細胞以2.0x106細胞/mL再懸浮於染色緩衝液(D-PBS+2% FBS)中。將抗LAG3抗體和同型對照連續稀釋在染色緩衝液中，劑量範圍從5pm至100nM，包括僅有緩衝液的無抗體對照。將經連續稀釋的抗體添加至細胞懸浮液，並在冰上培育15-30分鐘。將細胞離心並用染色緩衝液洗滌丸粒以去除未結合的抗體。接著，將細胞與識別人類Fc之別藻藍蛋白接合的第二F(ab')2(Jackson ImmunoResearch,# 109-136-170)一起在冰上培育15-30分鐘。將細胞離心並用染色緩衝液洗滌丸粒以去除未結合的二級F(ab')2，且以Cytofix(BD Biosciences,# 554655)和染色緩衝液的1：1稀釋液固定過夜。次日，將經固定的細胞離心、用染色緩衝液洗滌丸粒，再懸浮並過濾。在HyperCyt®細胞儀上取得螢光測量值並在ForeCytTM(IntelliCyt；Albuquerque，NM)中分析，以確定平均螢光強度(MFI)。使用GraphPad Prism，對11點反應曲線從四參數邏輯方程來計算EC50值。EC50定義為偵測到50%最大結合信號的抗體濃度。各抗體的MFI比是透過將抗體濃度100nM的MFI除以抗體濃度0nM的MFI來計算。
Figure 105132298-A0202-12-0083-16
如表9中所示，透過FACS分析，比較物和同型對照對親代野生型HEK293細胞沒有顯示出任何可測得的結合。計算出的MFI比範圍介 於1.0x和1.6x之間。一些抗LAG3抗體顯示對野生型細胞的比例較高，暗示有非特異性結合，其中計算出的MFI比介於0.9和8.2之間。在這些染色條件下，抗LAG3抗體以及比較物沒有決定出EC50值。
Figure 105132298-A0202-12-0084-17
如表10中所示，同型對照對HEK293/hLag3細胞沒有顯示出任何可測得的結合。本發明所有15個抗LAG3抗體顯示對HEK293/hLag3細胞有明顯結合，其中EC50值範圍從300pM至7.9nM。計算出的MFI比範圍從62x-414x不等。在結合分析中，比較物的EC50值為0.65nM和0.75nM，小於抗體200x。
Figure 105132298-A0202-12-0084-18
Figure 105132298-A0202-12-0085-19
如表11中所示，同型對照對HEK293/mfLag3細胞沒有顯示出任何可測得的結合。本發明15個抗LAG3抗體中總共13個對HEK293/mfLAG3細胞表現出明顯結合，其中EC50值範圍從900pM至大於10nM。計算出的MFI比範圍從8.8x到21.5x。比較物的EC50值大於10nM而計算的MFI比為6.7x和8.6x。
實例6：抗體對過度表現LAG3之細胞的結合，如藉由電化學發光免疫分析所測定
為了研究一組抗LAG3單株抗體結合細胞表面表現之LAG3的能力，利用人類和猴LAG3表現細胞株在基於電化學發光的檢測平台[Meso Scale Diagnostics,Rockville,MD-(MSD)]中開發出一個活體外結合分析。
透過慢病毒轉導產生HEK293(ATCC,CRL #-1573)穩定細胞株，以供表現重組型hLAG3(NCBI登錄號NP_002277.4)或猴LAG3(mfLAG3)[食蟹獼猴序列石蟹獼猴登錄號XP_005570011.1，基於恆河猴序列NCBI登錄號XP_001108923.1)(SEQ ID NO：576)，予以修改以將胺基酸位置74處的「X」取代為脯胺酸。依據螢光活化細胞分選(FACS)沒有可測得之LAG3表現的親代HEK293細胞株，被納入實驗中作為背景結合對照。不相干的人類IgG4和hIgG4被納入作為同型對照抗體。
實驗是根據以下程序進行。上述三個細胞株的細胞在不含Ca2+/Mg2+的1xPBS緩衝液中漂洗一次，然後在37℃下與Enzyme Free Cell Dissociation Solution培育10分鐘。脫離的細胞用具有Ca2+/Mg2+的1xPBS洗滌一次並用CellometerTM Auto T4細胞計數器(Nexcelom Bioscience)計數。將每孔大約10,000個於細胞洗滌緩衝液中的細胞接種到96孔碳電極盤(MULTI-ARRAY high bind plate,MSD)中，並在37℃下培養1小時以容許細胞附著。藉由在PBS中的2% BSA(w/v)在室溫下1小時來阻斷非特異性結合位點。以二重複的方式將抗LAG3抗體的連續稀釋溶液(範圍從1.7pM至100nM)加入至結合盤的細胞，並且在抗體不存在的情況下添加溶液，且在室溫下培育盤1小時。然後將盤洗滌，使用AquaMax2000盤洗滌器(MDS Analytical Technologies)來移除未結合的抗體。在室溫下使用SULFO-TAGTM接合的抗人類IgG抗體(MSD)偵測盤結合之抗體歷時1小時，洗滌後，用Read Buffer(MSD)根據製造商的建議程序來對盤進行成像，且用SECTOR成像儀6000(MSD)儀器來記錄發光信號。將直接結合信號(呈相對光單位-RLU)分析為抗體濃度的函數，並且用S形(四參數邏輯)劑量反應模型使用GraphPad PrismTM軟體來對數據進行擬合。各抗體的效力是透過計算EC50來確定。結合HEK293-hLAG3細胞和HEK293-mfLAG3細胞的EC50被定義為偵測到50%最大結合信號的抗體濃度。紀錄用結合至HEK293-hLAG3或 HEK293-mfLAG3細胞的100nM抗體所偵測到的信號相較於HEK293親代細胞的信號之比率做為LAG3結合特異性指標。在最高抗體濃度(100nM的)時的比率低於2倍，則該抗體被歸納為非特異性(NS)。
結合結果歸納於表12中。
Figure 105132298-A0202-12-0087-29
 NS=非特異性-在100nM ab<2下的比率
如表12中所示，抗體對結合至HEK-hLAG3細胞的效力範圍從EC50值690pM至52nM，相較於對親代HEK293細胞為100nM抗體結合，所有抗體就結合至人類LAG3表現細胞來說具有>2倍的特異性結合。抗體中只有七個特異地結合至HEK293-mfLAG3細胞，EC50值範圍從7.9nM至74 nM。比較物對HEK293-hLag3細胞的結合效力為約4.0nM和7.0nM。比較物未顯示特異性結合至HEK293-mfLag3細胞。一如預期，不相干的對照對HEK293-hLAG3細胞和HEK293-mfLAG3細胞的結合為非特異，其中H4H同型對照和H4sH同型對照結合比率範圍還比HEK293親代細胞高出0.7-1.1倍。
實例7：在細胞附著分析中阻斷LAG3結合至第II型MHC
採用細胞附著分析來測量抗LAG3抗體阻斷表現人類第2型MHC或小鼠第2型MHC表現細胞(分別RAJI細胞與A20細胞)附著至貼附在微量滴定盤上之hLAG3表現HEK293細胞的能力(依據Huard,et al.之Eur J Immunol.1995,25：2718-21中所述的分析)。
透過慢病毒轉導生成HEK293(ATCC,# CRL-1573)穩定細胞株來表現重組型hLAG3(NCBI登錄號NP_002277.4)或小鼠LAG3(mLAG3)(GenBank登錄號NP_032505.1)。親代HEK293細胞株沒有可透過螢光活化細胞分選(FACS)技術偵測到的人類LAG表現，並且被用來證明表現MHCII的RAJI和A20細胞附著需要LAG3。
實驗是根據下列程序進行：用1X PBS洗滌次匯合HEK293-hLAG3表現細胞一次、經胰蛋白酶處理，並在1,200rpm下離心5分鐘。將細胞丸粒再懸浮於1X PBS中，並隨後進行計數以測定細胞數。分離出適當數量的細胞並再懸浮於完全培養基(DME+10% FBS+青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸)中，使得每孔含有100μL的1.2^4個細胞。細胞平鋪至無菌NunclonTM Delta 96孔MicroWellTM Black Optical Bottom Plates(Thermo Scientific)中。盤周邊的孔並未納入分析設計，以避免邊緣效應。將100μL的1xPBS取代細胞添加入至周邊孔中。經平舖的HEK293-hLAG3細胞在37℃、5% CO2下培育過夜。培育後，用抗LAG3抗體和同種對照處理這些細胞。
在處理當日，所有抗體均連續稀釋(1：3)在RPMI培養基(無添加FBS或補充劑)中。9-點稀釋範圍在45pM至300nM之間，其中最後的稀 釋點不含有mAb。關於在附著分析中使用RAJI細胞的H4sH抗體測試，9點稀釋範圍介於23pM至150nM，其中最後的稀釋點不含有mAb。將最終體積為50μL的抗LAG3抗體或同型對照添加至HEK293-hLAG3細胞中並在37℃、5% CO2下培育1小時。當經平鋪的HEK293-LAG3細胞與測試抗體或對照抗體一起培育時，使用以下程序用鈣黃綠素AM標記非附著的B細胞(RAJI或A20)。收取RAJI和A20懸浮細胞，並在1,200rpm下離心5分鐘。將細胞丸粒再懸浮於1X PBS中並進行計數。用RPMI洗滌細胞，並以每1ml有106個細胞的濃度再懸浮於RPMI中。經由每1ml細胞懸浮液添加5μL鈣黃綠素AM並且在37℃、5% CO2下培育30分鐘來標記細胞。用RPMI洗滌經標記細胞1次、離心、用1X PBS洗滌並以每1ml有5x106個細胞的濃度再懸浮於PBS中。隨後，每1ml經鈣黃綠素AM標記的細胞添加10μL BD Pharmingen Fc阻斷物(0.5mg/mL)，在室溫下培育10分鐘。經鈣黃綠素AM-染色、經Fc-阻斷的RAJI或A20細胞再懸浮於RPMI中達到每1ml為3×106個細胞的最終濃度，且隨後使用於在附著分析中。
在LAG3抗體處理HEK293-LAG3細胞一小時之後，50μl的經標記RAJI細胞或A20細胞以1.5×105個細胞/孔的密度被添加至各孔中。經標記的懸浮細胞與HEK293單層一起培育在37℃、5% CO2下1小時。藉由輕輕用RPMI輕柔洗滌孔4次來洗去未附著的細胞、每次洗滌後用紙巾擦乾盤，隨後用PBS洗滌2x。向每孔添加最終體積為200μl的PBS，並在激發/發射波長為485nm/535nm下於VICTORTM X5 Multilabel Plate Reader上讀取鈣黃綠素AM螢光。使用四參數邏輯方程式對9點反應曲線使用GraphPad Prism來計算IC50值。IC50定義為觀察到在阻斷50% HEK細胞附著至RAJI細胞或A20細胞的抗體濃度。
使用基於細胞的附著分析來評估抗LAG3抗體阻斷LAG3結合至人類和小鼠MHCII的能力。該分析採用經螢光標記之內源性表現MHCII 的細胞[人類MHCII(RAJI)或小鼠MHCII(A20)]結合至經改造以表現人類LAG3之細胞的形式。評估LAG3抗體阻斷這個交互作用的能力評價而結果顯示於表13中。
Figure 105132298-A0202-12-0090-21
如表13中所示，同型對照未顯示RAJI或A20細胞對HEK293-hLAG3細胞的結合有任何可測得的阻斷。本發明所有LAG3抗體在最高抗體濃度下阻斷92-98% RAJI或A20細胞附著至HEK293-hLAG3細胞，其中IC50值範圍就RAJI細胞附著至HEK293-hLAG3細胞而言是從2.5nM至31nM，而就A20細胞附著至HEK293-hLAG3細胞而言是3.6nM至30nM。比較物的IC50值就RAJI細胞附著至HEK293-Lag3細胞而言為3.4nM和7.2 nM，而就A20細胞附著HEK293-Lag3細胞而言為5.1nM和9.6nM。
實例8：在T細胞/APC螢光素酶報導子分析中，LAG3誘導T細胞下調的阻斷
T細胞活化是藉由刺激辨識抗原呈遞細胞(APC)上由主要組織相容性複合物第I或II型(MHCI或MHCII)蛋白呈遞之特異性肽的T細胞受體(TCR)來達成(Goldrath et al.1999,Nature 402,255-262)。經活化的TCR又引發信號傳導事件級聯，其可透過受到轉錄因子(諸如活化因子-蛋白-1(AP-1)，活化T細胞的核因子(NFAT)，或活化B細胞的核因子κ-輕鏈增強因子(NFκB))驅動的報導子基因來進行監測。T細胞反應是經由組成性或誘導性表現於T細胞上的共受體接合來改善。一個這樣的受體是LAG3，T細胞活性的負向調節因子。LAG3與其配體MHCII交互作用，MHCII表現於目標細胞(包括APC或癌細胞)上，並透過關閉由TCR信號小體引發的正向信號來抑制T細胞活化(Workman et al.2002,J Immunol 169：5392-5395)。
為了表徵抗LAG3抗體拮抗LAG3在T細胞中介導信號傳遞的能力，開發出一個LAG3 T細胞/APC報導子分析來測量APC與T細胞之間交互作用引起之T細胞信號傳遞，該分析是透過採用衍生自兩種哺乳動物細胞株的混合培養物：Jurkat衍生的T細胞(細胞株JRT3.T3.5，如下文所述)與在HEK293背景下的經改造APC(如下文所述)(圖1)。
關於第一個組分，用於LAG3 T細胞/APC報導子生物分析的T細胞株是如下文進行開發：Jurkat衍生的T細胞株，JRT3.T3.5(ATCC,# TIB-153)最初是用Cignal Lenti AP-1 Luc報導子(Qiagen-Sabiosciences, #CLS-011L)依照製造商的說明進行轉導。慢病毒受到最小CMV啟動子控制而編碼螢火蟲螢光素酶基因、TPA誘導性轉錄反應要素(TRE)的串聯重複序列和嘌呤黴素抗性基因。抗生素選擇後，用人類CD28(NP_006130.1)、Ob2F3 TCR α與β次單位(α AGA92550.1，β AAA61026.1)、人類LAG3嵌合體(包含人類LAG3的胞外域(NP_002277.4)與人類CD300a的跨膜域和細胞質域(181 至299的胺基酸；登錄號NP 009192.2)與人類PD-1(登錄號NP_005009.2)轉導來進一步操縱嘌呤黴素抗性池的報導子細胞。藉由FACS分析在每一回合轉導後確認蛋白質表現。隨後產生單個選殖株JRT3.T3/AP1-Luc/CD28/hLAG3-CD300a嵌合體/hPD-1選殖株2D2，並使用於T細胞/APC報導子生物分析中。該細胞株維持在補充有100ug/mL潮黴素+500ug/mL G418+1ug/ml嘌呤黴素的RPMI+10% FBS+青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸(P/S/G)中，從而稱此為選擇培養基。這些細胞在本文稱為報導子T細胞。
關於第二個組分，用於LAG3 T細胞/APC報導子生物分析的APC細胞株是如下文所生成：用具有MHCII次單位HLA-DR2A(NP_061984.2)和HLA-DR2B(NP_002115)的人類轉導表現人類CD20(編號NP_068769.2)的穩定HEK293細胞株(ATCC,# CRL-1573)。HLA-DR2陽性細胞是透過FACS分離，將所得的細胞株HEK293/CD20/HLA-DR2維持在補充有有100ug/mL潮黴素+500ug/ml G418的DME+10%+P/S/G+非必需胺基酸中，從而稱此為選擇培養基。這些細胞在本文稱為APC細胞。
為了接合T細胞和APC，以便引發TCR信號傳遞，使用兩種方法：(1)雙特異性模式；和(2)肽脈衝模式。在這個生物分析中，抗LAG3抗體阻斷LAG3/MHCII交互作用並透過使CD300a分子的細胞質尾部遞送之抑制性信號傳遞失去功能，加上之後增加AP1-Luc信號傳遞來挽救T細胞活性。T細胞活化是經由螢光素酶讀數來進行監控。
雙特異性模式：在這個模式中，採用由一個結合至T細胞上之CD3的Fab臂，還有一個結合至HEK293細胞上之CD20的第二Fb所組成的雙特異性抗體(CD3xCD20雙特異性抗體，例如在US20140088295所揭示)。因為經改造T細胞上的CD3分子簇集，該雙特異性分子的存在會導致免疫突觸形成以及TCR複合體活化。
篩選前一天，經改造的報導子T細胞在選擇培養基中培養至 5×105個細胞/mL，並在次日於生物分析中進行測試。在固定濃度之CD3xCD20雙特異性抗體(100pM)存在下測定抗LAG3抗體的EC50值。按下列順序加入試劑。抗Lag3抗體和同型對照連續稀釋於補充有10% FBS和青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸的RPMI1640(分析培養基)中。10點稀釋範圍介於15pM至100nM，最終稀釋點不含mAb，僅含緩衝液的對照)。將經連續稀釋的抗體添加至96孔白色平底盤的對應孔中，該對應孔含有固定濃度(100pM)的雙特異性抗體。經培養過夜的報導子T細胞以2×106/mL再懸浮於分析培養基中、添加至含有抗LAG3抗體加上雙特異性抗體的盤並在37℃/5% CO2下培育30分鐘。報導子T細胞的最終濃度為每孔5×10^4。
接著，用D-PBS(Irvine Scientific Cat# 9240)洗滌APC細胞1x、經胰蛋白酶(Specialty Media Cat# SM-2004-C)處理並用分析培養基予以阻斷。離心後，將細胞於分析培養基中再懸浮至4×105/mL並添加至含有與抗LAG3加上雙特異性抗體一起培育之T細胞報導子細胞的盤中。APC細胞的最終濃度為每孔1×104。在37℃、5% CO2下培育盤歷時4-6小時。在添加ONE-GLOTM(Promega,# E6051)試劑之後偵測AP1-Luc活性，並且在Victor光度計上取得相對光單位(RLU)。以二重複的方式測試所有樣品。
使用MBP85-99的肽脈衝模式：TCR辨識特異性MHC/肽複合體，並導致T細胞活化。在本分析中所使用的Ob2F3 TCR雜二聚體經報導會與MHCII蛋白交互作用，與MBP85-99肽複合(髓鞘質鹼性蛋白NP_001020272；SEQ ID NO：583)。
篩選前一天，如上文關於雙特異性模式所述來製備經改造的報導子T細胞。用0.2μM MBP85-99肽(Celtek HLA-DR2 MBP85-99於DMSO中，ER-15，Lot# 140411，MW 1797.1g/mol)在含有抗生素的細胞培養基中於37℃/5% CO2下對APC細胞進行脈衝過夜。在1×104經脈衝APC存在下測定抗LAG3抗體的EC50值。按以下順序加入試劑：在分析培養基中連 續稀釋抗LAG3抗體和對照。抗LAG3抗體的10點連續稀釋範圍介於15pM至100nM，其中最後稀釋點不含mAb。將抗體添入至96孔白色平底盤的對應孔中。將經培養過夜的報導子T細胞再懸浮於分析培養基中至2×106/mL，添加至盤並且在37℃、5% CO2下培育30分。報導子T細胞的最終濃度為每孔5×104個T細胞。接著，用D-PBS(Irvine Scientific Cat# 9240)洗滌經MBP85-99肽脈衝之APC細胞1x、經胰蛋白酶(Specialty Media Cat# SM-2004-C)處理並用分析培養基阻斷。離心後，將細胞再懸浮於分析培養基中至4×105/mL並添加至抗LAG3加上經肽脈衝的報導子T細胞盤中。APC細胞的最終濃度為每孔1×104。在37℃/5% CO2下培育分析盤4-6小時。在添加ONE-GLOTM(Promega,# E6051)試劑之後偵測AP1-Luc活性，並且在Victor光度計上取得相對光單位(RLU)。以二重複的方式測試所有樣品。
使用GraphPad Prism，從四參數邏輯方程式對10點反應曲線來決定EC50值。每個經篩選抗體的RLU值是透過將不含mAb的最後連續稀釋液對照設為100%來進行常規化，其理論上表現出經雙特異性分子引起(在雙特異性模式中)或經MBP85-99肽脈衝之APC引起的最大APC-Luc反應。結果歸納於表14中。
Figure 105132298-A0202-12-0094-22
Figure 105132298-A0202-12-0095-23
如表14中所示，在T細胞/APC生物分析中測試的本發明所有抗Lag3 mAb挽救LAG3/HLA-DR2抑制，其中在肽模式分析中的EC50值範圍從135pM至8.83nM，而在雙特異性模式分析中的EC50值範圍從87pM至超過100nM，同時比較物表現EC50值為280pM和350pM。所測試的同型對照沒有在生物分析中顯示出有顯著挽救活性。在進一步實驗中，添加抗PD-1抗體(REGN 2810；在本文實例12中所述)沒有增加挽救T細胞活化。
在第二個實驗中，用人類PD-L1基因(登錄號NP_054862.1的胺基酸1-290)轉導HEK293/CD20/HLA-DR2細胞株，該基因已被選殖至慢病毒(pLEX)載體系統中。如上所述，表現受到hLAG-3與AP-1驅動之螢光素酶報導子的Jurkat T細胞與表現人類MHCII/肽複合體的PD-L1陽性抗原呈遞細胞一起培育。在這個分析中，抗LAG-3抗體僅在有抗PD-1抗體(REGN2810；本文實例12中所述)存在時挽救T細胞活性，在抗-PD-1抗體不存在時則無。總結來說，抗LAG-3抗體在這個T細胞分析中透過阻斷LAG-3/MHCII抑制性信號傳遞並且與抗-PD-1抗體協同來挽救T細胞活化。
實例9：抗LAG3抗體對經CD4+與CD8+刺激的石蟹獼猴T細胞表現結合
在這個實例中，經由FACS評估所選抗LAG3抗體結合至表現LAG3之CD4+及/或CD8+石蟹獼猴T細胞的能力。
首先，從食蟹獼猴全血(Bioreclamation,Westbury,NY)中分離出T細胞。簡言之，兩隻石蟹獼猴供體的全血1：1稀釋於PBS中並且層鋪 在85% Ficoll-Paque溶液上。依據標準程序，使用泛T細胞分離套組(Miltenyi Biotech)將紅血球與單核細胞和T細胞分開來。
使用非人類靈長類動物的T細胞活化/擴增套組(Miltenyi Biotech)將經分離的T細胞予以活化。細胞-珠粒混合物以1×106細胞/mL的濃度再懸浮於完全培養基中。培育72小時後，移除珠粒並且在完全培養基中擴增經活化T細胞96小時。
接著，每隻供體的如上所述之經刺激石蟹獼猴T細胞用LIVE/DEAD染料(Molecular Probes)染色以便經由FACS來區別活細胞與死細胞。接著，將細胞與PE接合之抗CD8和FITC接合的抗CD4一起在冰上培育15分鐘，好能夠偵測CD4和CD8陽性和陰性細胞群。
為了評估抗LAG3抗體與先前經分離CD4+和CD8+石蟹獼猴T細胞的結合，在阻斷緩衝液中連續稀釋抗LAG3抗體和同型對照並以範圍自100nM至50pM的最終劑量平鋪於96孔V底盤中。接著，使用Zenon Alexa-Fluor 647(Molecular Probes)將連續稀釋的抗體進行直接標記並且與石蟹獼猴CD4+/CD8+ T細胞懸浮液一起在冰上培育15-30分鐘。將細胞離心並用染色緩衝液洗滌丸粒以去除未結合的抗體，且用Cytofix(BD Biosciences)和染色緩衝液的1：1稀釋液固定12小時。在培育期之後，去除固定緩衝液並且將丸粒再懸浮於染色緩衝液中、過濾，且用於螢光測量。
在Fortessa(Becton Dickinson)上取得螢光測量值，並在FlowJo中分析數據以確定平均螢光強度(MFI)。使用GraphPad Prism，由四參數邏輯方程式對11點反應曲線計算EC50值。每種抗體的MFI比是藉由將抗體濃度1.1nM之MFI除以抗體濃度0nM之MFI(陰性對照)來計算。
Figure 105132298-A0202-12-0096-24
Figure 105132298-A0202-12-0097-30
 NB：：無結合
如前所示，抗LAG3抗體H4sH15482P與H4sH14813N對經改造石蟹獼猴LAG3-HEK293細胞株表現出結合。在這個實例中，H4sH15482P與H4sH14813N證明特異地結合至表現CD4+與CD8+ LAG3的石蟹獼猴T細胞，EC50範圍為1.1nM至85pM(表15)。歸納來說，此實例中所述的所選抗LAG3抗體對表現在石蟹獼猴經活化CD4+與CD8+ T細胞上的LAG顯示交叉反應性。相對地，比較物1證實僅會結合至CD8+石蟹獼猴T細胞。
實例10：抗LAG3抗體對Colon26腫瘤的活體內效力
在Colon 26臨床前同基因腫瘤模型中研究抗小鼠LAG3抗體單獨以及與抗小鼠PD-1抗體組合的活體內效力。
從Taconic Biosciences購買BALB/c小鼠。Colon 26是源於BALB/c小鼠品系的小鼠腺癌細胞株，購自美國典型培養物保存中心(ATCC)。在第0天，將五十隻BALB/c小鼠皮下植入1×106Colon 26(源於BALB/c品系的小鼠腺癌株)。在第8天，選出40隻具有平均腫瘤體積為50mm3的小鼠選擇並隨機分至4個治療組(N=10/組)中。在第14、17、21、24和28天，如下給予小鼠抗體：第1組，大鼠IgG2a同型對照(選殖株2A3，BioXCell，目錄# BE0089)和mIgG1同型對照(選殖株MOPC-21，BioXCell，目錄# BE0083)抗體；第2組，抗小鼠PD-1抗體(大鼠IgG2a抗小鼠PD-1抗體，選殖 株RPMI-14，BioXCell，目錄# BE0089)和mIgG1同型對照抗體；第3組，抗-小鼠LAG3抗體(大鼠IgG1抗小鼠LAG3抗體，選殖株C9B7W，BioXCell，目錄# BE0174)和大鼠IgG2a對照抗體；第4組，抗小鼠PD-1和抗小鼠LAG3抗體。所有抗體是以10mg/kg透過腹膜內注射來給藥。腫瘤體積是藉由在實驗期間(42天)每週卡尺測量兩次來進行監控。
在用抗小鼠PD-1抗體治療的小鼠中，觀察到腫瘤生長有顯著減少(圖2A-B)，其中10隻小鼠有5隻在實驗結束時的第45天變為無腫瘤。在用抗小鼠LAG3抗體治療的小鼠子集中也觀察腫瘤生長減少，其中10隻小鼠有3隻在第45天變為無腫瘤。明顯對比的是，用抗LAG3和抗PD-1抗體治療的組合優於任一療法，10隻小鼠中有8隻在實驗結束時變為無腫瘤，這暗示著抗LAG3和抗PD-1治療的強力加成效果。在實驗結束時，對照組中沒有無腫瘤小鼠。在第35天，用組合療法治療的小鼠中有統計顯著的腫瘤體積減少(p<0.05，圖2B)，但任一單獨療法均無。儘管有效清除腫瘤，但沒有觀察到體重損失的證據(未顯示)。因此，在已建立的Colon 26腫瘤模型中，抗PD-1和抗LAG3抗體的組合方案比對應單一療法明顯更為有效。
也在4T1、RENCA和A20臨床前同基因腫瘤模型中研究抗小鼠PD-1和抗小鼠LAG3抗體的活體內活性。相較於任一單抗體治療，使用兩種抗體組合治療產生至少一種加成性抗腫瘤效用(數據未示出)。
實例11：抗小鼠LAG3抗體對抗MC38腫瘤的活體內效力
針對在C57BL/6小鼠中已長成的MC38腫瘤，使用抗小鼠PD-1和抗小鼠LAG3阻斷抗體來檢驗PD-1和LAG3雙重阻斷的效用。
C57BL/6小鼠購自於Taconic Biosciences。MC38是一種源自於C57BL/6小鼠品系的小鼠腺癌細胞株，從國家衛生研究院寄存機構取得。抗LAG3和抗PD-1抗體以及對照是如實例10中所述的方法獲得。
在第0天，五十隻C57BL/6小鼠在腹脅內皮下植入3×105 MC38細胞。在第8天，選出40隻具有平均腫瘤體積為45mm3的小鼠並隨機分至4個治療組(N=10/組)中。在第8天、第12天、第15天，第19天和第23天，如下給予小鼠抗體：第1組，大鼠IgG2a和mIgG1同型對照抗體；第2組，抗-小鼠PD-1和mIgG1抗體；第3組，抗-小鼠LAG3和大鼠IgG2a抗體；第4組，抗小鼠PD-1和抗小鼠LAG3抗體。所有抗體是以10mg/kg藉由腹膜內注射來給藥。腫瘤體積是藉由在實驗期間(28天)每週卡尺測量兩次來進行監控。
抗PD-1抗體療法顯著減少小鼠子集的腫瘤生長(p<0.0001；第23天)(圖3A-B)，其中10隻小鼠中有2隻在實驗結束時變為無腫瘤。抗LAG3抗體單一療法沒有顯示出任何顯著的抗腫瘤效用(在實驗結束時0/10小鼠無腫瘤)，而抗LAG3和抗PD-1抗體的組合優於單獨抗PD-1療法，表示有協同效用。
為了測試抗PD-1和抗LAG3抗體組合的免疫調節特性，檢驗經治療小鼠的脾臟和引流淋巴結(DLN)的T細胞標記(圖4)。帶有腫瘤之小鼠的脾臟和引流淋巴結藉由解剖被取出並放入15mL RPMI1640 Glutamax I培養基(Invitrogen)中。分離總RNA，並使用對小鼠CD8β以及小鼠IFNγ具有特異性的引子/探針混合物進行RT-PCR Taqman分析[小鼠CD8β探針：AGCAGCTCTGCCCTCAT(SEQ ID NO：584)，正向引子：GCTCTGGCTGGTCTTCAGTATG(SEQ ID NO：585)，反向引子：TTGCCGTATGGTTGGTTTGAAC(SEQ ID NO：586)，和小鼠IFNγ(Mm01168134_m1,Applied Biosystems)]。樣品相對於小鼠親環素B轉錄表現位準進行常規化。TaqMan分析證明，在組合治療組的小鼠中，DLN和脾臟均有CD8+ T細胞擴增，且在組合以及單獨經抗PD-1治療動物中有T細胞效應分子IFNγ產量增加，指出PD-1和LAG3阻斷增加了T細胞的增殖和效應子功能。
實例12：抗人類LAG3抗體對抗MC38腫瘤的活體內效力
在此實驗中，研究本發明例示性抗人類LAG3抗體對抗MC38腫瘤的效力。抗人類LAG3 mAb不結合至小鼠LAG3。因此，為了要研究這些抗體在小鼠體內的活體內抗腫瘤特性，使用經人類化以表現人類LAG3蛋白的小鼠。關於本文的實驗，使用VelociGene®技術來生成表現人類PD-1和人類LAG3的胞外部分以及這些蛋白質之小鼠形式的跨膜與胞內部分的雙人類化小鼠(Valenzuela et al 2003；Nat.Biotechnol.21：652-659)。
雙人類化LAG3/PD-1小鼠是用VelociGene®技術予以改造，將小鼠Pdcd1和Lag3基因的胞外域取代為人類PD-1和人類LAG3基因的對應區域(美國專利申請案序號62/258,181，於2015年11月20日提申)。人類化PD-1和LAG3表現是透過在抗-CD3/抗-CD28抗體刺激之後檢驗人類化小鼠T細胞上的PD-1和LAG3蛋白質表現來進行評估。人類PD-1和LAG3蛋白質與對應小鼠配體的交互作用是藉由在細胞附著分析中測試人類LAG3對小鼠MHC II的結合，還有在SPR-Biacore結合研究中測試人類PD-1對小鼠PD-L1的結合予以驗證。
用此研究的例示性抗LAG3抗體是特異地結合至人類LAG3並包含SEQ ID NO：420-422-424-428-430-432之HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3與SEQ ID NO：418/426之HCVR/LCVR的完全人類抗體(也稱為H4sH15482P且在下文中稱為「mAb1」)。
抗人類PD-1抗體揭示於美國專利申請公開案US20150203579中，其以全文引用的方式併入本文。此實例中使用的抗PD-1抗體是H4H7798N(如在US20150203579中所揭示，也稱為REGN2810。更具體來說，H4H7798N包含SEQ ID NO：330的重鏈和SEQ ID NO：331的輕鏈，如在US20150203579中所揭示)。REGN2810(抗-hPD-1)以高親和力結合至人 類PD-1並阻斷PD-1與PD-L1和PD-L2的交互作用。
小鼠結腸腺癌細胞(MC38.Ova)經改造為表現雞卵白蛋白，以增加腫瘤免疫原性。
在第0天，LAG3 hum/hum PD-1 hum/hum 小鼠皮下植入1.5×106MC38.Ova細胞並且被隨機分至三個治療組(N=7/組)中。在第3天、第6天、第10天、第14天和第17天經由腹膜內注射對小鼠投予mAb1(抗hLAG3)(25mg/kg)、REGN2810(抗hPD-1)(10mg/kg)或同型對照抗體(25mg/kg)。腫瘤體積是藉由在實驗期間(24天)每週卡尺測量兩次來進行監控。
在第0天，LAG3 hum/hum PD-1 hum/hum 雙人類化小鼠接種MC38.Ova細胞，並經由腹膜內路徑在第3天、第6天、第10天、第14天與第17天投予mAb1(抗hLAG3)(25mg/kg)、REGN2810(抗hPD-1)(10mg/kg)或同型對照(25mg/kg)。REGN2810(抗hPD-1)顯示部分腫瘤生長抑制(圖5)，7隻小鼠中有2隻觀察到腫瘤消退，而在同型對照組中沒有一隻小鼠是無腫瘤的。呈25mg/kg的mAb1(抗hLAG3)單一療法對腫瘤生長沒有顯示出任何顯著影響，其中7隻小鼠中只有1隻在實驗結束前變為無腫瘤。小鼠體重沒有受到mAb1(抗hLAG3)、REGN2810(抗hPD-1)或同型對照治療所影響。
實例13：抗人類LAG3與抗人類PD-1抗體組合對抗MC38腫瘤的活體內效力
在此實驗中，檢驗mAb1(抗hLAG3)組合REGN2810(抗hPD-1)於雙人類化LAG hum/hum PD-1 hum/hum 小鼠中對抗MC38.Ova腫瘤的效力。雙人類化小鼠描述於本文實例12中。
用於此研究的例示性抗LAG3抗體是特異地結合至人類LAG3並包含SEQ ID NO：420-422-424-428-430-432的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3及SEQ ID NO：418/426之HCVR/LCVR的完全人類抗體(也稱為H4sH15482P且在下文為「mAb1」)。
此實例中使用的抗PD-1抗體是H4H7798N(揭示於US20150203579，也稱為REGN2810)。REGN2810(抗hPD-1)以高親和力結合至人類PD-1並阻斷PD-1與PD-L1和PD-L2的交互作用。
在第0天，小鼠皮下植入1×106MC38.Ova細胞並隨機分至四個治療組(對照組中N=7，而在mAb1(抗hLAG3)、REGN2810(抗hPD-1)、和mAb1(抗hLAG3)+REGN2810(抗hPD-1)組合治療的每一者中N=12)中。在第3天、第7天、第10天，第14天和第17天，藉由腹膜內注射對小鼠投予mAb1(抗hLAG3)(25mg/kg)、REGN2810(抗hPD-1)(10mg/kg)、mAb1(抗hLAG3)(25mg/kg)和REGN2810(抗hPD-1)(10mg/kg)之組合，或同型對照(25mg/kg)。腫瘤體積是藉由在實驗期間(32天)每週卡尺測量兩次來進行監控，而針對腫瘤復發不存在來監測無腫瘤動物歷時至多80天。
REGN2810(抗hPD-1)單一療法導致腫瘤生長抑制(圖6A-B)，12隻動物中有2隻(17%)腫瘤消退，而mAb1(抗hLAG3)並未顯著有效，證實先前實驗的結果。在經mAb1(抗hLAG3)治療的12隻小鼠中只有1隻觀察到腫瘤消退。在同型對照組中，在第32天沒有無腫瘤小鼠。相反地，mAb1(抗hLAG3)和REGN2810(抗hPD-1)的組合證明強烈抑制MC38.Ova腫瘤生長，導致在實驗結束前12隻小鼠中有5隻(42%)為無腫瘤小鼠。無腫瘤小鼠沒有一隻在植入後有腫瘤復發歷時80天，表示組合免疫療法的效果持久。單因子ANOVA與Tukey氏多重比較事後檢定揭示mAb(抗hLAG3)和REGN2810(抗hPD-1)組合治療組相較於mAb1(抗hLAG3)單一療法(p<0.05)或同型對照組(p<0.01)在第22天於腫瘤體積方面有顯著差異(圖6B)。REGN2810(抗hPD-1)單一療法也顯示相對於(p<0.05)顯著減少腫瘤生長。mAb1(抗hLAG3)和REGN2810(抗hPD-1)組合治療也導致動物存活率顯著增進(p<0.0001)，如由對數秩(曼特爾-考克斯)檢定所分析(圖6C)。儘管組合療法的功效有所增進，但沒有觀察到體重減少的證據(數據未顯示)。歸納來 說，mAb1(抗hLAG3)和REGN2810(抗hPD-1)的組合使得效力獲得改善，包括相較於REGN2810(抗hPD-1)或MAB1(抗hLAG3)單一療法來說減少腫瘤生長、增進腫瘤清除並增進存活。
實例14：抗LAG3與抗PD-1抗體的組合對抗MC38腫瘤的劑量範圍研究
本實例說明一組劑量範圍實驗，其在雙人類化LAG3 hum/hum PD-1 hum/hum 小鼠體內測量抗人類PD-1和抗人類LAG3抗體的組合對抗MC38.Ova腫瘤的活體內效力。雙人類化小鼠描述於本文實例12中。
用於此研究中的例示性抗LAG3抗體是特異地結合至人類LAG3並包含SEQ ID NO：420-422-424-428-430-432的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3與SEQ ID NO：418/426之HCVR/LCVR的完全人類抗體(也稱為H4sH15482P且在下文為「mAb1」)。
此實例中使用的抗PD-1抗體是H4H7798N(如US20150203579中所揭示，也稱為REGN2810)。REGN2810(抗hPD-1)以高親和力結合至人類PD-1並阻斷PD-1與PD-L1和PD-L2的交互作用。
在第一個實驗中，滴定REGN2810(抗hPD-1)並以10mg/kg和1mg/kg的劑量位準進行測試，兩個劑量組均作為單一藥劑以及與mAb1(抗hLAG3)(25mg/kg)組合。兩個組合治療組的結果與REGN2810(1mg/kg或10mg/kg)或mAb1(25mg/kg)單一療法相比較，以確定是否有觀察到加成/協同抗腫瘤效用。也對用同型對照抗體(25mg/kg)治療進行了測試。在第0天LAG-3hum/humPD-1hum/hum小鼠接種MC38.Ova細胞，並隨機分成六個治療組(同型對照組中N=6，而mAb1、REGN2810或REGN2810+mAb1治療中N=12)。在第3、7、10，14與17天，經由腹膜內注射對小鼠投予：mAb1(25mg/kg)；REGN2810(10mg/kg)；REGN2810(1mg/kg)；mAb1(25mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)；mAb1(25mg/kg)+REGN2810(1mg/kg)；或同型對 照(25mg/kg)。監測腫瘤體積歷時36天，並監測無腫瘤動物至多歷時80天。
表16顯示在研究的不同時間點時的平均腫瘤體積，而在第36天時的無腫瘤小鼠數目顯示於表17中。
Figure 105132298-A0202-12-0104-31
Figure 105132298-A0202-12-0104-32
 an/M：無腫瘤小鼠數目/每組小鼠總數目
呈1mg/kg的REGN2810單一療法在36天內僅顯示最少腫瘤消退，類似於同型對照治療組的結果(圖7A-B)。在REGN2810(1mg/kg)和同 型對照組中，分別有2/12(~16%)和0/6(0%)小鼠在第36天為無腫瘤。相反地，mAb1(25mg/kg)、REGN2810(10mg/kg)和REGN2810(1mg/kg)+mAb1(25mg/kg)治療組證實在22天內有類似的腫瘤生長減少(圖7A)。在第36天，mAb1(25mg/kg)治療導致有1/12(~8%)小鼠為無腫瘤，而在REGN2810(10mg/kg)組和REGN2810(1mg/kg)+mAb1(25mg/kg)組中，4/12(~33%)和3/12(25%)小鼠分別為無腫瘤。總體來說，mAb1(25mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)證明在MC38.Ova腫瘤生長方面有最穩健的減少，其中12隻小鼠有6隻(50%)在第36天前變為無腫瘤。儘管治療中斷了，無腫瘤小鼠中沒有一隻在植入後顯示腫瘤復發歷時80天，表示組合免疫療法的效果持久。mAb1(25mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)治療也導致動物存活率方面有明顯改善(p=0.0197)，如由對數秩(曼特爾-考克斯)檢定所分析(圖7C)。另外，沒有觀察到體重減少的證據。
在第二個實驗中，滴定mAB1(抗hLAG3)並以25mg/kg和5mg/kg的劑量位準來進行測試，兩個劑量組均作為單一藥劑以及與REGN2810(抗hPD-1)(10mg/kg)組合。兩個組合治療組的結果與mAb1(5mg/kg或25mg/kg)或REGN2810(10mg/kg)單一療法相比較，以確定是否觀察到加成/協同抗腫瘤效用。也對用同型對照抗體(25mg/kg)的治療進行測試。在第0天，LAG-3hum/humPD-1hum/hum小鼠接種MC38.Ova細胞，並隨機分至六個處理組(同型對照組中N=6，而mAb1、REGN2810或REGN2810+mAb1治療組中N=12)。在第3、7、10，14與17天，經由腹膜內注射對小鼠投予：mAb1(5mg/kg)；mAb1(25mg/kg)；REGN2810(10mg/kg)；mAb1(5mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)；mAb1(25mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)；或同型對照(25mg/kg)。監測腫瘤體積歷時31天。
呈5mg/kg的mAb1單一療法顯示最少腫瘤消退，類似同型對照治療組。mAb1(25mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)的組合顯示出最穩健的 腫瘤減少(圖8A)。mAb1(5mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)治療組也證明強力的組合效用。在第23天測量的腫瘤體積顯示於圖8B中。抗LAG-3抗體以及REGN2810的組合也顯示在動物存活方面有顯著改善(p<0.001，如由對數秩曼特爾-考克斯檢定所分析)(圖8C)。結果顯示，即便在低抗LAG3抗體劑量下，也看到強力的組合效用。基於本文顯示的結果，在對抗腫瘤的治療方案中不需要使用高劑量的抗LAG3抗體與抗PD-1抗體組合。
歸納來說，REGN2810(抗hPD-1)和mAb1(抗hLAG3)的組合在雙人類化LAG3/PD-1小鼠的MC38.ova腫瘤模型(其容許測試不與小鼠受體交叉的臨床抗體)中證明劑量依賴性效力相較於比REGN2810(抗hPD-1)和mAb1(抗hLAG3)單一療法有所增進，包括減少腫瘤生長且存活有所改善。REGN2810(抗hPD-1)和mAb1(抗hLAG3)組合在臨床前條件下的穩健抗腫瘤效力支持著它們在臨床上開發作為組合癌症免疫療法。
實例15：抗人類LAG3與抗人類PD-1抗體的組合對抗已長成MC38腫瘤的活體內效力
在此實驗中，在雙人類化LAG3 hum/hum PD-1 hum/hum 小鼠體內檢驗mAb1(抗hLAG3)組合REGN2810(抗hPD-1)對抗已長成之MC38.Ova腫瘤的效力。雙人類化小鼠描述於本文實例12中。
用於此研究中的例示性抗LAG3抗體是特異地結合至人類LAG3並包含SEQ ID NO：420-422-424-428-430-432的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3與SEQ ID NO：418/426之HCVR/LCVR的完全人類抗體(也稱為H4sH15482P且在下文為「mAb1」)。
此實例中使用的抗PD-1抗體是H4H7798N(如US20150203579中所揭示；也稱為REGN2810)。REGN2810(抗hPD-1)以高親和力結合至人類PD-1並阻斷PD-1與PD-L1和PD-L2的交互作用。
在第0天LAG-3hum/humPD-1hum/hum小鼠皮下接種MC38.Ova細胞。在第10天，選出10隻具有平均腫瘤體積為100mm3的小鼠選擇並隨機分至四個治療組中。在第10，14、17、22天，經由IP注射對小鼠投予：mAb1(25mg/kg；N=9)；REGN2810(10mg/kg；N=10)；mAb1(25mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)組合(N=11)或同型對照抗體(25mg/kg；N=7)。腫瘤植入後監測腫瘤體積歷時28天。
用抗hPD-1與抗hLAG-3抗體的組合治療帶有MC38.ova腫瘤的人類化小鼠會引發的瘤內和周邊T細胞的活化。REGN2810單一療法導致部分腫瘤生長抑制，而mAb1單一療法相較於經同型對照治療的小鼠未顯示平均腫瘤體積減少(圖9)。相反地，mAb1(25mg/kg)和REGN2810(10mg/kg)的組合證明穩健抑制MC38.Ova腫瘤生長。單因子變異數分析(ANOVA)和Bonferroni氏多重比較事後檢定分顯，相較於mAb1單一療法(p<0.01)或同型對照(p<0.05)，mAb1和REGN2810組合組之間的平均腫瘤體積有顯著差異(圖10)。當組合療法與REGN2810單一療法相比時，組合療法在實驗過程中的整體平均腫瘤體積較低，但這個差異未達到統計顯著性。抗LAG3抗體和REGN2810的組合也導致動物存活以及存活時間顯著增加(p<0.01，如對數秩曼特爾-考克斯檢定所分析)。在第25天，相較於對照和單一治療，經組合療法治療的小鼠有50%活了下來(圖11)。基於這些結果，相較於各別單一療法，組合治療展現出一種加成性、劑量依賴性抗腫瘤效用。
實例16：抗LAG3抗體在石蟹獼猴中的藥動學
在對母石蟹獼猴給1.0、5.0或15.0mg/kg單一靜脈內(IV)劑量之後(每個劑量組有5隻動物)，表徵抗LAG3抗體mAb1的藥動學。在不同時間點自所有動物收集血液樣品用於測定功能性mAb1濃度。血清中的功能性mAb1濃是使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)來進行測定。使用基於電化學發 功的橋接免疫分析來分析血清中的抗體。使用非房室分析(NCA)來估算PK參數。藉由初始短暫分布期，接著用線性β消除期來表徵平均濃度-時間曲線(圖12)。在8週研究期間沒有觀察到目標媒介的清除期。平均AUCinf以劑量成比例的方式增加，如由測試劑量位準的相似AUCinf/劑量值所證實。與這個發現一致的是，3個劑量組的平均總身體清除率(CL)值相似。另外，3個劑量組的β期半衰期(t1/2)相當，範圍從10.8天到11.5天。根據結果，無觀察到不良作用劑量(NOAEL)可以確立為至多50mg/kg。這些結果指明，mAb1在這個研究條件下證明了線性動力學。
實例17：抗LAG3抗體在石蟹獼猴中的毒物學評估
在4週、重複劑量、符合GLP毒物學研究期間，評估mAb1在公石蟹獼猴與母石蟹獼猴中的活體內毒物學與毒物動力學概況。猴(5隻動物/性別/組)透過IV輸注給予0、2、10，或50mg/kg/週mAb1。毒性的評估是基於死亡率、瀕死、臨床觀察、體重、食物消耗、眼科檢查、ECG評估、呼吸速率、脈搏血氧飽和度，體溫和血壓評估，以及神經學檢查。也評估臨床病理學參數(血液學、凝血、臨床化學和尿分析法)和免疫表現型分析。進行整體屍體剖檢、器官重量的測量和組織病理學評估。完整屍體剖檢是在給藥期結束時或在8週恢復期結束時執行。對選定的器官進行秤重，並用肉眼和顯微鏡檢查組織。
當經由每周IV輸注投予給石蟹獼猴時，mAb1在所有劑量位準下均耐受良好。由於mAb1耐受良好，且在任何評估的安全參數方面並沒有mAb1相關的變化，就本研究來說，無觀察到不良作用劑量(NOAEL)被認為是50mg/kg/劑量，在這項研究中投予的最高劑量。
實例18：結合至hLAG3胞外域之抗LAG3抗體H4sH15482P的氫/氘(H/D)交換 (H/D)-為基礎的表位定位
進行實驗，以確定抗LAG3抗體H4sH15482P所交互作用之人類LAG3胞外域(人類LAG3的胺基酸Leu23-Leu450，UniProt登錄號P18627，生產為在c端帶有人類IgG1標誌(「hLag3.Fc」)(R&D Systems,Minneapolis,MN)(SEQ ID NO：587))的胺基酸殘基。為此，採用氫/氘(H/D)交換表位定位與質譜法(HDX-MS)。HDX方法的一般性描述列於Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；以及Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A A。
實驗程序
在合併的HDX/MS平台(Waters Corporation,Milford,MA)上進行HDX-MS實驗，HDX/MS平台由一個用於氘標定的Leaptec HDX PAL系統、用於樣品消化與加載的Waters Acquity M-Class(Auxiliary溶劑控制器)、用於分析型管柱梯度的Waters Acquity M-Class(μBinary溶劑控制器)，以及用於消化性肽質量測量的Synapt G2-Si質譜儀組成。
在10mM PBS緩衝液中製備D2O為pD 7.0的標定溶液。關於氘標定，預先與抗Lag3抗體H4sH15482P以1：1莫耳比混合的3.8μL LAG3.Fc(5pmol/μL)或hLAG3.Fc和56.2μL D2O標定溶液一起培育歷時不同時間點(例如未氘化對照=0秒，氘化標定：1分鐘與20分鐘)。氘化是透過將50μL樣品轉移至50μL預冷淬滅緩衝液(0.2M TCEP、6M鹽酸胍於100mM磷酸鹽緩衝液中，pH 2.5)並且在1.0℃下培育4分鐘予以淬滅。經淬滅的樣品之後被注入至Waters HDX Manager供進行線上胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化。在0℃下將經消化肽捕獲至ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm，2.1×5mmVanGuard預管柱(Waters Corporation)，並且洗脫至分析型管柱ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm，1.0×50mm進行5%-40% B的9分鐘梯度分離(移動相A：0.1%甲酸/水，移動相B：0.1%甲酸/乙腈)。質譜儀設定在錐電壓37V、掃描時間0.5s 和湯姆森單位(Th)的質量/電荷範圍50-1700。
關於與H4sH15482P交互作用之人類Lag3的肽殘基的鑑定，處理未氘化樣品的LC-MSE數據，並針對包括人類LAG3、胃蛋白酶和隨機化序列之序列的資料庫使用Waters ProteinLynx Global Server(PLGS)軟體進行檢索。所鑑定的肽被輸入DynamX軟體，並藉由兩個標準過濾：1)每個胺基酸最小產物=0.2，和2)的複製檔案閾=3。然後基於留滯時間和在多個時間點內的高質量準確度(<10ppm)(每個時間三重複)，DynamX軟體自動決定每種肽的氘攝取。
結果
使用與MSE數據擷取偶合的線上胃蛋白酶/蛋白酶XIII管柱，於不存在或存在抗體的情況下以可再現的方式鑑定人類LAG3的總計123個肽，123個肽佔78.3%序列覆蓋。當結合至H4sH15482P時，四個Lag-3肽具有明顯降低的氘攝取(在p值<0.05下，質心增量值>0.8道耳頓)。所記錄的肽質量對應於三重複的質心MH+質量平均值。這些肽，對應於hLAG3.Fc的胺基酸34-77(SEQ ID NO：587)，結合至H4sH15482P時具有更慢的氘化率。這些鑑定出的殘基也對應由Uniprot entry P18627(LAG3_HUMAN，SEQ ID NO：588)定義之人類LAG的殘基28-71，並且如表18中所示。
Figure 105132298-A0202-12-0110-33
實例19：抗LAG3抗體在具有晚期惡性病的患者中的臨床試驗
本實例描述一個評估抗LAG3抗體做為單一療法以及與抗PD-1抗體組合在晚期惡性患者者中的安全性，耐受性和抗腫瘤活性的臨床試驗。
用於此研究的例示性抗LAG3抗體是特異地結合至人類LAG3並包含SEQ ID NO：420-422-424-428-430-432的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3及SEQ ID NO：418/426之HCVR/LCVR的完全人類抗體(也稱為H4sH15482P且在下文為「mAb1」)。
此研究中使用的抗PD-1抗體是H4H7798N(如US20150203579中所揭示，也稱為REGN2810)。REGN2810(抗hPD-1)以高親和力結合至人類PD-1並阻斷PD-1與PD-L1和PD-L2的交互作用。
研究目標
研究的主要目標為：在劑量遞增期(dose escalation phase)：為了評估安全性和藥動學(PK)，以便確定mAb1作為單一療法以及與REGN2810組合在晚期惡性病(包括淋巴瘤)患者中的第2期劑量。評估指標包括劑量限制性毒性(DLT)的比率、不良事件(AE)(包括免疫相關)、嚴重不良事件(SAE)、死亡和實驗室異常(依據不良事件評估標準[CTCAE]為第3級或更高級)，以及藥動學。
在劑量擴增期(dose expansion phase)：為了評估mAb1單獨和與REGN2810(依組別分開)組合如透過ORR所測量的初步抗腫瘤活性。評估指標包括總反應率(ORR)，其是基於實體腫瘤反應評估標準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST)1.1(Eisenhauer et al 2009,Eur.J.Cancer 45：228-247)(實體腫瘤)以及Lugano標準(Cheson et al 2014,J.Clin.Oncol.32：3059-3068)(淋巴瘤)。
第二個目標是：(a)評估mAb1單獨和與REGN2810(依組別分開)組合如透過ORR所測量的初步抗腫瘤活性，其是基於免疫相關實體腫瘤反應評估標準(irRECIST)(Wolchok et al 2009,Clin.Cancer Res.15：7412-7420；Nishino et al 2013,Clin.Cancer Res.19：3936-3943)、最佳整體反應(BOR)、反應持續時間(DOR)、疾病控制率，以及基於RECIST、irRECIST和Lugano標準的PFS(Cheson et al 2014,J.Clin.Oncol.32：3059-3068)；(b)表徵每個擴增組的安全性概況，如在劑量遞增期中所測量；(c)表徵mAb1作為單一療法以及mAb1和REGN2810組合給與時的PK；以及(d)評估免疫原性，如藉由針對mAb1與REGN2810的抗藥物抗體(ADA)所測量。
研究的探索目標是：(a)評估腫瘤體積；(b)探究REGN2810在血清、血漿、周邊血液單核細胞(PBMC)，與腫瘤組織樣品中於基線、治療期間還有在進展時得到的藥效學效應，所述樣品是取自經mAb1做為單一療法或與REGN2810組合治療的患者；以及(c)就感興趣的生物標記來評估預測潛力和臨床反應相關性，感興趣的生物標記包括但不限於：(i)循環腫瘤核酸；(ii)PBMC子集分布與免疫檢查點分子和其他感興趣生物標記的表現；(iii)腫瘤RNA表現；(iv)腫瘤浸潤淋巴球的數量與分佈(CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、調節性T細胞和組織，若允許的話其他亞型如B細胞，骨髓衍生細胞，NK細胞等)；(v)PD-1、PD-L1、LAG3，以及可能的其他檢查點調節分子的表現位準(信使RNA及/或蛋白質)；(vi)在已知的致癌基因和潛在腫瘤新抗原中的突變；以及(vii)腫瘤突變負荷。
研究設計
這是一個第1期、首次應用於人體(FIH)、開放標籤、多中心之mAb的安全性、耐受性，活性與PK的劑量遞增研究，mAb1作為單一療法且與REGN2810組合投予給晚期惡性患者者。研究三個劑量位準的mAb1(1.0、3.0和10mg/kg)做為單一療法以及與呈3.0mg/kg的劑量與REGN2810 組合。
在至多28天的篩選期後，患者接受了最多十七個21天治療期(總共最多51週的治療)，其次是24週隨訪期。每位患者每21天接受mAb1(+/- REGN2810)。
持續治療直到51週的治療期結束，或直至疾病進展、不可接受的毒性、撤銷同意或滿足退出研究標準。反應評估是前24週每6週，之後的27週每9週(無論研究藥物給藥是否延遲)。在最少24週治療(最少8個治療週期)後，確定完全緩解(CR)的患者可以選擇停止治療，並繼續所有相關的研究評估。同樣地，在與醫生諮詢後，已經過最少24週治療且病情穩定(SD)或部分反應(PR)，並維持3次連續腫瘤評估的患者可以選擇停止治療，但繼續所有相關研究評估。關於經歷反應以及後續進展的患者，在進展時要求腫瘤生檢。耐受4個劑量的mAb1單一療法還有初始腫瘤評估為至少SD，但後來表現出進展性疾病(PD)的患者可選擇將REGN2810 3.0mg/kg添加至最高劑量的mAb1並在那時安全地投予(如果已知的話)，以試圖透過組合淋巴球活化基因2(LAG-3)與程式化死亡1(PD-1)阻斷來「挽救」反應。安全性評估是在每個研究藥物給藥訪視時進行。
劑量遞增
計畫納入三個劑量遞增單一療法和組合療法(1.0、3.0和10mg/kg mAb1，具有或不具有3mg/kg REGN2810)。參與的第一組接受1.0mg/kg的mAb1單一療法。後續參與的每個額外組別會受限於在先前組別中觀察到的劑量限制性毒性(DLT)的數量。若有必要，加入劑量遞減組(0.3mg/kg mAb1，具有或不具有3mg/kg REGN2810)。
劑量遞增規則
就mAb1單一療法以及mAb1+REGN2810組來說，使用傳統3+3設計的變化形式(「4+3」)評估所有劑量位準。雖然在每個劑量位準有最 少3名患者被要求評估DLT，以使得第1期劑量遞增的效率達到最高，同時維持患者安全性，但還是在每個劑量位準加入4名患者以防患者在評估DLT之前中止。DLT評估期為28天。劑量位準的耐受性只有在所有潛在的DLT評估患者完成28天DLT期間無DLT(0/3或0/4)才會實現。如果3名患者完成DLT期間而沒有經歷DLT，但在DLT評估期間有一個第四名患者，只有在第四位患者完成DLT評估期或在評估DLT之前中止治療才有達到劑量位準耐受性。如果3或4個DLT可評估患者中有1個DLT，然後4名或3名以上患者(分別)被加入為總共7名患者。同樣地，1/6或1/7 DLT被認為是可以耐受的。2至7名可評估患者中有兩個DLT將已超過最大耐受劑量(MTD)。在耐受的最高劑量位準下，為了要進一步評估安全性，加入額外3至4名患者達總共6至10名DLT可評估患者。6至8個DLT中有零到1個，或9至10個DLT中有2個將被認為是可接受的。為了進一步評估安全性，在任一劑量位準下依據贊助商的裁量權(與研究人員諮詢)加入另外3名患者。
如果1.0mg/kg mAb1(劑量位準1；DL1)被認為是安全的(依據3~7名患者)，從3.0mg/kg mAb1(DL2)開始招募。在4名患者加入DL2後，可開始招募第一組合組(1.0mg/kg mAb1+3.0mg/kg REGN2810；DL3)。若3.0mg/kg mAb1(DL2)被認為是安全的，可以開始將劑量遞增至10mg/kg mAb1(DL4)。第二個組合組(3.0mg/kg mAb1+3.0mg/kg REGN2810；DL5)只有在DL2與DL3被認為是安全之後才招募。第三組合組(10mg/kg mAb1+3.0mg/kg REGN2810；DL6)只有在DL4和DL5被認為是安全之後才招募。如果多組是同時接受加入的，優先排到數目較低的組別(即，DL2甚於DL3或DL3甚於DL4)。
劑量限制性毒性
用於決定劑量遞增或開始新組合療法之安全性確定的DLT觀察期被定義為28天，始於週期1，第1天，意欲監控前2個研究藥物劑量 (mAb1，有或沒有REGN2810，視情況而定)的安全性和耐受。要是DLT可評估，則患者必須接受至少前2個劑量的研究藥物(亦即第1天及第22天)並在第一次投藥之後歷時至少28天，以及在第二次投藥之後起至少7天或在DLT期完成之前經歷DLT時(如下定義)予以監測。延遲投予第二劑量研究藥物超過第35天及/或研究藥物中止被認為是DLT(如果是研究藥物相關)。因此，DLT觀察期的持續時間對第二個劑量被延遲的患者來說更長，而對經歷AE的患者來說，必須評估持續期間以便決定該事件是否為DLT。
除了無法在窗內投予(由於研究藥物毒性)劑量# 2以外，DLT通常被定義為下列研究藥物相關毒性的任一者：
非血液學毒性：
‧等級
Figure 105132298-A0202-12-0115-720
2的眼色素層炎
‧任何等級
Figure 105132298-A0202-12-0115-721
3的非血液學毒性(不包括無臨床意義的實驗室異常，諸如澱粉酶或脂肪酶無症狀升高)
血液學毒性：
‧第4級嗜中性球減少症持續>7天
‧第4級血小板減少症
‧第3級血小板減少症伴隨出血
‧等級
Figure 105132298-A0202-12-0115-722
3的發熱性嗜中性球減少症或等級
Figure 105132298-A0202-12-0115-723
3的嗜中性球減少症伴隨經證明的感染
符合DLT定義的irAE與非irAE被認為是DLT。
最大耐受劑量
MTD定義為剛好低於因為6至7個可評估患者中有2或更多個DLT而停止感藥的劑量位準，並且會針對單一療法和組合療法分別確定。然而，由於因為使用REGN2810和其他PD-1/PD-L1抗體的單一療法已知會發生AE，對於組合組來說，組合毒性的強度、頻率和新穎性可能在決定 MTD時還有決定在某個劑量位準增加額外患者時予以考量。如果劑量遞增沒有因為DLT而停止，則會認為MTD尚未確定。將會招募另外3名患者至被認為是最高耐受劑量位準的單一療法組與組合組(亦即這些組的每一者中有6至10名患者)。就mAb1單一療法或與REGN2810一起的組合療法來說，如果劑量遞增因為DLT而在1.0mg/kg時停止，則在0.3mg/kg的劑量招募一組。就mAb1單一療法或組合療法的劑量遞增因為DLT而在3.0或10mg/kg劑量位準時停止，則將新招募患者的mAb1劑量減少至先前的測試劑量位準(分別在單一療法或組合療法組中)。不容許患者使用mAb1作為單一療法時不耐受之劑量來開始組合療法。
建議第2期劑量
擴展組的RP2D將不高於所測試的MTD或最高劑量，且單一療法與組合療法組可能不同。RP2D將基於安全性和PK數據來決定。
耐受4個mAb1劑量，且初始腫瘤評估為至少SD，但之後證明為PD的單一療法組患者能選擇在哪一點安全地投予之最高劑量mAb1(若已知的話)添加REGN2810 3.0mg/kg，透過組合LAG-3與PD1阻斷來試圖「挽救」反應。
擴增組
一旦mAb1單獨和與REGN2810組合已產生耐受性，則在選擇適應症[非小細胞肺癌(NSCLC)、透明細胞腎癌(ccRCC)、三陰性乳癌(TNBC)、黑色素瘤，與瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)]時招募使用單一療法或組合療法的多個擴增組供進一步評估安全性，並且在LAG3已知會表現或過度表現的腫瘤中尋求抗腫瘤活性；mAb1單獨或與REGN2810組合的抗腫瘤活性可能會發生的初步證據。招募擴增組是在劑量遞增完成後才開始。在確認RP2D之後，採用西蒙2階段設計(Simon 1989,Controlled Clinical Trials 10：1-10)來招募額外的10個擴增組(表19)。基於患者的腫瘤類型、存 在或不存在先前抗-PD-1/抗-程式化死亡配體1(PD-L1)療法、研究人員評估療法方案對患者的適合性以及分派治療組中的患者佔位可用性，將患者分派至特定治療組。如果在西蒙2階段設計的第1階段期間在個別擴增組中發生安全性問題，便暫停招募。在研究者和Regeneron公司討論後，在相同或較低劑量的mAb1重新開始招募。觸發暫停的安全性問題可能包括早期或晚期的安全性事件。患者用mAb1(劑量由劑量遞增的研究結果確定)單一療法或組合mAb1與REGN2810 3mg/kg Q3W治療至多51週。只有在第1階段觀察到反應的最低數目時才會招募每個擴增組的第2階段。
Figure 105132298-A0202-12-0117-34
研究母體
在劑量遞增期：未接受使用抗LAG3藥物及/或PD-1/PD-L1抑制劑之先前療法，且並非標準療法的候選者，或者是預期現有療法無法賦予臨床益處的晚期惡性患者者，還有患有無法治癒且無反應或顯示標準療法但仍有腫瘤進展的患者。
在劑量擴增組：未接受抗LAG3藥物先前療法還有下列各者 之帶有選定惡性病的患者：‧先前未接受用抗PD-1/PD-L1的療法，但卻是接受基於抗PD-1之療法的適當候選者(組別1、3、5、6，和9)或‧先前已經接受基於抗PD-1/PD-L1的療法，並對抗PD-1/PD-L1療法有經確認的目標反應(CR或PR)或SD歷時至少3個月，但之後續行治療，或者是具有SD或PR作為最佳反應且後續穩定反應歷時6個月(組別2、4、7和10)或‧不是標準療法的候選者，或對他們來說，預期沒有可用的療法能賦予臨床益處且適於mAb1單一療法(組別8)
納入標準：患者必須滿足以下標準才有資格納入研究：
1.男性和女性
Figure 105132298-A0202-12-0118-724
18歲。
2.劑量遞增組：組織學或細胞學確診為惡性病(包括淋巴瘤)以及經證明腫瘤進展但沒有替代標準照護治療選擇，或沒有替代標準照護但有治癒可能(亦即儘管有標準療法，但不反應或發生腫瘤進展)的患者，及先前未曾用PD-1/PD-L1抑制劑治療的患者。這些患者不需要依據RECIST 1.1或Lugano標準的可衡量疾病。
3.劑量擴增組：滿足下列標準，組織學或細胞學確診為依據RECIST 1.1或Lugano標準之可衡量疾病之下列腫瘤之一的患者：i.抗PD-1/PD-L1未經歷第IIIB期或第IV期NSCLC，先前沒有轉移性疾病療法或在含鉑方案之後有疾病進展/復發(組別1)ii.抗PD-1/PD-L1經歷*第IIIB期或第IV期NSCLC，就轉移性疾病沒有超過2種先前療法(組別2) iii.抗PD-1/PD-L1未經歷晚期或轉移性ccRCC，具有透明細胞組成，其先前已接受1至2次抗血管生成療法方案(組別3)iv.抗PD-1/PD-L1經歷*晚期或轉移性ccRCC，具有透明細胞組成，其先前接受1至2次抗血管生成療法方案(組別4)v.抗PD-1/PD-L1未經歷轉移性TNB(雌激素、孕酮，和人類表皮生長因子受體2陰性)，其先前接受5或更少次療法(組別5)vi.抗PD-1/PD-L1未經歷晚期或轉移性黑色素瘤，其先前接受不超過2次針對轉移性疾病的方案(組別6)vii.抗PD-1/PD-L1經歷*晚期或轉移性黑色素瘤，其先前接受不超過2次針對轉移性疾病的方案(組別7)viii.抗PD-1/PD-L1未經歷復發難治性DLBCL，其之後進展或不是自體幹細胞移植的候選者(組別8和9)ix.抗PD-1/PD-L1經歷*復發/難治性DLBCL，其之後進展或不是自體幹細胞移植的候選者(組別10)注：*抗PD-1/PD-L1經歷定義為已耐受或正在耐受抗PD-1/PD-L1療法(亦即，沒有因為毒性而中止)，且有過疾病控制併有：a.藉由重複成像確認為CR/PR，或從第一次給藥起至少12週、疾病進展前為SD。疾病進展必須在用抗PD-1/PD-L1的療法時或在最後一次給藥的12週內。b. SD或PR作為最佳反應，其中後續穩定反應(相對於基線降低不超過70%)歷時6個月，同時進行抗PD-1/PD-L1療法。
4.東岸癌症臨床研究合作組織體能狀態為0或1
5.預期壽命為至少3個月
6.充足的器官和骨髓功能如下：(a)血紅素
Figure 105132298-A0202-12-0119-725
9.0g/dL；(b)絕對嗜中性球計數
Figure 105132298-A0202-12-0119-727
1.5×109/L；(c)血小板計數
Figure 105132298-A0202-12-0119-729
75×109/L；(d)血清肌酐
Figure 105132298-A0202-12-0119-730
1.5x正常值 上限(ULN)或估算腎小球濾過率>50mL/min/1.73m2；(e)總膽紅素
Figure 105132298-A0202-12-0120-732
1.5x ULN；(f)天冬胺酸轉胺酶和丙胺酸轉移酶(ALT)
Figure 105132298-A0202-12-0120-733
3x ULN，或如果肝臟轉移為
Figure 105132298-A0202-12-0120-734
5x ULN；及/或(g)鹼性磷酸酶
Figure 105132298-A0202-12-0120-739
2.5x ULN(或
Figure 105132298-A0202-12-0120-740
5.0x ULN，如果肝臟或骨轉移的話)
7.願意並且能夠遵守臨床訪視以及研究相關程序
8.提供已簽署的知情同意書。
排除標準：符合下列標準任一者的患者將被排除在研究之外：1.正接受另一個研究的治療，或曾參加研究藥劑的研究並接受過治療，或在研究療法第一次給藥的4週內使用研究裝置，或在研究療法第一次給藥的3週內接受經核准全身性療法的治療，或在研究療法第一次給藥的5個半衰期內接受任何先前全身性療法(取決於何者較長)。僅針對擴增組2、4、7、10(經歷過抗PD-1/PD-L1)，在研究療法第一次給藥3週內不能給予先前抗PD-1/PD-L1療法，不管藥物半衰期或核准狀態。2.先前用任何LAG3靶定生物劑或小分子治療。3.在隨機分組前2週內有放射線療法且因為放射線而未從任何AE回復至基線。4.只有擴增組：另一種進展中或需要使用活性治療的惡性病(除了經過有效治癒療法的黑瘤皮膚癌或原位頸癌以外)，或在招募之前已被視為經有效治療明確局部控制至少2年的任何其他腫瘤。5.未經治療或主動中樞神經系統轉移。先前經治療中樞神經系統轉移的患者要是穩定的話可參與(亦即在研究治療第一次給藥前藉由成像沒有明顯進展歷時至少6週，以及任何神經症狀已回到基線)，以及沒有新的或擴大的中樞神經系統轉移的證據，還有在REGN2810第一次給藥之前4週內不需要任何全身性皮質類固醇用以控制中樞神經系統轉移的患者。6.在知情同意之前的那一年有腦炎、腦膜炎或不受控癲癇。7.正在進行或最近(5年內)，需要使用全身性免疫抑制治療的明顯自體免疫疾病證據。不排除以下：已解決的白斑病、兒童氣喘，只需要激素替代的甲狀腺低能症、不需要全身性治療的第1型糖 尿病或牛皮癬。8.研究藥物第一次給藥前1週內有皮質類固醇療法(>10mg潑尼松/天或等效物)。不排除需要短暫類固醇療程的患者。9.間質性肺病或主動非傳染性肺炎(過去5年)的已知病史或任何證據。10.人類免疫缺乏病毒的不受控感染、B型肝炎或C型肝炎感染；或診斷為免疫缺乏症。11.需要全身性療法的活動性感染。12.在研究藥物計畫開始的30天內接受活疫苗。13.篩選前4週內有重大外科手術、切開活組織檢查或明顯創傷外傷。14.研究療法第一次給藥前9個月內有心肌梗塞。15.先前同種異體幹細胞移植。16.就研究人員來說，參與研究對患者不是最佳利益的任一醫學病況。17.經證明的過敏性或急性過敏反應，歸因於抗體治療。18.已知對去氧羥四環素或其他四環類抗生素過敏。19.已知在研究要求下會干擾參與的精神病或物質濫用病症。20.性活躍男性或有懷孕可能但在研究期間不願實施避孕的女性。在研究計畫持續期間內(篩選訪視至研究藥物最後一次給藥後180天)懷孕、哺乳或預期懷孕的女性，或計畫生子的男性。21.性活躍男性或有懷孕可能但在第一次治療開始之前、研究期間以及研究藥物最後一次給藥投予後至少6個月不願實施避孕的女性。
研究治療
單一療法：mAb1是以下列單一療法劑量每21天在門診環境透過靜脈內(IV)輸注30分鐘來投予歷時至多51週：
‧DL1：每21天1.0mg/kg mAb1 IV輸注30分鐘，歷時51週
‧DL2：每21天3.0mg/kg mAb1 IV輸注30分鐘，歷時51週
‧DL4：每21天10mg/kg mAb1 IV輸注30分鐘，歷時51週
‧DL-1m：每21天0.3mg/kg mAb1 IV輸注30分鐘，歷時51週(若有必要)
組合療法：關於組合療法，研究藥物投予順序是在同一天先mAb1，然後REGN2810。研究藥物是每21天在門診環境透過IV輸注30分 鐘來投予歷時至多51週。要分派的計劃組合方案包括：
‧DL3：每21天1.0mg/kg mAb1和3.0mg/kg REGN2810 IV輸注30分鐘，歷時51週
‧DL5：每21天3.0mg/kg mAb1和3.0mg/kg REGN2810 IV輸注30分鐘，歷時51週
‧DL6：每21天10.0mg/kg mAb1和3.0mg/kg REGN2810 IV輸注30分鐘，歷時每51週
‧DL-1c：每21天0.3mg/kg mAb1和3.0mg/kg REGN2810 IV輸注30分鐘，歷時51週(若有必要)
評估指標 主要評估指標
在劑量遞增期：DLT速率、不良事件(AE，包括免疫相關)、嚴重不良事件(SAE)，死亡和實驗室異常(依據常見不良事件評估標準[CTCAE]為第3級或更高)和PK
在劑量擴增期：根據RECIST 1.1(實體腫瘤)和Lugano標準(淋巴瘤)的客觀反應率(ORR)。
次要評估指標
基於免疫相關實體腫瘤反應評估標準(irRECIST)的ORR；基於RECIST、irRECIST以及Lugano標準的最佳整體反應(BOR)、反應持續時間(DOR)、疾病控制率和無進展生存期(PFS)；AE；包括免疫相關、SAE、死亡和實驗室異常(依據CTCAE為第3級或更高)；PK和ADA。
程序及評估
mAb1單獨或與REGN2810組合的安全性與耐受性是透過臨床評估AE以及臨床評估的重複測量值來進行監測，包括生命徵象(體溫、血壓、脈搏和呼吸)、身體檢查(完整和有限)、12導程心電圖(ECG)，和實驗室 評估(包括標準血液學，化學和尿液分析)。
收集用於確定血清中功能性mAb1和功能性REGN2810的血液樣品以及ADA(抗mAb1或抗REGN2810)樣品。收集血清和血漿樣品用於額外生物標記分析。在血清、血漿、週邊血液單核細胞(PBMC)與腫瘤組織中研究推測之藥效學、與mAb1和REGN2810治療暴露有關的預測和預後生物標記、臨床活性，或潛在疾病。透過CT和MRI評估抗腫瘤活性。基因組DNA樣品是從同意進行選擇性藥物基因組學子研究的患者收集而來。
結果
預期mAb1投藥在本研究中對具有晚期惡性病的患者來說是安全且耐受良好。與3mg/kg REGN2810組合預期導致腫瘤消退，如藉由ORR在實體腫瘤患者體內所評估，實體腫瘤為諸如非小細胞肺癌、黑色素瘤、透明細胞腎癌，B細胞淋巴瘤或乳癌。
本發明不受限於本文所述特定具體例的範疇。事實上，除了本文所述的那些修改以外，本發明的各種修改對於習於技藝者來說，由先前說明以及附圖會變得清楚。這樣的修改意欲落入隨附申請專利範圍的範疇內。
<110> 美商再生元醫藥公司(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)
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<223> 合成
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 79
Figure 105132298-A0202-12-0145-372
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 80
Figure 105132298-A0202-12-0145-373
<210> 81
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 81
Figure 105132298-A0202-12-0145-77
<210> 82
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
Figure 105132298-A0202-12-0145-78
Figure 105132298-A0202-12-0146-81
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
Figure 105132298-A0202-12-0146-374
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 84
Figure 105132298-A0202-12-0146-376
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
Figure 105132298-A0202-12-0146-375
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
Figure 105132298-A0202-12-0147-377
<210> 87
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
Figure 105132298-A0202-12-0147-378
<210> 88
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
Figure 105132298-A0202-12-0147-379
<210> 89
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 89
Figure 105132298-A0202-12-0147-83
<210> 90
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 90
Figure 105132298-A0202-12-0148-84
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 91
Figure 105132298-A0202-12-0148-380
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 92
Figure 105132298-A0202-12-0148-381
<210> 93
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 93
Figure 105132298-A0202-12-0149-382
<210> 94
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 94
Figure 105132298-A0202-12-0149-384
<210> 95
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 95
Figure 105132298-A0202-12-0149-383
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 96
Figure 105132298-A0202-12-0149-385
<210> 97
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 97
Figure 105132298-A0202-12-0149-85
Figure 105132298-A0202-12-0150-86
<210> 98
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
Figure 105132298-A0202-12-0150-87
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 99
Figure 105132298-A0202-12-0150-386
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 100
Figure 105132298-A0202-12-0150-387
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 101
Figure 105132298-A0202-12-0151-388
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
Figure 105132298-A0202-12-0151-391
<210> 103
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
Figure 105132298-A0202-12-0151-389
<210> 104
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
Figure 105132298-A0202-12-0151-390
<210> 105
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 105
Figure 105132298-A0202-12-0152-89
<210> 106
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
Figure 105132298-A0202-12-0152-88
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 107
Figure 105132298-A0202-12-0152-392
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 108
Figure 105132298-A0202-12-0152-393
<210> 109
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 109
Figure 105132298-A0202-12-0153-394
<210> 110
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 110
Figure 105132298-A0202-12-0153-396
<210> 111
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 111
Figure 105132298-A0202-12-0153-395
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 112
Figure 105132298-A0202-12-0153-397
<210> 113
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 113
Figure 105132298-A0202-12-0154-91
<210> 114
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 114
Figure 105132298-A0202-12-0154-90
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 115
Figure 105132298-A0202-12-0154-398
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 116
Figure 105132298-A0202-12-0155-401
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 117
Figure 105132298-A0202-12-0155-399
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 118
Figure 105132298-A0202-12-0155-402
<210> 119
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 119
Figure 105132298-A0202-12-0155-400
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 120
Figure 105132298-A0202-12-0155-403
<210> 121
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 121
Figure 105132298-A0202-12-0156-93
<210> 122
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 122
Figure 105132298-A0202-12-0156-92
<210> 123
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 123
Figure 105132298-A0202-12-0156-404
<210> 124
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 124
Figure 105132298-A0202-12-0157-407
<210> 125
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 125
Figure 105132298-A0202-12-0157-405
<210> 126
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 126
Figure 105132298-A0202-12-0157-408
<210> 127
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 127
Figure 105132298-A0202-12-0157-406
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 128
Figure 105132298-A0202-12-0157-409
Figure 105132298-A0202-12-0158-96
<210> 129
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 129
Figure 105132298-A0202-12-0158-95
<210> 130
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 130
Figure 105132298-A0202-12-0158-94
<210> 131
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 131
Figure 105132298-A0202-12-0159-97
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 132
Figure 105132298-A0202-12-0159-410
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 133
Figure 105132298-A0202-12-0159-411
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 134
Figure 105132298-A0202-12-0159-413
<210> 135
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 135
Figure 105132298-A0202-12-0159-412
<210> 136
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 136
Figure 105132298-A0202-12-0160-414
<210> 137
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 137
Figure 105132298-A0202-12-0160-98
<210> 138
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 138
Figure 105132298-A0202-12-0160-99
<210> 139
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 139
Figure 105132298-A0202-12-0161-415
<210> 140
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 140
Figure 105132298-A0202-12-0161-418
<210> 141
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 141
Figure 105132298-A0202-12-0161-416
<210> 142
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 142
Figure 105132298-A0202-12-0161-419
<210> 143
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 143
Figure 105132298-A0202-12-0161-417
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 144
Figure 105132298-A0202-12-0162-420
<210> 145
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 145
Figure 105132298-A0202-12-0162-101
<210> 146
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 146
Figure 105132298-A0202-12-0162-100
<210> 147
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 147
Figure 105132298-A0202-12-0163-421
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 148
Figure 105132298-A0202-12-0163-423
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 149
Figure 105132298-A0202-12-0163-422
<210> 150
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 150
Figure 105132298-A0202-12-0163-424
<210> 151
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 151
Figure 105132298-A0202-12-0164-426
<210> 152
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 152
Figure 105132298-A0202-12-0164-425
<210> 153
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 153
Figure 105132298-A0202-12-0164-102
<210> 154
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 154
Figure 105132298-A0202-12-0164-103
Figure 105132298-A0202-12-0165-104
<210> 155
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 155
Figure 105132298-A0202-12-0165-427
<210> 156
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 156
Figure 105132298-A0202-12-0165-429
<210> 157
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 157
Figure 105132298-A0202-12-0165-428
<210> 158
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 158
<210> 159
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 159
Figure 105132298-A0202-12-0166-431
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 160
Figure 105132298-A0202-12-0166-432
<210> 161
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 161
Figure 105132298-A0202-12-0166-106
<210> 162
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 162
Figure 105132298-A0202-12-0166-105
Figure 105132298-A0202-12-0167-107
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 163
Figure 105132298-A0202-12-0167-433
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 164
Figure 105132298-A0202-12-0167-435
<210> 165
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 165
Figure 105132298-A0202-12-0167-434
<210> 166
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 166
Figure 105132298-A0202-12-0167-436
<210> 167
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 167
Figure 105132298-A0202-12-0168-437
<210> 168
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 168
Figure 105132298-A0202-12-0168-438
<210> 169
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 169
Figure 105132298-A0202-12-0168-108
<210> 170
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 170
Figure 105132298-A0202-12-0168-109
Figure 105132298-A0202-12-0169-110
<210> 171
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 171
Figure 105132298-A0202-12-0169-439
<210> 172
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 172
Figure 105132298-A0202-12-0169-441
<210> 173
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 173
Figure 105132298-A0202-12-0169-440
<210> 174
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 174
Figure 105132298-A0202-12-0170-442
<210> 175
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 175
Figure 105132298-A0202-12-0170-443
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 176
Figure 105132298-A0202-12-0170-444
<210> 177
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 177
Figure 105132298-A0202-12-0170-112
<210> 178
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 178
Figure 105132298-A0202-12-0171-113
<210> 179
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 179
Figure 105132298-A0202-12-0171-445
<210> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 180
Figure 105132298-A0202-12-0171-447
<210> 181
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 181
Figure 105132298-A0202-12-0171-446
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 182
Figure 105132298-A0202-12-0172-448
<210> 183
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 183
Figure 105132298-A0202-12-0172-449
<210> 184
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 184
Figure 105132298-A0202-12-0172-450
<210> 185
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 185
Figure 105132298-A0202-12-0172-114
<210> 186
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 186
Figure 105132298-A0202-12-0173-115
<210> 187
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 187
Figure 105132298-A0202-12-0173-451
<210> 188
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 188
Figure 105132298-A0202-12-0173-452
<210> 189
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 189
Figure 105132298-A0202-12-0174-453
<210> 190
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 190
Figure 105132298-A0202-12-0174-459
<210> 191
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 191
Figure 105132298-A0202-12-0174-454
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 192
Figure 105132298-A0202-12-0174-455
<210> 193
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 193
Figure 105132298-A0202-12-0174-116
<210> 194
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 194
Figure 105132298-A0202-12-0175-117
<210> 195
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 195
Figure 105132298-A0202-12-0175-456
<210> 196
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 196
Figure 105132298-A0202-12-0175-457
<210> 197
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 197
Figure 105132298-A0202-12-0176-460
<210> 198
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 198
Figure 105132298-A0202-12-0176-464
<210> 199
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 199
Figure 105132298-A0202-12-0176-461
<210> 200
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 200
Figure 105132298-A0202-12-0176-462
<210> 201
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 201
Figure 105132298-A0202-12-0176-463
Figure 105132298-A0202-12-0177-118
<210> 202
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 202
Figure 105132298-A0202-12-0177-119
<210> 203
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 203
Figure 105132298-A0202-12-0177-465
<210> 204
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 204
Figure 105132298-A0202-12-0177-466
<210> 205
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 205
Figure 105132298-A0202-12-0178-468
<210> 206
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 206
Figure 105132298-A0202-12-0178-470
<210> 207
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 207
Figure 105132298-A0202-12-0178-467
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 208
Figure 105132298-A0202-12-0178-469
<210> 209
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 209
Figure 105132298-A0202-12-0179-742
<210> 210
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 210
Figure 105132298-A0202-12-0179-120
<210> 211
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 211
Figure 105132298-A0202-12-0179-471
<210> 212
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 212
Figure 105132298-A0202-12-0180-472
<210> 213
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 213
Figure 105132298-A0202-12-0180-473
<210> 214
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 214
Figure 105132298-A0202-12-0180-475
<210> 215
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 215
Figure 105132298-A0202-12-0180-474
<210> 216
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 216
Figure 105132298-A0202-12-0180-122
<210> 217
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 217
Figure 105132298-A0202-12-0181-123
<210> 218
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 218
Figure 105132298-A0202-12-0181-124
<210> 219
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 219
Figure 105132298-A0202-12-0181-476
<210> 220
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 220
Figure 105132298-A0202-12-0182-477
<210> 221
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 221
Figure 105132298-A0202-12-0182-478
<210> 222
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 222
Figure 105132298-A0202-12-0182-480
<210> 223
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 223
Figure 105132298-A0202-12-0182-479
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 224
Figure 105132298-A0202-12-0183-125
<210> 225
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 225
Figure 105132298-A0202-12-0183-126
<210> 226
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 226
Figure 105132298-A0202-12-0183-127
<210> 227
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 227
Figure 105132298-A0202-12-0184-481
<210> 228
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 228
Figure 105132298-A0202-12-0184-483
<210> 229
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 229
Figure 105132298-A0202-12-0184-482
<210> 230
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 230
Figure 105132298-A0202-12-0184-484
<210> 231
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 231
Figure 105132298-A0202-12-0184-128
<210> 232
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 232
Figure 105132298-A0202-12-0185-129
<210> 233
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 233
Figure 105132298-A0202-12-0185-130
<210> 234
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 234
Figure 105132298-A0202-12-0185-131
<210> 235
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 235
Figure 105132298-A0202-12-0186-485
<210> 236
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 236
Figure 105132298-A0202-12-0186-488
<210> 237
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 237
Figure 105132298-A0202-12-0186-486
<210> 238
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 238
Figure 105132298-A0202-12-0186-487
<210> 239
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 239
Figure 105132298-A0202-12-0187-489
<210> 240
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 240
Figure 105132298-A0202-12-0187-490
<210> 241
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 241
Figure 105132298-A0202-12-0187-133
<210> 242
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 242
Figure 105132298-A0202-12-0187-132
Figure 105132298-A0202-12-0188-134
<210> 243
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 243
Figure 105132298-A0202-12-0188-491
<210> 244
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 244
Figure 105132298-A0202-12-0188-493
<210> 245
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 245
Figure 105132298-A0202-12-0188-492
<210> 246
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 246
Figure 105132298-A0202-12-0188-136
<210> 247
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 247
Figure 105132298-A0202-12-0189-494
<210> 248
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 248
Figure 105132298-A0202-12-0189-495
<210> 249
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 249
Figure 105132298-A0202-12-0189-137
<210> 250
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 250
Figure 105132298-A0202-12-0189-138
Figure 105132298-A0202-12-0190-139
<210> 251
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 251
Figure 105132298-A0202-12-0190-496
<210> 252
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 252
Figure 105132298-A0202-12-0190-498
<210> 253
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 253
Figure 105132298-A0202-12-0190-497
<210> 254
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 254
Figure 105132298-A0202-12-0190-499
Figure 105132298-A0202-12-0191-500
<210> 255
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 255
Figure 105132298-A0202-12-0191-501
<210> 256
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 256
Figure 105132298-A0202-12-0191-502
<210> 257
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 357
Figure 105132298-A0202-12-0191-140
<210> 258
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 258
Figure 105132298-A0202-12-0191-141
Figure 105132298-A0202-12-0192-142
<210> 259
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 259
Figure 105132298-A0202-12-0192-503
<210> 260
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 260
Figure 105132298-A0202-12-0192-505
<210> 261
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 261
Figure 105132298-A0202-12-0192-504
<210> 262
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 262
Figure 105132298-A0202-12-0193-506
<210> 263
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 263
Figure 105132298-A0202-12-0193-507
<210> 264
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 264
Figure 105132298-A0202-12-0193-508
<210> 265
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 265
Figure 105132298-A0202-12-0193-143
<210> 266
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 366
Figure 105132298-A0202-12-0194-144
<210> 267
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 267
Figure 105132298-A0202-12-0194-509
<210> 268
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 268
Figure 105132298-A0202-12-0194-511
<210> 269
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 269
Figure 105132298-A0202-12-0194-510
<210> 270
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 270
Figure 105132298-A0202-12-0195-512
<210> 271
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 271
Figure 105132298-A0202-12-0195-513
<210> 272
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 272
Figure 105132298-A0202-12-0195-514
<210> 273
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 273
Figure 105132298-A0202-12-0195-145
<210> 274
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 274
Figure 105132298-A0202-12-0196-146
<210> 275
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 275
Figure 105132298-A0202-12-0196-515
<210> 276
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 276
Figure 105132298-A0202-12-0196-516
<210> 277
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 277
Figure 105132298-A0202-12-0197-517
<210> 278
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 278
Figure 105132298-A0202-12-0197-519
<210> 279
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 279
Figure 105132298-A0202-12-0197-518
<210> 280
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 280
Figure 105132298-A0202-12-0197-147
<210> 281
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 281
Figure 105132298-A0202-12-0197-148
Figure 105132298-A0202-12-0198-149
<210> 282
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 282
Figure 105132298-A0202-12-0198-150
<210> 283
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 283
Figure 105132298-A0202-12-0198-520
<210> 284
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 284
Figure 105132298-A0202-12-0198-151
<210> 285
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 285
Figure 105132298-A0202-12-0199-521
<210> 286
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 286
Figure 105132298-A0202-12-0199-523
<210> 287
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 287
Figure 105132298-A0202-12-0199-522
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 288
Figure 105132298-A0202-12-0199-524
<210> 289
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 289
Figure 105132298-A0202-12-0200-153
<210> 290
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 290
Figure 105132298-A0202-12-0200-152
<210> 291
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 291
Figure 105132298-A0202-12-0200-525
<210> 292
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 292
Figure 105132298-A0202-12-0201-528
<210> 293
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 293
Figure 105132298-A0202-12-0201-527
<210> 294
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 294
Figure 105132298-A0202-12-0201-529
<210> 295
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 295
Figure 105132298-A0202-12-0201-526
<210> 296
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 296
Figure 105132298-A0202-12-0201-530
<210> 297
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 297
Figure 105132298-A0202-12-0202-155
<210> 298
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 298
Figure 105132298-A0202-12-0202-156
<210> 299
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 299
Figure 105132298-A0202-12-0202-531
<210> 300
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 300
Figure 105132298-A0202-12-0203-532
<210> 301
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 301
Figure 105132298-A0202-12-0203-533
<210> 302
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 302
Figure 105132298-A0202-12-0203-535
<210> 303
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 303
Figure 105132298-A0202-12-0203-534
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 304
Figure 105132298-A0202-12-0203-536
Figure 105132298-A0202-12-0204-159
<210> 305
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 305
Figure 105132298-A0202-12-0204-158
<210> 306
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 306
Figure 105132298-A0202-12-0204-157
<210> 307
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 307
Figure 105132298-A0202-12-0205-539
<210> 308
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 308
Figure 105132298-A0202-12-0205-537
<210> 309
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 309
Figure 105132298-A0202-12-0205-540
<210> 310
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 310
Figure 105132298-A0202-12-0205-538
<210> 311
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 311
Figure 105132298-A0202-12-0205-541
<210> 312
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 312
Figure 105132298-A0202-12-0206-542
<210> 313
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 313
Figure 105132298-A0202-12-0206-160
<210> 314
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 314
Figure 105132298-A0202-12-0206-161
<210> 315
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 315
Figure 105132298-A0202-12-0207-543
<210> 316
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 316
Figure 105132298-A0202-12-0207-546
<210> 317
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 317
Figure 105132298-A0202-12-0207-544
<210> 318
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 318
Figure 105132298-A0202-12-0207-547
<210> 319
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 319
Figure 105132298-A0202-12-0207-545
<210> 320
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 320
Figure 105132298-A0202-12-0208-548
<210> 321
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 321
Figure 105132298-A0202-12-0208-162
<210> 322
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 322
Figure 105132298-A0202-12-0208-164
<210> 323
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 323
Figure 105132298-A0202-12-0209-549
<210> 324
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 324
Figure 105132298-A0202-12-0209-551
<210> 325
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 325
Figure 105132298-A0202-12-0209-550
<210> 326
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 326
Figure 105132298-A0202-12-0209-552
<210> 327
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 327
Figure 105132298-A0202-12-0210-553
<210> 328
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 328
Figure 105132298-A0202-12-0210-554
<210> 329
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 329
Figure 105132298-A0202-12-0210-165
<210> 330
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 330
Figure 105132298-A0202-12-0210-166
Figure 105132298-A0202-12-0211-167
<210> 331
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 331
Figure 105132298-A0202-12-0211-555
<210> 332
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 332
Figure 105132298-A0202-12-0211-557
<210> 333
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 333
Figure 105132298-A0202-12-0211-556
<210> 334
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 334
Figure 105132298-A0202-12-0211-558
<210> 335
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 335
Figure 105132298-A0202-12-0212-559
<210> 336
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 336
Figure 105132298-A0202-12-0212-560
<210> 337
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 337
Figure 105132298-A0202-12-0212-169
<210> 338
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 338
Figure 105132298-A0202-12-0212-168
Figure 105132298-A0202-12-0213-170
<210> 339
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 339
Figure 105132298-A0202-12-0213-561
<210> 340
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 340
Figure 105132298-A0202-12-0213-563
<210> 341
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 341
Figure 105132298-A0202-12-0213-562
<210> 342
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 342
Figure 105132298-A0202-12-0213-564
Figure 105132298-A0202-12-0214-172
<210> 343
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 343
Figure 105132298-A0202-12-0214-565
<210> 344
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 344
Figure 105132298-A0202-12-0214-566
<210> 345
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 345
Figure 105132298-A0202-12-0214-171
<210> 346
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 346
Figure 105132298-A0202-12-0215-173
<210> 347
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 347
Figure 105132298-A0202-12-0215-567
<210> 348
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 348
Figure 105132298-A0202-12-0215-569
<210> 349
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 349
Figure 105132298-A0202-12-0215-568
<210> 350
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 350
Figure 105132298-A0202-12-0216-570
<210> 351
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 351
Figure 105132298-A0202-12-0216-571
<210> 352
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 352
Figure 105132298-A0202-12-0216-572
<210> 353
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 353
Figure 105132298-A0202-12-0216-174
<210> 354
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 354
Figure 105132298-A0202-12-0217-176
<210> 355
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 355
Figure 105132298-A0202-12-0217-177
<210> 356
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 356
Figure 105132298-A0202-12-0217-573
<210> 357
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 357
Figure 105132298-A0202-12-0218-178
<210> 358
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 358
Figure 105132298-A0202-12-0218-574
<210> 359
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 359
Figure 105132298-A0202-12-0218-576
<210> 360
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 360
Figure 105132298-A0202-12-0218-575
<210> 361
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 361
Figure 105132298-A0202-12-0218-179
Figure 105132298-A0202-12-0219-180
<210> 362
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 362
Figure 105132298-A0202-12-0219-182
<210> 363
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 363
Figure 105132298-A0202-12-0219-577
<210> 364
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 364
Figure 105132298-A0202-12-0219-578
<210> 365
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 365
Figure 105132298-A0202-12-0220-579
<210> 366
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 366
Figure 105132298-A0202-12-0220-581
<210> 367
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 367
Figure 105132298-A0202-12-0220-580
<210> 368
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 368
Figure 105132298-A0202-12-0220-185
<210> 369
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 369
Figure 105132298-A0202-12-0220-183
Figure 105132298-A0202-12-0221-186
<210> 370
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 370
Figure 105132298-A0202-12-0221-187
<210> 371
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 371
Figure 105132298-A0202-12-0221-582
<210> 372
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 372
Figure 105132298-A0202-12-0221-583
<210> 373
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 373
Figure 105132298-A0202-12-0222-584
<210> 374
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 374
Figure 105132298-A0202-12-0222-585
<210> 375
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 375
Figure 105132298-A0202-12-0222-586
<210> 376
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 376
Figure 105132298-A0202-12-0222-587
<210> 377
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 377
Figure 105132298-A0202-12-0223-189
<210> 378
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 378
Figure 105132298-A0202-12-0223-188
<210> 379
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 379
Figure 105132298-A0202-12-0223-588
<210> 380
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 380
Figure 105132298-A0202-12-0224-190
<210> 381
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 381
Figure 105132298-A0202-12-0224-589
<210> 382
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 382
Figure 105132298-A0202-12-0224-744
<210> 383
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 383
Figure 105132298-A0202-12-0224-590
<210> 384
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 384
Figure 105132298-A0202-12-0224-191
<210> 385
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 385
Figure 105132298-A0202-12-0225-195
<210> 386
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 386
Figure 105132298-A0202-12-0225-193
<210> 387
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 387
Figure 105132298-A0202-12-0225-192
<210> 388
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 388
Figure 105132298-A0202-12-0226-197
<210> 389
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 389
Figure 105132298-A0202-12-0226-592
<210> 390
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 390
Figure 105132298-A0202-12-0226-594
<210> 391
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 391
Figure 105132298-A0202-12-0226-593
<210> 392
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 392
Figure 105132298-A0202-12-0227-198
<210> 393
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 393
Figure 105132298-A0202-12-0227-199
<210> 394
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 394
Figure 105132298-A0202-12-0227-200
<210> 395
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 395
Figure 105132298-A0202-12-0228-595
<210> 396
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 396
Figure 105132298-A0202-12-0228-597
<210> 397
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 397
Figure 105132298-A0202-12-0228-596
<210> 398
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 398
Figure 105132298-A0202-12-0228-598
<210> 399
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 399
Figure 105132298-A0202-12-0228-599
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 400
Figure 105132298-A0202-12-0229-600
<210> 401
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 401
Figure 105132298-A0202-12-0229-202
<210> 402
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 402
Figure 105132298-A0202-12-0229-203
<210> 403
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 403
Figure 105132298-A0202-12-0230-601
<210> 404
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 404
Figure 105132298-A0202-12-0230-603
<210> 405
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 405
Figure 105132298-A0202-12-0230-602
<210> 406
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 406
Figure 105132298-A0202-12-0230-604
<210> 407
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 407
Figure 105132298-A0202-12-0231-204
<210> 408
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 408
Figure 105132298-A0202-12-0231-207
<210> 409
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 409
Figure 105132298-A0202-12-0231-205
<210> 410
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 410
Figure 105132298-A0202-12-0231-206
<210> 411
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 411
Figure 105132298-A0202-12-0232-605
<210> 412
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 412
Figure 105132298-A0202-12-0232-607
<210> 413
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 413
Figure 105132298-A0202-12-0232-606
<210> 414
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 414
Figure 105132298-A0202-12-0232-608
<210> 415
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 415
Figure 105132298-A0202-12-0233-609
<210> 416
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 416
Figure 105132298-A0202-12-0233-610
<210> 417
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 417
Figure 105132298-A0202-12-0233-209
<210> 418
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 418
Figure 105132298-A0202-12-0233-210
Figure 105132298-A0202-12-0234-211
<210> 419
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 419
Figure 105132298-A0202-12-0234-611
<210> 420
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 420
Figure 105132298-A0202-12-0234-613
<210> 421
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 421
Figure 105132298-A0202-12-0234-612
<210> 422
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 422
Figure 105132298-A0202-12-0234-614
<210> 423
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 423
Figure 105132298-A0202-12-0235-615
<210> 424
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 424
Figure 105132298-A0202-12-0235-616
<210> 425
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 425
Figure 105132298-A0202-12-0235-212
<210> 426
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 426
Figure 105132298-A0202-12-0235-213
Figure 105132298-A0202-12-0236-214
<210> 427
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 427
Figure 105132298-A0202-12-0236-617
<210> 428
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 428
Figure 105132298-A0202-12-0236-619
<210> 429
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 429
Figure 105132298-A0202-12-0236-618
<210> 430
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 430
Figure 105132298-A0202-12-0236-620
Figure 105132298-A0202-12-0237-217
<210> 431
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 431
Figure 105132298-A0202-12-0237-621
<210> 432
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 432
Figure 105132298-A0202-12-0237-622
<210> 433
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 433
Figure 105132298-A0202-12-0237-215
<210> 434
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 434
Figure 105132298-A0202-12-0237-216
Figure 105132298-A0202-12-0238-218
<210> 435
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 435
Figure 105132298-A0202-12-0238-623
<210> 436
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 436
Figure 105132298-A0202-12-0238-625
<210> 437
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 437
Figure 105132298-A0202-12-0238-624
<210> 438
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 438
Figure 105132298-A0202-12-0239-626
<210> 439
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 439
Figure 105132298-A0202-12-0239-627
<210> 440
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 440
Figure 105132298-A0202-12-0239-628
<210> 441
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 441
Figure 105132298-A0202-12-0239-219
<210> 442
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 442
Figure 105132298-A0202-12-0240-220
<210> 443
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 443
Figure 105132298-A0202-12-0240-629
<210> 444
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 444
Figure 105132298-A0202-12-0240-631
<210> 445
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 445
Figure 105132298-A0202-12-0240-630
<210> 446
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 446
Figure 105132298-A0202-12-0241-745
<210> 447
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 447
Figure 105132298-A0202-12-0241-633
<210> 448
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 448
Figure 105132298-A0202-12-0241-632
<210> 449
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 449
Figure 105132298-A0202-12-0241-221
<210> 450
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 450
Figure 105132298-A0202-12-0242-222
<210> 451
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 451
Figure 105132298-A0202-12-0242-637
<210> 452
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 452
Figure 105132298-A0202-12-0242-636
<210> 453
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 453
Figure 105132298-A0202-12-0243-638
<210> 454
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 454
Figure 105132298-A0202-12-0243-640
<210> 455
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 455
Figure 105132298-A0202-12-0243-639
<210> 456
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 456
Figure 105132298-A0202-12-0243-641
<210> 457
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 457
Figure 105132298-A0202-12-0243-224
Figure 105132298-A0202-12-0244-225
<210> 458
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 458
Figure 105132298-A0202-12-0244-226
<210> 459
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 459
Figure 105132298-A0202-12-0244-642
<210> 460
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 460
Figure 105132298-A0202-12-0244-643
<210> 461
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 461
Figure 105132298-A0202-12-0245-644
<210> 462
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 462
Figure 105132298-A0202-12-0245-646
<210> 463
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 463
Figure 105132298-A0202-12-0245-645
<210> 464
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 464
Figure 105132298-A0202-12-0245-647
<210> 465
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 465
Figure 105132298-A0202-12-0246-228
<210> 466
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 466
Figure 105132298-A0202-12-0246-227
<210> 467
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 467
Figure 105132298-A0202-12-0246-648
<210> 468
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 468
Figure 105132298-A0202-12-0247-649
<210> 469
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 469
Figure 105132298-A0202-12-0247-650
<210> 470
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 470
Figure 105132298-A0202-12-0247-651
<210> 471
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 471
Figure 105132298-A0202-12-0247-652
<210> 472
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 472
Figure 105132298-A0202-12-0247-653
Figure 105132298-A0202-12-0248-229
<210> 473
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 473
Figure 105132298-A0202-12-0248-230
<210> 474
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 474
Figure 105132298-A0202-12-0248-231
<210> 475
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 475
Figure 105132298-A0202-12-0249-654
<210> 476
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 476
Figure 105132298-A0202-12-0249-656
<210> 477
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 477
Figure 105132298-A0202-12-0249-655
<210> 478
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 478
Figure 105132298-A0202-12-0249-657
<210> 479
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 479
Figure 105132298-A0202-12-0249-658
<210> 480
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 480
Figure 105132298-A0202-12-0250-659
<210> 481
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 481
Figure 105132298-A0202-12-0250-232
<210> 482
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 482
Figure 105132298-A0202-12-0250-233
<210> 483
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 483
Figure 105132298-A0202-12-0251-661
<210> 484
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 484
Figure 105132298-A0202-12-0251-662
<210> 485
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 485
Figure 105132298-A0202-12-0251-660
<210> 486
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 486
Figure 105132298-A0202-12-0251-663
<210> 487
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 487
Figure 105132298-A0202-12-0252-664
<210> 488
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 488
Figure 105132298-A0202-12-0252-665
<210> 489
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 489
Figure 105132298-A0202-12-0252-234
<210> 490
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 490
Figure 105132298-A0202-12-0252-235
Figure 105132298-A0202-12-0253-236
<210> 491
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 491
Figure 105132298-A0202-12-0253-666
<210> 492
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 492
Figure 105132298-A0202-12-0253-668
<210> 493
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 493
Figure 105132298-A0202-12-0253-667
<210> 494
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 494
Figure 105132298-A0202-12-0254-669
<210> 495
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 495
Figure 105132298-A0202-12-0254-670
<210> 496
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 496
Figure 105132298-A0202-12-0254-671
<210> 497
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 497
Figure 105132298-A0202-12-0254-237
<210> 498
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 498
Figure 105132298-A0202-12-0255-239
<210> 499
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 499
Figure 105132298-A0202-12-0255-672
<210> 500
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 500
Figure 105132298-A0202-12-0255-674
<210> 501
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 501
Figure 105132298-A0202-12-0255-673
<210> 502
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 502
Figure 105132298-A0202-12-0256-675
<210> 503
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 503
Figure 105132298-A0202-12-0256-676
<210> 504
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 504
Figure 105132298-A0202-12-0256-677
<210> 505
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 505
Figure 105132298-A0202-12-0256-240
<210> 506
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 506
Figure 105132298-A0202-12-0257-241
<210> 507
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 507
Figure 105132298-A0202-12-0257-678
<210> 508
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 508
Figure 105132298-A0202-12-0257-679
<210> 509
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 509
Figure 105132298-A0202-12-0258-680
<210> 510
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 510
Figure 105132298-A0202-12-0258-683
<210> 511
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 511
Figure 105132298-A0202-12-0258-681
<210> 512
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 512
Figure 105132298-A0202-12-0258-682
<210> 513
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 513
Figure 105132298-A0202-12-0258-242
Figure 105132298-A0202-12-0259-243
<210> 514
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 514
Figure 105132298-A0202-12-0259-244
<210> 515
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 515
Figure 105132298-A0202-12-0259-684
<210> 516
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 516
Figure 105132298-A0202-12-0260-245
<210> 517
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 517
Figure 105132298-A0202-12-0260-685
<210> 518
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 518
Figure 105132298-A0202-12-0260-686
<210> 519
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 519
Figure 105132298-A0202-12-0260-246
<210> 520
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 520
Figure 105132298-A0202-12-0260-247
<210> 521
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 521
Figure 105132298-A0202-12-0261-249
<210> 522
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 522
Figure 105132298-A0202-12-0261-248
<210> 523
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 523
Figure 105132298-A0202-12-0261-687
<210> 524
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 524
Figure 105132298-A0202-12-0262-250
<210> 525
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 525
Figure 105132298-A0202-12-0262-688
<210> 526
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 526
Figure 105132298-A0202-12-0262-690
<210> 527
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 527
Figure 105132298-A0202-12-0262-689
<210> 528
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 528
Figure 105132298-A0202-12-0262-691
Figure 105132298-A0202-12-0263-251
<210> 529
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 529
Figure 105132298-A0202-12-0263-252
<210> 530
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 530
Figure 105132298-A0202-12-0263-253
<210> 531
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 531
Figure 105132298-A0202-12-0263-254
<210> 532
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 532
Figure 105132298-A0202-12-0264-255
<210> 533
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 533
Figure 105132298-A0202-12-0264-692
<210> 534
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 534
Figure 105132298-A0202-12-0264-694
<210> 535
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 535
Figure 105132298-A0202-12-0264-693
<210> 536
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 536
Figure 105132298-A0202-12-0265-256
<210> 537
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 537
Figure 105132298-A0202-12-0265-257
<210> 538
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 538
Figure 105132298-A0202-12-0265-258
<210> 539
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 539
Figure 105132298-A0202-12-0266-695
<210> 540
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 540
Figure 105132298-A0202-12-0266-697
<210> 541
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 541
Figure 105132298-A0202-12-0266-696
<210> 542
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 542
Figure 105132298-A0202-12-0266-698
<210> 543
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 543
Figure 105132298-A0202-12-0266-699
<210> 544
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 544
Figure 105132298-A0202-12-0267-259
<210> 545
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 545
Figure 105132298-A0202-12-0267-260
<210> 546
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 546
Figure 105132298-A0202-12-0267-261
<210> 547
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 547
Figure 105132298-A0202-12-0268-700
<210> 548
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 548
Figure 105132298-A0202-12-0268-702
<210> 549
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 549
Figure 105132298-A0202-12-0268-701
<210> 550
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 550
Figure 105132298-A0202-12-0268-703
<210> 551
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 551
Figure 105132298-A0202-12-0268-704
<210> 552
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 552
Figure 105132298-A0202-12-0269-262
<210> 553
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 553
Figure 105132298-A0202-12-0269-263
<210> 554
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 554
Figure 105132298-A0202-12-0269-264
Figure 105132298-A0202-12-0270-265
<210> 555
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 555
Figure 105132298-A0202-12-0270-705
<210> 556
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 556
Figure 105132298-A0202-12-0270-707
<210> 557
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 557
Figure 105132298-A0202-12-0270-706
<210> 558
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 558
Figure 105132298-A0202-12-0270-708
<210> 559
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 559
Figure 105132298-A0202-12-0271-709
<210> 560
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 560
Figure 105132298-A0202-12-0271-710
<210> 561
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 561
Figure 105132298-A0202-12-0271-266
<210> 562
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 562
Figure 105132298-A0202-12-0271-267
Figure 105132298-A0202-12-0272-269
<210> 563
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 563
Figure 105132298-A0202-12-0272-711
<210> 564
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 564
Figure 105132298-A0202-12-0272-713
<210> 565
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 565
Figure 105132298-A0202-12-0272-712
<210> 566
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 566
Figure 105132298-A0202-12-0272-270
<210> 567
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 567
Figure 105132298-A0202-12-0273-714
<210> 568
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 568
Figure 105132298-A0202-12-0273-715
<210> 569
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 569
Figure 105132298-A0202-12-0273-271
Figure 105132298-A0202-12-0274-272
<210> 570
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 570
Figure 105132298-A0202-12-0274-273
Figure 105132298-A0202-12-0275-274
<210> 571
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 571
Figure 105132298-A0202-12-0275-275
Figure 105132298-A0202-12-0276-276
<210> 572
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 572
Figure 105132298-A0202-12-0276-277
Figure 105132298-A0202-12-0277-278
<210> 573
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 573
Figure 105132298-A0202-12-0277-279
Figure 105132298-A0202-12-0278-280
<210> 574
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aa 1-478：人類Lag3(NP_002277.4的aa 29至450) aa 451-478：myc-myc-六組胺酸標誌
<400> 574
Figure 105132298-A0202-12-0278-281
Figure 105132298-A0202-12-0279-282
<210> 575
<211> 655
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aa 1-683：人類Lag3(NP_002277.4的aa 29至450) aa 451-683：mIgG2aFc
<400> 575
Figure 105132298-A0202-12-0279-283
Figure 105132298-A0202-12-0280-284
Figure 105132298-A0202-12-0281-285
<210> 576
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aa 1-533(石蟹獼猴XP_005570011.1的aa 18至533，基於恆河猴XP_001108923.1，經 修飾將位置74的胺基酸取代為P)
<400> 576
Figure 105132298-A0202-12-0281-286
Figure 105132298-A0202-12-0282-287
<210> 577
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 577
Figure 105132298-A0202-12-0282-288
Figure 105132298-A0202-12-0283-289
<210> 578
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 578
Figure 105132298-A0202-12-0284-290
<210> 579
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 579
Figure 105132298-A0202-12-0284-291
Figure 105132298-A0202-12-0285-292
<210> 580
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 580
Figure 105132298-A0202-12-0286-293
Figure 105132298-A0202-12-0287-294
<210> 581
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 581
Figure 105132298-A0202-12-0287-295
<210> 582
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 582
Figure 105132298-A0202-12-0288-296
Figure 105132298-A0202-12-0289-297
<210> 583
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 583
Figure 105132298-A0202-12-0289-298
<210> 584
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 584
Figure 105132298-A0202-12-0289-716
<210> 585
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 585
Figure 105132298-A0202-12-0289-717
<210> 586
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 586
Figure 105132298-A0202-12-0290-718
<210> 587
<211> 665
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG3.Fc
<400> 587
Figure 105132298-A0202-12-0290-299
Figure 105132298-A0202-12-0291-300
<210> 588
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG3胞外域P18627
<400> 588
Figure 105132298-A0202-12-0291-301
Figure 105132298-A0202-12-0292-302
<210> 589
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG3肽
<400> 589
Figure 105132298-A0202-12-0293-303

Claims (27)

  1. 一種特異性結合至人類淋巴球活化基因3(LAG3)蛋白之經單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO：420的胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HCDR1)、具有SEQ ID NO：422的胺基酸序列之HCDR2、具有SEQ ID NO：424的胺基酸序列之HCDR3、具有SEQ ID NO：428的胺基酸序列之輕鏈CDR1(LCDR1)、具有SEQ ID NO：430的胺基酸序列之LCDR2，和具有SEQ ID NO：432的胺基酸序列之LCDR3。
  2. 如請求項1之經單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有一或多個選自下列組成之群的特性：(a)在25℃下於表面電漿共振分析中所測量，以小於約1.5nM的結合解離平衡常數(KD)結合單體人類LAG3；(b)在37℃下於表面電漿共振分析中所測量，以小於約2nM的KD結合單體人類LAG3；(c)在25℃下於表面電漿共振分析中所測量，以小於約20pM的KD結合二聚體人類LAG3，；(d)在37℃下於表面電漿共振分析中所測量，以小於約90pM的KD結合二聚體人類LAG3；(e)在流式細胞測量分析中所測量，以小於約2nM的EC50結合至hLAG3-表現細胞；(f)在流式細胞測量分析中所測量，以小於約2.3nM的EC50結合至mfLAG3-表現細胞；(g)在細胞附著分析所測量，以小於約20nM的IC50阻斷hLAG3結合至人類第II型MHC；(h)在細胞附著分析所測量，以少於約15nM的IC50阻斷hLAG3結合至小鼠第II型MHC； (i)在細胞附著分析所測量，阻斷hLAG3結合至第II型MHC達超過90%；(j)在螢光素酶報導子分析中所測量，以少於約2.5nM的EC50挽救LAG3媒介的T細胞活性抑制；以及(k)在在螢光分析中所測定，以少於約1.2nM的EC50結合至活化CD4+和CD8+ T細胞。
  3. 如請求項1之經單離抗體或其抗原結合片段，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：418之HCVR。
  4. 如請求項1之經單離抗體或其抗原結合片段，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：426之LCVR。
  5. 如請求項1之經單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：418/426的HCVR/LCVR胺基酸序列對。
  6. 如請求項5之經單離抗體或其抗原結合片段，其為包含重鏈與輕鏈的抗體，其中該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：577。
  7. 如請求項5之經單離抗體或其抗原結合片段，其為包含重鏈與輕鏈的抗體，其中該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：578。
  8. 如請求項5之經單離抗體或其抗原結合片段，其為包含SEQ ID NO：577/578的重鏈/輕鏈胺基酸序列對的抗體。
  9. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之經單離抗體或其抗原結合片段以及醫藥學上可接受的載劑或賦形劑。
  10. 一種經單離多核苷酸分子，其包含編碼如請求項1至8中任一項所示抗體或其抗原結合片段之HCVR的多核苷酸序列。
  11. 一種經單離多核苷酸分子，其包含編碼如請求項1至8中任一項所示抗體或其抗原結合片段之LCVR的多核苷酸序列。
  12. 一種載體，其包含如請求項10或11之經單離多核苷酸分子。
  13. 一種細胞，其表現如請求項12之載體。
  14. 一種將請求項1之經單離抗體或其抗原結合片段或請求項9之醫藥組合物用於製備在有需要的個體中抑制腫瘤或腫瘤細胞生長的藥物之用途。
  15. 如請求項14之用途，其中該腫瘤為原發性或復發性腫瘤。
  16. 如請求項14之用途，其中該腫瘤為已長成的腫瘤。
  17. 如請求項14之用途，其中該腫瘤存在於患有選自下列組成之群的疾病或病症的個體中：血癌、腦癌、腎細胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭部與頸部的鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤、B細胞淋巴瘤以及黑色素瘤。
  18. 如請求項14之用途，其中該抗體或其抗原結合片段以初始劑量投予，接著一或多個第二劑量來進行投予，其中各第二劑量在緊接先前劑量之後1至4週被投予。
  19. 如請求項18之用途，其中該抗體或抗原結合片段以約1、3或10mg/kg個體體重的劑量投予。
  20. 如請求項14之用途，其中該抗體或其抗原結合片段與第二治療劑組合投予給該個體。
  21. 如請求項20之用途，其中該第二治療劑選自下列組成之群：CTLA-4抑制劑、針對腫瘤特異性抗原的抗體、針對遭病毒感染之細胞抗原的抗體、PD-L1抑制劑、CD20抑制劑、對抗CD20與CD3的雙特異性抗體、諸如抗氧化劑的膳食補充劑、VEGF拮抗劑、化療劑、細胞毒性劑、放射線、NSAID、皮質類固醇，以及可用於改善與該疾病或病症有關的至少一個症狀的任何其他療法。
  22. 如請求項20之用途，其中該第二治療劑為PD-1抑制劑。
  23. 如請求項22之用途，其中該PD-1抑制劑為REGN2810、納武單抗(nivolumab)或派姆單抗(pembrolizumab)。
  24. 如請求項23之用途，其中該PD-1抑制劑以1、3或10mg/kg個體體重的劑 量被投予。
  25. 如請求項14之用途，其中該抗體或其抗原結合片段經皮下、靜脈內、皮內、腹膜內、經口、肌肉內或顱內被投予。
  26. 一種特異性結合至人類LAG3蛋白之經單離抗體，其中該經單離抗體包含SEQ ID NO：577之重鏈及SEQ ID NO：578之輕鏈。
  27. 一種醫藥組合物，其包含特異性結合至人類LAG3蛋白之經單離抗體，且該經單離抗體包含SEQ ID NO：577之重鏈及SEQ ID NO：578之輕鏈。
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