CN116670287A - Gpc3抗体及其应用 - Google Patents
Gpc3抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116670287A CN116670287A CN202180082576.5A CN202180082576A CN116670287A CN 116670287 A CN116670287 A CN 116670287A CN 202180082576 A CN202180082576 A CN 202180082576A CN 116670287 A CN116670287 A CN 116670287A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- cancer
- antigen
- binding fragment
- gpc3
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101001014668 Homo sapiens Glypican-3 Proteins 0.000 title claims abstract description 127
- 102100032530 Glypican-3 Human genes 0.000 title claims abstract description 98
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 149
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 137
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 112
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 112
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 111
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 74
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 58
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 52
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims abstract description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 claims abstract description 28
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 135
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 64
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 61
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 52
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 47
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 28
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 27
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 claims description 23
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 17
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 13
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 12
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 12
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 12
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 claims description 6
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 6
- 208000007538 neurilemmoma Diseases 0.000 claims description 6
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 206010039667 schwannoma Diseases 0.000 claims description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 4
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 claims description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 4
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 2
- 101150075175 Asgr1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024151 Cadherin-16 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100038449 Claudin-6 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000229 Claudin-6 Proteins 0.000 claims description 2
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000762246 Homo sapiens Cadherin-16 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101100334515 Homo sapiens FCGR3A gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 2
- 101001005719 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025082 Melanoma-associated antigen 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 claims description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 210000003515 double negative t cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000002961 echo contrast media Substances 0.000 claims description 2
- 108010087914 epidermal growth factor receptor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 claims description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 claims description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 50
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 37
- 102000048373 human GPC3 Human genes 0.000 description 29
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 21
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 12
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 8
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 102000010956 Glypican Human genes 0.000 description 5
- 108050001154 Glypican Proteins 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 231100000491 EC50 Toxicity 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 108050007237 Glypican-3 Proteins 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700022150 Designed Ankyrin Repeat Proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000017274 Diospyros sandwicensis Nutrition 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 208000003874 Simpson-Golabi-Behmel syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 2
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-UHFFFAOYSA-N 2-deoxypentose Chemical compound OCC(O)C(O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000282828 Camelus bactrianus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000912781 Carcharhinus galapagensis Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001655736 Catalpa bignonioides Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000006711 Chan reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001008255 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-8 Proteins 0.000 description 1
- 101001047628 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-29 Proteins 0.000 description 1
- 101001008321 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2D-26 Proteins 0.000 description 1
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 description 1
- 101001008263 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-15 Proteins 0.000 description 1
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100022949 Immunoglobulin kappa variable 2-29 Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000282842 Lama glama Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 208000006644 Malignant Fibrous Histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 108010079855 Peptide Aptamers Proteins 0.000 description 1
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015778 Undifferentiated pleomorphic sarcoma Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- -1 cytosine (C) Chemical compound 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 210000002816 gill Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 101150039713 gpc3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 208000023112 overgrowth syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N phencyclidine Chemical compound C1CCCCN1C1(C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000402 unacceptable toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/303—Liver or Pancreas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464474—Proteoglycans, e.g. glypican, brevican or CSPG4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
- A61K2239/11—Antigen recognition domain
- A61K2239/13—Antibody-based
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
提供了GPC3抗体及其应用，具体提供了特异性结合GPC3的抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、嵌合抗原受体、免疫效应细胞、分离的核酸片段、载体、宿主细胞、相应制备方法、药物组合物、治疗方法、制药用途、GPC3检测方法及检测试剂盒，在制备治疗癌症或肿瘤药物中具有重要意义。
Description
本公开要求于2020年12月10日提交中国专利局、申请号为202011437242.9、发明名称为“GPC3抗体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中。本公开还要求于2021年11月16日提交中国专利局、申请号为202111353420.4、发明名称为“GPC3抗体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中。
本公开涉及抗体领域，具体而言，涉及GPC3抗体及其应用。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是一种硫酸乙酰肝素(HS)糖蛋白，属于硫酸类肝素蛋白聚糖家族成员，它通过磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜表面。GPC3核心蛋白包括580个氨基酸，大小约70KD，它被弗林蛋白酶(Furin)剪切后，产生一个40kD的氨基(N)末端亚基和一个30kD的羧基(C)末端亚基，二者通过二硫键连接。GPC3的两条HS侧链结合在靠近C端的位置(Takahiro Nishida,Hiroaki Kataoka.Glypican 3-Targeted Therapy in Hepatocellular Carcinoma，Cancers 2019；11(9):1339)。
GPC3在胚胎中胚层组织的细胞增殖中发挥重要的调节作用，缺失GPC3基因会导致过度生长综合症，即Simpson-Golabi-Behmel综合症(SGBS)。GPC3在整个胎儿期均有明显表达，而出生后到成人阶段，除在胎盘、乳腺、间皮、卵巢、肺及肾组织有弱表达外，其他正常组织无明显表达。GPC3在成人多种肿瘤组织中异常表达，如肝细胞癌(HCC)、肺鳞癌、胃癌、卵巢癌等。尤其在HCC细胞中呈现高表达，它通过提高自分泌/旁分泌经典Wnt信号传递，促进HCC细胞的生长和侵袭(Capurro MI,Xiang Y-Y,Lobe C,Filmus J.Glypican-3 promotes the growth of hepatocellular carcinoma by stimulating canonical Wnt signaling.Cancer Res 2005；65:6245–54.)。免疫组织化学染色检测发现大约70％的HCC病人肿瘤组织中呈现GPC3蛋白高表达(Capurro M,Wanless IR,Sherman M,et al.Glypican-3:a novel serum and histochemical marker for hepatocellular carcinoma.Gastroenterology 2003；125:89–97)，因此GPC3被认为是肿瘤治疗的一个候选靶标。
1993年比利时科学家Hamers-Casterman C在骆驼血液中发现一种只含重链不含轻链的天然重链抗体,重链抗体和普通的抗体相比虽然缺失了轻链,但是依然保留结合抗原的能力(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,et al.Naturally occurring antibodies devoid of light chains.Nature.363(6428):446–8(1993))。克隆骆驼体内重链抗体的可变区后,得到的仅由一个重链可变区组成的单域抗体(single domain antibody，sdAb)，称为纳米抗体或VHH结构域(variable heavy chain domain of a heavy chain antibody)。
与普通抗体相比，纳米抗体具有分子量小、稳定性好、可溶性高等诸多优点。因此应用纳米抗体技术研发GPC3抗体具有广阔的前景，获得GPC3特异性纳米抗体对相关治疗药物 或检测试剂的开发具有重要意义。
发明内容
本公开公开特异性结合GPC3的抗体或抗原结合片段、多肽、嵌合抗原受体、免疫效应细胞、分离的核酸片段、载体、宿主细胞、相应制备方法、药物组合物、治疗方法、制药用途、GPC3检测方法及检测试剂盒。
在第一方面，本公开涉及一种特异性结合GPC3的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含CDR1、CDR2和CDR3。
在一些具体的实施方式中，所述CDR1、CDR2和CDR3为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些具体的实施方式中，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统确定，例如选自表1；例如，所述HCDR1选自SEQ ID NO：24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、88、91或94，所述HCDR2选自SEQ ID：25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、89、92或95，和所述HCDR3选自SEQ ID：26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、90、93或96；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：24～26、27～29或30～32的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：33～35、36～38或39～41的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：42～44、45～47或48～50的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：51～53、54～56或57～59的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：60～62、63～65或66～68的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：69～71、72～74或75～77的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：78～80、81～83或84～86的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：88～90、91～93或94～96。
在一些具体的实施方式中，所述CDR1、CDR2和/或CDR3包含在所述HCDR1、HCDR2和/或HCDR3上发生至多10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的氨基酸序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
在一些具体的实施方式中，所述CDR1、CDR2和/或CDR3包含与所述HCDR1、HCDR2和/或HCDR3相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一性的序列。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含单域抗体，所述单域抗体包含所述CDR1、CDR2和CDR3。
在一些具体的实施方式中，所述单域抗体包含SEQ ID NO：17～23或87任一项所示序列；可选地，所述单域抗体包含与SEQ ID NO：17～23或87任一项所示序列相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或所述单域抗体包含与SEQ ID NO：17～23或87任一项所示序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列，所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
在一些具体的实施方式中，所述单域抗体包含SEQ ID NO：17～23或87任一项所示VHH结构域中的FR区；可选地，所述单域抗体包含与SEQ ID NO：17～23或87任一项所示VHH结构域中的FR区相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或者所述单域抗体包含与SEQ ID NO：17～23或87任一项所示VHH结构域中的FR区相比发生至多15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列，所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段为：(1)嵌合抗体或其片段；(2)人源化抗体或其片段；或(3)全人抗体或其片段。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含或不包含抗体重链恒定区；可选的，所述抗体重链恒定区可选自人、羊驼、小鼠、大鼠、兔或羊；可选地，所述抗体重链恒定区可选自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，所述IgG可选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4；可选地，所述重链恒定区可选自Fc区、CH3区或完整重链恒定区，优选地，所述重链恒定区为人Fc区，更优选具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；优选地，所述抗体或抗原结合片段为重链抗体。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。
在一些具体的实施方式中，所述VHH结构域特异性结合人、猴和/或鼠GPC3；优选地，其与人和/或猴GPC3结合的KD优于1.00E-7M、1.00E-8M、2.00E-8M、3.00E-8M、4.00E-8M、5.00E-8M、6.00E-8M、7.00E-8M、8.00E-8M、9.00E-8M、1.00E-9M、2.00E-9M、3.00E-9M、4.00E-9M、5.00E-9M、6.00E-9M、7.00E-9M、8.00E-9M、9.00E-9M或1.00E-10M。
在第二方面，本公开公开一种特异性结合GPC3的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3包含选自SEQ ID NO:17～23或87任一项所示VHH结构域中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些具体的实施方式中，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统确定，例如选自表1；例如，所述HCDR1选自SEQ ID NO：24、 27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、88、91或94，所述HCDR2选自SEQ ID：25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、89、92或95，和所述HCDR3选自SEQ ID：26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、90、93或96；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：24～26、27～29或30～32的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：33～35、36～38或39～41的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：42～44、45～47或48～50的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：51～53、54～56或57～59的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：60～62、63～65或66～68的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：69～71、72～74或75～77的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：78～80、81～83或84～86的序列；
优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：88～90、91～93或94～96。。
在一些具体的实施方式中，所述CDR1、CDR2和/或CDR3包含在所述HCDR1、HCDR2和/或HCDR3上发生至多10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的氨基酸序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
在一些具体的实施方式中，所述CDR1、CDR2和/或CDR3包含与所述HCDR1、HCDR2和/或HCDR3相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
在第三方面，本公开还公开一种多肽，所述多肽包含前述抗体或抗原结合片段，优选地，所述多肽还连接有其他功能性分子，所述其他功能性分子可选自以下一种或多种：信号肽、蛋白标签、其他抗原结合分子或细胞因子。
在一些具体的实施方式中，所述其他抗原结合分子特异性结合GPC3以外的抗原或结合与前述抗体或抗原结合片段不同的GPC3表位；
优选地，所述GPC3以外的抗原可选自：CD3，优选CD3ε；CD16，优选CD16A；NKG2D；CD40；4-1BB；CD137或CD19；EGFR；EGFRvIII；mesothelin；HER2；EphA2；Her3；EpCAM；MUC1；MUC16；CEA；Claudin18.2；叶酸受体；Claudin6；WT1；NY-ESO-1；MAGE3；ASGPR1或CDH16；
优选地，所述其他抗原结合分子为抗体或抗原结合片段；
优选地，所述多肽为多特异性抗原结合分子，所述多特异性抗原结合分子可为双特异性、三特异性或四特异性，更优选地，所述多特异性抗原结合分子可为二价、四价或六价。
在一些具体的实施方式中，所述细胞因子可选自IL2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-21、IFN或TNF-alpha。
在第四方面，本公开还公开一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含前述抗体或抗原结合片段。
在第五方面，本公开还公开一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞表达前述的嵌合抗原受体，或包含编码前述嵌合抗原受体的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞；优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
在第六方面，本公开还公开一种分离的核酸片段，所述核酸片段编码前述的抗体或抗原结合片段、多肽、或嵌合抗原受体。
在第七方面，本公开还公开一种载体(vector)，所述载体包含前述的核酸片段。
在第八方面，本公开还公开一种宿主细胞，所述宿主细胞包含前述的载体；优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)。
在第九方面，本公开还公开一种制备前述抗体或抗原结合片段或多肽的方法，所述方法包括培养前述细胞，以及分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或分离所述细胞表达的多肽。
在第十方面，本公开还公开一种制备前述免疫效应细胞的方法，所述方法包括将编码前述CAR的核酸片段导入所述免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达前述CAR。
在第十一方面，本公开还公开一种药物组合物，所述药物组合物包含前述的抗体或抗原结合片段、多肽、免疫效应细胞、核酸片段、载体或根据前述方法制备获得的产品；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；可选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
在第十二方面，本公开还公开一种治疗GPC3阳性肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述的抗体或抗原结合片段、多肽、免疫效应细胞、核酸片段、载体、根据前述方法制备获得的产品或前述药物组合物；优选地，所述GPC3阳性肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤或食道癌；更优选地，所述GPC3阳性肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、肺癌或乳腺癌。
在第十三方面，本公开还公开前述的抗体或抗原结合片段、多肽、免疫效应细胞、核酸 片段、载体、根据前述方法制备获得的产品或前述药物组合物在制备治疗GPC3阳性肿瘤或癌症药物中的用途，优选地，所述GPC3阳性肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤或食道癌；更优选地，所述GPC3阳性肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、肺癌或乳腺癌。
在第十四方面，本公开还公开前述的抗体或抗原结合片段、多肽、免疫效应细胞、核酸片段、载体、根据前述方法制备获得对的产品或前述药物组合物，用于治疗GPC3阳性肿瘤或癌症；优选地，所述GPC3阳性肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤或食道癌；更优选地，所述GPC3阳性肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、肺癌或乳腺癌。
在第十五方面，本公开还公开一种试剂盒，所述试剂盒包含前述的抗体或抗原结合片段、多肽、免疫效应细胞、核酸片段、载体、宿主细胞、根据前述方法制备获得的产品或前述药物组合物。
在第十六方面，本公开还公开一种检测生物学样品中GPC3表达的方法，所述方法包括在前述的抗体或抗原结合片段与GPC3之间能够形成复合物的条件下，使所述生物学样品与前述的抗体或抗原结合片段接触；优选地，所述方法还包括检测所述复合物的形成，指示样品中GPC3的存在或表达水平。
在第十七方面，本公开还公开前述抗体或抗原结合片段在制备GPC3检测试剂中的用途。
在第十八方面，本公开还公开一种用于检测GPC3的试剂盒，所述试剂盒至少包含前述的抗体或抗原结合片段。
术语定义和说明
除非本公开另外定义，与本公开相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。
此外，除非本文另有说明，本文单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非另外明确指出，否则单数形式“一种”和“这种”包括复数指示物。
本文术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用，旨在表示方案的包含性，意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……组成”方案。
术语“和/或”在本文使用时，包括“和”、“或”和“由所属术语链接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
本文术语“磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)”是一种硫酸乙酰肝素(HS)糖蛋白，属于硫酸类肝素蛋白聚糖家族成员，它通过磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜表面。本文“GPC3”包括成熟或未成熟的全长野生型GPC3蛋白或其突变体(例如点突变、插入突变或缺失突变)、剪切变体(splice variant)、直系同源物(Orthologs)以及前述GPC3的片段。示例性地，本文“GPC3”可以来源于哺乳动物，例如，人、灵长类动物，如猴(例如恒 河猴、食蟹猴)和啮齿类动物，例如小鼠和大鼠。示例性地，人GPC3氨基酸序列可参见NCBI:NM_004484.3，猴GPC3氨基酸序列可参见NCBI：XP_011739317.1。
本文术语“特异性结合”是指抗原结合分子(例如抗体)通常以高亲和力特异性结合抗原和实质上相同的抗原，但不以高亲和力结合不相关抗原。亲和力通常以平衡解离常数(equilibrium dissociation constant，KD)来反映，其中较低KD表示较高亲和力。以抗体为例，高亲和力通常指具有约10
-7M或更低、约10
-8M或更低、约1×10
-9M或更低、约1×10
-10M或更低、1×10
-11M或更低或1×10
-12M或更低的KD。KD计算方式如下：KD＝Kd/Ka，其中Kd表示解离速率，Ka表示结合速率。可采用本领域周知的方法测量平衡解离常数KD，如表面等离子共振(例如Biacore)或平衡透析法测定。
本文术语“抗原结合分子”按最广义使用，是指特异性结合抗原的分子。示例性地，抗原结合分子包括但不限于抗体或抗体模拟物。“抗体模拟物”是指能够与抗原特异性结合，但与抗体结构无关的有机化合物或结合域，示例性地，抗体模拟物包括但不限于affibody、affitin、affilin、经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、核酸适体或Kunitz型结构域肽。
本文术语“抗体”按最广义使用，是指包含来自免疫球蛋白重链可变区的足够序列和/或来自免疫球蛋白轻链可变区的足够序列，从而能够特异性结合至抗原的多肽或多肽组合。本文“抗体”涵盖各种形式和各种结构，只要它们展现出期望的抗原结合活性。本文“抗体”包括具有移植的互补决定区(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白质支架或人工支架。此类支架包括抗体衍生的支架(其包含引入以例如稳定化抗体三维结构的突变)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。参见，例如Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque et al.,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此类支架还可以包括非抗体衍生的支架，例如本领域已知可用于移植CDR的支架蛋白，包括但不限于肌腱蛋白、纤连蛋白、肽适体等。
本文“抗体”包括一种典型的“四链抗体”，其属于由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成的免疫球蛋白；重链是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域；轻链是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链；重链与重链之间、重链与轻链之间通过二硫键连接，形成“Y”字型结构。由于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将本文“免疫球蛋白”分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中的每类Ig都可以有κ链或λ链。
本文“抗体”还包括不包含轻链的抗体，例如，由单峰驼(Camelus dromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanicoe)和羊驼(Vicugna pacos)等骆驼科动物产生的重链抗体(heavy-chain antibodies,HCAbs)以及在鲨等软骨鱼纲中发现的免疫球蛋白新抗原受体(Ig new antigen receptor,IgNAR)。
如本文所用，术语“重链抗体”是指缺乏常规抗体的轻链的抗体。该术语具体包括但不限 于在不存在CH1结构域的情况下包含VH抗原结合结构域以及CH2和CH3恒定结构域的同型二聚体抗体。
本文术语“VHH结构域”和“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体”(single domain antibody,sdAb)具有相同的含义并可互换使用，是指克隆重链抗体的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
关于“重链抗体”和“单域抗体”、“VHH结构域”和“纳米抗体”的进一步描述可参见：Hamers-Casterman等，Nature.1993；363；446-8；Muyldermans的综述文章(Reviews inMolecular Biotechnology 74：277-302，2001)；以及以下专利申请，其被作为一般背景技术提及：WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；WO94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；WO97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016和WO 03/055527；WO 03/050531；WO 01/90190；WO03/025020；以及WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO 06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825以及这些申请中提到的其他现有技术。
本文“抗体”可以来源于任何动物，包括但不限于人和非人动物，所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物，例如骆驼科动物、大羊驼、原鸵、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。
本文术语“多特异性”是指具有至少两个抗原结合位点，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。
本文术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此,术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。
本文“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有基本上与天然抗体结构相似的结构。
本文“抗原结合片段”和“抗体片段”在本文中可互换使用，其不具备完整抗体的全部结构，仅包含完整抗体的局部或局部的变体，所述局部或局部的变体具备结合抗原的能力。示例性地，本文“抗原结合片段”或“抗体片段”包括但不限于Fab、F(ab’)
2、Fab’、Fab’-SH、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体。
本文术语“嵌合抗体”是指以下抗体，其具有源自一种来源生物(如大鼠、小鼠、兔或羊驼)的免疫球蛋白的可变序列以及源自不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人，1986,Bio Techniques 4:214-221；Gillies等人，1985J Immunol Methods 125:191-202；以上通过援引加入并入本文。
本文术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。
本文术语“全人抗体”是指具有其中FR和CDR二者都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文全人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文“全人抗体”不包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
本文术语“可变区”是指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的区域，“重链可变区”与“VH”、“HCVR”可互换使用，“轻链可变区”与“VL”、“LCVR”可互换使用。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。本文术语“互补决定区”与“CDR”可互换使用，通常指重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的高变区(HVR)，该部位因在空间结构上可与抗原表位形成精密的互补，故又称为互补决定区，其中，重链可变区CDR可缩写为HCDR，轻链可变区CDR可缩写为LCDR。本术语“构架区”或“FR区”可互换，是指抗体重链可变区或轻链可变区中除CDR以外的那些氨基酸残基。通常典型的抗体可变区由4个FR区和3个CDR区按以下顺序组成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
对于CDR的进一步描述，参考Kabat等人,J.Biol.Chem.,252:6609-6616(1977)；Kabat等人,美国卫生与公共服务部，“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)。本文“CDR”可由本领域公知的方式加以标注和定义，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统，使用的工具网站包括但不限于AbRSA网站(http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php)、abYsis网站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)和IMGT网站(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)。本文CDR包括不同定义方式的氨基酸残基的重叠(overlap)和子集。
本文术语“Kabat编号系统”通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
本文术语“Chothia编号系统”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
本文术语“IMGT编号系统”通常是指基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系 统(The international ImMunoGeneTics information system(IMGT))的编号系统，可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。
示例性地，采用Kabat、Chothia和IMGT确定S001-NB150-20(cyno+)、S001-NB150-28(cyno+)、S001-NB150-56、S001-NB152-1、S001-NB152-101、S001-NB152-72-2、VH001(SEQ ID NO：17～23)、VHH-12(SEQ ID NO：87)的CDR，具体结果如表1所示：
表1 CDR序列表
本文术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”可选自CH1结构域，铰链区，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成；当抗体为IgE时，其还包括CH4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括CH1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自Fc或CH3结构域。
本文术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
本文中的术语“Fc区”用于定义抗体重链中含有恒定区的至少一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。示例性地，人IgG重链Fc区可自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞生成的抗体可经历翻译后切割，自重链的C端切除一个或多个，特别是一个或两个氨基酸。因此，通过编码全长重链的特定核酸分子的表达由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链，或者它可包括全长重链的切割变体。当重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，编号方式依照Kabat EU索引)时可能就是这种情况。因此，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)，或C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。
典型地，IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域，可选地，在此基础上还可包含完整或部分铰链区，但不包含CH1域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中，碳水化合物链附着于CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。“CH3域”包含Fc区中在CH2域C端的那段残基(即自IgG的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”，knob)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”，hole)的CH3域；参见美国专利No.5,821,333，通过援引明确收入本文)。如本文中描述的，此类变体CH3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。
除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号系统，也称作EU索引，如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述的。
本文术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。
示例性地，以下六组是被认为是互为保守性置换的氨基酸的实例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
本文术语“同一性”可通过以下方式计算获得：为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的“同一性”百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。
考虑到为最佳比对这两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数随所述序列共有的相同位置变化而变化。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。例如，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。又例如，使用GCG软件包中的GAP程序(在www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
额外地或备选地，可以进一步使用本公开所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。例如，可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程序(版本2.0)执行此类检索。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序，评分＝100、字长度＝12执行，以获得与本公开核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序、评分＝50、字长度＝3执行，以获得与本公开蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述那样使用空位 BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
本文术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指经改造以在免疫效应细胞上表达并且特异性结合抗原的人工细胞表面受体，其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域，例如抗体的可变重链或轻链，(2)锚定CAR进入免疫效应细胞的跨膜结构域，和(3)胞内信号传导结构域。CAR能够利用细胞外抗原结合结构域以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫效应细胞重定向至所选择的靶标，例如癌细胞。
本文术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基的序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5′至3′。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA)，特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子，其适合作为载体用于在体外和/或体内，例如在宿主或患者中，直接表达本公开的抗体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或被编码分子的表达，从而可以将mRNA注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823B1)。本文“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
本文术语“载体”是指能够扩增与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及整合入已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
本文术语“宿主细胞”是指细胞中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
本文术语“药物组合物”是指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
本文术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如癌症和肿瘤。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)， 无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
本文术语“受试者”是指接受对如本公开所述的特定疾病或病症的治疗的生物体。示例性地，“受试者”包括接受疾病或病症治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物(例如，猴)或非灵长类哺乳动物。
本文术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。
本文术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。本文术语“肿瘤”或“瘤”是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
本文术语“EC50”是指半最大有效浓度，其包括在指定暴露时间之后诱导基线与最大值之间的半途响应的抗体浓度。EC50本质上代表其中观察到其最大作用的50％的抗体浓度，可通过本领域已知方法测量。
本文术语“GPC3阳性”是指细胞或组织的GPC3细胞表达高于相应细胞或组织的正常表达水平，“GPC3阳性”可通过本领域已知方法检测。
图1A为ELISA检测对照抗体与人GPC3-His蛋白的结合反应；
图1B为ELISA检测对照抗体与猴GPC3-His蛋白的结合反应；
图1C为ELISA检测对照抗体与鼠GPC3-His蛋白的结合反应；
图2A为ELISA检测多肽GC3pep蛋白与对照抗体的结合反应；
图2B为ELISA检测多肽YP7pep蛋白与对照抗体的结合反应；
图3A为Tab003抗体检测HepG2细胞GPC3表达量的FACS结果；
图3B为Tab005抗体检测HepG2细胞GPC3表达量的FACS结果；
图4A为Tab003抗体检测CHOK1-hGPC3.1C3细胞GPC3表达量的FACS结果；
图4B为Tab003抗体检测CHOK1-hGPC3.2B5细胞GPC3表达量的FACS结果；
图4C为为Tab003抗体检测CHOK1-hGPC3.3E9细胞GPC3表达量的FACS结果；
图5为Tab003抗体检测HEK293T-猴GPC3细胞GPC3表达量的FACS结果；
图6A为ELISA检测人GPC3蛋白免疫后羊驼血清抗体效价情况；
图6B为FACS检测人GPC3蛋白免疫后羊驼血清抗体效价情况；
图7A～图7B为ELISA检测VHH-hFc与人GPC3-his蛋白的结合反应；
图8A为FACS检测VHH-hFc与CHO-K1-人GPC3细胞的结合反应；
图8B为FACS检测VHH-hFc与CHO-K1细胞的结合反应；
图9A和图9C为FACS检测VHH-hFc与HepG2肿瘤细胞的结合反应；
图9B和图9D为FACS检测VHH-hFc与A431肿瘤细胞的结合反应；
图10为ELISA检测VHH-hFc与猴GPC3-His蛋白的结合反应；
图11为ELISA检测VHH-hFc与鼠GPC3-his蛋白的结合反应；
图12A为ELISA检测VHH-hFc与HEK293T-猴GPC3细胞的结合反应；
图12B为ELISA检测VHH-hFc与HEK293T细胞的结合反应；
图13A为ELISA检测VHH-hFc与GC3pep多肽蛋白的结合反应；
图13B为ELISA检测VHH-hFc与YP7pep多肽蛋白的结合反应。
下面结合具体实施例来进一步描述本公开，本公开的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本公开实施例仅是范例性的，并不对本公开的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本公开的精神和范围下可以对本公开技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本公开的保护范围内。
实施例1对照抗体制备、人源多肽制备、内源细胞鉴定和过表达细胞株的制备
(A)、对照抗体的制备
分别将识别人GPC3的单克隆抗体Y035和T2-23的VL和VH以及人IgG1Fc按照从N端到C端的顺序连接，其中VH和VL之间通过3个GGGGS连接子连接，形成scFv-人IgG1Fc(scFv-hFc)的形式，将其对应的核苷酸序列分别克隆到pTT5载体(购自优宝生物)中，并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。Y035和T2-23的的具体信息参见专利文献WO2017020812A1，其通过引用并入本文。将表达载体按照PEI(购自Polysciences)说明书瞬时转染HEK293E细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)并使用FreeStyle TM 293(Invitrogen)在37℃下连续培养5天，离心去除细胞成分，获得含ScFv-人IgG1 Fc(hFc)形式的抗体的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A层析柱(蛋白A填料AT Protein A Diamond和层析柱BXK16/26均购自博格隆)，使用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗后再用20mM PB,1M NaCl,pH 7.2进行清洗，最后使用pH3.4的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集从蛋白A层析柱上洗脱下来的带Fc标签的抗体，用1/10体积的pH8.0的1M Tris中和，用PBS在4℃条件透析过夜，透析后的抗体使用Nanodrop测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒(购自安度斯)检测抗体内毒素含量，最后将抗体经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存。将Y035scFv-hFc形式的抗体和T2-23scFv-hFc形式的抗体分别命名 为Tab003和Tab005。表2为相关对照抗体的序列信息。
表2对照抗体序列信息
对照抗体与人GPC3-His蛋白(购自Acro，货号：GP3-H52H4)、猴GPC3-His蛋白(购自Acro，货号：GP3-C5225)以及鼠GPC3-His蛋白(购自Sino Biological，货号：50989-M08B)的结合活性如表3～5和图1A～1C所示，IgG亚型对照为人IgG1。结果说明，Tab003、Tab005抗体均与人GPC3蛋白以及猴GPC3蛋白有很好的结合活性，Tab003不与鼠GPC3蛋白结合，Tab005与鼠GPC3蛋白结合良好，与文献报道相符。
表3 ELISA检测对照抗体与人GPC3-his蛋白的结合反应
表4 ELISA检测对照抗体与猴GPC3-his蛋白的结合反应
表5 ELISA检测对照抗体与鼠GPC3-his蛋白的结合反应
(B)、人源多肽GC3pep和YP7pep蛋白的制备
委托吉尔生化生产人源GPC3(NCBI:NM_004484.3，Ala524-Lys563)的多肽GC3pep和人源GPC3(NCBI:NM_004484.3，Asp511-Ser560)的多肽YP7pep，具体序列如下所示：
GC3pep：AELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLK(SEQ ID NO：8)；YP7pep：DGMIKVKNQLRFLAELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHS(SEQ ID NO：9)。
对制备的上述多肽分别用识别不同表位的阳性对照抗体进行ELISA检测，检测结果如表6～7和图2A、2B所示，Tab005不能结合多肽GC3pep和YP7pep，Tab003能结合多肽GC3pep和YP7pep，检测结果与文献报道的一致，说明已经制备获得具有结合活性的上述多肽。
表6 ELISA检测对照抗体与多肽GC3pep蛋白的结合反应
表7 ELISA检测对照抗体与多肽YP7pep蛋白的结合反应
(C)、内源性表达GPC3蛋白的细胞株鉴定
将HepG2细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，离心弃去培养基上清，细胞沉淀用PBS洗涤2次。用Tab003和Tab005抗体作为一抗，FITC标记的二抗(购自Invitrogen，货号：A11013)经FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析。结果如表8以及图3A～3B所示，说明HepG2细胞与Tab003和Tab005均可结合。
表8内源细胞系HepG2细胞的FACS检测结果
(D)、表达人GPC3蛋白的CHO-K1重组细胞株的制备
编码人GPC3全长氨基酸序列(NCBI:NM_004484.3)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体(购自Clontech)并制备质粒。对CHO-K1细胞系(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)进行质粒转染(
3000 Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含10μg/mL puromycin的含10％(w/w)胎牛血清的DMEM/F12培养基中选择性培养2周，用Tab003抗体和驴抗人IgG H+L抗体(Jackson，货号：109605088)，在流式细胞仪(FACSAriaII，自BD Biosciences)上分选阳性单克隆细胞到96孔板，并置于37℃，5％(v/v)CO
2培养，大约2周后选择部分单克隆孔进行扩增。对扩增后的克隆经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存。具体选择结果如表9和图4A～4C所示，IgG亚型对照为人IgG1对照。表9说明，已经制得一系列人GPC3阳性表达的CHO-K1单克隆细胞系。图4A～4C中，横坐标为细胞荧光强度，纵坐标为细胞数。结果说明，1C3、2B5、3E9为人GPC3高水平表达细胞株，最终选择2B5细胞株用于后续实施例。
人GPC3全长氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO：10)：
表9表达人GPC3蛋白的CHO-K1重组细胞系FACS检测结果
(E)、表达猴GPC3蛋白的重组HEK293T细胞株制备
编码猴GPC3全长氨基酸序列(NCBI：XP_011739317.1，SEQ ID NO：11)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体(购自Thermofisher scientific)并制备质粒。对HEK293T细胞系用
HD(Promega，货号：#E2311)进行质粒转染后，在含10μg/mL puromycin的含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用Tab003抗体和和驴抗人IgG H+L抗体(Jackson，货号：109605088)在流式细胞仪(FACSAriaII，购自BD Biosciences)上分选富集阳性单克隆细胞到96孔板，并置于37℃，5％(v/v)CO
2培养，大约1周后进行扩增。对扩增后的细胞经流式细胞分析法进行检测，选择长势较好、荧光强度较高的细胞株继续扩大培养并液氮冻存。表达量的结果如图5，显示经过puromycin加压筛选后的HEK293T-猴-GPC3具有单一的阳性峰，可用于检测抗体的交叉活性。
猴GPC3全长氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO：11)：
实施例2针对GPC3的单域抗体VHH的制备
(A)、羊驼免疫及血清效价检测
委托吉尔生化生产偶联载体蛋白(KLH)的多肽GC3pep，即多肽GC3pep-KLH(AELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLKC-KLH)。
采用人GPC3(Gln 25-His 559)-His蛋白(购自Acro，货号：GP3-H52H4)和多肽GC3pep-KLH，免疫两只羊驼(Alpaca，编号为NB150和NB152)。初次免疫时，人GPC3-His蛋白用弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射，即每只羊驼注射500μg人GPC3-His蛋白。前三次加强免疫时，人GPC3-His蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射，即每只羊驼注射250μg人GPC3-His蛋白。第四次加强免疫时，多肽GC3pep-KLH用弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射，即每只羊驼注射250μg多肽GC3pep-KLH。初次免疫与第一次加强免疫之间 间隔3周，第一次加强免疫与第二次加强免疫之间间隔3周，第二次加强免疫与第三次加强免疫之间间隔3周，第三次加强免疫与第四次加强免疫之间间隔2个月。
每次加强免疫1周后采血，用ELISA和FACS检测血清中人GPC3-His的抗体效价和特异性，结果如图6A～6B和表10所示。说明经人GPC3-His和多肽GC3pep-KLH蛋白免疫后的羊驼的血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中ELISA最高稀释度在12500左右。其中空白对照为1％(w/w)BSA，批次指第四次(TB4)和第五次(TB5)免疫后第七天的羊驼血清，表中的数据为OD450nm值。
表10 ELISA检测人GPC3-His蛋白免疫后的羊驼血清抗体效价
(B)、噬菌体文库构建及针对GPC3纳米抗体淘选
第五次(TB5)免疫后一周，采集100mL羊驼外周血，使用淋巴分离液分离PBMC，并使用RNAiso Plus试剂提取总RNA。使用PrimeScript
TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(购自Takara，货号：6210A)将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增编码重链抗体的可变区核酸片段：
第一轮PCR：
上游引物(SEQ ID NO：12)：CTTGGTGGTCCTGGCTGC；
下游引物(SEQ ID NO：13)：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC。
第二轮PCR：
以第一轮PCR产物作为模板，
上游引物(SEQ ID NO：14)：
下游引物-1(SEQ ID NO：15)：
下游引物-2(SEQ ID NO：16)：
回收目标单域抗体核酸片段，并使用限制性内切酶SfiI将其克隆进入噬菌体展示用载体pcomb3XSS中。产物随后电转化至大肠杆菌电转感受态细胞TG1中，构建针对GPC3的单域抗体噬菌体展示文库并对文库进行检定。通过梯度稀释铺板，计算库容的大小为3.4×10
9。为检测文库的插入率，随机选取48个克隆做菌落PCR。结果显示插入率达到100％。
(C)、针对GPC3的单域抗体淘选
将人GPC3-Llama-Fc蛋白(购自Acro，货号：GP3-H5257)用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为5μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，每个蛋白包被8孔，4℃包被过夜；弃包被液，PBS洗涤3次，每孔加入300μL 3％BSA-PBS封闭液，37℃封闭1小时；PBS洗涤3次，加入100μL噬菌体文库，37℃孵育1小时；吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次；加入100μL Gly-HCl洗脱液，37℃孵育8分钟，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至1.5mL无菌离心管中，迅速用10μL Tris-HCl中和缓冲液中和；取10μL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，可用于下一轮亲和淘选。
从第一轮淘选洗脱物滴度的平板上，用灭菌牙签随机挑取192个单克隆接种于1mL2×YT-A中，37℃，220r/min振荡培养8小时。取100μL上述培养物，按cell：phage＝1：20的比例加入M13K07噬菌体，37℃，静置15min，220r/min振荡培养45分钟。补加300μL体积的2×YT-AK，30℃，剧烈振荡培养过夜。第二天12000rpm离心2分钟，取上清，用于单克隆ELISA鉴定。
将人GPC3蛋白和GC3pep多肽用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释至终浓度为2μg/mL，按100μL孔加入酶标孔中，4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL5％脱脂牛奶，37℃封闭1小时；PBST洗涤3次，每孔加入50μL噬菌体培养菌液上清和50μL5％脱脂牛奶，37℃，孵育1小时；PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(用PBS按1:10000稀释)，100μL/孔，37℃作用1小时；PBST洗板6次。加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃，7分钟，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm波长下测光密度。挑选人GPC3蛋白和GC3pep多肽双阳性克隆送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。
对测序结果进行分析，根据VHH编码蛋白序列构建进化树，根据序列相似性剔除在进化树上距离较近的序列进行VHH-hFc生产鉴定。用于生产鉴定的VHH序列如下所示，并根据IMGT网站(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)、abYsis网站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)和AbRSA网站(http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php)确定所述VHH序列的CDR区，具体参见表1。
>S001-NB150-20(cyno+)(SEQ ID NO：17)
>S001-NB150-28(cyno+)(SEQ ID NO：18)
>S001-NB150-56(SEQ ID NO：19)
>S001-NB152-1(SEQ ID NO：20)
>S001-NB152-101(SEQ ID NO：21)
>S001-NB152-72-2(SEQ ID NO：22)
>VH001(SEQ ID NO：23)
>VHH-12(SEQ ID NO:87)
实施例3 VHH-hFc生产
将目标的VHH序列重组到人IgG1Fc的表达载体中，得重组质粒。具体的质粒构建、转染以及纯化流程参照实施例1(A)。将纯化的VHH-hFc进行蛋白浓度、纯度、内毒(Lonza试剂盒)等检测分析，结果如表11所示，结果发现，抗体最终产品纯度较高，内毒素浓度在1.0EU/mg以内。
表11纯化的VHH-hFc质量控制
实施例4 VHH-hFc抗的鉴定
(A)、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测VHH-hFc与人GPC3蛋白的结合
人GPC3蛋白用PBS稀释到终浓度1μg/mL，然后以50μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用PBS洗板2次，加入封闭液[PBS+2％(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，加入100nM梯度稀释的VHH-hFc、阳性对照抗体或阴性对照抗体，50μl每孔。37℃孵育2小时后，用PBS洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记二抗(购自Merck，货号：AP113P)，37℃孵育1小时，用PBS洗板5次。加入TMB底物50μl每孔，室温孵育10分钟后，加入终止液(1.0M HCl)50μl每孔。用ELISA读板机(Multimode Plate Reader，EnSight，购自Perkin Elmer)读取OD450nm数值，VHH-hFc与人GPC3蛋白的结合活性结果如图7A～图7B和表12-1、表12-2所示，S001-NB152-1抗体与人GPC3蛋白有弱结合，其余7个VHH-hFc与人GPC3蛋白均结合良好。其中IgG对照为hIgG1，表中数据为OD450nm值。
表12-1 ELISA检测VHH-hFc与人GPC3蛋白的结合反应
表12-2 ELISA检测VHH-hFc与人GPC3蛋白的结合反应
(B)、流式细胞实验(FACS)检测抗体与表达GPC3蛋白的细胞和不表达GPC3蛋白的细胞(阴性细胞)的结合
将所需细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，吸除培养基，用PBS缓冲液洗涤2次，用胰酶消化细胞，然后用完全培养基终止消化，并吹打细胞至单细胞悬液。细胞计 数后，离心，将细胞沉淀用FACS缓冲液(PBS+2％胎牛血清)重悬至2x10
6细胞每毫升，按每孔50μl加入到96孔FACS反应板中，加入VHH-hFc、阳性对照抗体或阴性对照抗体，每孔50μl，4度孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔50μl二抗anti-hIgG(H+L)Alexa 647(购自Jackson，货号：109-605-088)，冰上孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，100μl用FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(FlowJo)进行数据分析，得到细胞的平均荧光密度(MFI)。再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合，计算EC50。
分析结果如表13～14以及图8A～8B、图9A～9D所示(NB表示No binding，即不结合)，表13和图8A-8B表明VHH-hFc均可结合CHO-K1-人GPC3细胞，不结合CHO-K1细胞；表14-1、表14-2和图9A-9D表明VHH-hFc均可结合HepG2细胞，除抗体S001-NB150-20(cyno+)外，其余抗体均不结合A431细胞。
表13 FACS检测VHH-hFc与CHO-K1-人GPC3细胞和CHO-K1细胞结合反应
表14-1 FACS检测VHH-hFc与HepG2细胞和A431细胞结合反应
表14-2 FACS检测VHH-hFc与HepG2细胞和A431细胞结合反应
实施例5 VHH-hFc的交叉结合活性检测
(A)、ELISA检测VHH-hFc与猴GPC3蛋白和鼠GPC3蛋白的结合
将猴GPC3-His蛋白(购自Acro，货号：GP3-C5225)按照实施例4(A)的方法进行ELISA检测与数据分析。VHH-hFc与猴GPC3蛋白的ELISA结果如图10和表15所示，结果表明，S001-NB150-56抗体与猴GPC3蛋白有弱结合，S001-NB152-1抗体与猴GPC3蛋白不结合，其余VHH-hFc与猴GPC3蛋白结合良好。其中IgG对照为hIgG1，表中数据为OD450nm值。
表15 ELISA检测VHH-hFc与猴GPC3蛋白的结合反应
将鼠GPC3-his蛋白(购自Sino Biological，货号：50989-M08B)按照实施例4(A)的方法进行ELISA检测与数据分析。VHH-hFc与鼠GPC3蛋白的ELISA结果如图11和表16所示，结果表明，S001-NB152-1抗体与鼠GPC3蛋白有弱结合，S001-NB150-20(cyno+)和S001-NB152-101与鼠GPC3蛋白不结合，其余4个VHH-hFc与鼠GPC3蛋白结合良好。
表16 ELISA检测VHH-hFc与鼠GPC3蛋白的结合反应
(B)ELISA检测VHH-hFc与表达猴GPC3蛋白的细胞结合
将HEK293T-猴GPC3细胞按照实施例4(B)的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果如表17以及图12A、图12B所示，所有VHH-hFc均与HEK293T-猴-GPC3细胞结合，与HEK293T细胞不结合。
表17 FACS检测VHH-hFc与HEK293T-猴GPC3细胞和HEK293T细胞结合反应
实施例6 GPC3羊驼抗体的亲和力检测
(A)、VHH-hFc抗体与人GPC3蛋白亲和力检测
使用Protein A芯片(GE Helthcare；29-127-558)捕获抗人GPC3 VHH-hFc。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)(GE Healthcare；BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为16℃。两者都用运行缓冲液预处理。在每一个循环中，首先用Protein A芯片捕获待测抗体，然后注入单一浓度的GPC3抗 原蛋白，记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程，最后用Glycine pH1.5(GE Helthcare；BR-1003-54)完成芯片再生。通过注射溶液中不同浓度的人GPC3-His持续240秒来测量结合，其中流速为30μL/分钟，从200nM起始(测试的实际浓度见详细结果)，以1：1稀释，总共5个浓度。监测解离相长达600秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液触发。通过用10mM甘氨酸溶液(pH 1.5)以30μL/分钟的流速洗涤30秒，再生表面。通过减去从山羊抗人Fc表面获得的响应来校正本体折射率(Bulk refractive index)差异。也减去空白注射(＝双重参照)。为了计算表观KD和其他动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。VHH-hFc与人GPC3蛋白的结合速率(Ka)、解离速率(Kdis)及结合亲和力(KD)如表所示，其中抗体Tab003作为对照。如表18-1、表18-2和图13A和13B所示，VHH-hFc与人GPC3蛋白的亲和力均优于1E-7M，S001-NB150-28(cyno+)、S001-NB152-101和S001-NB152-72-2、VHH-12与人GPC3蛋白的亲和力接近1E-8M，其余VHH-hFc与人GPC3蛋白的亲和力均优于1E-8M，VH001的亲和力接近1E-9M。
表18-1 VHH-hFc与人GPC3蛋白的结合亲和力
| 抗体名称 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
| S001-NB150-20(cyno+) | 3.98E+05 | 2.41E-03 | 6.06E-09 |
| S001-NB150-28(cyno+) | 2.97E+05 | 5.74E-03 | 1.93E-08 |
| S001-NB150-56 | 1.04E+05 | 7.57E-04 | 7.25E-09 |
| S001-NB152-1 | 1.53E+05 | 1.14E-03 | 7.45E-09 |
| S001-NB152-101 | 1.51E+05 | 1.67E-03 | 1.11E-08 |
| S001-NB152-72-2 | 1.53E+05 | 1.78E-03 | 1.16E-08 |
| VH001 | 2.67E+05 | 4.43E-04 | 1.66E-09 |
| Tab003 | 2.62E+05 | 3.58E-04 | 1.36E-09 |
表18-2 VHH-hFc与人GPC3蛋白的结合亲和力
| 抗体名称 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
| VHH-12 | 1.44E+05 | 2.40E-03 | 1.67E-08 |
| Tab003 | 1.22E+05 | 4.26E-04 | 3.51E-09 |
| Tab005 | 2.08E+05 | 4.42E-05 | 2.13E-10 |
(B)、GPC3羊驼抗体与猴GPC3-his蛋白亲和力检测
按照实施例6(A)的方法对VHH-hFc与猴GPC3-His蛋白进行亲和力检测，其中抗体Tab003作为对照。如表19所示，VHH-hFc与猴GPC3蛋白的亲和力优于1E-8M。
表19 VHH-hFc与猴GPC3蛋白的结合亲和力
| 抗体名称 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
| S001-NB150-20(cyno+) | 2.43E+05 | 1.03E-03 | 4.23E-09 |
| S001-NB150-28(cyno+) | 3.06E+05 | 1.57E-03 | 5.12E-09 |
| S001-NB150-56 | 2.36E+05 | 1.09E-03 | 4.64E-09 |
| S001-NB152-1 | 1.75E+05 | 9.83E-04 | 5.63E-09 |
| S001-NB152-101 | 1.81E+05 | 4.80E-04 | 2.66E-09 |
| S001-NB152-72-2 | 2.34E+05 | 7.54E-04 | 3.23E-09 |
| VH001 | 3.52E+05 | 1.08E-03 | 3.06E-09 |
| Tab003 | 2.42E+05 | 3.09E-04 | 1.28E-09 |
(C)、GPC3羊驼抗体与鼠GPC3-his蛋白亲和力检测
按照实施例6(A)的方法对VHH-hFc与鼠GPC3-His蛋白进行亲和力检测，其中抗体Tab005作为对照。如表20所示，S001-NB150-20(cyno+)和S001-NB152-101与鼠GPC3蛋白不结合，其余5个VHH-hFc与鼠GPC3蛋白的亲和力均优于1E-7M，其中VH001与鼠GPC3蛋白结合的亲和力在1E-8M左右，S001-NB150-28(cyno+)、S001-NB150-56、S001-NB152-1和S001-NB152-72-2的亲和力则均在1E-8M以上。
表20 VHH-hFc与鼠GPC3蛋白的结合亲和力
实施例7抗体抗原结合表位(epitope)分析
(A)抗体抗原结合区域的鉴定
成熟的GPC3蛋白具有一个40kD左右可溶性的能够进入血液的的氨基端(N末端)肽和一个30kD左右的膜结合的羧基端(C末端)肽。Tab003抗体识别GPC3蛋白C末端靠近细胞膜的区域(近膜端)，Tab005抗体识别非近膜端区域。为了鉴定VHH-hFc的抗原结合表位是否位于近膜端，按照实施例4(A)ELISA方法，分别包被人源GPC3的多肽GC3pep(近膜端)和多肽YP7pep(近膜端)对VHH-hFc进行近膜端结合鉴定，如图13A、13B和表21所示，S001-NB152-72-2抗体可同时结合多肽GC3pep和多肽YP7pep，S001-NB150-28(cyno+)抗体可结合多肽YP7pep，这两种抗体都属于识别近膜端表位的抗体；其余抗体均不结合多肽GC3pep和多肽YP7pep，属于非近膜端抗体。
表21 ELISA方法对VHH-hFc进行近膜端和非近膜端表位分类
Claims (28)
- 一种特异性结合GPC3的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3包含选自SEQ ID NO:17～23或87任一项所示VHH结构域中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
- 根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统确定，例如选自表1；例如，所述HCDR1选自SEQ ID NO：24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、88、91或94，所述HCDR2选自SEQ ID：25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、89、92或95，和所述HCDR3选自SEQ ID：26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、90、93或96；优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：24～26、27～29或30～32的序列；优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：33～35、36～38或39～41的序列；优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：42～44、45～47或48～50的序列；优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：51～53、54～56或57～59的序列；优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：60～62、63～65或66～68的序列；优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：69～71、72～74或75～77的序列；优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：78～80、81～83或84～86的序列；优选地，根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自SEQ ID NO：88～90、91～93或94～96。
- 根据权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述CDR1、CDR2和/或CDR3包含在所述HCDR1、HCDR2和/或HCDR3上发生至多10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的氨基酸序列；所述突变选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
- 根据权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述CDR1、CDR2和/或CDR3包含与所述HCDR1、HCDR2和/或HCDR3相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
- 根据权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含单域抗体，所述单域抗体包含所述CDR1、CDR2和CDR3。
- 根据权利要求1～5任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述单域抗体包含SEQ ID NO：17～23或87任一项所示序列；可选地，所述单域抗体包含与SEQ ID NO：17～23或87任一项所示序列相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或所述单域抗体包含与SEQ ID NO：17～23或87任一项所示序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列，所述突变选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
- 根据权利要求1～6任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述单域抗体包含SEQ ID NO：17～23或87任一项所示VHH结构域中的FR区；可选地，所述单域抗体包含与SEQ ID NO：17～23或87任一项所示VHH结构域中的FR区相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或者所述单域抗体包含与SEQ ID NO：17～23或87任一项所示VHH结构域中的FR区相比发生至多15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列，所述突变选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
- 根据权利要求1～7任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段为：(1)嵌合抗体或其片段；(2)人源化抗体或其片段；或(3)全人抗体或其片段。
- 根据权利要求1～8任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含或不包含抗体重链恒定区；可选地，所述抗体重链恒定区可选自人、羊驼、小鼠、大鼠、兔或羊；可选地，所述抗体重链恒定区可选自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，所述IgG选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4；可选地，所述重链恒定区选自Fc区、CH3区或完整重链恒定区，优选地，所述重链恒定区为人Fc区，更优选具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；优选地，所述抗体或抗原结合片段为重链抗体。
- 根据权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。
- 根据权利要求1～10任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人、猴和/或鼠GPC3；优选地，其与人、猴和/或鼠GPC3结合的KD优于1.00E-7M、1.00E-8M、2.00E-8M、3.00E-8M、4.00E-8M、5.00E-8M、6.00E-8M、7.00E-8M、8.00E-8M、9.00E-8M、1.00E-9M、2.00E-9M、3.00E-9M、4.00E-9M、5.00E-9M、6.00E-9M、7.00E-9M、8.00E-9M、9.00E-9M或1.00E-10M。
- 一种多肽，其中，所述多肽包含权利要求1～11任一项所述抗体或抗原结合片段，优选地，所述多肽还连接有其他功能性分子，优选地，所述其他功能性分子选自以下一种或多种：信号肽、蛋白标签、其他抗原结合分子或细胞因子。
- 根据权利要求12所述的多肽，其中，所述其他抗原结合分子特异性结合GPC3以外的抗原或结合与权利要求1～11任一项所述抗体或抗原结合片段不同的GPC3表位；优选地，所述GPC3以外的抗原选自：CD3，优选CD3ε；CD16，优选CD16A；NKG2D；CD40；4-1BB；CD137或CD19；EGFR；EGFRvIII；mesothelin；HER2；EphA2；Her3；EpCAM； MUC1；MUC16；CEA；Claudin18.2；叶酸受体；Claudin6；WT1；NY-ESO-1；MAGE3；ASGPR1或CDH16；优选地，所述其他抗原结合分子为抗体或抗原结合片段；优选地，所述多肽为多特异性抗原结合分子，所述多特异性抗原结合分子为双特异性、三特异性或四特异性，更优选地，所述多特异性抗原结合分子为二价、四价或六价。
- 根据权利要求12所述的多肽，其中，所述细胞因子选自IL2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-21、IFN或TNF-alpha。
- 一种嵌合抗原受体(CAR)，其中，所述嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1～11任一项所述抗体或抗原结合片段。
- 一种免疫效应细胞，其中，所述免疫效应细胞表达权利要求15所述的嵌合抗原受体，或包含编码权利要求15所述嵌合抗原受体的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞；优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
- 一种分离的核酸片段，其中，所述核酸片段编码权利要求1～11任一项所述抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述多肽，或权利要求15所述嵌合抗原受体。
- 一种载体(vector)，其中，所述载体包含权利要求17所述的核酸片段。
- 一种宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含权利要求18所述的载体；优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)。
- 一种制备权利要求1～11任一项所述抗体或抗原结合片段或权利要求12～14任一项所述多肽的方法，其中，所述方法包括培养权利要求19所述细胞，以及分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或分离所述细胞表达的多肽。
- 一种制备权利要求16所述免疫效应细胞的方法，其中，所述方法包括将编码权利要求15所述的嵌合抗原受体的核酸片段导入免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达权利要求15所述的嵌合抗原受体。
- 一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12～14任一项所述的多肽、权利要求16所述免疫效应细胞、权利要求17所述的核酸片段、权利要求18所述载体或根据权利要求20-21任一项所述方法制备获得的产品；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；可选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
- 一种治疗GPC3阳性肿瘤或癌症的方法，其中，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12～14任一项所述的多肽、权利要求16所述免疫效应细胞、权利要求17所述的核酸片段、权利要求18所述载体、根据权利要求20-21任一项所述方法制备获得的产品或权利要求22所述的药物组合物；优选地，所述 GPC3阳性肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤或食道癌；更优选地，所述GPC3阳性肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、肺癌或乳腺癌。
- 权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12～14任一项所述的多肽、权利要求16所述免疫效应细胞、权利要求17所述的核酸片段、权利要求18所述载体、根据权利要求20-21任一项所述方法制备获得的产品或权利要求22所述的药物组合物在制备治疗GPC3阳性肿瘤或癌症药物中的用途；优选地，所述GPC3阳性肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤或食道癌；更优选地，所述GPC3阳性肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、肺癌或乳腺。
- 权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12～14任一项所述的多肽、权利要求16所述免疫效应细胞、权利要求17所述的核酸片段、权利要求18所述载体、根据权利要求20-21任一项所述方法制备获得的产品或权利要求22所述的药物组合物，其中，用于治疗GPC3阳性肿瘤或癌症；优选地，所述GPC3阳性肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤或食道癌；更优选地，所述GPC3阳性肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、肺癌或乳腺。
- 一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12～14任一项所述的多肽、权利要求16所述免疫效应细胞、权利要求17所述的核酸片段、权利要求18所述载体、权利要求19所述宿主细胞、根据权利要求20-21任一项所述方法制备获得的产品或权利要求22所述药物组合物。
- 一种检测生物学样品中GPC3表达的方法，其中，所述方法包括在权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段与GPC3之间能够形成复合物的条件下，使所述生物学样品与权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段接触；优选地，所述方法还包括检测所述复合物的形成，指示样品中GPC3的存在或表达水平。
- 权利要求1～11任一项所述抗体或抗原结合片段在制备GPC3检测试剂中的用途。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2020114372429 | 2020-12-10 | ||
| CN202011437242 | 2020-12-10 | ||
| CN202111353420 | 2021-11-16 | ||
| CN2021113534204 | 2021-11-16 | ||
| PCT/CN2021/136637 WO2022121969A1 (zh) | 2020-12-10 | 2021-12-09 | Gpc3抗体及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116670287A true CN116670287A (zh) | 2023-08-29 |
Family
ID=81973089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202180082576.5A Pending CN116670287A (zh) | 2020-12-10 | 2021-12-09 | Gpc3抗体及其应用 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240052055A1 (zh) |
| CN (1) | CN116670287A (zh) |
| WO (1) | WO2022121969A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023246574A1 (zh) * | 2022-06-24 | 2023-12-28 | 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 | 靶向gpc3的抗体及其用途 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002338020A1 (en) * | 2002-09-04 | 2004-03-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody against blood-solubilized n-terminal peptide in gpc3 |
| CN108659129B (zh) * | 2018-05-17 | 2021-08-03 | 新疆大学 | 一种抗gpc3蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用 |
| CN110872351B (zh) * | 2019-09-06 | 2022-06-17 | 广西科技大学 | 一种特异性结合gpc3蛋白的纳米抗体gn1及其制备方法和应用 |
| CN111320694B (zh) * | 2020-02-15 | 2022-07-22 | 广西科技大学 | 一种由重链抗体的可变区组成的纳米抗体gn2及其制备方法和应用 |
| CN111909274B (zh) * | 2020-07-21 | 2022-02-08 | 珠海中科先进技术研究院有限公司 | 一种具有突出高稳定性的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体及其制备方法 |
| CN111848802B (zh) * | 2020-07-21 | 2022-02-08 | 珠海中科先进技术研究院有限公司 | 一种具有突出热稳定性的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体及其制备方法 |
| CN111732659B (zh) * | 2020-07-21 | 2022-02-11 | 珠海中科先进技术研究院有限公司 | 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体及其制备方法与应用 |
| CN111848803B (zh) * | 2020-07-21 | 2022-04-08 | 珠海中科先进技术研究院有限公司 | 一种具有突出酸碱稳定性的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体及其制备方法 |
-
2021
- 2021-12-09 WO PCT/CN2021/136637 patent/WO2022121969A1/zh active Application Filing
- 2021-12-09 CN CN202180082576.5A patent/CN116670287A/zh active Pending
- 2021-12-09 US US18/266,393 patent/US20240052055A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022121969A1 (zh) | 2022-06-16 |
| US20240052055A1 (en) | 2024-02-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111051347A (zh) | Tigit抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
| CN111744013B (zh) | 抗tigit抗体联合pd-1抑制剂治疗疾病的方法和药物组合 | |
| JP2021502407A (ja) | ４−１ｂｂ抗体およびその製造方法と使用 | |
| CN110914304A (zh) | Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
| CN113508139A (zh) | 结合人lag-3的抗体、其制备方法和用途 | |
| WO2022127889A1 (zh) | Her2抗体及其应用 | |
| WO2022127844A1 (zh) | Cd5抗体及其应用 | |
| WO2022135536A1 (zh) | Cd3人源化抗体及其应用 | |
| WO2022105811A1 (zh) | Cd19人源化抗体及其应用 | |
| WO2021143914A1 (zh) | 一种激活型抗ox40抗体、生产方法及应用 | |
| CN116490210A (zh) | Cd70抗体及其应用 | |
| WO2022121969A1 (zh) | Gpc3抗体及其应用 | |
| WO2023098846A1 (zh) | 抗bcma纳米抗体及其应用 | |
| WO2021097800A1 (en) | Anti-pd-l1/anti-b7-h3 multispecific antibodies and uses thereof | |
| WO2023274183A1 (zh) | Cd16抗体及其应用 | |
| WO2022262859A1 (zh) | 抗人msln人源化抗体及其应用 | |
| WO2022121941A1 (zh) | 抗人msln的抗体及其用途 | |
| CN117940457A (zh) | 抗人cd3抗体及其应用 | |
| CN117616048A (zh) | Cd19抗体及其应用 | |
| CN117396515A (zh) | 抗msln抗体及其应用 | |
| WO2024017326A1 (zh) | 抗gprc5d纳米抗体及其应用 | |
| WO2022171113A1 (zh) | 人cd33抗体及其用途 | |
| CN117043192B (zh) | 针对IL-13Rα2的抗体及其应用 | |
| WO2023025194A1 (zh) | Fap/cd40结合分子及其医药用途 | |
| WO2023104138A1 (zh) | Bcma抗体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Country or region after: China Address after: No. 20 Yaogu Yiheng Road, Xiuying District, Haikou City, Hainan Province, 570311 Applicant after: Hainan Xiansheng Zaiming Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: No. 20 Yaogu Yiheng Road, Xiuying District, Haikou City, Hainan Province, 570311 Applicant before: Xiansheng Zaiming Pharmaceutical Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
| CB02 | Change of applicant information |