CN108368178A - 抗lag3抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了结合T细胞共抑制子淋巴细胞活化基因3(LAG3)的抗体及其使用方法。在本发明的多个实施方案中，抗体是与特异性结合LAG3的全人抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体用于抑制或中和LAG3活性，从而提供治疗疾病或病症如癌症或病毒感染的手段。

Description

抗LAG3抗体及其用途
发明领域
本发明涉及特异性结合免疫调节性受体淋巴细胞活化基因-3(LAG3)的抗体和抗体的抗原结合片段，以及使用这些抗体的治疗和诊断方法。
序列表
通过EFS-Web方式同时电子提交了ASCII格式的序列表的正式副本和说明书，序列表文件名为2016_10_07_10176WO01_SEQ_LIST_ST25.txt，创建日期为2016年10月07日，大小约为240千字节。在本ASCII格式文件中包含的序列表是本说明书的一部分并且其全部内容通过引用并入本申请。
背景技术
T细胞共刺激和共抑制分子(统称为共信号分子)在调节T细胞活化、亚群分化、效应功能和存活中发挥关键作用(Chen等，2013,Nature Rev.Immunol.13:227-242)。在T细胞受体识别抗原递呈细胞上的同源肽-MHC复合物之后，信号共传导受体和T细胞受体共定位于免疫突触处，在此处其与TCR信号传导协同以促进或抑制T细胞活化和功能(Flies等，2011,Yale J.Biol.Med.84:409-421)。最终的免疫应答由共刺激和共抑制信号之间的平衡(“免疫检验点”)所调控(Pardoll 2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。淋巴细胞活化基因-3(LAG3)的功能在外周T细胞耐受的介导中是一个这样的“免疫检验点”。
LAG3(也称为CD223)是在活化的CD4和CD8T细胞、γδT细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、浆细胞样树突状细胞和调节性T细胞上表达的503个氨基酸的跨膜蛋白受体。LAG3是免疫球蛋白(Ig)超家族成员。LAG3的主要功能是削弱免疫应答。LAG3与MHC II类分子结合导致向表达LAG3的细胞递送负面信号并下调抗原依赖性的CD4和CD8T细胞应答。LAG3负向调节T细胞的增殖、产生细胞因子和裂解靶细胞的能力，称为T细胞的“耗竭”。据报道，LAG3在增强调节性T(Treg)细胞功能方面发挥作用(Pardoll 2012,NatureReviews Cancer 12:252-264)。
由于LAG3在肿瘤免疫和感染免疫中具有重要作用，因而其是免疫疗法的理想靶点。在癌症和慢性病毒感染的治疗中已对使用包括单克隆抗体在内的拮抗剂对LAG3的阻断进行了研究(Turnis等，2015,Eur.J.Immunol.45:1892-1905)。
针对LAG3的单克隆抗体是本领域公知的并且其已在例如参见美国专利/公开号5976877、6143273、6197524、8551481、20110070238、20110150892、20130095114、20140093511、20140127226、20140286935和WO95/30750、WO97/03695、WO98/58059、WO2004/078928、WO2008/132601、WO2010/01957、WO2014/008218、EP0510079B1、EP0758383B1、EP0843557B1、EP0977856B1、EP1897548B2、EP2142210A1和EP2320940B1中被描述。
当开发一种用于治疗人类的免疫疗法时，需要显示具有诸如低免疫原性、适宜的结合动力学参数、与猴靶点的交叉反应性、适宜的体外活性和/或适宜的体内活性性质的抗体。
发明内容
本发明提供了结合LAG3的抗体及其抗原结合片段。本发明的抗体尤其适用于靶向表达LAG3的免疫细胞，以及用于调节LAG3的活性。在某些实施方式中，本发明的抗体用于抑制或中和LAG3的活性和/或用于刺激T细胞活化(例如，在T细胞介导的杀伤是有益的或所期望的情况下)。在某些实施方式中，抗体用于抑制调节性T细胞的功能和/或逆转耗竭的T细胞的失能状态。可以将本发明的抗-LAG3抗体或其抗原结合部分作为多特异性抗原结合分子所包括的一部分，例如用以调节免疫应答和/或将抗体靶向特定细胞类型(如肿瘤细胞或病毒感染的细胞)。抗体用于治疗疾病或病症，如癌症和病毒感染。
本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或者可以仅包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)2或scFv片段)，且可经修饰以影响功能性，例如，消除残留的效应功能(Reddy等，2000,J.Immunol.164:1925-1933)。在一些实施方式中，抗体可以是双特异性的。
在第一个方面中，本发明提供了与LAG3特异性结合的分离的重组单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗体是全人抗体。
本发明的示例性抗-LAG3抗体列于本申请的表1-3中。表1列出了示例性的抗-LAG3抗体的重链可变区(HCVR)、轻链可变区(LCVR)、重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标识。表2列出了示例性的抗-LAG3抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列标识。表3列出了示例性的抗-LAG3抗体的重链和轻链序列的氨基酸序列标识。
本发明提供了包含HCVR的抗体或其抗原结合片段，所述HCVR含有选自表1中列出的任意HCVR氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似序列的氨基酸序列。
本发明提供了包含LCVR的抗体或其抗原结合片段，所述LCVR含有选自表1中列出的任意LCVR氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似序列的氨基酸序列。
本发明还提供了包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)的抗体或其抗原结合片段，所述HCVR/LCVR包括表1中列出的任意HCVR氨基酸序列与表1中列出的任意LCVR氨基酸序列的配对。根据某些实施方式，本发明提供了包含HCVR和LCVR氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段，所述HCVR和LCVR氨基酸序列对包含在表1中列出的任意示例性抗-LAG3抗体中。在某些实施方式中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386/394、402/410、418/426、434/442、450/522、458/522、466/522、474/522、482/522、490/522、498/530、506/530、514/530、538/546和554/562。在某些实施方式中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自下列之一：SEQ ID NO：386/394(例如，H4sH15479P)、418/426(例如，H4sH15482P)或538/546(例如，H4sH14813N)。在某些实施方式中，本发明提供了抗-LAG3抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR含有与表1中列出的氨基酸序列有不超过5个氨基酸取代的氨基酸序列，以及所述LCVR含有与表1中列出的氨基酸序列有不超过5个氨基酸取代的氨基酸序列。例如，本发明提供了抗-LAG3抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR含有与SEQID NO：418所示的氨基酸序列有不超过5个氨基酸取代的氨基酸序列，以及所述LCVR含有与SEQ ID NO：426所示的氨基酸序列有不超过5个氨基酸取代的氨基酸序列。在另一个示例性实施方式中，本发明提供了抗-LAG3抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR含有与SEQ ID NO：418所示的氨基酸序列具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列，以及所述LCVR含有与SEQ ID NO：426所示的氨基酸序列具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1含有选自表1中列出的任意HCDR1氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2含有选自表1中列出的任意HCDR2氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3含有选自表1中列出的任意HCDR3氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1(LCDR1)，所述LCDR1含有选自表1中列出的任意LCDR1氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR2(LCDR2)，所述LCDR2含有选自表1中列出的任意LCDR2氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR3(LCDR3)，所述LCDR3含有选自表1中列出的任意LCDR3氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，所述HCDR3/LCDR3包括表1中列出的任意HCDR3氨基酸序列与表1中列出的任意LCDR3氨基酸序列的配对。根据某些实施方式，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR3/LCDR3氨基酸序列对，所述HCDR3/LCDR3氨基酸序列对包含在表1中所列的任意示例性抗-LAG3抗体中。在某些实施方式中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO：392/400(例如，H4sH15479P)、424/432(例如，H4sH15482P)和544/552(例如，H4sH14813N)。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR含有HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含有1个氨基酸不同于表1中列出的氨基酸序列的氨基酸序列，HCDR2包含有1个氨基酸不同于表1中列出的氨基酸序列的氨基酸序列，以及HCDR3包含有1个氨基酸不同于表1中列出的氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述LCVR含有LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含有1个氨基酸不同于表1中列出的氨基酸序列的氨基酸序列，LCDR2包含有1个氨基酸不同于表1中列出的氨基酸序列的氨基酸序列，以及LCDR3包含有1个氨基酸不同于表1中列出的氨基酸序列的氨基酸序列。例如，本发明提供了抗-LAG3抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR含有HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：420所示的氨基酸序列或有1个氨基酸不同于SEQ ID NO：420所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：422所示的氨基酸序列或有1个氨基酸不同于SEQ ID NO：422所示的氨基酸序列，以及所述HCDR3包含SEQ ID NO：424所示的氨基酸序列或有1个氨基酸不同于SEQ ID NO：424所示的氨基酸序列。在另一个示例性实施方式中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述LCVR含有LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO：428所示的氨基酸序列或有1个氨基酸不同于SEQ ID NO：428所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：430所示的氨基酸序列或有1个氨基酸不同于SEQ ID NO：430所示的氨基酸序列，以及所述LCDR3包含SEQ ID NO：432所示的氨基酸序列或有1个氨基酸不同于SEQ ID NO：432所示的氨基酸序列。
本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链含有选自表3中列出的任意HC氨基酸序列或者与选自表3中列出的任意HC氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似序列的氨基酸序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链含有选自表3中列出的任意LC氨基酸序列或者与选自表3中列出的任意LC氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似序列的氨基酸序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HC和LC氨基酸序列对(HC/LC)，所述HC/LC包括表3中列出的任意HC氨基酸序列与表3中列出的任意LC氨基酸序列的配对。根据某些实施方式，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含在表3中所列的任意示例性抗-LAG3抗体中含有的HC/LC氨基酸序列对。在某些实施方式中，HC/LC氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO：577/578、579/578和580/581。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含一组6个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，所述一组6个CDR包含在表1中列出的任意示例性抗-LAG3抗体中。在某些实施方式中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组选自下组：SEQ ID NO：388-390-392-396-398-400(例如，H4sH15479P)、420-422-424-428-430-432(例如，H4sH15482P)和540-542-544-548-550-552(例如，H4sH14813N)。
在一个相关的实施方式中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含一组6个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，所述一组6个CDR包含在表1中列出的任意示例性抗-LAG3抗体所定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对中。例如，本发明包括抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组，其包含在选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对中：SEQ ID NO：386/394(例如，H4sH15479P)、418/426(例如，H4sH15482P)和538/546(例如，H4sH14813N)。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列中CDR的方法和技术是本领域熟知的，并且可以用于鉴定本申请公开的具体HCVR和/或LCVR氨基酸序列中的CDR。能够用于标识CDR边界的示例性的方法包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义法。总体来说，Kabat定义是基于序列的变异性、Chothia定义是基于结构环区的位置而AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折中。参见例如，Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；和Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。还可以利用公共数据库鉴定抗体中的CDR序列。还可以利用公共数据库鉴定抗体中的CDR序列。
本发明包括具有经修饰的糖基化模式的抗-LAG3抗体。在一些实施方式中，通过修饰除去不需要的糖基化位点可能是有用的，或者例如使抗体缺乏在寡糖链上存在的岩藻糖部分以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的功能(参见Shield等，(2002)JBC 277:26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以改进补体依赖性细胞毒性(CDC)。
本发明包括包含Fc结构域的抗-LAG3抗体，其中Fc结构域含有如本申请中其他部分所描述的IgG1或IgG4同种型。在某些实施方式中，Fc结构域含有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：569、570、571、572和573。
本发明还提供了抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段与含有HCVR的CDR和LCVR的CDR的抗体或其抗原结合片段竞争与LAG3的特异性结合，其中所述HCVR和LCVR均具有选自表1中列出的HCVR和LCVR序列的氨基酸序列。
本发明还提供了分离的抗体及其抗原结合片段，所述分离的抗体及其抗原结合片段阻断LAG3结合至MHC II类。在一些实施方式中，阻断LAG3结合的抗体或其抗原结合片段可以结合至LAG3上与MHC II类结合的表位相同的表位或者可以结合至LAG3上与MHC II类结合的表位不同的表位。
本发明还提供了与人或其他物种的LAG3特异性结合的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗体可以结合至人LAG3和/或猴LAG3。
本发明还提供了与参照抗体或其抗原结合片段交叉竞争结合至LAG3的抗体及其抗原结合片段，所述参照抗体或其抗原结合片段包含HCVR的CDR和LCVR的CDR，其中所述HCVR和LCVR均具有选自表1中列出的HCVR和LCVR序列的氨基酸序列。
本发明还提供了与参照抗体或其抗原结合片段结合至相同表位的抗体及其抗原结合片段，所述参照抗体或其抗原结合片段包含HCVR的CDR和LCVR的CDR，其中HCVR和LCVR均具有选自表1中列出的HCVR和LCVR序列的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明提供了与参照抗体或其抗原结合片段结合至相同表位的抗体及其抗原结合片段，所述参照抗体或其抗原结合片段包含HCVR的CDR和LCVR的CDR，其中HCVR/LCVR含有SEQ ID NO：418/426所示氨基酸序列对。
本发明还包括抗-LAG3抗体，所述抗-LAG3抗体与人LAG3胞外域(SEQ ID NO：588)中含有的一个或多个氨基酸相互作用。在某些实施方式中，本发明提供了抗-LAG3抗体及其抗原结合片段，所述抗-LAG3抗体及其抗原结合片段与选自下组的氨基酸序列相互作用：(a)SEQ ID NO：588的氨基酸28至69；(b)SEQ ID NO：588的氨基酸28至71；(c)SEQ ID NO：588的氨基酸31至52；和(d)SEQ ID NO：588的氨基酸32至69。在某些实施方式中，本发明提供了抗-LAG3抗体及其抗原结合片段，所述抗-LAG3抗体及其抗原结合片段与SEQ ID NO：589中所含的一个或多个氨基酸相互作用，例如本发明提供了抗-LAG3抗体及其抗原结合片段，所述抗-LAG3抗体及其抗原结合片段与SEQ ID NO：589中所含的至少5个氨基酸、至少10个氨基酸或至少20个氨基酸相互作用。在某些实施方式中，本发明提供了抗-LAG3抗体及其抗原结合片段，所述抗-LAG3抗体及其抗原结合片段与SEQ ID NO：589所示的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO：588的氨基酸28至71)相互作用。
在一个实施方式中，本发明提供了一种重组人单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重组人单克隆抗体或其抗原结合片段具有一个或多个下述特征：(a)与人LAG3和/或猕猴LAG3特异性结合；(b)阻断LAG3与MHC II类结合；(c)阻断LAG3诱导的T细胞下调并挽救T细胞信号传导；以及(d)在患有癌症的对象中抑制肿瘤生长和增加存活。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以以激动剂的方式特异性结合至LAG3，即，其可以增强或刺激LAG3的结合和/或活性；在其他实施方式中，抗体可以以拮抗剂的方式特异性结合至LAG3，即其可以阻断LAG3结合至其配体。
在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段是双特异性的，其包含对LAG3的第一结合特异性和针对第二目标表位的第二结合特异性。第二目标表位可以是在LAG3上或在一个不同蛋白上的另一个表位。在某些实施方式中，第二目标表位可以在一个不同细胞(包括不同的T细胞、B细胞、肿瘤细胞或病毒感染细胞)上。
在第二个方面中，本发明提供了核酸分子，所述核酸分子编码抗-LAG3抗体或其部分。例如，本发明提供了编码表1中列出的任意HCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCVR核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子编码表1中列出的任意LCVR氨基酸序列；在某些实施方式中，核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCVR核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子编码表1中列出的任意HCDR1氨基酸序列；在某些实施方式中，核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCDR1核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子编码表1中列出的任意HCDR2氨基酸序列；在某些实施方式中，核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCDR2核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子编码表1中列出的任意HCDR3氨基酸序列；在某些实施方式中，核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCDR3核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子编码表1中列出的任意LCDR1氨基酸序列；在某些实施方式中，核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCDR1核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子编码表1中列出的任意LCDR2氨基酸序列；在某些实施方式中，核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCDR2核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子编码表1中列出的任意LCDR3氨基酸序列；在某些实施方式中，核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCDR3核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码HCVR的核酸分子，其中HCVR包含一组3个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组如表1中列出的任意示例性抗-LAG3抗体所定义的。
本发明还提供了编码LCVR的核酸分子，其中LCVR包含一组3个CDR(即，LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组如表1中列出的任意示例性抗-LAG3抗体所定义的。
本发明还提供了编码HCVR和LCVR两者的核酸分子，其中HCVR包含表1中列出的任意HCVR氨基酸序列的氨基酸序列，以及其中LCVR包含表1中列出的任意LCVR氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方式中，核酸分子包含选自表2中列出的任意HCVR核酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似序列的多核苷酸序列，以及选自表2中列出的任意LCVR核酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似序列的多核苷酸序列。在根据本发明这个方面的某些实施方式中，核酸分子编码HCVR和LCVR，其中HCVR和LCVR均来自表1中列出的相同抗-LAG3抗体。
本发明提供了编码表3中列出的任意重链氨基酸序列的核酸分子。本发明还提供了编码表3中列出的任意轻链氨基酸序列的核酸分子。
本发明还提供了编码重链(HC)和轻链(LC)两者的核酸分子，其中HC包含表3中列出的任意HC氨基酸序列的氨基酸序列，以及其中LC包含表3中列出的任意LC氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个相关的方面中，本发明提供了能够表达多肽的重组表达载体，所述多肽包含抗-LAG3抗体的重链或轻链可变区。例如，本发明包括包含上文所述的任意核酸分子的重组表达载体，即编码表1中所示的任意HCVR、LCVR和/或CDR序列的核酸分子。本发明还提供了能够表达多肽的重组表达载体，所述多肽包含抗-LAG3抗体的重链或轻链。例如，本发明包括包含上文所述的任意核酸分子的重组表达载体，即编码表3中所示的任意重链或轻链序列的核酸分子。在本发明的范围内还包括其中引入了此类载体的宿主细胞，以及通过在允许生产抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞生产抗体或其部分并回收所生产的抗体和抗体片段的方法。
在第三个方面中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含与LAG3特异性结合的重组人源抗体或其片段和药学上可接受的运载体。在一个相关的方面中，本发明涉及一种组合物，所述组合物是抗-LAG3抗体与第二治疗剂的组合。在一个实施方式中，第二治疗剂是与抗-LAG3抗体组合有益的任意药剂。与抗-LAG3抗体组合有益的示例性药剂包括但不限于结合和/或调节LAG3信号传导的其他药剂(包括其他抗体或其抗原结合片段等)和/或不直接结合LAG3但仍调节免疫细胞活化的药剂。在本申请的其他部分公开了涉及本发明抗-LAG3抗体的其他联合疗法和共制剂。
在第四个方面中，本发明提供了在对象中调节免疫应答的方法，所述方法包括向需要其的对象施用治疗有效量的本发明的抗-LAG3抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明提供了在对象中增强免疫应答的方法，所述方法包括给予对象有效量的与LAG3结合的本发明的抗体或其片段。在一个实施方式中，本发明提供了在对象中刺激或增强T细胞活化的方法。在某些实施方式中，本发明提供了拯救T细胞活性的方法，所述方法包括将T细胞与有效量的本发明抗体接触，从而拯救T细胞活性。在一个实施方式中，本发明提供了在对象中抑制T调节性(Treg)细胞的方法，所述方法包括向需要其的对象施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，需要其的对象可能患有诸如癌症或病毒感染的疾病或病症。在某些实施方式中，本发明提供了拯救LAG3介导的T细胞活性抑制的方法，所述方法包括将T细胞与有效量的本发明抗体接触。
在第五个方面中，本发明提供了使用本发明的抗-LAG3抗体或抗体的抗原结合部分在对象中治疗诸如癌症或病毒感染的疾病或病症的治疗性方法，其中所述治疗性方法包括向需要其的对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体或抗体的片段。所治疗的病症是通过刺激或抑制LAG3活性或信号传导被改善、减轻、抑制或预防的任意疾病或病况。在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂联合向需要其的对象施用。第二治疗剂可以选自下组：针对另一种T细胞共抑制子的抗体、肿瘤细胞抗原的抗体、T细胞受体的抗体、针对病毒感染细胞上的表位的抗体、细胞毒剂、抗癌药、抗病毒药、抗炎药(例如，皮质类固醇)、化疗剂、放疗、免疫抑制剂以及本领域公知的任意其他药物或疗法。在某些实施方式中，第二治疗剂可以是帮助抵消或减少与本发明的抗体或其抗原结合片段有关的任何可能的副作用(如果这种副作用会发生的话)的药剂。
在某些实施方式中，本发明提供了用于抑制肿瘤生长的方法。例如，本发明提供了在对象中抑制由原发肿瘤或转移性肿瘤导致的肿瘤生长。在某些实施方式中，本发明提供了增强患有癌症的对象的存活(例如，无进展存活或总体存活)的方法。癌症的实例包括但不限于原发性和/或复发性癌症，包括血癌(例如，血液系统恶性肿瘤，如淋巴瘤、骨髓瘤或白血病)、脑癌(例如，多形性胶质母细胞瘤)、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾细胞癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、骨癌、结直肠癌、前列腺癌和结肠癌。在某些实施方式中，本发明提供了用于抑制或阻抑成型的肿瘤生长的方法。所述方法包括向需要其的对象施用药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明抗-LAG3抗体。在某些实施方式中，抗体与选自下组的第二治疗剂联合施用：程序性死亡分子-1(PD-1)抑制剂(例如，抗-PD-1抗体，如纳武单抗或REGN2810)、程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂(例如抗-PD-L1抗体)、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂(例如，阿柏西普、贝伐单抗)、血管生成素-2(Ang2)抑制剂(例如，抗-Ang2抗体，如nesvacumab)、细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抑制剂(例如，伊匹单抗)、CD20xCD3双特异性抗体、细胞毒素、化疗剂和放疗。在本申请的其他部分描述了可以用于与本发明的抗-LAG3抗体联用治疗癌症的其他疗法/治疗剂的其他实例。
抗体或其片段可通过皮下、静脉内、皮内、腹膜内、口服、肌内或颅内施用。抗体或其片段可以以约0.1mg/kg至约100mg/kg对象体重的剂量施用。
本发明还包括本发明的抗-LAG3抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗将从阻断LAG3结合和/或信号传导获益的疾病或病症(如癌症)的药物中的用途。
其他实施方式基于随后的发明详述将变得显而易见。
附图简要说明
图1是在实施例8中描述的基于萤光素酶的LAG3生物测定的示意图。图(A)：“双特异性”模式：非活性Jurkat来源的T细胞经由CD3xCD20双特异性抗体被T-细胞受体(TCR)簇活化。图(B)：“肽”模式：在该模式中，非活性Jurkat来源T细胞被特异性MHC/肽复合物(具有MHC II蛋白HLA-DR2AB的Ob2F3TCR异二聚体与MBP85-99肽复合)活化。LAG3与DR2结合减弱了在活化的Jurkat来源T细胞中的应答。阻断LAG3抗体拯救了在活化的Jurkat来源T细胞中的应答。
图2A-2B总结了抗-小鼠LAG3抗体单用和与抗-小鼠PD-1抗体联用针对成型的结肠26肿瘤的体内效能结果(在实施例10中描述)。图2A.在肿瘤植入后的多个时间点测量的各治疗组中的平均肿瘤体积(mm3±SEM)。在第14天平均肿瘤体积达到50mm3时，开始治疗。治疗日用箭头表示。所有抗体以10mg/kg腹腔(i.p.)给药。图2B.在植入后第35天测量各治疗组中的各肿瘤体积。通过单因素ANOVA结合Dunnett多重比较后检验确定统计学显著性(*p<0.05)。图2A-2B.治疗组：同种型对照大鼠IgG2a+小鼠IgG1对照抗体：(●)；抗-小鼠PD-1抗体+小鼠IgG1对照(▲)；抗-小鼠LAG3抗体+大鼠IgG2a对照(■)；抗-小鼠PD-1抗体+抗-小鼠LAG3抗体(▼)。
图3A-3B总结了抗-小鼠LAG3抗体单用和与抗-小鼠PD-1抗体联用针对成型的MC38肿瘤的体内效能结果(在实施例11中描述)。图3A.在肿瘤植入后的多个时间点测量的各治疗组中的平均肿瘤体积(mm3±SEM)。在第8天平均肿瘤体积达到45mm3时，开始治疗。治疗日用箭头表示。图3B.在植入后第23天测量各治疗组中的各肿瘤体积。通过单因素ANOVA结合Dunnett多重比较后检验确定统计学显著性(****p<0.0001)。图3A-3B.治疗组：同种型对照大鼠IgG2a+小鼠IgG1(●)，抗-小鼠PD-1抗体+mIgG1对照(▲)，抗-小鼠LAG3抗体+大鼠IgG2a对照(■)，和抗-小鼠PD-1+抗-小鼠LAG3抗体(▼)。
图4A-4B显示了在实验结束时从荷瘤小鼠中收集的引流淋巴结(DLN)(A)和脾脏(B)中通过Taqman分析检测的鼠IFNγ和CD8b基因(经鼠亲环蛋白B的表达归一化)的表达水平(实施例11中描述)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图5A-5B总结了抗-人LAG3抗体(“mAb1”)和抗-人PD-1抗体(REGN2810)对MC38肿瘤的体内效能(在实施例12中描述)。图5A.在肿瘤植入后的多个时间点测量的各治疗组中的平均肿瘤体积(mm3±SEM)。治疗日用箭头表示。图5B.对各治疗组中的各肿瘤体积监测24天。显示了在第24天时各组中的无瘤小鼠数。图5A-5B.治疗组：25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)(■)；10mg/kg的REGN2810(抗-hPD-1)(▲)，和25mg/kg的人同种型对照抗体(●)。
图6A-6C总结了抗-人LAG3抗体(“mAb1”)单用和与抗-人PD-1抗体(REGN2810)联用对MC38肿瘤的体内效能(在实施例13中描述)。图6A.在肿瘤植入后的多个时间点测量的各治疗组中的平均肿瘤体积(mm3±SEM)。治疗日用箭头表示。图6B.在植入后第22天测量的各治疗组中的各肿瘤体积。通过单因素ANOVA结合Tukey多重比较后检验确定统计学显著性(*p<0.05；**p<0.01)。图6A-6B.治疗组：25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)(◆)；10mg/kg的REGN2810(抗-hPD-1)(■)；25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)与10mg/kg的REGN2810(抗-hPD-1)联用(▲)；25mg/kg的人同种型对照(●)。图6C.治疗小鼠的无瘤存活百分率。通过对数-秩(Mantel-Cox)检验确定统计学显著性(****p<0.0001)。治疗组：25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)(◆)；10mg/kg的REGN2810(抗-hPD-1)(▼)；25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)与10mg/kg的REGN2810(抗-hPD-1)联用(▲)；25mg/kg的人同种型对照(●)。
图7A-7C总结了在第一项实验中抗-人LAG3抗体(“mAb1”)单用和与抗-人PD-1抗体(REGN2810)联用对MC38肿瘤的体内效能(在实施例14中描述)。图7A.在肿瘤植入后的多个时间点测量的各治疗组中的平均肿瘤体积(mm3±SEM)。治疗日用箭头表示。图7B.在植入后第22天测量的各治疗组中的各肿瘤体积。通过单因素ANOVA结合Tukey多重比较后检验确定统计学显著性(*p<0.05)。图7C.治疗小鼠的无瘤存活百分率。通过对数-秩(Mantel-Cox)检验确定的统计学显著性(*p<0.0197)。治疗组：25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)(◆)；10mg/kg的REGN2810(抗-hPD-1)1mg/kg的REGN2810(抗-hPD-1)(▲)；25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)与10mg/kg的REGN2810(抗-hPD-1)联用(■)；25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)与1mg/kg的REGN2810(抗-hPD-1)联用(▼)；和25mg/kg的人同种型对照(●)。
图8A-8C总结了在第二项实验中抗-人LAG3抗体(“mAb1”)单用和与抗-人PD-1抗体(REGN2810)联用对MC38肿瘤的体内效能(在实施例14中描述)。图8A.在肿瘤植入后的多个时间点测量的各治疗组中的平均肿瘤体积(mm3±SEM)。治疗日用箭头表示。通过双因素ANOVA结合Dunnett多重比较检验确定统计学显著性(*p<0.05)。图8B.在植入后第23天测量的各治疗组中的各肿瘤体积。通过单因素ANOVA结合Dunnett多重比较检验确定统计学显著性(**p<0.01)。图8C.治疗小鼠的无瘤存活百分率。通过对数-秩(Mantel-Cox)检验结合用于多种比较的Bonferroni校正确定统计学显著性(***p<0.001，**p<0.01)。治疗组：25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)(◆)；5mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)10mg/kg的REGN2810(抗-hPD-1)(▲)；25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)与10mg/kg的REGN2810(抗-hPD-1)联用(■)；5mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)与10mg/kg的REGN2810(抗-hPD-1)联用(▼)；和25mg/kg的人同种型对照(●)。
图9显示了在实验中的多个肿瘤植入后时间点在各治疗组中的平均肿瘤体积(mm3±SEM)，以评估抗-人LAG3抗体(“mAb1”)单用和其与抗-人PD-1抗体(REGN2810)联用对成型的MC38肿瘤的效能(在本申请的实施例15中描述)。治疗日用箭头表示。
图10显示了在实施例15中所述的实验中在植入后第22天测量的在各治疗组中的各肿瘤体积。通过单因素ANOVA结合Dunnett多重比较检验确定统计学显著性。
图11显示了在本申请实施例15中所述的实验中治疗小鼠的无瘤存活百分率。通过对数-秩(Mantel-Cox)检验结合用于多种比较的Bonferroni校正确定统计学显著性(**p<0.01)。
图12显示了在雌性猕猴中mAb1单次静脉输注后血清中的平均(+SD)功能性mAb1浓度对时间曲线(在实施例16中描述)。
具体实施方式
在对本发明的方法进行描述以前，应理解本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件是可以改变的。还应理解本申请中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并非旨在限定，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求限定。
除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语均与本发明所属技术领域普通技术人员的通常理解具有相同含义。尽管与本申请中描述的那些类似或等效的任意方法和材料均可以用于实践或测试本发明，但是现在将描述优选的方法和材料。在本说明书中提及的所有出版物均通过引用整体并入本申请。
术语“LAG3”指淋巴细胞活化基因-3蛋白，一种免疫检验点受体或T细胞共抑制子，也称为CD223。全长LAG3的氨基酸序列在GenBank中以登录号NP_002277.4提供，并且在本申请中也称为SEQ ID NO：582。术语“LAG3”还包括具有SEQ ID NO：574、575或576的氨基酸序列的LAG3蛋白变体。术语“LAG3”包括重组LAG3或其片段。术语还包括与例如组氨酸标签、小鼠或人Fc或信号序列(如ROR1)偶联的LAG3或其片段。例如，术语包括SEQ ID NO：575所示的序列，其包含全长LAG3的氨基酸残基29-450偶联的在C-末端小鼠Fc(mIgG2a)。如SEQ IDNO：574所示例的蛋白变体包含与全长LAG3的氨基酸残基29-450偶联的在C-末端的组氨酸标签。除非明确指出来自非人物种，否则术语“LAG3”指人LAG3。
LAG3是免疫球蛋白(Ig)超家族成员。LAG3是具有四个胞外Ig样结构域D1至D4的503个氨基酸的1型跨膜蛋白，其在活化的T细胞、自然杀伤细胞、B细胞、浆细胞样树突状细胞和调节性T细胞上表达。LAG3受体与抗原提呈细胞(APC)上的MHC II类分子结合。
本申请中使用的术语“T细胞共抑制子”指通过T细胞的活化或抑制调节免疫应答的配体和/或受体。术语“T细胞共抑制子”也称为T细胞共信号传导分子，包括但不限于程序性死亡分子-1(PD-1)、细胞毒性T-淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、CD-28、2B4、LY108、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白3(TIM3)、具有免疫球蛋白和ITIM的T细胞免疫受体(TIGIT；也称为VSIG9)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1；也称为CD305)、诱导性T细胞共刺激剂(ICOS；也称为CD278)、T细胞活化的V-结构域Ig抑制剂(VISTA)和CD160。
本申请中使用的术语“抗体”旨在指由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子(其中两条重链(H)和两条轻链(L)通过二硫键相互连接(即“完整的抗体分子”))，以及其多聚体(例如，IgM)或其抗原结合片段。每条重链由重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(由结构域CH1、CH2和CH3组成)组成。每条轻链由轻链可变区(“LCVR或“VL”)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间插有更保守的区称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以下列顺序从氨基末端至羟基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的某些实施方式中，抗体(或其抗原结合片段)的FR可与人种系序列相同或可经天然或人工修饰。氨基酸共有序列可基于两个或多个CDR并排分析定义。
一个或多个CDR残基的取代或一个或多个CDR的省略也是可能的。抗体已在科学文献中进行描述，其中一个或多个CDR可免除用于结合。Padlan等(1995FASEB J.9:133-139)基于公开的晶体结构分析了抗体和其抗原的接触区，并得出结论仅约1/5-1/3的CDR残基实际上接触抗原。Padlan还发现许多抗体其中的一个或两个CDR没有氨基酸接触抗原(亦参见，Vajdos等，2002J Mol Biol 320:415-428)。
不接触抗原的CDR残基可基于之前的研究(例如CDRH2中的残基H60-H65经常是不需要的)从位于Chothia CDR外的Kabat CDR的区通过分子建模和/或经验鉴定。如果CDR或其残基省略，其通常由在另一人抗体序列或该序列的共有序列中占据相应位置的氨基酸取代。在CDR内可取代的位置和待取代的氨基酸也可凭经验选择。经验取代可以是保守或非保守取代。
本申请公开的全长的人抗-LAG3单克隆抗体相比对应的种系序列可在重链和轻链可变结构域的框架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。这种突变可通过将本申请公开的氨基酸序列与从例如公开的抗体序列数据库获得的种系序列进行比较而容易地确定。本发明包括抗体及其抗原结合片段，其源自本申请公开的任何氨基酸序列，其中在一个或多个框架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为抗体所来源的种系序列的相应残基，或突变为另一人种系序列的相应残基，或突变为相应种系残基的保守氨基酸取代(这种序列的变化在本申请中统称为“种系突变”)。本领域的普通技术人员以本申请公开的重链和轻链可变区起始，可容易地生成众多抗体和抗原结合片段，其包含一个或多个单独的种系突变或其组合。在某些实施方式中，在VH和/或VL结构域内的全部框架和/或CDR残基回复突变为在抗体所来源的最初种系序列中发现的残基。在其他实施方式中，仅一些残基回复突变为最初的种系序列，例如仅在FR1的最初8个氨基酸内或FR4的最后8个氨基酸内发现的突变的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变的残基。在其他实施方式中，一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列的相应残基(即不同于抗体最初来源的种系序列的种系序列)。此外，本发明的抗体可包含在框架区和/或CDR区内的两个或多个种系突变的任何组合，例如其中一些单独的残基突变为特定种系序列的相应残基而一些不同于最初种系序列的其他残基保留或突变为不同种系序列的相应残基。一旦获得，可容易地对包含一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特征进行测试，如改善的结合特异性、增加的结合亲和性、改善或增强的拮抗或激动生物性质(视情况可定)、降低的免疫原性等。以该一般方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明内。
本发明还包括全长的人抗-LAG3单克隆抗体，所述单克隆抗体包含本申请公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的具有一个或多个保守取代的变体。例如，本发明包括抗-LAG3抗体，所述抗体具有的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列相对本申请公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或以下、8个或以下、6个或以下、4个或以下等的保守性氨基酸取代。
本申请中使用的术语“人抗体”指在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人mAb可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中且特别是在CDR3中。然而，如在本申请中使用的，术语“人抗体”并非旨在包括其中CDR序列源自另一哺乳动物物种(例如，小鼠)的种系并已植入人FR序列上的mAb。术语包括在非人哺乳动物或在非人哺乳动物细胞中重组产生的抗体。术语并非旨在包括分离自人对象或在其中产生的抗体。
本申请中使用的术语“重组”指本发明的抗体或其抗原结合片段，其通过本领域公知的技术或方法生成、表达、分离或获得，如重组DNA技术(其包括例如DNA剪接和转基因表达)。术语指在非人哺乳动物(包括转基因非人哺乳动物，例如转基因小鼠)或细胞(例如，CHO细胞)表达系统中表达或分离自重组组合性人抗体文库的抗体。
本申请中使用的术语“多特异性抗原结合分子”指双特异性、三特异性或多特异性抗原结合分子及其抗原结合片段。多特异性抗原结合分子可以对一个靶多肽上的不同表位具有特异性或者可以含有对一个以上靶多肽的抗原具有特异性的抗原结合结构域。多特异性抗原结合分子可以是单一的多功能性多肽，或者其可以是彼此之间共价或非共价结合的两个或多个多肽的多聚体复合物。术语“多特异性抗原结合分子”包括可以连接至或与另一个功能性分子(例如，另一个肽或蛋白)共表达的本发明的抗体。例如，抗体或其片段可以功能性地(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)连接至一个或多个其他分子实体(如蛋白或其片段)以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗原结合分子。根据本发明，术语“多特异性抗原结合分子”还包括双特异性、三特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明的抗体功能性连接至另一个抗体或其抗原结合片段以产生具有第二结合特异性的双特异性抗体。本申请的其他部分描述了本发明的双特异性和多特异性抗体。
术语“特异性结合”或“特异性地与…结合”等指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可通过至少约1x10-8M或更小的平衡解离常数表征(例如，更小的KD表示更紧密的结合)。用于确定两分子是否特异性结合的方法为本领域熟知的且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。如在本申请中所述的，抗体已通过表面等离子体共振鉴定，例如BIACORETM，其特异性地与LAG3结合。此外，结合LAG3中的一个结构域和一种或多种其他抗原的多特异性抗体或结合LAG3的两个不同区的双特异性抗体也认为是如本申请所使用的“特异性结合”的抗体。
术语“高亲和性”抗体指具有与LAG3的结合亲和性的那些mAb，以通过表面等离子体共振例如BIACORETM或溶液亲和性ELISA所测量的至少10-8M，优选10-9M；更优选10-10M，进一步优选10-11M，更优选10-12M的KD表示。
术语“低解离率”、“Koff”或“kd”意为从LAG3解离的抗体，具有通过表面等离子体共振例如BIACORETM所确定的1x10-3s-1或更小，优选1x10-4s-1或更小的速率常数。
本申请中使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括任何天然存在的、酶促可获得的、合成的或基因工程改造的特异性结合抗原以形成复合物的多肽或糖蛋白。本申请中使用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”指抗体保持与LAG3结合的能力的一个或多个片段。
在特定的实施方式中，本发明的抗体或抗体片段可以与诸如配体或治疗性部分的部分缀合(“免疫缀合物”)，治疗性部分如细胞毒素、第二抗-LAG3抗体、肿瘤特异性抗原的抗体、抗癌药或用于治疗包括癌症或病毒感染(包括慢性病毒感染)在内的疾病或病况的任意其他治疗性部分。
本申请中使用的“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体(Ab)的抗体(例如，特异性结合LAG3的分离的抗体或其片段，基本上不含特异性结合除LAG3外的抗原的Ab)。
本申请中使用的“阻断抗体”或“中和抗体”(或“中和LAG3活性的抗体”或“拮抗抗体”)旨在指其与LAG3的结合导致LAG3的至少一种生物活性抑制的抗体。例如，本发明的抗体可防止或阻断LAG3与MHC II类的结合。
本申请中使用的术语“活化抗体”或“增强抗体”(或“激动抗体”)旨在指其与LAG3的结合导致LAG3的至少一种生物活性增加或刺激的抗体。例如，本发明的抗体可增加LAG3与MHC II类的结合。
本申请中使用的术语“表面等离子体共振”指通过检测生物传感器基质内蛋白浓度的改变能够对实时生物分子相互作用进行分析的光学现象，例如使用BIACORETM系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)。
本申请中使用的术语“KD”旨在指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“表位”指与已知为互补位的抗体分子的可变区中特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定区。单一抗原可具有多于一个的表位。因此，不同的抗体可结合抗原上的不同区域且可具有不同的生物效应。术语“表位”还指在抗原上的B和/或T细胞对其产生应答的位点。其还指由抗体所结合的抗原的区。可结构性或功能性定义表位。功能性表位一般是结构表位的子集且具有直接有助于相互作用亲和性的那些残基。表位还可以是构象性的，即，由非线形氨基酸构成。在一些实施方式中，表位可包括下述分子(如氨基酸、糖侧链、磷酸基或磺酰基)的有化学活性的表面基团形成的决定区，且在某些实施方式中，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
本申请中使用的术语“交叉竞争”意为与抗原结合并抑制或阻断抗原与另一抗体或其抗原结合片段结合的抗体或其抗原结合片段。术语还包括两种抗体间双向竞争，即第一抗体结合并阻断第二抗体结合的第一抗体，反之亦然。在某些实施方式中，第一抗体和第二抗体可与相同的表位结合。可替换地，第一和第二抗体可与不同但重叠的表位结合，从而一者的结合抑制或阻断第二抗体的结合，例如经由空间位阻。抗体间的交叉竞争可通过本领域公知的方法测量，例如，通过实时、无标记生物层干涉测定。两抗体间的交叉竞争可表示为第二抗体的结合(其中第一和第二抗体是相同的抗体)少于由于自身-自身结合所致的背景信号。两种抗体间的交叉竞争可表示为例如第二抗体的结合(其中第一和第二抗体是相同的抗体)少于基线自身-自身背景结合的％。
当述及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本上相同”指当与另一核酸(或其互补链)以适当的核苷酸插入或缺失而最佳比对时，存在至少约90％，且更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基的核苷酸序列同一性，如通过任何熟知的序列同一性算法所测量的，如下文所讨论的。与参照核酸具有较大同一性的核酸分子在一些实例中可编码具有与由参照核酸分子编码的多肽相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。
可以使用算法计算序列同一性，例如用于全局比对的Needleman Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，或用于局部比对的Smith Waterman算法(Smith和Waterman 1981,J.Mol.Biol.147:195-197)。另一种优选的算法是Dufresne等在2002年的Nature Biotechnology(vol.20,pp.1269-71)中描述的并且用于GenePAST软件中(GQ Life Sciences,Inc.Boston,MA)。
当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本上相似”意为当最佳比对时，如通过程序GAP或BESTFIT使用缺省缺口权重，两种肽序列分享至少90％的序列同一性，甚至更优选地至少95％、98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置通过保守氨基酸取代区分。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基通过另一具有拥有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基)的氨基酸残基取代的一种。一般而言，保守的氨基酸取代将基本上不改变蛋白的功能性性质。在其中两个或多个氨基酸序列彼此通过保守取代不同的情况中，可向上调整相似性的百分比或程度以对于取代的保守性质进行校正。进行该调整的方式是本领域技术人员熟知的。参见例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，其通过引用并入本申请。具有拥有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代基为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是在Gonnet等(1992)Science 256:1443 45所公开的PAM250对数-似然性矩阵中具有正值的任意改变，其通过引用并入本申请。“适度的保守性”取代是在PAM250对数似然性矩阵中具有非负值的任意改变。
多肽的序列相似性通常使用序列分析软件测定。使用与相似序列匹配的蛋白分析软件测定针对不同取代、缺失和其他修饰包括保守性氨基酸取代的相似性。例如，含有程序如GAP和BESTFIT的GCG软件可以使用缺省参数用于确定密切相关的多肽(如不同物种生物体或者野生型蛋白与其突变蛋白之间的同源性多肽)之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，GCG 6.1版。也可以使用采用缺省或推荐参数的在GCG 6.1版中的程序FASTA对多肽序列进行比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了查询和检索序列之间最佳重叠区域的比对和序列一致性百分率(Pearson(2000)，如上所述)。当将本发明的序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一种优选的算法是计算机程序BLAST，特别是使用缺省参数的BLASTP或TBLASTN。参见例如，Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402，其均通过引用并入本申请。
短语“治疗有效量”意为将其施用以产生所需效果的量。精确的量将取决于治疗目的，且将由本领域技术人员使用公知的技术确定(参见例如，Lloyd(1999)The Art,Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding)。
本申请中使用的术语“对象”指需要减轻、预防和/或治疗疾病或病症(如病毒感染或癌症)的动物，优选哺乳动物。该术语包括具有癌症、转移性癌症或病毒感染或处于其风险中的人对象。
本申请中使用的“抗癌药”意为用于治疗或减轻或抑制癌症的任何药剂，包括但不限于细胞毒素和诸如抗代谢物、烷化剂、蒽环类、抗生素、抗有丝分裂剂、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类固醇、环磷酰胺、美托烷(O,P′-(DDD))、生物制品(例如，抗体和干扰素)和放射性药剂的药剂。如在本申请中所所使用的，“细胞毒素或胞毒性试剂”还指化疗试剂和任何对细胞有害的试剂。示例性的此类试剂包括(紫杉醇)、替莫唑胺、细胞松弛素B、短杆菌肽D，溴化乙锭、依米丁、顺铂、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌，光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。
本申请中使用的术语“抗病毒药”指用于治疗、预防或减轻在宿主对象中的病毒感染的任何药物或疗法。术语“抗病毒药”包括但不限于齐多夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、利巴韦林、洛匹那韦、依法韦仑、科比司他、替诺福韦、利匹韦林、镇痛药和皮质类固醇。在本发明的背景下，病毒感染包括由下述病毒引起的长期或慢性感染，包括但不限于：人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
本申请中使用的术语“以增强免疫应答”指增加免疫细胞(如T细胞或NK细胞)对肿瘤细胞或病毒感染细胞的活性。在本发明的背景下，该术语包括阻断LAG3介导的T细胞活性抑制，或者挽救或逆转T细胞的耗竭状态。还包括抑制调节性T细胞的活性。如在本发明背景下所使用的，增强的免疫应答导致肿瘤细胞杀伤和/或肿瘤生长抑制增加。
本发明的抗体和抗原结合片段与LAG3特异性结合并增强T细胞活化。抗-LAG3抗体可以以高亲和性或以低亲和性结合至LAG3。在某些实施方式中，本发明的抗体可以阻断抗体，其中所述抗体可以结合至LAG3并抑制LAG3的信号传导。在一些实施方式中，本发明的抗体阻断LAG3结合至MHC II类和/或刺激或增强T细胞活化。在一些实施方式中，抗体结合至LAG3并逆转耗竭T细胞的失能状态。在某些实施方式中，抗体结合至LAG3并抑制调节性T细胞的活性。在一些实施方式中，可以将抗体用于刺激或增强免疫应答和/或用于治疗患有癌症或病毒感染的对象。当向需要其的对象施用时，抗体可以减少病毒(如HIV、LCMV或HBV)在对象中的慢性感染。可以将其用于抑制对象中的肿瘤细胞生长。可以将其单用或作为本领域公知的用于治疗癌症或病毒感染的其他治疗性部分或模式的辅助疗法。
在某些实施方式中，抗-LAG3抗体可以是多特异性抗原结合分子，其中包括针对LAG3的第一结合特异性和针对选自另一种T细胞共抑制子和LAG3的不同表位的第二结合特异性。
可以将包含下述中的任意一个的免疫原用于产生LAG3的抗体。在某些实施方式中，本发明的抗体来自使用全长的天然LAG3(参见NCBI登记号NP_002277.4)(SEQ ID NO：582)或使用重组LAG3肽免疫的小鼠。或者，可以使用标准生化技术制备和修饰LAG3或其片段(SEQ ID NO：574-576)并将其作为免疫原。
在某些实施方式中，免疫原是LAG3的一个或多个胞外域。在本发明的一个实施方式中，免疫原是LAG3的片段，其范围大致为SEQ ID NO：582的氨基酸残基29-450。
在一些实施方式中，免疫原可以是在大肠杆菌或在任意其他原核或哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的重组LAG3肽。
在某些实施方式中，可以使用上文所述区域的片段，或者在本申请所述区域的N末端或C末端或者两端超出所示区域约5至约20个氨基酸残基的肽制备与LAG3特异性结合的抗体。在某些实施方式中，可以将上文所述区域或其片段的任意组合用于制备LAG3特异性抗体。
可以对肽进行修饰以包括某些残基的添加或取代，用于标记或与载体分子(如KLH)缀合的目的。例如，可以在肽的N末端或C末端加入半胱氨酸，或者加入接头序列以制备用于与例如KLH缀合以供免疫之用的肽。
根据体外或体内测定确定，本发明的某些抗-LAG3抗体能够结合至并中和LAG3的活性。可以使用本领域技术人员公知的任意标准方法(包括如本申请所述的结合测定，或活性测定)测定本发明抗体结合至并中和LAG3活性的能力。
在本申请的实施例中说明了用于测量结合活性的非限制性、示例性体外测定。在实施例3中，通过表面等离子体共振确定了人抗-LAG3抗体对人LAG3的结合亲和性和动力学常数，并且在Biacore 4000或T200设备上进行了测量。在实施例4中，使用阻断测定确定抗-LAG3抗体之间的交叉竞争。实施例5和6描述了抗体与过表达LAG3细胞的结合。在实施例7中，使用结合测定确定抗-LAG3抗体在体外阻断LAG3的MHC II类结合能力的能力。在实施例8中，使用荧光素酶测定确定抗-LAG3抗体拮抗在T细胞中的LAG3信号传导的能力。在实施例9中，使用荧光测定确定抗-LAG3抗体结合至活化的猴CD4+和CD8+T细胞的能力。
在某些实施方式中，本发明的抗体能够在体外、在患有癌症的对象中或者在感染病毒(如LCMV)的对象中增强或刺激T细胞的活性。在某些实施方式中，将本发明的抗体与第二治疗剂(如第二T细胞共抑制子的抗体)联用以便在对象中增强免疫应答和抑制肿瘤生长。
特异性针对LAG3的抗体可以不含其他标记或部分，或者其可以含有N-末端或C-末端标记或部分。在一个实施方式中，标记或部分是生物素。在结合测定中，标记的位置(如果有的话)可以确定肽相对于其所结合表面上的方向。例如，如果表面上包被了抗生物素蛋白，则将对含有N-末端生物素的肽进行定向，以使得肽的C-末端部分远离表面。在一个实施方式中，标记可以是放射性核素、荧光染料或MRI可检测标记。在某些实施方式中，可以将这种标记的抗体用于包括成像测定在内的诊断测定。
发明的示例性实施方式
在某些实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人淋巴细胞活化基因3(LAG3)蛋白特异性结合，其中所述抗体或其抗原结合片段具有选自下组的性质：(a)在25℃下在表面等离子体共振中测量时以小于约10nM的结合解离平衡常数(KD)与单体人LAG3结合；(b)在37℃下在表面等离子体共振测定中测量时以小于约8nM的KD与单体人LAG3结合；(c)在25℃下在表面等离子体共振中测量时以小于约1.1nM的结合解离平衡常数(KD)与二聚体人LAG3结合；(d)在37℃下在表面等离子体共振测定中测量时以小于约1nM的KD与二聚体人LAG3结合；(e)在流式细胞术测定中测量时以小于约8nM的EC50与表达hLAG3的细胞结合；(f)在流式细胞术测定中测量时以小于约2.3nM的EC50与表达mfLAG3的细胞结合；(g)根据细胞粘附测定测量的以小于约32nM的IC50阻断hLAG3与人II类MHC的结合；(h)根据细胞粘附测定测量的以小于约30nM的IC50阻断hLAG3与小鼠MHC II类的结合；(i)根据细胞粘附测定确定的阻断超过90％的hLAG3与MHCII类的结合；(j)在荧光素酶报告基因测定中确定的以小于约9nM的EC50挽救LAG3介导的T细胞活性的抑制；以及(k)根据在荧光测定中确定的以小于约1.2nM的EC50与活化的CD4+和CD8+T细胞结合。
在某些实施方式中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段包含在表1中列出的重链可变区(HCVR)序列的任意一个中含有的三个重链互补性决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)；以及在表1中列出的轻链可变区(LCVR)序列的任意一个中含有的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。在某些实施方式中，分离的抗体或其抗原结合片段包含具有选自表1中列出的HCVR序列的氨基酸序列的HCVR。在某些实施方式中，分离的抗体或其抗原结合片段包含具有选自表1中列出的LCVR序列的氨基酸序列的LCVR。
在某些实施方式中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：(a)HCDR1结构域，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、388、404、420、436、452、460、468、476、484、492、500、508、516、540和556；(b)HCDR2结构域，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、390、406、422、438、454、462、470、478、486、494、502、510、518、542和558；(c)HCDR3结构域，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、392、408、424、440、456、464、472、480、488、496、504、512、520、544和560；(d)LCDR1结构域，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、396、412、428、444、524、532、548、564；(e)LCDR2结构域，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、398、414、430、446、526、534、550和566；以及(f)LCDR3结构域，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、400、416、432、448、528、536、552和568。
在某些实施方式中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386/394、402/410、418/426、434/442、450/522、458/522、466/522、474/522、482/522、490/522、498/530、506/530、514/530、538/546和554/562。
在某些实施方式中，权利要求7的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：386/394、418/426和538/546。
在某些实施方式中，本发明提供了一种阻断LAG3与MHC II类结合的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR的三个CDR和LVCR的三个CDR，其中所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、402、418、434、450、458、466、474、482、490、498、506、514、538和554，其中所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、394、410、426、442、522、530、546和562。
在某些实施方式中，分离的抗体或抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：386/394、418/426和538/546。
在某些实施方式中，本发明提供了一种竞争结合至某一包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386/394、402/410、418/426、434/442、450/522、458/522、466/522、474/522、482/522、490/522、498/530、506/530、514/530、538/546和554/562的抗体或其抗原结合片段的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，本发明提供了一种与某一包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386/394、402/410、418/426、434/442、450/522、458/522、466/522、474/522、482/522、490/522、498/530、506/530、514/530、538/546和554/562的抗体或其抗原结合片段结合至相同表位的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段是人、人源化或嵌合抗体。所述抗体或其抗原结合片段例如可以是IgG1或IgG4抗体，如人IgG1或IgG4抗体。这些抗体的恒定区可以对应于野生型恒定区，或对应于引入了突变的恒定区。
在某些实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体，所述分离的抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：577、579和580。在某些实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体，所述分离的抗体包含重链和轻链，其中所述轻链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：578和581。在某些实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含选自下组的重链/轻链氨基酸序列对：SEQ ID NO：577/578、579/578和580/581。
在一个方面中，本发明提供了一种多特异性抗原结合分子，所述多特异性抗原结合分子包含与LAG3特异性结合的第一抗原结合特异性和与第二目标抗原表位特异性结合的第二抗原结合特异性。
在一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含任意上述实施方式的抗-LAG3抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的运载体或稀释剂。
在一个方面中，本发明提供了分离的多核苷酸分子和载体，其包含本申请公开的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。在某些实施方式中，包括在本发明中提供了一种分离的多核苷酸分子和/或载体，其包含编码如本申请所述的抗体HCVR的多核苷酸序列。在某些实施方式中，包括在本发明中提供了一种分离的多核苷酸分子和/或载体，其包含编码如本申请所述的抗体LCVR的多核苷酸序列。
在一个方面中，本发明提供了在对象中增强免疫应答的方法，所述方法包括施用药物组合物，所述药物组合物包含本申请所公开的分离的抗-LAG3抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明提供了在对象中抑制T-调节性(Treg)细胞的方法，所述方法包括施用药物组合物，所述药物组合物包含本申请所公开的分离的抗-LAG3抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明提供了在对象中增强T细胞活化的方法，所述方法包括施用药物组合物，所述药物组合物包含本申请所公开的分离的抗-LAG3抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述对象患有选自下组的疾病或病症：血癌、脑癌、肾细胞癌(例如，透明肾细胞癌)、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、肝细胞癌、骨癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、间皮瘤、淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)和黑色素瘤。在某些实施方式中，对象患有由选自下组的病毒引起的慢性病毒感染：人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在某些实施方式中，将抗-LAG3抗体与选自下组的第二治疗剂向对象联合施用：PD-1抑制剂、CTLA抑制剂、肿瘤特异性抗原的抗体、病毒感染的细胞抗原的抗体、PD-L1抑制剂、CD20抑制剂、针对CD20和CD3的双特异性抗体、膳食补充剂如抗氧化剂、VEGF拮抗剂、化疗剂、细胞毒剂、射线、NSAID、皮质类固醇以及用于减轻与疾病或病症相关的至少一种症状的任意其他疗法。
在一个方面中，本发明提供了在对象中抑制肿瘤或肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向需要其的对象施用治疗有效量的本申请公开的抗-LAG抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，肿瘤是原发的或复发的。在某些实施方式中，肿瘤是成型的肿瘤。在某些实施方式中，对象患有转移性疾病和/或此前已接受在先治疗。在某些实施方式中，肿瘤存在于患有选自下组的疾病或病症的对象中：血癌、脑癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、骨癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、间皮瘤、淋巴瘤和黑色素瘤。在某些实施方式中，以一个或多个剂量施用抗-LAG3抗体或其抗原结合片段，其中每个剂量在紧随前面的剂量之后1至4周施用。在某些实施方式中，以约0.1mg/kg对象体重至约100mg/kg对象体重的剂量施用抗-LAG3抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，将抗-LAG3抗体与选自下组的第二治疗剂向对象联合施用：PD-1抑制剂、CTLA抑制剂、肿瘤特异性抗原的抗体、病毒感染的细胞抗原的抗体、PD-L1抑制剂、CD20抑制剂、针对CD20和CD3的双特异性抗体、膳食补充剂如抗氧化剂、VEGF拮抗剂、化疗剂、细胞毒剂、射线、NSAID、皮质类固醇以及用于减轻与疾病或病症相关的至少一种症状的任意其他疗法。在一个实施方式中，第二治疗剂是PD-1抑制剂，其中所述PD-1抑制剂是与PD-1特异性结合的抗体或其抗原片段。在一个实施方式中，PD-1抑制剂是REGN2810。在某些实施方式中，通过皮下、静脉内、皮内、腹膜内、口服、肌内或颅内施用抗-LAG3抗体或其抗原结合片段。
在一个方面中，本发明提供了挽救LAG3介导的T细胞活性抑制的方法，所述方法包括将T细胞与本申请所公开的抗-LAG3抗体或其抗原结合片段接触。在一个实施方式中，T细胞与本发明的抗-LAG3抗体和抗-PD-1抗体(例如，REGN2810)的组合接触。
抗体的抗原结合片段
除非特别另外表明，本申请中使用的术语“抗体”将理解为涵盖包含两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的抗体分子(即“全长的抗体分子”)及其抗原结合片段。如在本申请中所使用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括任意天然存在的、酶促可获得的、合成的或经基因工程改造的多肽或糖蛋白，其特异性地结合抗原以形成复合物。本申请中使用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”指保持与LAG3特异性结合能力的一种或多种抗体片段。抗体片段可以包括Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、包含CDR的片段或分离的CDR。在某些实施方式中，术语“抗原结合片段”指多重特异性抗原结合分子的多肽片段。在此类实施方式中，术语“抗原结合片段”包括例如与LAG3特异性结合的MHC II类分子。抗体的抗原结合片段可使用任意适宜的标准技术如蛋白水解消化或重组基因工程技术获自例如全长的抗体分子，所述技术涉及操纵和表达编码抗体可变和(任选地)恒定结构域的DNA。这些DNA为已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)得到，或可为合成的。DNA可测序并通过使用分子生物技术化学操纵，例如以将一个或多个可变和/或恒定结构域排列成为适宜的配置，或以引入密码子、生成半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR)如CDR3肽)或受限的FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化的分子如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、双体、三体、四体、微抗体、纳米抗体(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也涵盖在本申请使用的表述“抗原结合片段”内。
抗体的抗原结合片段将通常包含至少一个可变域。该可变域可以是任何大小或氨基酸组成且将一般包含至少一个CDR，其与一个或多个框架序列相邻或在与一个或多个框架序列同框。在具有与VL结构域结合的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可相对彼此以任何适当的排列进行配置。例如，可变区可以是二聚化的并包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可包含单体VH或VL结构域。
在某些实施方式中，抗体的抗原结合片段可以包含至少一个可变结构域，其与至少一个恒定结构域共价连接。可在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变和恒定结构域的非限制性、示例性配置包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可变和恒定结构域的任何排列中，包括上文列举的任何示例性排列，可变和恒定结构域可直接彼此连接或可通过全长或部分铰链或接头区连接。铰链区可由至少2(例如，5、10、15、20、40、60或更多)个氨基酸组成，其导致在单个的多肽分子中相邻的可变和/或恒定域间柔性或半柔性的连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含任何上文列举的可变和恒定结构域构造彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域(例如，通过二硫键)以非共价缔合的同型二聚体或异型二聚体(或其他多聚体)。
而对于全长的抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段将通常包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性地结合不同的抗原或在相同抗原上的不同表位。本申请公开的任何多特异性抗体形式，包括示例性的双特异性抗体形式，可以使用本领域的常规技术改造以适于在本发明抗体的抗原结合片段的背景下使用。
人源抗体的制备
用于在转基因小鼠中生成人源抗体的方法是本领域公知的。可在本发明的背景下使用任何这些公知的方法以制备特异性与LAG3结合的人源抗体。
使用技术(参见例如，US 6,596,541，瑞泽恩制药公司，)或任意其他公知的用于生成单克隆抗体的方法，首先分离具有人源可变区和小鼠恒定区的对LAG3具有高亲和性的嵌合抗体。技术涉及转基因小鼠的产生，所述小鼠具有含有与内源性小鼠恒定区基因座可操作地连接的人源重链和轻链可变区的基因组，以使得所述小鼠针对抗原的刺激产生包含人源可变区和小鼠恒定区的抗体。编码所述抗体的重链和轻链可变区的DNA被分离并且与编码人源重链和轻链恒定区的DNA可操作地连接。然后在能够表达全人抗体的细胞中表达所述DNA。
在通常情况下，使用目标抗原攻击小鼠，并且从表达抗体的小鼠中回收淋巴细胞(如B细胞)。可以将所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合以制备永生化的杂交瘤细胞系，并且对此类杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴定产生对目标抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。可以分离编码所述重链和轻链可变区的DNA并且与所述重链和轻链的所需的同种型恒定区连接。可以在细胞(如CHO细胞)中生产此类抗体蛋白。或者，可以直接从抗原特异性淋巴细胞中分离编码所述抗原特异性嵌合抗体或所述轻链和重链可变结构域的DNA。
首先，分离出具有人源可变区和小鼠恒定区的高亲和性嵌合抗体。如在下面的实验章节中所述的，对抗体进行表征并对所需的特征包括亲和性、选择性、表位等进行选择。使用所需的人源恒定区取代所述小鼠的恒定区以生成本发明的全人抗体，例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4。尽管可以根据特定用途改变所选择的恒定区，高亲和性抗原结合和靶点特异性特征均保留在可变区中。
生物等价物
本发明的抗-LAG3抗体和抗体片段包含具有不同于本申请所述抗体的那些的氨基酸序列，但是仍保持了结合LAG3的能力。此类变体抗体和抗体片段当与母体序列进行比较时包含一个或多个氨基酸插入、缺失或取代，但是显示出基本上与所述抗体等价的生物活性。同样地，本发明的编码抗体的DNA序列与所公开的序列相比包含一个或多个核苷酸插入、缺失或取代，但是其编码的抗体或抗体片段基本上是本发明的抗体或抗体片段的生物等价物。
如果例如两种抗原结合蛋白或抗体是药学等价物或药学替代物，即在类似的实验条件下单剂量或多剂量给予相同摩尔剂量时其吸收速率和程度未显示出显著差异，则认为这两者是生物等价物。如果一些抗体在其吸收程度上而不是吸收速率上是等价的仍可以将其认为是等价物或药学替代物并且仍可以认为其是生物等价物，因为这种在吸收速率上的差异是有意的并且已经反映在标签中，其对例如长期使用时达到有效的机体药物浓度不是必要的，并且针对所研究的特定药品认为其在医学上是不重要的。
在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和效能方面不存在具有临床意义的差异，则认为其是生物等价物。
在一个实施方式中，如果患者能够在对照产品和生物产品之间进行一次或多次的转换而在不良反应的风险方面无预期的增加，则认为这两种抗原结合蛋白是生物等价物，所述不良反应包括与无这种转换的连续疗法相比免疫原性出现具有临床意义的改变或有效性的降低。
在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白针对一种或多种病情的使用通过共同的作用机制发挥作用并且此类作用机制在公知的范围内，则认为其是生物等价物。
生物等效性可以通过体内和/或体外方法证明。生物等效性的测定包括，例如(a)在人或其他哺乳动物中的体内检测，测定在血液、血浆、血清或其他生物液体中的抗体或其代谢产物的浓度的时间函数；(b)进行体外检测，与人体内的生物利用度数据关联，并合理的预测在人体内的生物利用度数据；(c)在人或其他哺乳动物中进行体内检测，测定适当的抗体(或其靶点)适当的急性药理学作用的时间函数；和(d)在对照良好的临床试验中确定抗体的安全性、有效性或者生物利用度或生物等效性。
可以通过例如对残基或序列进行各种取代或者缺失生物活性不需要的末端或中间的残基构建本发明的抗体的生物等价物变体。例如，半胱氨酸残基不是生物活性所必须的，可以将其缺失或使用其他氨基酸取代以防止在还原过程中形成不必要的或不正确的分子内二硫键桥。在其他情况下，生物等价物抗体可以包括包含氨基酸改变的抗体变体，其改变了所述抗体的糖基化特征，例如消除或除去糖基化的突变。
包含Fc变体的抗-LAG3抗体
根据本发明的某些实施方式，提供了包含Fc结构域的抗-LAG3抗体，所述Fc结构域含有增加或减少抗体与FcRn受体结合的一个或多个突变，例如与在中性pH下相比在酸性pH下增加或减少抗体与FcRn受体结合的一个或多个突变。例如，本发明包括在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变的抗-LAG3抗体，其中所述突变在酸性环境中(例如，在pH范围从约5.5至约6.0的核内体中)增加Fc结构域与FcRn的亲和性。当向动物施用时，此类突变可以导致抗体血清半衰期的增加。此类Fc修饰的非限制性实例包括例如在位置250(例如E或Q)；250和248(例如L和F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或者在位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])的修饰；或者在位置250和/或428的修饰；或者在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)的修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V259I)的修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)的修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)的修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。在又一个实施方式中，所述修饰包括265A(例如D265A)和/或297A(例如N297A)的修饰。
例如，本发明包括包含Fc结构域的抗-LAG3抗体，所述Fc结构域含有一对或多对或者一组或多组选自下组的突变：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；257I和311I(例如P257I和Q311I)；257I和434H(例如P257I和N434H)；376V和434H(例如D376V和N434H)；307A、380A和434A(例如T307A、E380A和N434A)；以及433K和434F(例如H433K和N434F)。在一个实施方式中，本发明包括包含Fc结构域的抗-LAG3抗体，所述Fc结构域含有在IgG4铰链区中的S108P突变以促进二聚体稳定化。前述Fc结构域突变的所有可能的组合以及本申请所公开的抗体可变结构域中的其他突变均包含在本发明的范围内。
本发明还包括包含嵌合的重链恒定(CH)区的抗-LAG3抗体，其中所述嵌合的CH区包含来源于一个以上免疫球蛋白同种型的CH区的区段。例如，本发明的抗体可以包含嵌合的CH区，所述嵌合的CH区包含来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的部分或全部的CH2结构域，以及来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的部分或全部的CH3结构域。根据某些实施方式，本发明的抗体包含具有嵌合的铰链区的嵌合的CH区。例如，嵌合的铰链可以包含来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上部铰链”氨基酸序列(来自根据EU编号的位置216至227的氨基酸残基)，以及来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下部铰链”氨基酸序列(来自根据EU编号的位置228至236的氨基酸残基)。根据某些实施方式，嵌合的铰链区包含来自人IgG1或人IgG4上部铰链的氨基酸残基以及来自人IgG2下部铰链的氨基酸残基。在某些实施方式中，如本申请所述的包含嵌合的CH区的抗体显示出改善的Fc效应物功能且对抗体的治疗或药代动力学性质未产生不利影响。(参见例如，美国专利公开号20140243504，其公开的全部内容通过引用并入本申请)。在某些实施方式中，Fc区域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：569、570、571、572和573。
抗体的生物学特性
在通常情况下，本发明的抗体通过与LAG3结合发挥作用。本发明包括以高亲和性结合可溶性单体或二聚体LAG3分子的抗-LAG3抗体和抗原结合片段。例如，本发明包括通过(例如，本申请实施例3中所定义的测定形式的)表面等离子体共振测量的(例如，在25℃下或在37℃下)以小于约10nM的KD与单体LAG3结合的抗体和抗体的抗原结合片段。在某些实施方式中，通过表面等离子体共振(例如，使用如本申请实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定)测量的以小于约5nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约0.5nM、小于约0.1nM、小于约0.05nM或者小于约0.04nM的KD结合单体LAG3的抗体或其片段。
本发明还包括通过(例如，本申请实施例3中所定义的测定形式的)表面等离子体共振测量的(例如，在25℃下或在37℃下)以小于约1.1nM的KD与二聚体LAG3结合的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方式中，通过表面等离子体共振(例如，使用如本申请实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定)测量的以小于约0.5nM、小于约0.25nM、小于约0.1nM、小于约0.05nM或者小于约0.01nM的KD结合二聚体LAG3的抗体或其片段。
本发明还包括在25℃或37℃下通过表面等离子体共振(例如，使用如本申请实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定)测量的以大于约1.6分钟的解离半衰期(t1/2)与LAG3结合的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方式中，在25℃或37℃下通过表面等离子体共振(例如，使用如本申请实施例3中定义的测定形式(例如，mAb捕获或抗原捕获形式)，或基本上相似的测定)测量的本发明的抗体或抗原结合片段以大于约5分钟、大于约10分钟、大于约30分钟、大于约50分钟、大于约60分钟、大于约70分钟、大于约80分钟、大于约90分钟、大于约100分钟、大于约200分钟、大于约300分钟、大于约400分钟、大于约500分钟、大于约600分钟、大于约700分钟、大于约800分钟、大于约900分钟、大于约1000分钟或大于约1100分钟的t1/2结合LAG3。
本发明还包括通过如本申请实施例5中定义的流式细胞术或基本上相似的测定测量的以小于约8nM的EC50与表达人LAG3的细胞结合的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，通过流式细胞术(例如，使用本申请实施例5中定义的测定或基本上相似的测定)测量的抗体或其抗原结合片段以小于约5nM、小于约2nM、小于约1nM或小于约0.5nM的EC50结合表达人LAG3的细胞。
本发明还包括通过如本申请实施例5中定义的流式细胞术或基本上相似的测定测量的以小于约2.5nM的EC50与表达猕猴LAG3的细胞结合的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，通过流式细胞术(例如，使用本申请实施例5中定义的测定或基本上相似的测定)测量的抗体或其抗原结合片段以小于约2nM或小于约1nM的EC50结合表达mfLAG3的细胞。
本发明还包通过使用细胞粘附测定(例如，实施例7中所示的或基本上类似的测定)确定的以小于约32nM的IC50阻断LAG3与II类MHC(人HLA-DR2)结合的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，通过使用细胞粘附测定(例如，使用本申请实施例7中定义的测定形式或基本上类似的测定)测量的抗体或其抗原结合片段以小于约25nM、小于约20nM、小于约10nM或小于约5nM的IC50阻断LAG3结合至人II类MHC。
本发明还包通过使用细胞粘附测定(例如，实施例7中所示的或基本上类似的测定)确定的以小于约30nM的IC50阻断LAG3与II类MHC(小鼠HLA-DR2)结合的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，通过使用细胞粘附测定(例如，使用本申请实施例7中定义的测定形式或基本上类似的测定)测量的抗体或其抗原结合片段以小于约25nM、小于约20nM、小于约10nM或小于约5nM的IC50阻断小鼠LAG3结合至人II类MHC。
本发明还包括通过如本申请实施例7中定义的细胞粘附测定或基本上类似的测定测量的阻断LAG3与人或小鼠MHC II类的结合超过90％的抗体或其抗原结合片段。
本发明还包括通过本申请实施例8中定义的T细胞/APC荧光素酶报告基因测定或基本上类似的测定测量的以小于9nM的EC50阻断LAG诱导的T细胞下调的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，通过T细胞/APC荧光素酶报告基因测定(例如，使用本申请实施例8中定义的测定形式或基本上类似的测定)测量的抗体或其抗原结合片段以小于约5nM、小于约1nM、小于约0.5nM或小于约0.1nM的EC50阻断LAG诱导的T细胞下调。
本发明还包括通过本申请实施例9中定义的荧光测定或基本上类似的测定测量的以小于约1.2nM的EC50结合至猕猴活化的CD4+和CD8+T细胞的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，通过荧光测定(例如，使用本申请实施例9中定义的测定形式或基本上类似的测定)测量的抗体或其抗原结合片段以小于约1.1nM、小于约1nM、小于约0.5nM、小于约0.2nM或小于约0.1nM的EC50结合至猕猴活化的CD4+和CD8+T细胞。
在某些实施方式中，本发明的抗体可以通过阻断或抑制与LAG3相关的MHC II类的结合活性发挥作用，其通过结合至全长蛋白或SEQ ID NO：582中所示的氨基酸序列的任意其他区域或片段。
在某些实施方式中，当向需要其的对象预防性施用时，本发明的抗体用于抑制肿瘤生长或延迟癌症进展，以及可以增加对象的存活。例如，本发明抗体的施用可以导致原发肿瘤的缩小以及可以预防继发肿瘤的转移和进展。在某些实施方式中，当向需要其的对象治疗性施用时，本发明的抗体用于抑制肿瘤生长以及可以增加对象的存活。例如，向对象施用治疗有效量的本发明抗体可以导致在对象中成型的肿瘤的缩小和消失。
在一个实施方式中，本发明提供了一种与LAG3结合的分离的重组单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段显示出一个或多个下述特征：(i)包含HCVR，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、402、418、434、450、458、466、474、482、490、498、506、514、538和554，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列；(ii)包含LCVR，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、394、410、426、442、522、530、546和562，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列；(iii)包含HCDR3结构域，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、392、408、424、440、456、464、472、480、488、496、504、512、520、544和560，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列；和LCDR3结构域，其有选自下组的氨基酸序列：SEQID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、400、416、432、448、528、536、552和568，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列；(iv)包含HCDR1结构域，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、388、404、420、436、452、460、468、476、484、492、500、508、516、540和556，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列；HCDR2结构域，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、390、406、422、438、454、462、470、478、486、494、502、510、518、542和558，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列；
LCDR1结构域，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、396、412、428、444、524、532、548和564，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列；和LCDR2结构域，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、398、414、430、446、526、534、550和566，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列；(v)在25℃下在表面等离子体共振中测量时以小于约10nM的结合解离平衡常数(KD)与单体人LAG3结合；(vi)在37℃下在表面等离子体共振测定中测量时以小于约8nM的KD与单体人LAG3结合；(vii)在25℃下在表面等离子体共振中测量时以小于约1.1nM的KD与二聚体人LAG3结合；(viii)在37℃下在表面等离子体共振测定中测量时以小于约1nM的KD与二聚体人LAG3结合；(ix)在流式细胞术测定中测量时以小于约8nM的EC50与表达hLAG3的细胞结合；(x)在流式细胞术测定中测量时以小于约2.3nM的EC50与表达mfLAG3的细胞结合；(xi)根据细胞粘附测定测量的以小于约32nM的IC50阻断hLAG3与人II类MHC的结合；(xii)根据细胞粘附测定测量的以小于约30nM的IC50阻断hLAG3与小鼠II类MHC的结合；(xiii)根据细胞粘附测定确定的阻断超过90％的hLAG3与II类MHC的结合；(xiv)在荧光素酶报告基因测定中确定的以小于约9nM的EC50挽救LAG3介导的T细胞活性的抑制；(xv)根据在荧光测定中确定的以小于约1.2nM的EC50与活化的CD4+和CD8+T细胞结合；(xvi)在患有癌症的对象中抑制肿瘤生长和增加存活，以及(xvii)是全人的。
本发明的抗体可以具有一个或多个上述的生物学特征或其任意组合。在阅读了包括本申请工作实施例在内的本公开后，本发明抗体的其他生物学特征对本领域技术人员而言将是显而易见的。
物种选择性和物种交叉反应性
根据本发明的某些实施方式，抗-LAG3抗体与人LAG3结合，但不与其他物种的LAG3结合。或者，在某些实施方式中，本发明的抗-LAG3抗体与人LAG3结合以及与一个或多个非人物种的LAG3结合。例如，本发明的抗-LAG3抗体可以结合至人LAG3，并且可以结合或不结合(视情况而定)小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、奶牛、马、骆驼、猕猴、绒猴、恒河猴或黑猩猩LAG3中的一种或多种。在某些实施方式中，本发明的抗-LAG3抗体可以以相同的亲和性或以不同的亲和性结合至人和猕猴LAG3，但是不结合至大鼠和小鼠LAG3。
表位展示和相关技术
本发明包括与在LAG3分子的一个或多个结构域内(包括例如胞外D1至D4结构域、跨膜域和胞内域)存在的一个或多个氨基酸相互作用的抗-LAG3抗体。抗体结合的表位可以由位于LAG3分子上述任意一个结构域中的具有3个或多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单一连续的序列组成(例如，在结构域中的线形表位)。或者，表位可以由位于LAG3分子上述结构域的任意一个或两个中的多个不连续的氨基酸(或氨基酸序列)组成(例如，构象表位)。
本领域的普通技术人员公知的各种技术均可以用于确定抗体是否与多肽或蛋白中的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性的技术包括例如常规的交叉阻断试验，如在Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中所描述的。其他的方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)Methods MolBiol248:443-63)、肽切割分析晶体学研究和NMR分析。此外，可以使用方法如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰(Tomer(2000)Protein Science 9:487-496)。能够用于鉴定与抗体相互作用的多肽中的氨基酸的另一种方法是利用质谱进行的氢/氘交换检测。总的来说，所述氢/氘交换方法涉及使用氘标记目标蛋白，随后将所述抗体与所述氘标记的蛋白结合。接下来，将所述蛋白/抗体的复合物转移至水中，在被所述抗体复合物保护的氨基酸中可交换的质子由氘向氢的回交换速率慢于不作为界面一部分的氨基酸中的可交换质子。其结果是，来自蛋白/抗体界面的一部分的氨基酸可以保留氚，并且因此与没有包括在所述界面中的氨基酸相比显示出相对更高的质量。在所述抗体解离后，将所述靶蛋白进行蛋白酶裂解并进行质谱分析，以揭示氘标记的残基，所述残基对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
术语“表位”指B细胞和/或T细胞对其产生应答的抗原上的位点。B细胞表位可以由连续的氨基酸形成，或者由蛋白三级折叠并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常在独特的空间构象中包含至少3个，更通常地至少5个或8-10个氨基酸。
修饰辅助分析(MAP)，也称为基于抗原结构的抗体分析(ASAP)，这种方法根据各抗体与经化学或酶促修饰的抗原表面结合性质的相似性，对针对相同抗原的大量单克隆抗体(mAb)进行分类的方法(参见US 2004/0101920，其全部内容特别地通过引用并入本申请)。各个分类可以反映独特的表位，无论是与另一分类所表示的表位截然不同的还是部分重叠的。这项技术能够快速过滤基因相同的抗体，以使得表征可以集中在基因不同的抗体上。当用于杂交瘤筛选时，MAP可以容易地鉴定产生具有所需特征的mAb的稀有杂交瘤克隆。可以使用MAP将本发明的抗体分选为结合不同表位的抗体组。
在某些实施方式中，抗-LAG3抗体或其抗原结合片段结合LAG3中天然形式(如SEQID NO：582中示例的)或重组产生的(如SEQ ID NOS：574-576中示例的)任意一个或多个示例区域中的表位或者其片段。在一些实施方式中，本发明的抗体与胞外域结合，所述胞外域包含选自LAG3的氨基酸残基29-450的一个或多个氨基酸。在一些实施方式中，本发明的抗体与胞外域结合，所述胞外域包含选自猕猴LAG3的氨基酸残基1-533的一个或多个氨基酸(例如，SEQ ID NO：576)。
在某些实施方式中，本发明包括与在LAG3的胞外区域(SEQ ID NO：588)中存在的一个或多个表位相互作用的抗-LAG3抗体及其抗原结合片段。表位可以由位于LAG3胞外区域内的3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的一个或多个连续序列组成。或者，表位可以由位于LAG3胞外区域内的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。如本申请实施例18中所示，与本发明示例性抗体H4sH15482P相互作用的LAG3的表位由氨基酸序列LRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY(SEQ ID NO：589)所定义，其对应于SEQID NO：588的氨基酸28至71。因此，本发明包括与由SEQ ID NO：588的氨基酸28至71组成的区域(即，LRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY的序列[SEQ ID NO：589])中所含的一个或多个氨基酸相互作用的抗-LAG3抗体。
本发明包括与表1中本申请所述的任意特定示例性抗体或具有表1中所述的任意示例性抗体的CDR序列的抗体结合至相同表位或表位的一部分的抗-LAG3抗体。同样地，本发明还包括与表1中本申请所述的任意特定示例性抗体或具有表1中所述的任意示例性抗体的CDR序列的抗体竞争与LAG3或LAG3的片段的结合的抗-LAG3抗体。例如，本发明包括与本申请实施例4中所定义的一个或多个抗体(例如，H4sH15482P、H4sH15479P、H4sH14813N、H4H14813N、H4H15479P、H4H15482P、H4H15483P、H4sH15498P、H4H15498P、H4H17828P2、H4H17819P和H4H17823P)交叉竞争与LAG3的结合的抗-LAG3抗体。
通过使用本领域公知的常规方法能够容易地确定抗体是否与参照抗-LAG3抗体结合至相同表位或与之竞争结合。例如，为确定是否待测抗体与本发明的参照抗-LAG3抗体结合至相同表位，在饱和条件下将参照抗体与LAG3蛋白或肽结合。接下来，评估待测抗体与LAG3分子结合的能力。在使用参照抗-LAG3抗体饱和结合后，如果待测抗体能够与LAG3结合，则能够得出结论待测抗体与参照抗-LAG3抗体结合至不同的表位。另一方面，在使用参照抗-LAG3抗体饱和结合后，如果待测抗体不能与LAG3蛋白结合，则待测抗体可以结合至与本发明的对照抗-LAG3抗体结合的表位相同的表位。
为了确定是否抗体与参照抗-LAG3抗体竞争结合，在两个方向上进行上述结合方法：在第一个方向上，在饱和条件下将参照抗体与LAG3蛋白结合，随后评估待测抗体与LAG3分子的结合。在第二个方向上，在饱和条件下将待测抗体与LAG3分子结合，随后评估参照抗体与LAG3分子的结合。如果在这两个方向上仅第一(饱和)抗体能够与LAG3分子结合，则能够得出结论待测抗体和参照抗体竞争结合至LAG3。如本领域普通技术人员将理解的，与参照抗体竞争结合的抗体可以不一定与参照抗体结合相同的表位，但可通过结合重叠或相邻的表位在空间上阻断参照抗体的结合。
如果两个抗体分别竞争性抑制(阻断)对方与抗原的结合，则两个抗体与相同或重叠的表位结合。也就是说，根据在竞争性结合测定中的测量，1、5、10、20或100倍过量的一个抗体抑制至少50％，但是优选地75％、90％或者甚至99％的另一个抗体的结合(参见例如，Junghans等，Cancer Res.1990 50:1495-1502)。或者，如果抗原中降低或消除一个抗体结合的基本上所有的氨基酸突变降低或消除另一个的结合，则两个抗体具有相同的表位。如果降低或消除一个抗体结合的一些氨基酸突变降低或消除另一个的结合，则两个抗体具有重叠的表位。
然后可以进行其他的常规实验(例如，肽突变和结合分析)以确证是否所观察到的待测抗体结合的缺乏事实上是由于与参照抗体结合相同的表位导致的，或者是否是空间位阻(或另外的现象)导致了所观察到的结合缺乏。可以使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流式细胞术或本领域中任意其他定量或定性的抗体结合测定进行这种类型的实验。
免疫缀合物
本发明涵盖了与治疗部分如细胞毒素或化疗剂缀合以治疗癌症的人抗-LAG3单克隆抗体(“免疫缀合物”)。本申请中使用的术语“免疫缀合物”指与细胞毒素、放射性药剂、细胞因子、干扰素、靶点或报告物部分、酶、毒素、肽或蛋白或治疗剂化学或生物连接的抗体。抗体可沿分子的任何位置连接至细胞毒素、放射性药剂、细胞因子、干扰素、靶点或报告物部分、酶、毒素、肽或治疗剂，只要其能够结合其靶点即可。免疫缀合物的实例包括抗体药物缀合物和抗体-毒素融合蛋白。在一个实施方式中，药剂可以是针对LAG3的第二种不同的抗体。在某些实施方式中，抗体可以与特异性用于肿瘤细胞或病毒感染细胞的药剂缀合。可与抗-LAG3抗体缀合的治疗性部分的类型应考虑待治疗的病况和将实现的所需治疗效果。用于形成免疫缀合物的适宜药剂的实例是本领域公知的；参见例如，WO05/103081。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以对一个靶向多肽的不同表位是特异性的或者可以含有对一个以上的靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如，Tutt等，1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等，2004,TrendsBiotechnol.22:238-244。
在一个方面中，本发明包括多特异性抗原结合分子或其抗原结合片段，其中免疫球蛋白或其片段的一个特异性对LAG3的胞外域是特异的，以及免疫球蛋白的其他特异性对LAG3胞外域以外的结合或第二治疗性靶点是特异的，或者与治疗性部分缀合。
正如本领域的普通技术人员所公知的，本发明的任意多特异性抗原结合分子或其变体可使用标准的分子生物学技术构建(例如，重组DNA和蛋白表达技术)。
在一些实施方式中，LAG3-特异性抗体以双特异性的形式生成(“双特异性”)，其中与LAG3的不同结构域结合的可变区连接在一起从而在单一结合分子内赋予双结构域特异性。适当设计的双特异性抗体可通过增加特异性和结合亲合力增强总体的LAG3抑制性效能。具有针对单结构域的特异性的可变区(例如，N末端结构域的区段)，或可与一个结构域内的不同区域结合的可变区在允许每个区域同时与不同表位结合或允许每个区域与一个结构域内的不同区域结合的结构支架上配对。在针对双特异性的一个实例中，来自一个结合子的具有针对一个结构域的特异性的重链可变区(VH)与来自一系列结合子的具有针对第二结构域的轻链可变区(VL)重组以识别可与原始VH配对而不破坏针对该VH的原始特异性的非同源VL伴侣。以这种该方式，单一VL区段(例如，VL1)可与两个不同的VH结构域(例如，VH1和VH2)组合以产生包含两个结合“臂”的双特异性抗体(VH1-VL1和VH2-VL1)。单一VL区段的使用降低了系统的复杂性且由此简化了产生双特异性抗体使用的克隆、表达和纯化步骤并增加其效能(参见例如，USSN13/022759和US2010/0331527)。
或者，可以使用本申请所述的技术或本领域技术人员公知的其他技术以双特异性的形式制备结合一个以上结构域和第二靶点(例如，但不限于，举例来说第二种不同的抗-LAG3抗体)的抗体。与不同区域结合的抗体可变区可以与结合(例如，在LAG3胞外域上)相关位点的可变区连接在一起，以在单一结合分子内赋予双抗原特异性。适当设计的该双特异性性质可作为双功能发挥作用。将对胞外域具有特异性的可变区与对胞外域以外具有特异性的可变区组合，且在允许每个可变区与不同抗原结合的结构支架上配对。
能够用于本发明背景下的示例性双特异性抗体形式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中所述第一和第二Ig CH3结构域彼此间存在至少一个氨基酸的差异，并且与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比其中至少一个氨基酸的差异降低了双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方式中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A并且第二Ig CH3结构域含有使与蛋白A的结合减少或消除的突变如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。第二CH3还可以包括Y96F修饰(根据IMGT；根据EU为Y436F)。可以存在于第二CH3中的进一步的修饰包括：在IgG1抗体的情况下D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU为N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗体的情况下Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上文所述的双特异性抗体形式的变体包括在本发明的范围内。
能够用于本发明背景下的其他示例性的双特异性形式包括，但不限于，例如基于scFv的或双体双特异性形式、IgG-scFv融合、双可变结构域(DVD)-Ig、四价体杂交瘤、凸起-进入-孔洞(knob-into-hole)、共有轻链(例如，具有凸起-进入-孔洞等的共有轻链)、CrossMab、CrossFab(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性形式(参见例如，Klein等，2012,mAbs 4:6,1-11，并且作为本申请中引用的参考文献，其对前述的形式进行了综述)。也可以使用肽/核酸缀合构建双特异性抗体，例如其中将具有正交化学反应性的非天然氨基酸用于生成位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，然后将其自组装成具有所定义的组分、价态和几何形状的多聚体复合物。(参见例如，Kazane等，J.Am.Chem.Soc.[Epub:Dec.4,2012])。
治疗性施用和制剂
本发明提供了包含本发明的抗-LAG3抗体或其抗原结合片段的药物组合物。将根据本发明的治疗性组合物与掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受等的适宜的运载体、赋形剂和其他试剂一起施用。多种适宜的制剂能够在所有药物化学家公知的处方集Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA中找到。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳状碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有半固体混合物的碳蜡。亦参见Powell等，"Compendium ofexcipients for parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol52:238-311。
可以根据施用对象的年龄和身材、目标疾病、病况、施用途径等改变抗体的剂量。通常根据体重或体表面积计算优选剂量。当将本发明的抗体用于治疗成年患者中的疾病或病症时，或用于预防该疾病时，通常以约0.1至约60mg/kg体重，更优选地以约5至约60、约20至约50、约10至约50、约1至约10或约0.8至约11mg/kg体重的单剂量正常地施用本发明的抗体是有益的。可以根据病况的严重程度调整治疗的频率和持续时间。在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以至少约0.1mg至约800mg、约1至约500mg、约5至约300mg或者约10至约200mg、至约100mg或至约50mg的初始剂量施用。在某些实施方式中，初始剂量后以与初始剂量大致相同或较少的量施用第二或多次后续剂量的抗体或其抗原结合片段，其中后续剂量间隔至少1天至3天；至少1周、至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或者至少14周。
各种递送系统是公知的并且可以用于施用本发明的药物组合物，例如包封在脂质体中、微粒、微囊、能够表达突变型病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如，Wu等，(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括但不限于皮内、透皮、肌内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任意常规的途径施用，例如通过输注或推注、通过经上皮或粘膜层(例如，口腔粘膜、直肠和小肠粘膜等)的吸收和可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。药物组合物还可在囊泡(特别是脂质体)中递送(参见例如，Langer(1990)Science 249:1527-1533)。
在本申请中还构想了递送本发明抗体的纳米颗粒的使用。抗体缀合的纳米颗粒还可用于治疗和诊断应用两者。抗体缀合的纳米颗粒和制备方法及用途由Arruebo,M.等，2009(“Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications”inJ.Nanomat.Volume2009,Article ID 439389,24pages，doi:10.1155/2009/439389)详细描述，其通过引用并入本申请。可以开发纳米颗粒并与包含在药物组合物中的抗体缀合以靶向肿瘤细胞或自身免疫组织细胞或病毒感染的细胞。已在例如US 8257740或US 8246995中描述了用于药物递送的纳米颗粒，其全部内容分别并入本申请。
在某些情况下，可以在控释系统中递送药物组合物。在一个实施方式中，可以使用泵。在另一个实施方式中，可以使用聚合材料。在又一个实施方式中，可以将控释系统置于组合物靶点的附近，因此仅需要递送全身剂量的一部分。
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内、颅内、腹膜内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可通过公共已知的方法制备。例如，可通过在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中例如通过溶解、悬浮或乳化上述抗体或其盐制备可注射制剂。作为用于注射的水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖和其他辅助剂的等渗溶液等，其可与适当的增溶剂如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油性介质，使用例如芝麻油、大豆油等，其可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苄醇等组合使用。因此制备的注射剂优选填充在适当的安瓿中。
可以使用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本发明的药物组合物。此外，对于皮下递送，笔递送装置能够容易地用于递送本发明的药物组合物。此类笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常使用含有药物组合物的可替换的药筒。一旦药筒中的所有药物组合物已经施用并且药筒是空的时，空的药筒能够容易地被弃去并且被含有药物组合物的新药筒替换。然后可以重新使用药物递送装置。在一次性的笔递送装置中，无可替换的药筒。相反地，一次性笔递送装置在装置中的储液槽中预充了药物组合物。一旦药物组合物的储液槽变空，则将整个装置弃去。
多种可重复使用的笔和自动注射器递送装置已应用于本发明药物组合物的皮下递送。例如包括但不一定限于AUTOPENTM(欧文芒福德公司，伍德斯托克，英国)、DISETRONICTM笔(Disetronic医疗系统，Burghdorf，瑞士)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(礼来公司，印第安纳波利斯，IN)、NOVOPENTM I、II和III(诺和诺德，哥本哈根，丹麦)、NOVOPEN JUNIORTM(诺和诺德，哥本哈根，丹麦)、BDTM笔(Becton Dickinson公司，富兰克林湖，NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(赛诺菲-安万特，法兰克福，德国)仅列举了其中的几个。应用于本发明的药物组合物皮下递送的一次性笔递送装置的例子包括但不一定限于SOLOSTARTM笔(赛诺菲-安万特)、FLEXPENTM(诺和诺德)和KWIKPENTM(礼来)、SURECLICKTM自动注射器(安进公司，千橡郡，加拿大)、PENLETTM(Haselmeier，斯图加特，德国)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(雅培实验室，雅培公园，IL)仅列举了其中的几个。
有利地，将上文所述的用于口服或胃肠外的药物组合物制成适于适宜的活性成分剂量的单位剂量剂型。单位剂量的这种剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含的抗体的量通常为约5至约500mg每单位剂量剂型；特别是在注射剂形式，所含的抗体优选地为约5至约100mg并且对于其他剂型为约10至约250mg。
抗体的治疗用途
本发明的抗体尤其用于治疗、预防和/或减轻与LAG3的表达、信号传导或活性相关的或由LAG3的表达、信号传导或活性介导的，或者可以通过阻断LAG3与LAG3配体MHC II类之间的相互作用或以其他方式抑制LAG3的活性和/或信号传导治疗的任何疾病或病症。例如，本发明提供了通过向需要此类治疗的患者施用本申请所述的抗-LAG3抗体(或包含抗-LAG3抗体的药物组合物)用于治疗癌症(肿瘤生长抑制)和/或病毒感染的方法，以及在癌症治疗(肿瘤生长抑制)和/或病毒感染中使用的抗-LAG3抗体(或包含抗-LAG3抗体的药物组合物)。本发明的抗体用于治疗、预防和/或减轻疾病或病症或病况(如癌症或病毒感染)和/或用于减轻与此类疾病、病症或病况相关的至少一种症状。在本申请所述治疗方法的背景下，抗-LAG3抗体可以作为单一疗法(即，作为唯一的治疗剂)施用或与一种或多种其他治疗剂联用(在本申请的其他部分描述了实例)。
在本发明的一些实施方式中，本申请所述的抗体用于治疗患有原发性或复发性癌症的对象，包括但不限于血癌、脑癌(例如，多形性胶质母细胞瘤)、肾细胞癌(例如，透明肾细胞癌)、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、肝细胞癌、骨癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、间皮瘤和黑色素瘤。
本申请中使用的术语“血癌”包括影响血液、骨髓、淋巴结或淋巴系统的血液恶性肿瘤。因此，该术语包括来自淋巴和髓系细胞谱系细胞的恶性肿瘤。髓系细胞系通常产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞；淋巴细胞系产生B细胞、T细胞、NK细胞和浆细胞。因此，该术语包括上述细胞的恶性肿瘤，即淋巴瘤、骨髓瘤、淋巴性白血病和骨髓性白血病。实例包括但不限于急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤)和骨髓瘤(包括多发性骨髓瘤)。
可以将抗体用于治疗癌症的早期或晚期症状。在一个实施方式中，可以将本发明的抗体或其片段用于治疗晚期或转移性癌症。抗体用于降低或抑制或缩小实体瘤或血癌的肿瘤瘤生长。在某些实施方式中，使用本发明的抗体或其抗原结合片段治疗使得对象中的肿瘤消退超过40％、消退超过50％、消退超过60％、消退超过70％、消退超过80％或者消退超过90％。在某些实施方式中，可以将抗体用于防止肿瘤复发。在某些实施方式中，抗体用于在患有癌症的对象中延长无进展存活期或总存活期。在一些实施方式中，抗体用于降低化疗或放疗引起的毒性，同时维持癌症患者的长期存活。
在某些实施方式中，对象是癌症患者，并且其：
●此前未接受过抗-PD-1/PD-L1疗法，但是是接受基于抗-PD-1疗法的适宜候选人；和/或
●此前已接受过基于抗-PD-1/PD-L1的疗法，并在对抗PD-1/PD-L1疗法具有至少3个月的经确认的客观应答(CR或PR)或SD但是对该疗法随后出现进展，或者具有将SD或PR作为最佳应答，随后持续6个月的稳定应答；和/或
●不是标准疗法的候选人，或者预期没有表达治疗益处的可用疗法并适于mAb1单一疗法；和/或
●患有IIIB或IV期NSCLC且未使用过抗-PD-1/PD-L1的，未对转移性疾病进行预先治疗或在一个含铂方案后发生疾病进展/复发；和/或
●患有IIIB或IV期NSCLC且使用过抗-PD-1/PD-L1的，对转移性疾病此前接受过不超过2种预先治疗；和/或
●患有晚期或转移性具有透明细胞成分的ccRCC且未使用过抗-PD-1/PD-L1的，此前已接受过1至2个抗血管生成疗法方案；和/或
●患有晚期或转移性具有透明细胞成分的ccRCC且使用过抗-PD-1/PD-L1的，此前已接受过1至2个抗血管生成疗法方案；和/或
●患有转移性TNBC(雌激素、黄体酮和人表皮生长因子受体2阴性)且未使用过抗-PD-1/PD-L1的，此前已接受过5次或以下治疗；和/或
●患有晚期或转移性黑色素瘤且未使用过抗-PD-1/PD-L1的，此前对转移性疾病已接受过不超过2个方案；和/或
●患有晚期或转移性黑色素瘤且使用过抗-PD-1/PD-L1的，此前对转移性疾病已接受过不超过2个方案；和/或
●患有复发/难治性DLBCL且未使用过抗-PD-1/PD-L1的，其已在自体干细胞移植后进展或不是自体干细胞移植的候选人；和/或
●患有复发/难治性DLBCL且使用过抗-PD-1/PD-L1的，其已在自体干细胞移植后进展或不是自体干细胞移植的候选人。
在某些实施方式中，本发明的抗体可用于治疗患有慢性病毒感染的对象。在一些实施方式中，本发明的抗体用于降低宿主中的病毒滴度和/或挽救耗竭的T细胞。在某些实施方式中，本发明的抗体或其片段可以用于治疗淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的慢性病毒感染。在一些实施方式中，可以以治疗剂量向人免疫缺陷病毒(HIV)或人乳头瘤病毒(HPV)或乙型/丙型病毒(HBV/HCV)感染的患者施用本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个相关的实施方式中，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段用于治疗猿猴对象(如猕猴)中的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)感染。
在某些实施方式中，可以以治疗有效量向患有癌症或病毒感染的对象施用本发明的阻断抗体。
可以使用一种或多种本发明抗体以缓解或阻止或减轻疾病或病症的一种或多种症状或病况的严重程度。
本申请还考虑向处于有发展成疾病或病症(如癌症和病毒感染)风险中的患者预防性使用本发明的一种或多种抗体。
在本发明进一步的实施方式中，本发明抗体用于制备治疗患有癌症或病毒感染的患者的药物组合物。在本发明的另一个实施方式中，将本发明的抗体作为本领域技术人员公知的用于治疗癌症或病毒感染的任意其他药剂或任意其他疗法的辅助疗法。
联用疗法和制剂
联用疗法可以包括本发明的抗-LAG3抗体和可以有利地与本发明的抗体或与本发明抗体的生物活性片段联用的任意其他治疗剂。
本发明的抗体可以与一种或多种用于治疗或抑制癌症的抗癌药或疗法协同地组合，所述癌症包括例如血癌、脑癌(例如，多形性胶质母细胞瘤)、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、骨癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、间皮瘤和黑色素瘤。本申请考虑将本发明的抗-LAG3抗体与免疫刺激和/或免疫支持疗法联用以抑制肿瘤生长和/或增强癌症患者的存活。免疫刺激疗法包括通过在被抑制的免疫细胞上“松刹车”或“踩油门”以活化免疫应答来增强免疫细胞活性的直接免疫刺激疗法。实例包括靶向其他检验点受体、免疫接种和使用佐剂。免疫支持模式可以通过促进免疫原性细胞死亡、炎症或具有促进抗肿瘤应答的其他间接作用增强肿瘤的抗原性。实例包括射线、化疗、抗血管生成剂和手术。
在不同实施方式中，可以将一种或多种本发明的抗体用于与PD-1抑制剂(例如，抗-PD-1抗体，如纳武单抗、派姆单抗、pidilizumab、BGB-A317或REGN2810)、PD-L1抑制剂(例如，抗-PD-L1抗体，如avelumab、阿特珠单抗、度伐鲁单抗、MDX-1105或REGN3504)、CTLA-4抑制剂(例如，伊匹单抗)、TIM3抑制剂、BTLA抑制剂、TIGIT抑制剂、CD47抑制剂、GITR抑制剂、另一种T细胞共抑制子或配体的拮抗剂(例如，CD-28、2B4、LY108、LAIR1、ICOS、CD160或VISTA的抗体)、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂[例如，“VEGF-Trap”如阿柏西普或US 7,087,411中所示的其他抑制VEGF的融合蛋白，或抗-VEGF抗体或其抗原结合片段(例如，贝伐单抗或雷珠单抗)或VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼)]、Ang2抑制剂(例如，nesvacumab)、转化生长因子β(TGFβ)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂(例如，厄洛替尼、西妥昔单抗)、CD20抑制剂(例如，抗-CD20抗体，如利妥昔单抗)、肿瘤特异性抗原的抗体[例如，CA9、CA125、黑色素瘤相关抗原3(MAGE3)、癌胚抗原(CEA)、波形蛋白、肿瘤-M2-PK、前列腺癌特异性抗原(PAS)、粘蛋白-1、MART-1和CA19-9]、疫苗(例如，卡介苗、癌症疫苗)、增加抗原提呈的佐剂(例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、双特异性抗体(例如，CD3xCD20双特异性抗体或PSMAxCD3双特异性抗体)、细胞毒素、化疗剂(例如，达卡巴嗪、替莫唑胺、环磷酰胺、多西他赛、阿霉素、柔红霉素、顺铂、卡铂、吉西他滨、甲氨喋呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇和长春新碱)、环磷酰胺、放疗、IL-6R抑制剂(例如，sarilumab)、IL-4R抑制剂(例如，dupilumab)、IL-10抑制剂、细胞因子(如IL-2、IL-7、IL-21和IL-15)、抗体药物缀合物(ADC)(例如，抗-CD19-DM4ADC和抗-DS6-DM4ADC)、抗炎药(例如，皮质类固醇和非甾体抗炎药)、膳食补充剂(如抗氧剂)或任意其他治疗护理联用以治疗癌症。在某些实施方式中，本发明的抗-LAG3抗体可以与包括树突状细胞疫苗、溶瘤病毒、肿瘤细胞疫苗等的癌症疫苗联用以用于加强抗肿瘤应答。可以用于与本发明的抗-LAG3抗体联用的癌症疫苗的实例包括用于黑色素瘤和膀胱癌的MAGE3疫苗、用于乳腺癌的MUC1疫苗、用于脑癌(包括多形性胶质母细胞瘤)的EGFRv3(例如，Rindopepimut)或ALVAC-CEA(用于CEA+癌症)。
在某些实施方式中，本发明的抗-LAG3抗体可以与放射疗法联合施用以产生长期持久的抗肿瘤应答和/或增强癌症患者的存活。在一些实施方式中，本发明的抗-LAG3抗体可以在向癌症患者施用放射疗法之前、同时或之后施用。例如，可以将放射疗法以一个或多个剂量向肿瘤病灶施用，然后施用一个或多个剂量的本发明的抗-LAG3抗体。在一些实施方式中，可以向肿瘤病灶局部施用放射疗法以增强患者肿瘤的局部免疫原性(辅助放射)和/或杀死肿瘤细胞(消融放射)，随后全身施用本发明的抗-LAG3抗体。例如，向脑癌患者(例如，多形性胶质母细胞瘤)施用颅内放射联合本发明抗-LAG3抗体全身施用。在某些实施方式中，可以将本发明的抗-LAG3抗体与放射疗法和化疗剂(例如，替莫唑胺)或VEGF拮抗剂(例如，阿柏西普)联合施用。
在某些实施方式中，可以将本发明的抗-LAG3抗体与一种或多种抗病毒药联合施用以治疗由LCMV、HIV、HPV、HBV或HCV引起的慢性病毒感染。抗病毒药的实例包括但不限于齐多夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、利巴韦林、洛匹那韦、依法韦仑、科比司他、替诺福韦、利匹韦林和皮质类固醇。
可以在本发明的抗-LAG3抗体施用之前、同时或之后施用其他治疗性活性剂/成分。对于本申请的目的而言，将此类施用方案认为是抗-LAG3抗体与第二治疗性的活性成分“联用”。
可以在施用本发明的抗-LAG3抗体之前向对象施用其他治疗性活性成分。例如，如果第一成分在第二成分施用的1周前、72小时前、60小时前、48小时前、36小时前、24小时前、12小时前、6小时前、5小时前、4小时前、3小时前、2小时前、1小时前、30分钟前、15分钟前、10分钟前、5分钟前或少于1分钟前施用，则认为第一成分可在第二成分“前”施用。在其他实施方式中，其他治疗活性成分可在施用本发明的抗-LAG3抗体后施用于对象。例如，如果第一成分在第二成分施用1分钟后、5分钟后、10分钟后、15分钟后、30分钟后、1小时后、2小时后、3小时后、4小时后、5小时后、6小时后、12小时后、24小时后、36小时后、48小时后、60小时后、72小时后施用，则认为第一成分在第二成分“后”施用。在其他实施方式中，可将其他治疗活性成分在施用本发明的抗-LAG3抗体同时施用于对象。就本发明而言，“同时”施用包括将例如抗-LAG3抗体和其他治疗活性成分在单一剂型中(例如，共制剂)施用于对象或在分开的剂型中在约30分钟或彼此更短的时间内施用于对象。如果以分开的剂型施用，每个剂型可经由相同的途径施用(例如，抗-LAG3抗体和其他治疗活性成分两者可静脉内、皮下施用等)；或者，每种剂型可经由不同的途径施用(例如，抗-LAG3抗体可静脉内施用，而其他治疗活性成分可皮下施用)。就本公开内容而言，在任何事件中，成分在单一剂型中的施用、通过相同途径的不同剂型中的施用或通过不同途径以不同剂型施用都认为是“同时施用”。就本公开内容而言，抗-LAG3抗体在其他治疗活性成分施用“前”、“同时”或“后”(如上述本申请中定义的那些术语)施用认为是抗-LAG3抗体与其他治疗活性成分“联合”施用。
本发明包括药物组合物，其中本发明的抗-LAG3抗体与本申请中其他部分所述的一种或多种其他治疗活性成分共配制。
在本发明的抗-LAG3抗体与PD-1抑制剂(例如，如在US 2015/0203579中公开的抗-PD-1抗体，其全部内容通过引用并入本申请)联合施用的示例性实施方式中，包括施用包含抗-LAG3抗体和PD-1抑制剂的共制剂，可以向对象施用每个成分和/或使用各种剂量组合的共制剂。因此，本发明包括(i)本发明的抗-LAG3抗体和(ii)PD-1抑制剂(例如，如在US2015/0203579中公开的抗-PD-1抗体，其全部内容通过引用并入本申请)的组合同时、单独和/或顺序地用于治疗癌症或病毒感染。例如，可以以选自下组的量分别向对象施用抗-LAG3抗体和PD-1抑制剂(例如，抗-PD-1抗体)和/或将其包含在共制剂中：0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg和10.0mg。可以根据本申请其他部分中公开的任意施用方案向对象施用组合和/或共制剂，包括例如每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次等等。例如，本发明的抗-LAG3抗体可以以约0.8至约11、约1至约10、约3至约10、约1、约3或约10mg/kg的剂量与以3至5或约3.0mg/kg剂量的PD-1抑制剂(例如，在US 2015/0203579中公开的抗-PD-1抗体)同时施用。可以例如每14天、21天或28天进行一次同时施用。
在本发明的抗-LAG3抗体与VEGF拮抗剂(例如，VEGF trap，如阿柏西普)联合施用的示例性实施方式中，包括施用包含抗-LAG3抗体和VEGF拮抗剂的共制剂，可以向对象施用每个成分和/或使用各种剂量组合的共制剂。例如，可以以选自下组的量向对象施用抗-LAG3抗体和/或将其包含在共制剂中：0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg和10.0mg；以及可以以选自下组的量向对象施用VEGF拮抗剂(例如，VEGF trap，如阿柏西普)和/或将其包含在共制剂中：0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg和3.0mg。可以根据本申请其他部分中公开的任意施用方案向对象施用组合和/或共制剂，包括例如每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次等等。
给药方案
根据本发明的某些实施方式，可以在一个规定的时间范围内向对象施用多剂量的抗-LAG3抗体(或包含抗-LAG3抗体与本申请提及的任意其他治疗性活性剂的组合的药物组合物)。根据本发明这一方面的方法包括顺序地向对象施用多剂量的本发明的抗-LAG3抗体。在本申请使用的“顺序地施用”指在不同的时间点向对象施用各剂量的抗-LAG3抗体，例如在由预定的间隔(例如，小时、天、周或月)分隔的不同天。本发明包括包含顺序地向患者施用单一初始剂量的抗-LAG3抗体，随后一个或多个第二剂量的抗-LAG3抗体，以及任选地随后一个或多个第三剂量的抗-LAG3抗体的方法。可以以0.1mg/kg至100mg/kg对象体重之间的剂量施用抗-LAG3抗体。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”指施用本发明的抗-LAG3抗体的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；以及“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。初始、第二和第三剂量可以均含有相同量的抗-LAG3抗体，但是通常在施用频率方面其彼此之间可以是不同的。然而，在某些实施方式中，在治疗过程中，在初始、第二和/或第三剂量中所含的抗-LAG3抗体的量彼此之间可以彼此有所不同(例如，适当地上调或下调)。在某些实施方式中，在治疗方案开始时施用两个或多个(例如，2、3、4或5)剂量作为“负荷剂量”，随后降低频率施用后续剂量(例如，“维持剂量”)。
在某些实施方式中，在初始、第二和/或第三剂量中所含的抗-LAG3抗体的量可以是次优的或亚治疗的。本申请中使用的术语“亚治疗的”或“次优的”指在较低的以至于不能产生治疗作用的水平下或者低于治疗疾病(如癌症)所必需的水平下施用的抗体剂量。
在本发明的一个示例性实施方式中，在紧邻的上一次剂量给药后的1至26周(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、5、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多周)给予各第二和/或第三剂量。在本申请中使用的短语“紧邻的上一次剂量”指，在多次给药的顺序中，在所述顺序中的紧接的下一个剂量给药之前给予患者的抗-LAG3抗的剂量，在中间没有插入剂量。
根据本发明这一方面的方法可以包括向患者施用任意数量的第二和/或第三剂量的抗-LAG3抗体。例如，在某些实施方式中，仅向患者施用单一的第二剂量。在其他实施方式中，向患者施用两个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8个或更多个)第二剂量。同样地，在某些实施方式中，仅向患者施用单一的第三剂量。在其他实施方式中，向患者施用两个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8个或更多个)第三剂量。
在涉及多个第二剂量的实施方式中，可以以与其他第二剂量相同的频率施用各第二剂量。例如，各第二剂量可以在所述紧邻的上一次剂量给予后1至2周或者1-2个月给予患者。类似地，在涉及多个第三剂量的实施方式中，可以以与其他第三剂量相同的频率施用各第三剂量。例如，各第三剂量可以在所述紧邻的上一次剂量给予后2至12周给予患者。或者，给予患者的所述第二和/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中改变。在治疗过程中还可以由医师在临床检查后根据个体患者的需要调整给药频率。
抗体的诊断用途
本发明的抗-LAG3抗体还可以用于检测和/或测量样品中的LAG3，例如用于诊断目的。一些实施方式预期在测定中使用本发明的一种或多种抗体以检测疾病或病症如癌症、自身免疫性疾病或病毒感染。用于LAG3的示例性诊断测定包括例如使用本发明的抗-LAG3抗体接触从对象(例如，患者)获得的样品，其中使用可检测的标记或报告分子标记抗-LAG3抗体或作为捕获配体用以选择性地从对象样品分离LAG3。或者，在诊断应用中可以将未标记的抗-LAG3抗体与其本身是被可检测地标记的第二抗体联用。可检测的标记或报告分子可以是放射性同位素、如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光的部分如荧光素异硫氰酸酯或罗丹明；或酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。能够用于检测或测量样品中的LAG3的特异性的示例性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。
能够用于根据本发明的诊断测定中的样品包括从患者中获得的任何组织或液体样品，在正常或生理条件下其中包含可检测量的LAG3蛋白或其片段。一般而言，先测量从健康患者获得的特定样品中的LAG3蛋白水平(例如，未受癌症或自身免疫性疾病所扰的患者)以建立基线或标准LAG3水平。随后可以将该LAG3基线水平与从疑似具有癌症相关病况或与该病况相关的症状的个体获得的样品中测量的LAG3水平进行比较。
特异性针对LAG3的抗体可不包含其他标记或部分，或其可包含N-末端或C末端的标记或部分。在一个实施方式中，标记或部分是生物素。在结合测定中，标记(如果存在的话)的位置可确定肽相对肽与之结合的表面的方向。例如，如果表面以抗生物素蛋白涂覆，包含N末端生物素的肽将定向，从而肽的C末端部分将远离表面。
本发明的方面涉及本公开的抗体作为用于在患者中预测诊断癌症或病毒感染的标记物的用途。可以将本发明的抗体用于诊断检测以便在患者中评估癌症的预后和预测存活情况。
实施例
阐述下述实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且其并非旨在限制发明人所认为的其发明的范围。已作出努力以确保关于所使用数字的准确性(例如数量、温度等)，但是应对一些实验误差和偏差予以考虑。除非另外指出，份数以重量份计、分子量是平均分子量、温度是摄氏度、室温为约25℃且压力是处于或接近大气压。
实施例1：针对LAG3的人源抗体的产生
使用与小鼠Fc区偶联的GenBank登录号NP_002277.4(SEQ ID NO：582)范围从约氨基酸29–450的LAG3片段生产针对LAG3的人源抗体。免疫原与佐剂一起直接向如US8502018B2中所述的小鼠(即，包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的经基因工程改造的小鼠)或向如WO 2013022782中所述的人源化通用轻链(ULC)小鼠施用以刺激免疫应答。通过LAG3特异性免疫测定监测抗体的免疫应答。当产生了所需要的免疫应答时，收集脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其活力并形成杂交瘤细胞系。对杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴定生产LAG3-特异性抗体的细胞系。使用这项技术以及上文所述的免疫原获得了若干抗-LAG3嵌合抗体(即具有人源可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)；将使用这种方法在小鼠中产生的示例性抗体命名为H1M14985N、H1M14987N、H2M14811N、H2M14885N、H2M14926N、H2M14927N、H2M14931N、H2M18336N、H2M18337N和H4H14813N。
如US专利7,582,298中所描述的，还直接从抗原阳性B细胞(来自任意经免疫的小鼠)分离抗-LAG3抗体，无需与骨髓瘤细胞融合，其全部内容特别地通过引用并入本申请。使用这种方法，获得了若干种全人抗-LAG3抗体(即，具有人源可变结构域和人源恒定结构域的抗体)；将使用这种方法产生的示例性抗体命名如下：H4H15477P、H4H15483P、H4H15484P、H4H15491P、H4H17823P、H4H17826P2、H4H17828P2、H4sH15460P、H4sH15462P、H4sH15463P、H4sH15464P、H4sH15466P、H4sH15467P、H4sH15470P、H4sH15475P、H4sH15479P、H4sH15480P、H4sH15482P、H4sH15488P、H4sH15496P2、H4sH15498P2、H4sH15505P2、H4sH15518P2、H4sH15523P2、H4sH15530P2、H4sH15555P2、H4sH15558P2、H4sH15567P2和H4H17819P。
示例性抗体H4sH15496P2、H4sH15498P2、H4sH15505P2、H4sH15518P2、H4sH15523P2、H4sH15530P2、H4sH15555P2、H4sH15558P2和H4sH15567P2由ULC小鼠的B细胞产生。
在下述的实施例中详细描述了根据该实施例的方法产生的示例性抗体的生物学性质。
实施例2：重链和轻链可变区氨基酸和核苷酸序列
表1中列出了所选定的本发明的抗-LAG3抗体的重链和轻链可变区以及CDR的氨基酸序列标识。相应的核酸序列标识如表2中所示。
表1：氨基酸序列标识
表2：核酸序列标识
在本申请中的抗体通常根据下述命名法：Fc前缀(例如“H1H”、“H4sH”、“H4H”等)，随后为数字标识(例如“14813”、“17828”等，如表1中所示)，随后为“P”、“P2”或“N”后缀。因此，根据这种命名法，可以将本申请中的抗体称为例如“H4sH14813N”、“H4H17819P”、“H4H17828P2”等。在本申请中使用的抗体命名中的H4sH和H4H前缀表示抗体同种型的特定Fc区。例如，“H4sH”抗体具有带有2个或更多个氨基酸改变的人源IgG4Fc(如US20140243504中所公开的，其全部内容并入本申请)、“H4H”抗体具有在铰链区中丝氨酸突变为脯氨酸(S108P)的人源IgG4Fc、“H1M”抗体具有小鼠IgG1Fc以及“H2M”抗体具有小鼠IgG2Fc(由抗体名称中的第一个“H”表示所有可变区是全人的)。本领域的普通技术人员将理解，可以将具有特定Fc同种型的抗体转换为具有不同Fc同种型的抗体(例如，可以将具有小鼠IgG1Fc的抗体转换为具有人源IgG4的抗体等等)，但是无论如何，以表1中显示的数字标识表示的可变结构域(包括CDR)将是保持不变的，并且无论Fc结构域的性质如何，预计其与抗原的结合性质将是相同的或基本上相似的。
在某些实施方式中，所选择的具有小鼠IgG1Fc的抗体转换为具有人IgG4Fc的抗体。在某些实施方式中，抗体包含具有2个或更多个氨基酸改变的人源IgG4Fc(如US20100331527中所公开的，其全部内容并入本申请)。在一个实施方式中，IgG4Fc结构域包含在铰链区中丝氨酸突变为脯氨酸(S108P)以促进二聚体稳定化。在某些实施方式中，本发明抗体的Fc区包含SEQ ID NO：569、570、571、572或573所示的氨基酸序列。表3显示了所选择的具有人源IgG4Fc的抗-LAG3抗体的重链和轻链序列的氨基酸序列标识。
表3：重链和轻链氨基酸序列标识
表3中的每条重链序列包含可变区(VH或HCVR；包含HCDR1、HCDR2和HCDR3)和恒定区(包含CH1、CH2和CH3结构域)。表3中的每条轻链序列包含可变区(VL或LCVR；包含LCDR1、LCDR2和LCDR3)和恒定区(CL)。SEQ ID NO：577包含HCVR和恒定区，所述HCVR包含氨基酸1-123和所述恒定区包含氨基酸124-449。SEQ ID NO：578包含LCVR和恒定区，所述LCVR包含氨基酸1-107和所述恒定区包含氨基酸108-214。SEQ ID NO：579含有HCVR和恒定区，所述HCVR包含氨基酸1-123和所述恒定区含有氨基酸124-450。SEQ ID NO：580含有HCVR和恒定区，所述HCVR包含氨基酸1-119和所述恒定区含有氨基酸120-445。SEQ ID NO：581含有LCVR和恒定区，所述LCVR包含氨基酸1-107和所述恒定区含有氨基酸108-214。
在下述实施例中使用的对照构建体
在下述实验中包括两个对照构建体(抗-LAG抗体)用于比较目的：“比较抗体1”，根据WO2010/019570的具有抗体“25F7”的VH/VL序列的针对LAG3的人源单克隆抗体；以及“比较 抗体2”，具有根据US2014/0093511的抗体“v3.5”的VH/VL序列的针对LAG3的人源单克隆抗体。
实施例3：通过表面等离子体共振确定的与LAG3结合的抗体
在BiaCore 4000或BiaCore T200仪器上使用实时表面等离子体共振生物传感器测定确定纯化的抗-LAG3抗体结合至抗原的结合缔合和解离速率常数(分别为ka和kd)、平衡解离常数和解离半衰期(分别为kD和t1/2)。使用多克隆家兔抗-小鼠抗体(GE，#BR-1008-38)或使用单克隆小鼠抗-人Fc抗体(GE，#BR-1008-39)将Biacore传感器表面衍生化以捕获约50-85RU的抗-LAG3单克隆抗体，其分别以小鼠Fc或人源Fc表达。测试了与抗-LAG3抗体结合的LAG3试剂，包括表达C-末端myc-myc六组氨酸标签的重组人LAG3(hLAG3-mmh；SEQ ID：574)和表达C-末端小鼠IgG2a mFc标签的重组人LAG3(hLAG3-mFc；SEQ ID：575)。在BiaCoreT200上以50μL/min的流速将不同浓度(50、25、12.5和6.25nM)的LAG3试剂注射至已捕获了抗-LAG3单克隆抗体的表面上。在HBST运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mMEDTA，0.05％v/v表面活性剂P20)中监测4分钟LAG3试剂与所捕获的单克隆抗体的结合，同时监测10分钟从抗体上的解离。实验在25℃和37℃下进行。通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将数据加工和拟合为1:1结合模型确定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。然后，根据动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：KD(M)＝kd/ka和t1/2(min)＝[ln2/(60*kd)]。
在25℃和37℃下不同抗-LAG3单克隆抗体结合至单体(具有mmH标签)或二聚体(具有mFc标签)LAG3试剂的结合动力学参数如表4-7中所示。
表4：在25℃下抗-LAG3单克隆抗体结合至人源LAG3-mmh的结合动力学参数
*NB表示在实验条件下，LAG3试剂不与所捕获的抗-LAG3单克隆抗体结合。
表4显示了在25℃下所有本发明的抗-LAG3抗体以范围从49pM至10nM的KD值结合至hLAG3-mmh，而比较抗体以0.58nM和0.8nM的KD值结合。
表5：在37℃下抗-LAG3单克隆抗体结合至hLAG3-mmh的结合动力学参数
*NB表示在实验条件下，LAG3试剂不与所捕获的抗-LAG3单克隆抗体结合。
表5显示了在37℃下所有本发明的抗-LAG3抗体以范围从32pM至7.66nM的KD值结合至hLAG3-mmh，而比较抗体以2.1nM和3.0nM的KD值结合。
表4和表5中的数据表明在25℃和37℃下所有抗-LAG3抗体以非常类似的亲和性与单体hLAG3-mmh结合。
表6：在25℃下抗-LAG3单克隆抗体结合至hLAG3二聚体(hLAG3-mFc)的结合动力学参数
*NB表示在实验条件下，LAG3试剂不与所捕获的抗-LAG3单克隆抗体结合。
表6显示了在25℃下所有本发明的抗-LAG3抗体以范围从4.3pM至1.0nM的KD值结合至hLAG3二聚体，而比较抗体以97pM和0.16nM的KD值结合。
表7：在37℃下抗-LAG3单克隆抗体结合至hLAG3二聚体(hLAG3-mFc)的结合动力学参数
*NB表示在实验条件下，LAG3试剂不与所捕获的抗-LAG3单克隆抗体结合。
表7显示了在37℃下所有本发明的抗-LAG3抗体以范围从4.0pM至0.9nM的KD值结合至hLAG3二聚体，而比较抗体以0.26nM和0.45nM的KD值结合。
表6和表7中的数据表明在25℃和37℃下所有抗-LAG3抗体以非常类似的亲和性与hLAG3二聚体试剂结合。
实施例4：抗-LAG3抗体之间的Octet交叉竞争
为了评估是否两种抗体彼此之间竞争结合至单体人源LAG3(hLAG3.mmh)，在OctetRED384生物传感器(Pall ForteBio Corp.)上使用实时、无标记生物层干涉量度测定抗-LAG3单克隆抗体之间的结合竞争。交叉竞争实验在25℃下在0.01M HEPES pH7.4，0.15MNaCl，0.05％v/v表面活性剂吐温-20，0.1mg/ml BSA(Octet HBS-P缓冲液)中，以1000rpm的速度振摇板的条件下进行。所检测的所有抗-LAG3抗体和hLAG3溶液均在Octet HBS-P缓冲液中制剂。为了评估2种抗体是否能够彼此之间竞争地结合至hLAG3，首先作用75秒将约～0.6-0.85nm hLAG3.mmh从含有5μg/mL hLAG3的孔中捕获至抗-His包被的Octet生物传感器尖端。通过将捕获了hLAG3的Octet生物传感器尖端浸入含有5μg/mL第一抗-LAG3单克隆抗体(下文中称为mAb-1)的孔中5分钟使其饱和，随后将其浸入含有第二抗-LAG3单克隆抗体(下文中称为mAb-2)的孔中。在每步之间在HBS-P缓冲液中洗涤Octet生物传感器尖端30秒。
在实验过程中监测实时结合应答并记录每步结束时的结合应答。针对背景结合对hLAG3结合至mAb-1然后结合至阻断mAb的应答进行校正，比较并确定不同抗-Lag单克隆抗体的竞争/非竞争行为。
表8明确定义了在这两个方向上抗体竞争的关系，其与结合顺序无关。
表8：针对结合至单体hLAG3抗-LAG3抗体的交叉竞争
(*未列出自我竞争的mAb2)
实施例5：通过流式细胞术确定的结合至过表达LAG3的细胞的抗体
开发了在细胞表面上表达重组hLAG3(NCBI登录号NP_002277.4)或猴LAG3(mfLAG3)[对食蟹猴序列NCBI登录号XP_005570011.1进行进一步修饰根据猕猴(Macacamulata)序列NCBI登录号XP_001108923.1使用脯氨酸替代其74位氨基酸的“X”](SEQ IDNO：576)的HEK293细胞(HEK293；ATCC，#CRL-1573)的稳定细胞系并使用上述稳定细胞系以通过流式细胞术分析确定本发明的抗-LAG3单克隆抗体的结合特异性。
按照如下所示评估抗-LAG3抗体的结合：使用1x D-PBS(Irvine Scientific目录号#9240)洗涤稳定表达hLAG3或mfLAG3的稳定的HEK293细胞，胰酶消化(Specialty Media目录号#SM-2004-C)并使用HEK293细胞培养基(DME+10％FBS+P/S/G+非必需氨基酸)阻断。离心后，以2.0x106个细胞/mL将细胞在染色缓冲液(D-PBS+2％FBS)中重悬。将抗-LAG3抗体和同种型对照在染色缓冲液中以5pM至100nM的剂量范围连续稀释，包括不含抗体仅含缓冲液的对照。将连续稀释的抗体加入细胞悬液中并在冰上孵育15-30分钟。将细胞离心并使用染色缓冲液洗涤细胞球团以除去未结合的抗体。随后，将细胞与识别人Fc的与同别藻蓝蛋白(APC)偶联的二级F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch,#109-136-170)在冰上孵育15-30分钟。将细胞离心并使用染色缓冲液洗涤细胞球团以除去未结合的二级F(ab’)2并使用Cytofix(BD Biosciences,#554655)与染色缓冲液按照1:1稀释固定过夜。次日，将固定的细胞离心并使用染色缓冲液洗涤细胞球团，重悬和过滤。在细胞仪上采集荧光测量结果并在ForeCytTM(IntelliCyt；Albuquerque,NM)中分析以确定平均荧光强度(MFI)。使用GraphPad Prism从11点应答曲线的四参数logistic方程计算EC50值。将EC50定义为检测到最大结合信号的50％时的抗体浓度。通过将在抗体浓度100nM时的MFI除以抗体浓度0nM时的MFI计算每个抗体的MFI比率。
表9：通过FACS确定的抗-LAG3抗体与HEK293野生型(wt)细胞的结合
如表9中所示，通过FACS分析，比较和同种型对照未显示出任何可测量的与亲本野生型HEK293细胞的结合。经计算的MFI比率范围为1.0至1.6x之间。少数抗-LAG3抗体显示出在野生型细胞上较高的比率，提示存在非特异性结合，其经计算的MFI比率范围为0.9至8.2x之间。在这些染色条件下，未确定抗-LAG3抗体以及比较抗体的EC50值。
表10：通过FACS确定的抗-LAG3抗体与HEK293/hLag3细胞的结合
如表10中所示，同种型对照未显示出任何可测量的与HEK293/hLag3细胞的结合。全部15个本发明的抗-LAG3抗体显示出与HEK293/hLag3细胞的显著结合，其EC50值的范围从300pM至7.9nM。经计算的MFI比率的范围从62-414x。在结合测定中比较的EC50值为0.65nM和0.75nM以及针对这两个抗体的MFI比率小于200x。
表11：通过FACS确定的抗-LAG3抗体与HEK293/mfLag3细胞的结合
如表11中所示，同种型对照未显示出任何可测量的与HEK293/mfLag3细胞的结合。在15个本发明的抗-LAG3抗体中共计有13个抗体显示出与HEK293/mfLag3细胞的显著结合，其EC50值的范围从900pM至大于10nM。经计算的MFI比率范围从8.8x至21.5x。比较抗体的EC50值大于10nM且经计算的MFI比率为6.7x和8.6x。
实施例6：通过电化学发光免疫测定确定的结合至过表达LAG3的细胞的抗体
为考察一组抗-LAG3单克隆抗体结合表达LAG3的细胞表面的能力，在基于电化学发光的检测平台上[Meso Scale Diagnostics,Rockville,MD–(MSD)]开发了一种利用猴表达人和LAG3的细胞系的体外结合测定。
通过慢病毒转导以表达重组hLAG3(NCBI登录号NP_002277.4)或猴LAG3(mfLAG3)[食蟹猴(Macaca fascicularis)序列登录号XP_005570011.1，经修饰后其74位氨基酸“X”被基于猕猴(Macaca mulata)序列NCBI登录号XP_001108923.1的脯氨酸取代](SEQ ID NO：576)产生HEK293(ATCC,#CRL-1573)稳定细胞系。将亲代HEK293细胞系包括在实验中作为背景结合对照，该细胞系通过荧光活化细胞分选(FACS)无可检测的LAG3表达。包括无关人源IgG4和hIgG4作为同种型对照抗体。
根据下述程序进行实验。将来自上文所述三种细胞系的细胞在不含Ca2+/Mg2+的1xPBS缓冲液中洗涤1次，随后使用无酶细胞解离液在37℃下孵育10分钟。使用含Ca2+/Mg2+的1xPBS洗涤分离的细胞1次并使用CellometerTM Auto T4细胞计数仪(NexcelomBioscience)计数。将在细胞洗涤缓冲液中以约10,000个细胞每孔接种到96孔碳电极板中(MULTI-ARRAY高结合板，MSD)并在37℃下孵育1小时以使细胞贴壁。使用含2％BSA(w/v)的PBS在室温下孵育1小时阻断非特异性结合位点。以双复孔的形式向与板结合的细胞中加入范围从1.7pM至100nM连续稀释的抗-LAG3抗体溶液以及不存在所加入的抗体的溶液，并将板在室温下孵育1小时。然后使用AquaMax2000洗板仪(MDS Analytical Technologies)洗板以除去未结合的抗体。使用与SULFO-TAGTM偶联的抗-人IgG抗体(MSD)在室温下作用1小时检测与板结合的抗体。洗涤后，根据生产厂商推荐的程序使用读取缓冲液(MSD)将板显色并使用SECTOR Imager 6000(MSD)仪器记录发光信号。作为抗体浓度的函数对直接结合信号(相对光单位-RLU)进行分析并使用GraphPad PrismTM软件通过sigmoidal(4参数logistic)剂量应答模型对数据进行拟合。通过计算EC50确定每个抗体的效价。将结合HEK293-hLAG3和HEK293-mfLAG3细胞的EC50定义为检测到最大结合信号的50％时的抗体浓度。将所检测到的100nM抗体结合至HEK293-hLAG3或HEK293-mfLAG3细胞对比HEK293亲代细胞的信号比作为LAG3结合特异性的指示。对于在最高抗体浓度下(100nM)低于2倍的比率，推断抗体是非特异性的(NS)。
结合结果汇总在表12中。
表12：结合至过表达hLAG3或mfLAG3的细胞的抗体
NS＝非特异性-在100nM抗体时比率<2
如表12中所示，抗体与HEK293-hLAG3细胞结合的效价范围为EC50值从690pM至52nM，所有抗体均具有特异性结合，使用100nM抗体结合时，与表达人LAG3细胞的结合大于与亲本HEK293细胞的2倍。仅一些抗体以从7.9nM至74nM的EC50与HEK293-mfLAG3细胞特异性结合。在HEK293-hL与至HEK293-mfLag3细胞的特异性结合。如所预期的，无关对照与HEK293-hLAG3和HEK293-mfLAG3细胞的结合不具有特异性，H4H同种型对照和H4sH同种型对照以高于与HEK293亲本细胞的结合0.7-1.1倍的比率范围与HEK293-hLAG3和HEK293-mfLAG3细胞结合。
实施例7：在细胞粘附测定中阻断LAG3结合至II类MHC
使用细胞粘附测定测量抗-LAG3单克隆抗体阻断表达人MHC II或小鼠MHC II的细胞(分别为RAJI和A20细胞)粘附至附着在酶标板上的表达hLAG3的HEK293细胞的能力(基于Huard等，在Eur J Immunol.1995,25:2718-21中描述的测定)。
HEK293(ATCC,#CRL-1573)经慢病毒转导以表达重组hLAG3(NCBI登录号NP_002277.4)或小鼠LAG3(mLAG3)(GenBank登录号NP_032505.1)从而生成HEK293稳定细胞系。亲本HEK293细胞系经荧光活化细胞分选(FACS)技术确认无可检测的人LAG3表达，其用于证明表达MHC II的RAJI和A20细胞的粘附需要LAG3。
根据下述程序进行实验：使用1X PBS洗涤亚融合的表达HEK293-hLAG3的细胞1次、胰酶消化以及1,200rpm离心5分钟。将细胞球团重悬在1X PBS中，然后计数以确定细胞数。分离适宜数量的细胞并重悬在完全培养基(DME+10％FBS+青霉素/链霉素/谷氨酰胺)中，以使得每孔含有100μL 1.2^4个细胞。将细胞接种在无菌NunclonTMDelta 96-孔微孔TM黑色光学底培养板(Thermo Scientific)上。在测定设计中未包括板周边的孔以避免边缘效应。在周边的孔中加入100μL 1xPBS以代替细胞。将接种的HEK293-hLAG3细胞在37℃、5％CO2条件下孵育过夜。孵育后，使用抗-LAG3抗体和同种型对照处理这些细胞。
处理当天，将所有抗体在RPMI培养基(不含FBS或加入的补充物)中连续稀释(1:3)。在45pM至300nM范围内进行9点稀释，最后一个稀释点不含mAb。为了在使用RAJI细胞的粘附测定中检测H4sH抗体在23pM至150nM范围内对其进行9点稀释，最后一个稀释点不含mAb。将终体积50μL的抗-LAG3抗体或同种型对照加入HEK293-hLAG3细胞并在37℃、5％CO2条件下孵育1小时。在将接种的HEK293-LAG3细胞与待测或对照抗体孵育的同时，使用下述程序用钙黄绿素(Calcein AM)标记未粘附的B细胞(RAJI或A20)。收集RAJI和A20悬浮细胞并在1,200rpm下离心5分钟。将细胞球团重悬在1X PBS中并计数。使用RPMI洗涤细胞并使用RPMI以106个细胞每1mL的浓度将细胞重悬。通过每1mL细胞悬液加入5μL Calcein AM标记细胞并在37℃、5％CO2条件下孵育30分钟。使用RPMI洗涤标记细胞1次，离心，使用1X PBS洗涤并使用PBS以5x106个细胞每1mL的浓度将细胞重悬。随后，在每1mL Calcein AM标记细胞中加入10μL BD Pharmingen Fc封闭抗体(0.5mg/mL)，在RT下孵育10分钟。以3x106个细胞每1mL的终浓度将经Calcein AM-染色的、Fc-封闭的RAJI或A20细胞重悬在RPMI中，随后将其用于粘附测定。
在使用LAG3抗体处理HEK293-LAG3细胞1小时结束时，以1.5x105个细胞/孔的密度将50μl标记的RAJI或A20细胞加入各孔中。将标记的悬浮细胞与HEK293单层在37℃、5％CO2条件下孵育1小时。通过使用RPMI轻柔洗涤孔4次洗去未粘附的细胞，每次洗涤后用纸巾吸干板，随后使用PBS洗涤2次。向各孔中加入终体积200μl PBS，在VICTORTM X5多标记酶标仪上在485nm/535nm激发/发射波长下读取Calcein AM荧光。使用GraphPad Prism通过9点应答曲线使用4参数logistic方程计算IC50值。将IC50定义为观察到阻断50％HEK细胞对RAJI或A20细胞的粘附时的抗体浓度。
使用基于细胞的粘附测定评估了抗-LAG3抗体阻断LAG3与人和小鼠MHC II结合的能力。该测定使用了荧光标记的内源性表达MHC II的细胞(人MHC II(RAJI)或小鼠MHC II(A20))与经工程化改造以表达人LAG3的细胞之间结合的形式。评估了LAG3抗体阻断这种相互作用的能力，结果如表13中所示。
表13：阻断RAJI和A20细胞粘附至HEK293-hLAG3细胞的抗-LAG3抗体的IC50值
如表13中所示，同种型对照未显示出任何可检测的阻断RAJI或A20细胞与HEK293-hLAG3细胞的结合。在最高抗体浓度下所有本发明的LAG3抗体阻断92-98％的RAJI或A20细胞粘附至HEK293-hLAG3细胞，针对RAJI细胞至HEK293-hLAG3细胞的粘附其IC50值范围从2.5nM至31nM和针对A20细胞至HEK293-hLAG3细胞的粘附其IC50值范围从3.6nM至30nM。比较抗体针对RAJI细胞至HEK293-Lag3细胞的粘附IC50值为3.4nM和7.2nM以及针对A20细胞至HEK293-Lag3细胞的粘附IC50值为5.1nM和9.6nM。
实施例8：在T细胞/APC荧光素酶报告基因测定中阻断LAG3诱导的T细胞下调
通过刺激识别由抗原提呈细胞(APC)上的I类或II类主要组织相容性复合物(MHCI或MHC II)蛋白提呈的特定肽的T细胞受体(TCR)实现T细胞活化(Goldrath等，1999,Nature 402,255-262)。活化的TCR继而启动信号传导事件的级联，可以通过由转录因子(如活化蛋白1(AP-1)、活化的T细胞的核因子(NFAT)或活化的B细胞的核因子κ轻链增强子(NFκB))驱动的报告基因对其进行监测。通过T细胞上组成性地表达的或可诱导地表达的共受体的参与来改善T细胞应答。一个这样的受体是LAG3，其是T细胞活性的负性调节子。LAG3与在靶细胞上(包括APC或癌细胞在内)表达的其配体MHC II相互作用，以及通过关闭由TCR信号体启动的阳性信号来抑制T细胞活化(Workman等，2002,J Immunol 169:5392-5395)。
为了鉴定抗-LAG3抗体在T细胞中拮抗LAG3介导的信号传导的能力，开发了LAG3T细胞/APC报告基因检测法来测量由APC和T细胞之间的相互作用诱导的T细胞信号传导，其利用来自两种哺乳动物细胞系：源自Jurkat的T细胞(克隆JRT3.T3.5，如下文所述)和HEK293背景下的经工程改造的APC(如下文所述)的混合培养物(图1)。
对于第一种组分，用于LAG3T细胞/APC报告基因生物测定的T细胞系的建立如下：首先，根据生产厂商的说明，使用Cignal Lenti AP-1Luc报告基因(Qiagen–Sabiosciences,#CLS-011L)转导源自Jurkat的T细胞克隆JRT3.T3.5(ATCC,#TIB-153)。慢病毒编码在最小CMV启动子控制下的萤火虫萤光素酶基因、TPA诱导转录应答元件(TRE)的串联重复和嘌呤霉素抗性基因。经抗生素选择后，通过使用人CD28(NP_006130.1)、Ob2F3TCRα和β亚基(αAGA92550.1βAAA61026.1)、人LAG3嵌合体(包含人LAG3的胞外域(NP_002277.4)和人CD300a的跨膜/胞质结构域(从181至299的氨基酸；登录号NP009192.2))以及人PD-1(登录号NP_005009.2)进行转导进一步操纵具有嘌呤霉素抗性的报告细胞池。在各轮转导后通过FACS分析确证蛋白的表达。随后生成单克隆JRT3.T3/AP1-Luc/CD28/hLAG3-CD300a嵌合体/hPD-1克隆2D2并将其用于T细胞/APC报告基因测定。将细胞维持在补充了100μg/mL潮霉素+500μg/mL G418+1μg/mL嘌呤霉素的RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素/谷胺酰胺(P/S/G)中，在此处将其称为选择培养基。在本申请中将这些细胞称为报告T细胞。
对于第二种组分，用于LAG3T细胞/APC报告基因生物测定的APC细胞系的建立如下：使用人MHC II亚基、HLA-DR2A(NP_061984.2)和HLA-DR2B(NP_002115)转导表达人CD20(编号NP_068769.2)的稳定的HEK293细胞系(ATCC,#CRL-1573)。通过FACS分离HLA-DR2阳性细胞并将所得到的细胞系HEK293/CD20/HLA-DR2保持在补充了100μg/mL潮霉素+500μg/mLG418的DME+10％+P/S/G+非必需氨基酸中，在此处将其称为选择培养基。在本申请中将这些细胞称为APC细胞。
为了将T细胞和APC关联以启动TCR信号传导，使用两种方法：(1)双特异性模式；以及(2)肽脉冲模式。在这种生物测定中，抗-LAG3抗体阻断LAG3/MHC II相互作用并通过将由CD300a分子的胞质尾递送的抑制性信号传导失能以及随后增加AP1-Luc信号传导挽救T细胞活性。通过荧光素酶读数监测T细胞活化情况。
双特异性模式：在该模式中，使用由与T细胞上的CD3结合的一个Fab臂和与HEK293细胞上的CD20结合的另一个Fab臂组成的双特异性抗体(CD3xCD20双特异性抗体；例如，如US20140088295中所公开的)。双特异性分子的存在导致由于在经工程改造的T细胞上CD3分子成簇从而形成免疫突触和TCR复合物活化。
在筛选前一天，将经工程改造的报告T细胞以5x105个细胞/mL在选择培养基中培养并在次日进行生物测定检测。在固定浓度的CD3xCD20双特异性抗体(100pM)存在下确定抗-LAG3抗体的EC50值。以下述顺序加入试剂。在补充了10％FBS和青霉素/链霉素/谷氨酰胺的RPMI1640(测定培养基)中连续稀释抗-Lag3抗体和同种型对照。10点稀释的范围在15pM至100nM之间，最后一个稀释点不含mAb，仅含缓冲液作为对照。将连续稀释的抗体加入含有固定浓度(100pM)双特异性抗体的96孔白色平底板的相应孔中。以2x106/mL将培养过夜的报告T细胞重悬在测定培养基中，将其加入含抗-LAG3抗体和双特异性抗体的培养板中并在37℃/5％CO2条件下孵育30分钟。报告T细胞的终浓度为5x10^4每孔。
接下来，使用D-PBS(Irvine Scientific目录号#9240)洗涤APC细胞1次，胰酶消化(Specialty Media目录号#SM-2004-C)并使用测定培养基阻断。离心后，在测定培养基中将细胞重悬至4x105/mL并加入含有与抗-LAG3加双特异性抗体孵育的T细胞报告细胞的培养板中。APC细胞的终浓度为1x104每孔。在37℃、5％CO2条件下将培养板孵育4-6小时。在加入ONE-GloTM(Promega,#E6051)试剂后检测AP1-Luc活性并在Victor光度计上捕捉相对光单位(RLU)。所有样品以双复孔检测。
使用MBP85-99的肽脉冲模式：TCR识别特异性MHC/肽复合物并导致T细胞活化。据报道在该测定中使用的Ob2F3TCR异二聚体与同MBP85-99肽(髓磷脂碱性蛋白NP_001020272；SEQ ID NO：583)复合的MHC II蛋白HLA-DR2AB相互作用。
在筛选前一天，制备如上文所述用于双特异性模式的经工程改造的报告T细胞。在37℃/5％CO2条件下在相应的含抗生素的细胞培养基中使用0.2μM MBP85-99肽(在DMSO中的Celtek HLA-DR2MBP85-99，ER-15，批号#140411，MW 1797.1g/mol)对APC细胞脉冲处理过夜。在存在1x104个经脉冲APC的条件下，确定抗-LAG3抗体的EC50值。以下述顺序加入试剂：在测定培养基中连续稀释抗-LAG3抗体和对照。抗-LAG3抗体10点连续稀释的范围在15pM至100nM之间，最后一个稀释点不含mAb。将抗体加入96孔白色平底板的相应孔中。以2x106/mL将培养过夜的报告T细胞重悬在测定培养基中，将其加入培养板并在37℃、5％CO2条件下孵育30分钟。报告T细胞的终浓度为5x104个T细胞每孔。接下来，使用D-PBS(IrvineScientific目录号#9240)洗涤经MBP85-99肽脉冲的APC细胞1次，胰酶消化(SpecialtyMedia目录号#SM-2004-C)并使用测定培养基阻断。离心后，在测定培养基中将细胞重悬至4x105/mL并加入含有抗-LAG3加肽脉冲报告T细胞的培养板中。APC细胞的终浓度为1x104每孔。在37℃/5％CO2条件下将测定板孵育4-6小时。在加入ONE-GloTM(Promega,#E6051)试剂后检测AP1-Luc活性并在Victor光度计上捕捉相对光单位(RLU)。所有样品以双复孔检测。
使用GraphPad Prism通过10点应答曲线使用4参数logistic方程确定EC50值。通过将最后一个不含mAb的连续稀释(对照)设定为100％(理论上来说，其应在由双特异性分子激发后(在双特异性模式中)或经由使用MBP85-99肽脉冲的APC激发后显示出的最大AP1-Luc应答)将每个筛选抗体的RLU值归一化。结果汇总在表14中。
表14：在LAG3T细胞/APC生物测定中抗-LAG3抗体依赖性AP1-Luc信号传导的活化
如表14中所示，在T细胞/APC生物测定中检测的所有本发明的抗-Lag3mAb均挽救LAG3/HLA-DR2抑制，在肽模式测定中其EC50值的范围从135pM至8.83nM，在双特异性模式测定中其EC50值的范围从87pM至超过100nM，而比较抗体显示出的EC50为280pM和350pM。在生物测定中，所检测的同种型对照未显示出显著的挽救活性。在进一步的实验中，加入抗-PD-1抗体(REGN 2810；在本申请实施例12中所述)未显示出增强对T细胞活化的挽救。
在第二项实验中，使用已克隆进入慢病毒(pLVX)载体系统的人PD-L1基因(登录号NP_054862.1的氨基酸1-290)转导HEK293/CD20/HLA-DR2细胞系。如上文所述，将表达hLAG-3和AP-1驱动荧光素酶报告基因的源自Jurkat的T细胞与表达人MHC II/肽复合物的PD-L1阳性抗原提呈细胞共孵育。在这项测定中，仅在存在抗-PD-1抗体(REGN2810；在本申请实施例12中描述)而非不存在抗-PD-1抗体的条件下，抗-LAG-3抗体挽救T细胞活性。总之，在这项T细胞测定中，抗-LAG-3抗体通过阻断LAG-3/MHC II抑制性信号传导以及与抗-PD-1抗体协同作用挽救T细胞活化。
实施例9：抗-LAG3抗体显示出结合至CD4+和CD8+刺激的食蟹猴T细胞
在这个实施例中，通过FACS评估了所选择的抗-LAG3抗体结合至表达LAG3的CD4+和/或CD8+食蟹猴T细胞的能力。
首先，从食蟹猴的全血(Bioreclamation,Westbury,NY)中分离T细胞。简言之，将来自两个食蟹猴供体的全血在PBS中以1:1稀释并在85％的Ficoll-Paque溶液中分层。按照标准程序，将红细胞与单核细胞分离并使用全T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)分离T细胞。
使用针对非人灵长类的T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi Biotech)将所分离的T细胞活化。以1x106个细胞/mL将细胞-小珠混合物在完全培养基中重悬。孵育72h后，除去小珠并在完全培养基中扩增活化的T细胞96h。
接下来，使用LIVE/DEAD染料(Molecular Probes)将如上文所述的来自各供体的经刺激的短尾猴T细胞染色，以通过FACS区分活细胞和死细胞。随后，在冰上将细胞与PE偶联的抗-CD8抗体和FITC偶联的抗-CD4抗体孵育15min，以使得能够检测CD4和CD8阳性和阴性细胞群。
为了评估抗-LAG3抗体与此前分离的CD4+和CD8+食蟹猴T细胞的结合，在封闭缓冲液中将抗-LAG3抗体和同种型对照连续稀释并以范围从100nM至50pM的最终剂量接种在96孔V底培养板中。接下来，使用Zenon Alexa-Fluor 647(Molecular Probes)对连续稀释的抗体进行直接标记并与食蟹猴CD4+/CD8+T细胞悬液在冰上孵育15-30min。将细胞离心并使用染色缓冲液洗涤细胞球团以除去未结合的抗体并使用Cytofix(BD Biosciences)和染色缓冲液按照1:1稀释固定12h。孵育期后，去除固定缓冲液并在染色缓冲液中重悬细胞球团，过滤，并将其用于荧光测量。
在Fortessa(Becton Dickinson)上进行荧光测量并在FlowJo中分析数据以确定平均荧光强度(MFI)。使用GraphPad Prism通过11点应答曲线使用4参数logistic方程计算EC50值。通过将在11.1nM抗体浓度下的MFI除以在0nM抗体浓度下的MFI(阴性对照)计算每个抗体的MFI比率。
表15：所选择的抗-LAG3抗体结合来自多个供体的CD4+和CD8+食蟹猴T细胞的EC50和MFI比率
NB：无结合
如前所示，抗-LAG3抗体H4sH15482P和H4sH14813N显示至经工程改造的食蟹猴LAG3-HEK293细胞系的结合。在这个实施例中，H4sH15482P和H4sH14813N显示出对CD4+和CD8+的表达LAG3的食蟹猴T细胞的特异性结合，其EC50范围从1.1nM至85pM(表15)。总之，在本实施例中所述的所选择的抗-LAG3抗体与在食蟹猴活化的CD4+和CD8+T细胞上表达的LAG3的结合显示出交叉反应性。而相反的是，比较抗体1仅显示出至CD8+食蟹猴T细胞的结合。
实施例10：抗-LAG3抗体对Colon26肿瘤的体内有效性
在Colon26临床前同源肿瘤模型中研究了抗-小鼠LAG3抗体单用和与抗-小鼠PD-1抗体联用的体内有效性。
BALB/c小鼠购自Taconic Biosciences。来源于BALB/c小鼠品系的小鼠腺癌细胞系Colon 26购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。第0天，向50只BALB/c小鼠皮下植入1x106个Colon 26(来源于BALB/c品系的小鼠腺癌细胞系)细胞。在第8天，选择平均肿瘤体积50mm3的40只小鼠并将其随机分成4个治疗组(N＝10只/组)。在第14、17、21、24和28天，按照如下所示的方式给予小鼠抗体：第1组，大鼠IgG2a同种型对照(克隆2A3，BioXCell，目录号#BE0089)和mIgG1同种型对照(克隆MOPC-21,BioXCell，目录号#BE0083抗体)；第2组，抗-小鼠PD-1抗体(大鼠IgG2a抗-小鼠PD-1抗体，克隆RPMI-14，BioXCell，目录号#BE0089)和mIgG1同种型对照抗体；第3组，抗-小鼠LAG3抗体(大鼠IgG1抗-小鼠LAG3抗体，克隆C9B7W,BioXCell，目录号#BE0174)和大鼠IgG2a对照抗体；第4组，抗-小鼠PD-1和抗-小鼠LAG3抗体。所有抗体均通过腹腔注射以10mg/kg施用。在实验期间(42天)通过使用卡尺每周测量两次监测肿瘤体积。
在使用抗-小鼠PD-1抗体治疗的小鼠中观察到了肿瘤生长显著降低(图2A-B)，在第45天实验结束时10只小鼠中的5只变为无肿瘤。在使用抗-小鼠LAG3抗体治疗的小鼠子集中也观察到了肿瘤生长降低，在第45天时10只小鼠中的3只变为无肿瘤。与此形成鲜明对比的是，使用抗-LAG3和抗-PD-1抗体的联合治疗优于任意一种单药疗法，在实验结束时，10只小鼠中的8只变为无肿瘤，提示抗-LAG3和抗-PD-1治疗具有较强的相加作用。在对照组中实验结束时没有无瘤小鼠。到第35天时，使用联用疗法而非任意一种单药疗法治疗的小鼠肿瘤体积出现具有统计学意义的显著降低(p<0.05，图2B)。尽管出现了有效的肿瘤清除，但未观察到体重减轻的迹象(未显示)。因此，在成型的Colon 26肿瘤模型中，抗-PD-1和抗-LAG3抗体的联用方案比相应的单药疗法明显更有效。
还在4T1、RENCA和A20临床前同源肿瘤模型中研究了抗-小鼠PD-1和抗-小鼠LAG3抗体的体内活性。与单一抗体治疗相比，两种抗体的联合治疗至少产生了叠加的抗肿瘤作用(数据未显示)。
实施例11：抗-小鼠LAG3抗体对MC38肿瘤的体内有效性
使用抗-小鼠PD-1和抗-小鼠LAG3阻断抗体在C57BL/6小鼠中的成型MC38肿瘤中考察了PD-1和LAG3双阻断的作用。
C57BL/6小鼠购自Taconic Biosciences。来源于C57BL/6小鼠品系的小鼠腺癌细胞系MC38来自美国国立卫生研究院。抗-LAG3和抗-PD-1抗体以及对照如实施例10中所述获得。
第0天，向50只C57BL/6小鼠的侧腹部皮下植入3x105个MC38细胞。在第8天，选择平均肿瘤体积45mm3的40只小鼠并将其随机分成4个治疗组(N＝10只/组)。在第8、12、15、19和23天，按照如下所示给予小鼠抗体：第1组，大鼠IgG2a和mIgG1同种型对照抗体；第2组，抗-小鼠PD-1和mIgG1抗体；第3组，抗-小鼠LAG3和大鼠IgG2a抗体；第4组，抗-小鼠PD-1和抗-小鼠LAG3抗体。所有抗体均通过腹腔注射以10mg/kg施用。在实验期间(28天)通过使用卡尺每周测量两次监测肿瘤体积。
在一小组小鼠中抗-PD-1抗体治疗显著降低肿瘤生长(p<0.0001；第23天)(图3A-B)，在实验结束时，10只小鼠中的2只变为无肿瘤。抗-LAG3抗体单药疗法未显示出任何显著的抗肿瘤作用(在实验结束时，10只小鼠中没有小鼠变为无肿瘤)，而抗-LAG3和抗-PD-1抗体联用优于单独的抗-PD-1疗法，提示具有协同作用。
为检测抗-PD-1和抗-LAG3抗体联用的免疫调节性质，检查了所治疗小鼠脾脏和引流淋巴结(DLN)中的T细胞标记物。解剖取出荷瘤小鼠的脾脏和引流淋巴结并将其置于15mLRPMI1640Glutamax I培养基(Invitrogen)中。分离总RNA并使用针对小鼠CD8β[探针：AGCAGCTCTGCCCTCAT(SEQ ID NO：584)，正向引物：GCTCTGGCTGGTCTTCAGTATG(SEQ ID NO：585)，反向引物：TTGCCGTATGGTTGGTTTGAAC(SEQ ID NO：586)]和小鼠IFNγ(Mm01168134_m1，Applied Biosystems)具有特异性的引物/探针混合物进行RT-PCR Taqman分析。以小鼠亲环蛋白B转录物表达水平将样品归一化。TaqMan分析表明在联合治疗组中小鼠DLN和脾脏中的CD8+T细胞均扩增，以及在联合治疗和单独抗-PD-1治疗的动物中T细胞效应分子IFNγ的产生增加，提示PD-1和LAG3阻断了T细胞增殖的增加及其效应功能。
实施例12：抗-人LAG3抗体对MC38肿瘤的体内有效性
在这项实验中，研究了本发明的示例性抗-人LAG3抗体对MC38肿瘤的有效性。抗-人LAG3mAb不与小鼠LAG3结合。因此，为了在小鼠体内研究这些抗体的抗肿瘤性质，使用表达人LAG3蛋白的人源化小鼠。对于本申请中的实验，使用技术(Valenzuela等，2003；Nat.Biotechnol.21:652-659)生产了既表达人PD-1的胞外部分又表达人LAG3的胞外部分以及小鼠这些蛋白的跨膜和胞内部分的双人源化小鼠。
使用技术对双人源化LAG3/PD-1小鼠进行基因工程改造，使用人PD-1和人LAG3基因的相应区域替代小鼠Pdcd1和Lag3基因的胞外域(美国专利申请序列号62/258,181，2015年11月20日提交)。通过检测在使用抗-CD3/抗-CD28抗体刺激后，人源化小鼠T细胞中PD-1和LAG3蛋白的表达情况来验证人源化PD-1和LAG3的表达。通过在细胞粘附测定中检测人LAG3与小鼠MHC II的结合以及在SPR-Biacore结合研究中检测人PD-1与小鼠PD-L1的结合确证人PD-1和LAG3蛋白与相应小鼠配体的相互作用。
在本研究中使用的示例性抗-LAG3抗体是与人LAG3特异性结合的全人抗体并且包含SEQ ID NO：420-422-424-428-430-432所示的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3组和SEQ ID No：418/426所示的HCVR/LCVR对(也称为H4sH15482P，在下文中称为“mAb1”)。
在美国专利申请公开号US20150203579中公开了抗-人PD-1抗体，其全部内容通过引用在此并入。在本实施例中使用的抗-PD-1抗体是H4H7798N(如在US20150203579中所公开的；也称为REGN2810。更具体地，如US20150203579中所公开的，H4H7798N包含SEQ ID NO：330所示的重链和SEQ ID NO：331所示的轻链)。REGN2810(抗-hPD-1)以高亲和性与人PD-1结合并阻止PD-1与PD-L1和PD-L2的相互作用。
对小鼠结肠腺癌细胞(MC38.Ova)进行工程改造以表达鸡卵清蛋白以增加肿瘤免疫原性。
在第0天向LAG3hum/humPD-1hum/hum小鼠皮下植入1.5x106个MC38.Ova细胞并将其随机分成3个治疗组(N＝7只/组)。在第3、6、10、14和17天，通过腹腔注射向小鼠施用mAb1(抗-hLAG3)(25mg/kg)、REGN2810(抗-hPD-1)(10mg/kg)或同种型对照抗体(25mg/kg)。在实验期间(24天)通过使用卡尺每周测量两次监测肿瘤体积。
在第0天，向LAG3hum/humPD-1hum/hum双人源化小鼠接种MC38.Ova细胞并在第3、6、10、14和17天通过腹腔途径给予mAb1(抗-hLAG3)(25mg/kg)、REGN2810(抗-hPD-1)(10mg/kg)或同种型对照抗体(25mg/kg)。REGN2810(抗-hPD-1)显示出部分的肿瘤生长抑制(图5)，在7只小鼠中的2只中观察到了肿瘤抑制，而在同种型对照组中没有无肿瘤小鼠。25mg/kg的mAb1(抗-hLAG3)对肿瘤生长未显示出任何显著影响，7只小鼠中仅有1只到实验结束时变为无肿瘤。小鼠体重不受mAb1(抗-hLAG3)、REGN2810(抗-hPD-1)和同种型对照治疗的影响。
实施例13：抗-人LAG3和抗-人PD-1抗体联用对MC38肿瘤的体内有效性
在这项实验中，在双人源化LAG3hum/humPD-1hum/hum小鼠中考察了mAb1(抗-hLAG3)与REGN2810(抗-hPD-1)联用对MC38.Ova肿瘤的有效性。双人源化小鼠如本申请实施例12中所述。
在本研究中使用的示例性抗-LAG3抗体是与人LAG3特异性结合的全人抗体并且包含SEQ ID NO：420-422-424-428-430-432所示的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3组和SEQ ID No：418/426所示的HCVR/LCVR对(也称为H4sH15482P，在下文中称为“mAb1”)。
在本实施例中使用的抗-PD-1抗体是H4H7798N(如在US20150203579中所公开的；也称为REGN2810)。REGN2810(抗-hPD-1)以高亲和性与人PD-1结合并阻止PD-1与PD-L1和PD-L2的相互作用。
在第0天向小鼠皮下植入1x106个MC38.Ova细胞并将其随机分成4个治疗组(在对照组中N＝7，以及在mAb1(抗-hLAG3)、REGN2810(抗-hPD-1)和mAb1(抗-hLAG3)+REGN2810(抗-hPD-1)联用治疗组中分别为N＝12)。在第3、7、10、14和17天，通过腹腔注射施用mAb1(抗-hLAG3)(25mg/kg)、REGN2810(抗-hPD-1)(10mg/kg)、mAb1(抗-hLAG3)(25mg/kg)和REGN2810(抗-hPD-1)(10mg/kg)联用或同种型对照(25mg/kg)。在实验期间(32天)通过使用卡尺每周测量两次监测肿瘤体积以及对无瘤动物的无肿瘤复发监测长达80天。
REGN2810(抗-hPD-1)单药疗法导致肿瘤生长抑制(图6A-B)，12只动物中的2只(17％)肿瘤消退，而mAb1(抗-hLAG3)没有显著的有效性，证实了此前实验的发现。仅在使用mAb1(抗-hLAG3)治疗的12只小鼠中的1只中观察到了肿瘤消退。在同种型对照组中，第32天时没有无肿瘤小鼠。而相比之下，mAb1(抗-hLAG3)和REGN2810(抗-hPD-1)联用显示出对MC38.Ova肿瘤生长强烈的抑制，导致实验结束时12只中有5只(42％)无瘤小鼠。无瘤小鼠在植入后80天内均未显示出复发，表明联合免疫疗法具有长期作用。带有Tukey多种比较后检验的单因素ANOVA表明，在第22天时mAb1(抗-hLAG3)和REGN2810(抗-hPD-1)联合治疗组与mAb1(抗-hLAG3)单药疗法(p<0.05)或同种型对照(p<0.01)相比具有显著不同的肿瘤体积(图6B)。相对于对照，REGN2810(抗-hPD-1)单药疗法也显示出显著的肿瘤生长减少(p<0.05)。通过对数-秩(Mantel-Cox)检验的分析表明，mAb1(抗-hLAG3)和REGN2810(抗-hPD-1)联用对动物的存活率也具有显著改善(p<0.0001)(图6C)。尽管联用疗法的有效性得到了改善，但是未观察到体重减轻的迹象(数据未显示)。总之，与REGN2810(抗-hPD-1)或mAb1(抗-hLAG3)单药疗法相比，mAb1(抗-hLAG3)和REGN2810(抗-hPD-1)联用导致有效性得到改善，包括减少肿瘤生长、改善肿瘤清除和改善存活。
实施例14：抗-LAG3和抗-PD-1抗体联用对MC38肿瘤的剂量范围研究
本实施例描述了在双人源化LAG3hum/humPD-1hum/hum小鼠中检测抗-人-PD-1和抗-人LAG3抗体联用对MC38.Ova肿瘤的体内有效性的一组剂量范围实验。双人源化小鼠如本申请实施例12中所述。
在本研究中使用的示例性抗-LAG3抗体是与人LAG3特异性结合的全人抗体并且包含SEQ ID NO：420-422-424-428-430-432所示的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3组和SEQ ID No：418/426所示的HCVR/LCVR对(也称为H4sH15482P，在下文中称为“mAb1”)。
在本实施例中使用的抗-PD-1抗体是H4H7798N(如在US20150203579中所公开的；也称为REGN2810)。REGN2810(抗-hPD-1)以高亲和性与人PD-1结合并阻止PD-1与PD-L1和PD-L2的相互作用。
在第一项实验中，以10mg/kg and 1mg/kg剂量水平对REGN2810(抗-hPD-1)进行滴定和检测，将这两个剂量组均作为单药和与mAb1(抗-hLAG3)(25mg/kg)联用。将这两个联合治疗组的结果与REGN2810(1mg/kg或10mg/kg)或mAb1(25mg/kg)单药疗法进行比较，以确定是否观察到了相加/协同抗肿瘤作用。还检测了使用同种型对照抗体(25mg/kg)的治疗。在第0天，向LAG3hum/humPD-1hum/hum小鼠接种MC38.Ova细胞并将其随机分成6个治疗组(在同种型对照组中N＝6和在mAb1、REGN2810或REGN2810+mAb1治疗组中N＝12)。在第3、7、10、14和17天通过腹腔注射向小鼠施用：mAb1(25mg/kg)；REGN2810(10mg/kg)；REGN2810(1mg/kg)；mAb1(25mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)；mAb1(25mg/kg)+REGN2810(1mg/kg)；或同种型对照(25mg/kg)。对肿瘤体积监测36天，以及对无瘤动物监测长达80天。
表16显示了在研究中的不同时间点的平均肿瘤体积以及表17中显示了在第36天时的无瘤小鼠数。
表16：在不同时间点的平均肿瘤体积
表17：在第36天时的无瘤小鼠数
an/N：每组中的无瘤小鼠数/小鼠总数
1mg/kg REGN2810单药疗法在36天期间仅显示出极小的肿瘤消退，结果与同种型对照治疗组相似(图7A-B)。在第36天时，在REGN2810(1mg/kg)和同种型对照组中分别有2/12(～16％)和0/6(0％)只小鼠无肿瘤。相比之下，mAb1(25mg/kg)、REGN2810(10mg/kg)和REGN2810(1mg/kg)+mAb1(25mg/kg)治疗组在22天期间显示出相似的肿瘤生长减少(图7A)。在第36天时，mAb1(25mg/kg)治疗使得1/12(～8％)只小鼠无肿瘤，而在REGN2810(1mg/kg)组和REGN2810(1mg/kg)+mAb1(25mg/kg)组中分别有4/12(～33％)和3/12(25％)只小鼠无肿瘤。总而言之，mAb1(25mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)显示出使MC38.Ova肿瘤生长最强的减少，到第36天时12只小鼠中的6只(50％)变为无肿瘤。尽管停止治疗，但是在植入后80天无瘤小鼠均未显示出复发，表明联合免疫疗法具有长期作用。通过对数-秩(Mantel-Cox)检验的分析表明，mAb1(25mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)治疗对动物的存活率也具有显著改善(p＝0.0197)(图7C)。而且，未观察到体重减轻的迹象。
在第二项实验中，以25mg/kg and 5mg/kg剂量水平对mAb1(抗-hLAG3)进行滴定和检测，这两个剂量组均作为单药和与REGN2810(抗-hPD-1)(10mg/kg)联用。将这两个联合治疗组的结果与mAb1(5mg/kg或25mg/kg)或REGN2810(10mg/kg)单药疗法进行比较，以确定是否观察到了叠加/协同抗肿瘤作用。还检测了使用同种型对照抗体(25mg/kg)的治疗。在第0天，向LAG3hum/humPD-1hum/hum小鼠接种MC38.Ova细胞并将其随机分成6个治疗组(在同种型对照组中N＝6和在mAb1、REGN2810或REGN2810+mAb1治疗组中N＝12)。在第3、7、10、14和17天通过腹腔注射向小鼠施用：mAb1(5mg/kg)；mAb1(25mg/kg)；REGN2810(10mg/kg)；mAb1(5mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)；mAb1(25mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)；或同种型对照(25mg/kg)。对肿瘤体积监测31天。
5mg/kg的mAb1单药疗法显示出与同种型对照治疗组相似的极小的肿瘤消退。mAb1(25mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)联用显示出最强的肿瘤减少(图8A)。mAb1(5mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)治疗组也显示出了较强的联用效果。在第23天时测量的肿瘤体积如图8B中所示。抗-LAG3抗体和REGN2810联用对动物的存活也显示出显著改善(p<0.001，如通过对数秩Mantel-Cox检验分析)(图8C)。结果表明即使在较低抗-LAG3抗体剂量下也显示出较强的联用效果。根据本申请中所示的结果，在与抗-PD-1抗体联用对肿瘤的治疗方案中可能没必要使用高剂量的抗-LAG3抗体。
总之，在双人源化LAG3/PD-1小鼠的MC38.ova肿瘤模型中(该模型能够检测不与小鼠受体交叉的临床抗体)，将REGN2810(抗-hPD-1)和mAb1(抗-hLAG3)联用与REGN2810(抗-hPD-1)和mAb1(抗-hLAG3)单药疗法相比显示出改善的剂量依赖性疗效，包括减少肿瘤生长和改善存活。将REGN2810(抗-hPD-1)和mAb1(抗-hLAG3)联用在临床前设置中具有较强的抗肿瘤疗效，这支持将其作为联合癌症免疫疗法进行临床开发。
实施例15：抗-人LAG3和抗-人PD-1抗体联用对成型的MC38肿瘤的体内有效性
在这项实验中，考察了mAb1(抗-hLAG3)与REGN2810(抗-hPD-1)联用对在双人源化LAG3hum/humPD-1hum/hum小鼠中的成型MC38.Ova肿瘤的有效性。双人源化小鼠如本申请实施例12中所述。
在本研究中使用的示例性抗-LAG3抗体是与人LAG3特异性结合的全人抗体并且包含SEQ ID NO：420-422-424-428-430-432所示的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3组和SEQ ID No：418/426所示的HCVR/LCVR对(也称为H4sH15482P，在下文中称为“mAb1”)。
在本实施例中使用的抗-PD-1抗体是H4H7798N(如在US20150203579中所公开的；也称为REGN2810)。REGN2810(抗-hPD-1)以高亲和性与人PD-1结合并阻止PD-1与PD-L1和PD-L2的相互作用。
在第0天，向LAG3hum/humPD-1hum/hum小鼠皮下接种MC38.Ova细胞。在第10天时，选择平均肿瘤体积100mm3的小鼠并将其随机分成4个治疗组。在第10、14、17和22天通过IP注射向小鼠施用mAb1(25mg/kg；N＝9)，REGN2810(10mg/kg；N＝10)，mAb1(25mg/kg)+REGN2810(10mg/kg)联用(N＝11)或同种型对照抗体(25mg/kg；N＝7)。肿瘤植入后对肿瘤体积进行28天监测。
使用抗-hPD-1和抗-hLAG-3抗体的组合对携带MC38.ova肿瘤的人源化小鼠的治疗触发了瘤内和外周T细胞的活性。REGN2810单药疗法导致了部分肿瘤的生长抑制，而mAb1单药疗法与同种型对照治疗小鼠相比未显示出平均肿瘤体积缩小(图9)。而相比之下，mAb1(25mg/kg)和REGN2810(10mg/kg)的组合显示出对MC38.Ova肿瘤生长强烈的抑制。单因素方差分析(ANOVA)结合Bonferroni多重比较后检验表明mAb1和REGN2810联用组与mAb1单药疗法(p<0.01)或同种型对照(p<0.05)之间相比平均肿瘤体积存在显著差异(图10)。当将联用疗法与REGN2810单药疗法进行比较时，联用疗法在实验过程中的总体平均肿瘤体积更低，但是该差异未达到统计学显著性。抗-LAG-3抗体和REGN2810联用还使得动物存活增加以及存活持续时间显著增加(p<0.01，如通过对数秩Mantel-Cox检验分析的)。在第25天时，与对照和单药疗法相比，50％使用联合疗法治疗的小鼠存活(图11)。根据这些结果，与各单药疗法相比，联用疗法显示出叠加的、剂量依赖性抗肿瘤作用。
实施例16：在食蟹猴中抗-LAG3抗体的药代动力学
在向雌性食蟹猴(每个剂量组5只动物)单次静脉(IV)给予1.0、5.0或15.0mg/kg剂量后，鉴定抗-LAG3抗体mAb1的药代动力学(PK)。在不同时间点从所有动物处收集用于确定功能性mAb1浓度的血样。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)确定血清中功能性mAb1的浓度。使用基于电化学发光的桥接免疫测定分析血清中的抗-mAb1抗体。使用非房室分析(NCA)估计PK参数。通过初始短暂的分布相、随后线性β的消除相来表征平均浓度-时间曲线(图12)。在8周的研究持续时间段内未观察到靶点介导的清除相。如在所检测的剂量水平下具有相似的AUCinf/剂量值所证实的，平均AUCinf以与剂量成比例的方式增加。与这一发现一致的是，3个剂量组的平均机体总清除率(CL)值相似。此外，3个剂量组的β相半衰期(t1/2)是相当的，范围从10.8到11.5天。根据这些结果，可以确立高达50mg/kg的无可见不良反应剂量水平(NOAEL)。这些结果表明在本研究的条件下mAb1表现出线性动力学。
实施例17：在食蟹猴中评估抗-LAG3抗体的毒理学
在雄性和雌性食蟹猴中进行的为期4周、重复给药、符合GLP的毒理学研究评估mAb1的体内毒理学和毒代动力学性质。通过IV输注以0、2、10或50mg/kg/周给予猴(5只动物/性别/组)mAb1。根据死亡率、濒死率、临床观察、体重、食物消耗、眼科检查、ECG评估、呼吸率、脉搏血氧饱和度、体温、血压评估以及神经系统检查进行毒性评估。还评价了临床病理学参数(血常规、凝血、临床生化和尿常规)和免疫表型。进行了大体检尸检查、器官重量测量和组织病理学评估。在给药期结束时或8周恢复期结束时进行完整的尸体剖检。对选定的器官进行称重并进行大体和显微镜下的检查。
当每周一次通过IV输注向食蟹猴施用时，在所评估的所有剂量水平下mAb1均具有良好的耐受性。因为mAb1是良好耐受的且所评价的任何安全性参数均无与mAb1相关的改变，所以认为研究的无可见不良反应剂量水平(NOAEL)是在本研究中施用的最高剂量50mg/kg/剂量。
实施例18：基于氢/氘交换(H/D)的抗-LAG3抗体H4sH15482P与hLAG3的胞外域结合的表位展示
进行实验以确定人LAG3胞外域(人LAG3的氨基酸Leu23-Leu450，UniProt登录号P18627，其C-末端具有人IgG1标签(“hLag3.Fc”)(R&D Systems,Minneapolis,MN)(SEQ IDNO：587))与抗-LAG3抗体H4sH15482P相互作用的氨基酸残基。为了这一目的，利用使用质谱的氢/氘(H/D)交换表位作图(HDX-MS)。HDX法的一般性描述参见Ehring(1999)AnalyticalBiochemistry 267(2):252-259；and Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
实验程序
HDX-MS实验在集成的Waters HDX/MS平台上进行(Waters Corporation,Milford,MA)，该平台由用于氘标记的Leaptec HDX PAL系统，用于样品消化和装载的Acquity M-Class(Auxiliary溶剂管理器)，用于分析柱梯度的Waters Acquity M-Class(μBinary溶剂管理器)以及用于消化肽质量测量的Synapt G2-Si质谱仪组成。
在pD 7.0的D2O中的10mM PBS缓冲液中制备标记溶液。为了氘标记，将3.8μLhLAG3.Fc(5pmol/μL)或hLAG3.Fc与抗-Lag3抗体H4sH15482P以1:1摩尔比的预混物与56.2μL D2O标记溶液孵育不同时间点(例如，非氘化对照＝0sec，氘标记：1min和20min)。通过将50μL样品转移至50μL预先冷却的淬灭缓冲液(含0.2M TCEP，6M盐酸胍的100mM磷酸盐缓冲液，pH 2.5)中并将混合物在1.0℃下孵育4min淬灭氘化。然后将淬灭的样品注射入用于在线胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化的Waters HDX管理器。在0℃下将经消化的肽捕获在ACQUITYUPLC BEH C18 1.7-μm,2.1×5mm VanGuard预柱(Waters Corporation)上并洗脱至分析柱ACQUITY UPLC BEH C18 1.7-μm,1.0×50mm以使用5％-40％B(流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液)进行9分钟的梯度分离。将质谱设置为采样锥电压37V，扫描时间0.5s和质荷比范围50-1700汤姆森单位(Th)。
为了鉴定与H4sH15482P相互作用的人Lag3的肽残基，使用Waters ProteinLynxGlobal Server(PLGS)软件对来自未氘化样品的LC-MSE数据进行处理并针对包括人LAG3序列、胃蛋白酶和随机序列的数据库进行检索。将鉴定的肽导入DynamX软件，并通过两个标准进行过滤：1)每个氨基酸的最小产物＝0.2，以及2)复制文件阈值＝3。然后DynamX软件在多个时间点及每个时间点重复3次范围内根据保留时间和高质量准确度(<10ppm)自动确定每个肽的氘摄取情况。
结果
使用与MSE数据采集偶联的在线胃蛋白酶/蛋白酶XIII柱，在不存在或存在抗体的条件下，对来自人LAG3的代表78.3％序列覆盖度的共计123个肽进行了重复鉴定。当结合至H4sH15482P时，4个Lag-3肽显示出氘化摄取显著降低(质心δ值>0.8道尔顿，p值<0.05)。所记录的肽质量对应于来自三次重复的质心MH+质量的平均值。当结合至H4sH15482P时，对应于hLAG3.Fc的氨基酸34-77(SEQ ID NO：587)的这些肽具有更慢的氘化速率。这些经鉴定的残基还对应于由Unipro条目P18627所定义的人LAG3的残基28-71(LAG3_HUMAN，SEQ ID NO：588)，并且如表18中所示。
表18：在结合H4sH15482P后具有改变的氘代速率的人LAG3肽
实施例19：抗-LAG3抗体在晚期恶性肿瘤患者中的临床试验
本实施例描述了一项用以评估在晚期恶性肿瘤患者中抗-LAG3抗体单药疗法以及与抗-PD-1抗体联用的安全性、耐受性和抗肿瘤活性的临床试验。
在本研究中使用的示例性抗-LAG3抗体是与人LAG3特异性结合的全人抗体并且包含SEQ ID NO：420-422-424-428-430-432所示的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3组和SEQ ID No：418/426所示的HCVR/LCVR对(也称为H4sH15482P，在下文中称为“mAb1”)。
在本研究中使用的抗-PD-1抗体是H4H7798N(如在US20150203579中所公开的；也称为REGN2810)。REGN2810(抗-hPD-1)以高亲和性与人PD-1结合并阻止PD-1与PD-L1和PD-L2的相互作用。
研究目的
本研究的主要目的是：
在渐增剂量阶段：评估安全性和药代动力学(PK)性质，以确定在晚期恶性肿瘤(包括淋巴瘤)患者中mAb1单药疗法和与REGN2810联用在2期临床研究中的剂量。终点包括剂量限制性毒性(DLT)比率、不良事件(AE)(包括免疫相关的)、严重不良事件(SAE)、死亡和实验室异常(根据不良事件常见术语标准[CTCAE]的3级或更高级)以及药代动力学。
在剂量扩展阶段：通过ORR测量评估mAb1单用和其与REGN2810的联用(分别以组计)的初步抗肿瘤活性。终点包括根据在实体肿瘤中的应答评价标准(RECIST)1.1(Eisenhauer等，2009,Eur.J.Cancer 45:228-247)(实体肿瘤)和Lugano标准(Cheson等，2014,J.Clin.Oncol.32:3059-3068)(淋巴瘤)的总体应答率(ORR)。
次要目的是：(a)根据在实体肿瘤中的免疫相关应答评价标准(irRECIST)(Wolchok等，2009,Clin.Cancer Res.15:7412-7420；Nishino等，2013,Clin.CancerRes.19:3936-3943)、最佳总体应答(BOR)、应答持续时间(DOR)、疾病控制率以及根据RECIST、irRECIST和Lugano标准的PFS(Cheson等，2014,J.Clin.Oncol.32:3059-3068)通过ORR测量评估mAb1单用和与REGN2810联用(分别以组计)的初步抗肿瘤活性；(b)如在渐增剂量阶段所确定的在每个扩展组中鉴定安全性性质；(c)鉴定mAb1单药疗法以及当mAb1和REGN2810联用时的PK；以及(d)根据对mAb1和REGN2810抗药抗体(ADA)的测量评估免疫原性。
研究的探索性目的是：(a)评估肿瘤体积；(b)探索在基线时、治疗过程中和进展时从使用mAb1单药疗法或与REGN2810联用治疗的患者中获得的血清、血浆、外周血单核细胞(PBMC)和肿瘤组织样品(包括存档肿瘤组织)中REGN2810的药效学作用；以及(c)评估所关注的生物标记物的预测潜力和与临床应答的相关性，所述生物标记物可以包括但不限于：(i)循环肿瘤核酸；(ii)PBMC亚群分布以及免疫检验点分子和其他所关注的生物标记物的表达；(iii)肿瘤RNA表达；(iv)肿瘤浸润淋巴细胞(CD8+T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞和组织许可、其他亚型如B细胞、骨髓来源的细胞、NK细胞等)的数量和分布；(v)PD-1、PD-L1、LGA3和可能的其他检验点调节子的表达水平(信使RNA和/或蛋白)；(vi)已知癌基因和潜在的肿瘤新抗原中的突变；以及(vii)肿瘤突变负荷。
研究设计
这是一项在晚期恶性肿瘤患者中进行的将mAb1以单药疗法施用以及将其与REGN2810联用以评价安全性、耐受性、活性和PK的首次在人体内进行的(FIH)、非盲、多中心、渐增剂量的1期研究。对三个剂量水平的mAb(1.0、3.0和10mg/kg)作为单药疗法以及其与3.0mg/kg剂量的REGN2810的联用进行研究。
在长达28天的筛选期后，患者接受长达17个21天的治疗周期(共计治疗达51周)，随后进行24周的随访期。每名患者每21天接受1次mAb1(+/-REGN2810)。
治疗一直持续到51周治疗期结束时，或者直到出现疾病进展、不可接受的毒性、撤销知情同意或满足退出研究的标准。在前24周每6周进行一次应答评估，然后在随后的27周每9周进行一次，无论是否出现研究药物给药推迟。在最少24周治疗(最少8个治疗周期)后，确诊完全缓解(CR)的患者可以选择停止治疗并继续进行所有相关的研究评估。类似地，在与医师协商之后，已进行了最少24周治疗且在3次连续的肿瘤评估中保持病情稳定(SD)或部分应答(PR)的患者可以选择停止治疗并继续进行所有相关的研究评估。对出现应答并在随后进展的患者，要求在进展时进行肿瘤组织活检。接受mAb1单药疗法4次给药且在最初的肿瘤评估中至少为SD，但是随后出现疾病进展(PD)的患者可以选择将REGN2810 3.0mg/kg加入在该时间点施用安全的最高剂量(如果知晓的话)的mAb1中以尝试通过将淋巴细胞活化基因2(LAG-3)和程序性死亡分子1(PD-1)联合阻断“挽救”应答。在每次研究药物给药访视时进行安全性评估。
渐增剂量
计划招募3个渐增剂量的单药疗法和联用疗法组(1.0、3.0和10mg/kg mAb1，加入或不加入3mg/kg REGN2810)。招募的第一个组接受1.0mg/kg的mAb1单药疗法。随后招募的每个附加组可能受限于在此前的组中所观察到的剂量限制性毒性(DLT)的数量。如有必要，可以招募剂量递减组(0.3mg/kg mAb1，加入或不加入3mg/kg REGN2810)。
渐增剂量规则
修订传统的3+3设计为“4+3”以用于评价mAb1单药疗法和mAb1+REGN2810组的所有剂量水平。尽管在每个剂量水平最少需要3名患者以评估DLT，为了将1期渐增剂量的有效性最大化同时保证患者的安全性，在每个剂量水平招募4名患者以防出现在可以进行DLT评估前患者停药的情况。DLT评估期为28天。仅当所有潜在的DLT可评估患者均完成28天的DLT期且无DLT时(0/3或0/4)，才认为达到了某一剂量水平的耐受性。如果3名患者完成了DLT期且未出现DLT，但是在DLT评估期存在第4名患者，仅当第4名患者完成了DLT评估期或在可进行DLT评估前停止治疗时才认为达到了该剂量水平的耐受性。如果在3名或4名DLT可评估患者中存在1例DLT，则再分别招募4名或3名患者以达到共计有7名患者。类似地，认为1/6或1/7DLT是可耐受的。2至7个可评估患者中的两例DLT将超出最大耐受剂量(MTD)。在所耐受的最高剂量水平下，为了进一步评估安全性，将再招募3至4名患者以达到共计6至10名DLT可评估患者。在6至8名患者中有0至1例或在9至10名患者中有2例DLT将认为是可接受的。为了进一步评估安全性，可以根据申办者的判断(与研究者协商)在任意剂量水平下再招募3名患者。
如(3至7名患者之后)1.0mg/kg mAb1(剂量水平1；DL1)被视为是安全的，则招募将从3.0mg/kg Ab1(DL2)开始。在DL2中的4名患者入组后，可以开始入组第一个联用组(1.0mg/kg mAb1+3.0mg/kg REGN2810；DL3)。一旦将3.0mg/kg mAb1(DL2)视为是安全的，则可以开始将剂量渐增至10mg/kg mAb1(DL4)。仅当将DL2和DL3两者均视为是安全的之后，才开始招募第二个联用组(3.0mg/kg mAb1+3.0mg/kg REGN2810；DL5)。仅当将DL4和DL5两者均视为是安全的之后，才开始招募第三个联用组(10mg/kg mAb1+3.0mg/kg REGN2810；DL6)。如果同时开放多个组，则优选考虑编号更低的组(即，DL2优于DL3或者DL3优于DL4)。
剂量限制性毒性
将用于确定渐增剂量或开始新的联用疗法的安全性的DLT观察期定义为从第1个周期开始的28天的第1天，旨在监测前两个剂量的研究药物的安全性和耐受性(mAb1根据需要加入或不加入REGN2810)。为了可以进行DLT评价，在完成DLT期之前，患者必须至少已接受前2次研究药物(即，第1天和第22天)并且在第一次施用后监测至少28天，以及在第二次施用或出现DLT(定义如下)后监测至少7天。如果与研究药物相关，则将研究药物第二次施用推迟超过第35天和/或研究药物停药认为是DLT。因此，对于第二次给药推迟的患者其DLT观察期持续时间更长且对于出现AE的患者必须对其持续时间进行评估以确定是否该事件是DLT。
除了无法在窗口期内施用第2剂以外(由于研究药物毒性)，通常将DLT定义为下述研究药物相关毒性中的任意一种：
非血液系统毒性：
●≥2级的葡萄膜炎
●任何≥3级的非血液系统毒性(不包括不具有临床意义的实验室异常，如淀粉酶或脂肪酶的无症状升高)
血液系统毒性：
●持续>7天的4级中性粒细胞减少
●4级血小板减少
●具有出血的3级血小板减少
●≥3级的发热性中性粒细胞减少或具有有记录的感染的≥3级的中性粒细胞减少将符合DLT定义的irAE和非-irAE均认为是DLT。
最大耐受剂量
将MTD定义为略低于由于在6至7名可评估患者中出现2例或更多例DLT而停止给药的剂量水平，并且针对单药疗法和联用疗法单独确定。然而，由于REGN2810和其他PD-1/PD-L1抗体单药疗法AE的发生情况是已知的，因而对于联用组而言在确定MTD和决定在该剂量水平下加入其他患者时可以考虑联用毒性的强度、频率以及新出现的毒性。如果未因DLT而停止渐增剂量，则认为尚未确定MTD。将在每个单药治疗和联用组再招募3名患者视为最高剂量水平是可耐受的(即，在这些组的每一个中有6至10名患者)。如果mAb1单药疗法或与REGN2810的联用疗法的渐增剂量由于DLT而停止在1.0mg/kg，则在0.3mg/kg剂量下招募一个组。如果mAb1单药疗法或联用疗法的渐增剂量由于DLT而停止在3.0或10mg/kg剂量水平，则针对新招募的患者将mAb1的剂量降至此前已检测过的剂量水平(分别在单药疗法或联用疗法组中)。不允许患者使用单药疗法不能耐受的mAb1剂量开始联用疗法。
推荐的2期临床剂量
针对扩展组的RP2D不会高于MTD或已检测的最高剂量并且可以不同于单药疗法和联用疗法组。将根据安全性和PK数据确定RP2D。
接受4次mAb1给药且在最初的肿瘤评估中至少为SD，但是随后出现PD的单药疗法组的患者可以选择将REGN2810 3.0mg/kg加入在该时间点施用安全的最高剂量的mAb1中(如果知晓的话)以尝试通过将LAG-3和PD-1联合阻断“挽救”应答。
扩展组
一旦确立了mAb1单用以及与REGN2810联用的耐受性，则可以招募在选定适应征(非小细胞肺癌(NSCLC)、透明细胞性肾癌(ccRCC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、黑色素瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL))中使用单药疗法或联用疗法的多个扩展组以进一步评估安全性和寻找在已知表达或过表达LAG3的肿瘤中抗肿瘤活性的初步证据；可能出现mAb1单用或与REGN2810联用的抗肿瘤活性。在渐增剂量完成后，开始扩展组的招募。在确认RP2D后，使用Simon 2-阶段设计(Simon 1989,Controlled Clinical Trials 10:1-10)招募另外10个扩展队列(表19)。根据患者的肿瘤类型、存在或不存在此前的抗-PD-1/抗-程序性死亡配体(PD-L1)疗法、研究者对针对该患者的治疗方案的适宜性的评估以及在所分配的治疗组中患者位置的可用性将患者分配至特定治疗组。如果在Simon 2-阶段设计的阶段1中在单个扩展组中出现安全性问题，则可能暂停招募。在研究者与瑞泽恩公司之间进行讨论后，可以在相同或更低的mAb1剂量下重新开始招募。导致暂停的安全性问题可能包括早期或完全安全性事件。患者使用mAb1(通过渐增剂量结果确定的剂量)单药疗法或mAb1与REGN28103mg/kg Q3W联用治疗长达51周。仅当在阶段1中观察到最低数量的肿瘤应答时，才针对每个扩展队列入组阶段2。
表19：扩展组列表
研究人群
在渐增剂量阶段中：此前未接受过抗-LAG3药物和/或PD-1/PD-L1抑制剂治疗且不适合使用标准疗法治疗，预计没有表现出临床获益的可用疗法的晚期恶性肿瘤患者，以及患有无法治愈的恶性肿瘤且尽管采用标准疗法但是无应答或显示出肿瘤进展的患者。
在剂量扩展组中：患者患有选定的恶性肿瘤且此前未接受过抗-LAG-3药物治疗，并且
●此前未接受过抗-PD-1/PD-L1疗法，但是是接受基于抗-PD-1疗法的适宜候选人(队列1、3、5、6和9)或
●此前已接受过基于抗-PD-1/PD-L1的疗法，并在对抗PD-1/PD-L1疗法具有至少3个月的经确认的客观应答(CR或PR)或SD但是对该疗法随后出现进展，或者具有将SD或PR作为最佳应答，随后持续6个月的稳定应答(队列2、4、7和10)或
●不是标准疗法的候选人，或者预期没有表达治疗益处的可用疗法并适于mAb1单一疗法(队列8)
入选标准：患者必须符合下述标准才有资格纳入本研究：
1.年龄≥18岁的男性和女性。
2.渐增剂量组：患者患有已经组织学或细胞学确诊的恶性肿瘤(包括淋巴瘤)且已证实出现肿瘤进展，对于这些患者没有其他标准治疗选择，或没有其他具有治愈可能性的标准方法(即，尽管采用标准疗法但是无应答或显示出肿瘤进展)以及此前未使用过PD-1/PD-L1抑制剂治疗。不要求这些患者患有根据RECIST 1.1或Lugano标准的可测量疾病。
3.剂量扩展组：患者患有已经组织学或细胞学确诊的符合下述标准且属于根据RECIST1.1或Lugano标准的可测量疾病的下述肿瘤中的一种：
i.患有IIIB或IV期NSCLC，未使用过抗-PD-1/PD-L1，未对转移性疾病进行预先治疗或在一个含铂方案后发生疾病进展/复发(组1)
ii.患有IIIB或IV期NSCLC，使用过抗-PD-1/PD-L1*，对转移性疾病使用过不超过2种预先治疗(组2)
iii.患有晚期或转移性具有透明细胞成分的ccRCC，未使用过抗-PD-1/PD-L1，此前已接受过1至2个抗血管生成疗法方案(组3)
iv.患有晚期或转移性具有透明细胞成分的ccRCC，使用过抗-PD-1/PD-L1*，此前已接受过1至2个抗血管生成疗法方案(组4)
v.患有转移性TNBC(雌激素、黄体酮和人表皮生长因子受体2阴性)，未使用过抗-PD-1/PD-L1，此前已接受过5次或以下治疗(组5)
vi.患有晚期或转移性黑色素瘤，未使用过抗-PD-1/PD-L1，此前对转移性疾病已接受过不超过2个方案(组6)
vii.患有晚期或转移性黑色素瘤，使用过抗-PD-1/PD-L1*，此前对转移性疾病已接受过不超过2个方案(组7)
viii.患有复发/难治性DLBCL，未使用过抗-PD-1/PD-L1，其已在自体干细胞移植后进展或不是自体干细胞移植的候选人(组8和9)
ix.患有复发/难治性DLBCL，使用过抗-PD-1/PD-L1*，其已在自体干细胞移植后进展或不是自体干细胞移植的候选人(组10)。
注意：*将使用过抗-PD-1/PD-L1定义为已经或正在对抗-PD-1/PD-L1疗法耐受(即，未因毒性而停药)并且已具有下述任一疾病控制：
a.在疾病进展前，通过重复成像确认为CR/PR或从首次给药开始至少12周为SD。疾病进展必须出现在使用抗-PD-1/PD-L1疗法后或在末次给药12周内。
b.SD或PR作为最佳应答，随后稳定应答(与基线相比降低不超过70％)持续6个月，同时使用抗-PD-1/PD-L1疗法。
4.美国东部肿瘤协作组的表现状态为0或1
5.预期寿命至少3个月
6.具有如下所述的足够的器官和骨髓功能：(a)血红蛋白≥9.0g/dL；(b)绝对中性粒细胞计数≥1.5x 109/L；(c)血小板计数≥75x 109/L；(d)血清肌酐≤1.5x正常值上线(ULN)或估算的肾小球滤过率>50mL/min/1.73m2；(e)总胆红素≤1.5x ULN；(f)如果存在肝转移，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶(ALT)≤3x ULN或≤5x ULN；和/或(g)碱性磷酸酶≤2.5x ULN(或≤5.0x ULN，如果存在肝转移或骨转移)
7.有意愿并能够遵守门诊访视和研究相关程序
8.提供已签署的知情同意书。
排除标准：将从研究中排除符合任意下述标准的患者：1.目前在另一项研究中接受治疗，或者参加了研究药物的研究并接受治疗，或者在研究疗法首次给药4周内使用了研究设备，或者在研究疗法首次给药3周内接受了已批准的全身治疗，或者在研究药物首次给药的5个半衰期内接受了任何此前的全身疗法(以时间较长者为准)。仅对于扩展组2、4、7、10(使用过抗-PD-1/PD-L1)而言，在研究疗法首次给药3周内不能给予此前的抗-PD-1/PD-L1治疗，无论该药物的半衰期或审批状态如何。2.此前使用过任何LAG-3靶向的生物制剂或小分子治疗。3.随机分组前2周内进行过放疗以及因放疗引起的任意AE未恢复至基线。4.仅限于扩展组：具有出现进展或需要积极治疗的另一种恶性肿瘤，至少在招募前2年已经过潜在根治疗法治疗的非黑色素瘤皮肤癌或原位宫颈癌，或者已被视为使用明确的局部控制进行有效治疗的任意其他肿瘤除外。5.具有未经治疗的或活动性中枢神经系统转移。此前已对中枢神经系统转移进行过治疗的患者，只要其是稳定的(即，在研究治疗首次给药前至少6周内无影像学疾病进展证据，以及任何神经系统症状已恢复至基线)，并且不存在具有新增的或扩大的中枢神经系统转移的证据，以及在REGN2810首次给药前4周内患者不需要使用任何全身皮质类固醇来控制中枢神经系统转移，就可以参与研究。6.在知情同意前一年具有脑炎、脑膜炎或不受控制的癫痫发作。7.存在持续或近期(5年内)具有需要使用系统性免疫抑制疗法进行治疗的重大自身免疫性疾病的证据，这可能提示存在irAE的风险。无需将下述排除：白癜风、已恢复的儿童哮喘、仅需要激素替代疗法的甲状腺功能减退症、1型糖尿病或者不需要全身性治疗的牛皮癣。8.在研究药物首次给药前1周内使用了皮质类固醇疗法(>10mg泼尼松/天或等效物)。不排除需要短期类固醇治疗的患者。9.已知的间质性肺病或活动性、非感染性肺炎的病史或任何证据(过去5年)。10.未受控制的人类免疫缺陷病毒、乙肝病毒或丙肝病毒感染；或诊断为免疫缺陷。11.需要全身治疗的活动性感染。12.在计划开始给予研究药物前30天内接受过活疫苗。13.在筛选前4周内进行了重大外科手术、创伤性组织活检或受到严重创伤性损伤。14.在研究疗法首次给药前9个月内发生了心肌梗死。15.此前进行过同种异体干细胞移植。16.研究者认为将使得参与研究不是对受试者的最佳益处的任何身体状况。17.由抗体治疗引起的有记录的过敏或急性超敏反应。18.已知对多西环素或其他四环素类抗生素过敏。19.已知患有将干扰参与研究的要求的精神病或药物滥用障碍。20.具有生育能力的性行为活跃的男性或女性不愿意在研究期间进行避孕。在研究的预计持续时间内(筛选期访视至研究药物末次给药后180天)，妊娠、哺乳或希望怀孕的女性或计划生育的男性。21.在首次治疗开始前、研究期间和研究药物最后一个剂量施用后至少6个月不愿意进行充分避孕的具有生育能力的性行为活跃的男性或女性。
研究治疗
单药疗法：以下述单药疗法剂量每21天通过30分钟的静脉(IV)输注在门诊施用mAb1长达51周：
●DL1：持续51周每21天IV输注30分钟1.0mg/kg mAb1
●DL2：持续51周每21天IV输注30分钟3.0mg/kg mAb1
●DL4：持续51周每21天IV输注30分钟10mg/kg mAb1
●DL-1m：持续51周每21天IV输注30分钟0.3mg/kg mAb1(如有必要)
联用疗法：对于联用疗法，研究药物的施用顺序为在同一天先施用mAb1，再施用REGN2810。每21天通过30分钟的IV输注在门诊施用研究药物长达51周。计划分配的联用方案包括：
●DL3：持续51周每21天IV输注30分钟1.0mg/kg mAb1和3.0mg/kg REGN2810
●DL5：持续51周每21天IV输注30分钟3.0mg/kg mAb1和3.0mg/kg REGN2810
●DL6：持续51周每21天IV输注30分钟10.0mg/kg mAb1和3.0mg/kg REGN2810
●DL-1c：持续51周每21天IV输注30分钟0.3mg/kg mAb1和3.0mg/kg REGN2810(如有必要)
研究终点
主要终点
在渐增剂量阶段中：DLT比率、不良事件(AE；包括免疫相关的)、严重不良事件(SAE)、死亡和实验室异常(根据不良事件常见术语标准[CTCAE]的3级或更高级)以及PK。
在剂量扩展阶段中：根据RECIST 1.1(实体肿瘤)和Lugano标准(淋巴瘤)的客观应答率(ORR)。
次要终点
根据实体瘤免疫相关应答评价标准(irRECIST)的ORR；根据RECIST、irRECIST和Lugano标准的最佳总体应答(BOR)、应答持续时间(DOR)、疾病控制率和无进展存活期(PFS)；AE；包括免疫相关的、SAE、死亡和实验室异常(根据CTCAE的3级或更高级)；PK和ADA。
程序和评估
通过对AE进行临床评估以及通过对包括生命体征(体温、血压、脉搏和呼吸)、身体检查(完整的和有限的)、12-导联心电图(ECG)的临床评价和包括标准血常规、血生化和尿常规的实验室评估的重复测量对mAb1单用或与REGN2810联用的安全性和耐受性进行监测。
收集用于确定血清中的功能性mAb1和功能性REGN2810的血液样品以及ADA(抗-mAb1或抗-REGN2810)样品。收集用于分析其他生物标记物的血清和血浆样品。在血清、血浆、外周血单核细胞(PBMC)和肿瘤组织中研究与mAb1和REGN2810的治疗暴露、临床活性或潜在疾病相关的推测的药效学、预测和预后生物标记物。通过CT和MRI评估抗肿瘤活性。从同意进行任何药物基因组学子研究的患者中收集基因组DNA样品。
结果
预期的是，在研究中向晚期恶性肿瘤患者中施用mAb1是安全的和耐受良好的。如通过ORR在诸如非小细胞肺癌、黑色素瘤、透明细胞性肾癌、B细胞淋巴瘤或乳腺癌的实体肿瘤患者中所评估的，与3mg/kg REGN2810联用预计导致肿瘤消退。
本发明不限于本申请所述具体实施方式的范围。事实上，从上述说明和附图，本发明的多种修订以及本申请所述的那些对本领域的技术人员将变得显而易见。这些修订旨在落入所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
<120> 抗-LAG3抗体及其用途
<130> 10176WO01
<150> 62/239,524
<151> 2015-10-09
<150> 62/257,791
<151> 2015-11-20
<150> 62/315,119
<151> 2016-03-30
<150> 62/359,921
<151> 2016-07-08
<150> 62/365,006
<151> 2016-07-21
<160> 589
<170> 用于Windows 4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgtgg cctctggatt cacctttagc acctatgcca tgagttgggt ccgccaggct 120
ccagggatgg ggctggagtg ggtctcaagt attagtggta gtggtcgtaa cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240
cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgttt attactgtgc gaaagagtcc 300
gtaactggaa cttcgtccta ctactacggt gtggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cg 372
<210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Val Thr Gly Thr Ser Ser Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
ggattcacct ttagcaccta tgcc 24
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala
1 5
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
attagtggta gtggtcgtaa caca 24
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asn Thr
1 5
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
gcgaaagagt ccgtaactgg aacttcgtcc tactactacg gtgtggacgt c 51
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Ala Lys Glu Ser Val Thr Gly Thr Ser Ser Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp
1 5 10 15
Val
<210> 9
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agttatttaa attggtatca tcagaaacca 120
gggaaagccc caaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaaatgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg catcttacta ctgtcaacag agttacagaa ccccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Arg Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
cagagcatta gcagttat 18
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
gctgcatcc 9
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Ala Ala Ser
1
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
caacagagtt acagaacccc gctcact 27
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Gln Gln Ser Tyr Arg Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
caggtgcagc tggaggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt tggtatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatggtatg atggaactaa taaaaagtat 180
ggagactccg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagattgt 300
ggacatagtg gcaacgatcg ggggacttac tattactact acggtatgga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctca 387
<210> 18
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Lys Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Cys Gly His Ser Gly Asn Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
ggattcacct tcagttggta tggc 24
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr Gly
1 5
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
atatggtatg atggaactaa taaa 24
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys
1 5
<210> 23
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
gcgagagatt gtggacatag tggcaacgat cgggggactt actattacta ctacggtatg 60
gacgtc 66
<210> 24
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Ala Arg Asp Cys Gly His Ser Gly Asn Asp Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 25
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 26
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
cagagcatta gcagctat 18
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
gctgcatcc 9
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Ala Ala Ser
1
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 33
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggaactggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg ggttggggaa atcagtcata gaggaaccac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca ctggacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aaactgacct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag agacgaggaa 300
ctggaattcc gtttctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Ser His Arg Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Arg Asp Glu Glu Leu Glu Phe Arg Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
ggtgggtcct tcagtggtta ctac 24
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
atcagtcata gaggaaccac c 21
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Ile Ser His Arg Gly Thr Thr
1 5
<210> 39
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
tcgagagacg aggaactgga attccgtttc tttgactac 39
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Ser Arg Asp Glu Glu Leu Glu Phe Arg Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctatttag cctggtacca acaaaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct cgtctatggt gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cattttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
cagagtgtta gcagctat 18
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
ggtgcatcc 9
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Gly Ala Ser
1
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
cagcagcgta gcaactggcc gctcact 27
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 49
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtga ctccatcatc agtaatagtt attactgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt ggcaatttct tttatactgg ggccacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgctg acacgtccaa gaatcagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgca gacacggctc tgtattattg tgcgagttat 300
aataggaatt accggttcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 50
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ile Ser Asn
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Asn Phe Phe Tyr Thr Gly Ala Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ser Tyr Asn Arg Asn Tyr Arg Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
ggtgactcca tcatcagtaa tagttattac 30
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Gly Asp Ser Ile Ile Ser Asn Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
ttcttttata ctggggccac c 21
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
Phe Phe Tyr Thr Gly Ala Thr
1 5
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
gcgagttata ataggaatta ccggttcgac ccc 33
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
Ala Ser Tyr Asn Arg Asn Tyr Arg Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 57
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttactt ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 58
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
cagagcatta gcagctat 18
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 61
gctgcatcc 9
<210> 62
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 62
Ala Ala Ser
1
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 63
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 64
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 65
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 65
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt acttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggagag atcaatcata gtggaaacgc cgactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt ctccatatca gtggacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aggctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctatttatt actgtgcgag agcgggctat 300
tgtagtagtc ccacctgcta ttcctactac tacttcggta tggacgtctg gggccaaggg 360
accacggtca ccgtctcctc a 381
<210> 66
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 66
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Asn Ala Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Tyr Cys Ser Ser Pro Thr Cys Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Phe
100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 67
ggtgggtcct tcagtactta ctac 24
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 68
Gly Gly Ser Phe Ser Thr Tyr Tyr
1 5
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 69
atcaatcata gtggaaacgc c 21
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 70
Ile Asn His Ser Gly Asn Ala
1 5
<210> 71
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 71
gcgagagcgg gctattgtag tagtcccacc tgctattcct actactactt cggtatggac 60
gtc 63
<210> 72
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Ala Arg Ala Gly Tyr Cys Ser Ser Pro Thr Cys Tyr Ser Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Phe Gly Met Asp Val
20
<210> 73
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctctagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttatc agcagcttct tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcttccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatccg cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta actcaccttg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggagat caaa 324
<210> 74
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
cagagtgtta tcagcagctt c 21
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
Gln Ser Val Ile Ser Ser Phe
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
ggtgcatcc 9
<210> 78
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
Gly Ala Ser
1
<210> 79
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
cagcagtatg gtaactcacc ttggacg 27
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 81
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac cctcacgctg 60
acctgcaccg tctctgggtt ctcactcagc aatgctggga tgggtgtgag ctgggtccgt 120
cagccccctg ggaaggccct ggagtggctt gcacacattt tttcgaatga cgagaagtcc 180
tacagcacat ctctgaggac cagactcacc atctccaagg acacctccaa aagccaggtg 240
gtccttaccg tgaccaactt ggaccctgtg gacacagcca catatttctg tgcacggata 300
ccagagttta ccagctcgtc gtgggctctc tactacttct acggtatgga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctca 387
<210> 82
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 82
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Arg Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Thr Asn Leu Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Pro Glu Phe Thr Ser Ser Ser Trp Ala Leu Tyr Tyr
100 105 110
Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 83
gggttctcac tcagcaatgc tgggatgggt 30
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 84
Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala Gly Met Gly
1 5 10
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 85
attttttcga atgacgagaa g 21
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 86
Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys
1 5
<210> 87
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 87
gcacggatac cagagtttac cagctcgtcg tgggctctct actacttcta cggtatggac 60
gtc 63
<210> 88
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 88
Ala Arg Ile Pro Glu Phe Thr Ser Ser Ser Trp Ala Leu Tyr Tyr Phe
1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 89
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 89
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagcgccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtattacc agcacctact tcgcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gctacatcca gcagggccac tggcgtccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggacg gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgatgatt ttgcagtgta ttactgtcag caatatggta ggtcaccttg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaagt caaa 324
<210> 90
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 90
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Thr
20 25 30
Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Asp Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys
100 105
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 91
cagagtatta ccagcaccta c 21
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 92
Gln Ser Ile Thr Ser Thr Tyr
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 93
gctacatcc 9
<210> 94
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 94
Ala Thr Ser
1
<210> 95
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 95
cagcaatatg gtaggtcacc ttggacg 27
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 96
Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 97
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 97
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agttatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatgataa cacaaactat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accgcagaca catccacgaa tacagcctac 240
atggagctaa ggagcctgag atctgacgac acggccattt attactgtgt gcgatggaat 300
tggggttccg tctactggta cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc 360
tca 363
<210> 98
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Asp Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Trp Asn Trp Gly Ser Val Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 99
ggttacacct ttaccagtta tggt 24
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 100
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly
1 5
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 101
atcagcgctt acaatgataa caca 24
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 102
Ile Ser Ala Tyr Asn Asp Asn Thr
1 5
<210> 103
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 103
gtgcgatgga attggggttc cgtctactgg tacttcgatc tc 42
<210> 104
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 104
Val Arg Trp Asn Trp Gly Ser Val Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 105
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 105
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gattattagc agcagctact ttgcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcgtcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgt gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcaatgta tttctgtcag cagtatggta actcaccttg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 106
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 106
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Val Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 107
cagattatta gcagcagcta c 21
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 108
Gln Ile Ile Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 109
ggtgcgtcc 9
<210> 110
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 110
Gly Ala Ser
1
<210> 111
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 111
cagcagtatg gtaactcacc ttggacg 27
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 112
Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 113
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 113
cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60
acttgcacct tctctgggtt ctcactcaac actcatagag tgggtgtagg ctggatccgg 120
cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt atgggaatga tgttaagaac 180
tacagcccat ctctggagac caggctcacc atcgccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240
gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catatttctg ttcgtacata 300
acgggggaag gaatgtactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 114
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 114
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr His
20 25 30
Arg Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Gly Asn Asp Val Lys Asn Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Thr Arg Leu Thr Ile Ala Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Gly Met Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 115
gggttctcac tcaacactca tagagtgggt 30
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 116
Gly Phe Ser Leu Asn Thr His Arg Val Gly
1 5 10
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 117
atttatggga atgatgttaa g 21
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 118
Ile Tyr Gly Asn Asp Val Lys
1 5
<210> 119
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 119
tcgtacataa cgggggaagg aatgtac 27
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 120
Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Gly Met Tyr
1 5
<210> 121
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 121
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgtccgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atttcctgta ggtctagtca aaacctcatg tacagtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120
tttcaccaga ggccaggcca atctccaagg cgtctaattt ataaggtttc taaccgggac 180
tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggtac 300
acatttggcc aggggaccaa gctggagatc aaa 333
<210> 122
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 122
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Met Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 123
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 123
caaaacctca tgtacagtga tggaaacacc tac 33
<210> 124
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 124
Gln Asn Leu Met Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 125
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 125
aaggtttct 9
<210> 126
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 126
Lys Val Ser
1
<210> 127
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 127
atgcaaggta cacactggta caca 24
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 128
Met Gln Gly Thr His Trp Tyr Thr
1 5
<210> 129
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 129
caggtgcagc tgcagcagtg gggcgcagga ctattgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtctttcagt ggttattact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg gtctggaatg gattggggaa atcaatcata gaggaaacac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca ctcgacacgt ccaagaaaca gttctccctg 240
aacctgagtt ctgtgaccgc cgcggacacg gctatgtatt actgtacgag agacgaagaa 300
caggaactac gtttccttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 130
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 130
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Asp Glu Glu Gln Glu Leu Arg Phe Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 131
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 131
ggtgggtctt tcagtggtta ttac 24
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 132
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 133
atcaatcata gaggaaacac c 21
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 134
Ile Asn His Arg Gly Asn Thr
1 5
<210> 135
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 135
acgagagacg aagaacagga actacgtttc cttgactac 39
<210> 136
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 136
Thr Arg Asp Glu Glu Gln Glu Leu Arg Phe Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 137
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 137
gagattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca ggatattagc acctacttag cctggtacca acagagagct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcttccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cattttatta ctgtcaacag cgcagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300
gggaccgagg tggagatcaa a 321
<210> 138
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 138
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Ala Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 139
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 139
caggatatta gcacctac 18
<210> 140
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 140
Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
1 5
<210> 141
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 141
ggtgcttcc 9
<210> 142
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 142
Gly Ala Ser
1
<210> 143
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 143
caacagcgca gcaactggcc gctcact 27
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 144
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 145
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 145
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgttg tccatggtgg gtccttcagt ggttactact ggaactggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gaggaaacac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccgtatca gaagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctttgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgtgag aggagaggat 300
tacgattttt ggagtgatta ttataatgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 146
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 146
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val His Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Val Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gly Glu Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Asp Tyr Tyr Asn Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 147
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 147
ggtgggtcct tcagtggtta ctac 24
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 148
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 149
atcaatcata gaggaaacac c 21
<210> 150
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 150
Ile Asn His Arg Gly Asn Thr
1 5
<210> 151
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 151
gtgagaggag aggattacga tttttggagt gattattata atgactac 48
<210> 152
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 152
Val Arg Gly Glu Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Asp Tyr Tyr Asn Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 153
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 153
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gactattagc agctacttag cctggcacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaaa gggccacggg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcaccag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 154
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 154
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 155
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 155
cagactatta gcagctac 18
<210> 156
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 156
Gln Thr Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 157
gatgcatcc 9
<210> 158
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 158
Asp Ala Ser
1
<210> 159
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 159
cagcagcgta gcaactggcc tctcact 27
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 160
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 161
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 161
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgccgc cttcggagac cctgtccctc 60
atctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gaggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagc caccatatca gttgacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag aggcgaggat 300
tactatgata gtagtggtta ctcgtactac tttgactact ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 162
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 162
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Pro Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ile Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Arg Gly Glu Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 163
ggtgggtcct tcagtggtta ctac 24
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 164
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 165
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 165
atcaatcata gaggaagcac c 21
<210> 166
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 166
Ile Asn His Arg Gly Ser Thr
1 5
<210> 167
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 167
tcgagaggcg aggattacta tgatagtagt ggttactcgt actactttga ctac 54
<210> 168
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 168
Ser Arg Gly Glu Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr Tyr Phe
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 169
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 169
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 170
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 170
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 171
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 171
cagagtgtta gcagctac 18
<210> 172
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 172
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
<210> 173
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 173
gatgcatcc 9
<210> 174
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 174
Asp Ala Ser
1
<210> 175
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 175
cagcagcgta gcaactggcc gctcact 27
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 176
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 177
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 177
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaggc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggaattggat ccgccagtcc 120
ccagggacgg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gagggaacat caacttcaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gaggacacgt ccaaaaacca attctccctg 240
aggctgaact ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggagaggat 300
tacgatattt ggagtggtta ttatagggag tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 178
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 178
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Arg Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Thr Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Ile Asn Phe Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Glu Asp Tyr Asp Ile Trp Ser Gly Tyr Tyr Arg Glu Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 179
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 179
ggtgggtcct tcagtggtta ctac 24
<210> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 180
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 181
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 181
atcaatcata gagggaacat c 21
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 182
Ile Asn His Arg Gly Asn Ile
1 5
<210> 183
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 183
gcgagaggag aggattacga tatttggagt ggttattata gggagtac 48
<210> 184
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 184
Ala Arg Gly Glu Asp Tyr Asp Ile Trp Ser Gly Tyr Tyr Arg Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 185
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 185
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccact 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaga gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg ctgtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcgc tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 186
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 186
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 187
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 187
cagagtgtta gcagctac 18
<210> 188
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 188
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
<210> 189
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 189
gatgcatcc 9
<210> 190
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 190
Asp Ala Ser
1
<210> 191
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 191
cagcagcgta gcaactggcc tctcgct 27
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 192
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Ala
1 5
<210> 193
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 193
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt gagttctact ggaactggat ccgccagccc 120
ccagagaagg gcctggagtg gattggggaa atcaatcatc gtggaaacac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacatgt ccaagaacca gttctccctg 240
cagctgaact ctgtgaccgt cgcggacacg gctctgtatt actgtgcgtt tggctacgat 300
tttcggagtt cttatgagga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 194
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 194
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Glu Phe
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Met Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Phe Gly Tyr Asp Phe Arg Ser Ser Tyr Glu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 195
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 195
ggtgggtcct tcagtgagtt ctac 24
<210> 196
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 196
Gly Gly Ser Phe Ser Glu Phe Tyr
1 5
<210> 197
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 197
atcaatcatc gtggaaacac c 21
<210> 198
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 198
Ile Asn His Arg Gly Asn Thr
1 5
<210> 199
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 199
gcgtttggct acgattttcg gagttcttat gaggacgtc 39
<210> 200
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 200
Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Arg Ser Ser Tyr Glu Asp Val
1 5 10
<210> 201
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 201
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca ggatattagc acctacttag cctggcacca acagaaacct 120
ggccagcctc ccaggctcct catctatggt tcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 202
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 202
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 203
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 203
caggatatta gcacctac 18
<210> 204
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 204
Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
1 5
<210> 205
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 205
ggttcatcc 9
<210> 206
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 206
Gly Ser Ser
1
<210> 207
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 207
cagcagcgta gcaactggcc tctcact 27
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 208
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 209
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 209
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcaga agctatgcca tgagttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attagtggtg gtggtggtag gacatactac 180
acagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagag catgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccattt attactgtgc gaaagagagg 300
gtaactggaa tagaccacta ctactacggt gtggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 210
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 210
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Arg Val Thr Gly Ile Asp His Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 211
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 211
ggattcacct tcagaagcta tgcc 24
<210> 212
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 212
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala
1 5
<210> 213
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 213
attagtggtg gtggtggtag gaca 24
<210> 214
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 214
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Arg Thr
1 5
<210> 215
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 215
gcgaaagaga gggtaactgg aatagaccac tactactacg gtgtggacgt c 51
<210> 216
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 216
Ala Lys Glu Arg Val Thr Gly Ile Asp His Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp
1 5 10 15
Val
<210> 217
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 217
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagt agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct acatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
cggttcagtg gcagtgcatc tggaacagat ttcactctcg ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacacta cccccctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 218
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 218
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 219
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 219
cagagcatta gtagctat 18
<210> 220
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 220
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 221
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 221
gctacatcc 9
<210> 222
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 222
Ala Thr Ser
1
<210> 223
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 223
caacagagtt acactacccc cctcact 27
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 224
Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 225
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 225
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacaac ctggagggtc cctgagactt 60
tcctgtgcag cctctggatt tacattcagc agttatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatat atcagtagta gtggtaatac caaagactac 180
gcaggctctg tgaagggccg agtcaccatc tccagagaca acgccaagaa cttactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt atcactgtgc gagagatgga 300
gggcattacg atattttgac tggttccatg tcctactact actacgcttt ggacgtctgg 360
ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 390
<210> 226
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 226
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Asn Thr Lys Asp Tyr Ala Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Leu Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Gly His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Ser Met Ser Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 227
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 227
ggatttacat tcagcagtta tgaa 24
<210> 228
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 228
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Glu
1 5
<210> 229
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 229
atcagtagta gtggtaatac caaa 24
<210> 230
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 230
Ile Ser Ser Ser Gly Asn Thr Lys
1 5
<210> 231
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 231
gcgagagatg gagggcatta cgatattttg actggttcca tgtcctacta ctactacgct 60
ttggacgtc 69
<210> 232
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 232
Ala Arg Asp Gly Gly His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Ser Met Ser Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Val
20
<210> 233
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 233
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 234
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 234
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 235
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 235
cagagcatta gcagctat 18
<210> 236
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 236
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 237
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 237
gctgcatcc 9
<210> 238
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 238
Ala Ala Ser
1
<210> 239
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 239
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30
<210> 240
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 240
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 241
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 241
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttaaa acctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaggg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta gtggtagtac ctcatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attacaagaa gacgctgtct 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgttt attactgtgc gctggatata 300
atggcaacgg taggaggtct ctttaacaac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 242
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 242
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Tyr Lys Lys Thr Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Ile Met Ala Thr Val Gly Gly Leu Phe Asn Asn Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 243
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 243
ggattcacct ttaaaaccta tgcc 24
<210> 244
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 244
Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr Ala
1 5
<210> 245
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 245
attagtggta gtggtagtac ctca 24
<210> 246
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 246
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser
1 5
<210> 247
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 247
gcgctggata taatggcaac ggtaggaggt ctctttaaca ac 42
<210> 248
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 248
Ala Leu Asp Ile Met Ala Thr Val Gly Gly Leu Phe Asn Asn
1 5 10
<210> 249
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 249
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 250
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 250
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 251
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 251
cagagtgtta gcagcagcta c 21
<210> 252
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 252
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 253
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 253
ggtgcatcc 9
<210> 254
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 254
Gly Ala Ser
1
<210> 255
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 255
cagcagtatg gtagctcacc ttggacg 27
<210> 256
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 256
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 257
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 257
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agacatacta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacacaagt tccagggcag agtcacgatt accacggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtat attattgtgc gagagcccct 300
tatacccgac aggggtactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 258
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 258
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg His
20 25 30
Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala His Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Tyr Thr Arg Gln Gly Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 259
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 259
ggaggcacct tcagcagaca tact 24
<210> 260
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 260
Gly Gly Thr Phe Ser Arg His Thr
1 5
<210> 261
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 261
atcatcccta tctttggtac agca 24
<210> 262
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 262
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala
1 5
<210> 263
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 263
gcgagagccc cttatacccg acaggggtac ttcgatctc 39
<210> 264
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 264
Ala Arg Ala Pro Tyr Thr Arg Gln Gly Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 265
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 265
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctactca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaaga ttatagtact 300
ccgtggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339
<210> 266
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 266
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Asp Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 267
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 267
cagagtgttt tatacagctc caacaataag aactac 36
<210> 268
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 268
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 269
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 269
tgggcatct 9
<210> 270
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 270
Trp Ala Ser
1
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 271
cagcaagatt atagtactcc gtggacg 27
<210> 272
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 272
Gln Gln Asp Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 273
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 273
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc aactactata tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgactg gatgggaatt atcaaccctg gtggtggtaa cacaaactac 180
gcacagaagt tcctgggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgac cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccatat attactgtgc gagagaaaac 300
tggaactctt actttgacaa ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 274
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 274
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Leu Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Trp Asn Ser Tyr Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 275
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 275
ggatacacct tcaccaacta ctat 24
<210> 276
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 276
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr
1 5
<210> 277
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 277
atcaaccctg gtggtggtaa caca 24
<210> 278
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 278
Ile Asn Pro Gly Gly Gly Asn Thr
1 5
<210> 279
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 279
gcgagagaaa actggaactc ttactttgac aac 33
<210> 280
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 280
Ala Arg Glu Asn Trp Asn Ser Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 281
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 281
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa cttcttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca ctttattact gtcagcaata ttatggtgct 300
ccgtggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339
<210> 282
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 282
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Gly Ala Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 283
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 283
cagagtgttt tatacagctc caacaataag aacttc 36
<210> 284
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 284
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Phe
1 5 10
<210> 285
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 285
tgggcatct 9
<210> 286
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 286
Trp Ala Ser
1
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 287
cagcaatatt atggtgctcc gtggacg 27
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 288
Gln Gln Tyr Tyr Gly Ala Pro Trp Thr
1 5
<210> 289
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 289
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatacta tcaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accacggacg aatccacgaa cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccattt attactgtgc gagagcgaga 300
tatggttcgg ggagttatga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 290
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 290
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Arg Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 291
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 291
ggaggcacct tcagcagcta tact 24
<210> 292
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 292
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 293
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 293
atcatcccta tctttggtat agca 24
<210> 294
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 294
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala
1 5
<210> 295
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 295
gcgagagcga gatatggttc ggggagttat gactac 36
<210> 296
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 296
Ala Arg Ala Arg Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 297
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 297
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacacctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttataatact 300
ccatggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339
<210> 298
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 298
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Thr
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 299
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 299
cagagtgttt tatacacctc caacaataag aactac 36
<210> 300
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 300
Gln Ser Val Leu Tyr Thr Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 301
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 301
tgggcatct 9
<210> 302
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 302
Trp Ala Ser
1
<210> 303
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 303
cagcaatatt ataatactcc atggacg 27
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 304
Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 305
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 305
cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60
acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actaatggag tgggtgtggg ctggatccgt 120
cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt ggaatcattt attggaatga tgataagcgc 180
tacagcccat ctctgaggag cagactcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240
gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacacaga 300
ggcctcttcg gaggttggtt cgacccctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 306
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 306
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Asn
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Arg Gly Leu Phe Gly Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 307
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 307
gggttctcac tcagcactaa tggagtgggt 30
<210> 308
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 308
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Asn Gly Val Gly
1 5 10
<210> 309
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 309
atttattgga atgatgataa g 21
<210> 310
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 310
Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys
1 5
<210> 311
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 311
gcacacagag gcctcttcgg aggttggttc gacccc 36
<210> 312
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 312
Ala His Arg Gly Leu Phe Gly Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 313
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 313
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aggtatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaacctcct gatctttgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttactt ctgtcaacag agttacaata ccccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 314
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 314
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 315
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 315
cagagcatta gcaggtat 18
<210> 316
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 316
Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
1 5
<210> 317
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 317
gctgcatcc 9
<210> 318
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 318
Ala Ala Ser
1
<210> 319
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 319
caacagagtt acaatacccc gctcact 27
<210> 320
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 320
Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 321
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 321
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcaa tctctggatt cacctttagg agttatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg cgctggagtg ggtctcagtt attagtggta gcggtggtaa cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccgtc tccagagaca attccaggaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat atttctgttc gaaagttgca 300
gcagctaata attactatta cgctttggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 322
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 322
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ser Lys Val Ala Ala Ala Asn Asn Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 323
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 323
ggattcacct ttaggagtta tgcc 24
<210> 324
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 324
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala
1 5
<210> 325
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 325
attagtggta gcggtggtaa caca 24
<210> 326
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 326
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr
1 5
<210> 327
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 327
tcgaaagttg cagcagctaa taattactat tacgctttgg acgtc 45
<210> 328
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 328
Ser Lys Val Ala Ala Ala Asn Asn Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Val
1 5 10 15
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<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 329
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaagta tttggattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacaa ctcctgatct atttggtttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattattgca tgcaagctct acaaactccg 300
tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336
<210> 330
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 330
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Lys Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 331
cagagcctcc tgcatagtaa tggatacaag tat 33
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 332
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Lys Tyr
1 5 10
<210> 333
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 333
ttggtttct 9
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 334
Leu Val Ser
1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 335
atgcaagctc tacaaactcc gtacact 27
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 336
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr
1 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 337
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cgtctggatt caccttcagt aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggaatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctccaagtga gcagcctgag agccgatgac acggctgtat attactgtgc gagggacgga 300
gaggtcgaat atagcagctc gaattacaac tactacggtc tggatgtctg gggccaaggg 360
accacggtca ccgtctcctc a 381
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 338
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Val Ser Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Glu Val Glu Tyr Ser Ser Ser Asn Tyr Asn Tyr Tyr
100 105 110
Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 339
ggattcacct tcagtaacta tggc 24
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 340
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly
1 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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atatggaatg atggaagtaa taaa 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 342
Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 343
gcgagggacg gagaggtcga atatagcagc tcgaattaca actactacgg tctggatgtc 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 344
Ala Arg Asp Gly Glu Val Glu Tyr Ser Ser Ser Asn Tyr Asn Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Leu Asp Val
20
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 345
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatattg taacatatta ctgtcaacag tatgatgatc tcccgatcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa a 321
<210> 346
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 346
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Val Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Leu Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 347
caggacatta gcaactat 18
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 348
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1 5
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<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 349
gatgcatcc 9
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 350
Asp Ala Ser
1
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 351
caacagtatg atgatctccc gatcacc 27
<210> 352
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 352
Gln Gln Tyr Asp Asp Leu Pro Ile Thr
1 5
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<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 353
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt ctcctttcat aattttgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attactggta gtggtactag cacacactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa aacgctatat 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcgg 300
ggctatgatt atagtggttc ttactacaac tggttcgacc cctggggcca gggaaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 354
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 354
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe His Asn Phe
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Thr Gly Ser Gly Thr Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Gly Tyr Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Trp Phe
100 105 110
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 355
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 355
ggattctcct ttcataattt tgcc 24
<210> 356
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 356
Gly Phe Ser Phe His Asn Phe Ala
1 5
<210> 357
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 357
attactggta gtggtactag caca 24
<210> 358
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 358
Ile Thr Gly Ser Gly Thr Ser Thr
1 5
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<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 359
gcgaaagatc ggggctatga ttatagtggt tcttactaca actggttcga cccc 54
<210> 360
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 360
Ala Lys Asp Arg Gly Tyr Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Trp Phe
1 5 10 15
Asp Pro
<210> 361
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 361
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagaatcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagtattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctttgct gcatcaaatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagtag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccatcctt attcactttc 300
ggccctggga ccaaagtgga tatcaaa 327
<210> 362
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 362
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ser
85 90 95
Leu Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 363
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 363
cagagtatta gcagctat 18
<210> 364
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 364
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 365
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 365
gctgcatca 9
<210> 366
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 366
Ala Ala Ser
1
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 367
caacagagtt acagtacccc atccttattc act 33
<210> 368
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 368
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ser Leu Phe Thr
1 5 10
<210> 369
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 369
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag tctctggatt caccttcagt agttacgaga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaatg ggtttcacac attagtagta gtggaagtac catatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagatggg 300
aatatctgga gtggttatta tgccgcctac tacttctacg gtatggacgt ctggggccaa 360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384
<210> 370
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 370
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Asn Ile Trp Ser Gly Tyr Tyr Ala Ala Tyr Tyr Phe
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 371
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 371
ggattcacct tcagtagtta cgag 24
<210> 372
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 372
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Glu
1 5
<210> 373
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 373
attagtagta gtggaagtac cata 24
<210> 374
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 374
Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile
1 5
<210> 375
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 375
gcgagagatg ggaatatctg gagtggttat tatgccgcct actacttcta cggtatggac 60
gtc 63
<210> 376
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 376
Ala Arg Asp Gly Asn Ile Trp Ser Gly Tyr Tyr Ala Ala Tyr Tyr Phe
1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 377
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 377
gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaaaaccta cttgagttgg 120
cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180
tctggggtcc cagacagaat cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctgt acaatttcct 300
cggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336
<210> 378
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 378
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Ile Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Val Gln Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 379
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 379
caaagcctcg tacacagtga tggaaaaacc tac 33
<210> 380
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 380
Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 381
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 381
aagatttct 9
<210> 382
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 382
Lys Ile Ser
1
<210> 383
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 383
atgcaagctg tacaatttcc tcggacg 27
<210> 384
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 384
Met Gln Ala Val Gln Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 385
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 385
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaacc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg ggccttcagt gattactact ggaattggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcatc gcggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgtgt caccatttca gttgacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aggatgagct ctgtgaccgc cgcggacgcg gctgtgtatt actgtgcgag aggagaggat 300
tacgatattt ggaatggtta ttatcaggaa aaatggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 386
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 386
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Glu Asp Tyr Asp Ile Trp Asn Gly Tyr Tyr Gln Glu Lys Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 387
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 387
ggtggggcct tcagtgatta ctac 24
<210> 388
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 388
Gly Gly Ala Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 389
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 389
atcaatcatc gcggaagcac c 21
<210> 390
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 390
Ile Asn His Arg Gly Ser Thr
1 5
<210> 391
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 391
gcgagaggag aggattacga tatttggaat ggttattatc aggaaaaa 48
<210> 392
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 392
Ala Arg Gly Glu Asp Tyr Asp Ile Trp Asn Gly Tyr Tyr Gln Glu Lys
1 5 10 15
<210> 393
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 393
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtattagc acctacttag cctggtacca acagaagcct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaga gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg tagtttatta ctgtcaccag cgtagcaact ggcctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 394
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 394
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 395
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 395
cagagtatta gcacctac 18
<210> 396
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 396
Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
1 5
<210> 397
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 397
gatgcatcc 9
<210> 398
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 398
Asp Ala Ser
1
<210> 399
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 399
caccagcgta gcaactggcc tctcact 27
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 400
His Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 401
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 401
caggtgcagc tgcaggagtc ggggccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ttccttcagt agttactact ggagttggct ccggcagccc 120
ccaggaaagg ggctggagtg gattggatat atcttttaca gtgggagtac cgactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatttca gtagacacgt ccaagaagca gttctccctg 240
aagctgacct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtctatt actgtgcgcg aacaataagt 300
acgtggtggt tcgccccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 402
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 402
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Ile Ser Thr Trp Trp Phe Ala Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 403
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 403
ggtggttcct tcagtagtta ctac 24
<210> 404
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 404
Gly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 405
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 405
atcttttaca gtgggagtac c 21
<210> 406
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 406
Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 407
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 407
gcgcgaacaa taagtacgtg gtggttcgcc ccc 33
<210> 408
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 408
Ala Arg Thr Ile Ser Thr Trp Trp Phe Ala Pro
1 5 10
<210> 409
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 409
gaaatagtga tgacacagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccaggggg aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aacaacgtag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccaggc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttattc ctgtcagcag tataataact ggctcacttt cggcggaggg 300
accaaggtgg agatcaaa 318
<210> 410
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 410
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gly Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Ser Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 411
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 411
cagagtgtta gcaacaac 18
<210> 412
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 412
Gln Ser Val Ser Asn Asn
1 5
<210> 413
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 413
ggtgcatcc 9
<210> 414
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 414
Gly Ala Ser
1
<210> 415
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 415
cagcagtata ataactggct cact 24
<210> 416
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 416
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Leu Thr
1 5
<210> 417
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 417
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cgtctggatt cactttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaatt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccata tccagagaca attccaagaa cacacagtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gtcagtagct 300
acgtctgggg acttcgacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 418
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 418
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Val Ala Thr Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 419
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 419
ggattcactt tcagtagtta tggc 24
<210> 420
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 420
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 421
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 421
atatggtatg atggaagtaa taaa 24
<210> 422
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 422
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 423
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 423
gcgtcagtag ctacgtctgg ggacttcgac tactacggta tggacgtc 48
<210> 424
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 424
Ala Ser Val Ala Thr Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 425
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 425
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagaaccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagaattagc acctacttag cctggtatca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaaa gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gtagtgggtc tgggacaggc ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagtaact ggcctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 426
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 426
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Thr Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 427
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 427
cagagaatta gcacctac 18
<210> 428
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 428
Gln Arg Ile Ser Thr Tyr
1 5
<210> 429
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 429
gatgcatcc 9
<210> 430
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 430
Asp Ala Ser
1
<210> 431
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 431
cagcagcgta gtaactggcc tctcact 27
<210> 432
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 432
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 433
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 433
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgagaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttact aactactgga tcgtctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacgggat 300
acgattttcc cttcctatcc cctctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 434
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 434
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Val Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Thr Ile Phe Pro Ser Tyr Pro Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 435
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 435
ggatacagct ttactaacta ctgg 24
<210> 436
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 436
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp
1 5
<210> 437
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 437
atctatcctg gtgactctga tacc 24
<210> 438
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 438
Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr
1 5
<210> 439
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 439
gcgagacggg atacgatttt cccttcctat cccctc 36
<210> 440
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 440
Ala Arg Arg Asp Thr Ile Phe Pro Ser Tyr Pro Leu
1 5 10
<210> 441
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 441
gatattgtga tgactcagtc tcctctctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg aatagtaatg gatacaactt tttggattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacaa ctcctgatct atttggtttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tattggggtt tattactgca tgcaagctct ccaaactccg 300
atcaccttcg gccaagggac acgactggag attaaa 336
<210> 442
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 442
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Phe Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ile Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 443
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 443
cagagcctcc tgaatagtaa tggatacaac ttt 33
<210> 444
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 444
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Tyr Asn Phe
1 5 10
<210> 445
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 445
ttggtttct 9
<210> 446
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 446
Leu Val Ser
1
<210> 447
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 447
atgcaagctc tccaaactcc gatcacc 27
<210> 448
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 448
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Ile Thr
1 5
<210> 449
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 449
cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60
acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actaatggag tgggtgtggg ctggatccgt 120
cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt acactcattt attggaatga aaataagcac 180
tacagcccat ctctgaaaaa caggatcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240
gtccttacaa tgaccaactt ggaccctgtg gacacagcca cttattactg tgtacacagg 300
ggatggttgg gagcaatctt tgcctactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 450
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 450
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Asn
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Thr Leu Ile Tyr Trp Asn Glu Asn Lys His Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Asn Arg Ile Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Leu Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val His Arg Gly Trp Leu Gly Ala Ile Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 451
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 451
gggttctcac tcagcactaa tggagtgggt 30
<210> 452
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 452
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Asn Gly Val Gly
1 5 10
<210> 453
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 453
atttattgga atgaaaataa g 21
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 454
Ile Tyr Trp Asn Glu Asn Lys
1 5
<210> 455
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 455
gtacacaggg gatggttggg agcaatcttt gcctac 36
<210> 456
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 456
Val His Arg Gly Trp Leu Gly Ala Ile Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 457
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 457
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttact agttatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagat attagtggta gtggtggtag aacatattac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa tatgctgtat 240
ctgcaaatga acatcctgag agccgaagac acggccgtat atcattgtgc gaagggaaca 300
ggccagcagg tggaccttta caactactac tatgctttgg acgtctgggg ccaagggacc 360
acggtcaccg tctcctca 378
<210> 458
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 458
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ile Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Thr Gly Gln Gln Val Asp Leu Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Ala
100 105 110
Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 459
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 459
ggattcacct ttactagtta tgcc 24
<210> 460
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 460
Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr Ala
1 5
<210> 461
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 461
attagtggta gtggtggtag aaca 24
<210> 462
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 462
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr
1 5
<210> 463
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 463
gcgaagggaa caggccagca ggtggacctt tacaactact actatgcttt ggacgtc 57
<210> 464
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 464
Ala Lys Gly Thr Gly Gln Gln Val Asp Leu Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Ala
1 5 10 15
Leu Asp Val
<210> 465
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 465
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt tactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaacactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgacgac acggctgtct attactgtgc gagagataag 300
ggtataagtg gaattaaggg gggttcttac tactactact atgccatgga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctca 387
<210> 466
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 466
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Gly Ile Ser Gly Ile Lys Gly Gly Ser Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 467
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 467
ggattcacct tcagttacta tggc 24
<210> 468
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 468
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Gly
1 5
<210> 469
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 469
atatggtatg atggaagtaa taaa 24
<210> 470
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 470
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 471
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 471
gcgagagata agggtataag tggaattaag gggggttctt actactacta ctatgccatg 60
gacgtc 66
<210> 472
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 472
Ala Arg Asp Lys Gly Ile Ser Gly Ile Lys Gly Gly Ser Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Ala Met Asp Val
20
<210> 473
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 473
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aacgcctgga tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaaaca aaattgatgg tgggacaaca 180
gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
gtttatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtttatta ctgttccacg 300
gtggactaca attggtactt cgatttctgg ggccgtggca ccctggtcac tgtctcctca 360
<210> 474
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 474
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Asn Lys Ile Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Thr Val Asp Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 475
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 475
ggattcactt tcagtaacgc ctgg 24
<210> 476
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 476
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp
1 5
<210> 477
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 477
attaaaaaca aaattgatgg tgggacaaca 30
<210> 478
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 478
Ile Lys Asn Lys Ile Asp Gly Gly Thr Thr
1 5 10
<210> 479
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 479
tccacggtgg actacaattg gtacttcgat ttc 33
<210> 480
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 480
Ser Thr Val Asp Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 481
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 481
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt ttctttggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatggtatg atggaactaa tgaaaactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagtc cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggctgttt actactgtgc gagagatagg 300
ggagtggcga catttacgag ggggaattac tactacaact acggtatgga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctca 387
<210> 482
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 482
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Glu Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Val Ala Thr Phe Thr Arg Gly Asn Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 483
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 483
ggattcacct tcagtttctt tggc 24
<210> 484
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 484
Gly Phe Thr Phe Ser Phe Phe Gly
1 5
<210> 485
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 485
atatggtatg atggaactaa tgaa 24
<210> 486
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 486
Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Glu
1 5
<210> 487
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 487
gcgagagata ggggagtggc gacatttacg agggggaatt actactacaa ctacggtatg 60
gacgtc 66
<210> 488
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 488
Ala Arg Asp Arg Gly Val Ala Thr Phe Thr Arg Gly Asn Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Asn Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 489
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 489
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt ttctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggaggg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccata tccagagaca attccaagaa catgctgtat 240
ctacaaatga ccagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagattcg 300
ggtaaaactg gaactgggat aactgggtac tcctactact acggtatgga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctca 387
<210> 490
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 490
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Gly Lys Thr Gly Thr Gly Ile Thr Gly Tyr Ser Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 491
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 491
ggattcacct tcagtttcta tggc 24
<210> 492
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 492
Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr Gly
1 5
<210> 493
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 493
atatggtatg atggaagtaa taaa 24
<210> 494
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 494
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 495
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 495
gcgagagatt cgggtaaaac tggaactggg ataactgggt actcctacta ctacggtatg 60
gacgtc 66
<210> 496
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 496
Ala Arg Asp Ser Gly Lys Thr Gly Thr Gly Ile Thr Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 497
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 497
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcatc actaatagtt attactgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaagggtct ggagtggatt ggtagtatct attatagtgg gaggacctac 180
tacaacccgt ccctcgagag tcgagtcacc atatccgtgg acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagt tgacctctgt gaccgccgca gacacggcta tatattactg tgcgagggaa 300
ggggatccgt cgctcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 498
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 498
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Thr Asn
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Asp Pro Ser Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 499
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 499
ggtggctcca tcatcactaa tagttattac 30
<210> 500
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 500
Gly Gly Ser Ile Ile Thr Asn Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 501
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 501
atctattata gtgggaggac c 21
<210> 502
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 502
Ile Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr
1 5
<210> 503
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 503
gcgagggaag gggatccgtc gctcgacccc 30
<210> 504
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 504
Ala Arg Glu Gly Asp Pro Ser Leu Asp Pro
1 5 10
<210> 505
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 505
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc acctatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcacat attagtggta gtggtggtaa ttcatactcc 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctatat 240
ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acggccatat attactgttc gctggatata 300
atggctacag taggcggtct ctttgcctac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 506
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 506
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Ser Tyr Ser Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Leu Asp Ile Met Ala Thr Val Gly Gly Leu Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 507
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 507
ggattcacct ttagcaccta tgcc 24
<210> 508
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 508
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala
1 5
<210> 509
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 509
attagtggta gtggtggtaa ttca 24
<210> 510
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 510
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Ser
1 5
<210> 511
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 511
tcgctggata taatggctac agtaggcggt ctctttgcct ac 42
<210> 512
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 512
Ser Leu Asp Ile Met Ala Thr Val Gly Gly Leu Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 513
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 513
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cgtctggatt catcttcagt ttctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagacaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa tgaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgg gagagatcaa 300
ggtatttcgt attacgatat tttgactggt aattataact attactacgg tgtggacgtc 360
tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tca 393
<210> 514
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 514
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Phe Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Asn Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 515
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 515
ggattcatct tcagtttcta tggc 24
<210> 516
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 516
Gly Phe Ile Phe Ser Phe Tyr Gly
1 5
<210> 517
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 517
atatggtatg atggaagtaa tgaa 24
<210> 518
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 518
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu
1 5
<210> 519
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 519
gggagagatc aaggtatttc gtattacgat attttgactg gtaattataa ctattactac 60
ggtgtggacg tc 72
<210> 520
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 520
Gly Arg Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val
20
<210> 521
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 521
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 522
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 522
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 523
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 523
cagagcatta gcagctat 18
<210> 524
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 524
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
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<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 525
gctgcatcc 9
<210> 526
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 526
Ala Ala Ser
1
<210> 527
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 527
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30
<210> 528
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 528
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 529
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 529
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 530
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 530
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 531
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 531
cagagtgtta gcagcagcta c 21
<210> 532
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 532
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 533
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 533
ggtgcatcc 9
<210> 534
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 534
Gly Ala Ser
1
<210> 535
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 535
cagcagtatg gtagctcacc ttggacg 27
<210> 536
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 536
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 537
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 537
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggaactggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg ggttggggaa atcagtcata gaggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca ctggacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgacct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag agacgaggaa 300
ctggaattcc gtttctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 538
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 538
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Ser His Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Arg Asp Glu Glu Leu Glu Phe Arg Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 539
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 539
ggtgggtcct tcagtggtta ctac 24
<210> 540
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 540
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 541
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 541
atcagtcata gaggaagcac c 21
<210> 542
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 542
Ile Ser His Arg Gly Ser Thr
1 5
<210> 543
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 543
tcgagagacg aggaactgga attccgtttc tttgactac 39
<210> 544
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 544
Ser Arg Asp Glu Glu Leu Glu Phe Arg Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 545
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 545
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctatttag cctggtacca acaaaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct cgtctatggt gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cattttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 546
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 546
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 547
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 547
cagagtgtta gcagctat 18
<210> 548
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 548
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
<210> 549
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 549
ggtgcatcc 9
<210> 550
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 550
Gly Ala Ser
1
<210> 551
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 551
cagcagcgta gcaactggcc gctcact 27
<210> 552
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 552
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 553
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 553
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggatt cacctttagc ctctatgcca tgacctgggt ccgccaggtt 120
ccagggaagg ggctggaatg ggtctcaact attagtggta gtggtggtgg cacatactac 180
acagactccg ttaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgacgac acggccgttt tttactgtac gaaagagagt 300
acaactggaa cttactccta cttctacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 554
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 554
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Thr Lys Glu Ser Thr Thr Gly Thr Tyr Ser Tyr Phe Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 555
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 555
ggattcacct ttagcctcta tgcc 24
<210> 556
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 556
Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr Ala
1 5
<210> 557
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 557
attagtggta gtggtggtgg caca 24
<210> 558
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 558
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 559
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 559
acgaaagaga gtacaactgg aacttactcc tacttctacg gtatggacgt c 51
<210> 560
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 560
Thr Lys Glu Ser Thr Thr Gly Thr Tyr Ser Tyr Phe Tyr Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 561
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 561
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gaccattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccctcagcgg tctccaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 562
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 562
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Leu Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 563
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 563
cagaccatta gcagctat 18
<210> 564
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 564
Gln Thr Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 565
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 565
gctgcatcc 9
<210> 566
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 566
Ala Ala Ser
1
<210> 567
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 567
caacagagtt acagtacccc gctcact 27
<210> 568
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 568
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 569
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 569
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 570
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 570
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 571
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 571
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
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260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 572
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 572
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
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260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 573
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 573
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
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260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 574
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aa 1-478: 人Lag3 (NP_002277.4的aa 29至450)
aa 451-478: myc-myc-六组氨酸标签
<400> 574
Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly
20 25 30
Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro
35 40 45
Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp
50 55 60
Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly
65 70 75 80
Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu
85 90 95
Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg
115 120 125
Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr
130 135 140
Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn
145 150 155 160
Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg
165 170 175
Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His
180 185 190
Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser
195 200 205
Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser
210 215 220
Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu
225 230 235 240
Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu
245 250 255
Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro
260 265 270
Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe
275 280 285
Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr
290 295 300
Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu
305 310 315 320
Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu
325 330 335
Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe
340 345 350
Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro
355 360 365
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370 375 380
Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr
385 390 395 400
Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala
405 410 415
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420 425 430
Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His
435 440 445
His His
450
<210> 575
<211> 655
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aa 1-683: 人Lag3 (NP_002277.4的aa 29至450)
aa 451-683: mIgG2aFc
<400> 575
Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly
20 25 30
Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro
35 40 45
Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp
50 55 60
Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly
65 70 75 80
Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu
85 90 95
Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg
115 120 125
Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr
130 135 140
Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn
145 150 155 160
Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg
165 170 175
Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His
180 185 190
Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser
195 200 205
Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser
210 215 220
Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu
225 230 235 240
Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu
245 250 255
Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro
260 265 270
Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe
275 280 285
Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr
290 295 300
Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu
305 310 315 320
Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu
325 330 335
Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe
340 345 350
Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro
355 360 365
Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys
370 375 380
Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr
385 390 395 400
Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala
405 410 415
Leu Pro Ala Gly His Leu Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys
420 425 430
Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
435 440 445
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
465 470 475 480
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
485 490 495
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser
500 505 510
Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
515 520 525
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile
530 535 540
Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
545 550 555 560
Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met
565 570 575
Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn
580 585 590
Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser
595 600 605
Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn
610 615 620
Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu
625 630 635 640
His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
645 650 655
<210> 576
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aa 1-533 (猕猴XP_005570011.1的aa 18至533，其经修饰以使用基于恒河猴XP_001108923.1的P取代位置74的氨基酸)
<400> 576
Ala Pro Val Lys Pro Pro Gln Pro Gly Ala Glu Ile Ser Val Val Trp
1 5 10 15
Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro
20 25 30
Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His
35 40 45
Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Pro Ala Pro Gly His Pro Pro Val
50 55 60
Pro Gly His Arg Pro Ala Ala Pro Tyr Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg
65 70 75 80
Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg
85 90 95
Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg
100 105 110
Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly
115 120 125
Glu Tyr Arg Ala Thr Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg
130 135 140
Leu Arg Leu Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Thr Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg
165 170 175
Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Ser Arg Gly Gln Gly
180 185 190
Arg Val Pro Val Gln Gly Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe
195 200 205
Leu Phe Leu Pro His Val Gly Pro Met Asp Ser Gly Leu Trp Gly Cys
210 215 220
Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Ala Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly
245 250 255
Ala Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Ala Val Gly
260 265 270
Thr Gln Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Ala Pro Pro Gly Gly Gly Pro
275 280 285
Asp Leu Leu Val Ala Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu
290 295 300
Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Ile Cys His Ile Arg Leu
305 310 315 320
Gln Gly Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr Val
325 330 335
Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu Cys
340 345 350
Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Gln Glu His Phe Val Trp Ser Pro Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala Gln
370 375 380
Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu His Gln Gly
385 390 395 400
Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser Pro
405 410 415
Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Arg Ala Gly His
420 425 430
Leu Pro Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Phe Leu Leu Leu Leu Val
435 440 445
Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro Arg
450 455 460
Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln Ser
465 470 475 480
Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro Glu
485 490 495
Leu Glu Arg Glu Leu Gly Pro Glu Pro Glu Pro Gly Pro Glu Pro Glu
500 505 510
Pro Glu Gln Leu
515
<210> 577
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 577
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Val Ala Thr Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
Lys
<210> 578
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 578
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Thr Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 579
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 579
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Val Ala Thr Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 580
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 580
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Ser His Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Arg Asp Glu Glu Leu Glu Phe Arg Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 581
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 581
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 582
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 582
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro
465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln
485 490 495
Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu
515 520 525
<210> 583
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 583
Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg
1 5 10 15
<210> 584
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 584
agcagctctg ccctcat 17
<210> 585
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 585
gctctggctg gtcttcagta tg 22
<210> 586
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 586
ttgccgtatg gttggtttga ac 22
<210> 587
<211> 665
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG3.Fc
<400> 587
Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
35 40 45
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
65 70 75 80
Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
85 90 95
Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu
100 105 110
Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala
115 120 125
Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu
130 135 140
Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser
145 150 155 160
Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala
165 170 175
Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg
180 185 190
Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln
195 200 205
Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg
210 215 220
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu
225 230 235 240
Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val
245 250 255
Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu
260 265 270
Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr
275 280 285
Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala
290 295 300
Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu
305 310 315 320
Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe
325 330 335
Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val
340 345 350
Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln
355 360 365
Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu
370 375 380
Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly
385 390 395 400
Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser
405 410 415
Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly His Leu Ile Glu Gly Arg
420 425 430
Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
435 440 445
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
450 455 460
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
465 470 475 480
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
485 490 495
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
500 505 510
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
515 520 525
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
530 535 540
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
545 550 555 560
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
565 570 575
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
580 585 590
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
595 600 605
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
610 615 620
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
625 630 635 640
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
645 650 655
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665
<210> 588
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG3胞外域P18627
<400> 588
Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly
20 25 30
Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro
35 40 45
Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp
50 55 60
Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly
65 70 75 80
Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu
85 90 95
Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg
115 120 125
Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr
130 135 140
Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn
145 150 155 160
Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg
165 170 175
Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His
180 185 190
Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser
195 200 205
Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser
210 215 220
Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu
225 230 235 240
Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu
245 250 255
Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro
260 265 270
Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe
275 280 285
Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr
290 295 300
Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu
305 310 315 320
Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu
325 330 335
Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe
340 345 350
Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro
355 360 365
Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys
370 375 380
Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr
385 390 395 400
Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala
405 410 415
Leu Pro Ala Gly His Leu
420
<210> 589
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLAG3表位
<400> 589
Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro
1 5 10 15
Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr
35 40

Claims (42)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段与人淋巴细胞活化基因3(LAG3)蛋白特异性结合，其中所述抗体或其抗原结合片段与LAG3的胞外域(SEQ ID NO：588的氨基酸28-71)中所含的一个或多个氨基酸相互作用，所述相互作用通过氢/氘交换所确定。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与SEQ ID NO：589中所含的一个或多个氨基酸相互作用，所述相互作用通过氢/氘交换所确定。
3.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自下组的氨基酸序列相互作用：(a)SEQ ID NO:588的氨基酸28至69；(b)SEQ IDNO:588的氨基酸28至71；(c)SEQ ID NO:588的氨基酸31至52；以及(d)SEQ ID NO:588的氨基酸32至69。
4.根据权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与SEQ ID NO：589中所含的至少10个氨基酸相互作用。
5.根据权利要求2或4所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与SEQ ID NO：589中所含的至少20个氨基酸相互作用。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与SEQ ID NO：589所示的氨基酸序列相互作用。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含在重链可变区(HCVR)中含有的三个重链互补性决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和在轻链可变区(LCVR)中含有的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中所述HCVR包含：
(i)SEQ ID NO：418所示的氨基酸序列，
(ii)与SEQ ID NO：418具有至少90％同一性的氨基酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：418具有至少95％同一性的氨基酸序列；或者
(iv)与SEQ ID NO：418有不超过5个氨基酸取代的氨基酸序列；
以及所述LCVR包含：
(i)SEQ ID NO：426所示的氨基酸序列，
(ii)与SEQ ID NO：426具有至少90％同一性的氨基酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：426具有至少95％同一性的氨基酸序列；或者
(iv)与SEQ ID NO：426有不超过5个氨基酸取代的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有一个或多个选自下组的特性：
(a)以小于约1.5nM的结合解离平衡常数(KD)结合单体人LAG3，所述KD由表面等离子体共振测定在25℃下测量；
(b)以小于约2nM的KD结合单体人LAG3，所述KD由表面等离子体共振测定在37℃下测量；
(c)以小于约20pM的KD结合二聚体人LAG3，所述KD由表面等离子体共振测定在25℃下测量；
(d)以小于约90pM的KD结合二聚体人LAG3，所述KD由表面等离子体共振测定在37℃下测量；
(e)以小于约2nM的EC50结合至表达hLAG3的细胞，所述EC50在流式细胞术测定中测量；
(f)以小于约2.3nM的EC50结合至表达mfLAG3的细胞，所述EC50在流式细胞术测定中测量；
(g)以小于约20nM的IC50阻断hLAG3与人II类MHC的结合，所述IC50通过细胞粘附测定所确定；
(h)以小于约15nM的IC50阻断hLAG3与小鼠II类MHC的结合，所述IC50通过细胞粘附测定所确定；
(i)对hLAG3与II类MHC的结合阻断超过90％，所述结合阻断通过细胞粘附测定所确定；
(j)以小于约2.5nM的EC50挽救LAG3介导的T细胞活性抑制，所述EC50在荧光素酶报告测定中所确定；以及
(k)以小于约1.2nM的EC50结合至活化的CD4+和CD8+T细胞，所述EC50在荧光素酶报告测定中所确定。
9.根据权利要求7或8所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR，所述HCVR含有与SEQ ID NO：418有不超过5个氨基酸取代的氨基酸序列。
10.根据权利要求7-9中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含LCVR，所述LCVR含有与SEQ ID NO：426有不超过5个氨基酸取代的氨基酸序列。
11.根据权利要求7-9中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR含有与SEQ ID NO：418有不超过5个氨基酸取代的氨基酸序列和所述LCVR含有与SEQ ID NO：426有不超过5个氨基酸取代的氨基酸序列。
12.根据权利要求7或8所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1含有SEQ ID NO：420所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：420有1个氨基酸不同的氨基酸序列，所述HCDR2含有SEQID NO：422所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：422有1个氨基酸不同的氨基酸序列，所示HCDR3含有SEQ ID NO：424所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：424有1个氨基酸不同的氨基酸序列，所示LCDR1含有SEQ ID NO：428所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：428有1个氨基酸不同的氨基酸序列，所示LCDR2含有SEQ ID NO：430所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：430有1个氨基酸不同的氨基酸序列，所示LCDR3含有SEQ ID NO：432所示的氨基酸序列或与SEQID NO：432有1个氨基酸不同的氨基酸序列。
13.根据权利要求7-12中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含HCVR，所述HCVR具有SEQ ID NO：418所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求7-13中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含LCVR，所述LCVR具有SEQ ID NO：426所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求7或8所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3，所述
HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3含有SEQ ID NO：
420-422-424-428-430-432所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求15所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：418/426所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
17.根据权利要求16所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO：579所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求16所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含重链和轻链，其中所述轻链包含SEQ ID NO：578所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求17或18所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：579/578所示的重链/轻链氨基酸序列对。
20.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与包含HCVR的3个CDR和LCVR的3个CDR的抗体竞争结合至LAG3，所述HCVR具有SEQ ID NO：418的氨基酸序列和所述LCVR具有SEQ ID NO：426所示的氨基酸序列。
21.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与包含HCVR的3个CDR和LCVR的3个CDR的抗体结合至LAG3上的相同表位，所述HCVR具有SEQ ID NO：418所示的氨基酸序列和所述LCVR具有SEQ ID NO：426所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求20或21所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有一个或多个选自下组的特性：
(a)以小于约1.5nM的结合解离平衡常数(KD)结合单体人LAG3，所述KD由表面等离子体共振测定在25℃下测量；
(b)以小于约2nM的结合解离平衡常数(KD)结合单体人LAG3，所述KD由表面等离子体共振测定在37℃下测量；
(c)以小于约20pM的结合解离平衡常数(KD)结合二聚体人LAG3，所述KD由表面等离子体共振测定在25℃下测量；
(d)以小于约90pM的结合解离平衡常数(KD)结合二聚体人LAG3，所述KD由表面等离子体共振测定在37℃下测量；
(e)以小于约2nM的EC50结合至表达hLAG3的细胞，所述EC50在流式细胞术测定中测量；
(f)以小于约2.3nM的EC50结合至表达mfLAG3的细胞，所述EC50在流式细胞术测定中测量；
(g)以小于约20nM的IC50阻断hLAG3与人II类MHC的结合，所述IC50通过细胞粘附测定所确定；
(h)以小于约15nM的IC50阻断hLAG3与小鼠II类MHC的结合，所述IC50通过细胞粘附测定所确定；
(i)对hLAG3与II类MHC的结合阻断超过90％，所述结合阻断通过细胞粘附测定所确定；
(j)以小于约2.5nM的EC50挽救LAG3介导的T细胞活性抑制，所述EC50在荧光素酶报告测定中所确定；以及
(k)以小于约1.2nM的EC50结合至活化的CD4+和CD8+T细胞，所述EC50在荧光素酶报告测定中所确定。
23.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-22中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的运载体或稀释剂。
24.一种分离的多核苷酸分子，所述分离的多核苷酸分子包含编码如权利要求1-22中任意一项所述的抗体的HCVR的多核苷酸序列。
25.一种分离的多核苷酸分子，所述分离的多核苷酸分子包含编码如权利要求1-22中任意一项所述的抗体的LCVR的多核苷酸序列。
26.一种载体，所述载体包含权利要求24或25所述的多核苷酸序列。
27.一种细胞，所述细胞表达权利要求26所述的载体。
28.一种在对象中抑制肿瘤或肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向需要其的所述对象施用治疗有效量的根据权利要求1-22中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述肿瘤是原发性或复发性肿瘤。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述肿瘤是成型的肿瘤。
31.根据权利要求28-30中任意一项所述的方法，其中所述肿瘤存在于患有选自下组的疾病或病症的对象中：血癌、脑癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、骨癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、间皮瘤、B细胞淋巴瘤和黑色素瘤。
32.根据权利要求28-31中任意一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段以初始剂量以及随后的一个或多个后续剂量施用，其中每个后续剂量在紧邻的上一次剂量后1至4周施用。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段以约1、3或10mg/kg所述对象体重的剂量施用。
34.根据权利要求28-33中任意一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂联合向所述对象施用。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二治疗剂选自下组：CTLA抑制剂、肿瘤特异性抗原的抗体、病毒感染的细胞抗原的抗体、PD-L1抑制剂、CD20抑制剂、针对CD20和CD3的双特异性抗体、膳食补充剂如抗氧化剂、VEGF拮抗剂、化疗剂、细胞毒剂、射线、NSAID、皮质类固醇以及任意其他可用于减轻与所述疾病或病症相关的至少一种症状的疗法。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二治疗剂是PD-1抑制剂。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述PD-1抑制剂是REGN2810、纳武单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab)。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述PD-1抑制剂以1、3或10mg/kg所述对象体重的剂量施用。
39.根据权利要求28-38中任意一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段经皮下、静脉内、皮内、腹膜内、口服、肌内或颅内施用。
40.一种用于治疗可通过拮抗LAG3治疗的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的所述对象施用治疗有效量的根据权利要求1-22中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述疾病或病症是由选自下组的病毒引起的慢性病毒感染：人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述疾病或病症选自下组：血癌、脑癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、骨癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、间皮瘤、B细胞淋巴瘤和黑色素瘤。
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