CN116003595B - 靶向nk细胞nkp46受体的纳米抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体及其制备方法，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb1，其中，所述纳米抗体Nb1的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，提供的纳米抗体Nb1为与NK细胞激活型受体NKP46蛋白高亲和力的纳米抗体，通过该抗体可靶向作用于NK细胞NKP46受体，以期借此调控NK细胞活性，以增强CAR NK的治疗效应或制备双特异性、多特异性抗体增强NK细胞对肿瘤的杀伤效应。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体及其制备方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)与细胞毒性T细胞是仅有的两种可直接靶向杀伤肿瘤细胞的免疫细胞系。目前，基于嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigenreceptor,CAR T)的治疗方案已在临床中用于血液肿瘤的治疗。但是传统的CAR T治疗存在诸方面缺陷。第一，T细胞可释放包括多种炎症因子，如白介素-2、6及肿瘤坏死因子等，导致炎症因子释放综合症与神经系统毒性。其次，细胞毒性T细胞效应存在主要组织相容复合物(major histocompatibility complex Irestriction,MHC)限制性。部分肿瘤细胞可显著下调MHC表达，从而逃避CAR T细胞效应。
相比于细胞毒性T细胞，属于固有免疫系统的NK细胞具有在抗肿瘤免疫方面存在多方面优势。首先，不同于细胞毒性T细胞释放白介素-2、6及肿瘤坏死因子等炎症因子，NK细胞主要释放炎症因子为IFN-γ与GM-CSF。具有较低的神经毒性与系统炎症反应诱导效应。其次，由于其固有免疫属性，CAR NK细胞可不受MHC I限制，直接杀伤某些不表达CAR靶向抗原或MHC I缺失的肿瘤细胞。此外，不同于CAR T治疗，CAR NK治疗不易引起输血相关抑制物抗宿主病，使其具有更为广泛的临床适用性。同时，通过激活机体本身的NK细胞增强其抗肿瘤效应也正受到关注。
NK细胞通过激活型受体如CD16、NKG2D、NKP46、NKP43等活化而触发对肿瘤细胞的杀伤效应，因此发现对上述受体的激活型抗体对于调节NK细胞的抗肿瘤效应具有重要作用。
因此，迫切需要开发新的可靶向NKP46的纳米抗体，以期借此调控NK细胞活性，以增强CAR NK的治疗效应或制备双特异性、多特异性抗体增强NK细胞对肿瘤的杀伤效应。
发明内容
本申请的目的在于提供一种靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体及其制备方法和应用，旨在解决现有技术中缺乏可靶向NKP46的纳米抗体，无法调控NK细胞活性，不能增强CARNK的治疗效应的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供了一种靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb1，其中，所述纳米抗体Nb1的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。
第二方面，本申请提供了一种靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
将NKP46蛋白进行表达纯化，得到NKP46目的蛋白；
将所述NKP46目的蛋白包被在免疫管上进行富集筛选，得到噬菌体文库；
将所述噬菌体文库的洗脱液进行ELISA验证并进行二代测序，并根据测序结果合成纳米抗体的基因序列；
将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化，得到靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体。
第三方面，本申请提供了靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体在制备靶向NK细胞NKP46对肿瘤的免疫治疗的药物中的应用。
第四方面，本申请提供了靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体在制备基于靶向NK细胞NKP46的各种增强CAR NK抗肿瘤效果的肿瘤治疗的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
本申请第一方面提供的靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb1，其中，所述纳米抗体Nb1的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，提供的纳米抗体Nb1为与NK细胞激活型受体NKP46蛋白高亲和力的纳米抗体，通过该抗体可靶向作用于NK细胞NKP46受体，以期借此调控NK细胞活性，以增强CAR NK的治疗效应或制备双特异性、多特异性抗体增强NK细胞对肿瘤的杀伤效应。
本申请第二方面提供的一种靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体的制备方法，该制备方法基于噬菌体展示筛选技术，以NKP46蛋白为靶标构建了纳米抗体库，并结合二代测序、序列合成、克隆、表达、纯化，得靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体；该制备方法利用噬菌体在宿主菌中快速复制的生物特性，能够快速、高通量地筛选与NKP46蛋白结合的纳米抗体，制备方法快速、简便，有利于大量筛选，提高了筛选效率。
本申请第三方面提供的靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体在制备靶向NK细胞NKP46对肿瘤的免疫治疗的药物中的应用，由于得到的靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体包括纳米抗体Nb1，对NK细胞NKP46受体具有高亲和力，以期借此调控NK细胞活性，以增强CARNK的治疗效应或制备双特异性、多特异性抗体增强NK细胞对肿瘤的杀伤效应。
本申请第四方面提供的靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体在制备基于靶向NK细胞NKP46的各种增强CAR NK抗肿瘤效果的肿瘤治疗的检测试剂或检测试剂盒中的应用，由于得到的靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体包括纳米抗体Nb1，对NK细胞NKP46受体具有高亲和力，以期借此调控NK细胞活性，以增强CAR NK的治疗效应或制备双特异性、多特异性抗体增强NK细胞对肿瘤的杀伤效应，可用于制备基于靶向NK细胞NKP46的各种增强CAR NK抗肿瘤效果的肿瘤治疗的检测试剂或检测试剂盒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
其中：
图1为实施例中NKP46蛋白纳米抗体筛选分析图。
图2为实施例中NKP46蛋白纳米抗体Nb1单体(monomer)和二聚体(dimer)的表达纯化分析图。
图3为实施例中NKP46蛋白纳米抗体Nb1单体(monomer)和二聚体(dimer)的ELISA验证分析图。
图4为实施例中NKP46蛋白纳米抗体Nb1担体和二聚体与NKP46的亲和力分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请实施例第一方面提供一种靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb1，其中，所述纳米抗体Nb1的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。
本申请实施例第一方面提供的靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb1，其中，所述纳米抗体Nb1的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，提供的纳米抗体Nb1为与NK细胞激活型受体NKP46蛋白高亲和力的纳米抗体，通过该抗体可靶向作用于NK细胞NKP46受体，以期借此调控NK细胞活性，以增强CAR NK的治疗效应或制备双特异性、多特异性抗体增强NK细胞对肿瘤的杀伤效应。
在一些实施例中，纳米抗体Nb1的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，其中，Seq.IDNO.1如下所示：
MAVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFSSSAMGWYRQAPGKKRELVVGMRRDGRTTYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKQTGLTGVGHYWGQGTQVTVSS。
在一些实施例中，所述纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
所述纳米抗体Nb1中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2为：MAVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTF。
FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3为：YRQAPGKKRELVVG。
FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.4为：DSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCA。
FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，SEQ ID NO.5为：WGQGTQVTVSS。
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，SEQ ID NO.6为：SSSAMGW。
CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，SEQ ID NO.7为：MRRDGRTTYS。
CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，SEQ ID NO.8为：GKQTGLTGVGHY。
在一些实施例中，，所述纳米抗体Nb1的碱基序列如Seq.ID NO.9所示，Seq.IDNO.9为：
ATGGCGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCACGTTCAGTAGCTCTGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGAAGCGTGAGTTGGTCGTAGGTATGCGTCGTGATGGTCGCACAACGTATTCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGCCGGGAAGCAAACGGGGTTGACCGGGGTAGGGCACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
本申请实施例第二方面提供了靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
S01.将NKP46蛋白进行表达纯化，得到NKP46目的蛋白；
S02.将所述NKP46目的蛋白包被在免疫管上进行富集筛选，得到噬菌体文库；
S03.将所述噬菌体文库的洗脱液进行ELISA验证并进行二代测序，并根据测序结果合成纳米抗体的基因序列；
S04.将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化，得到靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体。
本申请实施例第二方面提供的一种靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体的制备方法，该制备方法基于噬菌体展示筛选技术，以NKP46蛋白为靶标构建了纳米抗体库，并结合二代测序、序列合成、克隆、表达、纯化，得靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体；该制备方法利用噬菌体在宿主菌中快速复制的生物特性，能够快速、高通量地筛选与NKP46蛋白结合的纳米抗体，制备方法快速、简便，有利于大量筛选，提高了筛选效率。
步骤S01中，将NKP46蛋白进行表达纯化，得到NKP46目的蛋白。
在一些实施例中，NKP46蛋白的表达纯化步骤如下：a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，拟通过不同浓度的IPTG在16℃低温进行诱导条件摸索；b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000W进行破菌；c)，17000g，4℃离心30min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；g)，Ni柱纯化后进行分子筛分离，AKATA参数设置0.5mL流速/分钟，每1mL收集一次；d)，根据电泳结果确定目的蛋白纯度，BCA法测定蛋白浓度。
步骤S02中，将所述NKP46目的蛋白包被在免疫管上进行富集筛选，得到噬菌体文库。
在一些实施例中，所述目的蛋白的浓度为10～12μg/mL。
在一些实施例中，所述富集筛选的步骤中，进行2～3轮富集筛选。
S03.将所述噬菌体文库的洗脱液进行ELISA验证并进行二代测序，并根据测序结果合成纳米抗体的基因序列。
在一些实施例中，进行富集筛选，得到噬菌体文库的具体步骤为：采用免疫管法对天然的羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行筛选，所选择的噬菌体展示库容量为2x109。筛选步骤如下：a)，将目的蛋白按10μg/mL浓度包被在免疫管上，进行3轮富集筛选；b)，使用第三轮噬菌体洗脱液铺板，随机挑取96个单克隆进行ELISA验证，以ELISA读数大于对应BSA读数3倍且读数大于0.5为阳性标准；c)，经过2次噬菌体ELISA鉴定的阳性单克隆送公司测序确定序列信息；d)，根据测序信息设计并合成筛选到的纳米抗体，通过大肠杆菌进行表达纯化制备纳米抗体单体(monomer)；e)，利用ELISA亲和性实验来初步鉴定纳米抗体的亲和力，选择亲和力较好的纳米抗体，通过(GGGGS)3linker两两偶联表达纯化产生纳米抗体二聚体(dimer)后进行表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)测定亲和常数。
步骤S04中，将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化，得到靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体。
在一些实施例中，所述表达载体选自pColdII载体。
在一些实施例中，所述宿主细胞选自大肠杆菌。
在一些具体实施例中，将纳米抗体基因序列克隆入pColdII载体，同时融合表达多聚组氨酸标签(His tag)及血凝素标签(hemagglutinin HA tag)用于后续检测。表达纯化步骤如下：a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，使用0.2mM浓度的IPTG在15℃低温进行诱导；b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000W进行破菌；c)，17000g，4℃离心30min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；g)，Ni柱纯化后进行分子筛分离，AKATA参数设置0.5mL流速/分钟，每1mL收集一次。
本申请实施例第三方面提供靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体在制备靶向NK细胞NKP46对肿瘤的免疫治疗的药物中的应用。
本申请实施例第三方面提供的靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体在制备靶向NK细胞NKP46对肿瘤的免疫治疗的药物中的应用，由于得到的靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体包括纳米抗体Nb1，对NK细胞NKP46受体具有高亲和力，以期借此调控NK细胞活性，以增强CAR NK的治疗效应或制备双特异性、多特异性抗体增强NK细胞对肿瘤的杀伤效应。
本申请实施例第四方面提供靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体在制备基于靶向NK细胞NKP46的各种增强CAR NK抗肿瘤效果的肿瘤治疗的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
本申请实施例第四方面提供的靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体在制备基于靶向NK细胞NKP46的各种增强CAR NK抗肿瘤效果的肿瘤治疗的检测试剂或检测试剂盒中的应用，由于得到的靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体包括纳米抗体Nb1，对NK细胞NKP46受体具有高亲和力，以期借此调控NK细胞活性，以增强CAR NK的治疗效应或制备双特异性、多特异性抗体增强NK细胞对肿瘤的杀伤效应，可用于制备基于靶向NK细胞NKP46的各种增强CARNK抗肿瘤效果的肿瘤治疗的检测试剂或检测试剂盒。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
(一)靶向NK细胞NKP46受体的纳米抗体及其制备
(1)NKP46蛋白的纯化
表达纯化步骤如下：a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，拟通过不同浓度的IPTG在16℃低温进行诱导条件摸索；b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000W进行破菌；c)，17000g，4℃离心30min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；g)，Ni柱纯化后进行分子筛分离，AKATA参数设置0.5mL流速/分钟，每1mL收集一次；d)，根据电泳结果确定目的蛋白纯度，BCA法测定蛋白浓度。
(2)纳米抗体筛选
采用免疫管法对天然的羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行筛选，所选择的噬菌体展示库容量为2x109。筛选步骤如下：a)，将目的蛋白按10μg/mL浓度包被在免疫管上，进行3轮富集筛选；b)，使用第三轮噬菌体洗脱液铺板，随机挑取96个单克隆进行ELISA验证，以ELISA读数大于对应BSA读数3倍且读数大于0.5为阳性标准；c)，经过2次噬菌体ELISA鉴定的阳性单克隆送公司测序确定序列信息；d)，根据测序信息设计并合成筛选到的纳米抗体，通过大肠杆菌进行表达纯化制备纳米抗体单体(monomer)；e)，利用ELISA亲和性实验来初步鉴定纳米抗体的亲和力，选择亲和力较好的纳米抗体，通过(GGGGS)3linker两两偶联表达纯化产生纳米抗体二聚体(dimer)后进行表面等离子共振(surface plasmonresonance，SPR)测定亲和常数。
(3)纳米抗体的纯化表达
将纳米抗体基因序列克隆入pColdII载体，同时融合表达多聚组氨酸标签(Histag)及血凝素标签(hemagglutinin HA tag)用于后续检测。表达纯化步骤如下：a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，使用0.2mM浓度的IPTG在15℃低温进行诱导；b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000W进行破菌；c)，17000g，4℃离心30min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；g)，Ni柱纯化后进行分子筛分离，AKATA参数设置0.5mL流速/分钟，每1mL收集一次。
(二)纳米抗体的ELISA实验
将HA标签融合到纳米抗体基因编码序列里，表达具有HA标签的纳米抗体，ELISA板包被NKP46蛋白，封闭，之后加入各种浓度的纳米抗体在室温孵育1小时，PBS漂洗3次，anti-HA抗体室温孵育1小时后，辣根过氧化物酶标记的抗HA抗体放大信号，TMB显色，同时做无关纳米抗体的对照和无关蛋白抗原的空白对照。
(三)表面等离子共振实验(surface plasmon resonance，SPR)
此实验用来验证在体外表达纯化的纳米抗体与体外纯化的抗原蛋白直接相互作用，并计算二者的平衡常数。纯化抗原蛋白被固定在芯片上，不同浓度的纳米抗体被被顺序加入来分析与抗原蛋白的亲和力，记录360秒内的反应信号，制作动力学曲线，计算各相关参数。
结果分析
1.NKP46蛋白纳米抗体的筛选和初步鉴定
NK.P46蛋白大小约42kDa，适合作为纳米抗体的筛选靶标(图1A)。三轮噬菌体天然纳米抗体文库筛选之后，随机挑取200个噬菌体克隆进行初步的ELISA验证，发现一个克隆Nb1的结合活性大于对照蛋白BSA 3倍(图1B)。
2.NK.P46纳米抗体的筛选鉴定
进而表达纯化Nb1纳米抗体单体(Nb1 monomer)并同时将Nb1纳米抗体制备成同源二聚体(Nb1 dimer)(图2A)，纯化后电泳结果显示Nb1单体约为15kD(图2A)，二聚体约为30kD(图2B)。之后进行直接的ELISA验证，确认纳米抗体Nb1单体与二聚体均与NK.P46蛋白具有结合活性(图3)而且二聚体结合活性高于单体；而无关的对照纳米抗体(Con Nb)不与NKP46蛋白结合。
3.纳米抗体Nb1单体()和二聚体()与NKP46蛋白的亲和力检测
Nb1号纳米抗体单体和二聚体进一步通过SPR决定其与NKP46蛋白的亲和常数，结果表明Nb1单体与NKP46的亲和常数分别为128.1nM，而二聚体的亲和常数为46.8nM(图4)，提示二聚体之后纳米抗体亲和力增强。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (2)
1. 一种结合NKP46受体的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为纳米抗体Nb1，其中，所述纳米抗体Nb1的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的结合NKP46受体的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
所述纳米抗体Nb1中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，FR2的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
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