CN115057931A

CN115057931A - 抗人lag-3抗体及其用途

Info

Publication number: CN115057931A
Application number: CN202210735906.2A
Authority: CN
Inventors: 郑勇; 吴琼; 李竞
Original assignee: Guangzhou Yuheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Yuheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2022-09-16
Also published as: CN110204614A; CN110204614B

Abstract

提供了结合人LAG‑3的新型完全人单克隆抗体。还提供了使用人源化大鼠的杂交瘤生成方法，编码抗LAG‑3抗体的核酸分子，用于表达抗LAG‑3抗体的表达载体和宿主细胞。本发明进一步提供了体外验证抗体功能的方法。本发明的抗体提供了通过调节人免疫功能治疗多种癌症的有效药剂。

Description

抗人LAG-3抗体及其用途

本申请是申请日为2019年2月27日、发明名称为“抗人LAG-3单克隆抗体及其制备方法和用途”的中国发明专利申请No.201910146172.2的分案申请。

序列表

本申请包含序列表，并且其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本申请一般而言涉及抗体。更具体地，本申请涉及结合人LAG-3的完全人单克隆抗体、其制备方法及其用途。

背景技术

淋巴细胞活化基因3(CD223)，也称为LAG-3，是一种I型跨膜蛋白，其是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。

LAG-3是在活化的T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞上表达的细胞表面分子，但其不在静息T细胞上表达。LAG-3与CD4具有约20％的氨基酸序列同源性，但其以更高的亲和力结合MHC II类分子及独立于MHC-II的LAG-3的主要功能配体纤维蛋白样蛋白1(FGL1)类分子，从而提供对T细胞受体信号传导的负调节。

LAG-3的体外阻断增强T细胞增殖和细胞因子产生，并且LAG-3缺陷小鼠在由超抗原葡萄球菌肠毒素B、肽或仙台病毒感染诱导的T细胞应答的下调中存在缺陷。LAG-3在活化的天然Treg(nTreg)和诱导的CD4⁺FoxP3⁺Treg(iTreg)细胞上表达，其中表达水平高于在活化的效应CD4⁺T细胞上观察到的表达水平。Treg细胞上LAG-3的阻断消除Treg细胞的抑制子功能，而非Treg CD4⁺T细胞中LAG-3的异位表达赋予抑制活性。基于LAG-3对慢性感染和癌症中T细胞功能的免疫调节作用，LAG-3特异性单克隆抗体的预测的作用机制是抑制肿瘤特异性效应T细胞的负调节。

目前在早期临床开发中只有三种潜在的拮抗剂抗体调节LAG-3功能和抗肿瘤免疫应答以治疗晚期实体瘤。这些抗体描述于专利US 20110150892 A1、US 20170101472A1和WO2015138920A1中，下文分别称为BMK1、BMK7和BMK5。如本文所述，BMK8是嵌合抗体BMK5的人源化形式。BMK1、BMK7和BMK8在本申请的上下文中用作基准抗体。因此，仍然需要具有改善的功效(例如高结合亲和力、低跨家族反应和良好的稳定性)的抗人LAG-3抗体。在本申请中，发明人利用人源化大鼠产生了一系列针对LAG-3的抗体和完全人抗体。本申请的抗体具有高结合亲和力，特异性结合人LAG-3蛋白而没有跨家族反应，并且有效调节免疫应答。

发明概述

广义而言，本发明涉及提供具有改善功效的抗体的新型化合物、方法、组合物和制品。本发明提供的益处广泛地适用于抗体治疗和诊断领域，并且可以与能够与各种靶标反应的抗体联合使用。本发明提供了与人LAG-3结合的抗体，优选完全人单克隆抗体。还提供了使用人源化大鼠产生杂交瘤的方法，编码抗LAG-3抗体的核酸分子，用于表达抗LAG-3抗体的表达载体和宿主细胞。本发明进一步提供了体外验证抗体功能的方法。本发明的抗体提供了通过调节人免疫功能治疗多种疾病的有效药剂。

在一些方面，本发明包括分离的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分具有一种或多种以下性质：

(a)以2×10^-10M或更低的K_D结合人LAG-3；

(b)抑制LAG-3与主要组织相容性(MHC)II类分子的结合；

(c)抑制LAG-3与纤维蛋白样蛋白1(FGL1)配体分子的结合；

(d)抑制LAG-3与LSECtin和/或半乳糖凝集素-3的结合；

(e)结合人LAG-3而不发生跨家族反应；或

(f)与人CD4没有交叉反应性。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：(i)与选自SEQ ID NO：1和7的序列之一所示的CDRH1具有至少90％序列同一性的CDRH1；(ii)与选自SEQ ID NO：2和8的序列之一所示的CDRH2具有至少90％序列同一性的CDRH2；和(iii)与选自SEQ ID NO：3和9的序列之一所示的CDRH3具有至少90％序列同一性的CDRH3；

B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：(i)与选自SEQ ID NO：4和10的序列之一所示的CDRL1具有至少90％序列同一性的CDRL1；(ii)与选自SEQ ID NO：5和11的序列之一所示的CDRL2具有至少90％序列同一性的CDRL2；和(iii)与选自SEQ ID NO：6和12的序列之一所示的CDRL3具有至少90％序列同一性的CDRL3；或

C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个(如1、2或3个)重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：(i)选自SEQID NO：1和7的CDRH1或与该CDRH1的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：2和8的CDRH2或与该CDRH2的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH2；和(iii)选自SEQ ID NO：3和9的CDRH3或与该CDRH3的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH3；

B)一个或多个(如1、2或3个)轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：(i)选自SEQID NO：4和10的CDRL1或与该CDRL1的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：5和11的CDRL2或与该CDRL2的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL2；和(iii)选自SEQ ID NO：6和12的CDRL3或与该CDRL3的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL3；或

C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)包含SEQ ID NO：3或9的CDRH3；或

B)与选自SEQ ID NO：3和9的序列之一所示的CDRH3具有至少90％序列同一性的CDRH3；或

C)CDRH3，其与A)的CDRH3的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异，

并且其中分离的抗体或其抗原结合部分以2×10^-10M或更低的K_D结合人LAG-3。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：1或由其组成的CDRH1；

(b)包含SEQ ID NO：2或由其组成的CDRH2；

(c)包含SEQ ID NO：3或由其组成的CDRH3；

(d)包含SEQ ID NO：4或由其组成的CDRL1；

(e)包含SEQ ID NO：5或由其组成的CDRL2；和

(f)包含SEQ ID NO：6或由其组成的CDRL3。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：7或由其组成的CDRH1；

(b)包含SEQ ID NO：8或由其组成的CDRH2；

(c)包含SEQ ID NO：9或由其组成的CDRH3；

(d)包含SEQ ID NO：10或由其组成的CDRL1；

(e)包含SEQ ID NO：11或由其组成的CDRL2；和

(f)包含SEQ ID NO：12或由其组成的CDRL3。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：13具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：13相比具有一个或多个(如1－10个，1－5个，1－3个，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：14具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：14相比具有一个或多个(如1－10个，1－5个，1－3个，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：15具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：15相比具有一个或多个(如1－10个，1－5个，1－3个，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：16具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：16相比具有一个或多个(如1－10个，1－5个，1－3个，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的分离的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。

在一些方面，本发明涉及包含编码如本文所公开的抗体或其抗原结合部分的核酸分子的表达载体。

在一些方面，本发明涉及包含如本文所公开的表达载体的宿主细胞。

在一些方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

在一些方面，本发明涉及用于制备抗LAG-3抗体或其抗原结合部分的方法，其包括在宿主细胞中表达抗体或其抗原结合部分并从宿主细胞分离抗体或抗原结合部分。

在一些方面，本发明涉及调节抗原特异性T细胞应答的方法，包括向受试者施用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的抗原特异性T细胞应答受到调节。

在一些方面，本发明涉及调节受试者的免疫应答的方法，其包括向受试者施用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答受到调节。

在一些方面，本发明涉及用于抑制或阻断LAG-3与MHC II或FGL1类分子结合的方法，其包括使所述MHC II类或FGL1类分子与如本文所公开的抗体或其抗原结合部分接触。

在一些方面，本发明涉及用于抑制或阻断LAG-3与LSECtin和/或半乳糖凝集素-3的结合的方法，其包括使所述LSECtin和/或半乳糖凝集素-3与如本文所公开的抗体或其抗原结合部分接触。

在一些方面，本发明涉及用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法，其包括向受试者施用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中肿瘤的生长受到抑制。

在一些方面中，本发明涉及用于治疗受试者中的病毒感染的方法，其包括向受试者施用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分，使得在受试者中治疗病毒感染。

在一些方面，本发明涉及用于治疗或预防受试者中的增殖性病症例如癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或其抗原结合部分。

在一些方面，本发明涉及如本文所公开的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防增殖性病症例如癌症的药物中的用途。

在一些方面，本发明涉及如本文所公开的抗体或其抗原结合部分在制备用于诊断增殖性病症例如癌症的诊断剂中的用途。

在一些方面，本发明涉及如本文所公开的抗体或其抗原结合部分用于治疗或预防增殖性病症例如癌症。

在一些方面，本发明涉及使用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分的试剂盒或装置和相关方法，以及如本文所公开的药物组合物，其可用于治疗增殖性病症例如癌症。为此，本发明优选提供可用于治疗此类病症的制品，其包含含有如本文所公开的抗体或其抗原结合部分的容器以及用于使用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分来治疗、改善或预防增殖性疾病或其进展或复发的说明材料。在选定的实施方案中，装置和相关方法将包括使至少一种循环肿瘤细胞与如本文所公开的抗体或其抗原结合部分接触的步骤。

具体地，本发明涉及以下实施方案：

1.分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：

(i)与选自SEQ ID NO：1和7的序列之一所示的CDRH1具有至少90％序列同一性的CDRH1；

(ii)与选自SEQ ID NO：2和8的序列之一所示的CDRH2具有至少90％序列同一性的CDRH2；和

(iii)与选自SEQ ID NO：3和9的序列之一所示的CDRH3具有至少90％序列同一性的CDRH3；

B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：

(i)与选自SEQ ID NO：4和10的序列之一所示的CDRL1具有至少90％序列同一性的CDRL1；

(ii)与选自SEQ ID NO：5和11的序列之一所示的CDRL2具有至少90％序列同一性的CDRL2；和

(iii)与选自SEQ ID NO：6和12的序列之一所示的CDRL3具有至少90％序列同一性的CDRL3；或

C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。

2.实施方案1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：

(i)选自SEQ ID NO：1和7的CDRH1或与该CDRH1的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH1；

(ii)选自SEQ ID NO：2和8的CDRH2或与该CDRH2的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH2；和

(iii)选自SEQ ID NO：3和9的CDRH3或与该CDRH3的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH3；

B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：

(i)选自SEQ ID NO：4和10的CDRL1或与该CDRL1的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL1；

(ii)选自SEQ ID NO：5和11的CDRL2或与该CDRL2的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL2；和

(iii)选自SEQ ID NO：6和12的CDRL3或与该CDRL3的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL3；或

C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。

3.实施方案1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：1或由其组成的CDRH1；

(b)包含SEQ ID NO：2或由其组成的CDRH2；

(c)包含SEQ ID NO：3或由其组成的CDRH3；

(d)包含SEQ ID NO：4或由其组成的CDRL1；

(e)包含SEQ ID NO：5或由其组成的CDRL2；和

(f)包含SEQ ID NO：6或由其组成的CDRL3。

4.实施方案1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：7或由其组成的CDRH1；

(b)包含SEQ ID NO：8或由其组成的CDRH2；

(c)包含SEQ ID NO：9或由其组成的CDRH3；

(d)包含SEQ ID NO：10或由其组成的CDRL1；

(e)包含SEQ ID NO：11或由其组成的CDRL2；和

(f)包含SEQ ID NO：12或由其组成的CDRL3。

5.实施方案1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：13具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：13相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：14具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：14相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

6.实施方案1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：15具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：15相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：16具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：16相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

7.实施方案1-6中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其具有一个或多个以下性质：

(a)以2×10^-10M或更低的K_D结合人LAG-3；

(b)抑制LAG-3与主要组织相容性(MHC)II类分子的结合；

(c)抑制LAG-3与纤维蛋白样蛋白1(FGL1)配体分子的结合；

(d)抑制LAG-3与LSECtin和/或半乳糖凝集素-3的结合；

(e)结合人LAG-3而不发生跨家族反应；或

(f)与人CD4没有交叉反应性。

8.实施方案1-7中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是单克隆抗体，例如完全人单克隆抗体，例如由转基因哺乳动物产生的完全人单克隆抗体，所述转基因哺乳动物优选是转基因大鼠，更优选是具有重组免疫球蛋白基因座的转基因大鼠。

9.一种分离的核酸分子，其包含编码实施方案1-8中任一项所定义的分离的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列，例如，SEQ ID NOs:17-20所示的核酸序列。

10.一种表达载体，其包含实施方案9的核酸分子。

11.一种宿主细胞，其包含实施方案10的表达载体。

12.一种药物组合物，其包含至少一种如实施方案1-8中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

13.一种制备实施方案1-8中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分的方法，其包括以下步骤：

-在实施方案11的宿主细胞中表达实施方案1-8中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分；和

-从宿主细胞分离抗体或其抗原结合部分。

14.一种调节受试者中的抗原特异性T细胞应答或调节受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用实施方案1-8中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的抗原特异性T细胞应答或免疫应答受到调节。

15.一种抑制或阻断LAG-3与MHC II类分子、FGL1类分子、LSECtin和/或半乳糖凝集素-3的结合的方法，其包括使所述MHC II类分子、FGL1类分子、LSECtin和/或半乳糖凝集素-3与实施方案1-8中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分接触。

16.一种抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法，其包括向受试者施用实施方案1-8中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中肿瘤的生长受到抑制。

17.一种治疗或预防受试者中的增殖性病症例如癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的实施方案1-8中任一项定义的抗体或其抗原结合部分。

18.实施方案1-8中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防增殖性病症例如癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病和/或炎症性疾病的药物中的用途。

19.实施方案1-8中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于诊断增殖性病症例如癌症的诊断剂中的用途。

20.实施方案1-8中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分，其用于治疗或预防增殖性病症例如癌症。

21.实施方案1-8中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分，其用于诊断增殖性病症例如癌症。

22.用于治疗或诊断增殖性病症例如癌症的试剂盒，其包含含有至少一种如实施方案1-8中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分的容器。

以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。提供概述以简化地介绍一些选择的概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助手段。此外，贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用整体并入本文。

附图简述

图1显示LAG-3抗体与细胞表面人LAG-3的结合，由MFI(平均荧光强度)表示，并由BD FACSCanto II测量。

图2显示了LAG-3蛋白与Raji细胞上表达的MHC-II的结合的阻断。

图3显示了LAG-3蛋白与LSECtin的结合的阻断。

图4显示了LAG-3蛋白与半乳糖凝集素-3的结合的阻断。

图5显示了通过FACS测量的与食蟹猴LAG-3的交叉反应性。

图6显示了通过FACS测量的与鼠LAG-3的交叉反应性。

图7显示了通过ELISA测量的与人CD4的交叉反应性。

图8A-E显示针对基准抗体BMK1、BMK7和BMK5的表位分仓(epitope binning)。

图9A-B显示表位作图的结果。

图10显示了人LAG-3抗体在报告基因测定中的作用。

图11显示人LAG-3抗体对人同种异体混合淋巴细胞反应的影响，如通过ELISA测量并通过IFN-γ水平(ng/mL)来反映的。

图12显示人LAG-3抗体对人同种异体混合淋巴细胞反应的影响，如通过³H-胸苷掺入测量并通过以一式三份的孔的CPM(每分钟计数)表示的增殖反应来反映的。

图13A-B显示了通过确定靶细胞裂解来进行的CDC测试和ADCC测试的结果。

图14A-B显示了血清稳定性测试的结果，如通过FACS测量的并且通过细胞的MFI表示。

发明详述

虽然本发明可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本发明原理的其具体的举例说明性实施方案。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方案。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。

除非在此另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括细胞的混合物等。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和断点之间的所有值。

通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,6^th ed.,W.B.Saunders Company(2010)；SambrookJ.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人,Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；和Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。与本文描述的分析化学，合成有机化学和药物和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的术语。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。

定义

为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。

如本文所用，术语“抗体”或“Ab”通常是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。氨基酸在各种区域或结构域中的分布遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature342:878-883中的定义。抗体可以具有不同的抗体同种型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”，其可以在本申请的上下文中互换使用，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合的能力，和/或其与全长抗体竞争结合相同的抗原。一般而言，参见FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第二版,Raven Press,N.Y.(1989)，其出于所有目的通过引用并入本文。抗体的抗原结合片段可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。在一些条件下，抗原结合片段包括Fab,Fab',F(ab')₂,Fd,Fv,dAb和互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如scFv)，嵌合抗体，双抗体和包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的至少一部分抗体的多肽。抗体的抗原结合片段可从给定抗体(例如，在本申请中提供的单克隆抗人LAG-3抗体)通过本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学切割方法)获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选特异性。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指单分子成分的抗体分子制剂。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

如本文所用，术语“人抗体”或“完全人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已经嫁接到人框架序列上的抗体。

如本文所用，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有其中框架和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。

术语“人源化抗体”旨在指其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。

如本文所用的术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列来自一个物种并且恒定区序列来自另一物种，例如其中可变区序列源自小鼠抗体和恒定区序列来源于人抗体。

如本文所用，术语“LAG-3”是指淋巴细胞活化基因-3。术语“LAG-3”包括变体、同种型、同系物、直系同源物和旁系同源物。

如本文所用，术语“人LAG-3”是指人序列LAG-3，例如具有Genbank登录号NP_002277的人LAG-3的完整氨基酸序列。人LAG-3序列可以与Genbank登录号NP_002277的人LAG-3不同，例如在非保守区中具有保守的突变，并且LAG-3具有与Genbank登录号NP_002277的人LAG-3基本上相同的生物学功能。例如，人LAG-3的生物学功能是具有由本公开内容的抗体特异性结合的LAG-3的胞外结构域中的表位，或人LAG-3的生物学功能是与MHCII类或FGL1类分子结合。

如本文所用，术语“小鼠LAG-3”是指小鼠序列LAG-3，例如具有Genbank登录号NP_032505的小鼠LAG-3的完整氨基酸序列。

如本文所用，术语“食蟹猴LAG-3”是指食蟹猴序列LAG-3，例如具有Genbank登录号XP_005570011.1的食蟹猴LAG-3的完整氨基酸序列。

如本文所用，术语“Ka”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kd”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。抗体的Kd值可以使用本领域良好建立的方法来确定。如本文所用，术语“K_D”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离常数，其从Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)。确定抗体Kd的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如

系统。

如本文所用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指针对靶抗原具有1×10^-7M或更低，更优选5×10^-8M或更低，甚至更优选1×10^-8M或更低，甚至更优选5×10^-9M或更低，和甚至更优选1×10^-9M或更低的K_D的抗体。

如本文所用的术语“EC₅₀”，也被称为“半数有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的上下文中，EC₅₀的单位为“nM”。

在本申请中“抑制结合”或“竞争相同表位”的能力是指抗体或其抗原结合片段抑制两个分子(例如人LAG-3和人抗LAG-3抗体)的结合至任何可检测水平。在某些实施方案中，两个分子的结合可以被抗体或其抗原结合片段抑制至少50％。在某些实施方案中，这种抑制作用可以大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。

如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原部分。“表位”也被称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。例如，表位通常包含独特立体构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或不连续的氨基酸，其可以是“线性”或“构象”表位。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用位点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用位点跨越蛋白质中彼此分离的氨基酸残基。取决于通过本领域技术人员已知的常规技术检测的结合相同表位的竞争性，可以筛选抗体。例如，可以进行竞争或交叉竞争研究以获得彼此竞争或交叉竞争结合抗原(例如RSV融合蛋白)的抗体。在国际专利申请WO 03/48731中描述了用于获得结合相同表位的抗体的高通量方法，其基于它们的交叉竞争。

如本文所用，术语“分离的”是指通过人工方式从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在，则可能是因为其天然发生变化，或者物质与天然分离，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活动物体内，从该天然状态分离的相同的高纯度多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人造或合成物质，也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。

如本文所用，术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合LAG-3蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除LAG-3蛋白以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人LAG-3蛋白的分离的抗体对其他抗原如来自其他物种的LAG-3蛋白可能具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

如本文所用，术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以导入载体的细胞，包括但不限于原核细胞如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，真菌细胞如酵母细胞或曲霉属(Aspergillus)，昆虫细胞如S2果蝇细胞或Sf9，以及动物细胞如成纤维细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞。

如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的间隙(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.,ed.),1988,New York:Oxford University Press；BiocomputingInformatics and Genome Projects,(Smith,D.W.,ed.),1993,New York:AcademicPress；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysisin Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo等人,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。

如本文所用，术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖和分化以最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的性质，还指抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答可以在用抗原刺激生物体后在生物体的免疫系统中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能够成功诱导宿主中免疫应答的产生取决于三个因素：抗原的性质，宿主的反应性和免疫手段。

如本文所用，术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染和化学和物理方法如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的并且在本文中公开。参见例如Graham等人,1973,Virology 52:456；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,同上；Davis等人,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu et al,1981,Gene 13:197。在本发明的一个具体实施方案中，将人LAG-3基因转染入293F细胞。

如本文所用，术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”可以互换使用。当提及术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”时，它们也包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。

如本文所用，术语“SPR”或“表面等离子体共振”是指并且包括允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)。关于详细描述，参见实施例和

U.,等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；

U.,等人(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.,等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B.,等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。

如本文所用，术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence ActivatedCell Sorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且可以对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(Foster City，CA)的FACSStar Plus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，FL)的EpicsC和来自Cytomation(Colorado Springs，Colorado)的MoFlo。

如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指其中与某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合的分泌的Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且对于这种杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的464页的表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选或另外地，感兴趣分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)公开的动物模型中评估。

术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与结合其同源抗原的抗体(适当的亚类)结合而启动。为了评估补体活化，可以执行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述的。

术语“受试者”包括任何人或非人动物，优选人。

如本文所用，术语“癌症”是指引发医学病症的任何肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的实体瘤和非实体瘤如白血病。

本文在治疗病情的情况中使用的术语“治疗”和“医治”一般涉及人或动物的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制病情进展，包括进展速度下降，进展速度停滞，病情消退，病情改善和病情治愈。还包括了作为预防措施(即预防)的治疗。对于癌症，“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其某种组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其某种组合。

如本文所用，术语“治疗有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂型的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。具体而言，“治疗有效量”意指抗体或其抗原结合部分有效治疗人LAG-3相关疾病或病症的量或浓度。

如本文所用，本发明的“宿主细胞”是指引入外源多核苷酸的细胞。

如本文所用，术语“药学上可接受”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至有机体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。存在多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)，短小棒状杆菌，脂多糖，细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。

抗LAG-3抗体

在一些方面，本发明包括分离的抗体或其抗原结合部分。

在本申请的上下文中，“抗体”可以包括多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，人源化和灵长类动物化抗体，CDR移植抗体，人抗体，重组产生的抗体，胞内抗体，多特异性抗体，双特异性抗体，单价抗体，多价抗体，抗独特型抗体，合成抗体，包括其突变蛋白及变体；及其衍生物(包括Fc融合蛋白和其他修饰)，以及任何其他免疫反应性分子，只要其表现出与LAG-3蛋白的优先结合或缔合。此外，除非上下文另外规定，否则该术语还包括所有类别的抗体(即IgA，IgD，IgE，IgG和IgM)和所有亚类(即IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)。在一个优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。在更优选的实施方案中，抗体是人单克隆抗体。

人抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生。一种技术是噬菌体展示，其中在噬菌体上合成(优选人)抗体文库，用感兴趣的抗原或其抗体结合部分筛选文库，并分离结合抗原的噬菌体，从其中可以获得免疫反应性片段。用于制备和筛选这种文库的方法是本领域众所周知的，并且用于产生噬菌体展示文库的试剂盒可商购获得(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；以及Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还有其他方法和试剂可用于产生和筛选抗体展示文库(参见例如Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982(1991))。

人抗体还可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如其中内源免疫球蛋白基因已经部分或完全失活并且已引入人免疫球蛋白基因的小鼠)中来制备。在攻击时，观察到人抗体产生，其与在人中各方面观察到的非常相似，包括基因重排、装配和抗体库。这种方法例如描述于美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和关于XenoMouse技术的美国专利6,075,181和6,150,584；Lonberg andHuszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。或者，可以通过产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞(这样的B淋巴细胞可以从患有肿瘤性疾病或者可能已经在体外被免疫的个体中获得)的永生化来制备人抗体。参见例如Cole等人,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner等人,J.Immunol,147(l):86-95(1991)；和U.S.P.N.5,750,373。

单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术来制备，包括杂交瘤技术，重组技术，噬菌体展示技术，转基因动物(例如

)或其一些组合。例如，可以使用杂交瘤和本领域公认的生物化学和遗传工程技术来生产单克隆抗体，如详细描述于An,Zhigiang(ed.)Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic,JohnWiley and Sons,1^st ed.2009；Shire et.al.(eds.)Current Trends in MonoclonalAntibody Development and Manufacturing,Springer Science+Business Media LLC,1^sted.2010；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,2nd ed.1988；Hammerling,等人,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)，每篇文献在此全部引入作为参考。应该理解，可以进一步改变选定的结合序列，例如以提高对靶的亲和力、使靶结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产生、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的抗体。在一个优选的实施方案中，通过使用杂交瘤来制备抗人LAG-3单克隆抗体。

产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤的产生

为了获得产生本发明抗体例如本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自免疫小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞并将其融合至合适的永生化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。就抗原特异性抗体的产生筛选产生的杂交瘤。杂交瘤的产生在本领域中是众所周知的。参见例如Harlow and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Publications,New York。

产生本发明的单克隆抗体的转染瘤的产生

本发明的抗体还可以在宿主细胞转染瘤中使用例如本领域众所周知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如Morrison,S.(1985)Science 229:1202)来产生。在一个实施方案中，将通过标准分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，使得所述基因可操作地连接于转录和翻译调节序列。在此上下文下，术语“可操作地连接”意在表示将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节抗体基因转录和翻译的预期功能。

术语“调控序列”旨在包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。这些调节序列描述于例如Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。用于哺乳动物宿主细胞表达的示例性调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒的启动子和/或增强子，或者可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子；还有，由不同来源的序列组成的调控元件，如SRa启动子系统，其包含来自SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复序列的序列(Takebe等人(1988)MoI.Cell.Biol.8:466-472)。表达载体和表达控制序列被选择为与使用的表达宿主细胞相容。

可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入相同或不同的表达载体中。在一些实施方案中，可变区用于通过将其插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中来产生任何抗体同种型的全长抗体基因，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段和VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。另外或可选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽符合读框地连接到抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。

除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体还可以携带额外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择导入了载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常选择标记基因赋予载体已经导入其中的宿主细胞对药物(例如G418，潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。选择标记基因可以包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。可以在原核或真核宿主细胞例如哺乳动物宿主细胞(其可以装配和分泌适当折叠和免疫活性的抗体)中表达本发明的抗体。

用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括与DHFR选择标记(例如，如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.MoI.Biol.159:601-621中所述的)一起使用的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述的dhfr CHO细胞)，NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。特别地，为了与NSO骨髓瘤一起使用，另一种表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达的时间段或将抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中来产生抗体。使用标准蛋白质纯化方法可从培养基中回收抗体。

具有某些性质的抗LAG3抗体

本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或性质。在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分具有一种或多种以下性质：

(a)以2×10^-10M或更低的K_D结合人LAG-3；

(b)抑制LAG-3与主要组织相容性(MHC)II类分子的结合；

(c)抑制LAG-3与纤维蛋白样蛋白1(FGL1)配体分子的结合；

(d)抑制LAG-3与LSECtin和/或半乳糖凝集素-3的结合；或

(e)结合人LAG-3而没有跨家族反应。

本发明的抗体以高亲和力结合人LAG-3。本发明的抗体与LAG-3的结合可以使用本领域中良好建立的一种或多种技术，例如ELISA来评估。本发明抗体的结合特异性也可以通过例如流式细胞术监测抗体与表达LAG-3蛋白的细胞的结合来确定。例如，抗体可以通过流式细胞术测定来测试，其中抗体与表达人LAG-3的细胞系例如已经转染以在其细胞表面上表达LAG-3的CHO细胞反应。用于流式细胞术测定的其他合适的细胞包括表达天然LAG-3的抗CD3-刺激的CD4⁺活化的T细胞。另外或可选地，可以在BIAcore结合测定中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如Kd值)。其他合适的结合分析包括ELISA分析，例如使用重组LAG-3蛋白。例如，本发明的抗体以5×10^-8M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白，以2×10^-8M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白，以5×10^-9M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白，以4×10^-9M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白，以3×10^-9M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白，以2×10^-9M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白，以1×10^-9M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白，以5×10^-10M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白，或以1×10^-10M或更低的K_D结合人LAG-3蛋白。

抗体调节免疫应答(例如抗原特异性T细胞应答)的能力可以通过例如抗体在抗原特异性T细胞应答中刺激产生白细胞介素-2(IL-2)的能力来指示。在某些实施方案中，本发明的抗体结合人LAG-3并展现刺激抗原特异性T细胞应答的能力。评估抗体刺激免疫应答能力的手段可以包括例如在体内肿瘤移植模型中抗体抑制肿瘤生长的能力，或抗体刺激自身免疫应答的能力。

如本文所公开的分离的抗体或其抗原结合部分抑制LAG-3与主要组织相容性(MHC)II类分子、FGL1类分子、LSECtin和/或半乳糖凝集素-3的结合。LAG-3负向调节T细胞信号传导和功能。LAG-3的配体包括例如主要组织相容性(MHC)II类分子、LSECtin和半乳糖凝集素-3。LAG-3可以与细胞表面上的MHC II类分子相互作用(Baixeras等人(1992)J.Exp.Med.176:327-337；Huard等人(1996)Eur.J.Immunol.26:1180-1186)。已经提出，LAG-3与MHC II类分子的直接结合在下调CD4⁺T淋巴细胞的抗原依赖性刺激中起作用(Huard等人(1994)Eur.J.Immunol.24:3216-3221)。近期，陈列平等人通过体内外实验进一步验证FGL1是LAG-3的主要免疫抑制配体，提出了一条新的肿瘤免疫逃逸通路FGL1-LAG-3，阻断FGL1-LAG-3相互作用可以增强抗肿瘤作用(Cell.2019Jan 10；176(1-2):334-347.e12.)。

半乳糖凝集素-3是31kD凝集素，其通过几种机制调节T细胞应答，包括细胞凋亡、TCR交联和TCR下调。半乳糖凝集素-3与LAG-3结合，并且LAG-3表达对于半乳糖凝集素-3介导的体外CD8+T细胞抑制是必需的。(Kouo等人(2015)Cancer Immunol.Res.10.1158:2326-6066)。已显示抗LSECtin抑制B16黑素瘤细胞生长(Xu等人(2014)Cancer Res.74(13):3418-3428)。

包含与特定序列具有序列同一性的CDR的抗LAG3抗体

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。

除非另有说明，否则将氨基酸分配给每个CDR可以根据以下提供的编号方案之一：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(5^th Ed.),USDept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242；Chothia等人,1987,PMID:3681981；Chothia等人,1989,PMID:2687698；MacCallum等人,1996,PMID:8876650；或Dubel,Ed.(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies,3^rd Ed.,Wily-VCHVerlag GmbH and Co.。

抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如上所述，例如Kabat编号系统)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。在Kontermann andDubel,eds.,Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001和Dinarello等人,Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000中描述了鉴定这些区域的方法。抗体序列的示例性数据库描述于并可获自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”网站(由Department of Biochemistry&Molecular Biology UniversityCollege London,London,England的A.C.Martin维护)和VBASE2网站www.vbase2.org，如Retter等人,Nucl.Acids Res.,33(Database issue):D671-D674(2005)中所述。优选使用Abysis数据库分析序列，其整合了来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据，参见Dr.Andrew C.R.Martin所著的书中的Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains.In:Antibody Engineering LabManual(Ed.:Duebel,S.and Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547,也可在网站bioinforg.uk/abs上获得)。Abysis数据库网站还包括已经开发用于识别可以根据本文的教导使用的CDR的一般规则。除非另有说明，否则本文所述的所有CDR均根据Kabat的Abysis数据库网站获得。

两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以通过Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))确定，其已并入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空隙权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

另外地或可选地，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来执行针对公共数据库的搜索以例如识别相关序列。这种搜索可以使用Altschul,等人(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)来执行。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可使用空位BLAST，如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述的。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

在其他实施方案中，CDR氨基酸序列可以与上述各个序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。作为说明性实例，抗体可以包含与选自SEQID NO：1和7的序列之一所示的CDRH1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的CDRH1。

包含具有氨基酸添加、缺失或取代的CDR的抗LAG3抗体在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：(i)选自SEQ ID NO：1和7的CDRH1或与该CDRH1的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：2和8的CDRH2或与该CDRH2的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH2；和(iii)选自SEQ ID NO：3和9的CDRH3或与该CDRH3的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRH3；

B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：(i)选自SEQ ID NO：4和10的CDRL1或与该CDRL1的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：5和11的CDRL2或与该CDRL2的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL2；和(iii)选自SEQ ID NO：6和12的CDRL3或与该CDRL3的氨基酸序列存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的CDRL3；或

C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。

优选地，分离的抗体或其抗原结合部分的CDR含有不多于2个氨基酸或不多于1个氨基酸的保守取代。如本文所用，术语“保守取代”是指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质的氨基酸取代。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

包含CDR的抗LAG3抗体

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：1的CDRH1；

(b)包含SEQ ID NO：2的CDRH2；

(c)包含SEQ ID NO：3的CDRH3；

(d)包含SEQ ID NO：4的CDRL1；

(e)包含SEQ ID NO：5的CDRL2；和

(f)包含SEQ ID NO：6的CDRL3。

在具体实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)由SEQ ID NO：1组成的CDRH1；

(b)由SEQ ID NO：2组成的CDRH2；

(c)由SEQ ID NO：3组成的CDRH3；

(d)由SEQ ID NO：4组成的CDRL1；

(e)由SEQ ID NO：5组成的CDRL2；和

(f)由SEQ ID NO：6组成的CDRL3。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：7的CDRH1；

(b)包含SEQ ID NO：8的CDRH2；

(c)包含SEQ ID NO：9的CDRH3；

(d)包含SEQ ID NO：10的CDRL1；

(e)包含SEQ ID NO：11的CDRL2；和

(f)包含SEQ ID NO：12的CDRL3。

在具体实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)由SEQ ID NO：7组成的CDRH1；

(b)由SEQ ID NO：8组成的CDRH2；

(c)由SEQ ID NO：9组成的CDRH3；

(d)由SEQ ID NO：10组成的CDRL1；

(e)由SEQ ID NO：11组成的CDRL2；和

(f)由SEQ ID NO：12组成的CDRL3。

包含重链可变区和轻链可变区的抗LAG3抗体

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：14具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；

在具体实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成的重链可变区；和/或

(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；

在具体实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的重链可变区；和/或

(b)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区。

在其它实施方案中，重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列可以与上述各个序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。作为说明性实例，抗体可以包含与SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的重链可变区具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区。

在一些进一步的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分可以包含重链和/或轻链的可变区中的氨基酸的保守取代或修饰。本领域理解的是，可以进行某些不消除抗原结合的保守序列修饰。参见例如Brummell等人(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildt等人(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov等人(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall等人(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley and O’Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy等人(1998)Int.Immunol.10:341-6和Beers等人(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。

本文使用的术语“保守取代”是指氨基酸取代，其不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

分仓和表位作图

将进一步理解的是，所公开的抗体将与由所选择的靶或其片段呈递的离散表位或免疫原性决定簇缔合或结合。在某些实施方案中，表位或免疫原性决定簇包括分子的化学活性表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特异性电荷特性。因此，如本文所用，术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。在某些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时，抗体被认为特异性结合(或免疫特异性结合或反应)抗原。在一些实施方案中，当平衡解离常数(K_D)小于或等于10^-6M或小于或等于10^-7M时，更优选当K_D小于或等于10^-7M时，称抗体与抗原特异性结合等于10^-8M，甚至更优选当K_D小于或等于10^-9M时，抗体被认为特异性结合抗原。

由连续氨基酸形成的表位(有时称为“线性”或“连续”表位)通常在蛋白质变性时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性后丢失。在任何情况下，抗体表位通常在独特的空间构象中包含至少3个，更通常地至少5或8-10个氨基酸。

在这方面，应该理解的是，在某些实施方案中，表位可以与例如LAG-3蛋白的一个或多个区域、结构域或基序结合或位于其中。类似地，本领域公认的术语“基序”将根据其通用含义使用，并且通常应该是指通常十至二十个连续氨基酸残基的蛋白质的短保守区域。

无论如何，一旦确定了抗原上的所需表位，就有可能产生针对该表位的抗体，例如通过使用本发明中描述的技术用包含表位的肽免疫。或者，在发现过程中，抗体的产生和表征可以阐明关于位于特定结构域或基序中的期望表位的信息。从这些信息中，可以竞争性筛选与相同表位的结合的抗体。实现这一点的方法是进行竞争研究以发现彼此竞争性结合的抗体，即抗体竞争结合抗原。在WO 03/48731中描述了基于其交叉竞争对抗体进行分仓的高通量方法。分仓或结构域水平或表位作图包括抗体竞争或在酵母上的抗原片段表达的其他方法在本领域中是公知的。

如本文所用，术语“分仓”是指用于基于抗原结合特征和竞争对抗体进行分组或分类的方法。尽管这些技术对于定义和分类本发明的抗体是有用的，但是这些仓(bin)并不总是直接与表位结合，并且表位结合的这种初始测定可以通过本领域中和如本文所述的其他公认的方法进一步改进和确认。然而，可以理解的是，将抗体凭验性地分配至各个仓提供了可以指示所公开的抗体的治疗潜力的信息。

更具体地，可以通过使用本领域已知和本文实施例中所示的方法确定选定的参考抗体(或其片段)是否结合相同的表位或与第二测试抗体交叉竞争结合(即，在相同的仓内)。

其他相容的表位作图技术包括丙氨酸扫描突变体，肽印迹(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)(特别地通过引用整体并入本文)或肽切割分析。另外，可以使用抗原的表位切除，表位提取和化学修饰等方法(Tomer(2000)Protein Science 9：487-496)(特别地通过引用整体并入本文)。

编码本发明抗体的核酸分子

本发明的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤表达的抗体(例如，如下文进一步描述的由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码通过杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，编码这种抗体的核酸可以从基因文库中回收。

通过将编码VH的核酸可操作地连接至编码重链恒定区(CH1，CH2和CH3)的另一DNA分子，可将编码VH区的分离的核酸转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat等(1991)，同上)，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区，但更优选是IgG1或IgG4恒定区，最优选是IgG4恒定区。

通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，可将编码VL区的分离的核酸转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat等，同上)，并且可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。

一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质的另一DNA片段例如抗体恒定区或柔性接头可操作地连接。在本文中使用的术语“可操作地连接”旨在表示两个DNA片段连接成使得两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。

本发明优选的核酸分子是编码1.53.3-uAb-IgG4k和3.40.19-uAb-IgG4L单克隆抗体的VH和VL序列的核酸分子。编码1.53.3-uAb-IgG4k和3.40.19-uAb-IgG4L的VH序列的DNA序列分别显示于SEQ ID NO：17和19中。编码1.53.3-uAb-IgG4k和3.40.19-uAb-IgG4L的VL序列的DNA序列分别显示于SEQ ID NO：18和20中。在一些实施方案中，核酸分别与SEQ IDNO：17-20具有至少80％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％96％、97％、98％或99％)的序列同一性。在一些实施方案中，同一性的百分比源自遗传密码的简并性，并且编码的蛋白质序列保持不变。

药物组合物

组合物的组分

药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用，使得抗LAG-3抗体增强对疫苗的免疫反应。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体，凝胶或固体载体，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的各种组分的组合或更多。

合适的组分可以包括例如抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸，抗坏血酸，EDTA，硫代硫酸钠，铂，过氧化氢酶，柠檬酸，半胱氨酸，巯基甘油，巯基乙酸，巯基山梨糖醇，丁基甲基苯甲醚，丁基化羟基甲苯和/或丙基砷酸盐。如本发明所公开的，在包含还原抗体或其抗原结合片段的一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的含有本发明公开的组合物的抗体或抗原结合片段的溶剂中，其可被氧化。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本发明进一步提供了多种方法，其中将抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合。从而，抗体或其抗原结合片段可以被防止氧化，以延长其保质期和/或增加活性。

施用、制剂和剂量

本发明的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不限于口服，静脉内，动脉内，皮下，肠胃外，鼻内，肌内，颅内，心内，心室内，气管内，口腔，直肠，腹膜内，皮内，局部，经皮和鞘内，或者通过植入或吸入。本发明组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，软膏剂，溶液剂，栓剂，灌肠剂，注射剂，吸入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。

用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊，丸剂，片剂，包括包衣片剂，酏剂，混悬剂，糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。

适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供的(例如，在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液，混悬液)。这些液体可以另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂，缓冲剂，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水，醇，多元醇，甘油，植物油等。适用于此类制剂的等渗载体的实例包括氯化钠注射液，林格溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定剂量方案(即剂量，时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期，清除率等)的经验考虑。

施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且基于减少增殖或致瘤细胞的数量，维持这种肿瘤细胞的减少，减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。或者，本发明治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。

本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用，施用时间，化合物清除速率，治疗持续时间，其他联合使用的药物、化合物和/或材料，病症的严重程度，以及物种，患者的性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以前的病史。化合物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。

通常，本发明的抗体或其抗原结合部分可以以各种范围施用。这些包括每剂量约5μg/kg体重至约100mg/kg体重；每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重；每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重。其他范围包括每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重和每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重。在某些实施方案中，剂量为至少约100μg/kg体重，至少约250μg/kg体重，至少约750μg/kg体重，至少约3mg/kg体重，至少约5mg/kg体重，至少约10mg/kg体重。

无论如何，本发明的抗体或其抗原结合部分优选根据需要施用于有需要的受试者。本领域技术人员可以确定施用频率，例如主治医生基于所治疗病症、所治疗受试者的年龄、所治疗病症的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑。

在某些优选的实施方案中，涉及本发明的抗体或其抗原结合部分的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用的多剂量的所选药物产品。更具体地说，本发明的抗体或其抗原结合部分可以每天，每两天，每四天，每周，每十天，每两周，每三周，每月，每六周，每两个月，每十周或每三个月施用。就此而言，可以理解的是，可以基于患者响应和临床实践来改变剂量或者调整间隔。

在给予一次或多次施用的个体中也可凭经验确定所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选定的实施方案中，剂量可分别根据经验确定或观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少或减轻。为了评估所选择的组合物的功效，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或病情的标志物。对于癌症，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小，通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样本的显微镜检查评估的改善；测量根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如用于前列腺癌的PSA)或致瘤性抗原，疼痛或麻痹的减轻；与肿瘤相关的言语、视力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或通过接受的测试测量的生活质量的提高或生存期的延长。本领域技术人员将明白，剂量将根据个体、肿瘤病情的类型、肿瘤病情的阶段、肿瘤病情是否已开始转移至个体中的其他位置以及过去使用的治疗和并行使用的治疗而变化。

用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含浓度为约10μg/mL至约100mg/mL的抗体或其抗原结合部分。在某些选定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度将包括20μg/mL，40μg/mL，60μg/mL，80μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，300μg/μg/mL，400μg/mL，500μg/mL，600μg/mL，700μg/mL，800μg/mL，900μg/mL或1mg/mL。在其他优选的实施方案中，ADC浓度将包括2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL，5mg/mL，6mg/mL，8mg/mL，10mg/mL，12mg/mL，14mg mL，16mg/mL，18mg/mL，20mg/mL，25mg/mL，30mg/mL，35mg/mL，40mg/mL，45mg/mL，50mg/mL，60mg/mL，70mg/mL，80mg/mL，90mg/mL或100mg/mL。

本发明的应用

本发明的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内用途，包括例如LAG-3的检测或通过阻断LAG-3增强的免疫应答。例如，可以将这些分子体外或离体施用于培养细胞，或例如体内施用于人受试者，以增强各种情况下的免疫力。免疫应答可以被调节，例如被增强、刺激或上调。

优选的受试者包括需要增强免疫应答的人患者。所述方法特别适用于治疗具有可通过增强免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)治疗的病症的人患者。在一个具体的实施方案中，所述方法特别适合于体内治疗癌症。为了实现免疫的抗原特异性增强，可以将抗LAG-3抗体与感兴趣的抗原一起施用，或者抗原可能已经存在于待治疗的受试者中(例如携带肿瘤或病毒的受试者)。当LAG-3的抗体与另一种药剂一起施用时，两者可以以任何顺序施用或同时施用。

本发明进一步提供了用于检测样品中人LAG-3抗原的存在或测量人LAG-3抗原的量的方法，包括在允许抗体或其部分与人LAG-3之间形成复合物的条件下使样品和对照样品与特异性结合人LAG-3的人单克隆抗体或其抗原结合部分接触。然后检测复合物的形成，其中与对照样品相比，样品之间的差异复合物形成表明样品中存在人LAG-3抗原。此外，本发明的抗LAG-3抗体可用于通过免疫亲和纯化来纯化人LAG-3。

鉴于本发明的抗LAG-3抗体抑制LAG-3与MHC II类或FGL1类分子的结合和刺激抗原特异性T细胞应答的能力，本发明还提供了使用本发明的抗体刺激、增强或上调抗原特异性T细胞应答的体外和体内方法。例如，本发明提供了刺激抗原特异性T细胞应答的方法，包括向受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，从而刺激抗原特异性T细胞应答。可以使用任何合适的抗原特异性T细胞应答指示剂来测量抗原特异性T细胞应答。

癌症的治疗

这种合适的指示剂的非限制性实例包括在抗体存在下增加的T细胞增殖和/或在抗体存在下增加的细胞因子产生。在一个优选的实施方案中，刺激抗原特异性T细胞的白细胞介素-2产生。本发明还提供了刺激受试者的免疫应答(例如，抗原特异性T细胞应答)的方法，包括向受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，从而使得刺激免疫应答(例如抗原特异性T细胞应答)。在一个优选的实施方案中，所述受试者是携带癌症的受试者并且刺激针对肿瘤的免疫应答。抗体对LAG-3的癌症阻断可增强患者对癌细胞的免疫应答。抗LAG-3抗体可单独使用或与其他免疫原性剂、标准癌症治疗剂或其他抗体联合使用。

可以使用本发明的方法治疗的癌症的实例包括骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，睾丸癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，食管癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，慢性或急性白血病包括急性骨髓性白血病，慢性粒细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，儿童实体瘤，淋巴细胞性淋巴瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)癌，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管生成，脊柱轴肿瘤，脑干胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱导的癌症包括由石棉诱导的癌症，以及所述癌症的组合。

抗体或其抗原结合部分可以与化学疗法或放射疗法组合使用。

与化疗组合使用

抗体或其抗原结合部分可以与抗癌剂、细胞毒性剂或化学治疗剂组合使用。

术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何药剂，并且包括但不限于细胞毒性剂，细胞抑制剂，抗血管生成剂，放射疗法和放射治疗剂，靶向抗癌剂，BRM，治疗性抗体，癌症疫苗，细胞因子，激素疗法，放射疗法和抗转移剂和免疫治疗剂。应该理解的是，在如上所述的选定实施方案中，此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与公开的位点特异性抗体结合。更具体而言，在某些实施方案中，将选择的抗癌剂连接至工程化抗体的不配对半胱氨酸以提供如本文所述的工程化偶联物。因此，这样的工程化缀合物被明确地考虑在本发明的范围内。在其他实施方案中，所公开的抗癌剂将与包含如上所述的不同治疗剂的位点特异性缀合物组合施用。

如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指对细胞有毒并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。在某些实施方案中，该物质是源自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于细菌(例如，白喉毒素，假单胞菌内毒素和外毒素，葡萄球菌肠毒素A)，真菌(例如α-八叠球菌素，局限曲霉素)，植物(相思豆毒蛋白，蓖麻毒素，蒴莲根毒素，槲寄生素，美洲商陆抗病毒蛋白，皂草素，白树毒素，momoridin，天花粉蛋白，大麦毒素，油桐(Aleurites fordii)蛋白，石竹素蛋白，Phytolacca mericana蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻风树毒蛋白，巴豆毒素，石碱草抑制剂，白树毒素，mitegellin，局限曲霉素，酚霉素，新霉素和单端孢霉烯族化合物)或动物(例如细胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或变体)的小分子毒素或酶促活性毒素。

为了本发明的目的，“化学治疗剂”包括非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)。这些化学试剂通常针对细胞生长或分裂所需的细胞内过程，因此对于通常快速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，从而抑制细胞进入有丝分裂。通常，化学治疗剂可以包括抑制或被设计用于抑制癌细胞或可能变成性或产生致瘤后代(例如TIC)的细胞的任何化学药剂。这些药剂通常是组合使用的，并且通常是最有效的，例如，在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。

可以与本发明的位点特异性构建体组合使用的抗癌剂(作为位点特异性缀合物的组分或未缀合状态)的实例包括但不限于烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺、多聚乙酰(acetogenins)、喜树碱、苔藓抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀、多卡米星、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉碱、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔类抗生素、dynemicin、双膦酸盐、埃斯波霉素、色素蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素类(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、

多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗-代谢物、埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗-肾上腺素、叶酸补充剂如弗林酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯布希(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵、爱波喜龙、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、

多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)、雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；卡西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；

吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱，

长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素；卡培他滨；考布他汀；甲酰四氢叶酸；奥沙利铂；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂(其减少细胞增殖)，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括的是用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂，抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，和抗-雄激素；以及曲沙他滨(1，3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核酶诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，

rIL-2；

拓扑异构酶1抑制剂；

rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

与放射疗法组合使用

本发明还提供了抗体或其抗原结合部分与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ-照射，X-射线，UV-照射，微波，电子发射等)的组合。还考虑了使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的联合疗法，并且所公开的缀合物可以与靶向的抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法在约1周至约2周的时间段内以脉冲方式施用。放射疗法可以对患有头颈癌的受试者施用约6至7周。任选地，放射疗法可以作为单剂量或作为多个顺序剂量施用。

诊断

本发明提供了用于检测、诊断或监测增殖性病症的体外和体内方法以及筛选来自患者的细胞以鉴定肿瘤细胞包括致瘤细胞的方法。这样的方法包括鉴定用于治疗的患有癌症的个体或监测癌症的进展，包括将患者或从患者获得的样品(体内或体外)与本文所述的抗体接触，并检测样品中与结合的或游离的靶分子的结合的抗体的存在或不存在或结合水平。在一些实施方案中，抗体将包含如本文所述的可检测标记或报道分子。

在一些实施方案中，抗体与样品中特定细胞的结合可表示样品可能含有致瘤细胞，从而表明具有癌症的个体可用本文所述的抗体有效治疗。

可以通过多种测定法分析样品，例如放射免疫测定法，酶免疫测定法(例如ELISA)，竞争结合测定法，荧光免疫测定法，免疫印迹测定法，Western印迹分析和流式细胞术测定法。兼容的体内诊断或诊断测定可以包括本领域公知的成像或监测技术，例如本领域技术人员已知的磁共振成像，计算机化断层摄影(例如CAT扫描)，正电子断层扫描(例如PET扫描)，放射线照相术，超声波等。

药物包装和试剂盒

还提供了包含包含一个或多个剂量的抗体或其抗原结合部分的一个或多个容器的药物包装和试剂盒。在某些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如抗体或其抗原结合部分，具有或不具有一种或多种其他试剂。对于其他实施方案，这种单位剂量以一次性使用的预充式注射用注射器供应。在其他实施方案中，单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖或类似物；缓冲液，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的pH范围内。或者，在某些实施方案中，缀合物组合物可以作为冻干粉末提供，其可以在加入合适的液体(例如无菌水或盐溶液)后重建。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。容器上或与容器相关联的任何标签指示封装的缀合物组合物用于治疗选择的肿瘤疾病状况。

本发明还提供了用于产生位点特异性缀合物以及任选地一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，小瓶，注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且包含药学有效量的所公开的缀合或非缀合形式的缀合物。在其他优选实施例中，容器包括无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒通常在合适的容器中包含工程化偶联物的药学上可接受的制剂，并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或组合治疗。例如，除了本发明的抗体或其抗原结合部分之外，这样的试剂盒可以含有任何一种或多种抗癌剂，例如化学治疗剂或放射治疗剂；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂。

更具体地说，试剂盒可以具有含有所公开的抗体或其抗原结合部分的单个容器，其含有或不含另外的组分，或者它们可以具有用于每种所需试剂的不同容器。在提供用于缀合的组合治疗剂的情况下，可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合单一溶液。或者，试剂盒的缀合物和任何任选的抗癌剂可以在施用于患者之前分开保存在不同的容器中。试剂盒还可以包含用于容纳无菌药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液，特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以设想溶剂也可以提供于另一个容器中。

如上简要所述，所述试剂盒还可含有向患者施用抗体或其抗原结合部分和任何任选组分的工具，例如一种或多种针，I.V.袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他类似装置，通过其可以将制剂注射或引入动物体内或将其施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳小瓶或类似物的装置以及用于商业销售的其他紧密封闭的部件，例如注射或吹塑塑料容器，其中放置并且保持所需的小瓶和其他装置。

序列表概述

本申请附带有包含许多核酸和氨基酸序列的序列表。下表提供了所包含的序列的概述。

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例并旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1

材料的制备

1.免疫原的产生

由Sangon Biotech合成具有SEQ ID NO：22的编码人LAG-3 ECD(胞外结构域，ECD)或具有SEQ ID NO：24的编码全长人LAG-3的核酸。LAG-3ECD的氨基酸序列和编码其的DNA序列分别示于SEQ ID NO：21和22，全长LAG-3的氨基酸序列和编码其的DNA序列分别示于SEQID NO：23和24。从合成的核酸中扩增LAG-3基因片段并将其插入表达载体pcDNA3.3(ThermoFisher)中。插入的LAG-3基因片段通过DNA测序进一步证实。通过将人LAG-3基因转染到293F细胞(ThermoFisher)中获得含有人LAG-3ECD与各种标签(包括人Fc，小鼠Fc和His标签)的融合蛋白。将细胞在37℃、5％CO₂下在FreeStyle 293表达培养基(ThermoFisher)中培养。培养5天后，将从瞬时转染细胞培养物收获的上清液用于蛋白质纯化。融合蛋白通过镍、蛋白A和/或SEC柱纯化。通过使用因子Xa蛋白酶(New England Biolabs)以切割位点切割ECD-hFc融合蛋白产生未加标签的LAG-3ECD蛋白。纯化的蛋白质用于免疫、筛选和表征。

2.基准抗体的产生

基于专利申请US 20110150892 A1和US 20170101472 A1中公开的信息合成抗人LAG-3基准抗体(BMK1和BMK7，其中BMK1在US 20110150892 A1中被称为“25F7”，和BMK7在US20170101472 A1中被称为“H4sH15482P”)。基准抗体BMK8是嵌合抗体BMK5的人源化形式，BMK5在WO2015138920A1中描述并称为“BAP050-chi”。在WO2015138920A1中BMK8被称为“BAP050-hum01”。如上面第1节所述，将合成的基因序列整合到质粒pcDNA3.3中。将质粒瞬时转染到293F细胞中。以与第1节中所述相同的方式培养细胞。培养5天后，从瞬时转染细胞培养物收获的上清液用于蛋白质纯化。基准抗体从上清液中纯化。

3.建立稳定的细胞系

产生人、小鼠和食蟹猴LAG-3转染细胞系。简而言之，使用Lipofectamine 2000转染试剂盒，根据制造商的方案，分别用含有全长人、小鼠和食蟹猴LAG-3的pcDNA3.3表达载体转染Flp-In-293、Flp-In-CHO或293F细胞。在转染48-72小时后，将转染的细胞在含有杀稻瘟菌素的培养基中培养以供选择并测试LAG-3表达。通过有限稀释获得表达人LAG-3的细胞系、表达食蟹猴LAG-3的细胞系和表达小鼠LAG-3的细胞系。

实施例2

抗体杂交瘤生成

1.免疫和细胞融合

用佐剂中的12.5μg hFc标记的人LAG-3ECD蛋白和12.5μg His标记的小鼠LAG-3交替免疫接种24周龄的OMT大鼠(具有重组免疫球蛋白基因座的转基因大鼠，如US8,907,157B2中所述)，产生框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的抗体。每两周对免疫的大鼠取血进行血清收集，并通过ELISA测量血清中抗人LAG-3的效价。将涂有人LAG-3.ECD.hFc的平板与稀释的大鼠血清(首先1:100，然后在2％BSA中稀释3倍)共孵育2小时。使用山羊抗大鼠-IgG-Fc-HRP作为二抗。通过分配100μL的TMB底物来显色，然后用100μL的2N HCl终止。使用酶标仪在450nM读取吸光度。一旦抗体滴度达到足够高，用无佐剂的DPBS中的40μg人LAG-3 ECD蛋白对大鼠进行最终加强。在融合当天，在无菌条件下从免疫的大鼠中取出淋巴结和脾脏，并制备成单细胞悬液。然后将分离的细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以1：1的比率混合。使用BTX 2000 Electro cell操纵器进行电细胞融合。然后将细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在37℃、5％CO₂下培养，直到准备好用于筛选。

2.杂交瘤上清液的初步筛选和确认筛选

使用ELISA测定法作为第一筛选方法来测试杂交瘤上清液与LAG-3蛋白的结合。将本实施例的第1节的平板在4℃用1μg/mL的人LAG-3 ECD.hFc包被过夜。封闭和洗涤后，将杂交瘤上清液转移至包被的平板并在室温下孵育1小时。然后洗涤平板，随后用二抗山羊抗大鼠IgG HRP孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止显色反应。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。

为了证实LAG-3抗体与细胞膜上表达的构象性LAG-3分子的天然结合，在LAG-3转染的CHO-K1细胞系上进行流式细胞术分析。将表达人LAG-3的CHO-K1细胞以1x10⁵个细胞/孔的密度转移到96孔U形底平板中。然后将杂交瘤上清液转移至平板并在4℃孵育1小时。用1×PBS/1％BSA洗涤后，加入二抗山羊抗大鼠IgG Alexa647并与细胞在4℃在黑暗中孵育0.5小时。然后洗涤细胞并重悬于1×PBS/1％BSA中，然后通过流式细胞术分析。作为阴性对照平行进行抗体与亲本CHO-K1细胞系的结合。进行与亲本CHO-K1细胞系的抗体结合作为对照。

使用抗体的阻断活性作为确认性筛选以选择潜在的抗体命中。通过FACS分析测试所选抗体阻断LAG-3蛋白与表达人MHC-II的细胞系Raji的结合的能力。将Raji细胞以1x10⁵个细胞/孔的密度转移到96孔U形底平板中。将上清液与mFc标记的LAG-3蛋白在4℃孵育30分钟。将混合物转移到用Raji细胞接种的96孔板中。将二抗PE标记的山羊抗小鼠IgG抗体(对大鼠IgG Fc无交叉反应性，Jackson Immunoresearch Lab)与细胞在4℃在黑暗中孵育0.5小时。然后洗涤细胞并重悬于1×PBS/1％BSA中并通过流式细胞术分析。

3.杂交瘤亚克隆：

一旦通过初步和确认性筛选验证了特异性结合，则通过使用半固体培养基方法将阳性杂交瘤细胞系亚克隆以获得单克隆抗hLAG-3抗体。在半固体培养基方法中，对于每种杂交瘤细胞系，将细胞在半固体克隆培养基(STEMCELL Technologies)中稀释并接种于6孔板中。在培养箱(37℃，5％CO₂)中培养细胞8-10天，直到在半固体培养基中可见单克隆。挑取克隆并转移至96孔板处于含有10％FBS的HAT培养基(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培养基)中。如上所述，通过针对人LAG-3的结合ELISA和FACS证实阳性克隆。

实施例3

杂交瘤测序和完全人抗体分子构建

1.杂交瘤测序

使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen)从杂交瘤细胞中分离总RNA，并如表1和表2所示制备第一链cDNA。如表3和表4所示，通过使用3'-恒定区简并引物和5'-简并引物组(其与Ig可变序列的上游信号序列编码区互补)从cDNA扩增抗体VH和VL基因。表5显示了包括制造商在内的试剂信息。

将PCR产物(10μL)连接到pMD18-T载体中，并将10μL连接产物转化到Top10感受态细胞中。将转化的细胞铺在2-YT+Cab平板上并在37℃孵育过夜。随机挑选阳性克隆用于在Shanghai Biosune Biotech Co.,Ltd.进行测序。

表1.cDNA扩增反应(20μL)

表2.cDNA扩增反应条件

	步骤1	步骤2	步骤3	步骤4
					温度(℃)	25	50	85	4
时间	10min	50min	5min	∞

表3.PCR反应体系(50μL)

组分	量
		cDNA	2.0μL
Premix Ex Taq	25μL
		5’-简并引物组(10pM)	2.5μL
3’-恒定区简并引物(10pM)	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	19.5μL

表4.PCR反应条件

表5.试剂信息

两种先导抗体分别命名为“1.53.3-uAb-IgG4k”和“3.40.19-uAb-IgG4L”。

1.53.3-uAb-IgG4k的CDR序列测定如下：

描述	SEQ ID NO.	序列信息
			CDRH1	1	GGSFSGYYWS
CDRH2	2	EINHRGNTNYNPSLKS
			CDRH3	3	GEDYSDYDYYGDF
CDRL1	4	RASQSISSYLA
			CDRL2	5	AASNRAT
CDRL3	6	QQRSNWPLT

1.53.3-uAb-IgG4k的重链和轻链可变区的序列如下：

3.40.19-uAb-IgG4L的CDR序列如下：

描述	SEQ ID NO.	序列信息
			CDRH1	7	GDSISSTSYYWG
CDRH2	8	SFYYSGSTYYNPSLKS
			CDRH3	9	MQLWSYDVDV
CDRL1	10	TGTSSDVGGYDYVA
			CDRL2	11	DVSERPS
CDRL3	12	SSYTSTTTLVV

3.40.19-uAb-IgG4L的重链和轻链可变区的序列如下：

2.完全人抗体分子构建

使用含有合适限制性位点的克隆引物重新扩增VH和VL基因，并将其克隆到表达载体中以产生相应的嵌合抗体克隆。

实施例4

LAG-3抗体与细胞表面人LAG-3的结合

将各种浓度的测试抗体、阳性和阴性对照添加到人LAG-3转染细胞中，然后通过相应的PE标记的二抗检测抗体在细胞表面上的结合。数据显示在图1中，EC₅₀显示在表6中。

表6

Ab	EC<sub>50</sub>(nM)
		1.53.3-uAb-IgG4k	0.43
3.40.19-uAb-IgG4L	0.13
		BMK1	0.32
BMK7	0.61
		BMK8	0.90

出人意料的是，如图1和表6所示，3.40.19-uAb-IgG4L与细胞表面LAG-3结合的EC₅₀(0.13)明显低于所有三种基准抗体BMK1(0.32)，BMK7(0.61)和BMK8(0.90)。此外，1.53.3-uAb-IgG4k与细胞表面LAG-3结合的EC₅₀(0.43)远低于BMK7(0.61)和BMK8(0.90)的EC₅₀。这些结果表明1.53.3-uAb-IgG4k和3.40.19-uAb-IgG4L能有效结合人LAG-3，并且结合效果优于或相当于基准抗体。

实施例5

LAG-3蛋白与Raji细胞上表达的MHC-II的结合的阻断

在1％BSA-PBS中连续稀释抗体，并在4℃下用mFc标记的LAG-3蛋白孵育30分钟。将混合物转移到用Raji细胞接种的96孔板中。使用山羊抗小鼠IgG Fc-PE抗体来检测LAG-3蛋白与Raji细胞的结合。通过流式细胞术评估MFI并通过FlowJo软件(版本7.6.1)分析。数据显示在图2中，EC₅₀显示在表7中。

表7

Ab	EC<sub>50</sub>(nM)
		1.53.3-uAb-IgG4k	0.80
3.40.19-uAb-IgG4L	0.67
		BMK1	0.76
BMK7	1.25
		BMK8	0.88

如图2和表7所示，出人意料的是，3.40.19-uAb-IgG4L与在Raji细胞上表达的MHC-II的结合的EC₅₀(0.67)明显低于所有三种基准抗体BMK1(0.76)，BMK7(1.25)和BMK8(0.88)的EC₅₀。此外，1.53.3-uAb-IgG4k与在Raji细胞上表达的MHC-II的结合的EC₅₀(0.80)低于BMK7(1.25)和BMK8(0.88)的EC₅₀。这些结果表明1.53.3-uAb-IgG4k和3.40.19-uAb-IgG4L在阻断与Raji细胞上表达的MHC-II的结合方面是有效的，并且阻断效果优于或相当于基准抗体。

实施例6

LAG-3蛋白与LSECtin和半乳糖凝集素-3的结合的阻断

在4℃分别用0.5μg/mL的人LSECtin或半乳糖凝集素-3包被96孔板过夜。抗体在1％BSA-PBS中连续稀释并与mFc标记的LAG-3蛋白混合。封闭并洗涤后，将混合物转移至平板并在室温下孵育1小时。然后洗涤平板，随后用相应的二抗孵育60分钟。洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止显色反应。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。数据显示在图3和4中。EC₅₀显示在表8中。

表8

如图3和4以及表7所示，1.53.3-uAb-IgG4k和3.40.19-uAb-IgG4L都能有效阻断LAG-3与LSECtin或半乳糖凝集素-3的结合，并且阻断效应优于或相当于基准抗体。

实施例7

完整动力学结合亲和力测试

通过表面等离子体共振(SPR)测试的完整动力学结合亲和力：

通过使用Biacore 8K的SPR测定来表征抗体针对人LAG-3的亲和力和结合动力学。将山羊抗人Fc预固定到传感器芯片(CM5)上，并且当注入芯片时捕获抗LAG-3抗体。将各种浓度的人LAG-3蛋白和运行缓冲液以30μL/min的流速流过传感器芯片，进行300s的缔合相，随后进行3600s的解离。缔合和解离曲线通过使用Biacore 8K评估软件的1：1Langmuir结合模型拟合。数据显示在表9中。

表9

Ab	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				1.53.3-uAb-IgG4k	6.60E+05	3.33E-05	5.05E-11
3.40.19-uAb-IgG4L	1.05E+06	1.11E-05	1.06E-11
				BMK1	4.87E+05	3.34E-04	6.85E-10
BMK7	2.13E+05	1.06E-04	4.97E-10
				BMK8	8.46E+04	6.74E-06	7.97E-11

通过荧光激活细胞分选(FACS)测试的LAG-3抗体与细胞表面LAG-3分子的结合亲和力

通过FACS分析测量抗体对细胞表面LAG-3的结合亲和力。将表达人LAG-3的Flp-In-293细胞以5×10⁵个细胞/mL的密度转移到96孔U形底平板中。将测试的抗体在洗涤缓冲液(1×PBS/1％BSA)中连续稀释并在4℃下与细胞孵育1小时。加入二抗山羊抗人IgG FcFITC(每摩尔IgG 3.5摩尔FITC)，并在4℃在黑暗中孵育0.5小时。然后将细胞洗涤一次并重悬于1×PBS/1％BSA中，并通过流式细胞术分析。基于定量珠粒(QuantumTM MESF试剂盒，Bangs Laboratories，Inc.)将荧光强度转化为结合的分子/细胞。使用Graphpad Prism 5计算亲和力。数据显示在表10中。

表10

Ab	KD(M)
		1.53.3-uAb-IgG4k	1.60E-10
3.40.19-uAb-IgG4L	5.30E-11
		BMK1	2.70E-10
BMK7	5.80E-10
		BMK8	9.40E-10

如通过SPR和FACS所测试的，由1.53.3-uAb-IgG4k和3.40.19-uAb-IgG4L表示的本发明的抗体有效结合人LAG-3，并且结合效果优于或相当于基准抗体。

实施例8

直系同源物(跨物种)和同系物(跨家族)结合

与食蟹猴LAG-3和鼠LAG-3的交叉反应性

通过FACS测量与食蟹猴和鼠LAG-3的交叉反应性。将表达鼠LAG-3的Flp-In-CHO细胞或食蟹猴LAG-3表达293F细胞以1x10⁵个细胞/孔的密度转移到96孔U形底平板中。将测试抗体在洗涤缓冲液(1×PBS/1％BSA)中连续稀释并与细胞在4℃下孵育1小时。用1×PBS/1％BSA洗涤后，施加相应的二抗，并与细胞在4℃在黑暗中孵育1小时。然后洗涤细胞并重悬于1×PBS/1％BSA中，然后通过流式细胞术分析。数据显示在图5和图6中。EC₅₀显示在表11中。

表11

Ab	EC<sub>50</sub>(nM)
		1.53.3-uAb-IgG4k	4.01
3.40.19-uAb-IgG4L	3.92
		BMK1	86.0
BMK7	2.65
		BMK8	3.05

如图5所示，本发明的LAG-3抗体“1.53.3-uAb-IgG4k”和“3.40.19-uAb-IgG4L”与细胞表面食蟹猴LAG-3结合。如图6所示，本发明的LAG-3抗体“1.53.3-uAb-IgG4k”和“3.40.19-uAb-IgG4L”不与细胞表面小鼠LAG-3结合。

与人CD4的交叉反应性

通过ELISA测量与人CD4的交叉反应性。在4℃用1μg/mL的人CD4包被平板过夜。封闭和洗涤后，将1μg/mL的LAG-3抗体加入平板并在室温下孵育1小时。然后洗涤平板，随后与相应的二抗孵育45分钟。洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止显色反应。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。数据如图7所示。

这些结果表明本发明的LAG-3抗体“1.53.3-uAb-IgG4k”和“3.40.19-uAb-IgG4L”不结合人CD4蛋白。

实施例9

针对BMK1、BMK7和BMK5的表位分仓

通过FACS分析将LAG-3抗体的结合表位针对基准抗体BMK1、BMK7和BMK5进行分仓。将在细胞表面表达人LAG-3的Flp-In-293细胞与浓度为1ug/mL的生物素化基准抗体孵育1小时，然后加入连续稀释的LAG-3抗体。使用链霉亲和素-PE抗体(Jackson ImmunoresearchLab)来检测基准抗体与细胞的结合。通过流式细胞术评估MFI并通过FlowJo进行分析。数据如图8A-E所示。

发现本发明的1.53.3-uAb-IgG4k与BMK竞争，但3.40.19-uAb-IgG4L不与BMK竞争。1.53.3-uAb-IgG4k与BMK1和BMK7共有接近的表位，但不与BMK5共有表位。出人意料的是，3.40.19-uAb-IgG4L具有与所有BMK1、BMK7和BMK5不同的表位。

实施例10

结构域作图和表位作图

1.结构域作图

LAG-3具有421aa(P30-L450)的胞外结构域，包括四个胞外免疫球蛋白超家族(IgSF)样结构域，即结构域1(“D1,”aa.37-167)、结构域2(“D2,”aa 168-252.)、结构域3(“D3,”aa.265-343)和结构域4(“D4,”aa.348-419)。通过用相对应的小鼠LAG-3氨基酸(在本公开的上下文中也称为“aa”)替换人LAG-3胞外结构域的下述残基而构建10种变体。

(1)变体1:xPro1.FL-x1:人LAG-3 aa 168至419被小鼠对应部分替换

(2)变体2:xPro1.FL-x2:人LAG-3 aa 37至167和aa 265至419被小鼠对应部分替换

(3)变体3:xPro1.FL-x3:人LAG-3 aa 37至252和aa 348-419被小鼠对应部分替换

(4)变体4:xPro1.FL-x4:人LAG-3 aa 37至343被小鼠对应部分替换

(5)变体5:xPro1.FL-x5:人LAG-3 aa 265至419被小鼠对应部分替换

(6)变体6:xPro1.FL-x6:人LAG-3 aa 37至167和aa 348至419被小鼠对应部分替换

(7)变体7:xPro1.FL-x7:人LAG-3 aa 37至252被小鼠对应部分替换

(8)变体8:xPro1.FL-x8:人LAG-3 aa 168至343被小鼠对应部分替换

(9)变体9:xPro1.FL-x9:人LAG-3 aa 348至419被小鼠对应部分替换

(10)变体10:xPro1.FL-x10:人LAG-3 aa 37至167被小鼠对应部分替换

将这10种变体克隆到pcDNA3载体中并且用于293F细胞转染。简言之，用FreeStyle293F培养基将293F细胞稀释至密度为1×10⁶个细胞/mL，并将3mL/孔的等分试样添加到24孔板中。使用293fectin试剂(Life Technologies)进行转染。对于每次转染，将3μg DNA稀释在150μL Opti-MEM I减血清培养基(Life Technologies)中，然后与6μL预先稀释在150μL Opti-MEM I减血清培养基中的293fectin试剂组合。在加入到培养物中之前，允许DNA/Lipofectamine混合物在25℃静置20分钟。在转染后48小时通过流式细胞术分析转染的细胞。

通过流式细胞术分析抗体与嵌合LAG-3变体或全长人/小鼠LAG-3的结合。简言之，将1μg/mL抗体与转染的表达嵌合LAG-3的293F细胞在4℃孵育1小时，然后用3μg/mL山羊抗人IgG Fc R-PE(Jackson)在4℃孵育40分钟。用流式细胞仪分析细胞。

检测抗体1.53.3-uAb-IgG4k和3.40.19-uAb-hIgG4L与这10种变体的结合能力，并且结果显示在下表12中。

表12.LAG-3抗体对10种变体的结合MFI值

按照抗体的FACS结合活性，两种先导抗体，即，“1.53.3-uAb-IgG4k”和“3.40.19-uAb-hIgG4L”都与结构域1(即aa.37-167)结合。因此，通过丙氨酸扫描实验进行结构域1(G37-Q167,131aa)的进一步表位作图。

2.表位作图

对人LAG-3进行丙氨酸扫描实验以进行表位作图。将人LAG-3上的丙氨酸残基突变为甘氨酸密码子，并且将所有其他残基(除了半胱氨酸残基之外)突变成丙氨酸密码子。对于人LAG-3胞外结构域(ECD)的每个残基，利用两个顺序PCR步骤进行位点氨基酸置换。将编码人LAG-3的ECD结构域1和结构域2与C端mFc-标签的pcDNA3.3-LAG-3-D12.mFc质粒用作模板，并且将一组诱变引物用于使用QuikChange lightning多位点定向诱变试剂盒(Agilenttechnologies,Palo Alto,CA)的第一步PCR。在突变链合成反应后，使用Dpn I核酸内切酶消化亲本模板。在第二步PCR中，扩增包含CMV启动子、LAG-3的胞外结构域1和2(D1和D2)、mFc-标签和单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)多腺苷化的线性DNA表达盒，并在37℃在Expi293细胞中瞬时表达(Life Technologies,Gaithersburg,MD)，通过蛋白质A-HPLC和mFc-ELISA定量试剂盒(Bethyl,USA)定量。

对于ELISA结合测定，将抗体1.53.3-uAb-IgG4k或3.40.19-uAb-hIgG4L(2μg/mL)包被在板上。在与包含定量的LAG-3突变体或人LAG-3-ECD.D12.mFc蛋白的上清液相互作用后，加入HRP缀合的抗mFc抗体(1:5000；Bethyl,USA)作为检测抗体。按照对照突变体的平均吸光度，将吸光度标准化。在对结合变化倍数设置另外的截点(<0.75)后，鉴定最终确定的表位残基。抗体1.53.3-uAb-IgG4k和3.40.19-uAb-hIgG4L的热点显示在表13和表14中。

表13.1.53.3-uAb-IgG4k抗体的热点

表14.3.40.19-uAb-IgG4L抗体的热点

由于没有存在的LAG-3结构，基于已知的髓磷脂连接的糖蛋白结构(PDB:5FLU，序列同一性18％)，建模LAG-3(aa:31-431)的结构。基于丙氨酸扫描结果，鉴定了两种抗体的热点，并显示在图9A和图9B中。

基于所述结果，可以看出，1.53.5-uAb-IgG4k抗体结合属于外环(G70-Y99)的W92位点，而3.40.19-uAb-IgG4L抗体结合L134-P138区。

实施例11

通过基于细胞的测定法测试的LAG-3抗体的体外功能

人LAG-3抗体在报告基因测定中的作用

将表达人LAG-3和具有稳定整合的IL-2荧光素酶报道基因的Jurkat细胞在SEE存在下与Raji细胞一起接种在96孔板中。将测试抗体加入到细胞中。将平板在37℃，5％CO₂下孵育过夜。孵育后，加入重构的荧光素酶底物并通过微孔板分光光度计测量荧光素酶强度。数据显示在图10中，EC₅₀显示在表15中。

表15

Ab	EC<sub>50</sub>(nM)
		1.53.3-uAb-IgG4k	1.07
3.40.19-uAb-IgG4L	0.21
		BMK1	0.59
BMK7	2.65
		BMK8	65.3

如图10所示，LAG-3抗体在报道基因测定中增强了Jurkat的IL-2途径。此外，如表15所示，该测定中3.40.19-uAb-IgG4L的EC₅₀明显低于全部三种基准抗体。

人LAG-3抗体对人同种异体混合淋巴细胞反应的影响

使用Ficoll-Paque PLUS梯度离心从健康供体新鲜分离人外周血单核细胞(PBMC)。根据制造商的说明使用人单核细胞富集试剂盒分离单核细胞。将细胞在含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养5至7天以产生树突细胞(DC)。根据制造商的方案使用人CD4⁺T细胞富集试剂盒分离人CD4⁺T细胞。将纯化的CD4⁺T细胞与同种异体的不成熟DC(iDC)和各种浓度的LAG-3抗体在96孔板中共培养。在第5天，收集培养物上清液进行IFN-γ测试和T细胞增殖测试。使用匹配的抗体对通过ELISA测量人IFN-γ。将平板用特异于人IFN-γ的捕获抗体(Pierce-M700A)预包被。使用生物素缀合的抗IFN-γ抗体(Pierce-M701B)作为检测抗体。在最后的16小时，以1μCi/孔添加³H-胸苷。通过闪烁计数测量³H-胸苷掺入，并将增殖反应表示为一式三份的孔的CPM(每分钟计数)。数据显示在图11和12中。

如图11所示，本发明的LAG-3抗体“1.53.3-uAb-IgG4k”和“3.40.19-uAb-IgG4L”在混合淋巴细胞反应中增强IFN-γ分泌。此外，如图12所示，本发明的LAG-3抗体“1.53.3-uAb-IgG4k”和“3.40.19-uAb-IgG4L”在混合淋巴细胞反应中增强T细胞增殖。

实施例12

ADCC和CDC测试

为了评估触发Fc效应功能的能力，评估抗LAG-3抗体是否可以介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。

ADCC测试

将表达人LAG-3的Flp-In-293细胞和各种浓度的LAG-3抗体在96孔圆底板中预孵育30分钟；然后加入PBMC作为效应物，效应物/靶比例为50：1。将平板保持在37℃、5％CO₂下4小时。通过基于LDH的细胞毒性检测试剂盒测定靶细胞裂解。使用酶标仪读取492nm处的吸光度。使用赫赛汀和表达HER2的细胞系SK-Br-3作为阳性对照。

CDC测试

作为靶标的表达人LAG-3的Flp-In-293和各种浓度的LAG-3抗体在96孔圆底平板中混合。以1:50的最终稀释度添加人补体。将平板保持在37℃、5％CO₂下2小时。靶细胞裂解由CellTiter-Glo确定。使用酶标仪读取吸光度。使用利妥昔单抗和表达CD20的细胞系Raji作为阳性对照。

图13A和13B显示了ADCC测试和CDC测试的数据。证明，由1.53.3-uAb-IgG4k和3.40.19-uAb-IgG4L表示的本发明的LAG-3抗体不介导ADCC(图13A)和CDC(图13B)效果。

实施例13

血清稳定性测试

在37℃下将前导Ab在新鲜分离的人血清(血清含量>95％)中孵育。在指定的时间点，将血清处理的样品的等分试样从培养箱中取出并在液氮中快速冷冻，然后在80℃储存直至准备用于测试。样品在稳定性测试之前立即快速解冻。将人LAG-3转染细胞与各种浓度的前导抗体在4℃下孵育1小时。使用PE标记的山羊抗人IgG来检测前导抗体与细胞的结合。通过流式细胞仪(BD FACSCanto II)测量细胞的MFI并通过FlowJo进行分析。数据显示在图14A和14B中。

证明由1.53.3-uAb-IgG4k和3.40.19-uAb-IgG4L代表的本发明的LAG-3抗体在新鲜人血清中稳定达14天。

本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

序列表

<110> 广州誉衡生物科技有限公司

<120> 抗人LAG-3抗体及其用途

<130> IDC226033

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1.53.3-uAb-IgG4k的CDRH1

<400> 1

Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1.53.3-uAb-IgG4k的CDRH2

<400> 2

Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1.53.3-uAb-IgG4k的CDRH3

<400> 3

Gly Glu Asp Tyr Ser Asp Tyr Asp Tyr Tyr Gly Asp Phe

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1.53.3-uAb-IgG4k的CDRL1

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1.53.3-uAb-IgG4k的CDRL2

<400> 5

Ala Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1.53.3-uAb-IgG4k的CDRL3

<400> 6

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3.40.19-uAb-IgG4L的CDRH1

<400> 7

Gly Asp Ser Ile Ser Ser Thr Ser Tyr Tyr Trp Gly

1 5 10

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3.40.19-uAb-IgG4L的CDRH2

<400> 8

Ser Phe Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3.40.19-uAb-IgG4L的CDRH3

<400> 9

Met Gln Leu Trp Ser Tyr Asp Val Asp Val

1 5 10

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3.40.19-uAb-IgG4L的CDRL1

<400> 10

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asp Tyr Val Ala

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3.40.19-uAb-IgG4L的CDRL2

<400> 11

Asp Val Ser Glu Arg Pro Ser

1 5

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3.40.19-uAb-IgG4L的CDRL3

<400> 12

Ser Ser Tyr Thr Ser Thr Thr Thr Leu Val Val

1 5 10

<210> 13

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1.53.3-uAb-IgG4k的VH

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Gly Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr

85 90 95

Arg Gly Glu Asp Tyr Ser Asp Tyr Asp Tyr Tyr Gly Asp Phe Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1.53.3-uAb-IgG4k的VL

<400> 14

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Gln Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3.40.19-uAb-IgG4L的VH

<400> 15

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Thr

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Met Gln Leu Trp Ser Tyr Asp Val Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3.40.19-uAb-IgG4L的VL

<400> 16

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asp Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Thr

85 90 95

Thr Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ser Val Leu

100 105 110

<210> 17

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1.53.3-uAb-IgG4k的VH

<400> 17

caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga cttttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcggtg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120

ccagggatgg ggctggagtg gattggggaa atcaatcatc gtggaaacac caactacaac 180

ccgtccctca agagtcgcgt caccatatca gaagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aggctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt tctgtacgag aggagaggac 300

tatagtgact acgattacta tggggacttc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 18

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1.53.3-uAb-IgG4k的VL

<400> 18

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctcaagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgct gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg caatttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa a 321

<210> 19

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3.40.19-uAb-IgG4L的VH

<400> 19

cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtga ctccatcagc agtactagtt actactgggg ctggatccgc 120

cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtttct attatagtgg gagcacctac 180

tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atttccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240

tccctgaagc tgaactctgt gaccgccgca gacacggctg tgtattactg tgcgaggatg 300

cagctatggt cgtacgatgt ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360

<210> 20

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3.40.19-uAb-IgG4L的VL

<400> 20

cagtctgccc tgactcaacc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt gggtatgact atgtcgcctg gtaccaacaa 120

cacccaggca aagtccccaa actcatgatt tatgatgtca gtgagcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcaccac cactctcgtt 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgtccgtc ctg 333

<210> 21

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人LAG-3 ECD

<400> 21

Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser

1 5 10 15

Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val

20 25 30

Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly

35 40 45

His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly

50 55 60

Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg

85 90 95

Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg

100 105 110

Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala

115 120 125

Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala

130 135 140

Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys

145 150 155 160

Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn

165 170 175

Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu

180 185 190

Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly

195 200 205

Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile

210 215 220

Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr

225 230 235 240

Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro

245 250 255

Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro

260 265 270

Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr

275 280 285

Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys

290 295 300

His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala

305 310 315 320

Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly

325 330 335

Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val

340 345 350

Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp

355 360 365

Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln

370 375 380

Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu

385 390 395 400

Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu

405 410 415

Pro Ala Gly His Leu

420

<210> 22

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人LAG-3 ECD

<400> 22

ccggtggtgt gggcccagga gggggctcct gcccagctcc cctgcagccc cacaatcccc 60

ctccaggatc tcagccttct gcgaagagca ggggtcactt ggcagcatca gccagacagt 120

ggcccgcccg ctgccgcccc cggccatccc ctggcccccg gccctcaccc ggcggcgccc 180

tcctcctggg ggcccaggcc ccgccgctac acggtgctga gcgtgggtcc cggaggcctg 240

cgcagcggga ggctgcccct gcagccccgc gtccagctgg atgagcgcgg ccggcagcgc 300

ggggacttct cgctatggct gcgcccagcc cggcgcgcgg acgccggcga gtaccgcgcc 360

gcggtgcacc tcagggaccg cgccctctcc tgccgcctcc gtctgcgcct gggccaggcc 420

tcgatgactg ccagcccccc aggatctctc agagcctccg actgggtcat tttgaactgc 480

tccttcagcc gccctgaccg cccagcctct gtgcattggt tccggaaccg gggccagggc 540

cgagtccctg tccgggagtc cccccatcac cacttagcgg aaagcttcct cttcctgccc 600

caagtcagcc ccatggactc tgggccctgg ggctgcatcc tcacctacag agatggcttc 660

aacgtctcca tcatgtataa cctcactgtt ctgggtctgg agcccccaac tcccttgaca 720

gtgtacgctg gagcaggttc cagggtgggg ctgccctgcc gcctgcctgc tggtgtgggg 780

acccggtctt tcctcactgc caagtggact cctcctgggg gaggccctga cctcctggtg 840

actggagaca atggcgactt tacccttcga ctagaggatg tgagccaggc ccaggctggg 900

acctacacct gccatatcca tctgcaggaa cagcagctca atgccactgt cacattggca 960

atcatcacag tgactcccaa atcctttggg tcacctggat ccctggggaa gctgctttgt 1020

gaggtgactc cagtatctgg acaagaacgc tttgtgtgga gctctctgga caccccatcc 1080

cagaggagtt tctcaggacc ttggctggag gcacaggagg cccagctcct ttcccagcct 1140

tggcaatgcc agctgtacca gggggagagg cttcttggag cagcagtgta cttcacagag 1200

ctgtctagcc caggtgccca acgctctggg agagccccag gtgccctccc agcaggccac 1260

ctc 1263

<210> 23

<211> 525

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长人LAG-3

<400> 23

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val

275 280 285

Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His

325 330 335

Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser

370 375 380

Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly

435 440 445

His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu

450 455 460

Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro

465 470 475 480

Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln

485 490 495

Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro

500 505 510

Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu

515 520 525

<210> 24

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长人LAG-3

<400> 24

atgtgggagg ctcagttcct gggcttgctg tttctgcagc cgctttgggt ggctccagtg 60

aagcctctcc agccaggggc tgaggtcccg gtggtgtggg cccaggaggg ggctcctgcc 120

cagctcccct gcagccccac aatccccctc caggatctca gccttctgcg aagagcaggg 180

gtcacttggc agcatcagcc agacagtggc ccgcccgctg ccgcccccgg ccatcccctg 240

gcccccggcc ctcacccggc ggcgccctcc tcctgggggc ccaggccccg ccgctacacg 300

gtgctgagcg tgggtcccgg aggcctgcgc agcgggaggc tgcccctgca gccccgcgtc 360

cagctggatg agcgcggccg gcagcgcggg gacttctcgc tatggctgcg cccagcccgg 420

cgcgcggacg ccggcgagta ccgcgccgcg gtgcacctca gggaccgcgc cctctcctgc 480

cgcctccgtc tgcgcctggg ccaggcctcg atgactgcca gccccccagg atctctcaga 540

gcctccgact gggtcatttt gaactgctcc ttcagccgcc ctgaccgccc agcctctgtg 600

cattggttcc ggaaccgggg ccagggccga gtccctgtcc gggagtcccc ccatcaccac 660

ttagcggaaa gcttcctctt cctgccccaa gtcagcccca tggactctgg gccctggggc 720

tgcatcctca cctacagaga tggcttcaac gtctccatca tgtataacct cactgttctg 780

ggtctggagc ccccaactcc cttgacagtg tacgctggag caggttccag ggtggggctg 840

ccctgccgcc tgcctgctgg tgtggggacc cggtctttcc tcactgccaa gtggactcct 900

cctgggggag gccctgacct cctggtgact ggagacaatg gcgactttac ccttcgacta 960

gaggatgtga gccaggccca ggctgggacc tacacctgcc atatccatct gcaggaacag 1020

cagctcaatg ccactgtcac attggcaatc atcacagtga ctcccaaatc ctttgggtca 1080

cctggatccc tggggaagct gctttgtgag gtgactccag tatctggaca agaacgcttt 1140

gtgtggagct ctctggacac cccatcccag aggagtttct caggaccttg gctggaggca 1200

caggaggccc agctcctttc ccagccttgg caatgccagc tgtaccaggg ggagaggctt 1260

cttggagcag cagtgtactt cacagagctg tctagcccag gtgcccaacg ctctgggaga 1320

gccccaggtg ccctcccagc aggccacctc ctgctgtttc tcatccttgg tgtcctttct 1380

ctgctccttt tggtgactgg agcctttggc tttcaccttt ggagaagaca gtggcgacca 1440

agacgatttt ctgccttaga gcaagggatt caccctccgc aggctcagag caagatagag 1500

gagctggagc aagaaccgga gccggagccg gagccggaac cggagcccga gcccgagccc 1560

gagccggagc agctc 1575

<210> 25

<211> 521

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长小鼠LAG-3

<400> 25

Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp

1 5 10 15

Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser

35 40 45

Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu

65 70 75 80

His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr

85 90 95

Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu

100 105 110

His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe

115 120 125

Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His

130 135 140

Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu

145 150 155 160

Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys

165 170 175

Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg

180 185 190

Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr

195 200 205

Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln

210 215 220

Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg

225 230 235 240

Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu

245 250 255

Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val

260 265 270

Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu

275 280 285

Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala

290 295 300

Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala

305 310 315 320

Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu

325 330 335

Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe

340 345 350

Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala

355 360 365

Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg

370 375 380

Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala

385 390 395 400

Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala

405 410 415

Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg

420 425 430

Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu Val Leu Val Leu Ile Leu

435 440 445

Gly Ala Leu Ser Leu Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Phe Gly Phe His

450 455 460

Trp Trp Arg Lys Gln Leu Leu Leu Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu His

465 470 475 480

Gly Ile Gln Pro Phe Pro Ala Gln Arg Lys Ile Glu Glu Leu Glu Arg

485 490 495

Glu Leu Glu Thr Glu Met Gly Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro

500 505 510

Gln Leu Glu Pro Glu Pro Arg Gln Leu

515 520

<210> 26

<211> 1563

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长小鼠LAG-3

<400> 26

atgagggagg acctgctcct tggctttttg cttctgggac tgctttggga agctccagtt 60

gtgtcttcag ggcctgggaa agagctcccc gtggtgtggg cccaggaggg agctcccgtc 120

catcttccct gcagcctcaa atcccccaac ctggatccta actttctacg aagaggaggg 180

gttatctggc aacatcaacc agacagtggc caacccactc ccatcccggc ccttgacctt 240

caccagggga tgccctcgcc tagacaaccc gcacccggtc gctacacggt gctgagcgtg 300

gctccaggag gcctgcgcag cgggaggcag cccctgcatc cccacgtgca gctggaggag 360

cgcggcctcc agcgcgggga cttctctctg tggttgcgcc cagctctgcg caccgatgcg 420

ggcgagtacc acgccaccgt gcgcctcccg aaccgcgccc tctcctgcag tctccgcctg 480

cgcgtcggcc aggcctcgat gattgctagt ccctcaggag tcctcaagct gtctgattgg 540

gtccttttga actgctcctt cagccgtcct gaccgcccag tctctgtgca ctggttccag 600

ggccagaacc gagtgcctgt ctacaactca ccgcgtcatt ttttagctga aactttcctg 660

ttactgcccc aagtcagccc cctggactct gggacctggg gctgtgtcct cacctacaga 720

gatggcttca atgtctccat cacgtacaac ctcaaggttc tgggtctgga gcccgtagcc 780

cctctgacag tgtacgctgc tgaaggttct agggtggagc tgccctgtca tttgccccca 840

ggagtgggga ccccttcttt gctcattgcc aagtggactc ctcctggagg aggtcctgag 900

ctccccgtgg ctggaaagag tggcaatttt acccttcacc ttgaggctgt gggtctggca 960

caggctggga cctacacctg tagcatccat ctgcagggac agcagctcaa tgccactgtc 1020

acgttggcgg tcatcacagt gactcccaaa tccttcgggt tacctggctc ccgggggaag 1080

ctgttgtgtg aggtaacccc ggcatctgga aaggaaagat ttgtgtggcg tcccctgaac 1140

aatctgtcca ggagttgccc gggccctgtg ctggagattc aggaggccag gctccttgct 1200

gagcgatggc agtgtcagct gtacgagggc cagaggcttc ttggagcgac agtgtacgcc 1260

gcagagtcta gctcaggcgc ccacagtgct aggagaatct caggtgacct taaaggaggc 1320

catctcgttc tcgttctcat ccttggtgcc ctctccctgt tccttttggt ggccggggcc 1380

tttggctttc actggtggag aaaacagttg ctactgagaa gattttctgc cttagaacat 1440

gggattcagc catttccggc tcagaggaag atagaggagc tggagcgaga actggagacg 1500

gagatgggac aggagccgga gcccgagccg gagccacagc tggagccaga gcccaggcag 1560

ctc 1563

<210> 27

<211> 533

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长食蟹猴LAG-3

<220>

<221> misc_feature

<222> (74)..(74)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 27

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Pro Gln Pro Gly Ala Glu Ile Ser Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Xaa Ala Pro Gly His Pro Pro

65 70 75 80

Val Pro Gly His Arg Pro Ala Ala Pro Tyr Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Thr Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Thr Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Ser Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Gln Gly Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro His Val Gly Pro Met Asp Ser Gly Leu Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Ala Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Ala Val

275 280 285

Gly Thr Gln Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Ala Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Ala Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Ile Cys His Ile Arg

325 330 335

Leu Gln Gly Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Gln Glu His Phe Val Trp Ser Pro

370 375 380

Leu Asn Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu His Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Arg Ala Gly

435 440 445

His Leu Pro Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Phe Leu Leu Leu Leu

450 455 460

Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro

465 470 475 480

Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln

485 490 495

Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro

500 505 510

Glu Leu Glu Arg Glu Leu Gly Pro Glu Pro Glu Pro Gly Pro Glu Pro

515 520 525

Glu Pro Glu Gln Leu

530

<210> 28

<211> 1599

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长食蟹猴LAG-3

<220>

<221> misc_feature

<222> (219)..(220)

<223> n是a, c, g, 或t

<400> 28

atgtgggagg ctcagttcct gggcttgctg tttctgcagc cgctctgggt ggctccagtg 60

aagcctcccc agccaggggc tgagatctcg gtggtgtggg cccaggaggg ggctcctgcc 120

cagctcccct gcagccccac aatccccctc caggatctca gccttctgcg aagagcaggg 180

gtcacttggc agcatcaacc agacagtggc ccgcccgcnn ccgcccccgg ccaccccccg 240

gtccccggcc atcgcccggc ggcgccctac tcttgggggc ccaggccccg ccgctacacg 300

gtgctgagcg tgggtcctgg aggcctgcgc agcgggaggc tgcccctgca gccccgcgtc 360

cagctggatg agcgcggccg gcagcgcggg gacttctcgc tgtggctgcg cccagcccgg 420

cgcgcggacg ccggcgagta ccgcgccacg gtgcacctca gggaccgcgc cctctcctgc 480

cgccttcgtc tgcgcgtggg ccaggcctcg atgactgcca gccccccagg gtctctcagg 540

acctctgact gggtcatttt gaactgctcc ttcagccgcc ctgaccgccc agcctctgtg 600

cattggttcc ggagccgtgg ccagggccga gtccctgtcc aggggtcccc ccatcaccac 660

ttagcggaaa gcttcctctt cctgccccat gtcggcccca tggactctgg gctctggggc 720

tgcatcctca cctacagaga tggcttcaat gtctccatca tgtataacct cactgttctg 780

ggtctggagc ccgcaactcc cttgacagtg tacgctggag caggttccag ggtggagctg 840

ccctgccgcc tgcctcctgc tgtggggacc cagtctttcc ttactgccaa gtgggctcct 900

cctgggggag gccctgacct cctggtggct ggagacaatg gcgactttac ccttcgacta 960

gaggatgtaa gccaggccca ggctgggacc tacatctgcc atatccgtct acagggacag 1020

cagctcaatg ccactgtcac attggcaatc atcacagtga ctcccaaatc ctttgggtca 1080

cctggctccc tggggaagct gctttgtgag gtgactccag catctggaca agaacacttt 1140

gtgtggagcc ccctgaacac cccatcccag aggagtttct caggaccatg gctggaggcc 1200

caggaagccc agctcctttc ccagccttgg caatgccagc tgcaccaggg ggagaggctt 1260

cttggagcag cagtatactt cacagaactg tctagcccag gtgcacaacg ctctgggaga 1320

gccccagggg ccctccgagc aggccacctc ccgctgtttc tcatccttgg tgtccttttt 1380

ctgctccttt tggtgactgg agcctttggc tttcaccttt ggagaagaca gtggcgacca 1440

agaagatttt ctgccttaga gcaagggatt caccctccgc aggctcagag caagatagag 1500

gagctcgagc aagaaccgga gctggaacca gagccggagc tggagcgcga gctggggccg 1560

gagcccgagc cggggcctga gcccgagccg gagcagctc 1599

Claims

1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

如SEQ ID NO：7所示的CDRH1，如SEQ ID NO：8所示的CDRH2，如SEQ ID NO：9所示的CDRH3，如SEQ ID NO：10所示的CDRL1，如SEQ ID NO：11所示的CDRL2，和如SEQ ID NO：12所示的CDRL3。

2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；

(iii)包含与SEQ ID NO：15相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；

(iii)包含与SEQ ID NO：16相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

3.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其具有一个或多个以下性质：

(a)以2×10^-10M或更低的K_D结合人LAG-3；

(b)抑制LAG-3与主要组织相容性(MHC)II类分子的结合；

(c)抑制LAG-3与纤维蛋白样蛋白1(FGL1)配体分子的结合；

(d)抑制LAG-3与LSECtin和/或半乳糖凝集素-3的结合；

(e)结合人LAG-3而不发生跨家族反应；或

(f)与人CD4没有交叉反应性。

4.权利要求1-3中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是单克隆抗体，例如完全人单克隆抗体，例如由转基因哺乳动物产生的完全人单克隆抗体，所述转基因哺乳动物优选是转基因大鼠，更优选是具有重组免疫球蛋白基因座的转基因大鼠。

5.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-4中任一项所定义的分离的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列，例如，SEQ ID NO:19-20所示的核酸序列。

6.一种表达载体，其包含权利要求5的核酸分子。

7.一种宿主细胞，其包含权利要求6的表达载体。

8.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1-4中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

9.一种制备权利要求1-4中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分的方法，其包括以下步骤：

-在权利要求7的宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合部分；和

-从宿主细胞分离所述抗体或其抗原结合部分。

10.权利要求1-4中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于调节受试者中的抗原特异性T细胞应答或调节受试者中的免疫应答的药物中的用途。

11.一种抑制或阻断LAG-3与MHC II类分子、FGL1类分子、LSECtin和/或半乳糖凝集素-3的体外结合的方法，其包括使所述MHC II类分子、FGL1类分子、LSECtin和/或半乳糖凝集素-3与权利要求1-4中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在体外接触。

12.权利要求1-4中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长的药物中的用途。

13.权利要求1-4中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防受试者中的癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病和/或炎症性疾病的药物中的用途。

14.权利要求13的用途，其中所述感染性疾病为病毒感染。

15.权利要求1-4中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于诊断增殖性病症例如癌症的诊断剂中的用途。

16.一种试剂盒，其包含含有如权利要求1-4中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分的容器。