CN113637074A

CN113637074A - NKp46抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113637074A
Application number: CN202010394302.7A
Authority: CN
Inventors: 王冬旭; 杨达志; 戴朝辉; 吴海祥; 李郑武; 姚婧妘; 朱僧; 宫绪敏
Original assignee: Shanghai Huaiyue Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Huaiyue Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2021-11-12

Abstract

本发明公开了一种靶向NKp46的抗体、其制备方法和用途。具体地，本发明公开了一种新的靶向NKp46的人源单克隆抗体。本发明还公开了制备所述的单克隆抗体的方法。本发明的单克隆抗体能够高特异性地结合NKp46抗原，其具有很高的亲和力并且具有显著抗肿瘤等活性。

Description

NKp46抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗体领域，具体地涉及一种NKp46抗体及其制备方法和应用。

背景技术

保持有效的免疫监视而不引起自身免疫反应需要效应T细胞反应的准确性。当免疫系统针对自身抗原发起免疫反应时便出现自身免疫性疾病。尽管在引发和维持自身免疫性反应中涉及的机制还不清楚，但是可能涉及在次级淋巴器官中以前在免疫方面被忽视的抗原的出现。

自然杀伤(NK)细胞是包括在非传统免疫中涉及的淋巴细胞的亚种群。NK细胞提供一种有效的免疫监督机制，由此可消除不希望的细胞如肿瘤细胞或病毒感染的细胞。NK细胞活性是通过包含两种活化和抑制信号的复杂机制进行调控的。

NK细胞上的一重要的抑制性受体CD94-NKG2A，其与非典型的MHC I类分子 HLA-E相互作用。这些受体中的一些具有调节T细胞抗原受体-依赖性T细胞活化的阈值的能力。在罕见的抑制性受体缺乏的情况下，这些活化同类型(isoform) 可能扩大T细胞效应器的功能并且促成自身免疫病理。NKG2A的氨基酸序列在哺乳动物(包括灵长类动物)中发生变化。例如，人NKG2A蛋白的和猕猴同源性少于 90％。

已证实多种不同的NK特异性受体在NK细胞介导的对HLA I类缺陷型靶细胞的识别和杀伤中起重要作用。这些受体(称为NKp30、NKp46和NKp44)是Ig超家族的成员。它们的交联(通过特异性mAb诱导)导致強烈的NK细胞激活，致使细胞内 Ca⁺⁺水平升高，触发细胞毒性和淋巴因子释放。重要的是，单克隆抗体介导的 NKp30、NKp46和/或NKp44的活化导致对于多种靶细胞的NK细胞毒性的激活。这些发现为这些受体在天然细胞毒性中的一种中心性作用提供了证据。

尽管目前关于靶向NKp46的抗体已经开展相关研究，但仍需获得活性更强，亲和力更高的特异性抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种NKp46抗体及其制备方法和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:6所示的CDR1，

SEQ ID NO:10所示的CDR2，和

SEQ ID NO:14所示的CDR3；

或者，

SEQ ID NO:7的CDR1，

SEQ ID NO:11所示的CDR2，和

SEQ ID NO:15所示的CDR3；

或者，

SEQ ID NO:8所示的CDR1，

SEQ ID NO:12所示的CDR2，和

SEQ ID NO:16所示的CDR3；

或者，

SEQ ID NO:9的CDR1，

SEQ ID NO:13所示的CDR2，和

SEQ ID NO:17所示的CDR3，

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留对NKP46的结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。

在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、2、3或 4所示。

在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本发明第一方面所述的重链可变区。

在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。

在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:18所示的CDR1’，

SEQ ID NO:19所示的CDR2’，和

SEQ ID NO:20所示的CDR3’，

在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。

在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。

在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)本发明第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)本发明第三方面所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：本发明第二方面所述的重链；和/或本发明第四方面所述的轻链。

在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。

在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1恒定区，且所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。

在另一优选例中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。

在另一优选例中，所述人源化抗体的CDR区包含1、2、或3个氨基酸的变化。

在另一优选例中，所述的动物为非人哺乳动物，较佳地为鼠、羊、兔。

在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。

在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，较佳地为20％，更佳地为10％。

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代的至少一个氨基酸序列为同源性为至少80％的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的衍生序列具有结合NKP46的活性。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO: 1、2、3或4所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。

在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。

在另一优选例中，所述抗体对NKP46的亲和力EC50为0.384-5.365nM，较佳地为0.384nM。

在另一优选例中，所述抗体可以与NK细胞表面的NKP46结合并激活所述的 NK细胞。

本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

本发明的第七方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的抗原结合结构域的scFv段为特异性结合于NKP46的结合区，并且所述scFv具有如本发明第一方面所述的重链可变区和如本发明第三方面所述的轻链可变区。

本发明的第八方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第七方面所述的CAR构建物。

本发明的第九方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、或其组合；和

(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。

本发明的第十方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、本发明第八方面所述的免疫细胞、本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合，所述活性成分用于(a)制备检测试剂、检测板或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗癌症和/或NKP46表达或功能异常相关的疾病的药物。

在另一优选例中，所述检测试剂、检测板或试剂盒用于：

(1)检测样品中的NKP46；和/或

(2)检测免疫细胞表面的NKP46；和/或

(3)检测表达NKP46的免疫细胞。

在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞、B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞。

在另一优选例中，所述的药物用于激活NK细胞的杀伤活性。

在另一优选例中，所述的NKP46表达或功能异常相关的疾病选自下组：癌症、自身免疫疾病、代谢相关疾病、感染疾病、或其组合。

在另一优选例中，所述的癌症包括实体瘤、血液癌。

在另一优选例中，所述代谢相关疾病包括：糖尿病、食源性肥胖和脂肪炎症。

在另一优选例中，所述感染疾病包括：细菌和病毒感染。

本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：

(i)活性成分，所述活性成分选自下组：本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、本发明第八方面所述的免疫细胞、本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。

本发明的第十二方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；或

(2)本发明第六方面所述的重组蛋白；

(3)本发明第七方面所述的CAR构建物。

本发明的第十三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第十二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

本发明的第十四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第十三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第十二方面所述的多核苷酸。

本发明的第十五方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中NKP46的方法，所述方法包括步骤：

(1)在体外，将所述样品与本发明第五方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在 NKP46。

本发明的第十六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明第五方面所述的抗体或本发明第九方面所述的免疫偶联物。

本发明的第十七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明第五方面所述的抗体；和/或

(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明第五方面所述的抗体的二抗；

或者，所述试剂盒含有本发明第十六方面所述的检测板。

本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第十四方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。

本发明的第十九方面，提供了一种激活NK细胞杀伤活性的方法，所述方法包括：给需要的对象施用本发明第五方面所述的抗体、所述抗体的抗体-药物偶联物、或表达所述抗体的CAR-T细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述的方法还包括：给需要的对象施用其他药物或治疗方法进行联合治疗。

在另一优选例中，所述的其他药物或治疗方法包括：抗肿瘤免疫治疗药物、肿瘤靶向药物、肿瘤化疗药物、肿瘤放射治疗。

在本发明的第二十方面，提供了一种制备嵌合抗体的方法，包括步骤：

将本发明第一方面所述的重链可变区和/或本发明第三方面所述的轻链可变区的核苷酸序列克隆入含有人抗体恒定区的核苷酸序列的表达载体后，通过转染动物细胞表达人-鼠嵌合抗体。

在本发明的第二十一方面，提供了一种制备人源化抗体的方法，包括步骤：

将本发明第一方面所述的重链可变区和/或本发明第三方面所述的轻链可变区中的CDR区的核苷酸序列植入含人源抗体FR区的核苷酸序列模板，再将其克隆入含有人抗体恒定区的表达载体后，通过转染动物细胞表达人源化抗体。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1a显示了SDS-PAGE分析的人源NKp46免疫原。

图1b显示了SDS-PAGE分析的猕猴NKp46免疫原。

图1c显示了酶联免疫吸附测定(ELISA)检测人源NKp46显示了ECD-Fc蛋白的生物素化。

图1d显示了酶联免疫吸附测定(ELISA)检测猕猴NKp46 ECD-Fc蛋白的生物素化。

图2a显示了酶联免疫吸附测定(ELISA)检测NKp46抗体与生物素化人源 NKp46-ECD-Fc蛋白的结合。

图2b显示了酶联免疫吸附测定(ELISA)检测NKp46抗体与生物素化猕猴 NKp46-ECD-Fc蛋白的结合。

图2c显示了酶联免疫吸附测定(ELISA)检测NKp46抗体与生物素化Fc蛋白的结合。

图3a显示了流式细胞(FACS)检测NKp46抗体与细胞表面的人源NKp46的结合。

图3b显示了流式细胞(FACS)检测NKp46抗体与细胞表面的猕猴NKp46的结合。

图3c显示了流式细胞(FACS)检测NKp46抗体与亲代CHOK1细胞的结合。

图4显示了流式细胞(FACS)检测NKp46抗体与原代NK的结合。

图5a显示了流式细胞(FACS)检测NKp46作用原代NK后CD107a阳性NK细胞的比例。

图5b显示了流式细胞(FACS)检测NKp46作用原代NK后CD69阳性NK细胞的比例。

图6显示了酶联免疫吸附(ELISA)检测NKp46作用原代NK后IFNγ水平的变化。

图7显示了酶联免疫吸附(ELISA)检测NKp46抗体与NKp46、NKp44和NKp30的结合。

注：附图中的抗体编号Ab-1、Ab-2、Ab-3、Ab-4分别与实施例中的抗体编号NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4具有相同含义。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，通过common light chain噬菌体展示技术，获得一组具有全新氨基酸序列的人源NKp46抗体。本发明所述NKp46抗体可以和人NKp46结合，具有高亲和力(KD达到3.24×10^-8M)；并且所述NKp46抗体能够结合NKp46蛋白受体的胞外区；所述NKp46抗体能够显著增加NK92或人NK细胞对靶细胞的杀伤效果；基于原代NK细胞活性实验检测，其生物学活性显著优于参比抗体。此外，本发明所述的NKp46抗体特异性高，缺乏与人NKp44和NKp30 同家族蛋白抗原的交叉反应。本发明所述的NKp46抗体能够用于激活机体对肿瘤的天然免疫反应、单独或与抗PD-1等单克隆抗体或其它抗肿瘤药物联合的肿瘤免疫治疗中。本发明抗体能够运用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病等药物的制备中。在此基础上完成了本发明。

术语

NKp46

自然杀伤细胞(NK)是体内一类十分重要的淋巴细胞，在天然免疫和获得性免疫中均发挥重要作用。在NK细胞表面存在两类表面受体，根据其功能可分为抑制型和激活型两类受体，分别介导NK细胞的不同识别模式，传递不同的活化信号和抑制信号。CD94/NKG2家族是研究较多的一类受体家族，主要包括NKG2A， NKG2B，NKG2C，NKG2D，NKG2E，NKG2F，NKG2H等成员。其中，NKG2A属抑制性受体，其配体是非经典主要组织相容性复合物I类分子-HLA-E。NK细胞同时表达激活型受体，如CD16a(FcγRIIIA)、NKG2D、SLAM家族成员和自然细胞毒性受体 (NCRs)。NK细胞的完全激活需要不同激活受体的共同参与。NKp46是一种46kDa 的糖蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族，在肿瘤浸润淋巴细胞上表达频繁。抗体激活NKp46不仅能引起NK细胞的杀伤作用，而且能引起细胞因子的释放。综上所述，NKp46是一个很有前途的抗肿瘤治疗靶点。在这里，我们描述了用(通用型轻链common light chain)噬菌体展示法发现全人NKp46抗体

抗体

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约 150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H) 组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR 通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和 IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA 和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的 FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利 5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。

在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。

在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

抗NKp46的抗体

本发明中，所述抗体为抗NKp46的抗体。本发明提供一种针对NKp46的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。

优选地，

所述的重链可变区(VH)具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO:6所示的CDR1，

SEQ ID NO:10所示的CDR2，和

SEQ ID NO:14所示的CDR3；

或者，

SEQ ID NO:7的CDR1，

SEQ ID NO:11所示的CDR2，和

SEQ ID NO:15所示的CDR3；

或者，

SEQ ID NO:8所示的CDR1，

SEQ ID NO:12所示的CDR2，和

SEQ ID NO:16所示的CDR3；

或者，

SEQ ID NO:9的CDR1，

SEQ ID NO:13所示的CDR2，和

SEQ ID NO:17所示的CDR3，

所述的轻链可变区(VL)具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO:18所示的CDR1’，

SEQ ID NO:19所示的CDR2’，和

SEQ ID NO:20所示的CDR3’，

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKp46结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin， H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物 (Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和 FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST 手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

较佳地，本文所述抗体为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment， scFv)、单域抗体(single domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。

所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。

本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、 (Fab’)2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及 IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。

所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。

其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。

本发明抗体可以是靶向NKp46(例如人NKp46)的嵌合抗体、人源化抗体、CDR 嫁接和/或修饰的抗体。

本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为 1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1-4

在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5

在另一优选例中，所述靶向NKp46的抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列，和 /或，轻链可变区氨基酸序列如下表1所示：

表1 NKp46抗体可变区氨基酸序列编号

抗体编号	VH序列编号	VL序列编号
			NKp46-1	SEQ ID NO:1	SEQ ID NO:5
NKp46-2	SEQ ID NO:2	SEQ ID NO:5
			NKp46-4	SEQ ID NO:3	SEQ ID NO:5
NKp46-5	SEQ ID NO:4	SEQ ID NO:5

重组蛋白

本发明还提供一种重组蛋白，其包括NKp46抗体的重链CDR1(VH-CDR1)、重链CDR2(VH-CDR2)和重链CDR3(VH-CDR3)中的一种或多种，和/或，NKP46抗体的轻链CDR1(VL-CDR1)、轻链CDR2(VL-CDR2)和轻链CDR3(VL-CDR3)中的一种或多种，

所述重链CDR1-3的序列如下：

CDR1(VH):

SYEMN(SEQ ID NO:6)

SYAMS(SEQ ID NO:7)

DYYMS(SEQ ID NO:8)

DYAMH(SEQ ID NO:9)

CDR2(VH):

YISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:10)

AISSSGSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:11)

FIRSEAYGGTTEYAASVKG(SEQ ID NO:12)

VIYSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:13)

CDR3(VH):

VWRFYFDY(SEQ ID NO:14)

EYYYYGMDV(SEQ ID NO:15)

GDRYCSSTSCWFDY(SEQ ID NO:16)

GAQWLVN(SEQ ID NO:17)

所述轻链CDR1-3的序列如下：

CDR1(VL):

RASQGISNALA(SEQ ID NO:18)

CDR2(VL):

AASRLES(SEQ ID NO:19)

CDR3(VL):

QQHYSTPPT(SEQ ID NO:20)

在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括NKp46抗体的重链可变区和/ 或NKp46抗体的轻链可变区，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1-4所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述重组蛋白及其包括的重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号如表2所示：

表2重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号

较佳地，所述的重组蛋白还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区，更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区，更佳地为人源抗体轻链恒定区。

所述的重组蛋白为本领域常规的蛋白质，较佳地，其为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)、单域抗体(single domain antibody，sdAb) 和单区抗体(Signle-domainantibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。

所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)。

所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。

所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。

其中，所述重组蛋白的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述重组蛋白。

核酸

本发明还提供一种核酸，其编码上述的抗体(例如抗NKp46的抗体)或重组蛋白或抗NKp46的抗体的重链可变区或轻链可变区。

较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:21- 24所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:25 所示。

更佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:21- 24所示；且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:25所示。

所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。

本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

载体

本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。

本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

抗体的制备

本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO- S、HEK-293细胞。

通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定 (ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal. Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。

本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC) 和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

抗体-药物偶联物(ADC)

本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。

典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。

本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。

抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体- 功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。

抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于 5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。

连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。

药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。

有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素 /倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines) 和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepinecontaining drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类 (oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。

在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。

通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。

本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。

在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。

在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：

其中：

Ab是抗体，

LU是接头；

D是药物；

而且下标p是选自1到8的值。

应用

本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。

较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗与NKp46表达或功能异常相关的疾病的药物。

本发明中，所述与NKp46表达或功能异常相关的疾病是本领域常规的与 NKp46表达或功能异常相关的疾病。较佳地，所述与NKp46表达或功能异常相关的疾病为癌症、自身免疫疾病，炎性疾病。

本发明中，所述癌症为本领域常规的癌症。

本发明中，所述自身免疫疾病为本领域常规的自身免疫疾病，较佳地为溶血性贫血，恶性贫血，结节性多动脉炎，系统性红斑狼疮，阿尔兹海默症，糖尿病等。

本发明抗体、ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，包括(但并不限于)：

(i)诊断、预防和/或治疗肿瘤发生、生长和/或转移，尤其是NKp46表达或功能异常相关的肿瘤。

(ii)诊断、预防和/或治疗自身免疫疾病，所述自身免疫疾病包括(但并不限于)：较佳地为溶血性贫血，恶性贫血，结节性多动脉炎，系统性红斑狼疮，阿尔兹海默症，糖尿病等。

(iii)诊断、预防和/或治疗炎性疾病，所述炎性疾病包括(但并不限于)：类风湿关节炎，血管球性肾炎，重症肌无力，多发性硬化，斑秃等。

检测用途和试剂盒

本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。

本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。

本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。

配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。

本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)NK细胞(CAR-NK)免疫疗法等。

本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与NKp46表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。

本发明的药物组合物可直接用于结合NKp46蛋白分子，因而可用于预防和治疗肿瘤等疾病。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。

本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50 毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗与NKp46表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用。较佳地，所述与NKp46表达或功能异常相关的疾病为癌症、自身免疫疾病，炎性疾病。

检测样品中NKp46蛋白的方法、组合物

本发明还提供一种检测样品中NKp46蛋白(例如检测过表达NKp46细胞)的方法，包括如下的步骤：上述的抗体与待检样品在体外接触，检测上述的抗体与所述待检样品是否结合形成抗原-抗体复合物即可。

所述的过表达的含义为本领域常规，指NKp46蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。

本发明中，上述是否结合形成抗原-抗体复合物的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为流式细胞实验(FACS)检测。

本发明提供一种检测样品中NKp46蛋白的组合物，其包括上述的抗体、重组蛋白、抗体偶联物、免疫细胞、或其组合作为活性成分。较佳地，其还包括上述的抗体的功能片段组成的化合物作为活性成分。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明所述的NKp46抗体，其与NKp46蛋白具有高度亲和力(亲和力常数 KD达到1.10×10^-9-3.24×10^-8M)；

(2)本发明NKp46抗体能够结合NKp46蛋白受体的胞外区；

(3)本发明所述的NKp46抗体特异性高；

(4)本发明抗体能显著增加NK细胞对肿瘤细胞的裂解杀伤活性。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10～30℃。

实施例1蛋白免疫原的制备

(1)人源NKp46免疫原的制备

将含有编码人源NKp46蛋白胞外区氨基酸序列Met1-Arg258(氨基酸序列如 SEQID NO:26所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示)的核苷酸序列克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体(购自Invitrogen，V044-50)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒。对HEK293细胞(购自Invitrogen)进行瞬时转染 (PEI，Polysciences)并使用FreeStyleTM 293(Invitrogen)在37℃下进行扩大培养。4天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含NKp46蛋白胞外区异源二聚蛋白的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A亲和层析柱(Mabselect Sure，购自GE Healthcare)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)清洗蛋白A亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用0.1M甘氨酸盐酸(pH2.5)洗脱，收集从蛋白A亲和层析柱上洗脱下来的带hFc标签的NKp46蛋白(NKp46-hFc)，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2) 在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的免疫原A。免疫原A在使用前进行一系列质控检测，包括检测其蛋白浓度、纯度、分子量、生物活性等。

(2)猕猴NKp46免疫原的制备

将含有编码猕猴NKp46蛋白胞外区氨基酸序列Pro22-Arg257(氨基酸序列如SEQID NO:28所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示)的核苷酸序列克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体(购自Invitrogen，V044-50)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒。对HEK293细胞(购自Invitrogen)进行瞬时转染(PEI，Polysciences)并使用FreeStyleTM 293(Invitrogen)在37℃下进行扩大培养。4天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含NKp46蛋白胞外区异源二聚蛋白的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A亲和层析柱(Mabselect Sure，购自GE Healthcare)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)清洗蛋白A亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用0.1M甘氨酸盐酸(pH2.5)洗脱，收集从蛋白A 亲和层析柱上洗脱下来的带hFc标签的NKp46蛋白(NKp46-hFc)，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于 -80℃保存，即获得纯化的免疫原A。免疫原A在使用前进行一系列质控检测，包括检测其蛋白浓度、纯度、分子量、生物活性等。

(3)NKp46蛋白的生物素化

用0.15M的Na₂HCO₃透析上述制备的蛋白免疫原(即hNkp46 ECD-Fc和猕猴 NKp46蛋白胞外区)。。将Biotin-NHS(购自Sigma Aldrich)溶解于DMF中，终浓度为10mg/mL。按照Biotin-NHS和蛋白免疫原摩尔比8:1的比例，加入所需量的Biotin-NHS(终浓度为1mg/mL)，室温放置30分钟后，加入1M的NH₄Cl终止反应。然后用PBS磷酸缓冲液(pH7.4)4℃透析过夜以去除游离的生物素，得到生物素化的免疫原(即生物素化的hNKp46 ECD-Fc和猕猴NKp46ECD-Fc)。生物素化hNKp46 ECD-Fc和猕猴NKp46 ECD-Fc的浓度可以利用BCA蛋白浓度测定试剂盒 (购自Pierce)进行测定。得到的生物化的hNKp46 ECD-Fc浓度为0.67mg/mL,生物化的猕猴NKp46 ECD-Fc的浓度为0.23mg/mL。

结果如图1a-1d和表3所示，成功制得人源NKp46免疫原、猕猴NKp46免疫原和生物素化的NKp46蛋白。

表3人源NKp46免疫原、猕猴NKp46免疫原和生物素化NKp46蛋白的制备

抗原	蛋白浓度(mg/mL)	SEC纯度
			人源NKp46	0.452	63％
猕猴NKp46免疫原	0.165	90％

实施例2噬菌体展示技术筛选NKp46抗体

利用人通用轻链(Common light chain)噬菌体展示库(由上海睿智化学研究有限公司构建)筛选先导抗体。通过三轮生物淘选得到与NKp46结合的抗体。

具体过程如下：

第一轮生物淘选，准备A、B、C、D四管，在A管中先加入1mL链霉亲和素偶联的Dynabeads(购自Invitrogen)及20μg生物素化的Fc蛋白，在B管中先加入 1mL链霉亲和素偶联的Dynabeads。然后在四管中分别加入10mL封闭液，即含有 2％(w/v)脱脂奶粉的PBS磷酸缓冲液，将B、C管室温封闭2小时，A、D管室温孵育 15min。将D管液体倒掉，将A管结合生物素化Fc蛋白的磁珠用封闭液洗涤3次后转移至D管，然后加入噬菌体ScFv抗体库，将D管室温封闭2小时。将C管中的液体倒掉，加入D管上清，然后加入20μg实施例1制得的生物素化hNKp46ECD-Fc，室温振荡孵育2小时。并且设置对照管，除了未加入生物素化hNKp46 ECD-Fc，其余条件相同，同样室温振荡孵育2小时。将B管离心获得封闭后的磁珠，加入孵育后的混合液，室温振荡孵育15分钟。置于磁力架中30秒，用1mLPBST，即含有0.05％(v/v)Tween-20的封闭液洗涤5次，再用封闭液、PBS缓冲液洗涤5次。洗涤后，每管加入1mL的10μg/mL胰酶，37℃孵育30分钟以洗脱与生物素化 hNKp46 ECD-Fc结合的噬菌体。将1mL的胰酶溶液加到4mL处于对数生长期的大肠杆菌TG1(购自LUCIGEN)中，37℃孵育30分钟，得到TG1的培养液。将TG1的培养液梯度稀释，涂布平板，37℃培养过夜。计算所得的与生物素化hNKp46 ECD- Fc结合的克隆数和对照管的克隆数，并挑选20～40个克隆测序。

同时，将平板上的克隆用2YT/氨苄青霉素培养基(2YT培养基的配制方法为：将10g酵母提取物、16g胰蛋白胨和5g NaCl加入1L水中，用NaOH调至pH7.0，高压灭菌)洗涤、收集，并接种到新鲜培养基中，37℃培养至对数期。加入辅助噬菌体M13KO7(购自NEB，货号N0315S)，辅助噬菌体与大肠杆菌TG1比例为1:1000，混匀，37℃静置30分钟。然后37℃振荡培养30分钟，4000rpm离心10分钟后收集细胞，加入新鲜2YT/卡那霉素培养基，30℃振荡培养4小时。5000rpm离心15 分钟，收集上清，加入1/4上清体积的含有20％PEG6000的2.5M的NaCl溶液，冰上放置过夜。5000rpm，4℃离心30分钟，收集噬菌体沉淀，溶解在PBS缓冲液中。10000rpm离心10分钟去除残留的细胞碎片，收集上清进行下一轮的生物淘选。

第二轮生物淘选的步骤与第一轮一致，淘选体系为1mL,富集与生物素化的hNKp46 ECD-Fc特异性结合的ScFv抗体序列。

第三轮生物淘选，用TryplE express(购自Invitrogen)消化CHOK1-hNKp46 细胞，CHOK1-blank细胞。加入含10％(v/v)FBS(购自Biological)的F12K培养基(购自Thermofisher)终止消化反应。细胞计数。将细胞用PBS洗涤一次。每种类型的细胞，取1-5E7个细胞。

准备A、B、C三管，在A管中先加入噬菌体ScFv抗体库，在B管中加入1E7个 CHOK1-hNKp46细胞，在C管中加入1E7个CHOK1-blank细胞，然后在三管中分别加入10mL封闭液，即含有2％(w/v)脱脂奶粉的PBS磷酸缓冲液，将A、B、C管在4℃振荡封闭1小时。300g,4℃离心5min收集C管细胞和A管上清。将C管中的液体倒掉，加入A管上清，重悬细胞。4℃振荡孵育1小时。300g,4℃离心5min收集B管细胞和C管上清。B管设置对照管。将B管中的液体倒掉，加入C管上清，重悬细胞。4℃振荡孵育2小时。300g,4℃离心5min收集B管细胞，倒掉上清，用10mLPBS 洗涤一次。用1mLPBS重复洗涤两次。用1mL甘氨酸缓冲液(0.1M，pH 2.2)重悬细胞，室温振荡孵育15分钟。18000g,4℃离心10min，将上清转移至新的管中，并加入100uLTris缓冲液(2M,pH 8.0)中和溶液。将1mL的溶液加到4mL处于对数生长期的大肠杆菌TG1(购自LUCIGEN)中，37℃孵育30分钟，得到TG1的培养液。将TG1的培养液梯度稀释，涂布平板，37℃培养过夜。计算所得的与CHOK1- hNKp46细胞结合的克隆数和对照管的克隆数，并挑选20～40个克隆测序。

从第三轮的平板中挑选单克隆于96孔板培养，每孔加入200μL含氨苄青霉素和2％(w/v)葡萄糖的2YT培养基，37℃、1000rpm振荡培养过夜。取10μL过夜培养的上清加到400uL含含氨苄青霉素的2YT培养基抗生素培养基中，37℃、250 rpm振荡培养1.5-2.5小时至OD600达到0.5-0.6。添加终浓度为1mM的IPTG，30 ℃振荡培养16小时，4000rpm离心10分钟，上清即得到单链抗体。

用FACS方法确定筛选得到的单链抗体具有与CHOK1-hNKp46细胞的结合活性。将CHOK1-hNKp46与CHOK1-blank MFI值比值大于9的克隆挑选出来进行测序，得到具有不同重链CDR3序列的克隆。然后再通过FACS筛选确定候选克隆具有与 CHOK1-cyno NKp46细胞的结合活性，选择FACS实验中MFI值>100的克隆作为符合条件的阳性克隆。

结果如表4所示，筛选获得12株阳性克隆，能特异性结合CHOK1-hNKp46细胞，其中4株阳性克隆能不同程度地特异性结合CHOK1-cyno NKp46细胞。阳性克隆可变区及CDR区氨基酸序列如表5所示。

表4 FACS筛选结果

表5阳性克隆可变区及CDR区氨基酸序列

实施例3噬菌体来源的先导抗体的生产和纯化

根据实施例2中获得的阳性克隆的测序结果，设计引物通过PCR方法分别扩增轻链和重链的可变区。配置50μL反应体系，包括0.5μL含有转染阳性克隆大肠杆菌TG1中提取的质粒、每种引物10pmol、25μL Q5高保真DNA聚合酶以及加水补足至50μL。设置PCR程序，预变性95℃5分钟，变性95℃30秒，退火 55℃30秒，延伸68℃30秒，25个循环后再额外68℃延伸1分钟，得到PCR产物。其中PCR所用的DNA聚合酶，购自NEB，货号E0555L。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为 QIAquickGel extraction kit，购自Qiagen，货号28706。进行连接反应：插入片段3μL，酶切过的表达载体2μL，重组酶Exnase 2μL，缓冲液4μL，反应体系20μL，于37℃反应半小时得到连接产物，即构建好的重组载体。其中，重组酶购自Vazyme，货号C112-02-AB；缓冲液为该重组酶配套购买使用的 5×CE II缓冲液,货号C112-02-AA；将重链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体重链IgG1恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤由上海睿智化学研究有限公司完成)，将轻链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体轻链κ恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤由上海睿智化学研究有限公司完成)中。将10μL连接产物加入100μL的感受态细胞(Ecos 101competent cells，购自Yeastern，货号FYE607)中，冰浴 30分钟。再于42℃水浴热激90秒，放回冰上2分钟后加入800μL无抗生素的2YT 培养基，于37℃摇床上以200rpm培养45分钟，取出200μL涂布于含100μg/mL 氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃孵箱过夜培养。次日，使用表达载体上引物pTT-EF1a-F和pSV40，配置30μL PCR体系，进行菌落PCR。菌落PCR的体系为：引物各1μL，10μL的PCR预混液(购自Novoprotein)，补足至20μL。用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μL点于另一块含100 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序和分析(参见Kabat,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutes ofHealth, Bethesda,Md.(1991)).

经过菌落PCR验证，将序列正确的重组抗体重、轻链的表达载体瞬时转染FreeStyle^TM 293-F细胞(购自Invitrogen)以生产抗体。转染时，293-F细胞的密度应为1-1.5×10⁶个/mL，100mL细胞需要100μg上述已构建好的重组载体(其中，重组重链载体和轻链载体的质量比为2:3)和200μg的转染试剂聚乙烯亚胺 (PEI)。将重组载体和PEI分别加入到5mL培养基中，室温静置5分钟，0.22μm 滤膜过滤后，将重组载体和PEI的混合物于室温静置15分钟。然后将上述混合物缓慢地加入到细胞中，在37℃、8％(v/v)CO₂培养箱中以120rpm的转速培养。7 天后，3500g离心细胞培养液30分钟，收集上清液，0.22μm滤器过滤。

用1mL蛋白A柱(购自GE Healthcare)纯化200mL澄清上清液中的单克隆抗体。蛋白A柱先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)平衡，然后将上清液上样到蛋白A柱，控制流速在3mL/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白A柱，平衡缓冲液的体积为蛋白A柱柱床体积的20倍。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液， pH3.0)洗脱结合在蛋白A柱上的单克隆抗体，用紫外检测器监测洗脱情况(A280 紫外吸收峰)。收集洗脱的抗体，加入10％(v/v)1.0MTris-HCl缓冲液中和pH。然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜。收集透析后的单克隆抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的NKp46抗体作为先导抗体。

将先导抗体进行蛋白浓度(A280/1.4)、纯度、内毒(Lonza试剂盒)等检测分析。

结果如表6所示，先导抗体内毒素浓度在1.0EU/mg以内。其中，抗体编号 NKp46-1、2、3、4分别对应于实施例中孔A5、A8、B1、C9中的抗体。

表6先导抗体的生产

实施例4 ELISA检测抗体与NKp46 ECD hFc的结合

将溶于PBS磷酸缓冲液(pH7.2)的链霉亲和素(1ug/mL)加入96孔ELISA板的底部，每孔100uL，4℃过夜孵育，包被ELISA板。吸去微孔板内溶液，用洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的PBS磷酸缓冲液(pH7.2))洗涤3次，每孔200uL。用封闭缓冲液(含3％牛血清白蛋白的PBS磷酸缓冲液(pH7.2))封闭ELISA板，每孔200 uL，室温振荡孵育1小时。ELISA板用洗涤缓冲液洗涤3次。将溶于PBS磷酸缓冲液(pH7.2)的生物素化hNKp46蛋白(1ug/mL)，生物素化cynoNKp46蛋白(1ug/mL) 和作为对照的生物素化hFc蛋白(1ug/mL)，按每孔100uL加入96孔ELISA板，室温振荡孵育1小时。ELISA板用洗涤缓冲液洗涤3次。将实施例3生产的先导抗体溶于封闭缓冲液，并从100ug/mL开始，做6次10倍的系列稀释，加入包被了链霉亲和素-生物素化蛋白的ELISA板，每孔100uL，室温振荡孵育1小时。ELISA 板用洗涤缓冲液洗涤3次。用封闭缓冲液将HRP联结的抗人IgG(Fab特异性)山羊抗体做1:5000稀释，每孔加入100uL，室温振荡孵育1小时。ELISA板用洗涤缓冲液洗涤3次。每孔加入100uLTMB显色，5分钟后用100uL盐酸溶液(1M)终止反应。检测450nm处的吸光度。

结果如图2a-2c和表7所示，结果显示先导抗体NKp46-1,2,4和5都能特异性结合人源NKp46-ECD-Fc蛋白和猕猴NKp46-ECD-Fc蛋白，其中NKp46-1对人源 NKp46-ECD-Fc蛋白和猕猴NKp46-ECD-Fc蛋白具有较高的结合活性。

表7抗体结合NKp46-ECD-hFc的EC50值

实施例5流式细胞实验(FACS)检测抗体与NKp46表达细胞的结合

编码人源NKp46全长氨基酸序列的核苷酸序列被克隆到pIRES载体(购自Clontech)并制备质粒。pIRES质粒感染CHOK1细胞株得含人/猴NKp46的CHOK1稳定细胞株(此处称为CHOk1-hNKp46和CHOK1-cynoNKp46稳定细胞株)，将带有猴源NKp46全长氨基酸序列的核苷酸序列克隆到pIRES载体，感染CHOK1细胞株得含猴NKp46的CHOK1稳定细胞株(此处称为CHOk1-cynoNKp46稳定细胞株)。将 CHOK1-hNKp46稳定细胞株，CHOK1-cynoNKp46稳定细胞株在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用PBS缓冲液(购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(Versene solution,购自Life technology公司)处理和收集细胞。用PBS缓冲液洗涤细胞2次。将收集的细胞用FACS缓冲液 (PBS+2％FBS，所述百分比为质量百分比)悬浮至2×10⁶细胞/mL，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，将实施例3生产的先导抗体溶于FACS缓冲液，并从100ug/mL开始，做6次10倍的系列稀释，加入待测样品每孔100微升，4℃孵育 1小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa 488)标记的抗人IgG(H+L)抗体(购自Invitrogen)，冰上孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤 3次，后用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACSCantoII，购自BD公司)检测和分析结果。

结果如图3a-3c和表8所示，待测抗体可特异性结合细胞表面的人NKp46(图 3a)，猕猴NKp46(图3b)，而不结合亲代CHOKI细胞(图3c)。其中IgG对照为人IgG。

表8 FACS检测抗体与NKp46表达细胞的结合

实施例6流式细胞实验(FACS)检测抗体与原代NK细胞的结合

将新鲜获取的全血用磷酸缓冲液PBS以1:1的体积比例稀释，获得稀释后的全血，用无菌吸管轻轻将稀释后的全血铺平在Ficoll液面(购自GE Healthcare)， Ficoll与稀释后的全血的体积比为3:4，避免震荡混匀，以400g转速室温20℃梯度离心30分钟，离心后的离心管分为三层，上层为血浆，中间乳白色分层即为单核淋巴细胞，用无菌吸管轻轻吸取中间层细胞，收集至新的离心管，用PBS磷酸缓冲液稀释至三倍体积，100g转速室温离心10分钟，弃上清。将淋巴细胞用 PBS磷酸缓冲液重悬至10mL，重复前面步骤取出血小板，最后将淋巴细胞重悬至 10mL含有10％胎牛血清的多组份RPMI 1640培养基(购自Invitrogen)备用，即为外周血单核淋巴细胞PBMC，所述百分比为质量百分比。随后从PBMC中分离得到原代NK(购自Stemcell)。

用PBS缓冲液洗涤细胞2次，将收集的细胞用FACS缓冲液(PBS+1％BSA，所述百分比为质量百分比)悬浮至1×10⁶细胞/mL，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，加入实施例3所得的待测先导抗体，每孔100微升，4℃孵育2小时。用 FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa 488)标记的二抗(购自 Invitrogen)，4℃孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次，后用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACSCantoII，购自BD公司)检测和分析结果。

结果如图4所示，与对照IgG相比，Ab-1、2、4、5与原代NK细胞结合平均荧光强度更高。

实施例7 NKp46抗体亲和常数的测定

用氨基偶联方法将抗人Fc IgG(购自Geneway)偶联固定在CM5芯片(购自GE) 表面，FC1作为参比通道。偶联固定过程如下：用新鲜配置的摩尔比为1:1的50mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和200mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)的混合物活化芯片。然后注入10-50μg/mL稀释在10mM醋酸纳缓冲液 (pH5.0)中的抗人Fc IgG。剩余的活化位点用1M乙醇胺封闭。然后，用含HBS-EP 缓冲液将实施例3所得的待测先导抗体稀释至5μg/mL，以10μL/分钟的流速捕获到芯片上，得到大约100～300RU的响应值。接着将hNKp46ECD-His(购自ACRO) 稀释至100nM，以30μL/分钟的流速流经芯片表面。在每个循环结束后，芯片表面用10mM，pH 1.5的甘氨酸进行再生。动力学速率常数需减去空白对照，用 globalfit分析方法1：1结合模型进行数据拟合(参照Biacore操作手册进行操作)。解离平衡速率常数(KD)用以下公式计算：KD＝kd/ka，其中，Kd为解离常数， Ka为结合常数。

结果如表9所示。

表9 NKp46抗体对免疫原的亲和常数

实施例8检测NKp46抗体对原代NK细胞的作用

(一)Ficoll分离全血获取外周血单核淋巴细胞PBMC

将新鲜获取的全血用磷酸缓冲液PBS以1:1的体积比例稀释得稀释后的全血，用无菌吸管轻轻将稀释后的全血铺平在Ficoll液面(购自GE Healthcare)， Ficoll与稀释后的全血的体积比为3:4，避免震荡混匀，以400g转速室温20℃梯度离心30分钟，离心后的离心管分为三层，上层为血浆，中间乳白色分层即为单核淋巴细胞，用无菌吸管轻轻吸取中间层细胞，收集至新的离心管，用PBS磷酸缓冲液稀释至三倍体积，100g转速室温离心10分钟，弃上清。将淋巴细胞用 PBS磷酸缓冲液重悬至10mL，重复前面步骤取出血小板，最后将淋巴细胞重悬至 10mL含有10％胎牛血清的多组份RPMI1640培养基(购自Invitrogen)备用，即为外周血单核淋巴细胞PBMC，所述百分比为质量百分比。

(二)流式细胞实验(FACS)检测NK细胞CD107a和CD69的表达

从PBMC中分离得到原代NK，加入到含有固定化的实施例2所得的纯化的 NKp46抗体的96孔板，在体外培养5天，培养基配方如下：RPMI1640,5％FBS,10 ng/ml IL-2，20ng/mlIL-12。用PBS缓冲液洗涤细胞2次，将收集的细胞用FACS 缓冲液(PBS+1％BSA，所述百分比为质量百分比)悬浮至1×10⁶细胞/mL，按每孔 100微升加入到96孔FACS反应板中，加入APC-antiCD107a和PE-antiCD69(购自 Biolegend)，4℃孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次，后用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACSCantoII，购自BD公司)检测和分析结果。

结果如图5a和图5b所示，与对照IgG相比，Ab-1、2、4、5提高了CD107a和 CD69阳性的NK细胞比例。

(三)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IFNγ水平的变化

从PBMC中分离得到原代NK，加入到含有固定化的实施例2所得的纯化的 NKp46抗体的96孔板，在体外培养4-5天，培养基配方如下：RPMI1640,5％FBS, 10ng/ml IL-2，20ng/ml IL-12。收集上清后用ELISA(来自R&D)检测细胞因子 IFNγ释放水平。

结果如图6所示，IFNγ水平随时间的增加而升高，Ab-1、2、4、5能够明显提高NK细胞释放IFNγ的水平。

实施例9 ELISA检测NKp46抗体与NKp46、NKp44和NKp30的结合

将带His标签的NKp46、NKp44和NKp30蛋白(分别购自AcroBiosystems和义翘神州)用PBS稀释至1μg/ml，以100μl/孔加入ELISA微孔板，4℃孵育过夜；用ELISA封闭液(含1％BSA，pH7.4的PBS磷酸缓冲液，所述百分比为质量百分比)37℃封闭两小时后，加入用PBS稀释为10μg/ml的实施例3所得的待测先导抗体，37℃温育1小时；加入山羊抗人IgG Fc的辣根过氧化物酶二抗(购自Sigma 商品号A0170)，室温孵育30分钟后；加入100微升/孔TMB显色液，室温孵育15分钟后，加入50微升1N盐酸终止显色反应，用ELISA读板机读取OD_450nm读数。

结果如图7所示，NKp46抗体和NKp46蛋白选择性结合，与NKp44或NKp30蛋白不结合。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本申请涉及的序列包括：

重链可变区(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYGISWVRQAPGQGLEWIGRIIPYFGITNYAQKFQGRVTITADKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCADNHLLRPGQNYYPWDYWGQGTTVTVSS

重链可变区(VH)的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG ATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTA GTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAC ACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGTTTGGAGGTTCTA CTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTT

重链可变区(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)

QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKN SLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYYYYGMDVWGKGTTVTVSSGSASAPTL

重链可变区(VH)的核苷酸序列(SEQ ID NO:22)

CAAGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG ATTCACCTTCAGTAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTA GTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAC TCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGAATACTACTACTA CGGTATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTT

重链可变区(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)

QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVGFIRSEAYGGTTEYAASVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTALYYCARGDRYCSSTSCWFDYWGQGTLVTVSSGSASAPTL

重链可变区(VH)的核苷酸序列(SEQ ID NO:23)

CAAGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGG ATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTAGGTTTCATAC GAAGCGAAGCTTATGGTGGGACAACAGAATACGCCGCGTCTGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCC AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCGAGAGGAGACCG ATATTGTAGTAGTACCAGCTGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCAT CCGCCCCAACCCTT

重链可变区(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)

QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGEGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLSAEDTAVYYCARGAQWLVNWGQGTLVTVSSGSASAPTL

重链可变区(VH)的核苷酸序列(SEQ ID NO:24)

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG ATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGGAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTT ATAGCGGTGGTAGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACG CTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGCGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGGGGCCCAGTGGCTGGT AAACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTT

轻链可变区(VL)：氨基酸序列(SEQ ID NO:5)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNALAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQHYSTPPTFGQGTKVEIK

轻链可变区(VH)的核苷酸序列(SEQ ID NO:25)

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATCGTGTGACCATCACCTGCCGTGCGAG CCAGGGTATTAGCAACGCTCTGGCATGGTACCAGCAGAAGCCGGGCAAAGCTCCGAAGCTGCTGATCTATGCTGCTA GCCGTCTGGAGAGCGGTGTGCCGAGCCGTTTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTTACCCTGACCATTAGCAGC CTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTACTATTGCCAGCAGCACTACAGCACCCCGCCGACCTTTGGCCAGGGTACCAA AGTGGAAATTAAG

重链可变区(VH)-CDR分析

CDR1(VH):

SYEMN(SEQ ID NO:6)

SYAMS(SEQ ID NO:7)

DYYMS(SEQ ID NO:8)

DYAMH(SEQ ID NO:9)

SYAMS(SEQ ID NO:30)

SYAIS(SEQ ID NO:31)

TNNIH(SEQ ID NO:32)

SYEMN(SEQ ID NO:33)

AYAMS(SEQ ID NO:34)

THGMH(SEQ ID NO:35)

SYGIH(SEQ ID NO:36)

SYGIS(SEQ ID NO:37)

CDR2(VH):

YISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:10)

AISSSGSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:11)

FIRSEAYGGTTEYAASVKG(SEQ ID NO:12)

VIYSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:13)

SISGSGGRTYIADSVKG(SEQ ID NO:38)

RIIPIFGIANYAQKFQG(SEQ ID NO:39)

YINPGSGKAKYSQRFQG(SEQ ID NO:40)

YISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:41)

AISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:42)

VISYDGSNKFYADSVKG(SEQ ID NO:43)

GINWNGGSTGYADSVKG(SEQ ID NO:44)

WISAYNGNTNYAQKLQG(SEQ ID NO:45)

CDR3(VH):

VWRFYFDY(SEQ ID NO:14)

EYYYYGMDV(SEQ ID NO:15)

GDRYCSSTSCWFDY(SEQ ID NO:16)

GAQWLVN(SEQ ID NO:17)

EWDKYCGGDCYRDH(SEQ ID NO:46)

DRVPGGFGEFDS(SEQ ID NO:47)

TYYFDY(SEQ ID NO:48)

VWRFYFDY(SEQ ID NO:49)

RAYSGDYYAAFDI(SEQ ID NO:50)

AKGILTGYYYGMDV(SEQ ID NO:51)

RAYSGDYYAAFDI(SEQ ID NO:52)

AGYSYAREFDY(SEQ ID NO:53)

轻链可变区(VL)-CDR分析

CDR1(VL):

RASQGISNALA(SEQ ID NO:18)

CDR2(VL):

AASRLES(SEQ ID NO:19)

CDR3(VL):

QQHYSTPPT(SEQ ID NO:20)

人源NKp46蛋白胞外区氨基酸序列(SEQ ID NO:26)

MSSTLPALLCVGLCLSQRISAQQQTLPKPFIWAEPHFMVPKEKQVTICCQGNYGAVEYQLHFEGSLFAVDRPKPPER INKVKFYIPDMNSRMAGQYSCIYRVGELWSEPSNLLDLVVTEMYDTPTLSVHPGPEVISGEKVTFYCRLDTATSMFL LLKEGRSSHVQRGYGKVQAEFPLGPVTTAHRGTYRCFGSYNNHAWSFPSEPVKLLVTGDIENTSLAPEDPTFPADTW GTYLLTTETGLQKDHALWDHTAQNLLR

人源NKp46蛋白胞外区核苷酸序列(SEQ ID NO:27)

ATGTCATCAACACTGCCCGCCCTGCTGTGCGTCGGCCTGTGCCTGAGCCAGAGGATTTCCGCCCAGCAGCAGACCCT GCCCAAACCCTTCATCTGGGCCGAGCCACACTTTATGGTGCCCAAGGAGAAGCAGGTGACCATCTGCTGTCAGGGCA ACTACGGCGCCGTGGAGTATCAGCTGCACTTCGAGGGCAGCCTGTTTGCAGTGGACAGGCCTAAGCCACCTGAGCGC ATCAACAAGGTGAAGTTCTACATCCCAGATATGAATAGCAGGATGGCCGGCCAGTACTCCTGCATCTATAGGGTGGG AGAGCTGTGGTCTGAGCCAAGCAATCTGCTGGACCTGGTGGTGACCGAGATGTACGATACCCCTACACTGTCTGTGC ACCCAGGCCCCGAAGTGATCAGCGGCGAGAAGGTGACATTCTATTGTCGGCTGGACACCGCCACATCCATGTTTCTG CTGCTGAAGGAGGGCCGGAGCTCCCACGTGCAGAGAGGCTACGGCAAGGTGCAGGCCGAGTTCCCTCTGGGACCAGT GACCACAGCACACAGGGGAACCTACAGATGCTTCGGCTCCTATAACAATCACGCCTGGTCCTTTCCCTCTGAGCCTG TGAAGCTGCTGGTGACCGGCGATATCGAGAACACATCTCTGGCCCCAGAGGACCCCACATTTCCTGCCGATACCTGG GGCACATATCTGCTGACCACAGAAACCGGACTGCAGAAAGATCACGCACTGTGGGACCATACCGCCCAGAACCTGCT GAGA

猕猴NKp46蛋白胞外区氨基酸序列(Pro22-Arg257)(SEQ ID NO:28)

PKQTLPKPIIRAESTYMVPKEKQATLCCQGSYGAVEYQLHFEGSLFAVERPKPPERINGV

KFHIPDMNSRKAGRYSCIYRVGELWSERSDLLDLVVTEMYDTPTLSVHPGPEVTSGEKVT

FYCRLDTATSMFLLLKEGRSRDVQRSYGKVQAEFPMGPVTTAHRGSYRCFGSYNNYAWSFPSEPVKLLVTGDIENTS LAPTDPTFPDSWDTCLLTRETGLQKDLALWDHTAQNLLR

猕猴NKp46蛋白胞外区核苷酸序列(Pro22-Arg257)(SEQ ID NO:29)

CCAAAGCAGACTCTCCCAAAACCGATCATCAGGGCTGAATCCACTTACATGGTTCCGAAGGAAAAGCAAGCGACCCT CTGTTGCCAGGGAAGTTATGGAGCTGTTGAATACCAGCTGCATTTTGAAGGAAGCCTTTTTGCCGTGGAGAGACCAA AACCACCTGAACGGATTAATGGAGTCAAATTCCACATCCCGGACATGAACTCCCGCAAGGCAGGGCGATACAGCTGC ATCTATCGGGTTGGGGAGCTCTGGTCAGAGCGCAGCGACTTGCTGGATCTGGTGGTAACAGAAATGTATGACACACC CACGCTCTCGGTTCATCCTGGACCCGAAGTGACCTCGGGTGAGAAGGTGACCTTCTACTGCCGTCTAGACACAGCAA CAAGCATGTTCTTACTGCTCAAGGAGGGAAGATCCAGAGACGTGCAGCGCAGCTACGGGAAAGTCCAGGCGGAGTTC CCCATGGGCCCTGTGACCACAGCCCACAGAGGGTCATACCGATGTTTTGGCTCCTATAACAACTATGCCTGGTCTTT CCCCAGTGAGCCAGTGAAGCTCCTGGTCACAGGCGACATTGAGAACACCAGCCTTGCACCTACAGACCCCACCTTTC CCGACTCTTGGGACACCTGCCTTTTAACCAGAGAGACGGGACTCCAGAAAGACCTTGCCCTCTGGGACCACACTGCC CAGAATCTCCTTCGG

重链可变区(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:54)

QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGRTYIADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREWDKYCGGDCYRDHWGQGTLVTVSSGSASAPTL

重链可变区(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:55)

QVQLVQSGSELKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARDRVPGGFGEFDSWGQGTLVTVSSGSASAPTL

重链可变区(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:56)

QVQLVQSGAEVKKPGASVMVSCKASGYTFTTNNIHWVRQATGQGLEWMGYINPGSGKAKYSQRFQGRLTLTKDTSAD TAYMELSSLGSEDTAVYYCARTYYFDYWGQGTLVTVSSGSASAPTL

重链可变区(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:57)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVWRFYFDYWGQGTLVTVSSGSASAPTL

重链可变区(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:58)

QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQINSLRAEDTAVYYCAKRAYSGDYYAAFDIWGQGRMVTVSSGSASAPTL

重链可变区(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:59)

QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTHGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKFYADSVKGRVTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAKGILTGYYYGMDVWGQGTTVTVSSGSASAPTL

重链可变区(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:60)

QMQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNGKN SLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRAYSGDYYAAFDIWGQGTMVTVSSGSASAPTL

重链可变区(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:61)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTS TAYMELSSLRPEDTAVYYCARAGYSYAREFDYWGQGTLVTVSSGSASAPTL 。

序列表

<110> 上海怀越生物科技有限公司

<120> NKp46抗体及其制备方法和应用

<130> P2020-0654

<160> 61

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 124

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asp Asn His Leu Leu Arg Pro Gly Gln Asn Tyr Tyr Pro Trp Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 126

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu

115 120 125

<210> 3

<211> 133

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Ser Glu Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Arg Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Trp Phe

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala

115 120 125

Ser Ala Pro Thr Leu

130

<210> 4

<211> 123

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Ser Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Ala Gln Trp Leu Val Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu

115 120

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

Ser Tyr Glu Met Asn

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 7

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 8

Asp Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 9

Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 10

Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 11

Ala Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 12

Phe Ile Arg Ser Glu Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 13

Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 14

Val Trp Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 15

Glu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 16

Gly Asp Arg Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Trp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 17

Gly Ala Gln Trp Leu Val Asn

1 5

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 18

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 19

Ala Ala Ser Arg Leu Glu Ser

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 20

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 21

<211> 375

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 21

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagtttgg 300

aggttctact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agggagtgca 360

tccgccccaa ccctt 375

<210> 22

<211> 378

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 22

caagtccagc tggtacagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtagta gtggtagtac catatactac 180

gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagaatac 300

tactactacg gtatggacgt ctggggcaaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagggagt 360

gcatccgccc caaccctt 378

<210> 23

<211> 399

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 23

caagtgcagc tggtgcaatc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtaggtttc atacgaagcg aagcttatgg tgggacaaca 180

gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcca gagacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag tctgagagcc gaggacacgg ccttgtatta ctgtgcgaga 300

ggagaccgat attgtagtag taccagctgc tggtttgact actggggcca gggaaccctg 360

gtcaccgtct cctcagggag tgcatccgcc ccaaccctt 399

<210> 24

<211> 369

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 24

caggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccaggggagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatagcg gtggtagtac atactacgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240

caaatgaaca gcctgagcgc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgag aggggcccag 300

tggctggtaa actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcagggag tgcatccgcc 360

ccaaccctt 369

<210> 25

<211> 321

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 25

gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga tcgtgtgacc 60

atcacctgcc gtgcgagcca gggtattagc aacgctctgg catggtacca gcagaagccg 120

ggcaaagctc cgaagctgct gatctatgct gctagccgtc tggagagcgg tgtgccgagc 180

cgtttcagcg gtagcggtag cggtaccgac tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaggatttcg caacctacta ttgccagcag cactacagca ccccgccgac ctttggccag 300

ggtaccaaag tggaaattaa g 321

<210> 26

<211> 258

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 26

Met Ser Ser Thr Leu Pro Ala Leu Leu Cys Val Gly Leu Cys Leu Ser

1 5 10 15

Gln Arg Ile Ser Ala Gln Gln Gln Thr Leu Pro Lys Pro Phe Ile Trp

20 25 30

Ala Glu Pro His Phe Met Val Pro Lys Glu Lys Gln Val Thr Ile Cys

35 40 45

Cys Gln Gly Asn Tyr Gly Ala Val Glu Tyr Gln Leu His Phe Glu Gly

50 55 60

Ser Leu Phe Ala Val Asp Arg Pro Lys Pro Pro Glu Arg Ile Asn Lys

65 70 75 80

Val Lys Phe Tyr Ile Pro Asp Met Asn Ser Arg Met Ala Gly Gln Tyr

85 90 95

Ser Cys Ile Tyr Arg Val Gly Glu Leu Trp Ser Glu Pro Ser Asn Leu

100 105 110

Leu Asp Leu Val Val Thr Glu Met Tyr Asp Thr Pro Thr Leu Ser Val

115 120 125

His Pro Gly Pro Glu Val Ile Ser Gly Glu Lys Val Thr Phe Tyr Cys

130 135 140

Arg Leu Asp Thr Ala Thr Ser Met Phe Leu Leu Leu Lys Glu Gly Arg

145 150 155 160

Ser Ser His Val Gln Arg Gly Tyr Gly Lys Val Gln Ala Glu Phe Pro

165 170 175

Leu Gly Pro Val Thr Thr Ala His Arg Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly

180 185 190

Ser Tyr Asn Asn His Ala Trp Ser Phe Pro Ser Glu Pro Val Lys Leu

195 200 205

Leu Val Thr Gly Asp Ile Glu Asn Thr Ser Leu Ala Pro Glu Asp Pro

210 215 220

Thr Phe Pro Ala Asp Thr Trp Gly Thr Tyr Leu Leu Thr Thr Glu Thr

225 230 235 240

Gly Leu Gln Lys Asp His Ala Leu Trp Asp His Thr Ala Gln Asn Leu

245 250 255

Leu Arg

<210> 27

<211> 774

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 27

atgtcatcaa cactgcccgc cctgctgtgc gtcggcctgt gcctgagcca gaggatttcc 60

gcccagcagc agaccctgcc caaacccttc atctgggccg agccacactt tatggtgccc 120

aaggagaagc aggtgaccat ctgctgtcag ggcaactacg gcgccgtgga gtatcagctg 180

cacttcgagg gcagcctgtt tgcagtggac aggcctaagc cacctgagcg catcaacaag 240

gtgaagttct acatcccaga tatgaatagc aggatggccg gccagtactc ctgcatctat 300

agggtgggag agctgtggtc tgagccaagc aatctgctgg acctggtggt gaccgagatg 360

tacgataccc ctacactgtc tgtgcaccca ggccccgaag tgatcagcgg cgagaaggtg 420

acattctatt gtcggctgga caccgccaca tccatgtttc tgctgctgaa ggagggccgg 480

agctcccacg tgcagagagg ctacggcaag gtgcaggccg agttccctct gggaccagtg 540

accacagcac acaggggaac ctacagatgc ttcggctcct ataacaatca cgcctggtcc 600

tttccctctg agcctgtgaa gctgctggtg accggcgata tcgagaacac atctctggcc 660

ccagaggacc ccacatttcc tgccgatacc tggggcacat atctgctgac cacagaaacc 720

ggactgcaga aagatcacgc actgtgggac cataccgccc agaacctgct gaga 774

<210> 28

<211> 236

<212> PRT

<213> 猕猴(Macaca mulatta)

<400> 28

Pro Lys Gln Thr Leu Pro Lys Pro Ile Ile Arg Ala Glu Ser Thr Tyr

1 5 10 15

Met Val Pro Lys Glu Lys Gln Ala Thr Leu Cys Cys Gln Gly Ser Tyr

20 25 30

Gly Ala Val Glu Tyr Gln Leu His Phe Glu Gly Ser Leu Phe Ala Val

35 40 45

Glu Arg Pro Lys Pro Pro Glu Arg Ile Asn Gly Val Lys Phe His Ile

50 55 60

Pro Asp Met Asn Ser Arg Lys Ala Gly Arg Tyr Ser Cys Ile Tyr Arg

65 70 75 80

Val Gly Glu Leu Trp Ser Glu Arg Ser Asp Leu Leu Asp Leu Val Val

85 90 95

Thr Glu Met Tyr Asp Thr Pro Thr Leu Ser Val His Pro Gly Pro Glu

100 105 110

Val Thr Ser Gly Glu Lys Val Thr Phe Tyr Cys Arg Leu Asp Thr Ala

115 120 125

Thr Ser Met Phe Leu Leu Leu Lys Glu Gly Arg Ser Arg Asp Val Gln

130 135 140

Arg Ser Tyr Gly Lys Val Gln Ala Glu Phe Pro Met Gly Pro Val Thr

145 150 155 160

Thr Ala His Arg Gly Ser Tyr Arg Cys Phe Gly Ser Tyr Asn Asn Tyr

165 170 175

Ala Trp Ser Phe Pro Ser Glu Pro Val Lys Leu Leu Val Thr Gly Asp

180 185 190

Ile Glu Asn Thr Ser Leu Ala Pro Thr Asp Pro Thr Phe Pro Asp Ser

195 200 205

Trp Asp Thr Cys Leu Leu Thr Arg Glu Thr Gly Leu Gln Lys Asp Leu

210 215 220

Ala Leu Trp Asp His Thr Ala Gln Asn Leu Leu Arg

225 230 235

<210> 29

<211> 708

<212> DNA

<213> 猕猴(Macaca mulatta)

<400> 29

ccaaagcaga ctctcccaaa accgatcatc agggctgaat ccacttacat ggttccgaag 60

gaaaagcaag cgaccctctg ttgccaggga agttatggag ctgttgaata ccagctgcat 120

tttgaaggaa gcctttttgc cgtggagaga ccaaaaccac ctgaacggat taatggagtc 180

aaattccaca tcccggacat gaactcccgc aaggcagggc gatacagctg catctatcgg 240

gttggggagc tctggtcaga gcgcagcgac ttgctggatc tggtggtaac agaaatgtat 300

gacacaccca cgctctcggt tcatcctgga cccgaagtga cctcgggtga gaaggtgacc 360

ttctactgcc gtctagacac agcaacaagc atgttcttac tgctcaagga gggaagatcc 420

agagacgtgc agcgcagcta cgggaaagtc caggcggagt tccccatggg ccctgtgacc 480

acagcccaca gagggtcata ccgatgtttt ggctcctata acaactatgc ctggtctttc 540

cccagtgagc cagtgaagct cctggtcaca ggcgacattg agaacaccag ccttgcacct 600

acagacccca cctttcccga ctcttgggac acctgccttt taaccagaga gacgggactc 660

cagaaagacc ttgccctctg ggaccacact gcccagaatc tccttcgg 708

<210> 30

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 30

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 31

Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 32

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 32

Thr Asn Asn Ile His

1 5

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 33

Ser Tyr Glu Met Asn

1 5

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 34

Ala Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 35

Thr His Gly Met His

1 5

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 36

Ser Tyr Gly Ile His

1 5

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 37

Ser Tyr Gly Ile Ser

1 5

<210> 38

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 38

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Ile Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 39

Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 40

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 40

Tyr Ile Asn Pro Gly Ser Gly Lys Ala Lys Tyr Ser Gln Arg Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 41

Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 42

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 43

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 44

Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 45

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 45

Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 46

<211> 14

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 46

Glu Trp Asp Lys Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Arg Asp His

1 5 10

<210> 47

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 47

Asp Arg Val Pro Gly Gly Phe Gly Glu Phe Asp Ser

1 5 10

<210> 48

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 48

Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 49

Val Trp Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 50

<211> 13

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 50

Arg Ala Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Ala Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 51

<211> 14

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 51

Ala Lys Gly Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 52

<211> 13

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 52

Arg Ala Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Ala Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 53

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 53

Ala Gly Tyr Ser Tyr Ala Arg Glu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 54

<211> 131

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 54

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Ile Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Trp Asp Lys Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Arg Asp His

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala

115 120 125

Pro Thr Leu

130

<210> 55

<211> 129

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 55

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Val Pro Gly Gly Phe Gly Glu Phe Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr

115 120 125

Leu

<210> 56

<211> 123

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 56

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Met Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Asn

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Gly Ser Gly Lys Ala Lys Tyr Ser Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Lys Asp Thr Ser Ala Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu

115 120

<210> 57

<211> 125

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Trp Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu

115 120 125

<210> 58

<211> 130

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Arg Ala Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Ala Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Arg Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro

115 120 125

Thr Leu

130

<210> 59

<211> 131

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr His

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ala Lys Gly Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala

115 120 125

Pro Thr Leu

130

<210> 60

<211> 130

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 60

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Arg Ala Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Ala Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro

115 120 125

Thr Leu

130

<210> 61

<211> 128

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 61

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Tyr Ala Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu

115 120 125

Claims

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO:6所示的CDR1，

SEQ ID NO:10所示的CDR2，和

SEQ ID NO:14所示的CDR3；

或者，

SEQ ID NO:7的CDR1，

SEQ ID NO:11所示的CDR2，和

SEQ ID NO:15所示的CDR3；

或者，

SEQ ID NO:8所示的CDR1，

SEQ ID NO:12所示的CDR2，和

SEQ ID NO:16所示的CDR3；

或者，

SEQ ID NO:9的CDR1，

SEQ ID NO:13所示的CDR2，和

SEQ ID NO:17所示的CDR3，

2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。

3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO:18所示的CDR1’，

SEQ ID NO:19所示的CDR2’，和

SEQ ID NO:20所示的CDR3’，

4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。

5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：

(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或

(2)如权利要求3所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链。

6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

7.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、或其组合；和

8.一种活性成分的用途，其特征在于，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、如权利要求7所述的抗体药物偶联物、或其组合，其特征在于，所述活性成分用于(a)制备检测试剂、检测板或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗NKP46表达或功能异常相关的疾病的药物。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：

(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、如权利要求7所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及

(ii)药学上可接受的载体。

10.一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中NKP46的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)在体外，将所述样品与如权利要求5所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在NKP46。