CN116063524B - 一种cd70纳米抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

一种cd70纳米抗体的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纳米抗体制备技术领域，具体为一种CD70纳米抗体的制备方法及其应用。CD70靶点与肿瘤的发生密切相关，且在肺癌、肾细胞癌、血液肿瘤、中枢神经系统胶质瘤等多种癌种中异常表达的情况尤为明显，因此学术界将其作为癌症临床治疗的新靶点。本发明利用双峰驼制备CD70纳米抗体，并成功筛选出在分子量上比全长抗体小很多的纳米抗体，且亲和力较全长抗体更强，能够有效识别和结合肿瘤细胞膜表面的CD70，在CAR‑T/CAR‑NK细胞疗法上的应用上非常有优势。

Description

一种CD70纳米抗体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及纳米抗体制备技术领域，具体为一种CD70纳米抗体的制备方法及其应用。
背景技术
近年来，癌症已然逐渐成为危害人类身体健康的恶性疾病，发病率和死亡率不断攀升。现阶段常规治疗癌症的方法包括手术切除和化疗。其中，手术切除过程中存在风险性，且只适用于癌症早期阶段，风险大、成功率低；而化疗耗时长，副作用大；因此越来越多的病患渴望更高效、安全的治疗方法。近年来，随着医疗研究人员的不断努力，靶向治疗法逐渐兴起。
研究发现，CD70属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员之一，是一种Ⅱ型跨膜蛋白，能与其受体CD27结合，在调控免疫应答过程中发挥重要的作用。正常生理状态下，人细胞的CD70表达局限，主要在活化的淋巴细胞和树突状细胞上呈过性表达。在病理情况下，CD70可高表达于多种肿瘤细胞中，在肾透明细胞癌中高表达状况尤为明显，被认为是肾癌的新型特异性的标志物。其他肿瘤如非霍奇金淋巴瘤、急性髓系白血病、胶质瘤、头颈部鳞状细胞癌等具有不同程度的CD70表达。因此，CD70成为一个有极具吸引力的肿瘤治疗新兴靶点。以CD70为靶点制备特异性抗体以及CAR-T/NK细胞疗法是当前研究的热点。因此，亟需一种可以快速筛选、快速产出高亲和力的CD70抗体的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CD70纳米抗体的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种CD70纳米抗体的制备方法及其应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：噬菌体库的构建；
步骤2：噬菌体库淘筛；
步骤3：hCD70nb的表达；
步骤4：流式筛选出与Raji高结合的hCD70nb；
进一步的，所述步骤1中，噬菌体库的构建，包括以下步骤：
S11：免疫前采血作为阴性血清；以CD70作为抗原，选择健康的两头双峰驼进行免疫；初次免疫将抗原与完全弗氏佐剂混合，乳化后皮下注射，抗原注射量为每只骆驼0.5mg；
S12：第二次免疫将抗原与不完全弗氏佐剂混合，乳化后皮下注射，抗原注射量为每只骆驼0.2mg；
S13：重复S12步骤进行第三至第五次免疫；
S14：采全血，使用percoll将淋巴细胞分离，采用TRIZOL裂解淋巴细胞并收集RNA并逆转录成cDNA，用cDNA采用巢式PCR方法，进行两轮PCR扩增抗体重链可变区VHH 基因片段；第一轮PCR扩增，回收500～750bp PCR，以回收的完整重链抗体及其重链可变区的基因片段为模板，用VHH二轮引物经第二轮PCR扩增，得到VHH目的基因，VHH 目的基因位于250～500bp之间；
S15：将上述得到的VHH片段连接到pADL-23C噬菌体展示载体质粒(Bgl1酶切)，之后将VHH片段及pADL-23C载体连接酶连接，电转化至TG1感受态细胞中。
进一步的，S11中，所述初次免疫的操作方法为按重量计，将抗原与完全弗氏佐剂1: (1～1.2)混合，乳化后皮下多点注射，初次注射抗原用量为每只骆驼0.5mg；第二次免疫的操作方法为按重量计，将抗原与不完全弗氏佐剂1:(1～1.2)混合，乳化后皮下多点注射，注射抗原用量为每只骆驼0.2mg。
进一步的，所述步骤2中，噬菌体库淘筛，包括以下步骤：
S21：取出筛选抗原，冰上放置解冻，将抗原包被免疫管，4℃缓慢旋转过夜，同时平行包被5％脱脂奶粉作对照；
S22：将过夜包被的免疫管中的液体弃掉，加入2mL PBS缓冲液室温清洗免疫管；
S23：加入2mL5％脱脂奶粉，室温旋转封闭2h；
S24：将封闭后的免疫管中液体丢弃，并加入1mL PBS缓冲液室温清洗；
S25：弃掉免疫管中的清洗液，加入2mL PBS缓冲液，加入制备的噬菌体库1mL，室温旋转孵育1h；
S26：将免疫管内液体弃掉，加入2mL PBST缓冲液室温清洗免疫管9次；
S27：将免疫管内液体弃掉，除残余液体，加入500μL Gly-HCl洗脱液，室温旋转洗脱8min；
S28：加入Tris-HCl中和缓冲液中和，将免疫管中的溶液转移至新的1.5mL离心管中；即为第一轮筛选噬菌体洗脱液；
S29：取第一轮噬菌体洗脱液侵染TG1菌株，在1.5mL离心管中进行105及106两个梯度稀释，进行平板计数；统计板上可以明显区分单菌落的稀释度的单菌落数量；通过克隆计数计算淘筛效率；重复上述步骤进行第二轮淘筛，通过克隆计数计算第二轮淘筛效率。
进一步的，S26中，所述PBST缓冲液为溶有质量分数0.1％的Tween20的PBS缓冲液。
进一步的，所述步骤3中，hCD70nb的表达，包括以下步骤：
S31：制备5'seq，3'seq，Target ORF三片段并进行Fusion PCR扩增反应：
a.5'seq制备引物：
D2P_1.08e_F：GGTGATGTCGGCGATATAGG
GSG-8HIS_R：ACCAGAACCGTGGTGGTGG
以pD2P质粒为模板，常规PCR扩增5'seq片段；
b.3'seq制备引物(不含eGFP)：
D2P_3'UTR_F：TAAATAAGGATTAATTACTTGGATGCC
D2P_1.08e_R：TTATTGCTCAGCGGTGGC
c.hCD70nb制备引物：
F：ATCACCACCACCATCACGGGAGCGGCATGGCGGCCCAGCCGGCCATGGCA
R：GGCATCCAAGTAATTAATCCTTATTTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTT
d.利用如下引物进行Fusion PCR扩增反应；
D2P_1.08e_F：GGTGATGTCGGCGATATAGG
D2P_1.08e_R：TTATTGCTCAGCGGTGGC；
S32：蛋白表达：
将Fusion PCR模板加入至加水溶解的ProteinFactory Rxn反应体系；将上述反应液混匀，透气膜封口，摇床上反应过夜。
S33：磁珠纯化：制备ProteinFactory反应液，离心收集上清；取His-Monsterbeads，用Binding Buffer洗涤两次，磁吸收集beads，备用；向上述上清液中加入洗涤好的His-Monster beads，充分震荡、旋转混合；将孵育后的样品，磁吸收集beads，吸弃上清；再加入Washing buffer，充分震荡，磁吸收集beads，吸弃上清；向beads中加入Elutionbuffer，用枪头吸吹至混匀，静置、磁吸beads、收集上清液，即为目标蛋白，重复5-8次。
进一步的，步骤S33中，所述Binding buffer为20mM Tris-HCl与500mM NaCl的混合溶液，pH 8.0；所述Washing buffer为20mM Tris-HCl、500mM NaCl和20mM Imidazole 的混合溶液，pH 8.0；所述Elution buffer为20mM Tris-HCl、500mM NaCl和250mM Imidazole的混合溶液，pH 8.0。
进一步的，所述步骤4中，流式筛选出与Raji高结合的hCD70nb，包括以下步骤：
S41：Raji细胞，计数，重悬；
S42：将细胞悬液中加入不同的hCD70nb蛋白，4℃下共孵育30min；
S43：加入Myc-Tag(9B11)并用Mouse mAb稀释400倍，4℃下共孵育30min；
S44：加入PBS并离心；
S45：将PBS重悬细胞流式上机，并以不加hCD70nb为阴性对照，筛选出hCD70nb。
进一步的，所述CD70纳米抗体为1C、1E、3C、3D、4F、5A、5C、5H、9H、11B 中的任意一种；其中：
1C的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
1E的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
3C的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
3D的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
4F的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
5A的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
5C的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
5H的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
9H的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
11B的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
1C的DNA序列如SEQ ID NO.11所示；
1E的DNA序列如SEQ ID NO.12所示；
3C的DNA序列如SEQ ID NO.13所示；
3D的DNA序列如SEQ ID NO.14所示；
4F的DNA序列如SEQ ID NO.15所示；
5A的DNA序列如SEQ ID NO.16所示；
5C的DNA序列如SEQ ID NO.17所示；
5H的DNA序列如SEQ ID NO.18所示；
9H的DNA序列如SEQ ID NO.19所示；
11B的DNA序列如SEQ ID NO.20所示。
进一步的，一种CD70纳米抗体的抗原结合部分。
进一步的，一种CD70纳米抗体的表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。
进一步的，一种包含上述表达载体的宿主细胞。
进一步的，一种药物组合物包括所述CD70纳米抗体、所述表达载体、所述宿主细胞以及至少一种药学上可接受的载体。
进一步的，所述的药物组合物在制备用于诊断CD70相关疾病的试剂盒中的用途，所述疾病为CD70表达相关的肿瘤、慢性炎性疾病、免疫疾病和感染性疾病。
进一步的，所述药物组合物在制备恶性肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述恶性肿瘤为表达CD70的恶性肿瘤，包含淋巴瘤、急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、食管癌、间皮瘤、胃癌、腺囊癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、胶质瘤、肺癌、骨肉瘤、甲状腺癌、黑色素瘤、或胰腺癌。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明基于CD70靶点在肺癌、肾细胞癌、血液肿瘤、中枢神经系统胶质瘤等多种癌种中异常表达这一客观事实，将其作为癌症临床治疗的新靶点。本发明先利用双峰驼制备CD70纳米抗体，筛选的纳米抗体在分子量上比全长抗体小了很多，其亲和力较全长抗体更强，能够有效阻断识别和结合肿瘤细胞膜表面的 CD70，在预防或治疗肿瘤或/和癌症的药物领域具有价值，尤其在CAR-T/NK细胞疗法的应用中具有优势。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的Fusion PCR结果；
图2是本发明的10种hCD70nb的SDS-PAGE图；
图3是本发明的流式的筛选结果；
图4是本发明的hCD70nb-1C与Raji、Jeko-1和Mino的结合能力；
图5是本发明的hCD70nb-1E与Raji、Jeko-1和Mino的结合能力；
图6是本发明的hCD70nb-3C与Raji、Jeko-1和Mino的结合能力；
图7是本发明的hCD70nb-3D与Raji、Jeko-1和Mino的结合能力；
图8是本发明的hCD70nb-4F与Raji、Jeko-1和Mino的结合能力；
图9是本发明的hCD70nb-5A与Raji、Jeko-1和Mino的结合能力；
图10是本发明的hCD70nb-5C与Raji、Jeko-1和Mino的结合能力；
图11是本发明的hCD70nb-5H与Raji、Jeko-1和Mino的结合能力；
图12是本发明的hCD70nb-9H与Raji、Jeko-1和Mino的结合能力；
图13是本发明的hCD70nb-11B与Raji、Jeko-1和Mino的结合能力；
图14是本发明的ELISA测试结果；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，主要材料的来源为：人CD27配体/CD70蛋白，Fc标签的活性三聚体；厂家：百普赛斯；货号CDL-H5266；规格：1mg。
实施例：
步骤1：噬菌体库的构建：
S11：免疫前采血5mL作为阴性血清；以CD70作为抗原，选择健康的两头双峰驼进行五次免疫；其中，初次免疫的操作方法为将抗原与完全弗氏佐剂按1:1重量混合，乳化后皮下多点注射，初次注射抗原用量为每只骆驼0.5mg；
S12:第二次免疫的操作方法为按重量计，将抗原与不完全弗氏佐剂按1:1重量混合，乳化后皮下多点注射，注射抗原用量为每只骆驼0.2mg；
S13：重复S12中第二次免疫的操作方法，进行第三至第五次免疫；
S14：采全血200mL，使用percoll将淋巴细胞分离，采用TRIZOL裂解淋巴细胞并收集 RNA并逆转录成cDNA，用cDNA采用巢式PCR方法，进行两轮PCR扩增抗体重链可变区VHH基因片段；第一轮PCR扩增，回收500～750bp PCR，以回收的完整重链抗体及其重链可变区的基因片段为模板，用VHH二轮引物经第二轮PCR扩增，得到VHH目的基因，VHH 目的基因位于250～500bp之间；
S15：将上述得到的VHH片段连接到pADL-23C噬菌体展示载体质粒(Bgl1酶切)，之后将VHH片段及pADL-23C载体连接酶连接，电转化至TG1感受态细胞中，然后将感受态细胞涂布平板并计数，采用克隆菌落PCR验证VHH基因插入率。
步骤2：噬菌体库淘筛：
S21：取出筛选抗原，冰上放置解冻，将抗原包被免疫管，4℃缓慢旋转过夜，同时平行包被5％脱脂奶粉作对照；
S22：将过夜包被的免疫管中的液体弃掉，加入2mL PBS缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min；
S23：加入2mL 5％脱脂奶粉，室温旋转封闭2h；
S24：将封闭后的免疫管中液体丢弃，并加入1mL PBS缓冲液温清洗免疫管3次，每次旋转5min；
S25：弃掉免疫管中的清洗液，加入2mL PBS缓冲液，加入制备的噬菌体库1mL，室温旋转孵育1h；
S26：将免疫管内液体弃掉，将Tween20的PBS缓冲液混合制备含有质量分数 0.1％Tween20的PBST缓冲液，室温清洗免疫管9次；
S27：将免疫管内液体弃掉，除残余液体，加入500μL Gly-HCl洗脱液，室温旋转洗脱 8min；
S28：加入Tris-HCl中和缓冲液中和，将免疫管中的溶液转移至新的1.5mL离心管中；即为第一轮筛选噬菌体洗脱液；
S29：取第一轮噬菌体洗脱液侵染TG1菌株，在1.5mL离心管中进行105及106两个梯度稀释，平板计数；统计板上可以明显区分单菌落的稀释度的单菌落数量；通过克隆计数计算淘筛效率；重复上述步骤进行第二轮淘筛，通过克隆计数计算第二轮淘筛效率。
步骤3：hCD70nb的表达：
S31：制备5'seq，3'seq，Target ORF三片段并进行Fusion PCR扩增反应：
a.5'seq制备引物：
D2P_1.08e_F：GGTGATGTCGGCGATATAGG
GSG-8HIS_R：ACCAGAACCGTGGTGGTGG
以pD2P质粒为模板，常规PCR扩增5'seq片段；
b.3'seq制备引物(不含eGFP)：
D2P_3'UTR_F：TAAATAAGGATTAATTACTTGGATGCC
D2P_1.08e_R：TTATTGCTCAGCGGTGGC；
PCR反应条件为：
95℃3min
72℃5min
4℃Forever
c.hCD70nb制备引物：
F：ATCACCACCACCATCACGGGAGCGGCATGGCGGCCCAGCCGGCCATGGCA
R：GGCATCCAAGTAATTAATCCTTATTTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTT；
PCR反应条件：
95℃3min
72℃5min
4℃Forever
d.利用如下引物进行Fusion PCR扩增反应；
D2P_1.08e_F：GGTGATGTCGGCGATATAGG
D2P_1.08e_R：TTATTGCTCAGCGGTGGC；
PCR反应条件：
95℃3min
72℃5min
4℃Forever
Fusion PCR结果如图1所示。
S32：蛋白表达：
将Fusion PCR模板以1：45的体积加入至水溶解的ProteinFactory Rxn反应体系中，混匀并调整总反应体系为10mL，将上述反应液置于一次性摇瓶中混匀，透气膜封口或盖上盖子(不可完全封闭)，在温度30℃、转速220rpm的摇床上反应过夜。
S33：磁珠纯化：取1.5mL ProteinFactory反应液，4℃4000rpm离心3min，收集上清液；取His-Monster beads，用5mL Binding Buffer洗涤两次，磁吸收集beads，备用；向上述上清液中加入洗涤好的His-Monster beads，充分震荡、4℃下旋转混合1h；将孵育后的样品，磁吸收集beads，吸弃上清液；再加入Washing buffer，充分震荡，磁吸收集beads，吸弃上清液；向beads中加入Elution buffer，用枪头吸吹至混匀，静置、磁吸beads、收集Elution上清液，即为目标蛋白，重复5-8次。
其中，所述Binding buffer为20mM Tris-HCl与500mM NaCl的混合溶液，pH 8.0；所述 Washing buffer为20mM Tris-HCl、500mM NaCl和20mM Imidazole的混合溶液，pH8.0；所述Elution buffer为20mM Tris-HCl、500mM NaCl和250mM Imidazole的混合溶液，pH 8.0。
步骤4：流式筛选出与Raji高结合的hCD70nb；
S41：Raji细胞，计数，重悬，使之密度为1*104/50μl；；
S42：将细胞悬液中加入不同的hCD70nb蛋白，4℃下共孵育30min；
S43：加入Myc-Tag(9B11)并用Mouse mAb稀释400倍，4℃下共孵育30min；
S44：加入2mL PBS并离心；400g离心5min；
S45：将100μL PBS重悬细胞流式上机，并以不加hCD70nb为阴性对照，筛选出10种hCD70nb，分别为1C、1E、3C、3D，4F，5A，5C，5H，9H、11B，流式的筛选结果如图3 所示。
检测1：
流式检测1C、1E、3C、3D，4F，5A，5C，5H，9H、11B 10种hCD70nb与不同肿瘤细胞的结合能力。检测方法如下：
SA1：对不同的肿瘤细胞(Raji，人Burkitt's淋巴瘤细胞；Jeko-1，人套细胞淋巴瘤细胞； Mino，人套细胞淋巴瘤细胞)计数并重悬细胞，使之密度为2*104/50μL；
SA2：向50μL的细胞悬液中加入不同浓度的10种hCD70nb蛋白，4℃下共孵育30min；
SA3：用Mouse mAb对Myc-Tag(9B11)进行400倍稀释，加入稀释液，4℃下共孵育30min；
SA4：加入2mLPBS，400g并离心；
SA4：将100μL的PBS重悬细胞流式上机，以不加hCD70nb为阴性对照，最终筛选出与人Burkitt's淋巴瘤细胞和人套细胞淋巴瘤细胞均有较好的结合能力，并且IC50比较小的hCD70nb。实验结果如图4～13所示。
结论：最终筛选出的10种hCD70nb与人Burkitt's淋巴瘤细胞和人套细胞淋巴瘤细胞均有较好的结合能力，并且IC50也是比较小的。
检测2：
进行ELISA检测，测试4F、9H 2种hCD47nb与CD70抗原的结合能力。检测方法如下：
SB1:将CD70抗原包被酶标板(浓度为100ng/mL，接种量为100μL/孔)，4℃包被过夜；
SB2:弃包被液，TBST洗涤3次，加入BSA，4℃封闭3h；
SB3:TBST洗涤3次，每孔加入100μL的2种hCD70nb，4℃孵育2h；
SB4:TBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的抗Myc抗体(用TBST按1:1000稀释)， 100μL/孔，4℃孵育1h；
SB5:TBST洗板5次，加入TMB显色液显色，100μL/孔，室温下孵育30min；
SB6:按50μL/孔加入终止液终止反应，并测量光密度。
结论：如图14所示，4F、9H 2种hCD47nb与CD70抗原均有较好的结合能力。
检测3：
在PBST缓冲溶液中通过蛋白A芯片特异性捕获人CD70-Fc蛋白，并与样品进行充分反应，在PBST缓冲液中解离分析上述反应得到的固相结合物，并用数据分析软件对结果进行分析，获得结合速率、解离速率以及亲和力常数。目前，41D12已被开发成抗CD70的全长抗体药物cusatuzumab。检测3中41D12来自Fab抗体，具体序列来自《ARGX-110,a highlypotent antibody targeting CD70,eliminates tumors via both enhanced ADCC andimmune checkpoint blockade》，表达成scFv作为阳性对照，实验结果如下表所示。
结论：根据结合过程中机读数值随时间的变化可得结合常Kon(1/Ms)。根据解离过程中机读数值随时间的变化可得解离常数Kdis(1/s)。根据公式：亲和力常数KD＝解离常数Kdis/ 结合常数Kon，可得不同CD70抗体亲和力常数KD。结果表明：CD70与蛋白41D12、hCD70nb-1C、hCD70nb-9H、hCD70nb-11B和hCD70nb-5C有明确结合；抗体的亲和力大小依次为：hCD70nb-9H(6.26E-09)＞41D12(1.16E-08)＞hCD70nb-1C(2.74E-08)＞ hCD70nb-11B(1.43E-07)；由此可见，hCD70nb-9H抗体亲和力常数均小于1x10-9(nM级别)，优于现有大部分抗体的1x10-8及以上亲和力常数，亲和力优于现有技术。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种CD70纳米抗体，其特征在于，所述CD70纳米抗体为1C、1E、3C、3D、4F、5A、5C、5H、9H、11B中的任意一种；其中：
1C的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
1E的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
3C的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
3D的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
4F的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
5A的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
5C的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
5H的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
9H的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
11B的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的一种CD70纳米抗体，其特征在于：
1C的DNA序列如SEQ ID NO.11所示；
1E的DNA序列如SEQ ID NO.12所示；
3C的DNA序列如SEQ ID NO.13所示；
3D的DNA序列如SEQ ID NO.14所示；
4F的DNA序列如SEQ ID NO.15所示；
5A的DNA序列如SEQ ID NO.16所示；
5C的DNA序列如SEQ ID NO.17所示；
5H的DNA序列如SEQ ID NO.18所示；
9H的DNA序列如SEQ ID NO.19所示；
11B的DNA序列如SEQ ID NO.20所示。
3.一种表达载体，其包含权利要求1~2中任意一项所述的一种CD70纳米抗体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体中的任一种。
4.一种宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求3所述的表达载体。
5.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1~2中任意一项所述的一种CD70纳米抗体或权利要求3所述的表达载体、或权利要求4所述的宿主细胞，以及至少一种药学上可接受的载体。
6.权利要求5所述的药物组合物在制备用于诊断CD70相关疾病的试剂盒中的用途，所述疾病为CD70表达相关的肿瘤、慢性炎性疾病、免疫疾病和感染性疾病。
7.权利要求5所述的药物组合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤为表达CD70的淋巴瘤。
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