CN116490210A - Cd70抗体及其应用 - Google Patents

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CN116490210A
CN116490210A CN202180078245.4A CN202180078245A CN116490210A CN 116490210 A CN116490210 A CN 116490210A CN 202180078245 A CN202180078245 A CN 202180078245A CN 116490210 A CN116490210 A CN 116490210A
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antibody
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马晓丽
曹卓晓
葛虎
唐任宏
任晋生
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Shandong Simcere Bio Pharmaceutical Co ltd
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Shandong Simcere Bio Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明公开了CD70抗体及其应用，具体公开能够结合CD70的抗体或抗原结合片段、相应的多特异性抗原结合分子、嵌合抗原受体及其免疫效应细胞、核酸片段、载体、细胞、组合物、制备方法、制药用途以及癌或肿瘤、自身免疫性疾病或病毒感染的治疗方法，对肿瘤、自身免疫性疾病和病毒感染等的治疗具有重要意义。

Description

CD70抗体及其应用
本发明要求2020年11月23日向中国国家知识产权局提交的，专利申请号为202011318991.X，发明名称为“CD70抗体及其应用”的在先申请的优先权。上述在先申请的全文通过引用的方式结合于本发明中。
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体而言，涉及CD70抗体及其应用。
背景技术
CD70是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族。它由193个氨基酸组成，以同源三聚体的形式存在。CD70在正常组织和造血细胞不表达，在激活的免疫细胞中瞬时表达。然而，CD70在多种实体瘤和非霍奇金淋巴瘤中表达，其表达通常和较差的预后相关。其配体CD27和CD70结合后，胞内端会结合TRAFs，譬如TRAF2和TRAF5，从而激活NFκB和c-jun kinase通路，在细胞增殖和分化中扮演着重要的角色，可调控T细胞、B细胞的功能。这些使得CD70成为一个重要的肿瘤、自身免疫疾病和病毒感染的靶点。
本发明中的抗体与CD70蛋白结合，可阻断CD70与CD27的结合，阻断下游信号通路，在肿瘤、自身免疫性疾病和病毒感染的治疗中具有重要意义。
发明内容
本发明公开提供一种特异性结合CD70的抗体或抗原结合片段、相应的多特异性抗原结合分子、嵌合抗原受体、免疫效应细胞、核酸片段、载体、细胞、组合物、及其制备方法、制药用途和治疗方法。
在第一方面，本发明公开一种特异性结合CD70的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45或46任一项所示VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
和/或，(b)SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、28、31、33、36、37、40、42、44或47任一项所示VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
优选地，所述HCDR1～3和/或所述LCDR1～3根据Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统确定，更优选地，所述HCDR1-3和/或所述LCDR1-3选自表1。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含：
(1)SEQ ID NO：3、15、17或19所示VH的HCDR1～3，和SEQ ID NO：4、16或18所示VL的LCDR1～3；
或，(2)SEQ ID NO：5、20、22、23或26所示VH的HCDR1～3，和SEQ ID NO：6、21、24、25所示VL的LCDR1～3；
或，(3)SEQ ID NO：7、27、29或30所示VH的HCDR1～3，和SEQ ID NO：8、28、31所示VL的LCDR1～3；
或，(4)SEQ ID NO：9、32、34、35或38所示VH的HCDR1～3，和SEQ ID NO：10、33、36或37所示VL的LCDR1～3；
或，(5)SEQ ID NO：11、39或41所示VH的HCDR1～3，和SEQ ID NO：12、40或42所示VL的LCDR1～3；
或，(6)SEQ ID NO：13、43、45或46所示VH的HCDR1～3，和SEQ ID NO：14、44或47所示VL的LCDR1～3。
在一些具体的实施方式中，SEQ ID NO：3所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：66～68、SEQ ID NO：69～71或SEQ ID NO：72～74所示的序列；
SEQ ID NO：15所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：75～77、SEQ ID NO：78～80或SEQ ID NO：81～83所示的序列；
SEQ ID NO：17所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：84～86、SEQ ID NO：87～89或SEQ ID NO：90～92所示的序列；
SEQ ID NO：19所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：93～95、SEQ ID NO：96～98或SEQ ID NO：99～101所示的序列；
SEQ ID NO：5、20、22或23所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：112～114、SEQ ID NO:115～117或SEQ ID NO：118～120所示的序列；
SEQ ID NO：26所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：121～123、SEQ ID NO：124～126或SEQ ID NO：127～129所示的序列；
SEQ ID NO：7所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：140～142、SEQ ID NO：143～145或SEQ ID NO：146～148所示的序列；
SEQ ID NO：27所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：149～151、SEQ ID NO：152～154或SEQ ID NO：155～157所示的序列；
SEQ ID NO：29或30所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：158～160、SEQ ID NO：161～163或SEQ ID NO：164～166所示的序列；
SEQ ID NO:9、32、34或35所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：177～179、SEQ ID NO：180～182或SEQ ID NO：183～185所示的序列；
SEQ ID NO：38所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：186～188、SEQ ID NO：189～191或SEQ ID NO：192～194所示的序列；
SEQ ID NO：11所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：205～207、SEQ ID NO：208～210或SEQ ID NO：211～213所示的序列；
SEQ ID NO：39所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：214～216、SEQ ID NO：217～219或SEQ ID NO：220～223所示的序列；
SEQ ID NO：41所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有 如SEQ ID NO：224～226、SEQ ID NO：227～229或SEQ ID NO：230～233所示的序列；
SEQ ID NO:13、43、45或46所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：244～246、SEQ ID NO：247～249或SEQ ID NO：250～252所示的序列；
SEQ ID NO：4、16或18所示VL的LCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：102～104、SEQ ID NO：105～107或SEQ ID NO：108～111所示的序列；
SEQ ID NO:6、21、24或25所示VL的LCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：130～132、SEQ ID NO:133～135或SEQ ID NO:136～139所示的序列；
SEQ ID NO:8、28或31所示VL的LCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：167～169、SEQ ID NO：170～172或SEQ ID NO：173～176所示的序列；
SEQ ID NO:10、33、36或37所示VL的LCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：195～197、SEQ ID NO：198～200或SEQ ID NO：201～204所示的序列；
SEQ ID NO:12、40或42所示VL的LCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：234～236、SEQ ID NO：237～239或SEQ ID NO：240～243所示的序列；
SEQ ID NO:14、44或47所示VL的LCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：253～255、SEQ ID NO：256～258或SEQ ID NO：259～262所示的序列。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含在SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45或46任一项所示VH的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3上发生至多6个突变的序列；和/或，
所述抗体或抗原结合片段包含在SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、28、31、33、36、37、40、42、44或47任一项所示VL的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3上发生至多6个突变的序列；
优选地，所述突变选自取代、缺失或插入突变；更优选地，所述取代为保守氨基酸取代；
优选地，所述突变的数目可选自1、2、3、4、5或6；
优选地，根据Kabat编号系统编号，所述突变包括在SEQ ID NO：3、5、15、17、20、22或23的HCDR2上发生的G55突变，更优选地，所述G55突变为G55A突变；或者，根据Kabat编号系统编号，所述突变包括在SEQ ID NO：9、32、34或35的HCDR2上发生的D61突变，更优选地，所述D61突变为D61Q突变。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45 或46任一项所述VH中的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列；
和/或，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、38、31、33、36、37、40、42、44或47任一项所述VL中的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，所述重链可变区包含所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和/或，
(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45或46任一项所示的序列；和/或，(b)SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、28、31、33、36、37、40、42、44或47任一项所示的序列；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含：
(1)SEQ ID NO：3、15、17或19任一项所示的序列和SEQ ID NO：4、16或18任一项所示的序列；
(2)SEQ ID NO：5、20、22、23或26任一项所示的序列和SEQ ID NO：6、21、24或25任一项所示的序列；
(3)SEQ ID NO：7、27、29或30任一项所示的序列和SEQ ID NO：8、28或31任一项所述示的序列；
(4)SEQ ID NO：9、32、34、35或38任一项所示的序列和SEQ ID NO：10、33、36或37任一项所示的序列；
(5)SEQ ID NO：11、39或41任一项所示的序列和SEQ ID NO：12、40或42任一项所示的序列；
(6)SEQ ID NO：13、43、45或46任一项所示的序列和SEQ ID NO：14、44或47任一项所示的序列。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45或46任一项所示VH的框架区具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的同一性的框架区序列；和/或，
与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、28、31、33、36、37、40、42、44或47任一项所示VL的框架区具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的框架区序列。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：3、5、7、9、 11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45或46任一项所示VH的框架区相比，具有至多15个氨基酸突变的序列；和/或，包含与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、28、31、33、36、37、40、42、44或47任一项所示VL的框架区相比，具有至多15个氨基酸突变的序列；
优选地，所述突变选自取代、缺失或插入突变；更优选地，所述取代为保守氨基酸取代；
优选地，所述突变的数目可选自1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：15所示VH的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，T28N、F29I、T30E、V37L、M69I或R71A；更优选地，至少具有T28N、F29I、T30E、V37L、M69I和R71A突变；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：20所示VH的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，Q43K、R71V或T73K突变，更优选地，至少具有R71V和T73K突变或至少具有Q43K、R71V和T73K突变；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：27所示VH的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，G26D、I37V或R94K突变，更优选地，至少具有G26D和R94K突变或至少具有G26D、I37V和R94K突变；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：32所示VH的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，V2I、D72E或V75A突变，更优选地，至少具有V2I突变或至少具有D72E和V75A突变；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：39所示VH的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，F24V或G26D突变，更优选地，至少具有F24V和G26D突变；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：43所示VH的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，G42E、G44R或N73I突变，更优选地，至少具有G42E、G44R和N73I突变，或至少具有G44R和N73I突变；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：16所示VL的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，Y49S、G57E或I58F突变，更优选地，至少具有Y49S、G57E和I58F突变；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：21所示VL的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，Y36L、P44F、L46G、F71Y或V85D突变，更优选地，至少具有F71Y和V85D突变，或至少具有Y36L、P44F、L46G和F71Y突变；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：28所示VL的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，V3Q、Q38R或D60A突变，更优选地，至少具有V3Q、Q38R和D60A突变；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：33所示VL的框架区相比，至 少具有选自下组的一个或多个突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，A43G、Y49H、T69R或F71Y突变，更优选地，至少具有A43G和Y49H突变，或至少具有A43G、Y49H、T69R和F71Y突变；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：40所示VL的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，M4L或N22S突变，更优选地，至少具有M4L和N22S突变；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：44所示VL的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，M4L或N22S突变，更优选地，至少具有M4L和N22S突变。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含或不包含重链恒定区和/或轻链恒定区；
优选地，所述重链恒定区包含全长重链恒定区或重链恒定区片段，所述重链恒定区片段可选自CH1、Fc或CH3结构域；
优选地，所述重链恒定区和/或轻链恒定区为人重链恒定区和/或人轻链恒定区；
优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1重链恒定区、IgG2重链恒定区、IgG3重链恒定区或IgG4重链恒定区；
优选地，所述重链恒定区是人IgG1重链恒定区、人IgG2重链恒定区、人IgG3重链恒定区或人IgG4重链恒定区；
优选地，所述重链恒定区具有如SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区具有如SEQ ID NO：49所述的氨基酸序列；
优选地，所述抗体或抗原结合片段具有如SEQ ID NO：50、52、54、56、58或60任一项所述的重链，和/或，所述抗体或抗原结合片段具有如SEQ ID NO：51、53、55、57、59或61所示轻链；
更优选地，所述抗体或抗原片段具有如SEQ ID NO：50所示的重链和SEQ ID NO：51所示的轻链，或具有如SEQ ID NO：52所示的重链和SEQ ID NO：53所示的轻链，或具有如SEQ ID NO：54所示的重链和SEQ ID NO：55所示的轻链，或具有如SEQ ID NO：56所示的重链和SEQ ID NO：57所示的轻链，或具有如SEQ ID NO：58所示的重链和SEQ ID NO：59所示的轻链，或具有如SEQ ID NO：60所示的重链和SEQ ID NO：61所示的轻链；
优选地，所述抗体缺乏岩藻糖基化。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、工程化抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、完整抗体、完整抗体的片段、裸抗体、缀合抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’) 2、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人CD70和/或猴CD70；优选地，所述抗体与人CD70和/或猴CD70结合的KD小于1.00-8E M、1.00E-9M、1.00E-10M、2.00E-10M、3.00E-10M、4.00E-10M、5.00E-10M、6.00E-10M、7.00E-10M、 8.00E-10M、9.00E-10M、1.00E-11M、2.00E-11M、3.00E-11M、4.00E-11M、5.00E-11M、6.00E-11M、7.00E-11M、8.00E-11M、9.00E-11M或1.00E-12M。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段抑制和/或阻断CD70与其配体CD27的结合；优选地，所述CD70为人CD70和/或猴CD70。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段表现出选自以下的一种或多种效应子功能：抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖性细胞毒作用(CDC)和抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP)。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。
在另一方面，本发明公开一种特异性结合CD70的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为：
(1)由过表达SEQ ID NO:1所示的抗原的CHO细胞免疫小鼠直接获得，或
(2)由(1)获得的抗体进一步进行人源化改进获得。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含本发明第一方面公开的抗体或抗原结合片段的部分或所有技术特征。
在第二方面，本发明公开一种多特异性抗原结合分子，所述抗原结合分子包括第一抗原结合模块，所述第一抗原结合模块包含前述的抗体或抗原结合片段；以及第二抗原结合模块，所述第二抗原结合模块特异性结合CD70以外的其他抗原，或者结合与第一抗原结合模块不同的CD70抗原表位；
优选地，所述其他抗原选自CD3、CD3ε、CD16、CD16A、CD28、CD20、CD19、CD47或CD40L；
优选地，所述多特异性抗原结合分子为双特异性、三特异性或四特异性。
在第三方面，本发明公开一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含前述抗体或抗原结合片段。
在第四方面，本发明公开一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞表达前述CAR或包含编码前述CAR的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞、(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞；
优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞；
优选地，所述T细胞选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞。
在第五方面，本发明公开一种分离的核酸片段，所述核酸片段编码前述的抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子或嵌合抗原受体。
在第六方面，本发明公开一种载体(vector)，所述载体包含前述的核酸片段。
在第七方面，本发明公开一种宿主细胞，所述细胞包含前述载体；优选地，所述细胞 为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)；优选地，所述细胞缺乏岩藻糖基转移酶，例如FUT8。
在第八方面，本发明公开一种制备前述抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括培养前述细胞，以及分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或分离所述细胞表达的多特异性抗原结合分子。
在第九方面，本发明公开一种制备前述免疫效应细胞的方法，所述方法包括：将包含编码前述CAR的核酸片段导入所述免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达前述CAR。
在第十方面，本发明公开一种药物组合物，所述组合物包含前述的抗体或抗原结合片段、多特异抗原结合分子、嵌合抗原受体、免疫效应细胞、核酸片段、载体或细胞；优选地，所述组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；优选地，所述组合物包含能够给予受试者0.1～50mpk施用量的所述抗体或抗原结合片段，优选1～20mpk，更优选为10～20mpk。
在第十一方面，本发明公开前述的抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、嵌合抗体受体、免疫效应细胞、核酸片段、载体或细胞在制备治疗癌症或肿瘤、自身免疫性疾病或病毒感染的药物中的用途；优选地，所述癌症或肿瘤可选自肾细胞癌、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤；优选地，所述药物包含能够给予受试者0.1～50mpk施用量的所述抗体或抗原结合片段，优选1～20mpk，更优选为10～20mpk。
在第十二方面，本发明公开一种治疗癌症或肿瘤、自身免疫性疾病或病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述的抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、嵌合抗体受体、免疫效应细胞、核酸片段、载体或细胞；优选地，所述癌症或肿瘤可选自肾细胞癌、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤；优选地，所述抗体或抗原结合片段的有效量为0.1～50mpk，优选1～20mpk，更优选为10～20mpk。
在第十三方面，本发明公开前述抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、嵌合抗原受体、免疫效应细胞、核酸片段、核酸载体或宿主细胞，其用于治疗癌症或肿瘤、自身免疫性疾病或病毒感染；优选地，所述癌症或肿瘤可选自肾细胞癌、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤；优选地，所述抗体或抗原结合片段对受试者的有效量为0.1～50mpk，优选1～20mpk，更优选为10～20mpk。
术语定义和说明
除非本文另外定义，本文所有术语均具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
此外，除非本文另有说明，本文单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应 包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非另外明确指出，否则单数形式“一种”和“这种”包括复数指示物。
本文术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用，旨在表示方案的包含性，意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……组成”方案。示例性地，“一种组合物，包括A和B”，应当理解为以下技术方案： 由A和B组成的组合物，以及 除A和B外，还 含有其他组分的组合物，均落入前述“一种组合物”的范围内。
术语“和/或”在本文使用时，包括“和”、“或”和“由所属术语链接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
本文术语“CD70”，又名“TNFSF7”或“CD27L”，其为TNF配体家族成员，是CD27(又称TNFRSF27)的配体。本文“CD70”包括成熟或未成熟的全长野生型CD70蛋白或其突变体(例如点突变、插入突变或缺失突变)、剪切变体(splice variant)、直系同源物(Orthologs)以及前述CD70的片段。本文“CD70”可以来源于人、灵长类动物，如猴(例如恒河猴、食蟹猴)和啮齿类动物，例如小鼠和大鼠。示例性地，人CD70氨基酸序列可参见UniProt号：P32970，恒河猴CD70氨基酸序列可参见UniProt号：F7GPA5。
本文术语“特异性结合”是指抗原结合分子(例如抗体)通常以高亲和力特异性结合抗原和实质上相同的抗原，但不以高亲和力结合不相关抗原。亲和力通常以平衡解离常数(equilibrium dissociation constant，KD)来反映，其中较低KD表示较高亲和力。以抗体为例，高亲和力通常指具有约10 -7M或更低、约10 -8M或更低、约1×10 -9M或更低、约1×10 -10M或更低、1×10 -11M或更低或1×10 -12M或更低的KD。KD计算方式如下：KD＝Kd/Ka，其中Kd表示解离速率，Ka表示结合速率。可采用本领域周知的方法测量平衡解离常数KD，如表面等离子共振(例如Biacore)或平衡透析法测定，示例性地，可参见本文实施例5所示KD值获得方法。
本文术语“抗原结合分子”按最广义使用，是指特异性结合抗原的分子。示例性地，抗原结合分子包括但不限于抗体或抗体模拟物。“抗体模拟物”是指能够与抗原特异性结合，但与抗体结构无关的有机化合物或结合域，示例性地，抗体模拟物包括但不限于affibody、affitin、affilin、经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、核酸适体或Kunitz型结构域肽。
本文术语“抗体”按最广义使用，是指包含来自免疫球蛋白重链可变区的足够序列和/或来自免疫球蛋白轻链可变区的足够序列，从而能够特异性结合至抗原的多肽或多肽组合。本文“抗体”涵盖各种形式和各种结构，只要它们展现出期望的抗原结合活性。本文“抗体”包括具有移植的互补决定区(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白质支架或人工支架。此类支架包括抗体衍生的支架(其包含引入以例如稳定化抗体三维结构的突变)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。参见，例如Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque et al.,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此类支架还可以包括非抗体衍生的支架，例如本领域已知可用于移植CDR的支架蛋白，包括但不限于肌腱蛋白、纤连蛋白、肽适体等。
本文“抗体”包括一种典型的“四链抗体”，其属于由两条重链(HC)和两条轻链(LC) 组成的免疫球蛋白；重链是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域；轻链是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链；重链与重链之间、重链与轻链之间通过二硫键连接，形成“Y”字型结构。由于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将本文“免疫球蛋白”分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
本文“抗体”还包括不包含轻链的抗体，例如，由单峰驼(Camelus dromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanicoe)和羊驼(Vicugna pacos)等产生的重链抗体(heavy-chain antibodies,HCAbs)以及在鲨等软骨鱼纲中发现的免疫球蛋白新抗原受体(Ig new antigen receptor,IgNAR)。
本文“抗体”可以来源于任何动物，包括但不限于人和非人动物，所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物，例如骆驼科动物、大羊驼、原鸵、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。
本文“抗体”包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、完整抗体、完整抗体的片段、裸抗体、缀合抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
本文术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异体(例如含有天然存在的突变或在制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。本文修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体或抗原结合分子。举例来说，单克隆抗体可通过多种技术制得，包括(但不限于)杂交瘤技术、重组DNA方法、噬菌体库展示技术和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转殖基因动物的方法和其它本领域已知的方法。
本文术语“天然抗体”是指通过多细胞生物体的免疫系统制造和配对的抗体。本文术语“工程化抗体”的抗体是指通过基因工程、抗体工程等技术获得的非天然抗体，示例性地，“工程化抗体”包括人源化抗体、小分子抗体(例如scFv等)、双特异性抗体等等。
本文术语“单特异性”是指表示具有一个或多个结合位点，其中每个结合位点结合相同抗原的相同表位。
本文术语“多特异性抗体”是指具有至少两个抗原结合位点，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。
本文术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此,术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。
本文“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有基本上与天然抗体结构相似的结构。
本文“抗原结合片段”和“抗体片段”在本文中可互换使用，其不具备完整抗体的全部结构，仅包含完整抗体的局部或局部的变体，所述局部或局部的变体具备结合抗原的能力。本文“抗原结合片段”或“抗体片段”包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’) 2、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体。
完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个同一的抗原结合片段，称作“Fab”片段，每个含有重和轻链可变域，还有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。如此,本文术语“Fab片段”指包含轻链的VL域和恒定域(CL)的轻链片段,和重链的VH域和第一恒定域(CH1)的抗体片段。Fab’片段因在重链CH1域的羧基末端增加少数残基而与Fab片段不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab’) 2片段。
本文术语“Fd”是指由VH和CH1结构域组成的抗体。本文术语“Fv”是指由单臂VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
本文术语“scFv”(single-chain variable fragment)是指包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun， The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS) 4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键，形成二硫键连接的Fv(dsFv)。
本文术语“双抗体(diabody)”，其VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
本文术语“单域抗体”(single domain antibody,sdAb)、“VHH”和“纳米抗体(nanobody)”具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。单域抗体可以衍生自骆驼科重链抗体或软骨纲鱼类IgNAR。
本文术语“裸抗体”是指不与治疗剂或示踪剂缀合的抗体；术语“缀合抗体”是指与治疗剂或示踪剂缀合的抗体。
本文术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567to Cabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人抗体)。
本文术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。
本文术语“全人抗体”是指具有其中FR和CDR二者都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文全人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文“全人抗体”不包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
本文术语“可变区”是指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的区域，“重链可变区”与“VH”、“HCVR”可互换使用，“轻链可变区”与“VL”、“LCVR”可互换使用。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。本文术语“互补决定区”与“CDR”可互换使用，通常指重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的高变区(HVR)，该部位因在空间结构上可与抗原表位形成精密的互补，故又称为互补决定区，其中，重链可变区CDR可缩写为HCDR，轻链可变区CDR可缩写为LCDR。本术语“构架区”或“FR区”可互换，是指抗体重链可变区或轻链可变区中除CDR以外的那些氨基酸残基。通常典型的抗体可变区由4个FR区和3个CDR区按以下顺序组成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
对于CDR的进一步描述，参考Kabat等人,J.Biol.Chem.,252:6609-6616(1977)；Kabat 等人,美国卫生与公共服务部，“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)。本文“CDR”可由本领域公知的方式加以标注和定义，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统，使用的工具网站包括但不限于AbRSA网站(http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php)、abYsis网站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)和IMGT网站(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)。本文CDR包括不同定义方式的氨基酸残基的重叠(overlap)和子集。
本文术语“Kabat编号系统”通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
本文术语“Chothia编号系统”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
本文术语“IMGT编号系统”通常是指基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统(The international ImMunoGeneTics information system(IMGT))的编号系统，可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。
示例性地，注释和确定SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45、46和SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、28、31、33、36、37、40、42、44、47所示的VH或VL序列的CDR，具体结果如下表所示：
表1抗CD70抗体重链及轻链CDR区氨基酸序列表
本文术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”至少包含：CH1结构域，铰链区，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成；当抗体为IgE时，其还包括CH4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括CH1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自CH1、Fc或CH3结构域。
本文术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
本文术语“Fc”是指完整抗体经木瓜蛋白酶水解而成的抗体羧基端部分，典型地，其包含抗体的CH3和CH2结构域。Fc区包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链的Fc区通常被定义为从Cys226位置的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据 Kabat编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化过程中，或通过对编码抗体重链的核酸重组工程化而除去，因此，Fc区可包括或不包括Lys447。
如无其他说明，本文所述“抗体”或“抗原结合片段”氨基酸残基编号由Kabat编号系统确定，详见，Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。以下结合氨基酸残基突变加以说明，例如，重链可变区T28N突变是指根据前述Kabat编号系统确定的重链第28位氨基酸残基由T突变为N。
本文术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。示例性地，下述每组内的氨基酸属于彼此的保守氨基酸残基，组内氨基酸残基的替换属于保守氨基酸的替换：
示例性地，以下六组是被认为是互为保守性置换的氨基酸的实例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
本文术语“同一性”可通过以下方式计算获得：为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的“同一性”百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。
考虑到为最佳比对这两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数随所述序列共有的相同位置变化而变化。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。例如，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。又例如，使用GCG软件包中的GAP程序(在www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
额外地或备选地，可以进一步使用本发明所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。例如，可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程序(版本2.0)执行此类检索。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序，评分＝100、字长度＝12执行，以获得与本发明核酸(SEQ ID NO:1)分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序、评分＝50、字长度＝3执行，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述那样使用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
本文术语“抗原嵌合受体(CAR)”是指经改造以在免疫效应细胞上表达并且特异性结合抗原的人工细胞表面受体，其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域，例如抗体的可变重链或轻链，(2)锚定CAR进入免疫效应细胞的跨膜结构域，和(3)胞内信号传导结构域。CAR能够利用细胞外抗原结合结构域以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫效应细胞重定向至所选择的靶标，例如癌细胞。
本文术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基的序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5′至3′。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA)，特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子，其适合作为载体用于在体外和/或体内，例如在宿主或患者中，直接表达本发明的抗体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或被编码分子的表达，从而可以将mRNA注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。本文“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
本文术语“载体”是指能够扩增与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及整合入已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
本文术语“宿主细胞”是指细胞中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突 变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
本文术语“药物组合物”是指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
本文术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如癌症、自身免疫性疾病和病毒感染的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
本文术语“受试者”是指接受对如本发明所述的特定疾病或病症的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物(例如，猴)或非灵长类哺乳动物。
本文术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。
本文术语“自身免疫性疾病”是指对象对其自身的细胞、组织和/或器官产生免疫反应而引起的细胞、组织和/或器官损伤的病症。
本文术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。本文术语“肿瘤”或“瘤”是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
本文术语“EC50”是指半最大有效浓度，其包括在指定暴露时间之后诱导基线与最大值之间的半途响应的抗体浓度。EC50本质上代表其中观察到其最大作用的50％的抗体浓度，可通过本领域已知方法测量。
有益效果
与现有技术相比，本发明提供一种新颖的CD70抗体，所述抗体至少具有以下之一有益效果：
1.良好的CD70亲和力；
2.结合人和/或猴CD70蛋白，和/或结合或表达人和/或猴CD70蛋白细胞(包括低表达细胞)；
3.阻断CD70与CD27的结合或CD70-CD27信号通路；
4.介导表达CD70细胞(包括低表达细胞)的ADCC、CDC和/或ADCP杀伤作用；
5.就前述效果而言，本发明所述CD70抗体优于阳性对照抗体41D12或与其基本相当。
附图说明
图1为CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21与huCD70.ECD-TNC.his的ELISA Binding结果；
图2为CD70抗体Hab058.21a与huCD70.ECD-TNC.his的ELISA Binding结果；
图3为CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21与macaca CD70.ECD-TNC.his的ELISA Binding结果；
图4为CD70抗体Hab058.21a与macaca CD70.ECD-TNC.his的ELISA Binding结果；
图5为CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab058.21a、Hab077.12、Hab095.21与huCD70-CHO-K1细胞的ELISA Binding结果；
图6为CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21与786-O细胞的FACS Binding结果；
图7为CD70抗体Hab058.21a与786-O细胞的FACS Binding结果；
图8为CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21与A549细胞的FACS Binding结果；
图9为CD70抗体Hab058.21a与A549细胞的FACS Binding结果；
图10A为CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21与Raji细胞的FACS Binding结果；
图10B为CD70抗体Hab058.21a与Raji细胞的FACS Binding结果；
图11为CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21与细胞LCL 8664的FACS Binding结果；
图12为CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21对786-O阻断实验结果；
图13为CD70岩藻糖敲除抗体Hab003.22a fut8KO、Hab035.31a fut8KO、Hab055.13 fut8KO、Hab077.12fut8KO、Hab095.21fut8KO对A498细胞的ADCC杀伤作用；
图14为CD70岩藻糖敲除抗体Hab003.22a fut8KO、Hab035.31a fut8KO、Hab055.13 fut8KO、Hab077.12fut8KO、Hab095.21fut8KO对786-O细胞的ADCC杀伤作用
图15为CD70岩藻糖敲除抗体Hab003.22a fut8KO、Hab035.31a fut8KO、Hab055.13 fut8KO、Hab077.12fut8KO、Hab095.21fut8KO对Raji细胞的ADCC杀伤作用；
图16为CD70岩藻糖敲除抗体Hab003.22a fut8KO、Hab035.31a fut8KO、Hab055.13 fut8KO、Hab077.12fut8KO、Hab095.21fut8KO对A549细胞的ADCC杀伤作用；
图17为CD70岩藻糖敲除抗体Hab003.22a fut8KO、Hab035.31a fut8KO、Hab055.13 fut8KO、Hab077.12 fut8KO、Hab095.21 fut8KO对Raji细胞的CDC杀伤作用；
图18为CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21对Raji细胞的ADCP杀伤作用；
图19为CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21对IL-8分泌抑制作用；
图20为CD70抗体在Raji异种移植肿瘤模型中药效；
图21为MOLM-13模型小鼠生存曲线。
所有附图中，41D12为阳性对照，重链如SEQ ID NO:63所示，轻链如SEQ ID NO:65所示：
附图13-21中，isotype为hIgG1。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1CD70相关重组抗原的制备以及相关抗原或抗体的纯化方法
一、抗原的设计和表达
1、以人、恒河猴CD70构建带标签的CD70抗原
以人CD70蛋白(UniProt号：P32970)和恒河猴CD70(UniProt号：F7GPA5)作为本发明CD70的模板，设计带标签的融合蛋白，分别克隆到pTT5载体上，在HEK293细胞瞬转表达，获得编码本发明抗原及检测用蛋白。融合蛋白的具体信息如下所示，其中双下划线为His和TNC标签，斜体为相应的CD70蛋白。
huCD70.ECD-TNC.his(His,TNC标签与人CD70成熟蛋白胞外区的融合蛋白)，可用于免疫和筛选：
macaca CD70.ECD-TNC.his(His,TNC标签与恒河猴CD70成熟蛋白胞外区的融合蛋白)，可用于免疫和筛选：
二、CD70相关重组蛋白的纯化，以及抗人CD70杂交瘤抗体和重组抗体的纯化
1、Protein A亲和层析纯化杂交瘤上清/重组抗体
首先高速离心收取表达抗体的细胞培养上清(特别地，岩藻糖敲除抗体在fut8KO细胞表达)。ProteinA亲和柱利用6M盐酸胍洗3-5倍柱体积，然后利用纯水清洗3-5倍柱体积。利用如1×PBS(pH7.4)缓冲体系作为平衡缓冲液对层析柱平衡3-5倍柱体积。细胞上清利用低流速上样结合，控制流速使保留时间约1min或更长时间，结合完毕后利用1×PBS(pH7.4)洗涤层析柱3-5倍柱体积至紫外吸收回落至基线。利用0.1M醋酸/醋酸钠(pH3.0-3.5)缓冲液进行样品洗脱，根据紫外检测收集洗脱峰，洗脱产物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速调节pH至5-6暂存。对于洗脱产物可以利用本领域技术人员熟知的方法进行溶液置换，如利用超滤管进行超滤浓缩及溶液置换至所需的缓冲体系，或者利用分子排阻如G-25脱盐替换成所需的缓冲体系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻柱去除洗脱产物中的聚体成分以提高样品纯度。
2.镍柱纯化huCD70.ECD-TNC.his等CD70相关重组蛋白
根据上述步骤“一、抗原的设计和表达”构建和表达CD70相关重组抗原后，按以下方法进行纯化：
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液置换为PBS，加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上柱结合，介质可以选择不同公司的镍柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A280读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。
收集的洗脱产物浓缩后可用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，流动相为PBS，去除聚体及杂蛋白峰，收集目的产物洗脱峰。所得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定为正确后分装备用。
实施例2抗人CD70鼠源单克隆抗体的制备
一、免疫
抗人CD70单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6-8周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原为过表达CD70的CHO细胞(购自康源博创，KC-1267)。
免疫方案：用人CD70过表达的CHO细胞株进行小鼠免疫，1×10 7细胞/只/次，腹腔内注射。细胞收集后用PBS稀释为1×10 8/ml，第0天腹膜内(IP)注射100μl/只，之后每7天进行一次加强免疫。于第21、35、49、63天取血，用ELISA方法确定小鼠血清中的抗体滴度。在7-9免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行淋巴和脾细胞融合。在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射50μg/只的生理盐水配制的huCD70.ECD-TNC.his抗原溶液。
二、脾细胞融合
采用优化的电介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0( CRL-8287 TM)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞以0.5-1×10 5/ml的密度用完全培养基(含20％FBS、1×HAT、1×牛胰岛素、1×非必须氨基酸、1×双抗、1×IL-6的DMEM培养基)重悬，200μl/孔种于96孔板中，37℃，5％CO 2孵育7-11天至形成针尖般克隆。去除上清，加入200μl/孔的HT完全培养基(含10％FBS、1×HT和1×牛胰岛素、1×非必须氨基酸、1×双抗的DMEM培养基)，37℃，5％CO 2培养1天后进行ELISA或者FACS检测。
三、杂交瘤细胞筛选
根据杂交瘤细胞生长密度，用人CD70结合ELISA方法进行杂交瘤培养上清检测(见实施例5“一、CD70抗体结合人CD70蛋白的ELISA实验”)。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞上清进行human CD70 CHO-K1，786-O细胞结合实验(参见实施例5)和CD70-CD27结合抑制实验(见实施例6)。对human CD70 CHO-K1，786-O细胞结合实验和CD70-CD27结合抑制实验均为阳性的孔细胞及时进行扩增冻存保种及亚克隆直至获得单细胞克隆。
亚克隆细胞也均需进行人CD70结合ELISA、human CD70 CHO-K1，786-O细胞结合实验和CD70-CD27结合抑制实验。通过以上实验筛选得到杂交瘤克隆，用无血清细胞培养法进一步制备抗体，按实施例1所述纯化方法纯化抗体，以备后续使用。
四、杂交瘤阳性克隆序列测定
从阳性杂交瘤中克隆序列过程如下。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照试剂盒说明书步骤提取RNA，用PrimeScript TM Reverse Transcriptase试剂盒反转录(Takara,Cat No.2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326Rev.B 0503)进行PCR扩增后送测序公司测序。经测序得到鼠源抗人CD70抗体Mab003、Mab035、Mab055、Mab058、Mab077、Mab095，其重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)氨基酸序列如下所示。
Mab003 HCVR：
Mab003 LCVR：
Mab035 HCVR：
Mab035 LCVR：
Mab055 HCVR：
Mab055 LCVR：
Mab058 HCVR：
Mab058 LCVR：
Mab077 HCVR：
Mab077 LCVR：
Mab095 HCVR：
Mab095 LCVR：
采用生物信息学的方法分析分析上述CD70单克隆抗体的CDR区，其中，所述CDR区采用Kabat编号系统、Chothia编号系统和IMGT编号系统进行确定和注释(http://www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi；http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)，具体结果如表1所示。
实施例3人IgG1嵌合抗体制备
根据实施例2获得的杂交瘤抗体Mab003、Mab035、Mab055、Mab058、Mab077和Mab095及其可变区编码基因的测序结果，设计引物，以测序基因为模板，经过PCR搭建各抗体VH/VK基因片段。所得VH/VK基因片段再与表达载体pTT5(带信号肽及hIgG1/hkappa恒定 区基因(CH1-Fc/CL)片段)进行同源重组，构建重组嵌合抗体全长表达质粒VH-CH1-Fc-pTT5/VL-CL-pTT5，形成ChAb003、ChAb035、ChAb055、ChAb058、ChAb077、ChAb095六个嵌合抗体。其中重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列参见SEQ ID NO：48和49(实施例4)。
实施例4鼠源抗人CD70抗体的人源化
一、构建人源化的抗人CD70抗体可变区
通过比对IMGT(http://imgt.cines.fr)人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE(Molecular Operating Environment,分子操作环境)软件，分别挑选与鼠源抗体同源性高的重链和轻链可变区种系基因作为模板，将鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。根据需要，进行回复突变和/或热点突变。 本实施例抗体的氨基酸残基按Kabat编号系统编号，CDR区由Kabat 编号系统确定。
1、Mab003的人源化
1.1、Mab003构架选择
鼠源抗体Mab003的人源化轻链模板为IGKV3-11*01和IGKJ2*01，人源化重链模板为IGHV1-46*01和IGHJ6*01，将鼠源抗体Mab003的CDR分别移植到其人源模板中，即获得Mab003的人源化抗体Hab003，其可变区序列如下所示，其中斜体表示FR序列，下划线表示CDR序列。
Hab003 HCVR(也称VH-CDR graft)：
Hab003 LCVR(也称VL-CDR graft)：
1.2、Mab003的人源化抗体的回复突变设计
根据需要，将Mab003人源化抗体的FR区序列中关键氨基酸进行回复突变为鼠源抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，具体回复突变设计见表2。
表2 Mab003的人源化抗体回复突变设计
注：Grafted代表将鼠抗体CDR植入人种系FR区序列；Y49S表示将Grafted第49位Y突变回S，其它依此类推。
1.3、Mab003人源化抗体
对上述表2的Mab003的人源化抗体回复突变设计进行组合，最终获得多种Mab 003人源化抗体(详见表3)。
表3 Mab003人源化抗体可变区对应氨基酸序列
Hab003.VH1 Hab003.VH2
Hab003.VL1 Hab003.11 Hab003.12
Hab003.VL2 Hab003.21 Hab003.22
注：Hab003.12表示Mab003人源化抗体Hab003.12具有如Hab003.VL1所述轻链可变区和如Hab003.VH2所述重链可变区，其它依此类推。
Hab003.VH1、Hab003.VH2、Hab003.VL1和Hab003.VL2氨基酸序列如下所示，斜体表示FR序列，下划线表示CDR序列，加粗表示回复突变。
Hab003.VH1(同Hab003 HCVR)：
Hab003.VH2：
Hab003.VL1(同Hab003 LCVR)：
Hab003.VL2：
1.4、Mab003人源化抗体的热点突变
基于003重链CDR2区HCDR2存在高风险易修饰位点NG，用计算机模拟的方式基于抗体结构对NG进行氨基酸突变以消除分子修饰风险。在其中一个优选实施例中，对Hab003.VH2的HCDR2的NG进行氨基酸突变，获得Hab003.VH2a，其氨基酸序列如下所示，其中带字符边框表示热点突变位置：
表4 Mab003人源化抗体热点突变抗体对应的可变区
Hab003.VL2
Hab003.VH2a Hab003.22a
注：Hab003.22a表示Mab003人源化抗体Hab003.22a具有如Hab003.VL2所述轻链可变区和如Hab003.VH2a所述重链可变区。
2、Mab035的人源化
2.1、Mab035构架选择
鼠源抗体Mab035的人源化轻链模板为IGKV2-29*02和IGKJ4*01，人源化重链模板为IGHV1-3*01和IGHJ6*01，将鼠源抗体Mab035的CDR分别移植到其人源模板中，即获得Mab035的人源化抗体Hab035。Hab035可变区序列如下所示，斜体表示框架区，下划线表示CDR区。
Hab035 HCVR(也称VH-CDR graft)：
Hab035 LCVR(也称VL-CDR graft)：
2.2、Mab035的人源化抗体的回复突变设计
根据需要，将Mab035的人源化抗体的FR区序列中关键氨基酸进行回复突变为鼠源抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，具体回复突变设计见表5。
表5 Mab 035的人源化抗体回复突变设计
注：Grafted代表将鼠抗体CDR植入人种系FR区序列；F71Y表示将Grafted第71位F突变回Y，其它依此类推。
2.3、Mab035人源化抗体
对上述表5的Mab035人源化抗体回复突变设计进行组合，最终获得多种Mab 035人源化抗体，具体组合参见表6。
表6 Mab035人源化抗体可变区对应氨基酸序列
Hab035.VH1 Hab035.VH2
Hab035.VL1 Hab035.11 Hab035.12
Hab035.VL2 Hab035.21 Hab035.22
Hab035.VL3 Hab035.31 Hab035.32
注：Hab035.12表示Mab035人源化抗体Hab035.12具有如Hab035.VL1所述轻链可变区和如Hab035.VH2所述重链可变区，其它依此类推。
Hab035.VH1、Hab035.VH2、Hab035.VL1、Hab035.VL2和Hab035.VL3的具体序列如下所示，其中斜体表示框架区，下划线表示CDR，加粗表示回复突变。
Hab035.VH1：
Hab035.VH2：
Hab035.VL1(同Hab035 LCVR)：
Hab035.VL2：
Hab035.VL3：
2.4、Mab035人源化抗体的热点突变
基于Mab035人源化抗体重链CDR2区HCDR2存在高风险易修饰位点NG，用计算机模拟的方式基于抗体结构对NG进行氨基酸突变以消除分子修饰风险。在其中一个优选实施例中，对Hab035.VH1的HCDR2的NG进行氨基酸突变，Hab035.VH1突变后序列如下，其中带字符边框表示热点突变位置。
Hab035.VH1a氨基酸序列如下所示：
表7 Mab035人源化抗体热点突变抗体对应的可变区
Hab035.VL3
Hab035.VH1a Hab035.31a
注：Hab035.31a表示Mab035人源化抗体Hab035.31a具有如Hab035.VL3所述轻链可变区和如Hab035.VH1a所述重链可变区，其它依此类推。
3、Mab055的人源化
3.1Mab055构架选择
鼠源抗体Mab055的人源化轻链模板为IGKV4-1*01和IGKJ2*01，人源化重链模板为IGHV2-26*01和IGHJ1*01，将鼠源抗体Mab055的CDR分别移植到其人源模板中，即获得Mab055的人源化抗体Hab055，其可变区序列如下所示，其中，斜体表示FR序列，下划线表示CDR序列。
Hab055 HCVR(也称VH-CDR graft)：
Hab055 LCVR(也称VL-CDR graft)：
3.2、Mab055的人源化抗体的回复突变设计
根据需要，将Mab 055的人源化抗体的FR区序列中关键氨基酸进行回复突变为鼠源抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，具体回复突变设计见表8，
表8 Mab 055的人源化抗体回复突变设计
注：Grafted代表将鼠抗体CDR植入人种系FR区序列；V3Q表示将Grafted第3位V突变回Q，其它依此类推。
3.3、Mab055人源化抗体：
对上述表8的Mab055的人源化抗体回复突变设计进行组合，最终获得多种Mab055人源化抗体，各抗体的可变区氨基酸序列如下所示，斜体表示框架区，下划线表示CDR，加粗表示回复突变。
表9 Mab055人源化抗体可变区对应氨基酸序列
Hab055.VH1 Hab055.VH2 Hab055.VH3
Hab055.VL1 Hab055.11 Hab055.12 Hab055.13
Hab055.VL2 Hab055.21 Hab055.22 Hab055.23
注：Hab055.12表示Mab055人源化抗体Hab055.12具有如Hab055.VL1所述轻链可变区和如Hab055.VH2所述重链可变区，其它依此类推。
Hab055.VH1(同Hab055 HCVR)：
Hab055.VH2：
Hab055.VH3：
Hab055.VL1(同Hab055 LCVR)：
Hab055.VL2：
4、Mab058的人源化
4.1、Mab058构架选择
鼠源抗体Mab058的人源化轻链模板为IGKV1-33*01和IGKJ4*01，人源化重链模板为IGHV7-4-1*04和IGHJ6*01，将鼠源抗体Mab058的CDR分别移植到其人源模板中，即获得Mab058的人源化抗体Hab058，其可变区序列如下，斜体表示FR序列，下划线表示CDR序列。
Hab058 HCVR(也称VH-CDR graft)：
Hab058 LCVR(也称VL-CDR graft)：
4.2、Mab058的人源化抗体的回复突变设计：
根据需要，将Mab058的人源化抗体的FR区序列中关键氨基酸进行回复突变为鼠源抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，具体回复突变设计见表10。
表10 Mab058的人源化抗体回复突变设计
注：Grafted代表将鼠抗体CDR植入人种系FR区序列；A43G表示将Grafted第43位A突变回G，其它依此类推。
4.3、Mab058人源化抗体：
对上述表10的Mab058人源化抗体回复突变设计进行组合，最终获得多种Mab 058人源化抗体(详见表11)。
表11 Mab058人源化抗体可变区对应氨基酸序列
Hab058.VH1 Hab058.VH2
Hab058.VL1 Hab058.11 Hab058.12
Hab058.VL2 Hab058.21 Hab058.22
注：Hab058.12表示Mab058人源化抗体Hab058.12具有如Hab058.VL1所述轻链可变区和如Hab058.VH2所述重链可变区，其它依此类推。
Hab058.VH1、Hab058.VH2、Hab058.VL1和Hab058.VL2的具体序列如下所示，其中，斜体表示框架区，下划线表示CDR，加粗表示回复突变。
Hab058.VH1：
Hab058.VH2：
Hab058.VL1：
Hab058.VL2：
4.4、Mab058人源化抗体的热点突变
基于Mab058人源化抗体重链CDR2区HCDR2存在高风险易修饰位点DD，我们用计算机模拟的方式基于抗体结构对DD进行氨基酸突变以消除分子修饰风险。在其中一个优选实施例中，我们对Hab058.VH1的HCDR2的DD进行氨基酸突变，Hab058.VH1突变后序列如下，其中带字符边框表示热点突变。
Hab058.VH1a氨基酸序列如下所示：
表12 Mab058人源化抗体热点突变抗体对应的可变区
Hab058.VL2
Hab058.VH1a Hab058.21a
注：Hab058.21a表示Mab058人源化抗体Hab058.21a具有如Hab058.VL2所述轻链可变区和如Hab058.VH1a所述重链可变区，其它依此类推。
5、Mab077的人源化
5.1、Mab077构架选择
鼠源抗体Mab077的人源化轻链模板为IGKV4-1*01和IGKJ2*01，人源化重链模板为IGHV2-70*04和IGHJ6*01，将鼠源抗体Mab077的CDR分别移植到其人源模板中，即获得Mab077的人源化抗体Hab077，其可变区序列如下，斜体表示FR序列，下划线表示CDR序列。
Hab077 HCVR(也称VH-CDR graft)：
Hab077 LCVR(也称VL-CDR graft)：
5.2、Mab077的人源化抗体的回复突变设计：
根据需要，将Mab077的人源化抗体的FR区序列中关键氨基酸进行回复突变为鼠源抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，具体回复突变设计见表13，
表13 Mab 077的人源化抗体回复突变设计
注：Grafted代表将鼠抗体CDR植入人种系FR区序列；M4L表示将Grafted第4位M突变回L，其它依此类推。
5.3、Mab077人源化抗体：
对上述表13的Mab077的人源化抗体回复突变设计进行组合，最终获得多种Mab 077人源化抗体，详见表14。
表14 Mab077人源化抗体可变区对应氨基酸序列
Hab077.VH1 Hab077.VH2
Hab077.VL1 Hab077.11 Hab077.12
Hab077.VL2 Hab077.21 Hab077.22
注：Hab077.12表示Mab077人源化抗体Hab077.12具有如Hab077.VL1所述轻链可变区和如Hab077.VH2所述重链可变区，其它依此类推。
Hab077.VH1、Hab077.VH2、Hab077.VL1、Hab077.VL2的氨基酸序列如下所示，斜体表示FR序列，下划线表示CDR序列，加粗表示回复突变。
Hab077.VH1(也称VH-CDR graft)：
Hab077.VH2：
Hab077.VL1(也称VL-CDR graft)：
Hab077.VL2：
6、Mab095的人源化
6.1、Mab095构架选择
鼠源抗体Mab095的人源化轻链模板为IGKV4-1*01和IGKJ4*01，人源化重链模板为IGHV3-7*01和IGHJ1*01，将鼠源抗体Mab095的CDR分别移植到其人源模板中，即获得Mab095的人源化抗体Hab095，其可变区序列如下，斜体表示FR序列，下划线表示CDR序列。
Hab095 HCVR(也称VH-CDR graft)：
Hab095 LCVR(也称VL-CDR graft)：
6.2、Mab095的人源化抗体的回复突变设计：
根据需要，将Mab 095的人源化抗体的FR区序列中关键氨基酸进行回复突变为鼠源抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，具体回复突变设计见表15，
表15 Mab 095的人源化抗体回复突变设计
注：Grafted代表将鼠抗体CDR植入人种系FR区序列；G44R表示将Grafted第44位G突变回R，其它依此类推。
6.3、Mab095人源化抗体：
对上述表15的Mab095的人源化抗体回复突变设计进行组合，最终获得多种Mab095人源化抗体，各抗体的可变区氨基酸序列如下，斜体表示FR序列，下划线表示CDR序列，加粗表示回复突变。
表16 Mab095人源化抗体可变区对应氨基酸序列
Hab095.VH1 Hab095.VH2
Hab095.VL1 Hab095.11 Hab095.12
Hab095.VL2 Hab095.21 Hab095.22
注：Hab095.21表示Mab095人源化抗体Hab095.21具有如Hab095.VL2所述轻链可变区和如Hab095.VH1所述重链可变区，其它依此类推。
Hab095.VH1：
Hab095.VH2：
Hab095.VL1(同Hab095 LCVR)：
Hab095.VL2：
二、抗CD70人源化全长抗体的构建和表达
设计引物PCR搭建各人源化抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pTT5(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)进行同源重组，构建抗体全长表达载体VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr，其中，阳性对照41D12重链和轻链可变区序列获取自专利WO2012123586A1。
其中，重链恒定区氨基酸序列如下所示：
轻链恒定区氨基酸序列如下所示：
Hab003.22a抗体重链氨基酸序列如下所示：
Hab003.22a抗体轻链氨基酸序列如下所示：
Hab035.31a抗体重链氨基酸序列如下所示：
Hab035.31a抗体轻链氨基酸序列如下所示：
Hab055.13抗体重链氨基酸序列如下所示：
Hab055.13抗体轻链氨基酸序列如下所示：
Hab058.21a抗体重链氨基酸序列如下所示：
Hab058.21a抗体轻链氨基酸序列如下所示：
Hab077.12抗体重链氨基酸序列如下所示：
Hab077.12抗体轻链氨基酸序列如下所示：
Hab095.21抗体重链氨基酸序列如下所示：
Hab095.21抗体轻链氨基酸序列如下所示：
41D12抗体重链可变区的氨基酸序列如下所示：
41D12抗体重链的氨基酸序列如下所示：
41D12抗体轻链可变区的氨基酸序列如下所示：
41D12抗体轻链氨基酸序列如下所示：
实施例5 CD70抗体结合活性检测
一、CD70抗体结合人CD70蛋白的ELISA实验
抗人CD70抗体的结合力通过抗体与人CD70蛋白的ELISA实验来检测。将融合蛋白huCD70.ECD-TNC.his固定到96孔酶标板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和CD70的结合活性。具体实验方法如下：
用pH7.4的PBS(HyClone，Cat No.SH30256.01)缓冲液将huCD70.ECD-TNC.his稀释至2μg/ml，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat No.9018)中，于4℃冰箱放置过夜(16-18小时)。弃去液体，并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05％tweeen-20)洗板3次后，加入用PBS稀释的2％BSA(生工生物工程,Cat No.A500023-0100)封闭液250μl/ 孔，37℃孵育箱(上海一恒，Cat No.BPC250)孵育2小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05％tweeen-20)洗板3次后，加入50μl/孔用样品稀释液(2％BSA-PBS)稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于室温孵育2小时。孵育结束后用PBST洗板3次，加入50μl/孔用样品稀释液(2％BSA-PBS)稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Merck，Cat No.AP113P)，室温孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-10min，加入50μl/孔1M HCl终止反应，用酶标仪(PE,EnSight)在波长450nm处读取吸收值，用GraphPad Prism 8分析数据，计算CD70抗体对人CD70蛋白的结合EC50值。
实验结果见图1-2及表17-18。实验结果显示，本发明鼠源杂交瘤抗体Mab003、Mab035、Mab055、Mab058、Mab077和Mab095及其人源化抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21、Hab058.21a均与人CD70蛋白有很好的结合作用，其中，人源化抗体对人CD70蛋白的结合EC50值比阳性对照抗体41D12低或基本相当。
表17 CD70杂交瘤抗体结合人CD70蛋白ELISA实验结果
受试样品 与人CD70蛋白结合ELISA实验EC50(μg/mL)
Mab003 0.005881
Mab035 0.005406
Mab055 0.001829
Mab058 0.008249
Mab077 0.005599
Mab095 0.006924
表18 CD70人源化抗体结合人CD70蛋白ELISA实验结果
受试样品 与人CD70蛋白结合ELISA实验EC50(μg/mL)
Hab003.22a 0.00817
Hab035.31a 0.006282
Hab055.13 0.007655
Hab077.12 0.008199
Hab095.21 0.007586
41D12 0.01006
受试样品 与人CD70蛋白结合ELISA实验EC50(μg/mL)
Hab058.21a 0.001253
41D12 0.002273
二、CD70抗体结合恒河猴CD70蛋白的ELISA实验
抗人CD70抗体的猴交叉结合力通过抗体与恒河猴CD70蛋白的ELISA实验来检测。将macaca CD70.ECD-TNC.his融合蛋白直接包被到96孔酶标板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和恒河猴CD70的结合活性。具体实验方法如下：
用pH7.4的PBS(HyClone，Cat No.SH30256.01)缓冲液将macaca CD70.ECD-TNC.his稀释至2μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat No.9018)中，于4℃冰箱放置过夜(16-18小时)。弃去液体，并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05％tweeen-20)洗板3次后，加入用PBS稀释的2％BSA(生工生物工程,Cat No.A500023-0100) 封闭液250μl/孔，37℃孵育箱(上海一恒，Cat No.BPC250)孵育2小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05％tweeen-20)洗板3次后，加入50μl/孔用样品稀释液(2％BSA-PBS)稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于室温孵育2小时。孵育结束后用PBST洗板3次，加入50μl/孔用样品稀释液(2％BSA-PBS)稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Merck，Cat No.AP113P)，室温孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-10min，加入50μl/孔1M HCl终止反应，用酶标仪(PE,EnSight)在波长450nm处读取吸收值，用GraphPad Prism 8分析数据，计算CD70抗体对猴CD70蛋白的结合EC50值。
实验结果见图3-4及表19-20。实验结果表明，本发明的CD70鼠源杂交瘤抗体Mab003、Mab035、Mab055、Mab058、Mab077和Mab095及其人源化抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21、Hab058.21a均与猴CD70蛋白有很好的结合作用。其中人源化抗体表现出与阳性对照41D12基本相当或更优的结合能力。
表19 CD70杂交瘤抗体结合恒河猴CD70蛋白ELISA实验结果
受试样品 与猴CD70蛋白结合ELISA实验EC50(μg/mL)
Mab003 0.07668
Mab035 0.007167
Mab055 0.001676
Mab058 0.006928
Mab077 0.009616
Mab095 0.005008
表20 CD70抗体结合恒河猴CD70蛋白ELISA实验结果
受试样品 与猴CD70蛋白结合ELISA实验EC50(μg/mL)
Hab003.22a 0.008198
Hab035.31a 0.00329
Hab055.13 0.00154
Hab077.12 0.002659
Hab095.21 0.004118
41D12 0.003394
受试样品 与猴CD70蛋白结合ELISA实验EC50(μg/mL)
Hab058.21a 0.004318
41D12 0.002304
三、CD70抗体与human CD70 CHO-K1细胞的结合实验
抗人CD70抗体的结合力通过抗体与高表达人CD70的human CD70 CHO-K1细胞系的ELISA实验来检测。将human CD70 CHO-K1细胞直接包被到96孔培养板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和human CD70 CHO-K1细胞的结合活性。具体实验方法如下：
用Ham's F-12K(Kaighn's)Medium完全培养基(Gibco，Cat No.21127030)将huCD70-CHO-K1细胞调整至5×10 5cells/ml密度，以100μl/孔的体积加入96孔细胞培养板 (Corning，Cat No.3599)中，于37℃细胞培养箱(ESCO)放置过夜(16-18小时)。弃去培养基，加入50μl/孔免疫染色固定液(Beyotime，Cat No.P0098)室温固定40min。弃去固定液，并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05％tweeen-20)洗板3次后，用PBS稀释的5％milk(生工生物工程,Cat No.A600669-0250)封闭液250μl/孔，37℃孵育箱孵育2小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05％tweeen-20)洗板3次后，加入50μl/孔用样品稀释液(2％BSA-PBS)稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于室温孵育2小时。孵育结束后用PBST洗板3次，加入50μl/孔用样品稀释液(2％BSA-PBS)稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Merck，Cat No.AP113P)，室温孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-10min，加入50μl/孔1M HCl终止反应，用酶标仪(PE,EnSight)在波长450nm处读取吸收值，用GraphPad Prism 8分析数据，计算CD70抗体对人CD70的结合EC50值。
实验结果见图5及表21。实验结果表明，本发明的CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab058.21a、Hab077.12、Hab095.21均与human CD70 CHO-K1细胞有很好的结合作用，优于阳性对照41D12或与阳性对照基本相当。
表21 CD70抗体与human CD70 CHO-K1细胞结合实验结果
受试样品 与human CD70 CHO-K1细胞结合ELISA实验EC50(μg/mL)
Hab003.22a 0.005252
Hab035.31a 0.006943
Hab055.13 0.007829
Hab058.21a 0.01603
Hab077.12 0.01247
Hab095.21 0.008235
41D12 0.008267
四、CD70抗体与786-O细胞的结合实验
抗人CD70抗体的结合力通过抗体与中表达CD70的肿瘤细胞系786-O(ATCC，CRL-1932)的FACS实验来检测。将786-O细胞收集到96孔细胞板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和人786-O的结合活性。具体实验方法如下：
收集786-O细胞，将细胞密度调整至5×10 5cells/ml，以100μl/孔的体积加入96孔培养板(Corning，Cat No.3799)中，4℃，1500rpm，5min离心。弃去上清，加入250μl/孔PBS(HyClone，Cat No.SH30256.01)，4℃，1500rpm，5min离心。弃去上清后，加入100μl/孔用样品稀释液(2％BSA-PBS)稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于4℃冰箱孵育1小时，孵育结束后，4℃，1500rpm，5min离心。弃去上清，加入250μl/孔PBS(HyClone，Cat No.SH30256.01)，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)。弃去上清后，加入100μl/孔用样品稀释液(2％BSA-PBS)稀释的Alexa Fluor-647标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-605-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-605-088)，放于4℃冰箱孵育1小时。孵育结束后，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)洗涤3次。最后弃去上清，加入80μl/孔PBS重悬细胞，流式细胞仪(BD,Canto II)检测荧光信号强弱，并用FlowJo和GraphPad Prism 8分析数据，计算CD70抗体对人786-O细胞的结合EC50值。
实验结果见图6-7及表22。实验结果表明，本发明的CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21、Hab058.21a均与肿瘤细胞系786-O有很好的结合作用，Emax值均比阳性对照抗体41D12高。
表22 CD70抗体与786-O细胞结合实验结果
五、CD70抗体与A549细胞的结合实验
抗人CD70抗体的结合力通过抗体与低表达人CD70的肿瘤细胞系A549(ATCC，CCL-185)的FACS实验来检测。将A549细胞收集到96孔细胞板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和人A549的结合活性。具体实验方法如下：
收集A549细胞，将细胞密度调整至5×10 5cells/ml，以100μl/孔的体积加入96孔培养板(Corning，Cat No.3799)中，4℃，1500rpm，5min离心。弃去上清，加入250μl/孔PBS(HyClone，Cat No.SH30256.01)，4℃，1500rpm，5min离心。弃去上清后，加入100μl/孔用样品稀释液(2％BSA-PBS)稀释的不同浓度待测抗体(人源化抗体)，放于4℃冰箱孵育1小时，孵育结束后，4℃，1500rpm，5min离心。弃去上清，加入250μl/孔PBS(HyClone，Cat No.SH30256.01)，4℃，1500rpm，5min离心。弃去上清后，加入100μl/孔用样品稀释液(2％BSA-PBS)稀释的Alexa Fluor-647标记的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-605-088)，放于4℃冰箱孵育1小时。孵育结束后，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)洗涤3次。最后弃去上清，加入80μl/孔PBS重悬细胞，流式细胞仪(BD,Canto II)检测荧光信号强弱，并用FlowJo和GraphPad Prism 8分析数据，计算CD70抗体对人A549细胞的结合EC50值。
实验结果见图8-9及表23所示。实验结果表明，本发明的CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21、Hab058.21a与肿瘤细胞系A549结合的Emax均优于对照抗体41D12。
表23 CD70抗体与A549细胞结合实验结果
六、CD70抗体与Raji细胞的结合实验
抗人CD70抗体的结合力通过抗体与中表达CD70的人Raji细胞(ATCC，CCL-86)FACS实验来检测。Raji细胞收集到96孔细胞板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和人Raji的结合活性。具体实验方法如下：
收集Raji细胞，将细胞密度调整至5×10 5cells/ml，以100μl/孔的体积加入96孔培养板(Corning，Cat No.3799)中，4℃，1500rpm，5min离心。弃去上清，加入50μl/孔4％FBS-PBS buffer，放于4℃冰箱孵育1小时，孵育结束后，4℃，1500rpm，5min离心。弃去上清后，加入100μl/孔用样品稀释液(2％FBS-PBS)稀释的不同浓度待测抗体，放于4℃冰箱孵育1小时，孵育结束后，4℃，1500rpm，5min离心。弃去上清，加入250μl/孔PBS(HyClone，Cat No.SH30256.01)，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)。弃去上清后，加入100μl/孔用样品稀释液(2％FBS-PBS)稀释的Alexa Fluor-647标记的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-605-088)，放于4℃冰箱孵育1小时。孵育结束后，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)洗涤3次。最后弃去上清，加入80μl/孔PBS重悬细胞，流式细胞仪(BD,Canto II)检测荧光信号强弱，并用FlowJo和GraphPad Prism 8分析数据，计算CD70抗体对人Raji细胞的结合EC50值。具体结果详见图10A-图10B和表24。根据图10所示结果可知，本发明所述人源化抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21、Hab058.21a与人Raji细胞的结合优于阳性对照41D12，或与41D12基本相当。
表24 CD70抗体与Raji细胞结合实验结果受试样品
七、CD70抗体结合LCL8664的FACS实验
抗CD70抗体与猴CD70的结合力通过抗体与表达猴CD70的肿瘤细胞系猴LCL 8664(ATCC，CRL-1805)FACS实验来检测。将LCL 8664细胞收集到96孔细胞板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和猴CD70的结合活性。具体实验方法如下：
收集LCL 8664细胞，将细胞密度调整至5×10 5cells/ml，以200μl/孔的体积加入96孔培养板(Corning，Cat No.3799)中，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)。弃去上清，加入250μl/孔PBS(HyClone，Cat No.SH30256.01)，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)。弃去上清后，加入100μl/孔用样品稀释液(2％FBS-PBS)稀释的不同浓度待测抗体(人源化抗体)，放于4℃冰箱孵育1小时，孵育结束后，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)。弃去上清，加入250μl/孔PBS(HyClone，Cat No.SH30256.01)，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)。弃去上清后，加入100μl/孔用样品稀释液(2％FBS-PBS)稀释的Alexa Fluor-647标记的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-605-088)，放于4℃冰箱孵育1小时。孵育结束后，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)洗涤3次。最后弃去上清，加入80μl/孔PBS重悬细胞，流式细胞仪(BD,Canto II)检测荧光信号强弱，并用FlowJo和GraphPad Prism 8分析数据，计算CD70抗体对猴CD70的结合EC50值。具体结果详见图11和表25。实验结果表明，本发明的CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21与肿瘤细胞系LCL 8664均有很好的结合，其EC50值优于阳性对照41D12，或其基本相当。
表25 CD70抗体与LCL 8664细胞结合实验结果
受试样品 与LCL 8664结合FACS实验EC50(μg/mL)
Hab003.22a 0.244
Hab035.31a 0.06305
Hab055.13 0.06045
Hab077.12 0.067
Hab095.21 0.1356
41D12 0.1569
八、CD70抗体的Biacore测定
该实验用Biacore 8K(GE)仪器，采用多循环动力学测定待测CD70抗体与人CD70(huCD70.ECD-TNC his)、猴CD70(macaca CD70.ECD-TNC his)的亲和力。
实验运行缓冲液为1×HBS-EP+缓冲溶液(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)(Cat.#BR-1006-69，GE)，流经池温度设置为25℃，样品仓温度设置为16℃。两者都用运行缓冲液预处理。用Protein A生物传感芯片(Cat.#29127556,GE)亲和捕获一定量的待测抗体，然后于芯片表面流经一定浓度的人、猴CD70抗原，利用Biacore 8K仪器(GE)实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，pH1.5的甘氨酸-盐酸再生溶液(Cat.#BR-1003-54,GE)将抗原-抗体复合物洗净再生。通过注射溶液中不同浓度的人CD70和猴CD70抗原240s来检测其结合过程，流速为30μL/min，从50nM起始(测试的实际浓度见详细结果)，以1:1稀释，设置一系列浓度梯度；解离时间长达900s，最后用10mM甘氨酸-盐酸溶液(pH 1.5)以30μL/min的流速洗涤30s完成芯片表面的再生。
实验得到的数据用GE Biacore 8K Evaluation version 2.0软件以(1:1)Langmuir模型进行拟合，得出结合速率(Ka)、解离速率(Kd)和亲和力数值(KD)，具体见表26-27所示。实验结果表明，本发明的CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab058.21a、Hab077.12、Hab095.21均能与人CD70和猴CD70以高亲和力结合，优于阳性对照41D12或与其基本相当。
表26 CD70抗体与huCD70蛋白的反应亲和力
抗体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
Hab003.22a 4.66E+05 7.62E-05 1.64E-10
Hab035.11 6.21E+05 1.05E-04 1.70E-10
Hab035.12 5.63E+05 9.61E-05 1.71E-10
Hab035.21 6.56E+05 9.44E-05 1.44E-10
Hab035.22 6.26E+05 7.60E-05 1.21E-10
Hab035.31 6.89E+05 8.86E-05 1.29E-10
Hab035.32 6.11E+05 9.48E-05 1.55E-10
Hab035.31a 6.06E+05 9.81E-05 1.62E-10
Hab055.13 1.57E+06 1.21E-04 7.69E-11
Hab058.21a 6.52E+05 8.87E-05 1.36E-10
Hab077.11 1.09E+06 1.12E-04 1.03E-10
Hab077.12 1.32E+06 1.08E-04 8.15E-11
Hab077.21 1.06E+06 1.12E-04 1.06E-10
Hab077.22 9.41E+05 9.49E-05 1.01E-10
Hab095.11 3.44E+05 7.19E-05 2.09E-10
Hab095.12 4.17E+05 7.02E-05 1.68E-10
Hab095.21 4.61E+05 8.83E-05 1.91E-10
Hab095.22 4.66E+05 7.22E-05 1.55E-10
41D12 4.36E+05 7.69E-05 1.76E-10
表27 CD70抗体与猴CD70蛋白的反应亲和力
实施例6 CD70抗体的阻断实验
抗人CD70抗体的阻断率通过抗体与CD27竞争结合786-O的FACS实验来检测。将786-O细胞收集到96孔细胞板中，抗体与CD27混匀加入到细胞板中，检测信号的强弱被用于判断抗体阻断CD70与CD27相互作用的能力。该方法用于竞争的CD27为huCD27.ECD.hFc或huCD27.ECD.mFc(简称huCD27.ECD.hFc/mFc)；其中huCD27.ECD.hFc购自Acro,货号为CD7-5254，在检测人源化抗体时使用；huCD27.ECD.mFc购自Acro，货号为CD7-5257，在检测杂交瘤纯化抗体时使用。具体实验方法如下：
收集786-O细胞，将细胞密度调整至5×10 5cells/ml，以100μl/孔的体积加入96孔培养板(Corning，Cat No.3799)中，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)。弃去上清，加入250μl/孔PBS(HyClone，Cat No.SH30256.01)，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)。弃去上清后，加入100μl/孔用样品稀释液(2％BSA-PBS)稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)和20μg/ml huCD27.ECD.hFc/mFc的混合液，放于4℃冰箱孵育1小时，孵育结束后，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)。弃去上清，加入250μl/孔PBS(HyClone，Cat No.SH30256.01)，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)。弃去上清后，加入100μl/孔用样品稀释液(2％BSA-PBS)稀释的APC标记的鼠抗人二抗(Biolegend，Cat No.409306)或羊抗鼠二抗(Invitrogen，Cat No.31630)，放于4℃冰箱孵育1小时。孵育结束后，4℃，1500rpm，5min离心(Thermo)洗涤3次。最后弃去上清，加入80μl/孔PBS重悬细胞，流式细胞仪(BD,Canto II)检测荧光信号强弱，并用FlowJo和GraphPad Prism 8分析数据，计算CD70抗体对CD70与CD27相互作用的阻断IC50值。具体结果详见图12和表28。实验结果显示，本公开的CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21均能显著抑制肿瘤细胞系786-O上表达的CD70和CD27蛋白结合的活性，IC50值和阳性对照抗体41D12相当或者更优(见表28)，说明本发明抗体具有良好的抑制CD70和CD27结合的能力，与阳性对照41D12相比，作用更优或基本相当。
表28 CD70抗体对786-O细胞阻断实验结果
受试样品 786-O细胞酶活抑制实验IC50(μg/ml)
Hab003.22a 0.159
Hab035.31a 0.09358
Hab055.13 0.05731
Hab077.12 0.06909
Hab095.21 0.1156
41D12 0.09268
实施例7 CD70抗体ADCC
提前一天复苏冻存的人PBMC，用含10％FBS，50ng/mL IL-2(R&D，Cat#202-IL-050) 的1640完全培养基重悬，放入37℃、5％CO 2培养箱中培养过夜。次日，将肿瘤靶细胞(786-O/Raji/A549/A498)和PBMC分别用含5％热灭活胎牛血清的无酚红1640培养基重悬后，按每孔10,000个肿瘤靶细胞和200,000个PBMC比例(50μL每孔)加入平底96孔板中，然后每孔分别加入50μL的CD70抗体或其对照分子，抗体按照4倍浓度梯度稀释(初始浓度为0.5μg/mL)，置于37℃、5％CO 2培养箱中孵育4小时。4小时后，用LDH检测试剂盒(DO JINDO，Cat#CK12)检测上清培养基中每孔细胞释放的LDH值，计算靶细胞杀伤百分率。
实验结果见图13-16，结果表明，PBMC里的NK细胞可被抗体募集，对CD70阳性的肿瘤细胞A498、786-O、Raji、A549产生杀伤作用。CD70岩藻糖敲除抗体Hab003.22a fut8KO、Hab035.31a fut8KO、Hab055.13fut8KO、Hab077.12fut8KO、Hab095.21fut8KO均能产生较强的ADCC作用，强于阳性对照41D12fut8KO或与其相当。
实施例8 CD70抗体CDC
将表达CD70的肿瘤细胞Raji离心后用含10％人血清的培养基重悬，按每孔20000个细胞(50μl每孔)加入圆底96孔板中，然后每孔分别加入50μl的CD70抗体或其对照分子，抗体按照4倍浓度梯度稀释(初始浓度为10μg/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2h。2h后，在96孔板中每孔加入50μl PBS稀释的PI染液(含0.5μl 1mg/ml PI，Invitrogen,Cat#P3566)，孵育30分钟，流式细胞仪检测PI阳性细胞比例，即CDC杀伤比例。
试验结果见图17，结果表明，抗体在人血清存在时，能引起CDC效应，从而对Raji细胞产生杀伤作用。本发明CD70岩藻糖敲除抗体Hab003.22a fut8KO、Hab035.31a fut8KO、Hab055.13fut8KO、Hab077.12fut8KO、Hab095.21fut8KO均能诱导强CDC效应。
实施例9 CD70抗体ADCP
CD14 +单核细胞是通过使用CD14Microbeads(CD14微球，Miltenyi Biotec,Cat#130-050-201)从人全血制备出的PBMC中分离纯化获得。将分离纯化得到的CD14 +单核细胞中加入25ng/ml重组人M-CSF(R&D，Cat#216-MC-025)进行巨噬细胞分化。分化第七天，将巨噬细胞消化下来后用CellTrace TM CFSE Cell Proliferation Kit(invitrogen，Cat#C34554)进行染色，同时用CellTrace TM Violet Cell Proliferation Kit(invitrogen,Cat#C34557)对表达CD70的肿瘤靶细胞Raji进行染色。按每孔80000个肿瘤靶细胞和20000个巨噬细胞比例(50μl每孔)加入低吸附平底96孔板中(Corning,Cat#3474)，然后每孔分别加入50μl的CD70抗体或其对照分子，抗体按照5倍浓度梯度稀释(初始浓度为10μg/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时。4小时后，在96孔板中每孔加入50μl多聚甲醛固定液，用流式细胞仪检测CFSE阳性巨噬细胞中Cell Trace Violet阳性肿瘤细胞比例。
实验结果见图18，结果表明，CD70抗体能够招募巨噬细胞，对CD70阳性的Raji细胞产生吞噬作用。本发明的CD70抗体Hab003.22a、Hab035.31a、Hab055.13、Hab077.12、Hab095.21均能对Raji产生ADCP的杀伤作用。
实施例10 CD70抗体对IL-8分泌的抑制
将中表达CD70的肿瘤细胞U266(ATCC，TIB-196)离心后用含10％胎牛血清的培养基重悬，将每孔50000个细胞(50μl每孔)加入圆底96孔板中，然后每孔分别加入50μl的CD70抗体或其对照分子，抗体按照4倍浓度梯度稀释(初始浓度为1μg/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育1小时。1小时后在圆底96孔板中每孔继续加入5000个表达CD27的稳转细胞系细胞HT1080(康源博创，KC-0144)，置于37℃、5％CO 2培养箱中继续孵育24小时。24小时后，离心收集96孔板中培养基上清，ELISA检测上清种IL-8表达量(BD，Cat#555244)。
U266和HT1080-CD27细胞共孵育后，CD70-CD27信号通路被激活，从而产生IL-8。如图19所示，结果表明，具有阻断功能的本发明CD70抗体可以阻断CD70-CD27信号通路，抑制IL-8的产生。本发明的CD70岩藻糖敲除抗体Hab003.22a fut8KO、Hab035.31a fut8KO、Hab055.13fut8KO、Hab077.12fut8KO、Hab095.21fut8KO均能显著抑制IL-8的抑制。
实施例11 CD70抗体在Raji异种移植肿瘤模型中的药效
人淋巴瘤Raji-luciferase-eGFP细胞(购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，1×10^6个)200μl尾静脉接种于5-6周龄的雌性NOD-SCID(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)小鼠。接种后第5天，根据体重将小鼠随机分为同型对照抗体组、对照组41D12fut8KO 0.1mg/kg、待测抗体组Hab035.31a fut8KO 0.1mg/kg共3组(分组及剂量见表29)，每组6只。所有抗体均为腹腔注射，一周两次，共给药2次。接种后第7天开始，每周两次监测小鼠体重并进行小动物活体成像，记录数据。活体成像操作：动物腹腔注射150mg/kg剂量的荧光素底物，异氟烷麻醉后，于底物注射后5分钟进行活体成像，luciferase曝光时间为30s。各组发光信号值平均值±标准差(Mean±SEM)表示并用GraphPad prism作图，使用two way ANOVA统计分析。
表29分组及剂量
实验结果见图20，结果表明，CD70抗体能够招募小鼠体内的免疫细胞，对CD70阳性的Raji细胞产生杀伤作用。与阴性对照组相比，本发明的CD70岩藻糖敲除抗体Hab035.31a fut8KO可有效抑制Raji肿瘤生长，与阴性对照组间具有显著性差异。
实施例12 CD70抗体在 OLM-13异种移植肿瘤模型中的药效
利用MOLM-13静脉肿瘤模型，研究CD70抗体的抗肿瘤活性。24只雌性CB17-SCID小鼠(6-7周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司)尾静脉接种5×10^6个人急性髓系白血病MOLM-13细胞(CBP60678，南京科佰生物科技有限公司)，接种后第2天随机分为3组，每组8只：第一组每周两次腹腔注射给予同型对照抗体，第二组每周两次腹腔注射给予10mg/kg 41D12fut8KO抗体，第三组每周两次腹腔注射给予10mg/kg Hab035.31a fut8KO抗体。整个实验过程中小鼠可自由进食、饮水。
每天观察小鼠状态，小鼠出现瘫痪、体重减轻超20％连续3天，或者满足其他需要安乐死指标时，安乐死小鼠。每周两次测量小鼠体重。Log-rank(Mantel-Cox)test比较各组小鼠生存趋势的差异，当p<0.05认为有显著性差异。
实验结果见表30(中位生存期)和图21(生存率)。结果表明，CD70抗体能够招募小鼠体内的免疫细胞，对CD70阳性的 M-13细胞产生杀伤作用。与阴性对照组相比，本发明的CD70岩藻糖敲除抗体Hab035.31a fut8KO可有效抑制Raji肿瘤生长，与同型对照抗体组间具有统计学上的显著性差异，而对照抗体41D12fut8KO组相比同型对照抗体组无统计学差异。
表30 MOLM-13模型小鼠中位生存期(MST)

Claims (27)

  1. 一种特异性结合CD70的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含：
    (a)SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45或46任一项所示VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
    和/或，(b)SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、28、31、33、36、37、40、42、44或47任一项所示VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
    优选地，所述HCDR1～3和/或所述LCDR1～3根据Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统确定，更优选地，所述HCDR1-3和/或所述LCDR1-3选自表1。
  2. 根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含：(1)SEQ ID NO：3、15、17或19所示VH的HCDR1～3，和SEQ ID NO：4、16或18所示VL的LCDR1～3；
    或，(2)SEQ ID NO：5、20、22、23或26所示VH的HCDR1～3，和SEQ ID NO：6、21、24、25所示VL的LCDR1～3；
    或，(3)SEQ ID NO：7、27、29或30所示VH的HCDR1～3，和SEQ ID NO：8、28、31所示VL的LCDR1～3；
    或，(4)SEQ ID NO：9、32、34、35或38所示VH的HCDR1～3，和SEQ ID NO：10、33、36或37所示VL的LCDR1～3；
    或，(5)SEQ ID NO：11、39或41所示VH的HCDR1～3，和SEQ ID NO：12、40或42所示VL的LCDR1～3；
    或，(6)SEQ ID NO：13、43、45或46所示VH的HCDR1～3，和SEQ ID NO：14、44或47所示VL的LCDR1～3。
  3. 根据权利要求1～2任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，SEQ ID NO：3所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：66～68、SEQ ID NO：69～71或SEQ ID NO：72～74所示的序列；
    SEQ ID NO：15所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：75～77、SEQ ID NO：78～80或SEQ ID NO：81～83所示的序列；
    SEQ ID NO：17所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：84～86、SEQ ID NO：87～89或SEQ ID NO：90～92所示的序列；
    SEQ ID NO：19所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：93～95、SEQ ID NO：96～98或SEQ ID NO：99～101所示的序列；
    SEQ ID NO：5、20、22或23所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：112～114、SEQ ID NO:115～117或SEQ ID NO：118～120所示的序列；
    SEQ ID NO：26所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有 如SEQ ID NO：121～123、SEQ ID NO：124～126或SEQ ID NO：127～129所示的序列；
    SEQ ID NO：7所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：140～142、SEQ ID NO：143～145或SEQ ID NO：146～148所示的序列；
    SEQ ID NO：27所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：149～151、SEQ ID NO：152～154或SEQ ID NO：155～157所示的序列；
    SEQ ID NO：29或30所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：158～160、SEQ ID NO：161～163或SEQ ID NO：164～166所示的序列；
    SEQ ID NO:9、32、34或35所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：177～179、SEQ ID NO：180～182或SEQ ID NO：183～185所示的序列；
    SEQ ID NO：38所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：186～188、SEQ ID NO：189～191或SEQ ID NO：192～194所示的序列；
    SEQ ID NO：11所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：205～207、SEQ ID NO：208～210或SEQ ID NO：211～213所示的序列；
    SEQ ID NO：39所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：214～216、SEQ ID NO：217～219或SEQ ID NO：220～223所示的序列；
    SEQ ID NO：41所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：224～226、SEQ ID NO：227～229或SEQ ID NO：230～233所示的序列；
    SEQ ID NO:13、43、45或46所示VH的HCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：244～246、SEQ ID NO：247～249或SEQ ID NO：250～252所示的序列；
    SEQ ID NO：4、16或18所示VL的LCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：102～104、SEQ ID NO：105～107或SEQ ID NO：108～111所示的序列；
    SEQ ID NO:6、21、24或25所示VL的LCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：130～132、SEQ ID NO:133～135或SEQ ID NO:136～139所示的序列；
    SEQ ID NO:8、28或31所示VL的LCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：167～169、SEQ ID NO：170～172或SEQ ID NO：173～176所示的序列；
    SEQ ID NO:10、33、36或37所示VL的LCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：195～197、SEQ ID NO：198～200或SEQ ID NO：201～204所示的序列；
    SEQ ID NO:12、40或42所示VL的LCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系统，具有如SEQ ID NO：234～236、SEQ ID NO：237～239或SEQ ID NO：240～243所示的序列；
    SEQ ID NO:14、44或47所示VL的LCDR1～3按照Kabat、Chothia或IMGT编号系 统，具有如SEQ ID NO：253～255、SEQ ID NO：256～258或SEQ ID NO：259～262所示的序列。
  4. 根据权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含在SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45或46任一项所示VH的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3上发生至多6个突变的序列；和/或，
    所述抗体或抗原结合片段包含在SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、28、31、33、36、37、40、42、44或47任一项所示VL的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3上发生至多6个突变的序列；
    优选地，所述突变选自取代、缺失或插入突变；更优选地，所述取代为保守氨基酸取代；
    优选地，所述突变的数目可选自1、2、3、4、5或6；
    优选地，根据Kabat编号系统编号，所述突变包括在SEQ ID NO：3、5、15、17、20、22或23的HCDR2上发生的G55突变，更优选地，所述G55突变为G55A突变；或者，根据Kabat编号系统编号，所述突变包括在SEQ ID NO：9、32、34或35的HCDR2上发生的D61突变，更优选地，所述D61突变为D61Q突变。
  5. 根据权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45或46任一项所述VH中的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列；
    和/或，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、38、31、33、36、37、40、42、44或47任一项所述VL中的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列。
  6. 根据权利要求1～5任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含：
    (a)重链可变区，所述重链可变区包含所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和/或，
    (b)轻链可变区，所述轻链可变区包含所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
  7. 根据权利要求1～6任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含：
    (a)SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45或46任一项所示的序列；和/或，(b)SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、28、31、33、36、37、40、42、44或47任一项所示的序列；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含：
    (1)SEQ ID NO：3、15、17或19任一项所示的序列和SEQ ID NO：4、16或18任一项所示的序列；
    (2)SEQ ID NO：5、20、22、23或26任一项所示的序列和SEQ ID NO：6、21、24或25任一项所示的序列；
    (3)SEQ ID NO：7、27、29或30任一项所示的序列和SEQ ID NO：8、28或31任一项所述示的序列；
    (4)SEQ ID NO：9、32、34、35或38任一项所示的序列和SEQ ID NO：10、33、36或37任一项所示的序列；
    (5)SEQ ID NO：11、39或41任一项所示的序列和SEQ ID NO：12、40或42任一项所示的序列；
    (6)SEQ ID NO：13、43、45或46任一项所示的序列和SEQ ID NO：14、44或47任一项所示的序列。
  8. 根据权利要求7所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45或46任一项所示VH的框架区具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的同一性的框架区序列；和/或，
    与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、28、31、33、36、37、40、42、44或47任一项所示VL的框架区具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的框架区序列。
  9. 根据权利要求7所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、22、23、26、27、29、30、32、34、35、38、39、41、43、45或46任一项所示VH的框架区相比，具有至多15个氨基酸突变的序列；和/或，包含与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、21、24、25、28、31、33、36、37、40、42、44或47任一项所示VL的框架区相比，具有至多15个氨基酸突变的序列；
    优选地，所述突变选自取代、缺失或插入突变；更优选地，所述取代为保守氨基酸取代；
    优选地，所述突变的数目可选自1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：15所示VH的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，T28N、F29I、T30E、V37L、M69I或R71A；更优选地，至少具有T28N、F29I、T30E、V37L、M69I和R71A突变；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：20所示VH的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，Q43K、R71V或T73K突变，更优选地，至少具有R71V和T73K突变或至少具有Q43K、R71V和T73K突变；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：27所示VH的框架区相比，至 少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，G26D、I37V或R94K突变，更优选地，至少具有G26D和R94K突变或至少具有G26D、I37V和R94K突变；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：32所示VH的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，V2I、D72E或V75A突变，更优选地，至少具有V2I突变或至少具有D72E和V75A突变；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：39所示VH的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，F24V或G26D突变，更优选地，至少具有F24V和G26D突变；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：43所示VH的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，G42E、G44R或N73I突变，更优选地，至少具有G42E、G44R和N73I突变，或至少具有G44R和N73I突变；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：16所示VL的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，Y49S、G57E或I58F突变，更优选地，至少具有Y49S、G57E和I58F突变；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：21所示VL的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，Y36L、P44F、L46G、F71Y或V85D突变，更优选地，至少具有F71Y和V85D突变，或至少具有Y36L、P44F、L46G和F71Y突变；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：28所示VL的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，V3Q、Q38R或D60A突变，更优选地，至少具有V3Q、Q38R和D60A突变；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：33所示VL的框架区相比，至少具有选自下组的一个或多个突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，A43G、Y49H、T69R或F71Y突变，更优选地，至少具有A43G和Y49H突变，或至少具有A43G、Y49H、T69R和F71Y突变；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：40所示VL的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，M4L或N22S突变，更优选地，至少具有M4L和N22S突变；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：44所示VL的框架区相比，至少具有选自下组的突变的框架区序列：按Kabat编号系统编号，M4L或N22S突变，更优选地，至少具有M4L和N22S突变。
  10. 根据权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含或不包含重链恒定区和/或轻链恒定区；
    优选地，所述重链恒定区包含全长重链恒定区或重链恒定区片段，所述重链恒定区片段可选自CH1、Fc或CH3结构域；
    优选地，所述重链恒定区和/或轻链恒定区为人重链恒定区和/或人轻链恒定区；
    优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1重链恒定区、IgG2重链恒定 区、IgG3重链恒定区或IgG4重链恒定区；
    优选地，所述重链恒定区是人IgG1重链恒定区、人IgG2重链恒定区、人IgG3重链恒定区或人IgG4重链恒定区；
    优选地，所述重链恒定区具有如SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区具有如SEQ ID NO：49所述的氨基酸序列；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段具有如SEQ ID NO：50、52、54、56、58或60任一项所述的重链，和/或，所述抗体或抗原结合片段具有如SEQ ID NO：51、53、55、57、59或61所示轻链；
    更优选地，所述抗体或抗原片段具有如SEQ ID NO：50所示的重链和SEQ ID NO：51所示的轻链，或具有如SEQ ID NO：52所示的重链和SEQ ID NO：53所示的轻链，或具有如SEQ ID NO：54所示的重链和SEQ ID NO：55所示的轻链，或具有如SEQ ID NO：56所示的重链和SEQ ID NO：57所示的轻链，或具有如SEQ ID NO：58所示的重链和SEQ ID NO：59所示的轻链，或具有如SEQ ID NO：60所示的重链和SEQ ID NO：61所示的轻链；
    优选地，所述抗体缺乏岩藻糖基化。
  11. 根据权利要求1～10任一项所述抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段选自单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、工程化抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、完整抗体、完整抗体的片段、裸抗体、缀合抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’) 2、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体。
  12. 根据权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人CD70和/或猴CD70；优选地，所述抗体或抗原结合片段与人CD70和/或猴CD70结合的KD小于1.00-8E M、1.00E-9 M、1.00E-10M、2.00E-10M、3.00E-10M、4.00E-10M、5.00E-10 M、6.00E-10M、7.00E-10M、8.00E-10M、9.00E-10M、1.00E-11 M、2.00E-11 M、3.00E-11 M、4.00E-11 M、5.00E-11 M、6.00E-11 M、7.00E-11 M、8.00E-11 M、9.00E-11 M或1.00E-12 M。
  13. 根据权利要求1～12任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段抑制和/或阻断CD70与其配体CD27的结合；优选地，所述CD70为人CD70和/或猴CD70。
  14. 根据权利要求1～13任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段表现出选自以下的一种或多种效应子功能：抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖性细胞毒作用(CDC)和抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP)。
  15. 根据权利要求1～14任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。
  16. 一种多特异性抗原结合分子，其特征在于，所述抗原结合分子包括第一抗原结合 模块，所述第一抗原结合模块包含权利要求1～15任一项所述的抗体或抗原结合片段；以及第二抗原结合模块，所述第二抗原结合模块特异性结合CD70以外的其他抗原，或者结合与第一抗原结合模块不同的CD70抗原表位；
    优选地，所述其他抗原选自CD3、CD3ε、CD16、CD16A、CD28、CD20、CD19、CD47或CD40L；
    优选地，所述多特异性抗原结合分子为双特异性、三特异性或四特异性。
  17. 一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1～15任一项所述抗体或抗原结合片段。
  18. 一种免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞表达权利要求17所述CAR或包含编码权利要求17所述CAR的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞；
    优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞；
    优选地，所述T细胞选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞。
  19. 一种分离的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码权利要求1～15任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求16所述的多特异性抗原结合分子或权利要求17所述的嵌合抗原受体。
  20. 一种载体(vector)，其特征在于，所述载体包含权利要求19所述的核酸片段。
  21. 一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求20所述载体；优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)；优选地，所述细胞缺乏岩藻糖基转移酶，例如FUT8。
  22. 一种制备权利要求1～15任一项所述抗体或抗原结合片段、权利要求16所述的多特异性抗原结合分子的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求21所述细胞，以及分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或分离所述细胞表达的多特异性抗原结合分子。
  23. 一种制备权利要求18所述免疫效应细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将包含编码权利要求17所述CAR的核酸片段导入所述免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达权利要求17所述CAR。
  24. 一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1～15任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求16所述的多特异抗原结合分子、权利要求17所述的嵌合抗原受体、权利要求18所述的免疫效应细胞、权利要求19所述的核酸片段、权利要求20所述的载体或权利要求21所述的细胞；优选地，所述组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；优选地，所述组合物包含能够给予受试者0.1～50mpk施用量的所述抗体或抗原结合片段，优选1～20mpk，更优选为10～20mpk。
  25. 权利要求1～15任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求16所述的多特异性抗原结合分子、权利要求17所述的嵌合抗体受体、权利要求18所述的免疫效应细胞、权 利要求19所述的核酸片段、权利要求20所述的载体或权利要求21所述的细胞在制备治疗癌症或肿瘤、自身免疫性疾病或病毒感染的药物中的用途；优选地，所述癌症或肿瘤可选自肾细胞癌、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤；优选地，所述药物包含能够给予受试者0.1～50mpk施用量的所述抗体或抗原结合片段，优选1～20mpk，更优选为10～20mpk。
  26. 一种治疗癌症或肿瘤、自身免疫性疾病或病毒感染的方法，其特征在于，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1～15任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求16所述的多特异性抗原结合分子、权利要求17所述的嵌合抗体受体、权利要求18所述的免疫效应细胞、权利要求19所述的核酸片段、权利要求20所述的载体或权利要求21所述的细胞；优选地，所述癌症或肿瘤可选自肾细胞癌、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤；优选地，所述抗体或抗原结合片段的有效量为0.1～50mpk，优选1～20mpk，更优选为10～20mpk。
  27. 权利要求1～15任一项所述抗体或抗原结合片段、权利要求16所述的多特异性抗原结合分子、权利要求17所述嵌合抗原受体、权利要求18所述的免疫效应细胞、权利要求19所述的核酸片段、权利要求20所述的核酸载体或权利要求21所述的宿主细胞，其特征在于，其用于治疗癌症或肿瘤、自身免疫性疾病或病毒感染；优选地，所述癌症或肿瘤可选自肾细胞癌、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤；优选地，所述抗体或抗原结合片段对受试者的有效量为0.1～50mpk，优选1～20mpk，更优选为10～20mpk。
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