CN112010975B - Lag3结合片段及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，其与淋巴细胞活化基因3(LAG3)结合，并抑制、干扰或中和其至少一种活性。该抗LAG3抗体或抗原结合片段可用于治疗疾病，如癌症。
Description
技术领域
本发明涉及一种结合淋巴细胞活化基因3(LAG3)的抗体或其抗原结合片段，以及其制备方法和用于制备药物组合物、治疗疾病的用途。
背景技术
LAG3(lymphocyte activation gene 3，LAG3，CD223)属于免疫球蛋白超家族，是一种免疫检查点受体蛋白，主要表达在活化的T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞树突细胞。LAG3主要通过与配体MHC II分子的结合，下调T细胞的活性。抑制LAG-3能够让T细胞重新获得细胞毒性，从而增强对肿瘤的杀伤效果。同时抑制LAG-3还能够降低调节T细胞抑制免疫反应的功能。
临床数据还显示，在多种癌症类型中，如黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌等，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)表达LAG-3，这与癌细胞侵略性的临床特征相关联。而阻断LAG-3则可以逆转以上的抑制作用，恢复CD8+T细胞增殖和活性，并减少调节性T细胞数量；而且还提高了T细胞免疫应答的敏感度。同时再阻断PD-1，免疫反应会协同性增强，抑制肿瘤。那么LAG抑制剂与PD1抑制剂联合用药或可以增强。
发明内容
本发明全文中关于VL结构域、VH结构域、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3的各个实施方式可以各自单独实施，也可以任意组合实施。
在本发明的一个方面中，提供一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含如下(1)-(2)中VL结构域和VH结构域的任意一种组合：
(1)含有SEQ ID NO:5所示的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:6所示的LCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:11所示的LCDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:12所示的HCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:13所示的HCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:14所示的HCDR3氨基酸序列的VH结构域；
(2)含有SEQ ID NO:5所示的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:6所示的LCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7所示的LCDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:8所示的HCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:9所示的HCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:10所示的HCDR3氨基酸序列的VH结构域；
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含如下(1)-(2)中VL结构域和VH结构域的任意一种组合：
(1)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的VH结构域；
(2)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的VH结构域。
在本发明的一个方面中，所述抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或dsFv片段。
在本发明的一个方面中，本发明的抗体或其抗原结合片段结合淋巴细胞活化基因3(LAG3)。
在本发明的一个方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链恒定区。
在本发明的一个方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的轻链恒定区。
在本发明的一个方面中，本发明涉及一种核酸，其包含编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
在本发明的一个方面中，本发明涉及一种载体，其表达本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一个方面中，本发明涉及一种细胞，其表达本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一个方面中，本发明涉及使用本发明的抗体或其抗原结合片段治疗癌症的方法，包括将本发明的抗体或抗原结合片段给予有需要的受试者。优选地，所述癌症选自肺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、头颈癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、多种肉瘤、细胞瘤和白血病。
在本发明的一个方面中，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段用于治疗癌症或制备治疗癌症的药物组合物的用途。优选地，所述癌症选自肺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、头颈癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌和白血病。
在本发明的一个方面中，提供一种组合物，其包含本发明所述的特异性结合淋巴细胞活化基因3(LAG3)的抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括以下中的一种或多种：药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂、药物辅料。
在一些实施方式中，所述组合物还可以包含其他治疗剂。在一些实施方式中，其他治疗剂包括化疗剂、免疫治疗剂或激素治疗剂。所述抗体或抗原结合片段与其他治疗剂的联合施用能够增强治疗效果。
在一些实施方式中，所述其他治疗剂为免疫治疗剂，优选地，所述免疫治疗剂为抗PD1抗体或其抗原结合片段，优选地，所述抗PD1抗体为Opdivo。
在一些实施方式中，所述受试者是哺乳动物，例如人类。在另一些实施方式中，所述受试者是分离的细胞、组织或器官，例如离体培养的细胞。
在一些实施方式中，所述“增强治疗效果”是指增强其他治疗剂或疗法的治疗效果。本发明提供的所述抗体或抗原结合片段可以单独施用，也可以与其他治疗剂或疗法联合施用。在一些实施方式中，其他治疗剂或疗法包括化疗剂、免疫治疗剂、激素治疗剂、放射治疗、手术治疗。
本发明提供的抗体或抗原结合片段具有以下中的一种或多种：增强的LAG3蛋白结合能力、增强的刺激T细胞分泌IFN-γ能力、增强的促进T细胞增殖能力、与PD1抗体联用后增强的刺激T细胞分泌IFN-γ能力、与PD1抗体联用后增强的促进T细胞增殖能力。在一些实施方式中，所述对照抗体为现有技术中存在的特异性结合LAG3蛋白的抗体，例如可以通过数据库寻找这样的抗体。在一些实施方式中，所述对照抗体为LAG3-BMS抗体。
附图说明
图1A示出了小鼠四免后血清滴度。
图1B示出了小鼠七免后血清滴度。
图2示出了Elisa检测anti-LAG3与LAG3结合灵敏度。
图3示出了FACS检测anti-LAG3抗体在293T-LAG3细胞上的结合。
图4示出了FACS检测anti-LAG3抗体在细胞水平上的阻断活性。
图5示出了混合淋巴细胞反应检测anti-LAG3抗体体外细胞活性。
图6示出了Elisa检测anti-LAG3抗体与LAG3结合灵敏度。
图7示出了anti-LAG3抗体单用及联用IFN-γ分泌。
图8示出了anti-LAG3抗体单用及与opdivo联用的T细胞增殖活性。
图9A示出了LAG3-BMS与LAG3的亲和力。
图9B示出了LAG3Q34-CA46与LAG3的亲和力。
图9C示出了LAG3Q817-CA108.1与LAG3的亲和力。
图10示出了各组食蟹猴给予不同抗体后平均药时曲线。
图11示出了anti-LAG3抗体免疫原性检测。
图12示出了MC38小鼠结肠癌模型中各组肿瘤体积的生长曲线。
图13示出了给药结束后各实验组肿瘤重量比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，举出以下实施例是为了向本发明所属技术领域的一般专业人员就如何利用本发明之方法和组合物提供一个完整的公开和说明，并非用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1抗LAG3单克隆抗体的产生
实施例1.1小鼠免疫
用LAG3(义翘神州，16498-H08H)与弗氏佐剂乳化后免疫博安全人抗体转基因小鼠BoAn-hMab。本次共免疫20只小鼠，分别免疫至五免或者七免。选取5只血清滴度较高的小鼠加强免疫，3天后处死小鼠取出脾脏用于后续实验。
实施例1.2噬菌体库的建立
取免疫小鼠的脾脏细胞，加入Trizol(Thermo Scientific，目录货号15596-026)，待裂解充分后加入1/5体积的氯仿，充分混匀，室温放置20min后4℃12000rpm离心20min，取上层水溶液，并加入等体积的异丙醇，室温放置20min，4℃12000rpm离心20min，弃去上清水溶液，加入75％乙醇洗涤两次，4℃12000rpm离心5min，弃去水溶液，保留沉淀，室温风干后加入DEPC水重悬沉淀获得RNA，获得的RNA使用罗氏反转录试剂盒Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit(Roche Applied Science，目录货号4897030001)按照其说明书将RNA反转录成cDNA。噬菌体库的建立步骤参照Carlos F.Barbas III，Phage display：Alaboratory manual中记载的方法进行，首先用PCR的方法从cDNA中获得重链和轻链的可变区，再将重链和轻链的可变区通过重叠延伸PCR的方法获得ScFv，用SfiI(NEB,目录货号R0123L)对ScFv进行酶切50℃5h，酶切后的ScFv(单链Fv)与质粒pCOMB3x(公司Stratagene)连接，然后将连接产物电转染至大肠杆菌TG1感受态细胞中，37℃200rpm培养1h后，加入75mL 2YT培养基(添加了氨苄抗生素和葡萄糖)，37℃200rpm培养1.5h，取2mL进行OD600的测定，按照1:20的比例加入提前制备的phage，37℃静置30min，4000rpm离心取细菌沉淀，用100mL 2YT(添加氨苄抗生素和卡那抗生素)的培养基重悬后30℃200rpm培养过夜，次日，12000rpm离心10min取上清，加入4％PEG8000和3％NaCl，冰浴1h，4℃12000rpm离心30min，取沉淀加入2YT培养基重悬，加入7％DMSO后冻存备用。以编号为LAG3 Q8的小鼠建立的噬菌体库LAG3 Q8，库容5×108；以编号为LAG3 Q17的小鼠建立的噬菌体库LAG3 Q17，库容8×108；以编号为LAG3 Q3的小鼠建立的噬菌体库LAG3 Q3，库容6.4×108；以编号为LAG3 Q4的小鼠建立的噬菌体库LAG3 Q4，库容6×108。
实施例1.3噬菌体筛选
1.平板筛选，用LAG3蛋白(义翘神州，16498-H08H)以1μg/孔包被平板，4℃放置过夜，第二天通过2％BSA封闭平板1h，加入噬菌体库(2×1012)孵育2h，洗涤4-10次后用Elution Buffer(pH 2.2)洗脱LAG3特异性结合的噬菌体。
2.磁珠筛选，将LAG3-Fc蛋白(义翘神州，16498-H02H)按照常规步骤进行生物素化(投入的LAG3-Fc蛋白与生物素摩尔比1:2)，再与Thermo的磁珠(Invitrogen Dynabeads M-280Streptavidin，00355871)结合后与噬菌体库孵育，洗涤4-10次后用Elution Buffer(pH2.2)洗脱LAG3特异性结合的噬菌体。
克隆来源如表1。
表1.阳性克隆来源
| 克隆ID | 来源库 | 来源小鼠 | 淘洗方法 |
| LAG3Q34-CA46-IgG4 | Q3+Q4 | LAG3Q3，LAG3Q4 | 平板筛选 |
| LAG3Q34-CA242-IgG4 | Q3+Q4 | LAG3Q3，LAG3Q4 | 平板筛选 |
| LAG3Q817-CA108-IgG4 | Q8+Q17 | LAG3Q8，LAG3Q17 | 平板筛选 |
| LAG3Q817-CA116-IgG4 | Q8+Q17 | LAG3Q8，LAG3Q17 | 平板筛选 |
| LAG3Q817-CA139-IgG4 | Q8+Q17 | LAG3Q8，LAG3Q17 | 平板筛选 |
| LAG3Q817-CA141-IgG4 | Q8+Q17 | LAG3Q8，LAG3Q17 | 平板筛选 |
| LAG3Q2526-CA152-IgG4 | Q25+Q26 | LAG3Q25，LAG3Q26 | 平板筛选 |
| LAG3Q817-CA265-IgG4 | Q8+Q17 | LAG3Q8，LAG3Q17 | 平板筛选 |
| LAG3Q817-CA271-IgG4 | Q8+Q17 | LAG3Q8，LAG3Q17 | 平板筛选 |
实施例1.4抗体的分子构建与生产
将克隆LAG3Q34-CA46、LAG3Q2526-CA152、LAG3Q817-CA108\CA116\CA139\CA141\CA265\CA271送Invitrogen生物技术有限公司测序。各克隆氨基酸序列如表2。
表2.具有阻断活性克隆氨基酸序列
通过常规的分子生物学技术PCR(2×EasyPfu PCR SuperMix厂家：Transgen货号：AS211批号：#L11228)扩增抗体可变区序列、重叠延伸PCR获取信号肽与可变区基因的连接片段、同源重组(ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit厂家：Vazyme货号：C112-01批号：TE222B8)等方法，把编码VH结构域的核苷酸序列片段插入带有编码抗体重链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO:15)的核苷酸序列的载体pCDNA3.4(Life Technology)，把编码VL结构域的核苷酸序列片段插入带有编码抗体轻链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO:18)的核苷酸序列的载体pCDNA3.4(Life Technology)，转染进入HEK293细胞在37℃\8％CO2\125rpm摇床中培养，6-7天后的瞬时表达上清通过Protein A亲和层析，纯化获得anti-LAG3抗体，并通过UV280结合消光系数确定抗体浓度。
对照抗体生产：通过IMGT数据及专利CN201580006297确定百时美施贵宝LAG3抗体Relatlimab的氨基酸序列，全基因合成后插入载体pCDNA3.4通过HEK293细胞表达，生产的抗体命名为LAG3-BMS，其重链序列如SEQ ID NO:16所示，其轻链序列如SEQ ID NO:17所示。
实施例1.5 Elisa检测抗体与LAG3蛋白的结合
包被不同浓度(3.2μg/ml、0.8μg/ml、0.2μg/ml、0.05μg/ml、0.0125μg/ml、0.003125μg/ml、0.00078125μg/ml、0μg/ml)的蛋白LAG3(16498-H08H，义翘神州)，100μl/孔4℃过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1μg/ml候选抗体各100μl，37℃孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果见图2及表3。
如表3所示，候选抗体LAG3Q34-CA46与LAG3蛋白结合EC50值为0.01979，显著低于对照组LAG3-BMS的EC50值0.04932，说明候选抗体的抗原结合能力优于对照组LAG3-BMS。
如表3所示，候选抗体LAG3Q817-CA108与LAG3蛋白结合EC50值为0.02261，显著低于对照组LAG3-BMS的EC50值0.04932，说明候选抗体的抗原结合能力优于对照组LAG3-BMS。
预示候选抗体LAG3Q34-CA46、LAG3Q817-CA108相较对照组LAG3-BMS对LAG3蛋白有更强的靶向性和结合性，能达到更好的药学效果。
表3.Elisa检测anti-LAG3抗体与LAG3结合灵敏度数据
| 抗体名称 | EC50(μg/mL) | 抗体名称 | EC50(μg/mL) |
| LAG3Q34-CA46 | 0.01979 | LAG3Q34-CA242 | 0.01731 |
| LAG3Q817-CA108 | 0.02261 | LAG3Q817-CA271 | 0.03389 |
| LAG3Q817-CA116 | 0.02849 | LAG3Q817-CA265 | 0.02293 |
| LAG3Q817-CA139 | 0.05634 | LAG3Q2526-CA152 | 0.2639 |
| LAG3Q817-CA141 | 0.06501 | LAG3-BMS | 0.04932 |
实施例1.6流式细胞仪检测anti-LAG3抗体与细胞293T-LAG3的结合能力
96孔圆底板中，加入50μL 293T-LAG3细胞，细胞数为50000/孔，用FACS buffer(无菌PBS，0.2％BSA)梯度稀释各抗体，按50μL/孔加入96孔圆底板中，4℃孵育1h。2000rpm离心3min后弃上清，用FACS buffer洗2次，加入100μL/孔荧光二抗(Southern Biotech，2040-09)，终浓度1μg/ml，4℃孵育1h，2000rpm离心3min后弃上清，用FACS buffer洗2次后用100μL/孔FACS buffer重悬，用流式细胞仪(艾森，NovoCyte 2060)进行检测。结果见图3。
实施例1.7 FACS检测anti-LAG3抗体在细胞水平上阻断LAG3蛋白结合Daudi细胞的活性
将样品和LAG3-mFc(1μg/ml)(百普赛斯，LA3-H52Aa)按(50+50)μl/w转到96浅孔板中，混匀后室温孵育30min，之后将培养好的Daudi细胞按1×105/w转入到96孔浅孔板中，2500rpm离心3min后弃上清，转入混合好的100μl抗体样品，混匀后于4℃静置1h。2500rpm离心3min，用含0.2％BSA的DPBS洗涤细胞2次，加入100μl/w荧光二抗(1:200)(Biolegend，407108)混匀后于4℃静置1h。取出后2500rpm离心3min，用含0.2％BSA的DPBS洗涤细胞2次，用50μl/w含0.2％BSA的DPBS重悬，用流式细胞仪测定。抑制率％＝(MFI(buffer)-MFI(样品))/MFI(0浓度抗体)×100。结果见图4。
实施例1.8混合淋巴反应检测anti-LAG3抗体的体外功能
复苏CD4+T细胞，1000rpm离心5min，完全培养基重悬细胞并计数，用完全培养基调整细胞密度至1×106个/mL。将CD4+T细胞每孔100μL加入96孔细胞培养板，最终每孔有100000个活细胞，37℃，5％CO2培养箱培养5-7天。用包被缓冲液将200×俘获抗体(抗IL-2抗体或者抗IFN-γ抗体)稀释至1×，96孔酶标板每孔加入100μL，2℃-8℃孵育过夜；弃去板中的俘获抗体，用200μL PBST(PBS+0.05％吐温20)洗涤96孔酶标板4次；每孔加入200μL 1×Assay Diluent A，室温孵育1小时(500rpm)，用200μL PBST洗涤96孔酶标板4次；取1×Assay Diluent A稀释待测上清至合适比例，混匀，取100μL稀释好的上清加到包被有IFN-γ或IL-2俘获抗体的酶标板中。同时稀释标准品，每孔100μL加入酶标板，室温孵育2小时(500rpm)。用200μL PBST洗涤96孔酶标板4次；用1×Assay Diluent A将200×检测抗体(生物素标记的抗IL-2抗体或生物素标记的抗IFN-γ抗体)稀释至1×，取100μL加到96孔酶标板中，室温孵育1小时(500rpm)。用200μL PBST洗涤96孔酶标板4次；用1×Assay Diluent A将亲和素标记的辣根过氧化酶(Avidin-HRP)稀释1000倍，吸取1000μL加到96孔酶标板中，室温孵育30分钟。用200μL PBST洗涤96孔酶标板5次；在96孔板中加入100μL TMB显色液，室温孵育10-20分钟，加入50μL终止液(2M H2SO4)；用酶标仪检测450nm波长处的光吸收(OD450)。结果见图5。
实施例2候选抗体表征
实施例2.1 LAG3Q817-CA108分子改造
经过分析发现CA108重链中含有N糖位点，设计引物将N突变成K，获得的新克隆标记为CA108.1。序列如表4。
表4.LAG3Q817-CA108分子改造序列
使用ExpiCHOTM Expression System Kit(Thermofisher Scientific，货号：A29133)进行瞬时转染实验，考察各抗体瞬时表达水平。各抗体瞬时表达量如表5。
表5.各抗体瞬时表达产量一览表
| 抗体名称 | 瞬时表达产量(mg/L) | 大小异质性(SEC-HPLC) |
| LAG3-BMS | 172.5 | 99.14％ |
| LAG3Q817-CA108.1 | 505 | 99.55％ |
| LAG3Q34-CA46 | 144 | 99.49％ |
从瞬时转染表达量可以看出，LAG3Q817-CA108.1表达量最高，提示该抗体具有较好的生产可行性。
实施例2.2 Elisa检测候选抗体与LAG3蛋白的结合
包被不同浓度(4μg/ml、1μg/ml、0.25μg/ml、0.0625μg/ml、0.015625μg/ml、0.0039063μg/ml、0.0009766μg/ml、0μg/ml)的蛋白LAG3(16498-H08H，义翘神州)，100μl/孔4℃过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1ug/ml候选抗体各100μl，37℃孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果见图6及表6。
表6.Elisa检测anti-LAG3抗体与LAG3结合灵敏度
| 抗体名称 | EC50(μg/mL) | 抗体名称 | EC50(μg/mL) |
| LAG3Q817-CA108.1 | 0.026 | LAG3-BMS | 0.032 |
| LAG3Q34-CA46 | 0.022 | / | / |
如表6所示，候选抗体LAG3Q34-CA46与LAG3蛋白结合EC50值为0.022，低于对照组LAG3-BMS的EC50值0.032，说明候选抗体的抗原结合能力优于对照组LAG3-BMS。
如表6所示，候选抗体LAG3Q817-CA108.1与LAG3蛋白结合EC50值为0.026，低于对照组LAG3-BMS的EC50值0.032，说明候选抗体的抗原结合能力优于对照组LAG3-BMS。
预示候选抗体LAG3Q34-CA46、LAG3Q817-CA108.1相较对照组LAG3-BMS对LAG3蛋白有更强的靶向性和结合性，能达到更好的药学效果。
实施例2.3种属交叉反应及非特异性结合实验
以CBS包被液(pH9.6碳酸溶液)包被不同浓度(4μg/ml、1μg/ml、0.25μg/ml、0.0625μg/ml、0.015625μg/ml、0.0039063μg/ml、0.0009766g/ml、0μg/ml)的蛋白：鼠LAG3(53069-M08H，义翘神州)，猴LAG3蛋白(LA3-C5252)，人LAG3蛋白(16498-H08H，义翘神州)以及CD4(LE3-H5228，百普赛斯)100μl/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入2μg/ml候选抗体各100μl，37℃孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP(猴LAG3检测使用抗fab二抗)，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果显示各抗体均与CD4蛋白无交叉反应，与猴LAG3蛋白有不同程度结合。结果见表7。
表7.各抗体与不同种属LAG3蛋白结合以及CD4蛋白交叉反应
实施例2.4混合淋巴反应检测候选抗体刺激T细胞分泌IFN-γ及促进T细胞增殖的能力
复苏CD4+T细胞，1000rpm离心5min，完全培养基重悬细胞并计数，用完全培养基调整细胞密度至1×106个/mL。将CD4+T细胞每孔100μL加入96孔细胞培养板，最终每孔有100000个活细胞，37℃，5％CO2培养箱培养5-7天。用包被缓冲液将200×俘获抗体(抗IL-2抗体或者抗IFN-γ抗体)稀释至1×，96孔酶标板每孔加入100μL，2℃-8℃孵育过夜；弃去板中的俘获抗体，用200μL PBST(PBS+0.05％吐温20)洗涤96孔酶标板4次；每孔加入200μL 1×Assay Diluent A，室温孵育1小时(500rpm)，用200μL PBST洗涤96孔酶标板4次；取1×Assay Diluent A稀释待测上清至合适比例，混匀，取100μL稀释好的上清加到包被有IFN-γ或IL-2俘获抗体的酶标板中。同时稀释标准品，每孔100μL加入酶标板，室温孵育2小时(500rpm)。用200μL PBST洗涤96孔酶标板4次；用1×Assay Diluent A将200×检测抗体(生物素标记的抗IL-2抗体或生物素标记的抗IFN-γ抗体)稀释至1×，取100μL加到96孔酶标板中，室温孵育1小时(500rpm)。用200μL PBST洗涤96孔酶标板4次；用1×Assay Diluent A将亲和素标记的辣根过氧化酶(Avidin-HRP)稀释1000倍，吸取1000μL加到96孔酶标板中，室温孵育30分钟。用200μL PBST洗涤96孔酶标板5次；在96孔板中加入100μL TMB显色液，室温孵育10-20分钟，加入50μL终止液(2M H2SO4)；用酶标仪检测450nm波长处的光吸收(OD450)。IFN-γ分泌结果见图7，T细胞增殖结果见图8。
如图7所示，LAG3Q817-CA108.1与Opdivo联用，相较单独使用LAG3Q817-CA108.1、单独使用LAG3-BMS、LAG3-BMS与Opdivo联用，可以刺激T细胞分泌更多的IFN-γ。预示将来在临床上LAG3Q817-CA108.1与Opdivo联用可以更好的刺激免疫反应，达到抗肿瘤效果。
从图8可以看出，LAG3Q817-CA108.1无论是单用还是与Opdivo联用，相较单独使用LAG3-BMS、LAG3-BMS与Opdivo联用，都具有更强的刺激T细胞增殖的能力。预示将来在临床上可能会比LAG3-BMS具有更好的免疫细胞激活能力，从而促进免疫系统对肿瘤进行更强的杀伤。
实施例2.5 LAG3Q817-CA108.1、LAG3Q34-CA46与LAG3-BMS的亲和力比较
把ProA传感器在PBST中浸泡10min以上。用PBST把每个抗体稀释至3μg/mL。用PBST把LAG3稀释五个浓度梯度：12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.56nM、0.78nM，以PBST作为空白对照。设置每个样品的检测步骤：Baseline(100s)、Loading(300s和1nm)、Baseline(100s)、Association(300s)、Dissociation(300s)、用pH1.7甘氨酸缓冲液再生传感器后循环检测每个样品。实验结束后用软件Data Analysis9.0的1:1模式进行数据拟合。亲和力数据见表8及图9A-图9C：
表8.
RED96检测候选抗体结合动力学
| 抗体名称 | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | KD(M) |
| LAG3-BMS | 6.98E+05 | 3.46E-04 | 4.96E-10 |
| LAG3Q34-CA46 | 3.73E+05 | 5.12E-05 | 1.37E-10 |
| LAG3Q817-CA108.1 | 2.96E+05 | 1.07E-04 | 3.61E-10 |
实施例2.6候选抗体药代评估
每个抗体选3只食蟹猴静脉注射给药，剂量为5mg/kg，于给药前、给药后1min、15min、30min、6h及24h(Day 2)、72h(Day 4)、168h(Day 8)、240h(Day 11)、336h(Day 15)、408h(Day 18)、504h(Day 22)、576h(Day 25)和672h(Day 29)采血清通过Elisa法检测抗体浓度，具体结果见表9及图10。
表9.各组食蟹猴静脉注射三种抗体后的平均药动学参数
食蟹猴静脉注射给予LAG3Q817-CA108.1后，血药浓度很快达峰，缓慢下降，28天时浓度依然很高，T1/2为318.83h(约13.3天)，AUC(0-∞)为20340.53μg/mL*hour，CL为79.31mL/hour；给予LAG3-BMS后，T1/2为328.36h(约13.7天)，AUC(0-∞)为17981.41μg/mL*hour。总之，LAG3Q817-CA108.1和LAG3-BMS都具有很长的半衰期，从AUC(0-∞)上看LAG3Q817-CA108.1具有略好的药物暴露量。
同时，采用ELISA方法检测各抗体的免疫原性，具体方法如下：以CBS包被液(pH9.6碳酸溶液)包被LAG3Q817-CA108.1、LAG3Q34-CA46、LAG3-BMS分别为0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.125μg/ml，100μl/孔4℃过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入100×血清，100μl，37℃孵育1h；然后加入LAG3Q817-CA108.1-biotin、LAG3Q34-CA46-biotin、LAG3-BMS-biotin分别为0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.125μg/ml，37℃孵育1h。洗掉，继而加入链霉素/HRP，37℃孵育1h；显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果见图11。
从检测结果来看，受试抗体免疫原性都很低，LAG3Q817-CA108.1在0-28天期间免疫原性没有升高的迹象，提示临床上低的抗药抗体发生率。
实施例2.7候选抗体在PD-1/LAG3 double KI HuGEMM小鼠中治疗皮下小鼠结肠癌MC38模型的药效学研究
在PD-1/LAG3 double KI HuGEMM小鼠皮下接种MC38细胞，建立小鼠结肠癌皮下移植肿瘤模型。待肿瘤生长至平均体积88mm3时，根据肿瘤大小将40只小鼠随机分为5组，每组8只。实验设生理盐水对照组、Opdivo单药组、Opdivo与LAG3Q34-CA46联合给药组、Opdivo与LAG3Q817-CA108.1联合给药组及Opdivo与LAG3-BMS联合给药组，腹腔注射给药，每周给药两次，共给药三周。根据相对肿瘤抑制率(TGI)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。图12为MC38小鼠结肠癌模型中各组肿瘤体积的生长曲线。LAG3Q817-CA108.1或LAG3-BMS与Opdivo联用，都具有比opdivo更好的抑瘤效果，两者联用很有可能提高PD1单药在病人上的应答率，为癌症患者带来更好的治疗效果。
给药后21天处死小鼠检测肿瘤重量，从瘤重上比较受试抗体的抑瘤效果见图13。
本实验中，荷瘤小鼠对各受试抗体在测试剂量下耐受良好，未观察到明显药物毒性。Opdivo在2mg/kg剂量下对PD-1/LAG3 double KI HuGEMM小鼠皮下结肠癌MC38模型有轻微的抗肿瘤生长作用。当Opdivo与LAG3Q817-CA108.1或LAG3-BMS联合治疗时，抗肿瘤效果与Opdivo单独给药组相比有很大增强。从给药结束后的肿瘤重量比较，LAG3Q817-CA108.1联用opdivo的抑瘤效果优于LAG3-BMS联用opdivo。
序列表
<110> 山东博安生物技术有限公司
<120> LAG3结合片段及其用途
<150> 201910455307.3
<151> 2019-05-29
<150> 201910455531.2
<151> 2019-05-29
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Pro Glu Phe Ile Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Asp Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Val Val Trp Phe Gly Glu Leu Leu Asn Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 4
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Gly Ser Ile Leu Ser Gly Gly Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Trp Ala Ser
1
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe
1 5 10
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Glu Phe Ile Phe Ser Gly Tyr Thr
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Ile Ser Asp Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ala Arg Glu Gly Val Val Trp Phe Gly Glu Leu Leu Asn Tyr Tyr Tyr
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Gly Leu Asp Val
20
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Gln Gln Tyr Tyr Tyr Thr Pro Leu Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Ile Ser Tyr Asp Gly Asn His Glu
1 5
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Ala Arg Gly Gly Gly Ser Ile Leu Ser Gly Gly Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 15
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 16
<211> 447
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 17
<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
Claims (9)
1.一种结合淋巴细胞活化基因3(LAG3)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含VL结构域和VH结构域，其中，所述抗体或其抗原结合片段的VL结构域包含如SEQ ID NO:5所示的LCDR1、如SEQ ID NO:6所示的LCDR2和如SEQ ID NO:11所示的LCDR3，并且所述抗体或其抗原结合片段的VH结构域包含如SEQ ID NO:12所示的HCDR1、如SEQ IDNO:13所示的HCDR2和如SEQ ID NO:14所示的HCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:3所示的VL结构域，并且所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ IDNO:4所示的VH结构域。
3.根据权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段。
4.根据权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自scFv或dsFv。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症的药物组合物中的用途，其中所述癌症为结肠癌。
6.一种核酸，其包含编码根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
7.一种细胞，其表达根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
8.一种组合物，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述组合物，其特征在于，所述组合物中还包含抗PD1抗体或其抗原结合片段。
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Citations (4)
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Patent Citations (4)
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| The CD4-related molecule, LAG-3 (CD223),regulates the expansion of activated T cells;C.J.Workman等;《Eur.J.Immunol》;20030430;第33卷(第4期);第970-979页 * |
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