CN109293778B - 同时抗cd70和cd47的重链抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

同时抗cd70和cd47的重链抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时抗CD70和CD47的重链抗体，该重链抗体为骆驼源获得，具体制备方法为，利用噬菌体抗体库技术筛选，使用基因工程方法制备所述单克隆抗体或其片段的DNA表达载体，转染宿主细胞获得含有所述单克隆抗体或其片段的细胞培养上清，并经纯化制备得到目的蛋白。本发明所述重链抗体可以应用于制备治疗肿瘤的药物，为进一步的抗体药物研发提供理论基础。

Description

同时抗CD70和CD47的重链抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗体药物技术，特别是涉及一种同时抗CD70和CD47的重链抗体及其制备方法和应用。
背景技术
CD70是Ⅱ型跨膜糖蛋白，也属TNF家族。hCD70是一个由193个氨基酸组成的三聚体，其中胞膜外的155个氨基酸序列与TNF配体超家族的其他成员具有一定的同源性。细胞因子受体CD27是肿瘤坏死因子受体(TFNR)超家族的成员，其在细胞生长和分化以及凋亡中起作用。CD27的配体是CD70，属于配体的肿瘤坏死因子家族。CD70为193个氨基酸的多肽，其具有20个氨基酸的亲水性N端结构域和包含2个潜在的N连接糖基化位点的C端结构域(Goodwin，R.G.等(1993)Cell73：447-56；Bowman等(1994)Immunol152：1756-61)。基于这些特性，确定CD70是具有细胞外C端部分的II型跨膜蛋白。
CD70在活化的T和B淋巴细胞以及树突状细胞上瞬时地存在(Hintzen等(1994)J.Immunol.152：1762-1773；Oshima等(1998)Int.Immunol.10：517-26；Tesselaar等(2003)J.Immunol.170：33-40)。除了在正常细胞上表达外，已经在不同类型的癌症中报道了CD70的表达，所述癌症包括肾细胞癌、转移性乳腺癌、脑肿瘤、白血病、淋巴瘤和鼻咽癌(Junker等(2005)J Urol.173：2150-3；Sloan等(2004)Am J Pathol.164：315-23；Held-Feindt和Mentlein(2002)Int J Cancer98：352-6；Hishima等(2000)Am J SurgPathol.24：742-6；Lens等(1999)Br J Haematol.106：491-503)。还提出了CD70与CD27的相互作用在细胞介导的自身免疫疾病和TNF-α产生的抑制中起作用(Nakajima等(2000)J.Neuroimmunol.109：188-96)。
CD27-CD70是共刺激受体-配体分子对，其相互作用提供的共刺激信号在多种自身免疫性疾病的发生、发展中起着促进作用，选择性干预这条共刺激通路能缓解或减轻某些自身免疫性疾病的发展，如sLE、RA。因此其可能成为自身免疫性疾病的一个特异性的治疗靶目标。
CD47是细胞表面免疫球蛋白之一，可以结合整合素和血小板蛋白，涉及多种生理功能，例如细胞转移，T细胞和DC细胞激活，轴突发育等功能。主要的，CD47是通过与吞噬细胞表面的SIRPα相结合，酪氨酸磷酸酶激活，阻止肌球蛋白在吞噬突触亚膜的积累来抑制吞噬作用。在这个过程中，CD47代表的是“别吃我”，来阻碍吞噬作用的自身攻击。实际上，CD47广泛地表达在人体的正常组织上，说明它的调节是广泛的。但同时它也在白血病(AML、慢性骨髓白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、实体瘤等细胞表面多表达。CD47在肿瘤细胞上的表达要高于正常细胞的表达，同时帮助肿瘤逃避吞噬细胞监控。因此CD47可以成为免疫治疗的重要靶点。
发明内容
发明目的：针对上述背景技术，本申请提供了一种同时抗CD70和CD47的重链抗体，并提供了其制备方法和应用。
技术方案：本申请所述的一种同时抗CD70和CD47的重链抗体，任选地包含一种或多种选自SEQ ID NO：11的氨基酸序列，其中，
X1为Q或氨基酸，
X2为A或氨基酸，
X3为Q或K，
X4为E或V，
X5为P或S，
X6为E或R，
X7为A或Y，
X8为R、S或T，
X9为K、N或R，
X10为A或G，
X11为L或V，
X12为D或G。
SEQ ID NO：11如下：
X1X2QVX3LX4ESGGGSVQAGGSLRLSCAAX5X6X7X8YSX9NCMGWFRQX10PGKEREGVASIWTGGGTTVYADSVKGRFTISQDNAKNTX11YLQMNSLKPEDTAMYYCAAAKPFSCDGRWLFESKFEYNYWX12QGTQVTVSS
进一步的，本发明所述的同时抗CD70和CD47的重链抗体，任选地包括一种或多种如SEQ ID No：1-8所示的重链可变区域。
更进一步的，本发明所述的同时抗CD70和CD47的重链抗体，包括如SEQ ID No：1-8所示的重链可变区域。
SEQ ID No：1-8如下：
SEQ ID NO：1
QAQVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAASEASYSNNCMGWFRQGPGKEREGVASIWTGGGTT
VYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAAKPFSCDGRWLFESKFEYNY
WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：2
QAQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASEASYSNNCMGWFRQGPGKEREGVASIWTGGGTT
VYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAAKPFSCDGRWLFESKFEYNY
WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：3
QAQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAAPEASYSNNCMGWFRQGPGKEREGVASIWTGGGTT
VYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAAKPFSCDGRWLFESKFEYNY
WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：4
QAQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASEARYSKNCMGWFRQGPGKEREGVASIWTGGGTT
VYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAAKPFSCDGRWLFESKFEYNY
WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：5
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASEASYSNNCMGWFRQGPGKEREGVASIWTGGGTT
VYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAAKPFSCDGRWLFESKFEYNY
WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：6
QAQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASRYTYSRNCMGWFRQAPGKEREGVASIWTGGGTT
VYADSVKGRFTISQDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAAAKPFSCDGRWLFESKFEYNY
WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：7
QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCAASEASYSNNCMGWFRQGPGKEREGVASIWTGGGTTVY
ADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAAKPFSCDGRWLFESKFEYNYWG
QGTQVTVSS
SEQ ID NO：8
QAQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASEASYSNNCMGWFRQGPGKEREGVASIWTGGGTT
VYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAAKPFSCDGRWLFESKFEYNY
WDQGTQVTVSS
本发明所述的同时抗CD70和CD47的重链抗体仅包括重链可变区域。
本发明所述的同时抗CD70和CD47的重链抗体为骆驼源获得。
本发明所述的单克隆抗体是骆驼的。
本发明所述同时抗CD70和CD47的重链抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取骆驼外周血中的RNA，反转录生成cDNA，PCR得到重链抗体VHH基因，与噬菌体载体连接构建成噬菌体文库，筛选出阳性重链抗体序列；
(2)设计引物对步骤(1)所得重链抗体的DNA分子进行PCR扩增，然后与质粒骨架连接构建重组质粒，转入宿主细胞得到重组菌株；
(3)培养步骤(2)得到的重组菌株，加入IPTG诱导表达，纯化获得同时抗CD70和CD47的重链抗体。
步骤(1)中，通过phage display筛选出阳性重链抗体序列。
步骤(2)中，所述引物包括VHH-F和VHH-R，其中引物VHH-F序列如SEQ ID NO：9所示，引物VHH-R序列如SEQ ID NO：10所示。
步骤(2)中，所述质粒为pET28B。
步骤(2)中，所述宿主细胞为BL21感受态细胞。
步骤(2)中，用限制性内切酶Nco I和Xho I酶切步骤1得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Nco I和Xho I酶切pET28B质粒，分别回收酶切产物和载体骨架连接得到重组质粒pET28B-VHH。
本发明所述同时抗CD70和CD47的重链抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
进一步的，所述肿瘤包括大B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、胃癌、肺癌、黑素瘤、脑胶质瘤和卵巢癌、白血病、慢性骨髓白血病、急性成淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、实体瘤。
有益效果：本发明通过构建高容量高多样性抗体库，从大容量抗体库中筛选出和CD70、CD47结合的抗体，且筛选出的抗体具有细胞活性，得到了同时抗CD70和CD47的重链抗体。所述重链抗体可以应用于制备治疗肿瘤的药物，为进一步的抗体药物研发提供理论基础。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1CD70及CD47特异抗体的发现
一、天然骆驼源重链抗体文库建立
抽取骆驼外周血，分离淋巴细胞并提取总RNA。将总RNA反转录得到cDNA。以cDNA为模板，用兼并引物PCR扩增抗体重链可变区(VHH)。PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，回收VHH的DNA。将来自不同骆驼的重链抗体基因等量混合，分组用内切酶切割，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，回收DNA片段并连接到已经用相同内切酶切割的噬菌粒载体质粒，将连接后的噬菌粒载体质粒用电转方式转入大肠杆菌，获得噬菌体重链抗体库。
二、CD70及CD47单克隆抗体筛选
1、抗体库的噬菌体展示和淘选
取100倍库容量的上述VHH重链抗体库菌液接种900ml 2YT-AG培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)，37℃、250rpm培养至OD600＝0.5～0.6，加入细胞密度100倍的辅助噬菌体，侵染0.5h，离心收集菌体，用900ml2YT-AK培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)重悬细胞，30℃、250rpm培养过夜。
将上一步培养物10000rpm、4℃离心20min，收集上清，加入1/4上清体积的PEG/NaCl，混匀，冰上静置2h；10000g 4℃离心25min，弃上清，离心管倒扣在平板纸上，使液体除尽；用3ml预冷1×PBS重悬噬菌体沉淀，12000g 4℃离心5min；转移上清到新的15ml离心管中，即获得第一轮起始噬菌体。
以CD70-Fc及CD47-Fc为抗原包被免疫管，采用3％的M-PBS封闭；然后加入100×库容的第一轮起始噬菌体进行抗体抗原结合，用PBST洗去未结合的噬菌体，用0.6mlTriethylamine洗脱噬菌体5min，加入0.6ml 1M Tris-HCl(pH 7.4)平衡，将洗脱下来的噬菌体重新感染TG1，进行洗脱产物的扩增，PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行3-4轮噬菌体库的富集筛选，抗原量依次降低，洗涤强度依次增强，每轮洗脱产物均进行滴度测定。
2、单克隆的诱导表达及ELISA筛选
将淘选后的菌液有限稀释涂布平板，培养过夜；挑取单克隆于分装有0.5ml/孔2YT-AG培养基的96孔深孔板培养过夜；然后将过夜培养物按照1:10转接至含有0.5ml/孔2YT-AG培养基的96孔深孔板中，培养至OD600＝0.5～0.6，加入辅助噬菌体37℃侵染15min，37℃培养45min，4000g离心收集菌体，用2YT-AK培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)重悬菌体，30℃诱导过夜，第二天离心转移上清至洁净的96孔深孔板，获得单克隆噬菌体样品。
以CD70-Fc及CD47-Fc为抗原包被96孔酶标板，封闭后向每孔中加入50μl单克隆噬菌体样品，37℃孵育1.5h；然后向每孔中加入300μl PBST，振荡5～10S，弃溶液，重复3～5次；之后向每孔中加入抗M13-HRP抗体PBST稀释液100μl，37℃孵育1h；然后向每孔中加入300μl PBST，振荡5～10s，弃溶液，重复5次；向每孔中加入50μl TMB显色液，显色3～10min(具体显色时间视显色速度而定)，之后向每孔中加入50μl 1M H2SO4终止显色；使用酶标仪测定OD450值，阳性克隆ELISA数据如下表1。
表1、噬菌体筛选阳性克隆ELISA数据
No. SEQ ID No.1 SEQ ID No.2 SEQ ID No.3 SEQ ID No.4 SEQ ID No.5 SEQ ID No.6 SEQ ID No.7 SEQ ID No.8 PC NC
CD70 2.0224 1.8429 1.8031 1.7366 1.6782 1.8928 1.7622 2.2523 2.1356 0.044
CD47 2.3981 2.2036 2.4123 2.5555 2.4782 2.4887 2.3539 2.3186 2.1397 0.0464
取上述在96孔板深孔板2YT-AG培养基中的过夜培养菌液，进行测序分析，最终获得独特的单克隆抗体的序列如SEQ ID NO：1～8所示。
实施例2重组细胞的获得
一、重组质粒的构建
1、采用VHH-F和VHH-R组成的引物对编码CD70-Fc及CD47-Fc特异抗体的DNA分子进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
VHH-F：AAGACAGCTATCGCGATTGCACT(SEQ ID NO.9)
VHH-R：GGCTCGAGGCCTGAGGAGACGGTGAC(SEQ ID NO.10)
2、用限制性内切酶Nco I和Xho I酶切步骤1得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶Nco I和Xho I酶切pET28B质粒(购买于Novagene)，回收载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET28B-VHH。
二、重组菌株的获得
将重组质粒pET28B-VHH化转入BL21感受态细胞，得到重组菌株。
实施例3CD70及CD47特异抗体的大规模制备和纯化
1、取保存在-80℃冰箱的菌种，在Kan抗性的平板上划线，37℃过夜培养约15h；挑取单克隆，接种在3mL的Kan抗性的液体LB培养基中，37℃，200rpm，过夜震荡培养约15h；取1mL菌液接种到100mL新鲜Kan抗性液体培养基中(1:100)，37℃，200rpm，震荡培养；待菌液OD600达到0.6时，加入IPTG母液，使终浓度为0.5mmol/L；30℃，200rpm，震荡培养3h；4℃，1000rpm，离心10min收集菌体，用PBS重悬菌体，再次相同条件离心收集菌体；收集的菌体直接用于菌体裂解。
2、样品的准备(使用生工Ni-TED 1ml预装重力柱)：将宿主细胞碎片通过离心等方式去除，然后过0.45μm的微孔滤膜，用结合缓冲液进行适当稀释。水洗：用5～10倍柱体积纯水以50～150cm/h清洗树脂，去除乙醇。平衡：用5～10倍柱体积结合缓冲液以150～600cm/h平衡介质，保证介质中的溶液的组分和pH与样本一致。上样：样品经过离心、过滤(0.45μm)后以低流速进行上样。若为20cm柱高，建议流速≤150cm/h，若为1ml柱体积，洗杂：用10～20倍柱体积洗杂液以150cm/h洗杂，清洗非特异吸附的杂蛋白，并收集洗杂液用于后续分析。洗脱：用5～10倍柱体积洗脱液以低流速进行洗脱，并收集洗脱液，SDS-PAGE检测，使用超滤管浓缩脱盐，-20℃保存目的蛋白。
Figure BDA0001850745740000081
Figure BDA0001850745740000091
Figure BDA0001850745740000101
Figure BDA0001850745740000111
Figure BDA0001850745740000121
Figure BDA0001850745740000131
Figure BDA0001850745740000141
Figure BDA0001850745740000151
Figure BDA0001850745740000161
序列表
<110> 浙江蓝盾药业有限公司
<120> 同时抗CD70和CD47的重链抗体及其制备方法和应用
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<211> 131
<212> PRT
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1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ala Ser Tyr Ser
20 25 30
Asn Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu
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Gly Val Ala Ser Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp
50 55 60
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 骆驼(camel)
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Ala Lys Pro Phe Ser Cys Asp Gly Arg Trp Leu Phe
100 105 110
Glu Ser Lys Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 3
<211> 131
<212> PRT
<213> 骆驼(camel)
<400> 3
Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Pro Glu Ala Ser Tyr Ser
20 25 30
Asn Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Ala Lys Pro Phe Ser Cys Asp Gly Arg Trp Leu Phe
100 105 110
Glu Ser Lys Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 4
<211> 131
<212> PRT
<213> 骆驼(camel)
<400> 4
Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ala Arg Tyr Ser
20 25 30
Lys Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Ala Lys Pro Phe Ser Cys Asp Gly Arg Trp Leu Phe
100 105 110
Glu Ser Lys Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 5
<211> 129
<212> PRT
<213> 骆驼(camel)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ala Ser Tyr Ser Asn Asn
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ser Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Lys Pro Phe Ser Cys Asp Gly Arg Trp Leu Phe Glu Ser
100 105 110
Lys Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 6
<211> 131
<212> PRT
<213> 骆驼(camel)
<400> 6
Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Tyr Thr Tyr Ser
20 25 30
Arg Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Ala Lys Pro Phe Ser Cys Asp Gly Arg Trp Leu Phe
100 105 110
Glu Ser Lys Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 7
<211> 129
<212> PRT
<213> 骆驼(camel)
<400> 7
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ala Ser Tyr Ser Asn Asn
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ser Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Lys Pro Phe Ser Cys Asp Gly Arg Trp Leu Phe Glu Ser
100 105 110
Lys Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 8
<211> 131
<212> PRT
<213> 骆驼(camel)
<400> 8
Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ala Ser Tyr Ser
20 25 30
Asn Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Ala Lys Pro Phe Ser Cys Asp Gly Arg Trp Leu Phe
100 105 110
Glu Ser Lys Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Asp Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagacagcta tcgcgattgc act 23
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggctcgaggc ctgaggagac ggtgac 26
<210> 11
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)
<223> X为Q或氨基酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (2)
<223> X为A或氨基酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)
<223> X为Q或K
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)
<223> X为E或V
<220>
<221> UNSURE
<222> (27)
<223> X为P或S
<220>
<221> UNSURE
<222> (28)
<223> X为E或R
<220>
<221> UNSURE
<222> (29)
<223> X为A或Y
<220>
<221> UNSURE
<222> (30)
<223> X为R、S或T
<220>
<221> UNSURE
<222> (33)
<223> X为K、N或R
<220>
<221> UNSURE
<222> (42)
<223> X为A或G
<220>
<221> UNSURE
<222> (81)
<223> X为L或V
<220>
<221> UNSURE
<222> (122)
<223> X为D或G
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (2)..(2)
<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> The 'Xaa' at location 5 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (27)..(27)
<223> The 'Xaa' at location 27 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (28)..(28)
<223> The 'Xaa' at location 28 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (29)..(29)
<223> The 'Xaa' at location 29 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (30)..(30)
<223> The 'Xaa' at location 30 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (33)..(33)
<223> The 'Xaa' at location 33 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (42)..(42)
<223> The 'Xaa' at location 42 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (81)..(81)
<223> The 'Xaa' at location 81 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (122)..(122)
<223> The 'Xaa' at location 122 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 11
Xaa Xaa Gln Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ser
20 25 30
Xaa Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Xaa Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Xaa Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Ala Lys Pro Phe Ser Cys Asp Gly Arg Trp Leu Phe
100 105 110
Glu Ser Lys Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Xaa Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130

Claims (3)

1.一种同时抗CD70和CD47的重链抗体，其特征在于，重链可变区域如SEQ ID No：1-8任一所示。
2.权利要求1所述同时抗CD70和CD47的重链抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括胃癌、肺癌、黑色素瘤、脑胶质瘤、卵巢癌、白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌。
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